Formation microscope optique Nikon

Formation microscope optique Nikon
1) Positionnement de l’échantillon
a) Déplacer horizontalement la platine à l’aide des 2 vis en bas de la tige de droite pour
amener la platine centrée et vers l’avant
b) Déposer l’échantillon au centre de la platine, devant l’objectif le plus court (5X)
c) Déplacer à nouveau la platine pour centrer l’échantillon à observer, sous l’objectif 5X
2) Source lumineuse et ajustement de l’optique
a) Si l’échantillon est couvert de matériel photosensible aux rayons ultraviolets dont le
développement n’est pas nécessairement terminé, s’assurer d’abord que la tirette contenant le
filtre jaune (NCB11) est en place, c’est-à-dire tirée partiellement vers la droite jusqu’au déclic
b) Avec le potentiomètre de la source environ à la moitié de sa capacité, mettre sous tension la
source lumineuse en appuyant sur l’interrupteur vert situé sur le devant de la source
d’alimentation, à droite du microscope
c) Ajuster la distance inter-oculaire en pivotant les deux parties mobiles du support des
oculaires (10X par défaut, 15X disponible sur demande) afin que chacun de vos yeux puissent
visualiser une image circulaire complète que votre cerveau devrait superposer
d) Les 2 oculaires peuvent s’ajuster de façon indépendante pour s’ajuster à la vision en
pivotant leur partie supérieure
e) On peut d’abord replacer les oculaires à leur position normale en les pivotant pour que leur
point central ou leur «zéro» soit vis-à-vis leur curseur de référence
f) Effectuer ensuite la mise au point des oculaires (après une mise au foyer, vue à l’étape
suivante) pour obtenir une image nette pour chaque œil (en fermant l’autre, si nécessaire).
3) Mise au foyer et choix de l’objectif
a) Effectuer d’abord la mise au foyer avec l’objectif le plus court (5X) en déplaçant
verticalement la platine à l’aide des grosses vis concentriques à gauche à la base du
microscope
b) Toujours faire attention à ne pas fracasser la fragile optique de l’objectif avec
l’échantillon !
c) Le déplacement rapide se fait avec la plus grosse vis extérieure, tandis que le déplacement
fin ou micrométrique se fait avec la plus petite au bout. La vis plate du côté droit effectue
aussi le déplacement fin.
d) Pour les boutons de gauche, le sens de rotation antihoraire monte le plateau (rapproche
l’échantillon) et le sens horaire le descend (éloigne l’échantillon).
e) Pour assister la mise au foyer (par exemple, sur un échantillon sans contraste ou sans
géométrie), on peut utiliser le diaphragme de champ («Field Aperture»).
1. Fermer partiellement le diaphragme de champ et faire la mise au point sur les
contours du diaphragme réfléchis sur la surface de l’échantillon
2. D’un point lumineux flou, on ajuste la distance pour obtenir une image nette avec
les contours hexagonaux du diaphragme
3. Quand l’échantillon est au foyer on peut ouvrir ensuite le diaphragme
f) Lorsque la mise au point est adéquate avec l’objectif 5X, il est possible de passer à un
grossissement plus fort sans danger, en pivotant la tourelle par sa base pour passer au 10X.
Pour ne rien désajuster, NE PAS toucher aux objectifs, utiliser la base de la tourelle !
g) Faire la mise au point pour cet objectif et passer à un grossissement plus fort en augmentant
le calibre de l’objectif (ex : 10X->20X->50X)
h) Passer d’un objectif fort à un plus faible en passant par les objectifs de moindre calibre
(ex : 20X ->10X -> 5X)
i) Toujours remettre la tourelle avec l’objectif 5X en position avant de changer d’échantillon
ou avant de retirer celui-ci
4) Configuration de l’éclairage en mode «épiscopique»
a) La source de lumière blanche pour éclairage en mode «épiscopique», c’est-à-dire pour une
observation de la surface par le dessus, se situe à complètement à l’arrière du microscope, à
peu près à la hauteur des oculaires. L’intensité de l’éclairage de la lampe peut-être modifié par
le potentiomètre sur la source d’alimentation.
b) Le faisceau émis par la lampe peut d’abord être filtré par les filtres de couleur bleu (NCB?)
ou jaune (NCB11) ou sans filtre. L’une des 2 positions opposées de la tirette du fond permet
le choix d’un filtre de couleur tandis que la position centrale n’insère aucun filtre devant le
faisceau. Utiliser le filtre jaune pour couper les ultraviolets par précaution si on doit
développer la photorésine après l’observation au microscope.
c) La seconde tirette permet d’insérer des filtres neutres pour atténuer uniformément toutes les
longueurs d’ondes de la lumière visible. Le filtre (ND16) atténue plus la lumière que le filtre
(ND4). Encore une fois, la position centrale n’insère aucun filtre devant le faisceau.
d) À droite, un curseur identifié «Apert. Stop» ou diaphragme d’ouverture permet de doser la
lumière incidente, ce qui peut parfois aider à révéler certains détails, mais peut aussi
simplement servir à atténuer la lumière incidente. Remettre le curseur en position haute
(entièrement ouvert) après usage.
e) L’autre curseur «Field Stop» est le diaphragme de champ. Celui-ci a ses contours opaques
visibles par réflexion sur l’échantillon. Cette réduction du champ de vision peut aider, grâce à
un fort contraste de la zone sombre et de la zone éclairée, à la mise au foyer. Elle peut aussi
servir à minimiser la surface exposée ou simplement à centrer l’attention sur un détail de
l’image. Remettre le curseur en position haute (entièrement ouvert) après usage.
f) Les deux vis métalliques de part et d’autre du microscope servent au positionnement de
l’ouverture du diaphragme de champ dans le champ de vision observé. En général, on laisse
celui-ci au centre de l’image.
g) La tirette suivante est un polariseur (P) muni d’une roulette pour faire pivoter le polariseur
et ainsi changer l’angle de polarisation. En mode normal d’observation, la tirette est
partiellement retirée (jusqu’au déclic) et n’utilise pas le polariseur. Ce dernier est utilisé pour
le mode d’observation dit de contraste interférentiel ou mode Nomarski expliqué en section
suivante.
h) Le faisceau incident est ensuite dévié vers le bas dans la colonne. Ce faisceau est
normalement dirigé directement vers l’objectif en place et l’échantillon pour être en partie
réfléchi vers l’objectif puis jusqu’aux 2 oculaires pour parvenir à nos yeux.
i) Une tige identifiée LF/DF permet de changer du mode normal d’observation en champ clair
(LF) pour le mode DF ou à champ foncé en tirant la tige vers l’extérieur. Ceci élimine alors
les rayons incidents perpendiculaires à l’échantillon et produit un éclairage indicent dont la
réflexion qui peut parvenir aux oculaires doit nécessairement provenir de surfaces non
parallèles au plan de l’échantillon. Ainsi, on obtient une image sombre, avec les lignes ou
points lumineux près des topologies, particules et aspérités de la surface de l’échantillon. On
peut si nécessaire augmenter l’intensité de l’éclairage de la source lumineuse.
j) Dans la colonne, un prisme muni d’un réglage d’angle (prisme Nomarski) est normalement
partiellement retiré pour ne pas interférer le faisceau réfléchi. Il est cependant utilisé pour le
mode de contraste interférentiel (voir en section suivante).
k) Située dans la colonne juste au-dessus du prisme, la tirette identifiée (A) est un analyseur
consistant en fait en un polariseur à angle fixe, qui est utilisé conjointement avec le polariseur
(P) et le prisme Nomarski. En mode normal, la tirette est partiellement retirée jusqu’au déclic.
l) La colonne possède aussi une tige à trois positions soient Bino, Bino&Photo et Photo pour
sélectionner la ou les destinations du faisceau réfléchi. En pratique, le mode combiné
Bino&Photo est normalement sélectionné car il permet d’observer à la fois l’image dans les
oculaires et sur un écran grâce à la caméra devant le 3ème port de sortie appelé Photo. Comme
le faisceau est dans ce cas séparé en deux par un prisme, les images sont légèrement
atténuées. Dans des cas plus critiques, on peut choisir le mode Bino seulement ou encore
Photo seulement, afin de maximiser la clarté de l’image pour la destination choisie.
5) Mode de contraste interférentiel (mode Nomarski)
a) Ce mode est utilisé entre autre pour faire ressortir la présence de films résiduels, de
particules, d’aspérité ou de fines topologies sur la surface d’un échantillon. Il donne plus de
clarté que le mode à champ foncé, particulièrement pour la prise de photos, car le contraste est
beaucoup moins grand. De plus, certains ajustements sont possibles.
b) Avec l’échantillon en place, en mode à champ clair, avec l’objectif choisi, au foyer, dans la
zone à observer, pousser le polariseur P en place, ainsi que l’analyseur A vers la colonne.
c) Ajuster le polariseur P en tournant la roulette d’angle de polarisation pour avoir le plus
d’atténuation possible. En principe, un ou l’autre des 2 points sur la roulette sera situé vis-àvis ou tout près du curseur de référence.
d) Pousser ensuite délicatement le prisme Nomarski vers la colonne. La tige du bouton
métallique devrait normalement être situé sur la position A pour être adapté au type
d’objectifs actuellement en place.
e) Observer l’image obtenue et faite pivoter le prisme avec le bouton métallique dans un sens
ou dans l’autre jusqu'à l’obtention d’une image satisfaisante. Un effet de 3ème dimension est
relativement facile à obtenir. Le champ ou l’arrière plan peut prendre une coloration
différente selon les ajustements. On peut aussi modifier légèrement l’angle de polarisation si
cela aide à faire ressortit certains détails, ou encore changer divers ajustements de l’éclairage
vues à la section précédente.
6) Mesures de dimension avec réglette ou «reticule»
a) L’oculaire droit possède une petite règle linéaire avec graduations régulières pouvant être
utilisée pour mesurer les dimensions de structures observées, en fonction du grossissement
utilisé.
b) Si celle-ci n’est pas visible, il se peut que la mise au point de l’oculaire ne soit pas
appropriée ou encore que cet oculaire soit partiellement retiré de son réceptacle tubulaire.
Dans ce dernier cas, faite pivoter tout l’oculaire jusqu’à ce qu’il s’enclenche dans la cavité. Il
y a 3 positions possibles (donc à tous les 120 degrés d’angle). Choisir la position selon la
orientation voulue pour la réglette, c’est-à-dire à l’horizontale, ou à l’endroit (à l’envers) avec
un angle de plus (de moins) 30 degrés de la verticale.
c) Mesurer le nombre de graduations sur la réglette et transposer cette valeur en valeur de
dimension à l’aide du tableau disponible près du microscope (valide pour un oculaire de 10X).
d) Repérer dans la colonne de gauche le nombre de graduations. Sélectionner à droite la
colonne de l’objectif utilisé (5X, 10X, 20X, 50X ou 100X). Retrouver la valeur de dimension
en micromètres correspondant au nombre de graduations mesurées.
1. On remarque que le nombre de graduations avec l’objectif 100X est à peu près le même
que la dimension en microns.
2. De plus, pour un même nombre de graduations, cette dimension doublera si on passe à
l’objectif 50X, sera multipliée par 5 pour 20X, par 10 pour 10X et par 20 pour 5X.
7) Utilisation de la caméra et prise d’images numérisées
a) La caméra est utilisée pour faciliter le visionnement de l’image en cours sur le microscope
(par exemple, pour un visionnement par plus d’une personne à la fois) et pour la prise
d’images fixes pour analyse ou référence future.
b) Mettre la caméra sous tension en basculant vers la droite l’interrupteur à 3 positions sur le
dessus de la caméra. Cette caméra utilise le port IEEE-1394 ou «Fire Wire» pour se relier au
port équivalent de l’ordinateur.
c) Démarrer le logiciel ConstrucTiff permettant l’enregistrement d’informations
complémentaires dans un format standardisé et l’usage de métrologie sur l’image capturée.
d) Dans ConstrucTiff, choisir Fichier/Nouveau pour faire démarrer le logiciel QCapture. Ce
logiciel permet de visualiser en direct l’image vue par la caméra et d’effectuer des
ajustements («Camera Setting») et des prises d’image («Snap»).
e) Si la fenêtre n’est pas déjà affichée, cliquer dans QCapture sur l’icône de la clé mécanique
pour faire ouvrir la fenêtre «Camera Setting» ou encore choisir «Options» puis «Camera
Setting» au menu.
f) Cliquer sur «Auto Expose» dans «Camera Setting» pour régulariser l’amplification du
signal faite par la caméra afin d’obtenir à l’écran une image ni trop claire, ni trop foncée. Ceci
est à faire normalement au changement d’objectifs ou après tout ajustement de l’éclairage.
g) Cliquer sur l’icône de la caméra dans QCapture pour permettre la capture de l’image en
cours ou choisir «Acquire» puis «Snap» au menu.
h) Le logiciel ConstrucTiff requiert que les informations soient fournies telles que le nom de
l’usager, le projet, une description, l’objectif utilisé, etc. Pour inclure les informations à même
l’image, cochez «inclure l’entête». L’image sera enregistrée en cochant sur «Appliquer».
i) L’image capturée s’affiche dans une fenêtre à l’intérieur de la fenêtre principale de
ConstrucTiff. Il est possible de faire de la métrologie tel que des mesures de distance, de
périmètre et de surface à l’aide de curseurs ajoutés à l’image. Il est dans ce cas important que
les grossissements respectifs de l’oculaire et de l’objectif l’utilisés lors de la prise de l’image
aient été correctement spécifiés lors de la prise d’information. Cependant, il est possible de
calibrer manuellement la mesure de distance selon une dimension connue sur l’image.
j) Pour enregistrer une image modifiée (avec des cotes de dimensions par exemple), utiliser
Fichier/Sauvegarder dans ConstrucTiff. On peut aussi ouvrir des fichiers existants et faire la
métrologie sur ceux-ci.
8) Pour terminer
a) Avant de retirer l’échantillon, revenir aux ajustements de départ, c’est-à-dire à un objectif
5X, avec la platine centrée et placée vers l’avant.
b) Retirer l’échantillon, quitter le logiciel ConstrucTiff (et QCapture), fermer la caméra
(interrupteur basculé en position centrale) ainsi que la source d’alimentation de la lampe.
c) S’assurer de remettre le microscope dans son état initial, selon les ajustements par défaut.
1. Avec le filtre jaune en place (NCB11)
2. Sans atténuateur ou filtre neutre
3. Avec les curseurs des diaphragmes relevés
4. Avec le polariseur, l’analyseur et le prisme Nomarski partiellement retirés
5. Avec les tiges respectivement en mode combiné (Bino&Photo) et champ clair (LF)
6. Avec le potentiomètre de la source à un peu moins de la moitié de sa valeur
maximale d’intensité
Note : Une affiche recto verso, laissée près du microscope, décrit ses composantes, résume la procédure
d’utilisation et contient le tableau pour la conversion des unités de graduation de la réglette en micromètres.
Pierre L. Langlois, CRN2, Université de Sherbrooke, 4 mars 2005