reau après congélation-décongélation avec les LDL du jaune d`œuf de

Etude de la fertilité in vitro de la semence de taureau après congélation-décongélation avec les
LDL du jaune d’œuf de poule : Comparaison
avec l’Optidyl®, dilueur commercial à base de
jaune d’œuf
L. BRIAND-AMIRAT1, M. ANTON2, O. GERARD3 et D. TAINTURIER1*
1 Laboratoire des biotechnologies et pathologie de la reproduction. Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes, BP 40706, 44307- Nantes
2 Groupe Physico-chimie des Emulsions, Laboratoire d’Etude des Interactions des Molécules Alimentaires, Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), BP 71627,
44316- Nantes Cedex 3
3 Ouest Génétique Elevage Reproduction (OGER), La Bossiérie, B.P 80, 44130- Blain
* Auteur chargé de la correspondance : e-mail : [email protected]
RÉSUMÉ
SUMMARY
Un dilueur à 8% de lipoprotéines de faible densité du jaune d’œuf de
poule (LDL), a donné après congélation-décongélation plus de spermatozoïdes mobiles qu’un dilueur témoin (l’Optidyl®) contenant 20% de jaune
d’œuf, 54,4% contre 30,2% respectivement (P<0.05). L’intégrité de la
membrane plasmique et de l’acrosome n’a pas été modifiée avec les deux
dilueurs. In vitro, le taux de segmentation des embryons a été plus élevé
pour les ovocytes fécondés avec les spermatozoïdes congelés-décongelés
dans le dilueur LDL en comparaison avec le dilueur jaune d’œuf, 63,0%
contre 54,8% (P<0.05). Le nombre de blastocystes obtenus après 8 jours de
culture in vitro n’a pas été significativement différent selon le dilueur.
In vitro bull semen fertility after freezing-thawing with egg yold LDL :
a comparison with Optidyl a commercial egg yold extend. Par L.
BRIAND-AMIRAT, M. ANTON, O. GERARD et D. TAINTURIER.
Mots-clés : taureau - sperme - congélation - LDL - jaune
d’œuf - mobilité des spermatozoïdes - in vitro.
Motility of bovine semen cryopreserved in Low-density lipoproteins
(LDL) was analyzed and compared to semen cryopreserved with Optidyl®,
a commercial extender containing egg yolk. To evaluate the fertilizing ability of semen, we used in vitro fertilization test, whereas acrosome and plasma membrane integrity were also evaluated. The percentage of motile spermatozoa was near two fold higher after freezing in LDL than in Optidyl®
54.4% versus 30.2% (P<0.05). Integrity of the acrosome and the plasma
membrane was maintained with both extenders. The cleavage rate was
significantly higher after fertilization with semen frozen in LDL than with
Optidyl® 63.0% versus 54.8% (P<0.05). No significant difference of blastocyst’s number was observed after in vitro culture. However, the higher
percentage of motile spermatozoa obtained with LDL extender suggests that
a lower number of spermatozoa could be used in the straws for artificial
insemination.
Keywords : Bull semen - Cryopreservation - Egg Yolk LDL - Sperm motility - in vitro.
Introduction
La congélation de la semence a facilité l’utilisation de l’insémination artificielle (IA) chez les bovins. Cependant, en
plus d’être lié à des paramètres tels que la détection de l’oestrus et la synchronisation de l’ovulation chez la vache, le
succès de l’insémination artificielle est fortement lié à la
qualité de la congélation de la semence. En effet, durant le
processus de congélation-décongélation, divers compartiments biochimiques et anatomiques du spermatozoïde peuvent être lésés (l’acrosome, le noyau, les mitochondries,
l’axonème, la membrane plasmique, etc…) altérant la capacité des spermatozoïdes à féconder l’ovocyte après l’IA. Par
conséquent, l’intérêt premier des protocoles de congélation/décongélation de la semence est d’assurer un bon
“ réveil ” des spermatozoïdes en prévenant la formation de
glace et en réduisant les dommages cellulaires pouvant survenir avant, pendant et après le processus de congélationdécongélation.
Revue Méd. Vét., 2006, 157, 4, 205-212
Le lait entier ou demi écrémé, le lait de noix de coco, le
jaune d’œuf de poule ont été largement utilisés pour la
conservation des spermatozoïdes. Plus particulièrement, le
jaune d’œuf est l’additif le plus communément utilisé dans
les centres d’IA en France dans l’espèce bovine. L’utilisation
du jaune d’œuf dans les dilueurs de la semence a tout
d’abord été rapportée pour ses effets bénéfiques dans la
conservation des cellules à basses températures. En association avec d’autres éléments, le jaune d’œuf assure une bonne
protection des spermatozoïdes contre le choc dû au froid
[5,17,25]. Cependant, l’utilisation du jaune d’œuf présente
certaines limites. En effet, la complexité de la composition
du jaune d’œuf rend, d’une part, la reproductibilité des résultats assez faible et, d’autre part, certains laboratoires ont
révélé que la concentration en jaune d’œuf habituellement
utilisée dans les dilueurs (20 %) interférait avec certains tests
biochimiques [36]. Par ailleurs, en plus des risques sanitaires
[1,2,6,34,35], le jaune d’œuf renferme des substances qui
inhiberaient la respiration des spermatozoïdes et par consé-
206
quent réduiraient leur mobilité [16,23,38]. Pour toutes ces
raisons, il est intéressant d’isoler et de produire l’élément
cryoprotecteur du jaune d’œuf de poule.
PACE et GRAHAM [23] ont purifié le jaune d’œuf de
poule en utilisant l’ultracentrifugation et ont rapporté que les
lipoprotéines de faible densité (LDL) avaient un rôle cryoprotecteur. Depuis, les investigations de FOULKES [12],
QUINN et CHOW [26], DEMIANOWICZ et STREZEK
[11], MOUSSA et al. [22] ont confirmé que les LDL avaient
bien un effet cryoprotecteur sur les cellules. Les travaux de
MOUSSA et al. [22] ont montré qu’une concentration de
8 % dans les dilueurs pour spermatozoïdes bovins offrait de
meilleurs résultats de mobilité après congélation-décongélation par rapport aux dilueurs à 20% de jaune d’œuf.
La mesure de la mobilité est un paramètre important de
sélection utilisée par les centres d’insémination mais elle
reste insuffisante pour prédire la fertilité in vivo et in vitro
des spermatozoïdes chez plusieurs espèces [3, 30, 31]. Un
plus grand nombre de spermatozoïdes mobiles est en faveur
d’une meilleure fertilité in vitro et in vivo. La fertilité de la
semence dépend de la capacité des spermatozoïdes à accéder
à l’ovocyte puis à interagir avec lui pour le féconder.
L’objectif de ce travail était de voir si la fertilité des spermatozoïdes était maintenue après congélation-décongélation
des spermatozoïdes dans le nouveau dilueur à base de LDL.
La fertilité in vitro a été évaluée en fonction de la segmentation des embryons et du développement embryonnaire
obtenu après fécondation in vitro des ovocytes avec de la
semence congelée-décongelée avec des LDL et le jaune
d’œuf. La fertilité in vivo n’a, quant à elle, pas encore été
vérifiée. L’intégrité de la membrane plasmique et de l’acrosome a été évaluée.
Matériels et méthodes
EXTRACTION DES LDL
Les œufs utilisés étaient issus d’élevages fermiers et ont
été cassés manuellement 24 heures après la ponte.
L’extraction des LDL du jaune d’œuf de poule a été réalisée
par la suite selon la méthode mise au point à l’ENVN / INRA
Nantes par MOUSSA et al. [22].
PRÉPARATION DES MILIEUX DE CONGÉLATION
Les LDL ont été utilisées à la concentration de 8 % (w/v,
MS), qui est la concentration optimum trouvée par
MOUSSA et al. [22] pour la cryoconservation de la semence
bovine. Nous avons utilisé deux dilueurs.
Dilueur 1 (Optidyl®) : dilueur commercial à base de 20 %
de jaune d’œuf, stérilisé par double ionisation (Biovet : BP
62, 32500- Fleurance, France).
Dilueur 2 (LDL) : 2,42 g Tris ; 1,48 g acide citrique ;
1,00 g fructose ; 6,4 ml glycérol ; 25 mg gentamicine, 50 000
UI pénicilline + 8 % LDL pour 100 ml d’eau stérile (préparé
au laboratoire).
Les osmolarités des dilueurs ont été mesurées à l’aide d’un
osmomètre (Hermann Roebling microosmometre type 13/
BRIAND-AMIRAT (L.) ET COLLABORATEURS
13 DR auto cal, Berlin, Germany) : elles étaient respectivement de 1367 et 1372 m Osmol/ kg H2O pour le dilueur LDL
et l’Optidyl®.
PRÉLÈVEMENT ET ANALYSE DE LA SEMENCE
Les éjaculats utilisés lors de cette étude provenaient de 11
taureaux, choisis au hasard au centre d’insémination artificielle de l’OGER (Ouest Génetique Elevage Reproduction)
de Blain. Deux éjaculats ont été obtenus par taureau à l’aide
d’un vagin artificiel. Dans les minutes suivant le prélèvement, l’échantillon a été analysé (volume, concentration en
spermatozoïdes mesurée par comptage dans une cellule de
Malassez) et mobilité massale sous microscope à platine
chauffante). Les échantillons conservés pour l’expérimentation avaient une mobilité massale de 5 ainsi qu’une concentration en spermatozoïdes supérieure à 300 x 106 spermatozoïdes / ml. Chaque éjaculat a été par la suite divisé en deux
fractions. Une fraction a été diluée avec de l’Optidyl® et
l’autre avec des LDL dans le but d’obtenir une concentration
de 120 x 106 spermatozoïdes / ml. Après dilution, la semence
a subi pendant 1h30 un refroidissement de 37 °C à + 4 °C
avant une équilibration de 2 h à + 4 °C dans des paillettes en
PVC de 0,25 ml (Biovet). Les paillettes ont été alors congelées pendant 10 min à 4 cm (-120 °C) de la surface de l’azote
liquide avant d’être plongées et stockées dans de l’azote
liquide à -196 °C.
ANALYSE DE LA MOBILITÉ
L’analyse de la mobilité de la semence a été réalisée à
l’aide de l’ATS 20 (J.C. Distribution, International, La Ferté
Fresnel, France). Le système comprend : un micro-ordinateur (PC), une caméra CCD, un moniteur TV noir et blanc,
trois logiciels assurant l’acquisition, le traitement et l’édition
des résultats, une imprimante à jet d’encre (HP 600).
Trois paillettes de chaque dilueur, pour un même taureau,
ont été décongelées dans un bain marie pendant 45 secondes
à 37 °C. Chaque échantillon a été déposé dans un tube de
1 ml puis incubé pendant 10 min à 37 °C. Cinq µ
l de l’échantillon ont été déposés sur une cellule à usage unique (CellVision de 20 µm de profondeur) et cinq champs choisis de
façon aléatoire ont été analysés. [L’ATS 20 travaille en mode
mono coupe à une fréquence de prise de vue de 20 images
par seconde. Les objets présents dans la cellule sont reconnus comme spermatozoïdes en fonction de leur taille et de
leur brillance. Les trajectoires des spermatozoïdes sont calculées en reliant les différents points obtenus au cours
d’images successives espacées d’intervalles de temps
réglables (en fonction de la vitesse des spermatozoïdes). Le
réglage de la configuration du système doit prendre en
mx5
compte la taille de la tête des spermatozoïdes (8 à 9,5 µ
à 5,5 µ
m), leur vitesse, la profondeur des cellules utilisées.
Cent à 150 trajectoires ont été analysées sur la mobilité (%
de spermatozoïdes mobiles), la vitesse linéaire (VSL ;
m / sec), la vitesse curviligne (VCL ;
Straight line velocity, µ
Curvilnear line velocity, µ
m / sec), la linéarité (LIN ; linearity
index = VSL/VCL x 100), l’amplitude de battement de la
tête (ALH ; Amplitude of the lateral head displacement, µm),
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ETUDE DE LA FERTILITÉ IN VITRO DE LA SEMENCE DE TAUREAU
207
et la vitesse de déplacement des spermatozoïdes (VAP ;
m/sec).
Average path velocity, µ
d’Hepes additionné de 100 UI/ml de pénicilline G et de 5 %
(v/v) de sérum de veau fœtal (SVF) (Gibco BRL P. Scotland
Ref :.10099-133).
EVALUATION DE L’INTÉGRITÉ DE L’ACROSOME
Maturation in vitro des ovocytes
Les COCs ont subi une maturation pendant 24 h à 39 °C
sous une atmosphère de 5 % de CO2, 95 % d’humidité. Le
milieu de maturation était composé de TCM 199 bicarbonate
supplémenté de 10 % de SVF, 75 µg/ml de gentamicine,
10 µ
g/ml d’Epidermal Growth Factor (EGF). Les COCs ont
été placés par groupe de 100 dans des puits contenant 500 µ
l
de milieu de maturation (boites 4-puits : Nunc, Roskilde,
Danemark).
L’intégrité de l’acrosome a été analysée par marquage par
le PSA couplé au FITC (pisum sativum agglutinin). Des
échantillons de semence ont été utilisés pour réaliser des
frottis sur des lames de verre. Après un séchage à l’air, les
lames ont été trempées pendant 15 min dans un bain de
methanol absolu. Après séchage les lames ont été incubées
g/ml) dans du
avec une solution PSA marqué au FITC (50 µ
PBS pendant 10 min à température ambiante dans un endroit
sombre et humide. Les lames ont par la suite été rincées à
l’eau pour éliminer l’excès de colorant puis laissées pendant
15 min dans l’eau. Après séchage à l’air, les lames ont été
stockées à + 4 °C avant observation au microscope à fluorescence (LEIKA DM-IRB relié à une caméra digitale DXM),
les images ont été analysées à l’aide de LUCIA G (logiciel
d’analyses d’images, NIKON). Les spermatozoïdes observés
(n=200 spermatozoïdes/lame) ont été classés en : a) spermatozoïdes positifs : avec acrosome, b) spermatozoïdes négatifs : acrosome absent.
EVALUATION DE L’INTÉGRITÉ DE LA MEMBRANE
PLASMIQUE : TEST HYPO-OSMOTIQUE (HOS TEST)
Trois échantillons ont été utilisés par éjaculat. Les
paillettes ont été décongelées dans un bain-marie pendant 45
secondes à 37 °C. La semence décongelée (100 µ
l) a été rajoutée à la solution hypo-osmotique (10 mOsm/kgH2O) préparée avec du fructose 75 mM + Tri sodium citrate dans de
l’eau distillée. Après 60 min d’incubation à 37 °C, 15 µ
l de la
solution ont été déposés entre lame et lamelle puis observés
au microscope optique (Olympus CK2, ULWCD 0,30) au
grossissement x 400 (300 spermatozoïdes sont comptés par
lame). Les spermatozoïdes observés ont été classés en positifs ou négatifs en fonction de la présence ou de l’absence
d’une queue enroulée et gonflée.
EVALUATION DE LA FERTILITÉ IN VITRO
Collecte des ovocytes par ponction folliculaire
Les ovaires ont été prélevés à l’abattoir immédiatement
après l’éviscération des vaches. Ils ont été rincés trois fois
avant d’être transportés au laboratoire dans une solution de
NaCl 0,9 % à une température de 30-38 °C dans un délai de
3 heures. Les ovocytes entourés de leur cumulus oophorus
(complexes-ovocytes-cumulus : COCs) ont été collectés par
aspiration des follicules visibles à la surface de l’ovaire (2-8
mm) à l’aide d’une pompe péristaltique à débit constant
reliée à une aiguille 19 G. Le liquide folliculaire a été
recueilli dans un tube de 50 ml. Les COCs compacts ont été
recherchés sous la loupe binoculaire, ils ont été sélectionnés
sur trois critères morphologiques : ovocytes entourés d’au
moins 3 couches de cellules du cumulus compact, avec un
cytoplasme non granuleux, de couleur homogène.
Après sédimentation, le culot cellulaire a été prélevé et
dilué dans un milieu TCM 199 tamponné par 25 mM
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Préparation de la semence et fécondation in vitro
Après 24 h de maturation, les ovocytes à cumulus expansés ont été rincés une fois dans le milieu de fécondation
TALP : 114 mM NaCl ; 3,2 mM KCl ; 2,0 mM CaCl2 ;
25 mM NaHCO3 ; 10 mM Na-lactate ; 6 mg / ml d’albumine
sérique bovine sans acides gras ; 0,2 mM Na-pyruvate ;
10 µg/ml d’héparine et PHE (Penicillamine 2 mM,
Hypotaurine 1 mM, Epinephrine 250 µM), PenicillineStreptomycine 100 UI/ml [24] puis placés par groupe de 100
dans des puits contenant 250 µ
l de TALP.
Pour chaque taureau, 400 COCs ont été utilisés et répartis
de façon aléatoire entre les deux lots : Lot 1 : 200 ovocytes
qui seront fécondés avec de la semence congelée-décongelée
dans le dilueur LDL. Lot 2 : 200 ovocytes qui seront fécondés avec de la semence congelée-décongelée avec le dilueur
Optidyl®. Les spermatozoïdes ont été sélectionnés pour la
fécondation par la technique du gradient de Percoll [13].
Pour chaque taureau, une paillette de chaque éjaculat a été
décongelée pendant 45 secondes dans un bain marie à 37 °C.
La mobilité des spermatozoïdes a été vérifiée au microscope,
puis la totalité de la semence, soit 0,25 ml a été déversée à la
surface d’un gradient discontinu de Percoll (2 ml de Percoll
45 % au dessus de 2 ml de Percoll 90 %) dans un tube de
10 ml avant d’être mis à centrifuger pendant 30 min à
700 x g à température ambiante. Les spermatozoïdes vivants
récupérés dans le culot (200 µ
l) ont été remis en suspension
dans une solution de Tyrode-Hepes-BSA fraction V 6 mg / ml
puis centrifugés pendant 10 min à 200 x g à température
ambiante. La concentration en spermatozoïdes dans le culot
cellulaire a été estimée après comptage sur cellule de
Malassez, les spermatozoïdes ont ensuite été dilués dans un
volume approprié de TALP pour avoir une concentration de
2 x 106 spermatozoïdes/ml. Les ovocytes et les spermatozoïdes (250 µ
l) ont été incubés pour une durée de 20 h à 39 °C,
5 % CO2, 95 % d’humidité.
Culture in vitro
Après fécondation in vitro, les cellules du cumulus et les
spermatozoïdes surnuméraires accolés à la zone pellucide
ont été enlevés par agitation au vortex pendant 2 min dans
2 ml d’une solution saline PBS (Phosphate Buffered Saline
solution). Les présumés zygotes ont ensuite été lavés 10 fois
dans des microgouttes de SOF (Synthetic oviduct fluid)
contenant 107,8 mM NaCl ; 6,7 mM KCl ; 1,15 mM
KH2PO4 ; 1,7 mM MgSO4 ; 5,35 mM lactate de sodium ;
25 mM NaHCO3 ; 0,73 mM pyruvate de sodium ; 2,04 mM
208
BRIAND-AMIRAT (L.) ET COLLABORATEURS
La flèche montre un spermatozoïde avec queue gonflée et recourbée.
FIGURE 2. — Spermatozoïdes de taureaux (congelés-décongelés dans
l’Optidyl®) après 1 h d’incubation dans la solution hypo-osmotique (x
630).
La flèche indique un acrosome coloré.
FIGURE 1. — Spermatozoïdes de taureau (congelés-décongelés avec le
dilueur LDL) après coloration au FITC-PSA, coloration verte de l’acrosome (x 400).
CaCl2,2H2O ; 0,20 mM L-glutamine ; 30 µ
l/ml BME 50 X
amino acids ; 10 µ
l/ml MEM 100 X amino acids ; 0,34 mM
tri-sodium-citrate ; 2,77 mM myo-inositol ; 2,5 µ
g/ml gentamicine ; 0,01 µ
g/ml rouge de phénol ; eau stérile ultra-pure
avant d’être mis en culture, par groupe de 30 dans 30 µ
l de
milieu de culture (1 zygote par µ
l). La culture a été réalisée
dans du SOF supplémenté avec 10 % de SVF sous huile
minérale à 39 °C, 5 % CO2, 5% O2 et 90 % de N2 pendant
7 heures à 8 jours (J0 = jour de la fécondation in vitro). Le
milieu de culture n’a pas été changé pendant toute cette
période. Soixante douze h après la fécondation, les embryons
ont été observés à la loupe binoculaire et le nombre d’embryons clivés a été évalué. Le nombre de blastocystes développés a été noté après 7 jours de culture.
Les produits utilisés dans cette étude provenaient de
Sigma-Aldrich Chimie (St Quentin Fallavier, France).
ANALYSE STATISTIQUE
ZP : Zone pellucide.
FIGURE 3. — Embryons au stade blastocyste obtenus après fécondation in
vitro avec de la semence congelée-décongelée avec les LDL (x 400).
La comparaison entre la mobilité des spermatozoïdes
après congélation-décongélation dans les dilueurs LDL et
Optidyl® a été réalisée avec le test de Wilcoxon. Les pourcentages de clivage et de développement jusqu’au stade blastocyste suivant les groupes ainsi que le pourcentage de sper-
Les valeurs du tableau correspondent à la moyenne ± S.E.M. de 22 éjaculats provenant de 11 taureaux. P<0,05 valeurs significativement différentes (S).
P>0,05 les valeurs ne sont pas significativement différentes (NS).
TABLEAU I. — Caractéristiques de mouvements des spermatozoïdes de 11 taureaux obtenus à l’ATS 20 après congélation-décongélation dans les dilueurs
LDL et Optidyl®.
Revue Méd. Vét., 2006, 157, 4, 205-212
ETUDE DE LA FERTILITÉ IN VITRO DE LA SEMENCE DE TAUREAU
matozoïdes gonflés après HOS ont été analysés par le test du
Khi-deux. Une probabilité inférieure à 0,05 a été retenue
comme seuil de signification.
Résultats
MOBILITÉ DE LA SEMENCE
La mobilité ainsi que VCL, ALH et VAP ont été significativement plus élevés (p<0,05) pour la semence congeléedécongelée avec le dilueur LDL 8 % que pour la semence
congelée-décongelée dans le dilueur Optidyl® (Tableau I).
Aucune différence n’a été observée concernant VSL et LIN
entre les deux dilueurs.
INTÉGRITÉ DE L’ACROSOME
Après exposition des spermatozoïdes au FITC-PSA, deux
types de spermatozoïdes ont été observés : ceux avec un
acrosome coloré qui apparaît en vert au microscope à fluorescence et ceux ne présentant pas d’acrosome coloré (considérés sans acrosomes). Quatre-vingt douze % des spermatozoïdes congelés-décongelés dans les deux dilueurs ont montré une fluorescence verte au niveau de l’acrosome.
L’intégrité de l’acrosome a été maintenue dans les deux
dilueurs (Tableau II, figure 1).
INTÉGRITÉ DE LA MEMBRANE PLASMIQUE : HOS
TEST
Après incubation des spermatozoïdes dans la solution
hypotonique, les spermatozoïdes avec une membrane plasmique intacte présentent un gonflement au niveau de la
queue. Aucune différence n’a été constatée entre la semence
congelée-décongelée dans les dilueurs LDL et Optidyl®. Ce
résultat montre que le dilueur LDL conserve aussi bien que
l’Optidyl® l’intégrité membranaire des spermatozoïdes de taureau après congélation-décongélation (tableau III, figure 2).
FERTILITÉ IN VITRO
Des embryons clivés ont été observés dans les 2 lots, 72
heures post-fécondation avec de la semence congelée-décongelée dans les deux dilueurs LDL et Optidyl®. Après 7-8
jours de culture in vitro dans le SOF, des blastocystes ont
également été obtenus dans les deux lots (Tableau IV, figure
3). Nous avons observé une différence significative sur le
taux de clivage entre les embryons des deux groupes. Le taux
de clivage a été significativement plus élevé (P<0,05) dans le
lot d’ovocytes fécondés avec de la semence congelée-décon-
gelée avec les LDL que dans le lot fécondé avec de la
semence congelée-décongelée avec de l’Optidyl®. Le taux
de blastocystes, quant à lui, a été identique dans les deux lots.
Nos résultats montrent que le dilueur LDL maintient la fertilité in vitro de la semence avec un taux de clivage plus élevé
que dans le dilueur Optidyl®.
Discussion
MOBILITÉ DE LA SEMENCE
Les résultats ont montré que le pourcentage de spermatozoïdes mobiles après décongélation était plus élevé que celui
obtenu avec l’Optidyl®. Ceci indique que dans nos conditions d’expérimentation, le dilueur LDL assure un meilleur
“ réveil ” de la semence après le processus de congélationdécongélation. Ces résultats sont répétables entre taureaux et
sont en accord avec ceux obtenus par MOUSSA et al. [22] en
comparant le dilueur LDL au Triladyl® (minitüb). Ces
dilueurs (Optidyl®, LDL) diffèrent de la façon suivante : le
dilueur Optidyl® renferme 20 % (p/v) de jaune d’œuf, ce
dernier contient 50 % de MS dont 66 % sont des LDL. Par
conséquent l’Optidyl® renferme naturellement entre 6-7 %
de LDL. Cette concentration est équivalente à celle utilisée
dans le dilueur LDL. Ce résultat suggère que le jaune d’œuf
renferme des éléments antagonistes à l’action des LDL qui
seraient éliminés par le procédé d’extraction des LDL [22].
PACE et GRAHAM [23], ont rapporté que les granules (correspondant au culot compact et jaunâtre, représentant 25%
de la matière sèche du jaune) avaient un effet néfaste sur la
mobilité des spermatozoïdes après le procédé de congélation-décongélation. Ce résultat a également été observé par
WATSON et MARTIN [37] sur les spermatozoïdes de béliers
et par Demianowicz et strezek sur les spermatozoïdes de verrat [11]. La présence de HDL (High Density Lipoproteins)
contenus dans les granules du jaune d’œuf pourrait donc
expliquer le résultat de mobilité obtenu après congélationdécongélation avec l’Optidyl® par rapport aux résultats obtenus ave le dilueur LDL.
La congélation de la semence avec les LDL permet d’avoir
un grand nombre de spermatozoïdes mobiles permettant de
réduire ainsi le nombre de spermatozoïdes par paillettes.
INTÉGRITÉ DE L’ACROSOME ET DE LA MEMBRANE
PLASMIQUE
Immédiatement après l’éjaculation, les spermatozoïdes de
mammifères sont incapables de féconder l’ovocyte. Une
période d’incubation dans l’appareil génital femelle est
indispensable pour acquérir la capacité à féconder : la capa-
Les valeurs correspondent à la moyenne de 22 éjaculats de 11 taureaux. P>0,05 : pas de différence significative après le test du Khi-deux
TABLEAU II. — Evaluation et comparaison de l’intégrité de l’acrosome entre la semence congelée-décongelée
avec le dilueur LDL et le dilueur Optidyl®.
Revue Méd. Vét., 2006, 157, 4, 205-212
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210
BRIAND-AMIRAT (L.) ET COLLABORATEURS
Les valeurs correspondent à la moyenne des résultats du test HOS obtenus sur 22 éjaculats provenant de 11 taureaux. P>0,05 : Aucune différence après le test du Khi-deux.
TABLEAU III. — Effet des dilueurs LDL et Optidyl® sur l’intégrité des membranes plasmiques des spermatozoïdes de taureau après test hypo-osmotique.
Les valeurs représentent la moyenne de résultats obtenus avec 22 éjaculats provenant de 11 taureaux. La différence
significative sur le taux de segmentation obtenue avec le test du Khi-deux (P<0,05) est mentionnée par 2 lettres différentes.
TABLEAU IV. — Comparaison entre les taux de clivage et de blastocystes obtenus après fécondation in vitro avec de la
semence congelée-décongelée avec les dilueurs Optidyl® et LDL.
citation [39]. La fixation à la zone pellucide stimule le
déclenchement de la réaction acrosomique (RA). Cette dernière, du point de vue morphologique est caractérisée par la
fusion progressive de la membrane plasmique avec la membrane acrosomique externe du spermatozoïde. Cela donne
lieu à la formation d’une part, de vésicules membranaires
mixtes et d’autre part de fenestrations au travers desquelles,
le contenu de l’acrosome, des enzymes hydrolytiques indispensables pour la fécondation, est libéré. Les spermatozoïdes
ayant subi une RA spontanée après l’éjaculation ou suite au
procédé de congélation sont incapables de se fixer à la zone
pellucide et par conséquent incapables de féconder l’ovocyte. L’évaluation de l’intégrité de l’acrosome après le processus de congélation-décongélation est donc un paramètre
important à étudier. Pour ce faire, plusieurs lectines peuvent
être utilisées. Ces lectines sont des protéines qui interagissent avec les glycoconjugués de la membrane acrosomique.
Dans cette étude, nous avons utilisé la Pisum sativum agglutinin (PSA) marquée par un fluorochrome, le FITC. Cette
lectine présente une affinité pour l’α-D-glucose et l’α-Dmannose, résidus de glycoprotéines généralement présentes
dans l’acrosome. L’intégrité de l’acrosome est un marqueur
de l’aptitude fonctionnelle du spermatozoïde à féconder.
Notre étude nous a permis de conclure que les spermatozoïdes congelés-décongelés avec les LDL conservaient cette
aptitude à la fécondation.
Le test hypo-osmotique (HOS) a été utilisé pour évaluer
l’intégrité de la membrane plasmique (MP). Le principe de
ce test est simple, en effet, les spermatozoïdes présentant une
queue (flagelle) gonflée après incubation dans une solution
hypo-osmotique sont considérés comme ayant une membrane plasmique intacte : l’eau se déplaçant du milieu hypotonique vers la cellule pour équilibrer l’osmolarité entre le
milieu extracellulaire et les compartiments intracellulaires,
le volume de la cellule se trouve alors augmenté entraînant
une courbure du flagelle [14]. Au microscope optique, ce
phénomène est plus facilement observable au niveau du flagelle qu’au niveau de la tête du spermatozoïde car la MP au
niveau du flagelle semble être moins attachée qu’au niveau
de la tête [15]. Les spermatozoïdes avec une MP lésée ne
présentent aucun gonflement ni courbure au niveau du flagelle [14,15,20,21]. La solution utilisée pour le test doit être
suffisamment hypo-osmotique pour permettre un gonflement de la cellule sans entraîner de lyse. Des études préliminaires ont montré qu’une solution à base de fructose et de
citrate de sodium dans de l’eau distillée (100-150 mOsm/kg
H2O) donnait de bons résultats avec les spermatozoïdes
congelés-décongelés [9,28,29]. Nos résultats ont montré que
le dilueur LDL n’engendrait pas plus de préjudices au niveau
de la membrane plasmique que le dilueur Optidyl®. Chez
l’Homme, les travaux de VAN DER VEN et al. [33] ont
montré une forte corrélation entre le pourcentage de spermatozoïdes gonflés et le pourcentage d’ovocytes de hamster
dénudés fécondés, suggérant ainsi que le test hypo-osmotique pourrait être un indicateur de fertilité chez l’homme
[4]. En effet, des résultats inférieurs à 50 % ont été obtenus
chez des hommes infertiles [7,8]. Cependant, chez les
bovins, l’aptitude du test hypo-osmotique comme outil de
prédiction de la fertilité n’a pas été confirmée [29]. Cette différence spécifique semblerait être due à des différences
d’élasticité membranaire, de perméabilité cellulaire à l’eau,
de volume maximum d’étirement ou de gonflement cellulaire ainsi que de la géométrie cellulaire [10].
FERTILITÉ IN VITRO
L’intérêt premier des techniques de congélation de la
semence est la production d’embryons après insémination
artificielle (IA). Cependant le succès de l’IA, nécessite la
présence d’un nombre suffisant de spermatozoïdes viables et
fertiles au site de fécondation et au moment opportun. Dans
cette étude, la fécondation in vitro a été utilisée comme
moyen rapide d’évaluation de la fertilité de la semence
congelée-décongelée avec le nouveau dilueur LDL.
Néammoins, il est certain qu’une comparaison complète des
deux dilueurs doit passer par l’évaluation des paillettes en
insémination artificielle. Un taux plus élevé de clivage des
embryons a été obtenu avec la semence congelée-décongelée
Revue Méd. Vét., 2006, 157, 4, 205-212
ETUDE DE LA FERTILITÉ IN VITRO DE LA SEMENCE DE TAUREAU
avec le dilueur LDL par rapport au dilueur Optidyl®.
Cependant, en plus d’être lié à l’aptitude des spermatozoïdes
à pénétrer l’ovocyte, le taux de clivage des embryons est fortement corrélé avec la qualité intrinsèque de l’ovocyte mis
en culture [18]. En effet, durant la maturation in vitro, l’ovocyte acquiert la capacité à reprendre la méiose, atteindre la
métaphase II et exclure le globule polaire I. Une maturation
cytoplasmique et nucléaire de l’ovocyte est nécessaire pour
être fécondable. Dans notre étude, nous avons utilisé des
ovocytes provenant de follicules de tailles différentes (> 2
mm). LONERGAN et al. [19] ont montré que les ovocytes
issus de gros follicules avaient un meilleur développement
en culture que ceux issus de petits follicules. Par conséquent,
la distribution aléatoire des ovocytes dans les deux lots pourrait aussi contribuer au résultat obtenu concernant le taux de
clivage. Le taux de blastocystes obtenus dans les deux lots
était quant à lui identique, malgré une différence significative obtenue sur le taux de clivage. Ce résultat pourrait s’expliquer par le fait que certains embryons clivés sont incapables d’assurer un développement embryonnaire et restent
bloqués au stade 8-16 cellules correspondant à la phase de
mise en route du génome embryonnaire [32]. Néammoins,
nos résultats ont montré que notre procédé d’extraction des
LDL n’altérait pas la fertilité in vitro de la semence de taureau après congélation-décongélation.
Conclusion
Après congélation-décongélation de la semence de taureau
dans le dilueur LDL, les taux de mobilité et de clivage ont été
plus élevés que ceux obtenus avec l’Optidyl®. Le taux de
blastocystes quant à lui a été identique avec les deux
dilueurs. L’intégrité de l’acrosome et de la membrane plasmique a été maintenue dans les deux dilueurs. Ce dilueur est
intéressant car il a l’avantage d’être chimiquement défini et
de ne pas interférer avec les observations microscopiques, ce
qui n’est pas le cas de l’Optidyl®. De plus, la congélation de
la semence avec les LDL permettrait de diminuer le nombre
de spermatozoïdes par paillette et d’augmenter ainsi le
nombre de paillettes commercialisables par taureau.
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