Milieux de culture

Milieux de culture
• Gélose trypticase soja
Formule :
Peptone trypsique de caséine : 15 g/l
Peptone papaïnique de soja
: 5 g/l
Chlorure de sodium
: 5 g/l
gélose
:15 g/l
Cette gélose permet la culture de micro-organismes exigeants avec un
temps de latence très diminué.
Elle sert de base pour la préparation de la gélose au sang : la culture et
l’hémolyse sont favorisées.
• Gélose colombia
Formule :
Mélange de peptone riche en acides aminés et en vitamines : 23 g/l
Amidon
: 1 g/l
Chlorure de sodium
: 5 g/l
+ Agar pour le milieu gélosé
Les milieux colombia mis au point pour l’isolement du Streptocoque,
constitue aujourd’hui des milieux de base de même valeur.
Par addition de sang, d’agents sélectifs ou de produits accélérateurs de
croissance, il est possible de préparer différents milieux nutritifs spéciaux pour
la culture, l’isolement et l’identification des micro-organismes dans les
prélèvements de gorge, les crachats, les exsudats, les pus, etc.
Les zones d’hémolyse sont particulièrement nettes sur gélose colombia.
• Gélose au sang ordinaire (GSO)
L’addition de 5 à 10% de sang de cheval à un milieu nutritif donne un milieu
permettant une culture visible mais pauvre de H. influenzae, en raison de sa
faible teneur en facteur V .Une culture en stries de S. aureus qui libère de
l’ADN synthétisé en excès permet d’obtenir des colonies de plus grande taille
par le phénomène de satellitisme.
Le sang de cheval, de lapin, de cobaye ou de rat donne de bons résultats.
Par contre le sang de mouton ne permet pas la culture de H. influenzae ou H.
parainfluenzae, en raison de l’absence de libération spontanée de NAD et de
NADP par les globules rouges de mouton associés à une très forte activité
hydrolytique de NAD et de NADP.
• Gélose au sang cuit (GSC)
La GSC est obtenue en ajoutant 5ml de sang de cheval en un flacon de 100ml
de gélose ordinaire (nous avons utilisé la gélose de trypticase soja ou la gélose
colombia) préalablement fondue et refroidie aux environs de 70°C.
On maintient à la température de 70°C pendant 10mn. On refroidie à 50°C avant
de couler en boites de pétri pour éviter la condensation.
Les géloses au sang cuit préparées avec du sang de lapin, cheval ou mouton
contiennent 33 à 53 mg/l de NAD ou NADP et conviennent parfaitement, de
même que la gélose préparée avec du sang humain.
• GSC Gentamicine
Milieu de base
:
GSC
Solvant de la gentamicine
:
eau distillée stérile
Ajouter la gentamicine à 5,5mg/l du milieu pour la gélose colombia ou
6,0 mg/l du milieu pour la gélose trypticase soja.
• GSC Bacitracine
Milieu de base
: GSC
Solvant de la bacitracine
: eau distillée stérile
Ajouter 300mg par litre de milieu.
NB : Dans la préparation de la GSC Gentamicine ou de la GSC Bacitracine la
solution d’antibiotique est ajoutée après refroidissement de la GSC jusqu’à
40°C.
• Gélose chocolat
Formule :
polypeptone
:
15 g/l
Amidon de maïs
:
1 g/l
Phosphate dipotassique
:
4 g/l
Phosphate monopotassique
:
1 g/l
Chlorure de sodium
:
5 g/l
Hémoglobine
:
10 g/l
Gélose
:
10 g/l
L’emploi de l’hémoglobine à la place du sang total permet la répartition en
flacons qu’il suffit de porter au bain marie bouillant et de couler ensuite en tubes
ou en boites de pétri .
Il faut noter que certains facteurs de croissance (NAD) présents dans la
gélose de sang cuit n’existe pas dans la gélose chocolat qui ne contient que de
l’hémoglobine.
Ces facteurs sont remplacés par un mélange chimiquement défini ( polyvitex)
dont la formule en g/l est la suivante :
Vitamine B 12
:
0,010
L-glutamine
:
10,000
Adénine
:
1,000
Chlorhydrate de guanine
:
0,030
Acide para-aminobenzoique
:
0,013
L-cystéine
:
1,100
Glucose
:
100,00
Diphosphopyridine nucletide oxydé :
0,250
Cocarboxylase
:
0,100
Nitrate ferrique
:
0,020
Chlorhydrate de thiamine
:
0,003
Chlorhydrate de cystéine
:
25,900
Ce constituant est présenté sous forme lyophilisé accompagné d’ un solvant.
Pour l’emploi, il faut reprendre un flacon par un ml de solvant et agiter pour
assurer une dissolution complète. Le mélange reconstitué ne se conserve pas.
Une fois le polyvitex reconstitué, faire fondre au bain marie bouillant en
flacon de 100ml de gélose chocolat et le ramener à 50°C.
Ajouter dans le milieu en surfusion un ml de polyvitex coulé en boite.
• Milieu de Levinthal
Il est préparé à partir de sang de cheval défribriné dont les globules rouges
sont lysés par choc osmotique et congélation ou par chauffage.
La solution stock de Levinthal est utilisée avec un bouillon nutritif ou
incorporé à un milieu gélosé et permet d’obtenir un milieu transparent.
• Haemophilus test Médium (HTM)
Il est préparé à partir de gélose MH supplémentée par 15µg/l d’hémine
15µ g/l de NAD 5mg/l d’extrait de levure. Ce milieu est recommandé par le
national clinical laboratory standard (NCLS) pour le test de sensibilité sur les
haemophilus
• Milieu cœur cervelle
C’est un excellent bouillon d’hémoculture.
Formule en g/l d’eau distillée
Infusion de cervelle de veau :
200,0
Infusion de cœur
:
250,0
Peptone de gélatine
:
10,0
Chlorure de sodium
:
5,0
phosphate disodique
:
2,5
glucose
:
2,0
(+ Agar si milieu gélosé)
• Bouillon Mueller Hinton
Infusion de viande de bœuf :
300g
Hyrolysat de caséine
:
17,5g
Amidon
:
1,5g
Eau distillée
:
1000ml
Ajuster à pH 7,4 répartir en tubes ou en flacons
Autoclaver à 120°C pendant 15mn
Ce milieu peut être solidifié par addition d’Agar 15 g/l. La gélose MH a servi de
milieu de base pour l’étude des antibiotiques.