Boudjema, Khaled
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Boudjema, Khaled
ﺍﻝﺠﻤﻬﻭﺭﻴﺔ ﺍﻝﺠﺯﺍﺌﺭﻴﺔ ﺍﻝﺩﻴﻤﻘﺭﺍﻁﻴﺔ ﺍﻝﺸﻌﺒﻴﺔ République Algérienne Démocratique et Populaire ﻭﺯﺍﺭﺓ ﺍﻝﺘﻌﻠﻴﻡ ﺍﻝﻌﺎﻝﻲ ﻭ ﺍﻝﺒﺤﺙ ﺍﻝﻌﻠﻤﻲ Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique أ ة – داس Université M’Hamed Bougara – Boumerdès Faculté des sciences Département de Biologie En vue de l’obtention du Diplôme de Magister en Biologie Option : biochimie et microbiologie appliquées Présenté et soutenu publiquement par Mr Boudjema Khaled L e 27/ 02/ 2008 Essai d'optimisation de la production d’acide lactique sur lactosérum par Streptococcus thermophilus Devant la commission d’examen composée de : Mr Louerguioui A …....Maître de conférence (UMBB)………….…….........Président Mme Hellal A ………….Professeur (ENP)……………………………………Promotrice Mme Fazouane F……….Maître de conférence (UMBB)……………………..Co-promotrice M me Alouane R ………Maître assistante (UMBB)……………………….....Examinatrice Mr Madani K. ……….Maître de conférence (Université de Béjaia)…........Examinateur Mme Mechakra A……...Maître de conférence (Université de Constantine)..Examinatrice Année universitaire 2007/2008 Remerciements : Ce travail a été réalisé au laboratoire de biochimie et microbiologie appliquées (UMBB) ainsi qu’au niveau de laboratoire de contrôle de qualité –Tipaza, sous la direction de Madame Hellal A, professeur à l’Ecole National Polytechnique (ENP) El Harrach. Je tiens à la remercier pour m’avoir proposé ce sujet, pour ces conseils et son suivi durant la période de réalisation de ce travail avec toute la patience. Mes vifs remerciements vont aussi : A Madame Fazouane F, maître de conférences (UMBB), pour ces conseils et son aide. A Monsieur Louerguioui A, maître de conférence (UMBB), pour avoir bien voulu nous faire l’honneur de présider ce mémoire. A Madame Alouane R, maître assistante (UMBB), pour avoir accepté d’examiner ce mémoire. A Madame Mechakra A, maître de conférence (Université de Constantine), pour avoir bien voulu nous faire l’honneur de participer au jury. A Monsieur Madani K, maître de conférence (Université de Béjaia), pour avoir accepté de participer au jury et contribuer à l’examination de ce travail. Mes remerciements sont également adressés à tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin. :ا ه! ع ا ا ر اارة ا آ أStreptococcus thermophilus S13 /0وط ا3د ا4! إ6 7 ارا89 ه: /4 .(+) ل$آ%* ) ا(د & ا $آ%? ا*رع ا> إج <& ا7 6@ إ,( pH ا*; و ا; )در اارة و G( B .AB ا ا(*وع او(ت وا4> اD E%Fا ا( ع ا ا9 هF7 ا ,م°42 أن در اارة/ إ6@ ة إH ذوJKا ا9 أن ه4> اD ;ا> ا*; و ا !6 ( اU FH ا ا7 % 2 ة و آS اTSU %1 آ6@ إ, 6.42= pH F7 اHU و ا1-7 0.412 ى بDB ا( اH7 رتE أ$آ% ي و إج <& اSا( ا .7.ل/ غ1.095 & ب bc لD ا$( هGd e إذ اPiret وLuediking ( ذجa_S Sا ا9 ا(;` أ_ أن هG( B .جfا( وا ,$آ% إج <& ا, /0وط ا3د ا4 إ, Streptococcus thermophilus S13: آت اح . ذج, ا4> اD Abstract: Streptococcus thermophilus S13 is themophilic and homolactic lactic acid bacteria strain which produces only L(+) lactic acid .The aim of this study consists of the optimization of physicochemical parameters (temperature and pH) , and also the culture medium for producing lactic acid by this bacterium on deproteinized and sterilized sweet cheese whey. The physicochemical analysis of cheese whey showed that it presents a suitable quality. The temperature 42°C, pH = 6.42, adding about 1% of yeast extract and 2% of lactose improved the cell growth and also the lactic acid production where µm = 0.412 h-1 and vm =1.095g/l.h. This fermentation followed Luediking and Piret model where it showed the light dissociation between growth and lactic acid production. Key words: Streptococcus thermophilus S13, optimization, lactic acid production sweet cheese whey, model. Résume: Streptococcus thermophilus S13 est une souche de bactéries lactiques thermophiles et homolactique qui produit uniquement l'acide L (+) lactique. L'objectif de cette étude consiste en une optimisation des paramètres physicochimiques (température et pH) ainsi que le milieu de culture pour produire l'acide lactique par cette bactérie sur lactosérum doux déproteiné et stérilisé .Les analyses physicochimiques de lactosérum ont montré que ce dernier présente une qualité adéquat. La température 42°C, pH=6.42, l'adjonction de 1% d'extrait de levure et 2% de lactose ont amélioré la croissance cellulaire ainsi que la production d'acide lactique où µm = 0.412 h-1 et vm =1.095 g/l.h. Cette fermentation a suivi le modèle de Luediking et Piret où elle a mis en évidence un léger découplage entre la croissance et la production d'acide lactique. Mots clé: Streptococcus thermophilus S13, optimisation, production d'acide lactique. Lactosérum doux, modèle. Introduction…………………………………………………………………………...1 I - Synthèse bibliographique Chapitre I: les bactéries lactiques. 1-Historique……………………………………………………………………….....3 2-Définition…………………………………………………………………………..3 3-Caractéristiques générales des bactéries lactiques………………………….……...3 4-Classification………………………………………………………………………4 5-Exigences nutritionnelles……………………………………….……………….....5 5.1- Exigence en acides aminés……………………………………………………...5 5.2- Exigence en vitamines…………………………………………………………..5 5.3- Exigence en bases azotées…………………………………................................5 5.4- Exigence en cations……………………………………………..........................5 6- Rôles des bactéries lactiques…………………………………….………………..6 6.1-Domaine alimentaire………………………………………………………….….6 6.2-Domaine de la santé……………………………………………………………..6 7- Streptocoques thermophilus………………………………………………………7 7.1- Caractéristiques de Streptococcus thermophilus..................................................7 7.2- Métabolisme de lactose chez Streptococcus thermophilus..................................8 Chapitre II: Lactosérum. 1-Définition et caractéristiques du lactosérum…………………………………..…11 2-Différents types de lactosérum…………………………………............................11 3-Composition de lactosérum…………………………………………………..…...11 4-Valorisation de lactosérum……………………………………..………………....13 4.1- Alimentation humaine………………………………………………….…..…..13 4.2- Alimentation animale…………………………….....………………………….13 4.3- Lactosérum substrat de fermentation………………………..............................13 Chapitre III: Acide lactique. 1- Historique………………………………………………………….……………14 2-Définition et caractéristiques…………………………………………….…..........14 3-Voies de synthèse de l'acide lactique………………………………………..........15 4-Application de l'acide lactique………………………………………….…….…..16 4.1-Industrie alimentaire…………………………………………….……………....16 4.2-Secteur pharmaceutique ou médical…………………………………………….16 4.3-Agriculture……………………………………………………..……………….16 4.4-Secteurs industriels divers………………………………………..…………….17 Chapitre IV: Fermentation lactique et production d'acide lactique. 1-Définition de la fermentation lactique…………………………………………....18 2-Différents types de fermentation lactique………………………………….……..18 3-Production d'acide lactique par fermentation lactique……………………..…......18 3.1- Cinétique de croissance bactérienne…………………………………..……….18 3.1. 1- Phase de latence…………………………………………………..………....19 3.1.2-Phase d'accélération……………………………………………………...…...19 3.1.3- Phase logarithmique (exponentielle)………………………………….….…..19 3.1.4- Phase de ralentissement……………………………………………………....19 3.1.5- Phase stationnaire………………………………………………………….....19 3.1.6- Phase de décroissance exponentielle ou de déclin………………….………..19 3.2- Paramètres de croissance……………………………………………..………..19 3.2.1- Temps de génération………………………………………………….….......19 3.2.2-Taux de croissance…………………………………………………….……...20 3.2.3-Rendement métabolique………………………………………………………20 3.3- Cinétique d'acidification……………………………………………………......21 3.4-Facteurs influençant les cinétiques de croissance et d'acidification…………….21 3.4.1- Taille de l'inoculum…………………………………………………………..21 3.4.2 - Température…………………………………………………………………22 3.4.3 - pH………………………………………………………………………..….22 3.4.4 - Aération et agitation…………………………………………………….…...22 3.4.5 - Concentration en substrat……………………………………………………23 3.4.6 - Substances antimicrobiennes…………………………………………….......23 3.5-Modélisation de la croissance et de la production d'acide lactique………….…23 3.5.1- Modélisation de la croissance microbienne…………………………………..24 3.5.2- Modélisation de la production d'acide lactique……………………….……...25 3.5.3-Modélisation de la cinétique de consommation de substrat……………..…...26 II-Partie expérimentale II.1 - Matériels et méthodes: 1- Objectif du travail ………………………………………………………………28 2- Matériels utilisés et réactifs.………………………………………………..……28 3- Matériel biologique……………………………………………………….……..28 4- Préparation des tubes de conservation ………………………………….………28 5- Milieu de culture…………………………………………………………..…….28 6- Conduite de la culture……………………………………………………………29 6.1- Préparation de préculture……………………………………………….……..29 6.2- Culture ………………………………………………………………..……....29 7- Mesure de la densité optique et de poids sec………………………..……….....29 7.1- Mesure de densité optique…………………………………………………….29 7.2- Mesure du pois sec………………………………………………..…………..30 8- Détermination des paramètres de croissance et de production……………….....30 8.1- Vitesse de spécifique croissance ……………………………………………..30 8.2- Vitesse moyenne d'acidification……………………………………..…….…..30 9- Méthodes analytiques…………………………………………………………...31 9.1-Mesure de pH…………………………………………………………………..31 9.2- détermination de la matière sèche…………………………………….…….…31 9.3- Dosage des cendres………………………………………………..…….…....31 9.4- Détermination de chlorures……………………………………..………….....31 9.5- Dosage de matière grasse………………………………………….…………..32 9.6- Dosage de l'azote total………………………………………………………...32 9.7- Détermination de la teneur en protéines…………………………….………...33 9.8- Dosage de lactose par méthode de Bradford…………………………..……...33 9.9- Détermination de la teneur de l'acide lactique………….……………………..34 9.9.1- Principe……………………………………………….………………….....34 9.9.2 - Mode opératoire………………………………………………….….…......34 9.9.2.1 - Précipitation des substances gênant l'opération…………………………..34 9.9.2.2 - Réaction colorée……………………………………...…………………..34 9.9.2.3 -Courbe étalon…………………………………………...........................…34 9.9.2.4 - Expression des résultats………………………………………………….35 II.2 - Résultats et discussion : 1- Composition biochimique de lactosérum……………………………….……….36 2- Optimisation de la fermentation en batch………………………………………...37 2.1- Optimisation des paramètres physicochimiques……………………………......37 2.1.1- Effet de température……………………………………………………….…37 2.1.2- Effet de pH……………………………………………………………..…….41 2.2- Optimisation des paramètres liés au milieu de culture………………………....47 2.2.1-Effet de l'extrait de levure……………………………………………..…........47 2.2.2- Effet de la concentration de lactose…………………………………………..51 3- Production d’acide lactique dans les conditions optimales………………………56 4- Modélisation de la croissance et la production d’acide lactique…………………58 4.1- Modélisation de la croissance bactérienne……………………………………..58 4.2- Modélisation de la production d’acide lactique………………………………...60 4.3- Relation entre la croissance et la production d’acide lactique………………….61 Conclusion…………………………………………………………………………...65 Références bibliographiques………………………………………………………...67 Annexe. Listes des figures: Figure 1: Streptococcus thermophilus……………………………………………....7 Figure 2: transport et métabolismes du lactose, glucose et le galactose chez les bactéries lactiques…………………………………...……………………………….10 Figure 3: les deux isomères de l'acide lactique……………………………………...14 Figure 4: les deux voies de production d'acide lactique…………………………….15 Figure 5: luttes contre les verroas…………………………………………..............16 Figure 7: les voies de fermentation lactique…………………………………...........18 Figure 8: Courbe de croissance d'une culture bactérienne en discontinue……..........19 Figure 9: Evolution du taux de croissance en fonction du temps…………………...20 Figure 10: Préparation des tubes de conservation…………………………...(annexe2) Figure 11: Principe de Beer lambert…………………………………..…....( annexe2) Figure 12: Courbe d'étalonnage de biomasse…………………………….…( annexe5) Figure 13: Courbe d'étalonnage de l'acide lactique…………………………( annexe5) Figure 14: Evolution de biomasse en fonction du temps à différentes températures et à pH constant…………………………………………………………………………38 Figure 15: Evolution de pH en fonction du temps à différentes températures et à pH constant………………………………………………………………………………38 Figure 16: Evolution de concentration d'acide lactique en fonction du temps à différentes températures et à pH constant…………………………………………....38 Figure 17: Evolution de la concentration de lactose en fonction du temps à différentes températures…………………………………………………………..…38 Figure 18: Evolution de taux de croissance maximal en fonction de températur…...39 Figure 19: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction température...39 Figure 20: Evolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps à T=42°C et à pH constant……………………………………………………......41 Figure 21: Evolution de biomasse en fonction du temps à différents pH et à T=42°C……………………………………………………………………………….43 Figure 22: Evolution de pH en fonction du temps à différents pH et à T= 42°C…...43 Figure 23: Evolution de la concentration l'acide lactique en fonction du temps à différents pH et T=42°C……………………………………......................................43 Figure 24: Evolution de concentration de lactose en fonction du temps à différents pH et à T=42°C............................................................................................................43 Figure 25: Evolution de taux de croissance maximal en fonction de pH…………...44 Figure 26: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction de pH……….44 Figure 27: Evolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps à T=42°C et pH = 6,42…………………………………………………………….....46 Figure 28: Evolution de biomasse en fonction du temps à différentes concentrations en extrait de levure et à T= 42°C………………………………………………...…..48 Figure 29: Evolution de pH en fonction du temps à différentes concentrations d'extrait de levure et à T= 42°C………………………………………………….….48 Figure 30: Evolution de la concentration d'acide lactique en fonction du temps à différentes concentrations d'extrait de levure et à T= 42°C………………………..48 Figure 31: Evolution de lactose en fonction du temps à différentes concentrations d'extrait de levure et à T= 42°C………………………………………………..…..48 Figure 32: Evolution de taux de croissance maximal en fonction de concentration d'extrait de levure………………………………………………………………..…..50 Figure 33: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction de concentration d'extrait de levure……………………………………………………………………50 Figure 34: Evolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps à T= 42°C et à EL = 1%.............................................................................................51 Figure 35: Evolution de biomasse en fonction du temps à différentes concentrations de lactose et à T= 42°C…………………………………………………………….52 Figure 36: Evolution de pH en fonction du temps à différentes concentrations de lactose et à T= 42°C…………………………………………………………..……53 Figure 37: Evolution de la teneur en acide lactique en fonction du temps à différentes concentrations de lactose et à T= 42°C…………………………………………....52 Figure 38: Evolution de concentration de lactose en fonction du temps à différentes concentrations de lactose et à T= 42°C…………………………………………….53 Figure 39: Evolution de taux de croissance maximal en fonction concentration de lactose…………………………………………………………………………..….54 Figure 40: Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction de concentration de lactose………………………………………………………..………………….54 Figure 41: Evolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps à T=42°C et à Lac = 2%...........................................................................................55 Figure 42: Evolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps dans les conditions optimales T= 42°C, pH= 6.42, EL= 1%, lac= 2%.....................57 Figure 43: Ajustement de concentration de biomasse en fonction du temps..........58 Figure 44 : Ajustement de taux de croissance en fonction de concentration d'acide lactique…………………………………………………………………………..…...60 Figure 45: Ajustement de concentration d'acide lactique en fonction du temps…….61 Figure 46: Evolution de vitesse spécifique de croissance et vitesse spécifique de production en fonction du temps dans les conditions optimales: T= 42°C, pH= 6.42, EL= 1% et lac= 2%.....................................................................................................62 Figure 47: Evolution de vitesse spécifique de production en fonction de vitesse spécifique de croissance…………………………………………………………...…63 Liste des tableaux: Tableau I: principales bactéries lactiques ……………………………………………4 Tableau II: les différents types de lactosérum……………………………………....12 Tableau III: teneur en vitamine dans le lactosérum………………………………....12 Tableau IV: températures optimales de Streptococcus thermophilus et leurs critères d'adaptation…………………………………………………………………………...22 Tableau V : principaux modèles descriptifs appliqués à la croissance bactérienne…24 Tableau VI: la quantité de lactose hydraté, exprimée en mg en fonction du volume de la solution de KMno4 (0,1 N)………………………… …………………....(annexe 6 ) Tableau VII: composition biochimique du lactosérum doux provenant de L'ORLAC de Draa Ben Khedda……………………………………………………………….....36 TableauVIII: conditions opératoires concernant l'optimisation de température……37 Tableau IX: conditions opératoires concernant l'optimisation de pH………………42 Tableau X: composition de l'extrait de levure………………………………(annexe 7) Tableau XI : conditions opératoires concernant l'optimisation de la concentration d'extrait de levure………………………………………………………………….…47 Tableau XII: conditions opératoires concernant l'optimisation de la concentration de lactose.. ……………………………………………………………………………....52 Tableau XIII: conditions optimales…………………………………………………56 Tableau XIV: les paramètres de croissance et de production d'acide lactique dans les conditions optimales…………………………………………………..………….64 Liste des abréviations: - t : temps - DO : densité optique - l : Litre - Min : minute - P : produit - X: biomasse - f: final - i: initial - MT: million tones - Lac: concentration de lactose - EL : concentration d’extrait de levure. - µ : taux de croissance - Vm : vitesse moyenne d’acidification - qp : vitesse spécifique de production - ATP: Adénosine Tris phosphate. - µm : vitesse spécifique de croissance maximale. - Yp/s : rendement de conversion du substrat en produit. - Yx/s : rendement de conversion du substrat en biomasse. - T: température. - pH: potentiel d'hydrogène. - α : coefficient lié à la croissance. - β : coefficient de production lié au maintien. - D°: degré dornic. - Aw : activité de l'eau. - ADP: Adenosine Di Phosphate. - NAD: Nicotinamide Adenosine Diphosphate. Introduction : Le monde a connu un développement très important dans le secteur industriel tandis qu'il y a toujours des risques et des conséquences néfastes sur l'environnement et la santé publique. Pour cela, les écologistes et les biologistes se sont intéressés depuis longtemps aux procédés et techniques qui servent à limiter la pollution engendrée par les industries. Parmi ces dernières, l'industrie laitière est une des plus polluantes par le rejet de quantités importantes de lactosérum. Du fait de sa richesse en élément nutritif tels que lactose, protéine solubles, vitamines hydrosolubles, matières grasses et les éléments minéraux, le lactosérum constitue un excellent milieu de culture pour les microorganismes, ce qui fait de lui un facteur de pollution redoutable (Agnes, 1986). Il affecte les structures physiques et chimiques du sol, de même, il réduit la vie aquatique en captant l'oxygène dissous (Panesar et al, 2007). En effet un litre de lactosérum présente une demande biochimique en oxygène (DBO) élevée qui varie entre 35 et 60 g/l (Goursaud, 1985). Pour diminuer le risque polluant du lactosérum, ce dernier est utilisé dans différents domaines tels que l'alimentation humaine, l'alimentation animale et éventuellement dans le domaine de la biotechnologie afin de produire des protéines d'organismes unicellulaires (P.O.U.), enzymes, vitamines, alcool, acides organiques (acide citrique, acide lactique,…etc). Beaucoup de chercheurs se sont intéressés à produire l'acide lactique à partir de lactosérum en procédant à une fermentation lactique, car cet acide à une large application dans plusieurs secteurs tels que: alimentaire, pharmaceutique, textile et cosmétique. De même, la demande globale en acide lactique est estimée en 70,000 MT. Cette demande peut dépasser 200,000 MT en 2011 (Lin et al, 2006). En Algérie, L'ORLAC de Draa Ben Khedda qui produit le camembert, déverse quotidiennement dans les cours d'eau, en moyenne 11 m3 d'eau résiduaire dont la grande partie représente le lactosérum. 1 Dans le but de la valorisation du lactosérum, nous nous sommes intéressés à la production d’acide lactique par fermentation du lactose en utilisant une souche bactérienne sélectionnée pour son pouvoir acidifiant. Notre étude a porté sur : - Etude de la composition du lactosérum doux qui provient de l'ORLAC de Draa Ben Khedda - Optimisation des conditions physico-chimiques de l’activité de la bactérie utilisée - Optimisation du lactosérum en tant que substrat de culture - Optimiser les paramètres de croissance et d'acidification telles que la vitesse spécifique de croissance (µ) et la vitesse moyenne d'acidification (vm). - Production d'acide lactique dans les conditions optimales. - Etablissement d’un modèle mathématique de fermentation. 2 1-Historique: Les bactéries ont été utilisées pour la fermentation des aliments depuis plus de 4000 ans sans pour autant comprendre la base scientifique de leur utilisation, mais tout en essayant de produire des aliments de meilleure conservation et de meilleure qualité (Saloffe Coste, 1994). Ce n'est qu'à la fin du 19eme siècle, époque des grandes découvertes de la microbiologie, que certains chercheurs ont pu isoler un streptocoque (Poullain, 1994). 2- Définition: Le groupe des bactéries lactiques, a été défini pour la 1ère fois par Orla-jensen (1919), réunit plusieurs genres caractérisés par leurs capacités à fermenter les glucides en produisant de l'acide lactique (Novel, 1993). Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes, hétérotrophes et chimioorganotrophes (De Roissart, 1986). 3- Caractéristiques générales des bactéries lactiques: Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif, immobiles, asporulées, catalase et oxydase négatives, nitrate réductase négative, anaérobies ou aérotolérantes. (Laurent et al, 1998). - Les bactéries lactiques sont des cocci ou des bâtonnet (Bourgeois et Larpent, 1996). - Elles ont des besoins complexes en facteurs de croissance: vitamine B, acide aminés, peptides, bases puriques et pyrimidiques. - Certaines bactéries lactiques ont été isolées de nombreux milieux naturels végétaux et animaux tels que le lait cru, l'environnement, les cavités buccales et vaginales… (Luquet, 1986). - Elles produisent des quantités abondantes d'acide lactique par fermentation de substances hydrocarbonées. - Elles se caractérisent par un métabolisme exclusivement fermentaire qui les conduit à produire a partir du glucose des quantités importantes d'acide lactique, accompagné dans certains cas d'autres métabolites (éthanol, CO2, autres acides organiques). - Elles ont une capacité de biosynthèse faible (Luquet, 1986). 3 4- Classification: La taxonomie des bactéries y compris les bactéries lactiques évolue depuis la première classification d'Orla-jensen (1919), qui a été basée sur la nature et le pourcentage de l'acide lactique produit, la température de croissance et les exigences azotés. Selon Lenoir et al (1992), il existe deux grands groupes morphologiquement bien distincts: les cocci et les bacilles. L'application de l'hybridation des acides nucléiques et des techniques de séquençage conduit à diviser les coques en 05 groupes: Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus et Leuconostoc. Le tableau I présente les principaux critères de différentiation entre les genres des bactéries lactiques: Tableau I : principales bactéries lactiques (Sutra et Federighi ., 1998). Genre Lactobacillus Morphologie Fermentation bacilles Température Nombre d'optimisation d'espèces homofermentaires ou Thermophiles ou Groupe I:23 hétérofermentaires Groupe I:16 mésophiles Groupe I:22 Carnobacterium bacilles hétérofermentaires psychrotrophes 6 Lactobacoccus coques homofermentaires mésophiles 5 Streptococcus coques homofermentaires Thermophiles ou mésophiles 19 Enterococcus coques homofermentaires mésophiles 13 Vagococcus Coques mobiles homofermentaires mésophiles 2 Pediococcus Coques en homofermentaires mésophiles 7 en homofermentaires mésophiles 1 tétrades Tetragenococcus Coques tétrades Leuconostoc coques hétérofermentaires mésophiles 11 Oenococcus coques hétérofermentaires mésophiles 1 Bifidobacterium Forme Acide et mésophiles 25 irrégulière lactique acétique 4 5- Exigences nutritionnelles: Les bactéries lactiques ont une faible aptitude biosynthétique et sont en principe incapables d'assimiler directement les principaux précurseurs de leur environnement. Elles sont considérées comme un groupe bactérien le plus exigeant du point de vue nutritionnel, car elles requièrent non seulement des substrats complexes carbonés, azotés, phosphatés et soufrés mais aussi des facteurs de croissance comme les vitamines et les oligoéléments dont le rôle des cœnzymes est plus important (Lenoir et al, 1992). 5.1- Exigences en acides aminés: Les bactéries lactiques sont en principe incapables d'effectuer la synthèse des acides aminés, et doivent par conséquent faire appel à des sources exogènes pour assurer leur métabolisme (Luquet, 1986). Les exigences en acides aminés des Streptococcus sont différentes de celles des lactobacilles, ils ont besoin d'acide glutamique, d'histidine, de cystéine, de méthionine et aussi de valine, de leucine, de tryptophane ou de tyrosine. Les lactobacilles ont besoin d'aspartate, d'histidine, de lysine, de leucine, de méthionine et de valine (Lenoir et al, 1992). 5.2- Exigences en vitamines Les bactéries lactiques sont incapables de synthétiser les vitamines qui jouent un rôle irremplaçable de cœnzymes dans le métabolisme cellulaire. Streptococcus thermophilus a une exigence absolue en acide pantothénique (B5) et en riboflavine (B2) et à moindre degré en thiamine (B1), en nicotinamide ou en acide nicotinique (B3) et en biotine (B8). La pyridoxine ou ses dérives (B6) stimulent fortement sa croissance (Desmazeaud M., 1983). 5.3- Exigences en bases azotées: Les bases puriques et pyrimidiques ne sont pas vraiment essentielles au métabolisme des bactéries lactiques (Desmazeaud M., 1983). 5.4- Exigences en cations: Boyaval et al (1988) ont montré le rôle précis des cations dans la résistance à l'oxygène, dans les différentes réactions métaboliques et dans la nutrition des bactéries lactiques. Amouzou et al (1985) ont montré le rôle de Mg2+ sur 5 Streptococcus thermophilus. La forme ionisée entraîne une activation de la fermentation lactique par une meilleure utilisation des sucres. 6- Rôles des bactéries lactiques: 6.1-Domaine alimentaire : 6.1.1- Rôle sur la structure et la texture : Dans les laits fermentés, l'acidification provoque la formation d'un callé plus ou moins ferme selon les bactéries lactiques présentes. Selon les produits, la texture recherchées est ferme (yaourt ferme) ou onctueuse (yaourt brassé, kéfir).Pour obtenir une consistance déterminée, l'utilisation de souches plus ou moins acidifiantes peut être combinée à celle de souches productrices de polysaccharides (Sutra et Federighi ., 1998). 6.1.2-Rôles dans la conservation : - Production d'acide lactique : les bactéries lactiques ont un rôle important dans l'inhibition des flores non lactiques. - Production de bactériocines : ces peptides antimicrobiens sont synthétisés par un très grand nombre de souches de bactéries lactiques .Ils sont généralement thermorésistants, actifs uniquement sur les bactéries à Gram positif (Laurent et al., 1998). 6.1.3- Rôles sur les caractéristiques organoleptiques : par production en dehors de l'acide lactique, d'autres produits tels que le diacétyle et l'acétaldéhyde, qui sont responsables des flaveurs caractéristiques (Sutra et Federighi ., 1998). 6.2-Domaine de la santé : Les bactéries lactiques assurent : - L'amélioration de la digestibilité du lactose; - L'abaissement du taux de cholestérol sanguin; - Des effets sur l'activation du système immunitaire; 6 - L'inactivation de composés toxiques et la protection contre certaines infections intestinales (Laurent et al., 1998). 7- Streptococcus thermophilus : Selon Bergey (2004), le genre Streptococcus est classé en (06) catégories: - Streptocoques pyogènes; - Streptocoques oraux; - Streptocoques fécaux; - Les Streptocoques lactiques ou lactocoques du groupe sérologique N, faiblement hémolytiques, mais jamais pathogènes; - Les Streptocoques anaérobies stricts; - Les autres Streptocoques de groupe sérologique inconnu, hétérogènes faiblement ou non hémolytiques, parmi les quels on trouve l'espèce non pathogène Streptococcus thermophilus. 7.1- Caractéristiques de Streptococcus thermophilus: Streptococcus thermophilus se présente sous forme de cellules sphériques ovoïdes (0,7 à 0,9 nm de diamètre) en paires, en chaînettes ou en longue chaîne (Terre, 1986) (figure 1). Figure 1 : Streptococcus thermophilus - C'est l'une des espèces les plus thermorésistantes car elle survie à un chauffage de 65°C pendant 30 min (Larpent, 1991). - Elle est halotolérante (2-4%) de NaCl et fermentaire en produisant exclusivement de l'acide lactique. Elle dégrade le lactose et le saccharose mais attaque aussi le fructose et le glucose (Torriani et al, 1997). 7 - Cette espèce est capable de synthétiser les exopolysaccharides (EPS) soit en monoculture, soit en association avec la souche Lactobacillus bulgaricus (Novel, 1993). - Elle possède une β galactosidase active en présence de cations monovalents ou divalents Mg2+, Mn2+ (Desmazeaud, 1990). - Elle se trouve dans le lait et produits laitiers. - Absence d'antigène de groupe qui caractérise également cette espèce (Accolas et al, 1980). - Elle contient environ 40% de G+C dans son ADN (Terre, 1986). - Elle a une température de croissance de 37°C à 45°C et non pas à 10°C (Accolas et al, 1980). 7.2- Métabolisme de lactose chez Streptococcus thermophilus: Le lactose est le sucre fermentescible du lactosérum, il sera tout d'abord hydrolysé en galactose et en glucose, ensuite converti en acide lactique (Beal et Sodini, 2003). L'entrée du lactose dans la cellule est réalisée grâce à l'activité d'une enzyme membranaire : Lactose perméase-dépendante. Le lactose est hydrolysé en glucose et galactose sous l'action d'une enzyme β galactosidase ou phospho- β galactosidase. Le glucose rejoint alors la voie glycolytique d’Embden Meyerhof Parnas (EMP) pour former le pyruvate (figure 2). Le galactose se transport chez les bactéries lactiques homo- fermentaires par plusieurs mécanismes, deux de ces voies nécessitent une translocalisation phosphorylante du sucre par l'intermédiaire des systèmes lactose ou galactose –PT, puis une dégradation du galactose 6 phosphate intracellulaire par la voie D tagatose - 6 phosphate. Le galactose peut être transporté de façon active sous forme de sucre libre, par l'intermédiaire d'un système perméase au dépend de l'énergie délivrée par l'ATP (figure2) (Desmazeaud, 1983). 8 Les études de Thompson et Centy-Wees (1994) sur les mécanismes de transport de glucides par Streptococcus thermophilus, ont montré qu’elle croit faiblement sur le galactose. Pour cela, il semble que le phénotype galactose (-) pourrait être du à une incapacité de ces bactéries à assurer le transport de sucre. 9 Figure 2: Transport et métabolisme du lactose, glucose et galactose chez les bactéries lactiques thermophiles (Desmazeaud, 1983). 10 1- Définition et caractéristiques du lactosérum : Le lactosérum est un sous produit de la fromagerie et de la caséinerie, c'est un liquide surnageant jaune verdâtre, son pH compris entre 5 et 6,5. Il représente près de 90% du lait mis en œuvre. (Kosikowski, 1979 ; Mereo, 1980). 2- Différents types de lactosérum: Selon le type de fromage ou de caséine produit et donc la coagulation employée acide, présure ou mixte, on distingue deux types de lactosérum (Boudier et Luquet, 1980): • Le lactosérum obtenu par coagulation du lait par la présure, et provenant de la fabrication des fromages à pâtes molles et à pâtes pressées (l'acidité est inférieure à 18°D), est appelé lactosérum doux. • Le lactosérum obtenu par coagulation lactique et provenant soit de la fabrication des fromages de type pâtes fraîches et pâtes molles ou de la fabrication de caséines lactiques et acides (l'acidité est supérieure à 18°D), est appelé lactosérum acide. 3- Composition de lactosérum: La composition moyenne de différents types de lactosérum est indiquée par le tableau II. 11 Tableau II: composition de différents types de lactosérum (Sottiez, 1990) Lactosérum doux Pâte Pâte pressée pressée non cuite cuite (Edam) Lactosérum acide Lactosérum déprotéiné camembert Pâte fraîche perméat Caséine doux (Emmenta d'ultrafiltrati l) on Liquide (%) 93,5 95 93,5 94 94 - extrait sec en % 6,5 5,00 6,50 6,00 6,00 4,50 pH 6,70 6,50 6,10 6,00 4,60 6,40 Lactose 76,00 75,00 75,00 65,5 74,00 85,00 Protéines 13,50 13,50 12,00 12,00 12,00 4,00 Cendres 8,00 8,00 8,25 9,00 12,00 9,00 Acide lactique 1,80 2,80 2,20 10,00 1,80 2,00 Matière grasse 1,00 1,00 1,00 0,50 0,50 0,00 Ca en % 0,60 0,65 0,70 1,90 1,80 0,60 P en % 0,60 0,65 0,70 1,50 1,50 0,60 Chlorure (NaCl) 2,50 2,50 2,50 2,50 7,50 2,80 Composition en g/l Matière minérale Dans cette composition sont retrouvées les vitamines qui sont des vitamines hydrosolubles, parmi eux, on note des quantités importantes de riboflavine (B2) ce qui donne la couleur jaune verdâtre du lactosérum; d'acide pantothénique (B5); thiamine (B1); de pyridoxine (B6) et l'acide ascorbique (Woo, 2002). Le tableau ci-dessous donne la teneur en vitamines dans le lactosérum. Tableau III : teneur en vitamines dans le lactosérum (Linden et Lorient, 1994) vitamines Concentration (mg/ml) - Thiamine 0,38 - Riboflavine 1,20 - Acide nicotinique 0,85 - Acide pantothénique 3,4 - Pyridoxine 0,42 - Cobalamine 0,03 - Acide ascorbique 2,2 12 4-Valorisation de lactosérum : Le lactosérum a plusieurs utilisations : • 4.1-Alimentation humaine: Il trouve son emploi dans les produits de confiserie (Boudier et Luquet, 1980) et la poudre constitue une matière première pour l'industrie alimentaire (Delagueriviere, 1981). • 4.2-Alimentation animale: Elle constitue le principal débouché du lactosérum, il est destiné à l'élevage industriel des porcs ou bien incorporé dans la ration des vaches laitières .Il peut également être incorporé aux aliments d'allaitement pour veaux.(Agnes,1986) • 4.3-Lactosérum substrat de fermentation: Le lactosérum pourrait être un substrat de fermentation pour de nombreuses espèces microbiennes. Selon Botofonja (1994), la croissance de certaines souches telles que Streptococcus lactis serrait bonne sur lactosérum seul du fait de la richesse de celui-ci en lactose. Le lactosérum est un bon milieu de culture permettant le développement des levures qui utilisent le lactose comme source de carbone (Omar et Sabry .,1991). Une étude menée par Bergmaier (2002) sur la production d'exopolysaccharides par fermentation avec des cellules immobilisées de Lactobacillus rhamnosus RW 9595M a été menée sur un milieu à base de perméat de lactosérum. Selon Poget-Ramseier (1993), le lactosérum est un bon milieu culture pour la production d'acide lactique à l'aide des bactéries lactiques. La composition de lactosérum et sa déficience en facteurs de croissance et en certains composés, fait que plusieurs chercheurs ont tenté de l'enrichir par l'addition de certains facteurs stimulant la croissance tels que l'extrait de levure, le bicarbonates de sodium, le Tween 80…etc (Yang et Silva, 1995). 13 1- Historique: L'acide lactique est utilisé depuis longtemps dans la conservation des aliments, il est découvert pour la première fois dans le lait fermenté par Scheele en 1780 et il est considéré au début comme un composant exclusif du lait. Pasteur en 1857 a découvert que celui-ci n'est pas uniquement un composant du lait mais un métabolite fermentaire produit par certains micro-organismes (Hofvendahl et Haln-Hagerdal, 2000). 2- Définition et caractéristiques: L'acide lactique ou acide α hydroxy propionique, se présente sous deux formes optiquement actives dues à la présence d'un carbone asymétrique situé en α de la fonction acide. La configuration L (+) est lévogyre et la configuration D (-) est dextrogyre (figure 3). COOH H C COOH OH HO CH3 C H CH3 Acide D lactique Acide L lactique Figure 3: les deux isomères de l'acide lactique (Jarry 1994). - L'acide lactique est classé comme à GRAS (Generally recognized as safe) donc il est utilisé comme un additif alimentaire par FDA (food and Drug Administration) (Narayanan et al, 2004). - L'isomère acide L lactique est préféré dans les produits alimentaires, dû à la présence de L lactate déshydrogénase dans l'être humain (Naveena et al, 2004). - L'isomère acide D lactique est parfois dangereux au métabolisme humain et peut causer un acidose et décalcification (Zhang et al, 2007). - Streptococcus thermophilus est homofermentaire, produit uniquement l'acide L lactique (Panesar et al, 2007). 14 3-Voies de synthèse de l'acide lactique: L'acide lactique peut être produit soit par fermentation microbienne soit par synthèse chimique - Synthèse chimique : L'addition de cyanure d'hydrogène et de catalyseur au acétaldéhyde conduit à la formation de lactonitrile .Ce dernier est hydrolysé par l'acide sulfurique pour donner acide DL lactique. - Fermentation microbienne: A l'aide d'un agent microbien, une source carbonée est transformée pour donner acide lactique .Après extraction et purification de métabolite formé, on obtient l'acide L lactique, Acide D lactique et acide DL lactique (figure 4). Source pétrochimique Source biologique Acétaldéhyde (CH3CHO) carbohydrates fermentiscibles Addition de HCN et Fermentation Catalyseur microbienne Lactonitrile (CH3CHOHCN) Jus de fermentation Hydrolyse par H2SO4 Extraction et Purification Uniquement acide DL lactique Acide L lactique, Acide D lactique ou isomère Racémique acide DL lactique Synthèse chimique Fermentation microbienne Figure 4: les deux voies de production d'acide lactique (Narayanan et al, 2004). La synthèse chimique d'acide lactique est moins utilisée à cause de ses effets néfastes sur l'environnement, et même que la demande de source chimique est très limitée (Narayanan et al, 2004). 15 4- Application de l'acide lactique: 4.1- Industrie alimentaire: Il est utilisé comme conservateur E270 ou comme acidulant, seul ou en combinaison avec d'autres acides. Il intervient dans presque tous les aliments et boissons grâce à son léger goût acide qui ne masque pas les flaveurs naturelles aromatiques. Acide lactique et ses sels sont reconnus comme additifs alimentaires dans de nombreux produits comestibles tels que: bonbons, saumures, choucroutes, boissons non alcoolisées, eaux minérales, jus de fruit…etc. Exemple: • En fromagerie : il est utilisé pour régler le pH du lait avant l'emprésurage. • En boulangerie: il est utilisé comme émulsifiant sous la forme de stéaroyllactoyllactate de sodium (Jarry, 1994) 4.2- Secteur pharmaceutique ou médical: Le lactate de calcium possède une action thérapeutique, tandis que les sels de métaux lourds servent d'opacifiant en imagerie médicale. Sous forme de polymères ou copolymère lactiques- glycoliques, il est utilisé pour la libération contrôlée des médicaments dans des fibres creuses, elle-même biodégradables. Cet aspect avantageux est encore mis à profit dans des implants chirurgicaux ou des fils de suture (Jarry, 1994). 4.3- Agriculture: L'agriculture en consomme dans le traitement antibrunissement des fruits, dans l'acidification des fourrages ensilés et comme intermédiaire dans la préparation des produits phytosanitaires optiquement actifs (Jarry, 1994). Exemple ; l'acide lactique est un produit très efficace pour lutter contre les varroas pour le petit apiculteur (Schultermandl et Imdorf, 2002) (figure 5) Figure 5 : lutte contre les varroas 16 4.4- Secteurs industriels divers: (textile, tannerie et l'œnologie): Ces industries l'utilisent soit comme agent de mordançage, soit dans le déchaulage des peaux. Les polymères de l'acide lactique sont thermoplastiques et résistants, facile à façonner et biodégradables donnant des produits naturels et sans danger (Jarry, 1994). 17 1-Définition de la fermentation lactique: La fermentation lactique correspond à la transformation du lactose du lait en acide lactique, sous l'action des microorganismes spécifiques appelés bactéries lactiques. Elle s'accompagne des modifications biochimiques, physico-chimiques et organoleptiques du produit (Beal et Sodini, 2003). C12H22O11 + Lactose H2O 4 CH3-CHOH-COOH Acide lactique 2- Différents types de fermentation lactique: D'après Guiraud (1998), la fermentation lactique présente deux voies: -Voie homolactique: elle permet de produire exclusivement l'acide lactique à partir des glucides. -Voie hétérolactique: en plus de l'acide lactique, cette voie permet de produire l'acide acétique, éthanol et dioxyde de carbone (figure 7). La fermentation lactique Hétérolactique Homolactique Production d'acide lactique à 85 % Production d'acide lactique, acide acétique, éthanol et CO2 Figure 7: les voies de fermentation lactique. 3- Production d'acide lactique par fermentation lactique: 3.1- Cinétique de croissance bactérienne: En milieu liquide, la plus part des bactéries y compris Streptococcus thermophilus ont une croissance homogène dans le bouillon de culture. On peut de façon simple mesurer le nombre des cellules vivantes ou la concentration cellulaire totale, ceci permet de décrire la courbe de croissance des bactéries qui comporte six (06) phases successives (figure 8). 18 Figure 8: Courbe de croissance d'une culture bactérienne en discontinue (Sechet, 2000). 3.1.1 - Phase de latence: la vitesse spécifique de croissance est nulle. Il y a adaptation des cellules au milieu avec synthèse d'enzymes (Meyer, 1999). 3.1.2 - Phase d'accélération: pendant cette phase, on remarque un démarrage de la croissance proprement dite: la reproduction cellulaire commence. 3.1.3 - Phase logarithmique ou exponentielle: phase ou toutes les cellules se trouvent dans leur état physiologique maximal et peuvent se multiplier sans entraves. La vitesse de reproduction atteint son maximum et reste constant pendant toute cette phase. (Sechet, 2000). 3.1.4 - Phase de ralentissement: dans cette phase, on remarque un épuisement du milieu de culture suite à la disparition d'un ou plusieurs composés nécessaire à la croissance bactérienne tels que (C, N, P,…etc). Le taux de croissance va diminuer progressivement pour s'annuler à la fin. 3.1.5 - Phase stationnaire: le nombre de bactéries vivantes reste constant, les cellules conservent une activité métabolique, leur structure biochimique subit des modifications (Meyer, 1999). 3.1.6 - Phase de décroissance exponentielle (déclin): la biomasse dans la phase d'autolyse (Sechet, 2000). 3.2- paramètres de croissance: 3.2.1- Temps de génération G: G= t/ n Où n: nombre de division. t: temps. 19 3.2.2- Taux de croissance (µ): Chaque cellule microbienne donne après multiplication deux cellules identiques. Après n génération, le nombre initial de cellule x0 pour t0, devient au temps t, x x = x = x 2 x 2 n 0 ut 0 ln x = ln x 0 + µt . ln 2 Où ln x − ln x 0 = µt . ln 2 µ = : ln x − ln x 0 t . ln 2 - Selon l'équation x0: nombre de cellules à t0 X: nombre de cellules à t µ: taux de croissance (h-1) lnx = ut⋅ ln2 + lnx0 , on peut déduire graphiquement le taux de croissance des cellules pendant la phase exponentielle en traçant on fait sortir la valeur de µ= lnx = f (t) puis la. pente.de.la.droite ln 2 (Scriban, 1999). La figure 9 nous présente le µ de différentes phases de croissance. Figure 9 : Evolution du taux de croissance en fonction du temps (Sechet, 2000). 3.2.3- Rendement métabolique: La consommation de substrat, provoquée par des milliers de réactions élémentaires du métabolisme, peut être subdivisée en trois (3) grandes fractions (Monod, 1942) : 20 - La fraction qui apporte l'énergie nécessaire aux synthèses; - La fraction qui apporte l'énergie nécessaire à l'entretien de la vie cellulaire. En effet, les fractions (1) et (2) représentent la part de substrat utilisée pour la croissance, fraction (3) représente le ratio nécessaire au maintien des cellules en vie (maintenance). Yx/s = ∆ ⋅ Biomasse ⋅ formée ∆ ⋅ substrat ⋅ carboné ⋅ consommé Yx/s: Rendement métabolique de bioconversion du substrat (Y) en biomasse. YP/s = ∆ ⋅ produit ⋅ formé ∆ ⋅ substrat ⋅ carboné ⋅ consommé YP/s: Rendement de conversion du substrat (Y) en produit (métabolites). 3.3- Cinétique d'acidification: La production d'acide lactique est généralement modélisée par la relation de Luedeking et Piret (1959a), qui traduit un phénomène de découplage partiel entre la croissance et la production. dp dx = α + β ⋅x dt dt Cette relation exprime la vitesse de production d'acide lactique (dP/dt en g.l-1.h-1) en fonction de la vitesse de croissance (dX/dt en g.l-1.h-1) et de la concentration bactérienne (X, en g.l-1). Les deux paramètre α et β dépendent de la souche et des conditions environnementales dans les quelles est cultivée. 3.4- Facteurs influençant les cinétiques de croissance et d'acidification: Les cinétiques de croissance et d'acidification des cultures pures de Streptococcus thermophilus sont affectées par les facteurs suivants: 3.4.1-Taille de l'inoculum: Les résultats de Reddy et al (1976), de Vahvaslka et Linko (1987) et Amrane (1991) montrent que la phase de latence diminue quand la taille de l'inoculum augmente. Belhocine (1987) a constaté que les performances de la fermentation s'améliorent lorsqu'on multiplie les repiquages. 21 3.4.2-Température: La température exerce une influence déterminante sur l'ensemble de l'activité cellulaire microbienne. Plusieurs études ont précisé les températures optimales de croissance ou d'acidification de Streptococcus thermophilus en culture pure (tableau IV). Tableau IV : températures optimales de Streptococcus thermophilus et leurs critères d'adaptation Températures optimales Critères d'adaptation Références 42°C à 45°C Niveau d'acidification Accolas et al (1977) 40,5°C Taux de croissance, Tayeb et al (1984) biomasse finale 35°C à 45°C Taux de croissance Radke et Sandine (1986) 40°C à 45°C Biomasse finale Amorozo et al (1989) 42°C Acidité titrable Robinson (1988) 40°C Biomasse finale Beal et Corrieu (1991) 3.4.3-pH: Selon Amrane et Prigent (1998), la diminution du pH, lors de la culture libre se combine à l'accumulation de l'acide lactique et conduit à une forte inhibition de la croissance et du métabolisme bactérien. Mc Bean et al (1979), Tayeb et al (1984) et Beal et Corrieu(1991) préconisent des pH compris entre 6 et 6,5 pour Streptococcus thermophilus. 3.4.4-Aération et agitation: 3.4.4.1-Aération: Streptococcus thermophilus est une bactérie anaérobie aérotolérante, cultivée en anaérobiose partielle. Elle est plus résistante à l'oxygène par rapport aux autres bactéries lactiques et elle ne produira que de petite quantité d' H2O2 (Juillard, 1987). 3.4.4.2-Agitation: L'agitation est un facteur complémentaire pour le transfèrt d'oxygène mais également pour les autres éléments du milieu. Les bactéries lactiques sont des organismes microaerophiles, donc tout facteur diminuant la quantité d'O2 dissous dans le milieu de culture stimule leur croissance et 22 favorise la production d'acide lactique (Juillard, 1987). De même Boubechiche (1999) a montré que l'agitation a un effet négatif sur la production d'acide lactique chez Streptococcus thermophilus. 3.4.5- Concentration en substrat: Amrane et Prigent (1999) montrent que les vitesses et les rendements de fermentation sont améliorés lorsque le milieu de culture est complété avec des composés facilement assimilables. Monod a proposé une relation qui exprime µ en fonction de S par analogie, de l'équation établie par Michaelis pour les enzymes : µ = µm S Ks + S Dans cette équation, Ks est la concentration pour laquelle le taux de croissance prend la moitié de sa valeur maximale (Scriban, 1999). 3.4.6-Substances antimicrobiennes: Certains produits chimiques modifient la croissance des bactéries en la ralentissant, ce sont des inhibiteurs spécifiques, essentiellement liés à la production d'acide lactique, qui est la cause la plus importante de l'inhibition des activités métaboliques (Beal et al, 1989). 3.5- Modélisation de la croissance et de la production d'acide lactique: La croissance microbienne est un phénomène globalement très complexe, par le nombre et le type des réactions mises en jeu au cours de son déroulement et par leur dépendance vis-à-vis des facteurs extérieurs pouvant d'ailleurs exercer des influences susceptibles d'interaction. L'application des méthodes mathématiques et statistiques à l'étude de croissance bactérienne et production de métabolites, a permis de faire progresser considérablement la connaissance de ces phénomènes et de ce fait de mieux les maîtriser et les exploiter (Scriban, 1999). Exemple : le tableau V donne les principaux modèles descriptifs appliqués à la croissance bactérienne. 23 Tableau V : principaux modèles descriptifs appliqués à la croissance bactérienne.(De Roissart et Luquet.1994) Modèles Equation Références Gompertz y = a. exp(−(b − c.t )) Bratchell et al., (1989) Logistique y = a / 1 + exp(b − c.t ) Berkman et al .,(1990) Y =[ a (1+b.e c.(d-1)]-1/b Richards Schnute Richards (1991) Y= k.(1-b/a).[1-b e (c+1-b-at) ( 1/b)/1-b Zwietering ] et al., (1990) 2 Spline Y= a0 + a1. (t-t0) + a2. (t-t1) +….an. (t-ti) n Oner et Erickson (1986) Y=a.[1+e-(b+kt)/c]-c Standard Stannard et al., (1985) y = a{1 − exp[− b. exp(c. ln t ] Weibull } Beal (1991) 3.5.1- Modélisation de la croissance microbienne: Le modèle le plus simple exprime que la vitesse de croissance est proportionnelle à la quantité de biomasse présente dans la culture est dx dt Où = µx (1) µ: la vitesse spécifique de croissance X: la concentration cellulaire. Intégrer entre t0 et t1, en prenant u constant et égal à µ m : on trouve X= X0 e(µm(t-t0)) (2) Cette relation correspond à la phase logarithmique de croissance. Si en absence d'inhibition par un métabolite, l'un des nutriments commence à faire défaut (substrat limitant), en accord avec Monod (1942), on peut alors décrire la croissance bactérienne µ = µm par S S + Ks la relation (1) dans laquelle µ prend la valeur: (3) Où S et Ks sont respectivement la concentration et la constante du substrat limitant. Le système formé par la relation (1) et (3) a été intégré par Pirt (1975) sous la forme suivante, lorsque µ m, Ks et Yx s sont constants: Ks ⋅ Yxs µ m ⋅ t = 1 + Xf X Ks ⋅ Yxs Xf − X 0 ln + ⋅ ln Xf Xf − X X0 24 (4) Dans cette relation Xf est la concentration finale en biomasse et Yxs est le rendement de transformation de substrat S en biomasse X. Si l'inhibition de croissance est due à l'accumulation de produit formé et si ce dernier est considéré non compétitive, la relation (3) devient alors: µ = µm ⋅ S Kp ⋅ S + Ks P + Kp (5) Où P et Kp sont respectivement la concentration du métabolite inhibiteur et la constante d'inhibition. L'intégration du système formé par les relations (1) et (5) a été réalisée par Powell (1984) pour µ m. ks. Kp et Yxs constants dans le cas d'une production associée à la croissance, (Ypx) constant: 1+ Ks.Yxs X Ypx Y X − X0 ln + ( X − X0 ) + Ks⋅Yxs 1 + px ln f µm ⋅ t = X X Kp X Kp X − X f 0 f f (6) Luedeking et Piret (1959b) ont fait appel à une loi d'inhibition proportionnelle à la concentration de produit µ = µ m − hP (7) Où h est un constant. 3.5.2- Modélisation de la production d'acide lactique: Luedeking et Piret (1959a) ont montré que la production d'acide lactique était partiellement associée à la croissance, d'où la loi suivante: qp = dP dX = αµ + β = α +β Xdt Xdt (8) Où qp : est la productivité spécifique. P : est la concentration en acide lactique α , β : sont des cœfficients. On supposant µ= µ m : constante, Tayeb et al (1984) ont intégré le système formé par (1) et (8). Ils ont ainsi obtenu une loi de production partiellement associée décrivant le début de la fermentation. P = X0 αµ m + β µm ⋅ [exp (µ m ⋅ t 0 ) − 1] 25 (9) Où X0 est la concentration initiale en biomasse après inoculation, on peut calculer µ m qui est la pente de la courbe ln dP = f (t ) dt De même Tayeb et al (1984) ont supposé une inhibition non compétitive de la croissance, en absence de limitation par le substrat: µ = µm Kp P + Kp (10) La résolution, dans le cas général, du système formé par (1), (8) et (10) conduit à l'équation différentielle non linéaire du second ordre: α ⋅ µ m ⋅ Kp (dP) = 0 dP 2 µ m ⋅ Kp dP = ⋅ + . (11) dt 2 P + Kp dt (P + Kp)(α ⋅ µ m ⋅ Kp + βKp + βP ) dt 2 -Lorsque P<<Kp (début de fermentation): u est constant et égal à µ m, on se ramène donc à l'équation (9). -Quand P = Kp (avant le milieu de la phase exponentielle): µ est constant et égal à µ m/2. Kp (constant d'inhibition) est égal à la concentration en produit pour la quelle la pente de la courbe Ln (dP/dt)=f (t) et égal à µ m/2 - Quand P>>Kp (fin de fermentation), on peut écrire: µ = µ m ⋅ Kp P Dans ces conditions, Tayeb et al (1984) affirment que l'on peut calculer α et β par une régression non linéaire. 3.5.3- Modélisation de la cinétique de consommation de sucre: Pirt (1975), décrit que la vitesse de consommation du substrat est la somme de deux dS termes, l'un lié à la croissance dt dS : dt m , l'autre lié à la maintenance G dS dS dS = + dt T dt G dt M (12) Les termes liés à la croissance et à la maintenance sont donnés respectivement par: µX 1 dX dS =− ⋅ =− dt Y Y dt G xsG xsG (13) 26 et dS = −ms ⋅ X dt M (14) D'où ms est le coefficient de maintenance et YxsG est le rendement de conversion du substrat en biomasse. Le rendement vrai de conversion du substrat en biomasse est : dX YxsG = − dS G (15) En portant (13) et (14) dans (12), on obtient le coefficient métabolique qs du substrat: µ dS qs = − + ms = Xdt Y T xsG (16) Si on divise les deux membres de l'équation sur µ on obtient: dS m 1 dS = − − = s+ µ YxsG dX T µXdt T (17) A partir de cette équation on peut écrire la loi de Pirt : 1 Yx⋅s⋅obs = ms 1 + µ YxsG (18) D'où Yx.s.obs est le rendement observé de conversion du substrat en biomasse. 27 1-Objectif du travail : Notre travail effectué au niveau de laboratoire de biologie (université de Boumerdes) ainsi qu'au niveau de laboratoire de contrôle de qualité –Tipaza, consiste d'une part, à optimiser les paramètres physicochimiques et le milieu de culture. Le substrat utilisé est le lactosérum doux provenant de l'ORLAC de Draa Ben Khedda en utilisant une souche homofermentaire Streptococcus thermophilus S13. Le second volet consistera à exprimer nos résultats par un modèle mathématique. 2- Matériels utilisés et réactifs: (annexe 1) 3-Matériel biologique: La souche utilisée dans notre étude est Streptococcus thermophilus S13, souche homolactique. C'est une souche de la collection du laboratoire de sciences et techniques de l’environnement de l’ENP, Alger. Elle est revivifiée par deux repiquages sur milieu M17 liquide, puis elle est conservée à une température de 4°C dans des tubes dits tubes de conservation contenant de la gélose M17 incliné. 4--Préparation des tubes de conservation:(annexe 2) 5- Milieu de culture: Le milieu de culture utilisé au cours de notre fermentation est à base de lactosérum doux issu de la fabrication de fromage à pâte cuite "Camembert" provenant de l'ORLAC de Draa Ben Khedda (Tizi-Ouzou). Avant son utilisation comme substrat de fermentation, ce lactosérum est déprotéiné selon le protocole proposé par Moulin et al (1976). Le pH de lactosérum est ajusté à une valeur de 4,6 (point isoélectrique des caséines) par addition d'acide sulfurique concentré, puis autoclavé pendant 5 minutes à 102°C. Après refroidissement, il est filtré sur un filtre (type Wattman). L'opération est répétée plusieurs fois jusqu'à l'obtention d'un sérum limpide, le filtrat recueilli est réajusté à pH=7 par NaOH, puis stérilisé à 120°C pendant 20 minutes ( annexe 4). 28 6- Conduite de la culture: 6.1- Préparation de préculture: A partir de la culture sur gélose M17 inclinée, on prélève quelques colonies qui seront transférées dans un tube de 10 ml de milieu M17 liquide, puis on l'incube à 42°C pendant 24 heures. Cette étape permet la réactivation de la souche " Streptococcus thermophilus S13". Après 24 heures d'incubation, on introduit aseptiquement 1ml de cette préculture dans un erlenmeyer d'une capacité de 250 ml qui contient 30ml du milieu M17, puis on l'incube à 42°C pendant 17 heures sans agitation. Lorsque la croissance bactérienne est suffisamment avancée, ce milieu va servir à inoculer le milieu de culture. 6.2- Culture : La fermentation en batch (discontinue) est réalisée dans des erlenmeyers d'une capacité de 1 litre, contenant 300 ml de milieu de culture (lactosérum doux déprotéiné et autoclavé), ces erlenmeyers sont ensemencés stérilement par 30 ml de préculture et incubés à 42°C sans agitation. 7- Mesure de densité optique et du poids sec: La croissance bactérienne est suivie par deux méthodes: 7.1-Mesure de densité optique: La mesure de densité optique est effectuée à une longueur d'onde de 600 nm au spectrophotomètre de type UV/VIS UV-9200. Dans le cas des dilutions, la turbidité est proportionnelle à la biomasse lorsqu'elle ne dépasse pas la limite 0.5 - 0.6 en unité d'absorbance (Oner et Erickson., 1986) Principe: Lorsqu'une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau lumineux monochromatique, elle absorbe une quantité de lumière qui est proportionnelle à sa concentration cellulaire selon la loi de Beer Lambert (Bourgeois et Leveau., 1991) (annexe 2). 29 7.2- Mesure du poids sec: L'estimation du poids sec permet d'établir une relation entre la DO et la concentration cellulaire. Dans notre travail, nous avons utilisé la méthode préconisée par Amrane (1991). - Prendre 20 ml du jus de fermentation (lactosérum déproteiné) et centrifuger à 3000 tours/minutes pendant le temps nécessaire (20 à 45 minutes) pour faciliter la séparation de biomasse; - le surnageant est séparé du culot; - Le culot ainsi obtenu est lavé deux fois avec l'eau distillée stérile en ayant soin de centrifuger après chaque lavage; - un maximum de surnageant est éliminé, puis le culot est mis en suspension dans un minimum d'eau distillée; - peser le culot en suspension puis sècher ce dernier dans une étuve à 105°C pendant 16 heures ; - après refroidissement au dessiccateur, repeser le culot en suspension jusqu'au poids constant; - le poids est déterminé par la formule suivante: P (g/l) = (m - m0)/0.02 Où m0: masse de culot en suspension avant séchage (g) m: masse de culot en suspension après séchage.(g) La courbe densité optique /temps est donc facilement transformée en courbe x = f (t), où x est la biomasse en g de matière bactérienne sèche par litre de milieu (annexe 5). 8-Détermination des paramètres de croissance et de production: 8.1-Vitesse spécifique de croissance : µ est la vitesse de croissance dx/dt rapportée à l'unité de biomasse (x) .µ max est taux de croissance maximal au cours de laquelle toutes les bactéries se trouvent dans leur état physiologique optimal. Il est déduit de la courbe ln(x) = f (t) (Scriban., 1999). 8.2- Vitesse moyenne d'acidification : Cette vitesse (vm) est déduite de la courbe de production d'acide lactique, c'est le rapport entre la concentration maximale en produit (Pm) et le temps mis pour l'atteindre (Scriban., 1999). 30 9- Méthodes analytiques: Toutes les analyses ont été effectuées en trois (03) essais. 9.1-Mesure de pH: La mesure de pH est effectuée sur lactosérum brute et déproteiné et pendant le déroulement de la fermentation. 9.2- Détermination de la matière sèche: Ce dosage est réalisé au niveau de l'ORLAC de Draa Ben Khedda, il est effectué sur le lactosérum brute et le lactosérum déprotéiné. Le principe est basé sur la dessiccation par élimination d'eau dans un appareil à infrarouge type sartorius MA 45 qui affiche directement sur l'écran la teneur en eau ou bien la teneur en extrait sec du produit en g/l. 9.3- Dosage des cendres: Ce dosage est effectué sur lactosérum brute et traité, nous avons utilisé la méthode préconisée par AFNOR (1986). Son principe consiste à une évaporation à sec d'une quantité connue du produit, puis incinération à 530°C dans un four à moufle pendant 4 heures et refroidissement dans un dessiccateur. Expression des résultats: P Teneur en cendre (g/l) = où − f P P i E Pf: poids final du produit. Pi: poids initial du produit. PE: prise d'essai. 9.4- Détermination de chlorures : Ce dosage concerne les deux types de lactosérum (brute et traité), après défécation de lactosérum, les chlorures sont dosés dans le filtrat par la méthode proposée par AFNOR (1980). Les chlorures d'un volume connu de lactosérum sont précipités en présence de 1 ml d'acide nitrique et 5 ml de nitrate d'argent. L'excès de sel argentique est déterminé par titrage à l'aide d'une solution de sulfocyanure d'ammonium en présence d'alun de fer. 31 La teneur en chlorures est donnée en gramme de NaCl par litre selon la formule suivante: Teneur en chlorures (g/l) = (5-n). 0,585 n: volume en ml de la solution de sulfocyanure d'ammonium nécessaire pour l'obtention de la couleur rouge. 9.5- Dosage de la matière grasse: Ce dosage est effectué sur lactosérum brute et lactosérum déprotéiné. La teneur en matière grasse est déterminée par la méthode de Gerber AFNOR (1980). Son principe est basé sur la dissolution des protéines par addition de 10ml d'acide sulfurique à 11ml de lactosérum qui est introduit dans un butyromètre. La matière grasse de lactosérum est séparée après une centrifugation à 3000 tours/min pendant 5 minutes à l'aide d'un ml d'alcool amylique. La lecture se fait de manière directe sur l'échelle du butyromètre. Expression des résultats: Teneur en matière grasse (g/l) = B-A Où A: la lecture faite à l'extrémité inférieure de la colonne. B: la lecture faite à l'extrémité supérieure de la colonne. 9.6- Dosage de l'azote total: Ce dosage est effectué sur le lactosérum brute et traité par la méthode de Kjeldahl, qui consiste en une minéralisation par chauffage de 10 ml de lactosérum plus 15 ml d'acide sulfurique concentré en présence d'un catalyseur (K2SO4, CUSO4) ; suivie par une distillation de l'ammoniac libéré qui sera titré par une solution d'acide sulfurique 0.1N (Audigie et al., 1984) (annexe 4). Le calcul de la teneur en azote total exprimée en gramme d'azote par litre de lactosérum, est égale à : 32 Νt = (v1 −v2 )Ρ0E,014×100 Où v1: volume de la solution d'acide sulfurique utilisée. v2: volume de NaOH 0,1 N dépensé pour neutraliser l'excès de H2SO4 0,1 N après la distillation. 0,014: coefficient de correspondance. PE: prise d'essai. 9.7- Détermination de la teneur en protéines: Les protéines contiennent à peu près 16 % d’azote donc la concentration en protéine est déterminée par la formule suivante: Concentration en protéines (g/l) = Azote total (g/l) x 100/16 = Azote total (g/l) × 6 , 25 . 6,25: facteur variable selon la nature de protéine à analyser (Audigie et al., 1984). 9.8- Dosage du lactose par méthode de Bradford: Ce dosage est effectué sur les deux types de lactosérum (brute et déprotéiné) selon la méthode préconisée par AFNOR (1980). Elle est utilisée lorsque les teneurs en lactose sont comprises entre 23 et 70 g/l. Son principe repose sur la défécation du lactosérum par l'héxacyanoferrate de potassium et l'acétate de zinc, une solution cupro-alcaline (annexe 1) est réduite à chaud par le filtrat obtenu. Le précipité cuivreux ainsi formé est dissous par 20ml de la solution ferrique (annexe 1) et le sulfate ferreux formé est dosé par le permanganate de potassium 0,1 N (annexe 4). La teneur en lactose, exprimée en gramme de lactose hydraté par litre de lactosérum, est égale à : Μ ×1000 × 200 1000 × 20 ×10 =Μ 33 M: est la masse, en milligramme de lactose hydraté, lue sur le tableau VI (annexe 6). 9.9-Détermination de la teneur en acide lactique: La concentration totale en lactate est mesurée par la méthode préconisée par Anonyme 1 (1973), qui est fondée sur la mesure de l'absorbance du complexe lactate-Fe3+ à 425nm. 9.9.1-Principe: Une suspension aqueuse est libérée des protéines et des lipides par précipitation au moyen de chlorure de baryum, sulfate de zinc et d'une solution d'hydroxyde de sodium. L'acide lactique contenu dans le filtrat forme avec le chlorure de fer III un composé jaune dont l'intensité est proportionnelle à la teneur en acide lactique. 9.9.2 - Mode opératoire: 9.9.2.1 - Précipitation des substances gênant l'opération: Introduire 20 ml de lactosérum dans un ballon jaugé de 50 ml, ajouter dans l'ordre, 10ml de la solution de chlorure de baryum, 5ml de solution de sulfate de zinc et 5ml d'hydroxyde de sodium, en ayant soin de bien mélanger à chaque fois. Compléter le volume à 50 ml avec de l'eau distillée, mélanger, laisser reposer la solution pendant 15 minutes et filtrer sur un filtre plissé. 9.9.2.2 -Réaction colorée: Introduire 10ml de filtrat clair dans une éprouvette a bouchon rodé ou dans un petit ballon jaugé, ajouter 1ml de la solution diluée de chlorure de fer (III), fraîchement préparée, et placer aussitôt le récipient à l'abri de la lumière, 10 minutes plus tard, l'intensité de la couleur est mesurée à 425 nm. 9.9.2.3 - Courbe étalon:( annexe 5) Mettre 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2; 2,5…etc. jusqu'à 10ml de la solution mère (1ml de cette solution contient 1g d'acide lactique) dans des ballons jaugés de 50 ml, ajouter 15 à 20 ml d'eau distillée ainsi que les agents de précipitation indiqués au préalable.Compléter le volume à 50 ml, prélever 10 ml du filtrat et exécuter la réaction colorée. Porter sur un système de coordonnées les valeurs d'extinction mesurées et les quantités correspondantes d'acide lactique contenues dans 11ml de la solution colorée. 34 9.9.2.4- Expression des résultats: Acide lactique en g dans un litre de lactosérum Où a: quantité de l'acide lactique en g PE: prise d'essai exprimé en L 35 = 0 ,5 × a PE 1- Composition biochimique du lactosérum: L'utilisation de lactosérum doux déproteiné comme substrat de fermentation lactique nécessite au préalable une étude biochimique détaillée. La connaissance de cette composition est nécessaire pour procéder par la suite à des essais de supplémentation afin d'obtenir un milieu de culture adéquat. Le tableau VII illustre le pH et la composition biochimique moyenne du lactosérum doux provenant de L'ORLAC de Draa Ben Khedda. Tableau VII : composition biochimique moyenne du lactosérum doux provenant de L'ORLAC de Draa Ben Khedda. pH Composition en g/l - Extrait sec - Taux des cendres - Chlorures - Matière grasse - Teneur en azote total - Teneur en protéines - Teneur en lactose Lactosérum brut (avant stérilisation et filtration) 6,00- 6,30 Lactosérum traité (filtré et stérilisé) 5,90- 6,20 79 7,98 1,80 1,00 1,61 10,06 61 70 7,96 1,75 0 1,12 7 57.9 On constate que la composition biochimique moyenne du lactosérum doux (brute et traité) provenant de l'ORLAC de Draa Ben Khedda, n’est pas très différente de celle obtenue par Sottiez (1990) dans le tableau II dans le cas du lactosérum de fromage à pâte pressée. Toutefois, les valeurs sont légèrement inférieures ce qui s’expliquerait par une différence de la composition initiale de lait utilisé. Comme montre le tableau VII, le lactose est le constituant le plus important du lactosérum (57.9 g/l), il représente 70 à 72 % de l'extrait sec (Britten, 2003). Après stérilisation, on remarque une diminution de concentration de lactose de 3.1g/l, cette perte en lactose peut être due à l’hydrolyse thermique (120°C). Après traitement du lactosérum par chauffage et filtration, on n’observe pas vraiment une grande différence entre les deux types de lactosérum (brute et traité) sauf qu'il y a diminution de taux de protéines de 10,06 g/l à 7 g/l avec un pourcentage de 30,41%. 36 La déproteinisation par chauffage du lactosérum est partielle car le lactosérum possède des protéines fragiles (les albumines (75%), les globulines ou immunoglobulines (10 à 12 %), les protéoses-peptones (10%) et les protéines mineures (5%)) (Cayot et al., 1998), ont un pHi (point isoélectrique) varie de 4,6 à 5,2 (Linden et Lorient, 1994) et n'ont pas un pHi fixe égal 4,6. A ce pH, ils précipitent certaines fractions protéiques tandis que les autres restent solubles dans le sérum. Enfin, on peut considérer notre lactosérum comme un milieu de culture adéquat à la croissance de Streptococcus thermophilus S13. 2- Optimisation de la fermentation en batch: 2.1- Optimisation des paramètres physicochimiques : 2.1.1- Effet de température : Nous avons effectué cinq fermentations à différentes températures et à pH constant (au voisinage de 6) (tableau VIII). Tableau VIII: conditions opératoires concernant l'optimisation de température. Paramètre variable • - Températures: T1=35°C T2=40°C T3=42°C T4=45°C T5=48°C Paramètres fixes • • • • • pH : au voisinage de 6 Inoculum : 10 % (v/v) de préculture Absence d'agitation Durée de fermentation : 12h Milieu de culture : 300 ml de lactosérum déproteiné et autoclavé Durant chaque fermentation on évalue la croissance, pH, acide lactique et le lactose en fonction du temps (figures 14, 15, 16,17). 37 6,5 1 35°C 6 40°C 0,8 35°C 42°C 40°C 45°C 0,6 5,5 48°C 42°C pH C o n cen tratio n d e b io m asse (g /l) 1,2 45°C 48°C 5 0,4 0,2 4,5 0 0 2 4 6 8 10 12 4 0 Temps (h) 4 6 8 10 12 Tem ps (h) figure 14 : Evolution de biomasse en fonction du temps à differentes température et à pH constant Figure 15 : Evolution de pH en fonction du tem ps à différentes tem pératures et à PH constant, 60 9 35°C 8 40°C 7 42°C 6 45°C 5 48°C 4 3 2 1 Concentration de lactose (g/l) 10 C o n cen tratio n d 'acid e lactiq u e (g /l) 2 0 55 35°C 40°C 50 42°C 45°C 48°C 45 40 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Tem ps (h) Temps (h) Figure16 : Evolution de la concentration d'acide lactique en fonction du temps à différentes températures et à pH constant figure 17: Evolution de la concentration de lactose en fonction du tem ps à différentes tem pératures Au bout de dix heures, la croissance se ralentit et la phase stationnaire est observée au bout de 12 h. D’après la figure 14, on constate que la croissance est meilleure à 42°C et elle atteint une valeur de 0.9658g de matière sèche / litre de milieu de culture. Cette croissance est abaissée si on augmente ou on diminue la température de T = 42°C. Selon Rosso et al. (1995), quand la température du milieu se situe en haut ou en bas de température requise pour la croissance optimale, l’activité microbienne est réduite et le microorganisme peut éventuellement se détruire. La figure 16 montre clairement que la température de 42°C a une meilleure production d’acide lactique (Pf = 9.06g/l) par rapport aux autres températures 35°C ,40°C, 45°C, 48°C qui ont les concentrations finales en acide lactique respectivement de 5.22g/l, 6.77g/l, 7.59g/l, 5.88g/l. 38 En effet, dans les systèmes biologiques, la température affecte le taux des réactions biochimiques, l’activité des enzymes extracellulaires et le temps de génération (Tchobanoglous, 1979), ce qui influe significativement sur la production d’acide lactique. Durant les cinq (5) fermentations, le pH diminue (figure 15). Par exemple, à T = 42°C et au bout de quatre heures, il passe de 6.09 à 5.22 et il arrive à 4.33 à la fin de la fermentation. Selon Terre (1986), Streptococcus thermophilus acidifie le lait plus rapidement. En plus, les résultats de Chamba et Prost (1989) et Chamba (1990) ont montré qu’une souche n’est acidifiante que si la diminution de pH égale au moins 0.5 unité en quatre heures pour les Streptococcus thermophilus. A cet égard, on peut considérer notre souche Streptococcus thermophilus S13 comme acidifiante. La figure 17 a bien illustré la dégradation de lactose par une simple droite décroissante. Cela veut dire que le lactose est consommé par la bactérie et converti par la suite en un produit fini (acide lactique). Sa production est représentée par une courbe croissante (figure 16). 0,8 0,16 0,7 0,14 taux de croissance m aximal (1/h) 0,6 0,12 Vitesse m oyenne d'acidificatio n (g/l h) 0,1 0,08 0,06 0,5 0,4 0,3 0,04 0,2 0,02 0,1 0 0 35 40 42 45 48 35 40 42 45 48 Température (°C ) Temperature (°C) Figure 19 : Evolution de vitesse m oyenne d'acidification en fonction de tem pérature Figure 18 : Evolution de taux de croissance maxim al en fonction de temperature Les figures 18 et 19 représentent respectivement l’évolution des deux paramètres de croissance et de production (µmax et Vm) en fonction de différentes températures. D’après ces deux figures, on voit que µmax et Vm ont des valeurs maximales 39 (0.155h-1, 0.755g/l.h) à T = 42°C, puis ces valeurs diminuent de part et d’autre de cette température. Tango et Ghaly (1999), signalent que le taux de réaction biochimique de n’importe quel microorganisme augmente avec l’augmentation de température jusqu'à l’arrivée à une température maximale qui est considérée comme limite, au delà de cette température, le taux de croissance diminue rapidement associé par un ralentissement de production. Avec une vitesse spécifique de croissance maximale égale 0.155 h-1 et une vitesse moyenne d’acidification maximale égale 0.755g/l.h à T= 42°C, on peut considérer cette température comme optimale pour la croissance et la production d’acide lactique par Streptococcus thermophilus S13 cultivée sur lactosérum doux. Donc, il est important que la température de fermentation soit le plus possible maintenue constante pour donner une meilleure croissance et production, car un brusque changement de température peut causer des perturbations (Tango et Ghaly ,1999). Accolas et al. (1977), Radke-Mitchell et Sandine (1986), Bensiameur (1996) et Boubechiche (1999) ont également signalé que la température de 42°C est optimale pour la souche Streptococcus thermophilus CNRZ302. En plus, Robinson (1988) a préconisé cette température d’incubation pour les souches de Streptococcus thermophilus en suivant comme critère d’acidification l’acidité titrable. Selon Bourgeois et Larpent (1996), Streptococcus thermophilus se distingue essentiellement des autres streptococcus lactiques par sa croissance thermophile avec un optimum autour de 42°C – 43°C. De même, Gyosheva et al. (1995) ont travaillé sur 75 souches de Streptococcus thermophilus et ont trouvé la température 42°C comme température d’incubation pour ces dernières. La figure 20 regroupe respectivement l’évolution de biomasse, pH, acide lactique produit et le lactose consommé en fonction du temps, à une température optimale égale 42°C et à pH au voisinage de 6. Elle montre d’une part, une augmentation de quantité de biomasse et d’acide lactique et d’autre part, une diminution du pH et de la quantité de lactose. Selon cette figure, la biomasse passe de 0.136 g/l à 0.965g/l, l’acide lactique passe de 1.96 g/l à 9.09 g/l, le pH diminue jusqu’à 4.33 à partir d’un pH initial de 6.09, le lactose passe de 58.4g/l à 41.5g/l. 40 12 65 10 60 55 8 50 6 45 4 40 2 35 0 Concentration de lactose (g/l) Biomasse ,acide lactique (g/l) et pH . Biomase pH Acide lactique Lactose 30 0 2 4 6 8 10 12 Tem ps (h) Figure 20 :Evolution de biom ase,pH, acide lactique et lactose en fonction de tem ps à T=42°C et à pH constant 2.1.2-Effet de pH : Comme la température, le pH est un facteur qui influe très significativement sur la croissance bactérienne, c’est pourquoi on cherche à savoir quel est le pH optimal qui donne une bonne croissance et production d’acide lactique. Après déproteinisation, filtration, ajustement de pH à 7 à l’aide de NaOH, on stérilise le milieu de culture dans un autoclave à 120°C pendant 20 minutes. Cette stérilisation provoque la précipitation d'une partie des protéines limitant ainsi la quantité d'azote disponible dans le milieu (Racine et al., 1991). En effet, le pH baisse de 7 jusqu’à 5.90 à 6.20 et d’après Beal et Corrieu (1991), Streptococcus thermophilus préfère une gamme de pH comprise entre 6 et 6.5. Pour cela, on ajuste le pH de 4,5 à 8, puis on stérilise. Les conditions opératoires sont présentées dans le tableau IX . 41 Tableau IX : conditions opératoires concernant l’optimisation de pH. Paramètre variable • Paramètres fixes • Température : 42°C - pH 1 = 4.72 • Inoculum : 10 % (v/v) de préculture - pH 2 = 5.06 • Absence d'agitation et d’aération - pH 3 = 5.34 • Durée de fermentation : 12h - pH 4 = 5.61 • Milieu de culture : 300 ml de pH: - pH 5 = 6.09 lactosérum déproteiné et autoclavé. - pH 6 = 6.37 - pH 7 = 6.42 - pH 8 = 6.62 - pH 9 = 7.3 Les figures 21, 22, 23, 24 représentent respectivement l’évolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps. Les figures 21 et 23 montrent que la croissance ainsi que la production d’acide lactique sont inhibées à pH = 4.72, tandis qu'il y a augmentation de la biomasse et la teneur en acide lactique avec l’élévation de pH jusqu’à pH = 6.42 où Xf =1.30 g/l et Pf = 9.90 g/l.h. Au-delà de ce pH, la croissance et la production d’acide lactique diminuent. La fermentation lactique par Streptococcus thermophilus s'effectue par la voie homofermentaire, au cours de laquelle 90% du lactose est transformé en acide lactique. D’après la figure 24, le lactose est dégradé rapidement par la souche utilisée. Le produit ainsi obtenu « Acide lactique » à la fin de cette dégradation, provoque l’abaissement de pH (figure 22). 42 8 pH=6,62 7 pH=6,42 pH =6,62 6.5 pH=6,37 pH =6,42 6 pH=6,09 1.2 pH =7,3 1 0.8 pH =6,37 0.2 pH=5,34 5 pH =5,61 0.4 pH=5,61 5.5 pH =6,09 0.6 pH=7,3 7.5 pH Concentration en biom asse (g/l) 1.4 pH =5,34 4.5 pH =5,06 4 pH =4,72 3.5 pH=5,06 pH=4,72 0 0 0 2 4 6 8 10 2 4 12 6 8 10 12 Temps (h) pH Figure 22 : Evolution de pH en fonction du temps à différents pH et à T=42°C Figure 21 : Evolution de biomasse en fonction du temps à différents pH et à T = 42°C. 6 4 2 =7.3 = 6.62 =6.42 = 6.37 = 6.09 = 5.61 = 5.34 = 5.06 = 4.72 Concentration de lactose (g/l) 60 pH pH pH pH pH pH pH pH pH 8 lactiq u e (g /l) C o n cen tr atio n d 'acid e 10 pH =7,3 pH =6,62 55 pH = 6,42 pH = 6,37 pH = 6,09 50 pH = 5,61 pH = 5,34 pH = 5,06 45 pH = 4,72 0 0 2 4 6 8 10 12 40 0 Temps (h) 2 4 6 8 10 12 Temps (h) Figure 23 : Evolution de la concentration d'acide lactique en fonction du tem ps à différents pH et à T=42°C Figure 24 : Evolution de concentration de lactose en fonction du tem ps à différents pH et à T= 42°C Il est connu qu’à des pH bas, l’acide lactique provoque une pression dans les cellules microbiennes (Vali et al.,2006) puis les bactéries perdent leurs activités physiologiques entraînant ainsi une inhibition de β galactosidase et d’autres enzymes de glycolyse. De façon générale, le lactose est converti en acide lactique par la voie d’EMBDEN MEYERHOF qui forme deux molécules de lactate par molécule de lactose consommé (Luquet et Corrieu, 2005). A l’aide de β-galactosidase, le lactose est scindé en galactose et glucose pour donner par la suite le pyruvate, ce dernier est transformé en acide lactique et énergie sous forme d’ATP. Durant la phase exponentielle où la croissance et la production sont assez importantes, la bactérie exige beaucoup d’ATP 43 pour assurer la synthèse et la production. Par contre, cette exigence diminue dans la phase stationnaire. Aux pH = 4.62 et 7.3, Streptococcus thermophilus S13 nécessite l’ATP beaucoup plus dans la maintenance que dans la croissance et la production, ce qui explique l’inhibition à des pH bas ou élevés. 0,3 0,25 Taux de croissance m axim al (1/h) 0,2 0,15 0,1 0,05 0 4,72 5,06 5,34 5,61 6,09 6,37 6,42 6,62 7,3 pH Figure 25: Evolution de taux de croissance m axim al en fonction de pH 0.9 0.8 0.7 Vitesse m oyenne d'acidification (g/l.h) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 4.72 5.06 5.35 5.61 6.09 6.37 6.42 6.62 7.3 pH Figure 26 :Evolution de vitesse m oyenne d'acidification en fonction pH Les figures 25 et 26 représentent respectivement l’évolution de µmax et Vm en fonction de différents pH. Il apparaît clairement que à pH = 6.42, le µmax atteint une valeur maximale égale 0.283 h-1 et Vmax prend une valeur maximale égale 0.816 g/l.h. Ces deux courbes illustrent bien l’effet de pH sur la croissance et la production d’acide lactique. Par exemple à des pH extrêmes 4.72 et 7.3, on voit que le taux de croissance est presque nul et il prend les valeurs suivantes : 44 0.01h-1 et 0.016 h-1.Même, la vitesse moyenne d’acidification est faible et elle prend les valeurs suivantes : 0.237g/l.h, 0.258 g/l.h. Adamberg et al. (2003), ont expliqué la croissance et la production d’acide lactique à des pH bas ou alcalins par la haute résistance des bactéries lactiques aux conditions défavorables (acidité élevée, alcalinité élevée…etc.). Selon Hutkins et Nannen (1993), les bactéries lactiques thermophiles notamment Streptococcus thermophilus, poussent et gardent généralement leur viabilité dans des milieux de pH compris entre 4.5 et 7. Avec Xf =1.30 g/l (figure 21), Pf =9.9 g/l (figure 23), µmax = 0.283 h-1 (figure 25) et Vmax = 0.816 g/l.h (figure 26) à T = 42°C et à pH = 6.42, on peut conclure que ce pH est pris comme optimum pour notre souche Streptococcus thermophilus S13 afin qu’elle puisse donner une bonne croissance et production d’acide lactique. McBean et al. (1979) ont proposé un pH de 6 pour Streptococcus thermophilus. Par contre Tayeb et al. (1984) ont adapté un pH de 6.5 pour la même souche. Les résultats des travaux de Hutkins et Nannen (1993) ont montré que le pH externe optimum pour les bactéries lactiques thermophiles et plus précisément Streptococcus thermophilus est de 6 à 7,5. D'une manière générale, la production d'acide lactique a un effet inhibiteur sur les bactéries lactiques et plus particulièrement Streptococcus thermophilus. Les travaux de Konings et Otto (1983) et Amrane (2001), ont montré que lorsque le pH du milieu extérieur diminue, par l'accumulation des acides organiques (acide lactique), la bactérie lactique maintient son pH intracellulaire plus alcalin (pH = 6.6) que le milieu extracellulaire, car les cellules excrètent rapidement l'acide lactique dissocié dans le milieu extracellulaire, en plus la membrane cellulaire est imperméable pour les protons extracellulaires (molécule de lactate) ( Hutkins et Nannen ,1993). La différence de pH entre le cytoplasme et le milieu extracellulaire forme un gradient de pH (pH). Pour excréter les protons à l'extérieur , la bactérie consomme l'ATP en activant l'enzyme H+, ATPase (Nannen et Hutkins, 1991), mais en fin de phase exponentielle de croissance, la quantité d'ATP disponible ne suffit plus, le gradient de pH disparaît, les activités hexokinasiques baissent et entraînent l'inhibition de la croissance et l'activité des enzymes intracellulaires telle que le β galactosidase car le 45 pH optimal de la β-D-galactosidase provenant de Streptococcus thermophilus est proche de neutralité)( Hutkins et Nannen ,1993). Fu et Mathews (1999) ; Mirdamadi et al (2003) ont justifié que la croissance et la production d'acide lactique sont inhibées par la présence d'acide lactique non dissocié. Le pka de l'acide lactique est de 3,86. La relation entre la forme dissociée [L-] et la forme non dissociée [HL] est représentée par l'équation suivante: pka = pH – log [L-] / [HL] ……… (1) D'après la figure 23 Pf = 9.9 g/l, donc [L-] + [HL] = 9.9g/l =0.11M…………. (2) A pH = 6, et à partir des équations (1) et (2), on trouve que 99.29 % de la totalité d'acide lactique est dissocié et 0.71 % non dissocié. Cependant, si le pH diminue jusqu'au 4.30, l'acide lactique non dissocié peut atteindre 26.63% de la totalité d'acide lactique, cela explique la raison de faible croissance à des pH bas. La figure 27 regroupe l'évolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps à T = 42°C et à pH = 6.42. Elle illustre l'augmentation de biomasse 46 de 0.128 g/l à 1.3 g/l, et l'acide lactique de 2.06 g/l à 9.9 g/l .En plus, elle montre la diminution de pH de 6.42 à 4.29 et de lactose de 58.4 g/l à 41g/l. 2. 2-Optimisation des paramètres liés au milieu de culture : 2.2.1-Effet de l'extrait de levure: Pour augmenter le rendement de croissance et de production d'acide lactique, on essaiera de supplémenter le lactosérum par des sources azotées. L'extrait de levure est le plus utilisé dans plusieurs travaux (Norton et al., 1994). Il constitue une source de vitamines et de facteurs de croissance (Adamberg et al., 2003). Le tableau X illustre la composition d'extrait de levure (annexe7). Pour connaître la concentration optimale d'extrait de levure qui nous a permis d'avoir une bonne croissance et production d'acide lactique, nous avons procédé à trois (3) fermentations supplémentées respectivement de 1%, 5%, 10% d'extrait de levure, une fermentation sans supplément (0%). Tableau XI: conditions opératoires concernant l'optimisation de la concentration d'extrait de levure. Paramètre variable • Paramètres fixes Concentration • Température: T = 42°C d'extrait de levure: • pH : au voisinage de 6 - EL = 0 % • Inoculum : 10% (v/v) de préculture - EL = 1 % • Absence d'agitation et d'aération - EL = 5 % • Durée de fermentation : 12h - EL = 10 % • Milieu de culture : 300 ml de lactosérum déproteiné et autoclavé. Nous avons représenté respectivement sur les figures 28, 29, 30, 31 l'évolution de biomasse, pH, acide lactique produit ainsi que le lactose consommé en fonction du temps. 47 6.5 1,6 1,4 6 EL = 0 % 1,2 1 EL = 0 % 0,8 EL = 1% 0,6 EL = 5 % EL = 1 % 5.5 EL = 5 % pH Concentration de biomasse (g/l) 1,8 EL = 10 % 5 EL = 10 % 0,4 4.5 0,2 0 0 2 4 6 8 10 4 12 0 2 4 8 10 12 Tem ps (h) Tem ps (h) Figure 28 : Evolution de biom asse en fonction du tem ps à différentes concentrations en extrait de levure et à T =42°C. Figure 29 : Evolution de pH en fonction du tem ps et à différentes concentration en extrait de levure et à T = 42°C 12 65 10 60 EL= 0 % 8 EL = 1% 6 EL = 5% 4 EL =10 % 2 C o n ce n trat io n d e la ct o se ( g /l) C o n cen tratio n d 'acid e lactiq u e (g /l) 6 EL = 0% EL = 1 % 55 EL = 5 % 50 EL = 10 % 45 40 35 0 0 2 4 6 8 10 0 12 2 4 6 8 10 12 Temps (h) Temps (h) figure 31 : Evolution de lactose en fonction du temps à différentes concentrations d'extrait de levure et à T=42°C Figure 30 : Evolution de la concentration d'acide lactique en fonction du temps à differentes concentrations d'extrait de levure et à T= 42°C D'après la figure 28, on voit que le temps de latence pour EL = 0 % est relativement long (environ 3 à 4 heures) tandis qu'il est réduit pour des concentrations d'extrait de levure 1 %, 5 %,10 %. Ce temps de latence est suivi par une phase d'accélération, il dépend généralement de plusieurs facteurs: taille de l'inoculum, l'état physiologique de la bactérie et la préculture. Ce temps de latence réduit correspond à une adaptation de Streptococcus thermophilus S13 à l’extrait de levure additionné. L'adjonction d'extrait de levure au lactosérum provoque une amélioration de la croissance où Xf égal 1.65 g/l ,1.59 g/l ,1.218 g/l pour des concentrations d'extrait de levure respectivement de 1 %, 5 %,10 %. Selon Bury et al. (2001), l'addition d'extrait de levure au lactosérum déproteiné 48 peut considérablement augmenter non seulement le taux d'acidification par Lactobacillus bulgaricus 11842 mais aussi l'activité de β-galactosidase. Cette activation entraîne la dégradation de lactose et une bonne assimilation de glucose qui se traduit par une bonne croissance. Cette amélioration a été attribuée à la disponibilité d'acides aminés libres, de peptides, purines de pyrimidine et de cofacteurs…etc (Zhang et al. ,2007). En plus, la figure 30 a montré une amélioration marquée concernant la production d'acide lactique ou Pf prend les valeurs de 8.16 g/l ,9.71 g/l, 8.33 g/l, 7.35 g/l pour des concentrations d'extrait de levure suivantes : 0 %,1 %, 5 %,10 %. En effet, durant la phase exponentielle la bactérie nécessite beaucoup d'énergie pour croître et pour produire l'acide lactique, l'amélioration observée dans la croissance peut être expliquée par la grande exigence de bactérie à l'énergie pour la croissance et la maintenance. En revanche, une petite quantité d'énergie va être destinée à la production d'acide lactique. A la fin des quatre (4) fermentations, le pH baisse jusqu’à 4.84, 4.35, 4.51, 4.69 pour des teneurs en extrait de levure respectivement de 0 %,1%,5%,10% (figure 29). Cette diminution de pH provoque un ralentissement de croissance et de production. D’après la figure 31, on remarque une diminution de quantité de lactose ce qui traduit une bonne assimilation de lactose par notre souche. Les figures 28, 29, 30, 31 montrent que la croissance et la production d'acide lactique sont meilleures à une concentration d'extrait de levure égale 1 %. 49 0,3 0,25 Taux de croissan 0,2 ce 0,15 m axim al 0,1 (1/h) 0,05 Vitesse moyenne d'acidification (g/l,h) 0 0% 1% 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0% 5% 10% Concentration en extrait de levure (%) 1% 5% 10% Concentration d'extrait de levure (%) Figure 32 : Evolution de Taux de croissance m axim al en fonction de concentration d'extrait de levure figure 33 : Evolution de vitesse moyenne d'acidification en fonction de concentration d'extrait de levure L'examen des figures 32 et 33 qui représentent respectivement l'évolution de vitesse spécifique de croissance et de vitesse moyenne d'acidification en fonction de différentes concentrations d'extrait de levure 0 %.1 %, 5 %,10 %, montre clairement que l'addition d'extrait de levure au lactosérum stimule la croissance et la production d'acide lactique . Ces deux paramètres prennent les valeurs maximales 0.301 h-1 et 0.809 g/l.h à une concentration d'EL = 1% (10g/l) puis ils commencent à diminuer progressivement avec l'augmentation de concentration d'extrait de levure. Par exemple à 5 % (µmax = 0.240 h-1, Vmax =0.694 g/l.h), à 10 % (µmax =0.1701h-1, Vmax = 0.612 g/l.h ). Ce ralentissement du taux de croissance ainsi que le taux de production peut être attribué à une inhibition par un excès de supplément (extrait de levure). Levander et Radstron (2001) ont attribué l’inhibition de la croissance et la production d’acide lactique à des concentrations d’extrait de levure au dessus de 10g/L. Amrane (2000) a travaillé sur la production d'acide lactique par Lactobacillus helveticus cultivée sur lactosérum supplémenté par extrait de levure et il a conclu que les concentrations d'EL supérieure à 20 g/l deviennent toxiques pour le microorganisme. En plus, Ghaly et al. (2003) ont signalé qu’à des concentrations élevées en extrait de levure, la concentration cellulaire diminue sous l’effet de forte toxicité. 50 Selon la figure 28 (où Xf = 1.65 g/l), la figure 30 (où Pf = 9.71 g/l), la figure 32 (où µmax = 0.301 h-1), la figure 33 (où Vmax = 0.809 g/l.h), nous retiendrons la concentration d'EL = 1% (10g/l) comme concentration optimale à la croissance et la production d'acide lactique. En effet, des résultats similaires ont été trouvés par Aeshlimani (1989), Amrane et Prigent (1997), Kulozik et Wilde (1999), Bouguettoucha et al. (2007), qui ont travaillé sur une autre bactérie lactique thermophile libre Lactobacillus helveticus. En revanche, Norton et al. (1994), Schepers et al. (2004), Sirisaneeyakul et al. (2007) ont travaillé respectivement sur des bactéries lactiques thermophiles immobilisées Lactobacillus lactisIO1, Lactobacillus helveticus et ont jugé que 10 g/l d'EL est la concentration optimale pour ces deux souches afin qu'elles puissent donner une bonne croissance et production d'acide lactique. Nous avons représenté simultanément sur la figure 34 l'évolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps à T = 42°C et EL = 1 %.Cette courbe fait apparaître que la biomasse arrive à une valeur de 1.65g/l , l’acide lactique présente un maximum Pf =9.71 g/l. Par contre, le pH chute jusqu’à 4.35 avec une quantité résiduelle de lactose égale à 38.5g/l. 2.2.2-Effet de la concentration de lactose: Dans le lactosérum, Streptococcus thermophilus utilise seulement le lactose comme source carbonée. Gyosheva et al. (1995) ont signalé que cette souche fermente 51 uniquement quelques sucres: le lactose et parfois le galactose .De même, cette souche a une préférence vis à vis des milieux de culture contenant le lactose comme source carbonée (Benateya, 1987). Pour déterminer l'influence du lactose, on a suivi sept fermentations additionnées de teneurs différentes en lactose 0 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %. Ces fermentations se sont déroulées dans un étuve réglée à T= 42°C avec un pH initial au voisinage de 6, les conditions opératoires sont bien détaillées dans le tableau XII. Tableau XII : conditions opératoires concernant l'optimisation de la concentration de lactose. Paramètre variable • Paramètres fixes • Températures: T= 42°C lactose (%): • pH : au voisinage de 6 - lac = 0 % • Inoculum : 10 % (v/v) de préculture - lac = 0.5 % • Absence d'agitation et d'aération - lac = 1 % • Durée de fermentation : 12h - lac = 2 % • Milieu de culture : 300 ml de lactosérum Concentration de - lac = 3 % déproteiné et autoclavé - lac = 4 % - lac = 5 % Les figures 35, 36, 37,38 représentent respectivement l’évolution de biomasse, pH, 1,6 lac = 0% 10 1,4 lac =0,5% 9 lac = 0,5% 8 lac = 1% 7 lac = 2% 6 lac = 3% 5 lac = 5% 4 lac = 5% lac =1% 1,2 lac = 2 % 1 lac =3 % 0,8 lac =4% 0,6 lac =5% 0,4 0,2 Concentration d'acide lactique (g/l) Concentration de biom asse (g /l) acide lactique et lactose en fonction du temps à T= 42°C. lac = 0% 3 2 1 0 0 0 2 4 6 8 10 0 12 2 4 6 8 10 12 Tem ps (h) Temps (h) Figure 37 : Evolution de la teneur en acide lactique en fonction du temps à différentes concentrations de lactose et à T = 42°C . Figure 35 : Evolution de biomasse en fonction du temps à différentes concentrations de lactose et à T= 42°C . 52 7 lac = 0% lac = 1% 6 lac = 2% lac = 3% 5.5 lac = 4% 5 lac = 5% 4.5 4 Concentration de lactose (g/l) 6.5 pH 70 lac = 0,5% lac = 0 % 65 lac = 0,5 % 60 lac = 1% lac = 2 % 55 lac = 3 % 50 lac = 4 % lac = 5% 45 40 35 0 2 4 6 8 10 Tem ps (h) 12 0 2 4 6 8 10 12 Tem ps (h) Figure 36 : Evolution de pH en foction du temps à différentes concentrations de lactose et à T= 42°C . Figure 38 : Evolution de la concentration de lactose en fonction du temps à différentes concentrations de lactose et à T = 42°C . Concernant la biomasse, la figure 35 montre que durant l'intervalle [0% à 2%], la biomasse augmente avec l'augmentation de la concentration du lactose et elle prend les valeurs de Xf suivantes : 0.965 g/l , 1.05 g/l , 1.2 g/l 1.5 g/l pour 0 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, cela est expliqué par une meilleure adaptation de Streptococcus thermophilus S13 au lactose additionné. D'après Bertheau et al. (1985), le βgalactosidase est induite par l'adjonction de lactose au milieu de culture. Ce qui facilite la consommation rapide de substrat et provoque ainsi une bonne croissance. Dans l'intervalle [3% à 5%], la croissance est inversement proportionnelle à la concentration de lactose, c'est-à-dire, la biomasse diminue quand la concentration de lactose additionnée est croissante. La figure 37 illustre que la concentration finale en acide lactique est maximale (PF = 9.47 g/l) à une concentration de lactose égale 2% (20g/l). Ce résultat est confirmé par la figure 38 où elle met en évidence la bonne dégradation de lactose à une concentration de lactose égale 2% par passage de 58.8 g/l à 40 g/l. 53 0,35 0,3 Taux de 0,25 croissance 0,2 m axim al 0,15 (1/h) 0,1 0,05 0 0% 0,50% 1% 2% 3% 4% 5% Concentration de lactose (%) Figure 39 : Evolution de taux de croissancem axim al en fonction de concentration de lactose 0,8 0,7 0,6 Vitess e m oyenne d'acidificatio n (g/l,h) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0% 0,50% 1% 2% 3% 4% 5% Conce ntration de lactose en (%) figure 40 : Evolution de vitess e m oyenne d'acidification e n fonction de concentration de lactose L'examen des deux figures 39 et 40 qui présentent l'évolution de µmax et Vmax en fonction de différentes concentrations de lactose, a mis en évidence que µmax = 0.320 à 2% de lactose puis il diminue de part et d'autre de cette concentration. Une observation similaire sur la figure 40 indique Vmax = 0.789g/l.h à lac = 2 %. Enfin, nous retiendrons la concentration de 2% en lactose comme concentration optimale pour la croissance et la production d'acide lactique en se basant sur le Xf, Pf, µmax et Vmax. 54 Vu le manque de littératures concernant la production d'acide lactique par Streptococcus thermophilus sur lactosérum enrichi en lactose, on essaiera de rapporter nos résultats à une autre souche de bactérie lactique thermophile qui est utilisée dans plusieurs travaux en culture mixte avec Streptococcus thermophilus. Les résultats d’Adamberg et al. (2003) qui ont travaillé sur Lactobacillus bulgaricus libre sont en accord avec notre résultat lac = 2%. Fu et Mathews (1999) ont travaillé sur Lactobacillus plantarum et ils ont trouvé la concentration de 20 g/l comme concentration optimale pour la croissance et la production d'acide lactique. D'une manière générale, le ralentissement de croissance et de production d'acide lactique observé à des concentrations supérieures à 2% (20 g/l), est dû à l'inhibition par l'excès de substrat (lactose) (Yun et al., 2003). Benateya (1987) a expliqué ce ralentissement par la pression osmotique sous l'effet de forte concentration en glucides. En plus, les travaux de Larsen et Anon (1989; 1990) ont montré que ce ralentissement de croissance et de production d’acide lactique est dû à l'accroissement de la pression osmotique et à la diminution de l'activité de l'eau (Aw).cette diminution de Aw résulte du fort pouvoir hygroscopique du lactose (Carrara et Rubiolo, 1994) . 55 La présentation simultanément de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps à T = 42°C et à Lac = 2 % sur la figure 41 fait apparaître que la biomasse passe de 0.138g/l à 1.5, pH passe de 6.26 à 4.18, acide lactique allant de 1.87 g/l à 9.47 g/l et la dégradation de lactose passe de 58.8 g/l à 40g/l. 3 - Production d'acide lactique dans les conditions optimales : Pour étudier l'effet des paramètres physicochimiques (T, pH) et les paramètres liés au milieu de culture (EL, Lac). On essaiera de regrouper les 04 facteurs dans une même fermentation sous les conditions citées dans le tableau XIII. Durant cette fermentation, on mesure la DO, pH, acide lactique et lactose. Tableau XIII: conditions optimales. Paramètres optimaux Paramètres fixes • T : 42°C • Inoculum : 10 % (v/v) de préculture • pH : 6,42 • Absence d'agitation et d'aération • EL: 1 % • Durée de fermentation : 24 h • Lac: 2 % • Milieu de culture : 300 ml de lactosérum déproteiné et autoclavé La figure 42 représente l'évolution de biomasse, pH, acide lactique et lactose en fonction du temps .Elle nous a permet de voir que la biomasse passe de 0.165g/l à 2.368 g/l, l'acide lactique passe de 2.28 g/l à 13.31 g/l , diminution de pH jusqu’à 4.23 et dégradation de lactose de 57.9 g/l à 35 g/. 56 On remarque que la croissance est presque liée à la production d'acide lactique car la croissance et la production augmentent parallèlement jusqu'au temps t =12 h puis elles se stabilisent. Il apparaît que la croissance et la production d'acide lactique sont inhibées lorsque le pH chute à 4.23. Cela est dû à la forte acidité (pH bas) qui résulte de l'accumulation de l'acide lactique. Amrane (2001) a conclu que l'inhibition peut être due à l'épuisement de source carbonée. Mais dans notre travail, ce n'est pas le cas, car la concentration de lactose passe de 57.9 g/l à 35 g/l avec un rendement de bioconversion de lactose en acide lactique Yp/s = 48.16 %, donc il reste dans le lactosérum 51.84 % de lactose non consommé par la bactérie. D'autres chercheurs tels que Somkuti et Steinberg (1979) ont montré que le galactose est un facteur responsable de l'inhibition de croissance du Streptococcus thermophilus. Ces travaux sont confirmés par Levander et Radstrom (2001) qui ont montré que les souches de Streptococcus thermophilus sont considérées galactose (-) et elles ne peuvent fermenter le galactose malgré qu'elles possèdent le gène nécessaire pour le catabolisme de galactose. En résumant l’effet de pH et de l’acide lactique sur la croissance et la production d’acide lactique par les résultats conclus par Amrane et Pringent (1999) : 57 1- au début de la fermentation en batch, le pH constitue le seul facteur qui contrôle la croissance et la production d’acide lactique. 2- durant la phase de ralentissement, le taux de production reste proche de son maximum et il diminue avec la diminution de pH. 3- à la fin de croissance, durant les deux phases stationnaire et de déclin, l’inhibition se fait uniquement par la concentration d’acide lactique non dissocié et le pH n’a qu’un effet indirect. 4 - Modélisation de la croissance et de la production d'acide lactique: Pour comprendre les phénomènes biologiques et plus précisément les cinétiques de croissance et de production d'acide lactique, on essaiera de traduire les résultats expérimentaux par un modèle mathématique en utilisant un logiciel "ORIGIN" qui est basé sur la méthode des moindres carrées. De façon générale, le choix de modèle mathématique est fait selon deux critères: - Il doit avoir une meilleure corrélation (R2 plus élevé (proche de 1)); - Il doit avoir aussi une excellente représentation du processus étudié. Avant la modélisation des cinétiques de croissance bactérienne et de production d'acide lactique, il est nécessaire de passer par la dérivation par rapport au temps de la grandeur mesurée. 4.1-Modélisation de la croissance bactérienne : La dérivation de X en fonction du temps est représentée par la figure 43: Concentration de biomasse (g/l) 2,5 2,0 points éxpérimrntaux points calculés 1,5 1,0 0,5 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Temps(h) Figure 43 :Ajustement de la concentration de biomasse en fonction du temps 58 Cette figure donne la cinétique de croissance de Streptococcus thermophilus S13 dans les conditions optimales: T= 42°C, pH= 6.42, EL = 1% et Lac = 2% sachant que les points correspondent aux valeurs de X expérimentales et la courbe correspond aux X numériques. La fonction qui nous a permis d'avoir un meilleur ajustement c'est la fonction de Richards qui a la forme suivante: Y = a [1+ (d-1) e-k (x-xc)] 1/ (1-d) (*) Avec a, xc, d, k sont des constants sans signification biologique et ils prennent les valeurs suivantes: a = 2.37165, xc =8.96709, d = 6.83021, k = 1.8555. Selon cette figure, on remarque que l'ajustement est excellent pour toutes les phases de croissance où le coefficient de corrélation R2 est très élevé (R2= 0.99913), c’est-àdire les points expérimentaux sont en très bon accord avec ceux calculée et cela veut dire qu’il y a peu d’erreurs entre la réalité et l’expérimentation. Donc on peut exprimer la biomasse par l’équation ci-après : X = 2.37165 [1 + 5.83021. e - 1.8555 (t - 8.96709)] 1 / (-5.83021) Cette figure est de forme sigmoïde a été mise en œuvre pour la première fois par Richards en 1961 en suivant l'équation : Y =[ a (1+b.e c.(d-1) -1/b ] (Baratchell et al, 1989). Selon Beal et al (1994); Boudrant et al(1994), ce modèle appelé descriptif (ou purement mathématique) permet d'exprimer les variables de croissance ou d'acidification par des équations dépendant du temps et comportant un nombre variable de paramètres n'ayant pas de signification biologique. Streptococcus thermophilus S13 est une souche homolactique qui produit uniquement l'acide lactique.Ce produit fini constitue un facteur limitant de la croissance et de la production. Pour cela nous avons tracé la courbe qui porte la vitesse spécifique de croissance en fonction de concentration d'acide lactique formé (figure 44). 59 0,40 Points mesurés Points ajustés 0,35 T a u x d e c ro is s a n c e (h -1 ) 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Concentration d'acide lactique (g/l) Figure 44 : Ajustement de taux de croissance en fonction de concentration d'acide lactique. D’après cette figure, on voit que l’ajustement du taux de croissance en fonction de concentration d’acide lactique formé n’est pas très bon c'est-à-dire que l’écart est peu important entre les points expérimentaux et les points calculés. Cela peut être dû au nombre réduit de prélèvements effectués durant la fermentation lactique pour faire le dosage de biomasse ainsi que l’acide lactique. Toutefois, quand la concentration d’acide lactique augmente, le taux de croissance baisse, dans ce cas on parle d’inhibition proportionnelle à la concentration de métabolite produit. Cette inhibition suit le modèle 7 (voir chapitre IV) : µ =µm – hp avec h = 0.02354 qui représente la pente de la courbe linéaire. Ce résultat est en accord avec les résultats de Luediking et Piret (1959 b). 4.2-Modélisation de la production d'acide lactique: La dérivation de P en fonction du temps est illustrée par la figure suivante: 60 C o n c e n tra tio n d 'a cid e la ctiq u e (g /l) 14 12 10 Points expérimentaux Points calculés 8 6 4 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Temps (h) Figure 45:Ajutement de la concentration d'acide lactique en fonction du temps La figure 45 donne la cinétique de production de Streptococcus thermophilus S13 dans les conditions optimales: T=42°C, pH= 6.42, EL = 1% et Lac = 2%. Cette courbe porte les points expérimentaux ainsi que la courbe ajustée. L'ajustement se fait par la même équation utilisée dans l'ajustement de la cinétique de croissance sachant que a = 13.35087, xc =6.41061, d = 4.16642, k = 0.72952. D'après cette figure, on note que l'écart est réduit entre les points expérimentaux et les points calculés où R2 = 0.99816, donc on peut exprimer la production par l’équation suivante : P = 13.35087 [1 + 3.16642. e – 0.72952 (t – 6.41061) 1 / (-3.16642) ] 4.3- Relation entre la croissance et la production d'acide lactique : Sur la figure 46, sont portées les vitesses spécifiques de croissance et les vitesses spécifiques de production en fonction du temps .Ces deux courbes présentent presque une allure identique c’est à dire les vitesses se trouvent à leur maximum au bout de 4 heures puis elles décroissent jusqu’à une valeur proche de 0 dans le cas de vitesse spécifique de croissance et elles arrivent à une valeur constante égale 0.39 h-1dans le cas de vitesse spécifique de production. 61 2.5 1 2 0.75 1.5 0.5 1 0.25 0.5 0 0 0 2 4 6 8 10 Vitesse spécifique de croissance (1/h) vitesse spécifique de production (1/h) Vitesse spécif ique de production Vitesse spécif ique de croissance 12 Temps (h) Figure 46 : Evolution de vitesse spécifique de production et vitesse spécifique de croissance enfonction du temps dans les conditions optimales: T=42°C,pH=6,2,EL=1%,LAC=2% En ce qui concerne la production des métabolites, Gaden (1955) a décrit trois types de cinétiques: - formation de produit directement lié au métabolisme du substrat (production couplée de la croissance). qp = α.µ (1) -formation de produit non lié au métabolisme du substrat (production dissociée de la croissance). qp = β (3) Dans le cas de notre travail, la représentation de qp en fonction de µ est illustrée sur la figure 47, cette courbe ne passe pas par l’origine et elle prend l’équation suivante : y = αµ+β ((Type 2 de la classification de Gaden) où α et β sont des coefficients liés à la croissance et à la production. 62 vitesse specifique de production (1/h) 2,5 2 1,5 y = 5,1523x + 0,0821 R2 = 0,9326 1 0,5 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Vitesse spécifique de croissance (1/h) Figure 47:Evolution de vitesse spécifique de production en fonction de vitesse spécifique de croissance D’après la courbe 47, on fait sortir α qui représente la pente de la courbe et β correspond au point d’intersection de notre courbe avec l’axe des coordonnées (y). Il apparaît clairement que la production d’acide lactique est légèrement découplée de la croissance avec un coefficient de corrélation R2 = 0.9326, α = 5.1523 et ß = 0.0821. Donc on peut écrire qp = 5.1523 µ + 0.0821. Selon Scriban (1999), les cinétiques de croissance et de production sont étroitement découplées lors de la production de composés intermédiaires du métabolisme appelés métabolites primaires. Il s'agit de molécules tels que les acides aminés et les vitamines nécessaires aux synthèses cellulaires. Ce découplage partiel entre la production d’acide lactique et la croissance a été trouvé par Amrane et Prigent (1997) ; Kulozik et Wilde (1999) qui ont travaillé sur une bactérie lactique thermophile Lactobacillus bulgaricus cultivée sur lactosérum enrichi. Le tableau XIV résume les paramètres de lactique dans les conditions optimales. 63 croissance et de production d'acide Tableau XIV: les paramètres de croissance et de production d'acide lactique dans les conditions optimales. Pf(g/l) 13.31 Vm(g/l.h) 1.095 Le tableau XIV qp(h-1) Xf (g/l) µ max (h-1) 2.17 2.368 0.412 Yp/s (%) 48.16 Yx/s (%) 9.68 α β 5.1523 0.0821 fait apparaître que la croissance présente un maximum Xf = 2.368 g/l et µ max = 0.412 h-1avec un rendement de bioconversion de lactose en biomasse Yx/s = 9.68 %. En plus, la production atteint une valeur Pf = 13.31 g/l, Vm maximale = 1.095 g/l.h avec un rendement de bioconversion de lactose en acide lactique Yp/s = 48.16 %. 64 La valorisation de lactosérum doux provenant de l'ORLAC de Draa Ben Khedda par fermentation lactique sert, d'une part, à limiter la pollution engendrée par ce sous - produit, d'autre part, à synthétiser un nouveau produit "Acide lactique" qui trouve une grande gamme d'application dans les domaines : alimentaire, pharmaceutique, cosmétique, textile…. D'après les résultats de l'analyse physicochimique du lactosérum doux issu de la fabrication du camembert, on a conclu que ce milieu de culture présente une qualité adéquat vu sa richesse en matières nutritifs : 57.9 g/l de lactose, 1.12 g/l de matière azotée, 7 g/l de protéines, 1.75 g/l de chlorure et 0 g/l de matière grasse. En général, les protéines solubles du lactosérum sont moins assimilables par les bactéries lactiques et plus particulièrement Streptococcus thermophilus, c'est pourquoi lors d'enrichissement de notre lactosérum par l’extrait de levure, la croissance et la production d'acide lactique sont bien améliorées. A l'échelle industriel, l'extrait de levure est un meilleur supplément mais le problème qui se pose toujours, c'est son coût élevé. L'adjonction de lactose comme source carbonée au lactosérum a permis aussi d'améliorer la croissance et la production. En effet, la production d'acide lactique par Streptococcus thermophilus S13 en batch et à pH non contrôlé ( pH libre) sous les conditions optimales : T = 42°C, pH = 6,42 , Extrait de Levure = 1 % (10g/l) , lactose = 2 % (20 g/l), présente une amélioration marquée de la croissance et de la production d'acide lactique où : Xf = 2.368 g/l,µ max = 0.412h-1 ,Pf= 13.31g/l et vm = 1.095g/l.h. Pour comprendre les cinétiques de croissance et de production d'acide lactique, il est nécessaire d'ajuster respectivement la biomasse (X) et la teneur en acide lactique (P) en fonction du temps en utilisant un logiciel "ORIGIN". 65 Dans le but d'améliorer la performance de notre souche Streptococcus thermophilus S13: Il faut que la fermentation se déroule à pH contrôlé en utilisant comme agents de neutralisation, hydroxyde de calcium, hydroxyde de sodium…ect. Cette opération permet d'éviter l'inhibition par le pH. Il faut travailler dans des conditions en continu pour empêcher l'inhibition provoquée par l'accumulation de produit fini "Acide lactique". Il faut travailler dans des cultures mixtes, en utilisant par exemple : Lactobacillus bulgaricus ou Lactobacillus helveticus qui stimulent l’activité de Streptococcus thermophilus. 66 • Accolas J.P., Bloquel R., Diedienne R., Regnerj., 1977 .Propriétés acidifiantes des bactéries lactiques thermophiles en relation avec la fabrication du yaourt. Lait, 67 :1-23. • Accolas J.P., Hemmed., Desmazeaud M.J., Vassel I., Bouillance C et Veaux MC., 1980.Les levains lactiques thermophiles: propriétés et comportement en technologie laitière. Lait, 60: 487-254. • Adamberg Y.K., Kask S., Laht T.M and Paalme T., 2003.The effect of temperature and pH on the growth of lactic bacteria: a pH-auxostat study. International journal of food and microbiology, 85:171-183. • Aeschlimani A., 1989. 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Bec bensen. Centrifugeuse de mark CENTRO8 SELECTA. Etuve de mark memmert. Four à moufle. Fermenteur. pH-mètre de mark HANNA PH 209. Plaque chauffante de mark VELP Scientifica. Plaque chauffante+ agitateur VELP Scientifica. Appareil de l'humidité de mark Sartoruis MA 45. Appareil Kjedahl de mark VELP Scientifica. Appareil Gerber de mark FUNKE. Spectrophotomètre UV -VIS UV-9200. Dessiccateur. • Réactifs: Composition de milieu M17 en g/l : - Tryptone………………………………………… 2.5 - Tryptone pepsique………………………………. 2.5 - Extrait de levure………………………………….. 5 - Extrait autolytique de levure……………………… 2.5 - Peptone papoinique……………………………… 5 - Lactose………………………………………….. 5 - Glycerphophate de sodium………………………. 19 - Sulfate de magnisium…………………………….. 0.25 - Acide ascorbique………………………………… 0.5 - Eau distillée………………………………………. 1000 ml - pH………………………………………………... 7.7 Autoclaver à 120°C pendant 20min Réactif cuproalcaline : (méthode de Bradford) (C'est un mélange des solutions A et B) • Solution A: - CUSO4, 5H2O……………………………………… 40g - H2SO4 concentré…………………………………… 5 ml - Eau distillée…………………………………………. 1000 ml • Solution B : - Tartrate double potassium et sodium……………….. 200g - Lessive de soude à 33 %.......................................... 375 ml - Eau distillée………………………………………..... 1000 ml Solution C: (solution ferrique) - Fe (SO4)3…………………………………………… 50g - H2SO4 concentré…………………………………… 200 ml - Eau distillée………………………………………….1000 ml • Préparation des tubes de conservation: Lait écrémé 1 ml Milieu M17 Incuber à 42°C pendant 24h Si le tube devient trouble, on ensemencera sur boite M17 Incuber à 42°C pendant 24h, 48h si il y a des petites colonies rondes et blanches, on procédera à une coloration de Gram Coloration de Gram(voire annexe3) Gram (+) On met quelques colonies dans le tube Gram (-) Incuber à 42°C pendant 24h Ensemencement d'un ml Incuber à 42°C pendant 24h Conserver à 4°C Figure 10 : Préparation des tubes de conservation Tubes de conservation : Boite de pétri : Tubes de conservation (milieu M17) Petites colonies rondes et blanches Streptococcus thermophilus S13 Avec Io>Ii Figure 11 : Principe de Beer Lambert • Coloration de Gram : - Récolter quelques colonies à l'aide d'une anse de platine; - Puis, les étaler sur une lame en verre; - Ajouter quelques gouttes d'eau distillée, ensuite flamber le dos de la lame; - Plonger la lame dans un bain de violet de gentiane pendant 1 à 2 min, puis rincer à l'eau; - Plonger la lame dans un bain de lugol pendant 30 à 40 secondes, puis rincer avec l'eau; - Plonger la lame dans un bain d'alcool pendant 30 secondes, puis rincer avec l'eau; - Plonger la lame dans un bain de fuchine pendant 40 secondes; - Rincer et égoutter la lame, ajouter une goutte d'huile à immersion - La lecture se fait sous microscope photonique: Si on voit une coloration rose, la bactérie est GRAM négatif. Si on voit une coloration violette, la bactérie est GRAM positif. Résultat de coloration de Gram : (Grossissement x 100) Streptococcus thermophilus S13: cocci Gram (+) • Préculture: Tube de 10ml de milieu M17 liquide préculture • Préparation de milieu de culture: Lactosérum brut Chauffage à 102°C Pendant 5min Filtration Lactosérum traité (déproteiné) Préparation de milieu de culture précipitation des protéines * Dosage de l’azote total par méthode de Kjeldahl : Mode opératoire : 1)- Minéralisation : - Introduire dans les matras de Kjedahl 10 ml de lactosérum ; - Ajouter 3g de catalyseur (1g de K2SO4 et 2g de CUSO4) ; - Ajouter 15 ml de l’acide sulfurique concentré ; - Placer les matras dans l’appareil de minéralisation de Kjedahl ; - Déclencher le chauffage. - lorsque le contenu devient limpide, maintenir le chauffage pendant 30min. 2)- Distillation : - Verser dans le matras refroidi contenant la solution limpide 80ml d’eau distillée puis 80 ml de NaOH à 33%, l’extrémité de l’appareil est plongée dans un bécher contenant 25 ml d’acide sulfurique 0.1 N ; - Mise en marche le distillateur( la distillation dure 15 min). 3)- Dosage : L’ammoniac recueilli dans une solution titrée d’acide sulfurique (0.1N), dont l’excès est dosé par NaOH 0.1N en présence d’indicateur coloré (phénophtaléine). * Dosage de lactose par méthode de Bradford : Mode opératoire : 1)-Défécation : Dans une fiole jaugée de 200ml, introduire dans l’ordre : - 20 ml de lactosérum ; - 2 ml de solution d’héxacyanoferrate II de potassium (ferrocyanure de potassium) ; - 2 ml de solution d’acétate de zinc ; - 100 ml d’eau distillée ; Agiter puis ajuster à 200 ml ; Agiter, laisser reposer 15 min et filtrer. 2)-Oxydation de lactose et lavage du précipité de cu2o : Dans une fiole d’erlenmyer de 150 ml, introduire : - 20 ml de solution cuivrique (Solution A) ; - 20 ml de solution tartaro-sodique (Solution B) ; - 10 ml de filtrat de défécation ; - 10 ml d’eau distillée ; - Agiter, porter à ébullition douce et maintenir celle-ci pendant 3 min puis laisser reposer. - Préparer un filtre et l’adapter sur une fiole. - Laver le précipité par décantation, à l’eau distillée bouillie, en évitant tout contact avec l’air. - Répéter les lavages jusqu’à obtention d’eau de lavage incolore. 3)-Réoxydation de cu2o et dosage de sel ferreux formé : Laver la fiole, dissoudre dans une erlenmeyer contenant le précipité de cu2o par 20 ml de solution ferrique acide, verser cette solution sur le filtre (même filtre utilisé dans 2). 4)-Titration : Titrer par une solution de permanganate de potassium 0.1 N jusqu’à coloration rose pale. • Courbe d'étalonnage de la biomasse : y = 1,1285x R2 = 0,9902 1,4 DO à 600 nm 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Concentration de biom asse en g/l Figure 12:Courbe d'étalonnage de biom asse Courbe d'étalonnage de l'acide lactique: 0,3 y = 0,3061x R2 = 0,9901 0,25 DO à 425 nm • 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Concentration d'acide lactique en g Figure 13 :courbe d'étalonnage de l'acide lactique 1 Tableau VI: Lactose hydraté exprimé en milligramme, en fonction du volume de la solution KMn04 (0,1N). (Méthode de Bradford). Volume de KMn04 0,1 N (ml) 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4 5,5 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 Lactose hydraté (mg) 14,9 15,8 16,9 17,8 18,8 19,8 20,7 21,7 22,7 23,6 24,1 24,6 25,1 25,6 26,1 26,6 27,1 27,6 28,0 28,5 29,0 29,5 30,0 30,3 31,0 31,5 Volume de KMn04 0,1 N (ml) 6,7 6,8 6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 8,7 8,8 8,9 9,0 9,1 9,2 Lactose hydraté (mg) 32,0 32,5 33,0 33,5 34,0 34,5 35,0 35,5 36,0 36,5 37,0 37,5 38,0 38,5 39,0 39,5 40,0 40,5 41,0 41,5 42,0 42,5 43,0 43,5 44,0 44,5 Volume de KMn04 0,1 N (ml) 9,3 9,4 9,5 9,6 9,7 9,8 9,9 10,0 10,1 10,2 10,3 10,4 10,5 10,6 10,7 10,8 10,9 11,0 11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8 Lactose hydraté (mg) 45,0 45,5 46,0 46,5 47,1 47,6 48,1 48,6 49,1 49,6 50,1 50,6 51,2 51,7 52,2 52,7 53,2 53,7 54,2 54,7 55,3 55,8 56,3 56,8 57,4 57,9 Volume de KMn04 0,1 N (ml) 11,9 12,0 12,1 12,2 12,3 12,4 12,5 12,6 12,7 12,8 12,9 13,0 13,1 13,2 13,3 13,4 13,5 13,6 13,7 13,8 13,9 14,0 14,1 14,2 14,3 14,4 Lactose hydraté (mg) 58,4 58,9 59,9 60,0 60,5 61,0 61,5 62,1 62,6 63,1 63,6 64,1 64,7 65,2 65,7 66,2 66,8 67,3 67,8 68,4 68,9 69,4 69,9 70,5 71,0 71,5 Volume de KMn04 0,1 N (ml) 14,5 14,6 14,7 14,8 14,9 15,0 Lactose hydraté (mg) 72,0 72,6 73,1 73,6 74,1 74,7 Tableau X : composition de l'extrait de levure (Ghaly et al ,2003) Composition % - Humidité 30 - Azote total 8.8 - Protéine 55 - Solubilité (mg/l) à 30°C 3000-1000 Acides aminés % de totale - Alanine 3.4 - Acide aminobutyrique 0.1 - Arginine 2.1 - Asparagine 3.8 - Cystine 0.3 - Acide glutamique 7.2 - Glycine 1.6 - Histidine 0.9 - Isoleucine 2.0 - Leucine 2.9 - Lysine 3.2 - Methionine 0.5 - Orthonine 0.3 - Phenylalanine 1.6 - Praline 1.6 - Serine 1.9 - Threonine 1.9 - Tyrosine 0.8 - Valine 2.3 Sels minéreux % - Nacl <1 - Cuivre --- Fer --- Magnésium --- Potassium --- Sodium --Vitamines ppm - Thiamine 20-30 - Riboflavine 50-70 - Pyridoxine 25-35 - Niacinamide 600 - Acide pontothenique 200