HPLC/UV - Master CHIMIE
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HPLC/UV - Master CHIMIE
Johanna BOY; Ingrid TELCHID Master 2 Professionnel "Chimie Analytique et Instrumentation" Les différentes bandes d’un spectre d’émission: PRINCIPE DE LA FLUORESCENCE - Bande de fluorescence: bande très large La Fluorescence est une propriété des fluorophores organiques, qui sont caractérisés par un λ d’ excitation et un λ d’émission, un rendement quantique de fluorescence Фf et une durée de vie de l’ordre de la nanoseconde. L’ irradiation d’ une molécule dans son état fondamental (So) par une source lumineuse externe telle qu’un laser ou une lampe UV, apporte de l’énergie (hνEx) qui sera absorbée par le fluorophore, ce qui permet le passage à un état excité de la molécule (S1’). - Diffusion Rayleigh: réémission d’une petite fraction de lumière excitatrice dans toutes les directions par les molécules de solvant avec la même longueur d’onde. Un photon hνEM est réémis, permettant au fluorophore de retourner à son état fondamental. Du fait de la dissipation d’énergie pendant l’état d’excitation, l’énergie du photon réémis est plus basse et donc la longueur d’onde est plus élevée. PARAMETRES DE MESURES Balayage: 200 à 800 nm Absence de filtres λ exc = 347 nm λ em = 450 nm Fenêtrage: Excitation = 5 nm Emission = 5 nm ¾ Vit. de balayage = 1000 nm/min ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ - Diffusion Raman: elle est 100 à 1000 fois plus faible que la diffusion Rayleigh. Elle provient d’un transfert d’une partie de l’énergie de la radiation excitatrice aux molécules de solvant sous forme d’énergie vibrationnelle. Sa position dépend du λ d’ excitation (l’écart λ Rayl–λ Ram est toujours identique pour un même fluorophore.) RESULTATS PHENOMENE DE QUENCHING Limite de linéarité I fluo = f[Cm(Q)](λ=600 nm) 900 800 Zone de linéarité: I fluo en u.a 700 600 500 0.1 à 1 ppm Auto-absorption 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80 100 120 Cm (Q) en ppm Courbe d’ étalonnage I fluo= f[Cm(Q)] (λ=600 nm) La présence d’ ions interférents peut entraîner le phénomène de quenching c’est à dire diminution ou extinction de la fluorescence. Ce phénomène est mis en évidence par les ions Cl[Cl -] ajouté en mol/L I fluo à λem = 550 nm Io/I 0 3,03. 10-4 7,56. 10-4 1,51. 10-3 3,03. 10-3 213,8797 202,6445 191,8508 171,3544 143,1775 1 1,0607 1,1148 1,2482 1,4938 N° échantillon 1 2 3 4 N° opérateur 1 1 2 2 Io/I = 1 + Ksv [Cl-] DOSAGE DE LA QUININE: N° échantillon 1 2 3 4 I fluo à λem = 600 nm 50,1443 47,7672 49,0919 51,4441 TONIC N° opérateur 1 1 2 2 I fluo à λem = 600 nm 45,3767 44,6691 44,6913 44,7289 Cm (Q)= 66 ppm AUTRES SPECTRES QUININE Spectre UVvisible de la quinine dans H2SO4 avec Cuve en quartz 300 € Spectrofluorimètre 30000 € AVANTAGES ET INCONVENIENTS La spectrofluorométrie avantages: présente de nombreux - sensibilité ( 100 à 1000 fois supérieure qu’en UVvisible) - peu de préparation de l’échantillon -acquisition rapide des spectres - simplicité d’utilisation Cm (Q) = 10 ppm Spectre d’excitation à La quinine est un alcaloïde fluorescent naturel d’Amérique du Sud extrait de l’écorce de quinquina, utilisée dans de nombreux médicaments pour la prévention du paludisme. Ce tonique est également utilisé pour parfumer les boissons. D’après l’équation de Stern-Volmer Cm (Q)= 73 ppm I fluo = 2,3.Io.ε.l.Фi.[Cm(Q)] = K.[Cm(Q)] si Abs < 0.04 C20H24N2O2 MM = 324 g/mol Фf = 54 % Droite Io/I = f([Cl-]) On obtient : Ksv = 161,22 L/mol SCHWEPPES Spectrofluorimètre Perkin-Elmer LS 55 Promotion 2007 Mais a quelques inconvénients: λ em = 450 nm permet de confirmer le choix de la longueur d’onde d’excitation - pour les solutions trop concentrées: absence de linéarité phénomène d’auto- quenching PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC) Elle permet la séparation d’un ou plusieurs composés d’un mélange, leur identification et leur quantification. La chromatographie en phase liquide est une méthode physico-chimique basée sur des différences d’interactions. Les molécules des produits à séparer ( solutés ) sont mises en fonction dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide ( éluant ). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire contenue dans la colonne chromatographique. Ces interactions aboutissent sur la séparation désirée. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt en permanence le système chromatographique, dont fait partie la colonne. Les composés en solution se répartissent suivant leurs affinités entre la phase mobile et la phase stationnaire. PARAMETRES DE MESURES ¾ Colonne: C8 ¾ Phase mobile: CH3OH/CH3CN/CH3COONH4 ( 45:15:40 % v/v/v) ¾ Débit: 1,0 mL/ min ¾ Détecteur UV: λ = 347 nm RESULTATS DOSAGE DE LA QUININE PAR HPLC Droite d’étalonnage Aire = f([Cm(Q)]) SCHWEPPES TONIC Aire 1 = 359920 u.a Aire 1 = 326260 u.a Aire 2 = 353090 u.a Aire 2 = 327470 u.a Moyenne = 356505 u.a quinine Cm (Q) = 61 ppm Cm (Q) = 56 ppm Chromatogrammme du tonic Chaîne HPLC Gilson Moyenne = 326865 u.a Chaîne HPLC 24000 € * J. E. O’Reilly, Fluorescence Experiments with Quinine, Journal of Chemical Education, 1975, 52(9), 610-612 * V.F. Samanidou, E.N. Evaggelopoulou, I.N. Papadoyannis, Simple and rapid HPLC method for the determination of Quinine in soft drinks using fluorescence detection, Journal of liquid chromatography & related technologies, 2004, 27(15), 2397 - 2406