Rapport de jury - Agregation interne 2007 - Accueil

Secrétariat Général
Direction générale des
ressources humaines
Concours du second degré – Rapport de jury
Session 2007
AGREGATION
Interne
BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE
Rapport de jury présenté par Madame Françoise GUILLET
Présidente de jury
Les rapports des jurys des concours sont établis sous la responsabilité des présidents de jury
1
SOMMAIRE
page
Composition du jury
3
Renseignements statistiques
4
Epreuves d’admissibilité
Première épreuve : Dossier technique relatif à un problème biotechnologique
o
o
-
Sujet
Rapport de l’épreuve
Seconde épreuve : Questions Biochimie, biologie cellulaire, microbiologie
o
o
Sujet
Rapport de l’épreuve
Epreuves d’admission
- Travaux pratiques
o
o
-
4
24
29
29
: Exploitation de documents techniques et pédagogiques.
Sujets
Rapport de l’épreuve
32
51
Epreuve sur dossier : Soutenance d'un dossier relatif à un projet.
o
Rapport de l’épreuve
Résultats des concours
Conclusion générale
53
53
2
Composition du jury
Président :
Mme GUILLET Françoise, Inspecteur général de l'éducation nationale
Vice-président :
M. DANIEL Jean-Yves, professeur des universités - Université Bordeaux II
Secrétaire du jury :
M. VANNESTE Patrick, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS
Membres :
Mme. BENAYOUN Christine, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS
M.CNOKAERT Joël, inspecteur d'académie- inspecteur pédagogigaque régional - Académie d’aix
Marseille
M. DUCANCEL Frédéric, Ingénieur de recherche - CEA gif Sur Yvette Académie : Versailles
Mme. ETIENNE Isabelle, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS
M. PERRIN Jean-François, professeur agrégé - lycée Saint louis Académie : BORDEAUX
M. PLAS Christian, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS
M. TELLIER Charles, professeur des universités - UMR-CNRS Académie : NANTES
Mme. WALTHER Claudine, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS
3
STATISTIQUES
NOMBRE DE CANDIDATS INSCRITS
Agrégation interne : 77
CAER : 14
NOMBRE DE CANDIDATS PRESENTS
PREMIERE EPREUVE
Agrégation interne : 49
CAER : 6
SECONDE EPREUVE
Agrégation interne : 48
CAER : 6
AGREGATION DE BIOCHIMIE - GENIE BIOLOGIQUE
Concours interne
Session 2007
PREMIERE EPREUVE
Durée : 6 heures
Coefficient : 1
Dictionnaire bilingue anglais – français autorisé.
L’usage de tout ouvrage de référence, de tout autre dictionnaire et de tout matériel
électronique est rigoureusement interdit.
Si les lipides occupent une place de plus en plus importante dans le domaine alimentaire (produits
allégés, produits enrichis en acides gras polyinsaturés…) et médical (obésité, risques
cardiovasculaires…), les domaines d’applications couverts par la lipochimie sont très vastes : parmi
ceux-ci nous pouvons mentionner les cosmétiques, les détergents, les peintures…
Le sujet propose différents thèmes relatifs aux lipides : analyses médicales, fabrications et contrôles
de produits cosmétiques et alimentaires, agronomie, génie fermentaire.
4
PARTIE A : détermination de la triglycéridémie
Le dosage des triglycérides est couramment pratiqué en classe de BTS Analyses Biologiques. Cette
partie propose l’étude de deux méthodes de dosage (documents 1 et 2).
QUESTION A1
Indiquer les réactions mises en jeu dans les deux méthodes de dosage.
QUESTION A2
Dans la première méthode plusieurs témoins sont effectués. Montrer la nécessité de ces témoins.
Démontrer la formule de calcul C = F .
A. Expliciter
A et calculer F.
QUESTION A3
Dans les deux méthodes le résultat peut être corrigé de – 0,11 mmol.L-1. Justifier cette correction.
PARTIE B : fabrications et contrôles de produits alimentaires et cosmétiques
QUESTION B1
Le beurre doit contenir moins de 16 % d’eau. Cette teneur en eau peut être contrôlée par la méthode
de Dean Stark.
L’appareil utilisé est représenté ci-dessous :
Une masse voisine de 50 g de beurre est introduite dans le ballon. Du xylène, quelques parcelles de
paraffine (anti-mousse) et une ou deux billes de verre sont ajoutés.
L’ébullition est maintenue à allure lente et régulière.
Le volume d’eau dans l’éprouvette est noté lorsque celui-ci est constant.
Le résultat est exprimé en grammes d’eau dans 100 g de beurre.
Rédiger le principe de cette méthode.
QUESTION B2
Le cholestérol peut être éliminé du beurre en le traitant par des cyclodextrines. La structure des
cyclodextrines est présentée dans le document 3.
A partir des données de ce document, présenter, à l’aide de schémas légendés, le principe de ce
traitement.
QUESTION B3
5
Une crème hydratante est constituée d’une phase lipophile protégeant la peau du dessèchement,
d’une phase aqueuse contenant au moins une substance hydrophile de petit poids moléculaire, de
stabilisants, de conservateurs et de parfum.
La stabilité de l’émulsion est obtenue grâce à des tensio-actifs (TA). Ceux-ci sont caractérisés par leur
HLB (hydrophilic lipophilic balance) compris entre 1 et 20. Les TA dont le HLB est inférieur à 10 sont
lipophiles alors que les TA dont le HLB est supérieur à 10 sont hydrophiles.
Les matières grasses ont un HLB requis (rHLB), HLB du mélange de TA nécessaire pour obtenir une
émulsion stable.
Les HLB ainsi que les rHLB sont additifs.
Lors d’une séance de travaux pratiques en BTS bioanalyses et contrôles, les élèves, pour préparer
une crème, doivent choisir les TA et calculer les proportions à utiliser (document 4).
Rédiger un corrigé justifiant ce choix et démontrant le calcul des proportions à utiliser.
PARTIE C : découverte du gène CUT1 d'Arabidopsis thaliana codant pour une enzyme
nécessaire pour la biosynthèse des cires cuticulaires
Les plantes terrestres sécrètent des couches de cires déposées sur les surfaces en contact avec le
milieu aérien extérieur et essentielles pour leur survie (limitation des pertes en eau, protection contre
les radiations U.V., facteur de résistance aux pathogènes, déterminant des relations plantes insectes
...). Les cires sont des lipides dérivés d'acides à très longues chaînes (VLCFA, very long chain fatty
acids).
En 1999, Millar, Clemens, Zachgo, Giblin, Taylor et Kunst ont publié un article présentant la
découverte du gène CUT1 chez Arabidopsis thaliana (arabette rameuse) et mettant en évidence sa
fonction dans la production des VLCFAs précurseurs des cires au niveau des tiges notamment. La
découverte de CUT1 a été réalisée grâce à l'analyse d'une base bioinformatique des marqueurs des
séquences exprimées obtenue par séquençage partiel des éléments d'une banque de cDNA
d'Arabidopsis.
Les questions de cette partie demandent l'utilisation des documents 5 à 7. Ces documents présentent
des extraits de l'article de Millar, Clemens, Zachgo, Giblin, Taylor, Kunst : « CUT1, an Arabidopsis
gene required for cuticular wax biosynthesis and pollen fertility, encodes a very-lon-chain fatty acid
condensing enzyme. » , Plant cell. (1999), vol. 11, 825-838.
6
QUESTION C1
Les cires ne figurent pas au chapitre intitulé « Les lipides » dans le programme des classes terminales
STL-BGB. Néanmoins, dans le cadre d'une séance de travaux dirigés, il est possible de présenter
très brièvement la fonction des cires végétales aux élèves afin de leur proposer le document 5 à
annoter lors d'un travail collectif. Vers quelles annotations essaiera-t-on de diriger le groupe de travail
?
Document 5 à rendre annoté avec la copie.
QUESTION C2
Le logiciel TBLASTN est présenté dans le document 6.
Construire un document destiné à être remis à des élèves et expliquant pourquoi une séquence
nucléique propose 6 phases de lecture par « transcription puis traduction informatiques ».
QUESTION C3
Résumer en quelques lignes le type de travail réalisé par un logiciel d'alignement de séquences (qu’ils
alignent des séquences nucléiques ou protéiques, type BLASTN, TBLASN, BLASTX …).
QUESTION C4
Utiliser les documents 6 et 7.
Dans le cadre de la recherche d'un nouveau gène fortement homologue à FAE1 quels sont les
intérêts et les limites d'utiliser la base informatique des marqueurs des séquences exprimées
(expressed sequence tags, ESTs) obtenue par les séquençages partiels d'une banque de clones de
cDNA ?
QUESTION C5
Commenter la figure 1 du document 7.
QUESTION C6
En quoi l'analyse présentée à la figure 2 du document 7 montre-t-elle l'unicité du gène CUT1 dans le
génome ?
Donnée : les séquences reconnues par les enzymes XbaI, EcoRV, NdeI, SphI et BcII ne sont pas
présentes dans CUT1.
QUESTION C7
Proposer une définition pour le mot gène au niveau BTS.
QUESTION C8
Le document 7, dans le paragraphe intitulé « Obtention d'une plante transgénique 35S-CUT1 de
phénotype dépourvue de cires », propose la réalisation de plantes Arabidopsis transgéniques
présentant le phénotype « tige dépourvue de cires ».
De façon surprenante, le phénotype est obtenu avec une construction dans laquelle le promoteur 35S
(promoteur fort) et le transgène sont en orientation sens. Ce phénomène appelé « suppression sens
de l'expression » (sense suppression of expression) est classique dans le monde végétal et est très
étudié, il a une origine postranscriptionnelle complexe.
On envisage de proposer le document 7 comme sujet de travail à des élèves en section BTS
biotechnologie. En quoi le paragraphe intitulé « Obtention d'une plante transgénique 35S-CUT1 de
phénotype dépourvue de cires » est-il à la fois pédagogiquement dangereux et pédagogiquement
intéressant ?
QUESTION C9
Le document 7, dans le paragraphe intitulé « Obtention d'une plante transgénique
phénotype dépourvue de cires », propose la réalisation de plantes Arabidopsis
présentant le phénotype « tige dépourvue de cires ».
Le phénotype «tige dépourvue de cires » se révèle aisément en exposant les plantes
puissant en lumière blanche : les plantes de phénotype sauvage montrent une tige
celles de phénotype « tige dépourvue de cires » une tige verte. Justifier.
35S-CUT1 de
transgéniques
à un éclairage
« blanche » et
PARTIE D : production d’une lipase fongique au laboratoire
7
Cette partie propose l’étude des conditions de la production, au laboratoire, d’une lipase fongique par
Candida lipolytica en fermenteur et milieu non renouvelé.
Le protocole expérimental est présenté dans le document 8 ; les résultats obtenus dans les
documents 9 et 10.
QUESTION D1
Indiquer les principales applications industrielles des lipases produites par les micro-organismes
sachant que leur activité catalytique est mise à profit pour des réactions d’hydrolyse mais aussi pour
des réactions de synthèse ou de trans-estérification.
QUESTION D2
Analyse du protocole :
1. Quel est l’intérêt d’ajouter dans le milieu de fermentation les constituants suivants : corn
steep liquor et tween 80 (oléate de sorbitane polyoxyéthyléné) ?
2. La détermination de la concentration en oxygène dissous est réalisée à l’aide d’une
électrode de Clark. Expliquer le principe de la mesure. Pourquoi la valeur mesurée est-elle
exprimée en pourcentage ?
3. Indiquer la composition d’un milieu d’isolement qui permettrait d’effectuer le contrôle de
pureté du milieu de fermentation (absence de contaminants) et de visualiser la production
d’une lipase par la souche de Candida lipolytica.
QUESTION D3
Exploitation des résultats :
1. Donner une valeur approchée de la vitesse spécifique maximale de croissance et du temps
de génération. Comment procéder pour obtenir des valeurs plus précises ?
2. Analyser les variations du pH et de la concentration en oxygène dissous. Comment les
interpréter ?
3. Que peut-on déduire de la cinétique de production de la lipase ?
4. A l’aide du document 10 déterminer la productivité volumique horaire globale et la
productivité volumique horaire maximale. Quel est l’intérêt de ces deux valeurs ?
Document 1
Test-Combination Triglycérides enzymatique
Réactifs
Concentrations des solutions prêtes à l'emploi
R1
Substrat/enzymes
•
Tampon Tris-citrate pH 8,2
•
Mg2+
•
cholate de sodium
•
monoéther isotridécanolique de polyéthylène glycol
•
ATP
•
PEP
•
NADH
•
lipase
•
PK
•
LDH
R2
74 mmol.L-1
30,8 mmol.L-1
7,9 mmol.L-1
0,2 %
0,05 mmol.L-1
0,3 mmol.L-1
0,25 mmol.L-1
≥ 3 U.L-1
-1
≥ 4 U.L
≥ 0,5 U.L-1
Glycérokinase
8
•
≥ 250 U.L-1
GK
La solution réactionnelle est obtenue en mélangeant 10 mL de solution R1 avec 0,5 mL de
solution R2.
Mode opératoire
Longueur d'onde : 340 nm
Trajet optique : 10-2 m d'épaisseur
Température d'incubation : 20-25°C
Mesurer contre l'air.
Effectuer un témoin-réactifs (TR) par série en remplaçant dans la manipulation l'échantillon
par de l'eau distillée.
Introduire dans des tubes à essais :
Témoin-essai (TE)
Essai
Solution 1
1000 µL
Solution réactionnelle
1000 µL
Echantillon
20 µL
20 µL
Mélanger et incuber env. 10 min. à 20-25°C. Lire les absorbances.
Calcul
Calculer la concentration (C) en triglycérides dans l'échantillon :
340 nm
Longueur
d'onde
C (mmol.L-1)
F x ∆A
Données :
εNADH à 340 nm : 630 m2.mol-1
Trajet optique = 10-2 m
Remarque : soustraire 0,11 mmol.L-1 de la concentration en triglycérides calculée ci-dessus.
9
Document 2
Détermination enzymatique des triglycérides
Réactifs
Réactif 1
étalon
glycérol
2,29 mmol.L-1
ou 2.L-1 de triglycérides
(PM = 875)
tampon tris pH 7,6
parachlorophénol
magnésium
amino-antipyrine
lipase
glycérokinase
glycérol 3 phosphate
oxydase
peroxydase
ATP
100 mmol.L-1
2,7 mmol.L-1
4 mmol.L-1
0,4 mmol.L-1
≥ 1000 U.L-1
≥ 200 U.L-1
Concentration dans le test :
Réactif 2
tampon
Réactif 3
≥ 2000 U.L-1
≥ 200 U.L-1
0,8 mmol.L-1
Mode opératoire
Solution de travail : reprendre 1 flacon de Réactif 3 par 25 mL de Réactif 2 (agitation douce).
Longueur d'onde : 505 nm (492-550)
Zéro de l'appareil : témoin réactif
Témoin
réactif
1 mL
Etalon
Dosage
Etalon (Réactif 1)
10 µL
Echantillon
10 µL
Solution de travail
1 mL
1 mL
Mélanger.
Mesurer les absorbances après une incubation de 5 min à 37°C
ou de 10 min à 20-25°C.
Stabilité de la coloration : 30 min.
Linéarité : 11,4 mmol.L-1 (70 g.L-1)
Remarque : en routine, sur les sérums de patients, il est fréquemment admis d'effectuer une
correction systématique de -0,11 mmol.L-1.
10
Document 3
CYCLODEXTRINES
Les cyclodextrines sont des polyosides cycliques constitués de 6 à 8 résidus glucose.
11
Document 4
La formule de la crème, émulsion L/H (lipophile dans hydrophile), fournie aux élèves est la
suivante :
Huile de vaseline
10 %
Alcool cétylique
5%
Stéarate de butyle
5%
Huile de germe de blé
5%
Propylène glycol
2%
Glycérol
1%
Extrait de lierre
1%
Parahydroxybenzoate de méthyl sodé
0,2 %
Parahydroxybenzoate de butyl sodé 0,2 %
Mélange de TA
7%
Parfum
0,5 %
Eau
qsp 100 %
HLB requis de quelques matières grasses
rHLB
12
15
9,5
11
Huile de vaseline
Alcool cétylique
Huile de germe de blé
Stéarate de butyle
HLB de quelques tensio-actifs
SPAN 80
SPAN 40
TWEEN 85
TWEEN 40
TWEEN 20
Monooléate de sorbitanne
Monopalmitate de sorbitanne
Trioléate de sorbitanne polyoxyéthyléné
Monopalmitate de sorbitanne polyoxyéthyléné
Monolaurate de sorbitanne polyoxyéthyléné
HLB
4,3
6,7
11
15,6
16,7
12
Document 5
Schéma métabolique des voies de biosynthèse des cires végétales de la tige chez
Arabidopsis
Les acides gras à très longues chaînes sont convertis en cires diverses par deux voies
distinctes. L'épaisseur des flèches indique l'importance relative du flux métabolique.
13
Document 6
Quelques données concernant TBLASTN, les marqueurs de séquences exprimées, les
ARNm et le code génétique
A propos de TBLASTN
TBLASTN est un logiciel de comparaison et d'alignement de séquences protéiques : une
séquence protéique donnée (une suite de résidus aminoacides) va être confrontée à des
séquences protéiques déduites de la transcription informatique selon les 6 phases de lecture de
séquences nucléiques obtenues dans des banques de données informatiques. Les séquences
nucléiques sont généralement des marqueurs de séquences exprimées (Expressed Sequence
Taged : EST)
TBLAST va « aligner » les séquences et donner les scores d'alignement.
A propos des marqueurs de séquences exprimées : Expressed Sequence Taged : ESTs
Voici, les étapes conduisant à l'obtention d'une base informatique de données d'ESTs :
− La première étape consiste à obtenir une banque d'ADNc. C'est à partir des ARNm totaux
obtenus avec l'être vivant choisi dans les conditions physiologiques déterminées qu'on
fabrique la banque d'ADNc (obtention de copies double brin ADN des ARNm). Les
ADNc sont alors clonés (inserts ADNc dans les vecteurs de clonage) de sorte que l'on
obtienne une collection de clones indépendants.
− La deuxième étape est le séquençage partiel et à grande échelle des clones obtenus : pour
chaque clone, quelques centaines de nucléotides (en général 200 à 700) sont séquencés à
chaque extrémité des inserts ADNc. L'information peut donc n'être que partielle par
rapport à la taille de certains ADNc (qui peut atteindre plusieurs milliers de nucléotides),
mais elle est suffisante pour caractériser de manière univoque chaque clone. On obtient
donc des 5'-ESTs et des 3'-ESTs.
− Les séquences (ESTs) sont alors triées (problème des doublons, des chevauchements...),
annotées et entrées dans une base de données informatique.
A propos des ARNm eucaryotes
Schéma de la structure d'un ARNm polyadénylé
UTR : région transcrite non traduite (untranslated region).
Le code génétique au niveau des ARNm
14
1° nucléotide en 5'
2° nucléotide
U
U
Phe:F
Phe:F
Leu:L
Leu:L
C
Ser:S
C
Leu:L
A
Ile:I
Ile:I
Ile:I
Met:M
Pro:P
Thr:T
G
Val:V
Ala:A
3° nucléotide
A
G
Tyr:Y
Tyr:Y
STOP
STOP
Cys:C
Cys:C
STOP
Trp:W
His:H
His:H
Gln:Q
Gln:Q
Asn:N
Asn:N
Lys:K
Lys:K
Asp:D
Asp:D
Glu:E
Glu:E
U
C
A
G
U
C
A
G
Arg:R
Ser:S
Ser:S
Arg:R
Arg:R
U
C
A
G
U
C
A
G
Gly:G
15
Document 7
Découverte du gène CUT1 d'Arabidopsis thaliana codant pour une enzyme nécessaire
pour la biosynthèse des cires cuticulaires
Depuis de nombreuses années, on sait que les VLCFAs sont synthétisés dans un système
microsomial d'élongation (système microsomial FAE, fatty acid elongation). Ce système
fonctionne par addition successives de résidus en C2 à partir du malonyl-Coenzyme A à des
acides gras en C16 et C18 préexistants et synthétisés de novo par la voie plastidique.
En 1995, un gène fondamental intervenant dans le processus de biosynthèse de VLCFAs a été
isolé chez Arabidopsis thaliana : FAE1 (fatty acid elongation 1). FAE1 code une enzyme
présente dans les graines et qui, à partir d'acides gras en C18, catalyse la première réaction
(condensation) du système microsomial FAE nécessaire à la production des acides gras en
C20 et C22 des réserves lipidiques de la graine. En 1997 on a montré que c'est FAE1 qui est
déterminant pour la production des VLCFAs des réserves des graines.
Les auteurs de l'article dont des extraits sont présentés ci-dessous ont pris comme point de
départ le raisonnement suivant :
Les cires dérivent de VLCFAs et chez la graine, la biosynthèse des VLCFAs est
dépendante des enzymes du système microsomial d'élongation, en particulier le produit de
FAE1. En recherchant un gène homologue à FAE1 et codant une enzyme à localisation
épidermique chez la plante, on peut espérer découvrir un gène d'importance dans la
biosynthèse des cires cuticulaires de la plante.
Notes : stem = tige, wax = cire.
Pour information CUT1 est désormais (en 2006) sous la nomenclature CER6.
Identification du gène CUT1
[... ...]
TBLASTN search for related sequences [...] in the database of expressed sequence tags
(ESTs) of anonymous Arabidopsis cDNA clones [...], using the deduced amino acid sequence
of FAE1, revealed that >15 ESTs had open reading frames with significant sequence
similarity. These ESTs did not correspond to known condensing enzymes, such as
chalcone synthase or 3-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III (KASIII), which had lower
similarity scores. Thus, a family of FAE1-related genes exists in Arabidopsis. These genes
are likely to encode condensing enzymes, which may be involved in the synthesis of
VLCFAs.
The expression patterns of several of these FAE1-related genes were examined by using
RNA gel blot analyses. One gene, represented by EST T76616, was expressed in stems,
leaves, and flowers, but it was not expressed in roots (data not shown). Furthermore, in situ
hybridization analysis demonstrated that the transcript corresponding to this gene
specifically accumulated in the epidermal cells of the Arabidopsis stem [...Figure 1...]. These
are the cells in which wax biosynthesis occurs, suggesting that this gene, CUT1, might be a
good candidate for a condensing enzyme involved in wax production. DNA sequencing
revealed that the CUTI cDNA from this T76616 clone was 1829 nucleotides long, which is a
length similar to that of the FAEI transcript [... ...] the CUTI cDNA has a 1494-bp coding
region, which is preceded by 58 bp of 5' untranslated region and followed by a 277-bp 3'
untranslated region, containing a 23-bp poly(A) tail. This cDNA sequence analysis, together
with the tact that the FAE1 protein is 506 amino acids in length, suggests that we have
identified a full-length cDNA. Alignment of the predicted CUT1 amino acid sequence with
16
the FAE1 protein revealed that they share 50.0% amino acid identity and 74.7% amino acid
similarity [...], confirming that the protein encoded by CUTI is a putative condensing enzyme,
possibly involved in VLCFA biosynthesis. DNA gel blot analysis demonstrated that CUTI
is a single copy gene [...Figure 2 ...], although there was a faintly hybridizing second band
when the experiment was performed at low stringency (data not shown).
[... ...]
17
Document 7
Découverte du gène CUT1 d'Arabidopsis thaliana codant pour une enzyme nécessaire pour
la biosynthèse des cires cuticulaires
Figure1. Distribution of the CUT1 Transcript in a
Cross-Section of an Arabidopsis stem.
The section was hybridized with the digoxigeninlabeled antisense CUT1 transcript, which is shown by
the formation of a dark red-brown precipitate.
Figure 2. Genomic DNA Gel Blot Analysis of CUT1
Hybridizing sequences.
Ten micrograms of Arabidopsis wild-type DNA [...]
was digested with the indicated restriction enzyme. The
blot was hybridized with the complete CUT1 coding
region derived from the EST clone T76166. The
positions of molecular length markers in kilobases are
indicated at left.
Obtention d'une plante transgénique 35S-CUT1 de phénotype dépourvue de cires
[...]
In an attempt to elucidate the function of CUT1, we generated transgenic
Arabidopsis plants harboring the binary vector p35S-CUT1, in which the complete CUT1
cDNA was subcloned in sense orientation behind the cauliflower mosaic virus 35S
promoter. The expression of this transgene in Arabidopsis could result in either the
constitutive expression of the CUT1 protein or the sense suppression of the expression of the
endogenous CUT1 gene, which occurs efficiently when transgenes are transcribed from a
strong promoter (Elmayan and Vaucheret, 1996).
In our transformation experiment, we obtained 46 kanamycin-resistant Arabidopsis
plants, transferred them to soil, and grew them to maturity. Instead of the typical waxy or
glaucous appearance of wild-type inflorescence stems, 36 of the transgenic plants had stems
with a shiny bright green appearance, indicating the absence of the epicuticular wax layer
[...Figure 3...]. Scanning electron microscopy revealed that the surfaces of these stems
completely lacked wax crystals ...]
18
Document 7
Découverte du gène CUT1 d'Arabidopsis thaliana codant pour une enzyme nécessaire pour
la biosynthèse des cires cuticulaires
Figure 3. 35-CUT1-plants display a waxless
phenotype and are male sterile.
(A) Comparison of the woax load on the stems of
wild-type (left) to transgenic 35S-CUT1 (right)
plants. In strong light, wilde-type plants appear
white [... ...] In contrast, the stems of transgenic
35S-CUT1 plants [... ...] have a bright green
appearance.
(B) 35S-CUT1 plants are sterile, as evidence from
siliques failing to develop. A fertile wild-plant is
shown at left.
Figure 4. Stems of transgenic 35S-CUT1 plants are
completely devoid of wax crystals.
(A) Scanning electron microscopy of the surface of
stems from 35S-CUT1 Plants displaying the
waxless phenotype.
(B) Stems from wilde-type plants.
Bars in (A) and (B) = 10 µm.
19
Document 8
Lipase Production in Discontinuous Operation System Using a Candida lipolytica Strain
ANA IONIŢĂ, M. MOSCOVICI, AURORA DRĂGOLICI, MIHAELA EREMIA,
CĂTĂLINA BUCĂ, RADU ALBULESCU, IOANA PAVEL, MIHAELA CLAUDIA
VAMANU
Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 7, No. 1, 2001, pp 547-552
Microorganism, culture media and cultivation conditions
Candida lipolytica ICCF – 214 strain selected previously by screening was used.
Liquid medium containing (w/v): glucose (2.0 %), corn steep liquor (1.0 %), yeast extract
(0.5 %), Tween 80 (1.0 %), mineral salts (K+ and Mg2+) and antifoam agent (mineral oil)
have been used for the submerged cultivation.
The initial pH of the media was 5.
The inoculum was prepared on GYP (glucose - yeast - peptone) medium in Erlenmeyer
flasks, incubated at 27 oC for 24 hours.
The fermenter was inoculated with 10 % (v/v) of inoculum.
The submerged cultivation was performed in a 14 L glass fermenter containing 6 L
medium, at 27 oC for 24 h.
The culture was variously stirred and aerated during fermentation corresponding to the
growth phase of the microorganism.
Enzyme assay
The activity of the extracellular lipase was assayed in the cell-free liquid, after separation of biomass by
centrifugation at 3500 rpm for 20 min.
The lipolytic activity was determined according to a modified Willstatter method, on olive
oil as substrate.
One activity unit was defined as the amount of enzyme which hydrolises the vegetable oil,
and thus causes the release of 1 µmole equivalent of carboxyl groups per minute, under
the reaction conditions (30 oC, pH = 7.2).
Other analytical methods
Sugar concentration of the culture was determined using a colorimetric method.
Biomass concentration was determined measuring the absorbance of the broth by visible spectrophotometry
at 600 nm.
20
Document 9
Production d’une lipase fongique
Résultats expérimentaux
Activité
Vitesse
Temps Glucose
A600
Ln (A600
Air Flow
« Lipase » %O2 d'agitation
(heure) (g/L) corrigée corrigée)
(L/min)
(U/mL)
RPM
0
20
0,2
-1,61
0
100
500
2
2
18
0,22
-1,51
0
80
500
2
4
16
0,24
-1,43
0
60
700
3
6
14
0,6
-0,51
2
44
700
3
8
10
1,1
0,10
3
38
800
3,5
10
5
1,4
0,34
12
30
800
3,5
12
1
1,6
0,47
16
20
800
4
14
0
1,8
0,59
20
30
900
4
16
0
1,8
0,59
22
42
900
4
18
0
1,8
0,59
26
50
900
4
20
0
1,7
0,53
34
64
900
4
22
0
1,8
0,59
38
84
900
4
24
0
1,8
0,59
30
88
900
4
pH
5
5
5
4
3,5
3,6
3,7
4
4,5
5
5,5
5,5
5,5
[glucose] = f(t)
25
20
15
g/L
10
5
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24
temps (h)
activité lipase = f(t)
40
U/mL
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24
temps (h)
21
Ln (A600) = f(t)
1,00
0,50
0,00
-0,50
-1,00
-1,50
-2,00
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24
tem ps (h)
% O2 dissous = f(t)
100
% O2
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24
tem ps (h)
22
Document 10
Suivi de la production de lipase par Candida lipolytica en milieu non renouvelé
activité lipase = f(t)
40
35
30
U/mL
25
20
RAPPORT SUR LA PREMIERE EPREUVE D'ADMISSIBILITE ETABLI PAR J. CNOKAERT , JF.
15
PERRIN, C. PLAS, P. VANNESTE
10
5
0
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
temps (h)
temps de préparation
du fermenteur
23
24
Résultats de l’épreuve
55 candidats ont composé :
- 1 a obtenu une note supérieure ou égale à 12/20 ;
- 2 ont obtenu une note supérieure ou égale à 10 et strictement inférieure à 12 ;
- 3 ont obtenu une note supérieure ou égale à 8 et strictement inférieure à 10 ;
- 10 ont obtenu une note supérieure ou égale à 6 et strictement inférieure à 8 ;
- 39 ont obtenu une note strictement inférieure à 6.
La moyenne générale de l’épreuve est de 4,9/20 et la meilleure note est de 12/20.
Malgré un sujet dont la conception était habituelle pour cette épreuve et dont les différentes parties
semblaient très accessibles les résultats sont décevants.
Le jury tient à rappeler aux candidats qu’il faut apprendre à utiliser les données des documents
fournis. Ces dernières associées à des connaissances de base permettent de répondre à des
questions portant sur des thèmes qui sont à priori inconnus.
Il faut absolument respecter le sujet. Ainsi lorsqu’un schéma est demandé, il ne s’agit pas de rédiger
un texte.
L’usage du vocabulaire scientifique doit être rigoureux.
Dans cette épreuve la mobilisation des connaissances de base en chimie et en physique est
indispensable.
Pour préparer cette épreuve, il est vivement conseillé de travailler les sujets des années antérieures.
Dans cette optique, le jury propose des éléments précis relatifs aux différentes questions posées.
QUESTION A1
Réactions mises en jeu dans les deux méthodes de dosage.
Triglycˇrides
lipase
glycˇrol
3 H2O 3 acides gras
glycˇrokinase
ADP
ATP glycˇrol 3 phosphate
pyruvate kinase
PEP
ATP
lactate
deshydrogˇnase
pyruvate
lacta
NADH,H+ NAD+
Test-Combination Triglycérides enzymatique
Détermination enzymatique des triglycérides
Triglycˇrides
lipase
glycˇrol
3 H2O 3 acides gras
glycˇrokinase
ATP
glycˇrol 3 phosphate
H2O2
dihydroxyacˇtone phosphate
ADP
2 H2O2 + parachorophˇnol + 4 amino antipyrine
glycˇrol 3 phosphate
oxydase
peroxydase
quinonˇimine + 4 H 2O
QUESTION A2
Nécessité des témoins : témoin-essai et témoin-réactifs : absorption du sérum et des réactifs
Démonstration de la formule de calcul C = F .
A = ATE - AEssai - ATR
A.
24
C=
1 VMR
.
εl E
F = 8,1 (avec C en mmol.L-1)
QUESTION A3
Dans les deux méthodes le résultats peut être corrigé de – 0,11 mmol.L-1 pour tenir compte du
glycérol libre du sérum
QUESTION B1
Le xylène, solvant non miscible à l’eau et de densité inférieure, forme avec l’eau un azéotrope. Cet
azéotrope constitué de 60 % de xylène et de 40 % d’eau bout à 95°C.
Par distillation en présence de xylène, l’eau contenue dans le beurre est entraînée sous forme de
vapeur dont la composition et la température sont celles de l’azéotrope. Les vapeurs condensées sont
recueillies dans un tube gradué. Les deux constituants de l’azéotrope se séparent par gravité et le
volume d’eau est mesuré directement.
QUESTION B2
Cyclodextrine et cholestérol forment un complexe, le noyau hydrophobe du cholestérol pénétrant à
l’intérieur de la molécule de cyclodextrine. Le complexe ainsi formé est alors hydrophile, les
groupements OH de la molécule de cyclodextrine et du cholestérol étant situés à la périphérie ; celuici peut alors être éliminé par lavage.
QUESTION B3
rHLB de la phase grasse = (12x10/25) + (15x5/25) + (11x5/25) + (9,5x5/25) = 11,9
Choix des tensio-actifs (TA) :
L’émulsion étant de type L/H les TA choisis seront hydrophiles (HLB > 10). L’un ayant un HLB
inférieur à 11,9 et l’autre un HLB supérieur à 11,9.
Donc Tween 85 (HLB = 11) et Tween 40 (HLB = 15,6).
Soit x la fraction de Tween 85 dans le mélange actif :
11 x + 15,6 (1-x) = 11,9
x = 0,804
Donc 80,4 % de Tween 85 et 19,6 % de Tween 40 dans le mélange actif.
25
QUESTION C1
Mots clés : élongation des acides gras 2C par 2C, aldéhyde, alcool primaire, ester, alcane, alcool
secondaire, cétone, réduction, oxydation.
QUESTION C2
Le document, mettant en œuvre des exemples de séquences devait faire ressortir que la lecture d’une
séquence de nucléotides codant pour une protéine se produit par groupes de trois nucléotides : les
triplets, ou codons. Il existe donc trois façons (cadres de lecture) de lire une séquence nucléotidique.
Soit :
+1 : lecture des triplets débutant au premier nucléotide
+2 : lecture des triplets débutant au deuxième nucléotide
+3 : lecture des triplets débutant au troisième nucléotide. De plus, l'ADN étant formé de deux brins
antiparallèles, la protéine synthétisée sera différente selon le brin transcrit en ARNm (ARNm
synthétisé dans le sens 5’3’ et traduit dans le même sens).
Il fallait faire intervenir aussi la notion de phase ouverte de lecture (Open Reading Frame, ou ORF, en
anglais) : séquence d'ADN délimitée par un codon START et un codon STOP. On recherche les ORF
selon les 6 phases de lecture possibles.
QUESTION C3
Les programmes BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ) comparent des séquences et calculent
la signification statistique des concordances. Les régions dont les séquences sont similaires sont
révélées en se basant sur le principe de parcimonie, c'est-à-dire en considérant le minimum de
changements en insertion, suppression, ou substitution qui séparent deux séquences. Pour qualifier et
quantifier la similitude entre séquences, un score est calculé. Ce score repose sur un système qui
permet d'attribuer un score élémentaire pour chaque position lorsque les séquences sont éditées l'une
sous l'autre.
Exemple d'alignement :
ATTCGCCGGTGTACTGCA-C-TGGCATCGTTGAC
::::::::: : :: ::: : :::::::::::::
ATTCGCCGG-G-ACCGCATCATGGCATCGTTGAC
: identité à une position (le score augmente) , - insertion/délétion (le score diminue).
Les programmes BLAST sont utilisés pour inférer des relations fonctionnelles ou évolutives entre
séquences ou pour identifier des membres de familles de gènes.
QUESTION C4
Intérêt fondamental : le cDNA, obtenu à partir de l’ARNm transcrit, ne contient pas les séquences
introns donc on peut chercher ses traductions possibles en séquences protéiques.
Limites : essentiellement techniques. L'obtention parcellaire non représentative des ARNm (tous les
ARNn ne sont pas 3’poly A …). Il peut toujours exister des gènes très peu exprimés ou exprimés
uniquement dans un tissu bien particulier à un instant précis du développement et qui échapperaient
ainsi à l’étude.
QUESTION C5
On construit une sonde marquée qui hybridera spécifiquement les transcrits ARNm de CUT1.
L'hybridation in situ conduit manifestement au développement d'un précipité rouge. La région
cuticulaire de la tige est fortement marquée, a contrario le signal dans la région centrale de la racine
est en comparaison très faible. Conclusion : les ARNm de CUT1 sont accumulés de façon marquée
au niveau cuticulaire, une transcription élevée de CUT1 est caractéristique au niveau cuticulaire de la
tige.
QUESTION C6
On choisit des enzymes de restriction qui vont « encadrer » le gène CUT1 lors de la phase
d’hydrolyse de restriction de l’ADN génomique préparé (les enzymes choisis ne doivent pas
hydrolyser CUT1). Si le gène CUT1 est simple copie, pour chaque enzyme, on obtiendra normalement
une longueur de fragment unique et caractéristique hybridée par la sonde (si les conditions de
stringence sont suffisamment fortes).
QUESTION C7
26
Le point de vue historique était important. La notion d'unité fonctionnelle d'hérédité, notion non
moléculaire, pouvait être discutée.
On pouvait terminer par une définition moléculaire « moderne » simple du type :
Unité physique et fonctionnelle fondamentale de l'hérédité. Un gène est une séquence ordonnée de
nucléotides (ADN ou ARN) situés sur un point précis
(locus) d'une molécule génomique
(chromosome eucaryote, chromosome bactérien, plasmide, génome ARN ou ADN viral) donné et qui
code pour un produit spécifique, par exemple une protéine ou une molécule d'ARN (ARNt ou ARNr).
QUESTION C8
En BTS biotechnologie un enseignant tente d’inculquer des connaissances fondamentales aux élèves,
par exemple « un promoteur constitutif fort (comme le promoteur caMV 35S) permet une transcription
non régulée continue et important du gène associé». L’expérience proposée ici est en contradiction et
les élèves risquent d’être déstabilisés.
Intérêt pédagogique : il est important dans un enseignement de niveau BTS de montrer aux élèves
que les connaissances d'un instant ne sont pas un corpus dogmatique. Un scientifique doit savoir se
montrer ouvert devant les faits et savoir que la science progresse par réfutation/complexification (les
aspects sociaux, politiques, historiques étant ici hors sujet).
QUESTION C9
Manifestement les plantes de phénotype sauvage (à la tige recouverte de cires) ont un pouvoir de
réflexion de la lumière très élevé devant celui des plantes de phénotype « tige dépourvue de cires »
(cires-). En éclairage intense blanc, les plantes sauvages apparaîtront donc blanche par réflexion
intense de la lumière blanche éclairante alors que les plantes cires- apparaîtront vertes (teinte due au
spectre d'absorption de la chlorophylle). L’aspect microscopique est cohérent avec cette explication.
QUESTION D1
Applications industrielles des lipases
- Lessives : élimination des triglycérides présents dans les matières grasses en association avec les
détergents (nécessité de lipases résistantes à un pH alcalin).
- Agro-alimentaire :
- Traitement des oléagineux ;
- Industrie fromagère : maturation des fromages, notamment bleus ou italiens (le goût
piquant est donné par des acides gras à chaîne courte) ;
- Synthèse d’arômes : esters propioniques, butyriques et caproïques du géraniol et du
citronnellol.
- Tannerie : élimination des graisses de la laine.
- Cosmétologie : élaboration d’huile enrichie en 1,2-dioléines.
QUESTION D2
1. Le corn steep est une source d’azote et de facteurs de croissance.
Le Tween 80 est un détergent qui facilite l’excrétion des produits de fermentation, ici la lipase, en
modifiant la perméabilité membranaire.
2. L’électrode de Clark est formée d’une cathode de platine et d’une anode d’argent entre
lesquelles est maintenue une ddp d’environ 0,7 V. Sous l’influence de cette tension, le dioxygène
dissous dans la solution de KCl est ionisé en hydroxyle au contact de la cathode. Au contact de
l’anode il y a formation de AgCl et production de 4 electrons. Il en résulte un courant très faible
proportionnel à la concentration en dioxygène du milieu dans lequel baigne l’électrode. Ce courant
est amplifié et mesuré. Une membrane de Téflon perméable au dioxygène mais imperméable à
l’eau et aux ions isole la solution de KCl du milieu réactionnel. Comme l’électrode consomme un
peu de dioxygène, la concentration qui est mesurée dépend de la vitesse de renouvellement du
dioxygène sous la membrane. Plus l’agitation est grande, plus la température est élevée, plus la
vitesse de diffusion est grande et plus la valeur mesurée est élevée. La valeur mesurée doit être
inférieure au niveau de saturation du milieu. Tous ces paramètres font qu’aucune concentration
ne peut être raisonnablement exprimée et les valeurs sont exprimées en pourcentage par rapport
à un état initial arbitrairement fixé à 100 %.
27
3. Le milieu choisi doit être un milieu non sélectif permettant la croissance des bactéries et des
levures, type Sabouraud (sans ATB) ou gélose trypticase soja. L’activité lipolytique pourra être
visualisée par la présence de tributyrine et rouge de phénol incorporés dans le milieu (acidification
et virage au jaune) ou huile d’olive et bleu victoria ( précipité bleu dû à l’affinité des acides gras
pour le colorant).
QUESTION D3
1. La phase exponentielle de croissance est effective entre les temps 4 et 6 heures.
µ = (-0,51-(-1,43))/120 = 7.66 10-3 min-1
G = Ln(2) /µ = 90 min
Pour plus de précision il convient d’avoir d’avantage de points entre 2 et 4 heures.
2. Première phase de culture (0 à 12 heures) : aération et agitation du milieu limitées. Le glucose
est consommé totalement durant cette phase qui correspond à la phase de croissance de la
souche. La souche consomme beaucoup de dioxygène et sa concentration baisse
progressivement. Le catabolisme glucidique induit la baisse du pH. La cinétique de disparition du
glucose est inversement proportionnelle à la cinétique de croissance de la souche.
Dans la seconde phase le milieu est d’avantage agité et aéré. La souche a terminé sa croissance
(plateau) ; le glucose est épuisé et le métabolisme de la souche s’oriente vers la consommation
d’autres substrats (protéines) en aérobiose (désamination oxydative et décarboxylation) qui
provoque une alcalinisation du milieu.
3. La production de lipase débute quand la souche a atteint le plateau, en fin de phase
exponentielle. La lipase peut être assimilée à un métabolite secondaire. En fin de « fermentation »
l’activité « lipase » diminue. Il s’agit probablement d’une régulation de sa synthèse due à
l’accumulation de la protéine.
4. Les productivités tiennent compte du temps d’occupation du fermenteur. La productivité horaire
globale se détermine depuis t = -4 h, temps de préparation du fermenteur compris, jusqu’à la fin
de la fermentation (24 h). La productivité horaire maximale est déterminée à t = 22 h (production
maximale de lipase).
Productivité horaire globale = 30/28 = 1,07 U.mL-1.h-1
Productivité horaire maximale = 38/26 = 1,46 U.mL-1.h-1
Sur le plan industriel, la productivité horaire maximale sera privilégiée, le fermenteur sera vidangé
à t = 22 h et une autre fermentation pourra être conduite rapidement.
28
EPREUVES ECRITES D’ADMISSIBILITE :
Deuxième épreuve
Sujet
Première question
A partir d'exemples précis, vous décrirez les différents moyens mis en
oeuvre par la cellule pour contrôler et réguler l'activité des enzymes
Deuxième question
L’évolution des techniques d’identification, depuis l’identification phénotypique jusqu’à l’identification
moléculaire, a modifié l’approche de la taxonomie bactérienne.
Vous exposerez les principes et les techniques de l'identification phénotypique, les cibles et les
moyens de l'identification moléculaire.
Vous discuterez de l'évolution de la taxonomie bactérienne et de la classification actuelle.
Troisième question
Les communications cellulaires.
Après avoir défini les grandes classes de récepteurs membranaires de surface, vous développerez les
caractéristiques et le fonctionnement des voies de signalisation qu’ils contrôlent.
Rapport sur la seconde épreuve d'admissibilité établi par
J. Cnokaert ; J-Y. Daniel ; F. Guillet, C.Tellier
Résultats de l’épreuve
Candidats ayant composé 56
Moyenne de l’épreuve : 6,63
Note la plus élevée : 16,5
Notes supérieurs ou égales à 12 : 3
Notes comprises entre 10 et 12 : 8
Notes comprises entre 8 et 10 : 6
Notes comprises entre 6 et 8 : 15
Notes inférieures à 6 : 24
Première question
Le sujet se limitait à la régulation de l’activité des enzymes. Il était donc inutile de rappeler les
notions de structure des protéines et de mécanismes d’action des enzymes.
L’introduction devait présenter l’importance de la régulation et du contrôle de l’activité des enzymes
pour la cellule (adaptation à l’environnement, économie d’énergie, maintien des conditions hors
équilibre…), avant d’aborder la présentation générale des moyens mis en œuvre. Une réflexion sur les
aspects spatio-temporels de cette régulation (mécanisme de régulation immédiate, à plus long terme,
importance de la compartimentation cellulaire) était attendue à ce niveau, et pouvait servir de fil
conducteur à l’organisation du contenu.
Un premier chapitre traitant des phénomènes de régulation immédiate (de la ms à la s) devait
permettre de présenter tous les mécanismes impliquant une interaction non-covalente avec l’enzyme.
29
Les mécanismes de régulation les plus simples, tels que l’effet de la concentration en substrat ou
d’inhibiteurs réversibles, ont souvent été oubliés (la plupart des candidats semblent ignorer l’existence
des anti-protéases !). La régulation par allostérie, et son intervention dans les mécanismes de rétrocontrôle, a généralement été bien traitée et illustrée avec des exemples pertinents
(phosphofructokinase, glycogène phosphorylase…).
La deuxième partie pouvait regrouper les mécanismes de régulation impliquant une modification
covalente de la structure de l’enzyme. Curieusement, aucun candidat n’a mentionné la différence
essentielle entre cette régulation de type « tout ou rien » et celle traitée dans la première partie de
type progressive. Les mécanismes d’activation de zymogènes et de régulation par
phosphorylation/déphosphorylation ont généralement été bien illustrés. L’intérêt de ce mode de
régulation dans les mécanismes d’amplification au niveau de cascades enzymatiques pouvait être
présenté. Certains candidats ont mentionné très justement que d’autres modifications posttraductionnelles (ADP ribosylation, glycosylation, …) pouvaient intervenir dans le contrôle de l’activité
enzymatique.
L’importance de la compartimentation dans le contrôle de l’activité enzymatique pouvait être évoquée
à ce niveau dans la mesure où les modifications post-traductionnelles jouent un rôle fondamental
dans l’adressage des protéines.
Dans une troisième partie, il était possible d’aborder, sans les détailler, les mécanismes de régulation
à long terme impliquant d’une part le contrôle de l’expression des gènes et d’autre part le contrôle de
la dégradation des protéines (ce dernier point semble ignoré de la plupart des candidats). Beaucoup
de candidats ont développé exagérément cette partie au détriment des aspects précédents. Une
présentation approfondie de ces mécanismes, régulant la quantité de protéines présente dans la
cellule, mais non directement l’activité des protéines, était hors sujet.
En conclusion, la plupart des candidats ont montré qu’ils avaient des connaissances dans le sujet
proposé, mais beaucoup de présentations ont souffert d’un manque d’organisation et de structuration.
Bien que le sujet insistait sur l’illustration des connaissances exposées par des exemples précis, très
souvent ceux-ci étaient absents. Le jury tient aussi à rappeler qu’un schéma précis et bien légendé
remplace souvent avantageusement plusieurs lignes de texte.
Deuxième question
Le sujet demandait de faire le lien entre l’évolution de la taxonomie et les techniques de l’identification
bactérienne. Aussi, était-il nécessaire en introduction de définir ces notions afin de montrer comment
les progrès technologiques, notamment dans le domaine de la biologie moléculaire, contribuent à faire
évoluer la classification. Il était utile de souligner également les difficultés rencontrées pour classer les
bactéries, du fait de l’absence de définition précise des rangs hiérarchiques et du caractère
dynamique au sens évolutif du terme de cette science (taxonomique).
Le plan pouvait s’articuler assez simplement autour de trois parties.
Une première partie consacrée aux bases de l’identification phénotypique devait permettre aux
candidats de mobiliser de nombreuses connaissances acquises à l’occasion des travaux pratiques de
microbiologie. En effet, après avoir rappelé la nécessité d’établir un système de référence sous la
forme d’une banque de données décrivant le choix des souches et la liste des caractères
phénotypiques (morphologiques, biochimiques, immunologiques, culturaux, physiologiques,
environnementaux…), il était intéressant de montrer les différentes approches de l’identification
phénotypique (galerie traditionnelle et clefs dichotomiques, méthodes probabilistes) puis d’indiquer
comment ces caractères ont été utilisés pour classer les bactéries (stratégies de comparaison,
établissement de dendogrammes…).
La deuxième partie demandait de faire le point sur les outils et les cibles de l’identification moléculaire
et leur relation avec l’évolution de la taxonomie. Dans ce cadre, on pouvait présenter les apports de la
biologie moléculaire à l’origine de l’évolution de la classification (GC%, hybridations, séquençage de
l’ARN 16S) puis indiquer les techniques spécifiques développées pour l’identification (PCR, RFLP,
profils protéiques…).
Enfin, une troisième partie devait faire le point sur la classification actuelle des bactéries en montrant
d’une part la volonté de maintenir le système binomial fondé principalement sur les caractères
phénotypiques et d’autre part les conséquences de l’avènement de la biologie moléculaire sur ce
30
système. Un point sur les différents rangs hiérarchiques actuellement utilisés allant du domaine
(Archaeabacteria et Eubacteria) à la notion d’espèce, de sous-espèce voire de rang inférieur
(pathotype, lysotype…) était attendu.
Dans l’ensemble, les candidats ont présenté des connaissances précises sur certains aspects du sujet
mais rares ont été ceux qui ont mis en relation les différentes parties pour présenter un ensemble
cohérent. Quelques techniques particulières de biologie moléculaire ont été parfois extrêmement
développées au détriment d’une approche plus globale demandée par le sujet
Troisième question
Sujet classique, de type question de cours, traité dans tous les manuels recommandés pour la
préparation de cette épreuve.
Le jury attendait des candidats qu’ils décrivent les récepteurs canaux, les récepteurs à sept domaines
transmembranaires couplés aux protéines G hétérotrimériques, et les récepteurs à un domaine
transmembranaire couplés à une activité enzymatique. A chacun de ces types de récepteur devait
être associées différentes voies de signalisation connues,
Dans le cas des récepteurs canaux, les mécanismes contrôlant leur activation et les conséquences
de cette activation sur la polarité des membranes et l’activation des synapses.
Pour les récepteurs à sept domaines transmembranaires, les voies passant par l’activation de
l’adélynate cyclase et la protéine kinase A ou par l’activation de la phospholipase Cb qui clive des
phosphoinositides en diacylglycérol et IP3 eux même à l’origine d’une signalisation intracellulaire via la
protéine kinase C et la libération dans le cytosol du Ca2+ du réticulum endoplasmique.
Pour les récepteurs à un domaine transmembranaire, il fallait établir la différence entre ceux qui
possèdent une activité enzymatique propre au niveau de leur domaine intracellulaire et ceux qui sont
associés à une enzyme cytoplasmique. Ensuite , il fallait décrire l’activation de la voie des MAP
kinases dans le premier cas et la signalisation Jak-STAT dans le second.
Les candidats particulièrement bien préparés pouvaient signaler qu’il existe d’autre types de
signalisation : les activités enzymatiques associées aux récepteurs sont principalement des tyrosines
kinases mais que l’on connaît des voies de signalisation utilisant récepteurs couplés à d’autres
activités enzymatiques. Enfin, il existe des voies reposant sur des hydrolyses spécifiques de protéines
cellulaires.
En conclusion, les candidats devaient insister sur les interrelations qui existent entre toutes ces voies,
et montrer qu’elles sont des facteurs puissants d’intégration d’une cellule dans un organisme. Ils
pouvaient terminer en indiquant des pathologies liées au dysfonctionnement de ces voies de
signalisation
31
EPREUVES D’ADMISSION
AGREGATION DE BIOCHIMIE - GENIE BIOLOGIQUE
CONCOURS INTERNE
Session 2007
EPREUVE PRATIQUE
Durée : 8 heures
Valorisation des coproduits de l’industrie agroalimentaire
Le lactosérum est l’un des coproduits de l’industrie agroalimentaire. L’industrie laitière produit
annuellement environ 650 000 tonnes de poudre de lactosérum. Classiquement deux types de
lactosérum sont produits suivant le traitement du lait : acide et doux. Le lactosérum acide peut être
utilisé directement en alimentation animale, alors que le lactosérum doux est transformé par
concentration, séchage, ultrafiltration... Dans cette dernière technique, deux fractions sont obtenues.
Le rétentat, riche en protéines, est utilisé en alimentation animale ou humaine, tandis que le perméat
à haute teneur en lactose est valorisé pour des applications en pharmacie ou en alimentation
humaine.
Le Corn Steep est un autre coproduit de l’industrie agroalimentaire. L’extraction de l’amidon et du
gluten de maïs comporte une première étape de trempage destinée à ramollir le grain. Durant cette
opération qui dure 30 à 40 heures à 50°C, 6% de la matière sèche du grain s’échappe dans l’eau de
trempage, alors commercialement appelée "Corn Steep Liquor". Les produits de valorisation de cette
dernière serviront de base en alimentation animale, ou encore de milieux dans les fermentations après
concentration.
Le sujet propose lors de cette séance de travaux pratiques :
- le contrôle, préalable à son utilisation, d’une micropipette par méthode photométrique ;
- une ultrafiltration du lactosérum suivie d’un dosage des protéines ainsi que d’un dosage de la
vitamine B1 par fluorimétrie ;
- l’étude de l'influence d'un paramètre physico chimique sur la croissance et le métabolisme d'une
levure, Pichia ohmeri, productrice de polyols, cultivée sur un milieu Corn Steep - glucose.
32
1. Contrôle de qualité d’une micropipette (volume 2 à 20 µL) par méthode photométrique
1. Principe général des méthodes photométriques
Un volume connu de diluant est préparé. La pipette à tester est utilisée pour ajouter un volume
d’une solution échantillon de chromophore ayant une absorbance connue. Le mélange est
homogénéisé et son absorbance est mesurée. Le volume est alors calculé sur la base de
l’augmentation de l’absorbance.
Compte rendu
Montrer l’intérêt et les limites d’une méthode photométrique par rapport à la méthode
gravimétrique.
Etablir la formule littérale permettant de calculer le volume délivré par la pipette.
2. Méthode photométrique normalisée pour le contrôle des pipettes à piston
Cette méthode est décrite par les normes ISO 8655-7 : 2005(F) et ISO/TR 16153 : 2004(F).
Le mode opératoire présenté en annexe 1 met en œuvre trois réactifs :
- un colorant (le Ponceau S) absorbant à 520 nm et n’absorbant pas à 730 nm ;
- un diluant présentant un composé absorbant à 730 nm mais n’absorbant pas à
520 nm ;
- un tampon n’absorbant ni à 520 nm ni à 730 nm.
Contrôler la pipette fournie pour un volume de 10 µL en suivant le mode opératoire présenté en
annexe 1.
Réaliser 5 mesurages du volume délivré, au réglage 10 µL, en conditions de répétabilité.
Compte rendu
Dégager l’intérêt de cette méthode normalisée par comparaison à la méthode générale
citée en 1.
Justifier le choix du matériel utilisé pour diluer la solution étalon de chromophore.
Présenter les résultats expérimentaux.
Présenter les calculs permettant de conclure quant à la qualité de la pipette.
Données :
• Compte tenu des qualités métrologiques du matériel utilisé, l'incertitude sur le volume
calculé peut être estimée à 0,25%.
• Relation mathématique donnant le volume délivré par la pipette
La relation exprimant le volume VU délivré par la pipette en fonction des différentes absorbances
mesurées est la suivante :
⎡
⎤
AU − AD1
⎢
⎥
AD 2 − AD1
⎢
⎥
VU = VD
⎢⎛1 − R ⎞ A
⎛ A − AD1 ⎞ ⎥
⎟⎟ ⎥
⎢⎜
⎟ S1 − ⎜⎜ U
⎣⎢ ⎝ R ⎠ AS 2 ⎝ AD 2 − AD1 ⎠ ⎦⎥
Rappel des notations utilisées :
- R : dilution de la solution mère pour réaliser l’étalon
- AS1 : absorbance de l’étalon à 520 nm
- AS2 : absorbance de l’étalon à 730 nm
- AD1 : absorbance du diluant à 520 nm
- AD2 : absorbance du diluant à 730 nm
- AU absorbance du mélange à 520 nm
- VD : le volume de diluant mis en oeuvre pour les
essais
- VU : le volume de solution mère ajouté au diluant par
la pipette à contrôler
• Tolérance pour la pipette utilisée : pipetman P20
L'écart maximum toléré pour un volume de 10 µL dans le laboratoire est de ! 0,5 µL.
33
2. Ultrafiltration du lactosérum
Les quantités de lactosérum disponibles dans le monde sont considérables puisqu’elles
représentent au moins 85% du lait transformé en fromage.
Bien que les protéines soient en faible quantité dans le lactosérum, leur extraction présente de
l'intérêt en raison de la valeur nutritionnelle et des propriétés fonctionnelles de celles-ci.
Il existe diverses techniques d’extraction, celle qui modifie le moins les qualités des protéines
est l’ultrafiltration.
Ce procédé membranaire permet d’obtenir un concentré protéique qui peut être utilisé par
exemple dans l’alimentation humaine.
Cependant les vitamines non liées aux protéines (comme les vitamines du groupe B) ne sont
que partiellement récupérées, ce qui constitue parfois un inconvénient.
Le sujet propose de concentrer un lactosérum en protéines, puis d’effectuer différentes mesures
permettant d’évaluer l’efficacité du procédé.
L’étude est réalisée à l’échelle du laboratoire sur un module constitué de fibres creuses, dont le
seuil de coupure est de 10 000 Da, avec recirculation du rétentat.
1. Réalisation de l’ultrafiltration
L’ultrafiltration sera réalisée à l’aide de la fiche technique fournie en annexe 2.
2. Dosage des protéines par la méthode du biuret
Etalonnage
Préparer, à partir d’une solution étalon de sérum albumine bovine (SAB) à 10,0 g.L-1, une
gamme d’étalonnage sous 1 mL de 0 à 10 mg.mL-1 en grands tubes à hémolyse.
Ajouter dans chaque tube 4 mL de réactif de Gornall.
Placer les tubes 30 minutes à l’obscurité et mesurer l’absorbance à 540 nm contre un témoin
réactif.
Essais
Réaliser les essais sur 1 mL de perméat, de rétentat et de lactosérum.
Compte rendu
Présenter sous forme de tableau l’ensemble des résultats expérimentaux.
Déterminer la concentration en protéines des échantillons.
Commenter les résultats obtenus.
3. Dosage de la vitamine B1 par fluorimétrie
Le dosage de la vitamine B1 est fondé sur l’oxydation de la thiamine en un dérivé fluorescent, le
thiochrome. Ce dosage s’applique aux échantillons ne contenant pas de quantités appréciables
de thiamine sous forme liée ou sous forme pyrophosphate. Le groupement phosphate peut
toutefois être préalablement éliminé par hydrolyse acide.
La concentration en thiamine du lactosérum étudié est de l’ordre de 5 mg.L-1.
Compte tenu du protocole et de la gamme d’étalonnage mis en œuvre, il est souhaitable
d’utiliser, pour réaliser un dosage satisfaisant, la méthode des ajouts dosés. Le dosage sera
donc effectué sur l’échantillon additionné d’une quantité connue de thiamine apportée par un
34
volume x, à déterminer, de la solution de thiamine à 2,00 g.L-1 mise à disposition pour
l’étalonnage.
Remarque
Pour calculer le volume de thiamine à ajouter dans chacun des échantillons, il sera admis que la
concentration en thiamine est la même dans le lactosérum, le perméat et le rétentat.
3.1. Extraction
-
Peser 0,5 g de NaCl dans un tube à essai.
Ajouter 0,5 mL de l’échantillon à doser (lactosérum, rétentat ou perméat).
Ajouter x µL de solution de thiamine à 2,00 g.L-1.
Ajouter 7,5 mL d’HCl à 0,1 mol.L-1.
Homogénéiser.
Placer au Bain-Marie pendant 30 minutes.
Refroidir puis filtrer. Le filtrat est recueilli directement en fiole jaugée de 50 mL.
Compléter avec HCl à 0,1 mol.L-1. Bien homogénéiser.
Les solutions obtenues sont appelées LH (pour lactosérum hydrolysé), RH (pour rétentat
hydrolysé) et PH (pour perméat hydrolysé).
Réaliser en parallèle un témoin d’extraction, TE, en remplaçant l’échantillon à doser et la
solution de thiamine par 15 µL de solution de thiamine à 2 g.L-1 + (485 + x) µL d’HCl à 0,1 mol.L1
.
3.2. Oxydation
3.2.1. Echantillons LH, RH, PH et TE
-
Introduire dans deux microtubes de 1,5 mL, environ 0,12 g de NaCl et 0,25 mL
d’échantillon. Un tube est destiné à la réalisation de l’essai, l’autre à la réalisation d’un
témoin.
Préparer extemporanément le réactif oxydant en mélangeant 1 mL de solution de
ferricyanure 1% (m/v) et 24 mL de NaOH 15% (m/v).
Ajouter dans le tube correspondant à l’essai 0,15 mL de réactif oxydant. Bien
homogénéiser.
Ajouter dans le tube correspondant au témoin 0,15 mL de NaOH 15%. Bien
homogénéiser.
Ajouter 0,65 mL d’isobutanol dans les deux microtubes. Bien homogénéiser.
Laisser décanter.
3.2.2. Etalons
-
Préparer, à partir de la solution de thiamine étalon à 2 g.L-1, une gamme de
concentration allant de 0,25 à 1 mg.L-1 (diluant = HCl à 0,1 mol.L-1).
Pour chaque concentration réaliser l’oxydation selon le protocole décrit ci-dessus.
3.3. Mesure de la fluorescence
Déposer dans les puits d’une microplaque 250 µL de chaque surnageant obtenu et lire la
fluorescence (annexe 3).
Longueur d’onde d’excitation : 360 nm
Longueur d’onde d’émission : 465 nm
Compte rendu
Présenter le calcul du volume x de thiamine ajouté dans les échantillons à doser.
35
Présenter l’ensemble des résultats expérimentaux.
Etablir la formule littérale permettant de calculer la concentration en vitamine B1 dans les
échantillons.
Présenter les résultats obtenus sous forme de tableau.
Déterminer la proportion de vitamine B1 récupérée dans le rétentat.
Commenter le résultat obtenu.
3. Etude de l'influence d'un paramètre physico chimique sur la croissance et le métabolisme
d'une levure osmophile : Pichia ohmeri
La souche étudiée se caractérise par son aptitude à produire, dans des conditions de pression
osmotique élevée, des polyols formant une gangue osmoprotectrice.
Ces molécules constituent des produits à haute valeur ajoutée. Leur pouvoir édulcorant,
acariogène et rafraîchissant en font des molécules de substitution de choix dans les pâtes à
mâcher ou le dentifrice par exemple.
Une fermentation en bioréacteur de 2 litres est réalisée en milieu liquide non renouvelé dont la
composition est donnée en annexe 4.
Le fermenteur a été préalablement ensemencé et placé à 30°C en aérobiose. Après environ
4 heures, l'aération du fermenteur sera supprimée.
1. Première phase : aérobiose
Les conditions de culture sont les suivantes :
- volume utile : 1,2 litre ;
- température 30 °C ;
- agitation : 600 rpm ;
- aération : 1 v/v/min.
1.1. Suivi de croissance de la levure en aérobiose
Réaliser un prélèvement d’environ 5 mL de culture aux temps t0, t1h, t2h et t3h.
Effectuer sur chaque prélèvement (dilué en eau stérile si nécessaire), une numération en cellule
de Malassez (annexe 5) après coloration au bleu de méthylène de Funk en comptant environ 20
à 50 levures par rectangle.
Pour réaliser cette coloration, mélanger volume à volume la suspension de levures à dénombrer
et le bleu de méthylène de Funk à pH 4 dans un tube à hémolyse stérile.
Compte rendu
Déterminer le pourcentage de viabilité sur un des prélèvements effectués.
Croissance de la levure :
présenter les résultats des numérations sous forme de tableau ;
déterminer le temps de génération de la levure en précisant la méthode utilisée.
Viabilité de la souche :
donner les résultats expérimentaux obtenus ;
expliciter le calcul effectué et indiquer le pourcentage de viabilité.
36
1.2. Mise en évidence par chromatographie sur couche mince des polyols produits et dosage
de l'éthanol
Centrifuger deux microtubes contenant 1,5 mL de culture prélevée à t3h. Conserver les
surnageants en glace.
2. Deuxième phase : semi-anaérobiose
Les conditions de culture sont les suivantes :
Température 30 °C ;
Agitation : 500 rpm ;
Aération : 0 v/v/min.
Effectuer un prélèvement d’environ 5 mL de culture après 3 heures de semi-anaérobiose.
Centrifuger deux microtubes contenant 1,5 mL de ce prélèvement. Conserver les surnageants
en glace avant la réalisation des analyses.
3. Culture en semi-anaérobiose de 24 heures
Une culture, conduite dans les mêmes conditions expérimentales, a été prolongée pendant
24 heures en semi-anaérobiose.
Un prélèvement de cette culture est fourni : « culture 24 heures ».
Centrifuger deux microtubes contenant 1,5 mL de ce prélèvement.
Conserver les surnageants en glace avant la réalisation des analyses.
4. Mise en évidence des polyols produits
Les polyols sont mis en évidence par chromatographie couche mince sur gel de silice.
Phase mobile :
chloroforme
85 mL
méthanol
30 mL
acide acétique
3 mL
eau
5 mL
Révélateur :
eau
molybdate d'ammonium
ammonium sulfate de cérium
acide sulfurique concentré
275 mL
10,5 g
0,5 g
15 mL
Le révélateur est appliqué au pinceau, la plaque est séchée au thermoventilateur, puis placée
sur plaque chauffante jusqu'à révélation.
Témoins :
Glucose
Arabitol
Ribitol
Xylitol
5 g.L-1
5 g.L-1
5 g.L-1
5 g.L-1
Essais : surnageants dilués au 1/20.
37
5. Dosage d'éthanol
Effectuer le dosage de l'éthanol, selon le protocole fourni en annexe 6, sur les surnageants
dilués au 1/10.
Compte rendu
Exploiter les résultats du chromatogramme.
Présenter sous forme de tableau, les résultats expérimentaux du dosage de l'éthanol.
Préciser la formule utilisée pour calculer la concentration en éthanol des moûts de
fermentation.
Calculer la concentration en éthanol des essais exprimée en g.L-1.
Commenter les résultats obtenus en utilisant les annexes 7 et 8.
Quel serait l'effet probable sur la production des polyols :
du maintien de l'aération pendant toute la durée du procédé ?
d'une augmentation de la concentration en phosphate inorganique dans le milieu ?
Au niveau d'un laboratoire recherche et développement, quelle stratégie pourra être
élaborée pour accroître la production de xylitol ?
38
Annexe 1
Fiche technique contrôle de la P20
Réactifs
- Solution mère de chromophore Ponceau S à 9,16 g.L-1. L’absorbance théorique en supposant
la loi de Beer-Lambert linéaire à l’infini, est de 418 à 520 nm, pour un trajet optique de 1 cm.
- Diluant : tampon phtalate 0,02 mol.L-1 pH 6,0 contenant 3,74 g.L-1 d’EDTA tétrasodique et
1,12 g.L-1 de CuCl2,2 H2O, et présentant ainsi un pic d’absorbance à 730 nm.
- Tampon phtalate 0,02 mol.L-1 pH 6,0.
Préparation de la solution étalon de chromophore
Diluer la solution mère de chromophore Ponceau S dans le diluant : 1 mL exactement de
solution mère de chromophore Ponceau S (pipette jaugée 2 traits de classe A) q.s.p. 200 mL
avec le diluant en fiole jaugée de classe A. Fermer soigneusement.
Soit R la dilution (0<R<1).
Réalisation des mesurages
Préparer une cuve contenant 2,00 mL de diluant délivrés à l’aide d’une pipette jaugée de
classe A et lire les absorbances du diluant à 520 nm et 730 nm contre un témoin adéquat :
respectivement AD1 et AD2.
Préparer une cuve contenant la solution étalon de chromophore et lire les absorbances à
520 nm et 730 nm contre un témoin adéquat : respectivement AS1 et AS2.
Ajouter à la cuve contenant les 2,00 mL de diluant, 10 µL de la solution mère de chromophore,
homogénéiser et mesurer l’absorbance à 520 nm.
Remarque :
Le mode opératoire présenté correspond à une adaptation des normes ISO 8655-7 : 2005(F) et
ISO/TR 16153 : 2004(F).
39
Annexe 2
Principe
Le lactosérum circule, sous pression, à l’intérieur d’un faisceau de fibres creuses dont le seuil de
coupure est de 10 kDa. Seules les molécules dont la taille est inférieure au seuil de coupure peuvent
traverser la paroi des fibres creuses.
Le rétentat est recueilli dans l’axe de la fibre alors que le perméat est recueilli latéralement.
Appareillage
La manipulation est réalisée sur un appareil « ÄKTA prime » qui peut également être utilisé en mode
FPLC.
40
Le schéma ci-dessous présente la face avant de l’appareil. De nombreux éléments ne sont pas
utilisés en mode filtration.
(chromatographie)
(chromatographie)
41
Le schéma ci-dessous présente le montage du module d’ultrafiltration.
Sortie du rétentat
Sortie du perméat
Il faut inclure dans le circuit, en plus du récipient contenant le lactosérum (tube de 50 mL gradué à
fond conique) et du récipient permettant de recueillir le perméat (tube de 50 mL gradué à fond
conique), un récipient contenant le liquide de lavage (eau) et un récipient poubelle (pour les
lavages entre chaque candidat, effectués par les examinateurs).
42
Mise en œuvre de l’ultrafiltration
La manipulation est réalisée sur 35 mL de lactosérum.
Le lactosérum est tout d’abord aspiré dans la vanne tampon située sur la face latérale droite de
l’appareil, puis dans la vanne gradient également située sur la face latérale droite de l’appareil, avant
d’être dirigé vers la pompe puis vers le capteur de pression, pour finalement circuler dans la fibre
d’ultrafiltration.
La manipulation permet de concentrer les protéines de l’échantillon.
Les molécules, dont le poids moléculaire est inférieur au seuil de coupure, restent à la même
concentration dans le perméat, le rétentat et le lactosérum.
Dans un premier temps, le lactosérum est aspiré, les effluents éliminés dans la poubelle, afin de
s’affranchir du volume mort du circuit (environ 15 mL).
Dans un second temps, pour obtenir une concentration plus élevée du rétentat, celui-ci est recyclé.
En début de manipulation, positionner les tuyaux de sortie du rétentat et du perméat dans la
poubelle.
Programmation de l’appareil :
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
Entrer dans " Manual run " en appuyant sur OK. " Set method base " apparaît ; pas de
réglage à effectuer.
Appuyer sur∇. " Set concentration %B " apparaît ; n’intervient pas en filtration donc pas
de réglage à effectuer.
Appuyer sur ∇. " Set gradient " apparaît ; n’intervient pas en filtration donc pas de réglage
à effectuer.
Appuyer sur ∇. " Set flow rate " apparaît. Appuyer sur OK pour régler le débit qui s’affiche
par défaut à 0,1 mL.min-1. Pour augmenter le débit appuyer sur ∆ (pression courte : de 0,1
en 0,1 ; pression longue : de 1 en 1 mL.min-1). Appuyer sur OK pour valider le débit choisi
soit 50 mL.min-1 dans la manipulation proposée.
Appuyer sur ∇. " Set fraction base " apparaît ; n’intervient pas en filtration donc pas de
réglage à effectuer.
Appuyer sur ∇. " Set fraction size " apparaît ; n’intervient pas en filtration donc pas de
réglage à effectuer.
Appuyer sur ∇. " Set pressure limit " apparaît. Appuyer sur OK pour régler la pression qui
s’affiche par défaut à 1,00 MPa. Utiliser les touches ∇ et ∆ pour augmenter ou diminuer la
43
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
pression. Choisir la pression limite indiquée pour la fibre (ici 0,4 MPa). Appuyer sur OK pour
valider la pression.
Appuyer sur ∇. " Set buffer valve position " apparaît. La position 1 s’affiche par défaut,
appuyer sur OK et utiliser les touches ∇ et ∆ pour choisir la bonne position, ici la position 7.
Appuyer sur OK pour valider la position choisie.
Appuyer sur ∇. " Set inject valve position " apparaît ; n’intervient pas en filtration donc pas
de réglage à effectuer.
Appuyer sur ∇. " Start run " apparaît. Appuyer 2 fois sur OK pour démarrer la manipulation.
Dès que 15 mL de lactosérum ont été aspirés appuyer sur pause/cont.
Positionner le tuyau de sortie du rétentat dans le tube de lactosérum et celui du perméat
dans un tube propre.
Appuyer sur pause/cont pour poursuivre la manipulation.
Arrêter l’ultrafiltration en appuyant sur "end" quand le volume de perméat est suffisant (soit
10 mL)." End run " apparaît. Sélectionner l’option yes à l’aide des touches ∇ et ∆. Appuyer
sur OK pour valider la position choisie. " Memory print out " apparaît. Sélectionner " no "
et valider. L’appareil est prêt pour l’étape suivante (lavage de la fibre par l’examinateur).
Remarque : il se peut que l’alarme pression se déclenche en cours de manipulation. Appuyer sur
pause/cont et laisser la pression redescendre (la valeur de la pression apparaît sur l’écran lors de la
manipulation). Appuyer à nouveau sur pause/cont. Si le problème persiste, il faut diminuer le débit
(parfois jusqu’à 5 mL.min-1).
44
Annexe 3
Fiche d’utilisation du microfluorimètre
Allumer les appareils (fluorimètre + ordinateur).
Cliquer sur l’icône Magellan, le portoir de microplaque se déploie, y déposer la plaque (puits A1 en
haut à gauche).
Cliquer sur Annuler dans le cadre « welcome ».
Cliquer sur create/edit a method.
Cliquer sur suivant.
Cocher create new et cliquer sur suivant.
Cocher endpoint measurement et cliquer sur measurement parameter.
- Dans l’onglet général, cocher fluorescence et move plate out after.
- Dans l’onglet « plate »
1. Choisir le bon type de plaque (si plaque 96 puits, choisir GRE 96 ft pdf) (ft = flat
bottom transparent). Cliquer sur browse, faire défiler les noms de plaques, et
sélectionner le bon type. Cliquer sur OK.
2. Définir la partie de la plaque à lire : cocher part of the plate et choisir les puits à lire.
3. Définir la direction des lectures : cocher dans « read direction » rows (rangées) ou
columns (colonnes).
- Dans l’onglet « measurement parameters ».
1. Cocher other.
2. Choisir la longueur d’onde d’excitation (ici 360 nm). Si le choix offert ne correspond
pas la longueur d’onde souhaitée, il faut changer de filtres.
3. Choisir la longueur d’onde d’émission (ici 465nm).
4. Cocher Gain optimal.
5. Choisir le mode de lecture (peu importe si fond transparent).
6. Conserver les paramètres choisis par défaut par l’appareil pour intégration et flash.
- Ne pas régler « l’onglet température » et « onglet shaking ».
Cliquer sur OK.
Cliquer sur suivant, le cadre « define the evaluation » apparaît.
Cliquer sur design layout, cela permet d’identifier les puits.
Cliquer sur un puits et choisir son identifiant en cliquant sur BL (blanc) ou ST (standard) ou SM
(échantillon) et l’appliquer en cliquant sur fill selection.
Procéder ainsi pour chaque puits.
Fermer well assignement.
Cliquer sur OK.
Cliquer deux fois sur suivant et nommer le fichier puis cliquer sur terminer.
Cliquer sur start measurement à moins que le cadre n’apparaisse directement en raison d’un
préréglage.
Cliquer sur plate in puis cliquer sur start.
La fenêtre « display in wells » apparaît et les valeurs lues s’affichent dans les puits correspondants. A
la fin des mesures, la fenêtre se ferme.
La fenêtre « evaluate results » apparaît. Cliquer sur print preview puis print pour imprimer les
résultats (ou cliquer sur view data pour simplement visualiser la plaque avec les valeurs).
45
Annexe 4
Milieu de préculture et de production
KH2PO4
MgSO4
Glucose
Corn steep (50% de matière sèche)
(NH4)2SO4
FeSO4
Eau distillée
Antimousse silicone
1g
0,5 g
100 g
5g
0,25 g
une pointe de spatule
q.s.p.
1L
1 goutte
46
Annexe 5
Cellule de Malassez
Les cellules à numération sont des lames comportant une surface quadrillée présente dans une cavité
de la lame de telle sorte que, recouverte d'une lamelle optiquement plane, elles emprisonnent un
volume connu de suspension de cellules.
- Sur la lame de numération préalablement recouverte d'une lamelle épaisse et plane, introduire la
suspension diluée par capillarité dans la chambre de numération en évitant absolument tout
débordement.
- Laisser les cellules sédimenter.
- Effectuer une numération de 200 cellules. Un bourgeon est considéré comme une cellule si son
diamètre est supérieur ou égal à la moitié du diamètre de la cellule dont il est issu.
47
Annexe 6
Dosage enzymatique de l'éthanol par méthode UV
Principe
L'alcool est dosé par voie enzymatique. L'absorbance du NADH formé au cours de la réaction
catalysée par l'alcool déshydrogénase (ADH) est mesurée à 340 nm.
ADH
+
CH3CH2OH + NAD
+
CH3CHO + NADH + H
Mode opératoire
Dans des macrocuves UV :
Témoin
Etalon
Essai
Tampon Tris pH 10 (mL)
2
2
2
Eau distillée (mL)
0,1
Solution étalon d’éthanol à 0,1 g.L-1
0,1
Surnageant dilué au 1/10 (mL)
0,1
Mélanger, attendre 2 à 3 minutes puis lire les absorbances A1 à 340 nm.
Solution ADH/NAD+ (mL)
0,5
0,5
0,5
Mélanger, attendre environ 15 minutes puis lire les absorbances A2 à 340 nm.
48
Annexe 7
Rappels
Pichia ohmeri, comme de nombreuses levures, possède les deux voies classiques conduisant au
pyruvate :
- la glycolyse ou voie d’Embden-Meyerhof-Parnas ;
- la voie des pentoses-phosphate.
La balance entre les deux voies a été décrite initialement chez Saccharomyces cerevisiae par le
phénomène appelé « effet Pasteur ». L’enzyme clef est la phosphofructokinase qui présente chez la
levure une double activité « kinase et phosphatase » dépendante de la charge énergétique cellulaire.
Cette régulation permet d’éviter les cycles futiles.
Données
D’importantes différences d’affinité de certaines enzymes pour un même substrat sont constatées
chez Pichia ohmeri, ainsi la transcétolase et la D-ribulose-5-P épimérase ont-elles une forte affinité
pour le D-xylulose-5-P, au contraire de la D-xylulose-5-phosphatase.
49
Annexe 8
Quelques voies métaboliques chez Pichia ohmeri
GLUCOSE
ATP
Glucokinase
ADP
Glucose-6-P-isomérase
Glucose-6 -P
Fructose-6-P
Glycolyse
NADP +
D-glycéraldéhyde-3-P
Glucose 6 P deshydrogénase
NADPH
Fructose-6-P
6-P-Gluconate
Sédoheptulose-7-P
Transcétolase
NADP +
Erythrose-4-P
6 phosphogluconate deshydrogénase
Ribose-5-P
NADPH
D-ribulose-5-P-3-épimérase
D-XYLULOSE-5-P
D-RIBULOSE-5-P
D-xylulose-5-phosphatase
D-ribulose-5- phosphatase
Pi
Pi
D-RIBULOSE
D-XYLULOSE
NADPH
NADPH
NADH
NADH
NADH D-xylulose réductase
NADP +
NADPH D-ribulose réductase
NAD +
NADH D-ribulose réductase
NADP +
NAD +
NADPH D-xylulose réductase
XYLITOL
XYLITOL
ARABITOL
RIBITOL
50
RAPPORT SUR L'EPREUVE DE TRAVAUX PRATIQUES ETABLI PAR
C. BENAYOUN, J. CNOKAERT, I. ETIENNE, J.F. PERRIN, C. PLAS, P. VANNESTE et C.WALTHER
Le jury félicite les candidats pour leur attitude positive. Cette épreuve reste toujours difficile à gérer en
raison du stress d’autant que le sujet propose des manipulations originales.
Résultats de l’épreuve
Dix candidats étaient présents aux épreuves pratiques.
1 candidat a obtenu une note supérieure ou égale à 14/20.
2 candidats ont obtenu une note supérieure ou égale à 12 et strictement inférieure à 14/20.
2 candidats ont obtenu une note supérieure ou égale à 10 et strictement inférieure à 12/20.
4 candidats ont obtenu une note supérieure ou égale à 8 et strictement inférieure à 10/20.
1 candidat a obtenu une note supérieure ou égale à 6 et strictement inférieure à 8/20.
Moyenne :
Note la plus faible :
Note la plus élevée :
10,5/20
07,1/20
15,5/20
Partie I
Contrôle de qualité d’une micropipette (volume 2 à 20 µL) par méthode photométrique
Trois candidats ont réalisé la manipulation.
Un seul l’a conduite à terme et a exploité les résultats.
Avec les balances analytiques dont la résolution est de 0,1 mg il est impossible de vérifier des
volumes délivrés inférieurs à 100 µL. Seule la méthode photométrique est utilisable, mais il faut une
technique qui permette de s’affranchir des longueurs de trajet optique, des imperfections des cuves,
de la pureté des colorants utilisés. Les spectrophotomètres doivent être raccordés aux étalons
primaires.
Partie II
Ultrafiltration du lactosérum
Les candidats se sont très bien comportés face à l’appareillage proposé pour réaliser l’ultrafiltration.
Pour le dosage des protéines quelques erreurs de calcul surprenantes ont été observées.
Il fallait constater que non seulement il y avait concentration effective du rétentat en protéines mais
que quelques peptides détectés par le réactif du biuret se retrouvaient dans le perméat.
Peu de candidats ont compris l’intérêt de l’ajout dosé.
Aucun candidat n’a mené à terme l’exploitation complète de cette partie en tenant compte notamment
du témoin d’extraction.
Cependant, malgré la difficulté du protocole, la majorité des candidats a quand même réalisé la
manipulation, ce qui a été apprécié par le jury.
Partie III
Etude de l'influence d'un paramètre physico chimique sur la croissance et le métabolisme
d'une levure osmophile : Pichia ohmeri
Les candidats n’ont pas été perturbés par les prélèvements réalisés sur les fermenteurs. Ils ont
conduit les différentes manipulations de façon satisfaisante. En revanche l’exploitation des résultats et
leur analyse dans le contexte physiologique proposé se sont avérées décevantes. Pichia ohmeri est
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une levure capable de produire du ribitol en conditions anaérobies. La synthèse de ce métabolite est
dépendante de la disponibilité du NADH,H+ produit par la voie d’Embden-Meyerhof-Parnas. En
aérobiose, l’arabitol est synthétisé par réoxydation du NADPH, H+ issu de la voie des pentosesphosphate. Si les voies métaboliques montrent que la production de xylitol est théoriquement
possible, les indications portées en annexe 7 indiquaient clairement que les voies conduisant à ce
polyol étaient non efficientes car en compétition avec la voie de production de l’arabitol ou du ribitol.
Les dosages montraient que Pichia ohmeri produisait peu d’éthanol même en anaérobiose. La CCM
ne permettait pas de séparer les trois polyols mais les distinguait nettement du glucose. Pour les
prélèvements « aérobiose et anaérobiose – 3 heures », la concentration en glucose de 100 g/L dans
le milieu de production masquait par effet de traînée toute mise en évidence de polyol. Après 24
heures d’anaérobiose, l’épuisement du glucose permettait de visualiser un spot de polyols non
identifiés par la CCM (en théorie du ribitol).
Pour répondre aux deux dernières questions, les hypothèses suivantes pouvaient être formulées :
- inhibition par le produit (phosphate inorganique) des deux phosphatases impliquées dans les
voies de synthèse des polyols,
- recherche d’une souche productrice de xylitol par double mutation sur la D-ribulose-5-P
épimérase et la transcétolase.
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Seconde épreuve d’admission
Soutenance d’un dossier
Rapport de l’épreuve sur dossier établi par Mme Françoise Guillet, M. Frédéric Ducancel,
M. Jean-Yves Daniel, M. Charles Tellier,
Résultats de l’épreuve
10 candidats ont présenté des dossiers
la moyenne de l’épreuve : 13
la meilleure note pour cette épreuve a été de 19
la moins bonne de 6
Tous les dossiers ont été préparés avec grand sérieux.
Certains présentaient des travaux effectués par les candidats lors de stages dans des laboratoires de
recherche ou de recherche et développement, d’autres relataient des expériences conduites avec des
étudiants.
Les sujets étaient très divers, les thèmes abordés étaient, d’une façon générale, pertinents. Le jury a
apprécié la qualité des documents présentés.
Les prestations orales ont été de bonne qualité : les candidats respectant le temps qui leur était
imparti, les techniques de présentation maîtrisées et utilisées de façon adaptée aux propos.
Le jury a particulièrement apprécié l’attitude des candidats lors des réponses à ses questions : la
plupart des candidats a montré que leur sujet et les données scientifiques qui le sous tendaient étaient
maîtrisées, ils ont su faire preuve de réflexion, d’honnêteté intellectuelle.
Cependant, le jury a regretté dans quelques présentations, le manque certain de réalisme et donc de
mise en pratique en milieu scolaire des projets pédagogiques : manipulations d’animaux vivants, de
matériels nécessitant beaucoup de précautions, besoins de certains équipements lourds.
Les meilleures prestations ont été celles qui alliaient sujet d’étude original et de niveau scientifique et
technologique élevé et application pédagogique réaliste ancrée dans les référentiels des diplômes de
la filière.
RESULATS des concours
AGREAGATION INTERNE : 4 candidats admis
CAER : 1 candidat admis
CONCLUSION GENERALE
Le jury félicite les candidats admissibles et admis à ce concours qui cette année encore a montré la
qualité des enseignants de biochimie génie biologique.
Il encourage les candidats non admis à se représenter.
L’agrégation interne est un concours difficile qui nécessite une préparation sérieuse qui ne doit
négliger ni les aspects purement scientifiques, ni les technologies et techniques à l’appui de ces
savoirs, ni la pratique des techniques devant assurer l’acquisition des compétences aux étudiants des
filières de biochimie génie biologique.
Le jury tient à remercier Monsieur Colpin directeur de l’ENCPB et l’ensemble de l’équipe de direction,
Madame Martine Charrin chef de travaux, qui ont accueilli ce concours et fait en sorte qu’il se déroule
dans d’excellentes conditions.
Il tient particulièrement à remercier l’ensemble des personnels de laboratoire, techniciens aides
techniques et agents de laboratoire qui par leur professionnalité ont assuré, avec les professeurs
préparateurs des travaux pratiques, la qualité de cette épreuve.
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