Axénisation des diatomées marines

Licence mention Biologie-Biochimie
Faculté des Sciences et Techniques
Stage professionnalisant – module S32B180
Axénisation de diatomées marines:
amélioration d'un protocole
par traitement aux antibiotiques de quatre souches
dont Haslea ostrearia Simonsen.
Haslea ostrearia
Responsable de la structure d'accueil: Pr. Joël FLEURENCE
Equipe MMS- EA2160-Bâtiment IsoMer
Tuteur: Pierre GAUDIN
Laëtitia BESCHUS
Université de Nantes
Février- Avril 2010
Sommaire
Sommaire..............................................................................................................................................2
Liste des abréviations...........................................................................................................................3
I.Introduction........................................................................................................................................4
II.Démarche..........................................................................................................................................5
1-Approche expérimentale...............................................................................................................5
2-Techniques utilisées......................................................................................................................6
a)Dénombrement des diatomées sur cellules hématimétriques..................................................6
b)Tests d'axénie FAG, FG, F/2m.................................................................................................7
c)Dénombrement des colonies bactériennes sur milieu solide...................................................7
III.Matériel et Méthodes.......................................................................................................................8
1-Choix des souches de diatomées..................................................................................................8
2-Conditions de culture....................................................................................................................8
3-Traitement antibiotique.................................................................................................................9
4-Traitement au lysozyme..............................................................................................................10
5-Comptage....................................................................................................................................10
6-Tests d'axénie..............................................................................................................................11
7-dénombrement sur milieu gélosé................................................................................................11
8-Tests statistiques.........................................................................................................................12
IV.Résultats.........................................................................................................................................13
1-Effet d'un cocktail d'antibiotiques..............................................................................................13
2-Biométrie de Haslea ostrearia.....................................................................................................14
3-Effet des antibiotiques sur Haslea ostrearia................................................................................15
4-Effets des antibiotiques sur Haslea ostrearia traitée au lysozyme..............................................16
V.Discussion/Conclusion....................................................................................................................20
1-Progrès........................................................................................................................................20
2-Difficultés rencontrées................................................................................................................20
3-Étapes suivantes..........................................................................................................................21
VI.Bibliographie.................................................................................................................................23
VII.Fonctionnement du laboratoire....................................................................................................25
1-Organigramme (Cf Annexe 1)....................................................................................................25
2-Sources de Financement.............................................................................................................25
VIII.Bilan des acquis..........................................................................................................................27
IX.Annexes.........................................................................................................................................28
1-Annexe 1- Organigramme..........................................................................................................28
2-Annexe 2- Les milieux utilisés...................................................................................................29
a)Milieu F/2 de Guillard « Standard » (Guillard, 1982)...........................................................29
b)Milieu FAG............................................................................................................................30
c) Milieu FG..............................................................................................................................30
d) Milieu F/2m..........................................................................................................................31
e) NB Nutrient Broth (sigma N7519).......................................................................................31
3-Annexe 3- Norme d'analyse bactériologique des eaux de consommation NF V08-011............32
Dénombrement des aérobies totaux par comptage des colonies obtenues à 30°C....................32
4-Annexe 4- Cibles et Modes d'action de quelques antibiotiques.................................................33
Résumé...............................................................................................................................................34
Liste des abréviations
ANR: Agence Nationale pour la Recherche
ATER: Attaché Temporaire d'Enseignement et de Recherche
CNRS: Centre National de la Recherche Scientifique
C.sp: Crapedostauros spE3
DAPI: 4',6'-diamidino-2-phénylindole
DO: Densité optique
EDTA: acide éthylène diamine tetra acétique
Hepes: acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique
H.o.: Haslea ostrearia P9b
IE: Ingénieur d'Etude
IR: Ingénieur de Recherche
ITRF: Ingénieurs et personnels Techniques de Recherche et de Formation
NaCl : Chlorure de sodium
NCC: Nantes Culture Collection
P.t.: Phaeodactylum tricornitum 1
T.w.: Thalassiosira weissflogii
UFC: Unité Formant Colonie
UMR: Unité Mixte de Recherche
UPRES-EA: Unité Propre de Recherche et d'Enseignement SupérieurEquipe d'Accueil
I. Introduction
Dans cette étude, le matériel biologique étudié lors de ce travail
expérimental sont les diatomées. Ce sont des microalgues unicellulaires
eucaryotes, mesurant de 2µm à 1mm. Elles vivent dans les milieux
aquatiques et sont entourées d'une coque siliceuse: le frustule. Celui-ci
donne leur forme: pennée (symétrie bilatérale) ou centrique (symétrie
radiale).
Une culture est dite axénique, lorsqu'elle ne contient aucun
contaminant microbiologique (Guillard, 2005). C'est une condition pour
étudier la physiologie d'une culture unialgale. On constate que, dans de
nombreuses études, l'objectif d'axénie est difficile à obtenir (Bradley et al.,
1987; Nagai et al., 1998). Le taux de succès est très variable selon la
méthode et le matériel biologique choisi. L'approche de purification doit
avoir le minimum d'influence sur les cellules.
Plusieurs techniques de purification existent. Il y a les méthodes de
sélection et filtration, centrifugation différentielle ou sonication (Guillard,
2005). On peut aussi éliminer les contaminants d'une culture par dilutions
successives (Audineau et Blancheton, 1985-1986) ou par traitements
antibiotiques (Admiraal et Peletier, 1979). C'est cette dernière méthode
que nous appliquerons. Cependant, toutes celles-ci sont souvent utilisées
conjointement pour en augmenter l'efficacité (Vazquez et al., 2004).
Différentes approches peuvent être envisagées pour un traitement
antibiotique. Le traitement peut varier en fonction des antibiotiques
choisis, de leurs concentrations et du temps d'exposition. Ceux-ci peuvent
être appliqués seuls, successivement ou en mélange. On peut également
faire une axénisation en milieu liquide ou sur milieu solide, en les ajoutant
directement dans le milieu.
Cette étude a été mise en place pour permettre des prochaines
expériences de coculture de diatomées avec des bactéries. L'objectif de
ce stage était donc d'obtenir une culture axénique de diatomées, en
améliorant le protocole d'axénisation utilisé. En effet, celui employé
auparavant ne prouvait plus son efficacité sur les nouvelles souches
isolées du milieu naturel.
II. Démarche
1- Approche expérimentale
Pour obtenir une souche axénique de diatomées, l'approche choisie
est le traitement aux antibiotiques. Pour cela, quatre souches de
diatomées ont été utilisées:
- Crapedostauros spE3 (C.sp.) Cox, (1999) parce que c'est une
espèce benthique, nouvellement découverte et étudiée au laboratoire.
- Haslea ostrearia (H.o.), Simonsen, (1974) parce qu'elle est très
étudiée au laboratoire qui en possède plus de cent souches. De plus, une
étude sur une coculture d'H.o. avec des bactéries va débuter. Il fallait
donc être en mesure de fournir une culture axénique.
- Phaeodactylum tricornitum (P.t.) Bohlin, (1897) a été choisie
puisqu'elle est utilisée comme diatomée type dans des études comme
celles de Berland et Maestrini, (1969); et Pelletier et Chapman, (1996). De
plus, son génome a été entièrement séquencé.
- Thalassiosira weissflogii (T.w.) Cleve, (1873) parce que c'est une
diatomée centrale et planctonique. Ce genre est aussi très étudié.
Les quatre souches de diatomées choisies permettent donc d'avoir
trois pennées et une centrale; ainsi qu'une benthique (C.sp), une
planctonique (T.w.) et deux tichopélagiques (P.t. et H.o.).
En choisissant cette approche d'axénisation, il faut utiliser des
antibiotiques qui couvrent de larges spectres. C'est pourquoi la Pénicilline
G, la Streptomycine, le Chloramphénicol et l'Amphotéricine B ont été
choisis. En effet, la Pénicilline et la Streptomycine permettent de cibler les
bactéries Gram positifs et négatifs. Le premier est un bactériostatique; il
empêche la multiplication par inhibition de la formation des liaisons du
peptidoglycane de la paroi cellulaire des bactéries Gram positif. La
Streptomycine se fixe sur la sous-unité 30s du ribosome, ce qui implique
une production de protéines non-fonctionnelles et la mort de la bactérie.
Le Chloramphénicol agit sur les bactéries Gram positifs et les levures. Il
affecte le ribosome, les liaisons peptidiques et la synthèse des protéines
mitochondriales. Enfin, l'Amphotéricine B est un antifungique, il s'associe à
l'ergostérol et permet la formation d'un canal transmembranaire libérant
les ions potassium du cytoplasme, ce qui induit la mort de la cellule
fongique.
Dans un premier temps, c'est un mélange de ces trois antibiotiques
et de l'antifungique qui a été appliqué sur les quatre souches de
diatomées dont on disposait. Suivant les réactions au traitement, l'étude
s'est portée sur Haslea ostrearia sur laquelle, on a testé les trois
antibiotiques séparément, puis avec un pré-traitement au lysozyme.
2- Techniques utilisées
a) Dénombrement des diatomées sur cellules hématimétriques
Parce que l'axénie doit avoir le minimum d'influence sur les
diatomées, il a été fait un dénombrement sur cellules hématimétriques au
microscope optique. Ceci permet de quantifier le nombre de cellules/mL
présentes et donc de décrire l'impact des antibiotiques sur la croissance
des diatomées. Ces comptages se font sur cellules de type Nageotte, ou
Neubauer pour des plus petites cellules. Chaque cellule a une profondeur
et un quadrillage définis, qui en déterminent le volume.
En fixant une lamelle par frottement sur la lame, le volume injecté
dans les rigoles est attiré par capillarité sur la lamelle. Ensuite, la lecture
au microscope suit des règles précises de comptage. Si des cellules sont
situées à cheval sur le quadrillage, il ne faut compter que celles situées
sur les lignes d'en bas et de gauche (Audineau et Blancheton, 19851986). De plus, il convient de compter le maximum de cellules pour être le
plus précis possible. Statistiquement, on compte jusqu'à 300 à 500
cellules.
Cette technique permet un comptage rapide et précis de la
concentration en tous types de cellules. De plus, elle utilise peu de
matériel. Cependant, le plus grand inconvénient de celle-ci est que, pour
avoir un comptage précis, il faut que la culture soit bien homogénéisée.
Les cellules doivent être réparties de façon homogène sur la lame, ce qui
peut
parfois
être
difficile.
Les
diatomées
produisent
polysaccharidique qui peut les retenir agglomérées.
un
mucus
b) Tests d'axénie FAG, FG, F/2m
Les milieux tests d'axénie contiennent des composants (Cf annexe
2) qui permettent la croissance de bactéries ciblées selon leur
métabolisme. Les tests FAG et FG contiennent sensiblement les même
composants et ciblent des bactéries non-méthylaminotrophiques, c'est
leurs salinités qui diffèrent. Tandis que le milieu F/2m, très pauvre, est
utilisé pour discriminer les bactéries méthylaminotrophiques.
Ces tests d'axénie permettent de mettre en évidence la présence
de bactéries et de champignons par ajout d'un petit volume de la culture
supposée axénique dans les tubes de milieux. C'est un test qualitatif qui
repose sur l'apparition d'un trouble.
Cette technique permet de voir efficacement si des bactéries ont
poussé sur le milieu. Elle est facile à mettre en place. Cependant, celle-ci
est non exhaustive. Elle ne permet pas de cibler toutes les bactéries.
Donc même sans trouble, la culture peut ne pas être axénique. Pour s'en
assurer, il convient de faire des tests complémentaires tels que ceux
exposés dans la discussion. De plus, il faut regarder les tubes
quotidiennement sur deux semaines, ce qui peut être contraignant, parce
qu'un trouble peut apparaître un jour et disparaître ensuite.
c) Dénombrement des colonies bactériennes sur milieu solide
Pour avoir un résultat quantitatif de l'effet du traitement sur la charge
bactérienne, il convient de faire un dénombrement sur milieu solide. Cette
technique utilise du milieu nutritif gélosé, qui permet la croissance des
bactéries. Dans cette étude, nous avons suivi le protocole de la norme
d'analyse bactériologique des eaux de consommation (NF V08-011, cf
annexe 3). Après le temps d’incubation indiqué, chaque colonie formée
correspond à une bactérie présente dans l'échantillon initial. En prenant
en compte le volume déposé et les dilutions, on peut obtenir le nombre
d'unité formant colonies (UFC). L'avantage de cette technique est qu'elle
permet d'avoir un résultat chiffré et précis de l'effet du traitement. De plus,
elle est facile à mettre en place. Cependant, tout comme les milieux FAG
et FG, cette approche ne permet pas de cibler toutes les bactéries,
seulement celles croissant dans les conditions de la norme.
III. Matériel et Méthodes
1- Choix des souches de diatomées
Au début de cette étude, quatre souches d'algues différentes ont été
utilisée pour comparer le comportement de chacune vis-à-vis des
antibiotiques. Ces diatomées sont toutes référencées dans l'algothèque du
laboratoire NCC (Nantes Culture Collection), qui comprend 300 souches
dont 98% de diatomées.
•
Crapedostauros spE3 (NCC228) Cox, 1999. Diatomées pennées,
isolées, dont les valves possèdent de nombreux pores et un raphé qui
forme une fissure longitudinale. C'est un espèce benthique mobile.
•
Haslea ostrearia P9b (NCC235.1) Simonsen, 1974. Elle est
appelée «navicule bleue». Cette cellule solitaire est mobile, de grande
taille et possède un fin frustule. C'est une diatomée marine de type
pennée fusiforme.
•
Phaeodactylum tricornitum 1 (NCC45) Bohlin, 1897. Elle présente
trois morphotypes bien distincts: une forme triradiée, une fusiforme et une
forme ovale. Le frustule est faiblement silicifié, seule la forme ovale est
mobile car elle possède un raphé.
•
Thalassiosira
weissflogii
(NCC133)
Cleve,
1873.
Cellules
habituellement en colonies, distantes les unes des autres, c'est une
diatomée de type centrale et planctonique. Elle est non mobile mais se
déplace facilement grâce au courant.
2- Conditions de culture
Les précultures sont ensemencées dans du milieu F/2, (Guillard,
1982- Cf annexe 2) environ quatre jours avant le début du protocole, à
16°C suivant un cycle jour/nuit de 14h/10h. L'intensité lumineuse est de
80µmol de photons.m-2.s-1. Ainsi, les diatomées se retrouvent en phase
exponentielle de croissance pour le protocole. Pour diminuer le temps de
préculture, on peut aussi mettre l'inoculum à 20°C, en lumière continue
pendant 48 heures.
Les tubes expérimentaux stériles, contenant 20mL de milieu F/2 et
ensemencés à 10000 cellules/mL, sont cultivés dans ces mêmes
conditions. Ils sont incubés pendant huit jours, puis examinés pour voir
l'effet du traitement aux antibiotiques sur les diatomées et permettre à
celles qui ont résisté de recoloniser le milieu.
3- Traitement antibiotique
Les antibiotiques Pénicilline G, Streptomycine, Chloramphénicol et
Amphotéricine B sont utilisés à des concentrations recommandées par
Provasoli (P8029-PACS) et SIGMA (P4083-PSN). Ceux-ci sont préparés
dans un même volume de 50mL dans lequel, ils sont dissous
successivement dans de l'eau à température ambiante concentrée à 9‰
en chlorure de sodium (NaCl). L'amphotéricine B quant à elle est dissoute
dans l'eau à 9‰ chauffée à 28°C, puis ajoutée au cocktail. Ensuite, la
solution est filtrée sur une membrane en acétate de cellulose, de porosité
0,2µm et de diamètre 25mm, pour rendre la solution stérile. Le cocktail
d'antibiotiques est réparti à raison de 200µL dans chaque tube contenant
20mL de milieu.
Dans un deuxième protocole, les antibiotiques sont appliqués
individuellement avec 100µL, 200µL ou 400µL dans chaque tube à essai
qui contient 20mL de milieu. Ces doses correspondent à 0,5C, 1C et 2C
(tableau 1). Les tubes à essai sont ensemencés à une concentration de
9000 cellules/mL.
Antibiotiques
0,5C
1C
2C
Pénicilline GSIGMA- P7794
150u/mL
300u/mL
600u/mL
Streptomycine
sulfate- SIGMAS9137- 5g
50µg/mL
100µg/mL
200µg/mL
ChloramphénicolSIGMA- C-0378- 5g
0,5µg/mL
1µg/mL
2µg/mL
0,125µg/mL
0,25µg/mL
0,5µg/mL
Amphotéricine BSIGMA- A-6804100mg
Tableau 1: concentrations en antibiotiques appliquées
4- Traitement au lysozyme
Dans une seconde partie, et suivant le protocole de Su et al., (2007),
les diatomées ont été pré-traitées au lysozyme, avant le traitement aux
antibiotiques. Le lysozyme est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des
liaisons du peptidoglycane. Il va donc lyser les parois des bactéries Gram
positif et permettre de dissiper le mucus polysaccharidique entourant les
diatomées et ainsi, pouvoir rendre plus accessibles les bactéries aux
antibiotiques.
Le lysozyme est préparé à 10mg dans 10mL d'eau ultra pure. Puis,
les volumes sont ajustés selon le protocole de Kim et Park, (1999) avec
un ratio de 1 volume de lysozyme, 1 volume de tampon d'acide 4-(2hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique (Hepes) 100mM avec du
Na2EDTA (acide éthylène diamine tetra acétique) 10mM, pH6,8, pour 8
volumes de culture. Le mélange réactionnel est incubé à 25°C pendant 90
minutes, puis les cellules sont lavées trois fois avec du milieu F/2 par
centrifugation à 2000 tours par minutes pendant 5 minutes.
En parallèle, une mesure de densité optique (DO) a été faite sur une
culture de Staphylococcus aureus (bactérie Gram positif) pour contrôler
l'activité du lysozyme. En effet, si le lysozyme est actif à cette
concentration, la culture de S.aureus sera plus claire, puisque l'enzyme
aura lysé la paroi de la culture-témoin. Cette mesure de diminution de la
DO s'effectue à 450 nanomètres, contre une culture de bactéries non
traitées par le lysozyme.
5- Comptage
Tous les comptages d'inoculi sont réalisés au microscope optique à
l'objectif 20, sur cellules hématimétriques avec un minimum de 500
cellules comptées sur chacune. Les comptages des trois souches
Crapedostauros spE3, Haslea ostrearia P9b et Thalassiosira weissflogii se
fait sur cellule de type Nageotte, qui possède un volume de 50mm 3.
Phaeodactylum tricornitum est comptée sur une cellule de type Neubauer,
qui a un volume plus petit de 0,9mm 3, puisque ces diatomées sont plus
petites et plus nombreuses.
Quand les comptages sont trop nombreux pour être réalisés en
temps réel, un petit volume de culture est prélevé dans des tubes de type
Eppendorf, dans lesquels sont ajoutées deux à quatre gouttes de lugol
acétique. C'est une solution de fixation composée d'iode, de iodure de
potassium et d'acide acétique. Pour P.t., dont le frustule est moins silicifié,
le lugol ne contient pas d'acide acétique. Ce lugol acétique permet de fixer
les diatomées sans abîmer leur frustule puisqu'il leur faut un milieu acide
pour ne pas être dégradé. Ainsi, on peut aisément refaire des comptages
quelques temps après, si des résultats semblent incohérents. Les tubes
de type Eppendorf (environ 1,5mL) sont gardés à 4°C dans le noir.
6- Tests d'axénie
Les principaux tests d'axénie réalisés sont ceux fait sur les milieux
stériles FAG, FG et F/2m qui sont des milieux de culture de croissance de
bactéries. Les tubes contiennent 10mL de milieu auxquels sont ajoutés
1mL de culture après huit jours de traitement. Les tubes sont ensuite
placés à température ambiante, dans le noir et la turbidité est regardée
quotidiennement sur quinze jours.
7- dénombrement sur milieu gélosé
Pour un résultat quantitatif de la charge bactérienne, des tests de
dénombrement sur boîtes contenant du milieu NB gélosé de chez Sigma
(Cf annexe 2) ont aussi été faits. Ces tests suivent la norme des analyses
bactériologiques des eaux de consommation NF V08-011 (Cf annexe 3).
Ils permettent de mettre en évidence la présence de microorganismes
poussant à 30°C sur 72 heures. Le milieu est coulé dans des boîtes de
Pétri, par dessus 1mL de culture d'algues non diluées ou diluées de 10 -1 à
10-4 dans de l'eau à 28‰ en NaCl. Chaque dilution est ensemencée sur
boîtes réalisées en duplicat. Une fois refroidies, les boîtes sont laissées à
incuber à 30°C, pendant 72h, dans le noir pour éviter la croissance des
diatomées. Puis, on compte le nombre de bactéries qui ont formées des
colonies (UFC).
8- Tests statistiques
Une étude statistique peut être faite puisque les mêmes conditions
d'expérience sont réalisées en triplicat. Arbitrairement, on prend un risque
de premier ordre α égal à 0,05 et on applique les tests sur le logiciel de
traitement statistique Sigmastat.
Le premier test statistique, qui permettait de comparer l'effet d'une
dose du mélange d'antibiotiques entre le témoin et l'essai sur les quatre
souches prises individuellement (Fig. 1), est le test t de Student. Celui-ci
est précédé du test F, de Fisher-Snédécor, d'égalité des variances. Dans
le cas où les variances sont égales, un test paramétrique comme celui de
Student peut être appliqué. Ce test t a été choisi car, on est en présence
d'un petit échantillon, au caractère quantitatif et on compare deux
moyennes expérimentales sur des échantillons indépendants. De plus, ce
test de Student a été appliqué pour comparer la croissance de H.o (Fig
4a) et le dénombrement des colonies sur milieu solide (Fig 5) sans ou
avec traitement au lysozyme.
Ensuite, pour l'espèce Haslea ostrearia, le but de l'étude est de voir
l'effet individuel de trois antibiotiques appliqués à trois concentrations
différentes (Fig 3 et 4b). C'est pourquoi le test statistique effectué est celui
de l'ANOVA à deux voies sans répétition d'expérience. Les conditions
d'application de ce test correspondent aux conditions de l'expérience.
C'est une mesure quantitative sur un petit échantillon, où l'on teste deux
facteurs d'influence: la concentration et le type d'antibiotiques; ce qui
implique de comparer douze moyennes expérimentales entre-elles.
IV. Résultats
1- Effet d'un cocktail d'antibiotiques
L'effet d'une dose (1C) (Tableau 1) du cocktail des trois antibiotiques
et de l'antifungique a été mesuré sur la croissance des quatre souches de
diatomées décrites précédemment, après huit jours de contact (Figure 1).
Effet des antibiotiques sur la concentration de cellules
*
nombre de cellules/mL
3500000
3000000
2500000
2000000
témoin
essai
1500000
1000000
*** p<0,001 vs témoin
500000
* p<0,05 vs témoin
***
0
C.sp
H.o
P.t
T.w
Figure 1: Comparaison des croissances de quatre souches de diatomées soumises à une
dose d'un mélange de trois antibiotiques et un antifungique: concentration de cellules après
huit jours de contact.
Il n'y a pas de différence observée sur la croissance des souches
Crapedostauros spE3 et Thalassiosira weissflogii entre les tubes témoins
sans antibiotique et ceux ayant reçus 200µL du mélange des quatre
antibiotiques: Pénicilline G, Streptomycine, Chloramphénicol et de
l'Amphotéricine B. Les antibiotiques à cette concentration n'influent pas
sur la croissance des diatomées pour ces souches et dans ces conditions.
Cependant, en observation macroscopique, les cultures de C.sp. n'avaient
pas la même couleur entre les tubes témoins (oranges) et les essais
(marrons).
Pour l'espèce Phaeodactylum tricornitum, une différence significative
(P<0,05) est remarquée, mais dans le sens d'une augmentation de
croissance après le traitement aux antibiotiques. Ceci peut être dû au fait
que l'axénie ait marché, et que les cellules poussent plus vite sans la
concurrence des bactéries pour les nutriments tels que l'azote. On peut
penser éventuellement que les tubes aient été ensemencés avec une
concentration initiale différente suite à une erreur de manipulation. Ou bien
encore, que la fixation au lugol pour P.t soit moins efficace car celui-ci ne
contient pas d'acide acétique. Les cellules ont peut-être continué à se
diviser un peu, ce qui a pu entraîner un biais dans les comptages.
Enfin, la plus grande variation est observée pour Haslea ostrearia
avec une différence significative (P<0,001) entre le témoin et les essais.
On observe une diminution conséquente de la croissance des diatomées
après traitement aux antibiotiques. Le traitement doit donc être trop
concentré pour cette espèce; puisque de nombreuses cellules sont mortes
(environ 20%).
On va donc chercher à savoir quel(s) antibiotique(s) ont cet effet sur
cette diatomée. Sachant que l'Amphotéricine B a déjà prouvé son
innocuité auparavant, il a été écarté des antibiotiques à tester.
2- Biométrie de Haslea ostrearia
Suite à ces résultats, l'étude s'est donc orientée vers Haslea
ostrearia P9b. Cette souche est originaire de la côte Atlantique Vendéenne
(Baie de Bourgneuf), isolée d'une claire ostréicole en Novembre 2007.
Pour mieux connaître cette diatomée, il a été fait une biométrie sur 150
individus de sorte à obtenir des valeurs de longueur de frustule suivant
une distribution Normale (Figure 2). L'analyse des images est faite sur
microscope optique (Olympus AX70), grâce au logiciel Nikon Lucia G.
effectif=f(longueur)
30
25
effectif
20
15
Longueur [µm]
10
5
0
<52.8 - <53.4 53.4)
54)
<54 54.6)
<54.6 - <55.2 - <55.8 - <56.4 55.2)
55.8)
56.4)
57)
<57 57.6)
<57.6 - <58.2 - <58.8 - <59.4 58.2)
58.8)
59.4)
60)
<60 60.6)
<60.6 - <61.2 - <61.8 - <62.4 61.2)
61.8)
62.4)
63)
<63 63.6)
longueur en µM
Figure 2: Distribution de la longueur longitudinale de H.o. sur 150 individus
D'après les valeurs obtenues, la longueur moyenne d'une cellule de
cette population de H.o. est de 58,699µm, ce qui est légèrement inférieure
à la classe modale qui est située entre 60 et 60,6µm. Cependant, on
constate qu'en prenant 150 individus, la distribution ne suit pas une loi
Normale. Il faudrait donc faire cette biométrie sur un plus grand échantillon
pour obtenir une longueur moyenne de frustule correcte. On pourrait
prendre un échantillon de 300 individus. Par rapport à une gamme de
taille de l'espèce Haslea ostrearia, cette souche se trouve dans la
moyenne.
3- Effet des antibiotiques sur Haslea ostrearia
L'étude s'est concentrée sur H.o.; sur qui, on a testé les trois
antibiotiques séparément et à trois concentrations (Tableau 1) différentes
(Figure 3).
Effet des trois antibiotiques sur H.o
200000
Pénicilline G
nombre de cellules/mL
180000
Chlorampénicol
160000
Streptomycine
###
**
140000
120000
100000
80000
*** p<0,001 vs témoin=0
***
###
60000
** p<0,01 vs témoin=0
###
***
40000
***
###
20000
0
0
0.5
1
1.5
***
###
2
### p<0,001 vs pénicilline
2.5
concentration en antibiotique (dose C)
Figure 3: Effet de trois antibiotiques appliqués individuellement à quatre concentrations différentes sur
Haslea ostrearia : concentrations obtenues après huit jours de culture en présence des antibiotiques.
Il n'y a pas de différence observée pour la gamme de concentration
en Pénicilline. Donc, pour cet antibiotique, les concentrations allant de
0,5C (150u/mL) à 2C n'ont pas d'influence sur la croissance de cette
souche de diatomée. De plus, les valeurs obtenues pour la Pénicilline
présentent des écarts-types importants. Ceci confirme qu'il n'y a pas de
différence significative en présence de l'antibiotique par rapport au témoin
sans Pénicilline.
Contrairement
à
ces
résultats,
le
Chloramphénicol
et
la
Streptomycine ont un impact important sur la croissance de Haslea
ostrearia à ces concentrations. Le Chloramphénicol inhibe la croissance à
partir de 1C (1µg/mL) et avec 2C, on observe une inhibition de croissance
de 80% par rapport au témoin sans antibiotique. De même, la
Streptomycine agit dés 0,5C (100µg/mL) pour atteindre une inhibition de
90% à une concentration de 2C soit deux fois celle conseillée par Guillard.
L'inhibition de croissance de Haslea ostrearia après l'application du
mélange d'antibiotiques (Fig. 1) est sans doute due au Chloramphénicol et
à la Streptomycine; bien que mélangés, les antibiotiques n'ont pas le
même effet que mis individuellement.
Les tests d'axénie dans les milieux FAG et FG sont, de plus, tous
positifs. En effet, tous les tubes présentes un trouble plus ou moins
importants, même pour les concentrations doublées d'antibiotiques. Ceci
montre que, en plus d'inhiber la croissance des algues, les antibiotiques
ne permettent pas d'éliminer les bactéries ciblées par ces milieux. La
culture obtenue n'est pas axénique.
Peut-être que les bactéries n'étaient pas assez accessibles pour les
antibiotiques, il faudrait donc appliquer au préalable un traitement qui
permette de rendre plus efficaces ces trois antibiotiques.
4- Effets des antibiotiques sur Haslea ostrearia traitée au lysozyme
D'après le protocole de Su et al., (2007), un traitement au lysozyme
précédant l'application des antibiotiques permet d'obtenir efficacement une
culture axénique. C'est pourquoi, l'expérience précédente a été répétée
dans les mêmes conditions, mais avec un pré-traitement au lysozyme. Les
résultats sont représentés par les Figures 4a et 4b.
La figure 4a est une comparaison de croissance après huit jours de
culture entre les cellules témoins d'Haslea ostrearia en absence
d'antibiotiques sans traitement au lysozyme ou après traitement au
lysozyme. On constate qu'il y a une différence significative entre le
contrôle et les cellules traitées (P=0,008). Donc le pré-traitement au
lysozyme a peut-être un effet inhibiteur sur la croissance de cette souche
de diatomée.
Effet du traitement au lysosyme seul
250000
200000
nombre de cellules/mL
contrôle
+ lysozyme
**
150000
100000
50000
** p< 0,01 vs contrôle
0
Figure 4a: Croissance d'Haslea ostrearia sans traitement (contrôle) et
avec traitement au lysozyme
Effet du traitement au lysosyme en fonction de la concentration en antibiotiques
nombre de cellules/mL
180000
160000
140000
Pénicilline G
120000
Streptomycine
100000
Chlorampénicol
80000
60000
0
0.5
1
1.5
2
2.5
concentration en antibiotiques (dose C)
Figure 4b: Effet du traitement au lysozyme, effectué en plus du traitement
avec les trois antibiotiques appliqués individuellement à Haslea ostrearia, à
quatre concentrations différentes
On voit d'après la figure 4b que les résultats ne sont pas
reproductibles par rapport à la figure 3. Les effets inhibiteurs du
Chloramphénicol et de la Streptomycine ne sont pas retrouvés. En effet,
pour des plus grandes concentrations de Chloramphénicol, les diatomées
ont une
meilleure
croissance. Les courbes correspondant à
la
Streptomycine et à la Pénicilline se suivent, avec cependant une
croissance plus faible pour les cellules traitées à la Streptomycine.
Les résultats sont difficiles à interpréter puisque les écarts-types sont
très grands, c'est pourquoi ils ne sont pas montrés sur cette figure. De
plus, les tests statistiques n'ont pas pu être appliqués puisque la
distribution des valeurs n'est pas Normale. Les post-tests ne permettent
pas d'avoir des résultats cohérents. Cette différence de comportement des
cellules face aux antibiotiques peut être expliquée par le pré-traitement au
lysozyme, ou bien par un problème de stockage des antibiotiques. En
effet, ceux-ci ont été répartis dans les tubes une semaine en avance et
conservés à 4°C dans les tubes à essai. Le Chloramphénicol pourrait
avoir perdu de son efficacité. Cependant, pour améliorer le protocole il
serait sûrement bon de le supprimer.
En parallèle, l'activité du lysozyme a été testée sur Staphylococcus
aureus. La différence de DO à 450nm entre les bactéries non traitées et
celles traitées au lysozyme est de 0,14. On peut difficilement apprécier
cette différence, mais le lysozyme est actif un minimum.
Les différences de comportement par rapport à la figure 3 sont peutêtre dues au fait que les cellules étaient agglomérées lors des comptages,
ce qui a entrainé un biais.
Enfin, les résultats d'axénie sur milieux FAG, FG et F/2m sont tous
positifs avec une plus ou moins grande turbidité des tubes. Les résultats
sont présentés dans le tableau 2.
0,5C
1C
2C
FAG
FG
FAG
FG
FAG
FG
P1
+++
+++
++
++
++
++
P2
+++
+++
++
++
++
+++
P3
+++
+++
+++
+++
++
++
S1
++
++
++
++
++
++
S2
++
++
++
++
++
++
S3
++
++
+
++
+
++
C1
+++
+++
++
+++
++
+++
C2
+++
+++
+++
+++
++
+++
C3
+++
+++
++
+++
+++
+++
Tableau 2: résultats des tests FAG et FG selon l'antibiotique et la concentration appliquée,
après quinze jours. P: Pénicilline, S: Streptomycine, C: Chloramphénicol, +: un peu
trouble, ++: trouble très marqué, +++: très trouble, colonies visibles, formation de filaments
Les résultats des tubes F/2m ne sont pas présentés, puisqu'on ne
peut pas apprécier la turbidité de ce milieu. Tous les tubes sont positifs, on
distingue dans tous, des bactéries en suspension.
Ainsi, malgré le pré-traitement au lysozyme, la culture d'Haslea
ostrearia n'est pas axénique. L'objectif d'axénisation de la diatomée n'a
pas été atteint. Cependant, grâce au dénombrement sur boîtes, il est
possible de savoir si les traitements ont permis de diminuer la charge
bactérienne de façon significative (figure 5). En effet, la diminution est de
65% par rapport au contrôle sans traitement au lysozyme. Donc, le
traitement est efficace mais demande à être améliorer pour pouvoir
atteindre une inhibition complète de la croissance bactérienne. Le
traitement au lysozyme a permis d'améliorer efficacement le protocole
mais le traitement antibiotique mériterait d'être modifié. Comme le
lysozyme permet l'élimination des bactéries Gram positif, il faudrait
recentrer le traitement antibiotique sur les bactéries Gram négatif.
Effet des traitements au lysozyme et antibiotiques sur la charge bactérienne
8000000
7000000
contrôle
+ lysozyme
UFC/mL
6000000
5000000
4000000
3000000
*
* p< 0,05 vs contrôle
2000000
1000000
0
Figure 5: Charge bactérienne (en unité formant colonie) sans traitement au
lysozyme (contrôle) et avec traitement au lysozyme.
V. Discussion/Conclusion
1- Progrès
Les travaux entrepris n'ont pas permis de répondre au sujet. En effet,
l'objectif de ce stage était d'obtenir une souche axénique d'Haslea
ostrearia, ce qui n'a pas été en mesure d'être fait. Bien que celui-ci n'est
pas été atteint, on a été en mesure de réduire significativement la charge
bactérienne totale grâce au pré-traitement au lysozyme. La première
intention était d'améliorer le protocole d'axénisation, et ceci a bien été
réalisé.
2- Difficultés rencontrées
Les difficultés rencontrées concernent principalement le travail en
milieu stérile: gestion des barreaux aimantés, travail sous la hotte à flux
laminaire ou au bec Bunsen. Pour pouvoir faire des comptages ou
prélever des volumes corrects, il fallait que les cellules soit réparties de
façon homogène. Cette homogénéité était assurée par les barreaux
aimantés. La difficulté était de garder les barreaux aimantés stériles tout
en les transvasant dans les tubes. La hotte à flux laminaires demande une
bonne organisation de son plan de travail pour ne pas avoir de
contamination. Ceci devient très difficile, quand il faut manipuler plusieurs
tubes en même temps.
De plus, la plus grande difficulté en axénisation est de pouvoir dire
qu'une souche est totalement axénique. En effet, les tests sur milieux
FAG, FG et F/2m ciblent des bactéries aux métabolismes spécifiques et
ne permettent pas une étude exhaustive de toutes les bactéries
présentent. Ce qui implique que, si on obtient des tests négatifs, on ne
puisse pas conclure à une axénisation complète. Seulement, à une
absence de bactéries ciblées par le milieu testé.
Cette dernière difficulté peut être contournée par l'emploi du 4',6'diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme Bruckner et al. (2008); Bruckner
et Kroth (2009). Le DAPI est une molécule fluorescente bleue avec une
absorption maximum à 358nm et une émission maximum à 461nm, et qui
se lie à l'ADN. Il permet ainsi, de distinguer les bactéries de la microalgue
grâce à un microscope à épifluorescence. Les bactéries apparaissent
bleues alors que les chloroplastes excités donnent une coloration rouge à
la diatomée. Une autre technique pour contrôler l'axénisation d'une
culture, est l'amplification du gène codant pour le 16srRNA spécifique des
bactéries comme l'ont fait Berg et al. (2002). La présence de bactéries
peut
être
déterminée
par
amplification
avec
la
polymérase
de
Thermophylus aquaticus, suivie d'un Northern Blot.
3- Étapes suivantes
L'étape suivante, pour obtenir une culture d'Haslea ostrearia
axénique, serait de tester de nouveaux cocktails d'antibiotiques qui
influenceraient moins la croissance des diatomées et permettraient
d'éliminer la totalité de la charge bactérienne. Il faudrait remplacer le
Chloramphénicol par d'autres antibiotiques comme la Néomycine à
200µg/mL (Solution PSN P4083, Sigma) ou la Kanamycine à 100µg/mL,
qui ciblent le même type de bactéries que le Chloramphénicol (Annexe 4).
La Pénicilline n'ayant pas eu beaucoup d'influence sur la croissance des
algues pourrait être appliquée à plus fortes concentrations, jusqu'à
1200u/mL (4C) par exemple. Il faudrait aussi tester l'effet synergique des
antibiotiques; car mis en cocktail, on cherche à ce que leur efficacité soit
supérieure aux antibiotiques mis séparément.
De plus, les traitements antibiotiques ont été appliqués à des
concentrations relativement faibles, mais sur une longue période de
contact: huit jours. Une alternative pourrait être d'appliquer un traitement
avec de fortes concentrations mais sur une très courte durée, pour ne pas
tuer toutes les diatomées. Il faudrait augmenter les concentrations de la
Pénicilline et de la Streptomycine jusqu'à 10C et les appliquer sur une
période de contact de 10 min à 1heure en fonction des mécanismes des
antibiotiques. Tout en gardant le pré-traitement au lysozyme, qui a montré
son efficacité, mais en évitant l'incubation à une température élevée.
Une fois la culture axénique obtenue, on peut étudier l'impact direct
de différents facteurs sur la diatomée; puis, travailler sur les interactions
entre les diatomées et les bactéries: savoir si la culture croît mieux quand
elle
est
axénique,
ou
connaître
les
échanges
entre
les
deux
microorganismes. En effet, des études documentent le fait que certaines
bactéries sécrètent des vitamines comme la vitamine B12 importante pour
les algues (Bruckner et Kroth, 2009) et utilisée dans le milieu F/2 (Cf
annexe 2).
VI. Bibliographie
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VII. Fonctionnement du laboratoire
1- Organigramme (Cf Annexe 1)
L'équipe Mer, Molécules et Santé (MMS) est constituée de 128
personnes réparties dans sept équipes différentes. Ces équipes sont sur
Angers, Nantes, Laval et Le Mans. Pour ma part, j'ai côtoyé les équipes 1
et 5 qui sont établies à l'UFR Sciences de Nantes. La première, s'intitule
« Écosystèmes et organismes marins », et est dirigée par le Professeur
Laurent BARILLE et l'équipe 5, « Protéines, pigments et cosmétologie »,
dont le responsable est le Professeur Joël FLEURENCE.
En annexe 1, l'organigramme général de MMS est présenté avec le
détail des deux équipes dans lesquelles se sont déroulées le stage. La
personne, qui a encadré mon stage pendant toute cette période, était
Pierre GAUDIN (en rouge) qui fait partie de l'appui technique de l'équipe
(Technicien de Recherche et Formation, Classe exceptionnelle).
2- Sources de Financement
Un laboratoire public est financé par le ministère de l'Enseignement
et de le Recherche, et par les crédits de recherche. Le laboratoire MMS
est classé Unité Propre de Recherche et d'Enseignement SupérieurEquipe d'Accueil (UPRES-EA n°2160). C'est pourquoi le ministère finance
cette équipe par des crédits quadriennaux qui correspondent à une
somme affectée sur quatre ans, calculée sur la base du nombre
d'enseignants-chercheurs et chercheurs du Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS) publiants du laboratoire. L'équipe devient
alors contractualisée pendant quatre ans. Pour MMS, ces crédits
représentent 30000 euros par an. Le statut d'Unités Mixtes de Recherche
(UMR) est un niveau de reconnaissance encore supérieure pour le
ministère. C'est un objectif de classe à atteindre pour recevoir plus de
financement, car il est associé à de grands organismes de recherche
nationaux tels que le CNRS ou l'INRA.
Cependant, ce budget est loin de couvrir tous les frais du laboratoire,
c'est pourquoi, les chercheurs doivent trouver d'autres sources de
financement, ce sont les crédits de recherche. Ces contrats sont
principalement des crédits accordés par la Région des Pays de la Loire et
sont des financements sur trois ans. Mais il existe aussi des programmes
nationaux, comme ceux financés par l'Agence Nationale pour la
Recherche (ANR) ainsi que des programmes européens. Un financement
correspond à une étude ou un programme et le laboratoire peut, et se doit,
d'en cumuler plusieurs. Après ces trois ans, le laboratoire doit rendre un
rapport pour justifier l'avancée de l'étude et l'utilisation du crédit de
recherche. En 2009, pour les deux équipes MMS de l'UFR Sciences et
Techniques de Nantes, les contrats de recherche ont représentés 133
264,74 euros. Ceci équivaut environ à 4,5 fois plus que les crédits
quadriennaux accordés par le ministère, c'est donc surtout sur ces crédits
de recherche que le laboratoire peut fonctionner.
VIII. Bilan des acquis
Ce module de stage professionnalisant m'a été très bénéfique. Cela
m'a demandé une grande organisation dans mon travail et mon emploi du
temps. Sur le plan technique, il permet une approche du travail de
recherche qui est demandé en Master, et m'a aidé à mieux appréhender
l'organisation d'une équipe de recherche et les fonctions que possèdent
les différents acteurs d'un laboratoire.
La biologie des microorganismes m'intéresse beaucoup et ce stage
dans l'équipe Mer, Molécules et Santé m'a donné l'occasion de pouvoir
approfondir, et de mettre en application mes connaissances scientifiques
sur ce sujet. Enfin, il m'a permis de me rendre compte de mes capacités et
de mes lacunes. J'y ai observé la difficulté à mettre en place une
démarche scientifique rigoureuse.
Mon bilan personnel de ce stage est très positif et il me permettra
sûrement de m'orienter plus facilement ultérieurement; puisque, j'ai acquis
une meilleure connaissance de mes attentes et mes capacités.
IX. Annexes
1- Annexe 1- Organigramme
2- Annexe 2- Les milieux utilisés
a) Milieu F/2 de Guillard « Standard » (Guillard, 1982)
Solutions de nutriments majeurs :
NaNO3 7,5 g
dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.)
NaH2PO4, H2O 0,5 g
dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.)
Na2SiO3, 9 H2O 3 g
dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.)
NH4Cl (*)
dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.)
2,65 g
* seulement pour les espèces n'utilisant pas les nitrates comme
source d'azote
Solution de microéléments métalliques :
Ajouter les éléments dan l’ordre, et attendre la dissolution complète
du précédent.
Na2EDTA
436 mg
FeCl3, 6 H2O
315 mg
CuSO4, 5 H2O 98 mg dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.) 1 ml
ZnSO4, 7 H2O 220 mg dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.)1 ml
CoCl2, 6 H2O 100 mg dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.) 1 ml
MnCl2, 4 H2O 1800 mg dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.) 1 ml
Na2MoO4, 2 H2O 63 mg dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.) 1 ml
Eau "ultra pure"
(q.s.p.) 100 ml
Solution de vitamines :
Thiamine - HCl
10 mg
Biotine 5 mg dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.)
1 ml
Vitamine B12
1 ml
5 mg dans 100 ml d'eau "ultra pure" (q.s.p.)
Eau "ultra pure"
(q.s.p.) 100 ml
Préparation du milieu F/2 :
- Filtrer l'eau de mer sur filtre GF/C 4,7 cm,
- ajuster la salinité à 28 g/l,
- ajouter la solution de vitamines (1 ml par litre de milieu),
- autoclaver le mélange, les solutions de nutriments et la solution de
métaux (20 mn à 120 °C),
- laisser refroidir,
- ajouter stérilement les nutriments majeurs (1 ml de chaque par litre
de milieu),
- ajouter stérilement la solution de métaux (1 ml par litre de milieu).
b) Milieu FAG
Bacto-peptone
3g
Yeast extract 1 g
(NH4)2SO4
1g
Na-glycérophosphate
Fe(SO4)2(NH4)2
25 mg
6 mg
Mélange eau ultra pure/eau de mer (50%)
(Q.S.P.) 1L
Préparation du milieu :
- Préparer 1 litre du mélange eau de mer/eau ultrapure,
- verser le bacto-peptone dans un bêcher d'un litre et le mettre en
solution avec un peu d'eau de mer diluée à 50 %,
- de la même façon, préparer trois solutions, une de Yeast extract,
une de Sulfate d'ammonium, une de Na-glycérophosphate, et les ajouter
dans cet ordre à la solution de bacto-peptone,
- mettre le fer sequestrène en solution dans environ 60 mL d'eau de
mer diluée à 50 % et l'ajouter à la solution précédente,
- verser le tout dans une fiole jaugée et compléter à 1 litre,
- reverser dans le bêcher et ajuster le pH à environ 7.6,
- à l'aide d'une seringue, répartir le milieu dans 25 tubes à raison de
20 mL par tube,
- stériliser à l'autoclave 20 minutes, à 1 Bar, à 121°C et conserver au
réfrigérateur.
c)
Milieu FG
Bacto-peptone
Yeast extract 0.5 g
4g
Na-glycérophosphate
Fe(SO4)2(NH4)2
25 mg
6 mg
Mélange eau ultra pure/eau de mer (75%)
(Q.S.P.) 1L
Préparation du milieu :
- Préparer 1 litre du mélange eau de mer/eau ultrapure (750 mL/250
mL),
- verser le bacto-peptone dans un bêcher de 1 litre et le mettre en
solution avec un peu d'eau de mer à 75%,
- de la même façon, préparer deux solutions, une de Yeast extract,
une de Na-glycérophosphate, et les ajouter dans cet ordre à la solution de
bacto-peptone,
- mettre le fer sequestrène en solution dans environ 60 mL d'eau de
mer à 75% et l'ajouter à la solution précédente,
- verser le tout dans une fiole jaugée et compléter à 1 litre,
- reverser dans le bêcher et ajuster le pH à environ 7.6,
- à l'aide d'une seringue, répartir le milieu dans 25 tubes à raison de
20 mL par tube,
- stériliser à l'autoclave 20 minutes, à 1 Bar, à 121°C et conserver au
réfrigérateur.
d) Milieu F/2m
Methylamine-HCl 1g
dans 1 litre de milieu F/2 de Guillard (Cf composition supra)
-stériliser à l'autoclave 20 minutes, à 1 Bar, à 121°C et conserver au
réfrigérateur.
e)
NB Nutrient Broth (sigma N7519)
beef extract: 3g/L
peptone: 5g/L
Le milieu nutritif est préparé à 8g/L dans de l'eau salée à 28‰, la
solution est chauffée puis répartie dans des tubes; pour des milieux
solides, on rajoute de l'agar à 15g/L. Chaque tube contenant 20mL de
milieu est autoclavé puis mis au bain-marie à 45°C, température de
surfusion.
Si le milieu n'est pas utilisé le jour de l'autoclavage, il faut qu'il soit
refondu à 110°C, puis coulé en boîtes de Pétri.
3- Annexe 3- Norme d'analyse bactériologique des eaux de
consommation NF V08-011
Dénombrement des aérobies totaux par comptage des colonies
obtenues à 30°C
Définition:
Aérobies totaux: Microorganismes (bactéries, levures, moisissures)
se développant en aérobiose à 30°C dans les conditions opératoires
définies.
Principe:
–
Ensemencement en profondeur et en double d'une quantité définie de produit (ou
de ses dilutions).
–
Incubation 72 heures à 30°C.
–
Calcul du nombre de microorganismes par comptage des colonies, puis ramener ce
nombre à une quantité initiale déterminée de produit (g ou mL).
Milieux de culture:
PCA (ou MOF pour produits laitiers). Éventuellement gélose blanche
pour double couche. Pour notre étude, il était conseillée d'utiliser du
Nutrient Broth (NB).
Diluants:
A défauts de normes spécifiques, utiliser par exemple: Peptone sel
ou Eau peptonée tamponnée. Nous avons utilisé du NaCl à 28‰.
4- Annexe 4- Cibles et Modes d'action de quelques antibiotiques
Spectre antimicrobien
+ Précis (quelques espèces)
Gram + Gram -
Penicilline
+
++
Streptomycine
+
++
Néomycine
++
++
Mycobactéries
Levures Moisissures
++
++
++
Polymyxine B
Kanamycine
++
++
++
Erythromycine
++
++
Mycoplasmes
+
Amphotericin B
Chloramphénicol
++ Large (la plupart des espèces)
+
++
+
++
Modes d'action :
La Pénicilline inhibe la synthèe des parois bactériennes
La Streptomycine inhibe la protéosynthèse chez les procaryotes
(interfère dans la translation au niveau du complexe d'initiation et d'élongation de chaîne du ribosome et entraine des erreurs de codons)
La Néomycine unhibe l'initiation et l'élongation durant la synthèse des protéines
(La néomycine se fixe sur la sous-unité 30S et dans certains cas sur la sous-unité 50S causant des erreurs de transcription)
L'Amphotéricine B interfère dans la perméabilité de la membrane fongique, causant la formation de canaux entrainant la fuite de petites molécules.
Le Chloramphénicol a effet bactériostatique
Inhibition de la translation sur la sous-unité ribosomiale 50S au niveau de la peptidyltransférase (inhibition de l'élongation).
La polymyxine B se lie à la membrane cytoplasmique des bactéries Gram (-) et en modifie la perméabilité
La kanamycine se lie à la sous-unité ribosomale 70S, inhibe la translocation, elicits miscoding
L'érythromycine empêche la croissance des bactéries, par interférence avec la synthèse des protéines. Elle se lie avec la sous-unité
ribosomique 50S et empêche ainsi la translocation des peptides et la formation de polypeptides.
Résumé
Les techniques de cultures axéniques sont rendues très complexes
par les variations de sensibilité et de spécificité des diatomées et de leur
cortège de bactéries. Les antibiotiques semblent être le traitement de
purification le plus efficace, cependant, le protocole d'axénisation
nécessitait une amélioration.
Dans cette étude, les croissances de quatre souches de diatomées
dont Haslea ostrearia (Simonsen, 1974) sont mesurées après huit jours de
contact aux antibiotiques, appliqués en cocktail ou séparément.
L'expérience prouve la difficulté d'obtenir une souche axénique de
diatomées. Cependant, une amélioration du protocole est permise par un
pré-traitement au lysozyme.