Boudjema, Khaled

Transcription

Boudjema, Khaled

‫ﺍﻝﺠﻤﻬﻭﺭﻴﺔ ﺍﻝﺠﺯﺍﺌﺭﻴﺔ ﺍﻝﺩﻴﻤﻘﺭﺍﻁﻴﺔ ﺍﻝﺸﻌﺒﻴﺔ‬
République Algérienne Démocratique et Populaire
‫ﻭﺯﺍﺭﺓ ﺍﻝﺘﻌﻠﻴﻡ ﺍﻝﻌﺎﻝﻲ ﻭ ﺍﻝﺒﺤﺙ ﺍﻝﻌﻠﻤﻲ‬
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
‫
أ
ة – داس‬
Université M’Hamed Bougara – Boumerdès
Faculté des sciences
Département de Biologie
En vue de l’obtention du Diplôme de Magister en Biologie
Option : biochimie et microbiologie appliquées
Présenté et soutenu publiquement par
Mr Boudjema Khaled
L e 27/ 02/ 2008
Essai d'optimisation de la production
d’acide lactique sur lactosérum par
Streptococcus thermophilus
Devant la commission d’examen composée de :
Mr Louerguioui A …....Maître de conférence (UMBB)………….…….........Président
Mme Hellal A ………….Professeur (ENP)……………………………………Promotrice
Mme Fazouane F……….Maître de conférence (UMBB)……………………..Co-promotrice
M me Alouane R ………Maître assistante (UMBB)……………………….....Examinatrice
Mr Madani K. ……….Maître de conférence (Université de Béjaia)…........Examinateur
Mme Mechakra A……...Maître de conférence (Université de Constantine)..Examinatrice
Année universitaire 2007/2008
Remerciements :
Ce travail a été réalisé au laboratoire de biochimie et microbiologie appliquées
(UMBB) ainsi qu’au niveau de laboratoire de contrôle de qualité –Tipaza, sous la
direction de Madame Hellal A, professeur à l’Ecole National Polytechnique (ENP)
El Harrach. Je tiens à la remercier pour m’avoir proposé ce sujet, pour ces conseils et
son suivi durant la période de réalisation de ce travail avec toute la patience.
Mes vifs remerciements vont aussi :
A Madame Fazouane F, maître de conférences (UMBB), pour ces conseils et
son aide.
A Monsieur Louerguioui A, maître de conférence (UMBB), pour avoir bien
voulu nous faire l’honneur de présider ce mémoire.
A Madame Alouane R, maître assistante (UMBB), pour avoir accepté
d’examiner ce mémoire.
A Madame Mechakra A, maître de conférence (Université de Constantine),
pour avoir bien voulu nous faire l’honneur de participer au jury.
A Monsieur Madani K, maître de conférence (Université de Béjaia), pour avoir
accepté de participer au jury et contribuer à l’examination de ce travail.
Mes remerciements sont également adressés à tous ceux qui m’ont aidé de près ou
de loin.
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Abstract:
Streptococcus thermophilus S13 is themophilic and homolactic lactic acid bacteria
strain which produces only L(+) lactic acid .The aim of this study consists of the
optimization of physicochemical parameters (temperature and pH) , and also the
culture medium for producing lactic acid by this bacterium on deproteinized and
sterilized sweet cheese whey. The physicochemical analysis of cheese whey showed
that it presents a suitable quality. The temperature 42°C, pH = 6.42, adding about 1%
of yeast extract and 2% of lactose improved the cell growth and also the lactic acid
production where µm = 0.412 h-1 and vm =1.095g/l.h. This fermentation followed
Luediking and Piret model where it showed the light dissociation between growth and
lactic acid production.
Key words: Streptococcus thermophilus S13, optimization, lactic acid production
sweet cheese whey, model.
Résume:
Streptococcus thermophilus S13 est une souche de bactéries lactiques thermophiles et
homolactique qui produit uniquement l'acide L (+) lactique. L'objectif de cette étude
consiste en une optimisation des paramètres physicochimiques (température et pH)
ainsi que le milieu de culture pour produire l'acide lactique par cette bactérie sur
lactosérum doux déproteiné et stérilisé .Les analyses physicochimiques de lactosérum
ont montré que ce dernier présente une qualité adéquat. La température 42°C,
pH=6.42, l'adjonction de 1% d'extrait de levure et 2% de lactose ont amélioré la
croissance cellulaire ainsi que la production d'acide lactique où µm = 0.412 h-1 et vm
=1.095 g/l.h. Cette fermentation a suivi le modèle de Luediking et Piret où elle a mis
en évidence un léger découplage entre la croissance et la production d'acide lactique.
Mots clé: Streptococcus thermophilus S13, optimisation, production d'acide lactique.
Lactosérum doux, modèle.
Introduction…………………………………………………………………………...1
I - Synthèse bibliographique
Chapitre I: les bactéries lactiques.
1-Historique……………………………………………………………………….....3
2-Définition…………………………………………………………………………..3
3-Caractéristiques générales des bactéries lactiques………………………….……...3
4-Classification………………………………………………………………………4
5-Exigences nutritionnelles……………………………………….……………….....5
5.1- Exigence en acides aminés……………………………………………………...5
5.2- Exigence en vitamines…………………………………………………………..5
5.3- Exigence en bases azotées…………………………………................................5
5.4- Exigence en cations……………………………………………..........................5
6- Rôles des bactéries lactiques…………………………………….………………..6
6.1-Domaine alimentaire………………………………………………………….….6
6.2-Domaine de la santé……………………………………………………………..6
7- Streptocoques thermophilus………………………………………………………7
7.1- Caractéristiques de Streptococcus thermophilus..................................................7
7.2- Métabolisme de lactose chez Streptococcus thermophilus..................................8
Chapitre II: Lactosérum.
1-Définition et caractéristiques du lactosérum…………………………………..…11
2-Différents types de lactosérum…………………………………............................11
3-Composition de lactosérum…………………………………………………..…...11
4-Valorisation de lactosérum……………………………………..………………....13
4.1- Alimentation humaine………………………………………………….…..…..13
4.2- Alimentation animale…………………………….....………………………….13
4.3- Lactosérum substrat de fermentation………………………..............................13
Chapitre III: Acide lactique.
1- Historique………………………………………………………….……………14
2-Définition et caractéristiques…………………………………………….…..........14
3-Voies de synthèse de l'acide lactique………………………………………..........15
4-Application de l'acide lactique………………………………………….…….…..16
4.1-Industrie alimentaire…………………………………………….……………....16
4.2-Secteur pharmaceutique ou médical…………………………………………….16
4.3-Agriculture……………………………………………………..……………….16
4.4-Secteurs industriels divers………………………………………..…………….17
Chapitre IV: Fermentation lactique et production d'acide lactique.
1-Définition de la fermentation lactique…………………………………………....18
2-Différents types de fermentation lactique………………………………….……..18
3-Production d'acide lactique par fermentation lactique……………………..…......18
3.1- Cinétique de croissance bactérienne…………………………………..……….18
3.1. 1- Phase de latence…………………………………………………..………....19
3.1.2-Phase d'accélération……………………………………………………...…...19
3.1.3- Phase logarithmique (exponentielle)………………………………….….…..19
3.1.4- Phase de ralentissement……………………………………………………....19
3.1.5- Phase stationnaire………………………………………………………….....19
3.1.6- Phase de décroissance exponentielle ou de déclin………………….………..19
3.2- Paramètres de croissance……………………………………………..………..19
3.2.1- Temps de génération………………………………………………….….......19
3.2.2-Taux de croissance…………………………………………………….……...20
3.2.3-Rendement métabolique………………………………………………………20
3.3- Cinétique d'acidification……………………………………………………......21
3.4-Facteurs influençant les cinétiques de croissance et d'acidification…………….21
3.4.1- Taille de l'inoculum…………………………………………………………..21
3.4.2 - Température…………………………………………………………………22
3.4.3 - pH………………………………………………………………………..….22
3.4.4 - Aération et agitation…………………………………………………….…...22
3.4.5 - Concentration en substrat……………………………………………………23
3.4.6 - Substances antimicrobiennes…………………………………………….......23
3.5-Modélisation de la croissance et de la production d'acide lactique………….…23
3.5.1- Modélisation de la croissance microbienne…………………………………..24
3.5.2- Modélisation de la production d'acide lactique……………………….……...25
3.5.3-Modélisation de la cinétique de consommation de substrat……………..…...26
II-Partie expérimentale
II.1 - Matériels et méthodes:
1- Objectif du travail ………………………………………………………………28
2- Matériels utilisés et réactifs.………………………………………………..……28
3- Matériel biologique……………………………………………………….……..28
4- Préparation des tubes de conservation ………………………………….………28
5- Milieu de culture…………………………………………………………..…….28
6- Conduite de la culture……………………………………………………………29
6.1- Préparation de préculture……………………………………………….……..29
6.2- Culture ………………………………………………………………..……....29
7- Mesure de la densité optique et de poids sec………………………..……….....29
7.1- Mesure de densité optique…………………………………………………….29
7.2- Mesure du pois sec………………………………………………..…………..30
8- Détermination des paramètres de croissance et de production……………….....30
8.1- Vitesse de spécifique croissance ……………………………………………..30
8.2- Vitesse moyenne d'acidification……………………………………..…….…..30
9- Méthodes analytiques…………………………………………………………...31
9.1-Mesure de pH…………………………………………………………………..31
9.2- détermination de la matière sèche…………………………………….…….…31
9.3- Dosage des cendres………………………………………………..…….…....31
9.4- Détermination de chlorures……………………………………..………….....31
9.5- Dosage de matière grasse………………………………………….…………..32
9.6- Dosage de l'azote total………………………………………………………...32
9.7- Détermination de la teneur en protéines…………………………….………...33
9.8- Dosage de lactose par méthode de Bradford…………………………..……...33
9.9- Détermination de la teneur de l'acide lactique………….……………………..34
9.9.1- Principe……………………………………………….………………….....34
9.9.2 - Mode opératoire………………………………………………….….…......34
9.9.2.1 - Précipitation des substances gênant l'opération…………………………..34
9.9.2.2 - Réaction colorée……………………………………...…………………..34
9.9.2.3 -Courbe étalon…………………………………………...........................…34
9.9.2.4 - Expression des résultats………………………………………………….35
II.2 - Résultats et discussion :
1- Composition biochimique de lactosérum……………………………….……….36
2- Optimisation de la fermentation en batch………………………………………...37
2.1- Optimisation des paramètres physicochimiques……………………………......37
2.1.1- Effet de température……………………………………………………….…37
2.1.2- Effet de pH……………………………………………………………..…….41
2.2- Optimisation des paramètres liés au milieu de culture………………………....47
2.2.1-Effet de l'extrait de levure……………………………………………..…........47
2.2.2- Effet de la concentration de lactose…………………………………………..51
3- Production d’acide lactique dans les conditions optimales………………………56
4- Modélisation de la croissance et la production d’acide lactique…………………58
4.1- Modélisation de la croissance bactérienne……………………………………..58
4.2- Modélisation de la production d’acide lactique………………………………...60
4.3- Relation entre la croissance et la production d’acide lactique………………….61
Conclusion…………………………………………………………………………...65
Références bibliographiques………………………………………………………...67
Annexe.
Listes des figures:
Figure 1: Streptococcus thermophilus……………………………………………....7
Figure 2: transport et métabolismes du lactose, glucose et le galactose chez les
bactéries lactiques…………………………………...……………………………….10
Figure 3: les deux isomères de l'acide lactique……………………………………...14
Figure 4: les deux voies de production d'acide lactique…………………………….15
Figure 5: luttes contre les verroas…………………………………………..............16
Figure 7: les voies de fermentation lactique…………………………………...........18
Figure 8: Courbe de croissance d'une culture bactérienne en discontinue……..........19
Figure 9: Evolution du taux de croissance en fonction du temps…………………...20
Figure 10: Préparation des tubes de conservation…………………………...(annexe2)
Figure 11: Principe de Beer lambert…………………………………..…....( annexe2)
Figure 12: Courbe d'étalonnage de biomasse…………………………….…( annexe5)
Figure 13: Courbe d'étalonnage de l'acide lactique…………………………( annexe5)
Figure 14: Evolution de biomasse en fonction du temps à différentes températures et
à pH constant…………………………………………………………………………38
Figure 15: Evolution de pH en fonction du temps à différentes températures et à pH
constant………………………………………………………………………………38
Figure 16: Evolution de concentration d'acide lactique en fonction du temps à
différentes températures et à pH constant…………………………………………....38
Figure 17: Evolution de la concentration de
lactose en fonction du temps à
différentes températures…………………………………………………………..…38
Figure 18: Evolution de taux de croissance maximal en fonction de températur…...39
Figure 19: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction température...39
Figure 20: Evolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps
à
T=42°C et à pH constant……………………………………………………......41
Figure 21: Evolution de biomasse en fonction du temps à différents pH et à
T=42°C……………………………………………………………………………….43
Figure 22: Evolution de pH en fonction du temps à différents pH et à T= 42°C…...43
Figure 23: Evolution de la concentration l'acide lactique en fonction du temps à
différents pH et T=42°C……………………………………......................................43
Figure 24: Evolution de concentration de lactose en fonction du temps à différents
pH et à T=42°C............................................................................................................43
Figure 25: Evolution de taux de croissance maximal en fonction de pH…………...44
Figure 26: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction de pH……….44
à T=42°C et pH = 6,42…………………………………………………………….....46
Figure 28: Evolution de biomasse en fonction du temps à différentes concentrations
en extrait de levure et à T= 42°C………………………………………………...…..48
Figure 29: Evolution de pH en fonction du temps à différentes concentrations
d'extrait de levure et à T= 42°C………………………………………………….….48
Figure 30: Evolution de la concentration d'acide lactique en fonction du temps à
différentes concentrations d'extrait de levure et à T= 42°C………………………..48
Figure 31: Evolution de lactose en fonction du temps à différentes concentrations
d'extrait de levure et à T= 42°C………………………………………………..…..48
Figure 32: Evolution de taux de croissance maximal en fonction de concentration
d'extrait de levure………………………………………………………………..…..50
Figure 33: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction de concentration
d'extrait de levure……………………………………………………………………50
à T= 42°C et à EL = 1%.............................................................................................51
Figure 35: Evolution de biomasse en fonction du temps à différentes concentrations
de lactose et à T= 42°C…………………………………………………………….52
Figure 36: Evolution de pH en fonction du temps à différentes concentrations de
lactose et à T= 42°C…………………………………………………………..……53
Figure 37: Evolution de la teneur en acide lactique en fonction du temps à différentes
concentrations de lactose et à T= 42°C…………………………………………....52
Figure 38: Evolution de concentration de lactose en fonction du temps à différentes
concentrations de lactose et à T= 42°C…………………………………………….53
Figure 39: Evolution de taux de croissance maximal en fonction concentration de
lactose…………………………………………………………………………..….54
Figure 40: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction de concentration
de lactose………………………………………………………..………………….54
à T=42°C et à Lac = 2%...........................................................................................55
dans les conditions optimales T= 42°C, pH= 6.42, EL= 1%, lac= 2%.....................57
Figure 43: Ajustement de concentration de biomasse en fonction du temps..........58
Figure 44 : Ajustement de taux de croissance en fonction de concentration d'acide
lactique…………………………………………………………………………..…...60
Figure 45: Ajustement de concentration d'acide lactique en fonction du temps…….61
Figure 46: Evolution de vitesse spécifique de croissance et vitesse spécifique de
production en fonction du temps dans les conditions optimales: T= 42°C, pH= 6.42,
EL= 1% et lac= 2%.....................................................................................................62
Figure 47: Evolution de vitesse spécifique de production en fonction de vitesse
spécifique de croissance…………………………………………………………...…63
Liste des tableaux:
Tableau I: principales bactéries lactiques ……………………………………………4
Tableau II: les différents types de lactosérum……………………………………....12
Tableau III: teneur en vitamine dans le lactosérum………………………………....12
Tableau IV: températures optimales de Streptococcus thermophilus et leurs critères
d'adaptation…………………………………………………………………………...22
Tableau V : principaux modèles descriptifs appliqués à la croissance bactérienne…24
Tableau VI: la quantité de lactose hydraté, exprimée en mg en fonction du volume de
la solution de KMno4 (0,1 N)………………………… …………………....(annexe 6 )
Tableau VII: composition biochimique du lactosérum doux provenant de L'ORLAC
de Draa Ben Khedda……………………………………………………………….....36
TableauVIII: conditions opératoires concernant l'optimisation de température……37
Tableau IX: conditions opératoires concernant l'optimisation de pH………………42
Tableau X: composition de l'extrait de levure………………………………(annexe 7)
Tableau XI : conditions opératoires concernant l'optimisation de la concentration
d'extrait de levure………………………………………………………………….…47
Tableau XII: conditions opératoires concernant l'optimisation de la concentration de
lactose.. ……………………………………………………………………………....52
Tableau XIII: conditions optimales…………………………………………………56
Tableau XIV: les paramètres de croissance et de production d'acide lactique dans
les conditions optimales…………………………………………………..………….64
Liste des abréviations:
- t : temps
- DO : densité optique
- l : Litre
- Min : minute
- P : produit
- X: biomasse
- f: final
- i: initial
- MT: million tones
- Lac: concentration de lactose
- EL : concentration d’extrait de levure.
- µ : taux de croissance
- Vm : vitesse moyenne d’acidification
- qp : vitesse spécifique de production
- ATP: Adénosine Tris phosphate.
- µm : vitesse spécifique de croissance maximale.
- Yp/s : rendement de conversion du substrat en produit.
- Yx/s : rendement de conversion du substrat en biomasse.
- T: température.
- pH: potentiel d'hydrogène.
- α : coefficient lié à la croissance.
- β : coefficient de production lié au maintien.
- D°: degré dornic.
- Aw : activité de l'eau.
- ADP: Adenosine Di Phosphate.
- NAD: Nicotinamide Adenosine Diphosphate.
Introduction :
Le monde a connu un développement très important dans le secteur industriel
tandis qu'il y a toujours des risques et des conséquences néfastes sur l'environnement
et la santé publique. Pour cela, les écologistes et les biologistes se sont intéressés
depuis longtemps aux procédés et techniques qui servent à limiter la pollution
engendrée par les industries.
Parmi ces dernières, l'industrie laitière est une des plus polluantes par le rejet
de quantités importantes de lactosérum. Du fait de sa richesse en élément nutritif tels
que lactose, protéine solubles, vitamines hydrosolubles, matières grasses et les
éléments minéraux, le lactosérum constitue un excellent milieu de culture pour les
microorganismes, ce qui fait de lui un facteur de pollution redoutable (Agnes, 1986).
Il affecte les structures physiques et chimiques du sol, de même, il réduit la vie
aquatique en captant l'oxygène dissous (Panesar et al, 2007). En effet un litre de
lactosérum présente une demande biochimique en oxygène (DBO) élevée qui varie
entre 35 et 60 g/l (Goursaud, 1985).
Pour diminuer le risque polluant du lactosérum, ce dernier est utilisé dans
différents domaines tels que l'alimentation humaine, l'alimentation animale et
éventuellement dans le domaine de la biotechnologie afin de produire des protéines
d'organismes unicellulaires (P.O.U.), enzymes, vitamines, alcool, acides organiques
(acide citrique, acide lactique,…etc).
Beaucoup de chercheurs se sont intéressés à produire l'acide lactique à partir
de lactosérum en procédant à une fermentation lactique, car cet acide à une large
application dans plusieurs secteurs tels que: alimentaire, pharmaceutique, textile et
cosmétique. De même, la demande globale en acide lactique est estimée en 70,000
MT. Cette demande peut dépasser 200,000 MT en 2011 (Lin et al, 2006).
En Algérie, L'ORLAC de Draa Ben Khedda qui produit le camembert, déverse
quotidiennement dans les cours d'eau, en moyenne 11 m3 d'eau résiduaire dont la
grande partie représente le lactosérum.
1
Dans le but de la valorisation du lactosérum, nous nous sommes intéressés à
la production d’acide lactique par fermentation du lactose en utilisant une souche
bactérienne sélectionnée pour son pouvoir acidifiant. Notre étude a porté sur :
- Etude de la composition du lactosérum doux qui provient de l'ORLAC de Draa
Ben Khedda
- Optimisation des conditions physico-chimiques de l’activité de la bactérie utilisée
- Optimisation du lactosérum en tant que substrat de culture
- Optimiser les paramètres de croissance et d'acidification telles que la vitesse
spécifique de croissance (µ) et la vitesse moyenne d'acidification (vm).
- Production d'acide lactique dans les conditions optimales.
- Etablissement d’un modèle mathématique de fermentation.
2
1-Historique:
Les bactéries ont été utilisées pour la fermentation des aliments depuis plus de 4000
ans sans pour autant comprendre la base scientifique de leur utilisation, mais tout en
essayant de produire des aliments de meilleure conservation et de meilleure qualité
(Saloffe Coste, 1994). Ce n'est qu'à la fin du 19eme siècle, époque des grandes
découvertes de la microbiologie, que certains chercheurs ont pu isoler un streptocoque
(Poullain, 1994).
2- Définition:
Le groupe des bactéries lactiques, a été défini pour la 1ère fois par Orla-jensen (1919),
réunit plusieurs genres caractérisés par leurs capacités à fermenter les glucides en
produisant de l'acide lactique (Novel, 1993). Les bactéries lactiques sont des cellules
procaryotes, hétérotrophes et chimioorganotrophes (De Roissart, 1986).
3- Caractéristiques générales des bactéries lactiques:
Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif, immobiles, asporulées,
catalase et oxydase négatives, nitrate réductase négative, anaérobies ou aérotolérantes.
(Laurent et al, 1998).
- Les bactéries lactiques sont des cocci ou des bâtonnet (Bourgeois et Larpent, 1996).
- Elles ont des besoins complexes en facteurs de croissance: vitamine B, acide aminés,
peptides, bases puriques et pyrimidiques.
- Certaines bactéries lactiques ont été isolées de nombreux milieux naturels végétaux
et animaux tels que le lait cru, l'environnement, les cavités buccales et vaginales…
(Luquet, 1986).
- Elles produisent des quantités abondantes d'acide lactique par fermentation de
substances hydrocarbonées.
- Elles se caractérisent par un métabolisme exclusivement fermentaire qui les conduit
à produire a partir du glucose des quantités importantes d'acide lactique, accompagné
dans certains cas d'autres métabolites (éthanol, CO2, autres acides organiques).
- Elles ont une capacité de biosynthèse faible (Luquet, 1986).
3
4- Classification:
La taxonomie des bactéries y compris les bactéries lactiques évolue depuis la
première classification d'Orla-jensen (1919), qui a été basée sur la nature et le
pourcentage de l'acide lactique produit, la température de croissance et les exigences
azotés.
Selon Lenoir et al (1992), il existe deux grands groupes morphologiquement bien
distincts: les cocci et les bacilles.
L'application de l'hybridation des acides nucléiques et des techniques de séquençage
conduit à diviser les coques en 05 groupes:
Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus et Leuconostoc.
Le tableau I présente les principaux critères de différentiation entre les genres des
bactéries lactiques:
Tableau I : principales bactéries lactiques (Sutra et Federighi ., 1998).
Genre
Lactobacillus
Morphologie
Fermentation
bacilles
Température
Nombre
d'optimisation
d'espèces
homofermentaires ou Thermophiles ou
Groupe I:23
hétérofermentaires
Groupe I:16
mésophiles
Groupe I:22
Carnobacterium
bacilles
psychrotrophes
6
Lactobacoccus
coques
homofermentaires
mésophiles
5
Streptococcus
coques
homofermentaires
Thermophiles ou
mésophiles
19
Enterococcus
coques
homofermentaires
mésophiles
13
Vagococcus
Coques mobiles
homofermentaires
mésophiles
2
Pediococcus
Coques
en homofermentaires
mésophiles
7
en homofermentaires
mésophiles
1
tétrades
Tetragenococcus
Coques
tétrades
Leuconostoc
coques
mésophiles
11
Oenococcus
coques
mésophiles
1
Bifidobacterium
Forme
Acide
et mésophiles
25
irrégulière
lactique
acétique
4
5- Exigences nutritionnelles:
Les bactéries lactiques ont une faible aptitude biosynthétique et sont en principe
incapables d'assimiler directement les principaux précurseurs de leur environnement.
Elles sont considérées comme un groupe bactérien le plus exigeant du point de vue
nutritionnel, car elles requièrent non seulement des substrats complexes carbonés,
azotés, phosphatés et soufrés mais aussi des facteurs de croissance comme les
vitamines et les oligoéléments dont le rôle des cœnzymes est plus important (Lenoir et
al, 1992).
5.1- Exigences en acides aminés:
Les bactéries lactiques sont en principe incapables d'effectuer la synthèse des acides
aminés, et doivent par conséquent faire appel à des sources exogènes pour assurer leur
métabolisme (Luquet, 1986). Les exigences en acides aminés des Streptococcus sont
différentes de celles des lactobacilles, ils ont besoin d'acide glutamique, d'histidine, de
cystéine, de méthionine et aussi de valine, de leucine, de tryptophane ou de tyrosine.
Les lactobacilles ont besoin d'aspartate, d'histidine, de lysine, de leucine, de
méthionine et de valine (Lenoir et al, 1992).
5.2- Exigences en vitamines
Les bactéries lactiques sont incapables de synthétiser les vitamines qui jouent un rôle
irremplaçable de cœnzymes dans le métabolisme cellulaire.
Streptococcus thermophilus a une exigence absolue en acide pantothénique (B5) et en
riboflavine (B2) et à moindre degré en thiamine (B1), en nicotinamide ou en acide
nicotinique (B3) et en biotine (B8). La pyridoxine ou ses dérives (B6) stimulent
fortement sa croissance (Desmazeaud M., 1983).
5.3- Exigences en bases azotées:
Les bases puriques et pyrimidiques ne sont pas vraiment essentielles au métabolisme
des bactéries lactiques (Desmazeaud M., 1983).
5.4- Exigences en cations:
Boyaval et al (1988) ont montré le rôle précis des cations dans la résistance à
l'oxygène, dans les différentes réactions métaboliques et dans la nutrition des
bactéries lactiques. Amouzou et al (1985) ont montré le rôle de Mg2+ sur
5
Streptococcus thermophilus. La forme ionisée entraîne une activation de la
fermentation lactique par une meilleure utilisation des sucres.
6- Rôles des bactéries lactiques:
6.1-Domaine alimentaire :
6.1.1- Rôle sur la structure et la texture :
Dans les laits fermentés, l'acidification provoque la formation d'un callé plus ou moins
ferme selon les bactéries lactiques présentes. Selon les produits, la texture recherchées
est
ferme (yaourt ferme) ou onctueuse (yaourt brassé, kéfir).Pour obtenir une
consistance déterminée, l'utilisation de souches plus ou moins acidifiantes peut être
combinée à celle de souches productrices de polysaccharides (Sutra et Federighi .,
1998).
6.1.2-Rôles dans la conservation :
- Production d'acide lactique : les bactéries lactiques ont un rôle important dans
l'inhibition des flores non lactiques.
- Production de bactériocines : ces peptides antimicrobiens sont synthétisés par un
très grand nombre de souches de bactéries lactiques .Ils
sont généralement
thermorésistants, actifs uniquement sur les bactéries à Gram positif (Laurent et al.,
1998).
6.1.3- Rôles sur les caractéristiques organoleptiques : par production en dehors de
l'acide lactique, d'autres produits tels que le diacétyle et l'acétaldéhyde, qui sont
responsables des flaveurs caractéristiques (Sutra et Federighi ., 1998).
6.2-Domaine de la santé : Les bactéries lactiques assurent :
- L'amélioration de la digestibilité du lactose;
- L'abaissement du taux de cholestérol sanguin;
- Des effets sur l'activation du système immunitaire;
6
- L'inactivation de composés toxiques et la protection contre certaines infections
intestinales (Laurent et al., 1998).
7- Streptococcus thermophilus :
Selon Bergey (2004), le genre Streptococcus est classé en (06) catégories:
-
Streptocoques pyogènes;
-
Streptocoques oraux;
-
Streptocoques fécaux;
-
Les Streptocoques lactiques ou lactocoques du groupe sérologique N,
faiblement hémolytiques, mais jamais pathogènes;
-
Les Streptocoques anaérobies stricts;
-
Les autres Streptocoques de groupe sérologique inconnu, hétérogènes
faiblement ou non hémolytiques, parmi les quels on trouve l'espèce non
pathogène Streptococcus thermophilus.
7.1- Caractéristiques de Streptococcus thermophilus:
Streptococcus thermophilus se présente sous forme de cellules sphériques ovoïdes
(0,7 à 0,9 nm de diamètre) en paires, en chaînettes ou en longue chaîne (Terre, 1986)
(figure 1).
Figure 1 : Streptococcus thermophilus
- C'est l'une des espèces les plus thermorésistantes car elle survie à un chauffage de
65°C pendant 30 min (Larpent, 1991).
- Elle est halotolérante (2-4%) de NaCl et fermentaire en produisant exclusivement de
l'acide lactique. Elle dégrade le lactose et le saccharose mais attaque aussi le fructose
et le glucose (Torriani et al, 1997).
7
- Cette espèce est capable de synthétiser les exopolysaccharides (EPS) soit en
monoculture, soit en association avec la souche Lactobacillus bulgaricus (Novel,
1993).
- Elle possède une β galactosidase active en présence de cations monovalents ou
divalents Mg2+, Mn2+ (Desmazeaud, 1990).
- Elle se trouve dans le lait et produits laitiers.
- Absence d'antigène de groupe qui caractérise également cette espèce (Accolas et al,
1980).
- Elle contient environ 40% de G+C dans son ADN (Terre, 1986).
- Elle a une température de croissance de 37°C à 45°C et non pas à 10°C (Accolas et
al, 1980).
7.2- Métabolisme de lactose chez Streptococcus thermophilus:
Le lactose est le sucre fermentescible du lactosérum, il sera tout d'abord hydrolysé en
galactose et en glucose, ensuite converti en acide lactique (Beal et Sodini, 2003).
L'entrée du lactose dans la cellule est réalisée grâce à l'activité d'une enzyme
membranaire : Lactose perméase-dépendante. Le lactose est hydrolysé en glucose et
galactose sous l'action d'une enzyme β galactosidase ou phospho- β galactosidase. Le
glucose rejoint alors la voie glycolytique d’Embden Meyerhof Parnas (EMP) pour
former le pyruvate (figure 2).
Le galactose se transport chez les bactéries lactiques homofermentaires par plusieurs
mécanismes, deux de ces voies nécessitent une translocalisation phosphorylante du
sucre par l'intermédiaire des systèmes lactose ou galactose –PT, puis une dégradation
du galactose 6 phosphate intracellulaire par la voie D tagatose - 6 phosphate. Le
galactose peut être transporté de façon active sous forme de sucre libre, par
l'intermédiaire d'un système perméase au dépend de l'énergie délivrée par l'ATP
(figure2) (Desmazeaud, 1983).
8
Les études de Thompson et Centy-Wees (1994) sur les mécanismes de transport de
glucides par Streptococcus thermophilus, ont montré qu’elle croit faiblement sur le
galactose. Pour cela, il semble que le phénotype galactose (-) pourrait être du à une
incapacité de ces bactéries à assurer le transport de sucre.
9
Figure 2: Transport et métabolisme du lactose, glucose et galactose chez les
bactéries lactiques thermophiles (Desmazeaud, 1983).
10
1- Définition et caractéristiques du lactosérum :
Le lactosérum est un sous produit de la fromagerie et de la caséinerie, c'est un
liquide surnageant jaune verdâtre, son pH compris entre 5 et 6,5. Il représente près de
90% du lait mis en œuvre. (Kosikowski, 1979 ; Mereo, 1980).
2- Différents types de lactosérum:
Selon le type de fromage ou de caséine produit et donc la coagulation
employée acide, présure ou mixte, on distingue deux types de lactosérum (Boudier et
Luquet, 1980):
• Le lactosérum obtenu par coagulation du lait par la présure, et provenant de
la fabrication des fromages à pâtes molles et à pâtes pressées (l'acidité est
inférieure à 18°D), est appelé lactosérum doux.
• Le lactosérum obtenu par coagulation lactique et provenant soit de la
fabrication des fromages de type pâtes fraîches et pâtes molles ou de la
fabrication de caséines lactiques et acides (l'acidité est supérieure à 18°D),
est appelé lactosérum acide.
3- Composition de lactosérum:
La composition moyenne de différents types de lactosérum est indiquée par le
tableau II.
11
Tableau II: composition de différents types de lactosérum (Sottiez, 1990)
Lactosérum doux
Pâte
Pâte pressée
pressée
non cuite
cuite
(Edam)
Lactosérum acide
Lactosérum
déprotéiné
camembert
Pâte fraîche
perméat
Caséine
doux
(Emmenta
d'ultrafiltrati
l)
on
Liquide (%)
93,5
95
93,5
94
94
-
extrait sec en %
6,5
5,00
6,50
6,00
6,00
4,50
pH
6,70
6,50
6,10
6,00
4,60
6,40
Lactose
76,00
75,00
75,00
65,5
74,00
85,00
Protéines
13,50
13,50
12,00
12,00
12,00
4,00
Cendres
8,00
8,00
8,25
9,00
12,00
9,00
Acide lactique
1,80
2,80
2,20
10,00
1,80
2,00
Matière grasse
1,00
1,00
1,00
0,50
0,50
0,00
Ca en %
0,60
0,65
0,70
1,90
1,80
0,60
P en %
0,60
0,65
0,70
1,50
1,50
0,60
Chlorure (NaCl)
2,50
2,50
2,50
2,50
7,50
2,80
Composition en
g/l
Matière minérale
Dans cette composition sont retrouvées les vitamines qui sont des vitamines
hydrosolubles, parmi eux, on note des quantités importantes de riboflavine (B2) ce qui
donne la couleur jaune verdâtre du lactosérum; d'acide pantothénique (B5); thiamine
(B1); de pyridoxine (B6) et l'acide ascorbique (Woo, 2002).
Le tableau ci-dessous donne la teneur en vitamines dans le lactosérum.
Tableau III : teneur en vitamines dans le lactosérum (Linden et Lorient, 1994)
vitamines
Concentration (mg/ml)
- Thiamine
0,38
- Riboflavine
1,20
- Acide nicotinique
0,85
- Acide pantothénique
3,4
- Pyridoxine
0,42
- Cobalamine
0,03
- Acide ascorbique
2,2
12
4-Valorisation de lactosérum :
Le lactosérum a plusieurs utilisations :
•
4.1-Alimentation humaine:
Il trouve son emploi dans les produits de confiserie (Boudier et Luquet, 1980) et la
poudre constitue une matière première pour l'industrie alimentaire (Delagueriviere,
1981).
•
4.2-Alimentation animale:
Elle constitue le principal débouché du lactosérum, il est destiné à l'élevage industriel
des porcs ou bien incorporé dans la ration des vaches laitières .Il peut également être
incorporé aux aliments d'allaitement pour veaux.(Agnes,1986)
•
4.3-Lactosérum substrat de fermentation:
Le lactosérum pourrait être un substrat de fermentation pour de nombreuses espèces
microbiennes. Selon Botofonja (1994), la croissance de certaines souches telles que
Streptococcus lactis serrait bonne sur lactosérum seul du fait de la richesse de celui-ci
en lactose.
Le lactosérum est un bon milieu de culture permettant le développement des levures
qui utilisent le lactose comme source de carbone (Omar et Sabry .,1991).
Une étude menée par Bergmaier (2002) sur la production d'exopolysaccharides par
fermentation avec des cellules immobilisées de Lactobacillus rhamnosus RW 9595M
a été menée sur un milieu à base de perméat de lactosérum.
Selon Poget-Ramseier (1993), le lactosérum est un bon milieu culture
pour la
production d'acide lactique à l'aide des bactéries lactiques.
La composition de lactosérum et sa déficience en facteurs de croissance et en certains
composés, fait que plusieurs chercheurs ont tenté de l'enrichir par l'addition de
certains facteurs stimulant la croissance tels que l'extrait de levure, le bicarbonates de
sodium, le Tween 80…etc (Yang et Silva, 1995).
13
1- Historique:
L'acide lactique est utilisé depuis longtemps dans la conservation des aliments, il est
découvert pour la première fois dans le lait fermenté par Scheele en 1780 et il est
considéré au début comme un composant exclusif du lait.
Pasteur en 1857 a découvert que celui-ci n'est pas uniquement un composant du lait
mais un métabolite fermentaire produit par certains micro-organismes (Hofvendahl et
Haln-Hagerdal, 2000).
2- Définition et caractéristiques:
L'acide lactique ou acide α hydroxy propionique, se présente sous deux formes
optiquement actives dues à la présence d'un carbone asymétrique situé en α de la
fonction acide. La configuration L (+) est lévogyre et la configuration D (-) est
dextrogyre (figure 3).
COOH
H
C
COOH
OH
HO
CH3
C
H
CH3
Acide D lactique
Acide L lactique
Figure 3: les deux isomères de l'acide lactique (Jarry 1994).
- L'acide lactique est classé comme à GRAS (Generally recognized as safe) donc il
est utilisé comme un additif alimentaire par FDA (food and Drug Administration)
(Narayanan et al, 2004).
- L'isomère acide L lactique est préféré dans les produits alimentaires, dû à la
présence de L lactate déshydrogénase dans l'être humain (Naveena et al, 2004).
- L'isomère acide D lactique est parfois dangereux au métabolisme humain et peut
causer un acidose et décalcification (Zhang et al, 2007).
- Streptococcus thermophilus est homofermentaire, produit uniquement l'acide L
lactique (Panesar et al, 2007).
14
3-Voies de synthèse de l'acide lactique:
L'acide lactique peut être produit soit par fermentation microbienne soit par synthèse
chimique
- Synthèse chimique :
L'addition de cyanure d'hydrogène et de catalyseur au acétaldéhyde conduit à la
formation de lactonitrile .Ce dernier est hydrolysé par l'acide sulfurique pour donner
acide DL lactique.
- Fermentation microbienne:
A l'aide d'un agent microbien, une source carbonée est transformée pour donner acide
lactique .Après extraction et purification de métabolite formé, on obtient l'acide L
lactique, Acide D lactique et acide DL lactique (figure 4).
Source pétrochimique
Source biologique
Acétaldéhyde (CH3CHO)
carbohydrates fermentiscibles
Addition de HCN
et
Fermentation
Catalyseur
microbienne
Lactonitrile (CH3CHOHCN)
Jus de fermentation
Hydrolyse par H2SO4
Extraction et
Purification
Uniquement acide DL lactique
Acide L lactique,
Acide D lactique ou isomère
Racémique acide DL lactique
Synthèse chimique
Fermentation microbienne
Figure 4: les deux voies de production d'acide lactique (Narayanan et al, 2004).
La synthèse chimique d'acide lactique est moins utilisée à cause de ses effets
néfastes sur l'environnement, et même que la demande de source chimique est très
limitée (Narayanan et al, 2004).
15
4- Application de l'acide lactique:
4.1- Industrie alimentaire:
Il est utilisé comme conservateur E270 ou comme acidulant, seul ou en combinaison
avec d'autres acides. Il intervient dans presque tous les aliments et boissons grâce à
son léger goût acide qui ne masque pas les flaveurs naturelles aromatiques.
Acide lactique et ses sels sont reconnus comme additifs alimentaires dans de
nombreux produits comestibles tels que: bonbons, saumures, choucroutes, boissons
non alcoolisées, eaux minérales, jus de fruit…etc. Exemple:
•
En fromagerie : il est utilisé pour régler le pH du lait avant l'emprésurage.
•
En boulangerie: il est utilisé comme émulsifiant sous la forme de
stéaroyllactoyllactate de sodium (Jarry, 1994)
4.2- Secteur pharmaceutique ou médical:
Le lactate de calcium possède une action thérapeutique, tandis que les sels de métaux
lourds servent d'opacifiant en imagerie médicale.
Sous forme de polymères ou copolymère lactiques- glycoliques, il est utilisé pour la
libération contrôlée des médicaments dans des fibres creuses, elle-même
biodégradables. Cet aspect avantageux est encore mis à profit dans des implants
chirurgicaux ou des fils de suture (Jarry, 1994).
4.3- Agriculture:
L'agriculture en consomme dans le traitement antibrunissement
des fruits, dans
l'acidification des fourrages ensilés et comme intermédiaire dans la préparation des
produits phytosanitaires optiquement actifs (Jarry, 1994).
Exemple ; l'acide lactique est un produit très efficace pour lutter contre les varroas
pour le petit apiculteur (Schultermandl et Imdorf, 2002) (figure 5)
Figure 5 : lutte contre les varroas
16
4.4- Secteurs industriels divers: (textile, tannerie et l'œnologie):
Ces industries l'utilisent soit comme agent de mordançage, soit dans le
déchaulage des peaux. Les polymères de l'acide lactique sont thermoplastiques et
résistants, facile à façonner et biodégradables donnant des produits naturels et sans
danger (Jarry, 1994).
17
1-Définition de la fermentation lactique:
La fermentation lactique correspond à la transformation du lactose du lait en
acide lactique, sous l'action des microorganismes spécifiques appelés bactéries
lactiques. Elle s'accompagne des modifications biochimiques, physico-chimiques et
organoleptiques du produit (Beal et Sodini, 2003).
C12H22O11 +
Lactose
H2O
4 CH3-CHOH-COOH
Acide lactique
2- Différents types de fermentation lactique:
D'après Guiraud (1998), la fermentation lactique présente deux voies:
-Voie homolactique: elle permet de produire exclusivement l'acide lactique à partir
des glucides.
-Voie hétérolactique: en plus de l'acide lactique, cette voie permet de produire l'acide
acétique, éthanol et dioxyde de carbone (figure 7).
La fermentation lactique
Hétérolactique
Homolactique
Production d'acide lactique
à 85 %
Production d'acide lactique,
acide acétique, éthanol et CO2
Figure 7: les voies de fermentation lactique.
3- Production d'acide lactique par fermentation lactique:
3.1- Cinétique de croissance bactérienne:
En milieu liquide, la plus part des bactéries y compris Streptococcus
thermophilus ont une croissance homogène dans le bouillon de culture. On peut de
façon simple mesurer le nombre des cellules vivantes ou la concentration cellulaire
totale, ceci permet de décrire la courbe de croissance des bactéries qui comporte six
(06) phases successives (figure 8).
18
Figure 8: Courbe de croissance d'une culture bactérienne en discontinue
(Sechet, 2000).
3.1.1 - Phase de latence: la vitesse spécifique de croissance est nulle. Il y a
adaptation des cellules au milieu avec synthèse d'enzymes (Meyer, 1999).
3.1.2 - Phase d'accélération: pendant cette phase, on remarque un démarrage de
la croissance proprement dite: la reproduction cellulaire commence.
3.1.3 - Phase logarithmique ou exponentielle: phase ou toutes les cellules se
trouvent dans leur état physiologique maximal et peuvent se multiplier sans
entraves. La vitesse de reproduction atteint son maximum et reste constant
pendant toute cette phase. (Sechet, 2000).
3.1.4 - Phase de ralentissement: dans cette phase, on remarque un épuisement du
milieu de culture suite à la disparition d'un ou plusieurs composés nécessaire à la
croissance bactérienne tels que (C, N, P,…etc). Le taux de croissance va diminuer
progressivement pour s'annuler à la fin.
3.1.5 - Phase stationnaire: le nombre de bactéries vivantes reste constant, les
cellules conservent une activité métabolique, leur structure biochimique subit des
modifications (Meyer, 1999).
3.1.6 - Phase de décroissance exponentielle (déclin): la biomasse dans la phase
d'autolyse (Sechet, 2000).
3.2- paramètres de croissance:
3.2.1- Temps de génération G:
G= t/ n
Où
n: nombre de division.
t: temps.
19
3.2.2- Taux de croissance (µ):
Chaque cellule microbienne donne après multiplication deux cellules identiques.
Après n génération, le nombre initial de cellule x0 pour t0, devient au temps t, x
x =
x =
x 2
x 2
n
0
ut
0
ln x = ln x 0 + µt . ln 2
Où
ln x − ln x 0 = µt . ln 2
µ =
:
ln x − ln x 0
t . ln 2
- Selon l'équation
x0: nombre de cellules à t0
X: nombre de cellules à t
µ: taux de croissance (h-1)
lnx = ut⋅ ln2 + lnx0 , on peut déduire graphiquement le taux de
croissance des cellules pendant la phase exponentielle en traçant
on fait sortir la valeur de
µ=
lnx = f (t)
puis
la. pente.de.la.droite
ln 2
(Scriban, 1999).
La figure 9 nous présente le µ de différentes phases de croissance.
Figure 9 : Evolution du taux de croissance en fonction du temps
(Sechet, 2000).
3.2.3- Rendement métabolique:
La consommation de substrat, provoquée par des milliers de réactions élémentaires du
métabolisme, peut être subdivisée en trois (3) grandes fractions (Monod, 1942) :
20
-
La fraction qui apporte l'énergie nécessaire aux synthèses;
-
La fraction qui apporte l'énergie nécessaire à l'entretien de la vie cellulaire.
En effet, les fractions (1) et (2) représentent la part de substrat utilisée pour la
croissance, fraction (3) représente le ratio nécessaire au maintien des cellules en vie
(maintenance).
Yx/s =
∆ ⋅ Biomasse ⋅ formée
∆ ⋅ substrat ⋅ carboné ⋅ consommé
Yx/s: Rendement métabolique de bioconversion du substrat (Y) en biomasse.
YP/s =
∆ ⋅ produit ⋅ formé
∆ ⋅ substrat ⋅ carboné ⋅ consommé
YP/s: Rendement de conversion du substrat (Y) en produit (métabolites).
3.3- Cinétique d'acidification:
La production d'acide lactique est généralement modélisée par la relation de
Luedeking et Piret (1959a), qui traduit un phénomène de découplage partiel entre la
croissance et la production.
dp
dx
= α
+ β ⋅x
dt
dt
Cette relation exprime la vitesse de production d'acide lactique
(dP/dt en g.l-1.h-1) en fonction de la vitesse de croissance (dX/dt en g.l-1.h-1) et de la
concentration bactérienne (X, en g.l-1). Les deux paramètre α et β dépendent de la
souche et des conditions environnementales dans les quelles est cultivée.
3.4- Facteurs influençant les cinétiques de croissance et d'acidification:
Les cinétiques de croissance et d'acidification des cultures pures de Streptococcus
thermophilus sont affectées par les facteurs suivants:
3.4.1-Taille de l'inoculum:
Les résultats de Reddy et al (1976), de Vahvaslka et Linko (1987) et Amrane (1991)
montrent que la phase de latence diminue quand la taille de l'inoculum augmente.
Belhocine (1987) a constaté que les performances de la fermentation s'améliorent
lorsqu'on multiplie les repiquages.
21
3.4.2-Température:
La température exerce une influence déterminante sur l'ensemble de l'activité
cellulaire microbienne. Plusieurs études ont précisé les températures optimales de
croissance ou d'acidification de Streptococcus thermophilus en culture pure (tableau
IV).
Tableau IV : températures optimales de Streptococcus thermophilus et leurs
critères d'adaptation
Températures optimales
Critères d'adaptation
Références
42°C à 45°C
Niveau d'acidification
Accolas et al (1977)
40,5°C
Taux de croissance,
Tayeb et al (1984)
biomasse finale
35°C à 45°C
Taux de croissance
Radke et Sandine (1986)
40°C à 45°C
Biomasse finale
Amorozo et al (1989)
42°C
Acidité titrable
Robinson (1988)
40°C
Biomasse finale
Beal et Corrieu (1991)
3.4.3-pH:
Selon Amrane et Prigent (1998), la diminution du pH, lors de la culture libre se
combine à l'accumulation de l'acide lactique et conduit à une forte inhibition de la
croissance et du métabolisme bactérien.
Mc Bean et al (1979), Tayeb et al (1984) et Beal et Corrieu(1991) préconisent des pH
compris entre 6 et 6,5 pour Streptococcus thermophilus.
3.4.4-Aération et agitation:
3.4.4.1-Aération:
Streptococcus thermophilus est une bactérie anaérobie aérotolérante, cultivée en
anaérobiose partielle. Elle est plus résistante à l'oxygène par rapport aux autres
bactéries lactiques et elle ne produira que de petite quantité d' H2O2 (Juillard, 1987).
3.4.4.2-Agitation:
L'agitation est un facteur complémentaire pour le transfèrt d'oxygène mais également
pour les autres éléments du milieu.
Les bactéries lactiques sont des organismes microaerophiles, donc tout facteur
diminuant la quantité d'O2 dissous dans le milieu de culture stimule leur croissance et
22
favorise la production d'acide lactique (Juillard, 1987). De même Boubechiche (1999)
a montré que l'agitation a un effet négatif sur la production d'acide lactique chez
Streptococcus thermophilus.
3.4.5- Concentration en substrat:
Amrane et Prigent (1999) montrent que les vitesses et les rendements de fermentation
sont améliorés lorsque le milieu de culture est complété avec des composés facilement
assimilables.
Monod a proposé une relation qui exprime µ en fonction de S par analogie, de
l'équation établie par Michaelis pour les enzymes :
µ = µm
S
Ks + S
Dans cette équation, Ks est la concentration pour laquelle le taux de croissance prend
la moitié de sa valeur maximale (Scriban, 1999).
3.4.6-Substances antimicrobiennes:
Certains produits chimiques modifient la croissance des bactéries en la ralentissant, ce
sont des inhibiteurs spécifiques, essentiellement liés à la production d'acide lactique,
qui est la cause la plus importante de l'inhibition des activités métaboliques (Beal et
al, 1989).
3.5- Modélisation de la croissance et de la production d'acide lactique:
La croissance microbienne est un phénomène globalement très complexe, par le
nombre et le type des réactions mises en jeu au cours de son déroulement et par leur
dépendance vis-à-vis des facteurs extérieurs pouvant d'ailleurs exercer des influences
susceptibles d'interaction.
L'application des méthodes mathématiques et statistiques à l'étude de croissance
bactérienne
et
production
de
métabolites,
a
permis
de
faire
progresser
considérablement la connaissance de ces phénomènes et de ce fait de mieux les
maîtriser et les exploiter (Scriban, 1999).
Exemple : le tableau V donne les principaux modèles descriptifs appliqués à la
croissance bactérienne.
23
Tableau V : principaux modèles descriptifs appliqués à la croissance
bactérienne.(De Roissart et Luquet.1994)
Modèles
Equation
Références
Gompertz
y = a. exp(−(b − c.t ))
Bratchell et al., (1989)
Logistique
y = a / 1 + exp(b − c.t )
Berkman et al .,(1990)
Y =[ a (1+b.e c.(d-1)]-1/b
Richards
Schnute
Richards (1991)
Y= k.(1-b/a).[1-b e
(c+1-b-at) ( 1/b)/1-b
Zwietering
]
et
al.,
(1990)
2
Spline
Y= a0 + a1. (t-t0) + a2. (t-t1) +….an. (t-ti) n
Oner
et
Erickson
(1986)
Y=a.[1+e-(b+kt)/c]-c
Standard
Stannard et al., (1985)
y = a{1 − exp[− b. exp(c. ln t ]
Weibull
}
Beal (1991)
3.5.1- Modélisation de la croissance microbienne:
Le modèle le plus simple exprime que la vitesse de croissance est proportionnelle à la
quantité de biomasse présente dans la culture est
dx
dt
Où
= µx
(1)
µ: la vitesse spécifique de croissance
X: la concentration cellulaire.
Intégrer entre t0 et t1, en prenant u constant et égal à µ m : on trouve
X= X0 e(µm(t-t0))
(2)
Cette relation correspond à la phase logarithmique de croissance. Si en absence
d'inhibition par un métabolite, l'un des nutriments commence à faire défaut (substrat
limitant), en accord avec Monod (1942), on peut alors décrire la croissance
bactérienne
µ = µm
par
S
S + Ks
la
relation
(1)
dans
laquelle
µ
prend
la
valeur:
(3)
Où S et Ks sont respectivement la concentration et la constante du substrat limitant.
Le système formé par la relation (1) et (3) a été intégré par Pirt (1975) sous la forme
suivante, lorsque µ m, Ks et Yx s sont constants:

Ks ⋅ Yxs
µ m ⋅ t =  1 +
Xf

 X
Ks ⋅ Yxs
Xf − X 0
 ln
+
⋅ ln
Xf
Xf − X
 X0
24
(4)
Dans cette relation Xf est la concentration finale en biomasse et Yxs est le rendement
de transformation de substrat S en biomasse X.
Si l'inhibition de croissance est due à l'accumulation de produit formé et si ce dernier
est considéré non compétitive, la relation (3) devient alors:
µ = µm ⋅
S
Kp
⋅
S + Ks P + Kp
(5)
Où P et Kp sont respectivement la concentration du métabolite inhibiteur et la
constante d'inhibition.
L'intégration du système formé par les relations (1) et (5) a été réalisée par Powell
(1984) pour µ m. ks. Kp et Yxs constants dans le cas d'une production associée à la
croissance, (Ypx) constant:
1+ Ks.Yxs X Ypx

Y  X − X0
ln + ( X − X0 ) + Ks⋅Yxs  1 + px ln f
µm ⋅ t = 
 X
 X Kp
 X Kp X − X
f
0
f

 f


(6)
Luedeking et Piret (1959b) ont fait appel à une loi d'inhibition proportionnelle à la
concentration de produit
µ = µ m − hP
(7)
Où h est un constant.
3.5.2- Modélisation de la production d'acide lactique:
Luedeking et Piret (1959a) ont montré que la production d'acide lactique était
partiellement associée à la croissance, d'où la loi suivante:
qp =
dP
dX
= αµ + β = α
+β
Xdt
Xdt
(8)
Où qp : est la productivité spécifique.
P : est la concentration en acide lactique
α , β : sont des cœfficients.
On supposant µ= µ m : constante, Tayeb et al (1984) ont intégré le système formé par
(1) et (8). Ils ont ainsi obtenu une loi de production partiellement associée décrivant le
début de la fermentation.
P = X0
αµ m + β
µm
⋅ [exp (µ m ⋅ t 0 ) − 1]
25
(9)
Où X0 est la concentration initiale en biomasse après inoculation, on peut calculer µ m
qui est la pente de la courbe
ln
dP
= f (t )
dt
De même Tayeb et al (1984) ont supposé une inhibition non compétitive de la
croissance, en absence de limitation par le substrat:
µ = µm
Kp
P + Kp
(10)
La résolution, dans le cas général, du système formé par (1), (8) et (10) conduit à
l'équation différentielle non linéaire du second ordre:
α ⋅ µ m ⋅ Kp
(dP) = 0
dP 2 µ m ⋅ Kp dP
=
⋅
+
.
(11)
dt 2
P + Kp dt (P + Kp)(α ⋅ µ m ⋅ Kp + βKp + βP ) dt
2
-Lorsque P<<Kp (début de fermentation): u est constant et égal à µ m, on se ramène
donc à l'équation (9).
-Quand P = Kp (avant le milieu de la phase exponentielle): µ est constant et égal à
µ m/2. Kp (constant d'inhibition) est égal à la concentration en produit pour la quelle la
pente de la courbe Ln (dP/dt)=f (t) et égal à µ m/2
- Quand P>>Kp (fin de fermentation), on peut écrire: µ =
µ m ⋅ Kp
P
Dans ces conditions, Tayeb et al (1984) affirment que l'on peut calculer
α et β par une régression non linéaire.
3.5.3- Modélisation de la cinétique de consommation de sucre:
Pirt (1975), décrit que la vitesse de consommation du substrat est la somme de deux
 dS
termes, l'un lié à la croissance 
 dt



 dS 
 :
 dt  m
, l'autre lié à la maintenance 
G
 dS 
 dS 
 dS 

 =
 +

 dt  T  dt  G  dt  M
(12)
Les termes liés à la croissance et à la maintenance sont donnés respectivement par:
µX
1 dX
 dS 
=−
⋅

 =−
dt
Y
Y
dt

G
xsG
xsG
(13)
26
et
 dS 

 = −ms ⋅ X
 dt  M
(14)
D'où ms est le coefficient de maintenance et YxsG est le rendement de conversion du
substrat en biomasse.
Le rendement vrai de conversion du substrat en biomasse est :
 dX 
YxsG = −

 dS  G
(15)
En portant (13) et (14) dans (12), on obtient le coefficient métabolique qs du substrat:
µ
 dS 
qs = −
+ ms
 =
Xdt
Y

T
xsG
(16)
Si on divise les deux membres de l'équation sur µ on obtient:
 dS 
m
1
 dS 
 = −
− 
 = s+
µ YxsG
 dX  T
 µXdt T
(17)
A partir de cette équation on peut écrire la loi de Pirt :
1
Yx⋅s⋅obs
=
ms
1
+
µ YxsG
(18)
D'où Yx.s.obs est le rendement observé de conversion du substrat en biomasse.
27
1-Objectif du travail :
Notre travail effectué au niveau de laboratoire de biologie (université de
Boumerdes) ainsi qu'au niveau de laboratoire de contrôle de qualité –Tipaza, consiste
d'une part, à optimiser les paramètres physicochimiques et le milieu de culture. Le
substrat utilisé est le lactosérum doux provenant de l'ORLAC de Draa Ben Khedda
en utilisant une souche homofermentaire Streptococcus thermophilus S13. Le second
volet consistera à exprimer nos résultats par un modèle mathématique.
2- Matériels utilisés et réactifs: (annexe 1)
3-Matériel biologique:
La souche utilisée dans notre étude est Streptococcus thermophilus S13, souche
homolactique. C'est une souche de la collection du laboratoire de sciences et
techniques de l’environnement de l’ENP, Alger. Elle est revivifiée par deux
repiquages sur milieu M17 liquide, puis elle est conservée à une température de 4°C
dans des tubes dits tubes de conservation contenant de la gélose M17 incliné.
4--Préparation des tubes de conservation:(annexe 2)
5- Milieu de culture:
Le milieu de culture utilisé au cours de notre fermentation est à base de lactosérum
doux issu de la fabrication de fromage à pâte cuite "Camembert" provenant de
l'ORLAC de Draa Ben Khedda (Tizi-Ouzou). Avant son utilisation comme substrat de
fermentation, ce lactosérum est déprotéiné selon le protocole proposé par Moulin et al
(1976).
Le pH de lactosérum est ajusté à une valeur de 4,6 (point isoélectrique des
caséines) par addition d'acide sulfurique concentré, puis autoclavé pendant 5 minutes
à 102°C. Après refroidissement, il est filtré sur un filtre (type Wattman). L'opération
est répétée plusieurs fois jusqu'à l'obtention d'un sérum limpide, le filtrat recueilli est
réajusté à pH=7 par NaOH, puis stérilisé à 120°C pendant 20 minutes ( annexe 4).
28
6- Conduite de la culture:
6.1- Préparation de préculture:
A partir de la culture sur gélose M17 inclinée, on prélève quelques colonies qui seront
transférées dans un tube de 10 ml de milieu M17 liquide, puis on l'incube à 42°C
pendant 24 heures. Cette étape permet la réactivation de la souche " Streptococcus
thermophilus S13".
Après 24 heures d'incubation, on introduit aseptiquement 1ml de cette préculture dans
un erlenmeyer d'une capacité de 250 ml qui contient 30ml du milieu M17, puis on
l'incube à 42°C pendant 17 heures sans agitation. Lorsque la croissance bactérienne
est suffisamment avancée, ce milieu va servir à inoculer le milieu de culture.
6.2- Culture :
La fermentation en batch (discontinue) est réalisée dans des erlenmeyers d'une
capacité de 1 litre, contenant 300 ml de milieu de culture (lactosérum doux déprotéiné
et autoclavé), ces erlenmeyers sont ensemencés stérilement par 30 ml de préculture
et incubés à 42°C sans agitation.
7- Mesure de densité optique et du poids sec:
La croissance bactérienne est suivie par deux méthodes:
7.1-Mesure de densité optique:
La mesure de densité optique est effectuée à une longueur d'onde de 600 nm au
spectrophotomètre de type UV/VIS UV-9200.
Dans le cas des dilutions, la turbidité est proportionnelle à la biomasse lorsqu'elle ne
dépasse pas la limite 0.5 - 0.6 en unité d'absorbance (Oner et Erickson., 1986)
Principe:
Lorsqu'une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau
lumineux monochromatique, elle absorbe une quantité de lumière qui est
proportionnelle à sa concentration cellulaire selon la loi de Beer Lambert (Bourgeois
et Leveau., 1991) (annexe 2).
29
7.2- Mesure du poids sec:
L'estimation du poids sec permet d'établir une relation entre la DO et la concentration
cellulaire. Dans notre travail, nous avons utilisé la méthode préconisée par Amrane
(1991).
- Prendre 20 ml du jus de fermentation (lactosérum déproteiné) et centrifuger à 3000
tours/minutes pendant
le temps nécessaire (20 à 45 minutes) pour faciliter la
séparation de biomasse;
- le surnageant est séparé du culot;
- Le culot ainsi obtenu est lavé deux fois avec l'eau distillée stérile en ayant soin de
centrifuger après chaque lavage;
- un maximum de surnageant est éliminé, puis le culot est mis en suspension dans un
minimum d'eau distillée;
- peser le culot en suspension puis sècher ce dernier dans une étuve à 105°C pendant
16 heures ;
- après refroidissement au dessiccateur, repeser le culot en suspension jusqu'au poids
constant;
- le poids est déterminé par la formule suivante:
P (g/l) = (m - m0)/0.02
Où m0: masse de culot en suspension avant séchage (g)
m: masse de culot en suspension après séchage.(g)
La courbe densité optique /temps est donc facilement transformée en courbe x = f (t),
où x est la biomasse en g de matière bactérienne sèche par litre de milieu (annexe 5).
8-Détermination des paramètres de croissance et de production:
8.1-Vitesse spécifique de croissance :
µ est la vitesse de croissance dx/dt rapportée à l'unité de biomasse (x) .µ max est taux de
croissance maximal au cours de laquelle toutes les bactéries se trouvent dans leur état
physiologique optimal. Il est déduit de la courbe ln(x) = f (t) (Scriban., 1999).
8.2- Vitesse moyenne d'acidification :
Cette vitesse (vm) est déduite de la courbe de production d'acide lactique, c'est le
rapport entre la concentration maximale en produit (Pm) et le temps mis pour
l'atteindre (Scriban., 1999).
30
9- Méthodes analytiques:
Toutes les analyses ont été effectuées en trois (03) essais.
9.1-Mesure de pH:
La mesure de pH est effectuée sur lactosérum brute et déproteiné et pendant le
déroulement de la fermentation.
9.2- Détermination de la matière sèche:
Ce dosage est réalisé au niveau de l'ORLAC de Draa Ben Khedda, il est
effectué sur le lactosérum brute et le lactosérum déprotéiné.
Le principe est basé sur la dessiccation par élimination d'eau dans un appareil à
infrarouge type sartorius MA 45 qui affiche directement sur l'écran la teneur en eau
ou bien la teneur en extrait sec du produit en g/l.
9.3- Dosage des cendres:
Ce dosage est effectué sur lactosérum brute et traité, nous avons utilisé la
méthode préconisée par AFNOR (1986). Son principe consiste à une évaporation à
sec d'une quantité connue du produit, puis incinération à 530°C dans un four à moufle
pendant 4 heures et refroidissement dans un dessiccateur.
Expression des résultats:
P
Teneur en cendre (g/l) =
où
−
f
P
P
i
E
Pf: poids final du produit.
Pi: poids initial du produit.
PE: prise d'essai.
9.4- Détermination de chlorures :
Ce dosage concerne les deux types de lactosérum (brute et traité), après
défécation de lactosérum, les chlorures sont dosés dans le filtrat par la méthode
proposée par AFNOR (1980).
Les chlorures d'un volume connu de lactosérum sont précipités en présence de 1 ml
d'acide nitrique et 5 ml de nitrate d'argent. L'excès de sel argentique est déterminé
par titrage à l'aide d'une solution de sulfocyanure d'ammonium en présence d'alun de
fer.
31
La teneur en chlorures est donnée en gramme de NaCl par litre selon la formule
suivante:
Teneur en chlorures (g/l) = (5-n). 0,585
n: volume en ml de la solution de sulfocyanure d'ammonium nécessaire pour
l'obtention de la couleur rouge.
9.5- Dosage de la matière grasse:
Ce dosage est effectué sur lactosérum brute et lactosérum déprotéiné. La teneur en
matière grasse est déterminée par la méthode de Gerber AFNOR (1980). Son principe
est basé sur la dissolution des protéines par addition de 10ml d'acide sulfurique à
11ml de lactosérum qui est introduit dans un butyromètre. La matière grasse de
lactosérum est séparée après une centrifugation à 3000 tours/min pendant 5 minutes à
l'aide d'un ml d'alcool amylique. La lecture se fait de manière directe sur l'échelle du
butyromètre.
Expression des résultats:
Teneur en matière grasse (g/l) = B-A
Où A: la lecture faite à l'extrémité inférieure de la colonne.
B: la lecture faite à l'extrémité supérieure de la colonne.
9.6- Dosage de l'azote total:
Ce dosage est effectué sur le lactosérum brute et traité par la méthode de
Kjeldahl, qui consiste en une minéralisation par chauffage de 10 ml de lactosérum
plus 15 ml d'acide sulfurique concentré en présence d'un catalyseur (K2SO4, CUSO4) ;
suivie par une distillation de l'ammoniac libéré qui sera titré par une solution d'acide
sulfurique 0.1N (Audigie et al., 1984) (annexe 4).
Le calcul de la teneur en azote total exprimée en gramme d'azote par litre de
lactosérum, est égale à :
32
Νt = (v1 −v2 )Ρ0E,014×100
Où
v1: volume de la solution d'acide sulfurique utilisée.
v2: volume de NaOH 0,1 N dépensé pour neutraliser l'excès de H2SO4
0,1 N après la distillation.
0,014: coefficient de correspondance.
PE: prise d'essai.
9.7- Détermination de la teneur en protéines:
Les protéines contiennent à peu près 16 % d’azote donc la concentration en
protéine est déterminée par la formule suivante:
Concentration en protéines (g/l) = Azote total (g/l) x 100/16 = Azote total (g/l)
× 6 , 25 .
6,25: facteur variable selon la nature de protéine à analyser (Audigie et al., 1984).
9.8- Dosage du lactose par méthode de Bradford:
Ce dosage est effectué sur les deux types de lactosérum (brute et déprotéiné)
selon la méthode préconisée par AFNOR (1980). Elle est utilisée lorsque les teneurs
en lactose sont comprises entre 23 et 70 g/l.
Son principe repose sur la défécation du lactosérum par l'héxacyanoferrate de
potassium et l'acétate de zinc, une solution cupro-alcaline (annexe 1) est réduite à
chaud par le filtrat obtenu.
Le précipité cuivreux ainsi formé est dissous par 20ml de la solution ferrique (annexe
1) et le sulfate ferreux formé est dosé par le permanganate de potassium 0,1 N
(annexe 4).
La teneur en lactose, exprimée en gramme de lactose hydraté par litre de lactosérum,
est égale à :
Μ ×1000 × 200
1000 × 20 ×10
=Μ
33
M: est la masse, en milligramme de lactose hydraté, lue sur le tableau VI (annexe 6).
9.9-Détermination de la teneur en acide lactique:
La concentration totale en lactate est mesurée par la méthode préconisée par
Anonyme 1 (1973), qui est fondée sur la mesure de l'absorbance du complexe
lactate-Fe3+ à 425nm.
9.9.1-Principe:
Une suspension aqueuse est libérée des protéines et des lipides par précipitation au
moyen de chlorure de baryum, sulfate de zinc et d'une solution d'hydroxyde de
sodium. L'acide lactique contenu dans le filtrat forme avec le chlorure de fer III un
composé jaune dont l'intensité est proportionnelle à la teneur en acide lactique.
9.9.2 - Mode opératoire:
9.9.2.1 - Précipitation des substances gênant l'opération:
Introduire 20 ml de lactosérum dans un ballon jaugé de 50 ml, ajouter dans l'ordre,
10ml de la solution de chlorure de baryum, 5ml de solution de sulfate de zinc et 5ml
d'hydroxyde de sodium, en ayant soin de bien mélanger à chaque fois. Compléter le
volume à 50 ml avec de l'eau distillée, mélanger, laisser reposer la solution pendant
15 minutes et filtrer sur un filtre plissé.
9.9.2.2 -Réaction colorée:
Introduire 10ml de filtrat clair dans une éprouvette a bouchon rodé ou dans un petit
ballon jaugé, ajouter 1ml de la solution diluée de chlorure de fer (III), fraîchement
préparée, et placer aussitôt le récipient à l'abri de la lumière, 10 minutes plus tard,
l'intensité de la couleur est mesurée à 425 nm.
9.9.2.3 - Courbe étalon:( annexe 5)
Mettre 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2; 2,5…etc. jusqu'à 10ml de la solution mère (1ml de cette
solution contient 1g d'acide lactique) dans des ballons jaugés de 50 ml, ajouter 15 à 20
ml d'eau distillée ainsi que les agents de précipitation indiqués au préalable.Compléter
le volume à 50 ml, prélever 10 ml du filtrat et exécuter la réaction colorée. Porter sur
un système de coordonnées les valeurs d'extinction mesurées et les quantités
correspondantes d'acide lactique contenues dans 11ml de la solution colorée.
34
9.9.2.4- Expression des résultats:
Acide lactique en g dans un litre de lactosérum
Où
a: quantité de l'acide lactique en g
PE: prise d'essai exprimé en L
35
=
0 ,5 × a
PE
1- Composition biochimique du lactosérum:
L'utilisation de lactosérum doux déproteiné comme substrat de fermentation
lactique nécessite au préalable une étude biochimique détaillée. La connaissance de
cette composition est nécessaire pour procéder par la suite à des essais de
supplémentation afin d'obtenir un milieu de culture adéquat.
Le tableau VII illustre le pH et la composition biochimique moyenne du lactosérum
doux provenant de L'ORLAC de Draa Ben Khedda.
Tableau VII : composition biochimique moyenne du lactosérum doux provenant
de L'ORLAC de Draa Ben Khedda.
pH
Composition en g/l
- Extrait sec
- Taux des cendres
- Chlorures
- Matière grasse
- Teneur en azote total
- Teneur en protéines
- Teneur en lactose
Lactosérum brut
(avant stérilisation et filtration)
6,00- 6,30
Lactosérum traité
(filtré et stérilisé)
5,90- 6,20
79
7,98
1,80
1,00
1,61
10,06
61
70
7,96
1,75
0
1,12
7
57.9
On constate que la composition biochimique moyenne du lactosérum doux
(brute et traité) provenant de l'ORLAC de Draa Ben Khedda, n’est pas très différente
de celle obtenue par Sottiez (1990) dans le tableau II dans le cas du lactosérum de
fromage à pâte pressée. Toutefois, les valeurs sont légèrement inférieures ce qui
s’expliquerait par une différence de la composition initiale de lait utilisé.
Comme montre le tableau VII, le lactose est le constituant le plus important du
lactosérum (57.9 g/l), il représente 70 à 72 % de l'extrait sec (Britten, 2003).
Après stérilisation, on remarque une diminution de concentration de lactose de 3.1g/l,
cette perte en lactose peut être due à l’hydrolyse thermique (120°C).
Après traitement du lactosérum par chauffage et filtration, on n’observe pas
vraiment une grande différence entre les deux types de lactosérum (brute et traité)
sauf qu'il y a diminution de taux de protéines de 10,06 g/l à 7 g/l avec un pourcentage
de 30,41%.
36
La déproteinisation par chauffage du lactosérum est partielle car le lactosérum
possède des
protéines
fragiles
(les
albumines
(75%),
les
globulines
ou
immunoglobulines (10 à 12 %), les protéoses-peptones (10%) et les protéines
mineures (5%)) (Cayot et al., 1998), ont un pHi (point isoélectrique) varie de 4,6 à 5,2
(Linden et Lorient, 1994) et n'ont pas un pHi fixe égal 4,6. A ce pH, ils précipitent
certaines fractions protéiques tandis que les autres restent solubles dans le sérum.
Enfin, on peut considérer notre lactosérum comme un milieu de culture adéquat
à la croissance de Streptococcus thermophilus S13.
2- Optimisation de la fermentation en batch:
2.1- Optimisation des paramètres physicochimiques :
2.1.1- Effet de température :
Nous avons effectué cinq fermentations à différentes températures et à pH constant
(au voisinage de 6) (tableau VIII).
Tableau VIII: conditions opératoires concernant l'optimisation de température.
Paramètre variable
•
-
Températures:
T1=35°C
T2=40°C
T3=42°C
T4=45°C
T5=48°C
Paramètres fixes
•
•
•
•
•
pH : au voisinage de 6
Inoculum : 10 % (v/v) de préculture
Absence d'agitation
Durée de fermentation : 12h
Milieu de culture : 300 ml de lactosérum déproteiné
et autoclavé
Durant chaque fermentation on évalue la croissance, pH, acide lactique et le lactose
en fonction du temps (figures 14, 15, 16,17).
37
6,5
1
35°C
6
40°C
0,8
35°C
42°C
40°C
45°C
0,6
5,5
48°C
42°C
pH
C o n cen tratio n d e b io m asse (g /l)
1,2
45°C
48°C
5
0,4
0,2
4,5
0
0
2
4
6
8
10
12
4
0
Temps (h)
4
6
8
10
12
Tem ps (h)
figure 14 : Evolution de biomasse en fonction du temps à
differentes température et à pH constant
Figure 15 : Evolution de pH en fonction du tem ps à
différentes tem pératures et à PH constant,
60
9
35°C
8
40°C
7
42°C
6
45°C
5
48°C
4
3
2
1
Concentration de lactose (g/l)
10
C o n cen tratio n d 'acid e lactiq u e
(g /l)
2
0
55
35°C
40°C
50
42°C
45°C
48°C
45
40
0
2
4
6
8
10 12
0
2
4
6
8
10
12
Tem ps (h)
Temps (h)
Figure16 : Evolution de la concentration d'acide
lactique en fonction du temps à différentes
températures et à pH constant
figure 17: Evolution de la concentration de lactose
en fonction du tem ps à différentes tem pératures
Au bout de dix heures, la croissance se ralentit et la phase stationnaire est observée au
bout de 12 h.
D’après la figure 14, on constate que la croissance est meilleure à 42°C et elle atteint
une valeur de 0.9658g de matière sèche / litre de milieu de culture. Cette croissance
est abaissée si on augmente ou on diminue la température de T = 42°C. Selon Rosso
et al. (1995), quand la température du milieu se situe en haut ou en bas de température
requise pour la croissance optimale, l’activité microbienne est réduite et le
microorganisme peut éventuellement se détruire.
La figure 16 montre clairement que la température de 42°C a une meilleure
production d’acide lactique (Pf = 9.06g/l) par rapport aux autres températures 35°C
,40°C, 45°C, 48°C qui ont les concentrations finales en acide lactique respectivement
de 5.22g/l, 6.77g/l, 7.59g/l, 5.88g/l.
38
En effet, dans les systèmes biologiques, la température affecte le taux des réactions
biochimiques, l’activité des enzymes extracellulaires et le temps de génération
(Tchobanoglous, 1979), ce qui influe significativement sur la production d’acide
lactique.
Durant les cinq (5) fermentations, le pH diminue (figure 15). Par exemple, à T =
42°C et au bout de quatre heures, il passe de 6.09 à 5.22 et il arrive à 4.33 à la fin de
la fermentation. Selon Terre (1986), Streptococcus thermophilus acidifie le lait plus
rapidement. En plus, les résultats de Chamba et Prost (1989) et Chamba (1990) ont
montré qu’une souche n’est acidifiante que si la diminution de pH égale au moins 0.5
unité en quatre heures pour les Streptococcus thermophilus. A cet égard, on peut
considérer notre souche Streptococcus thermophilus S13 comme acidifiante.
La figure 17 a bien illustré la dégradation de lactose par une simple droite
décroissante. Cela veut dire que le lactose est consommé par la bactérie et converti
par la suite en un produit fini (acide lactique). Sa production est représentée par une
courbe croissante (figure 16).
0,8
0,16
0,7
0,14
taux de
croissance
m aximal
(1/h)
0,6
0,12
Vitesse
m oyenne
d'acidificatio
n
(g/l h)
0,1
0,08
0,06
0,5
0,4
0,3
0,04
0,2
0,02
0,1
0
0
35
40
42
45
48
35
40
42
45
48
Température (°C )
Temperature (°C)
Figure 19 : Evolution de vitesse m oyenne d'acidification
en fonction de tem pérature
Figure 18 : Evolution de taux de croissance maxim al en
fonction de temperature
Les figures 18 et 19 représentent respectivement l’évolution des deux paramètres de
croissance et de production (µmax et Vm) en fonction de différentes températures.
D’après ces deux figures, on voit que µmax et Vm ont des valeurs maximales
39
(0.155h-1, 0.755g/l.h) à T = 42°C, puis ces valeurs diminuent de part et d’autre de
cette température. Tango et Ghaly (1999), signalent que le taux de réaction
biochimique de n’importe quel microorganisme augmente avec l’augmentation de
température jusqu'à l’arrivée à une température maximale qui est considérée comme
limite, au delà de cette température, le taux de croissance diminue rapidement associé
par un ralentissement de production.
Avec une vitesse spécifique de croissance maximale égale 0.155 h-1 et une vitesse
moyenne d’acidification maximale égale 0.755g/l.h à T= 42°C, on peut considérer
cette température comme optimale pour la croissance et la production d’acide lactique
par Streptococcus
thermophilus S13 cultivée sur lactosérum doux. Donc, il est
important que la température de fermentation soit le plus possible maintenue
constante pour donner une meilleure croissance et production, car un brusque
changement de température peut causer des perturbations (Tango et Ghaly ,1999).
Accolas et al. (1977), Radke-Mitchell et Sandine (1986), Bensiameur (1996) et
Boubechiche (1999) ont également signalé que la température de 42°C est optimale
pour la souche Streptococcus thermophilus CNRZ302.
En plus, Robinson (1988)
a préconisé cette température
d’incubation pour les
souches de Streptococcus thermophilus en suivant comme critère d’acidification
l’acidité titrable. Selon Bourgeois et Larpent (1996), Streptococcus thermophilus se
distingue essentiellement des autres streptococcus lactiques par sa croissance
thermophile avec un optimum autour de 42°C – 43°C. De même, Gyosheva et al.
(1995) ont travaillé sur 75 souches de Streptococcus thermophilus et ont trouvé la
température 42°C comme température d’incubation pour ces dernières.
La figure 20 regroupe respectivement l’évolution de biomasse, pH, acide lactique
produit et le lactose consommé en fonction du temps, à une température optimale
égale 42°C et à pH au voisinage de 6. Elle montre d’une part, une augmentation de
quantité de biomasse et d’acide lactique et d’autre part, une diminution du pH et de la
quantité de lactose. Selon cette figure, la biomasse passe de 0.136 g/l à 0.965g/l,
l’acide lactique passe de 1.96 g/l à 9.09 g/l, le pH diminue jusqu’à 4.33 à partir d’un
pH initial de 6.09, le lactose passe de 58.4g/l à 41.5g/l.
40
12
65
10
60
55
8
50
6
45
4
40
2
35
0
Biomasse ,acide lactique (g/l) et
pH
.
Biomase
pH
Acide lactique
Lactose
30
0
2
4
6
8
10
12
Tem ps (h)
Figure 20 :Evolution de biom ase,pH, acide lactique et
lactose en fonction de tem ps à T=42°C et à pH constant
2.1.2-Effet de pH :
Comme la température, le pH est un facteur qui influe très significativement sur la
croissance bactérienne, c’est pourquoi on cherche à savoir quel est le pH optimal qui
donne une bonne croissance et production d’acide lactique.
Après déproteinisation, filtration, ajustement de pH à 7 à l’aide de NaOH, on stérilise
le milieu de culture dans un autoclave à 120°C pendant 20 minutes. Cette stérilisation
provoque la précipitation d'une partie des protéines limitant ainsi la quantité d'azote
disponible dans le milieu (Racine et al., 1991).
En effet, le pH baisse de 7 jusqu’à 5.90 à 6.20 et d’après Beal et Corrieu (1991),
Streptococcus thermophilus préfère une gamme de pH comprise entre 6 et 6.5. Pour
cela, on ajuste le pH de 4,5 à 8, puis on stérilise. Les conditions opératoires sont
présentées dans le tableau IX .
41
Tableau IX : conditions opératoires concernant l’optimisation de pH.
Paramètre variable
•
Paramètres fixes
•
Température : 42°C
- pH 1 = 4.72
•
- pH 2 = 5.06
•
Absence d'agitation et d’aération
- pH 3 = 5.34
•
- pH 4 = 5.61
•
Milieu de culture : 300 ml de
pH:
- pH 5 = 6.09
lactosérum déproteiné et autoclavé.
- pH 6 = 6.37
- pH 7 = 6.42
- pH 8 = 6.62
- pH 9 = 7.3
Les figures 21, 22, 23, 24 représentent respectivement l’évolution de biomasse, pH,
acide lactique et lactose en fonction du temps.
Les figures 21 et 23 montrent que la croissance ainsi que la production d’acide
lactique sont inhibées à pH = 4.72, tandis qu'il y a augmentation de la biomasse et la
teneur en acide lactique avec l’élévation de pH jusqu’à pH = 6.42 où Xf =1.30 g/l
et Pf = 9.90 g/l.h. Au-delà de ce pH, la croissance et la production d’acide lactique
diminuent.
La fermentation lactique par Streptococcus thermophilus
s'effectue par la voie
homofermentaire, au cours de laquelle 90% du lactose est transformé en acide
lactique. D’après la figure 24, le lactose est dégradé rapidement par la souche utilisée.
Le produit ainsi obtenu « Acide lactique » à la fin de cette dégradation, provoque
l’abaissement de pH (figure 22).
42
8
pH=6,62
7
pH=6,42
pH =6,62
6.5
pH=6,37
pH =6,42
6
pH=6,09
1.2
pH =7,3
1
0.8
pH =6,37
0.2
pH=5,34
5
pH =5,61
0.4
pH=5,61
5.5
pH =6,09
0.6
pH=7,3
7.5
pH
Concentration en biom asse (g/l)
1.4
pH =5,34
4.5
pH =5,06
4
pH =4,72
3.5
pH=5,06
pH=4,72
0
0
0
2
4
6
8
10
2
4
12
6
8
10
12
Temps (h)
pH
Figure 22 : Evolution de pH en fonction du temps à
différents pH et à T=42°C
Figure 21 : Evolution de biomasse en fonction du
temps à différents pH et à T = 42°C.
6
4
2
=7.3
= 6.62
=6.42
= 6.37
= 6.09
= 5.61
= 5.34
= 5.06
= 4.72
60
pH
pH
pH
pH
pH
pH
pH
pH
pH
8
lactiq u e (g /l)
C o n cen tr atio n d 'acid e
10
pH =7,3
pH =6,62
55
pH = 6,42
pH = 6,37
pH = 6,09
50
pH = 5,61
pH = 5,34
pH = 5,06
45
pH = 4,72
0
0 2 4 6 8 10 12
40
0
Temps (h)
2
4
6
8
10
12
Temps (h)
Figure 23 : Evolution de la concentration
d'acide lactique en fonction du tem ps à
différents pH et à T=42°C
Figure 24 : Evolution de concentration de lactose en
fonction du tem ps à différents pH et à T= 42°C
Il est connu qu’à des pH bas, l’acide lactique provoque une pression dans les cellules
microbiennes (Vali et al.,2006) puis les bactéries perdent leurs activités
physiologiques entraînant ainsi une inhibition de β galactosidase et d’autres enzymes
de glycolyse.
De façon générale, le lactose est converti en acide lactique par la voie d’EMBDEN
MEYERHOF qui forme deux molécules de lactate par molécule de lactose consommé
(Luquet et Corrieu, 2005). A l’aide de β-galactosidase, le lactose est scindé en
galactose et glucose pour donner par la suite le pyruvate, ce dernier est transformé en
acide lactique et énergie sous forme d’ATP. Durant la phase exponentielle où la
croissance et la production sont assez importantes, la bactérie exige beaucoup d’ATP
43
pour assurer la synthèse et la production. Par contre, cette exigence diminue dans la
phase stationnaire.
Aux pH = 4.62 et 7.3, Streptococcus thermophilus S13 nécessite l’ATP beaucoup plus
dans la maintenance que dans
la croissance et la production, ce qui explique
l’inhibition à des pH bas ou élevés.
0,3
0,25
Taux de
croissance
m axim al
(1/h)
0,2
0,15
0,1
0,05
0
4,72
5,06
5,34
5,61
6,09
6,37
6,42
6,62
7,3
pH
Figure 25: Evolution de taux de croissance m axim al en fonction de
pH
0.9
0.8
0.7
Vitesse
m oyenne
d'acidification
(g/l.h)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
4.72 5.06 5.35 5.61 6.09 6.37 6.42 6.62 7.3
pH
Figure 26 :Evolution de vitesse m oyenne d'acidification en
fonction pH
Les figures 25 et 26 représentent respectivement l’évolution de µmax et Vm en
fonction de différents pH. Il apparaît clairement que à pH = 6.42, le µmax atteint une
valeur maximale égale 0.283 h-1 et Vmax prend une valeur maximale égale 0.816
g/l.h. Ces deux courbes illustrent bien l’effet de pH sur la croissance et la production
d’acide lactique. Par exemple à des pH extrêmes 4.72 et 7.3, on voit que le taux de
croissance est presque nul et il prend les valeurs suivantes :
44
0.01h-1 et 0.016 h-1.Même, la vitesse moyenne d’acidification est faible et elle prend
les valeurs suivantes : 0.237g/l.h, 0.258 g/l.h. Adamberg et al. (2003), ont expliqué la
croissance et la production d’acide lactique à des pH bas ou alcalins par la haute
résistance des bactéries lactiques aux conditions défavorables (acidité élevée,
alcalinité élevée…etc.). Selon Hutkins et Nannen (1993), les bactéries lactiques
thermophiles
notamment
Streptococcus
thermophilus,
poussent
et
gardent
généralement leur viabilité dans des milieux de pH compris entre 4.5 et 7.
Avec Xf =1.30 g/l (figure 21), Pf =9.9 g/l (figure 23), µmax = 0.283 h-1 (figure 25)
et Vmax = 0.816 g/l.h (figure 26) à T = 42°C et à pH = 6.42, on peut conclure que ce
pH est pris comme optimum pour notre souche Streptococcus thermophilus S13 afin
qu’elle puisse donner une bonne croissance et production d’acide lactique.
McBean et al. (1979) ont proposé un pH de 6 pour Streptococcus thermophilus. Par
contre Tayeb et al. (1984) ont adapté un pH de 6.5 pour la même souche. Les
résultats des travaux de Hutkins et Nannen (1993) ont montré que le pH externe
optimum pour les bactéries lactiques thermophiles et plus précisément Streptococcus
thermophilus est de 6 à 7,5.
D'une manière générale, la production d'acide lactique a un effet inhibiteur sur les
bactéries lactiques et plus particulièrement Streptococcus thermophilus. Les travaux
de Konings et Otto (1983) et Amrane (2001), ont montré que lorsque le pH du milieu
extérieur diminue, par l'accumulation des acides organiques (acide lactique), la
bactérie lactique maintient son pH intracellulaire plus alcalin (pH = 6.6) que le milieu
extracellulaire, car les cellules excrètent rapidement l'acide lactique dissocié dans le
milieu extracellulaire, en plus la membrane cellulaire est imperméable pour les
protons extracellulaires (molécule de lactate) ( Hutkins et Nannen ,1993). La
différence de pH entre le cytoplasme et le milieu extracellulaire forme un gradient de
pH (pH). Pour excréter les protons à l'extérieur , la bactérie consomme l'ATP en
activant l'enzyme H+, ATPase (Nannen et Hutkins, 1991), mais en fin de phase
exponentielle de croissance, la quantité d'ATP disponible ne suffit plus, le gradient de
pH disparaît, les activités hexokinasiques baissent et entraînent l'inhibition de la
croissance et l'activité des enzymes intracellulaires telle que le β galactosidase car le
45
pH optimal de la β-D-galactosidase provenant de Streptococcus thermophilus est
proche de neutralité)( Hutkins et Nannen ,1993).
Fu et Mathews (1999) ; Mirdamadi et al (2003) ont justifié que la croissance et la
production d'acide lactique sont inhibées par la présence
d'acide lactique non
dissocié. Le pka de l'acide lactique est de 3,86.
La relation entre la forme dissociée [L-] et la forme non dissociée [HL] est
représentée par l'équation suivante:
pka = pH – log [L-] / [HL] ………
(1)
D'après la figure 23 Pf = 9.9 g/l, donc
[L-] + [HL] = 9.9g/l =0.11M…………. (2)
A pH = 6, et à partir des équations (1) et (2), on trouve que 99.29 % de la totalité
d'acide lactique est dissocié et 0.71 % non dissocié. Cependant, si le pH diminue
jusqu'au 4.30, l'acide lactique non dissocié peut atteindre 26.63% de la totalité d'acide
lactique, cela explique la raison de faible croissance à des pH bas.
La figure 27 regroupe l'évolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en
fonction du temps à T = 42°C et à pH = 6.42. Elle illustre l'augmentation de biomasse
46
de 0.128 g/l à 1.3 g/l, et l'acide lactique de 2.06 g/l à 9.9 g/l .En plus, elle montre la
diminution de pH de 6.42 à 4.29 et de lactose de 58.4 g/l à 41g/l.
2. 2-Optimisation des paramètres liés au milieu de culture :
2.2.1-Effet de l'extrait de levure:
Pour augmenter le rendement de croissance et de production d'acide lactique, on
essaiera de supplémenter le lactosérum par des sources azotées. L'extrait de levure est
le plus utilisé dans plusieurs travaux (Norton et al., 1994). Il constitue une source de
vitamines et de facteurs de croissance (Adamberg et al., 2003). Le tableau X illustre
la composition d'extrait de levure (annexe7).
Pour connaître la concentration optimale d'extrait de levure qui nous a permis d'avoir
une bonne croissance et production d'acide lactique, nous avons procédé à trois (3)
fermentations supplémentées respectivement de 1%, 5%, 10% d'extrait de levure, une
fermentation sans supplément (0%).
Tableau
XI:
conditions
opératoires
concernant
l'optimisation
de
la
concentration d'extrait de levure.
Paramètre variable
•
Paramètres fixes
Concentration
•
Température: T = 42°C
d'extrait de levure:
•
- EL = 0 %
•
Inoculum : 10% (v/v) de préculture
- EL = 1 %
•
Absence d'agitation et d'aération
- EL = 5 %
•
- EL = 10 %
•
Milieu de culture : 300 ml de lactosérum déproteiné et
autoclavé.
Nous avons représenté respectivement sur les figures 28, 29, 30, 31 l'évolution de
biomasse, pH, acide lactique produit ainsi que le lactose consommé en fonction du
temps.
47
6.5
1,6
1,4
6
EL = 0 %
1,2
1
EL = 0 %
0,8
EL = 1%
0,6
EL = 5 %
EL = 1 %
5.5
EL = 5 %
pH
Concentration de biomasse (g/l)
1,8
EL = 10 %
5
EL = 10 %
0,4
4.5
0,2
0
0
2
4
6
8
10
4
12
0
2
4
8
10
12
Tem ps (h)
Tem ps (h)
Figure 28 : Evolution de biom asse en fonction du
tem ps à différentes concentrations en extrait de
levure et à T =42°C.
Figure 29 : Evolution de pH en fonction du tem ps et
à différentes concentration en extrait de levure et à T
= 42°C
12
65
10
60
EL= 0 %
8
EL = 1%
6
EL = 5%
4
EL =10 %
2
C o n ce n trat io n d e la ct o se ( g /l)
C o n cen tratio n d 'acid e lactiq u e (g /l)
6
EL = 0%
EL = 1 %
55
EL = 5 %
50
EL = 10 %
45
40
35
0
0
2
4
6
8
10
0
12
2
4
6
8
10
12
Temps (h)
Temps (h)
figure 31 : Evolution de lactose en fonction du temps à
différentes concentrations d'extrait de levure et à T=42°C
Figure 30 : Evolution de la concentration d'acide lactique
en fonction du temps à differentes concentrations
d'extrait de levure et à T= 42°C
D'après la figure 28, on voit que le temps de latence pour EL = 0 % est relativement
long (environ 3 à 4 heures) tandis qu'il est réduit pour des concentrations d'extrait de
levure 1 %, 5 %,10 %. Ce temps de latence est suivi par une phase d'accélération, il
dépend généralement de plusieurs facteurs: taille de l'inoculum, l'état physiologique
de la bactérie et la préculture.
Ce temps de latence réduit correspond à une adaptation de Streptococcus
thermophilus S13 à l’extrait de levure additionné. L'adjonction d'extrait de levure au
lactosérum provoque une amélioration de la croissance où Xf égal 1.65 g/l ,1.59 g/l
,1.218 g/l
pour des concentrations d'extrait de levure respectivement de 1 %, 5 %,10
%. Selon Bury et al. (2001), l'addition d'extrait de levure au lactosérum déproteiné
48
peut considérablement augmenter non seulement le taux d'acidification par
Lactobacillus bulgaricus 11842 mais aussi l'activité de β-galactosidase. Cette
activation entraîne la dégradation de lactose et une bonne assimilation de glucose qui
se traduit par une bonne croissance. Cette amélioration a été attribuée à la
disponibilité d'acides aminés libres, de peptides, purines
de pyrimidine et de
cofacteurs…etc (Zhang et al. ,2007).
En plus, la figure 30 a montré une amélioration marquée concernant la production
d'acide lactique ou Pf prend les valeurs de 8.16 g/l ,9.71 g/l, 8.33 g/l, 7.35 g/l pour
des concentrations d'extrait de levure suivantes : 0 %,1 %, 5 %,10 %.
En effet, durant la phase exponentielle la bactérie nécessite beaucoup d'énergie pour
croître et pour produire l'acide lactique, l'amélioration observée dans la croissance
peut être expliquée par la grande exigence de bactérie à l'énergie pour la croissance et
la maintenance. En revanche, une petite quantité d'énergie va être destinée à la
production d'acide lactique.
A la fin des quatre (4) fermentations, le pH baisse jusqu’à 4.84, 4.35, 4.51, 4.69 pour
des teneurs en extrait de levure respectivement de 0 %,1%,5%,10% (figure 29). Cette
diminution de pH provoque un ralentissement de croissance et de production. D’après
la figure 31, on remarque une diminution de quantité de lactose ce qui traduit une
bonne assimilation de lactose par notre souche.
Les figures 28, 29, 30, 31 montrent que la croissance et la production d'acide lactique
sont meilleures à une concentration d'extrait de levure égale 1 %.
49
0,3
0,25
Taux de
croissan 0,2
ce
0,15
m axim al 0,1
(1/h)
0,05
Vitesse
moyenne
d'acidification
(g/l,h)
0
0%
1%
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0%
5% 10%
Concentration en
extrait de levure
(%)
1%
5%
10%
Concentration d'extrait de
levure (%)
Figure 32 : Evolution de Taux de
croissance m axim al en fonction de
concentration d'extrait de levure
figure 33 : Evolution de vitesse moyenne d'acidification en
fonction de concentration d'extrait de levure
L'examen des figures 32 et 33 qui représentent respectivement l'évolution de vitesse
spécifique de croissance et de vitesse moyenne d'acidification en
fonction de
différentes concentrations d'extrait de levure 0 %.1 %, 5 %,10 %, montre clairement
que l'addition d'extrait de levure au lactosérum stimule la croissance et la production
d'acide lactique . Ces deux paramètres prennent les valeurs maximales 0.301 h-1 et
0.809 g/l.h à une concentration d'EL = 1% (10g/l) puis ils commencent à diminuer
progressivement avec l'augmentation de concentration d'extrait de levure. Par
exemple à 5 % (µmax = 0.240 h-1, Vmax =0.694 g/l.h), à 10 % (µmax =0.1701h-1,
Vmax = 0.612 g/l.h ).
Ce ralentissement du taux de croissance ainsi que le taux de production peut être
attribué à une inhibition par un excès de supplément (extrait de levure). Levander et
Radstron (2001) ont attribué l’inhibition de la croissance et la production d’acide
lactique à des concentrations d’extrait de levure au dessus de 10g/L. Amrane (2000) a
travaillé sur la production d'acide lactique par Lactobacillus helveticus cultivée sur
lactosérum supplémenté par extrait de levure et il a conclu que les concentrations
d'EL supérieure à 20 g/l deviennent toxiques pour le microorganisme. En plus, Ghaly
et al. (2003) ont signalé qu’à des concentrations élevées en extrait de levure, la
concentration cellulaire diminue sous l’effet de forte toxicité.
50
Selon la figure 28 (où Xf = 1.65 g/l), la figure 30 (où Pf = 9.71 g/l), la figure 32 (où
µmax = 0.301 h-1), la figure 33 (où Vmax = 0.809 g/l.h), nous retiendrons la
concentration d'EL = 1% (10g/l) comme concentration optimale à la croissance et la
En effet, des résultats similaires ont été trouvés par Aeshlimani (1989), Amrane et
Prigent (1997), Kulozik et Wilde (1999), Bouguettoucha et al. (2007), qui ont
travaillé sur une autre bactérie lactique thermophile libre Lactobacillus helveticus. En
revanche, Norton et al. (1994), Schepers et al. (2004), Sirisaneeyakul et al. (2007) ont
travaillé respectivement
sur des bactéries lactiques thermophiles immobilisées
Lactobacillus lactisIO1, Lactobacillus helveticus et ont jugé que 10 g/l d'EL est la
concentration optimale pour ces deux souches afin qu'elles puissent donner une
bonne croissance et production d'acide lactique.
Nous avons représenté simultanément sur la figure 34 l'évolution de biomasse, pH,
acide lactique et lactose en fonction du temps à T = 42°C et EL = 1 %.Cette courbe
fait apparaître que la biomasse arrive à une valeur de 1.65g/l , l’acide lactique
présente un maximum Pf =9.71 g/l. Par contre, le pH chute jusqu’à 4.35 avec une
quantité résiduelle de lactose égale à 38.5g/l.
2.2.2-Effet de la concentration de lactose:
Dans le lactosérum, Streptococcus thermophilus utilise seulement le lactose comme
source carbonée. Gyosheva et al. (1995) ont signalé que cette souche fermente
51
uniquement quelques sucres: le lactose et parfois le galactose .De même, cette souche
a une préférence vis à vis des milieux de culture contenant le lactose comme source
carbonée (Benateya, 1987).
Pour déterminer l'influence du lactose, on a suivi sept fermentations additionnées de
teneurs différentes en lactose 0 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %. Ces fermentations
se sont déroulées dans un étuve réglée à T= 42°C avec un pH initial au voisinage de
6, les conditions opératoires sont bien détaillées dans le tableau XII.
Tableau XII : conditions opératoires concernant l'optimisation de la
concentration de lactose.
Paramètre variable
•
Paramètres fixes
•
Températures: T= 42°C
lactose (%):
•
- lac = 0 %
•
- lac = 0.5 %
•
- lac = 1 %
•
- lac = 2 %
•
Milieu de culture : 300 ml de lactosérum
Concentration
de
- lac = 3 %
déproteiné et autoclavé
- lac = 4 %
- lac = 5 %
Les figures 35, 36, 37,38 représentent respectivement l’évolution de biomasse, pH,
1,6
lac = 0%
10
1,4
lac =0,5%
9
lac = 0,5%
8
lac = 1%
7
lac = 2%
6
lac = 3%
5
lac = 5%
4
lac = 5%
lac =1%
1,2
lac = 2 %
1
lac =3 %
0,8
lac =4%
0,6
lac =5%
0,4
0,2
Concentration d'acide lactique
(g/l)
Concentration de biom asse (g /l)
acide lactique et lactose en fonction du temps à T= 42°C.
lac = 0%
3
2
1
0
0
0
2
4
6
8
10
0
12
2
4
6
8
10
12
Tem ps (h)
Temps (h)
Figure 37 : Evolution de la teneur en acide lactique en
fonction du temps à différentes concentrations de
lactose et à T = 42°C .
Figure 35 : Evolution de biomasse en fonction du temps à
différentes concentrations de lactose et à T= 42°C .
52
7
lac = 0%
lac = 1%
6
lac = 2%
lac = 3%
5.5
lac = 4%
5
lac = 5%
4.5
4
6.5
pH
70
lac = 0,5%
lac = 0 %
65
lac = 0,5 %
60
lac = 1%
lac = 2 %
55
lac = 3 %
50
lac = 4 %
lac = 5%
45
40
35
0
2
4
6
8 10
Tem ps (h)
12
0
2
4
6
8
10
12
Tem ps (h)
Figure 36 : Evolution de pH en foction du
temps à différentes concentrations de
lactose et à T= 42°C .
Figure 38 : Evolution de la concentration de lactose en
fonction du temps à différentes concentrations de
lactose et à T = 42°C .
Concernant la biomasse, la figure 35 montre que durant l'intervalle [0% à 2%], la
biomasse augmente avec l'augmentation de la concentration du lactose et elle prend
les valeurs de Xf suivantes :
0.965 g/l , 1.05 g/l , 1.2 g/l 1.5 g/l pour 0 %, 0,5 %, 1
%, 2 %, cela est expliqué par une
meilleure adaptation de Streptococcus
thermophilus S13 au lactose additionné. D'après Bertheau et al. (1985), le βgalactosidase est induite par l'adjonction de lactose au milieu de culture. Ce qui
facilite la consommation rapide de substrat et provoque ainsi une bonne croissance.
Dans l'intervalle [3% à 5%], la croissance est inversement proportionnelle à la
concentration de lactose, c'est-à-dire, la biomasse diminue quand la concentration de
lactose additionnée est croissante.
La figure 37 illustre que la concentration finale en acide lactique est maximale (PF =
9.47 g/l) à une concentration de lactose égale 2% (20g/l). Ce résultat est confirmé par
la figure 38 où elle
met en évidence la bonne dégradation de lactose à une
concentration de lactose égale 2% par passage de 58.8 g/l à 40 g/l.
53
0,35
0,3
Taux de 0,25
croissance
0,2
m axim al
0,15
(1/h)
0,1
0,05
0
0%
0,50%
1%
2%
3%
4%
5%
Concentration de lactose (%)
Figure 39 : Evolution de taux de croissancem axim al en
fonction de concentration de lactose
0,8
0,7
0,6
Vitess e
m oyenne
d'acidificatio
n (g/l,h)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0%
0,50% 1%
2%
3%
4%
5%
Conce ntration de lactose en (%)
figure 40 : Evolution de vitess e m oyenne d'acidification
e n fonction de concentration de lactose
L'examen des deux figures 39 et 40 qui présentent l'évolution de µmax et Vmax en
fonction de différentes concentrations de lactose, a mis en évidence que µmax =
0.320 à 2% de lactose puis il diminue de part et d'autre de cette concentration. Une
observation similaire sur la figure 40 indique Vmax = 0.789g/l.h à lac = 2 %.
Enfin, nous retiendrons la concentration de 2% en lactose comme concentration
optimale pour la croissance et la production d'acide lactique en se basant sur le Xf, Pf,
µmax et Vmax.
54
Vu le manque de littératures concernant la production d'acide lactique par
Streptococcus thermophilus sur lactosérum enrichi en lactose, on essaiera de
rapporter nos résultats à une autre souche de bactérie lactique thermophile qui est
utilisée dans plusieurs travaux en culture mixte avec Streptococcus thermophilus. Les
résultats d’Adamberg et al. (2003) qui ont travaillé sur Lactobacillus bulgaricus libre
sont en accord avec notre résultat lac = 2%.
Fu et Mathews (1999) ont travaillé sur Lactobacillus plantarum et ils ont trouvé la
concentration de 20 g/l comme concentration optimale pour la croissance
et la
D'une manière générale, le ralentissement de croissance et de production d'acide
lactique observé à des concentrations supérieures à 2% (20 g/l), est dû à l'inhibition
par l'excès de substrat (lactose) (Yun et al., 2003).
Benateya (1987) a expliqué ce ralentissement par la pression osmotique sous l'effet de
forte concentration en glucides. En plus, les travaux de Larsen et Anon (1989; 1990)
ont montré que ce ralentissement de croissance et de production d’acide lactique est
dû à l'accroissement de la pression osmotique et à la diminution de l'activité de l'eau
(Aw).cette diminution de Aw résulte du fort pouvoir hygroscopique du lactose
(Carrara et Rubiolo, 1994) .
55
La présentation simultanément de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction
du temps à T = 42°C et à Lac = 2 % sur la figure 41 fait apparaître que la biomasse
passe de 0.138g/l à 1.5, pH passe de 6.26 à 4.18, acide lactique allant de 1.87 g/l à
9.47 g/l et la dégradation de lactose passe de 58.8 g/l à 40g/l.
3 - Production d'acide lactique dans les conditions optimales :
Pour étudier l'effet des paramètres physicochimiques (T, pH) et les paramètres liés au
milieu de culture (EL, Lac). On essaiera de regrouper les 04 facteurs dans une même
fermentation sous les conditions citées dans le tableau XIII. Durant cette
fermentation, on mesure la DO, pH, acide lactique et lactose.
Tableau XIII: conditions optimales.
Paramètres optimaux
Paramètres fixes
•
T : 42°C
•
•
pH : 6,42
•
•
EL: 1 %
•
Durée de fermentation : 24 h
•
Lac: 2 %
•
Milieu de culture : 300 ml de lactosérum
déproteiné et autoclavé
La figure 42 représente l'évolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en
fonction du temps .Elle nous a permet de voir que la biomasse passe de 0.165g/l à
2.368 g/l, l'acide lactique passe de 2.28 g/l à 13.31 g/l , diminution de pH jusqu’à
4.23 et dégradation de lactose de 57.9 g/l à 35 g/.
56
On remarque que la croissance est presque liée à la production d'acide lactique car la
croissance et la production augmentent parallèlement jusqu'au temps t =12 h puis
elles se stabilisent.
Il apparaît que la croissance et la production d'acide lactique sont inhibées lorsque le
pH chute à 4.23. Cela est dû à la forte acidité (pH bas) qui résulte de l'accumulation
de l'acide lactique.
Amrane (2001) a conclu que l'inhibition peut être due à
l'épuisement de source carbonée. Mais dans notre travail, ce n'est pas le cas, car la
concentration de lactose passe de 57.9 g/l
à
35 g/l avec un rendement de
bioconversion de lactose en acide lactique Yp/s = 48.16 %, donc il reste dans le
lactosérum 51.84 % de lactose non consommé par la bactérie.
D'autres chercheurs tels que Somkuti et Steinberg (1979) ont montré que le galactose
est un facteur responsable de l'inhibition de croissance du Streptococcus
thermophilus. Ces travaux sont confirmés par Levander et Radstrom (2001) qui ont
montré que les souches de Streptococcus thermophilus sont considérées galactose (-)
et elles ne peuvent fermenter le galactose malgré qu'elles possèdent le gène nécessaire
pour le catabolisme de galactose.
En résumant l’effet de pH et de l’acide lactique sur la croissance et la production
d’acide lactique par les résultats conclus par Amrane et Pringent (1999) :
57
1- au début de la fermentation en batch, le pH constitue le seul facteur qui contrôle
la croissance et la production d’acide lactique.
2- durant la phase de ralentissement, le taux de production reste proche de son
maximum et il diminue avec la diminution de pH.
3- à la fin de croissance, durant les deux phases stationnaire et de déclin,
l’inhibition se fait uniquement par la concentration d’acide lactique non
dissocié et le pH n’a qu’un effet indirect.
4 - Modélisation de la croissance et de la production d'acide lactique:
Pour comprendre les phénomènes biologiques et plus précisément les cinétiques de
croissance et de production d'acide lactique, on essaiera de traduire les résultats
expérimentaux par un modèle mathématique en utilisant un logiciel "ORIGIN" qui
est basé sur la méthode des moindres carrées.
De façon générale, le choix de modèle mathématique est fait selon deux critères:
- Il doit avoir une meilleure corrélation (R2 plus élevé (proche de 1));
- Il doit avoir aussi une excellente représentation du processus étudié.
Avant la modélisation des cinétiques de croissance bactérienne et de production
d'acide lactique, il est nécessaire de passer par la dérivation par rapport au temps de la
grandeur mesurée.
4.1-Modélisation de la croissance bactérienne :
La dérivation de X en fonction du temps est représentée par la figure 43:
Concentration de biomasse (g/l)
2,5
2,0
points éxpérimrntaux
points calculés
1,5
1,0
0,5
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Temps(h)
Figure 43 :Ajustement de la concentration de biomasse en fonction du temps
58
Cette figure donne la cinétique de croissance de Streptococcus thermophilus S13
dans les conditions optimales: T= 42°C, pH= 6.42, EL = 1% et Lac = 2% sachant que
les points correspondent aux valeurs de X expérimentales et la courbe correspond aux
X numériques.
La fonction qui nous a permis d'avoir un meilleur ajustement c'est la fonction de
Richards qui a la forme suivante:
Y = a [1+ (d-1) e-k (x-xc)] 1/ (1-d) (*)
Avec a, xc, d, k sont des constants sans signification biologique et ils prennent les
valeurs suivantes: a = 2.37165, xc =8.96709, d = 6.83021, k = 1.8555.
Selon cette figure, on remarque que l'ajustement est excellent pour toutes les phases
de croissance où le coefficient de corrélation R2 est très élevé (R2= 0.99913), c’est-àdire les points expérimentaux sont en très bon accord avec ceux calculée et cela veut
dire qu’il y a peu d’erreurs entre la réalité et l’expérimentation. Donc on peut
exprimer la biomasse par l’équation ci-après :
X = 2.37165 [1 + 5.83021. e - 1.8555 (t - 8.96709)] 1 / (-5.83021)
Cette figure est de forme sigmoïde a été mise en œuvre pour la première fois par
Richards en 1961 en suivant l'équation : Y =[ a (1+b.e
c.(d-1) -1/b
]
(Baratchell et al, 1989).
Selon Beal et al (1994); Boudrant et al(1994), ce modèle appelé descriptif (ou
purement mathématique) permet d'exprimer les variables de croissance ou
d'acidification par des équations dépendant du temps et comportant un nombre
variable de paramètres n'ayant pas de signification biologique.
Streptococcus thermophilus S13 est une souche homolactique qui produit
uniquement l'acide lactique.Ce produit fini constitue un facteur limitant de la
croissance et de la production. Pour cela nous avons tracé la courbe qui porte la
vitesse spécifique de croissance en fonction de concentration d'acide lactique formé
(figure 44).
59
0,40
Points mesurés
Points ajustés
0,35
T a u x d e c ro is s a n c e (h -1 )
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Concentration d'acide lactique (g/l)
Figure 44 : Ajustement de taux de croissance en fonction de concentration d'acide lactique.
D’après cette figure, on voit que l’ajustement du taux de croissance en fonction de
concentration d’acide lactique formé n’est pas très bon c'est-à-dire que l’écart est peu
important entre les points expérimentaux et les points calculés. Cela peut être dû au
nombre réduit de prélèvements effectués durant la fermentation lactique pour faire le
dosage de biomasse ainsi que l’acide lactique.
Toutefois, quand la concentration d’acide lactique augmente, le taux de croissance
baisse, dans ce cas on parle d’inhibition proportionnelle à la concentration de
métabolite produit. Cette inhibition suit le modèle 7 (voir chapitre IV) : µ =µm – hp
avec h = 0.02354 qui représente la pente de la courbe linéaire. Ce résultat est en
accord avec les résultats de Luediking et Piret (1959 b).
4.2-Modélisation de la production d'acide lactique:
La dérivation de P en fonction du temps est illustrée par la figure suivante:
60
C o n c e n tra tio n d 'a cid e la ctiq u e (g /l)
14
12
10
Points expérimentaux
Points calculés
8
6
4
2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Temps (h)
Figure 45:Ajutement de la concentration d'acide lactique en fonction du temps
La figure 45 donne la cinétique de production de Streptococcus thermophilus S13
dans les conditions optimales: T=42°C, pH= 6.42, EL = 1% et Lac = 2%. Cette
courbe porte les points expérimentaux ainsi que la courbe ajustée.
L'ajustement se fait par la même équation utilisée dans l'ajustement de la cinétique de
croissance sachant que a = 13.35087, xc =6.41061, d = 4.16642, k = 0.72952.
D'après cette figure, on note que l'écart est réduit entre les points expérimentaux et les
points calculés
où
R2 = 0.99816, donc
on peut
exprimer la production par
l’équation suivante :
P = 13.35087 [1 + 3.16642. e – 0.72952
(t – 6.41061) 1 / (-3.16642)
]
4.3- Relation entre la croissance et la production d'acide lactique :
Sur la figure 46, sont portées les vitesses spécifiques de croissance et les vitesses
spécifiques de production en fonction du temps .Ces deux courbes présentent presque
une allure identique c’est à dire les vitesses se trouvent à leur maximum au bout de 4
heures puis elles décroissent jusqu’à une valeur proche de 0 dans le cas de vitesse
spécifique de croissance et elles arrivent à une valeur constante égale 0.39 h-1dans le
cas de vitesse spécifique de production.
61
2.5
1
2
0.75
1.5
0.5
1
0.25
0.5
0
0
0
2
4
6
8
10
Vitesse spécifique de
croissance (1/h)
vitesse spécifique de
production (1/h)
Vitesse
spécif ique de
production
Vitesse
spécif ique de
croissance
12
Temps (h)
Figure 46 : Evolution de vitesse spécifique de production et
vitesse spécifique de croissance enfonction du temps dans les
conditions optimales: T=42°C,pH=6,2,EL=1%,LAC=2%
En ce qui concerne la production des métabolites, Gaden (1955) a décrit trois
types de cinétiques:
- formation de produit directement lié au métabolisme du substrat (production couplée
de la croissance).
qp = α.µ
(1)
-formation de produit non lié au métabolisme du substrat (production dissociée de la
croissance).
qp = β
(3)
Dans le cas de notre travail, la représentation de qp en fonction de µ est illustrée
sur la figure 47, cette courbe ne passe pas par l’origine et elle prend l’équation
suivante :
y = αµ+β ((Type 2 de la classification de Gaden) où α et β sont des coefficients liés à
la croissance et à la production.
62
vitesse specifique de
production (1/h)
2,5
2
1,5
y = 5,1523x + 0,0821
R2 = 0,9326
1
0,5
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Vitesse spécifique de croissance (1/h)
Figure 47:Evolution de vitesse spécifique de
production en fonction de vitesse spécifique
de croissance
D’après la courbe 47, on fait sortir α qui représente la pente de la courbe et β
correspond au point d’intersection de notre courbe avec l’axe des coordonnées (y).
Il apparaît clairement que la
production d’acide lactique est légèrement
découplée de la croissance avec un coefficient de corrélation R2 = 0.9326, α = 5.1523
et ß = 0.0821. Donc on peut écrire qp = 5.1523 µ + 0.0821. Selon Scriban (1999), les
cinétiques de croissance et de production sont étroitement découplées lors de la
production de composés intermédiaires
du métabolisme appelés métabolites
primaires. Il s'agit de molécules tels que les acides aminés et les vitamines nécessaires
aux synthèses cellulaires.
Ce découplage partiel entre la production d’acide lactique et la croissance a été
trouvé par Amrane et Prigent (1997) ; Kulozik et Wilde (1999) qui ont travaillé sur
une bactérie lactique thermophile Lactobacillus bulgaricus cultivée sur lactosérum
enrichi.
Le tableau XIV
résume les paramètres de
lactique dans les conditions optimales.
63
croissance et de production d'acide
Tableau XIV: les paramètres de croissance et de production d'acide
lactique dans les conditions optimales.
Pf(g/l)
13.31
Vm(g/l.h)
1.095
Le tableau XIV
qp(h-1)
Xf (g/l)
µ max (h-1)
2.17
2.368
0.412
Yp/s (%)
48.16
Yx/s (%)
9.68
α
β
5.1523
0.0821
fait apparaître que la croissance présente un maximum Xf = 2.368
g/l et µ max = 0.412 h-1avec un rendement de bioconversion de lactose en biomasse
Yx/s = 9.68 %.
En plus, la production atteint une valeur Pf = 13.31 g/l, Vm maximale = 1.095 g/l.h
avec un rendement de bioconversion de lactose en acide lactique Yp/s = 48.16 %.
64
La valorisation de lactosérum doux provenant de l'ORLAC de Draa Ben
Khedda par fermentation lactique sert, d'une part, à limiter la pollution engendrée par
ce sous - produit, d'autre part, à synthétiser un nouveau produit "Acide lactique" qui
trouve une grande gamme d'application dans les domaines : alimentaire,
pharmaceutique, cosmétique, textile….
D'après les résultats de l'analyse physicochimique du lactosérum doux issu de
la fabrication du camembert, on a conclu que ce milieu de culture présente une qualité
adéquat vu sa richesse en matières nutritifs : 57.9 g/l de lactose, 1.12 g/l de matière
azotée, 7 g/l de protéines, 1.75 g/l de chlorure et 0 g/l de matière grasse.
En général, les protéines solubles du lactosérum sont moins assimilables par
les bactéries lactiques et plus particulièrement Streptococcus thermophilus, c'est
pourquoi lors d'enrichissement de notre lactosérum par l’extrait de levure, la
croissance et la production d'acide lactique sont bien améliorées.
A l'échelle industriel, l'extrait de levure est un meilleur supplément mais le problème
qui se pose toujours, c'est son coût élevé.
L'adjonction de lactose comme source carbonée au lactosérum a permis aussi
d'améliorer la croissance et la production.
En effet, la production d'acide lactique par Streptococcus thermophilus S13 en
batch et à pH non contrôlé ( pH libre) sous les conditions optimales : T = 42°C, pH =
6,42 , Extrait de Levure = 1 % (10g/l) , lactose = 2 % (20 g/l), présente une
amélioration marquée de la croissance et de la production d'acide lactique où : Xf =
2.368 g/l,µ max = 0.412h-1 ,Pf= 13.31g/l et vm = 1.095g/l.h.
Pour comprendre les cinétiques de croissance et de production d'acide lactique,
il est nécessaire d'ajuster respectivement la biomasse (X) et la teneur en acide lactique
(P) en fonction du temps en utilisant un logiciel "ORIGIN".
65
Dans le but d'améliorer la performance de notre souche Streptococcus
thermophilus S13:
Il faut que la fermentation se déroule à pH contrôlé en utilisant comme agents
de neutralisation, hydroxyde de calcium, hydroxyde de sodium…ect. Cette
opération permet d'éviter l'inhibition par le pH.
Il faut travailler dans des conditions en continu pour empêcher l'inhibition
provoquée par l'accumulation de produit fini "Acide lactique".
Il faut travailler dans des cultures mixtes, en utilisant par exemple :
Lactobacillus bulgaricus ou Lactobacillus helveticus qui stimulent l’activité
de Streptococcus thermophilus.
66
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Matériels utilisés et réactifs:
•
Matériels:
Balance analytique de mark SCALTEC SBC52.
Bain-marie de mark memmert.
Bec bensen.
Centrifugeuse de mark CENTRO8 SELECTA.
Etuve de mark memmert.
Four à moufle.
Fermenteur.
pH-mètre de mark HANNA PH 209.
Plaque chauffante de mark VELP Scientifica.
Plaque chauffante+ agitateur VELP Scientifica.
Appareil de l'humidité de mark Sartoruis MA 45.
Appareil Kjedahl de mark VELP Scientifica.
Appareil Gerber de mark FUNKE.
Spectrophotomètre UV -VIS UV-9200.
Dessiccateur.
•
Réactifs:
Composition de milieu M17 en g/l :
- Tryptone………………………………………… 2.5
- Tryptone pepsique………………………………. 2.5
- Extrait de levure………………………………….. 5
- Extrait autolytique de levure……………………… 2.5
- Peptone papoinique……………………………… 5
- Lactose………………………………………….. 5
- Glycerphophate de sodium………………………. 19
- Sulfate de magnisium…………………………….. 0.25
- Acide ascorbique………………………………… 0.5
- Eau distillée………………………………………. 1000 ml
- pH………………………………………………... 7.7
Autoclaver à 120°C pendant 20min
Réactif cuproalcaline : (méthode de Bradford)
(C'est un mélange des solutions A et B)
•
Solution A:
- CUSO4, 5H2O……………………………………… 40g
- H2SO4 concentré…………………………………… 5 ml
- Eau distillée…………………………………………. 1000 ml
•
Solution B :
- Tartrate double potassium et sodium……………….. 200g
- Lessive de soude à 33 %.......................................... 375 ml
- Eau distillée………………………………………..... 1000 ml
Solution C: (solution ferrique)
- Fe (SO4)3…………………………………………… 50g
- H2SO4 concentré…………………………………… 200 ml
- Eau distillée………………………………………….1000 ml
• Préparation des tubes de conservation:
Lait écrémé
1 ml
Milieu M17
Incuber à 42°C pendant 24h
Si le tube devient trouble, on
ensemencera sur boite
M17
Incuber à 42°C pendant 24h, 48h
si il y a des petites colonies rondes
et blanches, on procédera à une
coloration de Gram
Coloration de Gram(voire annexe3)
Gram (+)
On met quelques colonies dans le tube
Gram (-)
Ensemencement d'un ml
Conserver à 4°C
Figure 10 : Préparation des tubes de conservation
Tubes de conservation :
Boite de pétri :
Tubes de conservation (milieu M17)
Petites colonies rondes et blanches
Streptococcus thermophilus S13
Avec Io>Ii
Figure 11 : Principe de Beer Lambert
•
Coloration de Gram :
- Récolter quelques colonies à l'aide d'une anse de platine;
- Puis, les étaler sur une lame en verre;
- Ajouter quelques gouttes d'eau distillée, ensuite flamber le dos de la lame;
- Plonger la lame dans un bain de violet de gentiane pendant 1 à 2 min, puis rincer à
l'eau;
- Plonger la lame dans un bain de lugol pendant 30 à 40 secondes, puis rincer avec
l'eau;
- Plonger la lame dans un bain d'alcool pendant 30 secondes, puis rincer avec l'eau;
- Plonger la lame dans un bain de fuchine pendant 40 secondes;
- Rincer et égoutter la lame, ajouter une goutte d'huile à immersion
- La lecture se fait sous microscope photonique:
Si on voit une coloration rose, la bactérie est GRAM négatif.
Si on voit une coloration violette, la bactérie est GRAM positif.
Résultat de coloration de Gram :
(Grossissement x 100)
Streptococcus thermophilus S13: cocci Gram (+)
•
Préculture:
Tube de 10ml de
milieu M17 liquide
préculture
•
Préparation de milieu de culture:
Lactosérum brut
Chauffage à 102°C
Pendant 5min
Filtration
Lactosérum traité
(déproteiné)
Préparation de milieu de culture
précipitation des protéines
* Dosage de l’azote total par méthode de Kjeldahl :
Mode opératoire :
1)- Minéralisation :
- Introduire dans les matras de Kjedahl 10 ml de lactosérum ;
- Ajouter 3g de catalyseur (1g de K2SO4 et 2g de CUSO4) ;
- Ajouter 15 ml de l’acide sulfurique concentré ;
- Placer les matras dans l’appareil de minéralisation de Kjedahl ;
- Déclencher le chauffage.
- lorsque le contenu devient limpide, maintenir le chauffage pendant 30min.
2)- Distillation :
- Verser dans le matras refroidi contenant la solution limpide 80ml d’eau distillée puis
80 ml de NaOH à 33%, l’extrémité de l’appareil est plongée dans un bécher contenant
25 ml d’acide sulfurique 0.1 N ;
- Mise en marche le distillateur( la distillation dure 15 min).
3)- Dosage :
L’ammoniac recueilli dans une solution titrée d’acide sulfurique (0.1N), dont l’excès
est dosé par NaOH 0.1N en présence d’indicateur coloré (phénophtaléine).
* Dosage de lactose par méthode de Bradford :
Mode opératoire :
1)-Défécation :
Dans une fiole jaugée de 200ml, introduire dans l’ordre :
- 20 ml de lactosérum ;
- 2 ml de solution d’héxacyanoferrate II de potassium (ferrocyanure de potassium) ;
- 2 ml de solution d’acétate de zinc ;
- 100 ml d’eau distillée ;
Agiter puis ajuster à 200 ml ;
Agiter, laisser reposer 15 min et filtrer.
2)-Oxydation de lactose et lavage du précipité de cu2o :
Dans une fiole d’erlenmyer de 150 ml, introduire :
- 20 ml de solution cuivrique (Solution A) ;
- 20 ml de solution tartaro-sodique (Solution B) ;
- 10 ml de filtrat de défécation ;
- 10 ml d’eau distillée ;
- Agiter, porter à ébullition douce et maintenir celle-ci pendant 3 min puis laisser
reposer.
- Préparer un filtre et l’adapter sur une fiole.
- Laver le précipité par décantation, à l’eau distillée bouillie, en évitant tout contact
avec l’air.
- Répéter les lavages jusqu’à obtention d’eau de lavage incolore.
3)-Réoxydation de cu2o et dosage de sel ferreux formé :
Laver la fiole, dissoudre dans une erlenmeyer contenant le précipité de cu2o par 20 ml
de solution ferrique acide, verser cette solution sur le filtre (même filtre utilisé dans
2).
4)-Titration :
Titrer par une solution de permanganate de potassium 0.1 N jusqu’à coloration rose
pale.
•
Courbe d'étalonnage de la biomasse :
y = 1,1285x
R2 = 0,9902
1,4
DO à 600 nm
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Concentration de biom asse en g/l
Figure 12:Courbe d'étalonnage de biom asse
Courbe d'étalonnage de l'acide lactique:
0,3
y = 0,3061x
R2 = 0,9901
0,25
DO à 425 nm
•
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Concentration d'acide lactique en g
Figure 13 :courbe d'étalonnage de l'acide lactique
1
Tableau VI:
Lactose hydraté exprimé en milligramme, en fonction du volume de la solution
KMn04 (0,1N). (Méthode de Bradford).
Volume
de
KMn04
0,1 N
(ml)
3,2
3,4
3,6
3,8
4,0
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
6,0
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
Lactose
hydraté
(mg)
14,9
15,8
16,9
17,8
18,8
19,8
20,7
21,7
22,7
23,6
24,1
24,6
25,1
25,6
26,1
26,6
27,1
27,6
28,0
28,5
29,0
29,5
30,0
30,3
31,0
31,5
Volume
de
KMn04
0,1 N
(ml)
6,7
6,8
6,9
7,0
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9
8,0
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
8,8
8,9
9,0
9,1
9,2
Lactose
hydraté
(mg)
32,0
32,5
33,0
33,5
34,0
34,5
35,0
35,5
36,0
36,5
37,0
37,5
38,0
38,5
39,0
39,5
40,0
40,5
41,0
41,5
42,0
42,5
43,0
43,5
44,0
44,5
Volume
de
KMn04
0,1 N
(ml)
9,3
9,4
9,5
9,6
9,7
9,8
9,9
10,0
10,1
10,2
10,3
10,4
10,5
10,6
10,7
10,8
10,9
11,0
11,1
11,2
11,3
11,4
11,5
11,6
11,7
11,8
Lactose
hydraté
(mg)
45,0
45,5
46,0
46,5
47,1
47,6
48,1
48,6
49,1
49,6
50,1
50,6
51,2
51,7
52,2
52,7
53,2
53,7
54,2
54,7
55,3
55,8
56,3
56,8
57,4
57,9
Volume
de
KMn04
0,1 N
(ml)
11,9
12,0
12,1
12,2
12,3
12,4
12,5
12,6
12,7
12,8
12,9
13,0
13,1
13,2
13,3
13,4
13,5
13,6
13,7
13,8
13,9
14,0
14,1
14,2
14,3
14,4
Lactose
hydraté
(mg)
58,4
58,9
59,9
60,0
60,5
61,0
61,5
62,1
62,6
63,1
63,6
64,1
64,7
65,2
65,7
66,2
66,8
67,3
67,8
68,4
68,9
69,4
69,9
70,5
71,0
71,5
Volume
de
KMn04
0,1 N
(ml)
14,5
14,6
14,7
14,8
14,9
15,0
Lactose
hydraté
(mg)
72,0
72,6
73,1
73,6
74,1
74,7
Tableau X : composition de l'extrait de levure (Ghaly et al ,2003)
Composition
%
- Humidité
30
- Azote total
8.8
- Protéine
55
- Solubilité (mg/l) à 30°C
3000-1000
Acides aminés
% de totale
- Alanine
3.4
- Acide aminobutyrique
0.1
- Arginine
2.1
- Asparagine
3.8
- Cystine
0.3
- Acide glutamique
7.2
- Glycine
1.6
- Histidine
0.9
- Isoleucine
2.0
- Leucine
2.9
- Lysine
3.2
- Methionine
0.5
- Orthonine
0.3
- Phenylalanine
1.6
- Praline
1.6
- Serine
1.9
- Threonine
1.9
- Tyrosine
0.8
- Valine
2.3
Sels minéreux
%
- Nacl
<1
- Cuivre
--- Fer
--- Magnésium
--- Potassium
--- Sodium
--Vitamines
ppm
- Thiamine
20-30
- Riboflavine
50-70
- Pyridoxine
25-35
- Niacinamide
600
- Acide pontothenique
200

Boudjema, Khaled

Transcription

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