Caractérisation de l`hétérogénéité phénotypique

Caractérisation de l’hétérogénéité phénotypique des populations microbiennes : vers de nouvelles
stratégies pour l’optimisation des bioprocédés
Jonathan Baert1, Anissa Delepierre1, Alison Brognaux1, Dominique Toye2, Frank Delvigne1
1
Gembloux Agro-Bio Tech, Université de Liège, 2 Passage des Déportés, 5030 Gembloux, Belgique.
Products Environment and Processes (PEPs), Departement of chemical Engineering, Université de Liège, Allée du
6 Août, 11 Sart Tilman, 4000 Liège, Belgique.
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Les biotechnologies industrielles couvrent une gamme très étendue de bioréactions permettant la
production d'une grande diversité de molécules d’intérêts. Bien que ces réactions soient maitrisées, une majorité
de ces applications requiert une étape importante d’optimisation afin d’assurer leurs rentabilités économiques
et leur compétitivité vis-à-vis de l’industrie chimique traditionnelle. Dans ce cadre, de nombreuses études ont
récemment mis en évidence l’existence d’une hétérogénéité phénotypique au sein des populations de clones
bactériens1. Cette variabilité phénotypique a été décrite comme étant la conséquence de la stochasticité au
niveau des réactions biochimiques. Celle-ci étant influencée par la proximité spatiale et l’abondance des
molécules intracellulaires impliquées dans ces réactions. Cette hétérogénéité s’amplifie dans des conditions de
cultures intensives mettant en œuvre de hautes densités cellulaires et des inhomogénéités extracellulaires liées
à la montée en échelle des procédés2. L’effet stressant de ces conditions sur le degré d’hétérogénéité des
populations microbiennes a largement été mis en évidence au niveau du phénotype, mais cette caractérisation
a rarement été menée de manière à établir les conséquences de cette hétérogénéité sur la performance des
bioprocédés.
Cette caractéristique intrinsèque des populations microbiennes doit donc être considérée afin de mettre
au point une stratégie d’optimisation rationnelle. Dans ce cadre, il est donc nécessaire de développer des outils
permettant d’analyser l’état métabolique d’une population. En effet, le métabolisme doit être perçu comme la
résultante fonctionnelle du phénotype et peut donc être mis en parallèle avec le niveau de performance d’une
application de manière plus rigoureuse.
Pour cette raison, nous avons (i) identifié le Redox Sensor Green (RSG) comme étant un marqueur
fluorescent externe corrélé au métabolisme bactérien et (ii) établi un protocole de marquage rapide compatible
avec une analyse par cytométrie en flux. Le RSG diffuse librement à travers la membrane des cellules procaryotes
et est alors converti en une espèce fluorescente par les réductases intracellulaires. En effet, la chaine de transport
d’électrons et l’état d’oxydoréduction gouverne l’état métabolique de la cellule. De plus, l’approche par
cytométrie en flux a démontré son potentiel pour caractériser les bioprocédés en donnant accès à une vision en
temps réel de l’hétérogénéité au sein d’une population microbienne.
En conclusion, le signal de fluorescence émis par le RSG est propositionnel à l’activité de la chaine de
transport d’électrons et son signal est intimement affecté par le flux de carbone à travers la cellule, la
disponibilité de l’accepteur final d’électrons et l’activation des voies métaboliques aérobies. Le RSG permet donc
de prendre en compte l’hétérogénéité de l’état métabolique au sein des populations microbiennes et peut donc
être à la base de stratégies d’optimisations rationnelles des bioprocédés. De plus, la simplicité d’analyse par
cytométrie en flux permet d’implémenter un suivi en ligne du procédé de manière à fournir en temps réel
l’évolution de l’état métabolique de la biomasse3. Ce suivi en ligne permettrait de mettre au point une stratégie
de régulation innovante basée sur les caractéristiques biologiques des microorganismes producteurs et révèle
donc des perspectives prometteuses dans le cadre de l’optimisation et du contrôle des bioprocédés industriels.
Références :
1. Baert J, et al.: Phenotypic variability in bioprocessing conditions can be tracked on the basis of on-line flow cytometry and
fits to a scaling law. Biotechnol J 2015, 10: 1316-1325.
2. Delvigne F, et al.: Metabolic variability in bioprocessing: implications of microbial phenotypic heterogeneity. Trends
Biotechnol 2014, 32: 608-616.
3. Brognaux A, et al.: A low-cost, multiplexable, automated flow cytometry procedure for the characterization of microbial
stress dynamics in bioreactors. Microb Cell Factories 2013, 12.