Composition phytochimique et évaluation in vitro de l?

J. sci. pharm. biol., Vol.8, n°1 - 2007, pp. 15-23
© EDUCI 2007
BAGRE I.*
BAHI C.
GNAHOUE G.
DJAMAN A.J.
GUEDE G.F.
COMPOSITION PHYTOCHIMIQUE ET EVALUATION
IN VITRO DE L’ACTIVITE ANTIFONGIQUE
DES EXTRAITS DES FEUILLES DE MORINDA
MORINDOIDES (BAKER) MILNE-REDHEAD
(RUBIACEAE) SUR ASPERGILLUS FUMIGATUS ET
CANDIDA ALBICANS.
RESUME
Dans cette étude, nous avons évalué
l’activité antifongique de quatre extraits
de Morinda morindoides (Baker) MilneRedhead (extrait total aqueux, extrait
éthanolique 70%, extrait acétalique et la
fraction 1, sur la croissance in vitro de
Aspergillus fumigatus et Candida albicans
et par la suite nous avons déterminé par
triphytochimique la composition chimique
de chaque extrait.
possède l’activité inhibitrice le plus élevé
avec une CI50 de 0,151 ± 0,1 mg/ml pour
Candida albicans et 0,04 ± 0,01 mg/ml
pour Aspergillus fumigatus.
Morinda morindoides possède donc des
composés antifongiques.
Mots-clés : Antifongique, Aspergillus
fumigatus, Extraits végétaux, Morinda
morindoides.
Les résultats ont révélés que la fraction
1 composée d’alcaloïdes et de stérols
ABSTRACT
In this study, we evaluated the
antifungal activity of four extracts of Morinda
morindoides (Baker) Milne-Redhead (total
aqueous extract, 70% éthanolic extract,
acetalic extract and fraction 1), on the
in vitro growth of Aspergillus fumigatus
and Candida albicans and thereafter we
determined by triphytochimic the chemical
composition of each extract.
a CI50 of 0,151 ± 0,1 mg/ml for Candida
albicans and 0,04 ± 0,01 mg/ml for
Aspergillus fumigatus.
Morinda morindoides possesses
antifungals compounds.
Key words : Antifungal, Aspergillus
fumigatus, Morinda morindoides, Plant
extract.
The results revealed that the fraction 1
composed of alkaloids and sterols have a
high potential for inhibitory activity with
Laboratoire de Pharmacodynamie Biochimique, UFR Biosciences, Université de Cocody - Abidjan, Côte d’Ivoire.
22 BP 582 Abidjan 22.
* Correspondances : BAGRE I., Laboratoire de Pharmacodynamie Biochimique. UFR Biosciences, Université
de Cocody, Abidjan. 22 BP 582 Abidjan 22. TEL (225) 08 00 89 01 ; [email protected]
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INTRODUCTION
Avec l’apparition de l’infection à VIH dans
la pathologie virale humaine, on assiste
à une progression rapide de plusieurs
maladies dites infections opportunistes.
Parmi ces infections, les candidoses, les
cryptococcoses et les aspergilloses sont
des mycoses en très fortes recrudescences.
(HSUEH P. R. et al., 2002 ; CHEN Y. C.
et al., 2003).
Les mycoses sont de nos jours un réel
problème de santé publique. Elles sont
de plus en plus difficiles à éradiquer
et leurs fréquences sont en très forte
progression. L’apparition de souches
résistantes aux antibiotiques usuels,
le changement dans le spectre clinique
des pathogènes (Candida, Histoplasma,
Aspergillus), l’émergence d’un pouvoir
pathogène chez des souches habituellement
saprophytes de notre environnement et les
immunodépressions causées par l’infection
à VIH sont les principaux facteurs de cette
forte recrudescence. (GARRIGUES J.C et
al., 1996).
Les difficultés socio-économiques que
connaissent les pays du tiers monde et
particulièrement la région ouest africaine
font que les populations n’ont pas toutes
accès aux spécialités pharmaceutiques
importées qui d’ailleurs font face à des
résistances.
Face à cette situation, des moyens
thérapeutiques traditionnels sont
envisagés. C’est dans le but d’apporter notre
contribution à la recherche de nouvelles
molécules que nous évaluons l’activité
antifongique de Morinda morindoïdes (Baker)
Milne-Redhead (Rubiaceae). C’est une
espèce végétale traditionnellement utilisée
dans le cadre des syndromes diarrhéiques
en Côte d’Ivoire. Cette plante est utilisée
un peu partout en Afrique. En République
Démocratique du Congo (RCD), elle est
communément appelée Nkongabululu (en
Tshiluba) ou Nkongobololo (en Lingala
ou Kikongo). Dans ce pays, cette plante a
longtemps été utilisée dans les villages et
en villes pour le traitement de quelques
maladies causées par des parasites. Une
décoction aqueuse de feuilles fraîches
constitue un remède traditionnel typique
employé pour le traitement de la malaria,
des vers intestinaux et des amibiases
(KAMBU K., 1990).
La présente étude vise à évaluer l’activité
in vitro de quelques extraits de Morinda
morindoides (Baker) Milne-Redhead sur
Candida albicans et Aspergillus fumigatus,
deux champignons microscopiques
responsables de mycose humaine, puis de
déterminer leur composition chimique.
MATERIEL ET METHODES
1-MATERIEL
1-1-Matériel d’origine végétale
Le matériel végétal est constitué de
feuilles de Morinda morindoides (Baker)
Milne-Redhead récoltées dans la région
du Centre Ouest de la Côte d’Ivoire. Ces
feuilles ont été séchées à l’abri du soleil
pendant 2 semaines.
A partir de la poudre obtenue après
broyage, nous avons préparé l’extrait
total aqueux (Eaq), l’extrait éthanolique
70% (Eeth), l’extrait acétalique (Eac) et la
fraction 1 (F1).
1-2-Matériel biologique
Les souches Aspergillus fumigatus et
Candida albicans sur lesquelles nous
avons travaillé, nous ont été fournies
par le Laboratoire de Mycologie de l’UFR
des Sciences Médicales de l’Université
de Cocody (Abidjan, Côte d’Ivoire). Ces
souches sauvages ont été isolées des
expectorations de malades du SIDA.
L’ensemencement s’est fait sur la gélose
de Sabouraud glucosée de références
69571 DARDILLY ADM Y42310 fournie
par OXOID LTD.
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2- METHODES
2-1- Préparation des différents
extraits végétaux
Les feuilles de Morinda morindoides
(Baker) Milne-Redhead ont été lavées et
séchées à l’abri du soleil et rendues en
poudre fine grâce à un broyeur IKA-MAG.
Les extraits totaux aqueux, éthanolique
70% et acétalique ont été préparés selon
la méthode décrite par GUEDE-GUINA et
al. (1993).
- Extrait total aqueux
Quatre vingt gramme (80 g) de poudre
de Morinda morindoides (Baker) MilneRedhead sont macérés dans 2 litres d’eau
distillée puis homogénéisés sous agitation
magnétique pendant 24 heures à 80°C
à l’aide d’un agitateur magnétique IKAMAG RCT. L’homogénat obtenu est filtré
successivement deux fois sur du coton
hydrophile puis sur du papier WATTMAN
3mm. Le filtrat obtenu est évaporé à l’aide
d’un évaporateur rotatif BUCHI 461 Water
Bath. La pâte résultante est lyophilisée.
La poudre qu’on obtient est l’extrait total
aqueux.
- Extrait éthanolique 70%
Vingt cinq grammes (25 g) de l’ extrait
total aqueux sont dissous dans 500 ml d’une
solution d’éthanol 70% (70 ml d’éthanol pur
pour 30ml d’eau distillée) puis homogénéisés
pendant 24 heures à l’aide d’un agitateur
magnétique. Après décantation, le surnageant
recueilli est évaporé à l’aide d’un évaporateur
rotatif BUCHI. La poudre obtenue est de
couleur verdâtre et constitue l’extrait
éthanolique 70%.
- Extrait acétalique
Cinq grammes (5 g) de l’extrait éthanolique
70% sont dissous dans 500 ml d’une solution
composée d’un mélange d’acétate d’éthyle et
d’eau distillée v/v. Le tout est homogénéisé
pendant 24 heures à l’aide d’un agitateur
magnétique. Après décantation on obtient
deux phases : une phase supérieure qui est
l’acétate d’éthyle et une phase inférieure qui
est l’eau distillée. La phase supérieure
est recueillie et évaporée à l’aide d’un
évaporateur BUCHI. La pâte obtenue
constitue l’extrait acétalique.
- Fraction 1
La F1 est obtenue après séparation de
l’extrait acétalique (Eac) sur une colonne
chromatographique montée avec du gel
de silice [MERCK Gel de Silice 60 (0,0630,200 mm)]. La colonne utilisée a une
largeur de 2 cm et une longueur de 50
cm avec un robinet en verre. L’éluant est
constitué par du dichlorométhane pur et par
un mélange de dichorométhane-méthanol
(95/5). Le gel de silice est préparé dans le
dichlorométhane pur puis coulé dans la
colonne jusqu’à une longueur de 20 cm.
Zéro virgule vingt cinq grammes (0,25 g)
d’Eac sont introduit dans la colonne et
déposés sur la surface du gel puis protégés
par du coton. Dans un premier temps, le
dichlorométhane pur est utilisé comme
éluant jusqu’à infiltration total de l’Eac
dans le gel puis on utilise le mélange
dichlorométhane-méthanol jusqu’à la fin
de la séparation. Quatre (4) fractions sont
obtenues en fonction de la coloration. F1
(jaune or), F2 (vert foncé), F3 (vert clair) et
F4 (jaune orangé).
Ces différents extraits ont été testés
sur la croissance in vitro de Aspergillus
fumigatus et Candida albicans, puis
leur composition phytochimique a été
déterminée.
2-2-Préparation des milieux de
cultures
2-2-1-Préparation de la gélose
Sabouraud
Le milieu Agar Sabouraud a été préparé en
homogénéisant dans 1 litre d’eau distillée 42
g de gélose en poudre. Ce mélange est porté
à ébullition et agité jusqu’à homogénéisation
complète sur un agitateur magnétique
chauffant IKA-MAG. Le milieu ainsi préparé
est réparti dans 9 tubes à essai (6 cm de
long et 2 cm de diamètre) numérotés de 1 à
9 à raison de 20 ml dans le tube 1 et 10 ml
dans les autres tubes.
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Le tube n°9 est le témoin de stérilité
du Sabouraud et le tube n°8, le témoin
de croissance des germes sans Morinda
morindoides (Baker) Milne-Redh. (KRA A.K.M.
et al., 2004 : ZIRIHI G.N. et al., 2007).
2-2-2- Incorporation des extraits
végétaux à la gélose et
ensemencement des germes
L’incorporation a été faite pendant
que la gélose est encore liquide selon la
méthode de la double dilution (KRA A.K.M.
et al., 2004 : ZIRIHI G.N. et al., 2007) qui
nous a permis d’obtenir une variation de
concentration de Morinda morindoides
(Baker) Milne-Redh allant de 300 mg/ml
dans le tube n°1 à 4,687 mg/ml dans le
tube n°7 pour l’Eaq de 50 mg/ml dans le
tube n°1 à 0,78 mg/ml dans le tube n°7
pour l’Eeth et l’Eac et de 3,125 mg/ml
dans le tube n°1 à 0,0487 mg/ml dans le
tube n°7 (selon une liaison géométrique
de raison 1/2).
Les tubes ainsi préparés sont stérilisés
à 121°C à l’autoclave de type MEDICLAVE
pendant 15 mn et inclinés à la température
de la salle (37°C) pour permettre à l’Agar
de se solidifier.
Après la solidification de la gélose tous
ces tubes sauf le 9 sont ensemencés avec
10µl d’une suspension contenant environ
1000 cellules. Les tests sont répétés 5 fois
par souche, pour plus de fiabilité, puis les
tubes ainsi préparés sont incubés à 30°C.
(KRA A.K.M. et al., 2004 : ZIRIHI G.N. et
al., 2007).
2-3-Dénombrement des colonies
Après 48 heures d’incubation, les
colonies de Aspergillus fumigatus et
Candida albicans ont été dénombrées par
comptage direct à l’aide d’un compteur de
colonies. Et la croissance des germes dans
les 9 tubes expérimentaux a été évaluée
en pourcentage de survivance, calculé par
rapport à 100% de survivance dans le tube
témoin de contrôle de croissance.
La méthode de calcul du pourcentage
de survivance des Aspergillus fumigatus
et Candida albicans dans les tubes
expérimentaux, peut se résumer par la
formule suivante :
n
S = –––––x 100
N
S : Survivance des germes (en %), N :
Nombre de colonies dans le tube témoin,
n : Nombre de colonies dans le tube
expérimental. (KRA A.K.M. et al., 2004 :
ZIRIHI G.N. et al., 2007).
La concentration pour 50 % d’inhibition
(CI50) pour chaque extrait a été déterminée.
La CI50 donne 50% d’inhibition, estimée
par rapport au nombre de germes ayant
poussé dans le tube témoin. C’est un
paramètre déterminé graphiquement à
partir d’un antifongigramme. Il représente,
la dose de produit pour laquelle 50% de
la croissance des germes fongiques sont
inhibés (KRA A.K.M. et al., 2004 : ZIRIHI
G.N. et al., 2007).
2-3-Tri phytochimique
2-3-1- Recherche des alcaloïdes
Six millilitres (6 ml) d’extrait végétal
sont évaporés. Le résidu est repris par 6
ml d’alcool à 60° et la solution alcoolique
ainsi obtenue est repartie dans deux tubes
à essai.
Dans le premier tube est ajouté 2
gouttes de réactif de DRAGENDORFF.
L’apparition d’un précipité ou d’une
coloration orangée indique la présence
d’alcaloïdes.
Dans le deuxième tube est ajouté 2
gouttes de réactif de BOUCHARDAT.
L’apparition d’une coloration brunrougeâtre indique une réaction positive de
présence d’alcaloïdes.
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2-3-2- Recherche des polyphénols
A 2 ml d’extrait végétal, on ajoute une
goutte de solution alcoolique de chlorure
ferrique 2%.
L’apparition d’une coloration bleuenoirâtre ou verte plus ou moins foncée signe
la présence de dérivés polyphénoliques.
2-3-3- Recherche des tanins
2-3-3-1- Recherche des tanins
catéchiques
5 ml d’extrait sont évaporés à sec. On
y ajoute 15 ml de réactif de STIASNY. Le
mélange est maintenu au bain-marie 80°C
pendant 30mn. Refroidir sous courant
d’eau.
L’observation de gros précipités en flocons
caractérise les tanins catéchiques.
2-3-3-2- Recherche des tanins
galliques
La solution est filtrée et le filtrat
recueilli est saturé d’acétate de sodium.
On y ajoute 3 gouttes de chlorure ferrique
2%. L’apparition d’une coloration bleunoir intense dénote la présence de tanins
galliques.
Une hauteur de mousse supérieure à 1
cm indique la présence de saponosides.
2-3-6- Recherche des quinones
On utilise le réactif de BORNTRAEGER
(ammoniaque diluée 2 fois) qui permet la
mise en évidence des substances.
Pour les quinones combinées, on
procède à une hydrolyse préalable avec
l’acide chlorhydrique au 1/5.
L’essai consiste à procéder immédiatement
à l’hydrolyse des solutions pour caractériser
les substances quinoniques totales
(substances quinoniques libres et substances
quinoniques combinées mais hydrolysées).
On évapore à sec dans une capsule 2 ml
d’extrait végétal. Le résidu est trituré dans
5 ml de HCl au 1/5. On porte la solution
au bain-marie bouillant pendant une 1/2
heure dans un tube à essai. On refroidit
sous un courant d’eau froide et l’hydrolysat
est extrait par 20 ml de chloroforme dans
un tube à essai. On recueille la phase
chloroformique dans un tube à essai et on y
ajoute 0.5 ml d’ammoniaque diluée 2 fois.
L’apparition d’une coloration allant
du rouge au violet indique la présence de
quinones.
2-3-4- Recherche des flavonoïdes
2-3-7- Recherche des polyterpènes
et des stérols
2 ml d’extrait végétal sont évaporés
à sec. Après refroidissement, le résidu
est repris par 5ml d’alcool chlorhydrique
dilué 2 fois dans un tube à essai. On y
ajoute deux à trois copeaux de magnésium
(dégagement de chaleur).
5ml d’extrait végétal sont évaporés à
sec. Le résidu est dissout à chaud dans
1 ml d’anhydride acétique et recueilli
dans un tube à essai. Le long du tube, on
fait couler avec 0,5 ml d’acide sulfurique
concentré.
L’addition de 3 gouttes d’alcool
isoamylique intensifie une coloration roseorange ou violacée qui signe la présence de
flavonoïdes.
L’apparition à l’interphase d’un anneau
pourpre ou violet, virant au bleu puis au
vert, indique une réaction positive.
2-3-5- Recherche des saponosides
10 ml d’extrait végétal sont mis dans
un tube à essai. Après avoir agité pendant
quelques minutes, la hauteur de mousse
est mesurée.
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RESULTATS
Le but de cette étude est d’évaluer
Ainsi avons-nous obtenu respectivement
l’activité antifongique de quelques extraits
pour Aspergillus fumigatus et Candida
de Morinda morindoides puis de déterminer
albicans les CI50 (mg/ml) suivant :
leur composition chimique.
Pour l’extrait total aqueux (Eaq) 12,47
Après 48 H d’incubation à 30°C, on observe
± 0,75 et 15,51 ± 1,03 ; pour l’extrait
comparativement au témoin, une diminution
éthanolique 70% (Eeth) 6,1 ± 2,1 et 7,2 ±
progressive du nombre de colonies au fur et
1,7 ; pour l’extrait acétalique (Eac) 1,25 ± 0,5
à mesure que la concentration des extraits
et 1,4 ± 0,05 ; pour la fraction 1 (F1) 0,04 ±
augmente dans les tubes expérimentaux.
0,01 et 0,151 ± 0,1.
Cela s’observe pour toutes les séries.
Le tableau II présente les grands groupes
Les données expérimentales traduites
chimiques contenus dans les différents
sous formes de courbes nous ont permis de
extraits étudiés. De l’extrait total aqueux à
déterminer les CI50 des différents extraits que
la fraction 1, certains groupes chimiques
nous avons testés. (Tableau I).
disparaissent pendant que d’autres
s’accentuent.
Tableau I : Valeurs des CI50 des extraits de Morinda morindoides après 48 H d’incubation à 30°C.
(Eaq, Eeth, Eac et F1)
Extraits/Fraction
Candida albicans
Aspergillus fumigatus
CI50 (mg/ml)
CI50 (mg/ml)
15,51 ± 1,03
12,47 ± 0,75
Extrait éthanolique 70% (Eeth)
7,2 ± 1,7
6,1 ± 2,1
Extrait acétalique (Eac)
1,4 ± 0,05
1,25 ± 0,5
Fraction 1 (F1)
0,151 ± 0,1
0,04 ± 0,01
Extrait total aqueux (Eaq)
Tableau II : Composition chimique des extraits de Morinda morindoides (Eaq, Eeth, Eac et F1)
Alcaloïdes
Polyphénols
Tanins catéchiques
Tanins galliques
Flavonoïdes
Saponosides
Quinones
Stérols
Extrait total
aqueux
Extrait
éthanolique 70%
Extrait acétalique
Fraction 1
++
++
++
+
+++
+++
+
+
+++
++
+
+
+
+++
+
+
+++
++
++
+
++
+++
+++
- : Absence
+ : Présence
++ : Présence accentuée
+++ : Présence très accentuée
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DISCUSSION
Les différents extraits et fractions que
nous avons testés ont montré que A.
fumigatus et C. albicans sont sensibles à
tous les extraits de notre étude.
Pour A. fumigatus, les extraits Eaq, Eac
et F1 présentent les meilleures activités.
Les CI50 sont respectivement de 12,47 ±
0,75 ; 1,25 ± 0,5 et 0,04 ± 0,01 mg/ml.
Pour C. albicans ce sont les extraits Eeth,
Eac et F1qui présentent les meilleurs activités
dont les CI50 sont respectivement de 7,2 ± 1,7 ;
1,4 ± 0,05 et 0,151 ± 0,1 mg/ml.
On remarque que pour les deux germes
testés, c’est l’extrait Eac et la F1 qui
donnent les meilleures activités.
L’acétate d’éthyle est donc le solvant
qui concentre mieux les principes actifs
de Morinda morindoides. La F1 a une
activité supérieure à celle de l’Eac. La F1
a été obtenue par le fractionnement de
l’Eac sur gel de silice. Le fractionnement
a donc regroupé dans la F1 les molécules
responsables de l’activité antifongique.
Le triphytochimique a permis de montrer
la gamme de groupes chimiques contenus
dans les différents extraits et fractions de
notre étude.
La F1 quant à elle ne comporte que des
alcaloïdes et des stérols.
L’analyse de tous ces résultats est en
faveur d’une supériorité de la fraction
F1 (CI50 de 0,151 ± 0,1 mg/ml pour C.
albicans et 0,04 ± 0,01 mg/ml pour A.
fumigatus) sur les autrebfraction . La F1
est composée d’alcaloïdes et de stérols.
Les molécules responsables de l’activité
antifongique contenu dans la F1 sont soit
des alcaloïdes soit des stérols. L’activité
peut être aussi due à une interaction de
molécules contenues dans ces groupes
chimiques.
Les résultats obtenus avec la F1 sont
certes éloignés de ceux que donnent
l’Amphotéricine B qui est la molécule
antifongique de référence ; soit CI50 = 0,06
µg/ml pour C. albicans et de 0,45 µg/ml
pour A. fumigatus. (CHONG-REN Y. et al.,
2006) ; mais meilleurs que ceux obtenus
par KRA et al. (2004).
En effet KRA a obtenu avec Fagara
macrophylla et Strychnos spinosa les CI50
respectifs de 1,071 et 1,07 mg/ml pour C.
albicans. Il a également obtenu avec la F3
de Misca la CI50 de 1,0379 mg/ml pour A.
fumigatus.
Ainsi, on constate que l’Eaq et l’Eeth
renferment tous les groupes chimiques
que nous avons recherchés, à savoir les
alcaloïdes, les polyphénols, les tanins
catéchiques, les tanins galliques, les
flavonoïdes, les saponosides, les quinones
et les stérols. La différence entre les
deux extraits se situe au niveau de la
concentration des tanins catéchiques,
des alcaloïdes et des flavonoïdes. L’Eaq à
part les alcaloïdes, a une concentration en
tanins catéchiques et en flavonoïdes plus
élevée que l’Eeth.
Morinda morindoides est une rubiacée
très utilisée en Afrique comme plante
médicinale. Elle a fait l’objet de plusieurs
études menées aussi bien par des chercheurs
africains que par des chercheurs européens.
Ainsi, son activité antiplasmodiale (TONA L.
et al., 1999 ; 2001 et 2004 ), antiprotozoaire
(TONA L. et al., 1998 ; CIMANGA R. K. et
al., 2006) et antibactérien (BAHI C., 1993 ;
KOFFI A. E., 2003) ont été étudiés.
L’Eac ne comporte pas les groupes
chimiques que sont les tanins catéchiques,
les tanins galliques et les quinones. Il
comporte par contre une concentration
élevée en alcaloïdes et en flavonoïdes.
L’étude que nous avons réalisée a la
particularité de mettre en lumière les
potentialités antifongique de .... encore
exploitées car le côté antifongique n’a été
abordé par aucun autre chercheur.
Ces études ont révélé que Morinda
morindoides a une activité antipaludique,
antiprotozoaire et antibactérien.
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CONCUSION
Cette étude nous a permis de montrer
F1 est composée d’alcaloïdes et de
que les extraits de Morinda morindoides
stérols, ce qui signifie que la (ou les)
possèdent une activité antifongique plus
molécule(s) active(s) est (sont) contenue(s)
ou moins importante sur la croissance in
dans l’un de ces groupes chimiques.
vitro de A. fumigatus et C. albicans.
Cette étude a permis également de
La fraction 1 possède la meilleure
montrer que notre méthode d’extraction
activité avec une CI50 de 0,151 ± 0,1 mg/ml
est une voie qui permet de concentrer les
pour C. albicans et 0,04 ± 0,01 mg/ml pour
principes actifs et d’améliorer l’activité de
A. fumigatus.
l’extrait total aqueux.
Morinda morindoides renferme tous
les groupes chimiques que nous avons
recherchés à savoir les alcaloïdes, les
polyphénols, les tanins catéchiques,
les tanins galliques, les flavonoïdes, les
saponosides, les quinones et les stérols.
Une analyse plus poussée devra
permettre de déterminer la structure des
moléculaiers responsable de l’activité
antifongiquel.
Au fur et à mesure que l’on avance
dans le fractionnement, certains groupes
chimiques disparaissent pendant que
d’autres subsistent une concentration.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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4- CIMANGA R.K., KAMBOU K., TONA L.,
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