LA RÉGÉNÉRATION IN VITRO DU FRAISIER (FRAGARIA X

49
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1999, 138, 49-74
LA RÉGÉNÉRATION IN VITRO DU FRAISIER
(FRAGARIA X ANANASSA DUCH.) (*)
II - Les possibilités offertes par la culture in vitro
E. M. EL HAMDOUNI
(1)
, A. LAMARTI
(1)
, A. BADOC
(2)
La culture de méristèmes et d’apex a été appliquée avec
efficacité pour l’élimination des virus et pour le développement de
la production à large échelle de plants de Fraisier (Fragaria X
ananassa Duch.) par micropropagation.
De même, des protocoles de régénération par organogenèse
directe ou indirecte sur divers types d’explants ont été mis au
point chez un grand nombre de variétés cultivées à travers le
monde.
Ces protocoles peuvent être potentiellement utilisés pour
l’amélioration de cette plante fruitière à travers la variation
somaclonale et permettre de sélectionner des clones résistants aux
maladies, aux ravageurs, au gel ou présentant des caractères
désirables (qualité du fruit, rendement, etc.).
Par ailleurs, un certain nombre de cultivars ont pu être
transformés génétiquement par l’intermédiaire d’Agrobacterium
tumefaciens.
(*)
Manuscrit reçu le 2 novembre 1999
(1)
Laboratoire de Biotechnologie et d'Amélioration des plantes, Département de
Biologie, Faculté des Sciences Mhanach II, BP 2121 Tétouan, 93002 Maroc.
(2)
Laboratoire de Mycologie et Biotechnologie végétale, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2, 3, place de la Victoire,
33076 Bordeaux Cedex.
50
INTRODUCTION
La plupart des fraises du commerce proviennent du Fraisier cultivé,
Fragaria X ananassa Duch., espèce octoploïde issue d’un hybride spontané
entre deux espèces octoploïdes originaires d’Amérique, Fragaria chiloensis
Duch. et F. virginiana L. .
La recherche de variétés résistantes présentant une meilleure qualité du
fruit et leur production de masse ont conduit tout naturellement à l'utilisation des
différentes techniques de culture in vitro. Ces dernières sont successivement
passées en revue pour le Fraisier cultivé.
GERMINATION IN VITRO
Les akènes du Fraisier montrent souvent un pourcentage variable et/ou
faible de germination. De même, l'émergence des plantules peut être étalée sur
une période allant de 2 à 12 semaines après l’ensemencement [34,92,106].
Les akènes de Fraisier germent mieux s’ils proviennent de fruits mûrs
et s’ils ont été
[28], en particulier de la partie basale et médiane du fruit [13,26]
stockés un minimum de temps [1,15].
Plusieurs traitements ont été utilisés dans le but d’améliorer la germination
des akènes du Fraisier.
Un stockage au froid des akènes [1,9,12,15,28,44,92,100,107,etc.], l'humidité
[35], l’exposition à la lumière [28,64,90-91,100], notamment la lumière rouge [44],
une forte pression osmotique [27] favorisent la germination.
Il en est de même de l’acide gibbérellique [13,26,64,100], l’ethephon
l’eau oxygénée [66] et les acides comme HCl, HNO3 et H2SO4
[13,66,93,107,109,etc.].
[28,34,106],
51
Chellappa [13] a testé une scarification mécanique en limant les akènes et
le pourcentage de germination augmente en utilisant non pas des akènes entiers,
mais des portions d’akènes mûrs de Fraisier renfermant l’embryon avec l’apex
et la radicule [56].
MICROPROPAGATION
Les travaux sur la micropropagation du Fraisier visaient à obtenir au
départ des plants indemnes de virus et ont conduit à la production de masse de
jeunes plants. Adams [2] a réalisé le premier l’obtention d’un nombre illimité de
plantules à partir d’un seul méristème par utilisation d’une cytokinine dans le
milieu de culture. Cependant, il n’a pas obtenu un grand nombre de plantules,
n’ayant utilisé qu’une faible concentration de benzyladénine (0,1 mg/l BA) dans
le milieu de culture. Puis Nishi et Ohsawa ont proposé une technique de
régénération de bourgeons sur des cals induits à partir de méristèmes apicaux,
mais cette technique a favorisé l’apparition de plantes présentant des altérations
phénotypiques. C'est pourquoi Boxus [10] a mis au point une technique évitant
la formation de cal et permettant la prolifération de bourgeons axillaires multiples
par l’utilisation dans le milieu de benzyladénine à une concentration dix fois plus
élevée que celle utilisée par Adams [2]. Les bourgeons séparés sont facilement
enracinés par l’omission de cytokinine dans le milieu de culture. Ainsi, Boxus
[11] a décrit un protocole pour la production de millions de plantules à partir d’un
seul méristème et l’a testé sur 74 variétés. Ce protocole a été adopté pour la
propagation de masse du Fraisier et a été modifié et adapté pour divers cultivars.
Il passe par quatre phases, d’établissement, de prolifération, d’enracinement et
d’acclimatation décrites dans la première partie de cette revue [16].
Culture de tissus
Des travaux de régénération à partir de divers explants ont été menés avec
succès par organogenèse directe (Tableau I) ou par culture de cals (Tableau II).
Ainsi, des plantules ont été régénérées à partir de la culture de cotylédons [55],
de tissus foliaires (limbe, pétiole ou stipules) [4-5,17,23,33,39-40,46,51,6768,70,80,86,96,98,etc.], de stolons ou de pédoncules [39,50-51], d’anthères
[14,79,83,85,99,etc.], d’ovaires non pollinisés ou de pétales [6,82], d’akènes
immatures [49]. Les Tableaux I et II mentionnent différentes solutions minérales
et balances phytohormonales utilisées ainsi que les cultivars étudiés.
52
Tableau I : Organogenèse directe sur divers explants de Fraisier
Cultivar ou
génotype
Explant utilisé S o l u t i o n
minérale
étudié
Balance
phytohormonale
Auxines
(µM)
Références
Cytokinines
(µM)
‘Allstar’
Disque foliaire
LS
2,46 AIB
Segment de stolon LS+KNO3 11,41 AIA
11,09 BA
44,38 BA
Liu et
Sanford, 1988
‘Honeoye’
Segment de stolon LS+CH
2,46 AIB
22,19 BA
‘Redcoat’,
'Veestar'
Disque foliaire
MS
10 AIA
10 BA
‘Brighton’,
Fleur non
‘Douglas’, ‘Fern’, pollinisée
‘Honeoye’,
Pétale
‘Parker’
MS
2,7-10,8
ANA
0,9-2,3
2,4-D
2,2-22 BA
Liu et
Sanford, 1988
Nehra et al.,
1989
Predieri et
al., 1989
‘Rapella’
Disque foliaire
MS
1 2,4-D
4,4 BA
‘Redgauntlet’,
‘Senga Sengana’
Akène immature
LF
0,54 ANA 2,22 ou
0,045 2,4-D 3,55 BA
Lis, 1990
‘Redcoat’
Disque foliaire
MS
1 ANA
10 BA
Nehra et al.,
1990a
‘Brighton’
Ovaire non
pollinisé
MS
2,3 2,4-D
11 BA
‘Tioga’, ‘Allstar’, Disque foliaire
‘Tribute’,
Segment de
‘Earlidawn’
stolon, de pétiole
ou d’hypocotyle
LS
1 2,4-D
14 BA
Battistini et
Rosati, 1991
Jelenkovic et
al., 1991
‘Chandler’
Disque foliaire
N30K [52] 2,46 AIB
‘Redgauntlet’,
‘Senga Sengana’,
‘Surprise des
Halles’
Pédoncule floral
LF
Segment de stolon
‘Hiku’, ‘Jonsok’
Disque foliaire
James et al.,
1990
8,8 BA
Barceló et
al., 1993
0,54 ANA
0,89 BA
Lis, 1993
MS
0,49 AIB
13,3 BA
Sorvari et
al., 1993
‘Totem’, ‘Tristar’ Disque foliaire
MS
2,85 AIA
8,8 BA
Mathews et
al., 1995
‘Chandler’
N30K
2,4 AIB
8,8 BA
Barceló et
al., 1998
Disque foliaire
LF : Lee et Fossard [46] ; LS : Linsmaier et Skoog [48] ; MS : Murashige et Skoog [63] ; AIA
: acide 3-indolacétique ; AIB : acide 3-indolbutyrique ; ANA : acide naphtalène acétique ; 2,4-D
: acide 2,4-dichlorophénoxyacétique ; BA : benzyladénine
53
Tableau II : Organogenèse sur cals issus de divers types
d’explants de Fraisier
Cultivar ou
génotype
étudié
Explant
utilisé
Milieu de
régénération
Solution
minérale
Références
Phyto
hormones
(µM)
‘Bogota’, ‘Brighton’,
JILA33, ‘Ostara’,
‘Redgauntlet', ‘Rapella’
Disque foliaire
Segment de
feuille
MS
0,9 2,4-D
11,11 BA
Jones et al.,
1988
‘Allstar’
Disque foliaire
LS
2,46 AIB
11,11 BA
‘Redcoat’
Disque foliaire
MS
1 ANA
10 BA
Liu et Sanford,
1988
Nehra et al.,
1990a
‘Redcoat’
Disque de feuille MS
immature
‘Pajaro’
Anthère
GD3 [24]
15 ANA
0,05 Kinétine
Quarta et al.,
1992
‘Hokowase’
Jeune feuille
MS
0,45 2,4-D
4,40 BA
Toyoda et al.,
1991
‘Addie’, ‘Dana’, ‘Gea’,
‘Santana’
Stipule
B5 [21]
ou MS
2,5 AIB
10 BA
Rugini et
Orlando, 1992
‘Aiko’, ‘Dana’, 'Gorella', Disque foliaire
‘Premial’
Segment de
pétiole
MS
4,5 2,4-D
22 BA
Isac et al.,
1994
F32025, F77109,
‘Hecker’, ‘Redgauntlet’,
‘Senga Sengana’,
‘Tribute', ‘Zefyr’
LS
5 BA
Svensson et
Johansson,
1994
‘Muir’, ‘Pajaro’, ‘Selva’ Filament
Ω (‘Dana’ X ‘Tribute’), d’anthère
85.30.5
GD3
15,1 BA
0,046
Kinétine
Damiano et al.,
1995
‘Aiko’, ‘Premial’,
‘Gorella’
MS
4,5 2,4-D
4,40 ; 13,3 ;
22,2 BA
Popescu et al.,
1997
Anthère
Disque foliaire
Segment de
pétiole
5 ou 10 2,4-D Nehra et al.,
5 ou 10 BA
1990c
LS : Linsmaier et Skoog [48]
MS : Murashige et Skoog [63]
BA : benzyladénine = benzylaminopurine
2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
AIB : acide 3-indolbutyrique
ANA : acide naphtalène acétique
54
Le taux de prolifération des bourgeons in vitro varie suivant le génotype
et de ce fait le milieu de culture doit être adapté pour chaque variété [95]. De plus,
les explants prélevés sur des plantes jeunes répondent mieux à la régénération et
la prolifération des bourgeons que ceux prélevés sur des plantes âgées [70].
Embryogenèse somatique
Les embryons issus d’un tissu non constitué de cellules zygotiques sont
dits somatiques et relèvent d’une embryogenèse asexuée ou somatique. Les
premiers travaux ont été réalisés par Reinert [84] et Steward et al. [97] chez la
Carotte domestique en 1958. Pour induire cette embryogenèse, l’explant doit être
placé dans un premier temps dans un milieu primaire renfermant des auxines
pour que les cellules subissent un processus de différenciation,puis transféré sur
un milieu secondaire sans auxine afin de permettre le développement des
embryons. L’embryogenèse somatique est un processus par lequel des cellules
somatiques se développent en plantes différenciées à travers les stades
embryonnaires caractéristiques des embryons zygotiques [105]. Les récentes
découvertes de dessiccation, de conservation et de réhydratation des embryons
somatiques peuvent avoir un certain impact sur les espèces cultivées, et ce en
relation directe avec la technologie de production de “ graines artificielles ”.
Chez le Fraisier, l’embryogenèse somatique est une alternative aux
méthodes actuelles de micropropagationet à la propagation classique par stolons.
Si la micropropagationpar culture d’apex ou de méristèmes permet la production
d’un million de plantules par an à partir d’un seul méristème [10],
l’embryogenèse somatique, en rapport avec la technologie des graines
artificielles, peut délivrer potentiellement des millions “ d’akènes de Fraisier ”
en quelques semaines.
Wang et al. [104] ont étudié l’embryogenèse somatique à partir
d’embryons zygotiques immatures et ont observé un taux d’apparition de tissu
embryogène élevé en présence de 5 mg/l de 2,4-D, 0,5 mg/l de BA et 500 mg/l
d’hydrolysat de caséine, mais peu de développement en embryons somatiques.
Suspensions cellulaires
L’établissement de suspensions cellulaires est réussi par transfert des cals
friables sur un milieu nutritif liquide approprié tout en assurant une agitation
orbitale servant à la fois pour l’aération et la dispersion des cellules. Chez le
Fraisier, des protocoles d’établissement de suspensions cellulaires à partir de
cals ont été mis au point (Tableau III).
La majorité des travaux ont concerné la biosynthèse de métabolites
secondaires. Ainsi, Hong et al. [30] ont décrit des processus pour
55
l’établissement et le développement de suspensions cellulaires initiées à partir
de cals issus de fruits immatures du cultivar ‘Brighton’ ; ils ont comparé trois
systèmes de culture par mesure de la consommation d’oxygène et
de saccharose et du gain en poids de matière sèche durant deux semaines
de culture ; ils ont mis en évidence des différences entre cultivars quant à leur
Tableau III : Induction du cal et établissement de suspensions
cellulaires chez le Fraisier
Cultivar
ou
génotype
étudié
Explant
utilisé
Milieu d’établissement
Solution minérale et
vitamines / phytohormones
d’un cal friable
MS
5 mg/l 2,4-D
0,1 mg/l BA
Références
de la
suspension
cellulaire
Fruit
immature
‘Pajaro’
Disque foliaire B5 [21]
10,7 µM ANA
4,6 µM Kinétine
Blando et al. 1993
B5
2,3 µM de 2,4-D
‘Shikinari’
Méristème
LS
apical
0,5-5 mg/l 2,4-D
Disque foliaire 0-2 mg/l BA
Segment de
pétiole
LS
‘Shikinari’ Disque foliaire LS
1 mg/l 2,4-D
0,1 mg/l BA
‘Pajaro’,
‘Selva’,
‘Muir’, Ω
(‘Dana’ X
‘Tribute’),
85.03.5
Segment de
pétiole
GD1 [24]
‘Shikinari’
Méristème
apical
MS
1 mg/l 2,4-D
0,1 mg/l BA
2 mg/l ANA
5 mg/l kinétine
LS : Linsmaier et Skoog [48]
ANA : acide naphtalène acétique
2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
MS
1 mg/l 2,4-D
0,1 mg/l BA
Hong et al. 1989
‘Brighton’
Mori et al., 1993
1 mg/l 2,4-D
0,1 mg/l BA
LS
1 mg/l 2,4-D
0,1 mg/l BA
Mori et al.,
1994a, 1994b ;
Mori et Sakurai,
1994, 1995
B5
0,5 mg/l 2,4-D
0,2 mg/l BA
Damiano et al.,
1995
LS
1 mg/l 2,4-D
0,1 mg/l BA
Sato et al., 1996
MS : Murashige et Skoog [63]
BA : benzyladénine
56
capacité d’initiation de cals et de production d’anthocyanes en suspension
cellulaire. La même équipe a démontré ultérieurement la possibilité de production
de composés volatils (butanol, butyrate d’éthylbutanol et butyrate de butyle) en
ajoutant au milieu des précurseurs [31]. Pour leur part, Damiano et al. [14] ont
établi des suspensions cellulaires et étudié le polymorphisme enzymatique chez
les plantes régénérées à partir de cals. Plusieurs travaux ont porté sur la
stimulation et l’amélioration de la production d’anthocyanes par divers facteurs
sur des suspensions cellulaires [57-62,87,89,108,etc.]. Ainsi, Nakamura et al. [65]
ont observé que de faibles concentrations de 2,4-D dans le milieu de culture ont
un effet négatif sur la croissance cellulaire et augmentent aussi bien la production
que la méthylation des anthocyanes.
Des méthodes de néoformation de plants de Fraisier à partir de
suspensions cellulaires ont été mises au point [19,101].
PROTOPLASTES
L’hybridation interspécifique chez le genre Fragaria en utilisant les
techniques de sélection classiques nécessite plusieurs années. Une solution
attrayante peut être la combinaison de divers génomes ou le transfert de gènes
extrachromosomiaux de Fragaria, à travers la fusion des protoplastes, un
protoplaste étant une cellule sans paroi pouvant fusionner avec un autre
protoplaste pour aboutir à une plante hybride [81].
Cependant, le développement d’un protocole efficace de fusion de
protoplastes nécessite la réalisation d’un certain nombre d’étapes pouvant
chacune constituer une barrière :
- Choix de la source des explants et du tissu.
- Développement d’un système enzymatique efficace pour se débarrasser
de la paroi pectocellulosique.
- Développement d’un milieu approprié pour la survie des protoplastes.
- Exécution du protocole de fusion pour la production d’hybrides
somatiques.
- Sélection du produit de fusion.
- Développement d’un milieu permettant la régénération de la paroi des
cellules sélectionnées et éventuellement de plantes complètes.
57
Chez le Fraisier, aucune publication n’a porté à notre connaissance sur
l’hybridation somatique. Cependant, Binding et al. [7] ont reporté la possibilité
de régénération des plantes à partir de protoplastes isolés de l’apex. Nyman et
Wallin [75-76] ont étudié les facteurs affectant le rendement, la survie, la culture
et la régénération des protoplastes issus de mésophylle ainsi que la détermination
du contenu en ADN chez les plantes régénérées. Dans cette dernière étude, un
rendement élevé en protoplastes a été obtenu à partir des feuilles de plantules
cultivées in vitro sur un milieu sans phytohormone et avec une faible
concentration en sucres, et ce après traitement du tissu foliaire par une solution
enzymatique contenant 1,0 % (p/v) de cellulysine et 0,05 % (p/v) de pectolyase.
Sur un milieu contenant 1,0 mg/l de 2,4-D et 0,5 mg/l d’AIB, ces protoplastes
isolés régénèrent leur paroi et commencent leur division formant ainsi des
colonies cellulaires et des plantes entières ont été régénérées sur le milieu de
Murashige et Skoog [63] solide additionné de 0,2 mg/l d’ANA et 5-10 mg/l de
BA. De même, Janeckova et al. [37] ont obtenu des propagules par division des
protoplastes chez le cultivar ‘Bounty’.
L'avenir de la technologie des protoplastes dans l’amélioration du Fraisier
passe par le développement de systèmes efficaces d’isolement et de régénération
de protoplastes pour chaque variété cultivée et également pour les espèces
apparentées ou sauvages, reconnues comme sources de résistance aux maladies
et aux stress environnementaux.
VARIATION SOMACLONALE
Les procédés de culture in vitro peuvent entraîner une instabilité génétique
qui se manifeste par l’apparition de variants dont les caractères morphologiques,
structuraux, etc. diffèrent de ceux de la plante mère. Ces modifications affectent
de manière plus ou moins importante le phénotype et le génotype [41]. Ces
variations constatées parmi les plantes régénérées et nommées variations
somaclonales [45] peuvent être le résultat d’une modification du nombre
chromosomique, d’une mutation, d’une délétion ou d’une méthylation des
séquences d’ADN [3,47]. Le terme de variant est utilisé quand la nature du
changement n’est pas connue et que son comportement héréditaire est inhabituel,
par opposition à un caractère transmis par la méiose selon les lois de l’hérédité.
58
Chez le Fraisier, plusieurs variants intéressants par leurs caractères ont été
produits (Tableau IV). Ainsi, Simon et al. [94] observent approximativement
10 % de plantes issues de la culture d’anthères présentant une tolérance au
mildiou, alors que la variété étudiée était susceptible à cette maladie. Des
régénérants résistants au Fusarium ont été sélectionnés à partir de cals issus de
feuilles [102] ; les plantules ainsi obtenues ont été transplantées sur un champ
infecté par le germe pathogène et ont montré un développement normal et ce
pendant trois générations. Lors d’un screening de 29 clones issus de la
régénération in vitro d’ovaires non pollinisés du cultivar ‘Brighton’, des
somaclones moins susceptibles au Phytophtora cactorum que le clone original
ont été obtenus [6]. Faedi et al. [18] ont retenu sur un total de 1484 pieds issus
de la culture in vitro d’anthères du cultivar ‘Pajaro’ 36 plantes (2,4 %) pour
leurs caractères agronomiques : rendement élevé, taille importante des fruits et
faible susceptibilité au mildiou. Janeckova et al. [37] ont obtenu par régénération
sur disques foliaires des clones différant du cultivar ‘Senga Sengana’ par le taux
de floraison et le rendement en fruits. Des différences significatives dans la
vigueur, la floraison, le rendement et la capacité de formation de stolons ont été
signalées par Merkle [54] dans une étude sur l’effet de diverses combinaisons
phytohormonales sur le comportement au champ de plants du cultivar ‘Senga
Sengana’ régénérés in vitro. Damiano et al. [14] ont signalé que les plantes
régénérées à partir de cals issus de la culture des filaments d’anthères montrent
un polymorphisme enzymatique vis-à-vis de la peroxydase, de l’acide
phosphatase et de la glutamate déshydrogénase. Popescu et al. [80] ont obtenu
par culture de cals issus de tissus foliaires de 3 cultivars des clones montrant des
variations phénotypiques de caractères comme la vigueur, la couleur des feuilles
et des fruits, la formation de stolons ou le rendement en fruits. Orlando et al.
[78] ont développé un protocole de sélection de plantes résistantes à Rhizoctonia
fragariae et Botrytis cinerea par l’addition, au milieu de sélection, d’enzymes
pectiques de ces champignons.
Bien que les variations phénotypiques puissent apparaître aussi chez les
plantes issues de la culture de méristèmes [42,88], il est généralement admis que
les variations génétiques sont associées à la régénération à partir des cals, que la
fréquence des variations somaclonales est généralement faible et que plusieurs
facteurs puissent être responsables de ces variations tels le génotype, la balance
phytohormonale dans le milieu ou l’âge du cal [69,80].
59
Tableau IV :
Exemples de quelques variations somaclonales chez le Fraisier
Cultivar ou
génotype
étudié
Explant
utilisé
Variations observées
Références
‘Brighton’
Ovaire non
pollinisé
- Résistance au Phytophthora cactorum Battistini et
Rosati, 1991
‘Pajaro’
Anthère
- Apparition d’aneuploïdes parmi les
régénérants
Quarta et al.,
1992
‘Hokowase’
Jeune feuille
- Résistance au Fusarium oxysporum
f. sp. fragariae
Toyoda et
al., 1991
‘Redcoat’
Disque foliaire - Vigueur
- Forme et nombre de feuilles
- Nombre de stolons
Nehra et al.,
1992
‘Pajaro’
Anthère
Faedi et al.,
1993
‘Senga
Sengana’,
‘Redgauntlet’
Disque foliaire - Nombre de fleurs
- Rendement
Janeckova et
al., 1993
Lignée 77101
Protoplaste
- Niveau de ploïdie (plantes 16x et 12x)
- Forme et taille des feuilles et des
fruits
- Capacité de production de stolons
Nyman et
Wallin,
1992a ;
Nyman 1993
- Polymorphisme enzymatique
- Capacité de régénération
Damiano et
al., 1995
‘Pajaro’,
Filament
‘Selva’, ‘Muir’, d’anthère
Ω (‘Dana’ X
‘Tribute’),
85.30.5
‘Gorella’,
‘Aiko’,
‘Premial’
- Résistance au mildiou
- Rendement en fruits
- Taille, forme et couleur des fruits
Disque foliaire - Couleur des fruits
Segment de
- Rendement en fruits
pétiole
- Capacité de production de stolons
- Vigueur de la plante
Popescu et
al., 1997
60
TRANSFORMATION GÉNÉTIQUE
La transformation génétique vise à créer des plantes transgéniques
exprimant des gènes leur conférant des caractères agronomiques. Avec le
progrès qu’a connu la culture des tissus et la technologie de recombinaison de
l’ADN, la transformation génétique est devenue maintenant une réalité. Deux
stratégies principales ont été développées pour le transfert de gènes étrangers aux
plantes supérieures ; le transfert indirect de gènes par l’intermédiaire
d’Agrobacterium tumefaciens et le transfert direct de gènes par microinjection,
par voie bolistique ou par électroporation. Tandis que le transfert direct est
devenu une excellente méthode chez les Monocotylédones(Blé, Maïs, Riz, etc.),
Agrobacterium tumefaciens s’est avéré être un véhicule efficace pour le
transfert de gènes à l’intérieur d’une large gamme de Dicotylédones dont le
Fraisier [20].
La bactérie Agrobacterium tumefaciens renferme un plasmide Ti qui
interagit avec les cellules de la plante et permet le transfert de gènes à l’intérieur
des cellules. Le Ti sauvage renferme des gènes qui causent la formation de
tumeurs ou galles au niveau du site d’infection de la plante. Cependant,
l’utilisation des techniques de recombinaison d’ADN permet de remplacer
facilement ces gènes par des gènes d’intérêt et des gènes marqueurs permettant
l’optimisation des techniques de transfert. La susceptibilité de la plante hôte à
Agrobacterium est la première condition à remplir pour le lancement du
protocole de transfert de gènes.
Il a été signalé que le Fraisier octoploïde (Fragaria X ananassa Duch.) est
susceptible à l’infection par des souches d’Agrobacteriumtumefaciens [38,103].
Le tableau V cite quelques travaux portant sur la transformation génétique du
Fraisier.
James et al. [36] ont décrit la transformation génétique d’une importante
variété européenne de Fraisier, ‘Rapella’, par deux vecteurs, pBIN6 et pSS1. Le
premier contient les gènes nptII (néomycine phosphotransférase), qui confère
une résistance à la kanamycine, et nos (nopaline synthase) ; les plantules
transformées croissent en présence de kanamycine et le transfert et l’expression
des gènes ont été confirmés par des tests enzymatiques. Le deuxième présente
les gènes nptII et ipt (isopentényltransférase), ce dernier stimulant la synthèse
des cytokinines. La nature transgénique des explants à été confirmée par leur
61
croissance en présence de kanamycine et par l'absence d'enracinement sur un
milieu sans phytohormone.
Nehra et al. [67-68] incubent des explants foliaires du cultivar ‘Redcoat’
avec une souche d’Agrobacterium tumefaciens portant un plasmide pBI121
vecteur binaire contenant deux gènes marqueurs, nptII et GUS. Ce dernier code
pour la β-glucuronidase qui produit une précipitation bleue caractéristique chez
les cellules et tissus de plantes lorsqu’ils sont incubés en présence d’un colorant
glucuronidé comme substrat ; il permet une vérification rapide de la
transformation génétique et une visualisation de la localisation de l’expression
du gène dans les cellules transformées. L’expression fonctionnelle et
l’intégration stable de ces deux gènes dans le génome a été confirmée par divers
tests biochimiques, enzymatiques et par l’hybridation de Southern.
Jelenkovic et al. [39] ont développé une procédure pour la transformation
génétique de certains génotypes de Fraisier en utilisant divers types d’explants
et la souche LBA4404 portant 3 vecteurs, pGV3850, pGV3850::1103 et
pBI121.
Graham et al. [22] ont développé un protocole de régénération à partir de
segments de tige en utilisant les gènes GUS et CpTi. [Cowpea protease Trypsin
inhibitor]. Ce dernier permet une inhibition de la trypsine, détectée par la
réduction ou l'élimination de la couleur jaune due à l'hydrolyse d'un substrat en
p-nitroaniline.
Mathews et al. [53] ont rapporté une incorporation stable d’un gène
contrôlant la biosynthèse de l’éthylène chez ‘Totem’ par l’intermédiaire des
souches EHA101 ou EHA105 portant des vecteurs avec les gènes nptII ou hpt,
qui induit une résistance à l'hygromicine B, et chez ‘Tristar’ par l’intermédiaire
des souches LBA4404 ou EHA101 portant des vecteurs binaires avec les gènes
nptII et uidA.
Récemment, El Mansouri [17] et Barceló et al. [4] ont décrit un protocole
de régénération du cultivar ‘Chandler’ à partir de disques foliaires et leur
transformation génétique par l’intermédiaire de la souche LBA4404
d’Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide non oncogène pAL4404
et le vecteur binaire pBI121 contenant le gène nptII de résistance à la
kanamycine et un gène chimérique.
62
Tableau V : Transformation génétique du Fraisier
Cultivar ou
génotype
transformé
explant
utilisé
Mode de transformation
/ souche
Références
‘Rapella’
Disque foliaire
Segment de
pétiole
Agrobacterium tumefaciens
souche : LBA4404 [29]
James et al., 1990
‘Redcoat’
Disque foliaire
Agrobacterium tumefaciens
souche : MP90 [43]
Nehra et al., 1990b
‘Tioga’, ‘Allstar’,
‘Tribute’,
‘Earlidawn’,
NJ8327-2,
NJ8343-6,
NJ8333-1
Disque foliaire
Segment
d'hypocotyle,
de pétiole ou
de stolon
Agrobacterium tumefaciens
souche : LBA4404
Jelenkovic et al.,
1991
Lignée 77101
Protoplaste
Électroporation
Nyman et Wallin,
1992b
‘Melody’,
‘Rhapsody’,
‘Symphony’
Segment de tige Agrobacterium tumefaciens
souche : LBA4404
Graham et al., 1995
‘Tristar’, ‘Totem’ Méristème
Disque foliaire
Segment de
pétiole
Agrobacterium tumefaciens Mathews et al.,
souches : LBA4404, EHA101 1995
ou EHA105
‘Chandler’
Disque foliaire
Agrobacterium tumefaciens
souche : LBA4404
El Mansouri, 1997
‘Chandler’
Disque foliaire
Agrobacterium tumefaciens
souche : LBA4404
Barceló et al., 1998
Comme alternative à la transformation indirecte par l’intermédiaire
d’Agrobacterium, Nyman et Wallin [77] ont fait appel à l'introduction de gènes
étrangers dans les protoplastes du Fraisier (lignée 77101) par électroporation.
Dans cette procédure, le vecteur pRT88HPT contenant les gènes hpt et GUS a
été utilisé. Ce dernier permet d'optimiser les paramètres d’électroporation pour
la distribution des gènes à l’intérieur des protoplastes. Les protoplastes
électroporisés sont sélectionnés en présence de 10 mg/l d’hygromycine B pour
obtenir des cals et par suite des plantes transformées.
63
Le développement des protocoles de transfert des gènes par l’intermédiaire
d’Agrobacterium et de l’électroporation a ouvert de nouveaux horizons pour
l’amélioration du Fraisier. Il est dorénavant possible de produire par
transformation génétique des variétés présentant des caractères d’intérêt
agronomique, tels la résistance aux herbicides, aux ravageurs (virus, insectes,
champignons, etc.) ou la tolérance aux stress environnementaux.
PRODUCTION DE PLANTES HAPLOÏDES
Les techniques de production de plantes haploïdes sont connues sous le
nom d’haplométhodes. Elles permettent tout particulièrementen amélioration des
plantes un gain du temps. Ainsi, la production de plantes homozygotes peut être
obtenue en un seul cycle de culture par culture in vitro (par culture d’anthères,
par exemple), alors que par sélection classique, il faut une période de 8 à 10
années. Guha et Maheshwari [25] ont reporté l’induction d’haploïdes par culture
d’anthères coupées de Datura innoxia. Depuis, la culture d’anthères a été
utilisée avec succès pour la production de plantes haploïdes [32].
Chez le Fraisier octoploïde (2n = 8x = 56), l’induction de plantes
polyhaploïdes in vitro à partir de la culture d’anthères de différents cultivars est
prometteuse et peut être un outil rapide et efficace pour l’amélioration de cette
plante. Ainsi, plusieurs auteurs [72,83,85;etc.] ont tenté de produire des
polyhaploïdes par culture d’anthères, mais il s’est avéré que les plantes obtenues
sont généralement octoploïdes et dans la plupart des cas les cals dont elles
dérivent sont issus plutôt des tissus somatiques des anthères que des
microspores. Pour remédier à ce problème, Svensson et Johansson [99] ont
étudié les facteurs environnementaux et la composition du milieu de culture qui
peuvent affecter les divisions des microspores et la production des cals ; sur un
total de 105 clones analysés, 92 ont été octoploïdes (8x), 2 heptaploïdes (7x),
7 hexadécaploïdes (16x) et 4 probablement mixoploïdes (4x-8x). Pour leur part,
Owen et Miller [79], ont pu obtenir des plantes polyhaploïdes à travers la culture
d’anthères chez trois cultivars de Fraisier (‘Chandler’, ‘Honeoye’ et ‘Redchief’)
lors d’une étude comparative de l’effet de différents milieux de culture sur la
fréquence de régénération des plantes.
Des alternatives sont la gynogénèse in vitro ou encore le croisement
interspécifique et la pollinisation par du pollen irradié, pouvant être associés à la
64
culture in vitro pour éviter un avortement précoce des embryons. Des essais
d'induction de parthénogénèse haploïde par du pollen irradié ont été entreprises
à l'INRA d'Avignon ; quelques polyhaploïdes ont été obtenus mais ils se
diploïdisent rapidement (Risser Georgette, comm. pers.).
Il est évident qu’il reste à faire des efforts pour pouvoir développer des
méthodes efficaces de production de plantes polyhaploïdes désirables pour les
programmes d’amélioration.
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ABSTRACT
In vitro regeneration of strawberry (Fragaria X ananassa
Duch.) II Possibilities offered by in vitro culture
The meristem and shoot culture has been applied with efficacy to
eliminate viruses and develop large scale production of strawberry plants
(Fragaria X ananassa Duch.) by micropropagation.
Processes of regeneration by direct or indirect organogenesis on various
explants have been settled for numerous cultivars around the world.
These processes can be potentially used for the improvement of this fruit
species by somaclonal variation and allow the selection of clones resisting
diseases, pests, frost or presenting desirable characters (quality of fruit, yield,
etc.).
Moreover, some cultivars have been genetically transformed through
Agrobacterium tumefaciens.
Key-words : cell suspension, Fragaria X ananassa, in vitro culture,
micropropagation, organogenesis, somaclonal variation,
strawberry, transformation.
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