Issatchenkia orientalis

Transcription

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur & de la Recherche Scientifique
Université d’Oran
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biotechnologie
Thèse de Doctorat en Biotechnologie
Présentée par :
Mme REZKI-BEKKI Meriem Amina
Thème
Production de métabolites par les levures :
caractérisation et identification des arômes et des
alcools.
Soutenue le 14/04/2014 devant la commission d’examen composée de :
Président :
M. TALEB M. Z. Professeur à l’Université d’Oran.
Examinateur : M. AOUES A. Professeur à l’Université d’Oran.
Examinateur : M. ABDELWAHED D. Professeur à l’Université de Tlemcen.
Examinateur : M TOUZI A.
Directeur d’Etudes au Cabinet de la Direction
Générale de la Recherche Scientifique et
Développement Technologique/Ministère de
l’ESRS.
Directeur de thèse :
Mme BENBAYER Z. MC à l’Université d’Oran.
Co-directeur de thèse
Pr François J.M. Professeur en Biochimie, BM et
bioNanotechnologie (Université de Toulouse, INSA).
REMERCIEMENTS
Le travail présenté dans cette thèse de doctorat a été effectué, en grande partie,
dans le Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, au sein de
l’EAD5 dirigée par le professeur Jean-Marie FRANÇOIS, à qui j’exprime ma
reconnaissance pour m’avoir accueillie au sein de son équipe de recherche et d’avoir
mis à ma disposition tous les produits et matériaux nécessaires à la réalisation de ce
travail. Merci pour son enthousiasme et son intérêt pour ce projet. J’ai beaucoup
appris auprès de lui et de son équipe et j’ai bénéficié de sa compétence, et de sa
patience contagieuse pour la recherche.
Il m’est très agréable d’adresser mes sincères remerciements à Mme BENBAYER
Zoubida pour avoir accepté de diriger ce travail, pour ses judicieux conseils et son
inlassable dévouement.
Je tiens aussi à remercier les membres du jury:
Monsieur TALEB M.Z., qui a accepté d’orchestrer le débat en tant que président
de ce jury de thèse,
Messieurs Touzi A., Abdelwahed D. et Aouès A. d’avoir accepter cette lourde
charge en examinant ce travail et de nous honorer par leur présence.
Je remercie également Laurent BENBADIS et Gustavo de BILLERBECK, qui ont su
chacun à leur tour me remotiver en mettant en valeur mon travail par leurs
connaissances scientifiques. J’ai beaucoup appris de nos discussions en particulier avec
Laurent qui a participé aux longues nuits devant le fermenteur.
Ma plus profonde gratitude à Marie-Ange TESTE qui m’a été d’une aide
précieuse et considérable. Sa gentillesse et sa disponibilité constantes ont participé au
bon déroulement de ce travail.
Une pensée très particulière à Ceren ALKIM avec qui j’ai partagé mes joies, mes
déceptions et mes nuits blanches au laboratoire.
Je remercie également M Philippe BLANC pour l’intérêt qu’il a porté à mon
travail et pour sa collaboration scientifique et amicale.
Parmi les personnes qui ont contribué à ce travail, je remercie Marie-Odile
LORET qui a porté sa part du projet, Thomas Walther pour ses conseils scientifiques et
Jean-Luc PARROU avec qui j’ai apprécié nos longues discussions et qui m’a épaulée
dans les moments difficiles.
Un grand merci au reste de l’équipe « JMF’slab » EAD5/LISBP: les deux Marion,
Audrey, Dong-Dong,…pour leur soutien plus que scientifique.
J’adresse mes sincères remerciements au directeur du LBRAP et amitiés à toutes
celles et ceux qui m’ont aidée de loin ou de près.
Et enfin, j’adresse mes remerciements, et pas des moindres, à ceux qui ont
toujours été là pour moi, qui m’ont soutenue quand le moral n’allait pas ou lorsque je
n’avais plus d’énergie pour continuer, ma petite famille: mon époux et mes deux chers
enfants, Mimi et Ramzi qui ont beaucoup pris sur eux pendant mon absence, merci
mes deux petits cœurs. Je vous aime et vous aurez toujours une très grande place dans
mon cœur.
RESUME
L’objet de cette thèse avait pour but l’isolement des levures à partir de biotopes algériens et
la caractérisation des souches qui possèdent des capacités intéressantes en termes de bio
productions. La taxonomie moléculaire sur la base des séquences du domaine D1/D2 de
l’ARN ribosomique 26S des isolats a aboutit à neuf espèces différentes. Notre étude s’est
concentrée sur cinq espèces: Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora uvarum, Kodamaea
ohmeri, Issatchenkia orientalis et Trichosporon asahii qui proviennent de biotopes
particuliers et sont très peu étudiées. L’étude des caractéristiques physiologiques a permis
de sélectionner la souche d’Issatchenkia orientalis (connu également sous le nom de Pichia
kudriavezii) qui possède des potentialités importantes en production et résistance à
l’éthanol qui en plus de sa résistance à de multiple stress comme les stress thermique, salin,
osmotique et pH en fait une candidate idéale pour l’intensification de la production du
bioéthanol.
Cette étude a également porté sur le profil d’accumulation des alcools supérieurs chez ces
souches cultivées sur milieu glucosé en absence et en présence d’excès en acides aminés:
leucine, isoleucine et phénylalanine. Elles ont révélé une production importante de
différentes molécules en particulier une production entre 250 et 300 mg/L du 2méthylbutanol chez Clavispora lusitaniae, de 400 mg/L en 3-méthylbutanol pour la souche
Kodamaea ohmeri. Quand à la souche I. orientalis, elle a montré une production
remarquable en 2-phényléthanol avec une concentration très proche des 1000 mg/L
représentant pratiquement le double de la concentration donnée par la souche contrôle S.
cerevisiae CEN.PK122-2N. De plus, ce niveau de production très élevé du 2-phényléthanol
par I. orientalis est corroboré par une grande résistance de cette levure à cet alcool
supérieur allant à une concentration de 5 g/L. Cette dernière représente le double de la
concentration à laquelle résiste la souche de référence S. cerevisiae.
Mots clefs : Levures, taxonomie, physiologie, éthanol, stress, fermentation,
arômes.
SUMMARY
This study was designed for the isolation of yeasts from Algerian habitats and
characterization of strains that possess valuable capabilities in terms of bioproduction. The
molecular taxonomy based on the sequences of the D1/D2 domain of the 26S ribosomal RNA
of the isolates results in nine different species. Our study focused on five of them: Clavispora
lusitaniae, Hanseniaspora uvarum, Kodamaea ohmeri, Issatchenkia orientalis and
Trichosporon asahii that come from specific habitats and are poorly studied at the
physiological level. The study of physiological characteristics was used to select the
Issatchenkia orientalis strain (also known as Pichia kudriavezii) that has significant potential
in ethanol production. This potential, together with its resistance to multiple stresses such as
heat, pH, salt, osmotic and ethanol stress, makes this species an excellent candidate for the
intensification of production of bio-ethanol.
This study also concerned the profile of accumulation of superior alcohols to these selected
yeast species cultivated on a glucose media in the presence of excess amino acids leucine,
isoleucine, phenylalanine. This study showed an important production of various
biomolecules in particular a production of 2-methylbutanol ranging 250 and 300 mg/L by
Clasvispora lusitaniae, of 400 mg 3-methylbutanol by Kodamaea ohmeri. Remarkably, the
Issatchenkia orientalis species exhibted a remarkable production of 2-phenylethanol to up
1000 mg/L, which was about 2 times higher than that obtained by the control
Saccharomyces cerevisiae strain CEN.PK122-2N. Furthermore, this higher PE production by
Issatchenkia orientalis corroborated with a high resistance of this yeast species to this
superior alcohol that can go up to 5 g/L 2-phenylethanol, which is two times higher than that
obtained for S. cerevisiae.
Keywords: Yeast, taxonomy, physiology, ethanol, stress, fermentation aromas.
‫الملخص‬
‫ٌهذؾ هزا انعمم نعضل خمبئش مه عذة مىبطق خضائشٌت و ححذٌذ هىٌت انسالالث انمخحصم عهٍهب و‬
‫دساست أهمٍخهب انبٍىحكىىنىخٍت‬
‫إن االعخمبد عهى بٍىنىخٍب اندضٌئبث ـً حصىفٍهب بذساست انمدبل ‪ D2/D1‬نهحبمط انشٌبً ‪ ،26S‬بٍه‬
‫أن هزي انسالالث حىخمً نخسعت أخىبط مخخهفت مه انخمبئش‪ .‬ؼٍش أن دساسخىب انمعمقت حشكضث عهى خمست‬
‫اخىبط هً ‪, Kodamaea ohmeri, ،Clavispora lusitaniae ،Hanseniaspora uvarum :‬‬
‫‪ Issatchenkia‬و ‪ Trichosporon asahii‬و انخً عضنج مه بعط انمىبطق اندضائشٌت راث طببع خبص نم‬
‫ٌخم دساسخهب بعذ‪.‬‬
‫‪Issatchenkia orientalis‬‬
‫إن دساست انخصبئص انفٍسٍىنىخٍت نهزي انخمبئش مكىخىب مه اخخٍبس انسالنت‬
‫انمصىت أٌعب ححج اسم ‪ Pichia kudriavezii‬و انخً حمخبص بخصبئص اوخبخٍت خذ مهمت و مقبومخهب نخأثٍش‬
‫اإلٌثبوىل ببإلظبـت إنى مقبومخهب نخأثٍش انحشاسة‪ ،‬انمهىحت‪ ،‬األسمىصٌت انعبنٍت و انحمىظت ممب ٌششحهب‬
‫السخعمبنهب ـً اوخبج اإلٌثبوىل انبٍىنىخً‪.‬‬
‫نقذ خصص خضء كبٍش مه هزي انذساست نخحذٌذ وىعٍت انكحىالث انمىخدت مه قبم هزي انسالالث و رانك‬
‫بعذ حىمٍخهب عهى وسط ٌحخىي عهى انؽهكىص ـً وخىد او ؼٍبة ـبئط مه األحمبض األمٍىٍت‬
‫انخبنٍت‪ leucine, isoleucine :‬و ‪ .phénylalanine‬إن انىخبئح انمخحصم عهٍهب بٍىج بأن انسالالث حمخهك‬
‫‪ Clavispora lusitaniae‬اوخدج مب بٍه ‪ 250‬و‬
‫خصبئص عبنٍت ـً إوخبج عذة خضٌئبث مثال انسالنت‬
‫‪300‬مػ‪/‬ل مه ‪ 2-méthylbutanol‬وانسالنت ‪400 Kodamaea ohmeri‬مػ‪/‬ل مه ‪ 3-méthylbutanol‬أمب‬
‫ـٍهب ٌخعهق ببنسالل ‪ Issatchenkia orientalis‬ـخمخبص بإوخبخهب انىـٍش مه ‪ 2-phényléthanol‬حٍث بهػ‬
‫‪S. cerevisiae‬‬
‫حشكٍضي ‪.1000‬مػ‪/‬ل أي مب ٌعبدل ظعؿ انكمٍت انمىخدت مه قبم انسالنت انمشخعٍت‬
‫‪.CEN.PK122-2N‬‬
‫اظبـت انى رنك حمخبص هزي انسالنت بمقبومخهب نكمٍت عبنٍت مه هزا انكحىل حصم انى‬
‫ظعؿ انكمٍت انخً حخحمههب انسالنت انمشخعٍت‪.‬‬
‫‪5‬غ‪/‬ل اي مب ٌعبدل‬
SOMMAIRE
RESUME ................................................................................................................................... 3
SUMMARY .............................................................................................................................. 4
RESUME EN ARABE ............................................................................................................. 5
INTRODUCTION GENERALE ......................................................................................... 10
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................ 13
Chapitre I : Généralités et caractéristiques biologiques des levures .............................. 14
1-Morphologie ..................................................................................................................... 16
1.1-La forme levure ....................................................................................................... 16
1.2- La forme pseudomycélium .................................................................................... 16
1.3- La forme mycélium ............................................................................................... 17
2- Structure cellulaire de la forme levure ............................................................................ 17
2.1- La paroi ................................................................................................................... 18
2.2- L’espace périplasmique .......................................................................................... 18
2.3- La membrane plasmique.......................................................................................... 18
2.4- Le cytoplasme .......................................................................................................... 19
2.5- Le noyau et le réticulum endoplasmique ................................................................. 19
3- Les exigences nutritionnelles .......................................................................................... 20
4- Métabolisme .................................................................................................................... 21
4.1- Métabolisme oxydatif .............................................................................................. 21
4.2- Métabolisme fermentaire ......................................................................................... 22
4.3- Métabolisme oxydo-réductif .................................................................................. .22
4.4- Métabolisme des monosaccharides ......................................................................... 23
4.5- Métabolisme des di- et tri-saccharides .................................................................... 24
4.6- Métabolisme des pentoses ...................................................................................... 25
4.7- Métabolisme des polysaccharides. ......................................................................... 27
4.8- Le transport des sucres .......................................................................................... 28
4.9- Le transport des ions ammonium .......................................................................... 28
4.10- Le transport des acides aminés ............................................................................. 29
4.11-Le transport des peptides et des polypeptides ...................................................... 30
5-Facteurs influençant le comportement des levures ......................................................... 31
5.1- Effet de la température ........................................................................................... 31
5.2- Effet du pH ............................................................................................................. 31
5.3- Effet de la pression osmotique et l’activité de l’eau ................................................ 32
5.4- Effet de l’oxygène et du dioxyde du carbone ......................................................... 32
5.5- Effet de la concentration d’éthanol ........................................................................ 33
5.6- Effet de l’acide acétique .......................................................................................... 33
Chapitre II : Utilisation industrielle des levures ................................................................ 34
A/ Production microbienne de l’éthanol .............................................................................. 35
1-Intérêts de cette production .............................................................................................. 35
2-Procédés utilisés au cours de la fermentation................................................................... 36
2.1-Fermentation type batch …. ................................................................................... 36
2.2- Fermentation type fed-batch …….. ...................................................................... 37
2.3- Fermentation type continu …................................................................................ 37
3-Les substrats utilisés au cours de cette production………………… ............................... 37
4-Les microorganismes utilisés au cours de cette production ….. ...................................... 38
5-Inhibition et tolérance à l’éthanol..................................................................................... 38
B/ Production microbienne des arômes ……….. ................................................................. 39
1-Définition …….. .............................................................................................................. 39
2- Les différents types d’arômes……. ................................................................................ 40
2.1- Les arômes naturels….. ........................................................................................... 40
2.2- Les arômes de synthèse ………………… .............................................................. 40
2.3- Les arômes de transformation……… ................................................................... .41
2.4- Les arômes de fumée…………. .............................................................................. 41
3-Utilisation des arômes……….. ........................................................................................ 41
4- Les arômes issus des biotechnologies …... ..................................................................... 41
4.1- Les modes de production…... .................................................................................. 42
4.2- Les microorganismes utilisés ................................................................................. 43
4.3- Les composés volatils formés par les microorganismes ........................................ 45
4.4- Le 2-phényléthanol (2PE)……................................................................................ 46
5-Problématiques de production microbienne des arômes …….. ....................................... 48
MATERIEL ET METHODES …….. .................................................................................. 49
1-Matériel biologique ........................................................................................................ 50
2-Méthodes d’isolement des levures ………. ................................................................... 51
2.1- Isolement à partir des échantillons solides ............................................................ 52
2.2- Isolement à partir du lait …… ................................................................................. 52
2.3-Isolement à partir du miel ……………… ................................................................ 52
3- Méthodes d’identification des souches de levures …… ................................................. 53
3.1-Méthode conventionnelle …. ................................................................................... 53
3.2- PCR sur histones ………......................................................................................... 53
3.3- Identification moléculaire au CIRM ...................................................................... 54
4- Milieux et conditions de culture… .................................................................................. 55
4.1- Milieux de culture ................................................................................................... 55
4.2- Conditions de culture .............................................................................................. 55
5- Analyse phénotypique ……. ........................................................................................... 58
5.1- Etude des caractères culturaux ……. ...................................................................... 58
5.2- Etude des caractères morphologiques ….. ............................................................. 58
5.3- Effet de quelques stress sur la croissance des souches retenues …….................... 58
6- Méthodes analytiques ….. ............................................................................................. 60
6.1- Détermination de la biomasse …….. ...................................................................... 60
6.2- Extraction d’alcools supérieurs et de leurs acétates……… .................................... 62
6.3- Analyse chromatographique par HPLC pour le dosage des différents sucres,
éthanol, glycérol et acétate …. .................................................................................. 63
6.4- Analyse chromatographique par GC-FID pour le dosage des alcools supérieurs et
leurs
acétates ………. ........................................................................................... 63
7- Analyse physiologique …… ........................................................................................... 64
7.1- Culture en anaérobiose ………… ......................................................................... 64
7.2- Assimilation des substrats carbonés ……… .......................................................... .64
RESULTATS ET DISCUSSION ....................................................................................... 66
1- Identification des isolats de levure……….. .................................................................... 67
1.1- PCR sur histones …….. .......................................................................................... 67
1.2- Identification moléculaire …. .................................................................................. 68
2- Caractères culturaux et morphologiques ……….. .......................................................... 71
2.1- Caractères culturaux .. ............................................................................................. 71
2.2- Caractères morphologiques. .................................................................................... 73
3-Effet des différents stress .. .............................................................................................. 76
3.1- Effet de la température ……. .................................................................................. 76
3.2- Effet du pH …… ..................................................................................................... 77
3.3- Effet du stress salin …. ............................................................................................ 78
3.4- Effet du stress osmotique ….................................................................................... 79
3.5- Effet de l’éthanol ……. .......................................................................................... 81
4- Analyse de la physiologie des cinq souches de levures retenues …. .............................. 84
4.1- Assimilation des substrats carbonés (Galerie API ID 32C)………. ....................... 85
4.2- Cinétiques et productions en aérobiose … .............................................................. 87
4.3- Cinétiques et productions de la souche Issatchenkia orientalis et CEN.PK122-2N
sur YPD et MMS en anaérobiose ……. ..................................................................... 91
4.4- Cinétiques et productions sur différents substrats glucidiques ……….. ................ 94
4.4.1- Culture et productions des cinq souches sur xylose.. ........................................ 97
5- Profil aromatique des cinq souches de levures retenues…….. ...................................... 99
5.1- Le profil d’accumulation des alcools supérieurs et de leurs acétates …… ............. 99
5.2- Tolérance au 2-phényléthanol …….. .................................................................... 103
6- Intérêt et dynamique physiologique de la souche Issatchenkia orientalis. .................. 105
6.1- Analyse de la viabilité cellulaire ……. ................................................................. 107
6.2- Aspect macrocinétique de la fermentation alcoolique type batch ….. ................. 109
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES……. .......................................... 112
ANNEXES . ........................................................................................................................... 115
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .... ...................................................................... 123
LISTE DES TABLEAUX… .............................................................................................. 154
LISTE DES FIGURES ........................................................................................................ 156
INTRODUCTION GENERALE
Introduction générale
Les levures sont des acteurs essentiels intervenant dans divers domaines et l’intérêt qu’elles
suscitent aujourd’hui est dû à leur grande diversité. Un grand nombre de levures
communément utilisées en biotechnologie a été obtenu à partir d’habitats naturels où elles
ont développé une faculté d’adaptation à un grand nombre de niches écologiques grâce à
leurs propriétés physiologiques très caractéristiques. L’ingénierie de ces levures a donc
trouvé dans l’industrie de la fermentation un champ d’application privilégié pour produire
divers métabolites comme les arômes et l’éthanol.
L’éthanol est un produit chimique industriel important pouvant avoir plusieurs destinées en
industrie chimique, pharmaceutique, cosmétique, etc. Aujourd’hui, il possède de nouveaux
potentiels en tant que biocarburant. Le bioéthanol grâce à ses propriétés physico-chimiques
compatibles avec l’essence, représente une alternative très prometteuse aux énergies
fossiles, couteuses et très polluantes. Grâce à leur capacité fermentaire, les levures
produisent cet alcool à partir de sucres qui peuvent être obtenus soit à partir de biomasse
sucrée (canne à sucre, betterave sucrière, etc.) ou amylacée (maïs, pomme de terre, manioc,
etc.), soit à partir de biomasse lignocellulosique (herbe, résidus agro-forestiers, bois, etc.).
Elles sont générées par les activités agricoles et agro-industrielles, c’est le cas par exemple
de la palmeraie algérienne, qui constitue le pivot de l’écosystème oasien par l’importance de
sa production et qui génère à chaque compagne des quantités importantes de déchets. La
valorisation de ces déchets, permet d’alimenter le marché national par des substances à
forte valeur ajoutée, en particulier l’alcool éthylique, substance énergétique stratégique et
base de nombreuses industries (Kaidi et Touzi, 2001). La production du bioéthanol à partir
de cette filière présente un très grand intérêt vu la diversité et la disponibilité des ressources
et la possibilité d’éviter la concurrence entre les usages alimentaires et énergétiques.
Mais comme dans tout procédé biotechnologique, il faut veiller à éviter les inhibitions par
les substrats utilisés et les métabolites produits. Or, l’inhibition par l’éthanol produit est un
frein majeur à l’obtention d’un titre et d’une productivité élevée en éthanol. La littérature
qui nous donne des pistes sur les perturbations cellulaires engendrées par l’éthanol et sur les
changements physiologiques et moléculaires mis en place par la levure en réponse à la
présence d’éthanol dans son environnement, précise que l’utilisation de Saccharomyces
cerevisiae a été fortement relancée suite au contexte économique et écologique actuel. Cet
organisme eucaryote unicellulaire et non-pathogène pour l’homme représente un modèle
expérimental avec de nombreux avantages dont la petite taille de son génome, sa facilité à
le manipuler génétiquement, la disponibilité de la séquence de son génome en 1996 et une
abondante littérature sur sa génétique et physiologie.
10
Introduction générale
Les arômes produits par les levures, constituent un élément important dans l’élaboration de
nombreux aliments en conférant à ces derniers leurs propriétés organoleptiques. Leur
marché est en plein essor afin de répondre aux demandes des consommateurs qui sont de
plus en plus attentifs à leur santé et à la composition de leurs aliments. Ces consommateurs
exigent des arômes dont l’innocuité est garantie et qui peut être satisfaite par les arômes
produits par voie microbiologique, en particulier par les levures.
Cependant ces métabolites, comme l’éthanol, deviennent des facteurs de stress importants
car ils s’accumulent dans le milieu de culture et inhibent la croissance des levures ainsi que
leur viabilité (Hu et al., 2007), ce qui diminue leurs rendements (Pina et al., 2004) et affecte
sérieusement les entreprises industrielles. L’étude et la maîtrise de la tolérance à ces
produits ont donc des intérêts économiques pour ces derniers. Cette problématique qui est
un sujet crucial pour la biotechnologie constitue notre deuxième objectif. De ce fait, la
recherche des souches à partir de divers biotopes algériens non encore exploités peut
répondre à ces contraintes. C’est dans ce contexte que s’intègre le présent travail dans
lequel les levures ont été isolées à partir des échantillons biologiques provenant de
différents biotopes. La capacité fermentaire et de production ainsi que leurs pouvoirs de
résistance ont été également étudiés.
Dans ce manuscrit, la première partie présente une étude bibliographique divisée en deux
chapitres distincts. Le premier rapporte des données générales sur les levures à l’échelle
structurale et physiologique. Le deuxième portera sur l’utilisation des levures de manière
très restreinte et se focalisera plus précisément sur les deux métabolites étudiés: l’éthanol et
les arômes.
La deuxième partie est consacrée aux matériels et aux protocoles expérimentaux mis en
place pour la réalisation de ce travail de thèse.
La troisième partie représente et discute l’ensemble des résultats obtenus à la suite de cette
étude.
Nous terminons par une conclusion générale et en envisageant les perspectives possibles à
la poursuite de ce travail.
11
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude Bibliographique
Chapitre I : Généralités et caractéristiques biologiques des
Levures
Les levures, champignons unicellulaires pour tout ou une partie de leur cycle végétatif,
forment un groupe très hétérogène. Il existe des formes intermédiaires entre levures et
champignons supérieurs typiques qui rendent leur distinction avec les champignons
filamenteux très subjective (Kreger-Van-Rig, 1984). Certaines levures ont une reproduction
sexuée qui correspond à une phase de leur cycle biologique où on note une alternance des
phases haploïde et diploïde. Le bourgeonnement qui est le mode de reproduction végétatif
le plus fréquent, est représenté par une évagination qui apparaît à un point de la cellule
mère. Le bourgeon grandit peu à peu en formant une nouvelle cellule qui se détache de la
cellule mère. Deux autres modes de reproduction végétative peuvent être rencontrés: la
fission, caractéristique du genre Schizosaccharomyces, qui se manifeste par la formation
d’une paroi transversale au grand axe de la levure et le bourgeonnement sur stérigmates,
propre au Sterigmatomyces, où la cellule fille prend naissance sur une protubérance formée
sur la cellule mère.
Ces micro-organismes ubiquitaires (Phaff et al., 1978 et Bonaly, 1990) peuvent coloniser
l’air, le sol, l’eau (Lo Presti et al., 2001), le tube digestif de certains animaux et les galeries
d’insectes (Rose et Harrison, 1987 ; Lachance et al., 1998 ; Lachance et al., 2001 et Lachance
et al., 2006). Certaines levures ont été isolées à partir d’environnements extrêmes comme
celles isolées à partir de l'Antarctique (Satyanarayana et Kunze, 2009). D’autres vivent
principalement sur les végétaux riches en sucres, dans les liquides sucrés, ou dans des
aliments tels que le pain et les céréales (Rocco et al., 1985). Les levures utilisatrices de
lactose se rencontrent ainsi dans les produits laitiers (Baroiller et Schmidt, 1990).
Les levures des produits alimentaires n’étant pas pathogènes, elles ne causeront pas
d’intoxication alimentaire mais peuvent produire par leur développement des altérations de
la qualité marchande de ces aliments (Rambaud, 2004). Enfin un petit nombre de levures
pathogènes sont à signaler, tout spécialement Candida albicans responsable du muguet des
jeunes enfants, des vaginites, etc. et Cryptococcus neoformens disséminé par les pigeons et
qui peut provoquer des méningites fatales (Koenig, 1995 ; Senet, 1995 ; Odds, 1995 et Hart
et Shears, 1997).
En se basant sur cette large distribution des levures, différents produits provenant de
différents biotopes algériens ont été choisis pour leur isolement:
 Les dattes
Les dattes, famille des Palmacées, sont des fruits charnus, de 4 à 6 cm de long avec un
noyau allongé. Elles sont jaunes, oranges, rouges ou même brunes lorsqu’elles arrivent à
13
maturité. Elles sont très énergétiques avec une valeur de 287 Kcal/100 g et très riches en
sucre (glucose, fructose et saccharose), en sels minéraux (potassium, calcium, magnésium et
fer) et en vitamines, en particulier les vitamines B 2, B3, B5 et B6. Leur richesse en fibres est
très importante. Par contre, elles sont pauvres en protéines (4 à 6%) et leur teneur en eau
est de 20% pour les dattes sèches et de 70% pour les dattes fraîches. Elles sont très
appréciées pour leur forte concentration en antioxydants (principalement les caroténoïdes
et les composés phénoliques) et leur pauvreté en matières grasses. Ils existent au moins
1200 variétés de dattes en Algérie. Les trois variétés choisies sont parmi les plus
consommées en Algérie à cause de leur consistance et de leurs multiples destinées: DegletNour est destinée à la consommation, Gharas pour la pâtisserie et Hamira pour la confiture
(Matallah, 2004).
 Le melon
C’est un fruit savoureux, sucré et parfumé, très consommé en Algérie. Le cantaloup,
variété possédant une note parfumée très prononcée, a été utilisé pour l’isolement. Il
constitue de plus une source importante de sels minéraux en particulier le potassium. Il est
également très riche en antioxydants, majoritairement des caroténoïdes qui représentent
85% et qui lui confèrent sa couleur rouge-orangée ; ainsi que certains composés
phénoliques, des superoxyde-dismutases et différentes vitamines comme la vitamine A et C
(Lester et Crosby, 2004).
 Le cornichon
Le cornichon, proche du concombre, présente les mêmes caractéristiques nutritionnelles.
Il contient des vitamines, des fibres et des minéraux en particulier le sodium (700mg/100g),
dû au sel utilisé pour le dégorger. Il reste un condiment très apprécié pour son léger piquant
qui ne prend pas le dessus sur les notes aromatiques et acidulées pour lesquelles il a été
choisi.
 Le lait
Le lait, liquide biologique de couleur blanchâtre légèrement visqueux, constitue un
aliment très riche dont la composition et les caractères physico-chimiques varient
sensiblement en fonction de plusieurs facteurs tels que l’espèce et la race animale, la région
et la saison. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi différentes régions et animaux
pour la récolte de nos échantillons. Le lait est un mélange très complexe et très instable qui
contient principalement des protides, des glucides (lactose) et très peu de lipides. Les
éléments minéraux sont très variés puisqu’il contient du calcium, du magnésium, du
phosphore et du sodium, et d’autres oligoéléments comme le fer, le fluor et le zinc. Son
profil vitaminique est très riche et est représenté par la vitamine A, D et les vitamines du
groupe B.
Le lait de brebis est plus riche que le lait de vache puisqu’il contient plus de matière grasse et
de matière azotée avec des teneurs en lactose et en sels minéraux plus élevées.
14
Le lait de chèvre est plus blanc car il ne contient pas de β-carotène.
Le lait de chamelle contient autant de protéines que le lait de vache avec une teneur élevée
en sels minéraux (sodium, potassium, magnésium et l’iode), en vitamines B (thiamine en
particulier) et C. Il présente la teneur la plus élevée en vitamines C parmi toutes les espèces
analysées (3,5 mg/100 ml). Ce lait se caractérise par sa teneur faible en sucre et une matière
grasse naturellement basse où on note 40 % de cholestérol de moins que le lait de vache
(Dillon, 1989). Ces caractéristiques diététiques sont à l’origine de l’augmentation de sa
consommation ces dernières années malgré son prix inabordable. Malgré les multiples
études microbiologiques principalement sur les bactéries lactiques, aucune étude n’a abordé
jusqu’à ce jour la nature des levures, leurs diversités et leur potentiel technologique dans ce
produit, ce qui a justifié le choix de ce lait pour notre étude.
 Le miel
Le miel est une solution saturée en sucres principalement le glucose et le fructose (en
plus du maltose, du saccharose et d’autres polysaccharides). Il est très riche en vitamines,
essentiellement les vitamines B1, B2, B3, B5, B6, C et accessoirement les vitamines A, B8, B9, D
et K. Il est très apprécié pour son effet antibactérien.
D’autres composants sont présents comme les flavonoïdes, les arômes, les grains de pollen,
les acides organiques, les sels minéraux et les protides où on note un très grand nombre
d’acides aminés. Cet échantillon, choisi pour sa richesse en différents sucres, a été récolté de
la région de Mostaganem très riche en flore. A notre connaissance aucune étude
microbiologique n’a étudié la nature des levures de ce produit, d’où son choix pour cette
étude.
1- Morphologie
La morphologie des levures est très variée. On distingue trois formes: la forme levure, le
pseudomycélium et le mycélium.
1.1-
La forme levure
C’est la plus simple, il s’agit de cellules uniques, libres ou associées deux à deux ayant une
morphologie caractéristique: sphérique, ovoïde, globuleuse ou cylindrique. Des formes
spécifiques sont parfois distinguées comme la forme apiculée (Hanseniaspora et Kloeckera),
en bouteille (Pityrosporum), triangulaire (Trigonopsis) ainsi que la forme pyramidale et
ogivale (Dekkera) (Walker et White, 2005). Ceci en plus des arthrospores, des ballistospores
et des chlamydospores (Barnett et al., 1983). Sous cette forme unicellulaire, les dimensions
sont de 2,5 à 10,5 µm de large et de 4,5 à 21 µm de long. Cette longueur peut dépasser, chez
certaines espèces, les 30 µm. Ces dimensions, ainsi que leurs aspects dépendent
fréquemment de l’âge des cellules et des conditions de culture (Scherr et Weaver, 1953).
15
1.2- La forme pseudomycélium
Chez certaines espèces et après bourgeonnement, les cellules filles restent associées les
unes aux autres et donnent des chaînettes constituées de plusieurs cellules formant un
pseudomycélium. Ce dernier peut être rudimentaire ne comptant que quatre à cinq cellules
comme il peut être plus important et présenter des ramifications. Souvent les cellules
centrales s’allongent et dessinent un axe principal, tandis que les cellules localisées aux
extrémités restent courtes et forment des blastospores (ou blastoconidies) au niveau des
constrictions, l’anaérobiose favorisent la production de cette forme (Belin, 1996).
1.3- La forme mycélium
La propriété de donner un vrai mycélium séparé par des cloisons ou septa caractérise
certaines espèces de levures. Cette différenciation résulte d’un allongement important des
cellules et l’hyphe ainsi formée prolifère par une croissance apicale. Dans la majorité des cas,
c’est le pseudomycélium qui se transforme en mycélium, mais il existe des espèces chez
lesquelles les levures donnent directement un filament sans passer par ce dernier. Son
élaboration débute par l’émergence d’un tube germinatif qui, par croissance apicale,
génèrera un filament qui s’étendra à un rythme constant, se cloisonnera et se ramifiera pour
constituer une hyphe et un mycélium qui se propagera pour donner un réseau bien
enchevêtré (Bouix et Leveau, 1980). Occasionnellement un septum peut séparer la forme
levure de la forme mycélium, c’est ce qui a été observé par Rahary et ses collaborateurs chez
C. albicans en mettant en évidence l’action de la cytohélicase de la cellule mère dans la
formation de ce septum (Rahary et al., 1984). La transition inverse existe également et selon
plusieurs auteurs, les levures apiculées qui se multiplient par bourgeonnement bipolaire,
seraient intermédiaires entre la forme mycélienne et la forme unicellulaire bourgeonnante
(Lodder, 1971).
Ce dimorphisme, voire ce polymorphisme est un phénomène marquant de certaines
espèces. Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer ce mécanisme (Nickerson et
Falcone, 1956 ; Bartnicki-Garcia, 1963 ; Bartnicki-Garcia et Lippman, 1969 ; Kanetsuna et al.,
1972 et San-Blast, 1979), mais ces dernières sont très anciennes et reposent sur les
observations de trois espèces seulement. Ce phénomène reste donc inexpliqué. Cependant,
il est sûr que cette transition levure-mycélium peut être provoquée par des facteurs
externes variés comme la température, le pH et la teneur en glucose (Pollack et Hashimoto,
1987 et Vidotto et al., 1988).
2- Structure cellulaire de la forme levure
La structure cellulaire des levures, qui est sous la dépendance des conditions physicochimiques et de l’âge de la culture, est de type eucaryote et possède une paroi épaisse et
rigide, un noyau limité par une membrane nucléaire, un cytoplasme contenant divers
organites et inclusions dont des mitochondries et une grande vacuole. Chez certaines
16
levures, on note l’existence d’une capsule constituée de phosphomannanes solubles dans
l’eau (Hansenula, Pichia), de mannanes plus ou moins ramifiés (Rhodotorula) ou
d’hétéropolysaccharides (Cryptococcus) (Larpent, 1991).
2.1- La paroi
C’est une structure dynamique externe qui englobe toute la cellule conférant sa rigidité et
sa forme caractéristique. Elle représente 15 à 20% de la matière sèche de la cellule,
d’épaisseur 150 à 230 nm. Sa composition chimique qui est sujette à des variations
importantes suivant les espèces, le cycle cellulaire et les conditions de culture (AguilarUscanga et François, 2003) comprend environ 80% de polysaccharides principalement des
mannanes (Peat et al., 1961 ; Gorin et al., 1969 et Mc Ellan et Lampin, 1969) et des glucanes
(Bacon et al., 1969 et Manners et masson, 1969) en proportion quasi égales, 10 à 20% de
protéines, 7 à 10% de lipides, 5% de sels minéraux et 1 à 3% de chitine qui se trouve
majoritairement au niveau des cicatrices de bourgeonnement afin de maintenir l’intégrité de
la paroi (Suarit et al., 1988 et Lipke et Ovalle, 1998). La couche intérieure de la paroi est en
grande partie responsable de sa force mécanique et fournit aussi les sites d'attachement pour
les protéines qui forment sa couche extérieure (Klis et al., 2002). Cette structure joue un rôle
important en maintenant une structure élastique qui assure une protection osmotique et
constitue une barrière physique.
2.2- L’espace périplasmique
C’est un espace qui est délimité par la membrane plasmique et la couche interne de la
paroi et représente le seul site de localisation cellulaire des enzymes telles que l’invertase
(Neumann et Lampen, 1967), la phosphatase acide (Schurr et Yagile, 1971 et Arnold, 1981),
les β-galactosidases, les β-glucanases (1-3) et β (1-6) et des protéases (Barnett et Robinow,
2002).
2.3- La membrane plasmique
C’est une membrane simple et fragile qui se trouve sous la paroi avec une épaisseur de
7,5 nm, retenant l’ensemble des constituants intracellulaires et résistante aux pH acides
mais altérée par des pH alcalins. Les membranes biologiques sont composées de deux types
de constituants principaux: les lipides et les protéines. La diversité des membranes étant très
grande, les compositions lipidiques diffèrent selon les organismes. Dans la composition
lipidique de la membrane plasmique, on distingue les phospholipides et les stérols. Parmi ces
derniers c’est l’ergostérol qui est le dérivé majeur et dont la teneur varie d’une espèce à
l’autre et en fonction de l’âge des cellules. Les autres stérols sont des précurseurs de
l’ergostérol. Un grand nombre de travaux démontrent qu’en aérobiose les levures
contiennent surtout des stérols insaturés tels que l’ergostérol, tandis qu’en anaérobiose
elles renferment des quantités non négligeables de squalène, triterpène linéaire
17
intermédiaire de la biosynthèse des stérols. Ces derniers qui sont soit libres soit estérifiés
avec un acide gras augmentent la rigidité de la membrane et diminuent sa perméabilité
(Bayley et Parks, 1975). Les phospholipides, qui sont intimement associés aux protéines et
aux stérols, assurent à la membrane sa fluidité permettant ainsi le bon fonctionnement des
processus métaboliques.
2.4- Le cytoplasme
Le cytoplasme renferme en plus des organites cellulaires tels que les mitochondries (qui
contiennent des ADN, ARN, ARN polymérase et des enzymes respiratoires) et l’appareil de
Golgi, des vacuoles (où se trouve le pool des acides aminés en plus des purines, des
orthophosphates polymérisés et des hydrolases) et des ribosomes. Il contient également des
enzymes, notamment celles de la glycolyse et de la fermentation alcoolique, des
polysaccharides, des polyphosphates, du glycogène et du tréhalose (Larpent, 1991).
2.5- Le noyau et le réticulum endoplasmique
La levure possède en général un seul noyau qui est entouré d’une enveloppe à deux
membranes où la membrane externe est en relation continue avec un système membranaire
cytoplasmique important, le réticulum endoplasmique. En de multiples endroits les
membranes externe et interne fusionnent pour former des pores, ces derniers permettent
les échanges entre le noyau et le reste de la cellule. Il contient le génome de la levure qui est
réparti sur les chromosomes dont la structure est semblable à celle des autres eucaryotes
avec un enroulement de l’ADN en «grains de chapelet» formés par des nucléosomes
constitués d’histones de type H2a, H2b, H3 et H4. Ce nucléosome, découvert grâce aux
progrès de la biophysique et de la microscopie électronique est considéré comme unité de
base comprenant 146 paires de bases d’ADN, enroulés autour d’un octamère de protéines
histones.
Le nombre des chromosomes varie selon les espèces, pouvant atteindre 3 chez
Hansenula holstii, 2 chez H. anomala et 16 chez S. cerevisiae haploïde. Chez cette dernière,
le génome comporte environ 12,5 millions de paires de bases qui ont été entièrement
séquencées en 1996 dans le cadre d’un travail international qui a pris environ 8 années en
utilisant les technologie standard de séquençage par la méthode Sanger (Goffeau et al.,
1996). Depuis, beaucoup d’autres levures ont été séquencées utilisant de technologies
nouvelles de séquençage (Souciet et al., 2009). On estime que la levure S. cerevisiae partage
23% de son génome avec l’homme, raison pour laquelle elle est utilisée comme organisme
modèle en biologie moléculaire et en génétique. Les levures peuvent être haploïdes,
diploïdes ou polyploïdes. La polyploïdie est fréquente chez les souches industrielles. Ceci en
plus des plasmides, petite molécule cyclique à ADN en double brin possédant 6Kpb qui est
un élément extra chromosomique présent chez presque toutes les souches de S. cerevisiae
(Guerineau et al., 1971). Le rôle de ce plasmide, 2µm, localisé dans le noyau de la levure à
raison de 60 copies (Livingston, 1977) n’est pas très bien connu. En revanche il est très utilisé
en tant que vecteur au cours des transformations (Broach, 1982).
18
3- Les exigences nutritionnelles
Pour leur croissance, les levures ont besoin d’une température et d’un pH adéquats,
d’oxygène, de carbone, d’azote minéral ou organique, de divers minéraux, principalement le
soufre assimilé sous forme inorganique SO 42- (Rose, 1980) et le phosphore qui participe au
maintien de l’intégrité de la membrane ainsi qu’à la synthèse des lipides et des hydrates de
carbone (Winter, 1988). Certaines d’entre elles ont besoin d’une ou plusieurs vitamines,
dont la biotine, la thiamine, l’acide pantothénique (ou la β alanine) et plus rarement
l’inositol et autres facteurs de croissance. Par contre, il est fréquent que les vitamines soient
de bons activateurs de la croissance sans être rigoureusement indispensables (Delcourt,
2011).
Les composés carbonés sont d’une grande importance pour les levures puisqu’elles
fournissent, le carbone nécessaire pour la biosynthèse de constituants cellulaires et l’énergie
nécessaire à son fonctionnement. Les glucides sont les plus fréquemment utilisés, en
particulier les monosaccharides comme les hexoses, les disaccharides et les trisaccharides.
D’autres glucides abondants et peu couteux comme les pentoses et les polysaccharides ont
fait l’objet de nombreux travaux ces dernières années (Waldron, 2010). Cependant, d’autres
composés carbonés peuvent être utilisés tels que les alcools, les acides ou les composés
moins oxygénés comme les hydrocarbures. On peut citer à titre d’exemple les alcanes qui
sont utilisés principalement par les levures du genre Candida (Lévi et al., 1979). Mais aucune
levure n’est capable d’utiliser le méthane contrairement au méthanol qui est métabolisé par
plusieurs genres tels que Candida, Hansenula, Pichia et Torulopsis (Veenhuis et al., 1983).
Les sources de carbone pouvant être utilisés par les levures sont résumées dans le tableau 1.
Tableau 1: Les sources de carbone pouvant être utilisées par les levures
(Modifié de : Walker et White, 2005)
Sources de carbone
Hexoses
Disaccharides
Trisaccharides
Polysaccharides
Oligosaccharides
Pentoses
Alcools
Acides organiques
Acides gras
Hydrocarbones
Composés aromatiques
Exemples
D-glucose, D-galactose, D-fructose, D-mannose
maltose, saccharose, lactose, tréhalose, mélibiose,
cellobiose, mélézitose
raffinose, maltotriose
inuline, cellulose, hemicellulose, chitine
maltotetraose, maltodextrines
L-arabinose, D-xylose, D-xylulose, L-rhamnose
méthanol, éthanol, glycérol
acétate, citrate, lactate, malate, pyruvate, succinate
oléate, palmitate
alcanes
phenol, cresol, quinol, resourcinol, catechol, benzoate
19
L’azote est le deuxième constituant important, jouant un rôle capital puisqu’il entre dans la
composition de plusieurs molécules, essentielles au fonctionnement cellulaire allant des plus
simples comme les acides aminés, les sucres aminés, les nucléotides, les coenzymes et les
vitamines jusqu’aux macromolécules, telles que les protéines, les acides nucléiques et la
chitine (Sanchez, 2008). La plupart des levures sont capables d’utiliser les sources azotées
minérales simples sous forme d’ion ammonium qui sont apportés dans le milieu par le
chlorure d’ammonium, le nitrate d’ammonium, le phosphate d’ammonium et surtout le
sulfate d’ammonium, meilleur composé car il apporte en même temps du soufre nécessaire
à la synthèse de certains acides aminés. L’azote peut être apporté également par des
composés organiques divers tels que les acides aminés, les peptides ou des polypeptides
dont la taille nécessite pour leur utilisation une hydrolyse par des peptidases intracellulaire.
Certaines levures, en particulier les Hansenula, Pachysolen, Citeromyces et certaines espèces
de Candida et de Trichosporon, sont capables d’utiliser les nitrites et les nitrates.
Généralement, les espèces qui utilisent les nitrates utilisent les nitrites, mais l’inverse n’est
pas toujours vrai, ainsi Debaryomyces hansenii et Pichia pinus utilisent les nitrates mais pas
les nitrites. Chez Brettanomyces bruxellensis et B. intermedius, l’utilisation des nitrates est
une caractéristique stable au moins à l’intérieur de l’espèce ce qui en fait un outil utilisé à
des fins taxonomiques (Lodder, 1970 ; Kreger Van Rij, 1984 et Moore et al., 1988). Enfin
l’urée en association avec la biotine et les bases puriques et pyrimidiques peut aussi être
utilisée comme source d’azote.
4- Métabolisme
Le métabolisme des levures est orienté par la source carbonée et les conditions
environnementales pour être : oxydatif, oxydo-réductif ou fermentaire. La voie de
dégradation des glucides, la glycolyse, convertit les sucres en pyruvate. L’entrée dans cette
voie varie selon le glucide tandis que la destinée du pyruvate dépend à la fois du sucre utilisé
et de l’espèce de levure considérée (Marden, 2007).
4.1- Métabolisme oxydatif
Ce type de métabolisme nécessite la présence d’oxygène et une concentration en
substrat limitée afin d’éviter un changement métabolique vers la production d’éthanol et
d’autres co-métabolites (effet Crabtree). Dans ces conditions, le glucose est oxydé via les
voies métaboliques de la glycolyse, du cycle de Krebs et de la phosphorylation oxydative. Le
cycle de Krebs permet la réduction du NADH et FADH2 grâce à la production des co-enzymes
et la synthèse de nombreux précurseurs nécessaires à la formation des principales
macromolécules (Rose et Harrison, 1971 et Van Dijken et Scheffers, 1986). Quant à la
phosphorylation oxydative, elle permet la régénération des co-enzymes réduits NADH et
FADH2 produits lors de la glycolyse. Ainsi les électrons libérés sont transférés à l’oxygène
moléculaire pour former une molécule d’eau et les protons exportés permettent de
maintenir le potentiel transmembranaire entre l’espace intermembranaire et la matrice de
20
la mitochondrie. De cette manière, l’entrée des protons à l’intérieur de la mitochondrie
permet la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique grâce aux ATP synth
ases situées à la membrane interne mitochondriale. L’efficacité de la chaîne respiratoire est
illustrée par le rapport du nombre de moles d’ATP formées par atome d’oxygène consommé
(P/O) variable selon les souches. Ce métabolisme qui conduit à la formation du CO2 et H2O
est très énergétique et permet aux levures de se maintenir en vie, de synthétiser de la
matière organique et de produire de la biomasse (X) avec un rendement cellulaire élevé (Lai,
2010). Dans ce cas l’oxydation du sucre est complète et le bilan énergétique théorique de
cette voie métabolique est décrit par l’équation suivante :
C6H12O6 + 6 O2 + 28Pi + 28 ADP→ X + 6 CO2 + 6 H2O + 28 ATP.
4.2- Métabolisme fermentaire
En anaérobiose, les levures sont capables de fermenter le glucose en éthanol, en dioxyde
de carbone, avec coproduction de glycérol, de certains acides et esters (Leyral et Vierlin,
2007 et Lai, 2010). Dans ce métabolisme, la fonction d’accepteur final d’électrons est
assurée par des molécules organiques où la levure utilise d’abord le NAD+ comme accepteur
intermédiaire d’électrons qui est réduit en NADH. La réduction finale de l’acétaldéhyde en
éthanol et en dioxyde de carbone permet ainsi de maintenir l’équilibre de la balance redox
en réoxydant les NADH produits au cours de la glycolyse, voie principale de dégradation du
sucre en pyruvate. Le bilan énergétique de cette transformation est décrit par l’équation qui
suit:
C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP → 2 C2H6O + 2 CO2 + ATP (20 Kcal).
4.3- Métabolisme oxydo-réductif
Certaines levures comme S. cerevisiae sont très sensibles au glucose et un excès de ce
sucre peut faire basculer le métabolisme oxydatif vers un métabolisme oxydo-réductif. Elles
sont alors définies comme levures Crabtree positive.
Une autre interprétation du shift métabolique chez la levure (oxydatif/oxydo-réductif) est
basée sur le phénomène d’overflow du carbone au niveau des nœuds pyruvate et
acétaldéhyde (figure 1). Au niveau du nœud pyruvate, la pyruvate déshydrogénase a une
affinité plus forte pour le pyruvate que la pyruvate décarboxylase, mais sa vitesse maximale
est plus faible. Aux faibles flux glycolytiques, le pyruvate est converti via le pyruvate
déshydrogénase vers le cycle de Krebs. Quand le flux glycolytique dépasse une valeur
critique, l’enzyme pyruvate déshydrogénase est saturée et de l’acétaldéhyde est formé. Il en
est de même au niveau du nœud acétaldéhyde. Celui-ci est préférentiellement converti en
acide acétique mais lorsque l’acétaldéhyde déshydrogénase est saturée, l’acétaldéhyde
serait transformé en éthanol (Lei et al., 2001).
21
Figure 1: Nœud métabolique du pyruvate et de l'acétaldéhyde
(Lei et al., 2001).
4.4- Métabolisme des monosaccharides
Les monosaccharides sont métabolisés différemment après le passage à travers la
membrane plasmique qui constitue la première étape dans ce métabolisme.
4.4.1- Le glucose, le fructose et le mannose
Ces sucres sont utilisés par toutes les levures et leur catabolisme laisse distinguer: les
levures à métabolisme uniquement respiratoire où le pyruvate formé à partir de ces sucres
est oxydé par le cycle de Krebs et les levures à métabolisme aéro-anaérobie où l’utilisation
des sucres se fait par la voie de la glycolyse qui a lieu dans le cytosol (voie d’EmbdenMeyerhof). En anaérobiose, ces sucres sont métabolisés en éthanol et en dioxyde de
carbone. La concentration des sucres n’a pas d’effet sur ce métabolisme. En revanche, en
aérobiose, la concentration de ces sucres est importante et peut inhiber chez certaines
levures la respiration. Le métabolisme est alors orienté vers la voie fermentaire même en
présence d’oxygène. C’est ainsi que la respiration et la fermentation contribuent à la
dégradation de ces sucres. On peut alors distinguer quatre phases:



Une première phase exponentielle où le métabolisme est essentiellement
fermentaire. On note une production de biomasse et d’éthanol à la suite de la
consommation du sucre.
Une phase diauxique qui explique la consommation du sucre et au cours de la quelle
par dérepression des enzymes correspondantes, le métabolisme est orienté vers un
métabolisme oxydatif.
La troisième phase est purement respiratoire où la levure consomme l’éthanol
produit lors de la première phase.
22

Quand l’éthanol est épuisé, la croissance s’arrête et les cellules entrent en phase
stationnaire.
4.4.2- Le galactose et le mélibiose
L’utilisation de ces sucres se fait selon la voie de Leloir (Caputto et al., 1949) où le
galactose est converti en glucose-1-phosphate qui entrera dans la glycolyse comme le
montre la figure 2.
Figure 2 : Voie de Leloir (métabolisme du galactose et du mélibiose)
(Timson, 2007 et Pannala et al., 2010).
4.5- Métabolismes des di- et tri-saccharides
Les disaccharides sont utilisés selon deux manières :


La première, où après avoir traversé la membrane plasmique le sucre est hydrolysé
dans le cytoplasme, c’est le cas pour le maltose.
La deuxième où les sucres sont hydrolysés dans l’espace périplasmique par l’invertase
pour le saccharose et le raffinose et par le mélibiase pour le mélibiose.
Ainsi les monosaccharides obtenus après hydrolyse sont utilisés par la levure comme
décrit précédemment.
4.5.1- Le lactose : est un disaccharide formé d’unité de galactose lié en β-1,4 à une
unité de glucose. Son hydrolyse conduit donc au galactose qui entre dans la voie
métabolique citée précédemment en faisant intervenir trois enzymes: kinase, transférase et
épimérase.
23
4.5.2- Le maltose : est un disaccharide constitué de deux unités de glucose liés en α1,4. Son hydrolyse par l’α-glucosidase donne du glucose qui entre dans la glycolyse. Son
transport est inactivé par la répression catabolique du glucose ainsi que l’inhibition de la
synthèse protéique en carence azotée (Brondijk et al., 2001).
4.5.3- Le saccharose : est un disaccharide constitué d’une unité de glucose liée en α1,2 à une unité de fructose. Son hydrolyse est assurée par l’invertase (β-fructofuranosidase).
Deux types d’invertase peuvent être rencontrée chez la levure : la première localisée dans le
cytoplasme et nécessite le transport du saccharose à travers la membrane plasmique pour
son hydrolyse (Stambuk et al., 1999) et la seconde est localisée dans l’espace périplasmique.
La forme cytoplasmique est exprimée de façon constitutive alors que l’expression de la
forme périplasmique est réprimée par de fortes concentrations en glucose (Carlson et
Botstein, 1982) et au contraire induite par de faibles taux de glucose (Ozcan et al., 1997).
4.5.4- Le tréhalose : est un disaccharide composé de deux unités de glucose reliées
entre elles par une liaison α-1,1 : α-D-glucopyranonyl-α-D-glucopyranoside. Il se caractérise
par son rôle de protecteur contre divers stress environnementaux et un rôle de sucre de
réserve à l’instar du glycogène. Son utilisation comme substrat carboné requiert une
tréhalase dite ‘acide’ codée par le gène ATH1 (Parrou et al., 2005).
4.5.5- L’isomaltose : est un disaccharide constitué de deux unités de glucose liées en
α- 1,6. Il est hydrolysé avec l’α-méthylglucoside, son analogue chimique, par des isomaltases
codés par cinq gènes (Naumov et Naumova, 2010 et Teste et al., 2010).
4.5.6- Le mélibiose : est un disaccharide constitué d’une unité de galactose liée en α1,6 à une unité de glucose. Son hydrolyse est assurée par une enzyme secrétée dans le
périplasme et appelée mélibiase et les sucres libérés sont transportés à l’intérieur de la
cellule par les transporteurs d’hexoses. Le glucose sera ainsi utilisé par la voie d’EmbdenMeyerhof et le galactose par la voie de Leloir.
4.5.7- Le raffinose : est un tri-saccharide constitué d’une unité de galactose, une
unité de glucose et une unité de fructose (α-D-galactopyranonyl-(1-6)-α-D- glucopyranosyl(1-2)-β-D-fructofuranose). Son hydrolyse se fait en deux étapes: la première utilise
l’invertase en libérant le fructose et du mélibiose et la seconde au cours de laquelle ce
dernier est dégradé par la mélibiase qui est une alpha-galactosidase codée par les gènes
MEL.
4.6- Métabolismes des pentoses
Le xylose est un aldopentose majoritaire de l’hémicellulose qui représente 20 à 50% de la
biomasse végétale terrestre (déchets agricoles, produits dérivés du bois, etc.) (Gnangui,
2010) et constitue, après le glucose, le sucre le plus abondant dans la nature (Carvalho,
2013) qu’on retrouve dans de nombreuses plantes (Ali et al., 2010 ; Buckeridge et Goldman,
24
2011 ; Xu et Lou, 2012 ; Jayapal et al., 2013 et Zheng et al., 2013). La production du
bioéthanol à partir du xylose présent dans cette biomasse représente donc un enjeu
économique important puisque cette biomasse est renouvelable (Ragauskas et al., 2006). Le
L-arabinose est également présent dans les hydrolysats lignocellulosique, bien que moins
abondant. C’est ce qui a conduit ces dernières années, de nombreux chercheurs à s’orienter
vers ces glucides abondants et peu couteux. Ces deux pentoses (D-xylose et L-arabinose)
entrent dans la voie des pentoses phosphate après leur conversion en D-xylulose (figure 3)
et l’utilisation du xylose serait due à une xylitol deshydrogenase (Wenger et al., 2010).
Certaines souches de Saccharomyces cerevisiae peuvent pousser sur xylose comme seule
source de carbone, mais aucune n’est capable de le fermenter aussi efficacement que le
glucose (Attfield et Bell, 2006). Seul le xylulose, isomère du xylose peut être fermenté par
Saccharomyces cerevisiae. De nombreuses stratégies d’ingénierie métabolique ont été
employées au cours de ces années pour créer des souches de levures capables de fermenter
ces deux pentoses. Des enzymes hétérologues de la voie métabolique du xylose ont été
introduites chez S. cerevisiae (Kotter et al., 1990, Kuyper et al., 2003 et Kuyper et al., 2004).
Des efforts ont été également faits pour améliorer ou ajuster les activités enzymatiques de la
voie métabolique du xylose (XR, XK et XDH) (Jeffries et Jin, 2004 ; Toivari et al., 2004 et Van
Maris et al., 2007), le flux de la voie des pentoses phosphate (Jeppsson et al., 2002), ou
accroître l’utilisation du xylose par évolution dirigée ou mutagénèse aléatoire (Sonderegger
et Sauer, 2003 et Ni et al., 2007). Des méthodes d’ingénierie évolutive sont utilisées pour
améliorer la conversion de ces deux sucres en éthanol (Garcia-Sanchez et al., 2010 ;
Okamoto et al., 2012 et Kim et al., 2013).
En dépit du nombre des résultats obtenus, il apparaît que la construction de souches de
levures génétiquement modifiées capables de convertir efficacement le xylose et l’arabinose
en éthanol est un objectif difficile car il requiert de modifier les flux métaboliques de la
levure et ses équilibres redox et énergétiques. En revanche d’autres levures comme Candida
shehatae, Pachysolen tannophilus et Pichia stipitis peuvent convertir le D-xylose en éthanol
(Maleszka et Schneider, 1982 ; Lu, 2007 ; Agbogbo et Coward-Kelly, 2008 ; Dufour et al.,
2011 et Silva et al., 2012), mais elles présentent des performances fermentaires nettement
inférieures à celles de S. cerevisiae, ainsi qu’une forte sensibilité à l’éthanol et aux inhibiteurs
présents dans les hydrolysats (acide acétique par exemple). Ces limitations et ces contraintes
constituent une barrière à leur utilisation à l’échelle industrielle, mais elles ont été utilisées
pour caractériser les voies de l’utilisation du xylose dans la perspective d’utiliser leurs gènes.
25
Figure 3 : Schéma simplifié de la voie métabolique de la dégradation du xylose
par les levures (Modifié de: Chu et Lee, 2007 ; Lee et al., 2012).
Abréviations : XR (Xylose réductase) ; XDH (Xylose déshydrogénase) ;
XK (Xylulokinase) ; XI (Xylose isomérase) ; ADH (Acétaldéhyde déshydrogénase).
4.7- Métabolisme des polysaccharides
Les polysaccharides nécessitent pour leur hydrolyse des enzymes extracellulaires que la
plupart des souches de levure, en particulier S. cerevisiae, ne possèdent pas. Cependant
d’autres enzymes hétérologues telles que amylases, cellulases, xylanases et pectinases, sont
exprimées chez S. cerevisiae afin qu’elle puisse fermenter un nombre de carbohydrates plus
large. Deux polysaccharides peuvent être utilisés : l’amidon qui est une ressource biologique
renouvelable importante et le glycogène qui représente un sucre de réserve et donc une
source d’énergie directement accessible pour la levure.
4.7.1- Amidon : est un polysaccharide constitué de deux homopolymères (l’amylose
et l’amylopectine) qui sont formés d’unités glucose liées en α-1,4 et ramifiées grâce à des
liaisons α-1,6 se distinguant par leur degré de polymérisation. L’amylose est très légèrement
ramifiée avec de courtes branches et est formée de 600 à 1000 molécules de glucose.
L’amylopectine est ramifiée avec de longues branches toutes les 24 à 30 molécules et est
formée de 10.000 à 100.000 unités glucose. L’exclusivité dans l’utilisation de ce
polysaccharide est réservée aux souches Saccharomyces cerevisiae var diastaticus, qui
possèdent des gènes codant la glucoamylase extracellulaire (1-4-α-D-glucohydrolase)
capable de métaboliser l’amidon. Ceci en plus de quatre espèces de Schwanniomyces qui
fermentent l’amidon en éthanol qui n’est pas utilisé totalement mais avec de faibles
concentrations (Stewart et Russel, 1983).
26
4.7.2- Glycogène : est un polymère formé d’unités de glucose liées en α-1,4 (pour les
chaînes principales) et des liaisons α-1,6 entraînant la structure ramifiée de ce
polysaccharide. C’est sous cette forme que certaines espèces, comme Saccharomyces
cerevisiae, stockent le glucose. C’est un sucre de réserve très important utilisé lors des
conditions stressantes.
4.8- Le transport des sucres
Le transport des hexoses tels que le glucose et le fructose vers l’intérieur de la cellule
s’effectue par diffusion facilitée, un mécanisme passif sans apport d’énergie (Maier et al.,
2002), caractérisé par leur faible affinité pour le glucose (Km: 10 à 20 mM) et le fructose
(Km: 50 à 70 mM) (Serrano et Delafuente, 1974). Quand au galactose et au mélibiose, le
passage à travers la membrane plasmique se fait par l’intermédiaire d’un transporteur
inductible qui est réprimé par de fortes concentrations en glucose (Ozcan et Johnston,
1999). Cette activité de transport des hexoses est régulée par la disponibilité en azote
assimilable dans le milieu extérieur et par l’activité de synthèse protéique des cellules
(Busturia et Lagunas, 1986). Cette diminution d’activité correspondrait à une séquestration
des transporteurs membranaires par endocytose suivi d’une dégradation plus tardive de ces
transporteurs par protéolyse. Une addition d’azote assimilable en cours de phase
stationnaire permet de restaurer partiellement une activité de synthèse protéique et en
conséquence une réactivation des systèmes de transport des hexoses, restaurant ainsi une
certaine activité fermentaire (Bely et al., 1994). Toutefois cette restauration d’activité de
transport des hexoses peut s’effectuer en présence d’un inhibiteur spécifique de la
glycosylation des systèmes de transport (tunicamycine B), indiquant ainsi qu’une synthèse
De Novo des systèmes de transport n’est pas nécessaire pour une reprise de l’activité de
transport: ce résultat pourrait étayer le rôle d’une séquestration des systèmes de transport
des hexoses par endocytose dans le phénomène d’inactivation catabolique.
Le transport du xylose est assuré par deux systèmes de forte affinité et un de faible affinité
qui consiste en une diffusion facilitée (Gardonyi et al., 2003). Chez S. cerevisiae, le xylose est
transporté par les transporteurs d’hexoses mais avec une affinité moins forte que pour le
glucose, en plus le transport du xylose est inhibé par ce dernier (Saloheimo et al., 2007). En
revanche, le système de transport du L-arabinose est totalement différent de celui du xylose
malgré la ressemblance de leur catabolisme comme il a été démontré par Fonseca et ses
collaborateurs. Les deux transporteurs caractérisés sont très spécifiques à l’arabinose
(Fonseca et al., 2007).
4.9- Le transport des ions ammonium
L’ion ammonium représente la source azotée la plus assimilée par la levure. Chez
Saccharomyces cerevisiae, par exemple, Dubois et Grenson ont montré l’existence de deux
transporteurs (perméases) pour l’ion ammonium qui possèdent des affinités différentes (Km:
27
0.2 et 2 mM respectivement). Ils ont également montré que ce transport s’effectue par
l’intermédiaire d’un uniport électrophorétique accumulatif permettant d’atteindre des
concentrations intracellulaires de l’ordre de 850 à 1000 fois la concentration extracellulaire
(Dubois et Grenson, 1979). Cette activité de transport nécessite la présence d’une source de
carbone énergétique pour être fonctionnelle. En revanche, elle est inhibée de façon non
compétitive par certains acides aminés comme l’arginine et l’aspartate (Roon et al., 1975 et
Egbosimba et Slaughter, 1987). Cependant et pour des raisons d’équilibre de charge de part
et d’autre de la membrane plasmique, l’entrée de l’ion ammonium est couplée à l’excrétion
d’un proton par la pompe ATPase de la membrane plasmique selon le mécanisme présenté
dans la figure 4.
Figure 4: Représentation schématique du fonctionnement de l’uniport
électrophorétique accumulatif responsable de l’entrée de l’ion ammonium chez
Saccharomyces cerevisiae.
4.10- Le transport des acides aminés
Trois grands groupes de transporteurs d’acides aminés existent chez les levures: le
premier est un transporteur unique relativement aspécifique fréquemment appelé GAP
(General Amino Acids Permease) qui est réprimé quand les levures se développent en
présence d’ammonium. Le second groupe implique des perméases spécifiques pour chacune
des classes d’acides aminés (acides, neutres et basiques). Et le troisième groupe inclut des
perméases spécifiques de chaque acide aminé à haute affinité pour la molécule et sont
responsables de l’introduction des acides aminés qui ne peuvent pas être synthétisés de
novo par la cellule (Horak, 1986 et Garrett, 1989).
28
4.10.1- Le transporteur GAP
Il s’agit d’une protéine qui a très peu d’affinité pour les acides aminés et permet le
transport des stéréoisomères D et L qui se trouvent en fortes concentrations dans le milieu.
Cette perméase générale des acides aminés sert de convoyeur et est composée d’un
complexe contenant trois polypeptides de poids moléculaire 53000, 45000 et 30000 daltons
respectivement et d’une protéine périplasmique avec un poids moléculaire de 14000. Cette
dernière partie est considérée comme responsable de la liaison avec les molécules d’acides
aminés pour assurer leur transport à travers la membrane plasmique (Woodward et
Kornberg, 1980). Pour Saccharomyces cerevisiae la GAP assure le transport de la plupart des
acides aminés basiques et neutres (Grenson et al., 1970 et Darte et Grenson, 1975) et serait
pour les acides aminés tels que la glycine, l’alanine, la phénylalanine, le tryptophane, la
tyrosine (Greasham et Moat, 1973 et Cooper, 1982) et la proline (Lasko et Brandriss, 1981) la
principale porte d’entrée. La GAP, dont la structure est mieux connue que celle des systèmes
de transport spécifique, peut être inhibée et réprimée par la présence de l’ion ammonium.
4.10.2- les systèmes de transporteurs spécifiques
Les transporteurs spécifiques d’acides aminés, décrits pour la première fois par
Grenson et ses collaborateurs en 1966, ne semblent pas être inhibés par la présence d’ion
ammonium dans le milieu. Ainsi, chaque acide aminé possède son propre système de
transporteurs mais certains acides aminés peuvent être pris en charge par deux systèmes de
transport distincts, comme par exemple la L-Lysine (Keenan et al., 1982 et Kotyk et al.,
1982). Une forte compétition a été observée entre les acides aminés d’une part et les
différents systèmes de transporteurs d’autre part et ceci à cause du nombre important de
ces derniers. Ces systèmes de transport sont de type transporteurs actifs symports
(Ribereau-Gayon et al., 1998 et Salmon et al., 1998). En parallèle, d’autres travaux ont décrit
sept systèmes actifs antiport proton/acide aminé indépendants qui sont tous conduits par la
force motrice du proton, établie par hydrolyse de l’ATP. Ce transport peut être couplé aussi
à la diffusion de molécule K+ pour maintenir le gradient électrochimique de part et d’autre
de la membrane plasmique.
4.11- Transport des peptides et des polypeptides
S’il est acquis que de nombreux di et tripeptides peuvent être utilisés par la levure (Payne
et Nisbet, 1981), ainsi que certains polypeptides comprenant jusqu’à cinq acides aminés
(Becker et al., 1973), peu d’informations sont disponibles sur les transporteurs des peptides
et des polypeptides même chez Saccharomyces cerevisiae.
5-Facteurs influençant le comportement des
levures
Les capacités de croissance et de production des levures sont généralement affectées par les
conditions environnementales qui peuvent ralentir ou arrêter leurs activités (Sainz et al.,
2003). Parmi ces conditions: la température (Laluce et al., 2002 ; Aldiguier et al., 2004), le
29
pH, l’apport en oxygène, les apports nutritionnels (sels, vitamines, glucose, etc.) (Alfenore et
al., 2002 ; Voit, 2003 et Wang et al., 2007), le mode de conduite du procédé (Gibson et al.,
2007 ; Lei et al., 2007), la concentration en éthanol (Tagaki et al., 2005 ; Canetta et al., 2006 ;
Lei et al., 2007 ; Wei et al., 2007) et les coproduits dans le milieu de culture (Ferreira et al.,
2004 ; Gibson et al., 2007 et Hirasawa et al., 2007). Ces derniers, considérés comme des
substances inhibitrices, sont parfois difficiles à éviter puisqu’ils sont souvent substrats ou
produits de la réaction biochimique considérée (Gryta et al., 2000). La réponse de la levure
face à ces phénomènes de stress est dynamique avec ou non une capacité d’adaptation à ces
conditions (Attfield, 1997 ; Sonnleitner 1998 ; Henson, 2003 et Lacroix et Yildirim, 2007) et
ceci à différents niveaux (macroscopique, microscopique et moléculaire) telles que la
modification du métabolisme cellulaire, des capacités de croissance et des fonctions
physiologiques. Ces modifications s’étendent naturellement sur leur rendement et leurs
productivités.
5.1- Effet de la température
La levure, comme les autres microorganismes, ne peut fonctionner que dans une gamme
de température «optimale» située entre 25°C et 30°C, jusqu’à une température critique au
delà de laquelle elle ne peut survivre. Dans la majorité des cas, la température ne reste pas
constante pendant la croissance. Les levures peuvent y résister, mais cette dernière peut
avoir des effets sur le métabolisme qui diffèrent d’une souche à une autre. Certains travaux
ont bien montré, chez certaines levures et en particulier chez S. cerevisiae, qu’une
température supérieure à 30°C accroît la vitesse de production de certains métabolites
comme l’éthanol (Aldiguier et al., 2004) mais augmente la sensibilité et accroît l’effet néfaste
des stress (chocs osmotiques, inhibition par l’éthanol) en entraînant une diminution de la
viabilité (Beney et al., 2001) et de l’activité cellulaire (Maréchal et al., 1999). En plus cette
élévation de température au dessus de la température maximale de croissance entraîne des
mutations et entraine également des modifications dans les protéines: certaines protéines
ne sont plus synthétisées alors qu’on note l’apparition d’autres protéines spécifiques
(Watson et al., 1987).
Toutefois, il a été démontré que la température de croissance influe sur la composition en
acides gras des membranes plasmiques (Watson et Rose, 1980). Ainsi la membrane
cytoplasmique des cellules cultivées à température élevée est plus résistante aux
dénaturations thermiques que celle des cellules cultivées à basse température.
5.2- Effet du pH
Le maintien du pH cytoplasmique est indispensable à la survie de la levure et les limites
de leur pH reportées dans la littérature se situent entre 2,4 et 8,6 avec un pH optimal entre
4,4 et 6,5 (Jones et al., 1981). La nature de l’acide (forme dissociée ou non) a une grande
importance. Les levures supportent la plupart des acides organiques et sont inhibées par les
acides lactique, citrique et acétique et elles le sont encore plus avec les acides sorbique et
propionique. D’autres stress peuvent modifier ce pH comme il a été démontré par Jones et
30
ses collaborateurs (1981) où le stress éthanolique provoque une chute du pH cytoplasmique,
ce qui induit le décès cellulaire. Cette diminution du pH intracellulaire peut être due soit à un
influx de protons (Birch et Walker, 2000 et Kasemets et al., 2006) ou à une accumulation
d’intermédiaires de la réaction tels que l’acide acétique, le glycérol (Ferreira et al., 2004).
5.3- Effet de la pression osmotique et l’activité de l’eau
La teneur en eau du milieu est importante à considérer. Certaines levures sont
osmotolérantes et supportent des aw de l’ordre de 0,65 comme de nombreuses levures
xérotolérantes telles que Zygosaccharmyces rouxii, Debarymyces hansenii, Hansenula
anomala, Pichia ohmeri, Schizosaccharomyces pombe et même plus allant jusqu’à 0,70
comme Zygosaccharomyces bisporus, Torulopsis candida, T. versatilis et T. etchellsii, valeurs
auxquelles aucun autre microorganisme ne peut se développer. Ces derniers marquent une
résistance importante mais avec un métabolisme lent (Leveau et Bouix, 1979). Toutefois,
l’influence de la pression osmotique est à relier à la nature des composés du milieu en
particulier les sels et à la température de résistance de ces levures. Leurs mécanismes de
résistance se manifeste par l’accumulation de polyols afin de minimiser la différence de
pression osmotique entre la cellule et le milieu et d’hydrater les polymères intracellulaire
grâce leurs groupements hydroxyles (Schobert, 1977).
5.4- Effet de l’oxygène et du dioxyde du carbone
La concentration en oxygène dissous dans le milieu de culture est un paramètre
important qui va orienter (en fonction de la souche utilisée, du mode de conduite, etc.) le
métabolisme de la levure. L’oxygène intervient aussi dans la synthèse des stérols et de
l’acide nicotinique. Un apport faible en oxygène peut en effet augmenter la tolérance à
l’éthanol (Ryder et Sinclair, 1972 et Ryu et al., 1984). En revanche, la solubilité du dioxyde de
carbone peut être influencée par plusieurs facteurs tels que le pH et la température
(Aguilera et al., 2005). Ce dernier (CO2) présent dans le ciel gazeux du réacteur et produit insitu par les réactions biologiques, peut être dissous dans le milieu liquide sous forme d’acide
carbonique (H2CO3), lequel est dissocié en bicarbonate (HCO3-), carbonate (CO3-2) et
hydrogène (H+) (Debs-Louka et al., 1999 et Garcia-Gonzalez et al., 2007).
Le CO2 peut être à la fois activateur et inhibiteur du métabolisme levurien (Kunkee et Ough,
1966 et Hirasawa et al., 2007). Il initie les voies anaplérotiques à faible concentration. Jones
et Greenfield (1982) ont montré que le rendement de conversion du substrat augmentait de
25% lors d’une croissance en aérobie sur glucose sous une pression partielle de 0,2 bar de
CO2. Par ailleurs, une augmentation trop importante de la pression partielle en gaz
carbonique semble entraîner une chute de la viabilité cellulaire (Ben Chaabane, 2006).
5.5- Effet de la concentration d’éthanol
En fermentation alcoolique, l’éthanol semble représenter la principale cause de stress et
devient toxique à des concentrations allant de 8 à 18% (P/V) pendant la culture qui limite sa
production et ceci selon son état physiologique et selon les souches. Une fois la
31
concentration de l’éthanol augmente dans le milieu de culture, on assiste à une diminution
de la vitesse de croissance, de la viabilité cellulaire, de l’activité métabolique et de la
capacité de production de la levure. De nombreux travaux ont confirmés ces phénomènes,
en particulier chez Saccharomyces cerevisiae (Aguilera et al., 2006 ; Canetta et al., 2006 ; Hu
et al., 2006 ; Hirasawa et al., 2007 ; Kitagaki et al., 2007 ; Lei et al., 2007 ; Wang et al., 2007;
Watanabe et al., 2007 ; Wei et al., 2007).
5.6- Effet de l’acide acétique
L’acide acétique, co-métabolite du métabolisme oxydo-réductif, semble plus toxique pour
la levure que l’éthanol (Ferreira et al., 2004) et a un effet inhibiteur sur la croissance
cellulaire en provoquant une diminution de la production de biomasse (Giannattasio et al.,
2005). En milieu acide, les acides faibles non dissociés peuvent diffuser à travers la
membrane plasmique, dans un environnement intracellulaire plus alcalin (cytoplasme) où la
dissociation a lieu (Imai et Ohno, 1995 ; Ferreira et al., 1997 et Pampulha et Loureiro-Dias,
2000).
32
Chapitre II :
Utilisation industrielle des levures
Les levures sont les premiers microorganismes à avoir été utilisé par l’homme puisque la
production des boissons alcoolisées est documentée depuis 6 000 ans avant notre ère chez
les Sumériens et les Babyloniens. Elles sont également les premiers microorganismes à avoir
été observé au microscope par A. Van Leeuwenhoek. C’est également grâce aux levures que
Pasteur contribua à la fondation de la microbiologie et Büchner au développement de la
biochimie. Leur rôle historique dans le domaine de l’agroalimentaire ne s’est pas démenti et
elles interviennent de nos jours dans la fabrication de nombreux produits alimentaires
(brasserie, vinification, fromagerie, etc.) en occupant une place essentielle dans cette
industrie. Elles participent aussi à la revalorisation des déchets agricoles et industriels et à la
production des protéines, des enzymes, des lipides et des vitamines.
Actuellement, ces microorganismes sont largement utilisés dans les secteurs de la recherche
biomédicale et des biotechnologies en raison de leur double état de micro-organismes et
d’eucaryotes. Ainsi, des levures modifiées génétiquement produisent l’antigène de surface
du virus de l’hépatite B utilisé dans le vaccin anti-hépatite. D’autres produisent la sérumalbumine humaine.
La facilité d’approvisionnement, de conservation et de mise en culture de ces
microorganismes ainsi que la variété des espèces et des souches disponibles sont des atouts
majeurs pour les enseignants et font intervenir les levures dans le domaine de la pédagogie.
Enfin la biologie des levures permet d’illustrer concrètement la plupart des principes
fondamentaux de la biologie dans des domaines variés: biochimie, microbiologie, génétique,
biologie cellulaire, biotechnologie, etc., et ceci avec un intérêt dans les secteurs industriels,
économiques et scientifiques les plus divers. C’est un organisme modèle, peu encombrant,
peu exigeant et peu coûteux. La figure 5 résume les principales utilisations de la levure qui
représente le microorganisme le plus exploité par l’homme. Je ne m’attacherai dans ce
chapitre à traiter que deux productions: celle de l’éthanol et des arômes. Deux métabolites
étudiés au cours de notre travail.
33
Figure 5 : représentation schématique des différents domaines
d’utilisation de la levure
A/ Production microbienne du l’éthanol
L’éthanol est un produit chimique industriel important pouvant avoir plusieurs destinés en
industrie chimique, pharmaceutique, cosmétique…etc. Aujourd’hui, il possède de nouveaux
potentiels en tant que biocarburant pour ses propriétés physico-chimiques compatibles avec
l’essence. C’est la raison pour laquelle, ces dernières années, sa production connaît un
intérêt considérable et un effort particulier est fait sur la recherche de nouveaux procédés
plus performants, notamment au niveau de la production d’éthanol par voie microbienne.
1- Intérêts de cette production
Les biocarburants, dont l’utilisation date de la fin du 19 ème siècle avec l’invention de
l’automobile, ont été jugés peu rentables et ont été rapidement écartés pendant plusieurs
années. Mais le prix du pétrole de plus en plus élevé et le problème économique actuel a fait
que la production de biocarburant a connu un regain d’intérêt ces vingt dernières années.
Parmi ces biocarburants qui sont multiples, l’éthanol produit par voie biologique (Farell et
al., 2006), constitue un additif des essences soit directement, soit sous forme de dérivés
oxygénés renforçant ainsi les propriétés antidétonantes. Ainsi l’augmentation de sa
34
production est actuellement considérée comme une stratégie visant à réduire le coût de
l’énergie (Maiorella et al., 1984). Plusieurs pays ont développé cette stratégie en le
produisant à partir de matières agricoles (biomasse) produites localement afin de diversifier
les sources énergétiques en développant une énergie renouvelable. C’est le cas notamment
de l’Amérique, en particulier les USA et le Brésil qui le produisent respectivement à partir du
maïs et de canne à sucre (Coelho, 2005). Et récemment l’union européenne, qui fixe comme
condition la réglementation de l’ajout de l’éthanol dans l’essence sans modification des
moteurs conventionnels.
Cette énergie qui est une alternative prometteuse au pétrole fossile (Bothast et Saha, 1997
et Zaldivar et al., 2001) est à la fois renouvelable et écologique et pourrait diminuer les
problèmes engendrés par les combustibles fossiles en particulier les émissions de gaz à effet
de serre. Des études ont montré que ces émissions sont réduites de 75 % quand un litre
d'essence est remplacé par un litre d'éthanol. L’intérêt de cette production a mené à de
nombreux progrès afin de réduire le coût des étapes des procédés de sa production,
notamment au niveau de l’étape de prétraitement et la distillation (Wyman, 2001). D’autres
efforts ont porté sur l’amélioration de l’étape de fermentation, notamment par la recherche
de souches plus résistantes aux différents stress rencontrés lors de la fermentation
alcoolique comme la température, la faible concentration en glucose et en particulier la
haute concentration en éthanol. De plus les sources de carbones utilisables ont été
améliorées et diversifiées (utilisation du pentose par exemple) dans le but d’augmenter le
rendement (Jeffries et Jin, 2004), d’autres dans le but de réduire la pollution qui fragilise
l’équilibre de notre environnement.
2- Procédés utilisés au cours de la fermentation
De nombreux procédés ont été testés dans différents travaux en envisageant d’augmenter le
titre final et le rendement en éthanol dans le but de minimiser le coût d’exploitation de cette
énergie. En effet l’éthanol en tant que molécule chimique est produit principalement par
trois types de procédés: le batch, le fed-batch (ou semi-continu) et les procédés continus.
Les procédés batch et continu sont les plus utilisés à l’échelle industrielle.
2.1-Fermentation type batch
C’est un procédé très simple où le bioréacteur est considéré comme un système fermé
contenant une quantité fixée de milieu de culture. Les microorganismes qui servent pour
l’inoculation ont déjà subi une phase d’adaptation. La culture en mode batch est
caractérisée par une productivité faible, limitée par les concentrations en biomasse liée à la
concentration maximale admissible en substrat évitant toute inhibition des capacités
fermentaires du microorganisme. Les performances dépendent des conditions de culture et
des substrats utilisés. Les rendements de conversion sont de l’ordre de 90 à 95% du
rendement théorique pour une concentration finale en éthanol de 10 à 16% (V/V) (Casey et
Ingledew, 1986).
35
2.2- Fermentation type fed-batch
Ce terme a été introduit par Yoshida et ses collaborateurs (1973), il s’agit d’un dérivé du
mode batch où la culture est alimentée de façon séquentielle ou continue en éléments
nutritifs et substrats. La conduite permet ainsi d’atteindre de plus hautes concentrations en
biomasse et produits que le mode batch en évitant l’inhibition par la concentration en
substrat et la limitation en éléments nutritifs et en réduisant les effets toxiques des produits
par dilution lors des apports (Ward, 1989 et Roukas, 1994). La production d’éthanol, qui peut
être retiré au fur et à mesure de sa production, se déroule selon deux phases: une phase de
croissance cellulaire et de production d’éthanol et une phase de production sans croissance.
Les concentrations finales en éthanol ont atteint 19% (V/V) en 2 jours pour Saccharomyces
cerevisiae (Alfenore et al., 2002) et 20,8% (V/V) en 20 jours pour Saccharomyces sake
(Hayashida et Ohta, 1981).
2.3- Fermentation type continu
Le réacteur en mode continu est un système ouvert, dans lequel le milieu de culture est
continuellement additionné et le milieu de fermentation qui contient les métabolites
produits, est continuellement extrait, avec un volume réactionnel constant dont le but de
maintenir les cellules en phase de croissance exponentielle et de production d’éthanol
(Ward, 1989). Elle permet l’obtention d’une productivité élevée (Vasconcelos et al., 2004),
facilite le contrôle du procédé et la maîtrise des rendements. Parmi les inconvénients de ce
mode de conduite est la limitation du taux de dilution afin d’éviter le lavage du réacteur ainsi
que l’inhibition du métabolisme (croissance et production) par les produits de la réaction
biochimique et la perte de viabilité. Cependant, plusieurs techniques ont été couplées telles
que l’évaporation, l’extraction avec des solvants et la filtration membranaire (Kargupta et
al., 1998).
3-Les substrats utilisés au cours de cette
production
Une multitude de substrats, à faible coût et dont la majorité sont d’origine végétale comme
le canne à sucre, le blé, le maïs, le riz, le manioc, le sorgho, peuvent être fermentés, du
moment qu’ils contiennent une quantité importante de sucres assimilables. Parmi la réserve
glucidique contenue dans ces produits agricoles, le glucose et le fructose sont les sucres les
plus assimilables en particulier par l’espèce Saccharomyces cerevisiae, la plus connu et la
plus utilisée en fermentation alcoolique. Cependant, une part importante de la plante reste
encore inexploitée. C’est pourquoi, depuis quelques années, on s’est orienté vers la partie
lignocellulosique, abondamment présente dans les végétaux. Cette dernière se compose de
molécules très résistantes et difficiles à hydrolyser en molécules assimilables par les
microorganismes impliqués dans la fermentation alcoolique. Son hydrolyse libère
majoritairement du glucose, du galactose, du mannose, du xylose et de l’arabinose.
36
4-Les microorganismes utilisés au cours de cette
production
Une grande variété de microorganismes produit de l’éthanol à partir des sucres. Les
bactéries produisent en plus d’autres alcools, des acides organiques, des polyols, des
cétones, ou des gaz (méthane, dioxyde de carbone, hydrogène, etc.). On cite quelques
souches de Clostridium qui peuvent avoir de bons rendements en éthanol. Cependant, seule
Zymomonas mobilis qui présente l’avantage d’être anaérobie stricte, est considérée comme
un strict producteur d’éthanol avec très peu de biomasse (Kosaric et Vardar-Sukan, 2001).
Mais les levures sont les microorganismes qui possèdent les meilleurs atouts et les meilleurs
potentiels pour cette production. Les plus utilisées sont Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces sp présentant chacune
des avantages et des désavantages, notamment en fonction de la composition du substrat et
du procédé employé (Zaldivar et al., 2001). Cependant Saccharomyces cerevisiae reste la
préférée car elle offre une efficacité en terme de production et de croissance à bas pH
(jusqu’à 4), un facteur important qui évite les contaminations. En plus, cette levure
représente un modèle expérimental avec de nombreux avantages (la petite taille et le
séquençage de son génome, la facilité à sa manipulation génétique, et la disponibilité de la
littérature). Toutefois peu de microorganismes sont réellement compétitifs en termes de
rendement en éthanol par rapport au substrat consommé, de capacité fermentaire, de
tolérance élevée à l’éthanol et d’adaptation aux conditions de fermentation.
5-Inhibition et tolérance à l’éthanol
L’éthanol, comme signalé précédemment, a un effet négatif aussi bien sur la croissance
cellulaire que sur la capacité fermentaire (D'Amore et Stewart, 1987). L’inhibition de la
croissance est effective autour de 20 g/L (Casey et Ingledew, 1986) et varie selon les souches
et les espèces. En revanche, l’inhibition de la capacité fermentaire est moins importante et la
production d’éthanol peut se poursuivre même après l’arrêt de la croissance.
La tolérance à l’éthanol est représentée par la capacité des levures à maintenir leur viabilité
à de fortes concentrations en éthanol. C’est un phénomène très difficile à étudier en raison
de l’absence de techniques universelles permettant sa quantification. Cependant, d’autres
valeurs sont utilisées telles que les valeurs relatives à la croissance cellulaire (Thomas et
Rose, 1979 et Beavan et al., 1982), à la vitesse spécifique de la production de l’éthanol
(Thomas et Rose, 1979) et à la viabilité cellulaire (Dombek et Ingram, 1987 et Birch et
Walker, 2000) ainsi que le flux de protons à travers la membrane plasmique (Jiménez et Van
Uden, 1985).
Les études réalisées dans ce domaine ont rapporté que l’accumulation de forte
concentration en éthanol augmente, chez la levure, la fluidité de la membrane plasmique qui
37
perd son intégrité (Cot, 2006), inhibe l’activité de l’ATPase de la membrane plasmique et des
enzymes de la glycolyse (Casey et Ingledew, 1986 et Salmon et al., 1998) et réprime le
système de transport du glucose ce qui perturbe ainsi le métabolisme et l’appauvrit en
énergie (Alexandre et al., 1998). D’autres travaux ont soulignés d’autres effets de ce stress
au niveau de la paroi comme la variation de sa composition en phospholipides, en ergostérol
et en acides gras (Alexandre et al., 1994 et Ding et al., 2009).
Cependant, les levures sont des microorganismes qui ont développé diverses stratégies pour
contrer les différents types de dommages produits par cet alcool (Ding et al., 2009). Parmi
elles, Saccharomyces cerevisiae qui présente les meilleurs atouts génétiques et
métaboliques et qui a toujours été considérée comme le producteur traditionnel d’éthanol:




la modification de la composition de la membrane plasmique en particulier en lipides
(Cot et al., 2007 ; Lei et al., 2007). A ce niveau, il a été précisé que les niveaux
d’acides gras insaturés (You et al., 2003), d’ergostérol et de phospholipides (Daum et
al., 1998 ; Swan et Watson, 1998 et Lei et al., 2007) peuvent être augmentés.
L’expression de facteurs qui stabilisent et/ou répare les protéines dénaturées en
faisant intervenir le tréhalose.
La synthèse des protéines impliquées dans l’expression des gènes liés au stress.
Ainsi que l’augmentation de l’activité de l’ATPase au niveau de la membrane
plasmique et la dismutase mitochondriale (Aguilera et al. 2006, Lei et al., 2007 et
Ding et al., 2009).
En effet, l’étude et la maîtrise de la tolérance en éthanol a non seulement des intérêts
fondamentaux pour les scientifiques, mais également une importance économique. C’est un
caractère de grande valeur économique en particulier pour l’industrie des biocarburants (Hu
et al., 2007), la raison pour laquelle, au cours de ces dernières années, les connaissances sur
la tolérance de la levure à ce stress a été très bien développée (Zhao et Bai, 2009). Et
beaucoup d’effort sont consacrés à la réaction de souches de levure qui tolèrent des niveaux
élevés d’éthanol (Piper, 1995 et Jeffries et Jin, 2004).
B/ Production microbienne des arômes
1-Définition
Les arômes sont des préparations concentrées de substances aromatiques (odorantes ou
gustatives) destinées à être ajoutées à des solutions ou des denrées alimentaires afin de leur
donner ou renforcer une odeur et/ou un goût (Moll et Moll, 1990). Ils se traduisent
généralement par la présence, au sein d’une matrice complexe, de nombreux composés
volatils de diverses propriétés physico-chimiques avec des impacts sensoriels différents. Ils
sont classés selon leur structure chimique et répartis en 11 familles: alcools, aldéhydes,
38
cétones, acides, esters, lactones, composés soufrés, phénols, hétérocycles aromatiques,
hydrocarbures terpéniques et éther-oxydes (Omelianski, 1923).
2- Les différents types d’arômes
2.1- Les arômes naturels
Ces composés naturels aromatisants peuvent être des préparations dont la composition
est plus ou moins bien déterminée ou des substances chimiquement définies (Moll et Moll,
1990). Ils sont obtenus soit à partir de matières végétales ou animales par extraction
(procédés physiques), soit par biotechnologie (procédés enzymatiques ou microbiologiques).
Dans le premier cas, l’extraction à partir de matières premières traditionnelles n’est pas
toujours rentable économiquement puisque les molécules naturelles recherchées sont dans
des mélanges complexes et à faibles doses. Cependant, le second cas pourrait permettre de
faire face à ces limitations vu que le développement récent des biotechnologies a fait ses
preuves et suscite une activité scientifique très importante ces dernières années (Mayer,
1991).
2.2- Les arômes de synthèse
Les arômes de synthèse qui sont produit par voie chimique à partir de différentes
sources, se divisent en deux groupes : les arômes «nature-identiques» et les arômes
artificiels.
2.2.1- Arômes « identiques aux naturels »
Ces arômes possèdent une constitution identique à celle d’une substance présente
dans les produits naturels, mais ils sont obtenus par synthèse chimique ou isolés par des
procédés chimiques. Contrairement aux naturels, ces arômes ont une grande pureté qui leur
permet de présenter des caractéristiques organoleptiques bien définies, uniques et plus
régulières en résistant mieux aux températures élevées. De plus, cet état de pureté leur
assure un pouvoir aromatisant remarquable avec un prix très compétitif par rapport aux
substances naturelles, raison pour laquelle ils sont très utilisés et en très faibles quantités. Ils
sont très souvent employés pour améliorer certaines caractéristiques olfactives d’extraits
naturels qui sont très souvent altérés au cours de l’extraction (Mayer, 1990)
2.2.2- Arômes artificiels
Certains arômes, obtenus par synthèse chimique, n’ont jamais été identifiés dans la
nature (Etievant, 1991). Ils ne peuvent être utilisés que s’ils figurent sur la liste des
substances aromatiques autorisées. Celles-ci sont peu nombreuses, elles possèdent des
propriétés olfactives très intenses et leurs structures, dans certains cas, sont très proches
des molécules naturelles qui ont servi de point de départ pour leur élaboration. C’est le cas
de l’éthylvanilline qui possède une odeur proche de la vanille mais plus intense et dont le
prix est beaucoup moins élevé. Dans d’autres cas, la structure des arômes artificiels est
totalement différente, comme par exemple, le méthylphénylglycidate d’éthyle qui possède
un arôme rappelant celui de la fraise. Ces molécules de synthèse ont permis des avancés
39
spectaculaires dans la connaissance de l’aromatisation, mais actuellement une grande
tendance oriente le marché vers un retour au naturel.
2.3- Les arômes de transformation
Ces arômes issus de la réaction de Maillard résultent d’un mélange de sucres et de
produits azotés afin de reproduire industriellement des notes de « viande », « poulet »,
« grillé », etc. Ces derniers sont utilisés par les industries agroalimentaires dans la
préparation des soupes, des sauces, des plats cuisinés, etc. (Fiess, 1995).
2.4- Les arômes de fumée
Ces derniers sont obtenus par combustion de bois tels que le hêtre, bouleau, mesquite,
etc. Les fumées ainsi obtenues sont récupérées, condensées et utilisées dans la préparation
des sauces, des sauces barbecue, des chips, du saumon et de la charcuterie goût fumé
(Fiess, 1995).
3-Utilisation des arômes
Les composés aromatiques étaient d’une grande importance dans la médecine
traditionnelle. En raison de leur activité biologique très élevée et de leur faible toxicité, les
composés aromatiques sont souvent utilisés dans les produits pharmaceutiques,
cosmétiques, particulièrement en parfumerie et dans le tabac.
Parce qu’ils possèdent des propriétés olfactives et gustatives bien définies, les arômes sont
aussi des additifs indispensables utilisés dans l’industrie alimentaire où ils participent
également à l’amélioration de la durée de vie des fruits transformés (Anese et al., 1997 et
Lanciotti et al., 2004). Les arômes alimentaires sont dépourvus de tout intérêt nutritionnel et
servent exclusivement à renforcer ou à améliorer le goût des aliments conférant ainsi aux
denrées alimentaires une saveur caractéristique (Mayer, 1991 et Aguedo et al., 2004) dans le
but de satisfaire le consommateur. Dans ce cas, ils peuvent soit modifier ou compléter le
profil aromatique d’un produit quelconque, soit aromatiser des produits
organoleptiquement neutres ou encore masquer des flaveurs désagréables comme les
produits issus du soja ou les concentrés protéiques.
4- Les arômes issus des biotechnologies
Les méthodes classiques de production d’arômes naturels ne s’avèrent plus performants et
satisfaisants face à la demande croissante des industries alimentaires. L’extraction à partir
matières premières naturelles présente de nombreux inconvénients: la production agricole
est saisonnière et limitée, leurs qualités varient en fonction de facteurs incontrôlables
(conditions climatiques et géographiques) et le prix de revient est très élevé. La synthèse
chimique, quand à elle, ne convient plus aux consommateurs qui apprécient peu les
composés artificiels. La nécessité tant technique qu’économique de diversifier les voies
40
d’obtention des matières aromatiques ainsi que les progrès réalisés dans le secteur des
biotechnologies ont conduit à explorer puis à exploiter les possibilités offertes par celles-ci.
Effectivement, les arômes produits par les biotechnologies semblent être la réponse pour
faire face à ces difficultés (Mayer, 1991) et le fait qu’elles puissent bénéficier du label naturel
a été un élément déterminant dans l’intérêt suscité au cours des dernières années. De plus,
la stéréospécificité de certains systèmes enzymatiques microbiens permet d’accéder
aisément à des molécules optiquement actives, difficiles à obtenir par synthèse. Les
biotechnologies donnent de surcroît la possibilité de réaliser en une seule étape des
synthèses qui nécessitent souvent de nombreuses réactions, ce qui entraîne des rendements
faibles et variables (Peyvatin et al., 1986). Grâce aux progrès réalisés dans le domaine des
connaissances sur le fonctionnement des organismes vivants, le champ d’application des
procédés utilisant des microorganismes qui ont historiquement joué un rôle essentiel dans
l’élaboration de ces composés dans de nombreux aliments (vins, bière, fromage, etc.)
(Chandrasekaran, 1997), des enzymes purifiées ou même des cellules végétales dont
l’approche est basée sur la capacité biochimique et génétique de ces cellules (Scragg, 1997
et Kim et al., 2001) pour la production d’arômes a été considérablement élargi. La
multiplicité des espèces naturelles utilisables, la variabilité induite par des conditions de
culture et la variabilité supplémentaire induite par le choix des procédés réalisés dans le
domaine du génie génétique permettent de modifier les systèmes biologiques au niveau
moléculaire, ainsi il est possible d’obtenir d’une part des microorganismes recombinés ayant
de nouvelles propriétés métaboliques, d’autre part des enzymes capables de surproduire
certaines arômes (Lerch et Schilling, 1992).
Bien que ces arômes issus des biotechnologies soient plus chers que les nature-identiques,
ils restent toujours moins onéreux que de véritables extraits (Lerch et Schilling, 1992) et leur
nombre reste limité.
4.1- Les modes de production
Les arômes produits par les biotechnologies sont parfois appelés «arômes néonaturels», ils
sont synthétisés par des systèmes enzymatiques proches ou identiques à ceux normalement
mis en jeu dans la matière première végétale. La voie la plus proche des systèmes
traditionnels consiste à synthétiser des substances aromatiques par bioproduction, c'est-àdire par voie de fermentation où la culture microbienne peut être améliorée par
l’optimisation des souches et des conditions de culture. Toutes ces molécules aromatiques
issues de fermentation résultent de réactions diverses telles que l’oxydation, la réduction,
l’estérification, l’hydrolyse, la décarboxylation, la méthylation, la condensation et
l’isomérisation. Ces réactions spécifiques effectuées par voie microbienne permettent de
simplifier une ou plusieurs des réactions nécessaires par synthèse chimique (Etievant, 1991).
La culture de cellules de plantes aromatiques in vitro a également été envisagée mais elle
présente des obstacles importants. L’expression des gènes contrôlant la production de ces
41
composés présente beaucoup de difficultés et les temps de croissance de ces cellules sont
trop élevés pour qu’elles soient appliquées à une production industrielle.
Enfin, il est possible d’utiliser des systèmes enzymatiques, particuliers et définis, connus
comme responsables de la production d’arômes dans les plantes. Ces systèmes
enzymatiques peuvent être utilisés in vivo dans les microorganismes ou bien in vitro après
avoir été isolés (Schreier, 1995). Dans les deux cas, les réactions mises en jeu sont simples et
unitaires, elles permettent la conversion d’un précurseur particulier naturel en une molécule
ou une série homologue de molécules aromatisantes. Ce mode de production n’est plus une
bioproduction mais une bioconversion. Il est important d’ajouter que pour synthétiser des
arômes par de tels systèmes enzymatiques, l’utilisation de «cellules entières» reste la plus
favorable car elle permet de réaliser des réactions pour lesquelles les enzymes impliquées
nécessitent des cofacteurs (NADH, NADPH, ATP, etc.). Cet avantage est capital car la
régénération des cofacteurs est souvent un obstacle à l’utilisation de nombreuses enzymes
purifiées et immobilisées sur support (Degorce-Dumas et al., 1984).
Fermentations, cultures de cellules végétales ou réactions enzymatiques sont autant de
procédés biotechnologiques très attrayants pour la production de substances aromatiques.
En effet, l’emploi de telles technologies permet d’une part de s’affranchir d’une matière
première souvent importée, parfois rare et coûteuses et d’une qualité peu constante et
d’autre part d’obtenir des produits pouvant bénéficier du label naturel (Etievant, 1991).
4.2- Les microorganismes utilisés
Les microorganismes sont capables de produire de nombreuses molécules aromatiques,
certains d’entre eux sont utilisés traditionnellement à cette fin par les industries agroalimentaires. En effet, on exploite depuis 25 ans de façon plus ou moins empirique les
flaveurs complexes produites par les microorganismes au cours des processus fermentaires.
Ce n’est que récemment que l’on a envisagé de recourir aux microorganismes, aux cellules
végétales ou aux enzymes pour la production de composés d’arôme. Les cultures
microbiennes peuvent être utilisées soit spécifiquement pour l’application comme additifs
alimentaires ou in situ en tant qu’une partie de la fermentation. Il est aussi possible d’utiliser
leurs capacités pour produire des molécules pures à hautes concentrations qui entrent alors
dans la composition d’arômes «naturels». Les souches utilisées et qui peuvent être des
bactéries, des champignons filamenteux ou des levures, proviennent des écosystèmes
naturels ou des collections de cultures microbiennes. Des mutants, obtenus par des modes
de sélection classiques, ou même des souches transformées par génie génétique, sont
souvent préférées aux souches sauvages pour leur productivité améliorée (Belin et al.,
1992).
4.2.1- Les bactéries productrices d’arômes
Les bactéries sont depuis très longtemps connues pour la synthèse d’arômes et peut
s’effectuer selon deux voies différentes : la première correspond à la biosynthèse d’arômes à
42
partir de substrats métabolisés par la bactérie, la seconde à une bioconversion à partir de
précurseurs particuliers ajoutés dans le milieu de culture (Romero, 1992). Par ailleurs, une
étude menée par Gupta et ses collaborateurs (1992) révèle qu’il est possible d’obtenir des
arômes par culture mixte. Le diacétyl, arôme du beurre, est obtenu par la souche
Enterobacter cloacae qui convertit le glucose en un mélange acétoïne-diacétyl lorsqu’elle est
placée dans un surnagent de culture de Trichoderma reesei. Certaines bioconversions sont
intéressantes parce qu’elles permettent de bons rendements à partir de précurseurs peu
coûteux : Lactococcus lactis, par exemple, synthétise du diacétyl au cours du métabolisme
du citrate (Romero, 1992).
Les données bibliographiques concernant les capacités des bactéries à produire des arômes,
révèlent que les concentrations obtenues sont bien souvent inférieures à 100 mg/L, il
s’avère donc indispensable de faire appel à l’amélioration des souches afin d’accroître les
productivités. Les travaux de Kuila et ses collaborateurs (1971) révèlent qu’après traitement
à la nitrosoguanidine (NTG) associée aux UV, les capacités de Streptomyces diacetilactis, à
produire différents composés aromatiques, sont considérablement améliorées et à des taux
plus élevés. Cette même souche, traitée uniquement aux UV, subit des modifications qui
conduisent à l’obtention de mutants performants en termes de production du diacétyl.
4.2.2- Les champignons filamenteux producteurs d’arômes
Il existe également un grand nombre de mycètes producteurs d’arômes, déjà utilisés
pour donner directement leurs qualités organoleptiques aux produits de fermentation
(boissons alcoolisées, fromages, etc.). Ils offrent maintenant de nouvelles possibilités mais
leurs applications dans la synthèse d’arômes et d’enzymes sont encore récentes. Les
champignons les plus étudiés pour la production d’arômes sont les basidiomycètes et avec
près de 25 000 espèces, ils forment un groupe important considéré comme le plus évolué de
tous les mycètes. Ils sont aussi mieux connus du fait de leur taille macroscopique et de leur
intérêt dans le domaine de l’alimentaire. Leurs enzymes sont très utilisés dans des procédés
de bioconversion.
4.2.3- Les levures productrices d’arômes
Les levures et notamment Saccharomyces cerevisiae, utilisées en alimentaire depuis
des temps très anciens participent à l’amélioration du goût et de la flaveur de nombreux
produits comme la bière, le vin, le saké et le pain (Lerch et Schilling, 1992). L’augmentation
de ces productions d’arômes peut être réalisée par l’amélioration des souches de levures. En
effet, la sélection de mutants de S. uvarum, sur milieu enrichi en analogues d’acides aminés,
conduit à la surproduction d’alcools et d’esters dans la bière (Lee et al., 1995). De plus des
recombinaisons génétiques réalisées sur des levures de saké permettent d’obtenir de
meilleures productions d’alcools supérieurs (Anonyme, 1993).
Les bactéries et les levures présentent des avantages considérables par rapport aux
champignons, notamment dans leur facilité de mise en œuvre, leur connaissance biologique
plus approfondie, et la diversité des interventions génétiques réalisées sur ces
43
microorganismes. Toutefois les champignons filamenteux possèdent des potentialités de
biosynthèse très intéressantes en ce qui concerne les composés à noyau benzénique (Gros
et Asther, 1989).
4.3- Les composés volatils formés par les microorganismes
Ces composés sont synthétisés par les microorganismes au cours des fermentations et
sont caractérisés par une note aromatique qui leur confère un intérêt d’application dans
l’industrie alimentaire en tant qu’additifs dans les crèmes, les glaces, les pâtisseries, les
boissons et en confiserie afin d’améliorer les qualités organoleptiques des aliments. Ils sont
utilisés également en industrie pharmaceutique et cométique en particulier en parfumerie
(Furia et Bellanca, 1971). Parmi ces derniers on peut citer les composés suivants:
A°) Acétaldéhyde : c’est une molécule intermédiaire de la fermentation alcoolique formée
par décarboxylation de l’acide pyruvique qui donne une odeur de pomme.
B°) Alcools supérieurs : ce sont des alcools à chaînes longues et complexes obtenus au
cours des fermentations par les microorganismes (levures) et qui ont des propriétés
organoleptiques très intéressantes. Parmi les principaux alcools figurent le propanol-1, le 2méthylpropanol (isobutanol), le 3-méthylbutanol, le 2-méthylbutanol-1 (alcools
isoamyliques). La synthèse de ces alcools dérive :


soit des cétoacides issus de la voie des sucres et notamment de l’acide pyruvique,
soit des α-cétoacides obtenus par la voie d’Ehrlich après désamination des acides
aminés correspondants (Parfait et Jouret, 1975).
Les α-cétoacides qui se forment par décarboxylation et réduction sont respectivement: αcétoisovalérianique, α-cétoisocapronique, α-céto-β-méthylisovalérianique. Les mêmes αcétoacides provenant des acides aminés contenus dans le milieu de culture, selon la voie
d’Ehrlich, sont obtenus par des réactions de transamination impliquant un autre αcétoacide (acide α-cétoglutarique) sur lequel le groupe aminique est transféré. L’alphacétoacide est par la suite décarboxylé puis réduit en alcool supérieur correspondant
(Usseglio-Tomasset, 1989).
C°) Les esters : très appréciés pour les arômes fruités qu’ils fournissent



Acétate d’éthyle : est un ester formé entre l’acide acétique et l’éthanol et qui
donne une odeur éthérée piquante.
Acétate d’amyle : cet ester, qui a une note fruitée caractéristique de la poire, est
formé à partir de l’alcool correspondant associé à l’acide acétique.
Acétate d’isoamyle : se forme à partir de l’alcool correspondant associé à l’acide
acétique et donne une note fruitée caractéristique de la banane. Sa production a
été mise en évidence par de nombreuses études chez les levures telles que Pichia
44


anomala dans le vin par Rojas et ses collaborateurs (2001) et Hanseniaspora
uvarum.
Acétate du 2-phényléthyle : il provient de l’estérification entre l’acide acétique et
le 2-phényléthanol et donne une odeur de rose renforcée par une note fraîche
très fruitée. Le 2PEA est produit par des levures qui font partie des levures non
saccharomyces. Il a été décelé chez de nombreuses levures comme
Hanseniaspora guilliermondii dans le vin (Rojas et al., 2001).
Isovalérate de phényléthyle : c’est un ester qui est formé à partir de l’alcool
correspondant associé à l’acide isovalérique. Il a une odeur de rose renforcée par
une note de miel.
D°) Les acides :
 Acide acétique : il est issu de l’oxydation de l’éthanol.
 Acide 2-phénylacétique : c’est un acide avec une odeur de rose qui résulte de
l’oxydation du 2-phényléthanol.
Parmi les composés volatils d’origine microbienne, trois seront étudiés au cours de ce
travail le 2MB (2-méthylbutanol), le 3MB (3-méthylbutanol) et le 2PE (2-phényléthanol).
Je m’attarderai sur ce dernier car c’est un composé très utilisé actuellement et dont la
production par voie microbienne est en expansion.
4.4- Le 2-phényléthanol (2PE)
4.4.1- Intérêt et propriétés physiques du phényléthanol
Le phényléthanol est un alcool benzénique qui présente une odeur douce de rose avec
des notes de jacinthe et un goût légèrement amer puis sucré rappelant celui de la pêche. Il
est, après l’éthanol, l’un des principaux alcools d’un point de vue commercial, au même titre
que l’alcool benzylique (Welsh et al., 1989). C’est un agent antimicrobien avec un effet
antiseptique et désinfectant (Corre et al., 1990). Grâce à ses propriétés conservatrices et son
odeur, il est le plus utilisé des fragrances en parfumerie alcoolique et en cosmétique. Il entre
donc dans la composition de nombreux parfums à des teneurs allant de 5 à 20%. En
revanche, en alimentaire, il n’est utilisé qu’à des concentrations de l’ordre de 1 à 3 ppm dans
les boissons alcoolisées, les crèmes glacées, en confiserie, en pâtisserie, etc. (Lugay, 1986 et
Anonyme, 1999).
Les propriétés physico-chimiques de ce composé est résumé comme suit :




Nom: alcool phénéthylique ou phényléthanol.
Synonymes: Benzèneéthanol, Benzylcarbinol.
Aspect: liquide visqueux incolore.
Formule: C8H10O.
45





Poids moléculaire: 122,17 g/mol.
Densité: 1,02 à 25°C.
Point d’ébullition: 220-222°C.
Solubilité dans l’eau: faible.
Caractéristique: odeur de rose.
4.4.2- Sources de phényléthanol naturel
A°) Origine végétale
Le phényléthanol a été retrouvé dans de nombreuses plantes aromatiques. Il a été
identifié dans les huiles essentielles de narcisse, de jacinthe, de géranium Bourbon, de pin
d’Alep et particulièrement dans les huiles de Rosa centifolia. On le retrouve à des teneurs
allant de 1-5% à 55%. Par ailleurs, une absolue de rose, obtenu par traitement chimique de
boutons floraux de roses, peut contenir jusqu’à 60% de phényléthanol (Pillivuyt, 1991 et
Savina et al., 1999). Malgré le coût élevé d’un tel arôme, la demande en phényléthanol
naturel, extrait de sources végétales, reste supérieure à l’offre. En conséquence, et afin de
pallier à ce manque, l’industrie aromatique se tourne de plus en plus vers la production
d’arômes par voie biotechnolgique.
B°) Origine microbienne
De nombreux travaux ont mis en évidence certaines bactéries qui produisent du
phényléthanol comme Microbacterium sp qui le produit sur milieu liquide à base de
« trypcase de soja », Brevibacterium linens qui le synthétise en dégradant la phénylalanine
(Jollivet et al., 1992) et par plusieurs souches de Xanthobacter (Hartmans et al., 1989). Cette
production est également observée chez les champignons du genre Polyporus, phellinus,
Penicillium (Welsh et al., 1989) et même Aspergillus niger (Wani et al., 2010). Une étude
réalisée sur Polyporus benzoinum montre que cette souche synthétise jusqu’à 360 mg/L de
2-phényléthanol (Fabre et al., 1996).
Certaines levures et notamment Saccharomyces cerevisiae produisent aussi du
phényléthanol qui entre dans la composition des flaveurs des boissons alcoolisées (bière,
saké, etc.). Il a été démontré, par les travaux de Hanssen et ses collaborateurs (1984) qu’une
souche de Kluyveromyces lactis produit environ 70 composés volatils parmi eux le
phényléthanol dont la concentration atteint 240 mg/L après 17 jours d’incubation. Par
ailleurs, les travaux de Jiang (1995) réalisés sur une autre souche de K. lactis CBS 5670
confirment cette production, mais à une concentration de 72 mg/L après une incubation de
5 jours seulement. Ceux de Liu et ses collaborateurs (2012) confirment cette production chez
Hanseniaspora uvarum. De plus d’autres levures comme Hansenula anomala, Kluyveromyces
marxianus et S. cerevisiae ont montré un fort potentiel pour la production du phényléthanol.
46
Dans la plupart des cas cette production dérive de la bioconversion de la phénylalanine
(Fabre et al., 1998 et Starck et al., 2002). La plupart des études réalisées sur la production
du 2-phényléthanol par les levures montrent que les concentrations ne dépassent
généralement pas les 100mg/L, cependant les travaux d’Albertazzi et collaborateurs (1994)
révèlent l’existence d’autres souches de S. cerevisiae et Hansenula anomala qui sont
capables de produire plus si on augmente la quantité du phénylalanine et des souches de
Pichia pastoris et de Kloeckera saturnus qui poursuivent la conversion de la phénylalanine
au-delà du phényléthanol conduisant à l’ester (le 2-phénylacétate).
Les effets inhibiteurs du 2-phényléthanol ont déjà fait l’objet de nombreuses études chez
d’autres espèces de levures afin de lever cette inhibition liée à une concentration critique
responsable non seulement de la bioconversion partielle de la phénylalanine mais aussi de la
diminution du pourcentage de viabilité de la souche au cours du temps (Fabre et al.,1997).
Cette sensibilité pose un véritable problème et a poussé les chercheurs à adopter d’autres
stratégies afin d’obtenir des concentrations économiquement intéressantes. L’amélioration
de la tolérance de la souche vis-à-vis du phényléthanol a été notamment recherchée en
utilisant un chemostat et en optimisant la composition du milieu et des conditions de culture
(Fabre et al., 1997). Mais les résultats n’étaient pas très concluants car il est difficile de
poursuivre la bioconversion au-delà d’une concentration critique de 3,1 g/L d’arôme.
Une seconde alternative repose plus sur l’élaboration d’une technique permettant de
détourner cette inhibition par l’extraction de l’arôme visant à améliorer la production en 2phényléthanol (Fabre et al., 1995 et Serp et al., 2003). Parmi ces travaux on peut citer
l’utilisation du polypropylène glycol 1200 afin d’éliminer en continu le 2-phényléthanol à
partir du milieu de fermentation (Etschmann et Schrader, 2006).
5-problématiques de production microbienne des
arômes
La production des arômes par les microorganismes s’est révélée limitée. Les études réalisées
dans ce sens ont montré que l’arrêt de la biosynthèse des arômes peut être occasionné par
leur propre accumulation dans le milieu qui exerce une inhibition de l’activité ou une
répression de la synthèse des enzymes impliquées dans la voie biosynthétique du
métabolite. Ceci réduit la tolérance des levures ainsi que la concentration du produit final.
Pour améliorer cette productivité et pallier à ces inconvénients plusieurs stratégies ont été
étudiées et il s’avère que la récupération du produit in situ a connu un grand succès.
Plusieurs méthodes d’extraction ont été proposées telles que la distillation à la vapeur,
l’extraction par des solvants, l’extraction par des fluides supercritiques (FSC), l’extraction par
adsorption sur support, l’extraction par inclusion dans des cyclodextrines, l’extraction par
des procédés membranaires, l’extraction par micro-ondes, etc.
Bien que l’industrie des arômes se soit développée grâce au perfectionnement des
méthodes d’extractions, ces dernières présentent toutes des inconvénients. Certaines ne
47
résolvent pas tous les problèmes légaux d’innocuité ou de préservation des qualités
aromatiques, d’autres conduisent souvent à des produits dégradés par la chaleur ou
modifiés par les réactions secondaires avec les solvants d’extraction. Cependant, des levures
naturellement résistantes peuvent résoudre ce problème et permettent de faire face à ce
phénomène d’inhibition et d’augmenter ainsi la productivité.
48
MATERIEL ET METHODES
Matériel et Méthodes
1- Matériel biologique
Différents isolats de levures ont été obtenus à partir de plusieurs échantillons
biologiques récoltés en Algérie: des fruits tels que les dattes, le melon et le cornichon,
différents types de laits et de miel. La liste des échantillons et leur région de provenance
sont représentées dans le tableau 2 et la figure 6.
Tableau 2 : Provenance des échantillons biologiques utilisés pour l’isolement des
levures.
Echantillons
Variétés
Nombre d’échantillon (s)
Régions
Dattes
Deglet-Nour
1
Ghardaïa
Gharass
1
Bechar
Hamira
1
Ouargla
Lait de vache
2
Ghardaïa et Oran
Lait de brebis
2
Ghardaïa et Oran
Lait de chèvre
2
Ghardaïa et Ain
Temouchent
Lait de chamelle
3
Ghardaïa, Bechar et
Ouargla
Melon
Cantalou
1
Oran (marché)
Miel
Miel d’Acacia
1
Sidi Lakhdar
(Mostaganem)
Cornichon
Délicatesse
1
Oran (marché)
Laits
50
Figure 6 : Localisation géographique des régions de récolte des différents échantillons
biologiques
2- Méthodes d’isolement des levures
L’isolement a été réalisé selon la méthode préconisée par Ducastelle et Lenoir en 1965
(Ducastelle et Lenoir, 1965). Elle varie en fonction de la consistance de l’échantillon.
51
2.1- Isolement à partir des échantillons solides
Ces échantillons sont le cornichon, le melon et les trois variétés de dattes (Deglet-Nour,
Gharass et Hamira) qui proviennent de trois régions différentes (Tableau 2). La chair du
melon, le cornichon et les dattes dénoyautées sont broyés et homogénéisés séparément
dans des mortiers stériles. Un gramme de chaque pâte est prélevé et dissout dans une
solution stérile de citrate de sodium à 2% préalablement chauffée à 45°C afin de la ramollir,
de dissoudre ses constituants et de libérer les cellules microbiennes.
2.2- Isolement à partir du lait
Les différents échantillons de lait (Tableau 2) ont été recueillis directement auprès des
éleveurs, puis répartis dans des tubes et placés dans une étuve à 30°C. Après coagulation
sous l’effet de la flore lactique endogène, les tubes sont quotidiennement suivis jusqu’à
l’intervention des levures révélée par leur odeur caractéristique.
2.3-Isolement à partir du miel
L’échantillon utilisé provient de Sidi-Lakhdar de la région de Mostaganem (Tableau 2). Ce
dernier est directement introduit dans la solution de citrate de sodium à 2% tiède.
La présence des levures dans tous ces échantillons est d’abord confirmée par observation
microscopique directe sur un frottis fixé à chaud, dégraissé au xylène et coloré au violet de
Gentiane (Guittonneau et al., 1939).
0,1 ml de chaque échantillon, contenant des levures, est ensuite étalé sur milieu OGA
(0,5% Yeast Extract et 2% Glucose) rendu sélectif par un pH acide (5 à 5,6), par l’ajout de
deux antibiotiques (Chloramphénicol à 0,5mg/ml et Oxytétracycline à 0,1mg/ml) et d’un
antifongique (thiabendazole à 3mg/L) car ces aliments contiennent, en plus des levures, des
bactéries et des moisissures (Vergeade et al., 1976 et Bouix et Leveau, 1980). Les boites sont
ensuite incubées à 30°C.
A partir de chaque boîte contenant une centaine de colonies, six colonies sont prélevées
au hasard, ensemencées chacune sur d’autres boîtes contenant le même milieu et incubées
à la même température. Après isolement, les isolats de levures ont été purifiés par
technique d’épuisement et conservés sur milieu « Sabouraud-Chloramphénicol » (1%
Bactopeptone, 2% Glucose) en gélose inclinée à 4°C afin d’éviter d’éventuelles
contaminations par des bactéries. Des repiquages réguliers sont effectués tous les trois mois
(Schmidt et Lenoir, 1978). Pour une conservation plus longue, les isolats sont conservés à –
80°C dans leur propre milieu de culture dilué de moitié avec une solution stérile de glycérol
40%.
52
3- Méthodes d’identification des souches de
levures
3.1-Méthode conventionnelle
L’identification des levures, selon les méthodes conventionnelles, repose sur la
détermination de divers caractères morphologiques et physiologiques (Lodder, 1971 ;
Barnett et Pankhurst, 1974 ; Schmidt et al., 1979 et Schmidt, 1984).
Les critères morphologiques comportent l’aspect de la cellule, l’aptitude à former de vrais
filaments mycéliens et à la sporulation, ainsi que l’apparence des cultures en milieu liquide
et sur milieu solide. Parmi les critères physiologiques, figurent l’assimilation de divers
composés azotés, l’assimilation et la fermentation de différentes sources de carbone, et la
résistance à certaines conditions défavorables du milieu de culture (présence
d’antibiotiques, absence de vitamines, etc.). Ces méthodes sont sûres, mais leur mise en
œuvre est longue et difficile, les lectures s’étendant parfois sur plusieurs semaines. Ceci
nous a amené à nous orienter vers une méthode moléculaire, universellement applicable qui
est la PCR sur histone.
3.2- PCR sur histones
Cette technique a été utilisée par P.J. L. Bell en 2004 sur plusieurs souches de levures
(Bell, 2004).
3.2.1- Extraction de l’ADN génomique
L’ADN génomique des dix huit isolats retenus (cf. 1er paragraphe-Résultats et
discussion) ainsi que celui des 6 souches contrôles a été extrait après culture toute une nuit
sur milieu complet YPD liquide (1% Yeast Extract, 1% Bactopeptone et 2% glucose). Les
souches contrôles appartenant à l’EAD5/LISBP/INSA de Toulouse sont :





Deux souches de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK122-2N (souche diploïde) et BY
4741 (souche haploïde);
Yarrowia lipolytica;
Saccharomyces pombe;
Kluyveromyces lactis;
Pichia guilliermondi.
Les ADN génomiques ont été extraits en utilisant le kit Masterpure Yeast DNA
purification kit de chez Epicentre (Ref MPY 80200). 300µl de chaque culture sont centrifugés
et le culot est resuspendu de façon énergique dans 60µl d’une solution de lyse. Les mélanges
ainsi obtenus sont placés au bain-marie à une température de 65°C pendant 15 minutes puis
dans la glace pendant 5 minutes. 30µl de solution de précipitation sont ensuite ajoutés et la
solution est mélangée par inversion du tube pendant 2 minutes.
53
Après une centrifugation de 10 minutes, le surnageant est récupéré dans un autre tube et
100µl d’isopropanol sont ajoutés afin de précipiter l’ADN. Après une nouvelle centrifugation
de 10 minutes le culot est lavé avec 200µl d’éthanol à 70%. Le tube est séché et le culot
d’ADN repris dans 25µl de TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH8). De la RNase (5µg/µl, 1
heure à 37°C) est ajoutée afin d’éliminer les ARNs qui pourraient être gênants pour voir
l’amplification de petits produits PCR. L’ADN génomique ainsi préparé est conservé à -20°C.
3.2.2- Amplification par PCR
La réaction de PCR se fait dans un volume final de 50µl:
5µl de tampon de réaction (10X) ; 5µl de dNTPs à 2,5 mM et 5µl de chaque amorce à 2,5µM
(Tableau 3) auquel on ajoute 0,5µl de pHFusion High-Fidelity DNA polymerase (Ref M0530L).
L’ADN génomique préalablement préparé (voir ci-dessus) servira de matrice (100ng). Le
programme de PCR est le suivant : étape initiale de dénaturation (98°C, 10 s), puis trente
cycles incluant les étapes: dénaturation (98°C, 10s), hybridation (44°C, 30s), élongation
(72°C, 1min 30s) et élongation finale (72°C, 5min). 5µl de produit PCR sont ensuite déposés
sur gel d’agarose (1,5% d’agarose, TAE) pour vérification.
Tableau 3: Le nom et les séquences des amorces utilisées pour l’amplification
des histones H3 et H4 (Bell, 2004)
Nom des amorces
Séquences des amorces
H3R2CERE
CTCTCAAGGCAACAGTACCTGG
H3R2YEAS
CTCTCAAGGCNACNGTNCCNGG
H4R1CERE
GATAGCTGGCTTAGTGATACC
H4R1YEAS
GATAGCTGGYTTNGTNATNCC
3.3- Identification moléculaire au CIRM
Nous nous sommes orientés vers le Centre International de Ressources Microbiennes
(CIRM, Thiverval Grignon, Paris) pour réaliser l’identification moléculaire de nos isolats dont
le nombre a été réduit à dix (cf 1er paragraphe-Résultats et discussion). Cette taxonomie
moléculaire utilise la procédure mise au point par Kurtzman et Robnett (Kurtzman et
Robnett 1997 et Kurtzman et Robnett, 1998) qui est basée sur l’amplification par PCR et
séquençage des amplicons du domaine D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique. Les
espèces ont été identifiées par une recherche Blast de D1/D2 séquences déposées dans la
base de données GenBank.
54
4- Milieux et conditions de culture
4.1- Milieux de culture
Les milieux qui ont été utilisés pour réaliser les différentes études sur ces souches de
levures sont les suivants :



Le milieu complet YP (1% Yeast Extract, (BIOKAR), 1% Bactopeptone, (DIFCO)) auquel
sera ajouté le sucre à une concentration de 2% (glucose (YPD), fructose (YPF),
saccharose (YPS), lactose (YPL)) et de l’agar à une concentration de 2% si le milieu est
utilisé à l’état solide.
Le milieu synthétique minimum YN (0,17% de Yeast Nitrogen base sans acides
aminés et sans sulfate d’ammonium (DIFCO), 0,5% de sulfate d’ammonium)
tamponné à un pH 5 avec un mélange acide succinique (1,35%)/soude (0,65%). Le
sucre utilisé est ajouté à une concentration de 2% (glucose (YNB), xylose (YNX)). Dans
le cas où ce milieu est utilisé à l’état solide de l’agar à 2% est alors ajouté.
Ces deux milieux sont directement autoclavés à 120°C pendant 20 minutes.
Un milieu minéral synthétique, MMS (Verduyn et al., 1992), dans lequel l’apport de
tous les éléments nutritifs peut être contrôlé. Ce dernier est composé de quatre
solutions qui sont préparées séparément et stérilisées différemment :
- solution 1 : 5g (sulfate d’ammonium), 3g (KH2PO4) et 0,5g (MgSO4) dans 900ml
d’eau distillée.
- solution 2 : 20g (Source de carbone) dans 100ml d’eau distillée.
- solution 3 : on mélange 1,5g (EDTA di-sodium) à 0,45g (ZnSO4, 7H2O) dans 75ml
d’eau distillée où le pH est ajusté à 6 avec du NaOH 1M. Cet ajustement doit être fait
après l’ajout de chacun des éléments suivants : 0,1g (MnCl2, 4H2O), 0,03g (CoCl2,
6H2O), 0,03g (CuSO4, 5H2O), 0,4g (Molybdène di-spodique (Na2MoO4, 2H2O)), 0,45g
(CaCl2, 2H2O), 0,3g (FeSO4, 7H2O) et 0,1g (Acide borique(H3BO3)). Le volume est
ensuite complété avec de l’eau distillée.
- solution 4 : on dissout 10mg de d-Biotine dans 5ml de NaOH 0,1M, puis le volume
est complété avec de l’eau distillée à 75ml et on ajuste le pH à 6,5 avec HCl 1M. Ce
pH doit être maintenu après l’ajout de chacun des constituants suivants afin de
faciliter leur dissolution : 100mg de Ca (D+) pantothénate, 100mg d’acide nicotinique,
250mg (My-Inositol), 100mg (Thiamine HCl), 100mg (Pyridoxal HCl) et 20mg (Acide
paminobenzoïque).
La solution 1 est autoclavée à 120°C pendant 20 minutes, la solution 2 est autoclavée à
110°C pendant 30 minutes et les solutions 3 et 4 sont filtrées (0,2µm) et conservées à 4°C à
55
l’abri de la lumière. Le milieu MMS est alors préparé en mélangeant les solutions 1 et 2 à 1
ml de chacune des solutions 3 et 4.
4.2- Conditions de culture
4.2.1- Pré cultures
Les pré-cultures utilisées au cours de ce travail sont réalisées dans le milieu désigné pour
l’expérience (YPD, YNB ou MMS) en tube (3ml) ou en Erlenmeyer si la pré-culture est
destinée à l’ensemencement d’un fermenteur. Cette pré-culture doit être fraîche et réalisée
à partir de colonies isolées (conservées sur gélose) et est incubée à une température de 30°C
sous agitation (100 rpm).
4.2.2- Cultures
4.2.2.1- Cultures sur milieu solide
Afin d’évaluer les exigences nutritionnelles de ces souches, deux milieux ont été
utilisés. Un milieu complet (YPD) et un milieu minimum (YNB). La lecture des résultats se fait
pendant trois jours à une incubation de 30°C pour noter d’éventuels changements.
4.2.2.2- Cultures en fioles Erlenmeyer
Les cultures réalisées dans ce travail ont été faites dans des fioles Erlenmeyer non
bafflées remplies au 1/10 afin de réduire le problème de transfert d’oxygène. Leur
incubation se fait à 30°C avec une agitation d’environ 200 rpm sur table agitante. Deux
milieux ont été utilisés (YPD et MMS) afin de suivre la croissance des souches sélectionnées.
Des prélèvements sont réalisés à différentes phases de croissance et des dosages effectués
par HPLC afin de comparer la production de trois métabolites (éthanol, glycérol et acétate)
ainsi que la consommation du sucre pour suivre la dynamique physiologique de ces cultures.
4.2.2.3- Culture en fermenteur
La souche utilisée au cours de cette fermentation est Issatchenkia orientalis, isolée
à partir du lait de chamelle. La pré-culture est réalisée dans 50ml de YNB (2% de Glucose:) et
incubée à 30°C pendant 12h sous agitation (100 rpm). Cette pré-culture (taux
d’ensemencement de 10% (V/V)) a servi à ensemencer 1L de milieu YNB contenu dans un
bioréacteur de 2L. L’ensemble est stérilisé à l’autoclave (120°C, 20mn) sous une pression
relative de 1 bar.
Cette fermentation en mode batch a été réalisée dans un fermenteur SARTORIUS, Biostat B
Plus (figure 7). Le pH est ajusté à 3 à l’aide d’une solution d’ammoniaque à 14% (V/V). La
température de la fermentation est maintenue à 30°C grâce à un baffle chauffant et un
système de refroidissement (en double cloison). Le bioréacteur a été balayé en permanence
par de l’air à un débit de 0,1L/mn. La vitesse d’agitation est fixée à 400 rpm jusqu’à ce que
pO2 atteigne 20%, puis augmentée pour éviter toute limitation d’oxygène dans le milieu. Ces
systèmes sont connectés à un ordinateur et un programme informatique qui réalise en ligne
l’acquisition des paramètres contrôlés (taux d’agitation, pH, température, débit d’air et
pression partielle de l’oxygène dissous) (figure 8). Cette culture est suivie et des
56
prélèvements, à travers un septum prévu à cet effet situé au centre du bioréacteur, sont
effectués toutes les heures pour des dosages hors ligne (glucose, éthanol, glycérol et
acétates).
Figure 7: Le fermenteur utilisé : SARTORIUS, Biostat B Plus.
Figure 8: Fermenteur SARTORIUS, Biostat B Plus avec son système d’acquisition pour le
contrôle des différents paramètres de la croissance
57
5- Analyse phénotypique
5.1- Etude des caractères culturaux
L’étude des caractères culturaux des cinq souches retenues (C. lusitaniae, H. uvarum, K.
ohmeri, I. orientalis et T. asahii) (cf. 1er paragraphe-Résultats et discussion) nous a conduits à
examiner l’aspect des cultures en milieu liquide et sur milieu solide après incubation à 30°C.
5.1.1- Caractères culturaux en milieu liquide
L’ensemencement des souches précédemment identifiées est réalisé sur milieu YPD
liquide réparti dans des tubes à essai avec des cloches de Durham. L’aspect de la culture de
chaque souche est soigneusement noté, on observe:
 la présence de dépôt au fond du tube ainsi que son aspect (fin, modéré ou épais).
 la présence de voile ou de pellicule en surface.
 la production de gaz.
5.1.2- Caractères culturaux sur milieu solide
La culture de ces souches sur YPD gélosé (même période et même température
d’incubation) nous a permis de définir la forme, la couleur et l’aspect des colonies.
5.2- Etude des caractères morphologiques
Cette étude a pour but l’examen microscopique de la forme des cellules, des différentes
organisations qui peuvent exister chez les levures et de «spores» asexuées ainsi que le mode
de reproduction végétative. Elle est réalisée sur des cultures fraîches en YPD liquide
incubées sous agitation à l’état frais, lutées à la paraffine (Bourgeois et al., 1996). Par contre
l’organisation des cellules de levure et les «spores» asexuées sont recherchées par
observation sur un fragment de colonie prélevé sur YPD solide.
5.3- Effet de quelques stress sur la croissance des souches retenues
Les expositions aux différents stress sont réalisées sur des cellules en pleine phase
exponentielle de croissance avec deux répétitions et ceci afin d’évaluer les performances de
nos souches.
5.3.1- Effet de la température
Afin de mettre en évidence l’effet du stress thermique sur ces souches, ces dernières sont
ensemencées sur YPD solide puis placées dans des étuves à quatre températures différentes
(25°C, 30°C, 37°C et 40°C) excepté pour la souche Issatchenkia orientalis (très résistante)
dont la culture a été poursuivie jusqu’à 42°C. Leur croissance est suivie quotidiennement,
pendant trois jours.
5.3.2- Effet du stress salin et osmotique
Les stress salin et osmotique sont provoqués par ajout d’une solution concentrée de
l’agent salin (NaCl à 0.5M) ou osmotique (sorbitol 2M) dans le milieu de culture (YNB). Ces
concentrations ont été mises au point par LISBP/INSA Toulouse.
58
Après l’ensemencement des cinq souches, une incubation a été faite à 30°C. A chacun de ces
stress on en a ajouté un autre qui est le stress thermique en réalisant une autre incubation à
40°C. Ainsi l’effet combiné des deux stress peut être déterminé (salin-thermique et
osmotique- thermique).
5.3.3- Effet du pH
Le milieu YPD solide a été préparé à quatre pH différents, trois acides (pH 2,5 ; 4 et 5)
ajustés avec du HCl 1M et un basique (pH 7) ajusté avec du NaOH 0,1M. L’agar (2%) est
ajouté aux deux milieux à pH 5 et 7 avant autoclavage alors que pour les milieux à pH 2,5 et
4 il est rajouté après autoclavage (agar 4% à diluer deux fois) afin d’éviter son hydrolyse.
Pour chaque souche, une pré-culture a été préparée, centrifugée à 13 000 tr/mn pendant
3mn et lavée avec de l’eau distillée stérile. Après un bref passage au vortex et centrifugation,
les cellules sont remises en suspension avec 100µl d’eau distillée stérile. Des dilutions
séquentielles (10-1, 10-2, 10-3 et 10-4) ont été préparées et 10µl de chaque dilution sont
déposés stérilement sur les boites précédemment préparées. Après séchage, elles sont
incubées à 30°C et à 40°C. Les résultats sont ainsi suivis et notés quotidiennement pendant
trois jours.
5.3.4- Effet de l’éthanol et du phényléthanol
Ces deux stress ont été étudiés sur les milieux YPD et YNB solides. L’éthanol est ajouté aux
concentrations suivantes: 0%, 5%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, et 22% (V/V) et le
phényléthanol à 0 ; 1 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 et 5 g/L. Les boites de Petri (fermées
rapidement afin d’éviter toute évaporation) sont ensemencées de la même manière que
précédemment (cf. paragraphe 5.3.3). L’incubation se fait à deux températures différentes
(30°C et 40°C), car en dehors de la toxicité de l’éthanol s’ajoute le facteur de la température
élevée qui pose un problème au cours de la fermentation. Les résultats sont ainsi suivis et
notés quotidiennement pendant trois jours.
La souche I. orientalis, montrant une résistance importante, a été sélectionnée afin de suivre
sa croissance en milieu YPD et YNB liquides en présence d’éthanol aux concentrations
suivantes: 0%, 5%, 8%, 12% et 20% (V/V d’éthanol). L’ensemencement est réalisé à 2UDO et
l’incubation à 30°C sous agitation (200 rpm). La croissance cellulaire est ainsi suivie à
intervalle de temps régulier par la mesure de la densité optique (600 nm, cf. paragraphe
6.1.1) et la viabilité cellulaire est déterminée par étalement sur milieu solide et par un
comptage après coloration au bleu de méthylène (cf. paragraphe 6.1.3). La première
technique est utilisée pour vérifier la fiabilité du comptage. C’est cette dernière qui sera
représentée.
59
6- Méthodes analytiques
6.1- Détermination de la biomasse
6.1.1- Mesure de la densité optique (DO)
L’évolution de la densité optique est estimée par spectrophotométrie à 600nm
(Spectrophotomètre Biochrom Libra S11) dans une cuve de 1mm de trajet optique. Afin de
favoriser le détachement des cellules et leur propagation dans le milieu, un bref passage au
sonificateur a été réalisé avec certaines souches qui préfèrent rester associées les aunes aux
autres. La zone de linéarité du spectrophotomètre se situant entre 0,1 et 0,3 unités
d’absorbance, des dilutions seront réalisées afin d’obtenir une densité optique située dans
cet intervalle.
6.1.2- Détermination de la matière sèche
La détermination de la biomasse sèche (g/L) par une méthode gravimétrique a été
réalisée de la manière suivante : un volume connu de culture est filtré à l'aide d'une pompe
à vide sur des membranes (Sartolon polyamide 0,45 µm SARTORIUS®) préalablement
séchées et pesées, puis rincées à l’eau distillée. Ces dernières sont ensuite séchées à l’étuve
à 60°C sous vide (200mm de Hg) pendant 48h puis pesées. La différence de masse des
membranes avant et après filtration de la suspension cellulaire permet de déterminer la
masse sèche (g/L). De plus le suivi de la croissance a permis d’établir une corrélation entre
ces deux paramètres (DO et matière sèche) afin d’homogénéiser la présentation des
résultats.
6.1.3- Détermination de la viabilité cellulaire et du nombre de cellules
6.1.3.1- Mesure de la viabilité au bleu de méthylène
Le principe de cette première technique repose sur la propriété que possède le bleu de
méthylène à pénétrer par diffusion dans toutes les cellules. La solution sera préparée
comme suit : 10mg de bleu de méthylène sont dilués dans 10ml d’eau distillée auxquels sont
ajoutés 2g de tricitrate de sodium dihydraté. L’ensemble est filtré sur une membrane
Minisart 0,2µm (SARTORIUS®) puis on complète 100ml avec de l’eau distillée stérile.
Le bleu de méthylène est une molécule organique qui réagit avec les oxydoréductases des
cellules actives. Il peut exister sous les deux formes :
* la forme oxydée en donnant une couleur bleue
* la forme réduite incolore.
60
Le bleu de méthylène sera réduit si les cellules sont actives (Bapat et al., 2006) tandis que les
cellules mortes seront colorées en bleu (Manabu et al., 1994).
6.1.3.2- Cellule de Thoma
La cellule de Thoma est composée de 16 grands carrés identiques. Ce grand carré
est lui-même formé de 16 (4X4) surfaces élémentaires (ou petits carrés) qui mesure chacune
1/400mm2. Le comptage est réalisé dans 10 grands carrés, pris en fer à cheval dans
l’ensemble de la cellule de Thoma. L’épaisseur entre lame et lamelle au niveau du
quadrillage est de 0,1mm et le volume observé est ainsi parfaitement défini. Le résultat est
exprimé comme suit :
10 X 16 X 1/400 X 0,1 = 0,04 mm3
Soit « n » le nombre de levures comptées. Le nombre de levures dans 1ml est
représenté par N et calculé comme suit
N = (n x1000)/0,04 = 25 000 n
La concentration cellulaire est ainsi exprimée en nombre de cellules/ml.
6.1.3.3- Comptage
Afin d’estimer le pourcentage des cellules viables, un mélange de 200µl de la
solution de bleu de méthylène avec 200µl de la suspension cellulaire est réalisé dans les
puits d’une microplaque ELISA. Après homogénéisation et 10mn d’incubation à température
ambiante, le mélange est introduit dans la cellule de Thoma et les cellules de levures sont
alors comptées au microscope optique (Nikon Eclipse E 400, grossissement 40 x 10). Ces
cellules se répartissent sur la lame de manière aléatoire. Les règles de comptage appliquées
sont les suivantes: pour des cellules chevauchant les lignes de quadrillage, seules les cellules
chevauchant la ligne horizontale supérieure et la ligne verticale droite sont comptées. Dans
le cas des levures bourgeonnantes, la cellule fille est comptée comme une cellule seulement
si sa taille est supérieure ou égale à la moitié de la taille de la cellule mère. Le nombre de
61
cellules doit être compris entre 150 et 300 pour diminuer l’erreur effectuée sur le comptage
au dessous de 10% (Postgate, 1967 ; McLean et al., 2001). Il suffit de compter les cellules
bleues et les cellules incolores.
Le pourcentage de viabilité est calculé en faisant le rapport entre le nombre de cellules
viables et le nombre total de cellules, en utilisant la formule suivante :
% viabilité = Nombre de Cellules Actives / (Nombre de Cellules Viables + Nombre de
Cellules Non Viables).
6.1.4- Dénombrement après culture
Les cellules viables sont définies comme étant des cellules capables de se dupliquer.
Cette méthode permet donc de les quantifier en comptant les colonies qu’elles forment.
Cette fraction de la population est déterminée par étalement sur milieu solide. Des dilutions
sont réalisées avec de l’eau physiologique (0,9 w/v NaCl : H 2O). Un échantillon est prélevé
stérilement de la culture et dilué successivement au dixième jusqu’à atteindre le niveau de
dilution permettant d’obtenir au mieux une cellule par millilitre de suspension. 100µl de
chaque dilution sont alors étalés sur milieu gélosé avec trois répétitions afin de faire la
moyenne des résultats. Après 48 heures d’incubation à 30°C, un comptage est réalisé sur les
boites dont le nombre de colonies se situe entre 30 et 300. Le résultat du comptage est
donné en unités formant une colonie (UFC/ml).
6.2- Extraction d’alcools supérieurs et leurs acétates
La production de trois alcools supérieurs (2-méthylbutanol, 3-méthylbutanol et 2phényléthanol) ainsi que leurs acétates (2-méthylbutylacétate, 3-méthylbutylacétate et 2phényléthylacétate) a été étudiée chez les cinq souches sur trois milieux : YPD, MMS avec le
sulfate d’ammonium comme source d’azote et MMS dont la source d’azote est représentée
par trois acides aminés : leucine, isoleucine et phénylalanine.
La cinétique de ces souches et celle de la souche CEN.PK122-2N prise comme souche de
référence, a été suivie et des prélèvements réalisés en phase exponentielle sont centrifugés.
Les surnageants récupérés sont conservés à -20°C.
L’étalon inter, qui va servir pour l’extraction, est préparé en prenant 25µl d’octanol dans une
fiole jaugée auquel on ajoute de l’éther jusqu’à 25ml. Ce mélange, qui est préparé
rapidement et avec précision sous une hotte, est mélangé et réparti dans des flacons qui se
ferment hermétiquement puis placé dans de la glace dans une chambre froide.
L’extraction des arômes est réalisée dans une chambre froide en mélangeant 1ml de chaque
échantillon avec 500µl de l’étalon inter. Ce mélange est vortexé pendant une minute puis
centrifugé à 400 rpm, à 16°C pendant 5 minutes. Deux phases sont alors obtenues (une
phase aqueuse et une phase organique).
62
En travaillant toujours à froid, 400µl de la phase organique sont récupérés dans des flacons
qui sont rapidement scellés afin d’éviter toute évaporation et qui seront analysés en
chromatographie en phase gazeuse.
6.3- Analyse chromatographique par HPLC pour le dosage des
différents sucres, éthanol, glycérol et acétate
L’HPLC, chromatographie liquide à haute pression, est une technique qui nous a permis
de quantifier les concentrations en sucres et autres métabolites tels que l’éthanol, l’acide
acétique et le glycérol sécrétés au cours des cultures réalisées. Tous ces composés ont fait
l’objet d’un étalonnage qui a été réalisé à partir de solutions contenant les différents
composés à analyser dans des gammes de concentrations variables. Les échantillons
prélevés du milieu de culture ou de fermentation à différentes phases de la croissance sont
centrifugés deux fois 13 000 tr/min pendant 5 mn et le surnageant est ensuite filtré avec des
filtres nylon 0.22µm avant d’être analysés. Les filtrats sont placés dans des flacons fermés
munis d’un septum perforable par l’aiguille d’injection.
L’appareil utilisé dispose d’une colonne (Aminex HPX-87H 300 mm x 7.8 mm -BioRad-)
spécifique pour la séparation des sucres, des alcools et des acides organiques. La phase
mobile utilisée est une phase polaire constituée d’un mélange d’acide sulfurique (H 2SO4) et
d’eau ultrapure à une concentration de 5 mM circulant à un débit de 0,5ml/mn pendant
toute la durée de l’acquisition. Cet éluant est préparé et préalablement dégazé sous vide.
La température de la colonne est fixée à 48°C et le volume de la boucle d’injection est de
20µl. La détection de chaque composant se fait à l’aide d’un réfractomètre (Refractomètre
Waters modèle 410). L’acquisition et le traitement des données se font par un logiciel
spécialisé, Chromeleon Chromatography Management System (Thermo Scientific Dionex),
permettant de calculer la surface des pics détectés. Cette surface est corrélée à une valeur
de concentration par l’intermédiaire d’une droite de calibration déterminée préalablement
pour chaque constituant.
6.4- Analyse chromatographique par GC-FID pour le dosage des
alcools supérieurs et leurs acétates
Cette analyse a été réalisée avec un appareil Agilent 6890N et une colonne de type
Agilent HP5 (longueur 30 m, diamètre 320 µm, épaisseur de film 0.25 µm) selon les
conditions suivantes :
 Gaz vecteur : Helium.
 Injecteur : 250°C, Split ratio = 10, Volume injecté = 2 µL.
 Détecteur : FID, 270°C, Débit H2 = 30 ml/min, Air = 300 ml/min.
 Conditions thermiques de séparation : 40°C 5 min.
Rampe de 30°C/min jusqu’à 250°C.
63
250°C 5 min
7- Analyse physiologique
7.1- Culture en anaérobiose
Les cinq souches (C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) ont été
examinées pour leur capacité à croitre en anaérobiose sur YPD solide à 30°C.
D’autres cultures ont été réalisées sur YPD liquide dans des fioles (figure 9), auxquelles ont
été ajoutés de la resazurin sodium salt (1000X) à 1g/L comme indicateur d’oxygène, du
Tween 80 (200X, dilué dans de l’eau) et de l’ergostérol (1000X, dilué dans de l’isopropanol)
qui est un facteur de croissance nécessaire en anaérobiose. L’incubation se fait sous
agitation (100 rpm).
Figure 9: Flacons pour la culture en anaérobiose des levures à 30°C
7.2- Assimilation des substrats carbonés
Les méthodes rapides actuellement commercialisées peuvent se substituer efficacement
à la démarche classique qui est longue et lourde à mettre en œuvre. Parmi ces dernières la
galerie ID 32C permet d’effectuer de nombreux tests en un temps court et sa relative
simplicité rendant son utilisation dans un laboratoire très appréciable.
7.2.1- Principe et description du dispositif
La galerie ID 32C est un système standardisé pour l’identification des levures et qui
comprend 32 tests d’assimilation miniaturisés. Elle comporte principalement 32 cupules
contenant chacune un substrat carboné sous forme déshydratée (Annexe 1) et des milieux
64
semi-solides (API C Medium) (Annexe 2) qui permettent de mettre en suspension les levures
à tester.
Après avoir mis en culture nos souches, on suspend quelques colonies de chaque souche
dans de l’eau distillée stérile dont l’opacité est comparée au Mac Farland point 2. 250µl de
chaque suspension sont transférés dans une ampoule qui contient le milieu semi solide API C
Medium, fourni dans le coffret. Après homogénéisation, on inocule la galerie en distribuant
135µl de la suspension par cupule puis on place le couvercle sur la galerie et on l’incube à
30°C.
Une première lecture est réalisée après 24 heures d’incubation et une autre après 48
heures, en notant la présence éventuelle d’un trouble et ceci par comparaison au contrôle
(O) qui est en position 1.F sur la galerie.
65
RESULTATS ET DISCUSSION
Résultats et Discussion
Les levures sont largement distribuées dans la nature et leur aspect ubiquitaire est encore
une fois confirmé par leur présence dans les échantillons biologiques choisis. Les levures
représentent une part notable de la flore microbienne des dattes, du melon, du cornichon,
du lait, et du miel où elles sont susceptibles de participer activement aux différentes
modifications biochimiques qui sont à l’origine du développement de la saveur et de l’arôme
de ces produits (Grippon, 1978 ; Schmidt et al., 1979 ; Schmidt, 1984 et Baroiller et Schmidt,
1990).
1- Identification des isolats de levure
1.1- PCR sur histones
A partir de ces biotopes, l’isolement a en effet aboutit à soixante quinze isolats. Une
première sélection a été faite en prenant la croissance comme premier critère et tous les
isolats à croissance lente ont été éliminés. Une deuxième sélection nous a permis de garder
dix-huit isolats, éliminant ceux qui avaient les mêmes caractéristiques morphologiques et
culturales et qui provenaient du même échantillon biologique.
Parmi ces dix huit isolats sélectionnés nous avons pu identifier par PCR sur histones les cinq
suivants S6, S7, S10, S11, S12 (figure 10) qui appartiennent au genre Yarrowia et à l’espèce
lipolytica. Cette technique est très fiable puisqu’elle a démontré que les régions promotrices
des gènes H3-H4 codant les histones dans la levure représentent une zone de choix pour une
identification rapide et précise permettant de différencier les différentes espèces entre elles
(Bell, 2004). Mais à cause du nombre limité de souches contrôles les autres isolats n’ont pas
pu être identifiées comme le montre les profils d’amplification qui sont représentés dans la
figure 10.
67
Figure 10: PCR des produits d’amplification (Amplicons H3 et H4) des 18 isolats
de levures
T: marqueur de taille; A: S. cerevisiae CEN.PK122-2N; B: S. cerevisiae BY4741; C: S.
pombae; D: Kluyveromyces lactis; E: Yarrowia lipolytica; F: Pichia guilliermondi;
S: souches à identifier.
1.2- Identification moléculaire
Une identification moléculaire s’est avérée nécessaire puisque l’ensemble des levures n’a
pu être identifié. Cette identification, comme indiqué dans matériel et méthodes, a été
réalisée au Centre International de Ressources Microbiennes (CIRM) en se basant sur
l’amplification par PCR et séquençage des amplicons du domaine D1/D2 de la région 26S de
l’ADN ribosomique (Kurtzman et Robnett 1997 et Kurtzman et Robnett, 1998). Cette
technique a été utilisée dans l’identification de toutes les levures isolées à partir de produits
alimentaires (Huang et al., 2010) et de nombreux travaux ont souligné la fiabilité et la
rapidité de cette méthode dans l’identification des levures (Baffi et al., 2011).
Le nombre d’isolats a été limité à dix. Les amplicons obtenus ont été séquencés et leurs
séquences ont été comparées aux bases de données. Les identités de séquences (100%) ont
permis de classer les dix isolats suivants en neuf espèces :
 Clavispora lusitaniae
 Hanseniaspora uvarum
 Kodamaea ohmeri
 Issatchenkia orientalis
 Trichosporon asahii
isolées à partir des dattes
isolées à partir du lait de chamelle
68
 Candida parapsilosis
isolée à partir du melon
 Yarrowia lipolytica
isolée à partir du lait de vache, de brebis et de chèvre
 Zygosaccharomyces bailii
isolée à partir du cornichon
 Zygosaccharomyces rouxii
isolée à partir du miel
L’ensemble de ces résultats sont représentés dans le tableau 4 et le rapport de l’alignement
des séquences est en annexe 3.
Tableau 4: Résultats du séquençage des amplicons obtenus après amplification par
PCR, du domaine D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique et comparaison aux
séquences de la base de données du NCBI faites à CIRM (Grignon, Paris)
Code de la souche
AH1 (S1)
AJ3 (S2)
BFK (S3)
MJ2 (S5)
LVG/PC (S6)
LVB/PR (S7)
LBN/CR (S10)
LCT/CV (S11)
LCS/ CS (S14)
LCW/GC (S15)
C/PC2 (S17)
MM2 (S18)
origine
Dattes
Dattes
Dattes
Melon
Lait de vache (Ghardaïa)
Lait de vache (Oran)
Lait de brebis
Lait de chèvre
Lait de chamelle (Ghardaïa)
Lait de chamelle (Bechar)
cornichon
Miel
Espèces
Clavispora lusitaniae
Hanseniaspora uvarum
Kodamaea ohmeri
Candida parapsilosis
Yarrowia lipolytica
Yarrowiali polytica
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica
Trichosporon asahii
Zygosaccharomyces bailii
Zygosaccharomyces rouxii
La présence de Yarrowia lipolytica dans le lait de vache, de brebis et de chèvre n’était pas
fortuite en raison de la teneur élevée de ces produits en lipides (Choisy et al., 1987 ;
Guerzoni et al., 1998 ; Wyder et Puham, 1999 ; Guerzoni et al., 2001 ; Suzzi et al., 2001). La
présence de Zygosaccharomyces bailii dans le cornichon n’est pas étonnante non plus car
elle est très tolérante au sel (Praphailong et Fleet, 1997) et c’est aussi le cas de
Zygosaccharomyces rouxii qui est présente dans le miel et qui est très résistante au sucre
(Barnett et al., 1990 ; Jansen et al., 2003).
69
En revanche, Trichosporon asahii et Candida parapsilosis sont considérées comme des
pathogènes opportunistes dont le principal habitat est la peau des êtres humains et des
animaux (Ebright et al., 2001). Il est peu probable que ces souches aient été initialement
présentes dans les échantillons biologiques choisis.
La large gamme d’habitat de l’espèce Clavispora lusitaniae comme l’a signalé Lachance et
ses collaborateurs en 2003 est en adéquation avec sa présence dans les dattes. Wyder et
Puham (1999) ainsi que El-Sharoud et ses collaborateurs (2009) ont également signalé sa
présence dans les fromages et certains produits laitiers car elle participe à leur affinage.
C’est une espèce qui a été retrouvée également dans les déchets industriels et quelques
échantillons cliniques (Gargeya et al., 1990).
L’isolement de Hanseniaspora uvarum à partir des dattes est en accord avec ce fruit puisque
cette espèce se retrouve couramment sur la peau des fruits riches en fructose et glucose
comme la peau des raisins (Baffi et al., 2011) et des pommes (Pando Bedrinana et al., 2011).
Elle a été retrouvée également dans le jus d’orange où elle participe à sa fermentation
(Mingorance-Cazola et al., 2003).
La présence de Kodamaea ohmeri dans les dattes est moins évidente car c’est une levure
qui est transporté par les insectes et les abeilles lors de leur visite sur les fleurs éphémères
(Lachance et al., 2001 et Benda et al., 2008). C’est une espèce qui a été isolée par Chi et ses
collaborateurs (2012) à partir de l’écosystème des mangroves (Chine), de la chair et des
excréments du poulet (avec I. orientalis) pour une éventuelle utilisation en tant que
probiotiques chez les animaux (Garcia-Hernandez et al., 2011 et Chi et al., 2012). Ajoutons à
ces travaux, ceux de Zhu et ses collaborateurs qui ont isolé à partir des sources naturelles
osmophiles, une souche de K. ohmeri capable de produire le D-arabitol, qui a une saveur
sucrée plus faible que le saccharose et moins sucré que le xylitol avec une valeur calorique
proche du zéro, et qui était jusque là produit uniquement par Candida famata (Zhu et al.,
2010).
Issatchenkia orientalis est l’une des levures indigènes présente sur la peau des raisins (Baffi
et al., 2011) et dans le vin (Clemente-Jimenez et al., 2004) qui se caractérise par sa tolérance
à l’acidité et à l’éthanol (Okuma et al., 1986). Elle a été également isolée à partir du Kéfir et
utilisée comme additif alimentaire microbien pour les animaux (Lee et al., 2002). Sa
présence peut s’expliquer par le fait que l’isolement a été réalisé après la fermentation du
lait de chamelle. Sa tolérance à la température, à l’acidité et à l’éthanol, ainsi que sa capacité
à assimiler du citrate et à fermenter du glucose et du saccharose lui permette de jouer un
rôle dans la fermentation du cacao (Daniel et al., 2009). Elle a été aussi retrouvée dans les
olives (Arroyo-Lopez et al., 2006) et certains produits laitiers tels que les fromages (ElSharoud et al., 2009) où elle participe à la protéolyse et la formation de composés d’arômes
dans le fromage type camembert (Chen et al., 2011) et les yaourts (Lourens-Hattingh et
Viljoen, 2002).
70
Il est à noter que l’étude réalisée par Galzy et ses collaborateurs (1996) a bien confirmé la
présence de C. lusitaniae, H. uvarum et Z. bailii dans les fruits, celle d’I. orientalis et de Y.
lipolytica dans les laitages et de Z. rouxii dans le miel.
De nombreux travaux ont été réalisés sur les souches Yarrowia lipolytica (Barth et Gaillardin,
1997), Zygosaccharomyces bailii et Z. rouxii (Merico et al., 2003 ; Martorell et al., 2007),
nous avons donc concentré notre étude physiologique sur les cinq souches restantes, à
savoir: C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii. Ces espèces sont isolées
à partir des dattes et du lait de chamelle, provenant d’un biotope particulier caractérisé par
son climat désertique et sa température élevée. De plus ces souches sont très peu étudiées
ce qui donne à notre travail un caractère novateur.
2- Caractères culturaux et morphologiques
Nous avons débuté notre étude par des cultures en milieu complet liquide et solide afin de
déterminer l’aspect des cultures de ces souches, la morphologie des cellules isolées, une
éventuelle organisation particulière des cellules (mycélium ou pseudo-mycélium), la
formation ou non de « spores » asexuées (chlamydospores, ballistospores, arthrospores) et
leurs modes de reproduction végétative qui peut se faire par scissiparité ou par
bourgeonnement. Dans ce dernier cas, l’arrangement du (ou des) bourgeon (s) sur la cellule
mère (bourgeonnement monopolaire, bipolaire ou multipolaire) mérite une attention.
L’ensemble de ces résultats sont regroupés dans le tableau 5.
2.1- Caractères culturaux
2.1.1- Sur milieu liquide
La croissance de ces levures en milieu liquide se manifeste de façon différente. On
note le caractère gazogène de l’ensemble des souches qui se traduit par la présence du CO 2
dans la cloche de Durham, excepté pour Trichosporon asahii. On observe la présence d’une
pellicule qui nappe la paroi du tube uniquement chez les souches isolées à partir du lait à
savoir Trichosporon ashii et Issatchenkia orientalis. La formation de cette pellicule a déjà été
observée chez cette dernière. Elle correspond à des polysaccharides produits par ces
souches. Les dépôts, qui renseignent sur la masse cellulaire, sont fins chez la souche H.
uvarum, cotonneux chez T. asahii, modéré chez la souche K. ohmeri et épais chez les souches
C. lusitaniae et I. orientalis (figure 11).
71
Figure 11: Aspect des cultures des cinq souches sur YPD liquide à 30°C pendant 3 jours
C.l: Clavispora lusitaniae ; H.u: Hanseniaspora uvarum ; K.o: Kodamaea ohmeri ;
T.a: Trichosporon asahii ; I.o: Issatchenkia orientalis
2.1.2- Sur milieu solide
Après une croissance de trois jours à 30°C sur milieu solide, ces souches à l’exception
de la souche T. asahii, possèdent en commun la forme ronde, le contour régulier et la
couleur blanche des colonies. On note cependant des différences d’aspect qui sont
représentées dans la figure 12 et sont résumées dans le tableau 5. T. asahii donne des
colonies veloutées et plissées. Ces caractères concordent très bien avec ceux cités dans la
littérature.
72
Figure 12: Aspect macroscopique des colonies des cinq souches après 3 jours d’incubation
sur YPD solide à 30°C
C.l: Clavispora lusitaniae ; H.u: Hanseniaspora uvarum ; K.o: Kodamaea ohmeri ;
I.o: Issatchenkia orientalis ; T.a: Trichosporon asahii.
2.2- Caractères morphologiques
La morphologie des cellules, comme l’illustre la figure 13, est variable. Elle est sphérique
chez C. lusitaniae et K. ohmeri, apiculée chez H. uvarum, ovoïde chez I. orientalis et allongée
chez T.asahii. Le mode de reproduction végétatif se fait par bourgeonnement pour la totalité
des souches. Il est bipolaire chez H. uvarum et multipolaire chez C. lusitaniae, K. ohmeri et I.
orientalis. La présence de pseudomycélium, formé par une succession de bourgeons allongés
et en chaines ramifiées, a été observée chez toutes les souches excepté pour I. orientalis. Par
contre chez T. asahii, des mycéliums bien développés où le thalle est bien organisé autour
d’un axe filamenteux à cloisons transversales, ont été remarqués en plus des
pseudomycéliums et des arthrospores, arrangées en « zigzag », qui résultent de la
désarticulation du mycélium.
73
Figure 13: Aspect microscopique des cellules des cinq souches après une culture de 24 h sur
YPD liquide à 30°C
74
Tableau 5: Les caractères culturaux et morphologiques des cinq souches de levures
retenues cultivées sur milieu YPD solide et liquide et incubées à 30°C
Souches
Caractères culturaux
sur milieu liquide
-Souche gazogène.
-Dépôt épais.
Caractères culturaux
sur milieu solide
-Colonie ronde, lisse et brillante
-Bord régulier
-Blanche et bombée.
Hanseniaspora
uvarum
-Souche gazogène.
-Dépôt fin.
-Colonie ronde, bord régulier
-Contour lisse, centre velouté
-Blanche
-Bombée avec le centre en
cône.
-Cellules apiculée (en forme
de citron).
-Bourgeonnement bipolaire.
-Présence
de
pseudomycélium.
Kodamaea ohmeri
-Souche gazogène.
-Dépôt modéré.
-Velouté
-Blanche
-Bombée avec
le centre en cône.
-Cellules sphériques.
-Bourgeonnement
multipolaire.
-Présence
de
pseudomycélium.
Issatchenkia
orientalis
-Souche gazogène.
-Dépôt épais.
-Présence de
voile.
- Velouté
-Blanche
-bombée.
-Grosses cellules ovoïdes.
-Bourgeonnement
multipolaires.
-Souche
non gazogène.
-Dépôt fin.
-Présence de
voile.
-Colonie ronde, bord dentelé
-Velouté avec surface plissée
- Blanche
-Bombée.
-Forme variable souvent
allongée.
- Présence de pseudomycélium.
-Mycélium bien développé.
-Présence d’arthrospores.
Clavispora
lusitaniae
Trichosporon asahii
75
Caractères morphologiques
-Cellules sphériques.
-Bourgeonnement
multipolaire.
-Présence de
pseudomycélium.
3-Effet des différents stress
Les levures rencontrent au cours de leur croissance et leur cycle de reproduction différentes
contraintes. Elles sont exposées à un ensemble de stress tels que les stress osmotique,
oxydatif, thermique, stress éthanol ou carence nutritive. Ces conditions de stress,
considérées comme des variations dans le milieu de culture des levures, impactent leur
comportement en affectant leurs capacités de croissance et leurs productions, causant ainsi
un dysfonctionnement pouvant aller jusqu’à la mort des cellules (Estruch, 2000 et
Hohmann, 2002). Il est important que les cellules disposent de moyens pour faire face à ces
stress afin de résister à ces dommages et réparer ceux causés au niveau macromoléculaire.
Ils sont notamment cruciaux pour les procédés de bioconversions et l’une des contraintes
dans un tel bioprocédé est de trouver un bon compromis entre d’une part leur optimisation
pour la productivité, le rendement et la viabilité des cellules et d’autre part la minimisation
du coût énergétique liés à ces régulations. Ce qui souligne l’importance de cette étude.
3.1- Effet de la température
La température est l’un des facteurs les plus importants qui agit sur la croissance des
microorganismes et leurs productions. Très peu d’études ont été consacrées à ce facteur et
son impact sur le comportement des levures au cours de la fermentation comme il a été
mentionné par Torija et ses collaborateurs (Torija et al., 2003). En revanche, on sait que la
température a un effet direct sur la viabilité cellulaire, la production d’éthanol et de glycérol
(Aldiguier et al., 2004). L’impact de ce paramètre, sur les cinq souches de levure retenues (C.
lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii), a été étudié et a donné les
résultats illustrés dans la figure 14.
Figure 14: Effet de la température sur les cinq souches de levure étudiées cultivées
sur milieu YPD solide
Ces résultats montrent que seule Hansenispora uvarum est incapable de soutenir une
croissance au-delà de 30°C et montre une sensibilité très nette à 37°C. Les quatre autres
souches affichent une bonne croissance jusqu’à 40°C. Il est important de noter que la
croissance d’Issatchenkia orientalis a été la moins affectée à haute température et elle peut
poursuivre sa croissance jusqu’à 42°C (résultat non présenté). Ces résultats sont en accord
avec les propriétés thermo-tolérantes de cette espèce signalées dans les travaux précédents
76
(Gallardo et al., 2010 ; Gallardo et al., 2011 ; Kwon et al., 2011 et Yuangsaard et al., 2013),
elle doit avoir une membrane plasmique plus résistante aux dénaturations thermiques. De
plus, Gallardo et ses collaborateurs ont montré que non seulement cette espèce poursuit sa
croissance à de telles températures mais donne le meilleur de sa production en éthanol à
42°C contrairement à Saccharomyces cerevisiae connue pour sa production maximale
d’éthanol entre 30-35°C (Gallardo et al., 2010). Cette souche peut avoir une grande valeur
pour des applications biotechnologiques en particulier lorsque la température dépasse les
39°C au sein d’un système de fermentation continu.
3.2- Effet du pH
Les levures apprécient bien l’acidité, mais elles n’ont pas la même sensibilité au pH.
Chacune est caractérisée par un seuil en dessus duquel elle ne se développe pas. La capacité
que possède les levures à résister à l’acidité a été étudiée chez de nombreuses souches de
levures (Wyder Puham, 1999) qui précisent l’importante inhibition par des pH très acides
(inférieur à 3) (Thomas et al., 2002) en ralentissant la consommation du sucre et réduisant
par conséquent la productivité (Torija et al., 2003) ou en affectant le transport actif de
l’azote (Dubois et Grenson, 1979 et Gregory et al., 1982), d’où l’importance des souches
résistantes à des pH bas.
Dans ce contexte et compte tenu du rôle essentiel que joue le pH sur différents aspects,
nous avons mis au point l’effet de ce stress sur les souches de levures retenues. Les résultats
reportés sur la figure 15 montrent une bonne résistance de toutes les souches aux pH= 4 - 5
et 7. En revanche à un pH très acide comme 2,5, la croissance n’est observée qu’avec les
souches Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora uvarum et Issatchenkia orientalis qui arrivent
à y résister. Les deux autres souches, en particulier Trichosporon asahii, présentent une
forte sensibilité à cette valeur. Il convient de noter que malgré la sensibilité de la souche H.
uvarum à la température, cette dernière montre une résistance importante aux pH très
acides.
77
Figure 15: L’effet du pH sur les cinq souches de levure étudiées sur milieu YPD solide,
incubées à 30°C
T.a: Trichosporon asahii ; I.o: Issatchenkia orientalis ; K.o: Kodamaea ohmeri ;
H.u: Haseniaspora uvarum ; C.l: Clavispora lusitaniae.
Cette résistance persiste même à 40°C avec la souche Issatchenkia orientalis qui affiche la
plus large gamme de pH pour sa croissance (résultats non présentés). Ceci concorde très
bien avec les travaux qui ont souligné la résistance de cette espèce à des pH très bas et à
différents acides comme l’acide lactique (Halme et al., 2004), l’acide acétique (Casey et
Dobson, 2003) et l’acide malique (Seo et al., 2007 et Kim et al., 2008) auxquels beaucoup de
levures sont sensibles.
3.3- Effet du stress salin
Le stress salin est l’un des plus sévères pour les microorganismes, y compris les levures.
Des concentrations élevées en sel dans le milieu peuvent avoir des effets toxiques sur le
métabolisme cellulaire car le potentiel hydrique est diminué. Une concentration importante
en ions rend difficile, voir impossible, l’absorption de l’eau par la levure puisqu’elle a un
potentiel hydrique inférieur à celui du milieu environnant. Pour maintenir constante l’eau
intracellulaire, la concentration cytoplasmique des composés osmotiques actifs doit être
supérieur à celle du milieu environnant (phénomène de « salt-in »). C’est le moyen
78
qu’utilisent les levures pour répondre à ce genre de stress. Afin d’évaluer la réponse à ce
stress par nos souches, nous les avons cultivées sur un milieu minimum avec une
concentration de 0,5M de NaCl.
Cette étude a montré qu’à 30°C, température optimale pour la croissance des levures, les
cinq souches (C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) ont bien toléré
cette concentration de NaCl (figure 16). Les études, peu nombreuses, réalisées sur ce stress
chez les levures ont montré que le glycérol joue un rôle important dans la résistance
puisqu’il constitue le principal soluté accumulé en réponse à la salinité (Jennings, 1984 et
Bellinger et Larher, 1988).
Figure 16: Effet du NaCl (0,5M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une
incubation à 30°C et à 40°C.
3.4- Effet du stress osmotique
La levure, comme les autres cellules, est capable de détecter un changement de la
pression osmotique du milieu extérieur et y répond par une déformation de la membrane
cellulaire ou par un changement de l’hydratation des protéines de la membrane (Deardorff,
1980 ; Kopell et Westhead, 1982 ; Hohmann, 2002 ; Fullerton et al., 2006 et Sun et al., 2007).
En général, elles répondent plus rapidement à un environnement hypo-osmotique qu’à un
environnement hyper-osmotique, puisque le risque d’éclatement est plus sévère (Potts,
1994 et Wood, 1999). Le mécanisme de résistance des levures à des milieux à activité d’eau
faible se traduit par l’accumulation dans la cellule de polyols. C’est le cas de
Zygosaccharomyces, souche xérotolérante, qui accumule de l’arabitol et du glycérol quand
l’activité de l’eau est faible (Rose, 1987). La résistance à ce stress a été également évaluée
chez nos souches en les cultivant de la même manière que le stress salin avec une
concentration de 2M de sorbitol. Des résultats similaires à ceux du stress salin ont été
obtenus avec le stress osmotique. Une croissance nette à 30°C des cinq souches comme le
montre la figure 17.
79
Figure 17: Effet du sorbitol (2M) sur les cinq souches cultivées sur milieu
YNB avec une incubation à 30°C et à 40°C.
L’effet des stress osmotique et salin ont été étudiées chez d’autres souches (Jakobsen et
Narvhus, 1996 ; Laubscher et Viljoen, 1999 et Fleet, 2007) mais sans l’effet de la
température. Notre étude a combiné ces stress avec le stress thermique et les résultats
obtenus montrent qu’à 40°C seules les souches C. lusitaniae et I. orientalis résistent à l’effet
synergique (figure 16 et 17). La souche H. uvarum, ne pousse pas à cette température et les
deux autres souches (K. ohmeri et T. asahii) ne résistent pas à l’effet combiné de ces deux
stress. Ces résultats sont résumés dans le tableau 6.
80
Tableau 6: Effet des différents stress sur les cinq souches de levures étudiées
(+ : Croissance positive ; - : pas de croissance)
Souches
pH
2,5 4
Températures (°C)
5
7
NaCl (0,5M) Sorbitol (2M)
25 30 37 40 42 30°C
40°C
30°C
40°C
Clavispora
lusitaniae
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
Hanseniaspora
uvarum
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
+
-
Kodamaea
ohmeri
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
Issatchenkia
orientalis
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Trichosporon
asahii
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
3.5- Effet de l’éthanol
Bien que l’éthanol soit le produit final de la fermentation, il devient un facteur de stress
important en s’accumulant dans le milieu. Il est connu comme un inhibiteur de la croissance
des microorganismes. Une fois produit par les levures, il diffuse à travers la membrane
plasmique, inhibe la croissance (Piper, 1995), diminue la viabilité des cellules (Bai et al.,
2004), affectant considérablement les fonctions et les propriétés physico-chimiques de la
membrane plasmique (Alexandre et al., 1994 et Alexandre et al., 1998) et réduit ainsi le
rendement en éthanol (Pina et al., 2004), ce qui impacte sérieusement les entreprises
industrielles. Les effets toxiques de cet alcool sur les souches de levure sont nombreux et
plusieurs études ont été réalisées dans ce sens. Déterminer l’effet de l’éthanol sur nos
souches nous a paru important à définir.
L’impact de ce stress sur nos souches ainsi que sur S. cerevisiae CEN.PK122-2N qui a servi de
souche de référence, a été étudié sur YPD avec différentes concentration en éthanol et à
deux températures (30°C et 40°C). La figure 18 illustre la réponse observée à ces stress et
montre clairement que l’effet inhibiteur de l’éthanol diffère d’une souche à une autre.
81
Figure 18: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YPD
solide incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)
C.N: souche de référence (CEN.PK122-2N) ; T.a: Trichosporon asahii ; I.o:
Issatchenkia orientalis ; K.o: Kodamea ohmeri ; H.u: Hanseniaspora uvarum ;
C.l: Clavispora lusitaniae.
A 30°C, les souches les plus sensibles sont Hanseniaspora uvarum et Trichosporon asahii
dont la résistance ne dépasse guère les 8%. La résistance pour la souche Kodameae ohmeri
atteint les 10% avec une inhibition complète à 12%. Celle de Clavispora lusitaniae atteint les
8% avec une inhibition totale à 10%. La souche de référence CEN.PK122-2N montre une
résistance importante allant jusqu’à 16%. Cependant, la souche Issatchenkia orientalis s’est
révélée la plus résistante à la toxicité de l’éthanol et d’une manière significative puisqu’elle
peut se développer en présence de 18% d’éthanol.
A 40°C, H. uvarum ne pousse pas, quand à T. asahii, sa résistance ne dépasse pas les 8%. La
résistance de la souche K. ohmeri baisse à 5% et de la souche de référence à 10%. En
revanche, une reprise de croissance de la souche C. lusitaniae a été constatée à cette
température mais avec un aspect de colonies différent, ceci laisse supposer l’apparition de
mutants. La souche I. orientalis reste la souche la plus résistante même à 40°C, une
température favorable à sa croissance comme il a été montré précédemment et à sa
production en éthanol, puisque cette production est meilleure à 42°C comme il a été
démontré par d’autres études (Gallardo et al., 2010 et Kwon et al., 2011)
On peut en déduire que lorsque la température et l’éthanol induisent des effets synergiques
sur la croissance, la résistance de ces levures diminue. Ceci a été montré chez S. cerevisiae
où la contribution de la température de la fermentation combinée avec le stress éthanol
influe sur la production en biomasse, la viabilité cellulaire et les différents types de
production notamment celle de l’éthanol et du glycérol (Aldiguier et al., 2004). Cependant
82
d’autres travaux ont bien montré que la concentration critique de l’éthanol à partir de
laquelle la levure cesse de croître est influencée par plusieurs facteurs (Casey et Ingledew,
1986 ; Van Uden, 1985 ; D’Amore et Stewart, 1987 et Jones, 1989).
Nous avons voulu compléter ce travail en étudiant l’effet de ces deux stress sur ces souches
dans un milieu minimum (YNB), ceci permettrait de mieux cerner l’impact du stress et de le
gérer efficacement au cours des fermentations en conditions contrôlés. La figue 19 montre
la gamme de concentration d’éthanol au cours de laquelle on note l’effet inhibiteur pour les
différentes souches analysées.
Figure 19: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YNB
solide incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)
C.N: souche de référence (CEN.PK122-2N) ; T.a: Trichosporon asahii ; I.o:
Issatchenkia orientalis ; K.o: Kodamea ohmeri ; H.u: Hanseniaspora uvarum ;
C.l: Clavispora lusitaniae.
A 30°C, les souches H. uvarum, T. asahii, K. ohmeri et C. lusitaniae donnent les mêmes
résultats que sur YPD. La souche I. orientalis donne une croissance très faible avec 16 et 18%
d’éthanol. Quand à la souche de référence sa croissance s’est arrêtée à la concentration en
éthanol de 14%.
Par contre à 40°C, dans des conditions minimum on note une baisse significative de la
résistance qui est passée à 5% pour la souche de référence, K. ohmeri et T. asahii et à 10%
pour la souche I. orientalis qui reste la souche la plus résistante. Il importe également de
noter qu’aucun mutant n’a été observé chez la souche C. lusitaniae sur ce milieu dont la
résistance ne dépasse guerre les 5% à cette température. La souche d’Issatchenkia orientalis
83
possède donc un caractère de très grande valeur en termes de résistance, ce qui peut
impliquer son utilisation à l’échelle industrielle en particulier pour la production de l’éthanol.
Cette étude est importante car Saccharomyces cerevisiae, producteur traditionnel d’éthanol,
a toujours été considérée comme une souche sensible aux fortes concentrations en éthanol
(Bai et al., 2004 ; Pina et al., 2004). Différentes stratégies ont été utilisées afin d’améliorer la
production d’éthanol et la viabilité de Saccharomyces cerevisiae comme la composition du
milieu, les paramètres de fonctionnement et le niveau d’oxygène (Zhao et Bai, 2009).
D’autres travaux se sont intéressés à une alimentation exponentielle en vitamines (Alfenore
et al., 2002) et en acides aminés qui ont un effet protecteur (Morita et al., 2003 ; Sekine et
al., 2007 et Takagi, 2008) comme l’isoleucine, la méthionine, la phénylalanine et la proline
(Hirasawa et al., 2007 ; Ding et al., 2009).
L’extrait de levure, qui a également un rôle dans la protection des cellules (Casey et al.,
1983 ; Thomas et Inglewed, 1992 ; Thomas et al., 1993 ; Jones et Ingledew, 1994), le
magnésium (Dombek et Ingram, 1986 et Birch et Walker, 2000), l’ammonium (Leao et Van
Uden, 1986 ; Jones et Ingledew, 1994 et Nissen et al., 2000) et le calcium (Nabais et al.,1988)
ont également fait l’objet de plusieurs utilisations pour contrer l’effet de l’éthanol. Mais les
résultats restent toujours très limités et cette souche de levure demeure toujours incapable
de résister à des taux très élevés d’éthanol. La tolérance à cet alcool montre une complexité
importante qui implique de multiples gènes (Hu et al., 2007). Plus de 400 gènes tolérants à
l’éthanol ont été répertoriés (Alexandre et al., 2001 ; Fujita et al., 2004 ; Teixeira et al.,
2009 ; Ma et Liu, 2010).
Devant cette incapacité de créer une souche de Saccharomyces cerevisiae avec une
tolérance bien améliorée, des levures naturellement tolérantes à l’éthanol peuvent avoir un
intérêt fondamental pour les scientifiques et économique pour les industriels. Ces premiers
résultats obtenus avec la souche d’Issatchenkia orientalis montrent qu’elle est multirésistante et la capacité à tolérer divers stress est l’un des critères importants dans le choix
des souches performantes pour la fermentation. Elle peut être donc une candidate idéale et
constituer une souche robuste pour la fermentation alcoolique. Cependant, des recherches
supplémentaires et complémentaires doivent être menées afin de confirmer cette résistance
sur milieu liquide et comprendre l’origine et le mécanisme de résistance chez cette souche.
4- Analyse de la physiologie des cinq souches de
levures retenues
Plusieurs caractéristiques physiologiques des levures contribuent à leur succès en tant que
microorganisme industriel (Skinner et al., 1980 ; Kirsop, 1982 ; Reed, 1983 ; Triveldi et al.,
1986 ; Rose et Harrison, 1987 et Larpent, 1991).
84
4.1- Assimilation des substrats carbonés (Galerie API ID 32C)
Parmi les substrats utilisés par les levures, les composés carbonés sont les plus
importants. Certaines levures peuvent utiliser une large gamme de composés carbonés
contrairement à d’autres qui en assimilent un petit nombre. Ce critère étant très important
pour la physiologie des levures, nous avons réalisé une galerie API : ID 32C dont les résultats
sont résumés dans le tableau 7.
Tableau 7: Assimilation des substrats carbonés par les cinq souches de levure réalisée
sur la galerie: ID 32C
-: pas de trouble ; +: léger trouble ; ++: trouble moyen ; +++ : très bon trouble
TESTS
Substrats
C.lusitaniae
H.uvarum
K.ohmeri
I.orientalis
T.asahii
GAL
D-GALactose
+++
++
+++
++
+++
ACT
Cycloheximide
(ACTidione)
-
++
-
-
+++
SAC
D-Saccharose
+++
-
+++
+++
+++
NAG
N-Acétyl-Glucosamine
+++
-
+++
+++
+++
LAT
acide LAcTique
+++
-
+
+++
+++
ARA
L-ARAbinose
++
-
-
-
++
CEL
D-CELlobiose
+++
++
+++
++
+++
RAF
D-RAFfinose
++
+
+++
-
-
MAL
D-MALtose
+++
-
+++
++
+++
TRE
D-TREhalose
+++
-
+++
-
+++
2KG
potassium 2cétoGluconate
++
++
+++
-
+++
MDG
Méthyl-αDGlucopyranoside
+++
-
+++
-
+++
MAN
D-MANnitol
+++
-
+++
+
+
LAC
D-LACtose (origine
bovine)
-
-
-
-
+++
INO
INOsitol
-
-
-
-
-
O
Pas de substrat
0
0
0
0
0
85
TESTS
Substrats
C.lusitaniae
H.uvarum
K.ohmeri
I.orientalis
T.asahii
SOR
D-SORbitol
++
-
+++
-
-
XYL
D-XYLose
+++
-
-
-
+++
RIB
D-RIBose
++
++
+
-
+++
GLY
GLYcérol
+++
-
+++
++
-
RHA
L-RHAmnose
+++
-
+
-
+
PLE
PaLatinosE
+++
-
+++
++
+++
ERY
ERYthritol
-
-
-
-
++
MEL
D-MELibiose
-
-
-
-
-
GRT
sodiumGlucuRonaTe
++
-
-
-
+++
MLZ
D-MéLéZitose
+++
-
+
++
+
GNT
potassium GlucoNaTe
++
++
-
++
+++
LVT
acide LéVulinique
(LeVulinTe)
++
-
+
-
-
GLU
D-GLUcose
+++
++
+++
+++
+++
SBE
L-SorBosE
+++
-
++
-
+
GLN
GLucosamiNe
++
-
++
-
++
ESC
ESCuline
++
++
++
-
-
citrate de fer
Comme prévu toutes les espèces de levures ont consommé de façon très active le glucose et
le galactose comme sources de carbone. Ces sucres simples représentent les formes
préférentielles de transport à l’intérieur de la cellule (Botton, 1991).
La souche Hanseniaspora uvarum a le spectre de l’utilisation de sucre le plus restreint pour
sa croissance puis qu’elle n’utilise pas certains substrats tels que le saccharose, le maltose et
le tréhalose, contrairement à la souche Kodamaea ohmeri dont le spectre est assez large.
Notons la capacité de croissance des souches Clavispora lusitaniae et Trichosporon asahii sur
les sucres à cinq carbones (C5) comme l’arabinose et le xylose (Tableau 7).
Cette analyse qualitative a montré que le spectre des sources de carbone utilisées par ces
souches ressemble beaucoup à celui trouvé dans la littérature excepté pour la souche
86
d’Issatchenkia orientalis. Cette souche isolée à partir du lait de chamelle du Sahara algérien
est sans doute génétiquement différente de celle qui a été isolée à partir du sirop de la
canne à sucre par Gallardo et ses collaborateurs et qui était incapable de croitre sur du
saccharose (Gallardo et al., 2011) et de la souche DMKU-3ET15, isolée à partir des saucisses
de porc fermentés incapable aussi de se développer sur du galactose, du maltose, du
saccharose et du melizitose (Yuangsaard et al., 2013).
4.2- Cinétiques et productions en aérobiose
4.2.1- Croissance sur milieux solides
Le milieu de culture crée un environnement favorable (humidité, température, pH,
etc.) et apporte tous les éléments nécessaires aux synthèses cellulaires et aux besoins
énergétiques des levures favorisant ainsi leur croissance. Cette dernière permet de suivre la
série d’interactions entre les levures et leur environnement. Pour ceci et dans un premier
temps trois milieux de culture: un milieu riche et complet (YPD), un milieu minimum (YNB) et
un milieu minéral synthétique (MMS) ont été utilisés pour vérifier la croissance des cinq
souches de levures retenues. Les résultats obtenus ne montrent aucun changement pendant
les trois jours de suivi et sont représentés dans la figure 20.
Figure 20: Culture des cinq souches de levures sur les milieux YPD, YNB et MMS solides
incubées à 30°C
Cette première culture réalisée sur ces milieux à l’état solide a montré que ces levures
trouvent tous les éléments nécessaires à leur synthèse et leur besoin énergétique dans ces
milieux en affichant une bonne croissance. Ceci à l’exception de la souche Hanseniaspora
uvarum qui exige trois vitamines pour croitre sur MMS: la vitamine B 2 (riboflavine), la
vitamine B3 (niacine) et la vitamine B9 (l’acide folique) comme le montre la figure 21. Il
importe de noter que la composition du milieu YNB sur lequel elle a donné une croissance
positive et l’échantillon biologique à partir duquel elle a été isolée (les dattes) nous ont aidé
dans la détermination de son auxotrophie pour ces trois vitamines.
87
Figure 21: Culture de la souche Hanseniaspora uvarum sur MMS(A)
et MMS + vitamine B2, B3 et B9 (B)
A: Pas de croissance ; B: Croissance positive
En effet, la riboflavine (vitamine B2) et l’acide folique (vitamine B3) font partie des vitamines
qui représentent des facteurs de croissance pour certaines souches de levures. Par contre, la
niacine (Vitamine B9) qui est impliquée par l’intermédiaire des NAD + et NADP+ dans la
synthèse de l’ATP, est synthétisée par la plupart des levures (Henry, 1983).
4.2.2- Cinétiques et productions sur milieux liquides
Afin de compléter ce travail, une cinétique a été suivie sur YPD et MMS liquides. Les
mesures spectrophotométriques ont permis d’évaluer le dédoublement de la population
pendant la croissance des quatre souches (H. uvarum ne pousse pas sur MMS). Les résultats
(figure 22) ont montré que la croissance des deux souches C. lusitaniae et I. orientalis, est
aussi importante sur YPD que sur milieu minéral synthétique (MMS) en donnant une
biomasse très proche. On note au contraire pour les deux autres (K. ohmeri et T. asahii) que
la biomasse donnée est plus faible sur MMS, que dans un milieu riche comme YPD, où elles
puisent directement les constituants de base dont elles ont besoin. Sur un milieu minimum,
elles doivent en effet synthétiser tous leurs constituants à partir des quelques substances
minérales et molécules organiques essentielles incluses dans ce le milieu. Une grande partie
de la source de carbone et d’énergie, en l’occurrence le glucose, est alors investi dans ces
voies anaboliques au détriment de la formation de la biomasse qui ne peut atteindre les
niveaux observés en croissance dans un milieu riche.
88
40
MIN
40
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
0
2
3,5
5
6,5
8
9,5
11
12,5
14
15,5
17
18,5
20
24
25,5
DO 600
35
YPD
C. lusitaniae
40
0
3,5
6,5
9,5 12,5 15,5 18,5 24
40
I. orientalis
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
0
2
3,5
5
6,5
8
9,5
11
12,5
14
15,5
17
18,5
20
24
25,5
DO 600
35
K. ohmeri
Temps (h)
T. asahii
0
2
3,5
5
6,5 12,5 15,5 18,5 24 30
Temps (h)
Figure 22: Cinétique des quatre souches de levures sur les milieux YPD et MMS,
incubées à 30°C
Le dosage du glucose et des métabolites à savoir l’éthanol, le glycérol et les acétates dans les
milieux de cultures précédents a été déterminé par HPLC. Les résultats représentés par la
figure 23 montrent que les souches C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri et I. orientalis
produisent, sur YPD, de l’éthanol à des quantités variant entre 4 et 6 g/L. Cette production
est très proche de celle de la CEN.PK122-2N qui atteint les 8 g/L. Même constatation pour le
glycérol et les acétates dont la production est assez faible.
Des résultats similaires ont été obtenus sur MMS à l’exception de la souche H. uvarum qui
exige sur ce support un supplément des trois vitamines citées précédemment. Seule la
souche T. asahii ne présente aucune production intéressante et les concentrations de
l’éthanol et du glycérol données sont très faibles. En effet, les levures sous la forme
89
10
9
Eth/YPD
8
Eth/MIN
7
6
Gly/YPD
5
Gly/MIN
4
Acét/YPD 3
Acét/MIN 2
1
0
Eth, gly,Acét (g/L)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Eth, Gly, Acét (g/L)
1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Eth, Gly, Acét (g/L)
3
4
1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Kodamaea ohmeri
1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
2
2
3
4
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
2
3
Points de prélèvement
4
2
3
4
1
Trichosporpon asahii
1
2
3
4
CEN.PK122-2N
1
2
3
Points de prélèvement
4
Figure 23: Productions des cinq souches et de la souche de référence CEN.PK122-2N
après culture sur milieux YPD et MMS et incubation à 30°C
indépendante révèlent un métabolisme plus actif que sous la forme mycélienne. Ceci est
fonction du rapport des masses et des surfaces respectives car elles offrent une plus grande
aire de contact avec le milieu extérieur.
90
Sur la base de ces analyses, on peut conclure qu’à l’exception la souche T. asahii qui semble
différente car présente un métabolisme oxydatif pur, les autres souches présentent un
métabolisme oxydo-réductif avec assimilation de glucose aux rendements très proche de
celui de Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK122-2N).
4.3- Cinétiques et productions de la souche Issatchenkia orientalis
et CEN.PK122-2N sur YPD et MMS en anaérobiose
Après avoir confirmé l’oxydation en aérobiose du sucre utilisé (le glucose), des cultures
réalisées en absence d’oxygène sur milieu solide et liquide ont montré qu’à l’exception de
Trichosporon asahii qui a un métabolisme oxydatif comme signalé précédemment, les autres
souches sont capables de croitre en anaérobiose et de fermenter le glucose.
La souche Issatchenkia orientalis qui sort du lot par ses capacités de résistance a été
sélectionnée pour être comparée à la souche de référence CEN.PK122-2N. Leur croissance
en anaérobiose, la consommation du sucre et leurs productions (éthanol, glycérol et
acétates dosés en HPLC) ont été suivies sur les mêmes milieux et sous les mêmes conditions
de culture que précédemment.
Les résultats (figure 24A) montrent que tout en consommant du glucose la souche
CEN.PK122-2N produit 8 g/L d’éthanol sur YPD et environ 10 g/L d’éthanol sur MMS pendant
la croissance. Cette production se stabilise au cours de la phase stationnaire et ce métabolite
n’est pas consommé dans ces conditions d’anaérobiose. Le glycérol est produit à une
quantité double sur MMS que sur YPD.
En anaérobiose et sur YPD, la production en éthanol de la souche Issatchakia orientalis est
de 20% supérieur à celle de la souche de référence CEN.PK122-2N, une production qui
dépasse les 10 g/L (figure 24B). Il en est de même pour la production du glycérol qui est plus
importante avec des valeurs deux fois supérieures à la souche de référence.
La différence au niveau de la production de ces deux métabolites (éthanol et glycérol) par les
deux souches est très bien appréciée sur les figures 25 et 26.
91
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
16
14
12
10
8
6
4
2
0
9,5
23
26
16
14
12
10
8
6
4
2
0
YPD
6,5
9,5
23
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
6,5
A
26
16
14
12
10
8
6
4
2
0
B
9,5
23
26
16
14
12
10
8
6
4
2
0
MMS
6,5
Temps (h)
14
9,5
Glu, Eth, Gly, Acét (g/L)
10
16
MMS
23
26
Temps (h)
Figure 24: Cinétiques et productions de la souche CEN.PK122-2N (A) et de la souche
Issatchenkia orientalis (B) sur les milieux YPD et MMS après une incubation à 30°C en
anaérobiose
92
Glu, Eth, GLy, Acét (g/L)
10
14
DO 600
12
DO 600
12
6,5
DO 600
14
16
DO 600
YPD
14
Glycérol
Acétates
DO 600
Glucose
Ethanol
16
16
12
CN.PK-2/YPD
I orient/YPD
CN.PK-2/MIN
I orient/MIN
Ethanol (g/L)
10
8
6
4
2
0
6,5
9,5
23
26
Temps (h)
Figure 25: Production d'éthanol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS)
par les deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)
2,5
CN.PK-2/YPD
I orient/YPD
CN.PK-2/MIN
I orient/MIN
Glycérol (g/L)
2
1,5
1
0,5
0
6,5
9,5
23
26
Temps (h)
Figure 26: Production de glycérol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS)
par les deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)
(CN.PK-2: CEN.PK122-2N ; I orient: Issatchenkia orientalis ; MIN: MMS)
Fiechter et ses collaborateurs précisent que la croissance en anaérobiose n’est possible
qu’avec les levures sensibles au glucose à condition qu’il y ait un apport en ergostérol, en
acides gras insaturés et parfois certaines vitamines comme l’acide nicotinique car ces
molécules ne sont pas synthétisées dans ces conditions. Ils précisent aussi que dans les
cultures de Saccharomyces cerevisiae développées en anaérobiose, seulement 10% du
93
glucose est converti en biomasse et le restant est transformé en produits de fermentation
que sont l’éthanol, le glycérol, l’acétate et le succinate (Fiechter et al., 1981). C’est ce qui a
été remarqué sur la figure 24A où la quantité de biomasse est faible par rapport aux cultures
en aérobiose. Il semble que la souche I. orientalis s’investit elle aussi dans la production
d’éthanol et de glycérol (figure 24B) en anaérobiose.
4.4- Cinétiques et productions sur différents substrats glucidiques
Le sucre est le composé majoritaire dans le milieu après l’eau avec une teneur de 20 g/L.
Il influence les caractères physico-chimiques du milieu et agit sur sa viscosité. D’un milieu
riche en sucre en début de fermentation, on obtient une solution hydro-alcoolique
contenant très peu ou pas de sucre en fin de fermentation.
L’alcool est le composé majoritaire produit lors de la fermentation alcoolique, suivi du
glycérol et des acides produits en faibles quantités mais responsables des variations du pH.
Dans ce sens et afin de comparer et de compléter les résultats obtenus par la galerie ID 32C,
des cultures sont réalisées avec cinq substrats glucidiques: le glucose, le fructose, le
saccharose et le lactose, utilisés avec le milieu YP et le xylose avec le milieu YNB. Ces sucres,
en particulier le glucose, le saccharose et le lactose représentent les sucres majoritaires des
sous-produits comme le lactosérum et les mélasses utilisés dans la production du
bioéthanol. Le résultat de leurs cinétiques est résumé dans le tableau 8. Les dosages de leurs
productions ont montré une production très faible en acétates, les autres productions à
savoir l’éthanol et le glycérol sont représentées dans le tableau 9.
Tableau 8: Croissance des cinq souches sur quatre substrats glucidiques avec leur taux de
croissance (µ [h-1])
(Milieu: YP et température d’incubation: 30°C)
(+ : Croissance positive, - : Pas de croissance).
Souches
.
Kodamaea ohmeri
Trichosporon asahii
Glucose
+
(0,88)
+
(0,75)
+
(0,91)
+
(0,97)
+
(0,31)
94
Fructose
Saccharose
Lactose
+
(0,89)
+
(0,67)
+
(0,89)
+
(0,95)
+
(0,30)
+
(0,75)
-
Faible
+
(0,92)
Faible
-
Faible
Faible
-
-
Tableau 9: Productions des cinq souches sur quatre substrats glucidiques
(Milieu: YP et température d’incubation: 30°C)
(G: Glucose, F:Fructose, S: Saccharose, F: Fructose)
(-: Pas de production)
Souches
G
Kodamaea ohmeri
Trichosporon asahii
Ethanol (g/L)
F
S
Glycérol (g/L)
F
S
L
G
5,95
5,86
5,95
-
0,46
0,39
-
L
-
5,30
4 ,47
5,24
4,42
4,62
-
0,54
1,1
0,85
1,37
1,05
-
8,96
8,40
-
-
1,24
1,5
-
-
0,56
-
-
-
0,53
-
-
-
En consommant les trois sucres (glucose, fructose et saccharose), C. lusitaniae, qui ne pousse
pas sur le lactose, produit de l’éthanol à des concentrations sensiblement égales autour de 5
g/L. Cependant, une croissance insignifiante avec le saccharose et le lactose est observée
chez la souche Hanseniaspora uvarum. En revanche, avec les autres sucres elle donne une
production en éthanol comparable à celle de C. lusitaniae.
Le lactose ne semble pas favorable à la croissance de Kodamaea ohmeri. Par contre cette
dernière est très bien stimulée par les autres sucres, en particulier le saccharose. Les taux de
croissance obtenus avec ces sucres sont très proches et la production d’éthanol est
sensiblement égale. Même constatation pour le glycérol. Le dosage des différents sucres a
montré que chez cette souche, le saccharose qui est un diholoside est hydrolysé, comme le
précise la littérature, en glucose et fructose à l’extérieur de la membrane plasmique par des
glycosidases périplasmiques, contrairement à Saccharomyces cerevisiae où ce sucre est
transporté intact à travers le plasmalemme par un mécanisme de transport actif de type
symport-H+ (Santos et al., 1982).
La croissance de la souche Issatchenkia orientalis est beaucoup plus faible avec le lactose
qu’avec les autres sucres. La meilleure croissance est obtenue avec le glucose et le fructose
après une phase de latence d’un peu plus de trois heures et un taux de croissance plus élevé
que celui obtenu avec les autres sucres (tableau 8). Des études ont confirmé la fermentation
de ces deux sucres chez cette espèce (Barnett et al., 2000 et Gallardo et al., 2010). Cette
souche produit environ 8 g/L avec le glucose et le fructose, et ce dernier n’est pas assimilé,
95
un résultat très intéressant. De même le glycérol est produit seulement avec le glucose et le
fructose et à des taux semblables (tableau 9). L’assimilation de ces métabolites a été
démontrée chez d’autres souches d’I. orientalis par Gallardo et ses collaborateurs (2010).
Cette propriété explique son utilisation dans la production des boissons alcoolisées (Basilio
et al., 2008 et Gallardo et al., 2010).
Même si la croissance n’est pas très importante et la phase de latence est un peu plus
longue, Trichosporon asahii poussent pratiquement sur tous les sucres (tableau 8). Mais au
niveau production cette souche n’est pas intéressante (tableau 9).
Sur la base de ces analyses de croissance et à l'exception de T. asahii, les autres souches de
levures en croissance exponentielle sur glucose, saccharose et fructose montrent des
vitesses de croissance très élevées. Ces souches et en particulier K. ohmeri peuvent être
utilisées dans la valorisation des mélasses de canne à sucres et de betteraves qui
contiennent principalement du glucose et du saccharose.
Les analyses obtenues avec ces quatre sucres reflètent les résultats de la galerie ID 32C et
confirment que le glucose est le sucre utilisé par l’ensemble des levures. Ceci en plus
d’autres monosaccharides dont certains entrent directement en chaînes de réaction de la
fermentation comme le fructose. Ces sucres simples sont en effet les formes préférentielles
de transport à l’intérieur de la cellule.
Le dosage de l’éthanol, du glycérol et des acétates qui résultent de la consommation de ces
sucres montre que:

l’acide acétique est produit à des quantités très faibles (données non représentés), ce
qui est mentionné dans la littérature. Cette production peut être augmentée dans un
milieu alcalin à cause de l’enzyme responsable (l’acétaldéhyde déhyrogénase) qui
fonctionne très bien en condition basique. Cet acide toxique pour les levures, ainsi
que les autres acétates traversent le plasmalemme des levures par diffusion passive.
Cette diffusion, lente à pH neutre, est favorisé par un pH acide et entraine une
acidification à l’origine d’une protéolyse généralisée conduisant à la mort cellulaire.

Le glycérol produit est formé par la réduction de la dihydroxyacétone phosphate
grâce à la glycérol-3-phosphate déshydrogénase à NAD qui donne le glycérol-3phosphate qui est hydrolysé en glycérol par une phosphatase spécifique (Holzer et
al., 1963). Il peut être obtenu par une autre voie grâce à la glycérol déshydrogénase à
NADP qui catalyse la transformation du glycéraldéhyde en glycérol après action d’une
phosphatase sur le glycéraldéhyde 3-phosphate. Cette fermentation est souvent en
équilibre avec la voie de synthèse de l’éthanol et les conditions défavorisant cette
production sont également celles qui stimulent la formation du glycérol.
96

L’éthanol représente le métabolite majeur produit par toutes les souches excepté T.
asahii principalement avec le glucose et le fructose. Les réactions qui conduisent à
l’éthanol sont les suivantes :
 L’acide pyruvique est, dans une première étape décarboxylé en CO 2 et
acétaldéhyde, grâce à la pyruvate décarboxylase qui a pour coenzyme la
thiamine pyrophosphate ;
 Dans une deuxième étape l’acétaldéhyde est réduit en éthanol par l’alcool
déshydrogénase, ce qui permet la réoxydation du NADH.
Le système de transport d’électrons ne fonctionne pas et il n’y a aucune synthèse d’ATP
correspondante. Ce métabolisme fermentaire du glucose est localisé dans le cytoplasme et
les cellules en fermentation ont peu de mitochondries qui sont caractérisées par l’absence
de crêtes bien développées. L’énergie est obtenue seulement à partir de la glycolyse (2 ATP
par molécule de glucose consommée) et le cycle de Krebs est fortement réduit bien qu’il
serve encore à produire des intermédiaires pour les biosynthèses.
4.4.1- Cultures et productions des cinq souches sur xylose
La production de l’éthanol à partir de la biomasse renouvelable tels que les matières
lignocellulosiques et les résidus agricoles, appelé biocarburant ou agrocarburant peut
résoudre, du moins partiellement, les problèmes annoncés de la disparition des énergies
fossiles et réduire les émissions de gaz à effet de serre (Bothast et Saha, 1997 et Zaldivar et
al., 2001). Ceci représente l’objectif de plusieurs travaux afin que ce type de production
devient une alternative prometteuse au pétrole (Klinke et al., 2004 ; Liu, 2006). Pour essayer
de répondre à cette problématique nous avons choisi d’étudier la croissance de nos souches
sur xylose.
Les cultures réalisées sur un milieu minimum (YNB) avec xylose comme seule source de
carbone (YNX) affichent une croissance seulement de deux souches: Clavispora lusitaniae et
Issatchenkia orientalis (figure 27).
La croissance en erlenmeyer sur xylose confirme l’incapacité des autres souches (H. uvarum,
K. ohmeri et T. asahii) à pousser avec ce substrat glucidique. Les seules souches qui utilisent
ce dernier donnent une croissance très faible en particulier I. orientalis et ceci après une
longue phase de latence (figure 28). Les dosages réalisés par HPLC ne décèlent aucune
production en éthanol (figure 29). Ce résultat explique que ces deux souches ne fermentent
pas le xylose et que ce dernier est converti en xylitol, qui en s’accumulant est connu pour
devenir toxique à la cellule (Hahn-Hägerdal et al., 2007).
97
C.l
I.o
Figure 27: Culture des cinq souches sur milieu YNX (2%) solide et liquide
I.o : Issatchenkia orientalis
C.lusitaniae
C.l : Clavispora lusitaniae
I.orientalis
40
DO 600
35
30
25
20
15
10
5
0
0
3 4,5 7,5 24 28 33 48 54 58 67 73
Temps (heures)
Figure 28: Cinétique de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX incubées à 30°C
98
Acétates (g/L)
Ethanol (g/L)
40
25
30
25
15
20
10
15
10
5
5
20
30
DO 600
20
Xyl, Eth, Gly, Acét
35
35
Do 600
40
25
25
15
20
10
15
10
5
5
0
0
28
48
54
67
0
73
0
28
Temps (heures)
Xyl, Eth, Gly, Acét
Glycérol (g/L)
DO 600
Xylose (g/L)
48
54
67
73
Temps (heures)
Figure 29: Productions de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX
Xyl: Xylose ; Eth: Ethanol ; Gly: Glycérol ; Acét: Acétates.
Les études réalisés sur la conversion de ce sucre soulignent deux enzymes métaboliques clés
que les levures utilisent dans la dégradation du xylose: la xylose réductase (XR) et la xylitol
déshydrogénase (XDH). Chez la levure, la phosphorylation des pentoses s’effectue
généralement après la transformation des aldopentoses en cétopentoses (pentuloses), ainsi,
le D-xylose est isoméré en D-xylulose. Ces cétopentoses sont utilisés par un grand nombre
de levures mais seulement un petit nombre possédant les isomérases spécifiques utilisent
les aldopentoses. La XR convertit le xylose en xylitol et la XDH catalyse l'oxydation du xylitol
pour la production du xylulose. Ce dernier est phosphorylé par une xylulokinase (XK) en
xylulose 5-phosphate puis métabolisé en éthanol en suivant la voie de la glycolyse et la voie
des pentoses phosphate (Lee et al., 2012). Ces résultats nous laissent supposer que C.
lusitaniae possède au moins la XR (xylose réductase).
5- Profil aromatique des cinq souches de levures
retenues
5.1- Le profil d’accumulation des alcools supérieurs et leurs acétates
Dans les fermentations alcooliques, en dehors de l’éthanol, les levures produisent des
alcools (Mallouchos et al., 2002). Ces derniers ainsi que leurs esters présentent des
99
propriétés organoleptiques intéressantes, très utiles et appréciées par le consommateur.
Certains de ces agents aromatisants continuent à être produits par des procédés chimiques.
C’est le cas du 2-phényléthanol, alcool utilisé pour son arôme de rose, qui est encore
synthétisé par voie pétrochimique à partir du toluène, du benzène, du styrène (Nomura et
al., 2001) produits cancérigènes et/ou dangereux pour la santé et l’environnement (Clarck,
1995 ; Etschmann et al., 2002) ou qui est extrait à partir des pétales de rose par un processus
très coûteux (Fabre et al., 1998).
Alors que la demande des consommateurs pour ces additifs alimentaires naturels est en
hausse (Lugay, 1986 et Anonyme, 1999), l’option de l’obtention de ces produits par voie
microbienne paraît donc la plus appropriée. En effet, de nombreux travaux ont été réalisés
dans ce sens et le profil aromatique de différentes souches de levure a été étudié. C’est le
cas de quatre de nos espèces sélectionnées connues pour participer à la maturation des
fromages en améliorant et en rehaussant leurs saveurs et leurs odeurs. K. ohmeri et I.
orientalis ont été isolées respectivement à partir des produits laitiers traditionnels brésiliens
(Borelli et al., 2006) et égyptiens (El-Sharoud et al., 2009). C. lusitaniae (Wyder et Puham,
1999) et H. uvarum (Pando-Bedrinana et al., 2011) ont été isolées à partir d’autres types de
fromage comme le camembert (Chen et al., 2011). Ces souches jouent également un rôle
capital dans les boissons alcoolisées en assurant un meilleur équilibre entre les alcools
supérieurs et leurs esters (Mingorance-Cazola et al., 2003 ; Clemente-Jimenez et al., 2004 et
Baffi et al., 2011) et peuvent de ce fait avoir une valeur applicative importante dans
l’optimisation de ces derniers (Kim et al., 2008 ; Hernandez-Orte et al., 2008 et Wang et al.,
2011).
Un des objectifs de nos recherches a été d’étudier la production des arômes par ces cinq
souches. Les souches sélectionnées et la souche de référence Saccharomyces cerevisiae
CEN.PK122-2N ont été cultivées sur glucose. L’azote est apporté par le sulfate d’ammonium
dans les milieux YPD et MMS (milieu minéral synthétique), alors que le milieu MMS-AA
(milieu minéral synthétique enrichi) a été supplémenté par trois acides aminés (la leucine,
l’isoleucine et la phénylalanine). La présence de ces acides aminés provoque un besoin
anabolique chez ces souches qui les transforment en alcools par la voie d’Erlich. La nature
des sources carbonées et azotées joue donc un rôle prépondérant dans la production
d’arômes tant sur le plan qualitatif que quantitatif (Yong et al., 1985 ; Yong et Lim, 1986 ;
Berger et al., 1987 et Gross et al., 1989). L’analyse chromatographique des bouillons de
fermentation de ces levures a permis d’identifier: un alcool amylique (2MB: 2méthylbutanol), un alcool isoamylique (3MB: 3-méthylbutanol) et le 2-phényléthanol (2PE).
Les profils d’accumulation de ces trois alcools supérieurs sont illustrés dans la figure 30.
100
1000
900
2MB
800
2MB (mg/L)
700
600
500
400
300
200
100
3MB (mg/L)
0
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
1000
900
YPD
MMS
MMS-AA
YPD
MMS
MMS-AA
YPD
MMS
Milieux
MMS-AA
3MB
2PE
2PE (mg/L)
800
700
600
500
400
300
200
100
0
C. lusitaniae
H. uvarum
K. ohmeri
I. orientalis
T. asahii
CEN.PK122-2N
Figure 30: Profil d’accumulation des alcools supérieurs (2MB, 3MB et 2PE)
101
par les six souches de levures étudiées sur trois
milieux différents (YPD, MMS et MMS-AA)
Nous observons que la souche T. asahii ne produit aucun de ses alcools. Elle a été plutôt
utilisée pour la production de la coumarine en assimilant des phénylalcanes avec des chaînes
d’alkyle de 7 à 12 atomes de carbones (AWE et al., 2009). Ce produit a une odeur douce,
poudrée et amandée qui évoque le foin et le tabac, est très utilisé en note de fond dans de
nombreux parfums orientaux et est un excellent fixateur. En revanche les résultats obtenus
avec les autres espèces montrent des productions variables.
La production de ces composés aromatiques est plus importante sur YPD, milieu complexe
riche en acides aminés qui proviennent de la peptone. En revanche elle est très faible sur le
MMS, ce qui était attendu car c’est un milieu minimum qui ne possède que le sulfate
d’ammonium comme seule source d’azote. Lorsqu’on ajoute au milieu MMS les acides
aminés, précurseurs de ces alcools supérieurs, la production est augmentée. Ce qui indique
que la production de ces alcools supérieurs dans un milieu riche est le résultat de la
bioconversion de l’excès des chaînes ramifiées et des acides aminés présents dans le milieu
de culture par la voie catabolique Ehrlich (Hazelwood et al., 2008).
Sur YPD, c’est Issatchenkia orientalis qui semble trouver dans ce milieu les acides aminés
nécessaires à la synthèse de ces alcools en particulier le 3MB et le 2PE dont la production
dépasse légèrement les 150 mg/L, suivie de la souche de référence (CEN.PK122-2N) et de
Kodamaea ohmeri (exception faite pour le 2PE). Pour les souches Clavispora lusitaniae et
Hanseniaspora uvarum, la production la plus importante qui a été noté sur ce milieu est celle
du 3MB qui est autour de 100 mg/L.
Les acides aminés (leucine, isoleucine et phényalanine) semblent bien stimuler la production
de ces alcools pour les autres souches, mais à des concentrations différentes:



Le 2MB: C. lusitaniae et la souche de référence donnent les meilleures productions
entre 250 et 300 mg/L suivies de K. ohmeri et d’I. orientalis dont la production est
inférieure à 100 mg/L.
Pour le 3MB, la différence n’est pas très significative entre les quatre souches et leurs
productions varient entre 300 mg/L et 400 mg/L.
Par contre, une différence considérable est affiché au niveau du profil du 2PE où I.
orientalis a été remarquablement singulier avec une concentration très proche des
1000 mg/L représentant pratiquement le double de la concentration donné par S.
cerevisiae en mg/L. Notre souche C. lusitaniae dont la production dépasse
légèrement les 700 mg/L, possède des performances de bioconversion deux fois
supérieurs à celle étudiée par Etschmann et Schrader en 2006 (C. lusitaniae DS MZ
70487) dont la production était de 330 mg/L.
102
Il est important de souligner que l’addition de phénylalanine stimule fortement la
production du 2PE (Fabre et al., 1998 et Starck et al., 2002). Ceci a été démontré chez
S. cerevisiae (Albertazzi et al., 1994), chez Kluyveromyces marxianus (Fabre et al.,
1997), ainsi que chez K. thermotolerantis (Etschmann et al., 2002). Notre étude le
confirme chez I. orientalis et C. lusitaniae. Ce résultat suggère que la bioconversion
de la phénylalanine en 2-phényléthanol par la voie Ehrlich est plus efficace chez I.
orientalis que chez Saccharomyces cerevisiae. Il serait donc intéressant de comparer
les capacités enzymatiques de la voie Ehrlich entre ces deux souches de levure et en
particulier celles de la transaminase et la décarboxylase qui jouent un rôle clef dans
cette voie (Hazelwood et al., 2008).
Parmi les espèces testées, C. lusitaniae peut être sélectionnée pour la production du 2méthylbutanol, K. ohmeri pour la production du 3-méthylbutanol et I. orientalis pour la
production du 2-phényléthanol.
Les esters correspondant à ces alcools supérieurs (2MBA, 3MBA et 2PEA) sont au dessous du
seuil de détection pour la majorité des souches testées (donnés non représentés). Seules H.
uvarum et I. orientalis qui donnent une petite production :


H. uvarum produit du 2MBA (2-méthylbutylacétate) à une quantité très faible (13,14
mg/L) avec des notes sensorielles très prononcées sur le milieu YPD. Ces notes ont
été décelées dans le vin ainsi que dans d’autres boissons alcoolisées comme celle
obtenue à partir du jus d’orange (Mingorance-Cazola et al., 2003). Plusieurs travaux
ont déjà souligné l’efficacité des souches apiculées dans la production des esters sans
aucune influence négative sur la production d’alcools supérieurs (Liu et al., 2012).
Et I. orientalis qui produit du 3MBA (3-méthylbutylacétate), sur MMS-AA, à une
concentration de 225,5 mg/L et le 2PEA (2-phényléthylacétate) à 12,5 mg/L. Ce
composé aromatique (2PEA) essentiel pour les industries alimentaire et cosmétique a
déjà fait l’objet de nombreuses études.
5.2- Tolérance au 2-phényléthanol
Parmi les produits aromatiques cités ci-dessus notre intérêt s’est porté plus
particulièrement sur le 2-phényléthanol dont la production était très importante chez la
souche d’ I. orientalis. Ce produit s’avère toxique pour les levures et entraîne l’arrêt de leur
croissance, ce qui réduit leur tolérance ainsi que leur production finale (Starck et al., 2002 et
Starck et al., 2003). Ces constations, nous ont orientés vers l’étude de cette inhibition avec
nos souches afin de voir si elles sont moins affectées par la présence du 2-phényléthanol.
Des essais (au nombre de trois) ont été réalisés en faisant varier la concentration en
phényléthanol exogène de 1 à 5 g/L (figure 31).
103
CN Ta
Io Ko Hu
Cl
CN Ta
Io
Ko Hu Cl
10-1
10-2
1g/L
10-3
10-4
10-1
10-2
2g/L
10-3
10-4
10-1
10-2
2,5g/L
10-3
10-4
10-1
10-2
3g/L
10-3
10-4
10-1
5g/L
10-2
10-3
10-4
30°C
40°C
Figure 31: Croissance des souches à différentes concentrations du 2-phényléthanol
sur YPD solide incubées à 30°C et à 40°C
(CN : CEN.PK122-2N ; Ta : Trichosporon asahii ; Io : Issatchenkia orientalis; Ko : Kodamaea ohmeri ;
Hu : Hanseniaspora uvarum ; Cl : Clavispora lusitaniae).
104
Sur un milieu riche (YPD), on note une sensibilité de toutes les espèces à partir de 2 g/L de
phényléthanol, y compris la souche de référence S. cerevisiae dont la résistance ne dépasse
pas les 2,5 g/L de phényléthanol. En revanche I. orientalis montre une résistance qui atteint
les 5 g/L à une température d’incubation de 30°C et de 2,5 à 3g/L à 40°C. Sur milieu
minimum (YNB) la résistance est moins marquée même pour la souche I. orientalis qui ne
dépasse guerre 2 g/L (résultats non représentés). Ces résultats confirment l’action délétère
du phényléthanol exogène sur ces souches et traduisent une inhibition de leur croissance au
fur et à mesure que la concentration augmente dans le milieu. De plus l’effet synergique du
phényléthanol et de la température est évident sur l’ensemble des souches.
Le niveau de production très élevé du 2-phényléthanol par I. orientalis est corroboré avec la
plus grande résistance de cette espèce à ce produit. Elle se révèle donc doublement
résistante par rapport aux autres levures étudiées jusqu’à présent, en particulier S.
cerevisiae qui résiste à 2,5 g/L. I. orientalis est donc une candidate importante pour la
production du 2-phényléthanol. Il serait intéressant de poursuivre cette étude dans des
conditions contrôlées pour analyser la bioconversion réalisée par cette souche.
6- Intérêt et dynamique physiologique de la
souche Issatchenkia orientalis
La production du bioéthanol par voie biologique a été couronnée de succès car considérée
comme une stratégie visant à réduire le coût de l’énergie (Maiorella et al., 1984). En plus,
elle peut se faire à partir de biomasse qui n’est pas en concurrence avec la production
alimentaire comme les résidus agricoles, les déchets alimentaires et industriels. Par
conséquent, l’utilisation des levures tolérantes à plusieurs types de stress qui constituent
des inhibiteurs de la fermentation est souhaitable. De nombreuses études ont été réalisées
dans ce sens et différentes levures ont été soumises à ces stress tels que les changements de
températures, de pH et des concentrations élevées en éthanol (Keatig et al., 2006 ; Gibson et
al., 2007 et Liu et al., 2009). Parmi ces dernières ont peut citer celle de Caker et ses
collaborateurs qui ont rapporté le génie évolutif de S. cerevisiae qui présentait une
résistance accrue au stress thermique, au stress éthanol et aux contraintes oxydatives (Caker
et al., 2005). Récemment, Benjaphokee et ses collaborateurs ont développé une souche de
S. cerevisiae présentant une grande productivité en éthanol (plus de 90%) sous différentes
contraintes (41°C et un pH de 3,5) (Benjaphokee et al., 2011). Mais les résultats apportés
jusque là présentent des inconvénients car ses souches sont manipulées génétiquement et
que le rendement à l’échelle industrielle est onéreux.
De même pour le phényléthanol qui est utilisé dans différents domaines et occupe la
deuxième place après l’éthanol sur le plan commercial, dont la sensibilité pose un problème
105
sérieux qui a incité les chercheurs et les industriels à adopter des méthodes très couteuses
comme l’extraction de cet arôme.
Des souches naturellement résistantes sont préférables car elles présentent certains
avantages par rapport au coût et à leur manipulation.
Les résultats de notre travail montrent que la souche Issatchenkia orientalis, connu
également sous le nom de Pichia kudriavezii ou Saccharomyces krusei ou Candida krusei
présente des caractéristiques intéressantes, dont une meilleure capacité de production et
une résistance à l’éthanol et au phényléthanol.
De plus en évaluant la tolérance de nos souches aux diverses conditions stressantes la
souche Issatchenkia orientalis, isolée à partir du lait de chamelle, est sortie du lot grâce à ses
propriétés multi-résistantes en affichant clairement une grande résistance à tous les stress
étudiés :

Cette souche est restée viable en raison de sa tolérance à des températures allant
jusqu’à 42°C, des conditions thermiques qui sont mortelles pour certaines souches de
Saccharomyces cerevisiae. Ce résultat est très prometteur car les levures capables de
croître et de produire de l’éthanol à grande température peuvent étendre le
processus de fermentation au-delà des limites tolérées par S. cerevisiae (35°C) (Isono
et al., 2012). En plus la sélection et l’adaptation des levures à hautes températures
est très importante dans la production à grande échelle en particulier dans les
régions tropicales où le refroidissement du système est très couteux. Certaines
souches thermo-tolérantes étaient capables de produire de l’éthanol à des
températures variant entre 30°C et 40°C comme Kluyvermyces marxianus (Singh et
al., 2006), mais aucune autre espèce n’a donné jusqu’à présent des productivités
importantes en éthanol à une température variant entre 41 et 43°C comme
Issatchenkia orientalis (Isono et al., 2012). Cette espèce peut représenter donc un
organisme de choix car la résistance à la température est un paramètre crucial pour
les procédés de bioconversion.

Elle est également tolérante aux pH acides, une tolérance allant jusqu’à 2,5 et peut
être plus. A ce pH, une souche industrielle de S. cerevisiae est capable de produire de
l’éthanol (De Molo et al., 2010) mais I. orientalis est plus résistante à l’acide lactique
(Thalagala et al., 2009) et l’acide acétique (Sarkar et al., 2012) que S. cerevisiae. Cette
tolérance aux conditions acides est très importante car elle permet de minimiser les
risques de contamination bactérienne et de réduire le coût de la stérilisation.

Cette souche affiche également une résistance aux stress osmotique et salin qui sont
d’une importance considérable à l’échelle industrielle car ils permettent de réduire le
coût du dessalement et de diminuer les risques de contamination (Isono et al.,
2012).
106
Une étude détaillée sera intéressante pour caractériser mieux les résistances de cette
souche. Pour atteindre cet objectif, cette partie de la thèse explore donc le comportement
de cette souche au cours du processus de fermentation en suivant les données macrocinétiques tels que les concentrations en substrats (glucose) et en produits (éthanol, glycérol
et acide acétique). Ce travail a été précédé par une caractérisation et une quantification de
la résistance de la souche Issatchenkia orientalis placée sous contraintes environnementales
en utilisant des concentrations croissantes en éthanol sur milieu liquide en focalisant la
viabilité cellulaire.
6.1- Analyse de la viabilité cellulaire
L’effet néfaste de l’augmentation de la concentration initiale en éthanol sur les
paramètres globaux de croissance ne fait aucun doute et la perte de viabilité des cellules
pendant la fermentation pose un problème sérieux pour la production de l’éthanol. Dans ce
sens et afin de compléter notre étude une analyse de la viabilité cellulaire a été réalisé sur
des cultures avec de l’éthanol exogène avec les mêmes milieux (YPD et YNB) à l’état liquide
et une incubation à 30°C. La série de culture a été réalisée en utilisant différentes
concentrations en éthanol qui ont été choisies en fonction des résultats obtenus sur milieu
solide. Ainsi l’évolution de la croissance mesurée par spectrophotmétrie et de la viabilité
cellulaire mesurée par comptage microscopique après coloration au bleu de méthylène ont
été suivies en fonction du temps. Cette étude analyse la dynamique de réponse du
paramètre « viabilité» face aux changements d’environnement « éthanol » qui peut être
caractérisée par l’évolution temporelle de la viabilité en fonction de l’état physiologique
initial et de la concentration en éthanol produit.
Les résultats de croissance où chaque courbe correspond à une culture contenant une
concentration différente en éthanol initialement ajoutée ainsi que ceux de la viabilité
cellulaire sont rassemblés dans la figure 32.
107
8%
12%
20%
Pourcentage des cellules viables
5%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
3,5
5
6,5
8
9,5
11
12,5
25
28
30
32
34
DO 600
0%
0
10
20
30
0
10
20
30
YPD
5%
8%
12%
16%
Pourcentage des cellules viables
DO 600
0%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps (h)
Temps (h)
YNB
Figure 32: Evolution de la croissance de la souche I. orientalis et de la proportion des
cellules viables au cours de cultures avec différentes concentrations en
éthanol exogène sur deux milieux YPD et YNB à 30°C
Les résultats montrent qu’une baisse de croissance de la souche I. orientalis est noté à partir
de 5% d’éthanol (V/V) par rapport à la culture témoin (0% d’éthanol (V/V)) et ceci sur les
deux milieux (YPD et YNB) où on a obtenu les même résultats au niveau de la croissance et
du pourcentage des cellules viables qui est de 80%.
108
Pour une concentration initiale en éthanol de 8% d’éthanol (V/V), on remarque une
croissance faible, une phase de latence longue et une diminution au niveau des cellules
viables en particulier sur YNB puisque la viabilité cellulaire a été réduite de 35% sur YPD et
de 40% sur YNB. La souche a donc besoin d’une période d’adaptation beaucoup plus longue
lorsque la concentration initiale en éthanol dans le milieu est élevée.
Une inhibition totale de la croissance est observée pour une concentration initiale en
éthanol supérieure à 12% et la viabilité cellulaire diminue de façon significative pour se
situer aux alentours de 50% sur YPD et de 70% sur YNB au bout de 20h. Cette valeur seuil
s’est avérée être différente de la valeur obtenu sur milieu solide et ceci peut s’expliquer par
la concentration cellulaire de l’inoculum utilisé. Mais cette souche reste la plus intéressante
en terme de résistance.
Il importe de noter que le test de la reprise des capacités de croissance réalisée comme
indiqué dans la partie matériel et méthodes a montré que cette dernière était positive et on
a noté en 14 h seulement une reprise de 37,32% de cellules viables sur milieu liquide et une
croissance qui était d’autant plus rapide que la concentration initiale en éthanol dans le
milieu est faible.
6.2- Aspect macrocinétique de la fermentation alcoolique type batch
En plus de l’étude de l’effet « choc-éthanol », une autre approche de compréhension a
été réalisée afin d’analyser l’effet de l’éthanol produit par la souche au cours de la
fermentation en condition contrôlée et d’évaluer la performance de cette souche pour la
production de cet alcool.
La fermentation présentée dans cette thèse a été réalisée en mode batch sur milieu
minimum YNB en utilisant le glucose comme substrat carboné et le sulfate d’ammonium
comme source d’azote. Plusieurs paramètres sont contrôlés et régulés: le pH à 3, la
température à 30°C et l’agitation et l’aération afin de maintenir une pression partielle en
oxygène au-dessus de 20% (cf. Matériel et Méthodes).
Pour répondre à notre objectif, l’impact de l’éthanol est suivi au cours de cette fermentation
ainsi que l’évolution des différents paramètres tels que le substrat, la biomasse, l’éthanol et
autres co-métabolites (glycérol, acide acétique) en fonction du temps.
Les résultats présentés dans la figure 33 nous permet de souligner quelques différences par
rapport aux autres souches de levures y compris la souche de référence Saccharomyces
cerevisiae.
109
Acétate
DO600
Glucose
DO600
15,00
20,00
15,00
10,00
10,00
5,00
5,00
0,00
0,00
Ethanol
Glu - EtOH - Gly - Ace (g/L)
Glycérol
- 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Temps (h)
Figure 33: Evolution cinétique de la biomasse, du glucose, de l’éthanol et coproduits au cours d’une culture en mode batch de la souche Issatchenkia
orientalis sur YNB.
Tout d’abord, le taux maximum de croissance (0,389 h-1) est obtenu dans les premières
heures et la croissance cellulaire est couplée à la production d’éthanol et du glycérol
pendant toute la fermentation. Ceci est observé chez les autres levures, principalement
Saccharomyces cerevisiae, uniquement pendant la première phase de la fermentation
(Barford, 1981 ; Van Dijken et Pronk, 1995 et Pham et al., 1998). La production de cette
fermentation est de 8,61 g/L d’éthanol, 1,50 g/L de glycérol et 0,42 g/l d’acide acétique.
On note que la production d’acide acétique est très faible et que la quantité du glycérol
produit augmente avec celle de l’éthanol. Ce comportement peut être lié, selon plusieurs
auteurs, au rôle attribué au glycérol dans la protection de la cellule «en conditions
stressantes » (Omori et al., 1996 et Nevoigt et Stahl, 1997), elle est également associée à la
production de biomasse pour l’équilibre redox.
La productivité en éthanol, qui reflète la performance d’une fermentation, reste stable le
reste du temps de la fermentation. Aucune chute de croissance n’a été notée ce qui reflète
la capacité d’adaptation de cette levure et explique sa résistance à ce stress. L’originalité de
ces résultats réside dans :


l’absence de toute concentration critique en éthanol,
et la non consommation de l’éthanol produit, contrairement à la plupart des autres
levures ainsi qu’à certaines souches d’I. orientalis comme la DY252 étudiée par Shin
110
et ses collaborateurs (2002) où on marque une transition diauxique à 1h de la
consommation du glucose.
Elle maintient de plus ses capacités de croissance et de productions ce qui est très important
et même indispensable pour l’intensification des productions microbiennes. Ajoutons à cela
son grand niveau de tolérance, une condition importante qui permet d’augmenter le
rendement en éthanol.
Au vu de l’ensemble de ces résultats, cette souche se révèle intéressante et mérite une
attention particulière pour déterminer le mécanisme de cette résistance. D’autres
fermentations doivent être envisagées afin de pouvoir améliorer le niveau de production de
cette souche en jouant sur les paramètres de culture.
111
CONCLUSION GENERALE
ET PERSPECTIVES
Conclusion Générale et Perspectives
L’étude et la maîtrise de la tolérance à certains stress sont très importantes. Ces contraintes
peuvent entraîner une baisse de la croissance des levures en affectant leur production. Cette
étude traite un sujet important dans les technologies microbiennes. En complément à de
nombreux travaux qui ont étudié l’effet des différents stress sur la physiologie des levures,
ce travail permettra de prolonger ces connaissances sur d’autres levures provenant de divers
biotopes non explorés et très peu étudiées. Il s’agit des souches sauvages issues d’un
écosystème naturel particulier. Ainsi les traits originaux de ces levures peuvent être
exploités.
L’étude des caractéristiques culturales et morphologiques ont permis de mettre au point les
différences phénotypiques entre les cinq souches isolées (Clavispora lusitaniae,
Hanseniaspora uvarum, Kodamaea ohmeri, Issatchenkia oreintalis et Trichosporon asahii).
L’étude physiologique de ces souches qui a porté principalement sur l’assimilation des
différents substrats carbonés et la croissance sur différents milieux de culture, en aérobiose
et en anaérobiose a déterminé le type trophique et le métabolisme glucidique de chacune
de ces souches. Les résultats obtenus montrent qu’en anaérobiose, la souche I. orientalis
s’investit dans la production de l’éthanol qui dépasse légèrement celle de la souche de
référence et dont la production du glycérol est deux fois plus élevée que celle obtenue par la
CEN.PK122-2N. Ces analyses ont été complétées par le dosage en HPLC de la consommation
des différents substrats et de certains métabolites tels que l’éthanol, le glycérol et les
acétates. Ces dosages révèlent une production importante autour de 8 g/L d’éthanol
produite par la souche I. orientalis avec le glucose et le fructose comme substrats
glucidiques.
En complément, la tolérance à certains stress tels que la température, le pH, la salinité, le
stress osmotique et le stress éthanol a permis de souligner l’importance de certaines d’entre
elles en particulier la souche Issatchenkia orientalis (portant également le nom de Pichia
kudriavezii) qui possède des potentialités très intéressantes en terme de résistance. Elle
résiste à une température allant jusqu’à 42°C, un pH très acide de 2,5. Sa résistance au stress
salin (NaCl: 0,5M) et au stress osmotique (sorbitol : 2M) persiste même à 40°C. Avec
l’éthanol, elle a démontré une résistance importante dépassant celle de la souche de
référence. Sur un milieu riche (YPD solide), elle résiste jusqu’à 18% d’éthanol (V/V) à 30°C et
40°C. En revanche dans des conditions minimum (YNB solide), elle résiste à 18% d’éthanol
(V/V) à 30°C et cette résistance baisse à 10% d’éthanol (V/V) à 40°C. Cependant, et dans de
telles conditions, elle reste toujours supérieur aux limites données par la souche de
référence Saccharomyces cerevisiae CEN.PK122-2N. Cette souche, encore peu étudiée,
montre des intérêts importants en biotechnologie, principalement dans la production du
bioéthanol.
113
Conclusion Générale et Perspectives
La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des profils aromatiques de chacune de
ces souches (C.lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) en ciblant les
molécules les plus produites par les levures telles que le 2-méthylbutanol (2MB), le 3méthylbutanol (3MB) et le 2-phényléthanol (2PE). Des cultures puis des extractions ont été
réalisées en utilisant trois milieux avec différents substrats azotés. Les dosages réalisés en
CPG-FID ont révélé que pour le 2MB, c’est C. lusitaniae et la souche de référence qui
donnent les meilleures productions variant entre 250 et 300mg/L. Pour le 3MB, la souche K.
ohmeri se caractérise par une production dépassant les 400mg/L. Par contre, la souche I.
orientalis a donné une production remarquable en 2PE avec une concentration très proche
des 1000 mg/L représentant pratiquement le double de la concentration donnée par S.
cerevisiae en mg/L. Le niveau de production très élevé du 2-phényléthanol par I. orientalis
est corroboré avec la plus grande résistance de cette espèce à ce produit. Elle se révèle donc
doublement résistante par rapport aux autres levures étudiées jusqu’à présent, en
particulier S. cerevisiae qui résiste à 2,5 g/L. I. orientalis est donc une candidate intéressante
pour la production du 2-phényléthanol.
Cette souche a bénéficié d’une attention particulière et la dynamique de sa physiologie a été
poussée plus loin en étudiant une fermentation en mode batch. Cette dernière a permis de
noter l’absence d’une phase diauxique qui explique que l’éthanol produit par cette souche
n’est pas consommé ; ceci reflète sa performance dans la production de cet alcool. En plus,
aucune chute de croissance et aucune concentration critique n’ont été remarquées, ce qui
confirme sa capacité d’adaptation et sa résistance à ce stress.
Ces premiers résultats obtenus avec la souche d’Issatchenkia orientalis montrent qu’elle est
multi-résistante, la capacité à tolérer divers stress étant l’un des critères les plus importants
pour choisir des souches performantes pour la fermentation. Elle peut donc être une
candidate intéressante et constituer une souche robuste pour la fermentation alcoolique qui
est d’une importance particulière pour la production de l’éthanol. Cependant, des
recherches supplémentaires et complémentaires à l’échelle physiologique et moléculaire
doivent être menées afin de comprendre l’origine et le mécanisme de résistance chez cette
souche.
114
ANNEXES
Annexes
ANNEXE 1
La composition de la galerie ID 32C
Cupules
Tests
Substrats
Quantité (mg/cup)
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
1.A
1.B
1.C
1.D
1.E
1.F
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.A
0.B
0.C
0.D
0.E
0.F
GAL
ACT
SAC
NAG
LAT
ARA
CEL
RAF
MAL
TRE
2KG
MDG
MAN
LAC
INO
0
SOR
XYL
RIB
GLY
RHA
PLE
ERY
MEL
GRT
MLZ
GNT
LVT
GLU
SBE
GLN
ESC
D-GALactose
cycloheximide(ACTidione)
D-SACcharose
N-Acétyl-Glucosamine
acide LAcTique
L-ARAbinose
D-CELlobiose
D-RAFfinose
D-MALtose
D-TREhalose
potassium 2-cétoGluconate
Méthyl-αD-Glucopyranoside
D-MANnitol
D-LACtose (originr bovine)
INOsitol
Pas de substrat
D-SORbitol
D-XYLose
D-RIBose
GLYcérol
L-RHAmnose
PaLatinosE
ERYthritol
D-MELibiose
sodiumGlucuRonaTe
D-MéLéZitose
potassium GlucoNaTe
acide LéVulinique (LeVulinTe)
D-GLUcose
L-SorBosE
GLucosamiNe
ESCuline
citrate de fer
0,70
0,014
0,66
0,64
0,64
0,70
0,66
2,34
0,70
0,66
1,09
1,92
0,68
0,70
0,70
2,72
0,70
0,70
0,82
0,68
0,66
1,44
0,66
0,76
0,66
0,92
0,48
0,78
0,70
0,68
0,28
0,069

Les numéros indiqués sont ceux qui figurent sur la galerie.
116
Annexes
ANNEXE 2
Composition du milieu semi-solide (API C Medium)
API C Mediem
(7mL)
Sulfate d’ammonium
Phosphate monopotassique
Phosphate dipotassique
Phosphate disodique
Chlorure de sodium
Chlorure de calcium
Sulfate de magnésium
L-Histidine
L-Tryptophane
L-Methionine
Agent gélifiant
Solution de vitamines
Solution d’oligo-éléments
Eau minéralisée
pH final : 6,4-6,8 à 20-25°C
117
5g
0,31g
0,45g
0,92g
0,1g
0,05g
0,2g
0,005g
0,02g
0,02g
0,5g
1 mL
10 mL
qsp 1000mL
Annexes
ANNEXE 3
IDENTIFICATION MOLECULAIRE
L’identification moléculaire est obtenue par amplification, séquençage et comparaison du domaine
D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique aux séquences de la base de données du NCBI
(Kurtman et Robnett 1997 et Kurtman et Robnett 1998).
N° IDENT
espèces
S1
500/500 (100%)
S2
525/527 (99%)
S3
Kodamaea ohmeri
487/487 (100%)
S5
Candida parapsilosis
535/535 (100%)
S6
Yarrowia lipolytica
525/525 (100%)
S7
Yarrowia lipolytica
525/525 (100%)
S10
Yarrowia lipolytica
525/525 (100%)
S11
Yarrowia lipolytica
525/525 (100%)
S14
526/526 (100%)
S15
Trichosporon asahii
563/563 (100%)
S17
Zygosaccharomyces bailii
545/545 (100%)
S19
Zygosaccharomyces rouxii
543/543 (100%)
LES SEQUENCES:

Identitées
S1 D1D2 26S rDNA
TACGCCAGCGTCCTAGAATCGCAGGCCTCGAAAAGG
GATGGAGGCGTCAACACGAGCTATAACACGCGCGCCCGAAGGTGCGCGCC
ACATTCTCGAGTTCTTGTTCCTCCCCCCTTTTCGACGCTGGCCCGGTAAA
ACCGTGTCTGCTTGCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTT
CACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGC
TATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTT
AGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGGAGCCGCGGTGTACAAAG
118
Annexes
AGTCGGCGTGCGCCATACGGGGCTCTCACCCTCCCAGGCGCCATGTTCCA
ATGGACTTGGGCGCGGCCGACTCAGACCACGAAACCTTCAAATTACAATT
CCCGCAGGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGG
GGCAATCCCTGTTG

S2 D1D2 26S rDNA
ACATCCTTGCcgAAGCGCAGTCCTCAATCCCG
GCTAACAGTATTCCAAAAAGCTATAACACTACAGAGTAGCTACATTCTTA
ATGATTTATCCTGCTGCCAGAATTGATGTTGGCCCAGTGAAATTTTTGAG
AGGCCCAAGCCCACGAGAGGCGAGTGCATGCAAAAAACACCATGTCTGAT
CAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTC
AAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTC
GCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTC
CCAAACAACTCGACTCTTCGAAAAAGTCTTACAGAGAAAAGGTATCCTCG
CCAAACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGAC
AAGGACCTAATCAAAGACAAATTCTACAAATTACAACTCGGGCACTGAAA
GTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTACCGCTTCACTCGCCGTA

S3 D1D2 26S rDNA
CGTCGGTGTCCTCAAAGCAGGCCTCGGAAAGAGACGGGGCATGA
ACTGCGGCTATAACACCCGAGGGCCACGTTCCACAGTCTTTGTACCCCGC
TTCTTACCCACACTGACAATCTGACGGCATGCCCTTCCCTTTCAACAATT
TCACGTGCTGTTTCACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCATCAC
TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCTGTATTTAGCTTTAGATGGAAT
TTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGAGAGC
GCCTTATAAGGAGCCGGGGGCCGTGCCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTG
ACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACACGGTCGCCTCCAAGACGCAATCTT
CAAATTACAACTCCCCGGGGGGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCA
CTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCG

S5 D1D2 26S rDNA
ACATCCTAGGCCGAAGCCGCAGTCCTCAGTC
TAAGCTGGCAGTATCGACAAAGACTATAACACACTACCGAAGCAGTGCCA
CATTTCTTTGCACTTATCCTACCGCTCAAACTGATGCTGGCCCGGTAAAC
TGTAGAGGCCACCCCCGAGAGAGTAACATACAAAATACCAAGTCTGATCT
CAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAA
119
Annexes
AGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGC
CAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCCC
AAACAACTCGACTCTTCGAAGGAACTTTACATAGGTCTGGGACATCTCAT
CGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTTCTGTTCCAAGAAACATAGACA
AGAGCCAGACCCAAAGATACCTTCTTCAAATTACAACTCGGACACTGAAA
GTGCCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTAAG
GCAA

S6 S7 S10 S11 D1D2 26S rDNA
TCAAGACGGGTGAAATGGGTGGATTATGTCGTCG
GTGGCAGTGTGGAGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAGGCGCTCCCATTTGT
AACCCTCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCGGCAGTACACCGCCCACG
AGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCTCCACTCATTTCCTTCCCTATCAA
CAATTTCACATACTATTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCACCTTTCC
TTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCACCAGTATTTAGCTTTAGAT
GGAGTTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTG
ATAAGGCAATACATGGAGAACGGTTAGCCAGACGGGGTTGTCACCCTCTA
TGACGTACTATTCCAAGCAACTTGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCT
TCAAATTACAATCCCGAGGGTTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTC
GCCGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGC

S14 D1D2 26S rDNA
GCATCCGTGACCTACACGGCCGCAGTCCTC
GGTCCCCGCACGCAGCATCTGGCCCTGGCTATAACACTCCGAAGAGCCAC
GTTCCAGAACCCCTTCTCCTGCAGCAAGAACCGATGCTGGCCCAGGGAAA
GCCCAGAGCGCCGCCCACGAGAGGCAGCGGTGCGCAATCCCCATGTCGGG
CGCAATACCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTTCACTCTCTTTT
CAAAGTGCTTTTCATCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCT
CGCCAGTATTTAGCCTTAGATGGAATTTACCACCCGCTTGGAGCTGCATT
CCCAAACAACTCGACTCGTCAGAAGGGCCTCACTGCTTCCGCCGGCATCC
CACGGGGCTCTCACCCTCCTGGGCGCCCTGTTCCAAGGGACTTGGACACC
GCCTTCCACACAGACTCCAACCTGCAATCTACAACTCGTGCCGCAAAGCA
CGATTTCAAATCTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTGAGG
120
Annexes

S15 D1D2 26S rDNA
TATGTCAACATCCTAAGCTCGAACGTGCCCGAAGGCCG
GCCATAAAGGCGAGCTGCAGTCCTCAGTCTCACCCAGTGTATGTGATAAT
AGGCTATAACACTTCCGGAGAAGTCACATTCCTACTACCTTTATCCACCG
GACAAAACTGATGTTGACCCGTTCCAAGGAAGTAGACCAGCAGAACTGGC
TGAATCCAAAGAACACGACTGACTTCAATCGTTTCCCTTTCAACAATTTC
ACGTACTGTTTAACTCTCTTTCCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCCTCACGG
TACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTC
ACCACCCATTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTAGAAGACGT
ATCACAGAGCACCGGTGGTCGTGTTAAGTACGGGATTATCACCCTCTTTG
ATACTCCTTTCCAGGAGACTTGGACACGGTCCGGCACGGAAAACGCCTCT
ATAGATTACAACTCGGACAATCGAAGACTGCCAGATTTCAAATTTGAGCT
CTTCCCGCTTCACTCGCCGTTACTA

S17 D1D2 26S rDNA
ATTATGCCAGCATCCTTGACTAAAAGTCGCATTCCTCAG
TCCCAGCTGGCAGTATTCCCCTGGACTATAAGTTCGTCCGCCACGAAGTG
GTAGAGCTACATTCCCAGGGATTTATCCTGCCGCCAAAACTGATGCTGGC
CCAGTGAACTGCGAGATTCCCCCACCCACGAGAGGCGAGGGGCGCAAAAC
ACCATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTT
CACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGC
TATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTT
AGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTCTACAAAGAA
CTGGGATCCTCGCCATACGGGATTCTCACCCTCCATGACGTCCTGTTCCA
AGGAACATAGACAAGGACCAGCCCCAGAGTCGCCTTCTACAAATTACAAC
TCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACT
CGCCGT

S19 D1D2 26S rDNA
TTATGCCAACATCCTTGACAAAATGTCGCATACCTCAGT
CCCAGCTGGCAGTATTCCCCTGGGCTATAACACTCCCTCCCGAAGAAAGA
AGCCACATTCCCAGAGATTTATCCTGCCGCCAAAACTGATGCTGGCCCAG
TGAGCTGCGAGATTCCCCCACCCACGAGGAGCGAGGGGCACAAAACACCA
121
Annexes
TGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTCCTTTTTCACT
CTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATC
GGTCTCTCGCCTGTATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAG
CTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCGTTCTACAAAGAACTGG
ATCACCTCGCCTCACGGGGTTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGG
AACATAGGCAAGGGCCAGTCCCAGAATCACTTTCTCCAAATTACAACTCG
GGCACCGAAAGGTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCG
CCGT
122
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
Annexes
Agbogbo F. K. & Coward-Kelly G. (2008). Cellulosic ethanol production using the naturally
occurring xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Biotechnol Lett, 30: 1515–1524.
Aguedo M., Ly M.H. & Lim K. (2004). The use of enzymes and microorganisms for the
production of aroma compounds from lipids. Food Technol Biotechnol, 42: 327–336.
Aguilar-Uscanga B. & François J.M. (2003). A study of the yeast cell wall composition and
structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Lett Appl Microbiol,
37(3): 268-274.
Aguilera F., Peinado R. A., Millan C., Ortega J. M. & Mauricio J. C. (2006). Relationship
between ethanol tolerance, H(+)-ATPase activity and the lipid composition of the plasma
membrane in different wine yeast strains. Int J Food Microbiol, 110: 34-42.
Aguilera J., Petit T., de Winde J. H. & Pronk J. T. (2005). Physiological and genome wide
transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae to high carbon dioxide
concentrations. FEMS Yeast Research, 5: 579-593.
Albertazzi E., Cardillo R., Servi S. & Zucchi G. (1994). Biogeneration of 2-phenylethanol and
2-phenylethylacetate important aroma components. Biotechnol Lett, 16(5): 491-496.
Aldiguier A. S., Alfenore S., Cameleyre X., Goma G., Uribelarrea J. L., Guillouet S. E. &
Molina-Jouve C. (2004). Synergistic temperature and ethanol effect on Saccharomyces
cerevisiae dynamic behaviour in ethanol bio-fuel production. Bioproces Biosyst Eng, 26:
217-222.
Alexandre H., Ansanay-Galeote V., Dequin S. & Blondin B. (2001). Global gene expression
during short-term ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett, 498: 98-103.
Alexandre H., Plourde L., Charpentier C. & François J.M. (1998). Lack of correlation between
trehalose accumulation, cell viability and intracellular acidification as induced by various
stresses in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology, 144(4): 1103-1111.
Alexandre H., Rousseaux I. & Charpentier C. (1994). Relationship between ethanol
tolerance, lipid composition and plasma membrane fluidity in Saccharomyces cerevisiae
and Kloeckera apiculata. FEMS Microbiol Lett, 124: 17-21.
Alfenore S., Molina-Jouve C., Guillouet S. E., Uribelarea J. L., Goma G. & Benbadis L. (2002).
Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin
feeding strategy during fed-batch process. Appl Microbiol Biotechnol, 60: 67-72.
Ali B. M., Bendi A. & Malti R. (2010). Caractérisation et valorisation des polysaccharides
pariétaux d’Urginea pancration de Djebel Tessala (Nord-Ouest Algérien), Les technologies
de laboratoire, 5(19): 15-19.
124
Annexes
Alterthum F., Dombek K. M. & Ingram L. O. (1989). Regulation of glycolytic flux and ethanol
production in Saccharomyces cerevisiae: effects of intracellular adenine nucleotide
concentrations on the in vitro activities of hexokinase, phosphofructokinase,
phosphoglycerate kinase and pyruvate kinase. Appl Environ Microbiol, 63: 1312-1314.
Anese M., Manzano M. & Mankali L. (1997). Quality of minimally processed apple slices
using different modified atmosphere conditions. J Food Quality, 20: 359–370.
Anonyme (1993). Alcool phényléthylique
personnelle (Société LESAFFRE).
et phénylacétaldéhyde. Communication
Anonyme (1999). Natürliche Aromastoffe immer stärker gefragt. Z. Lebensmittelw, 50: 30–
31.
Arnold W.M. (1981). Enzymes: In Yeast cell envelopes. Biochemistry Biophysics and
Ultrastructure, 2: 1-46.
Arroyo-Lopez F.N., Duran-Quintanaa M.C., Ruiz-Barbaa J.L., Querol A. & Garrido-Fernandez
A. (2006). Use of molecular methods for the identification of yeast associated with table
olives. Food Microbiology, 23: 791-796.
Attfield P. V. (1997). Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker’s yeast.
Nature Biotechnol, 15: 1351-1357.
Attfield P.V. & Bell P.J. (2006). Use of population genetics to derive non recombinant
Saccharomyces cerevisiae strains that grow using xylose as a sole carbon source. FEMS
Yeast Res, 6: 862-868.
Awe S., Mikolasch A. & Schauer F. (2009). Formation of coumarines during the degradation
of alkyl substituted aromatic oil components by the yeast Trichosporon asahii. Appl
Microbiol Biotechnol, 84: 965-976.
Bacon J.C.D., Farmer V.C., Jones D. & Taylor L.F. (1969). The glucan compounds of the cell
wall backer’s yeast Saccharomyces cerevisiae considered in relation to its ultrastructure.
Biochem J, 114: 557-567.
Baffi M.A., Dos Santos Bezerra C., Arevalo-Villena M., Biones-Perez I.A., Gomes E. & Da
Silva R. (2011). Isolation and molecular identification of wine yeasts from a Brazilian
vineyard. Anals of Microbiology, 61(1): 75-78.
Bai F. W., Chen L. J., Zhang Z., Anderson W. A. & Moo-Young M. (2004). Continuous ethanol
production and evaluation of yeast cell lysis and viability loss under very high gravity
medium conditions. Journal of Biotechnology, 110: 287-293.
125
Annexes
Bapat P., Nandy S. K., Wangikar P. & Venkatesh K. V. (2006). Quantification of metabolically
active biomass using Methylene Blue dye reduction test (MBRT): Measurement of CFU in
about 200s. J Microbiol Methods, 65: 107-116.
Barford J.P. (1981). A mathematical model for the aerobic growth of Saccharomyces
cerevisiae with a saturated respiratory capacity. Biotechnol Bioeng, 23: 1735-1762.
Barnett J.A. & Pankhurst R.J. (1974). A new key to the yeasts. North-holland Publishing
Company Amsterdam, London.
Barnett J.A., Payne R.W. & Yarrow D. (1983). Yeasts: Characteristics and identification.
Cambridge Univ Press. Cambgidge, 123-124.
Barnett J.A., Payne R.W. & Yarrow D. (1990). A guide to identifying and classifying yeasts.
Cambridge Univ Press. Cambridge, 213-219.
Barnett J.A., Payne R.W. & Yarrow D. (2000). Yeasts, characteristics and identification.
Cambridge University Press. Cambridge, 752-758.
Barnett J.A. & Robinow C.F. (2002). A history of research on yeasts 4: cytology part I, 18901950. Yeast, 19: 151-182.
Baroiller C. & Schmidt J.L. (1990). Contribution à l’étude de l’origine des levures du fromage
de Camembert. Le Lait, 70: 67-84.
Barth G. & Gaillardin C. (1997). Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia
lipolytica. FEMS Microbiol Rev, 19: 219-237.
Bartnicki-Garcia S. (1963). Symposium on biochemical bases of morphogenesis in fungi:
Moldueast dimorphism of Mucor. Bact Rev, 27: 293-304.
Bartnicki-Garcia S. & Lippman E. (1969). Fungal morphogenesis: Cell wall construction in
Mucor rouxii. Science NY, 165: 302-304.
Basílio A.C.M., de Araújo P.R.L., de Morais J.O.F., da Silva-Filho E.A., de Morais M.A. &
Simões D.A. (2008). Detection and identification of wild yeast contaminants of the
industrial fuel ethanol fermentation process. Curr Microbiol, 56: 322–326.
Bayley R.B. & Parks L.W. (1975). Yeast sterol esters and their relationship to the growth of
yeast. J Bacteriol, 124: 606-612.
Beavan M.J., Charpentier C. & Rose A.H. (1982). Production and tolerance of ethanol in
relation to phospholipid fatty acyl composition in Saccharomyces cerevisiae NCYC 431. J
Gen Microbiol, 128: 1447-1455.
126
Annexes
Becker J.M., Naider F. & Katchalski E. (1973). Peptide utilization in yeast: Studies on
methionine and lysine auxotrophs of Saccharomyces cerevisiae. Bioch Biophys acta, 291:
388-390.
Belin J.M., Bensoussan M. & Serrano-Carreon L. (1992). Microbial biosynthesis for the
production of food flavours. Trends Food Sci Technol, 3: 11-14.
Belin J.M. (1996). Les levures. In «C.M. Bougeois & J.P. Larpent Edit, Microbiologie
alimentaire, Tec et Doc Lavoisier. Paris. 36 p.»
Bell P.J.L. (2004). Yeast differentiation using histone promoter sequences. Letters in Applied
Microbiology, 38: 388–392.
Bellinger Y. & Larher F. (1988). A 13C comparative nuclear magnetic resonanace study of
organic solute production and excretion by the yeasts Hansenula anomala and
Saccharomyces cerevisiae in saline media. Can J Microbiol, 34: 605-612.
Bely M., Salmon J. M. & Barre P. (1994). Assimilable nitrogen addition and hexose transport
activity during enological fermentations. J Inst Brew, 100: 279-282.
Ben Chaabane F. (2006). Intensification de la production d’éthanol biocarburant dans un
bioréacteur bi-étagé avec recyclage cellulaire: Modélisation et Stratégie de conduite.
Thèse Doctorat, INSA, Toulouse.
Benda N.D., Boucias D. , Torto B. & Teal P. (2008). Detection and characterization of
Kodamaea ohmeri associated with small hive beetle Aethina tumida infesting honey bee
hives. Journal of apicultural Research, 47(3): 194-201.
Beney L., Martinez I., Marechal P., Moundaga S. & Gervais P. (2001). Osmotic destruction
of Saccharomyces cerevisiae is not related to a high water flow rate across the
membrane. Biochemical Engineering Journal, 9: 205-210.
Benjaphokee S., Hasegawa D., Yokota D., Asvarak T., Auesukaree C., Sugiyama M. … &
Harashima S. (2011): Highly efficient bioethanol production by a Saccharomyces
cerevisiae strain with multiple stress tolerance to high temperature, acid and ethanol. N
Biotechnol, 10: 1016-1018.
Berger R.G., Neuhäuser K. & Drawert F. (1987). Biotechnological production of flavor
compounds: High productivity fermentation of flavors using a strain of Ischnoderma
benzoinum. Biotehnol Bioeng, 30: 987-990.
Birch R. & Walker G. (2000). Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol stress
responses of Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and microbial technology, 26: 678 – 687.
Bonaly R. (1990). Morphologie et reproduction asexuée des levures. In «Larpent J. P. ed.,
Biotechnologie des levures, Masson, Paris, 426 p.»
127
Annexes
Borelli B.M., Ferreira E.G., Lacerda I.C.A., Franco G.R. & Rosa C.A. (2006). Yeast populations
associated with the artisanal cheese produced in the region of Serra da Canastra Brazil.
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22: 1115-1119.
Bothast R.J. & Saha B.C. (1997). Ethanol production from agricultural biomass substrate.
Adv Appl Microbiol, 44: 261-286.
Botton B. (1991) : La physiologie des levures. In «Larpent J. P. ed., Biotechnologie des
levures, Masson, Paris, 97 p.»
Bouix M. & Leveau J.Y. (1980). Les levures: Techniques d’analyse et de contrôle dans les
industries agroalimentaires (Tome 3). In «Bourgeois C.M. et Leveau J.Y. ed., Le contrôle
microbiologique. Tec et Doc Lavoisier, Paris, 130p.»
Bourgeois C.M., Mescle J.E. & Zucca J. (1996). Aspect microbiologique de la sécurité et de la
qualité des aliments. In «Bourgeois C.M. et Leveau J.Y. ed., Microbiologie alimentaire. Tec
et Doc Lavoisier, Paris, 223p.»
Broach J.R. (1982). The yeast plasmid 2 mu circle. Cell, 28(2):203-204.
Brondijk T.H., Konings W.N. & Poolman B. (2001). Regulation of maltose transport in
Saccharomyces cerevisiae. Arch Microbiol, 176: 96-105.
Buckeridge M. S. & Goldman G. H., (2011). Routes to Cellulosic Ethanol. Springer, New York,
270-276.
Busturia A. & Lagunas R. (1986). Catabolite inactivation of the glucose transport system in
Saccharomyces cerevisiae. J Gen Microbiol, 132: 379-385.
Cakar Z.P., Seker U.O., Tamerler C., Sonderegger M. & Sauer U. (2005). Evolutionary
engineering of multiple-stress resistant Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res, 5:
569-578
Canetta E., Adya A. K. & Walker G. M. (2006). Atomic force microscopic study of the effects
of ethanol on yeast cell surface morphology. FEMS Microbiol Lett, 255: 308-319.
Caputto R., Leloir L.R. & Clark L. (1949). The enzymatic transformation of galactose in to
glucose derivatives. J Biol Chem, 179: 490-497.
Carlson M. & Botstein D. (1982). Two differentially regulated mRNAs with different 5' ends
encode secreted with intracellular forms of yeast invertase. Cell, 28: 145-154.
Carvalho A. F. A., China O.H. & Arnold R. (2013). Xylo-oligosaccharides from lignocellulosic
materials: Chemical structure, health benefits and production by chemical and enzymatic
hydrolysis. Food Research International, 51: 75–85.
128
Annexes
Casey G.P., Magnus C.A. & Ingledew W.M. (1983). High-gravity brewing: nutrient enhanced
production of high concentrations of ethanol by brewing yeast. Biotechnol Lett, 5: 429–
434.
Casey G. P. & Ingledew W. M. (1986). Ethanol tolerance in yeasts. CRC Crit Rev Microbiol,
13: 219-280.
Casey G.D., Dobson A.D.W. (2003). Molecular detection of Candida krusei contamination in
fruit juice using the citrate synthase gene cs1 and a potential role for this gene in the
adaptive response to acetic acid. J Appl Microbiol, 94: 13–22.
Chandrasekaran M.J. (1997). Industrial enzymes from marine microorganisms: The Indian
scenario. J Mar Biotechnol, 5: 86–89.
Chen L.S., Cui J., Ding Q.B., Ma Y., Chen L.J., Dong J.Y., Jiang T.M. & Maubois J.I. (2011). The
effect of yeast species from raw milk in china on proteolysis and aroma compound
formation in camembert type cheese. Food and Bioprocess Technology, 10: 1-9.
Chi Z.M., Liu T.T., Chi Z., Liu G.L. & Wang Z.P. (2012). Occurrence and Diversity of Yeasts in
the Mangrove Ecosystems in Fujian, Ghandong and Hainan Provinces of China. Indian
Journal of Microbiology, 12: 168 170.
Choisy C., Gueguen M., Lenoir J., Schmidt J.L. & Tourneur C. (1987). Microbial aspects. In
«Eck, A. Ed., Cheesemaking Science and Technology. Tech et Doc Lavoisier, Paris, 259p.»
Chu B. C. H. & Lee H. (2007). Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose
fermentation. Biotechnology Advances, 25: 425–441.
Ciesarova Z., Smogrovicova D. & Domeny Z. (1996). Enhancement of yeast ethanol
tolerance by calcium and magnesium. Folia Microbiol, 41: 485–488.
Clarck G.S. (1995). An aroma chemical profile: Benzaldehyde Rerfumer and Flavorist. Aroma,
20: 53-60.
Clemente-Jimenez J., Mingorance-Cazorla L., Martinez-Rodriguez S., Heras-Viazquez F. &
Rodriguez-Vico F. (2004). Molecular characterization and oenological properties of wine
yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grap must. Food
Microbiol, 21: 149-155.
Coelho S. T (2005). Biofuels-Advances and trade barriers. United Nation Conference on
Trade and Development.
Cook A.M., Beggs J.D. & Fewson C.A. (1975). Regulation of growth of Acinetobacter
calcoaceticus NCIB 8250 on I-mandelate in batch cultures. J Gen Microbiol, 91: 325-337.
129
Annexes
Cooper T. G. (1982). in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and
Gene Expression. Strathern J. N., Jones E. W. and Broach J., eds, New York, 399 p.
Corre J., Lucchini J.J., Mercier G.M. & Cremieux A. (1990). Antibacterial activity of
phenylethanol alcohol and resulting membrane alterations. Res Microbiol, 141(4): 483497.
Cot M. (2006). Etudes physiologiques de l’adaptation et de la résistance de la levure
Saccharomyces cerevisiae au cours de la production intensive d’éthanol. Thèse de
Doctorat, Université de Toulouse.
Cot M., Loret M.O., François J.M., Benbadis L. (2007). Physiological behaviour of
Saccharomyces cerevisiae in aerated fed-batch fermentation for high level production of
bioethanol. FEMS Yeast Res, 7(1): 22-32.
D'Amore T. & Stewart G.G. (1987). Ethanol tolerance of yeast. Enzyme Microb Technol, 9:
322-330.
D'Amore T., Panchal C.J., Russell I. & Stewart G.G. (1990). A study of ethanol tolerance in
yeast. Crit Rev Biotechnol, 9: 287-304.
Daniel H.M., Vrancken G., Takrama J.F., Camu N., De Vos P. & De Vuyst L. (2009). Yeast
diversity of Ghanaian cocoa bean heap fermentations. FEMS Yeast research, 9(5): 774783.
Darte C. & Grenson M. (1975). Evidence for three glutamic acid transporting system
withspecialized physiological functions in Saccharomyces cerevisiae. Biochemical and
Biophysical Research Communications, 67: 1028-1033.
Daum G., Lees N.D., Bard M. & Dickson R. (1998). Biochemistry, cell biology and molecular
biology of lipids of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 14: 1471-1510.
Deardorff D. L. (1980). Osmotic strength, osmolality and osmolarity. Am J Hosp Pharm, 37:
504-509.
Debs-Louka E., Louka N., Abraham G., Chabot V. & Allaf K. (1999). Effect of compresed
carbon dioxide on microbial cell viability. Appl Environm Microbiol, 6: 626-631.
Degorce-Dumas J.R., Goursaud J. & Leveau J.Y. (1984). Production d’arômes par les
microorganismes: les potentialités. IAA. 101: 11-15.
Delcourt A. L. (2011). La levure de bière, c'est malin: Santé, beauté, bien-être. Un ingrédient
magique aux innombrables vertus, Éditions Leducs, Paris, 160 p.
De Melo H. F., Bonini B. M., Thevelein J., Simões D. A. & Morais M. A. Jr. (2010).
Physiological and molecular analysis of the stress response of Saccharomyces cerevisiae
imposed by strong inorganic acid with implication to industrial fermentations, J Appl
Microbiol, 109: 116–127.
130
Annexes
Dillon J.C. (1989). Place du lait dans l'alimentation humaine en régions chaudes. In
«Tisserand J.-L. Edit, Le lait dans la région méditerranéenne. CIHEAM. Paris. 163p».
Ding J., Huang X., Zhang L., Zhao N., Yang D. & Zhang K. (2009). Tolerance and stress
response to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 85:
253–263.
Dombek K.M. & Ingram L.O. (1986). Determination of the intracellular concentration of
ethanol in Saccharomyces cerevisiae during fermentation. Appl Environ Microbiol, 51:
197-200.
Dombek K.M. & Ingram L.O. (1987). Ethanol production during batch fermentation with
Saccharomyces cerevisiae: changes in glycolytic enzymes and internal pH. Appl Environ
Microbiol, 53: 1286-1291.
Dubois E. & Grenson M. (1979). Methylamine ammonia uptake systems in Saccharomyces
cerevisiae: multiplicity and regulation. Mol Gen Genet, 175: 7-76.
Ducastelle A. & Lenoir J. (1965). Contribution à l’étude de la flore microbienne du fromage
de type Camembert : Ses espèces dominantes. Le Lait, 45: 448-509.
Dufour N., Swana J. & Rao R. P. (2011). Fermentation Organisms for 5- and 6-Carbon Sugars.
In «Hood E. E., Nelson P. and Powell R. eds. Plant biomass conversion. Wiley-Blackwell
Chichester. Pbk. 358 p».
Ebright J.R., Fairfax M.R. & Vazquez J.A. (2001). Trichosporon asahii: a non-Candida yeast
that caused fatal septic shock in a patient without cancer or neutropenia. Clin Infect Dis,
33: 28-30.
Egbosimba E.E. & Slaughter J.C. (1987). The influence of ammonium permease activity and
carbon source on the uptake of ammonium from simple defined media by
Saccharomyces cerevisiae. J Gen Microbiol, 133: 375-379.
El-Sharoud W.M., Belloch C., Peris D. & Querol A. (2009). Molecular identification of yeasts
associated with traditional egyptian dairy products. Journal of Food Science, 74(7): 341346.
Estruch F. (2000). Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes, and stress
tolerance in budding yeast. FEMS Microbiol Rev, 24: 469–486
Etievant P. (1991). Les arômes: Produits chimiques ou naturels? INRA Mensuel, 58: 28-32.
Etschmann M.M.W., Bluemke W. & Kim J. (2002). Biotechnological production of 2phenylethanol. Appl Microbiol Biotechnol, 99: 1–8.
131
Annexes
Etschmann M.M.W. & Schrader J. (2006). Medium optimization for the production of the
aroma compound 2-phenylethanol using a genetic algorithm. J Mol Catal B: Enzym, 29:
187–193.
Fabre C.E., Duviau V.J., Blanc P.J. & Gomma G. (1995). Identification of volatile flavour
compounds obtained in culture of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology Letters, 11:
1207-1212.
Fabre C., Blanc P. & Goma G. (1996). Production of benzaldehyde by several strains of
Ischnoderma benzoinum. Sci Alim, 16: 63-70.
Fabre C.E., Blanc P.J. & Gomma G. (1997). Screening of yeasts producing 2-phenylethanol.
Biotechnol Tech, 11: 523–525.
Fabre C.E., Blanc P.J. & Gomma G. (1998). Production of 2-phenylethyl alcohol by
Kluyveromyces marxianus. Biotechnol Progr, 14: 270–274.
Farrell A. E., Plevin R. J., Turner B. T., Jones A. D., O’hare M. & Kammen D. M. (2006).
Ethanol can contribute to energy and environmental goals. Science, 311: 506-508.
Ferreira M. M., Loureiro-Dias M. C. & Loureiro V. (1997). Weak acid inhibition of
fermentation by Zygosaccharomyces bailii and Saccharomyces cerevisiae. Int J Food
Microbiol, 36(3): 145-153.
Ferreira B. S., Cecilia R. C., Van Keulen F. & Cabral M. S. (2004). Recombinant
Saccharomyces cerevisiae strain triggers acetate production to fuel biosynthetic
pathways. Journal of biotechnology, 109: 159-167.
Fiechter A., Fuhrmann G.F. & Kapelli O. (1981). Regulation of glucose metabolism in
growing yeasts cells. Adv Microbiol Physiol, 22: 123-183.
Fiess M. (1995): Additifs 1995: l’Europe enfin harmonisée. RIA, 545: 36-48.
Fleet G.H. (2007). Yeasts in foods and beverages: impact on product quality and safety. Curr
Opin Biotechnol, 18: 170-175.
Fonseca C., Romao R., Rodrigues de Sousa H., Hahn-Hagerdal B. & Spencer-Martins I.
(2007). L-Arabinose transport and catabolism in yeast. FEBS J, 274: 3589-3600.
Fujita K., Matsuyama A., Kobayashi Y. & Iwahashi H. (2004). Comprehensive gene
expression analysis of the response to straight-chain alcohols in Saccharomyces cerevisiae
using cDNA microarray. J Appl Microbiol, 97: 57-67.
Fullerton G. D., Kanal K. M. & Cameron I. L. (2006). On the osmotically unresponsive water
compartment in cells. Cell Biology International, 30: 74-77.
132
Annexes
Furia T.E. & Bellanca N. (1971). Feranoli’s Handbook ok flavor ingredients. G.L. Tuve, S.M.
Selby and I. Sunshine, Eds. Pbk, 287 p.
Gallardo J. C. M., Souza C. S., Cicarelli R. M. B., Oliveira K. F., Morais M. R. & Laluce C.
(2010). Enrichment of a continuous culture of Saccharomyces cerevisiae with the yeast
Issatchenkia orientalis in the production of ethanol at increasing temperatures. J Ind
Microbiol Biotechnol, 15: 132-165.
Gallardo J.C., Souza C.S., Cicarelli R.M., Oliveira K.F., Morais M.R. & Laluce C. (2011).
Enrichment of a continuous culture of Saccharomyces cerevisiae with the yeast
Issatchenkia orientalis in the production of ethanol at increasing temperatures. J Ind.
Microbiol Biotechnol, 38: 405-414
Galzy P., Moulin G. & Adrian J. (1996). Présence et utilisation des levures en alimentation
humaine. Ind Alim Agr, 1: 656-662.
Garcia-Sanchez R., Karhumaa K. & Fonseca C. (2010). Improved xylose and arabinose
utilization by an industrial recombinant Saccharomyces cerevisiae strain using
evolutionary engineering. Biotechnol Biofuels, 3: 13-15.
Garcia-Gonzalez L., Geeraerd A. H., Spilimbergo S., Elst K., Van Ginneken L., Debevere J.,
Van Impe J. F. & Devlieghere F. (2007). High pressure carbon dioxide inactivation of
microorganisms in foods: the past, the present and the future. Int J Food Microbiol, 117:
1-28.
Garcia-Hernandez Y., Rodriguez Z., Branao L.R., Rosa C.A., Nicoli J.R., Elias A. … & Halaihel
N. (2011). Identification and in vitro screening of avian yeasts for use as probiotic.
Research Veterinary Science, 10: 1-6.
Gardonyi M., Osterberg M., Rodrigues C., Spencer-Martins I. & Hahn-Hagerdal B. (2003).
High capacity xylose transport in Candida intermedia PYCC 4715. FEMS Yeast Res, 3: 4552.
Gargeya I.B., Pruitt W.R., Simmons R.B., Meyer S.A., Ahearn D.G. (1990). Occurrence of
Clavispora lusitaniae, the teleomorph of Candida lusitaniae, among clinical isolates. J Clin
Microbiol, 28: 2224-2227.
Garrett M. (1989). Characterization of AAT 1: a gene involved in the regulation of amino acid
transport in Saccharomyces cerevisiae. J Gen Microbiol, 135: 1429-1437.
Giannattasio S., Guaragnella N., Corte-Real M., Passarella S., Marra E. (2005). Acid stress
adaptation protects Saccharomyces cerevisiae from acetic acid-induced programmed. Cell
Death Gene, 354: 93-98.
133
Annexes
Gibson B. R., Lawrence S. J., Lecraire J. P. R., Powell C. D. & Smart K. A. (2007). Yeast
responses to stresses associated with industrial brewery handling. FEMS Microbiol Rev,
31: 535-569.
Gnangui A. (2010). Droit des déchets en Afrique : le cas de la Côte d'Ivoire, Editions
L'Harmattan, Paris, 277 p.
Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H. & Davis R.W. (1996). Life with 6000 genes. Sciences, 96:
563-574.
Gorin P.A.J., Spencer J.F.T. & Eveleign D.E. (1969). Enzymatic degradation of yeast-cell-wall
manns and galactomanns to polymeric fragments containing α (16) linked D
mannopyranon residues. Carb Res, 2: 387-398.
Greasham R.L. & Moat A.G. (1973). Amino acid transport in a polyaromatic amino acid
auxotroph of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol, 115: 975–981.
Gregory M.E., Keenan M.H.J. & Rose A.H. (1982). Accumulation of L-asparagine by
Saccharomyces cerevisiae X-2180. J Gen Microbiol, 128: 2557-2562.
Grenson M., Mousset M. Wiame J.M. & Béchet J. (1966). Multiplicity of amino acid
permeases in Saccharomyces cerevisiae: Evidence for a specific arginine-transporting
system. Biochim Biophys Acta, 127: 325-338.
Grenson M., Hou C. & Crabeel M. (1970). Multiplicity of amino acid permeases in
Saccharomyces cerevisiae: Evidence for general amino acid permease. Journal of
Bateriology, 103(3): 770-777.
Grippon J.C. (1978). Levures et moisissures intervenant dans la préparation des produits
laitiers. C.R. 20è Congr Int. Lait. 4 ST.
Gros B. & Asther M. (1989). Arômes de basidiomycètes: caractéristiques, analyses et
productions. Sci Alim, 9: 427-454.
Gross B., Gallois A., Spinnnler H.E. & Langlois D. (1989). Volatile compounds produced by
the ligninolytic fungus Phlebia radiata Fr (Basidiomycetes) and influence of the strain
specificity on the odorous profile. J Biotechnol, 10: 303-308.
Gryta M., Morawski A. & Tomaszewska M. (2000). Ethanol production in membrane
distillation bioreactor. Catalysis today, 16: 159-165.
Guerineau M., Grandchamp C., Paoletti C. & Slonimski P. (1971): Characterisation of a new
class of circular DNA molecules in yeasts. Biochem Biophys Commun, 42: 550-561.
Guerzoni M., Lanciotti R., Sinigaglia M., Anese M. & Lerici C. (1994). Influence of some
selected ions on system water activity and on ethanol vapour pressure an inhibitory
action on Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol, 40: 1051-1056.
134
Annexes
Guerzoni M.E., Gobbetti M., Lanciotti R., Vannini L. & Chaves Lopez C. (1998). Yarrowia
lipolytica as potential ripening agent in milk products. In «Jakobsen M., Narvhus J. and
Viljoen B.C. Eds., Yeasts in the Dairy Industry: Positive and Negative Aspects, Copenhagen,
Denmark, 23 p».
Guerzoni M.E., Lanciotti R., Vannini L., Galgano F., Favati F., Gardini F. & Suzzi G. (2001).
Variability of the lipolytic activity in Yarrowia lipolytica and its dependence on
environmental conditions. Food Microbiol, 69: 79– 89.
Guittonneau G., Keilling J. & Delaval H. (1939). Les formes levures dans la flore superficielle
des fromages de Camembert. Le Lait, 34: 31-36.
Gupta K.G., Puri N. & Gupta M. (1992). Bioproduction of diacetyl a dairy flavor by mixed
culture. In 12 th International congress of flavours, fragans and essential oils. Vienna.
Austria. 4-5 octobre.
Hahn-Hägerdal B., Karhumaa K., Fonseca C., Spencer-Martins I. & Gorwa-Grauslund M.F.
(2007 ). Towards industrial pentose-fermenting yeast strains. Appl Microbiol Biotechnol,
74(5): 937-953.
Halme A., Bumgarner S., Styles C. & Fink G.R. (2004). Genetic and epigenetic regulation of
the FLO gene family generates cell-surface variation in yeast. Cell, 116: 405-415.
Hanssen H.P., Sprecher E. & Klingenberg A. (1984). Accumulation of volatile flavor
compounds in liquid cultures of Kluyveromyces lactis. Z Naturforsch, 39C: 1030-1033.
Hart T. & Shears P. (1997). Atlas de poche de microbiologie, édition Flammarion MédecineSciences, Paris, 314 p.
Hartmans S., Smits J.P., Van Der Werf M.J., Volkering F. & De Bont J.A.M. (1989).
Metabolism of styrene oxide and 2-phenylethanol in the styrene-degrading Xanthobacter
strain 124X. Apllied and Environmental Microbiology, 55(11): 2850-2855.
Hayashida K. & Ohta H. (1981). effects of phosphatidylcholine or ergosteryl oléate on
physiological properties of Saccharomyces sake, Agricultural and biological chemistry. J
Inst Brew, 44: 2561-2567.
Hazelwood L.A., Daran J.M., Van Maris A.J., Pronk J.T. & Dickinson J.R. (2008). The Ehrlich
pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae
metabolism. Appl Environ Microbiol, 74: 2259-2266.
Henry S.A. (1983). Membrane lipids of yeasts: Biochemical and genetics studies, In: The
molecular biology of the Saccharomyces. (Cold Spring harbor laboratory, 101) New-York.
Henson M. A. (2003). Dynamic modeling and control of yeast cell populations in continuous
biochemical reactors. Computers Chem Eng, 27: 1185-1199.
135
Annexes
Hernandez-Orte P., Cersosimo M., Loscos N., Cacho J., Garcia-Moruno E. & Ferreira V.
(2008). The development of varietal aroma from non-floral grapes by yeasts of different
genera. Food Chemestry, 107(3): 1064-1077.
Hirasawa T., Yoshikawa K., Nakakura Y., Nagahisa K., Furusawa C., Katakura Y. & Shioya S.
(2007). Identification of target genes conferring ethanol stress tolerance to
Saccharomyces cerevisiae based on DNA microarray data analysis. J Biotechnol, 131: 3444.
Hohmann S. (2002). Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeast. Microbiology and
molecular biology reviews, 66(2): 300-372.
Holzer H., Bernhardt W. & Schneider S. (1963). Zur glycerinbildung in Bäckerhefe. Biochem
Z, 336: 495-509.
Horak J. (1986). Amino acid transport in eucaryotic microorganisms. Biochim Biophys Acta,
864: 223-256.
Hu X. H., Wang M. H., Tan T., Li J. R., Yang H., Leach L., Zhang R. M. & Luo Z. W. (2006).
Genetic dissection of ethanol tolerance in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.
Gen Soc Ame, 175: 1479-1487.
Hu X. H., Wang M. H., Tan T., Li J. R., Yang H., Leach L., Zhang R. M. & Luo Z. W. (2007).
Genetic Dissection of Ethanol Tolerance in the Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae.
Genetics, 175: 1479–1487.
Huang J. , Zhuang S. , Fu J., Wang C.Y., Sun Y.H. & Wang Y.F. (2010). Analysis of aroma
compounds of different yeast strains and its molecular identification by bioinformatics.
International Conference on Computer and Communication Technologies in Agriculture
Engineering. 1: 25-30.
Imai T. & Ohno T. (1995). The relationship between viability and intracellular pH in the east
Saccharomyces cerevisiae. Appl Environm Microbiol, 61(10): 3604-3608.
Ingram L. O. & Buttke T.M. (1984). Effects of alcohols on microorganisms, 253-300. In “Rose
A. H., Tempest D.W. Ed. Adv. Microbiol. Physiol. 25. Academic press London”.
Isono N., Hayakawa H., Usami A., Mishima T. & Hisamatsu M. (2012). A comparative study
of ethanol production by Issatchenkia orientalis strains under stress conditions. Journal of
Bioscience and Bioengineering, 113(1): 76-78.
Jakobsen M., Narvhus J. (1996). Yeasts and their possible beneficial and negative effects on
the quality of dairy products. Int Dairy J, 6: 755– 768.
Jansen M., Veurink J.H., Euverink G.J. & Dijkhuizen L. (2003). La croissance de la levure
tolérante au sel Zygosaccharomyces rouxii dans des plaques de microtitration: effets de
136
Annexes
NaCl, pH et de la température sur la croissance et la production d'alcool de fuel à partir
des acides aminés à chaîne ramifiée. FEMS Yeast Res, 3: 313-318.
Jayapal N., Tayki U. & Nuramey J. (2013). Value addition to sugarcane bagasse: Xylan
extraction and its process optimization for xylooligosaccharides production. Industrial
Crops and Products, 42: 14–24.
Jeffries T.W. & Jin Y.S. (2004). Metabolic engineering for improved fermentation of
pentoses by yeasts. Appl Microbiol Biotechnol, 63: 495-509.
Jennings D.H. (1984). Polyol metabolism in fungi. Adv Microb Physiol, 25: 149-193.
Jeppsson M., Johansson B., Hahn-Hagerdal B. & Gorwa-Grauslund M.F. (2002). Reduced
oxidative pentose phosphate pathway flux in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces
cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose. Appl Environ Microbiol, 68:
1604-1609.
Jiang J. (1995): Volatile metabolites produced by Kluyveromyces lactis and their changes
during fermentation. Process Biochem, 30(7): 635-640.
Jiménez J. & Van Uden N. (1985). Use of extracellular acidification for the rapid testing of
ethanol tolerance in yeasts. Biotechnology and Bioengineering, 27: 1596-1598.
Jollivet N., Bezenger M.C., Vayssier Y. & Belin J.M. (1992). Production of volatile
compounds in liquid cultures by 6 strains of Corynebacterium bacteria. Appl Microbiol
Biotechnol, 36: 790-794
Jones R.P., Pamment N. & Greenfield P.F. (1981). Alcohol fermentation by yeasts-the effect
of environmental and other variables. Process Biochemistry, 16: 42-49.
Jones R.P. & Greenfield P.F. (1982). Effect of carbon dioxide on yeast growth and
fermentation. Enz Microbiol Technol, 3: 249-257.
Jones R.P. (1989). Biological principles for the effects of ethanol. Enzyme Microb Technol, 11:
130–153.
Jones A.M. & Ingledew W.M. (1994). Fuel alcohol production: optimization of temperature
for efficient very-high-gravity fermentation. Appl Environ Microbiol, 60: 1048–1051.
Kaidi F. & Touzi A. (2001). Production de bio-alcool à partir des déchets de dattes. Rev Energ
Ren: Production et Valorisation – Biomasse, 75-78.
Kanetsuna F., Carbonell L.M., Moreno R.E. & Rodriguez J. (1972). Cell wall composition of
the yeast and mycelial forms of Paracoccidioïdes brasiliensis. J Bacteriol, 97: 1036-1041.
137
Annexes
Kargupta K., Datta S. & Sanyal K. (1998). Analysis of the performances of a continuous
membrane bioreactor with cell recycling during ethanol fermentation. Biochemical
engineering journal, 1: 31-37.
Kasemets K., Kahru A., Laht T. M. & Paalme T. (2006). Study of the toxic effect of short-and
medium-chain monocarboxylic acids on the growth of Saccharomyces cerevisiae using the
CO2 auxo acceletostat fermentation system. International Journal of Food Microbiol, 111:
206-215.
Keatig J.D., Chris P. & Shawn D.M., (2006). Tolerance and adaptation of ethanologenic
yeasts to lignocellulosic inhibitory compounds. Biotechnol Bioeng, 93: 1196–1206.
Keenan M.H.J., Rose A.H. & Silverman B.W. (1982). Effect of plasma membrane
phospholipid unsaturation on solute transport into Phanerochaete chrysosporium NCYC
366. J Gen Microbiol, 128: 2547–2556.
Kim T.H., Shin J.H., Baek H.H. & Lee H.J. (2001). Volatile flavour compounds in suspension
culture of Agastache rugosa Kuntze (Korean mint). J Sci Food Agric, 81: 569–575.
Kim D.H., Hong Y.A. & Park H.D. (2008). Co-fermentation of grape must by Issatchenkia
orientalis and Saccharomyces cerevisiae reduces the malic acid content in wine.
Biotechnol Lett, 30: 1633-1638.
Kim S. R., Baek H.H. & Shin J.H. (2013). Strain engineering of Saccharomyces cerevisiae for
enhanced xylose metabolism. Biotechnology Advances, xxx: xxx–xxx.
Kirsop B.H. (1982). Developments in Beer fermentation. In « A. Wiseman, edit. Topics in
Enzymeand fermentation Biotechnology. Ellis Horwood Limited, Chichester, 79 p».
Kitagaki H., Araki Y., Funato K. & Shimoi H. (2007). Ethanol induced death in yeast exhibits
features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway. FEBS Lett, 581: 29352942.
Klinke H.B., Thomsen A.B. & Ahring B.K. (2004). Inhibition of ethnol-producing yeast and
bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl
Microbiol Biotechnol, 66: 10–26.
Klis M. F., Pieternella M., Klaas H. & Stanley B. (2002). Dynamics of cell wall structure in
Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev, 23: 234-245.
Koenig H. (1995): Guide de mycologie médicale. Emmipses Ed., Marketing S.A. Strasbourg.,
31 p.
Kopell W. N. & Westhead E. W. (1982). Osmotic pressures of solutions of ATP and
Catecholamines relating to storage in Chromaffin Granules. The journal of biological
chemistry, 257(10): 5707-5710.
138
Annexes
Kosaric N. & Vardar-Sukan F. (2001). Lignocellulose. In « Roehr M. ed. The biotechnology of
ethanol ed., Weinheim, Germany, 125 p»
Kotter P., Amore R., Hollenberg C.P. & Ciriacy M. (1990). Isolation and characterization of
the Pichia stipitis xylitol dehydrogenase gene, XYL2, and construction of a xylose-utilizing
Saccharomyces cerevisiae transformant. Curr Genet, 18: 493-500.
Kotyk A., Horak J. & Knotkova A. (1982). Transport protein synthesis in non-growing yeast
cells. Biochem Biophys Acta, 698: 243-243.
Kreger-Van-Rij N.J.W. (1984). The yeasts, a taxonomic study. Elsevier Sci Publ, Amsterdam.
Kuila R.K., Ranganathan B., Dutta S.M. & Laxminorayana H. (1971). Introduction of
mutation in Streptococcus diacetylactis by nitrosoguanidine and ultraviolet irradiation. J
Dairy Sci, 53(3): 331-334.
Kunkee R. E. & Ough C. S. (1966). Multiplication and fermentation of Saccharomyces
cerevisiae under carbon dioxide pressure in wine. Appl Microbiol, 14(4): 643-648.
Kurtzman C.P. & Robnett C.J. (1997). Identification of clinically important ascomycetous
yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal
DNA gene. J Clin Microbiol, 38: 1216-1223.
Kurtzman C.P. & Robnett C.J. (1998). Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts
from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie
Van Leeuwenhoek, 73: 331-371.
Kuyper M., Harhangi H.R. & Stave A.K. (2003). High-level functional expression of a fungal
xylose isomerase: the key to efficient ethanolic fermentation of xylose by Saccharomyces
cerevisiae? FEMS Yeast Res, 4: 69-78.
Kuyper M., Winkler A.A., Van Dijken J.P. & Pronk J.T. (2004). Minimal metabolic
engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a
proof of principle. FEMS Yeast Res, 4: 655-664.
Kwon Y.J., Wang F. & Liu C.Z. (2011). Deep-bed solid state fermentation of sweet sorghum
stalk to ethanol by thermotolerant Issatchenkia orientalis IPE 100. Bioresour Technol, 102:
11262-11265.
Lachance M.A., Rosa C.A., Starmer W.T., Schlag-Ealer B., Barker J.S.F. & Bowles M. (1998).
Wickerhamiella australiensis, Wickerhamiella cacticola, Wickerhamiella occidentalis,
Candida drosophilae and Candida lipophila, five new related yeast species from flowers
and associated insects. International Journal of Systematic Bacteriology, 48: 1431-1443.
139
Annexes
Lachance M.A., Starmer W.T., Rosa C.A., Bowles J.M., Barker J.S. & Janzen D.H. (2001).
Biogeography of the yeasts of ephemeral flowers and their insects. FEMS Yeast Res, 1: 18.
Lachance M.A., Daniel H.M., Meyer W., Prasad G.S., Gautam S.P. & Boundy-Mills K. (2003).
The D1/D2 domain of the large-subunit rDNA of the yeast species Clavispora lusitaniae is
unusually polymorphic. FEMS Yeast Res, 4: 253-258.
Lachance M.A., Bowles J.M., Wiens F., Dobson J. & Ewing C.P. (2006). Metschnikowia
orientalis sp. nov., an Australasian yeast from nitidulid beetles. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 2489–2493.
Lacroix C. & Yildirim S. (2007). Fermentation technologies for the production of probiotics
with high viability and functionality. Curr Opin Biotechnol, 18: 176-183.
Lai Q.P. (2010). Utilisation des levures non-Saccharomyces en œnologie : études des
interactions entre Torulaspora delbrueckii et Saccharpmyces cerevisiae en cultures
mixtes. Thèse de Doctorat, Université de Toulouse.
Laluce C., Souza C. S., Abud C. L., Gattas E. A. L. & Walker G. M. (2002). Continuous ethanol
production in a nonconventional five-stage system operatingh with yeast cell recycling at
elevated temperatures. J Ind Microbiol Biotechnol, 29: 140-154.
Lanciotti R., Gianotti A. & Patrignani F. (2004). Use of natural aroma compounds to improve
shelflife and safety of minimally processed fruits. Tren Food Sci Technol, 15: 201–208.
Larpent J.P. (1991). Biotechnologie des levures. Ed Masson, Paris, 445 p.
Larpent-Gourgaud M. & Sanglier J.J. (1992). Biotechnologies: Principes et Méthodes. Ed
DOIN, Paris, 553 p.
Lasko P.F. & Brandiss M.C. (1981). Proline transport in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol,
148: 241-247.
Laubscher P.J. & Viljoen B.C. (1999). The resistance of dairy yeasts against commercially
available cleaning compounds and sanitizers. Food Technol Biotechnol, 37: 281–286.
Leao C. & Van Uden N. (1986). Effects of ethanol and other alkanols on passive proton influx
in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta, 774: 43-48.
Lee S., Villa K. & Patino H. (1995).Yeasts strain development for enhanced production of
desirable alcohols in beer. J Amer Soc Brew Chem, 53(4): 153-156.
Lee J.H., Lim Y.B., Koh J.H. , Baig S.Y. & Shin H.T. (2002). Screening of thermotolerant
yeast for use as microbial feed additive. J Microbiol Biotechnol, 12: 162-165.
140
Annexes
Lee S. H., Lim J.H. & baig S.Y. (2012). Effects of NADH-preferring xylose reductase expression
on ethanol production from xylose in xylose-metabolizing recombinant Saccharomyces
cerevisiae. Journal of Biotechnology, 158: 184 – 191.
Lei F., Rotboll M. & Jorgensen S. B. (2001). A biochemically structured model for
Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol, 88: 205-221.
Lei J., Zhao X., Ge X. & Bai F. (2007). Ethanol tolerance and the variation of plasma
membrane composition of yeast floc populations with different size distribution. J
Biotechnol, 131: 270-275.
Lerch K. & Schilling B. (1992). Towards applying molecular genetics for natural flavors. In
“12th International congress of flavours, gragans and essential oils”. Vienne. Austria. 4-5
octobre, pp 157-163.
Lester G.E. & Crosby K.M. (2004). Human wellness compounds in Honeydew fruit :
influence of cultivar and environment ; ISHS Acta Horticulturae 639: XXVI International
Horticultural Congress: Expanding Roles for Horticulture in Improving Human Well-Being
and Life Quality.
Leveau J.Y. & Bouix M. (1979). Etude des conditions extrêmes de croissance des levures
osmophiles. Ind Alim Agric, 11: 1147-1151.
Lévi J.D., Shennan J.L. & Ebbon P. (1979). Biomass from liquid n-alkanes. Microbial Biomass,
12: 361-362.
Leyral G. & Vierlin E. (2007). Microbiologie et toxicologie des aliments: Hygiène et sécurité
alimentaires, édit Wolters Kluwer, Amsterdam, 287 p.
Lipke N. P. & Ovalle R. (1998). Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New
Challenges. J Bacteriol, 180(5): 3735-3740.
Liu Z.L. (2006). Genetic dissection of ethanol tolerance in the budding yeast Saccharomyces
cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 7: 27-36.
Liu Z.L., Ma M. & Song M.(2009). Evolutionarily engineered ethanologenic yeast detoxifies
lignocellulosic biomass conversion inhibitors by reprogrammed pathways. Mol Genet
Genomics, 282: 233-244.
Liu T.M., Wang H.H., Wang K., Wang H., Zhao X.B. & Tang Y.Q. (2012). Enology
chatacteristics of yeasts Saccharomyces cerevisiae and Hanseniaspora uvarum selected
for chinese original wine. In: International conference on future Materials Engineering
and Industry Application. ICFMEIA Island., pp:233-239.
141
Annexes
Livingston D.M. (1977). Inheritane of 2µm DNA plamid from Saccharomyces. Genetics, 86:
73-84.
Lo Presti F., Riffard S., Meugnier H., Reyrolle M., Lasne Y., Grimont, P.A.D…. & Freney J.
(2001). Legionella gresilensis sp. nov. and Legionella beliardensis sp. nov., isolated from
water in France. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51:
1949–1957.
Lodder J. (1970). Criteria and methods used in classification. In «loddder ed, The yeasts. A
taxonomic study. North Holland Publishing Compagny, 84 p».
Lodder J. (1971). The yeasts. A taxonomic study. North Holland Publishing Campany.,
Amsterdam., London.
Lourens-Hattingh A. & Viljoen B.C. (2002). Survival of dairy-associated yeasts in yoghurt and
yoghurt-related products. Food Microbiology, 19: 597-604.
Lu C. (2007). Elucidating physiological roles of Pichia stipitis alcohol dehydrogenases in
xylose fermentation and shuffling promoters for multiple genes in Saccharomyces
cerevisiae to improve xylose fermentation, ProQuest, Wisconsin-Madison, 166 p.
Lugay J.C. (1986). Biogeneration of aromas. An industrial perspective. In: Parliment T,
Croteau R, eds. Biogeneration of Aromas. American Chemical Society, ACS Symposium
Series 317, pp. 11–17.
Ma M. & Liu L.Z. (2010). Quantitative transcription dynamic analysis reveals candidate genes
and key regulators for ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology, 10:
169-170.
Maier A., Volker B., Boles E. & Fuhrmann G.F. (2002). Characterisation of glucose transport
in Saccharomyces cerevisiae with plasma membrane vesicles (counter transport) and
intact cells (initial uptake) with single Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt6, Hxt7 or Gal2
transporters. FEMS Yeast Res, 2: 539-550.
Maiorella B.L., Blanch H.W. & Wilke C.R. (1984). Economic evaluation of alternative ethanol
fermentation process. Biotechnol Bioeng, 26: 1003-1025.
Maleszka R. & Schneider G. (1982). Fermentation of D-xylose, xylitol and D-xylulose by
yeasts. Can J Microbiol, 28: 360-367.
Mallouchos A., Komaitis M. & Koutinas A. (2002). Wine fermentations by immobilized and
free cells at different temperatures. Effect of immobilization and temperature on volatile
by-products. Food Chem, 80: 109–113.
Manabu S., Mitsui I. & Seizo Y. (1994). Evaluation of the alkaline methylene blue staining
method for yeast activity determination. J fermentation Bioeng, 78: 212-216.
142
Annexes
Manners D.J. & Masson A.J. (1969). The structure of two glucans yeast cell walls. F E B S
Letters, 4: 122-124.
Marden J. P. (2007). Contribution à l'étude du mode d'action de la levure saccharomyces
cerevisiae sc 47 chez le ruminant : Approche thermodynamique chez la vache laitière.
Thèse de Doctorat, Université de Toulouse.
Maréchal P. A., Martinez I., Poirier I. & Gervais P. (1999). The importance of the kinetics of
application of physical stresses on the viability of microorganisms: significance for
minimal food processing. Trends in food science and technology, 10: 15-20.
Martorell P., Stratford M., Steels H., Fernandez-Espinar M.T. & Querol A. (2007).
Physiological characterization of spoilage strains of Zygosaccharomyces bailii and
Zygosaccharomyces rouxii isolated from high sugar environments. Int J Food Microbiol,
114: 234-242.
Matallah M.A.A. (2004). Contribution à l'étude de la conservation des dattes de la variété
Deglet-Nour: Isotherme d'adsorption et de désorption. Mémoire d’ingénieur INA. Alger.
Mayer B. G. (1990). Nouvelles applications pour l’industrie alimentaire. Bios, 21(3): 47-55.
Mayer B.G. (1991). Les matières premières de l’aromatisation. Pour la science, 160 (2): 3039.
Mc Ellan J.W.L. & Lampin J.O. (1969). Phosphomannane In Enzyme required for the
formation of yeast protplasts. J Bact, 95: 967-974.
McLean D., Holcomb J., Maxwell K. & Somes J. B. (2001). A novel method for quantitation
of active yeast cells. Technical Report, 2: 1-5.
Merico A., Capitanio D., Vigentini I., Ranzi B.M., Compagno C. (2003). Aerobic sugar
metabolism in the spoilage yeast Zygosaccharomyces bailii. FEMS Yeast Res, 4:277-283.
Millar D.G., Griffiths-Smith K., Algar E. & Scopes R.K. (1982). Activity and stability of
glycolytic enzymes in the presence of ethanol. Biotechnol Lett, 4: 601-606.
Mingorance-Cazola L., Clemente-Jimenez J.M., Martınez-Rodrıguez S., Las Heras-Vazquez
F.J. & Rodriguez-Vico F. (2003). Contribution of different natural yeasts to the aroma of
two alcoholic beverages. World J Microbiol Biotechnol, 19: 297–304.
Moll N. & Moll M. (1990). Additifs alimentaires et auxiliaires technologiques. Edit Masson.
Paris. 83 p.
Moore K.J., Johnson M.G. & McClary S.P. (1988). Disk inoculums-solid medium method to
test carbon and nitrogen assimilation by yeast isolates. Appl Environ Microbiol, 54: 31853186.
143
Annexes
Morita Y., Nakamori S., Takagi H. (2003). L-proline accumulation and freeze tolerance of
Saccharomyces cerevisiae are caused by amutation in the PRO1 gene encoding gammaglutamyl kinase. Appl Environ Microbiol, 69: 212–219.
Nabais R.C., Sa Correia I., Viegas C.A. & Novais J.M. (1988). Influence of calcium ion on
ethanol tolerance of Saccharomyces bayanus and alcoholic fermentation by yeasts. Appl
Environ Microbiol. 54: 2439–2446.
Naumov G.I. & Naumova E.S. (2010). Comparative genetics of yeasts: a novel
betafructosidase gene SUC8 in Saccharomyces cerevisiae. Genetika, 46: 364-372.
Neumann N.P. & Lampen J.O. (1967). Purification and properties of yeast invertase.
Biochemistry, 6: 468-475.
Nevoigt E. & Stahl U. (1997). Osmoregulation and glycerol metabolism in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev, 21: 231-241.
Ni H., Laplaza J.M. & Jeffries T.W. (2007). Transposon mutagenesis to improve the growth of
recombinant Saccharomyces cerevisiae on D-xylose. Appl Environ Microbiol, 73: 20612066.
Nickerson W.Y. & Falcone G. (1956). Identification of protein disulfide reductase as a cellular
division enzyme in yeasts. Science N Y, 124: 722-723.
Nissen T.L., Hamann C.W., Kielland-Brandt M.C., Nielsen J. & Villadsen J. (2000). Anaerobic
and aerobic batch cultivations of Saccharomyces cerevisiae mutants impaired in glycerol
synthesis. Yeast, 16: 463-474.
Nomura K., Ogura H. & Alloga V. (2001). Direct synthesis of 2-phenylethanol by
hydrogenation of methylphenylacetate using homogeneous ruthenium-phosphine
catalysis under low hydrogen pressure. J Mol Catal A Chem, 166: 345–349.
Odds F.C. (1995). Les agents antifongiques: leur passé, leur présent et leur avenir. Bull Soc Fr
Microbiol, 10: 285-293.
Okamoto K., Ogata W. &Shimodo H. (2012). Efficient xylose fermentation by the brown rot
fungus Neolentinus lepideus. Enzyme and Microbial Technology, 50: 96–100.
Okuma Y., Endo A., Iwasaki H., Ito Y. & Goto S. (1986). Isolation and properties of ethanolusing yeasts with acid and ethanol tolerance. J Ferment Technol, 64: 379-382.
Omelianski V.L. (1923). Aroma-producing microorganisms. J Bacterial, 8 (10): 393-419.
Omori T., Ogawa K., Umemoto Y., Yuki Y., Yhajaira Y., Shimoda M. & Wada H. (1996).
Enhancement of glycerol production by brewing yeast (Saccharomyces cerevisiae) with
heat-shock treatement. J Ferm Bioeng, 82: 187-190.
144
Annexes
Ozcan S. & Johnston M. (1999). Function and regulation of yeast hexose transporters.
Microbiol Mol Biol Rev, 63: 554-569.
Ozcan S., Vallier L.G., Flick J.S., Carlson M. & Johnston M. (1997). Expression of the SUC2
gene of Saccharomyces cerevisiae is induced by low levels of glucose. Yeast, 13: 127-137.
Pampulha M. E. & Loureiro-Dias M. C. (2000). Energetics of the effect of acetic acid on
growth of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett, 184: 69-72.
Pando Bedrinana R., lastra Queipo A. & Suarez Valles B. (2011). Screening of enzymatic
activities in non-Saccharomyces cider yeasts. Journal of Food Biochemistry, 11: 175-179.
Pannala V.R., Bhat P.J., Bhartiya S. & Venkatesh K.V. (2010). Systems biology of GAL
regulon in Saccharomyces cerevisiae. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med, 2: 98-106.
Parfait A. & Jouret C. (1975). Formation des alcools supérieurs dans les rhums. Ann Technol
Agric, 24(3-4): 421-436.
Parrou J.L., Jules M., Beltran G., François J.M. (2005). Acid trehalase in yeasts and
filamentous fungi: localization, regulation and physiological function. FEMS Yeast Res, 5(6-7):
503-51.
Payne J.W. & Nisbet T.M (1981). Continuous monitoring of substrate uptake by
microorganisms using fluorescamine: Application to peptide transport by Saccharomyces
cerevisiae and Streptococcus faecalis. J Appl Biochem, 3: 447-458.
Peat S., Turvey J.R. & Doyle D. (1961). The polysaccharides of backer’s yeast V.A. Further
study of the mannan. J Chem Soc, 7: 3918-3923.
Peyvatin J.L., Jallageas J.C., Crouzet J. & Richard H. (1986). Arômes et parfums. Biofutur, 10:
19-30.
Phaff H.J., Miller M.W. & Mrak E.M. (1978). The life of yeast. Harward Unversity Press.
Cambridge, London.
Pham H.T.B., Larsson G. & Enfors S.O. (1998). Growth and energy metabolism in aerobic
fed-batch cultures of Saccharomyces cerevisiae: simulation and model verification.
Biotechnol Bioeng, 60: 474-482.
Pillivuyt G. (1991). Histoire du parfum. Edit Denoël, Paris, 235 p.
Pina C., Santos C., Couto J. A. & Hogg T. (2004). Ethanol tolerance of five non
Saccharomyces wine yeasts in comparison with a strain of Saccharomyces cerevisiae
influence of different culture conditions. Food Microbiology, 21: 439-447.
Piper P.W. (1995). The heat shock and ethanol stress responses of yeast exhibit extensive
similarity and functional overlap. FEMS Microbiol Lett, 134: 121-127.
145
Annexes
Pollack J.H. & Hashimoto T. (1987). The role of glucose in the pH regulation of germ-tube
formation in Candida albicans. J Gen Microbiol, 133: 415-424.
Postgate J. R. (1967). Viable counts and viability. Methods in Microbiology. Norris J. R. and
Ribbons D. W. Eds., Academic Pres&²s. 611 p.
Potts M. (1994). Desiccation tolerance of prokaryotes. Microbiological Reviews, 7: 755-805.
Praphailong W. & Fleet G.H. (1997). The effect of pH, sodium chloride, sucrose, sorbate and
benzoate on the growth of spoilage yeasts. Food Microbiol, 14: 459–468.
Ragauskas A.J., Williams C.K. & Davison B.H. (2006). The path forward for biofuels and
biomaterials. Science, 311: 484-489.
Rahary L., Poulain D., Reisinger O., Lematre J. & Bonaly R. (1984). Action de la cytohélicase
sur les tubes germinatifs de Candida albicans. Bull Soc Franc Mycol Med, 13: 187-193.
Rambaud J. C. (2004). Flore microbienne intestinale: Physiologie et pathologie digestives.
Edit John Libbey Eurotext, Paris, 247 p.
Reed G. (1983). Prescott et Dunn’s Industrial Microbiology. Edit. Avi Publishing Co. Inc.
Westport. 87 p.
Ribereau-Gayon P., Dubourdieu D., Donèche B. & Lonvaud A. (1998). Traité d’œ
nologie. Tome 1. Microbiologie du vin. Vinification. Édition Française.
Rocco K.A., Galligan P., Little K.J. & Spurgash A. (1985). A rapid bioluminescent ATP method
for determining yeast contamination in a carbonated beverage. Food Technology, 39: 4952.
Rojas V., Gil J.V. & Pinaga F. (2001): Studies on acetate ester production by nonSaccharomyces wine yeasts. Int J Food Microbiol, 70: 283–289.
Romero D.A. (1992). Bacteria as potential sources of flavor metabolites. Food technol, Nov:
122-126.
Roon R.J., Even H.L., Dunlop P. & Larimore F.L. (1975). Methylamine and ammonium
transport in Saccharomyces cerevisiae. J Bact, 122: 502-509.
Rose A. H. & Harrison J. S. (1971). The yeast. Vol. 4, 2éme edition. 297 p.
Rose A. H. (1980). Recent research on industrially important strains of Saccharomyces
cerevisiae. In: F.A. Slainner, S.M. Passmor and R.R. Davelopeds, Biology and Activity of
Yeast, Academic Press, London, p. 103 p.
146
Annexes
Rose A.H. (1987). Responses to the chemical environment. In «Rose A.H., Harrison J.S. edit.
the Yeasts, Volume 2, 2nd edition, Physiology and biochemistry of yeasts, Academic Press,
Londres, Royaume-Uni, 5 p».
Rose A.H. & Harrison J.S. (1987). The yeasts. Volume 3., Academic Press., London.
Roukas T. (1994). Ethanol production from non sterilized carbon pod extract by free and
immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture. Biotech bioeng,
43(3): 189 – 194.
Ryder D. N. & Sinclair C. G. (1972). Model for the growth of aerobic microorganisms under
oxygen limiting conditions. J Ferment Technol, 14: 787-798.
Ryu D. D., Kim Y. J. & Kim J. H. (1984). Effect of air supplement on the performance of
continuous ethanol fermentation system. Biotech Bioeng, 26(1): 12-16.
Sainz J., Pizarro F., Pérez-Correa J.R. & Agosin E. (2003). Modeling of yeast metabolism and
process dynamics in batch fermentation. Wiley periodicals Inc, 8: 818-828.
Salmon J.M., Vincent O., Mauricio J.C., Bely M. & Barre P. (1998). Sugar transport inhibition
and apparent loss of activity in Saccharomyces cerevisiae as a major limiting factor of
enological fermentations. Am J Enol Vit, 44: 127-133.
Saloheimo A., Rauta J., Stasyk O.V., Sibirny A.A., Penttila M. & Ruohonen L. (2007). Xylose
transport studies with xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains expressing
heterologous and homologous permeases. Appl Microbiol Biotechnol, 74: 1041-1052.
San-Blast G. (1979). Biosynthesis of glucans by subcellular fractions of Paracoccidioides
brasiliensis. Exp Mycol, 3: 249-258.
Sanchez Y. G. (2008). Etude de l’adaptation et de la gestion de l’activité cellulaire dans un
bioréacteur biétagé: intensification de la production d’éthanol. Thèse de Doctorat,
Université de Toulouse.
Santos E., Rodriguez L., Elorza M.V. & Sentendreu R. (1982). Uptake of sucrose by
Saccharomyces cerevisiae. Arch Biochem Biophys, 216: 652-660.
Sarkar N., Ghosh S. K., Bannerjee S. & Aikat K. (2012). Bioethanol production from
agricultural wastes: an overview. Renewable Energy, 37: 19–27.
Satyanarayana T. & Kunze G. (2009). Yeast Biotechnology: Diversity and Applications,
Springer Science, New Delhi, 744 p.
Savina J.P., Kohler D. & Brunerie P. (1999). Method for extracting 2-phenylethanol. Patent
US 005965780A.
147
Annexes
Scherr G.H. & Weaver R.H. (1953). The dimorphism phenomenon in yeasts. Bact Rev, 17: 5192.
Schmidt J.L. & Lenoir J. (1978). Contribution à l’étude de la flore levure du fromage de
Camembert. Son évolution au cours de la maturation. Le Lait, 577: 355-370.
Schmidt J.L., Graffard C. & Lenoir J. (1979). Contribution à l’étude des aptitudes
biochimiques de levures isolées du fromage de Cambert: Essais préliminaires. Le Lait, 59:
142-163.
Schmidt J.L. (1984). La flore levure des fromages in «Lavoisier Diffusion edit, Le fromage,
Paris, 265 p».
Schobert B. (1977): Is there an osmotic regulatory mechanism in algae and higher plants? J
Theor Biol, 68: 17-23.
Schreier P. (1995): Use of enzymes in flavor biotechnology. In the “ 7th European Congress
on Biotechnology”. 19-23 fevrier. Nice. France.
Schurr A. & Yagile Y. (1971). Regulation and characterization of alkaline phosphate in yeast.
J Gen Microbiol, 65: 291-303.
Scragg A.H. (1997). The production of aromas by plant cell cultures. In «Scheper P ed,
Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Vol. 55: 239–263. Springer, Berlin,
Germany».
Seitz E.W. (1991). Flavor building bloks. In « Goldberg I and Williams R. Eds, Biotechnology
and Food Ingrdients, Van Nostrand reinhold, New-York, 375 p».
Sekine T., Kawaguchi A., Hamano Y. & Takagi H. (2007). Desensitization of feedback
inhibition of the Saccharomyces cerevisiae gamma-glutamyl kinase enhances proline
accumulation and freezing tolerance. Appl Environ Microbiol, 73: 4011–4019.
Senet J.M. (1995). Phénomènes d’adhérence et molécules impliquées dans l’interaction
entre la levure Candida et son hôte. Bull Soc Fr Microbiol, 10(4): 279-283.
Seo SH, Rhee CH & Park HD (2007). Degradation of malic acid by Issatchenkia orientalis
KMBL 5774, an acidophilic yeast strain isolated from Korean grape wine pomace. J
Microbiol, 45: 521–527.
Serp D., Von Stockar U. & Pinga L. (2003). Enhancement of 2-phenylethanol productivity by
Saccharomyces cerevisiae in two-phase fed-batch fermentations using solvent
immobilization. Biotechnol Bioeng, 82: 103–110.
Serrano R. & Delafuente G. (1974). Regulatory properties of the constitutive hexose
transport in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biochem, 5(3): 161–171.
148
Annexes
Shin H.T., Lim Y.B., Koh J.H., Kim J.Y., Baig S.Y. & Lee J.H. (2002). Growth of Issatchenkia
orientalis in Aerobic Batch and Fed-batch Cultures. The Journal of Microbiology, 40(1): 8285.
Silva J. P. A., Silpa H. & Danevort K. (2012). Fermentation medium and oxygen transfer
conditions that maximize the xylose conversion to ethanol by Pichia stipitis. Renewable
Energy, 37: 259-265.
Singh G. P., Volpe G., Creely C. M., Grötsch H., Geli I. M. & Petrov D. (2006). The lag phase
and G1 phase of a single yeast cell monitored by Raman microespectroscopy. J of Raman
spectroscopy, 37: 858-864.
Skkiner F.A., Passmore S.M. & Davenport R.R. (1980). Biology and activities of yeasts.
Academic Press, New York.
Sonderegger M. & Sauer U. (2003). Evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae
for anaerobic growth on xylose. Appl Environ Microbiol, 69: 1990-1998.
Sonnleitner B. (1998). Dynamic adaptation of microbes. J Biotechnol, 65: 47-60.
Souciet J.L., Dujon B., Gaillardin C., Johnston M., Baret P.V., Cliften P., … & Talla E. (2009).
Comparative genomics of protoploid Saccharomycetaceae. Genome Res, 19(10): 1696-1709.
Stambuk B.U., da Silva M.A., Panek A.D. & de Araujo P.S. (1999). Active alpha-glucoside
transport in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett, 170: 105-110.
Starck D., Münch T. & Sonnleitner B. (2002). Extractive bioconversion of 2-phenylethanol
from L-phenylalanine by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Progr, 18: 514–523.
Starck D., Zala D. & Münch T. (2003). Inhibition aspects of the bioconversion of Lphenylalanine to 2-phenylethanol by Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microbiol
Technol, 32: 212–223.
Stewart G.G. & Russell I. (1983). Yeast floculation. In « Pollock J.R.A. Edit, Brewing Science,
London Ac. Press, 2: 61-91 »
Suarit R., Gopal P. K. & Sherped M. G. (1988). Evidence for a glycosidic linkage between
chitin and glucan in the cell wall of Candida albicans. J Gen Microbiol, 134: 2359-2368.
Sun Z., Lv G., Li S., Xie Y., Yu W., Wang W. & Ma X. (2007). Probing the role of micro
environment for microencapsulated Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress.
Journal of Biotechnology, 128: 150-161.
Suzzi G., Lanorte M.T., Galgano F., Andrighetto C., Lombardi A., Lanciotti R., Guerzoni M.E.
(2001). Proteolytic lipolytic and molecular characterisation of Yarrowia lipolytica isolated
from cheese. Int J Food Microbiol, 69: 69–77.
149
Annexes
Swan T.M. & Watson K. (1998). Stress tolerance in a yeast sterol auxotroph: role of
ergosterol, heat shock proteins and trehalose. FEMS Microbiol Lett, 169: 191-197.
Tagaki H., Takaoka M., Kawaguchi A. & Kubo Y. (2005). Effect of L-proline on sake brewing
and ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environm Microbiol, 12: 8656-8662.
Takagi H. (2008). Proline as a stress protectant in yeast: physiological functions, metabolic
regulations, and biotechnological applications. Appl Microbiol Biotechnol, 81: 211–223.
Teixeira M.C., Raposo L.R., Mira N.P., Lourenco A.B. & Sa-Correia I. (2009). Genome-wide
identification of Saccharomyces cerevisiae genes required for maximal tolerance to
ethanol. Appl Environ Microbiol, 75: 5761–5772.
Teste M.A., François J.M. & Parrou J.L. (2010). Characterization of a New Multigene Family
Encoding Isomaltases in the Yeast Saccharomyces cerevisiae, the IMA Family. Journal of
Biological Chemistry, 285(35): 26815-26824.
Thalagala T. A., Kodama T. P., Mishima S., Isono T., Furujyo N., Kawasaki A. & Hisamatsu
M. (2009). Study on ethanol fermentation using D-glucose rich fractions obtained from
lignocelluloses by a two-step extraction with sulfuric acid and Issatchenkia orientalis MF
121. J Appl Glycosci, 56: 7–11.
Thomas D.S. & Rose A.H. (1979). Inhibitory effect of ethanol on growth and solute
accumulation by Saccharomyces cerevisiae as affected by plasma-membrane lipid
composition. Arch Microbiol, 122: 49-55.
Thomas K. C. & Inglewed W. M. (1992). Production of 21% (v/v) ethanol by fermentation of
very high gravity (VHC) wheat mashes. J Microbiol, 10: 61-68.
Thomas K.C., Hynes S.H., Jones A.M. & Ingledew W.M. (1993). Production of fuel alcohol
from wheat by VHG technology. Appl Biochem Biotechnol, 43: 211-226.
Thomas K.C., Hynes S.H. & Ingledew W.M. (2002). Influence of medium buffering capacity
on inhibition of Saccharomyces cerevisiae growth by acetic and lactic acids. Appl Environ
Microbiol, 68: 1616-1623.
Timson D.J. (2007). Galactose metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Dynamic
Biochemistry. Process Biotechnology and Molecular Biology, 1: 63-73.
Toivari M.H., Salusjarvi L., Ruohonen L. & Penttila M. (2004). Endogenous xylose pathway in
Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol, 70: 3681-3686.
Torija M.J., Beltran G., Novo M., Poblet M., Rozès N., Mas A. & Guillamón J.M. (2003)
Effect of organic acids and nitrogen source on alcoholic fermentation: study of their
buffering capacity. J Agric Food Chem, 51(4): 916 -922.
150
Annexes
Triveldi N.B., Jacobson G.K. & Tesch W. (1986). Backers yest, CRC Crit. Rev Biotechnol, 4: 7583.
Usseglio-Tomasset L. (1989). Chimisme des fermentations. In « Chimie Œnologique ». Tech
& Doc. Lavoisier, Ed, AEB. Vendôme. pp 108-133.
Van Dijken J. P. & Scheffers W. A. (1986). Redox balances in the metabolism of sugars by
yeasts. FEMS Microbiology Reviews, 32: 199-224.
van Dijken J.P. & Pronk J.T. (1995). Regulation of carbon metabolism in chemostat cultures
of Saccharomyces cerevisiae grown on mixtures of glucose and ethanol. Yeast, 11: 407418.
Van Maris A.J., Winkler A.A., Kuyper M., de Laat W.T., van Dijken J.P. & Pronk J.T. (2007).
Development of efficient xylose fermentation in Saccharomyces cerevisiae: xylose
isomerase as a key component. Adv Biochem Eng Biotechnol, 108: 179-204.
Van Uden N. (1985). Ethanol toxicity and ethanol tolérance in yeast. Ann Rep Ferm Proc, 8:
11-58.
Vasconcelos J. N., Lopes C. E. & França F. P. (2004). Continuous ethanol production using
yeast immobilized on sugar-cane stalks. Brazilian Journal of chemical engineering, 21(3):
357-365.
Veenhuis M., Van Dijen J.P. & Harder W. (1983). The significance of peroxisome in the
metabolism of one carbon compounds in yeasts. Adv Microb Physiol, 24: 1-11.
Verduyn C., Postma E., Scheffers W.A. & Van D.J. (1992). Effect of benzoic acid on metabolic
fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic
fermentation. Yeast, 8: 501-517.
Vergeade J., Guiraud J., Larpent J.P. & Galzy P. (1976). Etude de la flore levure du SaintNectare. Le Lait, 56: 555-556.
Vidotto V., Picero G., Caramello S. & Paniate G. (1988). Importance of some factor son the
dimorphism of Candida albicans. Mycopathologie, 104: 120-135.
Voit E. O. (2003). Biochemical and genomic regulation of the trehalose cycle in yeast: review
of observations and canonical model analysis. J Theoretical Biology, 223: 55-78.
Waldron K. (2010). Bioalcohol production: Biochemical conversion of lignocellulosic
biomass, Woodhead Publishing Limited and CRC Press LLC, Cornwall, 476 p.
Walker G. M. & White N. A. (2005). Introduction to Fungal Physiology. In «Kavanagh K.,
Fungi: Biology and applications, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 267 p.»
151
Annexes
Wang F. Q., Gao C. J., Yang C. Y. & Xu P. (2007). Optimization of an ethanol production
medium in very high gravity fermentation. Biotechnol Lett, 29: 233-236.
Wang Y., Kang W., Xu Y. & Li J. (2011). Effect of different indigenous yeast β-glucosidases on
the liberation of bound aroma compounds. Journal of the Institute of Brewing, 117(2):
230-237.
Wani M.A., Sanjana K., Kuman D.M. & Lal D.K. (2010). GC-MS analysis reveals production of
2-phenylethanol from Aspergillus niger endophytic in rose. J of Basic Microbiology, 50:
110-114.
Ward O. P. (1989). Fermentation: biotechnology, principles, processes and products.
Prentice Hal, New Jersey, USA.
Watanabe M., Tamura K., Magbanua J. P., Takano K., Kitamoto K., Kitagaki H., Akao T. &
Shimoi H. (2007). Elevated expression of genes under the control of stress response
element (STRE) ad Msn2p in an Ethanol- tolerance sake yeast kyokai No. 11. J Bioscience
Bioeng, 104(3): 163-170.
Watson K. & Rose A. H. (1980). Fatty-acyl composition of the lipids of Saccharomyces
cerevisiae grow aerobically or anaerobically in media containing different fatty acids. J of
Gen Microbiol, 117: 225-233.
Watson J. D., Hopkins N. H., Roberts J. W., Stteitz J. A. & Wainer A. M. (1987). Yeast as the
E. coli of eucaryotic cell. Molecular biology of the gene, Benjamin-Cummings: 550-593.
Wei P., Li Z., lin Y., He P. & Jiang N. (2007). Improvement of the multiple-stress tolerance of
an ethanologenic Saccharomyces cerevisiae strain by freeze-thaw treatment. Biotechnol
Lett, 29(10): 1501-1508.
Welsh F.W., Murray W.D. & Williams R.E. (1989). Microbiological and enzymatic production
of flavor and fragrance chemicals. C R Biotechnol, 9: 105-169.
Wenger J.W., Schwartz K. & Sherlock G. (2010). Bulk segregant analysis by high-throughput
sequencing reveals a novel xylose utilization gene from Saccharomyces cerevisiae. PLoS
Genet, 6: e1000942.
Winter J. (1988). Fermentation alcoolique par Saccharomyces cerevisiae: Contribution à
l‘étude du contrôle de la dynamique fermentaire par l’inhibition et les facteurs
nutritionnels. Thèse Institut National des Sciences Appliquées, Toulouse.
Wood J. M. (1999). Osmosensing by bacteria: signals and membrane-based sensors.
Microbiology and molecular biology reviews, 230-262.
Woodward J.R. & Kornberg H.L. (1980). Membrane proteins associated with amino acid
transport by yeast (Saccharomyces cerevisiae). Biochemical Journal, 192: 659-664.
152
Annexes
Wyder M.T. & Puham Z. (1999). Role of selected yeasts in cheese ripening: An evaluation in
aseptic cheese curd slurries. International Dairy Journal, 9(2): 117-124.
Wyman C.E. (2001). Twenty years of trials, tribulations, and research progress in bioethanol
technology: selected key events along the way. Appl Biochem Biotechnol, 91: 5-21.
Xu P. & Lou M. (2012). Xylose: Production, consumption and health Benefits, Nova Science
Publishers, New York, 176 p.
Yong F.M. & Lim G. (1986). Effect of carbon source on aroma production by Trichoderma
viride. J Appl Microbiol Biotechnol, 2: 483-488.
Yong F.M., Wong H.A. & Lim G. (1985). Effect of nitrogen source on aroma production by
Trichoderma viride. Appl Biotechnol, 22: 146-147.
Yoshida M., Hirao M., Yokobayashi Y., Shiosaka M. & Sugimoto K. (1973). Process for
preparing low molecular weight amyloses. (Hayashibara Company) UNITED STATES
PATENT AND TRADEMARK OFFICE GRANTED PATENT, May 1973 patno: US3730840.
You K.M., Rosenfield C.L. & Knipple D.C. (2003). Ethanol tolerance in the yeast
Saccharomyces cerevisiae is dependent on cellular oleic acid content. Appl Environ
Microbiol, 69: 1499-1503.
Yuangsaard N., Yongmanitchai W., Yamada M. & Limtong S. (2013). Selection and
characterization of a newly isolated thermotolerant Pichia kudriavzevii strain for ethanol
production at high temperature from cassava starch hydrolysate. Antonie Van
Leeuwenhoek, 103: 577-588.
Zaldivar J., Nielsen J. & Olsson L. (2001). Fuel ethanol production from lignocellulose: a
challenge for metabolic engineering and process integration. Appl Microbiol Biotechnol,
56:17–34.
Zhao X.Q. & Bai F.W. (2009). Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for
efficient fuel ethanol production. Journal of Biotechnology, 144: 23–30.
Zheng Y., Huai I. & Dai O. (2013). Dilute acid pretreatment and fermentation of sugar beet
pulp to ethanol. Applied Energy, 105: 1–7.
Zhu H.Y., Xu H., Dai X.Y., Zhang Y., Ying H.J. & Ouyang P.K. (2010). Production of D-arabitol
by a newly isolated Kodamaea ohmeri. Bioprocess and Biosystems Engineering, 33(5):
565-571.
153
LISTE DES TABLEAUX
Liste des tableaux
Tableau 1: Les sources de carbone pouvant être utilisées par les levures……………………........20
Tableau 2: Provenance des échantillons biologiques utilisés pour l’isolement des levures….50
Tableau 3: Le nom et les séquences des amorces utilisés pour l’amplification des histones H3
et H4……………………………………………………………………………………………………………………………………54
Tableau 4: Résultats du séquençage des amplicons obtenus après amplification par PCR, du
domaine D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique et comparaison aux séquences de la
base de données du NCBI faites à CIRM (Grignon, Paris)……………………………………………………..69
Tableau 5: Les caractères culturaux et morphologiques des cinq souches de levure retenues
cultivées sur milieu YPD solide et liquide et incubées à 30°C …………………………………………….. 75
Tableau 6: Effet des différents stress sur les cinq souches de levures étudiées…………………..81
Tableau 7: Assimilation des substrats carbonés par les cinq espèces de levure réalisés sur la
galerie: ID 32C……………………………………………………………………………………………………………………85
Tableau 8: Croissance des cinq souches sur quatre substrats glucidiques avec leurs taux de
croissance (µ)…………………………………………………………………………………………………………………….94
Tableau 9: Productions des cinq souches sur quatre substrats glucidiques……………………… 95
155
LISTE DES FIGURES
Liste des figures
Figure 1: Nœud métabolique du pyruvate et de l'acétaldéhyde………………………………………….23
Figure 2: Voie de Leloir (métabolisme du galactose et du mélibiose)…………..……………………..24
Figure 3: Schéma simplifié de la voie métabolique de la dégradation du xylose par les
levures………………………………………………………………………………………………………………………………..27
Figure 4: Représentation schématique du fonctionnement de l’uniport électrophorétique
accumulatif responsable de l’entrée de l’ion ammonium chez Saccharomyces
cerevisiae……………………………………………………………………………………………………………………………29
Figure 5: représentation schématique des différents domaines d’utilisation de la levure……35
Figure 6: Localisation géographique des régions de récolte des différents échantillons
biologiques………………………………………………………………………………………………………………………….51
Figure 7: Le fermenteur utilisé: SARTORIUS, Biostat B Plus………………………………………………….57
Figure 8: Fermenteur SARTORIUS, Biostat B Plus avec son système d’acquisition pour le
contrôle des différents paramètres de la croissance……………………………………………………………57
Figure 9: Flacons pour la culture en anaérobiose des levures à 30°C…………………………………. 64
Figure 10: PCR des produits d’amplification (Amplicons H3 et H4) des 18 isolats de levures.68
Figure 11: Aspect des cultures des cinq souches sur YPD liquide à 30°C pendant 3 jours…….72
Figure 12: Aspect macroscopiques des colonies des cinq souches après 3 jours d’incubation
sur YPD solide à 30°C…………………………………………………………………………………………………………..73
Figure 13: Aspect microscopique des cellules des cinq souches après une culture de 24 h sur
YPD liquide à 30°C……………………………………………………………………………………………………………….74
Figure 14: Effet de la température sur les cinq souches de levure étudiées cultivées sur
milieu YPD solide…………………………………………………………………………………………………………………76
Figure 15: L’effet du pH sur les cinq souches de levure étudiées sur milieu YPD solide,
incubées à 30°C…………………………………………………………………………………………………………………. 78
Figure 16: Effet du NaCl (0,5M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une
incubation à 30°C et à 40°C…………………………………………………………………………………………………79
Figure 17: Effet du sorbitol (2M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une
incubation à 30°C et à 40°C…………………………………………………………………………………………………80
Figure 18: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YPD solides
incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)………………………………………………………………………………………...82
157
Liste des figures
Figure 19: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YNB solides
incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)……………………………………………………………………………………….. 83
Figure 20: Culture des cinq souches de levures sur les milieux YPD, YNB et MMS solides
incubées à 30°C ………………………………………………………………………………………………………………….87
Figure 21: Culture de la souche Hanseniaspora uvarum sur MMS(A) et MMS + vitamine B2, B3
et B9 (B)………………………………………………………………………………………………………………………………88
Figure 22: Cinétique des quatre souches de levures sur les milieux YPD et MMS à 30°C……..89
Figure 23: Productions des cinq souches et de la souche de référence CEN.PK122-2N après
culture sur milieux YPD et MMS et incubation à 30°C………………………………………………………….90
Figure 24: Cinétiques et productions de la souche CEN.PK122-2N (A) et de la souche
Issatchenkia orientalis (B) sur les milieux YPD et MMS après une incubation à 30°C en
anaérobiose………………………………………………………………………………………………………………………..92
Figure 25: Production d'éthanol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS) par les deux
souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)……………………………………………………………………………...93
Figure 26: Production de glycérol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS) par les
deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)……………………………………………………………………..93
Figure 27: Culture des cinq souches sur milieu YNX (2%) solide et liquide…………………………..98
Figure 28: Cinétique de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX incubées à 30°C………………………98
Figure 29: Productions de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX…………………………………………….99
Figure 30: Profil d’accumulation des alcools supérieurs (2MB, 3MB et 2PE) par les six souches
de levures étudiées sur trois milieux différents (YPD, MMS et MMS-AA)………………………….101
Figure 31: Effet du phényléthanol à 30°C et à 40°C sur YPD……………………………………………..104
Figure 32: Evolution de la croissance de la souche I. orientalis et de la proportion des cellules
viables au cours de cultures avec différentes concentrations en éthanol exogène sur deux
milieux YPD et YNB à 30°C ……………………………………………………………………………………………….108
Figure 33: Evolution cinétique de la biomasse, du glucose, de l’éthanol et co-produits au
cours d’une culture en mode batch de la souche Issatchenkia orientalis sur YNB……………..110
158

Issatchenkia orientalis

Transcription

Documents pareils

Utilisation industrielle des levures

hybridation et ogm - Institut Français de la Vigne et du Vin (IFV)

MICROCEL CW.FH10

SADOUDI Mohand

Yeast/Fungal Detox - Balanced Concepts

Maîtrise de la fermentation alcoolique sous stress éthanolique

Impact des levures sur la composition aromatique des vins

Mesure de l`activité de l`eau

Saccharomyces cerevisiae et fermentation alcoolique. Étude en