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Biotechnologies & Substances naturelles végétales François BERNIER, Tél. : 03 68 85 18 35, [email protected] Manipulation génétique de processus métaboliques dont les produits ont une importance industrielle, ou qui confèrent des propriétés intéressantes à la plante obtention de produits nouveaux ou améliorés (amidon, glucides, protéines de réserve, vaccins...) élimination de produits néfastes (oxalate, phytate...) obtention de plantes possédant de nouveaux caractères (résistance aux stress abiotiques et biotiques...). Contraintes liées à ces manipulations : expression et régulation des transgènes, transgènes multiples, adressage et stabilité des protéines. BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Biotechnologies & Substances naturelles végétales Laurence GONDET, Tél. : 03 68 85 18 82, [email protected] Culture in vitro de cellules, tissus & organes végétaux Micropropagation de plantes sources de SNV Production de SNV in vitro + TP/TD Mise en place protocole CIV Etudes de cas, analyses de publications BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Biotechnologies & Substances naturelles végétales Jeudi 15/09, 22/09 & 29/09, 14-16h 137H ILB Relations CIV // SNV LG Jeudi 06/10, 14-16h 137H ILB Préparation TP Lundi 10/10 – Vendredi 14/10 & Lundi 14/11 – Vendredi 18/11 Salle 175H, ILB 1er étage Nord 2 journées TP/TD CIV LG Jeudi 03/11, 10/11, 24/11, 01/12 & 08/12 14-16h 137H ILB + 1 créneau à fixer Cours F. Bernier Jeudi 08/12, 16-18h Salle 175H, ILB 1er étage Nord Observations TP LG Examen écrit 4h (12-16/12) Documents autorisés BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV & Substances naturelles végétales Molécule(s) Bioactive(s) Plante source Micropropagation Multiplication Production Culture in vitro BSNV – Master 2 BVP Transgénèse L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux / rappels Culture in vitro (CIV) = ensemble de techniques de multiplication végétative artificielle (reproduction asexuée), permettant de régénérer des plantes entières à partir de fragments de plantes, ou de cellules végétales isolées régénération de plantes identiques à la plante d’origine = clonage végétal ( micropropagation) ( attention : possibilité de variation somaclonale) Travail en conditions stériles + environnement parfaitement contrôlé (Composition du milieu nutritif, température, luminosité) BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux / rappels Divisions cellulaires Elongation cellulaire Croissance = modifications quantitatives Différenciation = Modifications qualitatives Développement Facteurs externes température et lumière Balance hormonale Rapport Aux / CK Dédifférenciation / Redifférenciation La cellule végétale est totipotente Multiplication végétative BSNV – Master 2 BVP Facteurs internes = Hormones Auxines Cytokinines Gibberellines Ethylène Acide abscissique L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux / rappels Auxines + Cytokinines Rhizogénèse sur boutures - Embryogénèse somatique Rhizogénèse sur cals Callogénèse Néoformation de bourgeons Caulogénèse bourgeonnement axillaire - BSNV – Master 2 BVP + L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux / rappels BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Les stratégies / Callogénèse Explant Feuilles AUX = CK CAL Dédifférenciation / Amas de cellules indifférenciées/ Prolifération non structuré Pectinases Cellulases Protoplastes Cellules végétales sans paroi pectocellulosique BSNV – Master 2 BVP Suspensions cellulaires L.Gondet L.Gondet, – 15.09.11 2006 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Les stratégies / Organogénèse AUX >>CK Tige feuillée RHIZOGENESE => racines adventives Bourgeons ORGANOGENESE BOURGEONNEMENT CK>AUX Voie DIRECTE Explant CAL BSNV – Master 2 BVP Voie INDIRECTE L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Les stratégies / embryogénèse somatique Bioréacteurs Germination Semences artificielles Explant Embryons Somatiques EMBRYOGENESE SOMATIQUE Voie DIRECTE CAL BSNV – Master 2 BVP AUX >CK Voie INDIRECTE L.Gondet – 15.09.11 CIV : Les Stratégies de régénération AUX >>CK Tige feuillée RHIZOGENESE => racines adventives Germination Semences artificielles Bourgeons ORGANOGENESE Embryons Somatiques AUX >CK Voie DIRECTE AUX = CK Dédifférenciation / Prolifération Pectinases Cellulases BSNV – Master 2 BVP CK>AUX EMBRYOGENESE SOMATIQUE Explant Feuilles BOURGEONNEMENT CAULOGENESE CAL Voie INDIRECTE Amas de cellules indifférenciées/ non structuré Protoplastes Cellules végétales sans paroi pectocellulosique Suspensions cellulaires L.Gondet – 15.09.11 Explant Cals Bourgeons ⇒Tiges feuillées Racines Embryons somatiques Bourgeons ⇒Tiges feuillées Embryons somatiques Racines Vitroplants BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Les constituants du milieu nutritif : Eau déminéralisée + sels minéraux + hormones + sucre + vitamines +/- agent gélifiant +/- antibiotiques, antifongiques, substances adsorbantes, antioxidantes… BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif • Sels minéraux Macroéléments Azote (N) NH4+, NO3Phosphore (P) H2PO4Potassium (K) K+ Soufre (S) SO4 2Magnésium (Mg) Mg 2+ Calcium (Ca) Ca 2+ Microéléments Chlore (Cl) ClFer (Fe) Fe 2+ Manganèse (Mn) Mn 2+ Zinc (Zn) Zn 2+ Cuivre (Cu) Cu 2+ Bore (B) H3BO3 + Aluminium, Nickel, Iode, Molybdène Milieux les plus courants : -Murashige & Skoog (MS, ou MS ½) -Gamborg (B5) BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Exemple : préparation d’un milieu MS BSNV – Master 2 BVP Catalogue Duchefa L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Exemple : préparation d’un milieu MS BSNV – Master 2 BVP Catalogue Duchefa p.50 L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Exemple : préparation d’un milieu MS BSNV – Master 2 BVP Catalogue Duchefa p.50 L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Exemple : préparation d’un milieu MS + Vitamines BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Exemple : préparation d’un milieu MS + Vitamines BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Exemple : préparation d’un milieu MS + Vitamines BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif Exemple de milieu minéral : Le milieu MS 1/2 BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif • Les phytohormones Auxines ( 0,01 à 10 mg/l) - acide indole 3 acétique (AIA) - acide indole 3 butyrique (AIB) - acide naphtalène acétique (ANA) - acide 2,4 dichlorophenoxyacétique (2,4D) - Dicamba Cytokinines (0,001 à 5 mg/l) - Benzyladénine (BA) = benzylaminopurine (BAP) - Zéatine - Kinétine (KIN) - Thidiazuron (TDZ) Thermostables ? BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Le milieu nutritif BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 Culture in vitro de cellules et tissus végétaux Vue d’ensemble d’un protocole de CIV Eau déminéralisée Milieu basal (sels minéraux +/- vitamines) les plus courants : Murashige & Skoog ( MS, MS1/2 …) Gamborg B5 Hormones ? Sucre Ajuster volume + pH Si thermolabiles !! Agent gélifiant ? Stérilisation (autoclave) ⇒Répartition dans récipients de culture ⇒Température ambiante BSNV – Master 2 BVP Explant Stérilisation L.Gondet – 15.09.11 Mais ça ne marche pas toujours… Plantes récalcitrantes Infections bactériennes et/ou fongiques BSNV – Master 2 BVP Stérilisation trop forte L.Gondet – 15.09.11 CIV & Substances naturelles végétales Molécule(s) Bioactive(s) Plante source Micropropagation Multiplication Production Culture in vitro BSNV – Master 2 BVP Transgénèse L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 Etude de cas / Analyse publication BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 • enjeux du travail Plante ligneuse médicinale endémique du Sud de l’ Himalaya (famille des Pittosporacées) Ecorce propriétés anti-inflammatoires Multiplication par voie sexuée, mais problèmes dus à une efficacité de germination faible et hétérogénéité des populations Mise au point d’un protocole de micropropagation in vitro obtention de clones en grande quantité BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 • Origine et nature des explants Arboretum / Plant Institute of Himalayan environment Fragments de tiges longueur 2 à 2,5 cm, (présence d’1 nœud simple) • Mode de stérilisation 5 min Tween 20 2% + 30 sec éthanol 80% + 8 min HgCl2 0,1% => Rinçages eau stérile BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 • Stratégie de culture in vitro Organogénèse directe: caulogénèse + rhizogénèse BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 1/ Organogénèse testée avec différentes BH • Milieu de base (milieu minéral) Murashige & Skoog (MS) pH 5,8 / Agar 0,8% • Nature des phytohormones Auxine = acide α naphtalène acétique (ANA) Cytokinine = N6 Benzyladénine (BA) BH optimale : BA 5µ µM ANA 0,1 µM • Balance hormonale Différentes BH testées, toujours CK en excédent BA de 1 à 10 µM / ANA de 0 à 0,25 µM / 8x3 explants par traitement Efficacité d’organogénèse quantifiée par : - % d’explants qui donnent des pousses - Nombre et longueur des pousses BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 2/ Organogénèse testée avec différents milieux minéraux avec BH optimale ( BA 5µ µM / ANA 0,1 µM) BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 Bilan : Conditions d’organogénèse directe optimales Milieu minéral = MS Balance hormonale : BA 5 µM / ANA 0,1 µM 4 semaines 25°C Photopériode 16h BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 Rhizogénèse en 2 étapes 5/Rhizogénèse 1 Pousse 2 cm immersion partie basale 48h dans MS ½ ∆ auxine ( IBA, ANA) ∆ Concentration ( 5 à 40 µM) 6/ Rhizogénèse 2 Milieu MS ½ gélosé sans hormones + 4 semaines BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 Rhizogénèse en 2 étapes 5/Rhizogénèse 1 Pousse 2 cm immersion partie basale 48h dans MS ½ ∆ auxine ( IBA, ANA) ∆ Concentration ( 5 à 40 µM) 20 µM 6/ Rhizogénèse 2 Milieu MS ½ gélosé sans hormones + 4 semaines BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.1 7/ transfert ex vitro Arrosage MS ¼ 1 explant 10 plantes matures en 12 semaines BSNV – Master 2 BVP Dhar et al., 2000 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.2 BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.2 Ordre Lamiales Famille Lamiaceae Genre Pogostemon BSNV – Master 2 BVP Paul et al., 2010 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.2 2 semaines MS +2.5 µM BAP +0.5 µM NAA 3 semaines 4 semaines BSNV – Master 2 BVP Paul et al., 2010 2 semaines MS +1 µM GA3 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.2 2 semaines MS ½ sans hormones BSNV – Master 2 BVP Paul et al., 2010 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.2 BSNV – Master 2 BVP Paul et al., 2010 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.2 BSNV – Master 2 BVP Paul et al., 2010 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.3 BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.3 BSNV – Master 2 BVP He et al., 2007 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.3 BSNV – Master 2 BVP He et al., 2007 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.3 BSNV – Master 2 BVP He et al., 2007 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.3 BSNV – Master 2 BVP He et al., 2007 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.4 BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.4 BSNV – Master 2 BVP Singh et al., 2010 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.4 BSNV – Master 2 BVP Singh et al., 2010 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.4 BSNV – Master 2 BVP Singh et al., 2010 L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Embryogénèse somatique 1- Induction : initiation d’un cal embryogène sur un milieu riche en Auxine (2,4-D, 1mg/l) et en Azote 2- Expression : Transfert sur un milieu pauvre en auxine (0,1 mg/l) Problème : efficacité de germination parfois faible Applications : micropropagation rapide, semences artificielles, cryopréservation BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Embryogénèse somatique Waki et al., 2011 BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Embryogénèse somatique Les différents stades de développement des embryons: 2.Heart 4. Cotyledonary 1. Globular 3. Torpedo 1 BSNV – Master 2 BVP 2 4 (Karami et al., 2006 – dos Santos et al., 2006) L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Embryogénèse somatique ⇒ recherche de marqueurs moléculaires liés à l’acquisition du potentiel embryogène gènes Serk ( Somatic Embryogenesis Receptor Kinase) (Schmidt et al., 1997) WUSCHEL ( Zuo et al., 2002), AGL15 (Thakare et al., 2008) BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.5 -Impact nutritionnel (protéines, acides gras polyinsaturés) + potentiel de valorisation non alimentaire : Biocarburants (huile), industries pharmaceutiques et produits phytosanitaires (saponines) Pb : infections virales, et virus présents dans les graines) => possibilité de les éliminer par culture in vitro (+ sélection de variétés résistantes) ? BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.5 Mise au point du protocole d’embryogénèse somatique =>étape 1 : induction de cals embryogènes Graines Stérilisation Rinçages Milieu MS + 2% Saccharose + 2,4-D ( 0,45µ µM ou 2,26 µM) + 0,4 % Agar 25°C, photopériode 16h lumière / 8h obscurité 2 ou 4 semaines Semis sur milieu MS Variations : - type d’explant - concentration en auxine - durée de culture Racines BSNV – Master 2 BVP + 1 semaine Hypocotyles (Eisa et al., 2005) Plantules 3 types d’explants Cotylédons L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.5 Les résultats : Conditions optimales pour la 1ère étape (=> cals embryogènes) Explant : hypocotyle Auxine : 0,45 µM 2,4-D Durée de culture : 4 semaines BSNV – Master 2 BVP (Eisa et al., 2005) L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.5 Mise au point du protocole d’embryogénèse somatique =>étape 2 : développement des embryons somatiques Milieu MS + 2% Saccharose +/- 2,4-D ( 0,45µ µM ) Globular Torpedo Embryogénèse optimale sur milieu sans 2,4-D (aucun embryon avec 0,45 µM 2,4-D !) Plantules 5% de germination BSNV – Master 2 BVP (Eisa et al., 2005) L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.6 - Goyavier du Brésil : Myrtacée cultivée pour ses fruits + plante ornementale BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Ex.6 Explants (embryons zygotiques) 20 µM 2,4-D Embryons Stade Torpedo 0,5 µM BAP 1µM GA3 Bar = 0,125 cm Bar = 0,2 cm Prégermination 0,1 % alginate de sodium Semences artificielles BSNV – Master 2 BVP (Cangahuala-Inocente et al., 2007) L.Gondet – 15.09.11 CIV / Micropropagation / Bilan Embryogénèse somatique - Mécanismes encore mal connus - Importance du 2,4-D dans la phase d’induction - Hétérogénéité des protocoles - Potentiel de culture en milieu liquide (=> bioréacteurs) - Embryons somatiques => semences artificielles - Une des techniques les plus recherchées dans le cadre de stratégies de micropropagation conforme (la plus rapide, et avec le moins de risque de variation somaclonale). BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 15.09.11 CIV & Substances naturelles végétales Molécule(s) Bioactive(s) Plante source Micropropagation Multiplication Production Culture in vitro BSNV – Master 2 BVP Transgénèse L.Gondet – 15.09.11
