Lyon_FS_2015

Quantification de la « Fibrine soluble » ou
« Soluble Fibrin Complexes »
Genève, mars 2013
Les anciens tests pour la détection des produits de
dégradation de la fibrin(ogène)e
- Agglutination de certaines souches de streptocoques ou de latex enrobé d’Ac antifibrinogène
- Faites sur sérum (thrombine + trasylol, 30 min à 37°C + centrifugation)
Etude contrôlée par électrophorèse du surnageant de centrifugation
20/135 (15%)+ : fibrinogène et monomères de fibrine résiduels
81/135 échantillons de patients héparinés: 19/81 (23%) faux +
1/54 (2%) faux + : échantillons de patients sans héparine
Connaghan, Francis, Ryan, Marder Am J Clin Pathol 1986:86:304
Conclusions
Faux positifs par coagulation incomplète du plasma
Faux négatifs par incorporation de PD fibrine dans le caillot
Terminologie des « Fibrin soluble complexes »
Protéine détectée dans les échantillons sanguins qui:
- réagit avec des anticorps polyclonaux dirigés contre le fibrinogène
- contient moins de 2 moles de fibrinopeptide A par mole d’équivalent fibrinogène
(attestant le clivage du fibrinopeptide A)
- a une masse moléculaire adéquate
- présence de fibrinopeptides A ou B dans le polymère
- présence des crosslinks induits par le FXIIIa
- a tendance à former des aggrégats
- a une activité catalytique pour l’activation du plasminogène et du FXIII
- exprime des sites antigéniques pour des anticorps spécifiques de la fibrine
« Fibrine soluble » ou Soluble Fibrin complexes
desA-profibrin molec (desAFM)
..
Da
Fibrinogène (Fg)
..
Da
D
FpA FpA
E
..
Da
D
Thrombine
Ea
D
..
FpA
E
..
Da
D
desAA-fibrin monomer (desAAFM)
Da
Ea Ea
Da
..
D
E
Interactions Da-Ea (non-covalentes)
1)Fg * desAFM, Fg * desAAFM, Fg * desAAFM * Fg, desAFM *desAFM, desAAFM * desAAFM
desAFM * desAAFM, desAAFM * Fg * desAAFM
2)FgDP * desAFM, FgDP * desAAFM, FnDP * desAFM, FnDP * desAAFM
Si les rapports Fg/desAAFM et FgDP/desAAFM sont élevés la taille des complexes est réduite
ce qui augmente leur solubilité
Liaisons (covalentes) induites par le FXIIIa (contenant des liaisons D-D)
1)La fibrine stabilisée peut rester soluble si elle est de petite taille
2)desAAFM*Fn*desAAFM, Fg*Fn*Fg, desAFM*Fn*desAFM
Coagulation « locale » versus coagulation systémique
Locale
Le sang entre en contact avec les composants sous-endothéliaux ou du FT
Son but est de refermer le « trou » dans le tapis endothélial
La fibrine soluble est un sous-produit de la formation du caillot ou provient
de la libération de la thrombine du caillot dans le sang
La quantité de fibrine va dépendre du degré d’activation de la coagulation et
de l’intensité du contact avec le flux sanguin
Coagulation « locale » versus coagulation systémique
Systémique
La coagulation a lieu dans le torrent circulatoire (p. ex. CIVD) et produit
des agrégats solubles plus petits que des caillots insolubles (absence de
stase)
La concentration des complexes solubles est plus élevée chez les
patients avec CIVD qu’avec les patients avec maladies
thromboemboliques veineuses
Principes des tests mesurant la fibrine soluble
1) Analyse de la région N-terminale et filtration sur gel
2) Paracoagulation et précipitation
3) Adsorption par le fibrinogène ou la fibrine
4) Utilisation de substrats chromogènes
5) Epitopes spécifiques de la fibrine générés par la coupure des fibrinopeptides
6) Epitopes crées par la polymérisation de la fibrine
7) Ac spécifiques de la fibrine générés par immunisation de fibrine polymérisée
Analyse de la région N-terminale et filtration sur gel
a)
La coupure des fibrinopeptides créé de nouvelles séquences d’aa
b)
La chromatographie d’exclusion permet de séparer les fragments de
fibrine soluble du fibrinogène. Il faut ensuite identifier les dérivés de
la fibrine (électrophorèse sur gel d’acrylamide et détection
immunologique).
Ces tests ne peuvent pas être utilisés en routine
Paracoagulation et précipitation
a) Paracoagulation d’échantillons de plasma après adjonction d’éthanol
-
quantification par néphélométrie
-
peu sensible mais très spécifique
-
! faux-positifs si fibrinogène très élevé ou si grande quantité de FnDP
b) Précipitation (protamine, ristocétine, histones, etc.)
-
quantification par néphélométrie
-
dissolution du précipité et dosage de la teneur en protéines
Adsorption par le fibrinogène ou la fibrine
1) La chromatographie d’affinité sur fibrinogène-agarose permet d’absorber les
complexes contenant des MF et les séparer des produits de dégradation de la
fibrine crosslinkée
2) Fg fixé sur des puits de microplaques et détection immunologique des complexes
contenant des desAFM et desAAFM
3) Méthode Largo: erythrocytes enrobés de FM. Les complexes de fibrine soluble
font agglutiner les erythrocytes
4) Variante de Muller: particules de latex enrobées de FM
5) Gly-Pro-Arg-Pro-phorèse: première migration dans un gel contenant le
tetrapeptide puis dans un gel sans le tetrapeptide
Méthodes utilisant des substrats chromogéniques
La fibrine soluble polymérisée et le fibrinogène dénaturé catalysent
l’activation du plasminogène par le t-PA (régions Aα148-160 et γ312-324)
La fibrine soluble crosslinkée et les complexes crosslinkés contenant des FM
n’ont pas de fonction catalytique
a)Coa-Set soluble fibrin (Chromogenix): t-PA, plasminogène, Ac antiantiplasmine, substrat de la plasmine
b)Berichrom FM (Dade Behring): t-PA, miniplasminogen
(Val442plasminogène), substrat de la plasmine
Epitopes spécifiques de la fibrine générés par la coupure des fibrinopeptides
La coupure des fibrinopeptides créé une nouvelle partie N-terminale dans les chaînes α
et β. Le fibrinopeptide B est coupé bcp. plus lentement que le A. La fibrine soluble
fraîchement formée contiendra plus de desAAFM que de desFAABBFM.
a)Mao produit un monoAc contre le neo-N terminal de la chaîne α17-78: pas de
réaction avec les caillots de fibrine sauf traitement avec 8M urée (pas avec 4M!)
b)Lill produit un monoAc contre le neo-N terminal de la chaîne α: sa liaison nécessite
traitement de l’échantillon avec l’urée ou NaBr (dénaturation réversible, avec le
thiocyanate irréversible).
Le test Enzymum-Test FM (Roche) : dénaturation au thiocyanate, tubes enrobés de
streptavidine, monoAc couplé avec la biotine, calibration avec des FM solubilisés.
!
Le nb de sites E2 exposés par le thiocyanate est très grand d’où sur-estimation (le
calibrateur ne comporte que deux sites E2)
L’épitope est présent dans une grande partie des FnDP
Epitopes spécifiques de la fibrine générés par la coupure des fibrinopeptides
Hamano et al. (Clin Chim Acta 2002:318;25)
- MonoAc F405 obtenu par immunisation avec des desAABBFM en présence du
peptide Gly-Pro-Arg-Pro
- reconnaît l’épitope α17-25
- ne réagit pas avec le fragment DD
- commercialisé par Stago
Suzuki et al. (Thromb Res 2007:121:377)
-MonoAc J2-23 obtenu par immunisation avec des desAABBFM
- reconnaît un épitope Aα 502-521
- ne reconnaît pas les PDFn
- commercialisé par Daiichi
Epitopes crées par la polymérisation de la fibrine
a) Aα148-160 : monoAc (ne lie pas le Fg)
Fibrinostika Soluble Fibrin (Organon Teknika)
b) γ312-324 : mono Ac (ne lie pas le Fg)
Ortho Diagnostic
c) MonoAc Aα148-160 pour la capture et un monoAc dirigé contre la région Cterminale de la chaîne α
!
hétérogénéité de la chaîne α par protéolyse limitée, dégradation de la partie Cterminale chez patients avec gde activité fibrinolytique (CIVD) (plasmine et élastase)
Ac spécifiques de la fibrine générés par immunisation avec de
la fibrine polymérisée
Iatron Soluble Fibrin LPIA
-Fibrine non-crosslinkée solubilisée avec de l’urée pour l’immunisation
- monoAc JIF-23 dirigé contre un épitope conformationnel dans la région Nterminale de la chaîne α (α17-78)
- ne reconnait pas le fibrinogène mais les desAAFM et les desAABBFM
- particules de latex enrobées d’anticorps
TpP ELISA (American Biogenetics Sciences)
- monoAc dirigé contre polymères contenant desAABBFM cross-linkés ou non
Standardisation des tests basés sur des principes très
différents
a) Caillots non-crosslikés solubilisés par des agents chaotropes (urée, NaBr, thyocyanate,
etc.)
b) Fg ou pools de plasma traités avec des traces de thrombine ou des protéases
analogues
c) Caillots protéolysés ou traités avec du CNBr
d) Fg dénaturé
e) Pool de patients avec CIVD
La fibrine soluble contenue dans les échantillons de patients est très hétérogène
Grande variation intra- et inter-individuelle
Pas de comparaison possible des résultats des tests
Même les tests basés sur un même principe (activation du t-PA) donnent des résultats
différents
Corrélations entre les différents tests
Patients samples (n=39)
Calibration des tests avec du desAABBFM
Comparaison de trois tests mesurant la fibrine soluble et les D-dimères
TVP proximales et distales, patients ambulatoires et hospitalisés, anticoagulés et non
anticoagulés
Elias et al. Haematologica 2004:89;499
monoAc F405
Hamano et al Clin Chim Acta 2002;318:25
Ac mono F405 en format latex automate
Hamano et al Clin Chem 2005;51:183
Corrélation entre les complexes solubles de fibrine et D-dimères (Iatron)
Latex enrobé de monoAc JIF-23 sur un Hitachi7170
Patients avec maladies diverses n=????
Nakahara et al Thromb Haemost 2003;89:832
Suivi de 11 patients opérés de ?
Nakahara et al. Thromb Haemost 2003;89:832
F405 latex
STA Liatest D-dimer
IL
Kim et al. Blood Coag Fibrinol 2013:25:150
Kim et al. Blood Coag Fibrinol 2013:25:150
SCORE ISTH
Patients avec ou sans
CIVD avérée au jour 1
D-dimer 1 = MDA DD
D-dimer 2 = Tinaquant
SFC = Iatron SF (JIF23)
Patients avec ou sans
CIVD avérée pendant leur
séjour aux SI
n = 331 avec pathologies diverses, 1870 échantillons
Dempfle et al. Thromb Haemost 2004;91:812
n = 148 (32 avec score JMHW pos) avec 13 pathologies différentes
FDP, D-dimer, SFMC (Largo semi-quantitatif) de Stago
Am J Hematol 2006;81:414
CONCLUSIONS
Les SFC constituent un mélange très hétérogène de produits
Les méthodes de dosages sont basés sur des principes très différents
La concordance des résultats entre différentes méthodes est très faible
Un calibrateur commun à toutes les méthodes est irréalisable
Depuis quelques années des méthodes réalisables sur des automates sont
disponibles
La principale application du dosage des SFC pourrait être une aide au
diagnostic de la CIVD et du monitorage de son traitement
n= 242
n= 143
n= 148