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Faculté de Pharmacie - de l`Université libre de Bruxelles
Faculté de Pharmacie Ecole Doctorale Thématique en Sciences Pharmaceutiques Caractérisation des mécanismes de résistance des cellules gliales tumorales à la chimiothérapie et identification de nouvelles pistes chimiothérapeutiques potentielles Le Calvé Benjamin Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques Promoteur : Kiss Robert Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie Composition du jury : Prof. Isabelle Salmon (Université Libre de Bruxelles) Prof. Marc Bracke (Université de Gand) Prof. Jean-Michel Kauffmann - Président (Université Libre de Bruxelles) Prof. Véronique Fontaine – Secrétaire (Université Libre de Bruxelles) Prof. Jacques Dubois (Université Libre de Bruxelles) Prof. Pierre Duez (Université Libre de Bruxelles) Prof. Karim Amighi (Université Libre de Bruxelles) Année Académique 2011-2012 ABREVIATIONS ............................................................................................................... 4 BUT DU TRAVAIL............................................................................................................ 6 RESUME............................................................................................................................ 7 INTRODUCTION.............................................................................................................. 8 1 Caractérisation du comportement biologique et clinique des glioblastomes........... 8 1.1 Echelle de gradation de la malignité ........................................................................8 1.2 Epidémiologie ...........................................................................................................9 1.3 Traitements.............................................................................................................10 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.4 Chirurgie............................................................................................................................... 10 Radiothérapie........................................................................................................................ 10 Traitement chimiothérapeutique standard............................................................................. 11 Chimiothérapie de deuxième ligne ....................................................................................... 12 Biologie des glioblastomes ......................................................................................12 1.4.1 Profils génétiques ................................................................................................................. 12 1.4.1.1 EGFR .......................................................................................................................... 13 1.4.1.2 PTEN........................................................................................................................... 13 1.4.1.3 P53 .............................................................................................................................. 14 1.4.1.4 MGMT ........................................................................................................................ 14 1.4.1.5 IDH1 ........................................................................................................................... 15 1.4.1.6 Autres altérations génétiques ...................................................................................... 15 1.4.2 Caractéristiques biologiques et moléculaires........................................................................ 16 1.4.2.1 Invasion....................................................................................................................... 16 1.4.2.2 Prolifération ................................................................................................................ 17 1.4.2.3 Nécrose ....................................................................................................................... 17 1.4.2.4 Angiogénèse................................................................................................................ 18 1.4.2.5 Apoptose ..................................................................................................................... 18 1.4.3 Cellules souches ................................................................................................................... 19 2 Quels sont les mécanismes de résistance à la chimiothérapie connus à ce jour pour les glioblastomes ?................................................................................................... 20 2.1 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose ..................................................20 2.2 Les systèmes de détoxification cellulaire................................................................21 2.3 Stress du réticulum endoplasmique .......................................................................22 3 Pourquoi le témozolomide offre-t-il un avantage thérapeutique par rapport à toutes les autres formes de chimiothérapies ? ................................................................ 23 3.1 Alkylation de l’ADN ...............................................................................................23 3.2 Induction de processus soutenus d’autophagie suivis d’apoptose tardive ............24 3.3 Effet anti-angiogénique ..........................................................................................25 3.4 Conclusion ..............................................................................................................26 4 Quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires permettant aux cellules gliales tumorales de résister au témozolomide ?............................................................. 26 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 Sur le plan cellulaire...............................................................................................26 Le métabolisme des cellules tumorales gliales ..................................................................... 26 La pompe à efflux ABCB1 (MDR1) .................................................................................... 28 L’hypoxie ............................................................................................................................. 29 1 4.1.3.1 4.1.3.2 4.2 4.2.1 4.2.2 Hypoxie et cellules souches ........................................................................................ 29 Hypoxie et résistance à la chimiothérapie................................................................... 30 Sur le plan moléculaire...........................................................................................30 MGMT.................................................................................................................................. 30 HIF1α ................................................................................................................................... 31 5 Quelles sont les approches thérapeutiques envisagées actuellement pour combattre les gliomes résistants au témozolomide? ......................................................................... 32 5.1 Le cilengitide...........................................................................................................32 5.2 La chlorotoxine.......................................................................................................33 5.3 L’avastin .................................................................................................................34 5.4 L’erlotinib...............................................................................................................36 5.5 Autres types de molécules ......................................................................................37 5.5.1 5.5.2 6 Immunothérapie.................................................................................................................... 37 Dasatinib............................................................................................................................... 38 Pourquoi nous sommes-nous intéressés aux phyllostictines?................................ 39 6.1 Origine des phyllostictines......................................................................................39 6.2 Technique d’extraction...........................................................................................39 6.3 Propriétés connues à ce jour ..................................................................................40 6.3.1 6.3.2 Pesticide................................................................................................................................ 40 Activités antibactérienne et zootoxique ................................................................................ 41 MATERIEL ET METHODES ........................................................................................ 43 1 2 3 4 Culture cellulaire et modèles biologiques ............................................................... 43 1.1 Lignées cellulaires établies .....................................................................................43 1.2 Lignées cellulaires résistantes au témozolomide....................................................43 1.3 Milieux et conditions de culture cellulaire .............................................................44 1.4 Les modèles in vivo .................................................................................................45 Les tests de croissance cellulaire et mort cellulaire................................................ 46 2.1 Le test colorimétrique MTT...................................................................................46 2.2 Analyse du cycle cellulaire .....................................................................................47 2.3 Analyse TUNEL......................................................................................................47 2.4 La vidéomicroscopie quantitative ..........................................................................48 Analyse de l’expression génomique ........................................................................ 49 3.1 Puce Affymétrix......................................................................................................49 3.2 La reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ...........................50 Analyse de l’expression protéomique ...................................................................... 53 4.1 L’immunofluorescence ...........................................................................................53 4.2 Western Blotting.....................................................................................................55 4.3 Extinction par la technique de siRNA....................................................................58 2 5 6 Etude de l’activité anticancéreuse de la phyllostictine A ....................................... 59 5.1 Etude de la liaison à l’ADN ....................................................................................59 5.2 Etude de liaison au glutathion, la cystéine ou la N-acétyle cystéine ......................59 5.3 Déplétion en glutathion ..........................................................................................60 Analyses statistiques................................................................................................. 61 6.1 Analyse de survie ....................................................................................................61 6.2 Comparaison de groupes de données .....................................................................61 RESULTAT - I ................................................................................................................. 62 Erratum ............................................................................................................................ 79 RESULTAT - II................................................................................................................ 81 DISCUSSION................................................................................................................... 95 1 Nouveaux mécanismes de résistance au témozolomide.......................................... 95 1.1 Analyse de nos résultats en fonction des données déjà publiées dans la littérature 95 1.2 Implication potentielle de nos résultats sur le plan clinique : mise au point de biomarqueurs tissulaires et/ou sanguins ............................................................................97 1.3 Implication potentielle de nos résultats sur le plan thérapeutique : identification de nouvelles cibles pour combattre les gliomes malins ......................................................98 2 Développement des phyllostictines dans le but d’une stratégie de traitement des gliomes.............................................................................................................................. 99 3 2.1 Exploitations optimisées des mécanismes d’action antitumoraux originaux........99 2.2 Caractérisation du mécanisme d’action...............................................................100 2.3 Amélioration de la biosélectivité par vectorisation ciblée ...................................101 Conclusions ............................................................................................................ 103 REFERENCES .............................................................................................................. 105 3 ABREVIATIONS ABREVIATIONS ABCC1: ATP-binding cassette sub-family C member 1 ABCG2: ATP-binding cassette sub-family G member 2 ABH: alkB homologous protein ADN: acide déoxyribonucléique Akr1c1, 2 et 3: aldo-kéto réductase 1c 1,2 et 3 ALDH1 aldéhyde déshydrogénase 1 ARNm: acide ribonucléique messager ATP: adenosine tri-phosphate BER: base excision repair Bip: immunoglobulin-binding protein CAIX: anhydrase carbonique IX CDKN2A: cyclin-dependent kinase inhibitor 2A ClC: canaux chlore DMSO: diméthylsulfoxyde dNTP: déoxynucléotides triphosphate EGF: epidermal growth factor EGFR: epidermal growth factor receptor F.D.A: Food and Drug Administration FITC: fluorescein isothiocyanate GFAP: glial fribrilary acidic protein GSH: glutathion HCl: acide chlorhydrique HIF-1α α: hypoxia-inductible factor 1α HRP: horseradish peroxidase IDH1 et 2: isocitrate déhydrogénase 1 et 2 IL-8: interleukine 8 LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3 LDH: lactate déshydrogénase LOH: loss of heterozygosity MCT1 et 4: mono-carboxylate transporter MDR: multidrogue résistance MEM: minimal essentiel medium MgCl2: chlorure de magnésium 4 MGMT: 06-méthylguanine DNA transférase MITC: 5-(3-méthyltriazene-1-yl) imidazole-4-carboxamide MMP-2 et -9: matrix metalloproteinase 2 et 9 MMR: mismatch repair NADPH: nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NF1: neurofibromin 1 NHDF: Normal Human Dermal Fibroblasts O.M.S: organisation mondiale de la santé PARK2: Parkinson protein 2 PCR: polymerase chain reaction PCV: procarbazine, lomustine, vincristine PDGFR: Platelet-derived growth factor receptors PDK1: pyruvate déshydrogénase kinase 1 PGP: glycoprotéine P PI3K: phosphate inositol 3 kinase PIP2: phosphatidylinositol-4,5-biphosphate PIP3: phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate PKC: protein kinase C PTEN: phosphatase and Tensin homolog RISC: RNA-Induced Silencing Complex RPMI: Roswell Park memorial medium RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction SiRNA: small interfering ARN SVF: sérum de veau fœtal TCGA: the cancer genome atlas research network TdT: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TEP: tomographie par émission de positons TMZ: témozolomide TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling UPR: unfolded protein response VEGF: vascular endothelial growth factor 5 BUT DU TRAVAIL BUT DU TRAVAIL Les tumeurs gliales et plus particulièrement le glioblastome, qui représente le plus haut grade de malignité, sont de très mauvais pronostic. Actuellement, la médiane de survie des patients atteints de glioblastomes est inférieure à quinze mois. Malgré les progrès des techniques chirurgicales et des moyens de radiothérapie, aucun patient n’a pu survivre à long terme à ce type de tumeur notamment à cause de son caractère invasif et agressif. Le traitement standard administré aux patients nouvellement diagnostiqués, après une résection chirurgicale la plus large de la tumeur, est un traitement concomitant radiothérapie-chimiothérapie au témozolomide suivi de cycles de témozolomide qui est la molécule qui offre le plus grand bénéfice thérapeutique au patient. Certains d’entres eux développent des résistances au témozolomide au cours de leur traitement notamment par la mise en place de mécanismes moléculaires au sein des cellules tumorales gliales. Notre travail s’est articulé en deux étapes distinctes. Tout d’abord, nous avons essayé de caractériser les gènes impliqués dans ces mécanismes de résistance acquise au témozolomide dans le but de découvrir des marqueurs prédictifs ou de nouvelles cibles dans le traitement des glioblastomes. La deuxième étape de ce travail est d’identifier des nouvelles molécules originales, brevetables et actives contre les glioblastomes. Nous nous sommes ainsi intéressés à des molécules produites par des champignons parasites de plantes. Les diverses molécules ont été testées sur des modèles in vitro et seraient susceptibles, grâce aux résultats que nous avons obtenus, d’être introduites en essais précliniques à plus ou moins moyen terme. Ce travail s’inscrit dans la thématique du Laboratoire de Toxicologie de la Faculté de Pharmacie de l’Université Libre de Bruxelles qui a pour but d’identifier les mécanismes moléculaires de résistance dans divers types de cancers (gliome, œsophage, mélanome…) et la découverte de nouveaux traitements anticancéreux d’origine naturelle. 6 RESUME RESUME Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus répandues chez l’adulte et l’enfant, et les plus agressives avec une médiane de survie inférieure à quinze mois. Deux caractéristiques biologiques rendent leur traitement particulièrement difficile. Tout d’abord, la capacité d’invasion du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales rend la résection chirurgicale totale impossible. De plus, ces cellules développent une résistance aux stimuli pro-apoptotiques rendant la plupart des agents chimiothérapeutiques peu efficaces contre ce type de tumeur. Actuellement, le seul agent chimiothérapeutique efficace dans le traitement des glioblastomes est le témozolomide. Malheureusement des mécanismes de résistance acquise peuvent apparaître chez des patients traités avec cette molécule. Nous avons donc étudié ces mécanismes moléculaires de résistance acquise au témozolomide et dans un deuxième temps nous avons tenté de trouver de potentielles molécules susceptibles de lutter contre les gliomes. Nous avons rendu résistants deux modèles de cellules gliales tumorales au témozolomide par un traitement incrémental durant plusieurs mois. Grâce à une analyse de type Affymétrix, nous avons comparé l’expression de l’ensemble des gènes entre les lignées normales et les lignées rendues résistantes. Deux familles de gènes sont ressorties comme impliquées dans ce processus de résistance : les transporteurs glucose et les aldokéto réductase 1C (akr1c). Pour les transporteurs glucose, il se pourrait que leur implication se fasse au niveau du métabolisme des cellules résistantes en permettant d’apporter plus de substrat énergétique et ainsi contourner les effets pro-autophagiques du témozolomide. Dans le cas des akr1c, il semblerait que leur surexpression ait pour but d’augmenter la prolifération des cellules tumorales résistantes. Nous avons, par la suite, étudié les propriétés anticancéreuses de métabolites fongiques, les phyllostictines, extraites du champignon Phyllosticta cirsii. Quatre métabolites naturels et deux dérivés hémisynthétiques ont été testés démontrant des activités plus ou moins importantes sans toutefois montrer in vitro de biosélectivité entre cellules tumorales et cellules normales. Les phyllostictines semblent se lier au groupement thiol libre comme nous l’avons déterminé sur le glutathion ou la cystéine. Il reste à déterminer la cible des phyllostictines dans les cellules tumorales et à améliorer la sélectivité de ces molécules. 7 INTRODUCTION INTRODUCTION 1 Caractérisation du comportement biologique et clinique des glioblastomes 1.1 Echelle de gradation de la malignité La gradation des gliomes est basée sur une classification établie par l’Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S). Elle permet d’identifier les différents types de tumeurs cérébrales en fonction de leur origine histologique ainsi que du facteur pronostic associé. L’échelle se divise en quatre grades notés de I à IV où ce dernier représente le plus haut grade de malignité. L’origine histologique fait référence aux types de cellules gliales desquelles sont issues les tumeurs. (Figure 1) On retrouve trois grands types histologiques qui sont les plus représentés chez les patients : astrocytaire, oligodendrogliale et épendymaire. Il existe aussi des tumeurs qui peuvent présenter des origines histologiques mixtes comme les oligoastrocytomes (Figure 1). Les tumeurs de grade I sont considérées comme bénignes du fait d’une délimitation précise et d’une croissance lente ce qui les rendent curable chirurgicalement. Le pronostic associé est très favorable. Pour le grade II, il s’agit encore de gliome de bas grade avec un pronostic vital positif pour le patient mais qui peuvent évoluer en grade III voire IV au cours du temps. En ce qui concerne les astrocytomes de grade II, le traitement le plus approprié est basé sur une résection chirurgicale de la tumeur ainsi qu’une chimiothérapie pour certains patients inclus dans des essais cliniques, mais pas en routine. De nouvelles techniques chirurgicales sont développées chez le patient éveillé pour combattre ces astrocytomes de grade II (Smith et coll., 2008; Ius et coll., 2011). L’approche thérapeutique diffère pour les oligodendrogliomes de grade II. Elle consiste en une résection chirurgicale suivie d’une chimiothérapie. La présence de la délétion 1p19q est un marqueur de bon pronostic pour les patients atteints de ce type de tumeur (Ino et coll., 2001). Les gliomes de haut grade regroupent toutes les tumeurs de grade III (dénommées gliomes anaplasiques) et IV (dénommées glioblastomes). Tout d’abord, le grade III nécessite un traitement par chirurgie puis l’association de chimiothérapie/radiothérapie. 8 Origine astrocytaire Origine oligodendrogliale Astroctytome pylocytique Grade I Origine ependymaire Origine mixte Subépendymome Astrocytome subependymaire à cellules géantes Myxopapillaire épendymome Astrocytome diffus Grade II Astrocytome pylomixoide Oligodendrogliome Ependymome Oligoastrocytome Oligodendrogliome anaplasique Ependymome anaplasique Oligoastrocytome anaplasique Xanthoastrocytome pléomorphique Grade III Astrocytome anaplasique Grade IV Glioblastome Figure 1 : Classification des différents types de tumeurs cérébrales en fonction de leur origine histologique et de leur degré de malignité (Source : Organisation Mondiale de la Santé : Classification of Tumours of the Central Nervous System - 4th edition). L’évolution est plus réservée et dans ce cas la médiane de survie, suivant l’origine histologique, peut descendre à 29 mois de part l’évolution très probable vers un gliome de grade IV. Ce dernier représente le degré de malignité le plus élevé avec un pronostic vital très sombre puisque la médiane de survie n’est que de 15 mois du fait de différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires que nous détaillerons par la suite. Il est important de préciser que les glioblastomes sont sous catégorisés en deux groupes : les glioblastomes de novo (95% des cas) et les glioblastomes secondaires qui dérivent de tumeurs de grades inférieurs. Il a été décrit dans la littérature un autre type de sous classification des glioblastomes (Verhaak, 2010) que nous détaillerons dans la partie suivante et qui est basé sur le profil génomique des différents types de tumeurs gliales. Le traitement associé aux tumeurs de grade III et IV est basé sur une résection chirurgicale la plus large possible du bloc tumorale rendue toutefois difficile par le caractère invasif de ces cancers au sein du parenchyme cérébral (Figure 2), suivi d’un traitement concomitant radiothérapie/chimiothérapie. 1.2 Epidémiologie Au cours de nos travaux, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au glioblastome. Il s’agit d’un type de tumeur qui touche préférentiellement l’adulte. La médiane d’âge des patients atteints de ce type de tumeur est de 64 ans aux USA ce qui est bien supérieure à la médiane que l’on observe dans les autres types de tumeurs cérébrales (Schwartzbaum et coll., 2006). La prévalence est de 3 à 4 nouveaux cas pour 100 000 personnes par an en Europe et aux USA (Louis et coll., 2007). C’est aussi la tumeur cérébrale la plus fréquente puisqu’elle représente 12-15% des tumeurs cérébrales et 6075% des tumeurs d’origine astrocytaire (Clarke et coll., 2010). Le nombre d’hommes touchés par ce type de tumeur est supérieur à celui des femmes (Holland et coll., 2010). L’évolution peut être lente et le patient peut parfois avoir une tumeur présente depuis plusieurs mois sans qu’aucun symptôme ne se manifeste. Les signes cliniques sont souvent des nausées, migraines et vomissements liés à une augmentation de la pression intracrânienne (Gladson et coll., 2010). Dans certains cas, il peut y avoir des épisodes épileptiques. Les facteurs qui favorisent le développement de ce type de tumeur sont encore peu connus. Il s’agirait plutôt d’une origine plurifactorielle (génétique, environnementale…) (Schwartzbaum et coll., 2006). 9 ZCN OP Figure 2 : Visualisations du caractère invasif des glioblastomes au sein du cerveau. Sur la gauche apparaît l’IRM (imagerie à résonnance magnétique) d’un patient atteint d’un glioblastome. On peut identifier sur l’image la formation d’un œdème périphérique (OP) et d’une zone centrale nécrotique (ZCN). Sur la droite, une coupe de cerveau au niveau du lobe frontal qui montre le large envahissement du lobe frontal et du corps calleux par la tumeur (Source : Organisation Mondiale de la Santé : Classification of Tumours of the Central Nervous System - 4th edition). 1.3 Traitements 1.3.1 Chirurgie La résection chirurgicale est la première étape du traitement pour les patients atteints d’un glioblastome. Cette étape est dépendante de plusieurs facteurs avec en premier lieu la localisation de la tumeur au sein du cerveau. En effet, suivant la zone où la tumeur se développe, il est difficile pour les neurochirurgiens de procéder à une résection totale sans endommager des fonctions motrices ou cérébrales. Pour contrer et minimiser les risques de perte de fonctions, il existe une technique de chirurgie éveillée du patient pour cartographier par électrostimulation les zones du cerveau et ainsi éviter toutes séquelles de l’opération (De Benedictis et coll., 2010). De plus le caractère invasif des glioblastomes ne permet pas une résection totale des cellules tumorales qui migrent dans le parenchyme cérébral (Figure 3). Il existe cependant une nouvelle technique qui permet de mieux visualiser les tumeurs lors des opérations. L’administration d’acide 5aminolevulinique, commercialisé sous le nom de Gliolan® va induire la surexpression au sein des tissus malins de la protoporphyrine IX (Idoate et coll., 2011). Cette dernière permet de colorer en rouge les cellules tumorales lorsqu’elles sont exposées à une lumière bleue. 1.3.2 Radiothérapie La radiothérapie est la deuxième étape dans le traitement des patients atteints de glioblastome. Elle a pour but d’inhiber la prolifération des cellules cancéreuses en ne ciblant que le tissu tumoral. Le protocole standard est une dose de 60 Grey fractionnée en doses de 2 Grey délivrées 5 jours par semaine pendant 6 semaines consécutives (Stupp et coll., 2005). D’autres études cliniques ont porté sur l’augmentation de la dose globale (jusque 90 Grey) ou sur la dose quotidienne (3-4 Grey) pour évaluer si ce nouveau protocole pouvait être bénéfique pour le patient. A ce jour, cette augmentation n’a pas amélioré significativement la survie mais au contraire il a été observé une toxicité avec des effets secondaires nuisibles pour les malades (Nieder et coll., 2004). 10 Pré-opératoire Post-opératoire Après 12 mois Après 17 mois Figure 3: Image par résonnance magnétique (IRM) d’un patient diagnostiqué d’un glioblastome au niveau de l’occipital droit avant son opération ainsi que la même image obtenue après son opération. Le patient a subi une chimiothérapie couplée à une radiothérapie de 60 Gray. Après douze mois, l’IRM montre une récidive tumorale adjacente au premier foyer qui avait été enlevé. Après 17 mois, la récidive tumorale est de nouveau de taille comparable à celle d’origine. Le patient est décédé peu de temps après cette IRM (Source : Nakada et coll., Cellular and Molecular Life Sciences, 2007). 1.3.3 Traitement chimiothérapeutique standard La molécule de référence est le témozolomide. Il s’agit d’un agent alkylant de la classe des imidazotétrazines. La molécule est une pro-drogue transportant l’ion méthyldiazonium capable de fixer un groupement méthyle sur les guanines de l’ADN en position O6, N3 et N7 bloquant ainsi le cycle cellulaire des cellules cancéreuses (Figure 4). L’intérêt de cette molécule se situe au niveau de son caractère amphiphile qui lui permet de passer la barrière hémato-méningée et de sa capacité à se dissoudre facilement en milieu aqueux permettant une administration orale (Friedman et coll., 2000). Le témozolomide apporte un bénéfice thérapeutique aux patients atteints de glioblastome en traitement concomitant avec la radiothérapie (Stupp et coll., 2009) puisque la survie à deux ans passe de 11%, pour les patients traités avec radiothérapie seule à 30% dans le traitement combiné. De même, la survie à 3 ans est passée de 4% à 15%, à 4 ans de 2% à 9% et enfin à 5 ans de 1% à 5%. En détail, le protocole de traitement est le suivant. Un premier cycle de chimiothérapie est administré au patient en même temps que la radiothérapie à raison de 75mg/m2 par jour et ce pendant toute la durée du traitement radiothérapeutique sans excéder 49 jours consécutifs. Après 4 semaines de pause, le patient reprend la chimiothérapie par cycle (jusqu’à 6) de 5 jours de traitement consécutifs espacés de 28 jours. Les doses administrées commencent à 150 mg/m2 par jour et peuvent monter jusqu’à 200mg/m2 par jour selon l’apparition ou non d’effets secondaires (Stupp et coll., 2005, 2007, 2009). Les effets secondaires les plus notables sont des neutropénies conduisant à l’apparition d’infections opportunistes qui sont combattues par un traitement prophylactique d’antibiotiques (Stupp et coll., 2005). L’efficacité de cet agent chimiothérapeutique dépend de l’activité ou non de l’enzyme de réparation O6-méthylguanine DNA méthyltransférase (MGMT). En fonction de la méthylation du promoteur du gène, la réponse au traitement standard est différente et le pronostic pour le patient est variable. Il a été démontré qu’en cas de méthylation du promoteur, la survie des patients est significativement meilleure que pour les patients ne présentant pas cette méthylation (Hegi et coll., 2005). 11 Figure 4: Le témozolomide est converti en milieu aqueux par relargage d’une molécule de dioxyde de carbone (CO2) pour donner le composé instable appelé 5-(3méthyltriazene-1-yl) imidazole-4-carboxamide (MTIC). L’ion méthyldiazonium se détache au contact de l’ADN et par substitution nucléophile attaque le groupement hydroxyle en position 6 de la guanine. Ce type d’alkylation peut aussi se retrouver en position 4 de la thymine (Source : Neidle et Thurston, Nature Reviews Cancer, 2005). 1.3.4 Chimiothérapie de deuxième ligne Lors de l’échec du protocole standard de traitement décrit par Stupp et coll., il est possible d’employer d’autres molécules ou protocoles chimiothérapeutiques pour limiter la progression des cellules tumorales gliales. Elles sont administrées en traitement concomitant avec une radiothérapie. Tout d’abord, les nitroso-urées avec la carmustine (BCNU) et la lomustine (CCNU) présentent une alternative au traitement au témozolomide. Ce sont des agents alkylants sur la position O6 de la guanine de l’ADN (Souhami et coll., 2004). La carmustine est aussi utilisée sous forme d’implants imprégnés de cette molécule et greffés chez le patient en intracrânien. Ce procédé porte le nom de Gliadel et a été validé comme traitement de seconde ligne par les autorités de la santé Nord américaine (FDA) (Quinn et coll., 2010). L’utilisation d’un autre agent alkylant de la famille des triazènes comme la procarbazine est aussi possible. Malgré la capacité de ces molécules à alkyler les bases de l’ADN, le témozolomide reste le traitement de référence de part sa capacité à induire de l’autophagie et à inhiber les mécanismes d’angiogénèse. Une autre alternative est la vincristine (isolée de la pervenche), molécule anti cancéreuse, capable d’inhiber la polymérisation de la tubuline en microtubule (Jordan et coll., 1985). Plus généralement, la combinaison PCV (procarbazine, lomustine et vincristine) peut être utilisée dans le traitement des gliomes de haut grade (Murphy et coll., 2002) (Figure 5). D’autres combinaisons chimiothérapeutiques sont en phase clinique comme l’association carboplatine et étoposide avec un résultat limité (Franceschi et coll., 2004). Différents paramètres de génétique moléculaire interviennent dans l’efficacité potentielle des différents traitements contre le glioblastome. Certains éléments peuvent servir au diagnostic des glioblastomes ou être des facteurs prédictifs aux traitements administrés. 1.4 Biologie des glioblastomes 1.4.1 Profils génétiques Le processus de tumorigenèse des cellules gliales s’explique par la mutation, la délétion ou l’amplification de pro ou anti-oncogènes. Il existe un grand nombre de gènes 12 Vincristine Etoposide Carmustine Carboplatine Procarbazine Lomustine Figure 5: Structure chimique des différentes molécules chimiothérapeutiques administrées en première ou deuxième ligne chez les patients atteints d’un glioblastome. Sur la ligne du haut, l’association Vincristine, Carmustine et Procarbazine constitue le traitement appelé PCV. D’autres molécules sont utilisées pour le traitement des glioblastomes comme la combinaison Etoposide-Carboplatine ainsi que la Lomustine qui fait partie de la famille des nitrosourées comme la Carmustine. impliqués dans l’évolution d’une cellule normale vers une cellule cancéreuse. Les glioblastomes présentent des altérations génétiques qui permettent de les différencier des tumeurs de grade inférieur. 1.4.1.1 EGFR L’amplification du gène du récepteur transmembranaire à tyrosine kinase EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) est une des caractéristiques génétiques les plus fréquentes dans les glioblastomes primaires. Il existe différentes origines mais elles ont toutes pour conséquence la surexpression de ce facteur entraînant une augmentation de la chimio- et radiorésistance, du pouvoir invasif et de la prolifération cellulaire (Gladson et coll., 2010). Au niveau clinique, la surexpression d’EGFR est directement liée à un pronostic défavorable pour le patient (Shinojima et coll., 2003; Heimberger et coll., 2005). La mutation la plus fréquente rencontrée dans les glioblastomes est une délétion des exons 2-7 de l’ARNm conduisant à la traduction d’un variant appelé EGFRvIII. Ce dernier n’a plus besoin d’être sous forme dimérisée pour s’activer, à l’inverse du variant sauvage entraînant ainsi une suractivité du récepteur EGFR (Chu et coll., 1997). Actuellement, plusieurs molécules inhibitrices d’EGFRvIII sont en développement dans le traitement du glioblastome notamment avec le Gefitinib et l’Erlotinib qui sont en essais cliniques de phase II (Reardon et coll., 2011; van den Bent et coll., 2009). 1.4.1.2 PTEN Le gène PTEN est un gène suppresseur de tumeur placé sur le bras long du chromosome 10. La délétion de ce gène peut être associée à une perte plus globale de matériel du chromosome 10 avec perte de l’hétérozygotie appelée LOH (Loss of Heterozygosity) et elle est très fréquente dans les glioblastomes. PTEN intervient directement dans la voie de signalisation PI3K/AKT en tant que régulateur négatif (Mellinghoff, Cloughesy et Mischel, 2007). La kinase PI3K convertit le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) en PIP3 qui va ensuite activer la protéine kinase AKT responsable de l’augmentation de la prolifération cellulaire et de l’inhibition de certaines voies de mort cellulaire (Wang et coll., 1997). La protéine PTEN va enlever un phosphate du noyau inositol du PIP3 dans le but d’inactiver la voie de signalisation (Figure 6). La délétion du gène PTEN ne 13 Figure 6: Aperçu de la voie de signalisation PI3K/Akt et de ses liens avec les intégrines et les RTK (Recepteurs à Tyrosine Kinase) dont receptor). L’activation d’EGFR se (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) traduit en EGFR (Epidermal growth factor par PIP3 la conversion du PIP2 (Phosphatidylinositol-3,4,5- trisphosphate) par l’intermédiaire de l’enzyme PI3K (phosphatidylinositol 3 kinase). Le régulateur de cette voie est la protéine PTEN (Phosphatase and TENsin homolog) qui reconvertit le PIP3 en PIP2. Les intégrines, par intéraction avec la matrice extracellulaire, peuvent aussi activer cette voie de signalisation par l’intermédiaire de la kinase FAK (Focal Adhesion Kinase) (Source: Guo et Giancotti, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2004). permet pas d’obtenir une protéine fonctionnelle ce qui engendre une suractivation de la voie PI3K/Akt (Wang et coll., 1997). 1.4.1.3 P53 La protéine p53 est une protéine régulatrice du cycle cellulaire. Les mutations de son gène situé sur le bras court du chromosome 17 sont souvent retrouvées dans les glioblastomes. Cette altération génétique est aussi présente dans les gliomes de grade II et III. La protéine P53 assure le contrôle de l’intégrité du génome (Albrechtsen et coll., 1999). Elle est aussi capable de réguler le cycle cellulaire notamment par l’intermédiaire de la protéine p21 ainsi que l’entrée de la cellule en apoptose par l’intermédiaire des caspases. Cette mutation du gène P53 se retrouve dans 28% des glioblastomes primaires et dans 65% des glioblastomes secondaires (Ohgaki et coll., 2004). On explique cette différence par le fait que les gliomes de bas grade présentent pour certains cette mutation et que l’évolution vers les gliomes de haut grade se fait en partie grâce à la présence de cette mutation. 1.4.1.4 MGMT Cette protéine appelée O6-méthylguanine DNA méthyltransférase est une enzyme de réparation de l’ADN dont le gène est situé sur le chromosome 10. Sa fonction est d’exciser les groupements alkyles qui se fixent sur la position O6 de la guanine par transfert de ce dernier sur l’enzyme (Gerson, 2004). Une fois cette étape faite, la protéine est ubiquitinylée et dégradée par le protéasome. En temps normal, sans l’intervention de l’enzyme, le nombre de mésappariements au sein de l’ADN empêche à la cellule de se diviser et l’oblige à rentrer en apoptose (Figure 7). L’enzyme MGMT agit en coopération avec le système enzymatique MMR (mismatch repair) qui contrôle la présence et la réparation des mésappariements de l’ADN (Kaina et coll., 2007). On comprend donc que l’enzyme MGMT joue un rôle très important dans l’efficacité des traitements chimiothérapeutiques à base d’agents alkylants notamment le témozolomide qui est la molécule de référence comme nous l’avons vu précédemment (Stupp et coll., 2007). L’activation de la protéine MGMT dépend du taux de méthylation de son promoteur (Watts et coll., 1997). Les patients atteints de glioblastome présentant cette méthylation 14 Figure 7: Illustration du mécanisme d’action de l’enzyme MGMT (O6-méthylguanine-DNAméthyltransférase). Ajout d’un groupement méthyle sur le groupement hydroxyle en position 6 de la guanine créant des mésappariements entre les bases de l’ADN. Intervention de l’enzyme MGMT en collaboration avec le système de réparation MMR (mismatch repair) qui contrôle si la cellule peut se diviser et répliquer son ADN. L’induction de méthylation sur la guanine en position O6 peut induire la formation de mutations ou même dans certains cas entraîner l’arrêt de la prolifération par blocage du cycle cellulaire en phase G2 du cycle (Source: Kaina B. et coll., DNA Repair, 2007). répondent de façon plus favorable au témozolomide que les patients exprimant l’enzyme de réparation (Hegi et coll., 2005). 1.4.1.5 IDH1 Un autre type de mutation a été mis en évidence dans les glioblastomes, il s’agit des mutations des gènes IDH1 et IDH2 (Yan et coll., 2009). Ces gènes codent pour une famille d’enzymes, les NADP+ isocitrate déhydrogénases présentes dans le cytosol, qui intervient dans le cycle de Krebs en transformant l’isocitrate en α-cétoglutarate. Cette réaction permet la production de NADPH et par conséquent la formation de glutathion protecteur contre le stress oxydatif. En cas de mutation, l’activité de ces enzymes est fortement réduite (Yan et coll., 2009; Bleeker et coll., 2010). La diminution de NADPH induit la diminution de la formation de glutathion, ce qui augmente la sensibilité à la radiothérapie et à la chimiothérapie (Bleeker et coll., 2010). On retrouve cette mutation en proportion importante dans les gliomes de bas grades ainsi que dans les glioblastomes secondaires. Elle est présente en plus petit pourcentage dans les glioblastomes primaires (Verhaak et coll., 2010). Cependant au niveau clinique, les patients présentant une mutation sur un des deux gènes ont une espérance de survie supérieure aux patients présentant un profil non muté (Yan et coll., 2009). 1.4.1.6 Autres altérations génétiques Il existe d’autres mutations impliquées dans le processus de cancérogénèse et que l’on retrouve dans les glioblastomes comme la protéine Ras qui se trouve en aval de la voie de signalisation de l’EGFR, la cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A) qui est une protéine suppresseur de tumeur notamment par la régulation du cycle cellulaire ou encore PDGFR qui fait partie des récepteurs tyrosine kinase intervenant comme EGFR dans la voie PI3K/Akt (Malla et coll., 2010). Plus récemment, le TCGA (The Cancer Genome Atlas research network), une étude de grande ampleur menée aux USA, vise à identifier les caractéristiques moléculaires des différents types de cancer. Le premier type de tumeur à avoir été analysé est le glioblastome. Le principe de l’étude a été basé sur la sélection d’un grand 15 nombre de tumeurs extraites de patients, en l’occurrence 206, et clairement identifiées comme étant des glioblastomes. La suite de l’étude a porté sur l’analyse des copies d’ADN et de sa méthylation ainsi que de l’expression des gènes par utilisation de la technique Affymétrix. Le résultat de cette étude a mis en évidence de nouvelles altérations génétiques telles que les délétions homologues des gènes NF1 (neurofibromin 1) et PARK2 (parkinson protein 2) ou encore l’amplification d’AKT3 (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3). Au-delà de ces caractéristiques génétiques, d’autres éléments permettent de caractériser les cellules gliales tumorales par des éléments biologiques et moléculaires. 1.4.2 Caractéristiques biologiques et moléculaires 1.4.2.1 Invasion Le pouvoir invasif des cellules de glioblastome est caractérisé par la capacité des cellules tumorales à migrer dans le parenchyme cérébral. Cette activité résulte d’une synergie entre deux mécanismes cellulaires distincts : le remodelage de la matrice extracellulaire et la motilité des cellules gliales tumorales. Dans un premier temps, les cellules tumorales sécrètent des protéases, les MMP (protéases de la matrice extracellulaire), qui vont digérer la matrice extracellulaire (Rao et coll., 2003) (Figure 8) et relarguer des facteurs de croissance qui vont activer la prolifération, l’invasion et l’angiogénèse. Une fois la matrice extracellulaire dégradée, elles peuvent migrer grâce à des complexes d’adhésion à la matrice telle que les intégrines (Guo et Giancotti, 2004). L’activation de ces intégrines n’est possible que par le remodelage du cytosquelette de la cellule dans le but d’augmenter la motilité cellulaire (Louis, 2006). Il a été aussi démontré que les cellules gliales tumorales sont capables de modifier leurs morphologies. La surexpression de certains canaux chlorure permettent des mouvements d’eau entre le milieu intra et extracellulaire facilitant ainsi la migration des cellules tumorales en leur permettant de se glisser entre les cellules de la matrice extracellulaire. La forme et le volume des cellules se trouvent modifiés par application des lois de l’osmose. La sortie ou l’entrée d’ions va être compensée par des flux passifs d’eau à travers la membrane plasmique pour rééquilibrer le désordre ionique (Soroceanu et coll., 1999). Enfin le rôle des cadhérines 16 Figure 8 : Schéma d’action des MMP (Protéases extracellulaires de la matrice). La digestion de la matrice extracellulaire engendre différents phénomènes comme la prolifération cellulaire, l’invasion ou encore l’angiogénèse. La libération de facteurs de croissance comme le TNF (Tumor Nécrosis Factor) ou encore le TGF-β (Transforming Growth Factor β ) vont permettre la croissance des cellules tumorales (Source : Rao J.S., Nature Reviews Cancer, 2003). dans les mécanismes d’invasion a été largement démontré dans la littérature. Ces protéines transmembranaires sont impliquées dans les interactions de types cellulescellules. Les deux principales sont les cadhérines E et N. Les cellules cancéreuses, en général, expriment les deux types de cadhérine mais lors de l’augmentation de la l’agressivité tumorale, les cadhérines E ne sont plus exprimées et sont remplacées par les cadhérines N. Ce phénomène va permettre l’augmentation de la motilité cellulaire et donc favoriser le processus d’invasion (Maret et coll., 2010). De plus, les glioblastomes expriment aussi à leur surface une forme immature de N-cadhérine (Pro-NCAM) qui n’interviennent pas dans les mécanismes d’adhésion mais au contraire favoriserait aussi l’invasion des cellules gliales tumorales (Maret et coll., 2010). Très récemment une étude a aussi montré que la cadhérine E pourrait aussi avoir un rôle dans les mécanismes d’invasion dans les tumeurs gliales de haut grade (Lewis-Tuffin et coll., 2010). 1.4.2.2 Prolifération La prolifération des cellules gliales tumorales est en partie due à un dérèglement du contrôle du cycle cellulaire. Il n’y plus de régulation des points de contrôle lors de la division cellulaire. Évidemment cette prolifération est variable selon les régions de la tumeur comme nous le verrons par la suite. Cette différence d’activité mitotique est caractéristique des tumeurs cérébrales de haut grade en comparaison avec les bas grades. 1.4.2.3 Nécrose La grande majorité d’un glioblastome, parfois jusqu’à 80% du bloc tumoral, est représentée par une large zone nécrotique centrale. La présence de nécrose est un indicateur histologique de l’agressivité de la tumeur. En effet, la demande énergétique et métabolique des cellules tumorales excède l’apport au sein de ces régions d’où le développement des ces zones. On retrouve aussi des vaisseaux sanguins présentant des thromboses en périphérie des zones nécrotiques augmentant ainsi le phénomène d’hypoxie (Louis, 2006). La réponse des cellules tumorales à ces phénomènes rend le glioblastome plus agressif. En périphérie de la nécrose, on retrouve des cellules appelées pseudopalissadiques (Figure 9). Issues du cœur de la tumeur, elles ont migré pour quitter la zone nécrotique grâce à la sécrétion de protéases extracellulaires de la matrice (MMP2 et -9). Les cellules pseudopalissadiques vont former le front de migration de la tumeur 17 Figure 9: Présentation de la formation du cœur nécrotique ainsi que des cellules pseudopalissadiques. A) apparition d’une zone hypoxique au centre de la tumeur par manque d’oxygène et de nutriments. B) migration des cellules vers l’extérieur de la zone hypoxique. C) apparition d’une zone nécrotique entourée de cellules pseudopalissadiques (Source: Louis D.N., Annual Review of Pathology, 2006). (Brat, 2004; Rong et coll., 2006). La surexpression par ces cellules de certains facteurs comme l’hypoxia-inductible factor 1α (HIF-1α) ou encore l’interleukine 8 (IL-8) vont favoriser les phénomènes de prolifération cellulaire et d’angiogénèse nécessaire au développement de la tumeur (Rong et coll., 2006). 1.4.2.4 Angiogénèse La vascularisation est très importante dans le glioblastome. Ce type de tumeur est capable de développer des capillaires par migration et prolifération de cellules endothéliales (Bergers et Benjamin, 2003). Ces nouveaux capillaires sanguins tumoraux ont des caractéristiques particulières notamment par le fait qu’ils prolifèrent de façon permanente et par leurs formes anarchiques (Bergers et Benjamin, 2003). On retrouve ces nouveaux vaisseaux en bordure des zones cellulaires pseudopalissadiques et nécrotiques. La nature des vaisseaux est un indicateur de diagnostic histologique puisque dans le cas des glioblastomes, on parle de vaisseaux en glomérules en référence à leurs formes se rapprochant des glomérules rénaux (Brat et Van Meir, 2001). L’hypoxie est considérée comme le principal moteur de l’angiogénèse notamment par l’intermédiaire du facteur transcriptionnel HIF-1α (Pouysségur et coll., 2006). Il a été démontré notamment que HIF-1α contrôle directement l’expression de l’angiopoïétine-2 et du vascular endothélial growth factor (VEGF) qui contrôlent l’angiogénèse (Vajkoczy et coll., 2004; Zagzag et coll., 2000). Certaines mutations génétiques peuvent être à l’origine de l’angiogénèse comme PTEN, P53 et EGFR (Brat et Mapstone, 2003) comme nous le verrons par la suite. 1.4.2.5 Apoptose Les glioblastomes sont caractérisés par une très forte résistance à l’apoptose. Elle est due à des modifications au niveau génomique et moléculaire des cellules tumorales. De plus, il a été démontré que les cellules migrantes ont une résistance accrue à l’apoptose (Giese et coll., 2003). Ces cellules tumorales migrantes sont à la base des problèmes de récidive des patients atteints de glioblastomes. Ces mécanismes de motilité cellulaire sont induits par l’interaction entre les cellules migrantes (liaison intégrine-milieu extracellulaire) et la matrice extracellulaire (Westhoff et Fulda, 2009). En temps normal, un défaut 18 d’interaction entre la cellule à la matrice extracellulaire entraîne une forme spécifique de mort cellulaire appelée l’anoïkose. Cette dernière intervient lorsque la cellule n’adhère plus à la matrice extracellulaire, ce qui déclenche la voie apoptotique intrinsèque. Les cellules gliales tumorales migrantes sont capables de résister à ce type de mort cellulaire notamment au travers des N-cadhérines ou des intégrines qui sont capables d’activer des protéines ou des voies anti-apoptotiques (Chiarugi et Giannoni, 2008). L’augmentation de la résistance à l’apoptose complique très sérieusement les possibilités de traitement et assombri le pronostic pour les patients car à l’heure actuelle la plupart des chimiothérapies présentes sur le marché sont de type pro-apoptotique. 1.4.3 Cellules souches On définit par cellule souche une cellule capable de donner des cellules spécialisées par différenciation cellulaire mais aussi capable de se renouveler quasi à l’infini. On parle très souvent des cellules souches hématopoïétiques qui sont à l’origine de l’ensemble des cellules sanguines. Ce type de cellules est capable de donner un grand nombre d’organes différents (Krause et coll., 2001). Dans le cerveau, il existe différentes zones qui possèdent une population de cellules souches et des cellules progénitrices gliales qui sont capables de donner les astrocytes ou les oligodendrocytes (Figure 10). Ces cellules possèdent des caractéristiques semblables aux cellules tumorales notamment au niveau de la prolifération, de la motilité et de l’expression de certains gènes (Sanai et coll, 2005). Les cellules souches neurales activent différents gènes pro-mitotiques et/ou antiapoptotiques qui sont aussi nécessaires pour l’initiation et la prolifération tumorale (Sanai and coll., 2005). Il a été plus récemment démontré que la différenciation et la division des cellules souches neurales étaient sous le contrôle direct de p53 et PTEN qui sont fréquemment altérés dans les glioblastomes (Zheng et coll., 2008). Dans le cas de ces derniers, une sous population cellulaire a été isolée de différents modèles (lignées cellulaires établies ou tumeurs prélevées chez certains patients) qui expriment spécifiquement des marqueurs de cellules souches (Gilbertson et Rich, 2007; Tabatabai et Weller, 2011) tels que l’antigène de surface CD133, l’intégrine alpha 6 ou encore l’enzyme ALDH1 (aldéhyde déshydrogénase 1). L’intérêt d’identifier ces populations cellulaires se situe au niveau de leur résistance aux agents chimiothérapeutiques et à la 19 Ependymocyte Figure 10: Différenciation et transformation des cellules souches neurales dans un tissu cérébral normal et tumoral. Les cellules souches neurales sont capables de s’autorenouveler et de se différencier pour donner les sous-types cellulaires présents dans le cerveau par l’intermédiaire des cellules progénitrices. Les cellules à l’origine du processus tumoral peuvent être issues de différentes cellules normales et notamment des cellules souches et sont capables de se différencier pour donner des cellules cancéreuses différenciées (Source : Hadjipanayis et Van Meir, Trends in Molecular Medicine, 2009). radiothérapie (Liu et coll., 2006) mais aussi au niveau de leur pouvoir régulateur de l’angiogénèse (Bao et coll., 2006) ce qui constitue actuellement une cible potentielle et prometteuse dans le traitement du glioblastome (Cheng et coll., 2010). 2 Quels sont les mécanismes de résistance à la chimiothérapie connus à ce jour pour les glioblastomes ? 2.1 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose Dans le cas du glioblastome, il existe deux types de populations avec des fonctions et des caractéristiques biologiques et moléculaires différentes (Giese et coll., 2003) : les cellules en prolifération et les cellules invasives. Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons aux cellules migrantes au niveau de leur résistance naturelle à l’apoptose et de leur implication dans le développement des récidives tumorales. La migration des cellules gliales tumorales a été très tôt mise en évidence dans les gliomes notamment par le fait que les premiers patients traités chirurgicalement pour des tumeurs cérébrales subissaient une ablation complète d’un hémisphère cérébral (hémisphérectomie) sans pourtant pouvoir éviter les récidives à distance (Giese et coll., 2003). La migration des cellules gliales tumorales est basée sur la modification de l’interaction entre cellules-cellules et cellules-matrice extracellulaire induite par des modifications de la morphologie cellulaire (Demuth et Berens, 2004) et la sécrétion de protéases qui vont dégrader la matrice extracellulaire (Rao et coll., 2003). Il a été démontré que les intégrines jouaient un rôle essentiel dans les phénomènes de migration cellulaire en général (Hynes, 1992) et au sein des cellules gliales tumorales en particulier (Tarabatai et coll., 2011). De plus, le phénomène de migration est directement lié à la modification de la prolifération des cellules. Pour privilégier la migration, les cellules gliales tumorales migrantes voient leur taux de prolifération diminuer par rapport aux cellules qui constituent le cœur de la tumeur (Giese et coll., 1999). Certaines protéines qui régulent le cycle cellulaire telles que les cyclines A, B et E ont une expression très réduites dans les cellules tumorales gliales migrantes (Mariani et coll., 2001). Mais les principales caractéristiques des cellules tumorales gliales migrantes se situent au niveau moléculaire. Le déséquilibre qui s’opère entre la diminution de la 20 prolifération et l’augmentation de la motilité se traduit aussi par une diminution de la sensibilité à l’apoptose dans les cellules gliales tumorales. Notamment, certains gènes contrôlant l’apoptose et la prolifération sont sous exprimés dans les cellules migrantes comme par exemple les caspases 2, 3, 6, 8 et 9 ainsi que NF-Kappa B (Zhao et coll., 2011). D’autres gènes inhibiteurs de l’apoptose, comme PKC ou Bcl-2, sont surexprimés (Zhao et coll., 2011) (Figure 11). Cette dernière protéine est située dans la membrane mitochondriale et empêche la dimérisation des protéines Bax qui est à l’origine du relargage du cytochrome C dans le cytoplasme induisant l’apoptose de la cellule (Ashkenazi et coll., 2008). 2.2 Les systèmes de détoxification cellulaire Dans les systèmes de détoxification cellulaire, les transporteurs ABC sont les plus connus. Ces derniers sont des pompes membranaires ATP dépendante chargées d’évacuer des cellules les molécules toxiques ou les métabolites au travers de la membrane plasmique. On les retrouve dans de nombreux types cellulaires avec des fonctions très variables qui peuvent aller du transport de cholestérol, de nucléoside ou encore de fer (Dean et coll., 2001). Certaines cellules souches expriment aussi les transporteurs ABC (Zhou et coll. 2001; Bleau et coll., 2009). Les cellules cancéreuses expriment également des transporteurs ABC notamment pour expulser les différentes molécules chimiothérapeutiques contribuant ainsi à leur résistance aux traitements conventionnels (Gottesman et coll., 2002). On parle de multidrogue résistance (MDR) car ces pompes à efflux sont capables d’éliminer plusieurs types d’agents toxiques ( Donnenberg et Donnenberg, 2005). Cette particularité a permis d’identifier des sous populations de cellules cancéreuses qui expriment les transporteurs ABC. Récemment, il a été mis en évidence que les cellules souches cancéreuses sont responsables de la MDR au travers de l’expression des transporteurs ABC (Donnenberg and Donnenberg, 2005). On a pu aussi mettre en évidence la surexpression d’ABCG2 dans la lignée cellulaire de glioblastome U373-MG (Patrawala et coll., 2005). Il a aussi été démontré que la voie de signalisation PI3k/Akt semblait réguler l’activité d’ABCG2 dans la lignée de glioblastome U-87 (Bleau et coll., 2009). A noter qu’il a aussi été 21 Figure 11: Représentation des deux voies majeures d’activation de l’apoptose. La voie intrinsèque est dépendante du gène P53 alors que la voie extrinsèque est indépendante de l’expression de ce gène. La voie extrinsèque nécessite l’activation de récepteur membranaire pour déclencher, par l’intermédiaire des caspases, la cascade de réaction qui mène à l’apoptose. Dans le cas des gliomes, la sous expression de ces caspases limitent l’induction de l’apoptose. Dans le cas de la voie intrinsèque, c’est la surexpression de l’inhibiteur Bcl-2 qui entraîne une induction limitée de l’apoptose (Source: Ashkenazi, Cytokine & Growths factors, 2008). montré que le témozolomide, traitement chimiothérapeutique standard des glioblastomes, n’est pas un substrat de la pompe à efflux ABCG2 (Figure 12) et que l’expression de cette dernière n’induit pas de résistance à cette molécule (Bleau et coll., 2009). Au niveau clinique, en 1998, une étude a été menée sur l’expression d’ABCC1 dans des prélèvements de gliomes avant et après chimiothérapie à base de doxorubicine et vincristine (Abe et coll.,1998). Il apparaît que l’expression de cette protéine est augmentée laissant présager qu’ABCC1 pourrait être impliqué dans des phénomènes de résistance acquise aux agents chimiothérapeutiques. 2.3 Stress du réticulum endoplasmique Le réticulum endoplasmique est un organite cytoplasmique impliqué dans la maturation et le repliement des protéines sécrétées et transmembranaires (Ron et Walter, 2007). Lors de l’exposition à des agents toxiques ou en condition de stress, il s’accumule au sein de cet organite des protéines mal conformées. On parle alors de stress du réticulum endoplasmique. De nombreux facteurs extrinsèques ou intrinsèques à la cellule peuvent induire ce phénomène mais dans le cas où il est enclenché la cellule dispose d’un moyen pour rétablir son équilibre et annihiler les effets de ce phénomène : la réponse UPR (Unfolded Protein Response). Au niveau moléculaire, la protéine chaperonne Grp78/Bip (immunoglobulin- binding protein) va se lier aux protéines mal conformées contenues dans le réticulum en se dissociant de la membrane de l’organite (Tabas et Ron, 2011). En temps normal, Grp78 inhibe d’autres protéines membranaires telles qu’IRE1 ou PERK mais lors de la dissociation de Bip, elles sont activées et transmettent des informations dans le cytosol. Dans le cas de IRE1, la protéine va se dimériser au niveau de la membrane du réticulum et s’autophosphoryler pour devenir active. Une fois fonctionnelle, IRE1 va épisser l’ARNm du gène XBP1 (X-box binding protein-1) qui sera à son tour traduit. XBP1 est un facteur de transcription qui active différents gènes permettant à la cellule de répondre au stress endoplasmique notamment par l’induction de la synthèse de protéines chaperonnes (Ron et Walter, 2007). Une autre voie d’activation l’UPR passe par la protéine PERK qui va s’homodimériser et s’autophosphoryler dans la membrane du réticulum. La cible cytosolique de PERK est la protéine EIF2α qui va être phosphorylée. Il découle de cette activation une diminution de la synthèse protéique, une 22 Figure 12: Régulation de l’expression d’ABCG2 (ATP-binding cassette sub-family G member 2) par la voie de signalisation PI3K/Akt dans les cellules souches de gliomes. Les récepteurs transmembranaires à tyrosine kinase activent la voie de signalisation par l’intermédiaire de la PI3 kinase qui phosphoryle le PIP2 en PIP3 activant ainsi Akt (voir figure 5). Ce dernier va permettre la translocation du récepteur ABCG2 du cytoplasme vers la membrane cytoplasmique (Source : Bleau et coll. Cell Cycle, 2009). activation du facteur de transcription NF-κB et l’inactivation de la protéine P53 (Ma et Hendershot, 2004; Ron et Walter, 2007). Lorsque le stress du réticulum endoplasmique perdure dans le temps, la cellule entre en apoptose par l’activation de la voie intrinsèque. Cette activation passe par l’augmentation de l’expression de la protéine CHOP qui va inhiber la protéine anti-apoptotique bcl-2 (Figure 13). Le taux de protéine GRP78 est suffisamment élevé dans les gliomes pour permettre à la cellule d’éliminer les protéines mal conformées sans pour autant lever l’inhibition des protéines PERK et IRE1 conduisant normalement la cellule en apoptose. Elle fournit aux cellules gliales tumorales un moyen de résister à l’agression des agents chimiothérapeutiques (Pyrko et coll., 2007). 3 Pourquoi le témozolomide offre-t-il un avantage thérapeutique par rapport à toutes les autres formes de chimiothérapies ? 3.1 Alkylation de l’ADN Le témozolomide est un agent alkylant de type imidazotétrazine de seconde génération capable de franchir la barrière hémato-méningée et qui ne nécessite pas de métabolisation hépatique. Il s’agit d’une pro-drogue qui ne nécessite pas d’intervention enzymatique pour être transformée en molécule active (Friedman et coll., 2000). Le mécanisme d’action principal du témozolomide est une réaction d’alkylation de l’ADN par ajout d’un groupement méthyle sur les positions O6, N3 et N7 des guanines et sur la position O4 des thymines (Kaina et coll., 2007). L’alkylation des positions va entraîner des mésappariements au sein de la double hélice de l’ADN pouvant à leur tour entraîner l’arrêt de la division cellulaire ou la mort par apoptose. En ce qui concerne les méthylations induites sur les positions N3, N7 et O3, des systèmes de réparation de l’ADN ubiquitaire notamment le BER (Base Excision Repair) et l’ABH (AlkB Homologous Protein) vont éliminer les groupements qui se sont fixés sur ces positions et éviter à la cellule l’accumulation de mutations dans son ADN (Kaina et coll., 2007). C’est la position O6 qui provoque le plus de mésappariements à l’ADN malgré le fait qu’elle ne représente que 5% des mutations induites par le témozolomide (Friedman et coll.,2000). 23 BIP BIP Figure 13: Schéma récapitulatif de la réponse UPR au sein des cellules. La protéine BIP (ou Grp78), qui lie les protéines mal conformées, est le point initial de l’activation de la réponse qui au travers des différents intermédiaires (IRE1, PERK) va conduire à l’activation de facteurs permettant de limiter l’impact du stress du réticulum endoplasmique sur la cellule. En cas de stress prolongé, la cellule va rentrer en apoptose par l’activation de la voie intrinsèque (Source : Ma et Hendershot, Nature Reviews Cancer, 2004). Comme nous l’avons décrit précédemment, l’enzyme de réparation MGMT excise les groupements méthyles de la position O6 de la guanine (Figure 14). L’expression de cette enzyme est variable suivant les personnes en fonction de la méthylation ou non du promoteur du gène (Watts et coll., 1997; Hegi et coll., 2008). On comprend qu’un déficit de cette enzyme va entraîner l’accumulation de mutations induisant la mort cellulaire. Lors de la transcription, le système MMR (Mismatch repair) va contrôler si l’ADN ne présente pas d’anomalies et si la cellule peut se diviser. Dans le cas où les mésappariements sont trop nombreux et qu’il n’y a plus de possibilité de réparation, la cellule va entrer en apoptose en surexprimant la protéine p53 qui va activer les caspases 8 et 3 (Kaina et coll., 2007). Plus récemment, il a été démontré que l’expression même de MGMT ne suffisait pas pour réparer l’ADN (Figure 6). En effet, lorsque l’enzyme MGMT transfère le groupement méthyle de la base azotée vers sa poche réactionnelle, elle devient inutile et est détruite par la cellule (Gerson, 2004). Lors d’un traitement répété au témozolomide, l’expression de la protéine MGMT diminue et le système de réparation s’affaiblit. Il devient donc impossible à la cellule cancéreuse de réparer son ADN. Elle ne peut plus se diviser et reste bloquée dans le stade G2/M du cycle cellulaire et finit par entrer en apoptose. 3.2 Induction de processus soutenus d’autophagie suivis d’apoptose tardive L’autophagie est un mécanisme très conservé au cours de l’évolution et à travers les espèces. En conditions normales, les cellules eucaryotes utilisent ce processus pour se débarrasser des éléments mal conformés tels que les protéines ou d’autres éléments qui pourraient devenir toxiques pour la cellule (Rabinowitz et White, 2010). En cas de stress induit par des agents chimiques ou par une privation en nutriments essentiels à la cellule, l’autophagie devient alors un mécanisme de défense et de survie de la cellule. Des organites complets peuvent être ainsi digérés et fournir à la cellule les éléments énergétiques nécessaires à sa survie (Kondo et coll., 2005). Le processus d’autophagie se fait en plusieurs étapes impliquant un grand nombre de voies de signalisation. Le principe repose sur la formation d’un autophagosome exprimant sur sa surface la protéine LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) capable d’internaliser des organites 24 Figure 14: Représentation des différents sites de l’ADN sur lesquels des agents chimiothérapeutiques peuvent induire des modifications entraînant des mésappariements. Pour chaque position, il existe des systèmes de réparation spécifiques qui sont associés : les systèmes BER (Base Excision Repair), ABH (AlkB Homologous Protein) et MGMT (O6-méthylguanine DNA méthyltransférase). Dans le cas du témozolomide, les positions O6, N3 et N7 des guanines et O4 des thymines sont alkylées (Source : Kaina et coll., DNA Repair, 2007). cellulaires (mitochondries, appareils de Golgi…) qui vont être dégradés par des hydrolases acides (Kanzawa et coll., 2004) et ainsi fournir l’énergie nécessaire à la survie de la cellule (Figure 15). Plusieurs voies de régulation, aussi bien positives que négatives, interviennent dans l’induction de l’autophagie cellulaire comme la voie PI3K/Akt ou encore PTEN (Kondo et coll., 2005) que nous avons décrits précédemment. Au niveau des cellules gliales tumorales, il a été démontré que le témozolomide induisait de l’autophagie dans la lignée cellulaire de glioblastome U373-MG (Kanzawa et coll., 2004) notamment par l’augmentation de l’expression de la protéine LC3. Plus récemment, ce phénomène a été confirmé et complété par le fait que l’induction prolongée (supérieure à 72 heures) d’autophagie sur la lignée cancéreuse de gliome U251 conduisait les cellules en mort cellulaire par apoptose tardive (Roos et coll., 2007). 3.3 Effet anti-angiogénique Hormis les effets d’alkylation de l’ADN et d’induction de l’autophagie, il a été démontré que le témozolomide induisait une diminution de l’expression du facteur de transcription HIF1α (Mathieu et coll., 2008). Comme nous l’avons expliqué précédemment, ce facteur de transcription est important dans l’angiogénèse (Pouysségur et coll., 2006) puisqu’il régule un bon nombre de gènes impliqués dans ce processus notamment le VEGF A et l’angiopoïétine 2 (Vajkoczy et coll., 2004; Zagzag et coll., 2000). Le traitement au témozolomide, sur différentes lignées de gliomes (U87, T98G, U373-MG, HS683 et U251), à une dose de 100 µM durant 5 jours à raison de 7 heures par jour induit une diminution de l’expression de HIF1α (Mathieu et coll., 2008). Ces résultats in vitro ont été confirmés in vivo notamment en mesurant la surface des vaisseaux sanguins en immunohistologie au sein de xénogreffes de gliomes humains prélevées sur des animaux immunodéprimés traités ou non au témozolomide. Les modèles de gliomes implantés chez ces animaux sont les lignées HS683 et U373-MG. Après traitement, la surface des vaisseaux a significativement diminuée dans les deux modèles confirmant l’activité anti-angiogénique du témozolomide (Mathieu et coll., 2008). De plus dans cet article, il a été démontré que les cellules endothéliales étaient aussi la cible du témozolomide puisqu’il induisait une diminution de la croissance de ces dernières. Des nombreux essais sont aussi en cours dans le traitement des glioblastomes 25 Figure 15: Mécanismes d’autophagie au sein des cellules en réaction à différents stimuli externes. La première étape est la synthèse d’une nouvelle membrane sur laquelle va venir se fixer la protéine LC-3. Cette membrane va s’étendre pour séquestrer différents organites de la cellule et se refermer pour former l’autophagosome. Ce dernier va fusionner avec un lysosome pour donner un autolysosome. Les enzymes lysosomiales vont dégrader les organites contenus dans cette vacuole pour libérer de l’énergie pour permettre à la cellule de survivre au stress induit par l’autophagie (Source : Kondo et coll., Nature Cancer Reviews cancer, 2005). par combinaison de témozolomide et d’un agent anti-angiogénique, l’avastin (comme nous le détaillons ci-après), pour augmenter l’efficacité de la chimiothérapie. 3.4 Conclusion Au final, en comparaison avec d’autres agents alkylants disponibles sur le marché, le témozolomide se démarque par ses capacités à induire de l’autophagie et à limiter les phénomènes d’angiogénèse. Les chimiothérapies de seconde ligne que nous avons décrites précédemment se limitent aux phénomènes d’alkylation de l’ADN. Il reste donc à ce jour la molécule la plus efficace pour combattre le glioblastome. 4 Quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires permettant aux cellules gliales tumorales de résister au témozolomide ? 4.1 Sur le plan cellulaire 4.1.1 Le métabolisme des cellules tumorales gliales Dans les années 30, Otto Warburg a démontré que des cellules cancéreuses hépatiques privilégiaient la voie glycolytique par rapport aux cellules normales de foie et ce malgré la présence suffisante d’oxygène pour cataboliser en totalité le glucose (Warburg, 1956). Ce phénomène a été dénommé l’effet Warburg. En détail, les cellules cancéreuses semblent changer leur métabolisme en passant de la phosphorylation oxydative, très rentable en ATP (36 moles d’ATP/ mole de glucose) à la glycolyse aérobie beaucoup moins rentable énergétiquement (4 moles d’ATP/ mole de glucose) (Vander Heiden et coll., 2009). Otto Warburg a expliqué ce phénomène par le fait que les cellules devaient certainement présenter des déficiences au niveau des mitochondries les empêchant de réaliser le cycle de Krebs. Les cellules cancéreuses auraient donc tendance à privilégier la glycolyse par défaut et dans le but de maintenir leur besoin énergétique nécessaire à leur prolifération (Warburg, 1956). Plus récemment, cette hypothèse a été infirmée notamment par la démonstration que les mitochondries des cellules cancéreuses étaient fonctionnelles et donc que ce changement métabolique aurait une autre origine 26 (Fantin et coll., 2006; Kim et coll., 2006). De plus, en obligeant les cellules cancéreuses à réutiliser la phosphorylation oxydative via l’inhibition de la lactate déshydrogénase, elles perdent de leur potentiel tumoral notamment en condition hypoxique (Fantin et coll., 2006). Une des raisons pour laquelle les cellules cancéreuses privilégient la glycolyse peut s’expliquer par l’avantage que leur confère ce type de métabolisme par rapport aux cellules environnantes (Gatenby et Gillies, 2004). En effet, la glycolyse permet aux cellules cancéreuses de résister au phénomène d’hypoxie intermittente à laquelle elles peuvent être soumises ainsi qu’à l’acidification de l’environnement tumoral fatal pour les cellules normales entourant les cellules tumorales (Gatenby et Gillies, 2004). Ce dernier élément est du au relargage massif de lactate avec des ions H+, issus de la transformation du pyruvate, dans le milieu interstitiel par l’intermédiaire des MCT (Mono-Carboxylate Transporter) (Gatenby et Gillies, 2004; Denko, 2008). L’hypoxie serait une des principales raisons de ce changement de métabolisme dans les cellules cancéreuses. Grâce au facteur de transcription HIF1α, de nombreux gènes sont transcrits et vont orienter le métabolisme des cellules tumorales vers la voie glycolytique (Figure 16). Parmi ces gènes, on peut trouver les transporteurs du glucose (GLUT 1 et 3) chargés de faire entrer suffisamment de glucose dans la cellule, la lactate déshydrogénase (LDH) qui transforme le pyruvate en lactate et la pyruvate déshydrogénase kinase 1 (PDK1) qui va inhiber la pyruvate déshydrogénase première enzyme réactionnelle du cycle des acides tricarboxyliques (Dang et Semenza, 1999). Il a été aussi démontré que certains prooncogènes tel que Ras (Blum et coll., 2005) ou la voie de signalisation PI3K/Akt peuvent aussi jouer un rôle dans l’activation de la glycolyse (Zhong et al., 2000). Au final, le changement métabolique confère aux cellules cancéreuses un avantage en terme de prolifération mais aussi au niveau de la résistance aux agents chimiothérapeutiques notamment au cisplatine, au paclitaxel ( Lu et coll., 2008) ou encore à la doxorubicine et à la camptothécine (Derdak et coll., 2008). Au niveau des glioblastomes, il a été démontré que l’inhibition de Ras par l’acide trans-farnesylthiosalicylique induisait une diminution de la stabilité de HIF1α et une diminution de l’expression d’enzymes clés de la glycolyse (Blum et coll. 2005). Dans le même temps, la prolifération cellulaire est stoppée entraînant la mort des cellules gliales tumorales. Il a été aussi démontré une hétérogénéité du type de métabolisme dans 27 Figure 16: Représentation de la coopération entre les différentes cellules tumorales en fonction de leur métabolisme. Les cellules situées en condition hypoxique vont exprimer le facteur de transcription HIF-1α. Ce dernier va induire l’expression de différents gènes notamment le transporteur glucose 1 (Glut1) et le transporteur du lactate (MCT4). Le métabolisme de ces cellules va être modifié en privilégiant la glycolyse aérobie par la conversion du glucose en lactate. Les cellules tumorales en normoxie ont, au contraire, un niveau d’expression faible d’HIF-1α. Par gradient de concentration et par l’expression du transporteur MCT1, ces cellules sont capables de recycler le lactate comme substrat énergétique. Au final, s’instaure une coopération énergétique entre les cellules tumorales hypoxiques et normoxiques (Source : Semenza, The Journal of Clinical Investigations, 2008). diverses lignées cellulaires gliales : certaines d’entre elles utilisent la glycolyse comme source d’énergie alors que d’autres utilisent la phosphorylation oxydative (Griguer et coll.,2005). De plus, il a été mis en évidence que les cellules de glioblastomes sont capables de métaboliser la glutamine pour synthétiser du NAPDH nécessaire à la synthèse des acides gras. La glutamine sera transformée en lactate qui sera exporté vers le milieu extracellulaire (DeBerardinis et coll., 2007). 4.1.2 La pompe à efflux ABCB1 (MDR1) Comme nous l’avons précédemment énoncé, les pompes à efflux peuvent être à l’origine de chimiorésistance dans les glioblastomes. Nous allons nous intéresser plus particulièrement au produit du gène MDR1 qui pourrait jouer un rôle dans la résistance au témozolomide. Il a en effet été démontré depuis une vingtaine d’années la fonction et le rôle de la glycoprotéine P (PGP) qui est issue du gène MDR1. Il s’agit d’une protéine possédant 12 domaines transmembranaires dont l’activité est ATP dépendante. Elle est exprimée dans plusieurs types de tissus ou d’organes tels que l’intestin, le foie, les reins ou encore la barrière hémato-encéphalique (Ambudkar et coll., 1999). Sa principale fonction est associée à la protection des cellules contre les agents chimiques nocifs. Les cellules cancéreuses utilisent ce système pour éliminer les agents chimiothérapeutiques notamment le taxol, la camptothécine ou encore le paclitaxel (Figure17). L’expression de la protéine PGP est ainsi souvent associée au mécanisme de résistance dans le traitement du cancer. Dans le cas des glioblastomes, il a été démontré que la tumeur exprime la protéine PGP au même taux que le tissu cérébral sain (von Bossanyi et coll., 1997; Demeule et coll., 2001). La protéine PGP est exprimée dans la majorité des échantillons de glioblastome alors que dans les gliomes de bas grade cette expression est plus hétérogène (von Bossanyi et coll., 1997). En 2009, Schaich et ses collaborateurs démontrent que l’efficacité du témozolomide dans le traitement des glioblastomes est liée à la présence d’une mutation sur le gène rendant la protéine moins fonctionnelle (Schaich et coll., 2009). Au niveau clinique, les patients, dont le gène MDR1 est muté, ont une survie accrue par rapport aux patients présentant un profil génétique standard pour ce même gène. La présence ou non de cette mutation devient donc un facteur prédictif de la réponse à la chimiothérapie au témozolomide. 28 Chemotherapeutic Agents Figure 17: Structure et mode de fonctionnement de la glycoprotéine P. Les molécules chimiothérapeutiques passent la membrane plasmique puis sont expulsées de la cellule par la glycoprotéine-P. Ce mécanisme de détoxification est un mécanisme ATPdépendant puisque pour une molécule évacuée de la cellule une molécule d’ATP est consommée (Source: Lucchese B., Nature reviews nephrology, 2009). 4.1.3 L’hypoxie 4.1.3.1 Hypoxie et cellules souches L’hypoxie a été caractérisée comme un mécanisme de résistance à la chimiothérapie, à la radiothérapie et est aussi un facteur de mauvais pronostic dans de nombreux types de cancer. Dans les glioblastomes, l’hypoxie, comme nous l’avons expliqué précédemment, aurait un rôle dans la modification du métabolisme des cellules gliales tumorales. Mais elle ne se limite pas uniquement à ce phénomène puisqu’elle serait aussi impliquée dans les mécanismes de chimiorésistance (Merighi et coll., 2007) et de radiorésistance (Eyler et Rich, 2008). En 2009, Pistollato et son équipe ont mis en évidence des différences d’expression de marqueurs de résistance dans des glioblastomes prélevés sur des patients en fonction de la localisation dans la tumeur (Pistollato et coll., 2010). Les prélèvements sont répartis en fonction de leur localisation dans la tumeur et de leur distance du cœur anoxique : le cœur qui est une zone fortement nécrosée et peu vascularisée, la partie intermédiaire et la partie périphérique qui est la plus vascularisée. A partir de ces prélèvements, des primocultures sont établies et utilisées pour caractériser l’expression en immunofluorescence de différents marqueurs tels que des marqueurs de différenciation cellulaire, d’hypoxie ou de résistance. Il ressort de cette étude que les cellules du cœur tumoral expriment très fortement les marqueurs de cellules indifférenciées telles que la nestine ou la protéine CD133 à l’inverse des cellules périphériques qui expriment fortement les marqueurs de différenciation tel que la protéine GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) ou de vascularisation tel que la protéine CD34. La localisation de la zone hypoxique est confirmée par l’expression très forte de HIF1α, de l’anhydrase carbonique IX (CAIX) ou encore de GLUT1 dans la zone centrale par rapport aux zones plus périphériques. Pour caractériser la résistance au témozolomide en fonction de la localisation des cellules, l’expression de l’enzyme MGMT a été analysée et il en ressort que les cellules les plus indifférenciées, donc les plus centrales expriment plus fortement l’enzyme de réparation de l’ADN (Pistollato et coll., 2010). Par exposition des cellules à une concentration de 500 µM de témozolomide durant 48 heures, il apparait que le traitement n’induit pas d’apoptose sur les cellules du cœur tumoral à l’inverse des cellules périphériques qui expriment les marqueurs d’entrée en apoptose. En revanche, l’ajout d’un inhibiteur de l’enzyme MGMT, la molécule O(6)-benzylguanine, permet de 29 rétablir la sensibilité au témozolomide à ces mêmes concentrations dans les cellules tumorales peuplant le cœur (Pistollato et coll., 2010). 4.1.3.2 Hypoxie et résistance à la chimiothérapie Il est clair que les agents chimiothérapeutiques ne peuvent pas atteindre les cellules tumorales s’il n’y a de réseau sanguin normal pour acheminer les molécules (Pouysségur et coll., 2006). Les zones hypoxiques sont dépourvues de vaisseaux sanguins ce qui réduit leur exposition au traitement chimiothérapeutique. Il a été démontré que l’utilisation d’agents antiangiogéniques contribuant à normaliser le réseau sanguin, devenu anarchique durant le processus de cancérogénèse, augmente l’efficacité de certains traitements chimiothérapeutiques (Tong et coll., 2004). De plus, en conditions hypoxiques, les cellules gliales tumorales vont développer des mécanismes de résistance à la chimiothérapie en surexprimant ou activant certaines protéines notamment Bcl-2 (Merighi et coll., 2007). Les conditions hypoxiques vont favoriser la phosphorylation de la protéine Bcl-2 et ainsi inhiber d’autres protéines pro-apoptotiques telles que Bax et Bak (Merighi et coll., 2007). 4.2 Sur le plan moléculaire Sur le plan moléculaire, plusieurs cibles peuvent être envisagées notamment en tenant compte des différentes caractéristiques des glioblastomes que nous avons décrites précédemment. 4.2.1 MGMT L’enzyme MGMT joue un rôle prépondérant dans la réponse des patients au témozolomide. Son activité limite l’action de l’agent chimiothérapeutique et induit une diminution de la survie pour les patients dont le promoteur du gène n’est pas méthylé (Hegi et coll., 2008). Des tests préliminaires ont été menés en combinant un inhibiteur de la MGMT, le O6-benzylguanine, et le témozolomide pour augmenter son activité sur des cellules tumorales (Koch et coll., 2007). Le traitement direct intra-tumoral a été très bien toléré par les patients. Une première étude clinique de phase II a été menée en combinant O6-benzylguanine et témozolomide sur des patients en récidive atteints de glioblastome ou astrocytome anaplastique (Quinn et coll., 2009). Les résultats n’ont pas été concluants 30 pour les patients atteints de glioblastomes et ont montrés un léger effet pour les patients atteints d’astrocytome anaplastique. De plus, il se pose un problème plus important dans la mise en place de traitement visant à inhiber l’enzyme MGMT. En effet, il s’agit d’une enzyme de réparation de l’ADN présente dans toutes les cellules. Son rôle, comme nous l’avons vu précédemment, est de prévenir et de réparer les mésappariements au sein de l’ADN. En cas d’inhibition de ce système de réparation, les cellules non tumorales s’exposent à ne plus pouvoir réparer certaines erreurs présentent dans leur code génétique pouvant conduire à un processus de cancérogénèse (Kaina et coll., 2007). 4.2.2 HIF1α α L’hypoxie est un inducteur d’un très grand nombre de modifications moléculaires au sein des cellules cancéreuses notamment par l’intermédiaire du facteur de transcription HIF1α. Nous avons vu précédemment que les conditions hypoxiques induisent une résistance à la chimiothérapie (Merighi et coll., 2007), de même que le phénomène de « switch métabolique » (effet Warburg) (Vander Heiden et coll., 2009) ou encore l’expression de marqueurs de cellules souches dans les cellules tumorales (Pistollato et coll., 2010). Au cœur de chacun de ces phénomènes, on retrouve le facteur de transcription HIF1α comme régulateur des différents gènes impliqués dans ces mécanismes (Semenza, 2000). Depuis peu, des travaux sont publiés sur des molécules inhibant ce facteur de transcription. Des travaux sur une stratégie antisens utilisant des siRNA a été mise au point et les premiers résultats in vitro ouvrent la voie à une introduction en phase I clinique (Greenberger et coll., 2008). Dans le même temps, Semenza et son équipe ont testé le potentiel d’inhibition d’HIF1α de plus de 3000 drogues en phase clinique (Zhang et coll., 2008). Sur les vingt molécules les plus efficaces, onze appartiennent à la famille des stéroïdes cardiotoniques tels que la digoxine ou l’ouabaïne. La digoxine permet de limiter la croissance tumorale et la néovascularisation en inhibant l’expression d’HIF1α et des gènes qu’elle contrôle (Yoshida et coll., 2010; Zhang et coll., 2008). Cette découverte permet d’ouvrir une nouvelle voie d’application pour ces molécules jusqu’ici cantonnées aux maladies cardiaques. 31 Toutes ces cibles ou ces mécanismes de résistance permettent aux cellules gliales tumorales de résister à bon nombre de molécules chimiothérapeutiques déjà sur le marché. A l’heure actuelle, seul le témozolomide a permis de prolonger significativement la survie des patients atteints de glioblastome. D’autres molécules sont actuellement en développement clinique ou sont arrivées récemment sur le marché pour, en combinaison ou non avec le témozolomide, augmenter l’espérance de vie des patients. Ces nouveaux traitements ciblent des mécanismes moléculaires surexprimés ou spécifiques des cellules gliales tumorales. 5 Quelles sont les approches thérapeutiques envisagées actuellement pour combattre les gliomes résistants au témozolomide? 5.1 Le cilengitide Le cilengitide est un tripeptide cyclique composé d’arginine, de glycine et d’acide aspartique (RGD) et a été développé par la société Merck au début des années 2000 (Figure 18). A l’origine, les premières tumeurs ciblées par ce nouveau traitement étaient les cancers du sein et du poumon (Burke et coll., 2002; Albert et coll., 2006). Les cibles moléculaires du cilengitide sont les intégrines et plus précisément les intégrines αvβ3 et αvβ5 pour la capacité qu’ont ces protéines de fixer et d’interagir avec les séquences RGD. Il a été démontré que ces intégrines jouaient un rôle prépondérant dans les mécanismes de migration et d’invasion des cellules tumorales par coopération avec la MMP-2 (Matrix Metalloproteinase 2) (Brooks et coll., 1996). De plus, l’intégrine αvβ3 est exprimée dans les cellules endothéliales et son expression est directement liée au processus d’angiogénèse (Brooks et coll., 1994). Tous ces facteurs font de l’intégrine αvβ3 une cible thérapeutique intéressante dans le traitement du cancer. L’idée d’utiliser le cilengitide comme traitement concomitant au témozolomide pour les patients atteints de glioblastome a été proposée par Stupp et son équipe. Les glioblastomes sont des tumeurs hautement vascularisées et elles surexpriment l’intégrine αvβ3 (Gladson et Cheresh, 1991). Une première étude clinique randomisée de phase II utilisant le cilengitide comme unique traitement sur une cohorte de 81 patients atteints d’un glioblastome a montré des effets limités (Reardon et coll., 2008). Deux doses ont été 32 Dasatinib Cilengitide Erlotinib Figure 18: Structure des différentes molécules en cours de développement dans le traitement des glioblastomes. Le cilengitide cible certaines intégrines surexprimées dans les cellules tumorales (Brooks et coll., 1996). L’erlotinib est un inhibiteur du récepteur EGFR (Heimberger et coll., 2005) et enfin le dasatinib est un inhibiteur de la tyrosine kinase. testées (500 et 2 000 mg par jour) et seul la dose de 2000 mg par jour a montré des effets sur les patients atteints d’une tumeur. La conclusion de cette étude conseillait l’utilisation du cilengitide comme traitement combiné au témozolomide pour en améliorer son activité. En 2010, Stupp et son équipe, en association avec d’autres équipes internationales, ont mené une étude clinique sur des patients atteints de glioblastome en combinant le traitement standard, comme nous l’avons précédemment décrit (Stupp et coll., 2009), par l’ajout de cilengitide deux fois par semaine à des doses de 500 mg par voie intraveineuse (Stupp et al., 2010). Le résultat de cette étude sur 50 patients a montré deux types de résultat en fonction du statut MGMT des patients. En effet, les patients dont le promoteur du gène MGMT est méthylé, ne voient pas d’amélioration de la survie par rapport aux patients dont le promoteur n’est pas méthylé. Ce résultat peut paraître paradoxal puisqu’en théorie la méthylation du promoteur est un facteur de bonne réponse au traitement chimiothérapeutique. De plus, dans cette étude, il n’y pas de groupe contrôle traité avec le traitement standard (radiothérapie + témozolomide) pour comparer les résultats obtenus avec le traitement concomitant au cilengitide. La comparaison s’effectue avec les courbes de survie obtenues en 2009 par l’équipe de Stupp publiées dans Lancet Oncology. Un autre facteur remet en cause cette étude : il semblerait que la dose de cilengitide utilisée (500 mg) ne soit pas optimisée pour obtenir un bénéfice thérapeutique et que la dose optimale pour obtenir une meilleure réponse soit de 2000 mg. 5.2 La chlorotoxine La chlorotoxine est une toxine extraite du venin de scorpion géant du désert d’Israël, le Leiurus quinquestriatus, capable de bloquer de façon réversible les canaux chlore dans les cellules (Debin, 1991). Le mécanisme d’action de la chlorotoxine n’est pas une interaction directe avec les canaux ClC et plus précisément ClC-3, mais il semblerait qu’elle interagisse avec la protéine MMP-2 (métalloprotéinase 2) exprimée à la surface des cellules cérébrales. Cette interaction provoque l’internalisation du complexe ainsi que de ClC-3 qui se trouve à proximité de MMP-2 le rendant inactif pour les flux de chlore à travers la membrane. En effet, nous avons vu précédemment que le changement de morphologie des cellules tumorales, par la modification des volumes 33 d’eau intracellulaire, permet aux cellules de mieux migrer au sein du parenchyme cérébral (Soroceanu, Manning et Sontheimer, 1999). Cette molécule est un peptide de 36 acides aminés obtenus par synthèse et capable de passer la barrière hémato-encéphalique ce qui en fait un candidat potentiel pour le traitement des tumeurs cérébrales. Après la découverte de cette molécule, il a été démontré que dans les gliomes, les flux de chlore spécifique étaient très importants et que ces mouvements sont directement corrélés avec le grade de malignité des tumeurs cérébrales (Ullrich et coll., 1998; Olsen et coll., 2003). Puis peu de temps après, la chlorotoxine a démontré une très grande capacité d’inhibition de ces flux chloriques au sein des cellules gliales tumorales (Soroceanu et coll., 1998). Le blocage de ces flux de chlore qui se font par des canaux chlore (ClC) inhibe les mécanismes d’invasion et de migration des cellules gliales tumorales. In vitro, la chlorotoxine inhibe la migration des cellules gliales (Soroceanu et al. 1999) et en in vivo le peptide va préférentiellement s’accumuler au sein des tumeurs cérébrales greffées sur des souris (Soroceanu et coll., 1998). Tous ces facteurs ont permis de lancer des études cliniques sur l’utilisation de la chlorotoxine comme traitement des gliomes de haut grade. En 2005, Hockaday et son équipe radiomarque la chlorotoxine et montre qu’elle s’accumule bien au sein de tumeurs cérébrales et non au sein du tissu cérébral sain (Hockaday et coll., 2005). Lors de la première phase clinique, il a été confirmé que la chlorotoxine est bien spécifique du tissu glial tumoral et que les effets secondaires associés à son administration sont faibles (Mamelak et coll., 2006). Les doses administrées étaient de 0,25, 0,5 et 1 mg en injection unique. Une étude phase II a été lancée en 2005 par la société Transmolecular suite à cette première étude pour évaluer le potentiel anticancéreux de la chlorotoxine en injections répétées combinées à la radiothérapie. A l’heure actuelle, aucun résultat n’a été publié sur l’efficacité de la chlorotoxine en phase II clinique. 5.3 L’avastin L’avastin ou aussi appelé bévacizumab est un anticorps recombinant monoclonal spécifique de VEGF développé par Genetech et Roche (Figure 19). Il est le premier inhibiteur d’angiogénèse disponible sur le marché. Plusieurs études cliniques ont été menées sur différents types de tumeurs pour évaluer l’efficacité de ce traitement. Dans le 34 Figure 19: Mécanisme d’action du bévacizumab (Avastin). L’anticorps recombinant va fixer le facteur VEGF et l’empêcher d’aller se fixer sur des récepteurs membranaires, VEGFR1 et 2. Une fois activé, ces deux récepteurs sont responsables d’une cascade d’activation dont l’augmentation de la prolifération, de la migration cellulaire et de l’angiogénèse par l’intermédiaire du récepteur VEGF1. Et dans le cas de l’activation du récepteur VEGF2, d’autres mécanismes moléculaires sont activés dont la surexpression de la métalloprotéase MMP-9 (Source : Mushin et coll., Nature Reviews Drugs Discovery, 2004). cas du glioblastome, qui surexprime VEGF, les études cliniques menées ont tenté d’utiliser cette molécule au sein de trois protocoles distincts : l’association avec un inhibiteur de topoisomérase de type I l’irinotécan, la combinaison avec le traitement standard témozolomide-radiothérapie et enfin en traitement de seconde ligne lors de récidives tumorales. Les premiers tests ont été menés avec la combinaison irinotécanavastin et publiés en 2007. Trente-cinq patients, présentant une récidive tumorale après traitement standard, ont reçu la combinaison à raison de 6 cycles (administration tous les 21 jours d’avastin à 15 mg/kg et irinotécan aux jours 1, 8, 21 et 29). La médiane de survie des patients traités est de 42 semaines (Vredenburgh et coll., 2007). L’étude clinique conclue que la combinaison avastin-irnotécan peut être recommandée pour les cas de récidive dans les glioblastomes et la toxicité du traitement est assez forte mais acceptable au regard du pronostique faible des patients en état de récidive. En 2008, une autre étude clinique de phase II combine le bévacizumab et le traitement standard chez 10 patients ayant été diagnostiqués pour un glioblastome (Lai et coll., 2008). Le but de cette étude est d’appliquer le traitement standard (témozolomide et radiothérapie) dans les mêmes doses administrées normalement et d’insérer un traitement au bévacizumab à raison de 10mg/kg en intraveineuse toutes les deux semaines. Les effets toxiques, notamment hypertension et protéine dans les urines, d’un traitement répété à l’avastin se font plus importants que dans la première étude clinique. Les auteurs recommandent une diminution de la dose d’avastin administrée dans un premier temps et de décaler l’utilisation de l’anticorps pour les traitements de seconde ligne. Sur l’ensemble des études cliniques disponibles actuellement, aucune ne comporte une étude comparative démontrant une réelle augmentation de la survie des patients traités avec l’avastin seul ou en combinaison avec d’autres agents chimiothérapeutiques tels que le témozolomide ou l’irinotécan. Toutes les études sont non comparatives et limitent donc leur impact et la puissance de ces études. Pour preuve, l’agence européenne du médicament a rejeté l’utilisation de l’avastin dans le traitement des glioblastomes récurrents car aucune étude ne démontre, en comparaison avec les chimiothérapies de seconde ligne telles que les nitroso-urées, l’avantage thérapeutique qu’il procure. D’autres études de phase III sont en cours sur des patients nouvellement diagnostiqués 35 5.4 L’erlotinib L’erlotinib est un inhibiteur du récepteur EGFR (Figure 18) qui est souvent surexprimé dans les glioblastomes (Heimberger et coll., 2005). La surexpression de ce récepteur dans les glioblastomes entraîne une augmentation de la croissance, de l’invasion et de la migration des cellules gliales tumorales (Lund-johansen et coll., 1990) et rend les tumeurs résistantes à la radiothérapie (Barker et coll., 2001). De plus, il a été démontré que la surexpression de ce récepteur était un facteur de mauvais pronostic pour le patient (Shinojima et coll., 2003; Heimberger et coll., 2005). L’erlotinib a été développé en partenariat par les laboratoires Roche et Genentech et il est utilisé comme traitement dans les cancers du poumon non à petites cellules et les cancers du pancréas en combinaison avec la gemcitabine. Des études cliniques sont actuellement menées pour déterminer le bénéfice thérapeutique qu’apporterait l’erlotinib, seul ou en combinaison, dans le traitement des glioblastomes. En 2010, Raizer et ses collaborateurs publient les résultats d’une étude clinique menée sur 96 patients atteints de gliomes de grade III et de glioblastomes traités avec de l’erlotinib. Pour les 43 patients atteints de glioblastome, le protocole consistait en une prise quotidienne de 150 mg par jour durant six semaines en complément d’une radiothérapie. Les résultats de l’étude montrent un effet très limité sur la survie des patients et les auteurs concluent sur l’utilité d’associer l’erlotinib à d’autres molécules anticancéreuses (Raizer et coll., 2010). D’autres études cliniques de phase II ont combiné l’erlotinib et le témozolomide afin d’en augmenter l’efficacité. En 2009, Peereboom et ses collègues administrent l’erlotinib en dose croissante, de 50 mg par jour jusqu’à 150 mg, en même temps que le traitement standard décrit par Stupp et ses collègues en 2005. Vingt-sept patients atteints d’un glioblastome sont intégrés à l’étude. Les conclusions de cette étude montrent une inefficacité du traitement combiné sur l’amélioration de la survie par rapport à un groupe contrôle historique. De plus, la toxicité qui découle de cette association traitement standard-erlotinib est très importante et inacceptable pour la poursuite d’un tel protocole (Peereboom et coll., 2010). En 2009, Prados et ses collaborateurs appliquent le même protocole que Peereboom et son équipe, à savoir le traitement concomitant erlotinib et témozolomide-radiothérapie. Soixante-cinq patients atteints de glioblastome et de gliosarcome (tumeur d’origine histologique mixte : gliale paroi des manchons vasculaires) ont intégré cette étude. Le protocole reprenait celui de Stupp et coll. décrit en 2005 et consistait à ajouter l’erlotinib à des doses 36 quotidiennes de 100 à 300 mg. Ces doses ont été fixées sur base d’une étude clinique de toxicité publiée en 2006. Les résultats de cette étude montrent une médiane de survie de l’ordre de 19 mois par rapport à un groupe contrôle tiré de deux études cliniques menées en 2005 et 2006 où la médiane de survie n’est que de 14 mois (Prados et coll., 2009). La toxicité semble acceptable malgré les doses administrées. Au final, l’efficacité de l’erlotinib est encore à démontrer et surtout son utilisation ainsi que sa toxicité et les effets secondaires associés. De plus, la présence ou non de mutation sur le récepteur EGF pourrait influer la réponse à l’erlotinib (Lee et coll., 2006). 5.5 Autres types de molécules D’autres molécules sont actuellement en développement dans le traitement des glioblastomes. Plusieurs études complémentaires sont en cours pour optimiser les molécules que nous avons détaillées précédemment. Elles associent notamment différentes molécules selon de nouveaux protocoles en faisant varier les doses et les durées d’administration (www.clinicaltrials.gov). 5.5.1 Immunothérapie De nombreux essais cliniques sont en cours pour la mise au point de thérapies basées sur l’utilisation de cellules immunitaires capables de reconnaître les cellules cancéreuses et de les supprimer. Il existe différentes approches dans ce domaine notamment en utilisant différents types de cellules de l’immunité pour lutter contre les cellules gliales tumorales (Vauleon et coll., 2010). Le système le plus utilisé est l’activation des cellules dendritiques prélevées chez le patient par la mise en contact avec des fragments peptidiques issues de la tumeur. Les cellules dendritiques vont s’activer et sont réinjectées au patient sous forme de vaccin. Au final, la réaction attendue est l’activation des lymphocytes T par les cellules dendritiques injectées, par présentation d’un peptide antigénique spécifique de la tumeur. L’organisme déclenche une réaction immunitaire ciblée sur la tumeur. Ce type de traitement est surtout utilisé pour augmenter l’efficacité des traitements standards tels que la radiothérapie et la chimiothérapie (Wheeler et coll., 2008). 37 5.5.2 Dasatinib Le dasatinib est un inhibiteur de tyrosine kinase commercialisé par la firme Bristol-Myers Squibb sous le nom de Sprycel (Figure 18). Cette molécule a été homologuée par la FDA et par l’agence européenne du médicament pour le traitement des leucémies aigües lymphoïdes. Actuellement, différentes équipes évaluent son efficacité dans le traitement des glioblastomes en se basant sur le fait que ces tumeurs surexpriment cette famille de tyrosine kinase et qu’elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes cellulaires tels que la migration ou l’adhésion (Stettner et coll., 2005). Les essais précliniques in vitro menés sur des lignées cellulaires de glioblastomes ont montrés que le dasatinib diminuait le taux de phospho-Src, qui est la forme activée de ces kinases, et induisait la mort des cellules tumorales par autophagie (Milano et coll., 2009). D’autres résultats ont montré que le dasatinib permettait de diminuer la croissance tumorale chez des animaux immunodéprimés greffés avec un modèle de glioblastome humain (Dumont et coll., 2009). En plus des effets d’inhibition de la croissance tumorale, la migration des cellules gliales tumorales est également diminuée chez les animaux traités avec le dasatinib (Dumont et coll., 2009). Les résultats des études cliniques sont décevants puisqu’à l’heure actuelle aucun résultat positif n’a été démontré. De plus très récemment, une étude clinique de grande ampleur aux USA, visant à combiner dasatinib et témozolomide-radiothérapie en comparant un groupe recevant la molécule active et l’autre un placébo a été suspendu par la FDA (www.clinicaltrial.gov). Il existe encore de nombreuses autres molécules en développement visant à combattre les glioblastomes. Mais la seule molécule permettant d’obtenir une augmentation importante de la survie est le témozolomide et ce vingt ans après sa découverte. Malheureusement, comme nous l’avons montré précédemment il n’y a l’heure actuelle aucun patient qui a pu être guéri d’un glioblastome. De plus, certains patients développent des résistances au témozolomide au cours de leur traitement et l’arsenal thérapeutique disponible pour les médecins est très limité. Il est donc nécessaire de continuer à rechercher des molécules actives et efficaces et de comprendre les mécanismes de résistance mis en place par les cellules gliales tumorales afin de les 38 contourner. Ceci concerne la seconde partie de nos travaux de recherche relative aux phyllostictines que nous détaillerons ci-après. 6 Pourquoi nous sommes-nous intéressés aux phyllostictines? 6.1 Origine des phyllostictines Cirsium arvense est une plante vivace bisannuelle, originaire des bords de la Méditerranée, qui a peu à peu colonisé de nombreuses régions où le climat lui permettait de se développer. Considérée dans de nombreux pays comme une plante envahissante notamment au sein des cultures, elle a été classée, en 2005 au Canada, comme une des variétés les plus nocives pour l’agriculture. La régulation de son développement est très difficile, de part deux paramètres : tout d’abord sa capacité a colonisé le sol par ses stolons et d’autre part par les techniques d’élimination soit chimique ou biologique très limitées. Toujours au Canada, l’utilisation de parasites, tel que Orellia ruficauda, permet de limiter la croissance de la plante. L’utilisation de parasite de type acarien a été aussi testé et montre des résultats plutôt prometteur quant à l’éradication de Cirsium arvense. L’équipe du professeur Evidente de l’université de Naples s’est intéressée à une famille de champignons pathogènes qui parasitent Cirsium arvense, les phyllosticta. La production de métabolites par ces champignons pourrait être utilisée comme biopesticide. Il a été démontré que certains champignons de cette famille (Phyllosticta maydis et Phyllosticta medicaginis) produisaient des métabolites utilisables comme pesticide. Le professeur Evidente et ses collaborateurs ont travaillé sur une souche précise du genre Phyllosticta, Phyllosticta cirsii. Ce pathogène a été cultivé en biofermenteur. Quatre métabolites de type oxazatricycloalkenones appelés phyllostictine A, B, C et D ont été isolé ce qui a permis de caractériser leur structure (Evidente et coll., 2008). 6.2 Technique d’extraction La culture de phyllosticta cirsii et la production des métabolites se fait en milieu liquide durant 4 semaines. La souche de champignon est fournie par le Dr. Alexander Berestetskyi de l’Institut de recherche sur la protection des plantes de Saint Petersburg. 39 Un milieu de culture minéral est ensemencé avec des fragments de mycélium cultivés en milieu PDA (Potato Dextrose Agar). La culture se déroule à température contrôlée (25°C) en condition statique durant quatre semaines. Différents milieux de culture ont été testés pour trouver le meilleur rendement de production des métabolites (Zonno et coll., 2008). Le meilleur substrat de culture est un milieu M-1-D modifié par enrichissement de différents éléments minéraux et dont le pH est ajusté à 5,5 (Pinkerton et Strobel 1976). Par la suite, le milieu de culture est filtré avec du papier Wathman et les résidus sont déshydratés puis resuspendus dans de l’eau distillée à pH 4,4 puis extrait avec un solvant organique, de l’acétate d’éthyle. L’étape suivante consiste à ajouter du sulfate de sodium puis l’ensemble est déshydraté, filtré et les solvants sont évaporés en condition de pression réduite. Au final, pour 7,7 litres de milieu de culture, il n’est récupéré que 1,26 gramme de substance huileuse contenant les différentes phyllostictines (Evidente et coll., 2008). L’étape suivante de l’extraction consiste en la séparation des différents métabolites sur colonne de silice par utilisation de différents mélange de solvants (éthanol, acétate d’éthyle ou chloroforme) puis à leur purification par chromatographie. Au final, après ces différentes étapes de purification, les quatre métabolites sont extraits à différents rendements par litre de milieu de culture : phyllostictine A= 11 mg/L, phyllostictine B= 1mg/L, phyllostictine C= 0,9 mg/L et phyllostictine D= 0,5 mg/L (Evidente et coll., 2008). A partir de ces extractions ont été synthétisés deux dérivés mono- et diacétylé de la phyllostictine A. Pour les autres phyllostictines, aucun dérivé n’a été synthétisé car les rendements d’extraction ne sont pas suffisants. Il faut noter que deux autres métabolites produits de Phyllostita cirsii ont été également extraits (Evidente et coll., 2008) : la phyllostoxine et la phyllostine avec des structures différentes des phyllostictines (Figure 20). 6.3 Propriétés connues à ce jour 6.3.1 Pesticide Les différentes phyllostictines ont été testées comme pesticide sur leur plante hôte, le Cirsium arvense. La phyllostictine A induit la nécrose des cellules végétales à une concentration de 6 mM alors que les phyllostictines B et D produisent un effet plus 40 1 4 2 5 3 6 Figure 20: Ensemble des métabolites identifiés au sein du champignon Phyllosticta ciirsii : 1- phyllostictine A, 2- phyllostictine B, 3- phyllostictine C, 4- phyllostictine D, 5phyllostoxin, 6- phyllostin (Source : Evidente et coll., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008 ; Evidente et coll., Tetrahedron, 2008). faible à la même concentration (Evidente et coll., 2008). La phyllostictine C n’induit aucune toxicité sur la plante. Le test est effectué par dépôt direct des différentes molécules sur la plante et par la mesure du diamètre de mort cellulaire engendré après 3 jours (Evidente et coll., 2008). Dans un second article, l’équipe du professeur Evidente détermine le pourcentage de viabilité cellulaire de protoplaste de Cirsium arvense après exposition à différents temps (1 à 6 heures) et différentes concentrations (1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM et 0,01mM). La phyllostictine A induit une mort cellulaire aux concentrations les plus élevées (Zonno et coll., 2008). La concentration d’inhibition de 50% de la viabilité cellulaire se situe aux alentours de 0,1mM pour 3 et 6 heures d’exposition. En comparaison, la phyllostictine A montre une meilleure activité que le glyphosate, molécule commerciale utilisée comme pesticide (Zonno et coll., 2008). 6.3.2 Activités antibactérienne et zootoxique Cette activité n’a été déterminée que pour les phyllostictines A et B du fait de leur meilleur rendement d’extraction que nous avons détaillé précédemment. Pour déterminer l’activité antibactérienne de ces deux composés, l’équipe du professeur Evidente a utilisé le test du disque. Ce test est le suivant : une gélose nutritive est ensemencée avec une souche bactérienne afin que la totalité de sa surface soit recouverte par des colonies. Une fois cette opération effectuée, on dépose des disques de papiers imprégnés de la molécule à tester à différentes concentrations. On considère que le test est positif lorsque le diamètre autour du papier imprégné où il n’y a pas de colonies présentes est supérieur à 12mm. Dans le cas de ces tests relatifs aux phyllostictines, deux souches bactériennes ont été testées : Escherichia coli (Gram -) et Lactobacillus sp. (Gram +). Dans le cas de la souche Gram+, seule la phyllostictine A a montré une réponse à une concentration de 5µg/disque. Pour ce qui est de la souche Gram -, aucune des deux phyllostictines n’a démontré d’activité (Evidente et coll., 2008). Dans le cas de la détermination de l’activité zootoxique, ce sont des larves d’Artemia Salina qui ont été utilisées. La phyllostictine A induit la mort de la totalité des larves à une concentration de 1mM et seulement 24% à 0.1mM. La phyllostictine B quant à elle n’induit aucune mortalité pour ces deux concentrations testées (Evidente et coll., 2008). 41 Les phyllostictines sont les premiers métabolites de champignon ayant un groupe oxazatricycloalkenone dans leurs structures chimiques. De plus, ces molécules présentent des activités biologiques intéressantes notamment au niveau de leur utilisation en tant que pesticide. Comme ces molécules n’ont jamais été étudiées en cancérologie expérimentale et que des résultats préliminaires obtenus au sein de notre laboratoire suggéraient une telle activité anticancéreuse, tout au moins in vitro, nous avons décidé de nous intéresser de plus près à cette famille de molécules et d’en caractériser leurs mécanismes d’action anticancéreuses, notamment au niveau de cellules gliales tumorales présentant divers degrés de résistance aux stimuli pro-apoptotiques.. 42 MATERIEL ET METHODES MATERIEL ET METHODES 1 Culture cellulaire et modèles biologiques 1.1 Lignées cellulaires établies Pour réaliser nos différentes expériences, nous avons utilisé des lignées cellulaires humaines et murines d’origines histologiques différentes. Toutes ces lignées proviennent de l’ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA) ou le la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany) et sont référencées avec des codes spécifiques pour chacune d’elles : - U373-MG, glioblastome code HTB-17 (ATCC) - T98G, glioblastome code CRL1960 (ATCC) - Hs683, oligodendrogliome HTB-138 (ATCC) - HT29, adénocarcinome du colon code HTB-38 (ATCC) - A549, carcinome du poumon non à petites cellules code ACC107 (ATCC) - SKMEL-28, mélanome code HTB-72 (ATCC) - B16F10, mélanome murin CRL-6475 (ATCC) - Wi38, fibroblaste code CCL-75 (ATCC) Nous avons également fait appel à une lignée cellulaire de fibroblaste dénommée NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts) commercialisée par la société Promocell (Heidelberg, Allemagne). Pour les cultures de kératinocytes, ces cellules sont issues du laboratoire du professeur Yves Poumay (Laboratoire cellules et tissus, Université Notre Dame de la paix, Namur) et proviennent de résection chirurgicale de peau pratiquée par le docteur Bienfait sur des humains adultes (Clinique Saint Luc, Bouge-Namur). 1.2 Lignées cellulaires résistantes au témozolomide Pour déterminer les mécanismes de résistance au témozolomide au sein des glioblastomes, nous avons mis au point deux lignées cellulaires précédemment citées, U373-MG et T98G, en les soumettant à des doses incrémentales de témozolomide. Nous avons commencé par traiter ces cellules avec une dose de 0.1 µM durant quatre semaines à raison de deux traitements par semaine. Puis suivant le même protocole, la 43 concentration de témozolomide est augmentée à 1 µM durant cinq semaines puis douze semaines à 10µM deux fois par semaine. Entre chaque augmentation de concentration de témozolomide, les cellules bénéficient d’une semaine de culture en milieu de culture normale sans ajout de témozolomide. Ensuite les cellules sont cultivées en présence de 500µM de témozolomide durant une semaine suivi d’une semaine de pause et une nouvelle semaine de traitement à 500 µM. Les cellules encore adhérentes sont remises en culture et sont à nouveau soumises à un cycle de traitement à 500 µM deux fois par semaines durant huit semaines avec une semaine sans traitement toutes les deux semaines. La dernière étape de l’induction de la résistance est l’exposition à une concentration de 1mM deux fois par semaine durant 4 semaines entrecoupées d’une semaine sans témozolomide. A l’heure actuelle, la littérature ne référence pas de protocole standard pour l’induction in vitro de résistance au témozolomide dans les cellules gliales tumorales. Plusieurs types de protocoles d’induction de résistance au témozolomide sont décrits dans la littérature. Tout d’abord la sélection de cellules par une exposition à une dose forte de témozolomide puis maintient de la résistance avec une exposition régulière avec la même dose (Sun et coll., 2010 ; Pan et coll., 2011). D’autres équipes utilisent une augmentation de dose incrémentale d’exposition au témozolomide pour induire un phénomène de résistance dans les cellules gliales tumorales (Oliva et coll., 2010). Nous avons décidé d’appliquer ce protocole car il se rapproche le plus du protocole de traitement standard dont les patients bénéficient en clinique (exposition au témozolomide puis phase de repos dans le traitement). De plus, la résistance induite relève d’un mécanisme d’adaptation plutôt que de la sélection d’une sous-population de cellules déjà résistantes et présentes dans les lignées cellulaires. Pour maintenir la résistance de ces cellules au témozolomide, elles sont cultivées en présence de 150 µM de témozolomide deux fois par semaines. 1.3 Milieux et conditions de culture cellulaire Les cellules sont cultivées en étuves thermostatées à 37°C sous atmosphère contrôlée à 5% de dioxyde de carbone (CO2) et saturée en eau. Deux types de milieu de culture cellulaire sont utilisés, le milieu MEM (Minimal Essentiel Medium, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) et le milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium, 44 Invitrogen, Merelbeke, Belgique) qui sont enrichis avec différents éléments. Tout d’abord chaque milieu est complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) et 1 mg/ml de glutamine (Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Différents antibiotiques sont ajoutés aux milieux de culture comme la gentamycine à 0,1 mg/ml et le mélange pénicilline/streptomycine à 200 UI/ml (Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Toutes les lignées cellulaires sont adhérentes. La suspension des cellules se fait par l’utilisation de trypsine appliquée sur les cellules durant 5 minutes à 37°C et neutralisées par un volume double de milieu de culture. La culture des kératinocytes se fait en deux étapes. Tout d’abord, lors de leur prélèvement, ils sont mis dans un milieu de culture KGM-2 kératinocyte (Biowhittaker). La deuxième phase consiste à maintenir les kératinocytes sous confluents dans du milieu epilife supplémenté avec des antibiotiques, des facteurs de croissance et des hormones (Cascade Biologics, Portland, USA). Dès que le pourcentage de confluence dépasse les 40%, on enlève les facteurs de croissance du milieu pour laisser les kératinocytes se multiplier en condition autocrine (Atanasova et al., 2005). 1.4 Les modèles in vivo Les modèles de gliomes U373MG et T98G, sensibles (TMZ-S) et résistants (TMZ- LTT) au témozolomide, ont été greffés dans les cerveaux de souris immunodéprimées femelles nu/nu âgées de 6 semaines (onze animaux sont répartis dans chacun des groupes). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites précédemment. Le jour de la greffe, elles sont resuspendues et centrifugées à 1000 tours/minute durant dix minutes. Le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu sans sérum. Le nombre de cellules (1 million) à injecter par souris est dilué dans 50 µL de milieu sans sérum. Tous les trois jours, le poids des animaux est mesuré et si la perte de poids excède 15% par rapport au jour de greffes, les souris sont euthanasiées en accord avec les règlements éthiques. Les groupes traités au témozolomide reçoivent une dose de 80 mg/kg par gavage trois fois par semaine durant trois semaines consécutives. Le traitement commence au jour 14 après la greffe. Les animaux sacrifiés sont prélevés de leur cerveau qui est conservé dans une solution de formaldéhyde à 4% en vue d’analyse 45 histochimique. Pour chaque animal prélevé, il est réalisé une mise en paraffine du cerveau puis coupe au microtome et dépôt sur la lame pour les étudier. L’ensemble des expériences in vivo ont été réalisées au sein de la société Unibioscreen conformément à l’agrément numéro LA1230509 attribué par le Comité Déontologique de Service Public Fédéral de Santé Public, Sécurité de la chaine alimentaire et de l’Environnement. 2 Les tests de croissance cellulaire et mort cellulaire Tout au long de nos analyses, nous avons utilisé différents tests pour déterminer la viabilité, la croissance ou la mortalité cellulaire. 2.1 Le test colorimétrique MTT Pour déterminer l’effet d’une molécule sur la croissance globale des cellules, nous utilisons le test MTT basé sur la capacité des cellules à transformer le bromure de 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium (sel de tétrazolium) en formazan. Cette réaction est réalisée par une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase. Le sel de tétrazolium, qui est de couleur jaune, devient bleu-violet suite à cette réaction et l’intensité de coloration, mesurée par un spectromètre, est proportionnelle au nombre de cellules vivantes en fin d’expérience. En détail, les cellules sont ensemencées sur une plaque 96 puits à différentes concentrations au jour 0 suivant les lignées cellulaires. Après 24 heures, le milieu de culture est extrait et remplacé par du milieu de culture contenant des concentrations croissantes de molécules testées. Après 72 heures d’incubation à 37°C sous atmosphère contrôlée à 5% de CO2, le milieu de culture est remplacé par une solution de RPMI sans rouge phénol contenant 0,5 mg/ml de sel de tétrazolium et incubé durant trois à six heures dans les conditions standards de culture cellulaire. Ensuite les plaques 96 puits sont centrifugées à 1000 tours/minute durant 10 minutes pour fixer les cristaux de formazan. Le milieu est retiré et remplacé par du diméthylsulfoxyde (DMSO) qui dissout les cristaux. Après agitation légère, l’intensité de couleur est mesurée par spectrométrie à la longueur d’onde 570nm (microplate Reader, Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgique). On 46 calcule la moyenne d’intensité pour chacune des concentrations et par la méthode de la droite de régression à partir de la courbe, on détermine une valeur d’IC50 par plaque MTT. 2.2 Analyse du cycle cellulaire L’analyse du cycle cellulaire s’effectue en cytométrie de flux par marquage de l’ADN à l’iodure de propidium. Les cellules sont cultivées pendant 72 heures dans du milieu de culture traditionnel. Elles sont par la suite mises en suspension par la trypsine. Les cellules sont rincées deux fois au PBS, avec entre chaque rinçage une étape de centrifugation à 1000 tours/min, et fixées dans de l’éthanol 70% pendant au moins 24 heures. Le jour de l’analyse, les suspensions sont rincées deux fois dans du PBS et mises en suspension dans une solution de 1mg/ml d’iodure de propidium (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) avec de la RNAse à 200µg/ml (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) pendant 30 minutes dans l’obscurité avant analyse. La propriété de l’iodure de propidium est de s’intercaler entre les bases de l’ADN et soumis à une longueur d’onde d’excitation de 530 nm, il émet une longueur d’onde de 617 nm. Ce marquage est proportionnel à la quantité d’ADN présente dans la cellule ce qui permet de déterminer la proportion de cellule dans chacune des phases du cycle cellulaire (G0/G1, S, G2/M) en fonction de la réplication de leur ADN. Pour chacune des mesures, 10 000 cellules sont analysées. L’ensemble des mesures est faite avec un cytomètre de flux de type Quanta SC flow (Beckman Coulter, Suarlée, Belgique). Les analyses sont réalisées en triplicat pour chaque condition expérimentale. 2.3 Analyse TUNEL L’analyse de type TUNEL permet de déterminer le taux de mort cellulaire d’une population en mesurant les cassures présentes dans l’ADN ainsi que la proportion de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. Cette technique est basée sur la détection de cassure au sein de l’ADN et le marquage de l’ADN par l’iodure de propidium. La fragmentation de l’ADN forme des extrémités 3’-OH libres. L’enzyme deoxynucleotidyl transferase (TdT) permet l’ajout sur ces extrémités de déoxyuridines triphosphates bromées qui sont reconnues par un anticorps spécifique couplé au fluorochrome FITC (Fluorescein isothiocyanate) qui émet à une longueur d’onde de 520 47 nm. Les cellules sont fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 1% durant 30minutes puis comme pour l’analyse du cycle cellulaire décrite ci-avant, les cellules sont remises en suspension, rincées deux fois au PBS et conservées à -20°C dans une solution éthanol 70% jusqu’à l’analyse. Pour le marquage à l’iodure de propidium, le principe est le même que précédemment décrit pour l’analyse du cycle cellulaire. Les mesures sont faites avec le cytomètre de flux de type Quanta SC flow (Beckman Coulter, Suarlée, Belgique) et l’ensemble des réactifs sont contenus dans le kit APO-BrDU (BD biosciences, Belgique). Le marquage est réalisé suivant les instructions fournies par le fabriquant. 2.4 La vidéomicroscopie quantitative La vidéomicroscopie quantitative nous a permis de déterminer deux paramètres de la croissance cellulaire : le nombre de divisions cellulaires ainsi qu’un ratio de croissance globale que nous détaillerons ci-après. Pour l’analyse de la durée des mitoses, nous avons utilisé un système de vidéomicroscopie assistée par ordinateur associé à un logiciel d’analyse d’images développé par le Dr. Olivier Debeir (au sein du Laboratoire de l’Image : Synthèse et Analyse (LISA, Faculté des Sciences Appliquées, ULB), en collaboration avec le Dr. C. Decaestecker (Laboratoire de Toxicologie) (Debeir et coll., 2005 ; Debeir et coll., 2008). Les cellules sont ensemencées trois jours avant le début de l’expérience dans une boîte de culture de 25cm² de surface à des concentrations cellulaires variables suivant la lignée cellulaire étudiée. Ensuite, les boîtes de culture sont placées dans une enceinte en plexiglas thermostatée à 37°C. Le milieu de culture est changé avant le début de l’analyse. La vidéomiscropie est basée sur la prise d’image d’un champ par une caméra branchée sur un microscope à des intervalles de temps régulier (toutes les 4 minutes) durant la totalité de l’expérience. Par la suite, les images sont récupérées et analysées pour déterminer la durée de division cellulaire ainsi que la croissance globale c’est-à-dire le rapport entre le nombre de cellules présentes dans la dernière image sur celui dans la première image pour chaque condition expérimentale. Le ratio global de croissance cellulaire est le rapport de croissance de la condition traitée divisée par le ratio de la condition contrôle. A titre d’exemple, si l’on dénombre 600 cellules dans la dernière image numérisée (1 080ème image) en fin d’expérience, et 100 cellules dans la première 48 image de la condition contrôle, le rapport de croissance dans cette condition est de 6. Si ce rapport est de 3 dans la condition traitée, le rapport global de croissance est de 3/6 = 0.5. Ceci signifie que seulement le nombre de cellules présentes dans la condition traitée est égal à 50% du nombre de cellules présentes dans la condition contrôle. 3 Analyse de l’expression génomique Pour déterminer l’expression de certains gènes nous avons utilisé différentes techniques plus ou moins ciblées. 3.1 Puce Affymétrix Le système de « puce à ADN » commercialisé par la firme Affymétrix (Santa Clara, USA) permet l’analyse de l’expression d’une quantité très importante de gènes au sein d’un échantillon biologique. Cette technique s’organise en plusieurs étapes. Tout d’abord, il faut extraire l’ARN des échantillons à tester et, par reverse transcription, obtenir l’ADN complémentaire (ADNc). On transcrit l’ARN à partir de cet ADNc en incorporant des nucléotides biotinylés. L’ARNc transcrit est ensuite fragmenté pour obtenir des ARNc de petite taille pour permettre leur hybridation sur la puce. L’analyse de l’expression s’effectue grâce à une puce (lame de verre) sur laquelle sont fixées des petites sondes d’ADN de 25 nucléotides. Pour chacun des gènes, il y a entre 11 et 20 sondes spécifiques et uniques sur la puce. Les ARNc biotinylés sont incubés sur la puce durant 16 heures puis on élimine les ARNc non hybridés par une série de rinçage de la puce. La révélation s’effectue en ajoutant la streptavidine couplée à la phycoérythrine. Les puces sont placées dans un lecteur pour déterminer l’intensité d’hybridation sur chacune des sondes et extraire les données brutes (Figure 21). Pour déterminer si l’hybridation s’est bien déroulée, des contrôles internes sont introduits dans les ARNc et sont reconnus spécifiquement par des sondes présentes sur la puce. L’analyse des résultats requiert un important travail notamment pour l’élimination du bruit de fond et l’identification des signaux spécifiques correspondant à chacun des gènes (Wilson et Miller, 2005). Chaque condition expérimentale est réalisée en triplicat et chaque échantillon est hybridé sur une puce différente. L’utilisation de triplicat permet d’avoir trois valeurs d’absorbance pour chaque gène sur chacune des conditions. Pour déterminer 49 Figure 21 : Principe de la technique Affymétrix. On extrait la totalité des ARN des cellules d’intérêt et on synthétise l’ADNc par la technique de RT-PCR. Ensuite à partir de cet ADNc, on transcrit l’ARNc avec des nucléotides portant des groupements biotines. Ces ARNc biotinilés sont fragmentés pour que leur taille soit comprise entre 20 et 25 nucléotides et sont déposés sur la puce Affymétrix où sont fixées des séquences d’ADN spécifiques pour environ 22 000 gènes. Par complémentarité parfaite, les ARNc déposés vont s’appareiller sur les ADN de la puce. Après plusieurs rinçages et lavages, on ajoute sur la lame un mélange de streptavidine-phycoérythrine qui va se lier à la biotine (Source : www.affymétrix.com). les ratios d’expression pour chacun des gènes, aucune des trois valeurs d’un échantillon ne doit se recouvrir avec l’une des trois valeurs de l’échantillon avec lequel il va être comparé. S’il n’y a pas de recouvrement, on réalise le ratio d’expression pour chacun des gènes sur bases des deux valeurs les plus proches entre les échantillons. Au final, seul les ratios supérieurs à 2 ou inférieurs à 0.5 sont retenus. Dans nos travaux, nous avons utilisé la puce Affymétrix Human Genome U133 set Plus 2.0 capable d’identifier l’expression de près de 22 000 gènes. Pour ces expériences, nous avons reçu le soutien de deux équipes extérieures à notre laboratoire : l’équipe du professeur Gianluca Bontempi (Département d’informatique, Université Libre de Bruxelles) assisté du docteur Benjamin Haibe-Kains pour l’analyse des données brutes et de l’équipe du Docteur Paul Van Hummelen de la plateforme Affymétrix de la KUL (Katholieke Universiteit van Leuven). Nous avons, dans un premier temps, comparé les résultats expérimentaux obtenus par Affymétrix à d’autres résultats cliniques disponibles dans la base de données publiques de l’hôpital Henry Ford (Détroit, USA) qui répertorie les valeurs d’expression de gènes dans des puces Affymétrix et ce pour divers types histologiques et grades anatomo-cliniques de tumeurs cérébrales humaines et de tissus cérébraux sains. Puis nous avons analysé les résultats grâce au logiciel EASE (Expression Analysis Systematic Explorer). Il permet de catégoriser les gènes issus d’analyse à haut débit en identifiant dans la liste des gènes Affymétrix les familles qui sont significativement représentées (Hosack et coll., 2003). Cette technique permet d’isoler les catégories biologiques de gènes dont l’expression pourrait être modifiée au sein des cellules gliales tumorales lors de l’induction de la résistance par le témozolomide. 3.2 La reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) La RT-PCR consiste en l’extraction des ARN messagers et en leur transcription en ADNc pour analyser l’expression des gènes. La première étape de cette technique est l’extraction des ARN totaux grâce au Trizol (Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Les cellules sont cultivées en boîte de culture jusqu’à confluence et grattées en présence de PBS. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée, le surnageant est éliminé et le culot est incubé avec le Trizol à raison de 1ml par 10cm² de culture cellulaire récoltée. Après 5 50 minutes à température ambiante, on ajoute 0,1ml de chloroforme par ml de Trizol. L’échantillon est agité au Vortex® et centrifugé pour laisser apparaître trois phases. La phase supérieure ou aqueuse contient les ARN. Elle est prélevée puis les ARN sont précipités grâce à l’isopropanol et lavés à l’éthanol avant d’être resuspendus dans de l’eau sans ARNase. On traite les ARN récoltés avec une DNAse I (Invitrogen) pour éliminer les contaminations par de l’ADN génomique. On recommence les étapes de purification par ajout d’un mélange phénol/chloroforme et d’alcool isoamylique et centrifugation. A chaque étape, on récolte la phase aqueuse qui contient les ARN. Pour contrôler la qualité et quantifier les ARN, on mesure la densité optique à 260 nm ainsi que le ratio d’absorbance à 260 et 280 nm (absorbance des protéines). Ce ratio doit être compris entre 1,6 et 2 pour avoir des ARN de bonne qualité utilisable pour les étapes suivantes. On effectue ensuite la synthèse de l’ADNc. Pour cela, on incube les ARN avec l’enzyme transcriptase inverse superscript II (Invitrogen), un mélange de déoxynucléotides triphosphate ainsi qu’une amorce oligoDT complémentaire des queues polyA présentes sur les ARN messagers. On dénature préalablement les ARN en chauffant à 70°C pour éviter l’hybridation entre eux ou la formation de boucle, puis on incube le mélange amorce-enzyme-déoxynuclétides pendant 50 minutes à 42°C qui est la température optimale d’activité de la transcriptase inverse. La réaction de formation de l’ADNc est stoppée en chauffant à 70°C durant 10 minutes pour dénaturer l’enzyme la rendant inactive. L’ADNc est purifié sur colonne Kit PCR High Pure (Roche diagnostics, Mannheim, Allemagne) et quantifié par mesure de l’absorbance à 260nm. L’amplification des fragments de gènes à analyser se fait par PCR (polymerase chain reaction). La première étape consiste à sélectionner un couple d’amorces spécifiques pour chaque gène cible de l’ADNc qui va permettre l’amplification de la séquence d’intérêt (voir tableau ci-dessous). Le choix des amorces ainsi que la détermination de leur sélectivité se fait grâce au logiciel HYBSIMULATOR (Advanced Gene Computing Technology, Irvine, USA) et leur synthèse est ensuite effectuée par Invitrogen (Merelbeke, Belgique). Pour chaque analyse d’expression de gène, le mix PCR est constitué de la même quantité de réactifs dans un volume total de 50µl: 51 20ng d’ADNc 50µM de chacun des déoxynucléotides triphosphate (dNTP) 1µM de chacune des amorces dilué dans un tampon MgCl2 de concentration 1,5 mM 0,5 U TaqDNA polymérase La technique PCR se décompose en une répétition de phases. Tout d’abord, la dénaturation de l’ADN par chauffage à 95°C, l’hybridation des amorces à une température spécifique pour chacune d’elle et enfin la synthèse de l’ADNc par la TaqDNA polymérase à 72°C. L’amplification se fait par répétition de 35 cycles dans un thermocycler (Westburg, Leusden, Netherlands). Les produits d’amplification sont révélés par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1,2% préparé dans un tampon Trisborate EDTA (Invitrogen) avec une solution pour la révélation du gel sous ultraviolet (SYBR® Safe DNA stain Gel, Invitrogen). Pour chaque PCR, il est intégré des contrôles négatifs pour vérifier si les échantillons ne sont pas contaminés par des ADN (échantillon complet de mix PCR sans l’ADNc testé). Dans chaque gel un marqueur de taille est déposé pour contrôler la taille des fragments d’ADN amplifiés. Les cibles auxquelles nous nous sommes intéressés et leurs séquences amorces sont détaillées dans le tableau ci-dessous. 52 Gènes Séquences amorces Température d’hybridation Nestin Sens: 5′-ggatcagatgacattaagacc-3′ Antisens: 5′-ccgtatcttcccacctct-3′ 59°C GFAP Sens: 5′-gttctctcggagtatctgg-3′ Antisens: 5′ccctacttgtatgcctagtg-3′ 59°C CD90 Sens: 5′-cctaaggaagctaaaagcatg-3′ Antisens: 5′-ctcaatgagatgccataagct-3′ 57°C Vimentine Sens: 5′-gattcaggaacagcatgtc-3′ Antisens: 5′-tctctagtttcaaccgtctta-3′ 57°C CK20 Sens: 5′-gattcaggaacagcatgtc-3′ Antisens: 5′-tctctagtttcaaccgtctta-3′ 57°C CD44 Sens: 5′-ggcttagacagagttgatct-3′ Antisens: 5′-ggctatgagacttgtatcactac-3′ 57°C CD133 Sens: 5′-gagagtaactaggattctagctt-3′ Antisens: 5′-ccattcgacgatagtacttagc-3′ 57°C MELK Sens: 5′-gtgaatccagatcaactgttg-3′ Antisens: 5′-gctagataggatgtcttccacta-3′ 57°C Actine Sens: 5′-ctaagtcatagtccgcctag-3′ Antisens: 5′-aaatcgtgcgtgacattaagg-3′ 62°C Tableau 1 : récapitulatif des amorces utilisées pour chaque gène en PCR ainsi que leur température d’hybridation 4 Analyse de l’expression protéomique 4.1 L’immunofluorescence L’analyse de l’expression d’une protéine par immunofluorescence permet de visualiser à l’aide d’un microscope à fluorescence l’expression ainsi que la localisation d’une protéine au sein d’une cellule. Cette expérience se déroule en plusieurs étapes. Tout d’abord, les cellules sont cultivées dans une plaque 6 puits (Sarstedt, Essen, Belgique) avec une lame de verre de 18*18mm (Menzel-Gläser, Braunschweig, Allemagne) stérilisées au fond de chaque puit. On ajoute dans chaque puit 3ml de milieu 53 de culture contenant une concentration cellulaire voulue et on incube à 37°C à 5% de CO2. Le milieu de culture est retiré après 72 heures et les cellules sont rincées au PBS deux fois avant d’être fixées dans une solution de formaldéhyde à 4% tamponnée à pH 7,4 durant 20 minutes. Les cellules sont à nouveau rincées au PBS et perméabilisées dans une solution de triton X100 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) à 0.2% durant 20 minutes. Cette étape permet de perméabiliser les membranes cellulaires et par conséquent permettre aux anticorps spécifiques de la protéine d’intérêt d’accéder aux cibles intracellulaires. On arrête la réaction avec une solution de BSA à 0.1% durant 1 heure puis on rince les lames avec du PBS avant de déposer la solution d’anticorps primaire dilué dans une solution PBS-BSA (0,2%) durant 1 heure (voir le tableau de la page suivante). Enfin les cellules sont rincées et mises en présence d’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (Alexa 488, Invitrogen) spécifique de l’anticorps primaire. Les lamelles sont ensuite montées sur une lame en verre et fixées avec du Moviol (Calbiochem, VWR, Heverlee, Belgium). La lecture des lames s’effectue à l’aide d’un microscope à fluorescence Zeiss Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen, Germany) équipée de filtres d’excitations et d’émission des longueurs d’onde adéquates ainsi que d’une caméra Axiocam HRm Zeiss couplée à un système d’analyse d’image (Axiovision Rel 4.6 software). Chaque condition est réalisée en triplicat avec prise d’au moins 3 images par condition. La coloration DAPI (4',6'diamidino-2-phénylindole) permet de visualiser le noyau en se fixant fortement à l’ADN et en émettant une lumière bleue intense. 54 Primaire Primaire Secondaire Anticorps Code Origine Compagnie Dilution Glut3 53095 Lapin Abcam 1/100 Glut10 33245 Lapin Abcam 1/100 Lapin/Alexa488 A11008 Chèvre Invitrogen 1/400 Tableau 2 : récapitulatif des anticorps primaires et secondaires utilisés en immunofluorescence ainsi que leur concentration d’utilisation 4.2 Western Blotting On récolte les différents extraits protéiques pour chacune des conditions dont on veut évaluer le taux d’expression d’une protéine en cultivant les cellules puis en les lysant avec 200µL/25cm² de Cellytic (Invitrogen). On gratte les boîtes de culture afin de lyser les cellules puis on centrifuge pendant 10 minutes à 1200 rpm/minute. Seul le surnageant contient les extraits de protéine, le culot cellulaire correspond à des débris. Les extraits sont ensuite dosés en termes de concentration protéique par une méthode colorimétrique (BCA Protein Assay, Pierce, Anvers). Cette réaction colorimétrique repose sur la capacité des protéines à réduire en milieu alcalin les ions cuivre (II) de l’acide bicinchonique en ions cuivre (I). Il se forme un produit de réaction de couleur violette quantifiable par mesure de l’absorbance à 562nm (microplate Reader, Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgique). On évalue la quantité en protéines de chaque échantillon en réalisant en parallèle une courbe étalon avec une solution de BSA à différentes concentrations. Une fois la teneur en protéine quantifiée, les échantillons sont disposés dans un gel d’électrophorèse en condition dénaturante (présence de sodium dodécyl-sulfate) dont le pourcentage d’acrylamide peut varier de 5 à 15% suivant le poids moléculaire des protéines à séparer. Dans chaque puits du gel d’acrylamide, on dépose la même quantité de protéine en l’occurrence 20µg additionné d’un tampon de charge (0,5 M Tris-HCl pH 55 = 6,8 ; 30% glycérol ; 10% SDS ; 0,012% bleu de bromophénol). Avant migration, les échantillons protéiques sont dénaturés à 95°C durant 10 minutes. La migration s’effectue dans une cuve d’électrophorèse (Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgique) en présence d’un tampon de migration (25 mM Tris-HCl ; 192 mM glycine ; 0,1% SDS) à voltage constant (100 Volts) durant 1 heure. Un des puits contient un marqueur de taille moléculaire qui permettra d’identifier en fin d’expérience la taille des bandes protéiques après révélation. Lorsque la migration se termine, on transfère les protéines sur une membrane PVDF (PerkinElmer, Zaventem, Belgique) qui a été préalablement trempée dans une solution de méthanol. Le transfert s’effectue dans une cuve de transfert en présence d’une solution tampon (25 mM Tris-HCl ; 192 mM glycine ; 20% méthanol) à voltage constant (100 Volts) durant 90 minutes à 4°C. Avant d’ajouter l’anticorps primaire, on bloque l’ensemble des sites aspécifiques de liaison de la membrane par incubation de cette dernière dans une solution de protéines, soit du lait en poudre à 5% ou de la BSA à 5% tamponnée à pH = 7,6. On rince entre chaque étape la membrane avec une solution de TBS (20mM Tris-HCl ; 137 mM NaCl ; pH = 7,6) à laquelle on ajoute 2% de Tween 20TM (Sigma). On incube la membrane avec une solution d’anticorps primaire de la protéine d’intérêt préparée à base d’une solution de lait ou de BSA à 5% toute une nuit suivant la solution utilisée pour bloquer les sites non spécifiques de la membrane. On rince plusieurs fois la membrane avec la solution de TBS + Tween 20 TM . La détection de l’anticorps primaire se fait grâce à l’anticorps secondaire qui est couplé à la HRP (Horse Radish peroxydase) qui va se fixer sur l’anticorps primaire. Cette réaction est détectée par chimioluminescence (Kit ECL SuperSignal, Pierce, USA). On expose la réaction à un film radiographique sensible à la lumière (Hyperfilm ECL, Amersham, Diegem, Belgique) et on développe l’image grâce à un appareil (AGFA Curix 60). Pour chaque condition expérimentale, on effectue un contrôle d’expression protéique. Dans notre cas, il s’agit de la tubuline, pour comparer si la quantité de protéine déposée est bien la même dans chacune des conditions expérimentales. 56 Anticorps Code Origine Compagnie Dilution Glut3 Ab53095 Lapin Abcam 1/150 Glut10 Ab33245 Lapin Abcam 1/500 Primaire Akr1c3 A6229 Souris Sigma 1/500 Primaire Akr1c2 Souris Abnova 1/500 Primaire Tubuline Ab6161 Rat Abcam 1/5000 Secondaire Souris 31430 Chèvre Pierce Secondaire Lapin 1858415 Chèvre Pierce Secondaire Rat Ab6734 Lapin Abcam Primaire Primaire H00001646A01 1/2000 Tableau 3 : récapitulatif des anticorps primaires et secondaires utilisés en western blot ainsi que leur concentration d’utilisation 57 4.3 Extinction par la technique de siRNA Pour démontrer si l’expression du produit du gène akr1c3 avait une influence sur la croissance cellulaire des cellules astrogliales tumorales résistantes au témozolomide, nous avons utilisé la technique des petits ARN interférents autrement appelé siRNA. Le principe repose sur l’hybridation de l’ARN messager cible avec un petit fragment d’ARN complémentaire et spécifique de ce gène. Lors de leur hybridation, un complexe ARNARN se forme qui va être reconnu et dégradé par le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) empêchant la traduction de l’ARN messager et donc l’expression de la protéine cible. A noter que cette extinction n’est que transitoire et que l’expression de la protéine n’est altérée que pendant une courte période définie lors des mises au point (Figure 22). Cette technique nécessite la synthèse de siRNA parfaitement complémentaire et spécifique de l’ARNm cible. Nous avons demandé à la firme Eurogentech (Liège, Belgique) de synthétiser trois séquences différentes de siRNA pour l’ARNm de la protéine akr1c3. Pour que le siRNA soit parfaitement internalisé dans la cellule, nous avons utilisé comme agent de transfection le DIC14 amidine/siRNA lipoplexe (3tetradecylamino-N-tert-butyl-N–tetradecylpropionamidine) synthétisé au sein du Laboratoire de Structure et Fonction des Membranes Biologiques de la Faculté des Sciences de l’ULB par le docteur Caroline Lonez. Avant la transfection des cellules, on mélange 200µl de siRNA à 0,4µM (4µl de SiRNA à 10µM avec 196µl de buffer) avec 200µl de DIC14 amidine (4µl de DIC14 amidine et 196µl de buffer) dans du milieu RPMI. L’ensemble est agité et laissé à température ambiante durant 20 minutes. On ajoute le mélange dans une boite de culture contenant les cellules d’intérêt à environ 50% de confluence et on laisse ce mélange en présence des cellules à 37°C durant deux heures puis on rince les cellules avec du PBS. On analyse l’extinction potentielle du taux d’expression de la protéine par western blotting. Pour cette expérience nous avons utilisé deux contrôles : tout d’abord les cellules misent en présence de l’agent de transfection seules et ensuite des cellules transfectées avec un siRNA « scramble » qui n’est spécifique d’aucun ARNm de la cellule. 58 Figure 22: Mécanisme d’action des siRNA au sein des cellules. Les ARN interférents arrivent sous forme double brin dans la cellule et vont être clivés par la nucléase Dicer. Les petits fragments d’ARN obtenus sont pris en charge par le complexe RISC qui va reconnaître l’ARNm homologue de la séquence du siRNA. Les deux éléments sont appariés puis dégradés rendant la traduction de l’ARNm impossible (Source : Arenz et coll., Die Naturwissenschaften, 2003). 5 Etude de l’activité anticancéreuse de la phyllostictine A L’ensemble des analyses suivantes ont été réalisées au sein du laboratoire du professeur Marie-Hélène David-Cordonnier, Unité INSERM U-837, Institut pour la recherche sur le cancer de Lille (France). Ces expériences ont consisté à déterminer le mécanisme d’action des phyllostictines en étudiant leur capacité de liaison à l’ADN ou sur des groupements thiols libres. 5.1 Etude de la liaison à l’ADN Le but de cette expérience est de caractériser la capacité d’interaction de la phyllostictine A avec l’ADN. Pour cela, l’équipe du professeur Cordonnier a analysé avec deux techniques différentes (dichroïsme circulaire et électrophorèse sur gel) la fixation de la phyllostictine A (concentrations de 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100µM) avec un fragment d’ADN simple ou double brin de 21pb (Eurogentech, Belgique). Cette même équipe a aussi étudié les fixations potentielles par spectrométrie de masse en analysant la masse des fragments formés (David-Cordonnier et coll., 2007; Depauw et coll., 2009) en incubant un fragment de 7pb (Eurogentech, Belgique) avec ou sans phyllostictine A. 5.2 Etude de liaison au glutathion, la cystéine ou la N-acétyle cystéine Pour analyser si la phyllostictine A interagit avec les groupements thiol libres, l’équipe du professeur Marie-Hélène David-Cordonnier (Unité INSERM U-837, Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille) a incubé pendant 16 heures à 37°c chacun des composés (Sigma) à une concentration de 100µM en présence de phyllostictine A dans une solution d’acétate d’ammonium à 1mM à pH 7,15. Les échantillons sont injectés dans un spectromètre de masse en tandem API 3000 (Perkin Elmer Sciex) équipé d’une source d’ionisation de type electrospray (Sciex, Canada) grâce à une seringue rincée au méthanol. Le débit d’injection de la seringue (5µl/min) est contrôlé par une pompe médicale (Harvard Apparatus, USA). Le quadripôle est calibré avec du propylène glycole. Les données sont récoltées en mode positif par le logiciel d’acquisition Analyst 1.4.1. Les données de spectre de masse obtenues après passage dans l’electrospray sont obtenues en scannant les rapports masse/charge allant de 100 à 600 et les données 59 obtenues après passage dans le double spectromètre de masse le sont en scannant les rapports masse/charge allant de 50 à 600 (David-Cordonnier et coll., 2003). 5.3 Déplétion en glutathion Pour analyser si la déplétion en GSH avait une influence sur l’activité anticancéreuse de la phyllostictine et ainsi déterminer si le glutathion est la cible moléculaire des molécules, l’équipe du professeur Cordonnier a testé sur la lignée cellulaire KB3-1 (carcinome épidermoïde du poumon) la phyllostictine A pour évaluer son IC50 (inhibition de croissance in vitro à 50%) avec ou sans prétraitement à la sulfoximine de buthionine (BSO). Cette molécule est un inhibiteur de l’enzyme clé de la synthèse du gluthation intracellulaire, la γ-glutamylcysteine synthetase (Griffith, 1982). Un prétraitement à 1mM de 24 heures permet de diminuer très fortement le taux de glutathion intracellulaire (Madonna et coll., 2010) et d’étudier si le mécanisme d’action de la phyllostictine A est basé sur la liaison directe au glutathion. En pratique, les cellules KB3-1 sont cultivées dans des plaques 96 puits à une concentration cellulaire de 3 000 cellules par puits pendant 24 heures en présence de 1mM de BSO (Sigma). Après 24 heures, le milieu de culture est retiré et remplacé par du milieu de culture contenant des concentrations croissantes de phyllostictine A (de 10-4 à 10-8 M). On évalue la valeur de l’IC50 par le test MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) après 72 heures d’incubation. Cette technique est basée sur le même principe que le test MTT précédemment décrit. Le MTS (CellTiter 96 AQueous one solution cell proliferation assay, Proméga) est réduit par les enzymes mitochondriales en formazan, de couleur violette, dont l’absorbance maximale se situe aux alentours de 500nm (Madonna et coll., 2010). Les résultats sont obtenus par lecture des plaques à l’aide de l’appareil Labsystems Multiskan MS (type 352). Chaque expérience est faite trois fois de façon indépendante. 60 6 Analyses statistiques L’ensemble des données statistiques a été contrôlé par le docteur Christine Decaestecker (Laboratoire de Toxicologie, Université Libre de Bruxelles). Les conditions d’applicabilité des tests paramétriques (taille des échantillons, distribution normale des données et égalité des variances) n’étant généralement pas remplies dans le cas de nos expériences, nous avons réalisés nos analyses statistiques à l’aide de tests nonparamétriques. L’ensemble des calculs a été fait à l’aide du logiciel Statistica (StatSoft, Tulsa, USA). 6.1 Analyse de survie Les analyses de survie ont été réalisées grâce à la méthode de Kaplan-Meier. Ce type d’analyse permet d’étudier la chronologie des apparitions d’un événement particulier dans le temps au sein d’une population. Cet événement est ici la mort d’un animal dans nos expériences in vivo. La méthode de Kaplan-Meier permet ainsi d’établir des courbes de survie entre différents groupes. Les courbes se construisent sous la forme d’escaliers dont les paliers indiquent les intervalles de temps pendant lesquels il n’y a pas de décès. Les marches indiquent les moments des décès et leur hauteur la proportion des survivants à un moment donné. Le test de Log-rank a ensuite été utilisé pour comparer ces courbes de survie afin d’identifier des différences significatives. 6.2 Comparaison de groupes de données Les analyses de données indépendantes ont été faites par les tests non- paramétriques de Kruskal-Wallis pour les données générées sur plus de deux groupes et Mann-Whitney dans le cas de comparaison entre deux groupes. 61 RESULTATS - 1 RESULTAT - I Long-term In Vitro Treatment of Human Glioblastoma Cells with Temozolomide Increases Resistance In Vivo through Upregulation of GLUT Transporter and Aldo-Keto Reductase Enzyme AKR1C Expression Benjamin Le Calvé, Michal Rynkowski, Marie Le Mercier, Céline Bruyère, Caroline Lonez, Thierry Gras, Benjamin Haibe-Kains, Gianluca Bontempi, Christine Decaestecker, Jean-Marie Ruysschaert, Robert Kiss, and Florence Lefranc Neoplasia 12 (2010) 727-739 62 Résumé Les glioblastomes représentent les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives. Le traitement standard de ce type de tumeur s’articule en trois parties. Tout d’abord, une résection chirurgicale la plus large possible de la tumeur suivant sa localisation suivie d’un traitement par radiothérapie et d’une chimiothérapie concomitante au témozolomide répartie en plusieurs cycles. Ce protocole mis en place par Stupp et son équipe est à ce jour le plus efficace car il a permis d’augmenter la survie à deux ans de 11% pour les patients traités par radiothérapie seule, et de 30% pour les patients traités avec cette combinaison. A l’heure actuelle, le témozolomide représente le meilleur agent chimiothérapeutique de première ligne disponible pour lutter contre les glioblastomes. L’activité antitumorale principale du témozolomide s’explique par sa capacité à alkyler les bases de l’ADN et donc à induire des mésappariements au sein de la structure double brin. Cette initiation de défaut d’appariement au sein de l’ADN renforce l’activité de la radiothérapie. De plus, il a été démontré que le témozolomide est un inducteur d’autophagie au sein des cellules gliales tumorales. Ce mécanisme de défense naturelle des cellules conduit à la mort cellulaire dans le cas ou le phénomène d’autophagie est prolongé. Il existe cependant des mécanismes de résistance naturelle au témozolomide dans les cellules gliales tumorales. La méthylation ou non du promoteur de l’enzyme O6méthylguanine DNA méthyltransférase (MGMT) est un élément prédictif de la réponse des patients au témozolomide. En effet, son expression est liée à la capacité des cellules tumorales à réparer les mésappariements créés par le témozolomide au sein de l’ADN. Au final, l’expression de cette enzyme diminue la réponse des patients à cet agent chimiothérapeutique et donc leur survie. A ce mécanisme de résistance naturelle des cellules gliales tumorales vient s’ajouter des résistances dites « acquises » suite à un traitement répété au témozolomide. Notre travail s’est essayé à identifier les gènes impliqués dans ce mécanisme après un traitement répétitif de cellules gliales tumorales humaines au témozolomide et à identifier leurs rôles dans les mécanismes de résistance acquise. Pour mener à bien notre travail, nous avons, dans un premier temps, mis au point deux lignées cellulaires, T98G et U373-MG, résistantes au témozolomide par une 63 exposition avec des doses incrémentales à cet agent chimiothérapeutique. La réponse au témozolomide dans les lignées résistantes est plus faible que pour les lignées normales puisque lorsque les cellules sont implantées dans des souris immunodéprimées les survies de ces animaux sont plus faibles chez ceux greffés avec les cellules résistantes malgré un traitement au témozolomide. Nous avons ensuite analysé l’expression de certains gènes exprimés dans les cellules souches ou caractéristiques des origines histologiques des lignées cellulaires. Les caractéristiques des deux lignées semblent par contre différentes au niveau de la dynamique cellulaire. Pour la lignée U373-MG, les cellules résistantes ont un taux de division cellulaire plus élevé par rapport aux cellules normales sans pour autant que la proportion des cellules dans les différentes phases du cycle ne soit modifiée. Par contre, pour la lignée T98G, les cellules résistantes montrent une diminution de la prolifération cellulaire lorsqu’elles sont cultivées en absence de témozolomide. Ce phénomène peut s’expliquer par la dépendance au témozolomide induite par une exposition à long terme. Nous avons dans un deuxième temps analysé l’expression des gènes dans les quatre lignées cellulaires (normales et résistantes) grâce à la technique Affymétrix® pour évaluer les variations d’expression au sein d’une même lignée mais aussi les variations d’expression communes aux deux lignées cellulaires. Cette analyse a permis d’extraire deux familles de gènes surexprimés communément dans les deux lignées : certains transporteurs du glucose (GLUT) et les aldo-kéto réductase 1c (akr1c). Les transporteurs du glucose sont une famille de onze isoformes comprenant douze domaines transmembranaires. Dans notre étude, quatre transporteurs glucose semblent avoir leurs expressions augmentées dans les cellules résistantes (GLUT 1, 3, 5 et 10). Pour les aldokéto réductases 1c, il s’agit d’une famille d’enzymes capable de transformer les cétostéroïdes en hydroxystéroïdes. Ces gènes sont tous situés sur le bras court du chromosome 10. Trois de ces enzymes sont ressorties de l’analyse Affymétrix® : akr1c1, akr1c2 et akr1c3 et leur augmentation est très clairement affichée dans les résultats de l’analyse génomique. Nous avons comparé nos résultats avec une base de données cliniques disponibles de l’hôpital Henry Ford (Détroit, USA) qui répertorie les valeurs d’expression de gènes dans des puces Affymétrix® et ce pour divers types histologiques et grades anatomo-cliniques de tumeurs cérébrales humaines et de tissus cérébraux sains. 64 Ces différents gènes ont été caractérisés dans la littérature comme en liens directs avec des processus de chimiorésistance ou encore de l’augmentation de la prolifération. Pour valider les résultats obtenus en Affymétrix®, nous avons procédé à une validation de l’expression protéique de ces gènes par western blot des différents gènes énumérés précédemment. Dans un dernier temps, nous avons procédé à la diminution transitoire d’un des gènes, akr1c3, par siRNA et analysé son impact au niveau de la prolifération cellulaire. Au maximum de la diminution, la prolifération cellulaire est diminuée de près de 50% par rapport à une population contrôle transfectée avec un siRNA de séquence aléatoire. Ces résultats ont été obtenus grâce à l’utilisation de la vidéomiscropie quantitative. En conclusion, la résistance acquise au témozolomide est directement liée à différents gènes qui contrôlent des mécanismes telle que la prolifération cellulaire (akr1c) ou encore le métabolisme (GLUT). En complément ou en substitution du témozolomide, certaines molécules pourraient être développées pour toucher ces cibles et permettre d’augmenter l’efficacité du témozolomide ou d’éviter l’apparition de résistance acquise. 65 Volume 12 Number 9 September 2010 pp. 727–739 727 www.neoplasia.com Long-term In Vitro Treatment of Human Glioblastoma Cells with Temozolomide Increases Resistance In Vivo through Up-regulation of GLUT Transporter and Aldo-Keto Reductase Enzyme AKR1C Expression1 ,2 † Benjamin Le Calvé* , Michal Rynkowski , ,2,3 Marie Le Mercier* , Céline Bruyère*, ‡,2 Caroline Lonez , Thierry Gras*, §,¶ ¶ Benjamin Haibe-Kains , Gianluca Bontempi , ,2 ‡ Christine Decaestecker* , Jean-Marie Ruysschaert , ,2 ,†,2 Robert Kiss* and Florence Lefranc* *Laboratoire de Toxicologie, Institut de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium; †Service de Neurochirurgie, Hôpital Erasme, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium; ‡Laboratoire de Structure et Fonction des Membranes Biologiques, Centre de Biologie Structurale et de Bioinformatique, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium; §MicroArray Unit, Jules Bordet Institute, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium; ¶ Machine Learning Group, Department of Computer Science, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Abstract Glioblastoma (GBM) is the most frequent malignant glioma. Treatment of GBM patients is multimodal with maximum surgical resection, followed by concurrent radiation and chemotherapy with the alkylating drug temozolomide (TMZ). The present study aims to identify genes implicated in the acquired resistance of two human GBM cells of astrocytic origin, T98G and U373, to TMZ. Resistance to TMZ was induced by culturing these cells in vitro for months with incremental TMZ concentrations up to 1 mM. Only partial resistance to TMZ has been achieved and was demonstrated in vivo in immunocompromised mice bearing orthotopic U373 and T98G xenografts. Our data show that long-term treatment of human astroglioma cells with TMZ induces increased expression of facilitative glucose transporter/solute carrier GLUT/SLC2A family members, mainly GLUT-3, and of the AKR1C family of proteins. The latter proteins are phase 1 drug-metabolizing enzymes involved in the maintenance of steroid homeostasis, prostaglandin metabolism, and metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons. GLUT-3 has been previously suggested to exert roles in GBM neovascularization processes, and TMZ was found to exert antiangiogenic effects in experimental gliomas. AKR1C1 was previously shown to be associated with oncogenic potential, with proproliferative effects similar to AKR1C3 in the latter case. Both AKR1C1 and AKR1C2 proteins are involved in cancer pro-proliferative cell chemoresistance. Selective targeting of GLUT-3 in GBM and/or AKR1C proteins (by means of jasmonates, for example) could thus delay the acquisition of resistance to TMZ of astroglioma cells in the context of prolonged treatment with this drug. Neoplasia (2010) 12, 727–739 Address all correspondence to: Robert Kiss, PhD, Laboratoire de Toxicologie, Institut de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, Campus de la Plaine CP205/1, Boulevard du Triomphe, 1050 Brussels, Belgium. E-mail: [email protected] 1 The present study was supported by grants awarded by the Fonds de la Recherche Scientifique Médicale (Belgium) and by the Fonds Yvonne Boël (Brussels, Belgium). 2 C.L. is a postdoctoral fellow, F.L. is a clinical research fellow, C.D. is a senior research associate, and R.K. is a director of research with the Fonds National de la Recherche Scientifique (Belgium). B.L.C. and M.L.M. are the holders of a Grant Télévie from the Fonds National de la Recherche Scientifique. 3 M.L.M. is currently a researcher at the Department of Pathology, Erasme University Hospital, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium. Received 11 April 2010; Revised 8 June 2010; Accepted 8 June 2010 Copyright © 2010 Neoplasia Press, Inc. All rights reserved 1522-8002/10/$25.00 DOI 10.1593/neo.10526 728 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. Introduction Malignant gliomas represent the most common type of primary brain tumor and constitute a spectrum of clinicopathologic entities from low- to high-grade malignancies. Nearly all low-grade tumors (except grade 1) eventually progress to high-grade malignancies [1]. Glioblastoma (GBM) is the most frequent and malignant glioma [2]. Treatment of GBM patients is multimodal with maximum surgical resection, followed by concurrent radiation and chemotherapy with the alkylating drug temozolomide (TMZ) and/or with nitrosourea [3–7]. However, whereas these treatments prolong GBM patient survival, they do not affect the overall dismal prognosis of this disease. No GBM patient has been cured to date [3–7] because of the diffuse nature of GBM cell invasion into the brain parenchyma and the natural resistance of GBMmigrating cells to apoptosis and thus to chemotherapy and radiotherapy [6]. One of the most beneficial treatments for GBM patients is surgery followed by radiotherapy with concomitant TMZ administration [3–5]. Moreover, TMZ increases GBM sensitivity to radiotherapy [3–5] most effectively in O6-methylguanine-DNA methyltransferase–negative GBMs by increasing the degree of radiation-induced double-strand DNA damage [8]. TMZ can also prevent irradiation-induced glioma cell invasion [9] through caspase-mediated prevention of irradiationinduced FAK activation [10]. TMZ also displays antiangiogenic effects in experimental gliomas [11]. TMZ has been shown to first induce proautophagic defenses in GBM cells [12,13], a feature that leads to late apoptosis [14]. Thus, although TMZ does not cure GBM patients, it significantly improves GBM patient survival and quality of life. Stupp et al. [5] assigned 573 GBM patients to treatment; 278 (97%) of the 286 patients in the radiotherapy-alone group and 254 (89%) of 287 in the combined treatment radiotherapy and TMZ group died during the 5 years of follow-up. Overall survival rates were 27% at 2 years, 16% at 3 years, 12% at 4 years, and 10% at 5 years with TMZ versus 11%, 4%, 3%, and 2% with radiotherapy alone, respectively [5]. A benefit of combined therapy was recorded in all clinical prognostic subgroups, including patients aged 60 to 70 years [5]. However, GBMs can present innate resistance to TMZ or develop acquired resistance during treatment [4,6]. Innate resistance of GBM cells to TMZ includes various events, such as loss of the phosphatase and tensin homolog, leading to the activation of the phosphoinositide3-kinase/Akt pathway [6,15], unmethylation of O6-methylguanineDNA methyltransferase [16], robust base excision repair [17], high activity of the DNA repair protein O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase [18], and deficiency in the DNA mismatch repair system [19]. Acquired resistance of GBM cells to TMZ during treatment includes loss of the mismatch repair protein MSH6 [20] and the selection of less-differentiated preexisting resistant cells in the parental tumor [21]. The present study aimed to identify genes implicated in acquired resistance of two human GBM cells of astrocytic origin, T98G and U373 [22,23]. Resistance to TMZ was induced in these cells by culturing them in vitro over months with incremental TMZ concentrations up to 1 mM. Only partial resistance to TMZ has been achieved in vivo, and this demonstrated in immunocompromised mice bearing orthotopic U373 and T98G xenografts. Whole-genome analyses (Affymetrix, High Wycombe, UK), along with proteomic validations (Western blot analysis and immunofluorescence), were performed in the U373 and T98G GBM cells that were treated for months with TMZ and in the untreated control cells. Stem cell markers were also analyzed in the various GBM cell variants because GBM response to TMZ can be influenced by the proportion and/or nature of GBM stem cells [24–28]. Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 Materials and Methods Cell Lines, Media, and Compounds Established cell lines. The human U373 (ATCC code HTB-17) GBM, T98G (ATCC code CRL1690) GBM, and the human HT29 colon cancer (ATCC code HTB-38) cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) and maintained in our laboratory as detailed previously [21,22]. Compounds. TMZ was obtained from Schering Plough (Brussels, Belgium). Long-term Treatment of U373 and T98G GBM Cell Lines with TMZ U373 and T98G GBM cell lines were treated as follows: (a) 0.1 μM TMZ two times per week (Monday and Thursday) for 4 weeks (with fresh medium change at each TMZ treatment), (b) 1 μM TMZ two times per week for 5 weeks, (c) 10 μM TMZ two times per week for 12 weeks with 1 week of washout after each week of TMZ treatment, (d ) 500 μM TMZ once a week for 3 weeks with 1 week of washout between the 2 weeks of TMZ treatment, (e) 500 μM TMZ two times per week for 8 weeks with 1 week of washout between 2 weeks of TMZ treatment, and ( f ) 1 mM TMZ two times per week for 4 weeks with 1 week of washout between the weeks of TMZ treatment. The cells were analyzed for genomic and proteomic purposes after 4 weeks of washout after the treatment described in ( f ). U373 and T98 GBM cells remained permanently cultured in the presence of 150 μM TMZ for the experiments performed in the current study. Animal Models In vivo orthotopic xenografts of human U373 and T98G cells left untreated and thus sensitive (“TMZ-S” phenotype) versus TMZ longterm treated (“TMZ-LTT” phenotype) GBM cells were obtained as described previously [21,22]. All mice (6-week-old female nu/nu mice of 21-23 g; Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France) had GBM TMZ-S (11 mice per group/experimental model) or TMZ-LTT (11 mice per group/experimental model) cells stereotactically implanted into their brains on the same day. All of the in vivo experiments described in the present study were performed based on authorization no. LA1230509 of the Animal Ethics Committee of the Federal Department of Health, Nutritional Safety and the Environment (Belgium). Analyses of GLUT Transporter and AKR1C Enzyme Genomic Expression in a Clinical Series of 159 Gliomas and 23 Normal Brain Samples from the Henry Ford Hospital The genomic expression of four GLUT transporters (GLUT-1, -3, -5, and -10) and three AKR1C enzymes (AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3) was analyzed in a series of 179 human brain samples that included 23 normal brain tissues, 10 grade 2 astrocytomas, 19 grade 3 astrocytomas, 77 GBMs, 38 grade 2 oligodendrogliomas, and 12 grade 3 oligodendrogliomas. Microarray data were generated by the Henry Ford Hospital (Detroit, MI) from the Affymetrix Array Series GSE4290, and these are available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi? acc=GSE4290. Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction Analyses Total RNA was extracted using the TRIzol isolation reagent (Life Technologies, Inc, Merelbeke, Belgium) according to the manufacturer’s instructions. The extracted RNA was treated with DNase I (Life Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 Technologies, Inc) to eliminate any remaining genomic DNA. The quality and integrity of the extracted RNA were assessed using both the BioAnalyzer 2100 (Agilent, Toulouse, France) and gel electrophoresis. Reverse transcription (RT) reactions were carried out in a thermal cycler (Thermocycler; Westburg, Leusden, the Netherlands). The purification of the complementary DNA (cDNA) produced was performed using the High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) in accordance with the manufacturer’s instructions. The integrity of the cDNA was confirmed by an analysis of β-actin gene expression on the basis of a 25-cycle standard polymerase chain reaction (PCR) analysis in a total volume of 50 μl with 20 ng of cDNA. Standard PCRs were carried out in a thermal cycler (Thermocycler; Westburg). The thermal profiles were as follows: predenaturation for 4 minutes at 95°C, denaturation for 45 seconds at 95°C, annealing for 45 seconds at their respective hybridizing temperatures (T m), elongation for 1 minute and 15 seconds at 72°C, and a final elongation for 10 minutes at 72°C. The PCR products were obtained after 35 thermal cycles. All of the PCR analyses were performed based on the same quantity of purified cDNA (total amount, 20 ng). The products that were amplified by means of the standard PCR were resolved by gel electrophoresis in 1.2% agarose TAE gels in parallel with a 1-kb plus DNA ladder (Invitrogen, Merelbeke, Belgium) and visualized with SYBR safe (Invitrogen) staining under UV light. The following primers and their T m values were used: Nestin: forward 5′ggatcagatgacattaagacc-3′ and reverse 5′-ccgtatcttcccacctct-3′ (T m = 59°C); glial fibrillary acidic protein (GFAP): forward 5′-gttctctcggagtatctgg-3′ and reverse 5′ccctacttgtatgcctagtg-3′ (T m = 59°C); CD90: forward 5′cctaaggaagctaaaagcatg-3′ and reverse 5′-ctcaatgagatgccataagct-3′ (T m = 57°C); vimentin: forward 5′-gattcaggaacagcatgtc-3′ and reverse 5′tctctagtttcaaccgtctta-3′ (T m = 57°C); CK20: forward 5′-gaacctaaatgaccgtctagc-3′ and reverse 5′-ccaaatctgttttatgtaagggttag-3′ (T m = 59°C); CD44: forward 5′-ggcttagacagagttgatct-3′ and reverse 5′ggctatgagacttgtatcactac-3′ (T m = 57°C); CD133: forward 5′-gagagtaactaggattctagctt-3′ and reverse 5′-ccattcgacgatagtacttagc-3′ (T m = 57°C); maternal embryonic leucine zipper kinase (MELK): forward 5′-gtgaatccagatcaactgttg-3′ and reverse 5′-gctagataggatgtcttccacta-3′ (T m = 57°C); and actin: forward 5′-ctaagtcatagtccgcctag-3′ and reverse 5′-aaatcgtgcgtgacattaagg-3′ (T m = 62°C). Genomic Analyses Whole genomic analyses were performed on U373 and T98G TMZ-S versus TMZ-LTT GBM cells at the VIB MicroArray Facility (UZ Gasthuisberg, Catholic University of Leuven, Leuven, Belgium) using the Affymetrix Human Genome U133 set Plus 2.0. We are expressing the genomic-related data as medians and median absolute deviations (MADs). Data analysis was carried out as described previously [29,30]. Proteomic Analyses Western blot analysis. Proteins were electrophoresed on a 10% SDS-PAGE using a Bio-Rad electrophoresis unit at 100 V for 1 hour and transferred onto nitrocellulose membranes. The membranes were blocked in Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20 and 5% fatfree milk or 5% bovine serum albumin for 1 hour. Membranes were incubated overnight with primary antibodies at different concentrations: monoclonal mouse anti-AKR1C3 (1:500; Sigma, Bornem, Belgium), polyclonal rabbit anti-AKR1C2 (1:500; Abnova, Taipei, Taiwan), polyclonal rabbit anti-Glut10 (1:500; Abcam, Cambridge, UK), and poly- GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. 729 clonal rabbit anti-Glut3 (1:150; Abcam). Proteins expression was detected by incubating the membrane with the appropriate secondary antibodies. Immunoreactive protein bands were detected using the Pierce Supersignal Chemiluminescence system (Thermo Fisher Scientific, Erembodegem, Belgium). Immunofluorescence analyses. Cells were cultured on coverslips and fixed with 4% formaldehyde in PBS for 20 minutes at 4°C. Fixed cells were permeabilized by adding 0.2% (vol./vol.) Triton X-100 and 10% (wt./vol.) bovine serum albumin for a total of 20 minutes. Cells were washed twice with PBS and blocked in PBS containing 0.1% of bovine serum albumin for 1 hour at room temperature. Cells were then stained for 1 hour at room temperature with a polyclonal antibody against GLUT-10 and GLUT-3 (Abcam). Antigens were detected using antirabbit secondary antibodies conjugated to Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Coverslips were mounted on microscope slides with 10 μl of Moviol agent (Calbiochem, VWR, Heverlee, Belgium). Pictures were obtained using a 40× microscope oil immersion objective (Zeiss observer.Z1; Zeiss, Oberkochen, Germany) and an Axiocam HRm Zeiss camera controlled by software. Pictures were converted to stacks and navigated using the Axiovision Rel 4.6 software. Three coverslips were analyzed, and three pictures were taken for each coverslip (with the same exposure time) for each condition (TMZ-S vs TMZ-LTT cell lines). The most representative data are shown. Transient Knock-down of AKR1C Expression by Means of an Anti-AKR1C Small Interfering RNA in Human T98G and U373 GBM Cells We have tested three different sequences of anti-AKR1C3 small interfering rNA (siRNA), and we have chosen the most efficient one for carrying out the silencing process. The sequence of this anti-AKR1C3 siRNA (Eurogentec, Seraing, Belgium) is 5′-GGUGAGGAACUUUCACCAA-3′ for the sense sequence and 5′-UUGGUGAAAGUUCCUCACC-3′ for the antisense sequence. A siRNA-negative control (scramble; Eurogentec) was used as a process control. The sense and the antisense strands were annealed by the manufacturer in 50 mM Tris, pH 7.5 to 8.0, in 100 nM diethylpyrocarbonate-treated water. The final concentration of the siRNA duplex was 100 μM. U373 and T98G TMZ-LTT and TMZ-S cells lines were transfected with DiC14-amidine/siRNA lipoplexes. DiC14-amidine (3tetradecylamino-N -tert-butyl-N -tetradecylpropionamidine) was synthesized as previously described [31], and liposomes were prepared as previously [32]. Briefly, after having dissolved DiC14-amidine in chloroform, the solvent was evaporated under a steam of N2. The resulting lipid film was further dried under vacuum overnight then hydrated with prewarmed buffer (10 nM HEPES, 150 mM NaCl at pH 7.3) to reach a concentration of 10 mM and vortexed for 1 minute. Liposomes were then extruded seven times through a 0.4-μm polycarbonate filter (GE Osmonics, Herentals, Belgium) at 55°C and stored at 4°C in a 4-ml polystyrene tube (Falcon, VWR, Heverlee, Belgium). For experiments, liposomes were heated for 2 hours at 55°C before use. To form the DiC14-amidine/siRNA lipoplexes, a volume of siRNA at 0.4 μM (usually 200 μl) was added into an equal volume of liposomes (20 μg of diC14-amidine/ml) in RPMI (Invitrogen) while gently shaking the tube. The liposome/siRNA mixture was allowed to stand for 20 minutes at room temperature before use. Under these conditions, the lipoplex has a cationic lipid/siRNA ratio of 7.5:1 (wt./wt.), and the charge ratio is calculated to be 4.54 positive charges for 1 negative charge. The liposome/siRNA mixture (at a final concentration of 0.032 μM 730 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. in siRNA) was added to U373 and T98G TMZ-LTTand TMZ-S cells for 2 hours. On day 2, each group of cells was pooled and replated for subsequent experiments. On days 3, 5, 7, and 9, glioma cells were lysed directly in Cellytic solution (Sigma). The efficiency of the AKR1C3 siRNA was evaluated by means of Western blot analysis. Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 Statistical Analyses Data obtained from independent groups were compared by the nonparametric Kruskal-Wallis (more than two groups) or MannWhitney U tests (two groups). The standard survival time analyses were carried out with the log-rank test. The statistical analysis was performed using Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK). Computer-Assisted Phase-Contrast Video Microscopy For human U373 and T98G GBM cell lines, the effects of longterm treatment with TMZ and AKR1C3 siRNA (vs scramble siRNA) on cell viability, growth, and division were characterized in vitro by the use of computer-assisted phase-contrast video microscopy, as described elsewhere [33]. Cells were monitored for 72 hours. Films were compiled on the obtained time-lapse image sequences, which enabled a rapid screening of cell viability. Cell count–based determination of global growth ratio. In each (control or treated) condition, the cell growth level was evaluated by the ratio between the numbers of cells counted in the last and first frames of the image sequences. The global growth ratio (GGR) was defined by the ratio between the two growth levels obtained in the treated and control conditions. All of the cell counts were performed in triplicate using an interactive computer tool [33,34]. The GGRs were computed at the 24th, the 48th and the 72nd hour of quantitative video microscopy analyses by dividing the cell growth level in TMZ-LTT GBM cell populations by the cell growth level at the same experimental times in the corresponding TMZ-S GBM cell populations. In the AKR1C3 siRNA experiments, we followed the number of cells for 6 days (2 days after transfection). For a quantitative measure of proliferation on AKR1C3 siRNA, the GGRs were computed between siRNA and scramble conditions at 3, 5, 7, and 9 days after transfection. Specific analysis of cell division rate and duration. Cells undergoing division exhibit very bright patterns compared with nondividing cells. On the basis of this observation, we developed a custom division detection system capable of identifying cells undergoing division in time-lapse sequences. This detection method is based on an automatic event detection completed by an interactive validation/correction procedure as previously described [33,34]. At the end of the sequence analysis, all events are linked to different cell divisions, making available the number of cell divisions as well as their durations [33,34]. We computed the cell division numbers normalized by the number of cells that were counted in the first frame. Determination of In Vitro Cell Cycle Kinetics TMZ-S and TMZ-LTT GBM cells were incubated for 72 hours in culture medium. Cells were collected by trypsinization and were neutralized with cell medium. Cell suspensions were centrifuged for 10 minutes at 1000 rpm at room temperature and then washed two times with PBS before being fixed in 70% ethanol. Cells were stored at −20°C for 24 hours. Flow cytometry using propidium iodide was performed. Briefly, fixed samples were washed with PBS and resuspended in propidium iodide (1 mg/ml) and RNase (200 μg/ml) for at least 30 minutes at 37°C in the dark. Stained cells were analyzed on a cell laboratory Quanta SC flow cytometer (Beckman Coulter, Suarlée, Belgium). We analyzed the percentage of cells in the G0/G1, S, and G2/M phases of the cell cycle and took into account the percentage of polyploid cells (as detailed elsewhere [35,36]) that were removed from the cell cycle kinetic determination. Results Chronic In Vivo Treatment of TMZ-S and TMZ-LTT U373 and T98G Orthotopic GBM Xenografts with TMZ Figure 1A shows that without additional TMZ treatment, the U373 TMZ-LTT xenografts in vivo displayed more aggressive behavior in vivo than U373 TMZ-S xenografts in survival (P < .001). This feature has not been observed with the T98G model (Figure 1B). The aggressive nature of U373 TMZ-LTT xenografts when compared with U373 TMZ-S cells seems to be partially associated with the higher invasive pattern for U373 TMZ-LTT xenografts, as illustrated in Figure 1C. For all tested models, per os TMZ treatment strongly and significantly improved mouse survival (Figure 1, A and B). It should be noted that we killed all mice after 287 days to avoid contamination. To characterize the resistance acquisition in the TMZ-LTT groups, we computed survival gains as being the differences of the median survival times between each treated group and its respective control. For the U373 TMZ-S group, the median survival was 116 days for the control and up to 287 days for the treated group, whereas the median survival was 51 days for the control and 203 days for the TMZ-LTT–treated group (Figure 1A). The survival gains were 152 days for the TMZ-LTT group and up to 171 days in the TMZ-S group. We performed similar studies for the T98G cell lines. The survival gains were 124 days for the TMZ-LTT and up to 222 days for the TMZ-S groups (Figure 1B). The diminution in survival gain for the TMZ-LTT group compared with the TMZ-S group suggests that long-term treatment with TMZ induces the development of a certain level of resistance to this chemotherapeutic agent, whereas full resistance has not been reached. The TMZ IC50 (inhibitory concentration 50%) in vitro growthinhibitory concentrations ranged between 150 and 200 μM for TMZ-S groups in U373 and T98G cell lines (as revealed by the MTT colorimetric assay; data not shown), whereas TMZ-LTT U373 and T98G cells were adapted to grow up to 1 mM. Characterization of Cancer Stem Cell Profiles in TMZ-LTT versus TMZ-S U373 and T98G GBM Cells Beier et al. [28] recently demonstrated that TMZ induces a dose- and time-dependent decline of the stem cell subpopulation (i.e., CD133+ cells) in various experimental glioma models. We thus analyzed the expression of CD133 and other stem cell markers such as CD44, nestin, and MELK [24,37] in TMZ-LTT U373 and T98G GBM cells and compared the expression to the levels found in TMZ-S cells. The RT-PCR analyses (Figure 1D) did not reveal any difference in the patterns of expression of stem cell markers in U373 and T98G TMZ-S versus TMZ-LTT GBM cells [22,23]. Indeed, in our current study, longterm TMZ treatment did not eliminate CD133+ cells in the U373 and T98G GBM cell lines (Figure 1D) [22,23], whereas we had previously shown that this occurred with Hs683 malignant oligodendroglioma cells [30]. It has been established that highly malignant gliomas contain various proportions of astrocytic versus oligodendroglial tumor cells [38,39]. Thus, the possibility remains that TMZ preferentially eliminates CD133+ cells in malignant gliomas with an oligodendroglial component. Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. 731 Figure 1. Survival of immunocompromised mice with brain xenografts of TMZ-S (blue dots) versus TMZ-LTT (red triangles) U373 (A) and T98G (B) GBM cells. Mice were orthotopically grafted into their brains with 106 U373 or T98G tumor cells on day 0 (D0). U373 and T98G GBM cells that previously grew in vitro for months in the presence of 1 mM TMZ are labeled “TMZ-LTT,” whereas those without any TMZ treatment in vitro are labeled “TMZ-S” (see Materials and Methods). The mice bearing orthotopic TMZ-S (blue symbols) versus TMZ-LTT (red symbols) GBM xenografts (11 mice per experimental group) were left untreated (open symbols) or were treated with TMZ (full symbols). The TMZ treatment (80 mg/kg per os) was given three times a week (Monday, Wednesday, and Friday) for three consecutive weeks, with treatment started on D14. For each cell line, the P value was calculated by comparing the control and the treated groups, in addition to comparing the two CT groups in (A). (C) Morphologic illustrations (hematoxylin-eosin staining, ×40) of a TMZ-S (Ca) versus a TMZ-LTT (Cb) U373 orthotopic xenograft in the brains of immunocompromised mice after having injected 106 TMZ-S or TMZ-LTT U373 GBM cells 42 days earlier. BP indicates brain parenchyma; T , tumor. Arrows show tumor islets invading the normal parenchyma. (D) mRNA expression (RT-PCR analysis) of nestin, GFAP, vimentin, cytokeratin 20 (CK20), CD133, CD90, CD44, and MELK in U373 and T98G TMZ-S and TMZ-LTT cells. HT-29 colon cancer cells were used as an internal control. Actin RT-PCR was used as a quality control for the reverse transcription and the PCR. It must be noted that U373 GBM cells express GFAP depending on the substratum on which the cells are cultured [22]. In the current study, the GBM cells were cultured on plastic. The human HT29 colon cancer cells were used as a control cell population to illustrate the absence of vimentin and the presence of cytokeratin CK20 expression in these cells (Figure 1D). Cell Population Growth Dynamics and Cell Cycle Kinetics Table 1 reveals that genes involved in cell proliferation enabled the best discrimination between U373 and T98G TMZ-S and TMZ-LTT cells. We therefore made use of quantitative video microscopy and flow cytometry to analyze the growth dynamics and cell cycle kinetics of the U373 and T98G TMZ-S versus TMZ-LTT GBM cell populations. Figure 2A shows that U373 TMZ-LTT GBM cells display higher growth kinetic rates over time when compared with U373 TMZ-S GBM cells, as shown by the GGR index. Indeed, a GGR of about 1.4 at 24 hours for U373 LTT cell indicates that the growth level was 1.4 times higher in the U373 TMZ-LTT GBM cell population at the 24th hour of the quantitative video microscopy analysis when compared with the growth rate of U373 TMZ-S cells. This increase in cell grow rate consistent with the in vivo data illustrated in Figure 1A, 1Ca, and 1Cb clearly shows higher biological aggressiveness for U373 TMZ-LTT GBM cells compared with U373 TMZ-S GBM cells. In contrast, T98G TMZ-LTT GBM cells seem to grow slower than T98G TMZ-S cells (Figure 2A). This feature has been validated by the in vitro experiments reported below and could, at least partly, relate 732 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 to acquired dependence to the chemotherapeutic as already demonstrated by Martello et al. [40]. We performed flow cytometry analysis to investigate the cell cycle kinetics in U373 and T98G TMZ-LTT versus TMZ-S cell populations (Figure 2B). No significant differences were found in terms of cell cycle kinetics between these various GBM cell populations (Figure 2B). We made use of T98G GBM TMZ-S cells treated for 72 hours with 150 μM TMZ as a positive control (Ct+) for the flow cytometry analysis. The data in Figure 2C show that the higher growth kinetics (as revealed by the GGR assessment in Figure 2A) observed in U373 TMZ-LTT GBM cells when compared with TMZ-S counterparts (Figure 2A) could be partially attributed to an increased mitotic rate, with the fraction in G1, S, and G2 phases remaining unaffected between TMZ-LTT and TMZ-S GBM cells (Figure 2B). Similarly, the lower growth kinetics observed in T98G TMZ-LTT GBM cells when compared with TMZ-S counterparts (Figure 2A) could be partially attributed to a weaker mitotic rate (Figure 2C ). The higher mitotic rate observed in U373 TMZ-LTT GBM cells when compared with the TMZ-S counterparts (Figure 2C ) seems to translate into shortened (P < .001) mitosis duration times (data not shown). In a similar fashion, the decrease in mitotic rates observed in T98G TMZ-LTT GBM cells when compared with the TMZ-S counterparts (Figure 2C) seems to translate to increased (P < .001) mitosis duration times (data not shown). Whole Human Genome Analyses in GBM TMZ-S versus GBM TMZ-LTT Models Table 1 details the gene categories whose expression profiles were significantly altered in human U373 and T98G GBM cell lines treated for long periods with increasing concentrations of TMZ up to 1 mM. The genes that were most significantly altered both in the U373 and T98G GBM models included the AKR1C (AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3) and GLUT transporter (mainly GLUT-1, GLUT-3, GLUT-5, and GLUT-10) families of genes. We therefore focused our attention on the proteomic expressions of these genes in the U373 and T98G TMZ-S and TMZ-LTT cell lines. Figure 2D illustrates which were the three genes whose expression were the most increased during long-term TMZ treatment. For example, “SCRG1 ×13” indicates that the expression of the SCRG1 gene was increased by 13 times under prolonged treatment with TMZ. It is interesting to note that SCRG1 is a potential marker of autophagy [41], knowing that TMZ indeed induces marked proautophagic effects in GBM cells [12,13]. The GLUT genes. Figure 3 shows that GLUT-1 was already highly expressed in the U373 and T98G TMZ-S cells and that treating these cells for long periods with increasing concentrations of TMZ only slightly increased GLUT-1 expression in the U373 and T98G TMZLTT cells. The data obtained from clinical samples confirm the high levels of GLUT-1 expression in clinical samples of gliomas as well as in normal brain tissues, with no differences in expression between the various histopathologic groups. Sustained treatment of U373 and T98G TMZ-S GBM cells with TMZ increased GLUT-3 expression in both cell lines. We therefore decided to investigate GLUT-3 expression at the proteomic level in these cell lines. Figure 4, A and B, shows that we failed to detect an increase in GLUT-3 and GLUT-10 expressions using Western blot analysis. We thus proceeded with immunofluorescence analysis and Table 1. Gene Categories Underexpressed or Overexpressed in the Set of Genes Detected as Differentially Expressed in Human U373 and T98G GBM Left Untreated (S) versus TMZ Long-term Treated (LTT) Cells. System* Gene Category† List Population ¶ Hits U373 Biological system # Ease Score‡ Bootstrap Score§ Genes LTT/S Ratio SPP1 RRM2 SPOCK1 AKR1C1 AKR1C2 AKR1C3 SULF1 IGFBP5 IGFBP2 11.5 4.1 3.2 4.2 3.6 3.1 8.5 4.9 4.1 RRM2 CCNA2 MCM6 CCMB1 SMC4 PBK RARRES3 BST2 BTC 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 6.3 5.4 4.7 †† Total Hits** Total Cell proliferation 5 94 1040 10,979 0.00004 0.001 Molecular function Trans-1/2-dihydrobenzene-1/2-diol dehydrogenase activity 3 96 3 11,107 0.0002 0.005 Cellular component Extracellular space 5 95 391 10,824 0.0006 0.005 Mitotic cell cycle 5 334 329 10,937 0.0003 0.001 Biological process Cell cycle 6 334 690 10,937 0.0005 0.001 Biological process Cell proliferation 6 334 1036 10,937 0.0006 0.001 T98G Biological system *The system of categorizing genes (e.g., “GO (gene ontology) Biological System”) in the databases provided by the EASE software package [29,30]. The specific category of genes within the system. ‡ The probability value characterizing the change of proportion between the two ratios: population hits/population total and list_hits/list_total. It constitutes the upper band of the distribution of leave-1out Fisher exact probabilities computed on these two ratios. § An iteratively running overrepresentation analysis on random gene lists to determine true probability more accurately. ¶ The number of genes in the list of differentially expressed genes (list_diff resulting from the microarray data analysis) that belong to the Gene Category. # The number of genes in list_diff that belong to any gene category within the system. **The number of genes in the total group of genes assayed (list_tot) that belong to the specific gene category. †† The number of genes in list_tot that belong to any gene category within the system. † Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. 733 Figure 2. (A) In vitro global growth rate determination (by means of the GGR assessment as described in Materials and Methods) of U373 and T98G TMZ-LTT GBM cells compared with the TMZ-S counterparts (see Figure 1 and its legend). (B) Flow cytometry analysis for cell cycle kinetic determination in U373 versus T98G TMZ-S versus TMZ-LTT cells. Sub-G1 cells were excluded from the cell cycle kinetic analysis using a methodology that was detailed previously [39]. The positive control (Ct+) was T98G GBM TMZ-S cells that were treated for 72 hours in the presence of 150 μM TMZ. (C) Numbers of cell division events detected during the 72-hour treatment of TMZ-S and TMZ-LTT. The relative number of mitosis is the number of cell divisions counted and normalized by the number of cells counted in the first frame. (D) Illustration of the three genes whose expressions have been the most markedly activated by long-term TMZ treatment in U373 OR T98 versus U373 and T98G GBM cells. observed variations in the expression of the two glucose transporters, which may partly explain the apparent discrepancies between the Western blot and immunofluorescence analyses. The latter show that GLUT-10 protein expression is indeed more important in U373 TMZ-LTT (Figure 4Cb) than in U373 TMZ-S (Figure 4Ca) GBM cells. We obtained similar data with T98G TMZ-S versus TMZ-LTT GBM cells (data not shown). In fact, the expression of GLUT-10 is localized to a perinuclear body, the nature of which has been already demonstrated by Coucke et al. [42]. Figure 4Cd highlights the GLUT-10 perinuclear localization, with the corresponding bright field in Figure 4Cc. We also observed an increase in GLUT-3 perinuclear protein expression in U373 TMZ-LTT (Figure 4Db) and T98G TMZ-LTT (data not shown) compared with U373 TMZ-S (Figure 4Da) and T98G TMZ-S (data not shown) GBM cells. Sustained TMZ treatment increased GLUT-5 messenger RNA (mRNA) levels in U373 GBM cells (GLUT-5 seems not to be expressed in T98G GBM cells) and GLUT-10 mRNA levels in T98G GBM cells, with significant levels of GLUT-10 mRNA already present in U373 TMZ-S GBM cells (Figure 3). When analyzing the glioma clinical samples, GLUT-10 mRNA expression levels were maximal in GBMs, whereas GLUT-3 and GLUT-5 mRNA levels displayed heterogeneous patterns among the various histopathologic groups under study. The AKR1C genes. Figure 5 shows that sustained treatment of U373 and T98G GBM cells with TMZ for long periods (several months) led to marked increases in AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3 mRNA levels, a feature that has been confirmed at the proteomic level for AKR1C2 and AKR1C3, as illustrated at the bottom of Figure 5. We also investigated the patterns of AKR1C1 expression in U373 and T98G TMZ-S versus TMZ-LTT at the proteomic level but could not confirm the overexpression of AKR1C1 observed at the mRNA level (data not shown). As detailed in the Discussion, AKR1C gene products are implicated in chemoresistance and cell proliferation processes. Reducing AKR1C3 expression in U373 and T98G GBM cells affected cell behavior on two levels: 1) the growth dynamics of U373 and T98G GBM cell populations (by means of quantitative video microscopy) and 2) the sensitivity of U373 and T98G GBM cells to TMZ (by means of the MTT colorimetric assay). We focused on AKR1C3 because we were able to design selective and efficient silencing for AKR1C3. We have not investigated 734 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. the silencing of AKR1C1 and AKR1C2 because the homology of the two genes is high, preventing us from obtaining selective AKR1C1 versus AKR1C2 siRNA. The data revealed that transient silencing of AKR1C3 in U373 TMZ-LTT GBM cells significantly decreased their global growth rate (as assessed by the GGR index in Figure 6). Western blot analysis Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 revealed the efficiency of knockdown using the AKR1C3 siRNA (Figure 6). Silencing AKR1C3 in U373 and T98G TMZ-LTT GBM cells did not alter their sensitivity to a variety of cytotoxic drugs (data not shown). Altogether, these data suggest that TMZ-induced increases in AKR1C3 expression did not modify GBM cell sensitivity to cytotoxic drugs, whereas U373 GBM cells defended themselves in Figure 3. Left panels: Determination of GLUT-1, -3, -5, and -10 mRNA levels (by means of an Affymetrix whole genome analysis; see Materials and Methods) in human T98G and U373 TMZ-S (open bars) and TMZ-LTT (gray bars) GBM cells. The data are illustrated as medians and MADs (error bars). Right panels: Determination of GLUT-1, -3, -5, and -10 mRNA levels in a clinical series of 23 normal brain samples (NB) and 159 gliomas (O-II = oligodendroglioma grade 2 [n = 38], O-III = oligodendroglioma grade 3 [n = 12], A-II = astrocytoma grade 2 [n = 10], A-III = astrocytoma grade 3 [n = 19], and GBM = GBM grade 4 [n = 77]). Data were extracted from microarray experiments performed at the Henry Ford Hospital GSE4290), as described in the Materials and Methods section. Data are reported as individual tissue measurements (1 tissue measurement = 1 black dot) and median values (bars). Statistical comparisons have been performed between each tumor group and the normal brain tissue (control) group. Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. 735 Figure 4. Western blot analysis of GLUT-10 (A) and GLUT-3 (B) expression in T98G and U373 TMZ-S and TMZ-LTT GBM cells. (C) Lowmagnification (×80) immunofluorescence analysis of GLUT-10 in U373 GBM cells with TMZ-LTT (Cb) versus TMZ-S (Ca). The white arrows point to a very intense GLUT-10–associated spot that is apparent in each U373 GBM cell. High-magnification (×400) of bright-field (Cc) versus immunofluorescence (Cd) analyses in U373 TMZ-LTT are also provided: the blue DAPI stain reveals the nucleus of a U373 TMZ-LTT GBM cell, whereas the green stain highlights GLUT-10 perinuclear localization. (D) Low-magnification (×80) immunofluorescence analysis of GLUT-3 protein expression in TMZ-LTT (Db) versus TMZ-S (Da) U373 GBM cells. The white arrows point to a very intense GLUT-3–associated spot that is apparent in each U373 GBM cell. increasing their proliferation rates (Figure 2), a feature that translated in vivo by an increased biological aggressiveness (Figure 1). AKR1C3 thus seems implicated in this process observed in U373 GBM cells. In contrast, T98G GBM cells became dependent on TMZ for their growth as detailed previously (Figure 2). Discussion Gliomas account for more than 50% of all primary brain tumors [1–6]. The worst prognosis is associated with gliomas of astrocytic origin, whereas gliomas with an oligodendroglial origin offer a higher sensitivity to chemotherapy, especially when oligodendroglioma cells display 1p19q deletions [1,4]. TMZ provides therapeutic benefits and is commonly used with radiotherapy in highly malignant astrocytic tumors, including GBMs [1–7]. However, all GBMs become resistant to TMZ [43]. Nevertheless, it seems that glioma cell sensitivity to TMZ may differ in whether they arose from oligodendroglial versus astroglial progenitors. Indeed, we recently reported increased TMZ sensitivity of Hs683 orthotopic malignant oligodendrogliomas that were previously treated in vitro with increasing TMZ concentrations before being xenografted into the brains of immunocompromised mice [30]. Whole genome and proteomic analysis revealed that this increased TMZ sensitivity could be explained, at least partly, by a TMZ-induced p38dependent dormancy state, which in turn resulted in changes in amino acid metabolism balance, delay in growth, and a decrease in Hs683 oligodendroglioma cell–invasive properties [30]. In the current study, we made use of two GBM cell lines of astrocytic origin, namely, U373 and T98G [22,23], and observed that TMZ resistance acquired by these two cells lines translated into overexpression of several glucose transporters (GLUT) and of three members of the aldoketo reductase (AKR) family, namely, AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3. 736 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. As emphasized by Gatenby and Gillies [44], a near-universal property of primary and metastatic cancers is up-regulation of glycolysis, resulting in increased glucose consumption, a feature that was elucidated in 1956 by Warburg [45]. Persistent metabolism of glucose to lactate Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 even in aerobic conditions seems to be an adaptation to intermittent hypoxia [46]. HIF-1α, a hypoxia-activated transcription factor, is implicated in the overexpression of several important enzymes implicated in the conversion of glucose into lactate [46]. Figure 5. Left panels: Determination of AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3 mRNA levels of expression (by means of an Affymetrix whole genome analysis; see Materials and Methods) in human T98G and U373 TMZ-S (open bars) and TMZ-LTT (gray bars) GBM cells. Data are illustrated as medians and MADs (error bars). Right panels: Determination of AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3 mRNA expression levels in a clinical series of 23 normal brain samples (NB) and 159 gliomas (O-II = oligodendroglioma grade 2 [n = 38], O-III = oligodendroglioma grade 3 [n = 12], A-II = astrocytoma grade 2 [n = 10], A-III = astrocytoma grade 3 [n = 19], and GBM = GBM, grade 4 [n = 77]). Data were extracted from microarray experiments performed at the Henry Ford Hospital as described in Materials and Methods section. Data are reported as individual tissue measurements (1 tissue measurement = 1 black dot) and median values (bars). Statistical comparisons have been performed between each tumor group and the normal brain tissue (control) group. Bottom: Western blot analysis of AKR1C2 and AKR1C3 protein expression in T98G and U373 TMZ-S and TMZ-LTT GBM cells. Neoplasia Vol. 12, No. 9, 2010 Figure 6. Upper panel: GGR computed at 3, 5, 7, and 9 days in AKR1C3 siRNA-transfected U373 TMZ-LTT GBM cell populations (see legend to Figure 2A) versus scramble transfected cells. All experiments were performed in triplicate. Bottom panel: Methodological control (Western blot analysis) of AKR1C3 siRNA versus scramble siRNA efficiency in U373 TMZ-LTT GBM cells. The Western blot (WB) bands have been digitized, and quantitative data below the WB bands represent the number of pixels of the band multiplied by pixel intensity, the final result of which has been normalized to the corresponding tubulin band. Our data reveal that long-term treatment of astroglioma U373 and T98G cells leads to overexpression of GLUT-1, -3, and -10. Hypoxia increases the expression of GLUT-1 [47,48], GLUT-3 [48], and GLUT-10 [47]. Therefore, it seems that astroglioma cells facing adverse TMZ-induced events react by overexpressing GLUT transporters and subsequently increasing glucose intake to partly counteract the TMZ-induced antiangiogenic effects [11]. Indeed, glycolytic breakdown of glucose is preceded by the transport of glucose across the cell membrane, a rate-limiting process mediated by facilitative glucose transporter proteins belonging to the facilitative glucose transporter/solute carrier GLUT/SLC2A family [44,48]. Mutations in GLUT-10 alter angiogenesis [42]. Overexpression of GLUT-3 mRNA is correlated with tumor grade, and protein expression of this glucose transporter has been demonstrated in GBM but not in other grade [49]. Nishioka et al. [50] have suggested that the increased expression of GLUT-3 may be closely related to the malignant progression of astrocytomas to GBMs and related to the aberrant neovascularization that accompanies GBMs. GLUT-3 indeed seems to be a GLUT transporter that correlates directly with glioma aggressiveness [49,51]. Furthermore, our current data clearly show that long-term treatment of both U373 and T98G GBM cells translates into overexpression of GLUT-3 (Figures 3 and 4). Other studies have reported associations between increased GLUT expression and increased proliferative indices [48,52]. It is well known that astrocytes play a role in brain metabolism, being a key element in the capture of energetic compounds from the circulation and deliver- GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. 737 ing these compounds to active neurons [53]. Glioma cells display higher proliferation rates than normal astrocytes, and this proliferative dysfunction is associated with changes in gap junction communication [53]. Indeed, the inhibition of gap junction communication is associated with an increase in glucose uptake because of a rapid change in the localization of both GLUT-1 and type 1 hexokinase; this effect persists from the up-regulation of GLUT-1 and type 1 hexokinase and to the induction of GLUT-3 and type 2 hexokinase [53]. In addition, cyclins D1 and D3 have been found to act as sensors of the inhibition of gap junctions and have been proposed to play the role of mediators in the observed mitogenic effect [53]. All of these features may partly explain the data we report here. The data suggest potential relationships between GLUTexpression, cell proliferation, and partial acquisition of resistance to TMZ, at least in U373 GBM cells, which diffusely invade the brain parenchyma [54] and display higher biological aggressiveness compared with T98G GBM cells [22,23]. GLUT-5 is a particular glucose transporter because it displays a high affinity for fructose and a low affinity for glucose [55]. The data from the present study show that GLUT-5 is expressed at very low basal levels in U373 GBM cells but is not expressed in T98G GBM cells and that long-term TMZ treatment augments its expression in U373 GBM cells (Figure 3). AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3 are members of the AKR superfamily [56]. The AKR1C family of proteins are phase 1 drugmetabolizing enzymes involved in the maintenance of steroid homeostasis, prostaglandin metabolism, and metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons [56,57]. Increased expression of AKR1C proteins directly correlates with poor prognosis in breast and prostate cancers [56] and with chemoresistant features in non–small cell lung [58] and colon [59] cancer. The data in the current study reveal that the expression of AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3 was significantly increased in both U373 and T98G GBM cells (at both the mRNA and protein levels) after long-term TMZ treatment (Figure 5). Transient silencing of AKR1C3 protein in both U373 TMZ-LTT GBM cells induced a decrease in proliferation rates (Figure 6) but an increase in chemosensitivity of AKR1C3deficient U373 and T98G TMZ-LTT cells when compared with naive (wild-type) U373 and T98G TMZ-LTT cells. Chien et al. [57] established mouse NIH3T3 mouse cell lines ectopically and stably expressing human AKR1C1, AKR1C2, or AKR1C3 and showed that ectopic expression of human AKR1C1 and AKR1C2, but not AKR1C3, significantly enhanced foci formation. After subcutaneous injection of these stable cell lines into nude mice, fibrosarcomas formed from all three cell lines [57]. However, the number and size of tumors formed by the AKR1C3expressing cell line was fewer and smaller than those formed by AKR1C1- and AKR1C2-expressing cells [57]. Davies et al. [60] identified AKR1C isoforms as novel targets of jasmonates in cancer cells. Furthermore, these authors provided further evidence of the promise of these compounds, or derivatives thereof, as adjunctive therapies in the treatment of cancer. Increased levels of expression of AKR1C1 parallels increased cell proliferation activity in human colon cancer cells [59]. It has been known that AKR1C3 can catalyze the conversion of prostaglandin D2 to prostaglandin F2α′, which is an activator of cell proliferation [61]. This reaction inhibits the natural conversion of prostaglandin D2 to prostaglandin J2, which is known to be a ligand of peroxysome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) [61]. The activation of PPARγ by a natural agonist (such prostaglandin J2) usually increases the expression of GLUT-3, as demonstrated by Garcia-Bueno et al. [62]. Thus, although we observed an overexpression of AKR1C3, we should 738 GBM Cell Resistance to Temozolomide Le Calvé et al. detect a decrease in cellular GLUT-3 expression. However, the reverse feature has been observed, and it is already known that HIF-1α activates transcription of GLUT-1 and -3 [45]. Thus, altogether, these data suggest that GLUT-3 overexpression is controlled by HIF-1α rather than by the PPARγ signaling pathways. In conclusion, our data show that long-term treatment of human astroglioma cells with TMZ induces increased expression of facilitative glucose transporter/solute carrier GLUT/SLC2A family members, primarily GLUT-3, and of the AKR1C family of proteins that are phase 1 drug-metabolizing enzymes involved in the maintenance of steroid homeostasis, prostaglandin metabolism, and metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons. GLUT-3 has previously been suggested to exert roles in GBM neovascularization processes, whereas TMZ has been shown to exert antiangiogenic effects in experimental gliomas. AKR1C1 has previously been shown to be associated with oncogenic potential and proproliferative effects, as has AKR1C3 in this latter case. Both AKR1C1 and AKR1C2 proteins are involved in cancer cell chemoresistance. Selective targeting of GLUT-3 and/or AKR1C proteins (by means of jasmonates, in the case of AKR1C) in GBM could delay the acquisition of resistance to TMZ by astroglioma cells when treated for long periods with this drug. Acknowledgments The authors thank Jean-François Gaussin and Mischael Dehoux for their excellent technical assistance for the in vivo experiments, which were performed at Unibioscreen SA (Brussels, Belgium). References [1] Louis DN (2006). Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol 1, 97–117. [2] Ohgaki H and Kleihues P (2007). Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma. Am J Pathol 170, 1145–1453. [3] Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, Weller M, Fisher B, Taphoorn MJ, Belanger K, Brandes AA, Marosi C, Bogdahn U, et al. (2005). Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 352, 987–996. [4] Lefranc F, Facchini V, and Kiss R (2007). 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Voici ci-dessous les deux figures telles qu’elles devraient être représentées. 79 T98G U373 A -N -LTT –N -LTT T98G U373 B -N -LTT –N -LTT GLUT10 GLUT3 Tubulin Tubulin Ca Cc Cb Cd Da Db RESULTATS - 2 RESULTAT - II In vitro anticancer activity, toxicity and structure–activity relationships of phyllostictine A, a natural oxazatricycloalkenone produced by the fungus Phyllosticta cirsii Benjamin Le Calvé, Benjamin Lallemand, Carmen Perrone, Gaëlle Lenglet, Sabine Depauw, Gwendoline Van Goietsenoven, Marina Bury, Maurizio Vurro, Françoise Herphelin, Anna Andolfi, Maria Chiara Zonno, Véronique Mathieu, François Dufrasne, Pierre Van Antwerpen, Yves Poumay, Marie-Hélène DavidCordonnier, Antonio Evidente, Robert Kiss Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8-17 81 Résumé Les molécules d’origine naturelle représentent un réservoir très important pour la découverte de structures à potentiels anticancéreux. Dans notre travail nous nous sommes intéressés à des molécules extraites de champignon. Les phyllostictines sont des métabolites naturels produits par Phyllosticta cirsii, un champignon parasite qui se développe sur certaines plantes de l’hémisphère Nord, notamment le Cirsium arvense classé comme nuisible pour l’agriculture. A l’origine, ces molécules pourraient constituer de potentiels bio-herbicides comme il a déjà été démontré pour d’autres souches de cette famille comme Phyllosticta maydis et medicaginis. Quatre métabolites ont été extraits de la culture en biofermenteur de la souche Phyllosticta cirsii, avec des rendements variables. Chaque molécule est de type oxazatricycloalkénones naturels et elles ont été nommées comme suit : phyllostictine A, B, C et D. Deux autres métabolites ont été extraits du milieu de culture avec des structures différentes des phyllostictines : la phyllostoxine et la phyllostine. L’équipe du docteur Evidente de l’Université de Naples a travaillé sur les phyllostictines et a démontré des activités herbicides sur Cirsium arvense. La plus active étant la phyllostictine A qui est plus efficace que le glyphosate, molécule herbicide de référence. Les phyllostictines B et la D ont montré une activité herbicide plus faible que leur homologue A et la phyllostictine C n’a aucune activité herbicide. Les phyllostictines A et B ont été aussi testées pour évaluer leurs activités antimicrobiennes et zootoxiques. Au cours de ces tests c’est la phyllostictine A qui s’est montrée la plus active. Il a été synthétisé deux dérivés mono- et diacétylé de la phyllostictine A. Dans notre travail, nous avons caractérisé le potentiel antitumoral des phyllostictines en étudiant leurs activités inhibitrices de croissance sur des lignées cellulaires normales et cancéreuses d’origine histologique diverse. Puis dans un deuxième temps, nous avons tenté de mettre en évidence par quel mécanisme d’action les phyllostictines agissent sur les cellules tumorales. Pour des raisons de rendement d’extraction la plupart des expériences ont été menées sur la phyllostictine A qui est la molécule la plus disponible dans le milieu de culture du champignon. Nous avons dans un premier temps déterminé la concentration inhibitrice de 50% (indice IC50) sur cinq lignées cancéreuses (quatre humaines et une murine) puis sur six 82 lignées cellulaires normales (quatre kératinocytes en conditions de confluence et de sousconfluence et deux fibroblastes). Les indices IC50 pour les lignées cancéreuses ainsi que pour les lignées de fibroblastes sont à peu près de l’ordre du µM ce qui indique que la phyllostictine A n’est pas biosélective pour les lignées cancéreuses. Par contre, pour les fibroblastes en condition de sous-confluence, les indices IC50 sont plus hétérogènes avec des valeurs qui oscillent entre 20 et 100µM. En condition de confluence, pour les mêmes lignées cellulaires, les IC50 apparaissent plus élevés ce qui pourrait indiquer que la phyllostictine A joue sur des mécanismes de prolifération cellulaire. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons analysé le cycle cellulaire par cytométrie de flux grâce au marquage de l’ADN par l’iodure de propidium sur la lignée cellulaire de glioblastome U373-MG traitée à la concentration IC50 pendant 48 heures. Les résultats obtenus montrent que le nombre de cellules diminue dans les phases G0/G1 alors que dans les phases G2/M ce nombre augmente. Il semblerait donc que la phyllostictine A induise un blocage du cycle cellulaire en phase G2/M dans la lignée U373-MG. Nous avons par la suite analysé le taux de cassure de l’ADN toujours par analyse en cytométrie de flux grâce à la technique TUNEL. Après un traitement similaire à celui utilisé pour l’analyse du cycle cellulaire, il ressort de cette analyse que la quasi-totalité des cellules présentent des cassures au sein de leur ADN ce qui confirme les résultats de cycle cellulaire puisque les cellules deviennent incapables de se diviser. Dans un deuxième temps, nous avons essayé de déterminer le mécanisme d’action anticancéreux de la phyllostictine A. Tout d’abord, nous avons analysé, en collaboration avec l’équipe du professeur David-Cordonnier de l’Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (France), la capacité de la phyllostictine A à alkyler ou acyler l’ADN. Il apparaît clairement que la phyllostictine n’est pas capable de se lier à l’ADN ou d’en modifier la structure. Dans un deuxième temps, nous avons analysé la capacité de la phyllostictine A à interagir avec des groupements thiols libres. Pour cela, la phyllostictine est incubée pendant 16 heures à 37°C avec de la L-cystéine, du glutathion ou de la Nacétyle cystéine. Il apparaît qu’après analyse par spectrométrie de masse, il se forme des adduits entre la phyllostictine A et les groupements thiols libres des différentes molécules précédemment citées. L’activité anticancéreuse de la phyllostictine A résiderait ainsi dans sa capacité à lier les groupements thiols libres au sein de ces cellules. 83 Enfin, nous avons déterminé la concentration IC50 de chacune des phyllostictines et des deux dérivés semi-synthétiques par le test colorimétrique MTT sur cinq lignées cancéreuses humaines (U373-MG, Hs683, A549, SKMEL-28) et murine (B16F10). Il apparaît que la phyllostictine A ainsi que ses deux dérivés présentent les IC50 les plus faibles (de l’ordre du µM) sur l’ensemble des lignées cellulaires alors que pour les phyllostictines B et D, les valeurs IC50 sont toutes comprises entre 20 et 70µM. A partir de ces résultats nous avons pu déterminer les éléments indispensables à l’activité inhibitrice de croissance de ces molécules. La taille du macrocycle ainsi que la présence du noyau β-lactame rendent les phyllostictines plus actives. La mono et la diacétylation de la phyllostictine A augmente légèrement son activité anticancéreuse permettant certainement un meilleur passage de la membrane plasmique. L’intérêt de ces molécules se situe aussi dans leur activité sur les cellules résistantes présentées dans la première partie des résultats. En effet, la phyllostictine A s’est montrée aussi active, in vitro, sur les modèles U373-MG et T98G sensibles et résistants au témozolomide. Ces résultats ne sont pas publiés dans l’article suivant mais sont repris dans la partie 2.1 de la Discussion. En conclusion, les phyllostictines présentent une activité anticancéreuse intéressante qui pourrait être améliorée par la synthèse de dérivés hémisynthétiques conservant les structures actives au sein de la molécule. De plus, il reste à déterminer leur cible avec précision puisque la capacité à lier des groupements thiols libres peut agir sur de nombreuses cibles protéiques potentielles (modification structure tertiaire ou quaternaire de protéine, activité enzymatique…). 84 Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 Contents lists available at ScienceDirect Toxicology and Applied Pharmacology j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. e l s e v i e r. c o m / l o c a t e / y t a a p In vitro anticancer activity, toxicity and structure–activity relationships of phyllostictine A, a natural oxazatricycloalkenone produced by the fungus Phyllosticta cirsii Benjamin Le Calvé a, Benjamin Lallemand b, Carmen Perrone c, Gaëlle Lenglet d, Sabine Depauw d, Gwendoline Van Goietsenoven a, Marina Bury a, Maurizio Vurro e, Françoise Herphelin f, Anna Andolfi c, Maria Chiara Zonno e, Véronique Mathieu a, François Dufrasne g, Pierre Van Antwerpen g,h, Yves Poumay f, Marie-Hélène David-Cordonnier d, Antonio Evidente c, Robert Kiss a,⁎ a Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium Laboratoire de Chimie Analytique, Toxicologie et de Chimie Physique Appliquée, Faculté de Pharmacie de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium Dipartimento di Scienze, del Suolo, della Pianta, dell'Ambiente e delle Produzioni Animali, Università di Napoli Federico II, Portici, Italy d INSERM U-837, Jean-Pierre Aubert Research Center (JPARC), Team Molecular and Cellular Targeting for Cancer Treatment, Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille, Lille, France e Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, CNR, Bari, Italy f Cell and Tissue Laboratory, URPHYM, University of Namur (FUNDP), Namur, Belgium g Laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique, Faculté de Pharmacie de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium h Plate-Forme Analytique, Faculté de Pharmacie de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium b c a r t i c l e i n f o Article history: Received 8 November 2010 Revised 14 March 2011 Accepted 31 March 2011 Available online 12 April 2011 Keywords: Phyllostictines Normal cells Cancer cells In vitro Cell proliferation Cell death Apoptosis Videomicroscopy Hemisyntheses Chemical stability a b s t r a c t The in vitro anticancer activity and toxicity of phyllostictine A, a novel oxazatricycloalkenone recently isolated from a plant-pathogenic fungus (Phyllosticta cirsii) was characterized in six normal and five cancer cell lines. Phyllostictine A displays in vitro growth-inhibitory activity both in normal and cancer cells without actual bioselectivity, while proliferating cells appear significantly more sensitive to phyllostictine A than nonproliferating ones. The main mechanism of action by which phyllostictine displays cytotoxic effects in cancer cells does not seem to relate to a direct activation of apoptosis. In the same manner, phyllostictine A seems not to bind or bond with DNA as part of its mechanism of action. In contrast, phyllostictine A strongly reacts with GSH, which is a bionucleophile. The experimental data from the present study are in favor of a bonding process between GSH and phyllostictine A to form a complex though Michael attack at C=C bond at the acrylamide-like system. Considering the data obtained, two new hemisynthesized phyllostictine A derivatives together with three other natural phyllostictines (B, C and D) were also tested in vitro in five cancer cell lines. Compared to phyllostictine A, the two derivatives displayed a higher, phyllostictines B and D a lower, and phyllostictine C an almost equal, growth-inhibitory activity, respectively. These results led us to propose preliminary conclusions in terms of the structure–activity relationship (SAR) analyses for the anticancer activity of phyllostictine A and its related compounds, at least in vitro. © 2011 Elsevier Inc. All rights reserved. Introduction Fungal species produce an enormous number of natural compounds that differ in chemical structure, biological activity, mecha- Abbreviations: bp, base pairs; BSO, buthionine sulfoximide; CD, circular dichroism; CT-DNA, calf thymus DNA; ESI-MS, electrospray ionization mass spectroscopy; EMSA, electrophoretic mobility shift assay; FCM, flow cytometry; GBM, glioblastoma; GSH, glutathione; MALDI-TOF, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight; MTT, 3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; m/z, mass/charge; NSCLC, non-small-cell lung cancer; PI, propidium iodide; Tm, melting temperature. ⁎ Corresponding author at: Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, Campus de la Plaine, Boulevard du Triomphe, 1050 Brussels, Belgium. E-mail address: [email protected] (R. Kiss). 0041-008X/$ – see front matter © 2011 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.taap.2011.03.027 nisms of action, specificity and environmental impact. Among them, fungal pathogens of weeds are considered interesting potential sources of novel natural herbicides. Species of the genus Phyllosticta are known to produce several bioactive metabolites, e.g., phyllosinol, brefeldin and PM-toxin (Comstock et al., 1973; Entwistle et al., 1974; Sakamura et al., 1969). Recently, a strain of Phyllosticta cirsii, a potential mycoherbicide for the biological control of the noxious and widespread weed, Cirsium arvense, has been studied for its capability to produce phytotoxic compounds with herbicidal properties (Evidente et al., 2008). A main metabolite, named phyllostictine A, was purified from the liquid culture of this fungus and chemically characterized as a new oxazatricycloalkenone (Evidente et al., 2008). This toxin, isolated together with three other related metabolites (named phyllostictines B–D), proved to have interesting biological properties B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 in preliminary bioassays, including a noteworthy phytotoxicity associated with antibiosis against bacteria (Evidente et al., 2008). In contrast, neither antifungal nor zootoxic activity has been demonstrated for phyllostictine A, except at high concentrations (Evidente et al., 2008). The toxicity of phyllostictine A has also been evaluated on tobacco protoplasts by flow cytometry analyses and on C. arvense protoplasts by fluorescence microscopy (Zonno et al., 2008). Furthermore, the capability of the fungus to produce these metabolites in vitro has been ascertained and improved, enabling a relatively good yield to be obtained in liquid fermentation (Zonno et al., 2008). Considering the novelty of the chemical structures of phyllostictines, the interesting preliminary biological effects reported above for those compounds and the lack of reports describing the anticancer activity and toxicity of natural and hemisynthetic derivatives of phyllostictines, we therefore characterized their potential in vitro anticancer activity and toxicity. We first characterized the in vitro growth-inhibitory activity of phyllostictine A by means of the MTT colorimetric assay in six normal human (fibroblasts and proliferating versus non-proliferating keratinocytes) versus five mouse and human cancer cell lines in order to determine the levels of phyllostictine A bioselectivity, which here refers to the ratio between the growth-inhibitory effects observed in normal versus cancer cells. We used flow cytometry, computerassisted phase-contrast microscopy and biochemical analyses to decipher some of the mechanisms of action of phyllostictine A when it exerts its in vitro anticancer activity. Lastly, we hemisynthesized two phyllostictine A derivatives, for which we also determined the in vitro growth-inhibitory concentration in five cancer cell lines as we did for three phyllostictine A analogs, i.e. phyllostictine B, C and D. These results led us to propose preliminary conclusions in terms of the structure–activity relationship (SAR) analyses for the anticancer activity of phyllostictine-related compounds, at least in vitro. Material and methods Fungal strain. The P. cirsii strain is stored in the mycological collection of the Institute of Science of Food Production (ITEM N. 8964) in 20% glycerol at −80 °C. For inoculum production, it was transferred to potato-dextrose-agar (PDA) plates and grown at 25 °C under near-UV lights for two weeks. Fungal metabolites and their derivatives. For the production of phytotoxic metabolites, Roux bottles (1 l) containing a mineral-defined medium (200 ml) (Pinkerton and Strobel, 1976) were seeded with mycelial fragments obtained from colonies actively growing on PDA plates. The cultures were incubated under static conditions at 25 °C in the dark for four weeks then filtered on filter paper (Whatman no. 4) and lyophilized. The lyophilized culture filtrates (7.7 l) were dissolved in distilled water (700 ml) and then extracted with EtOAc as detailed previously (Evidente et al., 2008). The organic extract was purified by a combination of silica gel CC and preparative TLC on silica gel and reverse phase (Evidente et al., 2008). Phyllostictine purity (N95%) was determined by means of LC-UV. Phyllostictine A was converted into the corresponding 15-O-acetyl and 11,15-O,O′-di-acetyl derivatives by reaction with acetic anhydride and pyridine according to the procedures recently reported (Evidente et al., 2008). The two acetyl derivatives were purified as previously reported and their physic and spectroscopic properties were identical to those previously reported (Evidente et al., 2008). Determination of in vitro growth-inhibitory activity in normal and cancer cells. Mouse and human cancer cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA), the European Collection of Cell Culture (ECACC, Salisbury, UK), the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany) and PromoCell Gmbh (Heidelberg, Germany). 9 We used four human and one mouse cancer cell lines that included the A549 non-small-cell lung cancer (NSCLC; DSMZ code ACC107), the SKMEL-28 melanoma (ATCC code HTB-72), the Hs683 oligodendroglioma (ATCC code HTB-138) and the U373 glioblastoma (ECACC code 89081403) cell lines, while the mouse cancer cell line was related to the B16F10 melanoma (ATCC code CRL-6475). We also used two established fibroblast cell lines, Wi38 (ATCC code CCL-75) and NHDF (PromoCell c-12300), and four keratinocyte primocultures, which are described below. The cells were cultured in MEM (Invitrogen; the U373 cells have been cultured in RPMI, not in MEM medium, Wi-38 and NHDF cell lines) and in RPMI (Invitrogen; the Hs683, SKMEL-28, A549, and B16F10 cell lines) media supplemented with 5% heat-inactivated fetal calf serum (Invitrogen). All culture media were supplemented with 4 mM glutamine, 100 μg/ml gentamicin, and penicillin–streptomycin (200 U/ml and 200 μg/ml, respectively) (Invitrogen). The overall growth level of each cell line was determined using the colorimetric MTT, 3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma, Belgium) assay as detailed previously (Hayot et al., 2002, 2006; Van Quaquebeke et al., 2005). The number of living cells was determined after 72 h of culture in the presence (or absence, which was the control) of the various compounds. Each experimental condition was carried out in sextuplicate. The MTT colorimetric assay was also employed to determine the growth of sub-confluent proliferating versus confluent nonproliferating keratinocytes (see below). Establishing keratinocyte primocultures. Human adult normal keratinocytes were isolated using the trypsin float technique from skin samples obtained from a plastic surgery clinic (Dr. B. Bienfait, Clinique St. Luc, Bouge-Namur). Primary and secondary cultures were established as previously described (Atanasova et al., 2005; Minner et al., 2010). At approximately 40% of culture confluence, keratinocytes were grown under autocrine conditions by exclusion of all growth factors from the culture medium. Two days later, hyperproliferating undifferentiated cultures were analyzed while subconfluent (SC), whereas after four additional days of incubation, cultures had become confluent (C) and were analyzed as differentiating cultures. Indeed, in these conditions, confluent cultures are growth-arrested and express suprabasal markers of epidermal differentiation (Atanasova et al., 2005; Minner et al., 2010). Computer-assisted phase-contrast microscopy (videomicroscopy). The direct visualization of compound-induced effects on cell proliferation and cell migration was carried out using computer-assisted phasecontrast microscopy, i.e., quantitative videomicroscopy, as detailed elsewhere (De Hauwer et al., 1998; Delbrouck et al., 2002; Hayot et al., 2006). Determination of in vitro apoptosis and cell cycle kinetics. Flow cytometric analyses of apoptosis-related cell death and cell cycle kinetics were carried out with the U373 glioblastoma cell lines using the TUNEL technique with the APO AF detection kit according to the manufacturer's instructions (BD Pharmingen, Erembodegem-Aalst, Belgium). The experimental conditions are detailed in Fig. 2, its legend and the related Results section. Positive control and negative controls for apoptosis determination were provided by the manufacturer. For the cell cycle kinetic determination, we analyzed the percentages of cells in the G0/G1, S, G2/M phases of the cell cycle, and also the percentages of polyploid cells. Each sample relied on the analysis of 10,000 events, i.e. 10,000 U373 cells. Stained cells were analyzed on a CellLab Quanta SC flow cytometer (Beckman Coulter; Analis, Suarlee, Belgium). Determination of DNA binding/alkylation properties. The DNA melting temperature and circular dichroism experiments were performed using 10 B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 CT-DNA as described previously (David-Cordonnier et al., 2007). The EMSA was also conducted as described previously (Depauw et al., 2009) with the following modifications. The sequence for the 21-bp oligonucleotide was 5′-GATCTCGAGCAGGAAGTTCGA (Eurogentec, Belgium). The unphosphorylated single-stranded oligonucleotide was 5′radio-labeled by polynucleotide kinase (Roche, France) in the presence of α-ATP and then hybridized to its complementary sequence as described previously (Depauw et al., 2009). Samples were incubated for 2 or 16 h prior to electrophoresis on a 10% native polyacrylamide gel (acrylamide/bisacrylamide ratio: 19/1) in 1X Tris–Borate–EDTA (TBE) buffer as specified elsewhere (Depauw et al., 2009). A mass spectrometry analysis of DNA alkylation was performed using a matrix-assisted laser desorption ionization technique coupled with a Voyager-DE-STR analyzer (Applied Biosystems) of time of flight (MALDI-TOF). A 7-bp hairpin oligonucleotide with a loop of 3 bases d(5′-HO-CTATGACTCTGTCATAG-OH-3′) (duplex underlined, Eurogentec, Belgium) (50 μM) was incubated alone or with phyllostictine A (200 μM) overnight at 37 °C in 1 mM ammonium acetate pH 7.15. The DNA samples were then desalted using C18 Zip-Tip (Millipore, France) according to manufacturer's recommendations and recovered in 2 μl of elution solution (7 mg/ml of 3-hydroxypicolinic acid, 20 mM ammonium hydrogen citrate, 50% acetonitrile, QSP H20) to be charged on a MALDI-TOF target. The spectra correspond to an accumulation of 35 shots at different positions of each spot. The analysis of cleaved DNA on a denaturing polyacrylamide gel was performed using a 265-bp 3′-end radio-labeled DNA fragment as described previously (David-Cordonnier et al., 2006). Determination of phyllostictine A bonding to GSH, L-Cys and NAC using ESI-MS and MS–MS. Electrospray ionization mass spectroscopy (ESIMS) was performed as described previously (David-Cordonnier et al., 2003) with the following modifications. GSH, L-cysteine (L-Cys) and N-acetyl-cysteine (NAC) were obtained from Sigma. Samples containing 100 μM of separated compounds or a mixture of the thiolcontaining bionucleophiles with phyllostictine A (100 μM) were incubated at 37 °C for 16 h in 1 mM ammonium acetate, pH 7.15. Samples were injected with the single MS mode in a MS-MS mass spectrometer API 3000 (Perkin-Elmer Sciex) equipped with an ionspray (nebulizer-assisted electrospray) source (Sciex, Toronto, Canada) using a needle prewashed with methanol. The solutions were continuously infused with a medical infusion pump (Model 11, Harvard Apparatus, South Natick, USA) at a flow rate of 5 μl/min. Polypropylene glycol was used to calibrate the quadrupole. Full-scan ion spray mass spectra were acquired at unit resolution by scanning from m/z 100 to 600 with a step size of 0.1 Da and a dwell time of 3 ms. Twenty or forty spectra were summed and recorded at an orifice voltage of −50 V, whereas the potential of the spray needle was held at − 4.5 kV. The MS-MS data were obtained with the same mass spectrometer by scanning from m/z 50 to 600, using the energy of collision specified in the legend of figures. Data were acquired in positive mode and processed by the Analyst 1.4.1 workstation. Cytotoxic activity of phyllostictine A upon GSH depletion in epidermoid carcinoma KB-3.1 cell line. Cells were treated with 1 mM of buthionine sulfoximide (BSO, Sigma, France) for 24 h prior to the addition of graded concentrations of phyllostictine A for an additional 72 h. IC50 values were determined using MTS reaction (Madonna et al., 2010). Three independent experiments were each performed in triplicate. Statistical analyses. Data are expressed as the means ± SDev. Data obtained from independent groups were compared by Mann– Whitney U tests (two groups). The statistical analyses were performed using Statistica software (Statsoft, Tulsa, USA). In order to analyze the cell cycle, we performed a Pearson's chi-square test of goodness of fit for comparing the treated cell distribution to the untreated (control) cell distribution. Results Characterization of in vitro growth-inhibitory effects in human normal versus cancer cell lines The growth inhibitory activities of phyllostictine A were analyzed in five cancer and six normal cell lines treated for 72 h with the compound. We first checked that phyllostictine A remained stable for this 72 h-period in cell culture medium (without serum). HPLC analyses revealed that N90% (as compared to the initial amount of compound added at t = 0 h) of phyllostictine were still present in the culture medium after 72 h (data not shown). These data thus validate that the results obtained below relate to phyllostictine A and not to degradation products. Of the six normal cell lines, two (Wi38 and NHDF) were of fibroblastic origin, while the remaining four normal cell strains were keratinocytes. Each strain included subconfluent (SC) proliferating keratinocyte versus confluent (C) non proliferating keratinocytes committed towards epidermal differentiation (Atanasova et al., 2005; Minner et al., 2010). Fig. 1A reveals that the IC50 growth-inhibitory values ranged between 8 and 17 μM for the cancer cell lines (U373 = 8 μM; Hs683 = 9 μM; A549 = 9 μM; B16F10 = 10 μM; SKMEL-28 = 17 μM), and between 4 and N100 μM for the normal cell lines. Phyllostictine A thus appeared to be non-bioselective between cancer and normal cells, at least in vitro. We then analyzed whether phyllostictine A displays greater growth-inhibitory effects in proliferating than in non-proliferating keratinocytes. Sub-confluent (K“×”sc in Fig. 1A; proliferating) keratinocytes actually appear more sensitive to phyllostictine A than confluent (K“×”c in Fig. 1A; non-proliferating) keratinocytes, while large variations were observed between the four primocultures (Fig. 1A). Fig. 1B shows that phyllostictine A is cytotoxic with respect to U373 GBM cells treated with a 5 μM concentration. We have thus analyzed phyllostictine A-induced effects on U373 cell cycle kinetics and levels of apoptosis as detailed below. Characterization of phyllostictine A-induced modifications in cell cycle kinetics and apoptosis Fig. 2 illustrates phyllostictine A-induced effects on the cell cycle kinetics (Fig. 2A) and levels of apoptosis (Fig. 2B) of the U373 GBM cell line. Phyllostictine A, at its IC50 growth-inhibitory concentration of 5 μM (see Fig. 1A), significantly increased the percentages of cells in the G2/M phase of the cell cycle as well as the percentages of polyploid cells, while it significantly decreased the percentages of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle. The TUNEL-related analysis enables the determination of the proportion of cells that display DNA fragmentation processes because this technique relies on the analysis of the activation of endonucleases during the apoptosis program and FITC-dUTP labeling of the DNA breaks. The data in Fig. 2B show that nearly the totality of U373 GBM cells treated with 5 μM phyllostictine A for 48 h display degradation processes of their DNA comparing to the control population. Phyllostictine A does not exert its growth-inhibitory effects through DNA alkylation processes We first evaluated the possible reaction of phyllostictine A with DNA as a main bionucleophile target that could explain the cytotoxic effect of this compound through DNA acylation/alkylation. Several spectrometric and biochemical approaches were used (Fig. 3). The DNA melting temperature (Tm) of CT-DNA was evaluated in B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 A p < 0.001 100 50 80 40 % of cells Concentrations (µM) IC50In Vitro Growth Inhibitory A 60 40 p < 0.05 control treated p < 0.05 30 20 10 20 0 Sub-confluent Fibroblasts Confluent Keratinocytes 48 S B Normal Cell Lines 24 G0/G1 G2/M polyploids p < 0.001 100 72h PhyllostictineTreated Control 0 Cancer Cell Lines % of TUNEL positive cells 0 B 11 80 60 40 20 0 U373 Glioblastoma Cell Line Negative Positive Controls Control Treated U373 GBM Cells Fig. 1. (A) Determination by means of the MTT colorimetric assay of the growth-inhibitory effects induced by phyllostictine A in five cancer cell lines (four human and one mouse (B16F10)) and six normal cell lines, which included two established fibroblast cell lines (Wi38, and NHDF) and four keratinocytes primocultures (K1–K4). We used proliferating sub-confluent (K“×”sc) versus non-proliferating confluent (K“×”c) keratinocytes for each of the four keratinocyte primocultures. The effects of phyllostictine A are illustrated as IC50 growth inhibitory concentrations. (B) Videomicroscopy-related illustrations of the effects induced by phyllostictine A at 5 μM in the human U373 GBM cell line. The panel represents morphological illustrations at low magnification (G×1200) during 72 h. Fig. 2. Phyllostictine A induces apoptosis and cell cycle arrest in U373 GBM. (A) FCMrelated determination of the proportion of U373 GBM cells in the different phases of their cell cycle when treated with 5 μM phyllostictine A during 48 h. The data are reported as the mean values ± SDev calculated in sextuplicate. The statistical analysis is based on Mann–Whitney test. (B) FCM-related analyses (TUNEL technique) of the percentages of apoptotic U373 GBM cells that were treated for 48 h with 5 μM phyllostictine A. The negative and positive control was furnished by the manufacturer of the TUNEL kit. The data are reported as the mean values ± SDev calculated in sextuplicate. The statistical analysis is based on Mann–Whitney test. the absence (plain lanes) or presence of phyllostictine A at 1:2 (dashed lanes) or 1:1 (dotted lanes) drug to DNA ratios (Fig. 3A). The hyperchromicity at 260 nm of single-stranded DNA relative to doublestrand DNA was measured and plotted as the percentage of melted DNA (black lanes). The corresponding first-derivative plots (red lanes) were deduced to precisely localize the respective mid-points (Tm values), which both correspond to the same temperature. Therefore, no variation in the Tm was observed, suggesting no stabilization of the DNA helix upon possible binding of phyllostictine A to the DNA. Similarly, circular dichroism measurements revealed no changes of the CT-DNA spectra in the presence of phyllostictine A (Fig. 3B). Covalent bonding (or high-affinity DNA binding) was found in the EMSA based on the separation of short DNA fragments on polyacrylamide gels in native conditions (David-Cordonnier et al., 2005). Fig. 3C showed no shift of the radio-labeled 21-bp DNA after either a 2-hour or a 16-hour incubation time with increasing concentrations of phyllostictine A. Similarly, no destabilization of the DNA helix was observed as a possible alternative binding mode (David-Cordonnier et al., 2005). In parallel, a small 17 bases hairpin oligonucleotide containing a 7-bp double-stranded portion of DNA was incubated in the absence (upper panel) or presence (lower panel) of phyllostictine A and then analyzed on a MALDI-TOF mass spectrometer (Fig. 3D). Peaks at mass/charge (m/z) values of 5159 and 2577 can be attributed to the native hairpin oligonucleotide with one or two charges (labeled -1 and -2, respectively); 5159 m/z corresponds to the CTATGACTCTGTCATAG [M-H] − 1, whereas a much smaller peak at 4867 m/z corresponded to the same oligonucleotide lacking its first base due to the degradation processes in the source (TATGACTCTGTCATAG [M-H]− 1; labeled -1’). No additional peak was present after the incubation with phyllostictine A (200 μM), suggesting that no DNA bonding process occurred upon treatment with phyllostictine A. Lastly, as shown in Fig. 3E, a DNA ladder was observed with weak intensity, but no cleavage of the DNA was induced upon DNA sample treatment with phyllostictine A, even at concentrations of 100 μM. These data are thus in contrast with those reported in Fig. 2B, which rely on DNA fragmentation analysis in whole U373 GBM cells, and not on pure DNA as in Fig. 3E. Phyllostictine A covalently bonds with GSH, L-Cys and NAC at thiol groups A comparison of the EI-MS spectra of phyllostictine A alone (Fig. 4A) and GSH alone (Fig. 4C) with that of phyllostictine A incubated overnight with GSH (Fig. 4D) demonstrated the presence of an additional peak [M+ H]+ at m/z 633.4 (in green) that corresponded to the mass of an adduct formed between GSH and phyllostictine A ([GS-Phy+ H]+). The MS–MS analysis of the peaks corresponding to phyllostictine A (Fig. 4B) and GSH, as a Glu−Cys―Gly tripeptide B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 C 100 75 75 50 50 25 25 0 30 40 50 60 70 0 90 80 2H 16 H PhyllostictineA (µM) PhyllostictineA (µM) 0 1 2.5 5 10 25 50 100 MeltedDNA (% max value) 100 First derivative (% of max value) A 0 1 2.5 5 10 25 50 100 12 NO SHIFT Temperature (°C) B 15 CD (mdeg) 10 5 21 bp 0 -5 21b -10 -15 250 300 350 400 450 500 E DNA D PhyllostictineA (µM) G 0 1 2.5 5 10 25 50 100 wavelength (nm) -1 5159 Intensity (a.u.) 4 104 3 104 -2 2577 2 104 -1’ 4870 4 1 10 0 2000 3000 4000 5000 6000 7000 6000 7000 [m/z] DNA + Phyllostictine A -1 Intensity(a.u.) 2.5 104 5159 2 104 1.5 104 1104 -2 2577 -1’ 4870 5000 0 2000 3000 4000 5000 [m/z] Fig. 3. Study of DNA binding/bonding properties of phyllostictine A. (A) DNA melting temperature at 260 nm (in black) and the corresponding first-derivative plots (in red) of samples containing 20 μM of CT-DNA alone (plain lanes) or with 10 μM (dashed lanes) or 20 μM (dotted lanes) of phyllostictine A. The Tm values correspond to the temperature obtained when 50% of the DNA was melted (dashed grill). (B) Circular dichroism spectra were recorded from 230 nm to 500 nm using samples containing phyllostictine A (50 μM) alone (red), CT-DNA (200 μM) alone (blue) or a mixture of both molecules (purple). (C) Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) of increasing concentrations of phyllostictine A (as indicated in μM on the top of the lanes) incubated with a 21 bp radio-labeled DNA fragment for 2 or 16 h. Single (21 bases) and double (21 bp) stranded DNA migration positions are indicated using arrows. (D) MALDI-TOF analysis of a 7 bp hairpin oligonucleotide incubated alone (top) or with phyllostictine A (bottom). Peaks (m/z) labeled -1 and -2 correspond to the full-length DNA as MH+ and MH2+ 2 , respectively, whereas the small peak labeled -1’ corresponds to singly protonated DNA ([m + 1] / 1) of the same DNA molecules but lacking the first 5′ base due to degradation during the analysis. (E) Analysis on a denaturing polyacrylamide gel. Increasing concentrations of phyllostictine A, as indicated at the top of the lanes (μM) were incubated with a 265 bp radio-labeled DNA fragment prior to heating for 5 min at 90 °C in the formamide-containing loading buffer and electrophoretic separation in denaturing conditions. The G-track lane (labeled “G”) was used as a marker for the DNA sequence. (Fig. 4D), were used to identify the nature of the generated adduct (Fig. 4F) at m/z 633.4. The scheme for the product ions generated by MS–MS is illustrated in Fig. 5, exemplifying a bonding process between GSH and phyllostictine A to form the product at m/z 633.4 though Michael attack at C=C bond at the acrylamide-like system. Particularly, the m/z peaks at 504 and 558 could correspond to adducts lacking the glutamic acid or glycine, respectively, as a consequence of cleavage [1] or [2] generated from collision in the B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 A 1.2 108 B [Phy]+1 326.2 1.2 107 [Phy+NH4+] 8 107 343.1 4 10 7 0 300 [Phy+Phy]+NH4+] 404.3 668.4 [Phy+Phy]+1] 651.4 400 500 600 700 179.8 2 106 4 106 0 Phy-H2O 307.9 Phy 152.8 326.2 308.1 100 200 300 Cys-Gly 178.8 8 106 GSH 4 106 308.0 Glu-Cys 161.9 232.9 2 106 Glu 130.0 75.9 [GSH-GSH]+1 388.2 462.3 300 400 615.2 500 600 700 0 800 100 200 300 [m/z] [m/z] E F [GSH]+1 [Phy]+1 8 308 326.2 1.6 10 1.2 108 [Phy+Phy]+NH4+] [Phy+NH4+] 343.1 8 107 404.3 2 105 651.4 5 [GS-Phy]+1 633.4 1.5 10 1 105 668.4 5 105 300 400 500 600 700 800 GS-Phy 633 2.5 105 [Phy+Phy]+1] 7 0 179.8 [m/z] 6 106 Gly 2 107 4 10 152.8 1 106 0 100 200 300 D 7 0 CE39 119.8 [m/z] 6 107 4 10 3 106 91.8 800 [GSH]+1 8 107 CE20 8 106 [m/z] C 13 0 308 326 189 179 130 558 504 260 436 233 100 200 300 400 500 600 [m/z] [m/z] Fig. 4. ESI-MS and MS–MS analysis of the alkylation of GSH by phyllostictine A. (A) ESI-MS of phyllostictine alone and (B) MS–MS spectra of peak at m/z = 326 corresponding to phyllostictine A treated with an energy of collision of 20 (CE20) or 39 eV (CE39) are presented in red. ESI-MS of (C) GSH or (E) GSH incubated with phyllostictine A and MS–MS of GSH at peaks 308 (D) and GS-Phy adduct at m/z 633 (F). The collision energy was + 20 eV. MS–MS cleavages at peptidic bonds of the tripeptide GSH (Glu―Cys―Gly) generate peaks corresponding to mono- or di-amino-acids as specified in panel D. Peaks in blue relate to the thiol-containing molecule (GSH) used in the sample or its product ions generated in MS– MS. Peaks in green correspond to the newly generated adducts or peaks of respective product ions that are specific for the adduct and not found using either of the single molecules. Peak in purple (labeled 308 in panel E, left spectra) could correspond either to GSH or the product ion of phyllostictine A as identified in panel B (left panel) and D, respectively. Q2 collision cell during MS–MS analysis of the 633.4 product. Such [Phy− Cys − Gly + H]+ and [Phy− Cys− Glu+ H]+ fragments suggest the alkylation of phyllostictine A to the common amino acid cysteine, probably through bonding at the thiol group of cysteine within GSH. Product ions 326 and 307 correspond to cleavage [3] at the sulfur atom, releasing phyllostictine A from GSH. The generation of the products ions at m/z of 436, 189 and 260 could only be explained from an alkylation at C=C double bond as presented in Fig. 5. Similar experiments performed using L-cysteine or N-acetylcysteine alone (Fig. 6, panels A and D, respectively) or those treated overnight with phyllostictine A (Fig. 6, panels B and C, respectively) revealed additional peaks after incubation (in green) compared to the analysis of each individual component (in blue or red). The MSMS spectra for peaks at m/z of 447.2 or 489.2 revealed similar ions products at [M + H]+ = 326, 308 and 180 m/z, all being common peaks with the MSMS of phyllostictine A alone (Fig. 4B) but also different peaks at [M+H]+ = 397 and 380 m/z or [M + H]+ = 439 and 422 m/z, respectively. Both series of product ions differed from their respective parental ions by a loss of mass of 50 and 67, respectively, suggesting that the collision removed them from a common part of the NAC-Phy and L-Cys-Phy adducts. Finally, we evaluated the impact of the thiol reactivity on the cytotoxic effect of phyllostictine A by treating KB-3.1 cells with BSO, an inhibitor of GSH biosynthesis that acts by specifically blocking the γ-glutamylcysteine synthetase; BSO was shown to be strongly efficient at 1 mM in this cell line (Madonna et al., 2010). After 24 h of treatment with BSO, cells were treated with phyllostictine A for 72 h. The phyllostictine A-induced cytotoxicity measured using the MTS reagent revealed that the decrease in the intrinsic GSH level had no effect on the cytotoxicity induced by phyllostictine A, with IC50 of 2.8 ± 0.5 μM and 3.0 ± 0.5, in the absence or presence of BSO pretreatment, respectively. Preliminary structure–activity relationship (SAR) analyses performed on natural versus hemisynthetic phyllostictines We modified the phyllostictine A chemical structure to perform very preliminary SAR analyses with respect to phyllostictine-induced growth-inhibitory effects in human cancer cells. We hemisynthesized two phyllostictine A derivatives, i.e., 15-O-acetyl-phyllostictine A and 11,15-O,O′-diacetyl-phyllostictine A (Fig. 7A), which displayed higher in vitro growth-inhibitory activity not only when compared to phyllostictine A but also when compared to phyllostictines B, C and D (Fig. 7B). The chemical structures of phyllostictine A, B, C and D are illustrated in Fig. 7A. Discussion Five cancer cell lines have been used in the current study with four human cell lines displaying various levels of resistance to pro- 14 B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 A D 3 108 102.1 [L-Cys]+1 2 108 122.1 2 10 8 1 108 0 1 10 304.3 100 200 [NAC]+1 102.1 164.0 1.5 108 241.0 214.1 163.1 462.2 300 400 500 [NAC]+NH4+ [NAC-NAC]+1 181.0 327.1 [NAC-NAC]+NH4+ 241.0 214.1 344.1 462.2 8 5 107 0 600 15 304.3 100 200 300 [m/z] 400 500 600 [m/z] B E 4 10 8 3 10 8 2 108 102.1 122.1 163.1 [Cys-Phy]+1 447.2 [Phy]+1 326.2 [L-Cys]+1 1 10 200 300 400 500 102.1 0 600 489.2 [NAC]+NH4+ [Phy]+NH4+ 181.0 343.1 506.2 214.1 241.0 304.3 100 200 1.2 106 400 500 600 [m/z] F Cys-Phy 269 447 308 326 1.6 106 462.2 300 [m/z] C [NAC-Phy]+NH4+ [NAC-Phy]+1 164.0 5 107 462.2 100 8 [Phy]+1 326.2 [NAC]+1 1.5 108 214.1 241.0 1 108 0 2 108 326 1.6 106 1.2 106 397 NAC-Phy 8 105 4 105 0 8 105 380 180 489 439 431 150 122 100 308 4 105 422 130180 200 300 400 500 [m/z] 0 100 200 300 400 500 [m/z] Fig. 6. ESI-MS and MS–MS analysis of the alkylation of L-Cys and NAC by phyllostictine A. ESI-MS analyses of L-Cys (A), NAC (D) alone or in the presence of phyllostictine A (B and E, respectively) evidenced peaks for [Cys-Phy] and [NAC-Phy] adducts that are further analyzed using MS–MS in (C) and (F), respectively. The energies of collision were + 20 eV and + 15 eV, respectively. Peaks in red correspond to phyllostictine A or its related product ions. Peaks in blue relate to the thiol-containing molecule (L-Cys or NAC) used in the sample or their product ions generated in MSMS. Peaks in green correspond to the newly generated adducts or peaks of respective product ions that are specific for the adduct and not generated using either of the single molecules. apoptotic stimuli, i.e., the U373 GBM (Gomez-Manzano et al., 1997), the A549 NSCLC (Mijatovic et al., 2006), and the SKMEL-28 melanoma cell line (Shen et al., 2007). The remaining two cancer cell lines display actual sensitivity to pro-apoptotic stimuli, i.e., the human Hs683 oligodendroglioma (Branle et al., 2002) and the mouse B16F10 melanoma (Mathieu et al., 2009) cell lines. We noticed no differences in terms of sensitivity to phyllostictine A between cancer cell lines that display certain levels of resistance to pro-apoptotic stimuli (U373, SKMEL-28, and A549) and those that are sensitive to pro-apoptotic stimuli (Hs683, and B16F10) (see Fig. 1A). Thus, phyllostictine A represents an interesting molecule to combat cancer cells that display intrinsic resistance to pro-apoptotic stimuli. However, the data from the present study also clearly indicate that phyllostictine A does not display actual bioselectivity between proliferating normal and proliferating cancer cells. Therefore, bioselective derivatives of phyllostictine A are mandatory to obtain phyllostictine A-related compounds that could become selective anticancer agents. Based on the structure of phyllostictine A, we thus hypothesized that bionucleophiles could react with the β-lactam ring (acylation) or as “Michael acceptors” on the electrophilic carbon atom at β position of the “acrylamide” system (alkylation), as part of its mechanism of action. We first evaluated the possible reaction of phyllostictine A with DNA as a main bionucleophile target that could explain the cytotoxic effect of this compound through DNA acylation/alkylation but the data impaired this hypothesis (see Fig. 3). We then wondered whether phyllostictine A induced a depurination process of the DNA, as has been shown for other DNA alkylating agents. Such druginduced depurination processes generate a heat-labile abasic site, leading to a strand break that can be revealed using a radio-labeled DNA fragment separated on a denaturing polyacrylamide gel (DavidCordonnier et al., 2006). No additional peak was present after the incubation with phyllostictine A (200 μM), suggesting that no DNA bonding process occurred upon treatment with phyllostictine A (see Fig. 3). Lastly, no cleavage of the DNA was induced upon DNA sample treatment with phyllostictine A (see Fig. 3). Therefore, phyllostictine A seems not to bind or bond with DNA as part of its mechanism of action. We then looked for phyllostictine A reactivity toward other strong bionucleophiles such as glutathione (GSH), L-cysteine and N-acetylcysteine (NAC) through their respective thiol groups using mass Fig. 5. Schematic representation for the product ions generated by MS–MS (see Fig. 5), exemplifying a DNA bonding process between GSH and phyllostictine A to form the product at m/z 633.4 though Michael attack at C C bond at the acrylamide-like system. 16 B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 A O N Me N O R3 O Me O O OR2 OH (CH2 )n MeO MeO R1O HO Phyllostictine A (PA) R1=R2=H R3=Me n=3 15-O-acetyl-PA R1=H R2=Ac R3=Me n=3 R1=R2=Ac R3=Me n=3 11,15-O,O’-diacetyl-PA Phyllostictine B R1=R2=H R3=Me n=1 R1=R2=H R3=CH(OH)CH3 n=2 Phyllostictine C In Vitro IC50 Growth Inhibitory Concentrations (µM) B 80 Phyllostictine D phyA mA dA phyB phyC phyD 70 60 50 40 30 20 10 0 Hs683 U373 A549 SKMEL-28 B16F10 Cancer Cells Lines Fig. 7. (A) Chemical structures of two phyllostictine A derivatives and of phyllostictine A, B, C and D. (B) Determination by the MTT colorimetric assay of the IC50 growthinhibitory values of phyllostictines A–D and of the two phyllostictine A derivatives in five cancer cell lines (four human and one mouse (B16F10) cell lines). spectrometry. However, glutathione represents an in vitro target in the setting up of our experiments. The experimental data show that the depletion of GSH in KB-3.1 cell line with BSO did not modify the IC50 in vitro growth inhibitory concentration. Thus, phyllostictine A may interact with other proteins rich in cysteine or with enzymes that display cysteine residues in their active center. Dennehy et al. (2006) have demonstrated that 539 proteins implicated in different types of cellular function can be modified by the adduction of thiolreactive electrophils in HEK293 cells. Furthermore, it seems that phyllostictine A targets mainly relate to cell proliferation because proliferating (subconfluent) keratinocytes display higher sensitivity to phyllostictine A-induced growth inhibitory effects than nonproliferating (subconfluent) ones. This hypothesis is corroborated by the fact that phyllostictine A induces an accumulation of U373 cancer cells in the G2/M phase of their cell cycle (see Fig. 2B). Altogether these data lead us to emit the hypothesis according to which tubulin could be a potential target of phyllostictine A because this heterodimer, which is composed by the subunits α and β, contains 20 cysteines and the oxidation of these amino acids inhibits the tubulin polymerization process (Landino et al., 2011). In this case, tubulin protects others proteins against oxidation, while cell cycle kinetics are affected by the modification of microtubules (Landino et al., 2011). Altogether, these data have encouraged us to proceed with the hemisyntheses of novel phyllostictine derivatives in order to proceed with SAR analyses about the in vitro growth inhibitory effects of phyllostictine A. The first two phyllostictine A derivatives we hemisynthesized, i.e. 15-O-acetyl-phyllostictine A and 11,15-O,O′diacetyl-phyllostictine A (Fig. 7A), displayed higher anticancer activity compared to phyllostictine A and to the three phyllostictine A analogs we also analyzed, i.e. phyllostictines B, C and D. The improved growth-inhibitory activity of the acetyl derivatives of phyllostictine A compared to phyllostictine A itself could be related to the hydrolysis of the acetyl groups that probably occurs in the cells and the potential increase in lipophilicity, improving the ability of the compound to cross the cell membrane. The decrease in the growth-inhibition activity of phyllostictine B compared to phyllostictine A could relate to the decrease in the macrocyclic ring size, which in turn should determine modifications in the phyllostictine B conformational freedom. Phyllostictine C, whose growth-inhibition activity closely mimics the one displayed by phyllostictine A (Fig. 7B), indeed differs only in its macrocyclic ring by one methylene group (Fig. 7B). Thus, the conformational freedom of its macrocyclic ring should be similar to that of phyllostictine A. The hydroxyl ethyl at C-5 present in phyllostictine C instead of the methyl present in the other phyllostictines (Fig. 7A) thus does not seem to impact the phyllostictine C-induced growth-inhibitory effects in human cancer cells (Fig. 7B). Phyllostictine D displayed the weakest growth-inhibitory effect when compared to phyllostictines A and C and similar ones to phyllostictine B (Fig. 7B). This loss in growth-inhibitory activity for phyllostictine D might relate to several features: i) a reduced macrocyclic ring size; ii) different functional groups on this macrocylic ring, such as the carbonyl group at C-8; iii) a marked modification of the conformational freedom determined by both the different macrocyclic ring size and functionalities; and iv) the presence of a δ-lactam ring instead of the β-lactam ring present in the remaining three phyllostictines. Thus, the presence of a β-lactam ring per se was not sufficient to induce growth-inhibitory effects in normal and cancer proliferating cells if one refers to the loss of activity of phyllostictine B compared to phyllostictines A and C. In addition, the presence of a δ-lactam ring that replaces the β-lactam ring did not make a significant difference when the growth-inhibitory activities of phyllostictine B were compared to those of phyllostictine D (Fig. 7B). Altogether, these data strongly suggest that the size and conformation of the macrocyclic ring is of crucial importance in terms of the growthinhibitory effects displayed by phyllostictines, at least in vitro in cancer cells (Figs. 7A and B). Indeed, the growth-inhibitory effects of phyllostictines B and D are closely related to each other when each cancer cell line under study was analyzed individually, a feature not observed when paired comparisons were carried out between phyllostictines A and C (Fig. 7B). Similar results were obtained when phyllostictines A–D were assayed for phytotoxic, antimicrobial and zootoxic activities (Evidente et al., 2008). The importance of the 2,2,3,4-tetrasubstituted 2,3,5-trihydrofuran ring in the in vitro growth inhibition of cancer cells remains to be determined by assaying phyllostictine A derivatives showing modifications of this moiety, a goal that we are currently pursuing. Similarly, it remains to be determined whether the mono- and diacetyl derivatives of phyllostictine A display bioselectivity between normal proliferating and cancer proliferating cells and identical mechanisms of action compared to phyllostictine A. We are currently enlarging our series of phyllostictine A derivatives before choosing the lead, with which we will decipher the mechanisms of its anticancer action and the profile of its bioselectivity. In conclusion, phyllostictine A displays in vitro growth-inhibitory activity both in normal and cancer cells without actual bioselectivity, but proliferating cells appear significantly more sensitive to phyllostictine A than non-proliferating ones. Phyllostictine A behaves as a cytotoxic compound that displays similar efficiency in cancer cells that display sensitive versus resistance to pro-apoptotic stimuli. Phyllostictine A seems not to bind or bond with DNA as part of its mechanism of action, but is able to strongly react with thiol groups such as GSH. Conflict of interest statement No author has any conflict of interest(s) to disclose. B. Le Calvé et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 254 (2011) 8–17 Acknowledgments The financial support for this study was provided by FRFC grant no. 2.4522.10 to Yves Poumay. Marie-Hélène David-Cordonnier thanks the IRCL for the grant, the Conseil Régional Nord-Pas de Calais, the University of Lille Grand Nord and the IRCL for a PhD fellowship to Gaëlle Lenglet, Hervé Drobecq (IBL) for his expertise in the MALDITOF analysis, Dr. Mostafa Kouach and Dr. Gilbert Briand (Centre Universitaire de Mesures et d'Analyses “CUMA”, Faculté de Pharmacie de Lille) for access to the API 3000 mass spectrometer and fruitful discussions and the IFR114-IMPRT for access to the Storm facilities. Véronique Mathieu is a post-doctoral fellow, and Robert Kiss is a director of research with the Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS, Belgium). Benjamin Le Calvé is the holder of a Grant Télévie from the Fonds National de la Recherche Scientifique. References Atanasova, G., Jans, R., Zhelev, N., Mitev, V., Poumay, Y., 2005. Effects of the cyclindependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine) on the physiology of cultured human keratinocytes. Biochem. Pharmacol. 70, 824–836. Branle, F., Lefranc, F., Camby, I., Jeuken, J., Geurts-Moespot, A., Sprenger, S., Sweep, F., Kiss, R., Salmon, I., 2002. Evaluation of the efficiency of chemotherapy in in vivo orthotopic models of human glioma cells with and without 1p/19q deletions and in C6 rat orthotopic allografts serving for the evaluation of surgery combined with chemotherapy. Cancer 95, 641–655. Comstock, J.C., Martinson, C.A., Gengenbach, B.G., 1973. 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DISCUSSION DISCUSSION 1 Nouveaux mécanismes de résistance au témozolomide 1.1 Analyse de nos résultats en fonction des données déjà publiées dans la littérature Dans notre premier travail, nous avons mis en évidence deux familles de gènes responsables de l’acquisition de la résistance au témozolomide dans deux lignées cellulaires de glioblastomes. Tout d’abord, les modèles de glioblastome cultivés pendant plusieurs mois en présence de la molécule montrent une réponse plus faible au traitement par le témozolomide (in vivo en greffes orthotopiques chez la souris immunodéficiente) que les modèles normaux n’ayant pas été cultivés en présence de témozolomide. Nous avons observé une modification de la localisation des transporteurs glucose 3 et 10. Il a été démontré que le transporteur glucose 3 est bien exprimé dans des échantillons de tumeurs cérébrales et que son expression est directement liée au grade des tumeurs cérébrales (Nishioka et coll., 1992). D’autres études ont montré l’implication des transporteurs glucose dans l’augmentation de la prolifération cellulaire au sein des tumeurs gliales (Airley et coll., 2007; Macheda et coll., 2005). Récemment des travaux ont mis en évidence le lien entre l’expression de l’oxyde nitrique synthétase et la localisation sur la membrane plasmique du transporteur glucose 3 (Ferreira et coll., 2011). Ce mécanisme de régulation pourrait faire intervenir la voie de signalisation Akt. Pour ce qui est du transporteur GLUT 10, son expression n’a jamais été étudiée dans les tumeurs gliales. Par contre, une mutation du gène de GLUT 10 entraîne un syndrome touchant l’organisation et le développement des vaisseaux sanguins au niveau cérébral (Coucke et coll., 2006). L’implication de ce transporteur glucose dans le processus d’angiogénèse pourrait expliquer sa surexpression perinucléaire dans le cas de nos lignées résistantes notamment pour contrecarrer l’effet anti-angiogénique du témozolomide. Cette hypothèse pourrait être confirmée par l’analyse immunohistochimique des tumeurs prélevées sur les souris au cours de l’expérience in vivo. Récemment, un article publié par Oliva et coll. (2010) a montré que lors de l’induction de la résistance au témozolomide dans la lignée cellulaire U251, l’ADN mitochondriale était 95 altéré et que la fonction de phosphorylation oxydative pouvait être atteinte. Cette perte de fonction pourrait aussi expliquer la modification de l’expression des transporteurs glucose. L’augmentation de la prolifération cellulaire observée dans le cas du modèle U373-MG LTT peut s’expliquer aussi par l’expression des transporteurs GLUT 1 et 3. En effet, il a été démontré que les cellules gliales tumorales montrent une prolifération cellulaire plus importante que les astrocytes normaux. Cette augmentation de la prolifération est due à une diminution des interactions cellulaires de type Gap (HerreroGonzález et coll., 2009). Dans le même temps, cette inhibition des liaisons communicantes se traduit par une augmentation des apports intracellulaires en glucose. Ces apports sont possibles grâce à l’augmentation d’expression des transporteurs glucose 1 et 3 couplée à l’augmentation de l’activité des héxokinases de type 1 et 2 nécessaire au métabolisme du glucose (Herrero-González et coll., 2009). Pour le transporteur GLUT 5, nos résultats montrent que son expression semble se limiter à la seule lignée U373-MG. De plus, ce transporteur glucose est un cas particulier dans cette famille protéique puisqu’il s’agit en fait d’un transporteur majoritairement orienté pour le fructose avec une très faible affinité pour le glucose (Uldry et Thorens, 2004). En ce qui concerne les protéines de la famille des aldo-kéto réductase de type 1c (akr1c1, akr1c2 et akr1c3), ce sont des enzymes impliquées dans le métabolisme des prostaglandines et dans le maintien du taux de stéroïdes (Bauman et coll., 2004). De nombreux articles font état d’un lien entre l’expression de ces enzymes et la durée de survie dans les cancers du sein et de la prostate (Penning et coll., 2004) ainsi que de la chimiorésistance dans les cancers du poumon non à petites cellules (Wang et coll., 2007) et du colon (Selga et coll., 2008). Il a été aussi démontré que la protéine akr1c3 catalyse la conversion de la prostaglandine D2 en prostaglandine F2α qui est elle-même un activateur de la prolifération cellulaire (Bauman et coll., 2004). Cette réaction inhibe la conversion naturelle de la prostaglandine D2 en prostaglandine J2 connue pour être un activateur du récepteur nucléaire PPARγ (Bauman et coll., 2004). Cependant, il a été démontré que l’activation de ce récepteur par ce ligand induisait l’augmentation de l’expression de la protéine GLUT 3 (García-Bueno et coll., 2007). Or dans notre travail, l’inhibition de cette voie n’induit pas de modification de l’expression de ce transporteur glucose. Il apparaît donc que dans les lignées gliales tumorales résistantes l’expression de 96 GLUT 3 pourrait être sous l’influence d’un autre facteur de transcription tel que HIF1α. Nous avons aussi démontré que l'inhibition transitoire par siRNA de l’expression de la protéine akr1c3 diminuait la prolifération cellulaire de la lignée U373-MG : ces résultats confirment bien le rôle dans la prolifération cellulaire joué par akr1c3 comme il a été déjà démontré dans le cancer de la prostate (Wang et coll., 2008). Il a été aussi démontré dans la littérature que les protéines de la famille des akr1c et plus particulièrement akr1c2 et akr1c3 sont impliquées dans les mécanismes de résistance aux anthracyclines dans le cancer du sein. Basé sur le même principe d’analyse d’expression des gènes que nous avons utilisés, akr1c2 et akr1c3 ressortent comme surexprimées dans les cellules résistantes. 1.2 Implication potentielle de nos résultats sur le plan clinique : mise au point de biomarqueurs tissulaires et/ou sanguins Les différents gènes impliqués dans les mécanismes de résistance au témozolomide pourraient être utilisés comme marqueur de détection de résistance acquise à cet agent chimiothérapeutique. Pour évaluer la consommation de glucose, il existe des techniques, notamment la tomographie par émission de positons (TEP), capable de déterminer la consommation de glucose au sein des tumeurs (Mankoff et coll., 2007). Cette technique est basée sur le même principe que la scintigraphie. On injecte au patient un traceur radioactif, en l’occurrence ici du désoxyglucose avec un groupement fluor18 (18F-FDG), et on analyse l’émission de photons émis par le composé radioactif lors de sa désintégration. L’intérêt du glucose radiomarqué est double. Tout d’abord, il s’accumule dans la cellule car il n’est pas métabolisable et il ne peut ressortir de la cellule car une fois internalisé il est phosphorylé. On pourrait donc imaginer suivre l’évolution des tumeurs gliales et leur consommation en glucose au cours d’un traitement standard avec du témozolomide et utiliser ces données comme un marqueur précurseur de l’apparition de résistance. Dans le cas des akr1c, il serait aussi possible de suivre la métabolisation des prostaglandines notamment en suivant les taux plasmatiques ou excrétés (dosage dans les urines) de la prostaglandine D2. En effet, comme nous l’avons expliqué précédemment la prostaglandine D2 est catalysée par la protéine akr1c3 en prostaglandine F2α (Bauman et coll., 2004) au lieu de la prostaglandine J2. De même que pour le suivi de la 97 consommation de glucose par les tumeurs, il est possible de suivre l’évolution de la concentration plasmatique de la prostaglandine J2 qui devrait diminuer en cas d’augmentation de l’expression de la protéine akr1c3. La sensibilité de ce type de test est déjà prouvée puisque ce dosage est utilisé pour évaluer le taux plasmatique des prostaglandines dans les cas de schizophrénie (Martínez-Gras et coll., 2011). En utilisant des marqueurs spécifiques des deux familles de gènes que nous avons identifiés comme impliqués dans les mécanismes de résistance au témozolomide dans les cellules gliales tumorales, il serait possible d’anticiper l’apparition de résistance en mettant en place des phases de pause dans le traitement chimiothérapeutique à base de témozolomide ou bien en alternant l’administration du témozolomide avec d’autres types de traitements. 1.3 Implication potentielle de nos résultats sur le plan thérapeutique : identification de nouvelles cibles pour combattre les gliomes malins Plusieurs pistes pourraient être développées pour trouver des agents thérapeutiques capables de cibler les protéines surexprimées dans nos modèles de cellules résistantes. On retrouve dans la littérature plusieurs types de nouvelles molécules capables d’inhiber l’activité des akr1c ou d’utiliser leur propriété. Tout d’abord, les inhibiteurs d’akr1c sont nombreux puisque les anti-inflammatoires non-stéroïdiens font partie des molécules potentiellement inhibitrices de ces enzymes. Récemment, l’indométacine, molécule découverte en 1963 et commercialisée sous le nom d’Indocid®, s’est montrée efficace pour inhiber la migration et la prolifération de tumeur de poumon non à petites cellules (Kato et coll., 2011). Cette molécule avait aussi été identifiée comme inhibiteur sélectif de la protéine akr1c3 dans une précédente étude (Lovering et coll., 2004). L’intérêt de cette molécule se situe dans le fait qu’elle n’induit pas d’inhibition des cyclo-oxygénase de type 1 et 2 réduisant ainsi les effets secondaires de ces traitements (Lovering et coll., 2004). Il existe aussi des molécules telles que les jasmonates qui sont des inhibiteurs des enzymes akr1c dans les cellules de leucémie de part leur structure proche de celle de la prostaglandine D2 (Davies et coll., 2009). Enfin, il existe un autre de type de chimiothérapie qui utilise l’activité de l’enzyme akr1c3 capable de métaboliser une prodrogue en molécule active (Guise et coll., 2010). Le nom de cette pro-drogue, PR-104A, est actuellement en phase II clinique et cette particularité d’être activée par akr1c3 qui 98 est surexprimée dans un grand nombre de type de cancer, ouvre un large panel de débouchés thérapeutiques. Dans le cas des transporteurs glucose, il existe moins de molécules en développement qui ciblent directement ces protéines. Quelques molécules sont connues pour être des inhibiteurs de ces transporteurs tels que la phloretine (Cao et coll., 2007) qui est un antioxydant ou encore la cytochalasine B (Rodríguez-Enríquez et coll., 2009). La problématique de développer des traitements qui inhibent les transporteurs GLUT se situe au niveau de la sélectivité et de la toxicité de ces molécules. En effet, l’expression de ces transporteurs est ubiquitaire et leur inhibition pourrait toucher d’autres types cellulaires et induire des séquelles sur d’autres tissus que celui tumoral. Enfin les transporteurs GLUT sont souvent liés aux conditions hypoxiques ce qui implique une vascularisation faible de la zone tumorale et donc une difficulté pour atteindre la cible au sein de la tumeur. 2 Développement des phyllostictines dans le but d’une stratégie de traitement des gliomes 2.1 Exploitations optimisées des mécanismes d’action antitumoraux originaux L’étude de la relation structure activité des phyllostictines a montré deux éléments qui semblent intervenir dans le mécanisme cytotoxique de ces molécules. Tout d’abord, la présence du noyau β-lactame semble être importante pour leur activité. En effet, les résultats des études de viabilité cellulaire démontrent que parmi les différentes phyllostictines la seule molécule ne présentant pas le noyau β-lactame mais un noyau δlactame, la phyllostictine D, a une moyenne d’indice IC50 plus élevée que les métabolites les plus efficaces (de l’ordre de 50µm alors que pour la phyllostictine A la moyenne n’est que de 10µM). Le deuxième élément qui semble jouer un rôle prépondérant dans l’activité des phyllostictines est la taille du macrocycle. En effet, les phyllostictines B et D ont le même nombre de carbones, douze, composant le macrocycle et leur efficacité antitumorale in vitro est plus faible que celles des autres composés (Table 4). Pour la phyllostictine C, le nombre de carbone composant le macrocycle est de treize. L’activité 99 Hs683 U373 A549 SKMEL28 B16F10 Moyenne Phyllostictine A 9.4 8.3 8.6 16.7 10.0 10.6 15-0-Acetyl Phyllostictine A 5.9 1.1 6.7 3.8 0.9 3.7 11,15-0,0'-Diacetyl Phyllostictine A 9.7 0.9 9.0 7.8 0.9 5.7 Phyllostictine B 50.4 30.0 61.2 71.9 30.7 48.8 Phyllostictine C 29.3 8.3 31.3 33.2 9.9 22.4 Phyllostictine D 63.2 35.3 70.1 69.6 20.9 51.8 Table 4: Tableau récapitulatif des indices IC50 (µM) d’inhibition de croissance à 50% sur cinq lignées cellulaires cancéreuses d’origine histologique différente. Ces valeurs sont obtenues à trois jours avec les différents métabolites de Phyllosticta cirsii ainsi qu’avec les deux dérivés hémisynthétiques. La colonne de droite représente la moyenne en µM des indices IC50 sur l’ensemble des lignées. antitumorale est intermédiaire, c'est-à-dire meilleure que pour les phyllostictines B et D mais plus faible que pour la phyllostictine A qui présente le plus grand macrocycle avec quatorze carbones. Si l’on s’intéresse maintenant à l’activité des deux dérivés hémisynthétiques de la phyllostictine A, il apparaît que leur activité cytotoxique est légèrement meilleure que pour la phyllostictine A. La mono- et diacétylation en positon 11 et 15 renforce certainement le caractère hydrophobe des deux molécules leur permettant de passer plus facilement la membrane plasmique des cellules. D’autres modifications chimiques pourraient être envisagées pour optimiser l’activité anticancéreuse de ces métabolites en conservant les deux caractéristiques de structure qui semblent responsables de l’activité anticancéreuse : la présence du macrocycle et la taille du macrocycle (minimum de quatorze carbones). Cependant, il conviendrait aussi d’améliorer la biosélectivité de ces molécules afin de mieux cibler les cellules cancéreuses. En ce qui concerne la résistance au témozolomide, nos premiers tests in vitro sur les deux modèles résistants (U373-MG et T98G), que nous avons mis au point, montrent que les valeurs IC50 d’inhibition de croissance IC50 obtenues sont en tout point les mêmes que celles obtenues sur les lignées dites normales (Table 5). Ce résultat est encourageant car il indique que la phyllostictine A est capable de contourner les mécanismes de résistance mis en place par les cellules gliales tumorales lors des traitements chroniques avec le témozolomide. 2.2 Caractérisation du mécanisme d’action Comme nous l’avons démontré dans la partie résultat concernant les phyllostictines, ces métabolites sont capables de se lier au groupement thiol libre disponible sur des molécules telles que le glutathion, la cystéine ou l’acétylcystéine. Cependant lorsque le glutathion est supprimé dans des cellules par un prétraitement au buthionine sulfoximide, la valeur de l’indice IC50 associée à la phyllostictine A reste inchangée. Lorsque l’on met en contact direct du glutathion avec de la phyllostictine A, on obtient des adduits mais la déplétion du glutathion dans les cellules cancéreuses KB3.1 n’empêche pas l’activité de la phyllostictine. En clair, la véritable cible dans les cellules n’est pas le glutathion mais une protéine ou des protéines possédant un ou des 100 Sensible résistante U373-MG 8 7 T98G 16 5 Table 5 : Comparaison des valeurs d’IC50 (en µM) de la phyllostictine A sur les lignées cellulaires U373-MG et T98G sensibles et résistantes au témozolomide par la technique du test MTT. groupements thiols libres susceptibles d’inhiber son fonctionnement au sein des cellules. On peut penser que les structures quaternaires de certaines protéines pourraient être altérées ou même le site actif de certaines enzymes inhibé. Un article publié par Dennehy et coll. (2006) a montré que certaines molécules capables de former des adduits sur les cystéines vont toucher plus de 500 protéines au sein des cellules HEK293. Au sein de ces protéines, de nombreuses familles sont impliquées dans la prolifération, la réplication de l’ADN ou encore la synthèse protéique (Dennehy et coll., 2006). Il devient donc difficile d’identifier une seule et unique cible au sein des cellules cancéreuses. Le seul élément au sein des résultats qui permettrait de réduire le nombre de cible potentielle est l’accumulation des cellules au sein de la phase G2/M du cycle cellulaire. La famille de protéines qui pourrait être impliquée aurait un lien direct ou indirect avec les mécanismes de division cellulaire. Le fait que de nombreuses protéines soient ciblées au sein des cellules empêche d’obtenir in vitro des molécules biosélectives comme nous l’avons présenté dans nos résultats. Pour présenter les phyllostictines comme traitement potentiel pour les gliomes, il devient nécessaire de rendre plus sélective ce type de molécules vis-à-vis des cellules gliales tumorales. 2.3 Amélioration de la biosélectivité par vectorisation ciblée Plusieurs moyens techniques permettent un adressage ciblé de molécules thérapeutiques vis-à-vis de cellules cancéreuses, en l’occurrence dans le cas qui nous intéresse les cellules gliales tumorales. Dans le cas des tumeurs cérébrales, la barrière hémato-méningée peut représenter un obstacle à l’adressage d’agents chimiothérapeutiques (Figure 23). De plus, les pompes à efflux présentes dans les cellules gliales tumorales peuvent diminuer significativement l’efficacité d’un traitement chimiothérapeutique. Le mécanisme d’action que nous avons identifié pour la phyllostictine A et ses dérivés semblent indiquer que cette molécule est d’autant plus active que les cellules prolifèrent rapidement. Or dans un cerveau atteint d’un cancer, les cellules qui présentent le taux de prolifération le plus élevé sont les cellules gliales tumorales. Le fait que la phyllostictine cible un grand nombre de protéines dans semble- 101 Figure 23: Présentation des différents mécanismes permettant à différentes molécules ou substrats de passer la barrière hémato-méningée. A) les petits lipides diffusent librement au travers de la membrane. B) les sucres, les nucléosides ou les acides aminés sont transportés grâce à des protéines. C) les molécules de plus haut poids moléculaire se fixent sur des récepteurs spécifiques et sont internalisées pour passer la membrane hémato-méningée. D) les protéines sont absorbées par des mécanismes d’endocytose (Source : Malakoutikhah et coll., Angewandte Chemie, 2011). t-il, les cellules à prolifération rapide, permet ainsi d’espérer de court-circuiter la résistance naturelle des cellules gliales tumorales aux stimuli pro-apoptotiques. Dans le cas d’une administration des phyllostictines par voie systémique pour combattre les tumeurs cérébrales, un système d’adressage efficace que nous préconisons pour la délivrance de ces phyllostictines ferait appel aux liposomes (Bellavance et coll., 2010). Les liposomes sont des bicouches lipidiques circulaires qui ont la capacité de part leur hydrophobie de passer facilement les membranes biologique telles que la membrane plasmique ou encore la barrière hémato-méningée (Brasnjevic et coll., 2009). De plus, les liposomes protègent les molécules contre différents stress qui pourraient les dégrader (action enzymatique, variation de pH…). A ce jour, différentes études ont montré l’intérêt de ce type de délivrance pour le traitement des gliomes. En protégeant la molécule à délivrer, on optimise sa délivrance au sein des cellules en augmentant sa biodisponibilité. Dans le cas des phyllostictines, la quantité de molécule disponible au sein des cellules serait plus importante et optimiserait l’efficacité de la molécule. Dans un deuxième temps pour augmenter la biosélectivité de ces molécules, il existe des modifications possibles sur ces liposomes notamment en ajoutant des groupements rendant l’adressage spécifique aux cellules gliales tumorales, notamment par le greffage d’anticorps reconnaissant des cibles moléculaires surexprimées dans les gliomes. Il existe notamment une possibilité de cibler certains types par le greffage de l’anticorps AC133 spécifique de la protéine CD133 que l’on retrouve exprimée sur les cellules souches cancéreuses (Tabatabai et Weller, 2011; Bourseau-Guilmain et coll., 2011). Le principe consiste à greffer sur des nanocapsules lipidiques des immunoglobulines produites par des lignées cellulaires d’hybridomes. Cette technique d’adressage ouvre de nouvelles perspectives pour combattre les cellules souches cancéreuses connues pour être des cellules résistantes aux agents chimiothérapeutiques conventionnels. Il existe d’autres types de technique d’adressage spécifique pour cibler les cellules gliales tumorales. Les nanoparticules peuvent être attachées à la molécule à délivrer ou bien encapsuler cette dernière. Plusieurs types de nanoparticules existent comme les polyacétates, les polyascorbates ou encore les polysaccharides. L’intérêt de ces molécules 102 se situe au niveau de leur taille (<200nm) qui permet un passage aisé de la barrière hémato-méningée (Malakoutikhah et coll., 2011). Le greffage de peptide reste aussi un bon moyen d’adresser spécifiquement des molécules au sein des cellules cancéreuses. La séquence RGD (arginine-glycine-acide aspartique) a été un des premiers peptides utilisé pour cibler les cellules cancéreuses notamment grâce à sa spécificité pour les intégrines αvβ3 qui sont impliquées dans les mécanismes d’invasion des cellules gliales tumorales. Récemment il a été greffé une séquence polycyclique RGD sur du témozolomide permettant de diminuer de dix fois l’indice IC50 sur la lignée MCF-7 (Braun et coll., 2010). Dans le même temps, le peptide Angiopep-2 a montré de très bonne capacité pour franchir la barrière hémato-méningée grâce à son affinité pour les protéines LRP (Low-density Receptor Protein family) impliquées dans les mécanismes d’endocytose (Xin et coll., 2011). Ces protéines se retrouvent aussi dans les cellules gliales tumorales rendant ce peptide efficace puisque capable de reconnaître la même cible dans deux types de cellules différentes (Xin et coll., 2011). 3 Conclusions Notre première partie du travail a permis de mettre au point deux lignées de glioblastome résistant au témozolomide. Cette résistance a été validée par des expériences in vivo puisque lorsque ces cellules sont greffées sur des animaux immunodéficients, la durée de survie de ces animaux traités au témozolomide est plus faible que pour les animaux greffés avec les lignées cellulaires normales. Grâce à l’analyse de l’expression des gènes, nous avons pu isoler deux familles de gènes impliquées dans les mécanismes de résistance au témozolomide : les transporteurs du glucose et les aldo-kéto réductase de type 1. Nous avons aussi mis en évidence que l’expression de la protéine akr1c3 est directement liée aux mécanismes de proliferation cellulaire. En effet, l’extinction transitoire de son expression à l’aide d’un siRNA permet de diminuer la prolifération cellulaire de la lignée U373-MG résistante au témozolomide. Il faudrait aussi déterminer la fonction des transporteurs glucose dans les mécanismes de résistance au témozolomide en identifiant s’ils jouent un rôle dans la prolifération comme akr1c3 ou bien s’ils sont directement liés à la résistance propre. Enfin pour investiguer et 103 comprendre complètement ces mécanismes de résistance, il faudrait identifier le régulateur commun de ces gènes. Il est possible que les surexpressions de ces gènes soient en fait coordonnées par une seule et même protéine. On peut penser que le facteur de transcription HIF-1α, qui est connu pour réguler l’expression des transporteurs glucose, puisse aussi contrôler l’expression des akr1c. La deuxième partie de notre travail nous a permis d’identifier une nouvelle famille de molécules naturelles et originales présentant une activité anticancéreuse in vitro. Nos travaux ont montré qu’un type de métabolite, la phyllostictine A, ainsi que ses deux hémidérivés synthétiques mono et diacétylés ont montrés des activités anticancéreuses intéressantes sur différentes lignées cellulaires. De plus, il semblerait que ces molécules soient capables de fixer les groupements thiols libres au sein des cellules ce qui expliquerait leur activité in vitro. En testant l’activité de la phyllostictine A sur nos modèles résistants au témozolomide, nous avons remarqué que cette molécule est capable de s’affranchir des mécanismes de résistance et d’avoir une activité cytotoxique identique à celle obtenue sur les modèles de cellules gliales tumorales ne présentant pas de résistance au témozolomide. Il serait aussi intéressant de confronter ces molécules à des modèles in vivo de tumeurs humaines greffés de manière orthotopique au sein du cerveau de souris immunodéficientes. Le modèle U373-MG ainsi que son homologue U373-MG LTT pourraient représenter un bon modèle de part ces caractéristiques proches des modèles cliniques. Cependant, l’absence de biosélectivité ainsi que la non identification précise de la cible de la phyllostictine A limite le développement de ces molécules vers une phase préclinique. Pour remédier à ces différents problèmes, notamment pour la biosélectivité, il est possible de moduler par des systèmes d’adressage précis la phyllostictine pour la rendre sélective des cellules tumorales gliales. En ce qui concerne, l’identification de la cible de ces molécules, vu le nombre de cible potentielle, la nécessité d’utiliser des techniques de protéomiques globales est indispensable. 104 REFERENCES REFERENCES Abe, T., Mori, T., Wakabayashi, Y., Nakagawa, M., Cole, S.P.C., Koike, K., Kuwano, M., Hori, S (1998). Expression of multidrug resistance protein gene in patients with glioma after chemotherapy.Journal of Neuro-Oncology 40, 11-18. Airley, R. E., and Mobasheri, A. (2007). Hypoxic regulation of glucose transport, anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer: novel pathways and targets for anticancer therapeutics. Chemotherapy 53, 233–256. Albert, J. M., Cao, C., Geng, L., Leavitt, L., Hallahan, D. E., and Lu, B. (2006). Integrin alpha v beta 3 antagonist Cilengitide enhances efficacy of radiotherapy in endothelial cell and non-small-cell lung cancer models. International journal of radiation oncology, biology, physics 65, 1536–1543. 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