Stratégie de travail en SyBr green

Stratégie de travail en SyBr green :
Vous trouverez dans la première partie de la page WEB toutes les informations concernant le
SyBr Green I.
Plusieurs étapes sont requises pour aboutir à une quantification correcte de vos gènes cibles.
Pour chacun de vos gènes, il va falloir trouver un bon couple d’amorce (fonctionnant dans
des conditions de PCR définies : MgCl2, température) :
Cette recherche du meilleur couple d’amorces possibles commence à travers plusieurs
logiciels :
- Oligo6 sur 3 PC communs (Bâtiments Roussy, Méchain et Fac).
- Light Cycler Probe Design Software LCPDS sur PC communs (Bâtiments Roussy,
Méchain et Fac) et sur des PC personnels (logiciel d’installation disponible sur CD).
- Primer3 disponible sur le WEB (http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi)
Oligo6 et Primer3 sont les plus adaptés au dessin d’amorces en SyBr Green I.
Vous pouvez trouver des couples validés sur le site
suivant :http://www.medgen.ugent.be/rtprimerdb/index.php
Par expérience, il est conseillé de dessiner plusieurs couples sur le même gène, de tester ces
différents couples parallèlement afin de choisir le meilleur. De façon générale, le dessin du
couple est un élément crucial ; les modifications des conditions (MgCl2, Températures) ne
changeront pas fondamentalement les choses.
Plusieurs règles de base dans ce dessin :
- travailler sur des amplicons de petite taille (entre 80 et 300 bases) permet d’augmenter la
robustesse de la PCR (on évite d’éventuelles zones à problèmes).
- choisir des températures d’hybridations proches (entre 55 et 60°C)
Cette mise au point nécessite une matrice d’ADN portant le gène cible (plasmide, cDNA,
produit de PCR, …). Cet ADN matrice va prendre le nom de standard quand il va être utilisé
pour quantifier les concentrations inconnues des gènes cibles de vos échantillons.
Cet ADN standard peut être :
- un cDNA : imaginons que votre gène est exprimé plus ou moins fortement l’un de vos ARN
dont vous disposez de grande quantité. Pour éviter tout biais lié à des RT-PCR faites à des
moments différents, vous pouvez anticiper en préparant parallèlement plusieurs RT-PCR pour
avoir des quantités de cDNA suffisante pour toutes vos manips. En poolant les cDNA et en les
aliquotant en petit volume pour les stocker à -20°C, vous ne les décongèlerez qu’une fois le
jour de votre manip (pas de re congélation = moins de dégradation).
L’ARN que vous utilisez peut être un ARN complexe mais aussi un ARN synthétique,
construit en clonant votre gène cible dans un système in vitro permettant de synthétiser de
l’ARN cible.
- un plasmide portant votre gène cloné : faites alors très attention aux manipulations de ces
standards, les très grande quantité de cibles générées peuvent venir vous contaminer si vous
ne prenez pas vos précautions.
D’autre part, dans certains cas, il a été démontré une différence dans l’efficacité de PCR d’un
couple d’amorces selon que l’on travaille sur un plasmide ou sur un cDNA. La différence de
complexité génomique des 2 systèmes a été avancée. L’interférence du tampon de RT dans la
PCR a été également avancée.
Donc, même si votre standard est un plasmide, il peut être intéressant d’estimer l’efficacité de
PCR sur du cDNA pour s’assurer que les 2 efficacités ne sont pas trop différentes.
- un produit de PCR : la encore faites très attention aux contaminations.
Sachez que l’efficacité d’un couple d’amorce peut être différente selon la matrice : en
particulier, si les efficacités PCR sur les plasmides sont toujours performante, il peut être
nécessaire de confirmer cette efficacité sur un cDNA.
Optimisation des conditions de PCR :
Vous pouvez consulter la note technique de Roche LC9/2000 sur ce sujet.
Différents kits mis au point pur le SyBrgreen I sur Light Cycler sont disponibles. Les kits
recommandés (validés par les utilisateurs du site) sont :
- Le kit Master de Roche : kit 1
- Le kit Master plus de Roche (différent du premier par son tampon optimisé permettant
d’éviter les mises au point de MgCl2)
- Le kit ReadyMix de Sigma : kit 3
La comparaison de ces 3 kits en décembre 2004 n’a pas fait apparaître de différences entre les
kits 1 et 3. Il est par contre absolument nécessaire d’utiliser un kit de PCRq hot start.
1°/ Choix du bon couple d’amorces
1ére étape : pour chaque couple d’amorces
Tester 2 à 3 conditions de MgCl2 (kit Master de Roche et Readymix de Sigma) : 3 et 4 mM
MgCl2 et une condition de température (entre 55 et 60°C). L’utilisation du kit Master plus de
Roche permet en principe d’éliminer le paramètre MgCl2. Les amorces sont à 0,25 µM final.
Tester 3 conditions de concentrations de matrices (cDNA pur, dilué au 1/10, au 1/100).
Tester un témoin négatif pour chaque couple (eau à la place de la matrice).
La première manip consiste à tester ces conditions. On va choisir le meilleur couple, c'est-àdire celui :
- permettant une amplification (visualisée par une augmentation de la fluorescence au cours
du temps) dans les PCR « matrices » et une absence d’amplification (ou tardive) dans la PCR
« témoin négatif ».
- présentant une bonne spécificité : la courbe de fusion ne doit pas montrer de pics parasites
(dimerisation d’amorces, cible non spécifique) dans les PCR « matrices » mais un pic
spécifique unique. Des pics parasites vont avoir « consommés » des molécules de Taq et vont
de ce fait entraîner des biais dans les quantifications. En cas d’amplification dans la PCR
« témoin négatif », le profil de fusion correspond au dimère d’amorces. Si cette amplification
est tardive (a plus de 30-35 cycles), elle ne va pas influencer - dans la majorité des cas - le
résultat de la quantification.
Il est conseillé lors de cette première manip de déposer sur gel d’agarose ce produit PCR afin
de s’assurer de la bonne taille du produit.
Donc à la fin de la 1ère étape, on élimine les couples présentant des pics parasites (dimères ou
non), en particulier lorsque ces pics apparaissent pour des valeurs de Ct relativement faibles.
2ème étape : on va déterminer l’efficacité du couple dans les conditions définies au cours de la
première étape.
Cette seconde manip consiste à tester des dilutions sériées de l’ADN matrice (appelé
standard).
L’obtention des Cp de chacune des dilutions va permettre de tracer une droite de régression.
La pente de cette droite doit être comprise entre 3,32 (efficacité de 100%) et 3,7 (efficacité de
86%).
Pour déterminer la gamme de mesure linéaire pour chaque couple, il faut isoler les séries de
dilutions produisant des ∆Ct équivalents entre dilutions : par exemple, contrôler le ∆Ct
(cDNA pur - dilué 1/10) et le ∆Ct (cDNA dilué au 1/10 - 1/100).
On va identifier les éventuels effets inhibiteurs en comparant les valeurs de Cp des différentes
dilutions.
A l’issue de cette seconde étape, on a donc défini un couple d’amorces du gène cible dans des
conditions PCR définies (MgCl2, température) présentant une bonne spécificité et avec une
efficacité comprise entre 86 et 100%.
2°/ Définir la « gamme dynamique » du couple :
Une fois le bon couple trouvé pour un gène, il faut « borner » la gamme linéaire : ajuster les
concentrations de l’ADN matrice (standard) de façon telle qu’elles puissent couvrir les
concentrations de ce même gène dans les échantillons et donc permettre une mesure de la
concentration dans ces échantillons.
Il peut être utile d’utiliser un ou plusieurs échantillons représentatifs pour connaître les bornes
nécessaires aux mesures. Il n’est pas nécessaire de borner vos manips entre les cycles 25 et 35
si tous vos échantillons « sortent » autour de 20 cycles pour un gène donné.
Vos résultats seront d’autant plus robustes que votre efficacité PCR sera forte et que la
gamme dynamique utilisée prendra des valeurs comprises entre les cycles 15 et 25. Au delà, il
faudra penser a dupliquer les points de mesure afin de tenir compte
- de problème lié aux faibles nombre de copies à l’origine
- d’une efficacité de PCR plus faible …
3°/ Ne pas oublier les contrôles : on distingue
- Un contrôle négatif (eau à la place de l’ADN)
- Un contrôle RT- (contrôle de contamination par du DNA génomique)
- Un contrôle positif (pour mettre la PCR au point)
4°/ Définir le choix de la stratégie de quantification :
Reportez vous au chapitre : « les différentes stratégies de quantification possibles ».