Proposition stage ENS_CRCL

MASTERBIOSCIENCES
ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE LYON
Offre de stage de Master
Tuteur du stage et Laboratoire d’accueil:
Il s’agit d’une proposition de stages couplés entre :
- pour le premier stage : le Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon – Site de la
Faculté de Médecine Lyon Sud – Equipe Germain Gillet. L’étudiant sera encadré par le Dr
Jonathan Lopez (MCU-PH en Biochimie et Biologie moléculaire – UFR de Médecine Lyon
Sud – Plateforme de Génétique Somatique des Cancers Hospices Civils de Lyon)
- pour le second stage : le CRUK Beatson Institute for Cancer Research – University of
Glasgow – Mitochondria and Cell Death group du Dr Stephen Tait au sein duquel j’ai
réalisé une mobilité postdoctorale entre 2013 et 2015. L’étudiant sera encadré par un
chercheur postdoctoral pendant son stage. Une bonne maîtrise de l’anglais est nécessaire.
Le second stage vise à acquérir des compétences techniques spécifiques dans le domaine de la
biologie du lysosome qui seront nécessaires à la poursuite du projet en thèse au CRCL à la
rentrée suivante.
Pour tous renseignements merci de me contacter par mail : [email protected].
J’encadre actuellement en thèse une étudiante de l’ENS (qui a aussi travaillé avec moi à Glasgow)
que vous pouvez également contacter si vous le souhaitez : [email protected].
Titre du projet de recherche:
TMEM175, un régulateur de la mort autophagique dépendante ?
Description du projet:
Ce projet s’inscrit dans la continuité de mes travaux de postdoc au Beatson Institute centrés sur la
régulation de la perméabilisation mitochondriale. Nous avons développé un outil moléculaire
permettant de mimer l’addiction des cellules tumorales aux BCL2 anti-apoptotiques (« Mitopriming ») qui nous permet d’induire la perméabilisation mitochondriale et la mort synchrone et
très rapide d’une population cellulaire de manière dose-dépendante (Lopez, Bessou et al. Nature
Communications. 2016). De par sa grande robustesse notre approche est particulièrement
intéressante pour réaliser des criblages. Ainsi j’ai réalisé avant de partir un criblage « perte de
fonction » utilisant la technologie CRISPR/Cas9 (banque Gecko de 120k sgRNA soit 6 par gène et
4 par miRNA) dans une lignée HeLa ≪ primée ≫ à mourir. Ceci nous a permis d’identifier un
grand nombre de nouveaux régulateurs de l’apoptose mitochondriale, de la mort caspaseindépendante et de la biogénèse mitochondriale. J’ai sélectionné sur une base bibliographique
plusieurs candidats « suppresseurs de tumeur » (gènes dont le KO protège de la mort
mitochondriale) potentiellement intéressants en dermatologie (spécialité qui représente la plus
grosse part de mon activité d’oncologie moléculaire hospitalière et pour laquelle la collaboration
avec les cliniciens du site fonctionne très bien).
Parmi ces candidats, TMEM175 semble particulièrement intéressant. Sa fonction de transporteur
potassique du lysosome vient d’être très récemment caractérisée par des études
d’électrophysiologie (Cang et al. Cell. Aug 2015). Au niveau fonctionnel les lysosomes KO pour
TMEM175 présentent des altérations du pH luminal et une fusion anormale avec les
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autophagosomes durant l’autophagie. Par ailleurs TMEM175 a été décrit comme un gène de
susceptibilité au Parkinson (Zhu et al. Mol Neurobiol. 2016), maladie fortement associée au
développement de mélanomes sans que le lien fonctionnel n’est encore été identifié.
Nous nous proposons de caractériser par des approches de biologie cellulaire et moléculaire la
fonction « pro-mort » de TMEM175 que nous avons identifié lors de notre criblage dans des
modèles de mélanome. Dans une optique plus translationnelle (et plus long terme) nous
chercherons à moduler l’activité de TMEM175 pour favoriser ou au contraire limiter la rupture
de la membrane lysosomale et la mort cellulaire.
Lors du premier stage nous commencerons par comparer l’expression de TMEM175 entre
mélanomes et tissu sain. Nous évaluerons ensuite l’impact de son KO sur la réponse à une
stimulation de l’autophagie (starvation, modulation de mTOR, etc) sur des lignées que nous
aurons générées par la technologie CRISPR/CAS9. Nous caractériserons aussi très finement le type
de mort cellulaire mis en jeu en nous intéressant particulièrement à la perméabilisation des
lysosomes. Pour cela nous utiliserons des approches variées de microscopie et de biochimie. Nous
nous focaliserons également sur l’impact fonctionnel en termes de mort cellulaire des
polymorphismes identifiés lors des études de susceptibilités au Parkinson et rechercherons leur
présence chez nos patients atteints de mélanomes.
Le second stage au Beatson Institute vise à confirmer les résultats obtenus par d’autres approches
fonctionnelles (purific ation de lysosomes, imagerie en temps réel de l’autophagie). Ces méthodes
de purification seront très utiles pour la poursuite en thèse. En effet nous souhaitons ensuite
moduler l’activité de TMEM175 pour favoriser la rupture de la membrane lysosomiale (LMP) et la
mort cellulaire (en oncologie) ou à l’inverse l’inhiber (maladies neuro-dégénératives).
Pour cela nous réaliserons deux criblages : le premier utilisant la technologie CRISPR/CAS9 pour
identifier des régulateurs potentiellement « targetables » de la LMP TMEM175-dependante (seuls
les candidats ne tuant pas les cellules TMEM175 KO ou son mutant inactif seront retenus) ; le
second avec un criblage d’interaction directe d’une banque de petites molécules disponible sur la
Plateforme C3D du CRCL, suivie d’une validation fonctionnelle comme précédemment. Ceci
devrait nous permettre d’identifier des molécules capables de moduler sélectivement la mort
lysosomale-dépendante potentiellement intéressantes en cancérologie ou en neurosciences.
Publications du laboratoire (5 max):
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J Lopez · M Bessou · (…) · G Ichim · SWG Tait. · Mito-priming as a method to engineer Bcl-2
addiction · 2016 · Nature Communications
J Lopez · SWG Tait · Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within · 2015 ·
British Journal of Cancer
G Ichim · J Lopez · (…) · DJ Murphy · SWG. Tait · Limited Mitochondrial Permeabilization
Causes DNA Damage and Genomic Instability in the Absence of Cell Death ·2015 ·
Molecular cell
J Lopez* · C Hesling* · (…) · G Gillet · R Rimokh Tif1 is essential for the terminal
differentiation of mammary alveolar epithelial cells and for lactation through SMAD4
inhibition · 2013 ·Development
J Lopez · C Hesling · (…)· G Gillet · P Gonzalo · Src tyrosine kinase inhibits apoptosis through
the Erk1/2-dependent degradation of the death accelerator Bik · 2012 · Cell death and
differentiation