Utilisation de la methode premi-test pour la

Utilisation de la méthode Premi-test pour la détection de résidus
antibactériens dans la viande de lapins : choix du muscle, étude de l’effet
temps/congélation, comparaison des méthodes d’extraction des jus à
température ambiante ou après passage au bain-marie.
S. BOUCHER1, E. BOUSQUET2, B. ARMANGE2, J.M. FABRE3
1
LABOVET CONSEIL (Réseau Cristal) - BP 539 85505 Les Herbiers Cedex, France
2
VIRBAC France – 13e rue LID – 06517 CARROS Cedex, France
3
PHYLLUM - Buroparc III - Rue de la Découverte - 31675 LABEGE Cedex, France
Résumé. La méthode Premi®Test n’est pas très employée pour les viandes de lapins et quelques interrogations
demeurent :
- Quelles pièces anatomiques peuvent être prises comme échantillon représentatif ?
- Quelles sont les meilleures techniques d’extraction des jus pour obtenir des échantillons représentatifs ?
- Quel est l’effet de la congélation sur la conservation de certaines molécules ?
Les auteurs analysent par Premitest ou HPLC la viande de lapins traités ou non avec une association de TMP
Sulfadiméthoxine ou d’oxytétracycline. Ils montrent que la détection est indépendante du morceau choisi, que
pour des raisons de protocole, il est possible de laisser la viande décongeler à température ambiante ou de la
décongeler au bain-marie sans altérer les résultats de l’essai et qu’on ne note pas de différences significatives
lorsque l’analyse est réalisée après 18 semaines de congélation à -20°C.
Abstract. Utilisation of the Premi-test method to detect antibacterial residues in rabbit meat: choice of the
muscle, study of the effect time/freezing, comparison of the juices extraction methods at ambient
temperature or after water-bath. The Premi®Test method is not frequently used for rabbit meat, and
unanswered questions remain:
Which piece can be considered as representative samples?
Which are the best techniques of juice extraction to obtain representative samples?
What is the effect of freezing on the preservation of some molecules?
The authors analyse by Premitest or HPLC the meat of rabbits that have either been treated or not with an
association of TMP Sulfadiméthoxine or oxytétracycline. They show that detection is independent of the piece
chosen, that for practical reasons it is possible to let the meet de-freeze either at ambient temperature or to water
bath without affecting the results, and that no significant difference is recorded when the analysis is conducted
after 18 weeks of freezing at -18°C.
Introduction
®
La méthode Premi Test est une méthode officielle
(DGAL / SDRRCC/N2006-8240) de détection des
antibactériens dans les jus de viande dans de
nombreux pays (Okerman 1998, Beverley 2001, Fabre
2003, Stead et al. 2005). Elle est très employée pour
le bovin, le porc, les volailles (Fabre et al. 2004) et
parfois utilisée sur la viande de lapins. Cependant, la
composition de cette viande et sa faible jutosité nous
ont amenés à procéder à quelques essais pour
connaître les limites de détection du test sur les
viandes de lapin.
Le protocole proposé devait permettre de répondre à
trois questions :
Quelles pièces anatomiques peuvent être prises
comme échantillon représentatif d’un animal ?
Quelles sont les meilleures techniques d’extraction
des jus ?
Quel est l’effet de la congélation sur la conservation
de certaines molécules ?
1. Matériel et méthodes
1.1. Animaux.
Il s’agissait de lapins de chair conventionnels de
souche Hycole jamais traités avec des antibactériens,
nés de mères non traitées. Ils recevaient une
alimentation et une eau de boisson sans antibiotique.
Trois lots d’animaux étaient constitués : 2 animaux
"blancs" (sans traitement), 8 animaux avec un
traitement A (Oxytétracycline) et 8 avec un traitement
B (Triméthoprime et Sulfadiméthoxine). Les animaux
traités étaient abattus par groupe de 2 à différents
stades après le dernier traitement.
1.2. Premitest.
La méthode Premi®Test est normée (certificat
AFNOR : DSM-28/1-06/06) (Gaudin et al. 2006,
Gaudin et al. 2008). Le test consistait à extraire 100
microlitres de jus de viande mis à incuber avec des
géloses et un indicateur coloré bleu contenant des
Bacillus stearothermophilus pendant 20 mn. Après
rinçage, l’ensemble ainsi qu’un témoin négatif étaient
placés à 64°C pendant quelques heures ce qui
permettait de tuer les autres bactéries non résistantes à
la chaleur. Un témoin négatif était réalisé à partir de
jus de viande de lapin élevé spécifiquement sans
antibiotique. Dès que le virage coloré du témoin
négatif était fait (la gélose devenait jaune), on pouvait
lire l’ensemble à l’aide d’un Premi®Scan, afin de
s’affranchir des aléas liés à la vision humaine (Stead
et al. 2005). Le test a une sensibilité pour
13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans.
l’oxytétracycline de 200 à 400 ppb (Limite Maximale
de Résidus – LMR 100 ppb) et de 25 - 50 ppb pour la
sulfadiméthoxine (LMR 100 ppb) (Braham 2001,
Geijp et al. 2009, Stead et al. 2009). Toutes les
analyses en chromatographie (HPLC) ont été confiées
pour cet essai au Laboratoire Départemental de la
Vendée.
1.3 Protocole.
Un lot de 8 animaux reçoit un traitement A à base
d’oxytétracycline injectable avec une galénique
« longue action » (Terralon® : SC, 0.5ml/kg PV, soit
100 mg de matière active/Kg PV). Un autre lot de 8
animaux reçoit un traitement B à base de
sulfadiméthoxine et de triméthoprime injectable
(Bactotryl® : SC, 0.125ml/kg PV soit 23,34 mg de
sulfadiméthoxine et 5 mg de triméthoprime/Kg PV).
Les animaux sont traités le premier jour de la semaine
S1 (Semaine 1) à l’âge de 10 semaines. 2 lapins sans
traitement depuis au moins un mois sont sélectionnés.
2 animaux traités avec un médicament donné sont
abattus (électronarcose et saignée) à des temps allant
de 2h, 24h, 48h, 72h, 96h ou 192 h après la fin du
traitement. Les animaux ont été découpés 3 heures
maximum après l’abattage. Sur chaque animal, on a
prélevé 6 morceaux de râble, 4 de cuisse, 2 des pattes
avant et 2 de l’abdomen (figure 1).
Figure 1. Notation des différents morceaux découpés
chromatographie en semaine S18 sont envoyés pour
réaliser les analyses, dès réception. Le test statistique
choisi est le test de Khi2.
2. Résultats
2.1. Résultat en fonction du lieu de prélèvement.
Que l’on prenne le côté droit ou le côté gauche du
lapin, on ne note pas d'effet « côté prélevé »
significatif (figures 2 et 3, Khi 2 = 0,72 ddl = 1).
Figure 2. Différences selon le côté choisi
Gauche
50
26
52
24
Droit
0
10
20
30
40
50
60
Positifs
Négatifs
70
80
De même, on ne note pas d'effet lieu du prélèvement
significatif (Khi2 = 0,96 ddl = 1) si on teste les
différences éventuelles entre « morceaux » analysés
(figure 3).
Figure 3. Résultat selon le « morceau » prélevé
Rable
25
13
Patte avant
24
14
Positifs
28
Cuisse
Abdomen
10
0
10
Négatifs
13
25
20
30
40
2.2. Résultat en fonction de la préparation des
échantillons (figure 4 et 5).
Figure 4. Résultats après bain-marie en fonction du
délai avant abattage
10
8
Tous les échantillons sont emballés séparément quand
la carcasse est refroidie (minimum 4 heures après
abattage) puis congelés. Les carcasses sont
accompagnées du numéro d’identification du lapin et
ne sont découpées que l’une après l’autre pour éviter
tout mélange. Les sachets sont identifiés au fur et à
mesure de l’ensachage.
Les prélèvements sélectionnés sont analysés après
décongélation au bain marie à 65°C sur certains
échantillons et après avoir laissé décongeler les
viandes à température ambiante sur d’autres pièces
anatomiques de même origine. Le jus est extrait par
pressage dans les deux cas. Tous les échantillons
congelés à -20°C prévus pour l’analyse en
chromatographie en semaine S1 sont envoyés au
laboratoire qui réalise les analyses dès réception. Tous
les échantillons congelés à -20 °C et gardés congelés
18
semaines,
prévus
pour
l’analyse
en
6
Négatifs
4
Positifs
2
0
Blancs
2h
24 h
48 h
72 h
96 h
192 h
Figure 5. Résultats à température ambiante en
fonction du délai avant abattage
10
8
6
Négatifs
4
Positifs
2
0
Blancs
2h
24 h
48 h
72 h
13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans.
96 h
192 h
Lorsqu’on compare les résultats après traitement des
viandes au bain marie ou à température ambiante, on
les trouve comparables (Khi 2 = 0,63 / ddl = 1). On
note 34% de positifs en « Bain marie » et 37% en
"Température ambiante". Il n’y a aucune différence
significative sur les échantillons "extrêmes" et un peu
plus de positifs à 48h en "température ambiante".
2.3. Résultat en fonction du temps de congélation
pris en compte (figures 6 et 7).
Lorsqu’on compare avec la méthode HPLC les
résultats obtenus en semaine 18 après congélation
pour les deux traitements, on note que les cinétiques
sont satisfaisantes ce qui fait de ce test une bonne
référence pour l’analyse des échantillons en
Premi®Test.
Figure 6. Résultats HPLC semaine 18 après
traitement tétracyclines en fonction du délai avant
abattage
Figure 8. Résultats S1 après traitement tétracyclines
en fonction du délai avant abattage
20
15
Négatifs
10
Positifs
5
0
2h
24 h
48 h
72 h
96 h
192 h
Figure 9. Résultats S1 après traitement sulfamides en
fonction du délai avant abattage
20
15
N égat if s
10
Po sit if s
5
0
100000
2 h
24 h 48 h
72 h
9 6 h 19 2 h
10000
1000
Figure 10. Résultats S18 après traitement
tétracyclines en fonction du délai avant abattage
100
10
1
2h
24 h
48 h
72 h
192 h
Figure 7. Résultats HPLC sem 18 après traitement
sulfamides en fonction du délai avant abattage
5
4
3
2
1
0
Négatifs
Positifs
2h
100000
24 h
48 h
72 h
96 h
192 h
10000
1000
Figure 11. Résultats S18 après traitement sulfamides
en fonction du délai avant abattage
100
10
1
2h
48 h
96 h
192 h
Les Premi®Test réalisés en semaine 1 (sans période
de congélation) après préparation au bain marie
(figure 8 et 9) peuvent être comparés aux Premi®Test
réalisés après 18 semaines de congélation après
préparation au bain marie également (figure 10 et 11).
On note alors des résultats identiques à ceux obtenus
en frais pour les points suivants :
- Aucun négatif 2 h après traitement
- Aucun positif 192 h après traitement
Bien qu’on ait l’impression pour les sulfamides qu’il
y a un peu plus de positifs après congélation longue
durée, et inversement pour les tétracyclines il n’y a
pas de différence significative (Khi 2 = 0,32 / ddl = 1)
et pas de différence sur les extrêmes.
5
4
3
2
1
0
Négatifs
Positifs
2h
24 h
48 h
72 h
96 h
192 h
2.4. Comparaison entre Premi®Test et HPLC en
S18 (tableau 1 et 2).
Lorsqu’on compare la méthode Premi®Test et la
chromatographie à partir des échantillons gardés
congelés jusqu’en semaine 18 et qu’on les analyse
après décongélation au bain marie (tableau 1 et 2), on
ne note aucun négatif 2 heures après traitement ce qui
fait de Premi®Test un bon outil de détection des
animaux en cours de traitement. Nous n’avons pas
non plus de positif 192 h après traitement ou lorsque
13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans.
les lapins reçoivent un aliment « blanc », ce qui nous
amène à écrire qu’il n’y a pas de faux positifs en
Premi®Test dans les conditions testées. Certains
animaux ont des taux de résidus de tétracyclines
supérieurs aux LMR et ne sont pas détectés en
Premi®Test. La limite de sensibilité du Premi®Test
est supérieure à la LMR pour cette molécule.
Tableau 1. Comparaison entre Premi®Test et HPLC
en S18 pour les tétracyclines
Oxytétracycline
Premi
test
HPLC
2h
+
4
-
0
>LMR
2
<LMR
24h 48h 72h 192h Blanc
4
0
2
0
0
0
0
4
4
2
4
2
2
0
0
0
0
0
0
2
1190 5952 1310
428/
valeurs 5/15 /257 /119
<20
593
000 1
1
2
<25
Tableau 2. Comparaison entre Premi®Test et HPLC
en S18 pour les sulfamides
Sulfadiméthoxine 2h 48h 72h 192h Blanc
Premi
positif
4
2
0
0
0
test
négatif 0
4
4
4
4
>LMR 2
HPLC
2
0
0
0
<LMR 0
0
2
2
2
valeurs 6712/ 254/7 33/87 <20nd
5870 18
3. Discussion
A l’issue de ces essais, l’objectif est de disposer d’un
ensemble de recommandations opérationnelles et de
modes opératoires pour la mise en œuvre la plus
performante possible du Premi®Test sur les viandes
de lapin. Dans l'ensemble, les résultats apparaissent
très cohérents. Le Premi®Test donne de bons
résultats, indépendants du lieu de prélèvement, de la
méthode de préparation des échantillons congelés ou
de la durée de conservation des échantillons congelés.
Par rapport à la chromatographie, on ne note aucun
faux positif. Cependant, dans les conditions de l’essai,
il existe une sensibilité du Premi®Test à des seuils
plutôt supérieurs à la LMR pour certains
antibiotiques, notamment, dans notre essai, pour
l’oxytétracycline (Stead et al. 2004). Toute analyse
Premi®Test à titre libératoire des viandes de lapins
abattus doit donc être confirmée par dosage HPLC.
Conclusion
Le Premi®Test est un test facile à mettre en œuvre. Il
a toute son utilité dans la détection de lapins en cours
de traitement. La détection semble indépendante du
morceau choisi pour le test. Pour des raisons de
protocole, il est possible de laisser la viande
décongeler à température ambiante ou de la
décongeler au bain-marie sans altérer les résultats de
l’essai. En outre, on ne note pas de différence
significative lorsque l’analyse est réalisée après 18
semaines de congélation. Mais, si cette méthode
bactériologique globale est peu onéreuse, elle ne peut
être envisagée que comme une première approche,
qualitative et non quantitative. En effet, pour
déterminer avec assurance les teneurs en antibiotiques
et leur nature dans une viande donnée, il est
nécessaire de l’analyser par HPLC.
Références
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screening of antimicrobial drug residues in food by the use
of Premi®Test. Vet. Sci. : Vol. 70 – Avril.
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13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans.