Diarrhées infectieuses - Formation technicien de laboratoire d
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Diarrhées infectieuses - Formation technicien de laboratoire d
FORMATION CONTINUE- TECHNICIEN(NE) DE LABORATOIRE Mme le Docteur Rosine BAURIAUD MCU-PH – Hôpital RANGUEIL - TOULOUSE -1- P L A N Diarrhées infectieuses 1. Définitions – Généralités 2. Diagnostic différentiel Pathologies responsables de diarrhée aiguë Diarrhées : lésionnelles - malabsorption motrices - sécrétoires Infectieuses : parasitaires - fungiques - virales 3. Physiopathologie 4. Flore physiologique intestinale La coproculture Analyse bactériologique des selles 1. Circonstances cliniques 2. Prélèvements – transports 3. Examen direct 4. Ensemencement - routine - . adulte . enfant notion de voyage malade sous traitement antibiotique TIAC recherche de portage coproculture quantitative (malade hémato-oncologique) 5.Milieux 6.Culture identification - Sensibilité aux antibiotiques – Traitement Bactéries pathogènes : Entérobactéries Salmonella Shigella Yersinia enterocolitica Aeromonas modification de la flore : Clostridium difficile E. Coli Campylobacter Klebsiella oxytoca Diarrhées infectieuses Virales Parasitaires -2- Vibrio cholerae Diarrhées infectieuses 1. Définition Une diarrhée est définie par des émissions quotidiennes trop fréquentes de selles trop abondantes, liquides ou pâteuses (poids supérieur à 300 gr/j). En pratique, on parle de diarrhée lorsqu’il y a plus de trois selles molles ou liquides par jour. La diarrhée aiguë dure en général moins de 8 à 10 jours. Elle est précédée d’un transit normal et ne récidive pas à court terme. La diarrhée chronique dure en général des mois ou des années. Un syndrome dysentérique est défini par des excrétions glaireuses et sanglantes pouvant ne pas contenir de matières fécales. Il s’y associe habituellement des épreintes et une sensation de ténesme. Les symptômes d’une toxi-infection alimentaire sont une diarrhée liquidienne, des douleurs abdominales, des vomissements, parfois de la fièvre. L’évolution est le plus souvent bénigne et spontanément résolutive en quelques jours. La diarrhée aiguë peut se définir comme une modification brutale de la fréquence et/ou de la consistance des selles évoluant depuis moins de 3 semaines. Généralités Les infections du tractus digestif se manifestent par divers syndromes regroupés sous le terme de diarrhées infectieuses aiguës. Ces infections représentent l’une des plus grandes causes de morbidité et de mortalité dans le monde (zone tropicale du tiers-monde). La prévalence des diarrhées aiguës varie en fonction de la saison, de la localisation géographique, du groupe d’âge et des conditions d’hygiène. Dans le tiers-monde, les diarrhées aiguës sont responsables de 5 à 10 millions de milliers de morts par an et représentent la première cause de mortalité infantile. En milieu occidental ou industrialisé, leur incidence (un épisode par adulte et par an en France) en fait toujours un problème majeur de santé publique. La mortalité est très basse, limitée aux malades fragilisés par leur âge ou des co-morbidités). L’origine est trouvée dans 50 % des cas. En effet, en pays développé et sur terrain sain, ce sont des maladies courtes, bénignes, guérissant spontanément, sans qu’un diagnostic étiologique ne soit utile. Par contre, il existe des formes sévères, importantes à reconnaître pour proposer un traitement adapté. Diarrhées infectieuses : un des motifs de consultations les plus fréquents en médecine générale. L’incidence connaît des fluctuations importantes selon les périodes de l’année. Habituellement revêtent un caractère aigu (infection principale cause) mais aussi chronique (chez immunodéprimé). Interrogatoire minutieux : voyage, âge patient, terrain immunodéprimé, mode de vie, existence de cas identiques, délai d’incubation, aspect de la diarrhée, les signes associés, la prise de médicaments des 5 jours précédents. Tous les épisodes diarrhéiques ne sont pas infectieux. Toutes les diarrhées infectieuses ne sont pas bactériennes (virus, parasites). Toutes les diarrhées bactériennes ne sont pas dues à une bactérie infectieuse spécifique. En effet dans certains cas, c’est un dysmicrobisme (déséquilibre dans la flore normale) qui est à l’origine de la diarrhée. -3- 2. Diagnostic différentiel des diarrhées infectieuses Diarrhée aiguë - colites inflammatoires, maladie de Crohn - rectocolite hémorragique - colites ischémiques - colites d’origine tumorale - intoxications par les champignons, toxines végétales diverses (algues, moules) Diarrhée chronique Certaines pathologies responsables de diarrhée aiguë peuvent être à l’origine de diarrhée chronique. Les principales causes sont : - diarrhée lésionnelle - cancers, lymphomes - polypose diverticulite - maladies inflammatoires du tube digestif - lésions ischémiques - diarrhée par malabsorption - certaines causes citées ci-dessus - maladie cœliaque - résection intestinale - maladie de Whipple (agent infectieux : Tropheryma whippelii) - amylose - insuffisance pancréatique - insuffisance en sels biliaires - gastrectomie et vagotomie - ischémie intestinale chronique - diarrhée motrices - neuropathies - hyperthyroïdie - diarrhées sécrétoires - tumeur endocrine - prise de laxatifs irritants - adénome villeux hyper sécrétant 3. Physiopathologie Diarrhée bactérienne 1- Invasion muqueuse et/ou production d’une cytotoxine. Dans ce cas, la diarrhée aiguë est liée à la pénétration des microorganismes dans les cellules de l’épithélium intestinal et/ou à la production d’une cytotoxine. L’atteinte siège principalement au niveau de l’iléon distal et du colon. Cette invasion est souvent responsable d’un syndrome dysentérique et de lésions muqueuses macroscopiques (iléite et/ou colite). Les souches qui en sont responsables, après une étape de colonisation (facultative) envahissent l’épithélium intestinal. Elles peuvent : - soit se multiplier au sein de l’entérocyte et créer des ulcérations de la muqueuse (colique) entraînant un syndrome dysentérique. Entrent dans ce cadre : Shigella, E. coli entéro-invasifs (« Shigella like ») et probablement Yersinia et -4- Campylobacter. L’activité entéro-invasive est sous le contrôle d’un plasmide codant la synthèse des substances responsables de la lyse tissulaire. L’élaboration des toxines, inconstante, peut également intervenir ; - soit simplement traverser des entérocytes et coloniser les ganglions ; c’est le cas des Salmonella responsables des fièvres typho-paratyphoïdiques ; ou se multiplier dans la sous-muqueuse (Salmonella responsables des gastro-entérites). Bactéries invasives - Salmonella . invasion . traversée de la muqueuse . pénétration dans la sous muqueuse . multiplication, macrophages dans les formations lymphoïdes (plaques de Peyer) . inflammation et exsudation liquidienne . dissémination possible et localisations secondaires - Shigella, E. coli invasif . plasmide de virulence . pénétration . multiplication . mouvement, dissémination horizontale . destruction de la muqueuse : sang, pus et mucus dans les selles . pas de passage au-delà de lamina propia . pas de dissémination ni de localisation extra intestinale. 2- Production d’une entérotoxine ou adhésion entérocytaire Une diarrhée hydro électrolytique peut être liée à une entérotoxine qui stimule l’adénylcyclase membranaire et provoque une sélection d’électrolytes et d’eau. Il n’existe dans ce cas ni lésion muqueuse histologique, ni bactériémie. Les souches bactériennes adhèrent à la muqueuse, se multiplient sans pénétrer dans les cellules et élaborent des toxines qui provoquent sur les entérocytes des altérations fonctionnelles réversibles et transitoires, sans modifications morphologiques, et dont le résultat est la sortie d’eau et d’électrolytes dans la lumière du tube digestif. C’est le syndrome cholérique, de localisation essentiellement entérique, caractérisé par l’abondance et la fréquence des selles, trop liquides, trop aqueuses. C’est le cas de Vibrio cholerae, des Escherichia coli entérotoxinogènes (ECET). Production d’entérotoxine : Vibrio cholerae E. coli - propriété d’adhésion prolifération jejunum iléon production d’entérotoxine . protéique . de type A – B . récepteurs cellulaires (gangliosides) . activation de l’adénylate cyclase . augmentation de l’AMPC intracellulaire . perte eau et électrolytes . émission selles abondantes, aqueuses, incolores eau de riz -5- . déshydratation rapide - Vibrio cholerae : gène chromosomique - Escherichia coli : toxine LT, gène plasmidique 3- Diarrhée et antibiotiques La pathogénie des diarrhées associées au traitement antibiotique n’est pas parfaitement connue. Certaines souches bactériennes peuvent être responsables de diarrhée par leur simple prolifération (Clostridium difficile, Klebsiella oxytoca). Le mécanisme donc le mieux documenté est la modification de l’écosystème bactérien, qualitative ou quantitative. L’action directe de l’antibiotique, ces mécanismes ont été plus rarement mis en cause et restent discutés : - toxicité de produits pour la muqueuse intestinale (amoxicilline/acide clavulanique/clindamycine) - lésions pariétales du grêle avec atrophie villositaire et chélation des sels biliaires (aminosides et polypeptides) - modification des échanges hydroélectrolytiques (clindamycine) - accélération de la motricité intestinale (macrolides). Facteurs de risque liés à l’antibiotique : spectre large comprenant la flore commensale, anaérobies et entérobactéries présence d’un cycle entérohépatique faible absorption digestive voie d’administration orale voie d’élimination biliaire dose et durée de traitement élevées polyantibiothérapie 4- Toxi-infection alimentaire – Pouvoir pathogène – Etiologie Ingestion de toxines bactériennes, conséquence de l’ingestion d’une toxine produite par les bactéries lors de leur séjour dans l’aliment avant ingestion, la prolifération in vivo ne jouant aucun rôle. Staphylocoque doré : charcuterie, pâtisseries, laitages, glaces …….) Bacillus cereus : produits insuffisamment réfrigérés après leur cuisson. - -6- 4. Analyse de la flore physiologique intestinale Flore et écosystème intestinal 40 % du poids des selles est constitué par des microorganismes. 1 ml du contenu du gros intestin contient 10 fois plus de germes qu’un ml de sang ne contient de globules rouges. Les espèces anaérobies strictes concernent plus de 99 % des bactéries fécales cultivables. On qualifie de flore normale ou encore autochtone endogène, résidente, physiologique, saprophyte, les espèces présentes de façon constante dans l’écosystème et capable de s’y multiplier. -7- La flore intestinale La flore intestinale se caractérise par une grande densité et diversité et est implantée essentiellement au niveau colique. Elle contient 1012 bactéries par gramme de matière fécale et renferme plus de 400 espèces différentes dont la très grande majorité est anaérobie stricte. La flore intestinale représente un réel écosystème, établissant des liens étroits avec les épithéliums digestifs et le système immunitaire qui leur est associé (gut associated lymphoid tissue, GALT). La flore digestive participe en outre à un certain nombre d’activités fonctionnelles et interfère avec la digestion et l’absorption de certains nutriments. Entre l’âge de 1 et 2 ans, l’enfant acquiert une flore intestinale identique à celle de l’adulte. La composition de la microflore demeure relativement stable au cours de la vie, mais est très variable d’un individu à l’autre en fonction notamment des habitudes alimentaires. L’équilibre de la flore intestinale participe à réguler le transit intestinal, à empêcher la pénétration d’antigènes hostiles et à éviter la pullulation de germes pathogènes. Cet équilibre est perturbé par des troubles organiques (inflammation de la muqueuse intestinale) ou troubles fonctionnels hépatiques et pancréatiques ainsi que par des facteurs exogènes (malnutrition, immuno-suppression et antibiothérapie). La perturbation de l’équilibre entraîne une colonisation par des germes atypiques et une augmentation de la perméabilité intestinale. Les rôles de la flore physiologique intestinale sont les suivants : - contribution au développement de la muqueuse et de l’immunité intestinale - Résistance à la colonisation par des germes pathogènes (barrière) résultant d’effets mécaniques, métaboliques et d’actions sur le milieu (p. ex acidification) Véritable barrière vis-à-vis de l’implantation et de la prolifération de germes pathogènes. Conditionne l’établissement et la maturation du système immunitaire intestinal. - - Modulation du métabolisme de la muqueuse intestinale Action sur les produits de sécrétion endogène Action sur les nutriments Modifications qualitatives du contenu digestif (pH) Action sur le métabolisme de certains médicaments Production de vitamines (B (B1, B2, B6 et B12) et de vitamine K. Modulation de la motricité intestinale Modifications de l’anatomie du TD Modifications histologiques Modifications du transit intestinal Énergétique cellulaire Rapports entre la flore autochtone et la muqueuse intestinale. Dans le domaine de la pathologie, l’adhérence de certains microorganismes aux tissus de l’hôte est une étape d’importance primordiale et nécessaire à la colonisation de ces tissus. L’adhérence s’effectue par l’intermédiaire d’adhésines, structures agéniques de surface, se présentant sous forme de filaments appelés « fimbriae » susceptibles de se lier à des récepteurs spécifiques sur les membranes cellulaires. -8- Pour la flore autochtone, les données sont plus imprécises. Les bactéries semblent simplement incluses dans le mucus et pour quelques unes sans rapport particuliers avec la muqueuse. Rupture d’équilibre de la flore et de l’écosystème intestinal - facteurs liés au terrain : déficit immunitaire, congénitaux ou âgés, malnutrition, prématurité … - facteurs exogènes : changement d’alimentation, stress, …. - les antibiotiques La vitesse de circulation, le nombre de globules rouges dans le sang, la vitesse de vidange stomacale peuvent être perturbés par l’absence de flore. Ecologie La TD est un lieu privilégié pour la sélection et l’émergence de bactéries résistantes potentiellement pathogènes au cours de l’administration de traitements antibiotiques. La flore intestinale joue un rôle important de réservoir de gènes codant pour la résistance aux antibiotiques. Flore digestive Estomac, duodénum, intestin grêle proximal, peu de bactéries (103104 bact/gr) lactobacilles et streptocoques. Diversité, abondance s’accroissent dans l’iléon avec prédominance des espèces anaérobies strictes. Colon : densité la plus forte 109/1011 bact/gr, 400 à 500 espèces différentes. L’analyse de la flore reflète la composition de la flore intraluminale. Des bactéries sont également présentes dans le mucus qui recouvre l’épithélium intestinal. Abondante et variée. Bactéries anaérobies (1010 à 1011 /gr de selles) Bacteroïdes (B. fragilis à gram -) Fusobacterium (à gram -) Bifidobacterium (à gram +) Clostridium (à gram +) Bactéries aéro-anaérobies facultatives (107 – 109) Entérobactéries coliformes : E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus Enterococcus : E. faecalis Lactobacillus -9- Germes obligatoires et passagers mis en évidence par une analyse de routine de la flore physiologique intestinale et valeurs de tolérance Germes résidents E. coli Enterococcus spp. Germes passagers E. coli atypiques : lactose négatif hémolytique Autres entérobactéries : Klebsiella spp. Proteus spp. Enterobacter spp. Citrobacter spp. …… Germes aérobies Autres germes : Lactobacillus spp. Germes microaérophiles Germes anaérobies Pseudomonas spp. Bacillus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. ≤105 106 - 107 ≤105 ≤104 105 - 107 108 – 1010 Bactéroïdes Prevotella Porphyromonas 108 – 1010 Bifidobacterium spp. Clostridium spp. Levures : ≤105 ≤102 ……… Moisissures : ≤102 Candida sppm. Saccharmomyces spp. Champignons Valeurs de tolérance (norme) Exprimés en CFU 106 - 107 Geotrichum spp. Lucor spp. Aspergillus ………. CFU = colony forming units ; Remarques : - chez le nourrisson élevé au lait maternel, le nombre de Bacteroïdes est sensiblement diminué - Le nombre de Clostridium spp. est généralement augmenté avec les personnes âgées. - 10 - Signification des espèces microbiennes dans le contexte de l’écologie intestinale Escherichia coli E. coli a été longtemps considéré comme la bactérie intestinale la plus importante. Cependant E. coli représente moins de 0,1% de la masse bactérienne du colon, la majorité de la flore étant constituée par les germes anaérobies stricts. Autres entérobactéries Il existe au moins une trentaine d’espèces d’entérobactéries en provenance de l’alimentation. Enterococcus spp Les entérocoques font partie de la flore obligatoire et résidente du colon et de l’intestin grêle. Certaines souches sont présentes dans des aliments fermés. Autres bactéries aérobies Pseudomonas spp, Bacillus spp, Staphylococcus spp et Streptococcus spp sont des germes de passage. La colonisation intestinale par ces germes peut être intermittente, mais peut aussi être le signe d’une perturbation de la barrière intestinale. - Pseudomonas aeruginosa peut être à l’origine de diarrhées chez l’enfant. - Bacillus cereus peut produire une entérotoxine qui est à l’origine de diarrhées aqueuses. - Certaines souches de Staphylococcus aureus produisent des entérotoxines qui provoquent des gastro-entérites aiguës. Lactobacillus Les lactobacilles font partie de la flore obligatoire résidente de l’intestin grêle, du colon, de la cavité buccale et du vagin. Bacteroïdes – Prevotella – Porphyromonas Parmi ces trois espèces, ce sont essentiellement les Bacteroides spp qui colonisent l’intestin, ils constituent la fraction la plus importante de la flore résidente et jouent un rôle important dans la résistance à la colonisation. Bifidobacterium spp Ils constituent une fraction importante de la flore intestinale obligatoire résidente avec une tendance à la diminution chez les personnes âges. Chez le nourrisson alimenté au lait maternel, les bifidobactéries représentent avec 109 à 1010 CFU/g la population bactérienne dominante vers la fin de la première semaine de vie. Clostridium spp Clostridium spp fait partie de la flore résidente du colon et est un germe de l’environnement (sol). Clostridium spp ne semble pas exercer une fonction utile à l’écologie du système intestinal. L’augmentation en nombre chez l’adulte est souvent le signe d’une malabsorption, de troubles digestifs ou de malnutrition. Levures et moisissures Les levures et moisissures sont uniquement des germes de passage au niveau des intestins. - 11 - La coproculture : Analyse bactériologique des selles 1/ Circonstances cliniques et épidémiologiques Contextes classiques : Adulte ou enfant de + de 2 ans et contexte par défaut : Salmonella, Shigella, Camphylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique) Enfant de moins de 2 ans : Salmonella, Shigella, Camphylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique) + E. coli entéropathogène EPEC Contextes particuliers : Notion de voyage récent en pays tropical : Salmonella, Shigella, Campylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique), Aeromonas hydrophila, Pleisiomonas shigelloides, Vibrio cholerae, E. coli 0157 et autres producteurs de vérotoxine (EHEC), E. coli entérotoxigènes (ETEC) Malade sous traitement antibiotique, suspicion de colite pseudo-membraneuse : Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Toxi-infection alimentaire collective (TIAC) : Salmonella, Shigella, Camphylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique), Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, C. perfringens, (Cl. botulinum). Syndrome hémolytique et urémique (SHU) : E. coli 0157 et les autres producteurs de vérotoxine (EHEC). Syndrome cholériforme : Salmonella, Shigella, Campylobacter, Y. enterocolitica (si diarrhéique), Vibrio cholerae, Aeromonas hydrophila, Plseisiomonas shigelloïdes. Recherche portage BMR : BLSE, SAMR, entérocoque vanco R. Portage chez personnel de restauration 2/ Prélèvements Types - échantillon de selles : - soit selles liquides, molles, glaireuses ou hémorragiques - soit selles solides : indications précises dans ce cas - écouvillonnage : pour les enfants, les nourrissons, jamais pour recherche de C. difficile - biopsie rectale ou colique sous endoscopie, jamais pour recherche de C. difficile Fréquence - 3 prélèvements à 1 jour d’intervalle, surtout si portage à éliminer. Ne pas souiller par les urines. Transport : - pour C. difficile, acheminement rapide au laboratoire, si attente mettre à 4°C moins de 24 heures - si attente > 24 h, il faut congeler les selles rapidement pour conserver la toxine B - pour la culture, la bactérie est revivifiable à partir de selles conservées plusieurs semaines à 4° Les selles sont recueillies dès leur émission dans un récipient propre. Un échantillon (mucopurulent ou sanglant) si possible du volume d’une noix est prélevé à l’aide d’une spatule ou d’un flacon-cuillère, puis transféré dans un pot à vis hermétique. Un écouvillonnage rectal peut être utile, notamment chez le nourrisson et le petit enfant. - 12 - Acheminement : Le prélèvement doit être immédiatement acheminé au labo ou conservé au maximum 12 heures à 4° pour éviter la dessiccation et la prolifération des bactéries et levures commensales. Au-delà de ce délai on doit utiliser un milieu de transport (glycérine tamponnée). 3/ Examen direct Examen macroscopique Selles solides, semi solides, pâteuses, liquides, muco-purulentes, glaireuses, fécales, afécales, … Examen microscopique A l’état frais, ou après coloration Il est rarement utilisé. - Après coloration, l’examen du frottis permet d’apprécier le pourcentage des deux types de bactéries. Une flore équilibrée est majoritairement composée de bacilles à Gram négatif mais avec toujours présence de bacilles à Gram positif. - Permet de déceler hématies, cellules desquamées, polynucléaires. Toutefois dans certaines diarrhées à bactéries invasives la présence de leucocytes n’est pas toujours constatée. - Parfois présence de bactéries mobiles : Vibrion du choléra Campylobacter 4/ Ensemencement Adulte Sans renseignements cliniques (ou pour recherche de portage) : BCP Rambach 37° Sélénite Milieu pour Campylobacter : atmosphère spéciale Si diarrhée, renseignements cliniques, selles liquides, en plus ajouter : Milieu Clostridium Shoedler + 4 disques céfoxitine Mueller Hinton (oxydase positive, Aeromonas) Enfant - méconium : gélose au sang – acide nalidixique – gélose chocolat – BHI - < 1 mois : BCP – Rambach – Sélénite – Campylobacter – Acide nalidixique – BHI Mueller Hinton (oxydase + Aeromonas) - + disque céfalotine (Yersinia) - > 1 mois BCP – Rambach – Campylobacter – Sélénite – Clostridium – Mueller Hinton + disque Recherche de Vibrio cholerae A l’ensemencement classique ajouter un TCBS, une gélose alcaline, une eau peptonée alcaline. - 13 - Coproculture quantitative (services d’hématologie – oncologie) 0,1 gr de selles ou 0,1 ml dans 10 ml d’eau physiologique faire dilutions –2 –4 –6 Ensemencement 1. dilution –2 (1 colonie = 103) sur Bile-Esculine-Azide (BEA), BEA + Vanco – Drigalski – Chapman – Sabouraud – Cetrimide – Clostridium 2. dilution-4 ( 1colonie = 105) sur BEA 3. dilution-6 ( 1 colonie = 107) sur gélose Drigalski Faire antibiogramme sur : Entérobactérie Bacille pyocyanique Staphylocoque doré 5/ Milieux Gélose Rambach (isolement et identification rapide des Salmonella) La composition du milieu de culture différentiel proposé par Rambach est la suivante : - propylène glycol (10 g) - peptone (5 g) - extrait de levure (2 g) - désoxycholate de sodium (1 g) - rouge neutre (0,03 g) - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-d-galactopyranoside (0,1 g) - gélose (15 g) - eau distillée (1 l) Seules les Salmonella spp métabolisent le propylène glycol en formant des acides qui, combinés à l’indicateur de pH donnent aux colonies une couleur rouge vif caractéristique et spécifique. Mises à part Salmonella Typhi, Salmonella Para-typhi A et certains sérovars rares qui ne métabolisent pas le substrat, la gélose Rambach doit permettre de différencier sans ambiguité les Salmonella spp des autres bactéries à Gram négatif y compris les Proteus spp. Sur ce nouveau milieu, les coliformes se développent sous la forme de colonies bleu ou bleu-vert, témoins de la production d’une ß-galactosidase. Les autres entérobactéries donnent des colonies incolores. Les colonies de Pseudomonas aeruginosa sont roses. Toutes les colonies lisses, régulières, d’environ 2 à 3 mm de diamètre, à centre rouge vif et à bord incolore voir rose pâle après 18 à 24 h d’incubation à 38°C sur gélose Rambach ont été identifiées comme Salmonella. Milieu lactose-glucose-H2S (ou milieu de Hajna-Kligler) (commercialisé sous forme déshydratée ou prête à l’emploi) Ce milieu complexe permet de confirmer la fermentation du glucose (caractère d’identification de famille, avec ou sans production de gaz) et d’orienter l’identité du genre par l’étude de l‘attaque du lactose et de la production d’H2S. Ce milieu permet encore d’effectuer le test ONPG et de rechercher la LDC. Il est présenté en position inclinée avec un culot important de 3 cm environ. Dans le culot (en anaéobiose relative), le glucose est toujours attaqué par voie fermentative et, bien qu’il soit en proportion faible, son attaque entraîne une acidification importante. Selon la voie de fermentation empruntée, il y a ou non - 14 - production de gaz (H2 ou CO2). Plus ou moins abondants, ces derniers peuvent entraîner seulement la formation de quelques bulles ou, au contraire, créer une poche qui décolle complètement le milieu du fond du tube. Que le lactose soit ou non attaqué, l’acidification produite suffit toujours à faire virer au jaune l’indicateur de pH. Sur la pente (en aérobiose), le glucose est attaqué surtout par voie oxydative. L’acidification produite sera donc faible, d’autant plus, rappelons le que la quantité de glucose présente dans le milieu est faible. Si la bactérie ne peut que métaboliser le glucose (cas des microbes lactose-négatifs), la dégradation des acides aminés, très active en aérobiose et entraînant la formation de produits alcalins, va neutraliser la pente qui, après 24 heures d’incubation, apparaîtra rouge. Au contraire, les bactéries lactose-positives, oxydant et fermentant les quantités importantes de lactose présentes dans le milieu, acidifieront suffisamment pour que l’alcalinité due au métabolisme protéique n’interfère pas, en 24 h, la pente apparaîtra donc jaune (teinte du rouge de phénol à pH acide). Par ailleurs, la réduction du thiosulfate en anaérobiose par certaines entérobactéries se traduira par la formation de sulfure de fer noir en présence du nitrate ferrique. B.E.A. (gélose Bile-Esculine-Azide) Elle est utilisée pour la différenciation des streptocoques du groupe D de Lancefield, lorsqu’ils sont associés à d’autres bactéries dans les produits pathologiques. Les streptocoques des autres groupes, les staphylocoques et la plupart des bacilles Gram négatif ne cultivent pas sur ce milieu. Les colonies de streptocoques de groupe D de Lancefield sont petites, translucides et entourées d’un halo noir (esculine positive). Seules les Listeria donnent des colonies semblables qui peuvent prêter à confusion. Il est donc indispensable d’identifier les bactéries suspectes. Sur ce milieu, les streptocoques des autres groupes sérologiques sont en général inhibés. Les staphylocoques ne sont que partiellement inhibés mais leurs colonies sont souvent plus grandes, opaques et sans halo noir. Certaines levures et de rares entérobactéries peuvent aussi cultiver, leurs colonies produisent parfois un léger brunissement du milieu qui ne peut être confondu avec le halo franchement noir produit par les streptocoques D. Milieux pour identification de Campylobacter Btuzler : bacitracine – novobiocine – céfazidine – colistine – cycloheximide Skirrow : vancomycine – polymixine – triméthoprime Blaser : vancomycine – polymixine – triméthoprime – céphalotine – amphotéricine - 15 - 6. Culture – Identification – Sensibilité aux antibiotiques - traitement Bactérie pathogènes Entérobactéries La plupart des bactéries appartenant à la famille des entérobactéries (1937) sont : - des bacilles à Gram négatif ne formant pas de spore - à ciliature péritriche (sauf Klebsiella, Shigella et Yersinia pestis qui sont immobiles) - se développant en aéro anaérobiose - cultivant sur milieux ordinaires - utilisant le D. glucose et autres sucres par fermentation souvent avec production de gaz - elles sont catalase (+) sauf Shigella dysenteriae sérotype 1 et oxydase (-) - elles réduisent les nitrates en nitrites - contiennent un Ag commun, Ag de Kunin ou ECA (enterobacterial common antigen) et possèdent un GC % compris entre 39 et 59 %. Dans la plupart des cas, elles se développent sous forme de colonies rondes lisses à bords réguliers d’un diamètre de 2 à 3 mm dès 18 heures d’incubation à 37°C. Certaines colonies sont muqueuses (présence d’une capsule ou non). L’identification est basée sur l’étude de caractères biochimiques complétés ou non par une étude sérologique. Caractères antigéniques Les entérobactéries possèdent différents antigènes : - Un antigène commun dénommé ECA (pour Enterobacterial Common Antigen) ou antigène de Kunin. Cet antigène n’existe que chez les entérobactéries et, de ce fait, a un intérêt taxonomique. Sa présence chez les Yersinia a permis d’inclure ce genre dans la famille des entérobactéries. - Les antigènes O ou somatiques correspondent aux polyosides fixés sur les lipopolysaccharides (LPS). Ils sont thermostables et résistent à l’alcool. Les bactéries portant des antigènes O sont agglutinées par les anticorps correspondants ; les agglutinats sont fins, lents à se constituer et difficilement dissociables par agitation (agglutination « corps à corps »). Comme les autres bactéries Gram -, la paroi des entérobactéries est recouverte d’une membrane externe dont le feuillet externe est constitué du LPS. Certaines mutations affectent le core et/ou l’Ag O et l’on distingue : - mutants R (Rough) = colonies rugueuses - colonies S (Smooth) = colonies lisses (bactéries non mutées, possédant l’Ag O). La structure de l’Ag O est très variable d’une espèce à l’autre et au sein d’une même espèce, d’où le sérogroupage (E. coli, Salmonella). - L’antigène R correspond au polysaccharide du core central. La disparition de l’antigène O le démasque et rend les souches « rough » (colonies rugueuses) autoagglutinables dans l’eau physiologique, plus sensibles aux substances bactéricides du sérum, plus facilement phagocytées et donc moins pathogènes. - Les antigènes H ou flagellaires n’existent que chez les souches mobiles. Constitués de protéines spécifiques dénommées flagelline, ils sont thermolabiles et inactivés par l’alcool. Ils provoquent une agglutination floconneuse (accolement des - 16 - bactéries par leurs flagelles), rapidement constituée mais facilement dissociable par agitation (rupture des flagelles). - Les antigènes de surface comprenant : a) les antigènes K, capsulaires, de nature polysaccharidique. Chez les Escherichia coli, les Shigella ou chez certaines Salmonella et Citrobacter (alors appelés Vi), ils masquent l’agglutination par les anticorps anti O qui peut être restituée après chauffage de la souche car ils sont détruits par ébullition. b) Les antigènes d’adhérence ou adhésines de nature protéique, portés par des pili communs (encore appelés fimbriae). Salmonelles Responsables de 40 à 80 % des TIAC et de 10 à 15 % des diarrhées du voyageur. Incubation de 8 à 36 heures, vomissements, douleurs abdominales, diarrhée aqueuse et fièvre qui dure 2 à 5 jours. Peut aussi se présenter sous forme de gastroentérites sporadiques ou épidémiques ou d’une diarrhée glairo-sanglante avec une colite ulcérée. Les Salmonella mineures sont avant tout des parasites du tube digestif de l’homme et des animaux. Les sérotypes qui, contrairement aux précédents, n’ont pas de spécificité d’hôte, sont dits ubiquitaires. Après la maladie, certains sujets restent porteurs sains et éliminent pendant plusieurs mois des Salmonella dans leurs selles. Les Salmonella sont retrouvées dans le milieu extérieur. Des Salmonella sont aussi fréquemment retrouvées dans les farines de poisson ou poudres d’os utilisées pour l’alimentation des animaux. La contamination de l’homme se fait par voie buccale. a) S. Typhimurium est rencontrée dans tous les pays. Elle est la plus souvent identifiée au Centre National des Salmonella de l’Institut Pasteur. Elle est isolée chez l’homme, chez les animaux et dans l’environnement. b) S. Typhimurium occupe la première place dans l’étiologie des toxi-infections alimentaires. Pratiquement toutes les denrées peuvent héberger quelques Salmonella ; mais les denrées d’origine animale jouent le rôle principal. c) Depuis 1987, la fréquence d’isolement de S. enteritidis augmente fortement pour être en 1989 le deuxième sérovar le plus fréquemment isolé chez l’homme. Cette flambée d’infection à S. enteritidis est préoccupante et correspond dans la majorité des cas à la consommation d’œufs de poule. Les salmonelloses purement digestives Les toxi-infections alimentaires à Salmonella se manifestent par des diarrhées, de la fièvre et des vomissements. Les premiers signes surviennent 8 à 10 heures après l’ingestion de l’aliment contaminé. L’évolution de ces gastro-entérites est en règle générale spontanément favorable en quelques jours. Les entérites à Salmonella s’observent principalement chez le jeune enfant. Des épidémies peuvent survenir dans des collectivités de nourrissons. La fréquence des entérites à Salmonella au cours du S.I.D.A. est à noter. Les formes extra digestives Elles sont plus rares : infections urinaires, cholécystites, méningites, ostéomyélites, spondylodiscites, infections pulmonaires. Ces formes surviennent plus volontiers chez des malades immunodéprimés. Les déficits enzymatiques des globules rouges et la drépanocytose sont des circonstances favorisantes. - 17 - Centre national des Salmonella et Shigella Unité des entérobactéries, Institut Pasteur. Note relative à la nouvelle classification des Salmonella (1987). Deux espèces génétiques ont été individualisées dans le genre Salmonella : Salmonella enterica (la plus fréquente) qui est subdivisée en 6 sous-espèces (subsp.) : S. enterica subsp. entérica, S. enterica subsp. Salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae et S. enterica subsp. indica. Salmonella bongori (très rares). L’identification des espèces et sous-espèces se fait sur la base de caractères biochimiques. À l’intérieur de ces espèces et sous-espèces, les souches peuvent être différenciées par la sérotypie (antigène O, H et Vi). Salmonella enterica subsp. enterica renferme la majeure partie des sérotypes de Salmonella isolés chez l’homme et les animaux à sang chaud. Exemples : La nomenclature pour le sérotype Typhimurium est : Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhimurium ou plus simplement : Salmonella sérotype Typhimurium. La nomenclature pour le sérotype Typhi est : Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhi ou plus simplement : Salmonella sérotype Typhi. Identification des Salmonelles des gastro-entérites Caractères communs aux entérobactéries : en API 20E : lactose (-) ; ONPG (-) ; H2S (+) ; ODC (+) ; urée (-) ; TDA (-) ; indol (-) ; VP (-) ; citrate (+) ; gaz (+) Classification sérologique Elle est basée sur la détermination, par agglutination sur lame, des antigènes O, H et Vi. Il existe plus de 2 000 sérovars, mais avec un nombre limité de sérums agglutinants, tout laboratoire peut typer la majorité des souches de Salmonella qu’il isole. Le typage de sérovars rares nécessite l’intervention d’un laboratoire de référence. Antigènes O La spécificité de chacun des 67 antigènes O répertoriés est déterminée par sa composition, c’est-à-dire par la structure des polysaccharides de la paroi bactérienne. - Les formes R. Ce sont des mutants, non pathogènes, qui ont perdu par délétion une grande partie de la chaîne polysaccharidique responsable de la spécificité O. Ces souches ne sont plus sérotypables et sont auto-agglutinables dans de l’eau physiologique. - Les formes T (de transition). Ces souches sont rares. Elles donnent des colonies ayant l’aspect S, mais elles ont perdu leur spécificité O, comme les formes R. - Les bactériophages dits convertisseurs. Ils peuvent par lysogénie produire des modifications de la structure antigénique O des Salmonella. Les facteurs antigéniques O qui sont liés à une conversion phagique peuvent être présents ou absents. Ils sont soulignés dans le tableau de Kauffmann-White. - 18 - Antigènes H Les flagelles sont constitués d’une molécule protéique, la flagelline, dont la composition en acides aminés détermine le type antigénique H. Cette composition est codée par un gène de structure H1 pour la phase 1 et un gène H2 pour la phase 2. Certains sérotypes sont monophasiques. ILs ne peuvent synthétiser de la flagelline que d’une seule spécificité. La plupart des sérotypes sont diphasiques. Ils peuvent synthétiser des antigènes H soit de la phase 1, soit de la phase 2. Les antigènes de la phase 1 sont désignés par des lettres : a, b, c … z. Comme l’alphabet n’y suffisait pas, les plus récemment reconnus sont désignés par un z suivi d’un nombre. Les antigènes de la phase 2 sont désignés par des chiffres. Inversion de phase. Lorsque dans une culture, la majorité des bactéries est par exemple en phase 1, la quantité d’antigènes de la phase 2 est trop faible pour être détectée. L’inversion de phase consiste à ensemencer la souche dont la phase 1 est connue dans une gélose molle en présence de sérum correspondant à cette phase 1. Seules les bactéries qui ne sont pas immobilisées par ce sérum, donc qui sont de l’autre phase, peuvent migrer dans la gélose molle et être recueillies à distance du point d’ensemencement. Cette population entièrement constituée de bactérie en phase 2 est utilisée pour la détermination de la deuxième phase. Cette technique est connue sous le nom de méthode de SvenGard. Antigènes Vi a) Ce polyoside capsulaire n’est trouvé que de façon inconstante chez trois sérotypes : S. typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin. b) Les souches Vi + qui produisent une quantité importante d’antigène Vi sont Oinagglutinables. Elles deviennent habituellement O-agglutinables après un chauffage à 100°C qui fait passer l’antigène Vi dans le surnageant. Le tableau de Kauffmann-White Ce tableau indique pour chaque sérovar les antigènes O, Vi et H dont la détermination est utile pour le typage sérologique. À chaque sérovar correspond une formule antigénique. Par exemple : S. Virchow : 6,7 : r : 1,2. Dans ce tableau, les sérovars qui ont des antigènes O communs caractéristiques sont rassemblés pour former un groupe O désigné par une lettre A, B, C, D etc. Exemple : les sérovars du groupe B ont tous l’antigène O4 et ceux du groupe D, l’antigène O9. À l’intérieur de chaque groupe O, les sérovars apparaissent d’après l’ordre alphabétique de la phase I de leur antigène H. Sensibilité aux antibiotiques – Traitement Un antibiogramme est effectué sur toute souche de Salmonella isolée autant pour caractériser cette souche que pour orienter le traitement antibiotique qui n’est pas systématique pour toutes les salmonelloses digestives. Entérites et toxi-infections alimentaires : Seules les formes sévères chez le nourrisson ou chez le vieillard sont traitées par les antibiotiques. Dans les autres cas où le pronostic est favorable, un traitement symptomatique suffit. - 19 - Porteurs sains Les personnes qui, au décours de la maladie, continuent d’éliminer des Salmonella dans leurs selles ne doivent pas être traitées par les antibiotiques. Ceux-ci sélectionnent des souches résistantes et sont sans action sur la durée du portage. Seules des mesures d’hygiène sont à préconiser. Les Shigelles : hier et aujourd’hui Les Shigelles sont des entérobactéries strictement adaptées à l’Homme. Ce sont les agents étiologiques de la dysenterie bacillaire ou shigellose, responsables de 10 à 20 % des cas de maladies intestinales sévères dans le monde. Dans les régions tempérées, la dysenterie bacillaire se limite en général à une diarrhée modérée suivie d’un syndrome dysentérique bénin. Dans les pays en voie de développement des régions chaudes à bas niveau d’hygiène, l’infection souvent endémique se manifeste en général par une dysenterie aiguë qui peut être fatale, surtout si elle est causée par Shigella dysenteriae 1 ou bacille du Shiga. Les enfants de 1 à 5 ans représentant la cible principale de la shigellose. Responsables de grandes épidémies d’armée en campagne ou de camps (réfugiés, prisonniers). 4 à 30 % d’isolement de gastro-entérites sporadiques, de rares gastro-entérites épidémiques survenues après ingestion d’eau ou d’aliments souillés ou par contamination inter humaine. Le tableau clinique est typiquement un syndrome dysentérique franc et fébrile, mais il peut s’agir d’une diarrhée sans fièvre. Quelques dates dans l’histoire de la dysenterie bacillaire La dysenterie bacillaire a pu jouer un rôle dans notre histoire, aussi bien médicale que militaire, maritime ou coloniale, comme le montrent les quelques exemples suivants, rapportés dans l’ordre chronologique. 1761. – Van Swieten, premier médecin de la Reine de Hongrie, avait décrit en français en 1761 un livre, imprimé à Amsterdam, intitulé « Description des maladies des Armées avec la méthode de les traiter ». Dans le chapitre consacré à la dysenterie, il en décrit avec précision les signes cliniques, il note que les selles dysentériques contiennent souvent du sang. Quant au traitement, en plus de l’inévitable saignée en faveur à cette époque, il prescrit de réhydrater les dysentériques avec de l’eau tiède ou de l’eau de millet, de les alimenter avec du riz et de calmer leurs douleurs avec des pilules d’opium. 1779. – Une grave épidémie de dysenterie frappa cette année-là les provinces de l’ouest de la France. Le nombre des morts fût estimé à 175000 (pour 27 millions d’habitants). 1792. – A la bataille de Valmy, le 10 septembre 1792, les troupes prussiennes furent vaincues, non seulement par les soldats de Dumouriez et de Kellermann, mais aussi par la dysenterie. 1837. – Le navigateur Dumont d’Urville, qui découvrit la Terre Adélie, accomplie dans les mers australes son dernier voyage autour du monde, qui fut un succès scientifique, mais au prix de pertes humaines assez lourdes à cause de la dysenterie. 1894. – Dans ses Mémoires, Pasteur Vallery-Radot rappelle que Calmette, désigné par Pasteur pour être le premier directeur de l’Institut Pasteur de Saïgon, n’y séjourna que peu de temps, car il fut rapidement rapatrié sanitaire à - 20 - cause d’une dysenterie, contractée en Cochinchine, alors qu’il venait de commencer l’étude des venins de serpent. 1914-1918. – Julien Dumas, qui fut directeur du Grand Cours de Microbiologie de l’Institut Pasteur, fut affecté en 1914 au laboratoire central de bactériologie des Armées. Il reconnut bien vite que, dans la plupart des cas, la « diarrhée des tranchées » s’identifiait à la dysenterie bacillaire. Actualité des Shigella – Sources 99 % des souches de Shigella présentent un tropisme digestif et sont isolées de selles humaines : selles afécaloïdes, glaireuses, muco-sanglantes ; dans la phase aiguë de la shigellose, on observe au microscope, outre de nombreux leucocytes, une culture presque pure de bacilles à Gram négatif. Lorsque des aliments ou des échantillons d’eau sont contaminés par des shigelles, l’homme est toujours à l’origine de la contamination. Les réservoirs de shigelles d’origine non humaines sont exceptionnels. Les épidémies sont dues, dans les pays en voie de développement, à S. dysenteriae type 1 (Sd1) ou bacille de Shiga, particulièrement menaçant, à S. flexneri et à S. sonnei. Les shigelloses sont endémo-épidémiques en Asie et dans le sous-continent indien : Bengladesh, Inde, Pakistan. On estime à 91 millions et à 414 000 respectivement le nombre annuel des épisodes à Shigella et de décès dus à cette maladie en Asie, dus le plus souvent à S. flexneri ou S. sonnei. Le taux d’incidence médian de diarrhée sanglante en Afrique est estimé à 10,2/100 000 habitants. La cible principale est l’enfant de moins de 5 ans, rarement atteint avant 6 mois s’il est nourri au lait maternel, le vieillard, la femme enceinte et le sujet immunodéprimé. Physiopathologie Les shigelles sont des bactéries entéro-invasives, capables de pénétrer dans les cellules épithéliales de la muqueuse du côlon et de s’y multiplier avec formation d’abcès et d’ulcération. Shiga-toxine Connue depuis 1903 chez S. dysenteriae 1, elle est localisée dans l’espace périplasmique de la bactérie et libérée lors de la lyse de la bactérie. C’est une toxine protéique de 70 kDa, codée par des gènes chromosomiques. Vérotoxine Différentes espèces bactériennes produisent une toxine caractérisée par son pouvoir cytotoxique pour les cellules Véro. Cette toxine très voisine de la Shiga-toxine a été trouvée : - chez des souches de E. coli - chez d’autres espèces bactériennes Pouvoir entéro-invasif Le pouvoir entéro-invasif est en relation avec la présence de plasmides communs aux différentes espèces de Shigella et aux E. coli entéro-invasifs. La maladie humaine est la conséquence de l’invasion de la muqueuse du côlon. Ceci entraîne une forte réaction inflammatoire provoquant abcès et ulcération du colon et l’apparition de sang et de mucus dans les selles. L’infection est limitée à la muqueuse sans traverser la lamina propria. - 21 - Pouvoir pathogène chez l’Homme Il existe des formes intermédiaires entre le syndrome dysentérique aigu et des manifestations diarrhéiques assez banales. Les shigelloses surviennent surtout à la période estivo-automnale (septembreoctobre). La durée de l’incubation varie entre 12 heures et 3 jours, les troubles intestinaux persistent entre 3 et 5 jours : fièvre en général inférieure à 39°C, crampes abdominales, nombreuses selles afécaloïdes, glaireuses, mucosanglantes, purulentes. L’isolement est en régression sous nos climats. En France, le plus grand nombre de souches est reçu en septembre-octobre. Cela s’explique par la température estivale et les retours de vacances en pays exotiques. S. sonnei est la plus souvent isolée. S. flexneri vient ensuite. S. dysenteriae et S. boydii sont rarement isolées en France. Dans les pays en voie de développement, la shigellose endémique est due avant tout à S. flexneri. Génétique du pouvoir pathogène – Facteurs de pathogénicité Toutes les souches potentiellement pathogènes de Shigella et d’E. coli entéroinvasif (ECI) hébergent un plasmide de virulence, différent selon les espèces, mais génomiquement apparenté. Ce plasmide et 3 gènes chromosomiques sont indispensables à l’expression complète de la virulence. Identification Caractères bactériologiques communs à toutes les Shigella Outre les caractères généraux des Enterobacteriaceae, les souches appartenant au genre Shigella ont toutes les caractères communs suivants : immobiles (bouillon en phase exponentielle pas de culture sur milieu au citrate de Simmons absence de LDC et de tryptophane-désaminase fermentation du glucose sans gaz (exceptions avec certains biotypes de S. flexneri 6 et S. boydii 13 et 14 jamais de production d’H2S Caractères généraux des Shigella qui sont tous des caractères négatifs : lactose, H2S, LDC, VP, uréase phénylalanine désaminase, gélatinase, citrate Simmons, acétate de Trabulsi. Les colonies suspectes [lactose (-) et H2S (-)] sont l’objet d’une caractérisation plus complète. Il importe de faire le diagnostic différentiel entre les Shigella et les « Alkalescens-dispar » qui sont des E. coli immobiles et ne produisant pas de gaz. Sérotypie ou typage sérologique d’une souche Ce n’est qu’une fois le diagnostic de genre Shigella établi avec certitude que le typage antigénique peut être entrepris par agglutination sur lame. Caractères de chaque espèce Les quatre espèces du genre Shigella se distinguent entre elle par des caractères biochimiques et des caractères antigéniques, basés sur l’étude des antigènes O polysaccharidiques. - 22 - - S. dysenteriae = sous-groupe A Cette espèce est caractérisée par l’absence de fermentation du manitol. Il existe 10 sérotypes. S. dysenteriae type 1 ou bacille de Shiga possède ne bêtagalactosidase très active, est indole (-) et, fait rare chez les Enterobacteriaceae, ne possède pas de catalase. - S. flexneri = sous-groupe B Cette espèce comporte 6 sérotypes et 2 variants . - S. boydii = sous-groupe C Cette espèce comporte 18 sérotypes. - S. sonnei = sous-groupe D Il n’existe qu’un seul sérotype. Mannitol ODC Indole ONPG S. flexneri S. dysenteriae S. boydii S. sonnei +/D - D -/+ + D -/+ + + d d : variable suivant les sérotypes ou les biotypes pour S. donnei +/- positif avec la majorité des sérotypes -/+ négatif pour la majorité des sérotypes * S. flexneri : indole + pour les sérotyupes 3, 4 et 5 indole – pour les sérotypes 1, 2 et 6. *S. dysenteriae sérotype 1 est : catalase (-) et possède une ß-galactosidase très active (ONPG + en moins d’une heure). Diagnostic différentiel Il se pose essentiellement avec : les Escherichia coli, biotypes Alcalescens-dispar (AD) : qui sont immobiles et atazogènes. Pousse sur acétate Trabulsi de E. coli. L’hybridation quantitative de l’ADN montre que les espèces du genre Shigella (sauf Shigella S. boydii sérotype 13) et E. coli font partie du même groupe génomique. Sensibilité aux antibiotiques - Traitement Les Shigella sont irrégulièrement sensibles aux antibiotiques. Cependant, rappelons que c’est au cours d’une épidémie de shigellose que les plasmides de résistance multiple transférable ont été découverts au Japon. Aussi, aujourd’hui, le traitement doit être guidé par les résultats d’un antibiogramme. a) Intérêt du traitement antibiotique des infections à Shigella : diminuer le portage et la contagion, la durée des symptômes, le risque de complications. b) Une évolution du traitement : depuis plusieurs années, des souches de Shigella sonnei résistantes aux aminopénicillines et au cotrimoxazole (traitement recommandé jusqu’à présent) ont émergé et sont devenues prédominantes. c) Chez l’enfant : l’azithromycine devient un traitement de choix. La ceftriaxone, administrée par voie parentérale, peut difficilement être considérée comme un traitement de première intention. Les quinolones ne sont à envisager qu’en dernière intention ; seule la ciprofloxacine peut être recommandée. d) Chez l’adulte : la ciprofloxacine et l’ofloxacine peuvent être recommandées en première intention pour une durée de 3 jours. - 23 - Le traitement associe réhydratation hydroélectrolytique et antibio-thérapie. Prophylaxie : lutte contre le péril fécal. Yersinia enterocolitica Rapport du CNR 2003 Caractéristiques des Y. enterocolitica entéropathogènes d’origine humaine. 149 souches analysées en 2003. Biotype Sérotype Nombre de Souches 2 09 39 (26 %) 3 05 4 (3 %) 4 03 106 (71 %) Pas de nette prédominance d’isolement dans une région française. Pas de pic saisonnier. Légère prédominance chez l’Homme. Très grande prédominance chez les enfants en bas âge (75 % de 0 à 9 ans). Isolés des selles 83 %, du sang 12 %. Autres prélèvements : biopsie du colon, plaie, liquide d’ascite, kyste mésentérique. Le tableau clinique prédominant est l’association diarrhées, fièvre, douleurs abdominales. Les formes septicémiques se retrouvent plus souvent chez l’homme de plus de 60 ans présentant un terrain fragilisé associant cirrhose, néoplasie, diabète. Les souches de bio sérotypes 2/09 sont associées à des formes septicémiques. Le nombre de souches reçues au CNR n’est qu’un reflet très sous estimé de la réalité de l’infection à Yersinia en France. Pouvoir pathogène La manifestation clinique la plus commune de l’infection humaine est l’entérocolite. Elle survient le plus souvent chez le jeune enfant. L’adénite mésentérique, moins fréquente qu’avec Y. pseudo-tuberculosis s’observe plutôt chez l’adolescent et l’adulte jeune. Une arthrite réactionnelle peut survenir une à trois semaines après une entérite à Y. enterocolitica. Elles sont préférentiellement observées chez les adultes jeunes, surtout ceux appartenant au groupe tissulaire HLA-B27 (80 % des malades). Parmi les manifestations dermatologiques causées par Y. enterocolitica, l’érythème noueux est de loin la plus fréquente. Les souches pathogènes pour l’homme se répartissent essentiellement dans les sérogroupes O:3, O:9, O:5,27 et O:8. Le porc est un important réservoir de souches pathogènes et constitue la principale source de contamination humaine. Physiopathologie de l’infection à Yersinia enterocolitica Après ingestion, une forte proportion des bactéries est détruite (plus de 90 %) lors de la traversée de l’estomac, par l’acidité gastrique. La pathogénicité de Y. enterocolitica est multifactorielle, ce microorganisme mettant en jeu à la fois des facteurs codés par le chromosome et par un plasmide. - 24 - Déterminants chromosomiques de virulence L’entérotoxine. Les souches pathogènes de Y. enterocolitica sécrètent in vitro une entérotoxine qui présente une forte homologie avec la toxine ST de Escherichia coli. Les « invasines ». La pénétration des microorganismes dans la muqueuse intestinale est une étape cruciale dans la pathogénie de l’infection digestive par Y. enterocolitica. Deux gènes chromosomiques sont responsables de l’invasion des cellules épithéliales in vitro : inv (pour invasion) et ail (pour attachement invasion locus). L’expression de ces deux gènes dépend de la température. Déterminants plasmiques de virulence Un plasmide de 70 à 75 kilobases (kb) est hébergé par les souches pathogènes de Y. enterocolitica. Il contribue à la prolifération bactérienne dans les tissus. Identification Caractères culturaux Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis sont des espèces psychrophiles et peuvent se multiplier à des températures comprises entre +4 et +10°C. La recherche de Y. enterocolitica par coproculture est facilitée par l’utilisation de milieux de sélection. Les milieux sélectifs contenant des sels biliaires (gélose Mac Conkey, Hektoen, Wauters, SS, DCL) sont utilisables et incubés à 30°C. Il existe aussi des milieux rendus sélectifs par l’adjonction d’antibiotiques (milieu CIN : cefsulodine, irgasan, novobiocine) permettant de détecter de faibles quantités de Y. enterocolitica dans les selles. Caractères bactériologiques Y. enterocolitica : caractères des entérobactéries. Les éléments importants sont : Absence de mobilité à 37° et mobilité en dessous de 29°. Réaction de l’uréase fortement et rapidement positive. Test à l’ONPG positif. Absence de LDC, ADH, TDA, H2S. Aspect thermodépendant des caractères phénotypiques (VP). ODC (+), VP (+), saccharose sorbitol sont acidifiés. L’hétérogénéité bioclinique permet de définir 5 chimiotypes ou biotypes sur la base de caractères variables : production d’indol, fermentation du xylore, présence d’une lipase, réduction de l’esculine. Il existe 34 antigènes O et 20 antigènes sont décrits définissant des sérogroupes. Un petit nombre est associé à une pathologie humaine ou animale. Sensibilité aux antibiotiques -Traitement Y. enterocolitica est naturellement résistant à l’ampicilline et aux céphalosporines de première génération par production à la fois d’une bêtalactamase constitutive et d’une bêta-lactamase (céphalosporinase) inductible. De rares souches présentent une résistance acquise à d’autres antibiotiques. Comme pour les caractères biochimiques, l’expression de la résistance est dépendante de la température. Lors d’infections graves, les antibiotiques utilisés seront choisis parmi ceux cités ci-dessus ou parmi les céphalosporines de troisième génération associées ou non à un aminoglycoside. Il n’existe pas de prévention spécifique des yersinioses. - 25 - Escherichia coli Introduction Isolée pour la première fois par Escherich en 1885, Escherichia coli, l’espèce bactérienne la mieux étudiée, est une bactérie commensale du tube digestif dont certains clones peuvent être pathogènes (infections urinaires, diarrhées, méningites néonatales, infections généralisées). Les souches pathogènes diffèrent des non pathogènes par la présence ou l’expression de « facteurs de virulence ». Ces facteurs dépendent de la présence de certains gènes de pathogénicité situés sur le chromosome, les plasmides ou les bactériophages. Aspects cliniques des diarrhées à E. coli Catégories des E. coli I. Entérotoxinogènes ETEC II. Entérooinvasifs EIEC Épidémiologie (âge à risque) Voyageurs, enfants (<2 ans) Pays en voie de développement Épidémies occasionnelles enfants, adultes, tous pays. III. Entérohémorragiques EHEC IV.1. Entéropathogènes EPEC Enfants (1 – 2 ans ; personnes âgées) Pays développés Enfants (<6 mois) tous pays IV.2. Entéroagrégatif EAggEC IV.3. Adhésion diffuse DAEC Enfants pays en développement Enfants tous pays Syndrome clinique Diarrhée aqueuse aiguë, crampes abdominales Diarrhée aqueuse puis dysenterie aiguë, crampes abdominales, fièvre Diarrhée aiguë hémorragique, colites fébriles, SHU Diarrhée aqueuse aiguë et persistante, fièvre, vomissement Diarrhée aqueuse aiguë et persistante Diarrhée aqueuse aiguë et persistante, fièvre, vomissement Les E. coli entérotoxinogènes ou ETEC Décrites depuis 1967, les ETEC (1, 2, 3, 4) sont une cause importante de diarrhées survenant chez les enfants dans les pays en développement. Elles sont aussi l’agent responsable de diarrhée des voyageurs. Les souches ETEC se distinguent par la grande diversité des sérotypes. Toutefois, 78 sérotypes O ont été détectés et 34 séro-groupes H. Pathogénèse Les ETEC provoquent une diarrhée aqueuse et quelquefois un syndrome cholériforme avec risque de déshydratation. La pathogénèse peut être divisée en deux parties : la colonisation de l’intestin grêle où des facteurs d’adhésion sont nécessaires et la production de toxine. Facteurs de colonisation (adhésion) Les ETEC adhérent aux cellules épithéliales humaines de l’intestin grêle au moyen de structures d’adhésion ou facteurs de colonisation (FC) qui sont sous forme de - 26 - fimbriae, fibrilles et adhésines non filamenteuses. Actuellement plus d’une vingtaine ont été décrits. Entérotoxines Deux types de toxine sont connues, la toxine thermostable ST, découverte en 1967 et la toxine thermolabile LT antigéniquement semblable à la toxine CT du choléra. Les gènes codant les toxines LT et ST sont portés par des plasmides. Les E. coli entéroinvasifs ou EIEC Très peu de données publiées sur l’épidémiologie des EIEC : ce sont surtout des épidémies diagnostiquées rétrospectivement. À cause de la grande similitude existant entre E. coli et Shigella, il est surprenant que les EIEC soient moins fréquents. Des épidémies à EIEC ont été associées à des fromages ou autre nourriture contaminée. Le sérogroupe O124 reste le plus fréquent (un camembert français importé aux Etats-Unis a été la cause d’une épidémie de dysenterie à O124 en 1973). Les EIEC pourraient devenir le 5ème sérogroupe de Shigella auquel l’espèce E. coli est étroitement apparentée, d’autant plus qu’ils partagent un gros plasmide responsable de l’invasion cellulaire et certains de leurs antigènes. Les souches EIEC appartiennent à un nombre limité de sérotypes. Pathogénèse La pathogénicité des EIEC est déterminée par la capacité de la bactérie à envahir les cellules épithéliales. L’invasion requiert plusieurs gènes situés sur le plasmide de virulence de 220 Kpb et sur le chromosome travaillant ensemble pour une expression clinique et moléculaire de cette maladie. Le gène ipaH dont les produits sont immunogènes mais de fonction encore inconnue, est présent en multiples copies sur le chromosome et sur le plasmide invasif. Le produit d’un gène sen localisé sur le plasmide d’invasivité pourrait constituer (tout ou en partie) une nouvelle entérotoxine présente dans 75 % des EIEC. Tous les EIEC contiennent une séquence IS630 commune aux Shigella qui peut être détectée par PCR. Les E. coli entérohémorragiques ou EHEC L’émergence de nouveaux pathotypes de E. coli comme les E. coli entérohémorragiques (EHEC) commence à poser un problème de Santé Publique en France. Ils ont été observés et décrits en Amérique du Nord depuis 1983 où ils sont responsables d’épidémies de diarrhées aqueuses et hémorragiques. Les infections à EHEC ont été associées à des colites hémorragiques (CH), ces dernières pouvant se compliquer au bout de quelques jours d’un Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU), ou plus rarement de purpura thrombocytopénique thrombotique (TTP) pouvant entraîner la mort. L’agent pathogène en cause est souvent en E. coli de sérotype rare O157:H7. Depuis février 1993, les premiers foyers de SHU sont apparus en France, où n’existaient, pour l’instant que des cas sporadiques, mais les sérotypes en cause étaient plus O103:H2, 026:H11, O111:H38. Dans les pays développés, cette infection est associée le plus souvent à l’ingestion de viande hachée (hamburgers) contaminée (USA, GB, Australie) ou de produits laitiers non pasteurisés (France). - 27 - Le SHU est caractérisé par une anémie hémolytique micro angiopathique, avec thrombocytopénie, insuffisance rénale et des symptômes nerveux centraux. Le terme de EHEC décrit les souches de E. coli qui donnent les mêmes caractéristiques cliniques et épidémiologiques que les O157:H7 et qui possèdent les mêmes facteurs de virulence. Le terme STEC ou VTEC est donné à toutes les souches de E. coli productrices de vérotoxine (Shiga-Like-Toxin ou Shiga-Toxin et Verotoxin – producing Escherichia coli), Stx ou VT étant le facteur essentiel des STEC. Pathogénèse Les STEC ne produisent pas d’entérotoxine thermostable ou thermolabile. La pathogénicité des EHEC est liée à plusieurs facteurs de virulence, comme la production d’une ou plusieurs vérotoxines (Stx ou VT), de protéines intervenant dans les lésions cellulaires dites d’attachement-effacement A/E, d’entérohémolysine. Presque toutes les souches cliniques STEC possèdent aussi un plasmide de 90 Kpb qui pourrait être impliqué dans la pathogénicité des EHEC. Des études ont montré que les EHEC partagent avec les EPEC la capacité de causer des lésions d’attachement et d’effacement A/E au niveau des entérocytes de la muqueuse intestinale. Ils possèdent le gène « d’attachement et d’effacement » eaeA, localisé sur le chromosome. Une région chromosomique de 35 Kpb correspondant à l’effacement de l’entérocyte appelée LEE (ou locus de l’effacement de l’entérocyte) et présente dans toutes les souches STEC et EPEC serait nécessaire à ces lésions A/E et supporte les gènes sep, eaeA et espB. Les E. coli entéroadhérents ou « HEP-2-ADHERENT EC » Ce groupe de E. coli a la propriété d’adhérer aux cellules HEP-2 et aux cellules épithéliales intestinales in vitro et est associé à des diarrhées aqueuses aiguës ou persistantes. E. coli entéropathogènes classiques ou EPEC caractérisés par une adhésion localisée. Les souches EPEC étaient autrefois responsables des diarrhées infantiles et étaient appelées E. coli des gastro-entérites infantiles (GEI). Actuellement elles sont plus rarement rencontrées dans nos pays. Pathogénèse Les EPEC colonisent la muqueuse intestinale en adhérant très fortement aux entérocytes intestinaux, produisent des lésions d’attachement et d’effacement caractérisées par la destruction localisée des micro villosités de la bordure en brosse et induisent des altérations au niveau du cytosquelette des cellules épithéliales. Les E. coli entéroagrégatifs ou « EAggEC » ou AAEC, caractérisées par une adhésion agrégative. Une épidémie massive de gastro-entérite est survenue au Japon dans une école où 2 700 enfants ont développé une diarrhée à EAggEC. Les EAggEC sont associés plus particulièrement à des diarrhées aqueuses persistantes chez de jeunes enfants dans les pays en développement ou développés. Il existe peu d’information sur la maladie clinique des EAggEC qui apparaît être semblable à celle des EPEC. Pathogénèse Adhésion agrégative (AA) Les souches EAggEC se caractérisent par un profil particulier d’adhésion, appelée adhésion agrégative, caractérisée par des agrégats de bactéries en « briques - 28 - empilées ». Cette adhésion est associée à un aggA situé sur un plasmide de 60 MDa et est corrélée avec l’expression de fimbriae I d’adhésion agrégative et à l’hémagglutination aux érythrocytes humains. Toxines Le même plasmide de 60 MDa code aussi une entérotoxine thermostable EAST1 (« enteroaggregative E. coli heat stable enterotoxin »). Les EAggEC élaborent une toxine thermolabile de 120 KDa. Les E. coli à adhésion diffuse ou DAEC. Les DAEC constituent le groupe le plus hétérogène des E. coli provoquant des diarrhées. Ces E. coli ont été récemment associées à des diarrhées aiguës et persistantes chez des enfants dans les pays développés ou en développement. Les diarrhées peuvent être aqueuses et contenir du mucus. Le rôle pathogène des E. coli à adhésion diffuse dans l’étiologie des maladies diarrhéiques est controversé. Pathogénèse Adhésion diffuse (DA) Les DAEC se caractérisent par deux facteurs d’adhésion : le gène codant une adhésine de fimbriae qui a un support chromosomique ; le gène d’origine plasmidique codant une protéine de la membrane externe. Conseils au diagnostic biologique d’une infection diarrhéique à E. coli. La détection de différents pathotypes de Escherichia coli comporte des étapes dans la conduite de l’analyse : - Une fiche de renseignement - L’aspect macroscopique et microscopique - Les selles doivent être ensemencées sur un milieu gélosé non inhibiteur pour E. coli : il y a lieu de rechercher les facteurs de virulence par PCR directement dans les selles. Un écouvillon rectal mis dans un milieu de transport type TGV AER est conseillé. - Le facteur de virulence devra être recherché en fonction du contexte épidémiologique. Actuellement les pathotypes de E. coli les plus fréquemment rencontrés sont par ordre d’importance décroisssante : les EHEC, certains EAggEC, puis viennent les ETEC, les EPEC, les autres EAggEC et enfin les EIEC. - Si le sérogroupage ou le sérotypage a un intérêt pour certains pathotypes comme les EPEC, il n’est pas suffisant pour les autres, la recherche de la présence de facteurs de virulence restant à déterminer. Identification a) EPEC (E. coli entéropathogènes) : en pratique courante le diagnostic d’approche se fait par recherche des antigènes O par agglutination sur lame à l’aide d’anti-sérums spécifiques. b) ETEC (E. coli entérotoxinogènes) : sont très rares en France. Leur identification ne peut être pratiquée que dans des laboratoires spécialisés. c) EIEC (E. coli entéro-invasifs) rares en France. Leur identification précise ne peut se faire qu’en laboratoire spécialisé. Les souches suspectes doivent être adressées à un Centre de Référence. - 29 - d) EHEC (E. coli entéro-hémorragiques). Décrits en Amérique du Nord, ils sont rares en France. Les souches doivent être adressées au Centre de Référence. Les gènes responsables Entéropathogène : EPEC Ilot de pathogénicité locus LEE, locus d’effacement de l’entérocyte avec le gène eae. 0157 gène de l’intimine eae comparable aux EPEC. Entérohémorragique EHEC stx et ear et STEC Shiga like stx, regroupés sous le terme de E. coli shigatoxinogène (plus de 100 sérogroupes). - 30 - Sensibilité aux antibiotiques E. coli est une espèce naturellement sensible aux antibiotiques actifs sur les bacilles à Gram négatif. Des résistances à la plupart des antibiotiques peuvent apparaître rendant nécessaire la pratique d’un antibiogramme ; La résistance acquise aux ß-lactamines concerne : - Le plus souvent les pénicillines : ampicillines, ticarcilline, pipéracilline (40% des souches) par production d’une ß-lactamase plasmidique. Les inhibiteurs de ßlactamases (acide clavulanique, tazobactam, sulbactam) restaurent l’activité des antibiotiques. - Plus rarement chez cette espèce, on peut observer une résistance aux céphaloporines de 3ème génération par production de ß-lactamases à spectre - 31 - étendu. Dérivées des précédentes, ces ß-lactamases sont aussi sensibles aux inhibiteurs. - Moins de 5% des souches peuvent apparaître résistantes aux céphalosporines par hyperproduction d’une céphalosporinase naturelle s’exprimant normalement très bas niveau. - Récemment des dérivés des pénicillinases résistantes aux inhibiteurs de ßlactamase ont été décrits, en particulier chez des souches urinaires (phénotype TRI ou IRT). La résistance aux aminosides par production d’enzymes modificatrices est rare chez E. coli. La résiStance acquise aux quinolones peut être observée. Elle est due à une mutation chromosomique. La maladie du Hamburger E. coli entérohémorragique (EHEC) et syndrome hémolytique et urémique (SHU) 0157 H7. E. coli individualisé au début des années 1980 aux USA à l’occasion d’épidémies de colites hémorragiques liées à la consommation de hamburgers. Ces mêmes bactéries sont les agents du syndrome hémolytique et urémique (SHU) dit idiopathique de l’enfant. Ce type de pathogénie révèle la vulnérabilité des modes de fabrication industrielle de certains aliments. Après une diarrhée hémorragique, entre 5 et 10% des personnes infectées, particulièrement les jeunes enfants et les personnes âgées, développent une complication sévère, le SHU. Syndrome avec anémie, taux de plaquettes bas, insuffisance rénale taux de létalité entre 2 et 7% et des séquelles à long terme comme des lésions rénales ou sérologiques ou hypertension. * Aux USA : Région la plus touchée. Le CDC estime que les ECEH 0157H7 infectent chaque année 20 000 personnes aux Etats-Unis et provoquent la mort de 500 d’entre elles. * En Europe : Angleterre, Pays de Galle : 18 épidémies 1992-1994. ECEH en France, pas de données. Pour le SHU, incidence 1/100 000 enfants de moins de 15 ans. Formes sporadiques, jamais épidémiques, des infections existent à bas bruit, sans que l’on puisse dire quel est le mode de transmission en cause. - Nombreux véhicules alimentaires : . steak haché . viande d’origine bovine, . lait non pasteurisé . fromages, yaourts, produits laitiers . cidre, jus de pomme (fruits tombés non lavés) . légumes crus . eau de boisson - Transmission inter-humaine possible - Pas de porteur sain chronique - Facteur de pathogénicité : . adhésion à la bordure en brosse des cellules intestinales - 32 - . production de toxines du groupe des vérotoxines - Diagnostic : . difficile . milieu sorbitol . agglutination . PCR - AC - Antibiotiques : . administration inutile, parfois même ils peuvent provoquer un effet néfaste en libérant de façon massive les vérotoxines par lyse des E. coli. . après entérites, le risque de développer un SHU est identique, voire plus élevé en cas de prise d’antibiotiques. La famille des Vibrionaceae Elle regroupe des bacilles à Gram négatif, mobiles par ciliature polaire ou mixte, aéro-anaérobies facultatifs, croissant sur milieux ordinaires, réduisant les nitrates en nitrites, fermentant les glucides et donnant une réaction d’oxydase positive. Elle regroupe quatre genres : Vibrio, Plesiomonas, Aeromonas, Photobacterium. Les Vibrionaceae sont des bactéries aquatiques. Les espèces des genres Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas sont rencontrées en pathologie humaine. Les bactéries du genre Photobacterium sont des bactéries de l’environnement. Le genre Vibrio Les Vibrio sont des bacilles à Gram négatif généralement isolés, droits ou incurvés, assez courts (1,5 à 3,0 µm) parfois franchement coccobacillaires. On distingue des espèces halotolérantes - V. cholerae - V. cholerae non-01 et NC (non cholérique) et NAG (non agglutinable par le sérum polyvalent 01) - V. mimicus On distingue des espèces halophiles - V. fluvialis - V. metschnikovii - V. anguillarum, V. vulnificus - V. parahaemolyticus - V. fischeri, alginolyticus, costiculus… - V. damsela - V. hollisae - V. furnissii Une autre distinction peut être faite selon que les espèces sont retrouvées ou non en pathologie humaine : - soit comme pathogènes pour l’Homme : V. cholerae, V. parahaemolyticus - soit comme saprophytes ou opportunistes : V. alginolyticus, V. furnissii, V. damsela, V. fluvialis, V. mimicus, V. hollisae, V. metchnikovii, V. vulnificus. Habitat et épidémiologie L’agent du choléra est éliminé en grande quantité par les malades dans les selles, ainsi peut-on retrouver de 106 à 108 vibrions par ml de selles. Il est présent également dans les vomissements. On peut retrouver V. cholerae dans le milieu extérieur. Relativement fragile, ce germe persiste de façon éphémère dans les - 33 - eaux d’étangs ou de rivières. Sa survie est prolongée dans les eaux salées (lagune, …) ; il peut y survivre plus de 15 jours. Il peut également persister dans certains aliments frais (lait, poisson, …) durant plus de deux semaines. L’homme est le principal réservoir de vibrions cholériques, qu’il soit malade ou porteur « sain ». Le vibrion est en général retrouvé durant 6 à 10 jours chez le porteur, parfois plus longtemps (porteur chronique). La contamination peut se faire surtout par contact manuel direct avec un porteur et surtout avec un malade ou un cadavre. Dans les régions sèches, la transmission est uniquement interhumaine. En zone humide (côtière, lagunaire ou fluviale) la transmission est mixte, interhumaine et hydrique. Les circonstances favorisant la diffusion de la maladie sont liées au bas niveau socio-économique et surtout aux mauvaises conditions de peuplement. Physiopathologie Après avoir franchi massivement la barrière gastrique, les vibrions se multiplient rapidement dans l’intestin ; ils traversent la couche de mucus et adhèrent aux entérocytes par leurs antigènes d’attachement. L’entérotoxine libérée provoque le tableau du choléra. Pouvoir pathogène Le choléra est une maladie strictement humaine. La durée d’incubation varie de quelques heures à 5 jours selon la dose infectante. Émergence d’un nouveau Vibrio cholerae épidémique en Asie. Le Vibrio cholerae 01 est l’agent responsable du choléra épidémique. Plusieurs autres espèces de Vibrio (V. cholerae non-01 V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. damsela, V. fluvialis, V. algynoliticus, V. hollisae, V. metschnikovii, V. furnissii, V. mimicus et V. cincinatiensis) sont à l’origine d’infections gastro-intestinales et extra- intestinales localisées ou généralisées dont la survenue était jusqu’à ce jour toujours sporadique. Les infections à Vibrio autres que V. cholerae 01 (ou Vibrio halophiles) sont, en zone d’endémie, acquises lors de la consommation de coquillages crus ou peu cuits ou par contact du milieu marin avec une plaie cutanéo-muqueuse. Depuis la fin 1992, plusieurs épidémies de syndromes cholériques associés à l’isolement d’un V. cholerae non-01 ont eu lieu en Inde et au Bangladesh. La première de ces épidémies a eu lieu en octobre-novembre 1992 à Madras, état du Tamilnadu en Inde. Les 124 Vibrio isolés lors de cette épidémie se sont révélés ne pas agglutiner ni avec l’antisérum 01 ni avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les facteurs A, B et C de V. cholerae 01. Ce Vibrio a donc été identifié comme un V. cholerae non-01 sans toutefois pouvoir être typé parmi les 138 sérotypes de V. cholerae non-01 connus à ce jour. À Calcutta, bien qu’il n’y avait pas d’augmentation du nombre de cas de choléra, la plupart (> 95 %) des Vibrio isolés des selles de patients atteints de syndrome cholérique en janvier 1993 étaient des V. cholerae non-01. Ces V. cholerae non-01, comme ceux du Tamilnadu n’étaient pas typables et possédaient les gènes spécifiques de la toxine cholérique et de la toxine de la zonula occludens, mais pas ceux de l’entérotoxine thermostable spécifique de V. cholerae non-01. La production de toxine cholérique fut confirmée pour l’ensemble de ces souches en ELISA. La majorité des souches était résistante au cotrimoxazole, à la streptomycine et à la furazoline, mais sensible aux autres antibiotiques, la tétracycline en particulier. - 34 - Dans le sud du Bangladesh, une épidémie de choléra débuta en janvier 1993. En moins de 6 semaines, plus de 10 000 cas et 500 décès y ont été répertoriés. Pendant cette épidémie, un nombre anormalement élevé de cas était noté chez des adultes, groupe relativement moins à risque de choléra au Bangladesh. Tous les Vibrio isolés chez ces patients étaient des V. cholerae non-01 et partageaient les mêmes caractéristiques que ceux isolés en Inde plusieurs semaines auparavant. Une autre épidémie de syndromes cholériques (13 275 cas et 434 décès en 3 mois) associés à l’isolement de ce nouveau V. cholerae non-01 a depuis touché Calcutta de janvier à avril 1993. Lors de ce dernier épisode, il fut aussi noté un taux anormalement élevé de cas adultes. Par ailleurs, parmi 115 cas confirmés de V. cholerae non-01, 93 % avaient des vomissements et 77 % étaient sévèrement déshydratés. Une proportion importante de patients avait une hyperleucocytose, fait inhabituel pour le choléra provoqué par V. cholerae 01. Un antisérum spécifique de cette nouvelle souche de V. cholerae non-01 a depuis été mis au point au Japon à partir des souches isolées à Madras, ce qui a permis de le typer sous le nom de V. cholerae 0139 ou encore sérogroupe « Bengal ». Au-delà des aspects complexes de classification microbiologique, qui en fait sont secondaires, il faut retenir qu’un nouveau V. cholerae producteur de toxine cholérique mais différent du classique V. cholerae 01 a émergé du foyer endémique asiatique du choléra. Ce Vibrio est tout aussi virulent que le V. cholerae 01 et cause d’un syndrome cholérique en tout point similaire au choléra classique (clinique, gravité et mode de transmission), le taux d’attaque élevé chez les adultes du Bangladesh et d’Inde, habituellement prémunis de manière relative contre l’endémie à V. cholerae 01, suggère que l’introduction de ce nouveau Vibrio est très récente dans cette population. Cette caractéristique épidémiologique laisse envisager que l’ensemble de la population y est particulièrement susceptible. La propagation de ce nouveau Vibrio est très rapide puisqu’il est passé du sud (Madras) à l’est de l’Inde (Calcutta) et au Bangladesh en quelques semaines. Il est très probable que ce nouveau Vibrio va se propager en Asie et ailleurs en affectant avant tout les plus démunis. Bien que les caractéristiques microbiologiques de ce nouveau Vibrio soient particulières, la prévention et le traitement de la maladie qu’il provoque sont les mêmes que pour le choléra classique. La surveillance internationale de la diffusion de ce nouveau Vibrio devra donc être renforcée. Identification Bacille à Gram (-), fin incurvé, très mobile, ni capsule, ni spore. Aéroanaérobie cultive sur milieux usuels Milieux à pH neutre ou alcalin, pH 9 pas < 6 Optimum de croissance dans milieu à 1 à 3% de NaCl, en milieux liquides de 3 ou 4 h en surface, en milieux solides, colonies en 8-10 heures. Croissance sur milieux avec sels biliaires. En fonction de ces caractères, on utilise : -eau peptonée alcaline pH 8,6 salée à 3% comme milieu d’enrichissement -gélose alcaline pH 9 -TCB S pH 8,6 = thiosulfate citrate bile saccharose En 18-24 h, voile en surface milieu liquide, colonies de 2 à 3 mm de diamètre, smooth, lisses, plates, transparentes, gélose alcaline jaune sur TCBS saccharose (+). - 35 - Sur GS : colonies hémolytiques. Sensible au composé vibriostatique 0129 (des souches R ont été décrites ; il s’agit d’un plasmide de résistance croisée avec R au triméthoprime. Différents biovars HOH sang de mouton Sensibilité polymyxine 50 U VP GR de poulet Vibrio Différence avec : TCB Arginine Gaz en glucose LDC Gélatinase-Dnase C.V. 0129 2-4 diamino-6-7 diisopropylphtéridine + + + + Sensible cholerae eltor S - + R + + Aeromonas + ± ± + Résistant Plesiomonas + + ± sensible Vibrio cholerae : AgO commun sérogroupe 01 (C. cholerae et el Tor) Les autres à caractères biochmiques très voisins sont NAG. Ensuite trois spécificités antigéniques A-B-C qui définissent 3 sérotypes (aussi bien pour cholerae que pour el Tor) : . inaba AC . ogawa AB . hikojima ABC Identification biochimique obligatoire : Hajna glucose (+) ; lactose (-) ; gaz (-) ; H2S (-) ; API 20E ; ONPG (+) ; ADH (-) ; LDC (+) ; ODC (+) ; CIT (+) ; urée (-) ; TDA (-) ; indol (+) ; VP (variable) ; Gel (+) ; Glu (+) ; Man (+) ; Ina (-) ; Sor (-) ; Rha (-) ; Sac (+) ; Mal (-) ; Amy (-) ; Ana (-) Portage Faire en plus des milieux d’enrichissement 2 à 3 g de selles sur EPA. Au bout de 4 à 5 heures, repiquage sur 2ème milieu d’enrichissement. 3ème passage ou enrichissement sur milieux sélectifs. Vibrio parahaemolyticus Habitat et pouvoir pathogène Bactérie présente dans l’eau de mer, dans les eaux littorales, dans les poissons, les coquillages, les mollusques. Vibrio parahaemolyticus est responsable de diarrhées aiguës chez l’homme, consécutives à une ingestion d’aliments contaminés. La diarrhée débute 2 à 6 heures après le repas. Les selles sont souvent hydriques, parfois sanglantes, la température est peu élevée ; la diarrhée persiste 4 à 7 jours. Ce Vibrio produirait une entérotoxine thermolabile, mais le mécanisme de la diarrhée est assez complexe et une action entéro-invasive combinée à l’entérotoxine n’est pas exclue. - 36 - Diagnostic bactériologique Prélèvements La bactérie peut être recherchée à partir de selles, de fruits de mer frais ou congelés, ou d’eaux. La recherche devra être systématique, même en France, à partir des selles, si on a la notion d’intoxication alimentaire consécutive à l’ingestion de produits d’origine marine. Sensibilité aux antibiotiques - Traitement Il est vivement conseillé de déterminer la sensibilité aux antibiotiques de toute souche isolée. La multirésistance est relativement rare chez les espèces du genre Vibrio, et la majorité des antibiotiques utilisés en thérapeutique humaine restent actifs sur les Vibrio. Il faut toutefois signaler que des souches de V. cholerae résistantes à la tétracycline ou même multirésistantes, ont été isolées. Cette résistance est d’origine plasmidique. La résistance au triméthoprime et au cotrimoxazole a également été rapportée. Les Vibrio spp. demeurent en général sensibles aux aminosides, au chloramphénicol et aux quinolones. L’ampicilline est généralement inactive vis-à-vis de la majorité des vibrions. Le traitement du choléra et des gastro-entérites sévères à V. cholerae non 01 entraînant une déshydratation, repose essentiellement sur la rééquilibration hydro-électrolytique et accessoirement sur le traitement antibiotique qui a fait l’objet de controverses compte tenu de la fréquence croissante de souches résistantes. Celui-ci (tétracycline, cotrimoxazole ou érythromycine, ceci en fonction de la sensibilité de la souche isolée, du contexte [adulte ou enfant, femme enceinte, …] et /ou autres facteurs) permet, en éliminant les germes de réduire la fuite d’eau et d’électrolytes et de raccourcir la durée du portage. Aeromonas Groupes impliqués dans les infections humaines : par ordre de fréquence A. hydrophila (espèce type) A. caviae A. veronii biovar sobria (incluant A. ichthiosma) A. jandaei A. veronii biovar veronii A. schubertii A. trota (incluant A. enteropelogenes) A. bestiarum Habitat – Pouvoir pathogène Les Aeromonas sont des bactéries ubiquistes dont le réservoir naturel est les eaux : eaux stagnantes, eaux d’égout, eaux douces, eaux de mer. Leur présence augmente pendant les mois d’été. Les Aeromonas sont isolés fréquemment dans les eaux douces (bactéries dulçaquicoles), dans les eaux stagnantes, les eaux courantes, les eaux de boisson, les eaux de mer ou de lagunes recevant de l’eau douce et les eaux d’égout (concentration 104 ml). Ce sont des bactéries caractéristiques des eaux de surface. Ils peuvent se multiplier dans les eaux douces en fonction des conditions de température, de pH et de la teneur en éléments nutritifs, ils seraient de bons indicateurs de l’état trophique de ces eaux. - 37 - Leur présence est signalée dans divers aliments (huîtres, moules, coquillages notamment) et dans les sols. Il peut faire partie de la flore intestinale de l’homme. Grâce à des recherches utilisant des milieux sélectifs, on a pu montrer l’existence d’un portage intestinal chez les animaux ou chez l’homme. Chez ce dernier, le portage concerne 1 à 3 % des sujets en Europe ou aux Etats-Unis et jusqu’à 8 à 16 % des enfants et 27 % des adultes dans des pays exotiques comme la Thaïlande. Les souches psychotropes, capables de se multiplier dans les aliments même à 4°C, peuvent être responsables de toxi-infections alimentaires. Les trois espèces mobiles d’Aeromonas les plus fréquemment impliquées dans les infections humaines sont A. hydrophila, A. caviae et A. veronii biogroupe sobria. caviae a été associé à des infections intestinales : gastro-entérites et toxiinfections alimentaires. Les manifestations extra digestives sont surtout des infections de plaies : cellulites avec réaction inflammatoire localisée ; il peut y avoir des formes graves de type de gangrène (pronostic défavorable). La complication la plus grave est la bactériémie (le plus souvent sujets à risques : maladies hépatiques, affections malignes). Identification Les Aeromonas sont des bacilles à Gram négatif, aéro-anaérobies dotés d’une oxydase, fermentant le glucose avec ou sans gaz, réduisant les nitrates en nitrites, mobiles par ciliature polaire ou immobiles, résistants au composé 0/129 , une espèce non pathogène pur l’Homme. Caractères bactériologiques Ils cultivent sur milieu ordinaire et leurs colonies ressemblent à celles des entérobactéries. Sur BCP, les colonies peuvent être lactose (+) ; elles sont H2S (-) ; ONPG (+) ; indol (+) ; uréase (-) ; TDA malonate (-). Caractères biochimiques d’identification des principales espèces d’Aeromonas Gaz en VP Indol ADH LDC ODC glucose Aeromonas Escu Hémo Sacch Man Arabi Cello line lyse * arose nitol nose biose caviae - - + V - - + V + + + V hydrophila + + + + + - + + + + V - veronii bvar sobria + + + + + - - + + + - - veronii bvar veronii + + + - + + + + + + - + schubertii - V - + + - - + - - - - jandaei + + + + + - - + - + - - trota + - + + + - - V - + - + * 5 % sang de mouton - 38 - Sensibilité aux antibiotiques - Traitement Les Aeromonas sont en général sensibles aux tétracyclines, aux aminosides, au chloramphénicol, aux fluoroquinolones et à l’association thriméthoprimesulfaméthoxazole. La plupart des Aeromonas produisent des ß-lactamases inductibles chromosomiques, la sensibilité aux ß-lactamines dépend de l’espèce et du niveau d’expression des ß-lactamases. Contrairement à Aeromonas hyrophila, il n’y a pas, chez Aeromonas caviae, d’hydrolyse de l’imipénème. La détermination de la sensibilité aux antibiotiques par micro dilutions en système rapide peut entraîner des erreurs et n’est pas une méthode fiable pour les Aeromonas. La gravité potentielle des formes septicémiques impose un traitement, en général une fluoroquinolone associée à un aminoside. Dans la majorité des cas, sauf terrain particulier, l’antibiothérapie dans le cadre des diarrhées est inutile. Campylobacter Définition : Les Campylobacter sont des bacilles à Gram négatif caractérisés par : - leur morphologie. bacilles fins, de 0,5 à 5 µm de long, incurvés en forme de virgule, en forme de S, de « vol de mouette » ou de forme hélicoïdale pour les formes longues. - leur mobilité. Elle est très vive due à une ciliature polaire monotriche. Elle est classiquement décrite comme un « vol de moucherons ». Les formes longues peuvent être flagellées aux deux extrémités. - Leur métabolisme respiratoire micro-aérophile. - Une réaction oxydase (+). Classification La catalase permet de diviser le genre Campylobacter en deux groupes. A – Groupe catalase négatif Les espèces qui forment ce groupe ne sont pas pathogènes pour l’homme. B – Groupe catalase positif Dans ce groupe on distingue : - C. fetus - C. jejuni est aujourd’hui reconnu comme une bactérie fréquem-ment responsable de diarrhée chez l’homme - C. coli est proche de C. jejuni et a un pouvoir pathogène identique. Habitat et épidémiologie Les Campylobacter sont des bactéries trouvées dans le tube digestif des animaux, notamment les volailles, les ovins et les porcs. Les animaux de compagnie (chien et chat) ont été incriminés comme vecteurs de Campylobacter. La contamination de l’Homme se fait par voie digestive. Les cas de campylobactériose sont le plus souvent sporadiques. L’eau ou des laitages contaminés ont été à l’origine d’épidémies. C. jejuni ITAC – Ce sont des germes invasifs au niveau de l’iléon et du colon, responsables de micro abcès et d’adénopathies mésentériques. Ils provoquent des cas sporadiques, estivaux, frappant surtout les enfants, survenant au contact avec des animaux de ferme, des chats et chiens, de l’ingestion d’aliments contaminés, doit le lait non pasteurisé et la viande de volaille. - 39- Tableaux cliniques vont de la diarrhée aqueuse d’intensité modérée, rapidement régressive au syndrome dysentérique fébrile : myalgies et arthralgies sont fréquentes. On note 10% de rechutes. Seconde cause de gastro-entérite bactérienne en France. Physiopathologie En raison de leur grande mobilité les Campylobacter sont aptes à traverser le mucus. Ils peuvent pénétrer dans les entérocytes. Le caractère invasif de la bactérie se traduit par la présence de leucocytes et de sang dans les selles des malades. Des toxine ont été mises en évidence chez des souches de C. jejuni. L’une d’elles a des propriétés voisines de la toxine cholérique. Une autre toxine aurait une activité cytotoxique. Leur rôle exact est encore à préciser. Indépendamment de la sécrétion de toxines, cette bactérie du mucus peut s’internaliser dans les vacuoles intracytoplasmiques. La contamination est essentiellement alimentaire (volaille et porc) ou par l’intermédiaire de porteurs sains. Caractères bactériologiques - Identification Les Campylobacter sont micro-aérophiles. Le mélange gazeux le plus favorable à leur croissance contient : 5% d’oxygène, 10% de CO2 et 85% d’azote. Il est le plus aisément obtenu en utilisant un générateur adapté placé dans une jarre pour anaérobies. Milieux de culture De milieux sélectifs pour rechercher les Campylobacter dans les selles ont été mis au point. Ils contiennent un mélange d’antibiotiques inhibant la plupart des bactéries de la coproflore : - milieu de Butzler - milieu de Skirrow - milieu de Blaser Les Campylobacter se développent à 37°C, mais une température d’incubation de 42°C favorise la croissance de C. jejuni. Aspect des colonies Sur milieu gélosé les colonies apparaissent en 2 à 4 jours. Elles mesurent 1 à 2 mm de diamètre. Elles sont plates, grisâtres et translucides. - Caractères biochimiques Tous les Campylobacter réduisent les nitrates en nitrites et sont oxydase (+). Les espèces ayant un intérêt médical possèdent toutes une catalase. C. jejuni se distingue par son aptitude à hydrolyser l’hippurate. Caractères permettant de distinguer les principales espèces de Campylobacter rencontrés en médecine humaine : Espèce C. fetus C. jejuni C. coli Croissance à 25°C 42°C + + + Sensibilité à Ac. nalidixique Céfalotine R S S R S* R - C. laridis se distingue par sa résistance à l’acide nalidixique. - 40- Hydrolyse de l’hippurate + - Sensibilité aux antibiotiques - Traitement Les formes septicémiques ou autres que digestives de campylobactériose justifient un traitement antibiotique par voie générale. Pour l’entérite à Campylobacter dont la guérison est spontanée, la nécessité d’un traitement antibiotique se discute. L’antibiotique de choix est alors l’érytromycine qui permet de raccourcir la durée du portage digestif. Les Campylobacter sont sensibles aux aminosides, aux tétracyclines, au chloramphénicol et à la combinaison amoxicilline-acide clavulanique. Clostridium difficile : http://www.microbes-edu.org/etudiant/difficile.htm 1 - Introduction Actuellement, Clostridium difficile, germe anaérobie strict de type bacille à Gram + est reconnu comme un entéropathogène majeur, à l'origine de colites pseudomembraneuses ou de diarrhées post-antibiotiques. Cet agent est majoritairement impliqué dans les diarrhées nosocomiales de l'adulte. 2 - Historique La première description de colite pseudo-membraneuse (CPM) date de 1893 (Finney) chez une jeune femme au décours d'une chirurgie digestive. Trente ans plus tard, Hall et O'Toole décrivent la bactérie présente dans les selles de nouveau-nés asymptomatiques comme Bacillus difficilis en raison des difficultés rencontrées pour sa culture. Ce n'est que dans les années 1970 que le rôle de C. difficile dans les CMP et diarrhées est reconnu. En effet, l'introduction de la clindamycine (famille des lincosamides) en thérapeutique entraîne une flambée d'observations de CPM. Puis Larson (Angleterre) et John Bartlett (USA)(Photo ci-jointe) démontrent l'existence d'une activité cytotoxique dans les selles de patients atteints de CPM post-antibiotiques. Enfin en 1984 sont caractérisées les toxines A (entérotoxine) et B (cytotoxine). 3 - Habitat Le portage digestif asymptomatique de C. difficile est estimé à 3% dans la population adulte mais il peut atteindre 15 à 25% des sujets après un traitement antibiotique ou un séjour dans une unité à forte endémicité. En revanche, un taux de portage élevé est habituellement observé chez les jeunes enfants: 50-70% des enfants de moins de 2 ans sont colonisés. Ce germe est aussi commensal chez l'animal comme le porc. 4 - Epidémiologie Cet agent est majoritairement impliqué dans les diarrhées nosocomiales de - 41- l'adulte. Plusieurs dizaines d'épidémies ont été décrites aux USA et en Europe. D'où une surveillance en milieu hospitalier. http://infobits.chus.qc.ca/colite.htm http://www.hospvd.ch/swiss-noso/f23a2.htm On peut être amené à confronter les souches isolées par différentes méthodes : - phénotypique : sérogroupage; - génotypiques : AP-PCR, PCR-ribotypage, électrophorèse en champ pulsé, toxinotypie (PCR-RFLP) analysant le polymorphisme des gènes codant pour les toxines A et B. 5 - Pouvoir pathogène C. difficile est responsable de 15-25% des diarrhées post-antibiotiques. Les signes cliniques régressent dans 25% des cas après l’arrêt de l’antibiotique responsable. . Plus de 95% des CPM présentent les signes suivants: diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, hyperleucocytose. . Les complications sont graves: perforation, péritonite, mégacôlon toxique. . Enfin les rechutes sont fréquentes (20%) et surviennent dans les 2 mois suivant l’épisode. . La quasi-totalité des antibiotiques ont été incriminés, en particulier ceux à large spectre ayant une activité visà-vis de la flore anaérobie. Prévalence de C. difficile et de ses toxines dans les selles de différentes populations http://www.angh.org/ndl_df_cag_diagnostic.htm 6 - Physiopathologie - La prescription depuis plusieurs jours d'antibiotiques à large spectre (aminopénicillines, céphalosporines) ou à spectre étroit (clindamycine) entraine au sein de la flore digestive, l'émergence et la sélection de C. difficile qui va produire des toxines par la suite: - 42- - Les 2 facteurs principaux de virulence sont la toxine A et la toxine B. Ce sont des exoprotéines de grande taille. . La toxine A est nommée entérotoxine, car fortement entérotoxique dans le modèle de l’anse ligaturée de lapin ; elle possède également une activité cytotoxique. . La toxine B ou cytotoxine est mille fois plus puissante que la A. Ces toxines inactivent des protéines régulatrices du cytosquelette d’actine (monoglycosylation des protéines Rho). - D’autres facteurs (enzymes protéolytiques, expression de fimbriae et flagelles, adhésion, capsule) pourraient jouer un rôle. Certaines souches produisent une autre toxine (ADP-ribosyltransférase ou toxine binaire) qui pourrait participer au pouvoir pathogène. Les souches non toxinogènes sont considérées comme non virulentes. http://www.uark.edu/campus-resources/mivey/ressum.html 7 - Diagnostic biologique - Outre les aspects cliniques habituels, l'endoscopie associée ou non à la tomographie axiale permettra de visualiser certains aspects: Si la rectosigmoïdoscopie avec visualisation des membranes est très spécifique, les pseudomembranes ne sont pas toujours présentes dans les colites. - Le diagnostic bactériologique repose sur la recherche des toxines. En parallèle, la culture de C. difficile est recommandée. On reteindra qu'il s'agit d'un examen inhabituel demandé spécifiquement dans un contexte clinique particulier - 43- Prélèvement C. difficile est recherché à partir des selles liquides en évitant l’écouvillonnage rectal. La recherche des toxines doit être effectuée à partir de selles ou de liquides intestinaux (examen endoscopique). Si l’examen est différé, les échantillons doivent être conservés à 4°C. La conservation à température ambiante ou la congélation à –80°C diminuent notablement l’activité des cytotoxines. Mise en évidence des toxines La grande majorité des souches produisent simultanément les toxines A et B. Leur mise en évidence directement à partir des selles est un excellent marqueur de la présence d’une souche toxinogène de C. difficile. Des souches toxine A- toxine B+ sont maintenant décrites. Une étude japonaise rapporte une forte prévalence mais en France, leur fréquence reste faible (1,5 à 3%). Toutefois, ces souches (délétées dans la partie comportant l’épitope reconnu par les Ac), ne sont pas dépistées par les tests immuno-enzymatiques ne détectant que la toxine A (http://microvet.arizona.edu/research/ClostridiumWeb/methods.html) * La méthode de référence consiste à rechercher un effet cytopathogène (ECP) de la toxine B par culture cellulaire. Différentes lignées cellulaires sont utilisables: MRC5, Vero, CHO, HeP2. . Sur MRC5 (cf ci-dessous), l’ECP correspond à une ballonisation des cellules (arrondissement du noyau et effondrement du cytoplasme avec apparition d’une forte réfringence). Il est observé après dépôt d’un filtrat de selles sur les cellules. A gauche : culture cellulaire normale A droite: ballonisation des cellules Cette méthode présente une excellente sensibilité (ordre du picogramme) mais se heurte à l’absence de standardisation. Enfin, elle nécessite une infrastructure lourde, le délai de réponse est de plusieurs jours. Souvent seront préférés des test rapides. * Tests immuno-enzymatiques Des tests ELISA ou ceux unitaires immuno-enzymatiques ou immunochromatographiques ont été développés. Ils détectent soit la toxine A seule soit les toxines A et B au moyen d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les tests unitaires rapides permettent de rendre un résultat en moins de 30 minutes. La - 44- spécificité des méthodes ELISA est bonne (>95%) avec une sensibilité qui varie selon les études (60-90%). Exemples d'un test rapide (Triage®) détectant la toxine A (+ à droite) et un antigène bactérien (glutamate déshydrogénase)(+ au milieu et à droite). *Techniques de biologie moléculaire La PCR pour détecter les toxines A et/ou B est encore d’application limitée à cause de l'extraction des selles et de l'éventuelle présence d' inhibiteurs de la Taq polymérase. De nouveaux kits d’extraction et le développement de la PCR en temps réel devraient rendre ces nouvelles approches intéressantes dans un avenir proche. http://microvet.arizona.edu/research/ClostridiumWeb/methods.html 3- Culture et mise en évidence de la bactérie dans les selles * Diagnostic rapide par recherche d’antigène dans les selles Il s’agit de la glutamate déshydrogénase qui peut être mise en évidence par agglutination (test latex) ou par méthode immuno-enzymatique. La spécificité est bonne mais ces tests ne représentent que des méthodes de dépistage puisqu’ils ne préjugent pas du caractère toxinogène de la souche. * Isolement de C. difficile par culture (page suivante) - 45- L’examen microscopique des selles est peu informatif. La culture est effectuée dans des conditions d'anaérobiose stricte (sachet individuel, jarre) sur milieux sélectifs comme le milieu TCCA (gélose cœur cervelle + 5% de sang de cheval, 0,1% de taurocholate, 250 mg/l de cyclosérine et 10 mg/l de céfoxitine). Les subcultures peuvent être effectuées sur gélose au sang ou milieu de WilkinsChalgren. Après 48 h d'incubation en anaérobiose à 37°C, les colonies sont faciles à repérer, elles présentent les caractéristiques suivantes: - colonies circulaires à bords irréguliers (35 mm), non hémolytiques; - colonies présentant un aspect de verre fritté à la loupe binoculaire, - odeur caractéristique de crottin de cheval (libération de crésol); - colonies fluorescentes sous UV (mais dépend du milieu utilisé). * L'identification peut être réalisée par utilisation de galeries biochimiques : rapid ID 32A, API 20A …) mais la plupart des caractères de cette bactérie sont négatifs. Elle ne produit pas d'indole, de lécithinase ou d'uréase à la différence de C. bifermentans et C. sordellii. L'identification définitive se fait par CLHP (détection d'acide isocaproïque). - 46- * Méthodes de typage des souches: Différentes méthodes peuvent être utilisées : - phénotypique : sérogroupe selon la technique de Michel Delmée (Bruxelles) ; - génotypiques : AP-PCR, PCR-ribotypage, électrophorèse en champ pulsé, toxinotypie (PCR-RFLP qui analyse le polymorphisme des gènes codant pour les toxines A et B). 8 - Sensibilité aux antibiotiques - traitement - prophylaxie - L’antibiogramme ne présente qu'un intérêt taxonomique (résistance naturelle à certaines ß-lactamines dont la céfoxitine ou FOX).Cet antibiotique entre dans la composition du milieu TCCA. Exemple d'antibiogramme: FOX, céfoxitine; IPM, imipénème; AMX, amoxicilline; PIP, pipéracilline. La résistance acquise à la clindamycine (CLI) est relativement fréquente. De rares souches de sensibilité diminuée au métronidazole ont été détectées en France mais sont à ce jour des souches de sérogroupe D (non toxinogène). Sinon le traitement est simple: 1 - Arrêt de l’antibiothérapie si possible 2 - Traitements spécifiques : Métronidazole (Flagyl®) 250 mg x 4/j ou 500 mg x 3 /j per os pendant 10 jours. Diarrhée simple ou colite modérée : Lors d’intolérance au Flagyl® ou de rechute : Vancomycine (Vancocin®) 125 mg x 4 /j per os pendant 10 jours En cas de CPM peu sévère Vancomycine, 125 mg x 4 /j per os pendant 10 jours En cas de CPM sévère (retentissement général ou terrain Vancomycine : 500 mg mg x 4/j pendant 10-14 jours fragile) ou complication (perforation colique, dilatation colique aiguë) 3 - Prévention des rechutes Certaines études ont montré que l’association d’agents probiotiques (Saccharomyces boulardii ou Lactobacillus GG) aux traitements antibiotiques usuels, diminuerait le taux de récurrence. http://www.florastor.com/ReceptorSites.asp 4 - Prévention des infections nosocomiales C. difficile est reconnu comme le principal agent de diarrhées nosocomiales chez l’adulte. La prévention de la transmission repose sur l’isolement technique et géographique des patients symptomatiques. Le lavage des mains avec un savon antiseptique (type chlorhexidine actif sur les spores) et port de gants sont des mesures essentielles. L’éradication des réservoirs inertes est difficile du fait de la persistance des spores et impose une désinfection quotidienne. http://www.hospvd.ch/swiss-noso/f23a2.htm http://www.medstudent.ucla.edu/sao/clinical/bugbytes/ - 47- Ce cours a été préparé par le Docteur Dominique DECRÉ (Faculté de Médecine SaintAntoine, Université PARIS VI)(Version provisoire, le 29.07.04). Pour en savoir plus : Quelques adresses: http://infobits.chus.qc.ca/colite.htm http://www.angh.org/ndl_df_cag_diagnostic.htm http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/cc/difficile.html http://lyon-sud.univ-lyon1.fr/bacterio-viro/DESLYON/Fiches/chapitre1/C._difficile.html http://www.hc-sc.gc.ca/pphb-dgspsp/msds-ftss/msds36f.html http://www.cps.ca/francais/enonces/ID/id00-02.htm Clostridium difficile En pratique Culture sur milieux sélectifs les tests biochimiques classiques ont souvent peu de valeur test d’agglutination au latex (oxoïd) : permet la détection de ce germe dans des bouillons de culture sélectifs et d’enrichissement et aussi pour identifier des colonies de C. difficile Principe : des particules de latex sont enduites d’anticorps IgG spécifiques d’antigènes des parois cellulaires de C. difficile. L’agglutination est visible en 2minutes. Recherche des toxines A et B (ImmunoCard) : sur les selles sur la bactérie isolée Le test immunocard toxines A et B est une méthode immunoenzymatique (EIA) rapide et qualitative, à flux horizontal, destinée à la détection des toxines A et B de C. difficile. Klebsiella oxytoca Klebsiella oxytoca est un bacille gram négatif aéro anaérobie de la famille des entérobactéries faisant partie de la flore colique, dite secondaire, qui n’est généralement pas recherché comme pathogène en coproculture au sein de la flore intestinale normale. C’est un germe saprophyte de la flore fécale normale. Même s’il est retrouvé dans 30 à 40 % des cas dans la flore fécale de l’Homme, son rôle pathogène est donc, comme celui de E. coli, difficile à apprécier par sa seule présence en coproculture. Sakuraï et col. ont, en 1979, rapporté la présence de Klebsiella oxytoca dans les cultures de la muqueuse colique chez deux patients présentant un aspect de colite hémorragique après prise d’ampicilline. Plus récemment, d’autres observations ont été rapportées après prise de pristinamycine (Pyostacine) ou de synergistine. Les colites hémorragiques post-antibiotiques associées à des cultures positives de Klebsiella oxytoca se traduisent par l’apparition d’une diarrhée sanglante, des douleurs abdominales et parfois de vomissements un à sept jours après la prise d’antibiotiques. L’atteinte du côlon gauche apparaît quasi constante et le diagnostic est le plus souvent établi à l’aide d’une simple rectosigmoïdoscopie. L’évolution spontanée est favorable en quelques jours. L’utilité d’un traitement antibiotique par fluoroquinolone est discutée. Le diagnostic repose, non sur la coproculture qui n’a pas de signification puisque ce germe peut être retrouvé chez des sujets normaux, mais sur la culture des biopsies de la muqueuse colique. Ces colites hémorragiques seraient - 48- liées à la sécrétion par Klebsiella oxytoca de cytotoxines dont l’activité ressemblerait à celle de la toxine A de Clostridium difficile. Virus des diarrhées C. Mengelle - Laboratoire de Virologie, CHU Purpan, Toulouse - (1998) Les gastroentérites virales (qui comportent diarrhées et/ou vomissements) affectent une grande partie de la population. Dans les pays développés, elles sont une cause majeure de maladies chez les bébés et les jeunes enfants ; dans les pays en voie de développement, elles constituent dans ce même groupe épidémiologique une cause majeure de morbidité et mortalité. Une étude menée aux USA a montré que les gastroentérites virales représentent 16% de l’ensemble des maladies. Elles surviennent dans deux conditions épidémiologiques précises : -les diarrhées de l’enfant : endémie -les épidémies. Au cours des épidémies, le mode de contamination est facile à identifier : alimentation souillée, en particulier coquillages et eau. Le virus infecte les cellules de l’oropharynx, dans lequel il ne provoque pas de manifestations cliniques, mais il doit résister aux pH acides de l’estomac, des sécrétions biliaires et progresser vers les cellules intestinales pour pouvoir s’y repliquer. La replication peut avoir lieu dans les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale, mais aussi dans les cellules lymphoïdes comme pour les Adenovirus. Cette multiplication au niveau du site de prédilection du virus provoque les manifestations cliniques. Il existe des barrières naturelles qui empêchent l’attachement du virus à la cellule et sa pénétration intracellulaire. Il s’agit de la réponse immunitaire locale humorale et cellulaire. La réponse immunitaire humorale correspond aux anticorps de classe IgM, IgG et IgA présents dans le sérum et le liquide duodénal. La réponse immunitaire à médiation cellulaire est mal connue. Les principaux virus rencontrés au cours des gastroentérites sont : - - - Les Rotavirus qui sont les principaux virus responsables des diarrhées sévères de l’enfant : une enquête réalisée aux USA a dénombré 3,5 millions de cas par an, résultant en 35% d’hospitalisation pour gastro-entérites et provoquant 75 à 150 décès. Les Rotavirus sont responsables dans les pays développés de la majorité des diarrhées aiguës (DA) hivernales survenant sous forme de cas sporadiques chez les nourrissons et les enfants de moins de 3 ans. Ils sont plus rarement en cause chez l’adulte. La DA est bénigne associée à des vomissements et parfois une fièvre modérée ; elle dure de 2 à 6 jours. Les formes sévères avec déshydratation sont possibles, surtout chez le nourrisson. Les Adénovirus sont deuxième cause de gastro-entérite du nourrisson. Le tableau clinique est analogue à celui des Rotavirus. Les calicivirus (virus du groupe Norwalk – agent découvert en 1972 - et apparentés) sont également ubiquitaires mais atteignent les enfants plus âgés et les adultes. La transmission est hydrique et entraîne de petites épidémies de groupe. L’incubation est courte et la durée de la maladie très brève. Elle se - 49- manifeste par des vomissements, la diarrhée, des myalgies et une fièvre modérée. Physiopathologie Rotavirus : La multiplication a lieu essentiellement au niveau de l’intestin grêle, au niveau des entérocytes qui accumulent de très nombreuses particules virales dans le réticulum endoplasmique. Une malabsorption transitoire se traduit par une diminution de l’activité des enzymes des cellules de la bordure en brosse. Une fuite de sodium se produit. Agent de Norwalk : Le virus provoque l’atteinte de la muqueuse jéjunale, par contre aucune lésion histologique n’est visible au niveau gastrique ou rectal. Une malabsorption transitoire est également observée, ainsi qu’une diminution de l’activité des enzymes des cellules de la bordure en brosse (phosphatase alcaline en particulier). - 50- Gastroentéropathies parasitaires et mycosiques M.D. Linas - Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHU Rangueil, Toulouse (1998) Le tube digestif héberge de nombreux parasites. Mais le problème diagnostique est différent selon que le malade a toujours vécu en Europe ou a séjourné en zone tropicale. Le malade n’a jamais quitté l’Europe Douleurs abdominales : des douleurs abdominales de siège, de type et variables, isolées ou associées à des nausées, des vomissements, des dyspeptiques, révèlent occasionnellement une parasitose digestive : ascardiase, giardiase, plus rarement anisakiase, fasciolase erratique, autochtone, candidose gastrique ou intestinale, …. d’horaire troubles téniasis, amibiase Troubles du transit : - - - - Si la diarrhée ou la constipation s’associe à une hyperéosinophilie, on discute une helminthiase : téniasis, ascaridiase, anisakiase, trichinose. Nous ne reviendrons pas sur les aléas du diagnostic coprologique. Devant une rectocolite avec épreintes, ténesme, émission de glaires et de sang, ulcérations recto-sigmoïdiennes, on évoque l’amibiase autochtone, malgré sa rareté. Une diarrhée chronique du grêle, avec ou sans malabsorption, implique la recherche de Giardia dans le liquide de tubage duodénal et des selles. La giardiase peut provoquer une malabsorption ou complique fréquemment d’autres entéropathies. Au cours des diarrhées postantibiotiques, il n’est pas rare de trouver des Candida dans les selle, leur rôle pathogène est loin d’être toujours démontré, sauf s’ils sont très abondants. Examen L’examen macroscopique doit être soigneux. Il faut rechercher les oxyures adultes et les anneaux mûrs du genre ténia ; ces anneaux sont musculeux et animés de mouvements, de couleur blanchâtre et volontiers comparés à des pâtes alimentaires cuites. La distinction entre Taenia saginata et Taenia solium n’est pas indispensable pour le traitement. Les ascaris adultes sont exceptionnellement retrouvés. Il faut être vigilant vis-à-vis des pseudoparasites. L’examen microscopique peut fréquemment retrouver des flagellés (Giardia intestinalis) et des amibes à l’examen direct et après concentration. L’examen des techniques de concentration ne mettront que rarement des œufs d’helminthes en évidence. Il existe fréquemment des œufs en transit, œufs de grande douve (Fasciola hepatica), petite douve (Dicrocoelium dentriticum), œufs d’acariens. Ces œufs en transit se repèrent car ils se trouvent à différents stades de développement et sont altérés. La technique de la cellophane adhésive pourra compléter cet examen si nécessaire pour la recherche d’œufs d’oxyures. Parasites susceptibles d’être diagnostiqués a. Protozoaires : Amibes - Flagellés b. Helminthes : Taenias – Oxyures – Trichocéphale Ascaris (engrais humains) c. Champignons. - 51- Le malade a séjourné en zone tropicale Chez un Européen ayant séjourné ou ayant vécu outre-mer ou un travailleur migrant originaire des pays tropicaux, sont à évoquer l’amibiase et les helmintiases, plus rarement une mycose. L’amibiase intestinale aiguë est aisément démontrée par la mise en évidence des amibes hématophages (Entamoeba histolytica). En revanche, on abuse du diagnostic d’amibiase intestinale chronique chez de vieux « coloniaux » colopathies : même si l’on trouve dans leurs selles des formes minuta ou des kystes, il n’est pas certain que l’amibiase soit responsable des troubles digestifs. Une coccidiose à Isospora belli peut être responsable de diarrhée aiguë persistante avec présence d’oocystes à l’examen des selles. De nombreux helminthes provoquent des douleurs abdominales, des troubles du transit, des nausées, des vomissements : vers rond (ascaris, ankylostomes, anguillules, trichostrongyles, capillaria, gnathostomes, …) ténias (Taenia saginata, Hymenolepsis nana, ….), douves intestinales (d’Orient et d’Egypte), schistosomes intestinaux (Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, …). L’examen coprologique complété au moindre doute par des techniques spéciales (Baerman, rectoscopie avec biopsie rectale ou sigmoïdienne), met en évidence les larves ou les œufs de ces vers. Des mycose exotiques disséminées créent des localisations digestives surtout intestinales de diagnostic difficile : histoplasmose, blastomycose, coccidioïdomycose). Enfin, le gastro-entérologue est parfois consulté pour un méga œsophage latinoaméricain, peut être chagasique, ou une « gastro-entérite » fébrile apparue au retour d’un séjour en zone tropicale qui évoque en premier lieu un accès palustre de primo-invasion. Examen Les protozoaires, amibes et flagellés, sont fréquents ainsi que les œufs et larves d’helminthes. Parasites susceptibles d’être diagnostiqués : Entamoeba histolytica +++ Flagellés Helminthiases digestives : Ascaris – Ankylostome – Anguillule - Taenia Douve intestinale - Schistosome, …. Le malade est immunodéprimé La giardiase n’est pas une maladie opportuniste des sujets ayant un déficit immunitaire, elle n’est pas spécialement pathogène au cours du SIDA, mais prend un caractère récidivant. L’anguillulose, seule helminthiase citée ici, a un statut bien particulier : elle ne devient maligne que dans certaines situations d’immunodépression liées surtout à la prescription à haute dose de corticoïdes : greffés faisant une réaction de rejet, porteurs d’une maladie de système traités. Elle est rarement observée au cours du SIDA. Chez un immunodéprimé (SIDA), on recherchera aussi des cryptosporidies et des microsporidies en plus de l’examen standard parasitologique. La cryptosporidiose est retrouvée essentiellement en France chez les patients atteints de SIDA. Contrairement aux Etats-Unis elle est exceptionnelle chez l’immunocompétent. - 52- La microsporidiose à Enterocytozoon bieneusii, de découverte récente, semble responsable de diarrhée prolongée chez 20 à 30% des sidéens pour lesquels aucun cas de diarrhée n’a pu être identifié. Examen L’examen microscopique direct ou « état frais » doit être soigneux. Environ 30% des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et présentant une diarrhée chronique sont porteurs de parasites, protozoaires essentiellement, dont Blastocystis hominis. Ce parasite est reconnu actuellement comme pathogène lorsqu’il est en grande abondance. La technique de concentration devra concentrer les kystes de protozoaires. Les cryptosporidies peuvent être concentrées par la technique de Bailanger ou de Ritchie. Une partie du culot servira à faire un frottis qui sera ensuite coloré par la coloration de Ziehl-Neelsen modifiée. En cas de diarrhée persistante, il faudra entreprendre la recherche des microsporidies. Chez les malades porteurs de cryptosporidies et de microsporidies, la répétition des examens montre une persistance de ces parasites de 2 à 6 mois. Parasites susceptibles d’être diagnostiqués : Protozoaires +++ : Amibes - Isospora belli – Microsporidies - Cryptosporidies (Si Giardia intestinalis abondant) - Blastocystis hominis Helminthiases ± Anguillule Champignons : Candidose +++ - 53- Téléchargeable : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/ecolishig/ecolishig-souches-fiche01a.pdf - 54- Téléchargeable : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/salmcnr/salmcnr-fiche01.pdf - 55- - 56- Téléchargeable : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/yersinia/yersinia-fiche01.pdf - 57-