HPLC - Master CHIMIE

Analyse par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
de filtres solaires
Larrahondo Maria, Rieb Estelle
Master 2 Professionnel "Chimie Analytique et Instrumentation"
Promotion 2006
La chromatographie est une technique analytique dont les premières expériences, celles de Tswett, datent de 1903. Elle permet la séparation d’un ou
plusieurs composés d’un mélange pour leur identification et leur quantification. La chromatographie en phase liquide est une méthode physico-chimique
basée sur des différences d’interactions. Les molécules des produits à séparer (solutés) sont mises en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit
dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire contenue dans la
colonne chromatographique. Ces interactions provoquent des échanges qui aboutissent à la séparation désirée. La phase mobile poussée par une pompe
sous haute pression, parcourt en permanence le système chromatographique, dont fait partie la colonne.
Les composés en solution se répartissent suivant leur affinité, entre la phase mobile et la phase stationnaire.
Un peu de théorie…
trB
trA
Largeur à
mi-hauteur
« Phase stationnaire polaire et phase mobile apolaire »
t
Temps de rétention r : caractéristique du
constituant et des conditions d’analyse
Surface du pic: fonction de la quantité de
constituant.
Temps de
rétention
R = 1 , 18
chromatographie à polarité de phase normale.
« Phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire »
chromatographie à polarité de phase inverse.
t rB − t rA
d A + d B
Phase
Phase
Phase
Phase
Si R < 1 la résolution est mauvaise
Si 1 < R < 1,5 la résolution est acceptable
Si R > 1,5 la résolution est bonne
Mode isocratique: le mélange de différents solvants ne varie pas au cours de la
séparation
Mode gradient d’élution: variation des pourcentages des solvant au cours de la
séparation
Fig.1 Illustration des paramètres en chromatographie
Appareillage
stationnaire polaire Æ affinité pour les solutés polaires.
stationnaire apolaire Æ affinité pour les solutés apolaires.
mobile polaire Æ entraîne les solutés polaires.
mobile apolaireÆ entraîne les solutés apolaires.
¾Système de pompage : permet d’obtenir un débit stable, et non pulsé.
¾Les deux solvants : sont pompés séparément puis mélangés dans la chambre de mélange.
Dégazeur
¾Le système de dégazage : élimine les bulles qui perturbent la fonctionnement du détecteur (élargissement de pics).
Chambre de mélange
¾Chambre de mélange : le mélange est mis sous pression puis envoyé vers l’injecteur
Pompes
¾Dispositif d’injection de l’échantillon : permet d’introduire l’échantillon en tête de colonne tout en conservant la pression élevée sur
la colonne. Le volume est maîtrisé par une boucle d’injection (20, 50µL...). Une vanne
Rhéodyne est alors basculée manuellement pour lancer l’analyse.
Injecteur automatique
¾Le four : maintient la température de la colonne constante.
Détecteur
¾La colonne : est un tube rempli de phase stationnaire.
(DAD : barrettes de diode)
¾Détecteur à barettes de diodes : permet l'acquisition du spectre de l'échantillon en temps réel, une représentation en 3
dimensions (temps, absorbance, longueur d'onde) et une caractérisation des composés par leur
spectre.
+ colonne thermostatée dans four (de préférence)
Fig.2 Photo d’une chaîne
HPLC Agilent 1100
Application
Une exposition au soleil peut générer des lésions cutanées. La concentration des filtres UV doit être connue pour ne pas dépasser un taux limite autorisé, fixé par différentes législations.Une
procédure de dosage de deux filtres solaires, octocrylène et parsol, a été mise au point par HPLC.
Conditions de séparation de l’octocrylène et du parsol
Système HPLC Agilent 1100
Mode isocratique
Phase mobile eau/acétonitrile (15/85, v/v)
Colonne Waters Nova-Pak C18 3,9 mm id x 75 mm
0,8 ml.min-1
λ = 310 nm détecteur DAD
Échantillon solubilisé dans 60% d’acétonitrile + 40%
d’eau
Octocrylène
O
O
N
2-ethylhexyl 2-cyano-3,3-diphenylacrylate
Chromatogramme d’une crème solaire
Chromatogramme 3D d’une crème solaire
OCTOCRYLENE
PARSOL
Aire
Courbe d'étalonnage
Parsol
yp = 161.24x + 22.184
R2 = 0.9999
4000
3500
3000
Aire
parsol
2000
Linéaire (parsol)
1500
O
O
Linéaire (octocrylène)
1000
500
yo = 69.688x + 12.043
R2 = 0.9999
0
octan-3-yl 3-(4-methoxyphenyl)acrylate
Fig.4 Chromatogramme d’une crème
contenant 13% d’octocrylène et 9%
de parsol.
octocrylène
2500
O
0
5
10
15
20
25
Concentrations µg/ml
Fig.3 Courbe d’étalonnage: témoigne de
la linéarité.
Intervalle: Octocrylène 0,625-15 µg/ml
Parsol 0,825-19,8 µg/ml
Concentration
Octocrylène
Parsol
LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL)
9
29
5
16
Fig.5 Chromatogramme 3D (temps, absorbance,
longueur d’onde)
Tab.1 Limites de détection
(3*Signal/bruit) et de
quantification (10*Signal/bruit)
Prix d'un appareil
AGILENT 1100
La Chromatographie Haute Performance est une méthode particulièrement sélective, linéaire et sensible. Pouvant être couplée avec la plupart des détecteurs (UV,
MASSE, FLUORESCENCE, RMN…), elle s’adapte à une très large gamme de matrices et analytes. L’optimisation est relativement simple. Cependant, plusieurs
paramètres (pH, Phase mobile, Colonne, Température…) peuvent influencer la séparation.
35 126 € TTC