Livret des résumés - Arc Espace Chercheurs

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Livret des résumés
Livret des résumés
08h30
Accueil des participants
09h15 - 09h30 Ouverture du colloque
09h30 - 09h45 Etude de la régulation par sumoylation de la biogenèse des mRNPs
et de la stabilité génétique
Hugo BRETES (Institut Jacques Monod)
09h45 - 10h00 Analyse de la signalisation acide rétinoïque dans la leucémie aiguë
promyélocytaire : rôle des interactions protéiques et détermination
des cibles d’aval
Julien ABLAIN (Hôpital Saint-Louis)
10h00 - 10h15 Etude de l’activité anti-vasculaire des agents anti-vasculaires dans des
modèles murins de xénogreffes et du mécanisme d’échappement tumoral
impliquant les progéniteurs endothéliaux circulants
Mélissa TAYLOR MARCHETTI (Institut Gustave Roussy)
12h00 - 12h15
Rôle de WT1, gène suppresseur de la tumeur de Wilms,
dans les neuroblastomes.
Caroline MASSEROT-LUREAU (Centre Universitaire Des Saints-Pères)
12h15 - 12h30
Émergence du concept de «cancer stem cell».
Lucie LAPLANE (Université Paris Ouest)
12h30 - 14h00
14h00 - 14h15
Le rôle de Rpp30 (RNaseP protein 30) dans la formation de piRNAs
et le contrôle d’éléments transposables pendant l’ovogenèse chez
D.melanogaster: une relation inattendue entre les tRNAs et les piRNAs
Anahi MOLLA HERMAN (Institut Curie)
14h15 - 14h30
Plasticité cellulaire et le cancer: le rôle d’une déméthylase histone
lors d’un événement reprogrammation cellulaire et l’identification de
modificateurs
de son activité
Steven ZURYN (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire
et Cellulaire)
14h30 - 14h45
Identification d’une nouvelle voie de signalisation aPKC-Cortactine-MT1MMP requise à l’invasion tumorale dans les cancers du sein
Carine ROSSE (Institut Curie)
10h15 - 10h30 Mécanismes de biogénèse et sécrétion des exosomes
Marina COLOMBO (Institut Curie)
10h30 - 10h45 Rôle de la N-cadherine dans la migration collective, un modèle in vivo
pour l’étude de l’invasion métastatique
Arun KUMAR (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire
et Cellulaire)
10h45 - 11h15 PAUSE CAFÉ
11h15 - 11h30
Etude de la préprocalcitonine, candidat prometteur pour le
développement d’un vaccin thérapeutique dans les cancers bronchiques :
Identification et caractérisation de peptides antigéniques immunogènes
issus de cet antigène
Aurélie DURGEAU (Institut Gustave Roussy)
COCKTAIL DÉJEUNATOIRE
14h45 - 15h00
Identification de nouveaux facteurs angiocrines contrôlant positivement
l’expansion des cellules souches des gliomes
Eva Maria GALAN MOYA (Institut Cochin)
15h00 - 15h15
L’éducation des cellules Natural Killers par le récepteur activateur NKp46
calibre leur réactivité fonctionnelle anti-tumorale et anti-virale.
Emilie NARNI-MANCINELLI (Centre d’Immunologie de Marseille Luminy)
11h30 - 11h45
Analyse des événements génétiques et cellulaires associés à l’oncogénèse
des leucémies aiguës dans un syndrome d’instabilité génétique
constitutionnel, la maladie de Fanconi
Raphael CECCALDI (Hôpital Saint-Louis)
15h15 - 15h30
Isocitrate deshydrogénase et mutation Arg132His : impact pronostique
et sur la réponse à la radio- et chimiothérapie
Marianne LABUSSIERE (Institut du Cerveau et de La Moelle Epinière)
15h30 - 16h00
PAUSE-CAFÉ
11h45 - 12h00
Les Septines sont requises lors de l’établissement de jonction en sortie
de mitose des divisions de cellules épithéliales.
Nabila FOUNOUNOU (Institut de Génétique et Développement
de Rennes)
16h00 - 18h30
1ère session de présentation des posters scientifiques
(Audition par le jury des candidats au Prix Alexandre Joël catégorie Master 2
et au Prix Hélène Starck Catégorie Post-doctorat)
liste des posters
présentés mercredi 24
et jeudi 25 octobre 2012
08h30
ACCUEIL DES PARTICIPANTS
09h30 - 12h00 2 session de présentation des posters scientifiques
(Audition par le jury des candidats au Prix Alexandre Joël catégorie Thèse)
ème
11h00 - 12h30 Echanges Jeunes chercheurs - donateurs autour des articles de vulgarisation
scientifiques (Prix Kerner) et des posters scientifiques
12h30 - 14h00 DÉJEUNER
14h00 - 14h30 Café rencontre Chercheurs - Donateurs
14h30 - 15h00 Conférence du Docteur Pierre-Antoine Defossez (Université Denis Diderot Paris 7)
L’épigénétique : bases conceptuelles, découvertes récentes,
et perspectives pour la thérapie du cancer
15h00 - 16h30 Cérémonie de remise des Prix Jeunes Chercheurs de la Fondation ARC
16h30
COCKTAIL DE CLÔTURE
Prix Alexandre Joël Catégorie Master 2
Facteurs socio-économiques et qualité de la prise en charge thérapeutique
après un diagnostic de cancer du sein
Sophie BROUSSY (Institut Bergonie)
Développement de modèles précliniques de phéochromocytomes/paragangliomes
malins SDHB-dépendants chez la souris
Alexandre BUFFET (Centre de Recherche Cardiovasculaire de l’HEGP)
Elaboration d’un nouveau modèle murin de LMC reproduisant la chronicité
de la pathologie, afin d’évaluer des stratégies thérapeutiques visant à contourner
la faible sensibilité des cellules souches leucémiques aux inhibiteurs de tyrosine kinase
Noémie DE GUNZBURG (Commissariat à l’Energie Atomique)
Prix Alexandre Joël Catégorie Thèse
Rôle de l’hélicase FBH1 dans le maintien de la stabilité du génome
Agathe BACQUIN (Institut Gustave Roussy)
Utilisation de peptides issus des filaments intermédiaires pour le ciblage de nanocapsules
lipidiques contenant du Paclitaxel vers les cellules de glioblastomes (tumeurs cérébrales)
Julien BALZEAU (Centre Hospitalier Universitaire d’Angers)
Rôle d’histones méthyltransférases spécifiques de H3K9 dans la régulation de l’équilibre entre
prolifération et différenciation cellulaire.
Valentine BATTISTI (Université Denis Diderot)
Etude des fonctions des protéines virales de la famille EBNA3 dans l’immortalisation des
lymphocytes B par le virus d’Epstein-Barr
Quentin BAZOT (Ecole Normale Supérieure de Lyon)
liste des posters
Implication fonctionnelle de la protéine adaptatrice Lnk dans les cellules normales
et pathologiques du lignage mégacaryocytaire
Hajer BEN MOUSSA (UFR de Santé Médecine et Biologie Humaine de Paris XIII)
Rôle et mécanisme d’action du ligand ADMP1 et du récepteur Alk1/2 dans la signalisation
BMP au cours du développement de l’embryon d’oursin Paracentrotus lividus
Emmanuel HAILLOT (Station Zoologique)
Rôle de la Poly(ADP-ribose) polymérase-3 (PARP-3) dans la réponse cellulaire aux cassures
double-brin.
Christian BOEHLER (Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg)
Rôle des facteurs NER dans le processus de transcription
Izarn ILTIS (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire)
Le complexe CRL2(LRR-1) E3 ubiquitine-ligase régule la stabilité de HTP-3 afin d’inhiber
la mise en place de la méiose dans les cellules souches germinales chez C. elegans
Julien BURGER (Institut Jacques Monod)
MyD88 participe à la régulation des mécanismes de réparation de l’ADN et favorise la résistance
des cellules tumorales aux agents génotoxiques. MyD88 une nouvelle cible thérapeutique ?
Alain KFOURY (Centre Léon Bérard)
Modifications de la chromatine associées à la sénescence cellulaire
Kévin CONTREPOIS (Commissariat à l’Energie Atomique de Saclay)
Les G-quadruplexes constituent un obstacle pour la réplication et une menace
pour la stabilité du génome
Aurèle PIAZZA (Institut Curie)
Régulation du trafic et de l’activité de la métalloprotéase ADAM10 par les Tétraspanines
à 8 cystéines
Emmanuel DORNIER (Hôpital Paul Brousse)
Rôle des lymphocytes T CD4 régulateurs dans la suppression des réponses immunitaires
anti-tumorales
Arnaud POMMIER (Institut Cochin)
Etude de l’immunité cellulaire T CD4 dirigée contre la télomérase : implications pour
l’immunothérapie antitumorale et l’immunosurveillance des cancers.
Magalie DOSSET (Etablissement Français du Sang)
Contrôle de l’homéostasie protéique par un nouveau complexe du reticulum endoplasmique
Magali RICHARD (Institut de Biologie de l’Ecole Normale Supérieure)
Exploration d’une polythérapie ciblée dans le traitement des rhabdomyosarcomes
Sarah DUMONT (Centre Léon Bérard)
Nouvelles molécules perturbant la vascularisation tumorale: Synthèse, évaluation biologique
et recherche de métabolites d’ analogues de la combrétastatine A-4.
Mohamed Ali SOUSSI (Faculté de Pharmacie de l’Université Paris XI)
Effet anti-angiogénique des inhibiteurs des kinésines Eg5 et Mklp2 : Etude de leur potentiel
anti-tumoral dans des modèles pré-cliniques.
Prisca EXERTIER (Université des Sciences et Technologies de Bordeaux)
Toxines bactériennes ciblant les GTPases Rho et la voie cyclic-AMP : régulation du cytosquelette
d’actine et conséquences sur la perméabilité vasculaire
Caroline STEFANI (Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire)
Rôle des isoformes des membres du pore de transition de perméabilité (PTP) mitochondrial
dans la communication apoptotique entre le réticulum endoplasmique (RE) et la mitochondrie
en réponse au stress RE dans des lignées cancéreuses humaines
Cindy GALLERNE (Faculté de Pharmacie de l’Université Paris XI)
Contrôle de la dynamique de réplication par Chk1 chez les mammifères.
Hervé TECHER (Institut Curie)
liste des posters
Identification des gènes régulés par les produits du gène de fusion TMPRSS2-ERG dans le cancer
de la prostate
Tian TIAN (Institut de Biologie de Lille)
Nouveaux algorithmes d’identification de transcrits chimères dans les données de RNASequencing pour l’amélioration du diagnostic en cancérologie.
Nicolas PHILIPPE (Centre de Recherche en Biochimie Macromoléculaire)
Prix Hélène Starck Catégorie Post-doctorat
La voie de signalisation Notch comme outil pour suivre les cellules souches et leurs lignages
au cours du développement et de la tumorigenèse de la glande mammaire.
Véronica RODILLA (Institut Curie)
Caractérisation des modifications épigénétiques du chromosome X dans les différents types
moléculaires de cancers du sein et de lignées cellulaires de cancers du sein
Ronan CHALIGNÉ (Institut Curie)
Etude de la participation d’une voie alternative de réparation de l’ADN dans les processus
de déméthylation de l’ADN chez l’homme: interconnexions entre les mécanismes de régulation
épigénétique, de réparation de l’ADN et de cancérogenèse
Inga GRIN (Institut Gustave Roussy)
Rôle des altérations du locus PTEN dans l’instabilité génétique du cancer du sein.
Etude par CGH array haute résolution sur puce dédiée.
Natalie JONES (Institut Bergonie)
Recherche et étude des protéines partenaires d’Hsp27 responsables de l’évolution
androgéno-indépendante des cancers de la prostate.
Maria KATSOGIANNOU (Institut Paoli Calmette)
Le ciblage thérapeutique de Clusterin, par l’utilisation de l’antisens OGX-011 augmente,
de manière synergique, l’activité de thérapies ciblées (Acide Zolédronique et inhibiteurs
de Hsp90) dans le traitement des tumeurs osseuses.
François LAMOUREUX (Faculté de Médecine de Nantes)
Validation fonctionnelle d’une nouvelle cible candidate pour le traitement du cancer colorectal :
un possible rôle oncogénique de la MAP3K ZAK
Lydia LARTIGUE (Institut Bergonie)
Étude des voies de tolérance des lésions : introduction d’une lésion unique sur le chromosome
Karel NAIMAN (Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille)
Dynamique et mécano-transduction des intégrines à haute-résolution: Mécanismes cellulaires
de détection de la rigidité des tissues et implication dans la croissance tumorale.
Olivier ROSSIER (Institut Interdisciplinaire de Neurosciences)
Etude de la réparation des adduits encombrants et des pontages interbrins de l’ADN induits
par le stresse oxydant et/ou les agents anti-canéreux. Applications aux mécanismes
de tumorigenèse et de résisatnce aux thérapeutiques anti-cancéreuses.
Ibtissam TALHAOUI (Institut Gustave Roussy)
PRIX ALEXANDRE JOËL - Master 2
Poster
Facteurs socio-économiques et qualité de la prise en charge thérapeutique après
un diagnostic de cancer du sein
BROUSSY Sophie
INSTITUT BERGONIE - BORDEAUX
Dpt Recherche Clinique Information
Financement de la Fondation ARC : Master 2
PRIX ALEXANDRE JOËL
CATÉGORIE MASTER 2
ciés à la non-conformité aux BPC de chirurgie étaient le
stade clinique II ou III (référence (ref) : stadeI; Rapport de
cotes (RC)=2,54;IC95%=1,6-3,9) et l’âge supérieur à
70 ans (ref inférieur 50; RC=1,66;IC95%=1,1-2,7) et à la
non-conformité aux BPC de radiothérapie étaient l’envahissement ganglionnaire (ref= sans envahissement ;
RC=1,45;IC95%=1,1-2,0), de comorbidités (ref= sans
comorbidités ; RC=2,58;IC95%=1,3-5,2) et le grade histopronostique III (ref= grade I; RC=1,85;IC95%=1,2-2,8).
Concernant le statut SE, ni le niveau d’instruction, ni l’ID
n’ont permis d’identifier de population à risque de nonconformité de PEC. Ainis, seuls des facteurs cliniques ont
été identifiés comme associés à la non-conformité; ils sont
donc à prendre en compte pour adapter la PEC. La part de
l’éloignement géographique (distance résidence-centre
de soins) comme le lien entre éloignement et certains
facteurs SE est une approche que nous développerons. ●
L’objectif de l’étude SES-Sein est de mesurer les associations entre facteurs socio-économiques (SE) et qualité de
prise en charge (PEC) thérapeutique du cancer du sein,
plus particulièrement les étapes de chirurgie et radiothérapie. Il s’agit d’une cohorte prospective multicentrique
composée de cas incidents de cancer du sein infiltrant non
invasif diagnostiqués en 2003-4 dans les établissements
publics et privés d’Aquitaine et Poitou-Charentes. La
qualité de la PEC était évaluée selon la conformité des
pratiques aux recommandations de Bonnes Pratiques
Cliniques (BPC) nationales et internationales. Les indicateurs SE utilisés étaient le niveau d’instruction au niveau
individuel et l’indice de défavorisation (ID) de Townsend
au niveau agrégé (constitué de 4 indicateurs : taux de logements surpeuplés, de ménages sans voiture, de chômeurs,
de logements occupés par des non propriétaires). La
méthodologie statistique reposait sur des modèles logistiques. L’étude portait sur 925 patientes. Les facteurs asso-
13
Poster
Développement de modèles précliniques de phéochromocytomes/paragangliomes
malins SDHB-dépendants chez la souris
BUFFET Alexandre
CENTRE DE RECHERCHE CARDIOVASCULAIRE DE L’HEGP - PARIS
INSERM U970 - Equipe Gène Pression Artérielle
Introduction
Les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs rares, développées aux dépens des cellules neuroendocrines du
système nerveux autonome et de la médullosurrénale (on
parle alors de phéochromocytome (PH)). Ils sont une cause
classique d’hypertension artérielle (HTA) secondaire par
leur sécrétion de catécholamines. Environ 30% des cas de
PGL sont génétiquement déterminés et sont causés par
une mutation constitutionnelle dans l’un des 10 gènes de
prédisposition connus. Parmi eux, le gène SDHB est d’intérêt car ses mutations sont responsables de formes malignes
de la maladie et associées à un mauvais pronostic. Cette
propension aux formes agressives des PGL SDHB-dépendants n’a actuellement pas d’explication. L’objectif de ce
projet de recherche est la compréhension des mécanismes
de cancérogenèse impliquant le gène SDHB par l’étude de
modèles animaux.
Description du projet
Initialement, mon équipe d’accueil a généré des modèles
d’inactivation (KO) du gène SDHB chez la souris, pour
avoir un modèle le plus proche possible du PGL malin chez
l’homme. Toutefois, l’inactivation homozygote du gène
SDHB (SDHB -/-) est létale in utero, et les souris ayant
une inactivation hétérozygote du gène SDHB (SDHB +/-)
ne présentent pas de phénotype apparent.
Mon travail a donc consisté en la caractérisation de trois
modèles murins différents :
n tout d’abord, la caractérisation de 64 souris présentant
une inactivation hétérozygote du gène PTEN (PTEN +/-),
modèle pour lequel le développement de PH avait déjà été
décrit. Nous avons retrouvé à l’histologie un PH chez 40
souris PTEN +/- (soit 62,5 %), âgées de 8 à 14 mois. La
prise de pression artérielle à la queue a permis de mettre
14
Poster
Elaboration d’un nouveau modèle murin de LMC reproduisant la chronicité de la pathologie,
afin d’évaluer des stratégies thérapeutiques visant à contourner la faible sensibilité
des cellules souches leucémiques aux inhibiteurs de tyrosine kinase
DE GUNZBURG Noémie
COMMISSARIAT A L’ENERGIE ATOMIQUE - FONTENAY AUX ROSES
Institut des Maladies Emergentes et des Thérapies Innovantes (IMETI)
en évidence une HTA chez des souris de 9 mois porteuses
de PH. Des métastases pulmonaires ont été mises en
évidence chez 4/7 souris PTEN +/-.
n Ensuite, un modèle double transgénique, réalisé par
croisement de cette lignée PTEN +/- avec les souris SDHB
+/- (SDHB +/-, PTEN +/-). 19 souris double transgéniques
ont été explorées. Un PH a été retrouvé dans 14 cas (soit
73,7 %), et des métastases pulmonaires dans 3/9 souris
SDHB +/-, PTEN +/-. Ces souris sont hypertendues dès
l’âge de 7 mois, âge où nous avons retrouvé les premiers
PH dans cette lignée. Les recueils urinaires ont mis en
évidence une sécrétion préférentielle de métanéphrines.
De surcroit, l’immunohistochimie a permise la mise en
évidence d’une perte focale de SDHB dans certains PH de
ces souris.
n Enfin, un modèle d’inactivation conditionnelle du gène
SDHB, généré par croisement de souris SDHB floxées avec
une lignée de souris exprimant la Cre sous contrôle du
promoteur du PSA (Prostate Specific Antigen), qui est actif
dans la médullo-surrénale chez la souris (SDHBlox/-,
PSA-Cre). Les souris explorées n’ont pas présenté de PH
jusqu’à l’âge de 12 mois.
La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome
myéloprolifératif chronique qui se distingue par la présence
dans les cellules leucémiques d’un remaniement génétique
particulier, constitué par la translocation entre les chromosomes 9 et 22, résultant en l’expression de la protéine
de fusion oncogénique BCR-ABL. La prise en charge de
cette pathologie a été révolutionnée par l’arrivée sur le
marché d’un traitement ciblé, représenté par les molécules
de la classe des inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK). Cependant, alors qu’ils ont considérément amélioré le pronostic
de la maladie, les ITK ne permettent pas d’éradiquer
l’ensemble du pool des cellules leucémiques, même chez
les patients répondant le mieux. La problématique actuelle
réside dans l’insensibilité des cellules souches leucémiques
(CSL) aux ITK. Notre projet consiste en la mise en place
d’un nouveau modèle murin de LMC, réalisé par la transplantation syngénique dans des souris irradiées, de cellules
murines préalablement transduites par un vecteur permettant l’expression de la protéine BCR-ABL. Le but de ce
modèle est de reproduire de façon optimale la physiopathologie et l’évolution de la pathologie humaine, afin de
pouvoir réaliser des études in vivo.
Conclusions et perspectives
En conclusion, le développement de ces modèles animaux
de prédisposition au PGL va permettre d’étudier et de
décortiquer les mécanismes moléculaires de tumorigenèse
et de cancérogenèse impliquant le gène SDHB. A terme,
ces modèles permettront de réaliser les essais pré-cliniques essentiels à la mise en place de protocoles thérapeutiques innovants dans le PGL malin, destinés en
particulier aux patients porteurs d’une forme rapidement
évolutive de PGL SDHB-dépendant pour laquelle il n’existe
actuellement aucune solution thérapeutique curative. ●
Plusieurs innovations ont été réalisées en comparaison
avec les modèles existants. La construction lentivirale « SIN
LTV-BCR-ABL », dérivant du virus de l’Immunodéficience
Simienne (SIV) et permettant l’expression de la séquence
BCR-ABL, a tout d’abord été validée in vitro sur des cellules
de la lignée BAF3. L’expression de BCR-ABL a ensuite été
vérifiée dans la population de cellules souches à long terme
de phénotype Lin-Sca+Kit+FLK2-Thy1low, CD45.1, préalablement transduites. Après avoir subi une irradiation
létale, trois groupes de cinq souris de phénotype CD45.2,
dénommés « BCR-ABL 1, 2 et 3 », ont été transplantés avec
des quantités variables de cellules transduites (2 500,
1 000 et 250 respectivement), associées à 500 000 cellules de moelle de soutien (CD45.2). Un quatrième groupe
de cinq souris, a également reçu, après irradiation, 2 500
cellules du même phénotype transduites par un vecteur
témoin « LTV-GFP », associées à 500 000 cellules de
moelle de soutien. Les souris transplantées ont majoritairement vu leur hématopoïèse se reconstituer à J19 pour la
lignée érythrocytaire, à J40 pour la lignée granuleuse et à
J48 pour la lignée plaquettaire. A J76 post transplantation,
les souris n’ont pas encore déclaré de LMC, mais ont
stabilisé la valeur de leur chimérisme CD45.1, à un niveau
corrélé au nombre de cellules CD45.1 transplantées. Il
semble y avoir un avantage prolifératif de bcr-abl dans
notre modèle, puisque le chimérisme CD45.1 est nettement
supérieur dans le groupe « BCR-ABL1 » (20,7%), que dans
le groupe « GFP » (5,3%), alors qu’ils ont reçu le même
nombre de cellules transplantées. L’expression de bcr-abl
dans les souris transplantées a été confirmée chez 8 souris
sur 9 par RT-qPCR.
A l’heure actuelle, la poursuite du suivi des souris est nécessaire, afin de confirmer le fait qu‘elles développeront une
LMC. Cependant, ceci montre déjà l’avantage de ce modèle
par rapport aux modèles antérieurs, de ne pas entrainer
de LMC d’évolution fulgurante après la transplantation.
Des investigations pourront être réalisées sur ces souris,
une fois la pathologie déclarée, pour étudier le mécanisme
de résistance des CSL aux traitements existants, et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques les
contournant. ●
15
PRIX ALEXANDRE JOËL - Thèse
Communication orale
Analyse de la signalisation acide rétinoïque dans la leucémie aiguë promyélocytaire :
rôle des interactions protéiques et détermination des cibles d’aval
ABLAIN Julien
HOPITAL SAINT LOUIS - PARIS
CNRS UMR7212 / INSERM U944
Financement de la Fondation ARC : 4ème année de thèse
protéine PML. Dans les cellules de LAP, PML est séquestrée
par PML/RARA. Le traitement par l’AR ou l’arsenic provoque la reformation de structures organisées par PML
appelées corps nucléaires (CN). L’inactivation ou la perte
de PML dans nos modèles de LAP abroge complètement
l’effet de l’AR sur l’auto-renouvellement des cellules leucémiques et la régression de la maladie.
La leucémie aiguë promyélocytaire (LAP) est initiée par la
translocation chromosomique t(15;17) qui donne lieu à
l’expression de l’oncoprotéine de fusion PML/RARA. Cette
protéine suffit à transformer les progéniteurs hématopoïétiques ex vivo et induit des leucémies chez les souris
transgéniques. La leucémogénèse associe un blocage de
la différenciation et une augmentation de l’auto-renouvellement des cellules leucémiques. Deux agents thérapeutiques ont démontré leur efficacité dans des modèles
précliniques et chez les patients : l’acide rétinoïque (AR)
et l’arsenic. L’AR provoque la différenciation terminale des
blastes leucémiques alors que l’arsenic ne conduit qu’à
une différenciation marginale. En revanche, les deux agents
induisent la dégradation de PML/RARA et permettent une
éradication des cellules initiatrices de leucémie (CIL).
PRIX ALEXANDRE JOËL
CATÉGORIE THÈSE
Communication orale / Poster
Ces données permettent d’établir un nouveau modèle
rendant compte de l’effet thérapeutique de l’AR dans la
LAP. Ainsi, la dégradation de PML/RARA induit la reformation des CN par PML, ce qui cause l’activation de p53.
Ce mécanisme aboutit à une perte de l’auto-renouvellement des cellules leucémiques menant à l’éradication de
la maladie. Nos résultats suggèrent d’une part que la dégradation d’une oncoprotéine peut suffire à éliminer des
cellules tumorales, ce qui ouvre de nouvelles perspectives
thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. D’autre part,
l’activation d’un axe PML/p53 contrôlant l’auto-renouvellement des cellules constitue une piste d’étude pour le
développement de thérapies ciblées visant à éradiquer
spécifiquement les cellules souches cancéreuses. ●
Par une analyse approfondie de l’effet de différents traitements in vivo, ainsi que par des approches d’interférence
ARN ciblant PML/RARA, nous avons montré que l’éradication des CIL est liée à une perte d’auto-renouvellement
due à la dégradation de PML/RARA et non à la différenciation des blastes leucémiques. Nous avons également
identifié une signature transcriptionnelle correspondant à
la perte d’auto-renouvellement provoquée par l’AR. Elle
implique un arrêt de cycle et une activation atypique de
p53 qui présente certaines caractéristiques de la sénescence cellulaire. L’inactivation de p53 par interférence ARN
dans les modèles de LAP ex vivo et in vivo inhibe en effet
la perte d’auto-renouvellement et réduit fortement le bénéfice thérapeutique en réponse à l’AR. Ce phénotype est
confirmé par l’analyse des effets du traitement à l’AR dans
des modèles murins de LAP p53+/+ ou p53-/-.
Publications :
Activation of a PML/p53 axis by therapy-triggered PML/
RARA degradation underlies APL cure
Julien Ablain, Hassane Soihili, Aurélien de Reynies, Saverio
Minucci & Hugues de Thé (soumis, en révision)
Uncoupling RARA transcriptional activation and degradation elucidates the bases of a leukaemia therapy
Julien Ablain, Magdalena Leiva, Laurent Peres & Hugues
de Thé (soumis, en révision)
Enfin, nous avons observé que l’activation de p53 et l’éradication des CIL par l’AR dépend de la présence de la
17
Communication orale
Communication orale
Etude de la régulation par sumoylation de la biogenèse des mRNPs et de la stabilité
génétique.
Analyse des événements génétiques et cellulaires associés à l’oncogénèse des leucémies
aiguës dans un syndrome d’instabilité génétique constitutionnel, la maladie de Fanconi
BRETES Hugo
CECCALDI Raphael
INSTITUT JACQUES MONOD - PARIS
UMR 7592 CNRS - Equipe Pores nucléaires : Transport et cycle cellulaire.
HOPITAL SAINT LOUIS - PARIS
Inserm U944 - Laboratoire d’hématologie APHP
Financement de la Fondation ARC : 2ème et 3ème années de thèse
avons mis en évidence que seule la sous-unité Hpr1 est
SUMOylée. L’analyse de la SUMOylation de cette protéine
dans un mutant d’Ulp1 révèle que cette enzyme régule la
déSUMOylation de Hpr1. D’autre part, l’identification des
résidus SUMOylés de Hpr1 nous a permis de montrer que
cet événement de SUMOylation du complexe THO régule
son association sur les mRNPs.
Au cours de la transcription, plusieurs facteurs sont assemblés sur les ARN messagers (ARNm) pour former les Ribonucléoparticules de messagers (mRNPs), et contrôler leur
maturation, leur stabilité et leur devenir dans le cytoplasme.
Afin d’assurer la production de protéines fonctionnelles,
la cellule dispose de plusieurs mécanismes de régulation
et de contrôle de qualité assurant la fidélité de l’information
génétique transmise au niveau ARNm et protéine.
Pour étudier l’impact de cette SUMOylation sur les fonctions connues du complexe THO, nous avons analysé les
conséquences d’un défaut de SUMOylation de ce complexe
sur l’export des ARNm, et sur l’expression génique à l’aide
de gènes rapporteurs LacZ. Nous avons pu montrer que
des mutants affectant la SUMOylation de Hpr1 perturbent
l’expression de ces rapporteurs sans affecter l’export des
ARNm. De manière intéressante, les défauts d’expression
de ces gènes LacZ observés dans des mutants inactivant
le complexe THO ou affectant sa SUMOylation sont moins
importants lorsqu’ils possèdent un intron, expliquant les
phénotypes d’export d’ARN non épissés préalablement
mis en évidence dans des mutants d’Ulp1.
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la SUMO-protéase Ulp1 a été impliquée dans un contrôle de qualité
prévenant l’export d’ARN non épissés vers le cytoplasme,
suggérant que ce processus pourrait être contrôlé par la
modification post-traductionnelle par le polypeptide
SUMO d’un ou de plusieurs effecteurs au sein des mRNPs.
Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous avons
mis en place un crible protéomique visant à identifier les
protéines dont l’association sur les mRNPs dépend d’Ulp1.
Dans ce but, nous avons purifié les mRNPs de cellules
sauvages et mutées pour Ulp1, puis nous avons analysé
leur contenu en protéines par spectrométrie de masse.
Ces données mettent donc en évidence un nouveau mécanisme dans lequel des protéines des NPCs régulent l’expression génique en contrôlant Ulp1, et caractérisent pour
la première fois un rôle de la SUMOylation dans le contrôle
de l’assemblage des mRNPs, et potentiellement, de la
stabilité du génome et de son expression. ●
Cette approche nous a permis de mettre en évidence une
diminution du recrutement des sous-unités du complexe
THO sur les mRNPs de cellules mutantes pour Ulp1. Ce
complexe est connu pour permettre l’assemblage de
mRNPs compétentes pour l’export, favoriser la transcription, et prévenir l’instabilité génétique en empêchant la
formation d’hybrides ADN matrice – ARNm (dénommés
R-loops). Grâce à plusieurs analyses biochimiques, nous
avons montré qu’une perte de fonction d’Ulp1 entraine un
défaut de recrutement du complexe THO sur plusieurs
ARNm, sans affecter l’intégrité du complexe ou la stabilité
de ses différentes sous-unités. Pour comprendre comment
Ulp1 régule l’association du complexe THO sur les mRNPs,
nous avons procédé à une recherche de formes SUMOylées
pour chacune des sous-unités du complexe THO, et nous
Publications :
Nuclear pore-associated proteins control mRNP
metabolism
through sumoylation of the THO complex.
Hugo BRETES, Thibaut LEGER, Marlene OEFFINGER, Valérie DOYE and Benoit PALANCADE.
(Publication soumise)
18
B- We then investigate the BMF pathogenesis in FA. We
found that CD34+ counts and in vitro clonogenic activity
were significantly lower in FA patients compared to donors.
As FA cells have a constitutive DNA repair defect, we investigated the cellular response to DNA damage. We found
that FA cells had a strong activation of p53 and p21, leading
to a delayed G0/G1 cell-cycle arrest after resolution of the
G2 checkpoint. ShRNA-mediated knockdown of p53 or p21
in hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) from FA
patients rescued in vitro clonogenic ability. Moreover, we
lentivirally knocked-down the FANCD2 gene in normal
CD34+ cord-blood cells and xeno-transplanted these FAlike cells into immunodeficient NSG mice. Strikingly, simultaneous knock-down of p53 using a tandem FANCD2-TP53
shRNA dramatically improved the engraftment capacities
into NSG mice when compared to FANCD2 shRNA controls.
Finally, analysis of fresh cells from FA patients and healthy
donors showed that FA HSPCs strongly expressed the p21/
CDKN1A gene and a signature of G0/G1 cell cycle arrest.
Altogether, these results identify an exacerbated p53/
p21-mediated G0/G1 cell cycle arrest in response to replicative stress and unresolved DNA damage as a central
mechanism of BMF in FA patients.
Fanconi anemia (FA) is a genetic condition characterized
by congenital abnormalities, chromosome fragility, bone
marrow failure (BMF) during childhood, and cancer susceptibility. FA patients experience a high risk to develop
myelodysplasia (MDS) and acute myeloid leukemia
(AML). FA cells harbor typical cellular features: a high level
of chromosomal breaks, a massive G2 checkpoint arrest,
and an excess of cell death. The combined background of
genomic instability and hypoplastic bone marrow contributes to the development of an overt MDS or AML. This
study was based on the cohort of FA patients referred at
Saint-Louis Hospitals, French Reference Center for Constitutional Bone Marrow Failure.
A- During the first part of my work, we observed that a
fraction of FA patients has acquired an abrogation of the
G2 checkpoint arrest, defining a new clonal phenotype,
that is “checkpoint attenuation”. We hypothesized that
(1) the ATR-CHK1-p53 checkpoint pathways could be
involved in this phenotype, and (2) attenuation of this
checkpoint pathway allows the cells to overcome the cell
cycle arrest and related cell death. We indeed found that
the attenuated cells expressed lower levels of the checkpoint proteins CHK1 and p53 than “classical” FA cells, and
that this correlated with the strong expression of a microRNA targeting CHK1 expression, namely miR-15a. Attenuation was recapitulated using siRNA and chemical
inhibitors. Moreover, CHK1 inhibition protected FA cells
from cell death, consistently with a survival advantage
conferred by the checkpoint abrogation. FA attenuated
patients had milder bone marrow deficiency, but several
of them developed MDS/AML. Purified MDS/AML cells
expressed CHK2 but low levels of CHK1, suggesting that
attenuation also contributed to tumor progression. The
acquired deregulation of the DNA damage response here
identified in FA, has implications for bone marrow oncogenic progression, with probable relevance in MDS/AML
in general.
Altogether, our results gave important new understanding
in physiopathogenic mechanisms of bone marrow failure
and tumor progression in FA. They are shown in Ceccaldi
et al., JCI 2011 and in Ceccaldi et al., cell Stem Cell 2012. ●
Publications :
Article I : Quentin S, Cuccuini W, Ceccaldi R, Nibourel O,
Pondarre C, Pagès MP, Vasquez N, Dubois d’Enghien C,
Larghero J, Peffault de Latour R, Rocha V, Dalle JH, Schneider P, Michallet M, Michel G, Baruchel A, Sigaux F, Gluckman E, Leblanc T, Stoppa-Lyonnet D, Preudhomme C, Socié
G, Soulier J. Myelodysplasia and leukemia of Fanconi
anemia are associated with a specific pattern of genomic
abnormalities that includes cryptic RUNX1/AML1 lesions.
Blood. 2011 Apr 14;117(15):e161-70.
19
Communication orale
JM, Regairaz M, Pla M, Vasquez N, Zhang QS, Pondarre
C, Peffault de Latour R, Gluckman E, Cavazzana-Calvo M,
Leblanc T, Larghero J, Grompe M, Socié G, D’Andrea AD,
Soulier J. Bone marrow failure in Fanconi anemia is triggered by an exacerbated p53/p21 DNA damage response
that impairs hematopoietic stem and progenitor cells. Cell
Stem Cell. 2012, Jun 7.
Article II : Ceccaldi R, Briot D, Larghero J, Vasquez N,
Dubois d’Enghien C, Chamousset D, Noguera ME, Waisfisz
Q, Hermine O, Pondarre C, Leblanc T, Gluckman E, Joenje
H, Stoppa-Lyonnet D, Socié G, Soulier J. Spontaneous
abrogation of the G2 DNA damage checkpoint has clinical
benefits but promotes leukemogenesis in Fanconi anemia
patients. J Clin Invest. 2011 Jan 4;121(1):184-94.
Article III : Ceccaldi R, Parmar K, Mouly E, Delord M, Kim
Mécanismes de biogénèse et sécrétion des exosomes
COLOMBO Marina
INSTITUT CURIE - PARIS
INSERM U 932 - Unité Immunité Cancer
STAM and TSG101 induced a decrease, knock-down of
ALIX, CHMP4C, VTA1 and VPS4B caused an increase in
the amount of secreted exosomes as compared to the
control. Protein quantification and western blotting performed on exosomes purified by ultracentrifugation revealed that silencing of ALIX induced an increase in the
MHC class II content in the exosomes, rather than of their
total amount. Immuno-electron microscopy analysis indicated that vesicles released by ALIX KD cells were larger
in size, and showed increased labeling for MHC class II as
compared to the control, and that MVBs from ALIX KD
cells accumulate MHC II molecules.
Exosomes correspond to the small intraluminal vesicles
(ILVs) of endosomal compartments called multivesicular
bodies (MVBs), which are formed by inward budding of
the endosomal limiting membrane. The molecular mechanisms involved in the formation of ILVs are still poorly
understood in eukaryotic cells: several mechanisms have
been described, dependent or not on the ESCRT machinery,
a family of four protein complexes that have been involved
in cargo sorting and MVB biogenesis.
The aim of this study is to assess the involvement of the
different ESCRT proteins in exosome biogenesis in HeLaCIITA cells. A medium-throughput screening was performed using a FACS-based assay, which allows relative
quantification of CD63- and MHC class II-bearing exosomes in the supernatant of cells treated with small-interfering RNA. shRNA to seven of these proteins were shown
to affect exosome secretion: whereas knock-down of HRS,
20
These observations reveal ALIX as a candidate involved
in MHC II sorting and exosome biogenesis, which could
be of potential use as a means to increase immunogenicity
of vesicles secreted by antigen-presenting cells. ●
21
Communication orale
Etude de la préprocalcitonine, candidat prometteur pour le développement d’un vaccin
thérapeutique dans les cancers bronchiques : Identification et caractérisation de peptides
antigéniques immunogènes issus de cet antigène
DURGEAU Aurélie
INSTITUT GUSTAVE ROUSSY - VILLEJUIF
Unité INSERM U753 - Immunologie des tumeurs Humaines : interactions effecteurs cytotoxiques - système
tumoral
cellules tumorales pour échapper au système immunitaire,
entraine la présentation de peptides antigéniques, tel que
ppCT16-25, issus de séquences signal et apprêtés par la
voie SP-SPP. Au contraire, le rétablissement de l’expression
de TAP permet la présentation d’épitopes apprêtés par la
voie conventionnelle protéasomes-TAP. Ainsi, mes résultats révèlent une compétition entre les deux voies d’apprêtement qui est directement régulée par le niveau
d’expression de TAP. Mes résultats ont indiqué aussi que
les épitopes issus des séquences signal correspondent à
une alternative de choix utilisée par le système immunitaire
pour éliminer les tumeurs ayant perdu TAP et contourner
ainsi ce mécanisme d’échappement tumoral (Durgeau et
al, J Immunol 2011).
Les thérapies anti-cancéreuses nécessitent aujourd’hui
des approches plus ciblées dont le but est d’éliminer les
cellules cancéreuses sans altérer les tissus normaux. Les
approches basées sur une vaccination peptidique suscitent
un intérêt croissant, en stimulant activement le système
immunitaire de l’hôte, afin d’activer spécifiquement les
lymphocytes T cytotoxiques (CTL) contre la tumeur. Ainsi,
différents vaccins thérapeutiques ont été développés dans
les cancers de poumon, néanmoins, les succès de ces
essais restent limités. Les limites majeures de ces approches résident dans la faible immunogénicité des peptides tumoraux utilisés, le faible nombre des précurseurs
T spécifiques et la résistance des cellules tumorales aux
CTL. Nos travaux antérieurs, fondés sur l’établissement
de lignées tumorales et de clones CTL autologues dans les
cancers bronchiques, nous ont permis d’identifier un Ag
tumoral, la préprocalcitonine (ppCT) qui est surexprimé
dans plusieurs carcinomes bronchiques et les carcinomes
médullaires de la thyroïde (MTC) faisant ainsi de cet l’Ag
un candidat prometteur en immunothérapie. Nous avons
identifié un peptide antigénique (ppCT16-25) issu de la
région C-terminale du peptide signal de ppCT, reconnu
par un clone T cytotoxique. Il est apprêté de manière indépendante de la voie classique protéasomes-TAP par un
nouveau mécanisme impliquant deux protéases différentes, la signal peptidase (SP) et la signal peptide peptidase (SPP).
J’ai ensuite étudié l’immunogénicité de la ppCT chez des
patients HLA-A2 atteints de cancers bronchiques. Mes
résultats ont confirmé le pouvoir immunogène de la ppCT
et m’ont permise d’identifier plusieurs peptides de 15 ou
10 acides aminés susceptibles d’induire une activation des
lymphocytes T CD8. Notre objectif à plus long terme est
de développer une approche vaccinale multiépitopique
fondée sur la ppCT qui permettrait d’éliminer les cellules
tumorales qui ont modulé ou non les molécules TAP. En
effet, une réponse polyépitopique aurait l’avantage d’augmenter les chances d’éradiquer la tumeur et de diminuer
les risques d’émergence de variants tumoraux ayant perdu
une molécule HLA ou une sous-unité TAP. ●
Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la régulation
de ces deux voies d’apprêtement des Ag et à l’influence
de l’altération de la voie protéasomes-TAP sur le répertoire
antigénique présenté à la surface des cellules tumorales.
Mes résultats ont montré que le niveau d’expression des
transporteurs TAP détermine la voie d’apprêtement des
Ag et par conséquent influence la nature des peptides
antigéniques présentés aux lymphocytes T CD8. En effet,
la modulation des molécules TAP, souvent utilisée par les
Publications :
Durgeau, A., El Hage, F., Vergnon, I., Validire, P., de Montpreville, V., Besse, B., Soria, J.C., van Hall, T., and MamiChouaib, F. (2011). Different expression levels of the TAP
peptide transporter lead to recognition of different antigenic peptides by tumor-specific CTL. J Immunol 187,
5532-5539.
22
Communication orale
Les Septines sont requises lors de l’établissement de jonction en sortie de mitose
des divisions de cellules épithéliales.
FOUNOUNOU Nabila
INSTITUT DE GENETIQUE ET DEVELOPPEMENT DE RENNES - RENNES
UMR 6290 - Laboratoire « Polarité cellulaire, trafic membranaire et signalisation »
cours de la mitose en préservant la polarité jusqu’au rétablissement des jonctions adhérentes. Afin de vérifier cette
hypothèse j’ai d’abord caractérisé l’établissement de
jonction et la dynamique de l’appareil contractile lors de
ces divisions, en utilisant différents marqueurs. L’analyse
dans les cellules contrôle montre que la Myosine::RFP se
concentre au sillon de division lors de la cytodiérèse, la
Cadhérine::GFP (Ecad::GFP) révèle une diminution du
marquage au niveau du sillon de division. D’autre part les
molécules Ecad::EosFP photo-converties au niveau du futur
sillon de division (avant l’ingression) forment la nouvelle
jonction. Ces données suggèrent un remodelage localisé
de la jonction permettant le repliement de la membrane
et l’interaction en trans des molécules de Ecad dans la
cellule en mitose. En comparaison avec les cellules mutantes pour une des septines, la Myosine est moins restreinte au sillon de division et la vitesse de contraction est
ralentie. De plus Ecad apparaît plus concentrée au sillon
de division pendant la contraction. À la fin de la contraction,
le cortex apical est relâché sans établissement d’une
nouvelle jonction. En résumé, nos résultats permettent
d’expliquer les données contradictoires de la littérature
sur le rôle des Septines dans la cytodiérèse, et pointent
vers un rôle des Septines en plateforme organisatrice de
la contraction localisée et restreinte. Nous avons également
décri l’établissement en sortie de mitose des jonctions
adhérentes in vivo, proposant un modèle de remodelage
de jonction localisé au niveau du sillon de division. ●
La division cellulaire asymétrique est un processus important pour la génération de la diversité cellulaire. Dans le
but d’identifier de nouveaux régulateurs de ces divisions,
un crible génétique a été réalisé au laboratoire, en combinant les outils génétiques de l’organisme modèle drosophile avec des techniques de pointe de biologie cellulaire.
Nous avons identifié les septines comme régulateurs
potentiels des divisions asymétriques. Les septines sont
des petites GTPases très conservées, qui fonctionnent en
complexe et qui sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires comme la cytodiérèse ou la polarité
cellulaire. Nos hypothèses portaient sur l’éventuel rôle des
septines lors des divisions asymétriques des organes
mécanosensoriels en affectant la polarité ou la ségrégation
des déterminants d’identité. Pour tester ces hypothèses,
j’ai analysé par microscopie confocale sur animal vivant
la dynamique de Sep2::GFP ainsi que les divisions asymétriques grâce à un rapporteur de localisation de déterminant d’identité. Les résultats majeurs de cette analyse
montrent que les Septines Pnut, Sep2 et Sep5 fonctionnent
en complexe et qu’elles sont requises lors des divisions
planaires (au sein d’un épithélium) et non durant les divisions orthogonales (les cellules qui délaminent de l’épithélium). Ce défaut est spécifique des Septines car il n’est
pas observé dans des organes mutants pour la formine
Diaphanous caractérisée pour son rôle dans la cytodiérèse.
En effet, sa perte de fonction induit un défaut de cytodiérèse
quelle que soit l’orientation de la division. Contrairement
aux divisions orthogonales, les divisions au sein d’un épithélium monocouche sont contraintes de rétablir des
jonctions adhérentes en sortie de mitose. D’après nos résultats et ceux d’autres équipes, nous avons émis l’hypothèse
que les Septines garantissent l’intégrité de l’épithélium au
Publications :
Tissue polarity: PCP inheritance ensured by selective mitotic endocytosis.
Founounou N, Le Borgne R. (Curr Biol. 2011)
23
Communication orale
Rôle de la N-cadherine dans la migration collective, un modèle in vivo pour l’étude de
l’invasion métastatique
Communication orale
Émergence du concept de « cancer stem cell ».
LAPLANE Lucie
KUMAR Arun
INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE - ILLKIRCH
CNRS UMR 7104 - INSERM U 964 -Department of Development & stems cells
leading and promoting the movement of glia as collective
and that homeostatic interaction ensure that glial cells do
not leave the chain and migrate together. In this context,
the project aims at looking into underlying molecular
pathway involved in the migration and one such example
is Cadherins, a cell adhesion molecule. Our recent findings
show that N-cadherin (N-cad) is expressed in glial cells
of the developing wings. We use conditional gain and loss
of function condition as well as time lapse in the whole
organism and show that N-cad affects collective glial cell
migration efficiency.
Cadherins (cad) are transmembrane glycoproteins that
mediate Ca++-dependent cell–cell adhesion and classic
cad including E-cad and N-cad are involved in various
developmental and morphogenetic processes. Cadherins
comprise an extracellular domain, a transmembrane domain and a highly conserved cytoplasmic domain interacting with catenins and other cytoskeleton molecules). The
extracellular cad domain is intimately involved in homophilic interactions between cells. Cell migration is an essential component of metastatic dissemination of tumor
cells from the primary tumors to the local and distant sites.
In addition to E-cadherin loss in cancer cell progression,
one of the mammalian N-cadherins is upregulated in the
invasive migrating cells in breast, prostate cancer or in
melanoma. Despite major efforts, we still lack detailed
insight into how cancer cells actually migrate out of primary
tumors and invade neighboring tissues; however, the
importance of collective processes and cell adhesion is
now recognized. We use genetic approaches at cellular
resolution to dissect the collective migration process in
vivo. Glia in the Drosophila developing wing provide an
excellent tool to study collective migration in vivo and we
have used genetic approaches at cellular resolution to
dissect the bases of this process. Our previous studies
have shown that glial chain front plays a crucial role in
Further, combining knowledge on cellular interactions and
molecular pathways regulating cell motility opens broader
perspective for coordinated cell migration. Therefore, investigating migratory events in more detail will be valuable
for cancer research and if confirmed, even more so from
clinical oncology perspective. ●
Publications :
Sara Berzsenyi, Arun Kumar, and Angela Giangrande
(2011). Homeostatic Interactions at the Front of Migration
Control the Integrity and the Efficiency of a Migratory Glial
Chain. J. Neurosci, 2011 Sep 28; 31(39): 13722-7.
24
UNIVERSITE PARIS OUEST - PARIS
Laboratoire IREPH-DIPSA, Département de Philosophie
INTRODUCTION. On considère les cellules souches
comme des « entités » stables. Mais cette conception a
été critiquée par certains biologistes qui jugent qu’il ne
s’agit là que d’un « état », transitoire, dépendant du microenvironnement, susceptible d’être induit. L’objectif de ma
recherche est de montrer que la résolution de cette controverse est primordiale pour la production de thérapies contre
les cancers. L’importance de cette question provient de la
découverte récente des cellules souches cancéreuses
(CSC). Ces cellules cancéreuses, porteuses de la propriété
souche, seraient les seules capables d’initier et de maintenir
le développement des cancers. Depuis la découverte des
CSC, une nouvelle stratégie thérapeutique a émergé. Cette
stratégie consiste à éliminer spécifiquement les CSC et
repose sur l’idée qu’en l’absence de ces cellules les cancers
dégénèreront et disparaitront. Ma recherche montre que
cette stratégie thérapeutique n’est valable que si les cellules
souches (et donc les CSC) sont des « entités » stables.
D’autres stratégies thérapeutiques doivent être développées si la propriété souche qualifie un « état » cellulaire.
l’acquisition de la propriété souche est possible in vivo.
Enfin, l’issue de la controverse sur l’origine des CSC a
démontré que les CSC pouvaient provenir de cellules nonsouches. Nous montrons également que d’autres stratégies
thérapeutiques sont envisageables pour lutter contre les
CSC et l’induction potentielle de la propriété souche, telles
que des thérapies différenciatrices ou des thérapies ciblant
les facteurs susceptibles d’induire la propriété souche.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES. Il paraît urgent, pour
le développement de thérapies contre les cancers adéquates et efficaces, de résoudre le problème de la nature
des cellules souches (« entité » ou « état »). En effet, si la
cellule souche désigne un « état » cellulaire possible, il faut
alors déterminer : (1) de quel type d’état il s’agit et (2) sur
quels facteurs/relations repose l’émergence de cet état.
En revanche, si les cellules souches sont des entités stables,
d’autres questions doivent être résolues : (1) Comment
cibler les CSC si ce sont des populations hétérogènes de
cellules ? (2) Comment éviter les effets secondaires « on
target » ? Les nanovecteurs semblent offrir une solution
élégante mais la toxicité de leur dégradation reste inconnue ; et enfin, (3) Comment évaluer ces nouvelles thérapies
qui ne détruiront d’abord qu’un très petit nombre de
cellules ? ●
DESCRIPTION DU PROJET. La stratégie thérapeutique
qui a été proposée par les partisans des CSC suggère
d’abandonner les stratégies classiques consistant à éliminer la masse tumorale (évaluation RECIST) au profit d’une
thérapie ciblée sur les CSC. Nous montrons que cette
dernière stratégie repose sur une vision des CSC comme
« entité » et non comme « état ». En effet, si les partisans
de la vision de « l’état » devaient avoir raison, alors la
propriété souche serait susceptible d’être acquise par des
cellules cancéreuses non-souches et la stratégie thérapeutique anti-CSC mènerait à une impasse. Or, nous avons
relevé un nombre croissant de données en faveur de l’hypothèse de « l’état », particulièrement crédible dans le cas
des cancers. D’une part, les données en faveur de l’hypothèse de « l’entité » sont remises en question par le système
expérimental (cytométrie en flux et lignées de souris immunodéficientes). D’autre part, des données montrent que
Publications :
- Laplane L. (2009) « Cellule souche cancéreuse : réflexions
épistémologiques ». Sociétés 3(105) : 45-55.
- Laplane L. (2011) « Stem Cells and the Temporal Boundaries of Development: Toward a Species-Dependent
View. » Biological Theory, 6(1): 48-58.
- Pradeu T, Laplane L, Morange M, Nicoglou A and Vervoort
M. (2011) « The Boundaries of development ». Biological
Theory 6(1): 1-3.
- Laplane L. (2011) « Le mystère de la genèse des individus ».
Critique, 764-765 : 143-152.
25
Communication orale
Rôle de WT1, gène suppresseur de la tumeur de Wilms, dans les neuroblastomes.
MASSEROT-LUREAU Caroline
CENTRE UNIVERSITAIRE DES SAINTS-PERES - PARIS
INSERM UMR-S 1007- Homéostasie Cellulaire et Cancer : reprogrammation des réponses biologiques et
thérapies alternatives
Financement de la Fondation ARC : 1ère à 3ème années de thèse
Situation du projet : Le Neuroblastome est la tumeur solide
extra crânienne la plus fréquente chez l’enfant de moins
de 5 ans. Il s’agit d’une tumeur embryonnaire ayant pour
origine le système nerveux sympathique. L’amplification
de l’oncogène N-Myc, qui est retrouvée dans environ 25%
des neuroblastomes, est un facteur de mauvais pronostic
clairement établi puisqu’elle est présente dans des tumeurs
plus agressives, disséminantes, avec des taux de survie
inférieurs à 10% à 3 ans. Les mécanismes par lequels
l’oncogène N-Myc conduit à cette agressivité ne sont pas
encore bien identifiés.
roblastomes et notamment de savoir s’il pourrait être impliqué dans les voies de signalisation de N-Myc.
Résultats : 1) Nous avons montré, dans des lignées cellulaires de neuroblastomes et des échantillons tumoraux de
patients, une corrélation inverse entre, d’une part, l’amplification et l’expression de l’oncogène N-Myc et d’autre
part, l’expression de WT1: les tumeurs avec amplification
de N-Myc n’expriment pas WT1 alors les tumeurs N-Myc
non amplifié l’expriment plus fortement; 2) la diminution
de l’expression de WT1 par ARN interférence ne modifie
pas l’expression de N-Myc mais induit une augmentation
de l’expression de hTERT associée à une prolifération
cellulaire accrue.
WT1 code un facteur de transcription à doigt de zinc qui
joue un rôle fondamental dans le développement du rein.
Sa délétion a été décrite pour la première fois dans les
tumeurs de Wilms (tumeurs rénales de l’enfant). Cependant le rôle de WT1 dans développement tumoral varie en
fonction des modèles cellulaires ; il peut avoir un rôle
d’oncogène ou au contraire agir comme un gène suppresseur de tumeur. Des données récentes semblent montrer
que WT1 serait fortement exprimé dans des neuroblastomes plus différenciés donc moins agressifs. L’objectif de
notre travail est d’évaluer quel est son rôle dans les neu-
Conclusion : Nous montrons ainsi que WT1, dont la forte
expression est associée à l’absence d’amplification de NMyc et à une moins forte agressivité tumorale, pourrait
jouer un rôle suppresseur de tumeurs dans les neuroblastomes en inhibant la télomérase et la prolifération cellulaire.
Si WT1 ne semble pas moduler l’expression de N-Myc, un
des mécanismes permettant d’expliquer l’agressivité des
tumeurs N-Myc amplifié et qu’il nous reste à démontrer
pourrait donc être lié à l’inhibition de WT1 par N-Myc. ●
26
Communication orale
Etude de l’activité anti-vasculaire des agents anti-vasculaires dans des modèles murins
de xénogreffes et du mécanisme d’échappement tumoral impliquant les progéniteurs
endothéliaux circulants
TAYLOR MARCHETTI Mélissa
Inserm U981 -Biologie des Cellules Circulantes, Laboratoire de Recherche Translationnlle
patients were remarkably consistent with our pre-clinical
data, evidencing a new mechanism that should be targeted
to improve VDA-based strategies. ●
The concept that immediate mobilization of bone marrowderived circulating endothelial progenitor cells (CEPs) is
a key mechanism mediating tumor resistance to vascular
disrupting agents (VDAs) has prevailed until now. Here,
we demonstrate that administration of VDA to tumorbearing mice induces two distinct peaks in CEPs: an early,
unspecific CEP efflux after drug administration followed
by a never-before-documented late yet more dramatic
tumor-specific CEP burst which exclusively infiltrated
tumors and incorporated neovessels in response to tumor
hypoxia. Combined anti-angiogenic drugs could not disrupt
the early peak but completely abrogated the late VDAinduced CEP burst, blunted bone-marrow-derived cell
recruitment to tumors and resulted in striking antitumor
efficacy, indicating that the late CEP burst was the actual
source of tumor recovery after VDA therapy. CEP and
circulating endothelial cell kinetics in VDA-treated cancer
Publications :
Reversing resistance to vascular disrupting agents by
blocking late mobilization of circulating endothelial progenitor cells.
Taylor M, Billiot F, Marty V, Rouffiac V, Cohen P, Tournay
E, Opolon P, Louache F, Vassal G, Laplace, Builhé C, Vielh
P, Soria J.C, Farace F.
Cancer Discovery May 2012 2; 434-49
Circulating Endothelial Progenitors and Tumor Resistance
to Vascular-Targeting Therapies
De Palma M, Nucera S.
Cancer Discovery May 2012 2; 395
27
Poster
Rôle de l’hélicase FBH1 dans le maintien de la stabilité du génome
BACQUIN Agathe
Poster
Utilisation de peptides issus des filaments intermédiaires pour le ciblage de nanocapsules
lipidiques contenant du Paclitaxel vers les cellules de glioblastomes (tumeurs cérébrales)
BALZEAU Julien
UMR 8200 - Stabilité génétique et oncogenèse
CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE D’ANGERS - ANGERS
UPRES EA3143 - Laboratoire de Neurobiologie
et Transgénèse
Introduction : La recombinaison homologue (RH) joue un
rôle essentiel au moment de la première division méiotique
en favorisant la ségrégation optimale des chromosomes
et en participant au brassage génétique. C’est également
un processus clé de réparation de l’ADN et de prise en
charge des fourches de réplication bloquées. Une mauvaise
régulation de ce mécanisme peut cependant provoquer
des réarrangements chromosomiques importants et des
pertes d’hétérozygoties, qui sont des caractéristiques
communes aux cellules tumorales. Plusieurs hélicases
anti-recombinogènes ont été décrites chez l’homme telles
que les protéines Blm et Wrn, dont les déficiences sont
responsables des syndromes de Bloom et de Werner
respectivement. L’hélicase humaine FBH1, décrite plus
récemment, serait également capable d’inhiber la RH en
limitant le recrutement de Rad51, acteur majeur de ce
mécanisme.
suivi de sa polyubiquitination et de sa dégradation par la
voie du protéasome. Cette dégradation dépend de l’action
conjuguée de PCNA et du complexe ubiquitine-ligase
CRL4(Cdt2). Elle est nécessaire au recrutement optimal
de la polymérase translésionnelle êta, qui joue un rôle
majeur dans la réplication d’ADN endommagé.
Description du projet : Afin de caractériser la fonction et
le mode de régulation de l’hélicase FBH1 dans les cellules
humaines, nous avons examiné sa localisation subcellulaire
en l’absence de dommage et après traitement à différents
agents génotoxiques tels que les ultra-violets et les agents
méthylants. Nos résultats montrent que FBH1 est recruté
au niveau des foyers de réplication où il colocalise avec le
facteur de processivité des polymérases réplicatives,
PCNA. Après traitement génotoxique, FBH1 s’accumule
aux sites de dommages de l’ADN de façon précoce et
transitoire. En couplant une approche biochimique et une
approche d’imagerie cellulaire, nous montrons que PCNA
contrôle l’accumulation de FBH1 pendant la réplication et
en réponse à des dommages via une interaction directe
par le biais de deux motifs distincts d’interaction à PCNA.
De plus, nous montrons que le recrutement de FBH1 est
Perspectives : Afin de mesurer l’impact d’une dérégulation
de FBH1 sur la réplication de l’ADN, nous projetons d’étudier la dynamique de réplication par peignage, en utilisant
différents mutants de FBH1. Par ailleurs, étant donné
l’implication des hélicases anti-recombinogènes Blm et
Wrn dans des syndromes prédisposant aux cancers, il sera
intéressant d’investiguer le niveau d’expression de FBH1
dans différents cancers. ●
Conclusion : Notre hypothèse est donc que FBH1 serait
recruté sur l’ADN via une interaction avec PCNA, au
moment de la réplication ou en réponse à un stress génotoxique, afin de limiter les événements de recombinaison
non programmés dépendants de Rad51. Par la suite, PCNA
provoquerait la dégradation de FBH1 en collaboration avec
le complexe ubiquitine-ligase CRL4(Cdt2) afin de limiter
le temps de résidence de FBH1 qui pourrait interférer avec
la prise en charge des dommages par le mécanisme de
synthèse translésionnelle.
Publications :
Agathe Bacquin, Caroline Pouvelle, Mylène Perderiset,
Carine Tellier-Lebegue, Sophie Salomé-Desnoulez, JeanBaptiste Charbonnier et Patricia L Kannouche.
«The helicase Fbh1 is tightly regulated by PCNA via
CRL4(Cdt2) proteolysis to promote Translesion DNA
Synthesis in human cells» (soumis)
28
des souris porteuses d’un gliome de type GL261. Les souris
sont sacrifiées 21 jours après implantation de la tumeur,
les cerveaux prélevés et étudiés pour déterminer la localisation des LNC et leurs effets sur les volumes des
tumeurs.
Les filaments intermédiaires sont l’un trois des constituants
du cytosquelette cellulaire, avec les microtubules composés de dimères de tubuline et les filaments d’actine. Les
filaments intermédiaires sont spécifiquement exprimés
selon le type cellulaire, et au laboratoire il a été montré
qu’ils sont capables d’interagir avec les dimères de tubuline
sur des sites particuliers appelés TBS pour Tubulin-Binding
Site. Des peptides correspondant aux séquences TBS ont
été synthétisés et se révèlent être capables d’inhiber la
polymérisation de la tubuline in vitro (Bocquet et al., 2009).
Un de ces peptides appelé NFL-TBS.40-63, issu de la
sous-unité légère des neurofilaments, rentre sélectivement
dans les cellules de gliome et détruit le réseau de microtubules, inhibant ainsi la multiplication cellulaire. Ce
peptide pénètre peu dans les cellules saines du système
nerveux et ne présente pas de toxicité pour ces cellules.
Enfin, ce peptide ralentit la croissance de tumeur cérébrale
de glioblastome injectée dans le cerveau de rat (Bergès et
al., 2012).
Ces travaux montrent que les LNC fonctionnalisées avec
le peptide NFL-TBS.40-63 rentrent plus rapidement et de
façon plus importante dans les cellules de glioblastome
que les LNC non-fonctionnalisées. Chez les souris porteuses de gliome, le volume des tumeurs diminue de 60%
après traitement avec les LNC contenant du Paclitaxel, et
de 75% pour ceux traités avec les LNC remplies de Paclitaxel et fonctionnalisées avec le peptide NFL-TBS.40-63.
L’analyse par microscopie en fluorescence montre que les
LNC fonctionnalisées avec le peptide sont localisées principalement au niveau de la tumeur à l’inverse des LNC non
fonctionnalisées avec le peptide. Ces résultats montrent
que le peptide NFL-TBS.40-63 permet de cibler les LNC
vers la tumeur de glioblastome, où leur entrée et leur effet
sont augmentés par la présence du peptide. ●
Ce travail porte sur l’utilisation des propriétés de ciblage
du peptide NFL-TBS.40-63 pour le greffer à la surface de
nanocapsules lipidiques (LNC) contenant un agent anticancéreux (Paclitaxel), afin de les guider vers les cellules
tumorales et de faciliter leur entrée dans les cellules.
L’incorporation cellulaire de ces LNC contenant un fluorochrome liposoluble, le DiD (ex/em 644/665nm), est
suivie par cytométrie en flux et microscopie sur des lignées
de gliome de souris GL261 et sur des cultures primaires
d’astrocytes de souris. Du Paclitaxel est encapsulé avec
du DiD dans les LNC et testé en culture cellulaire et chez
Publications :
- Bocquet A, Berges R, Frank R, Robert P, Peterson AC, Eyer
J. Neurofilaments bind tubulin and modulate its polymerization. J Neurosci. 2009, 29(35):11043-54.
- Berges R, Balzeau J, Peterson A, Eyer J, A Tubulin Binding
Peptide Targets Glioma Cells Disrupting Their Microtubules, Blocking Migration, and Inducing Apoptosis. Mol
Ther. 2012 Apr 10.
29
Poster
Poster
Rôle d’histones méthyltransférases spécifiques de H3K9 dans la régulation de l’équilibre
entre prolifération et différenciation cellulaire.
Etude des fonctions des protéines virales de la famille EBNA3 dans l’immortalisation
des lymphocytes B par le virus d’Epstein-Barr
BATTISTI Valentine
BAZOT Quentin
UNIVERSITE DENIS DIDEROT - PARIS
CNRS UMR7216 -Laboratoire d’ Epigénétique et Destin Cellulaire
ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE LYON - LYON
Unité U758 - Laboratoire de Virologie Humaine
et SETDB1 (Fritsch et al, Mol Cell, 2010). Mon projet s’intéresse à l’étude de l’interdépendance des ces quatre KMTs
de H3K9. Il porte sur l’étude fine du rôle de ces KMTs dans
la régulation de l’équilibre entre prolifération et différenciation cellulaire, plus particulièrement, dans l’établissement progressif de la tri-méthylation de H3K9 sur les
promoteurs gènes de la prolifération cellulaire. En utilisant
le modèle de différenciation musculaire terminale, j’ai ainsi
pu montrer que les 4 KMTs sont essentielles à la différenciation. De manière inattendue, les résultats montrent que
4 KMTs agissent de façon différentielle dans les cellules
en prolifération. À l’inverse, en différenciation, les 4 KMTs
pourraient coopérer pour établir progressivement la triméthylation de H3K9 inhibitrice sur les gènes de prolifération cellulaire. ●
Durant la différenciation musculaire terminale, les myoblastes sortent d’une manière irréversible du cycle cellulaire pour ensuite fusionner et former les myotubes. Ce
processus implique l’activation des gènes musculaires,
précédée par l’extinction irréversible des gènes de la prolifération cellulaire. Ainsi, notre laboratoire a montré que
durant la différenciation terminale, les gènes associés à la
prolifération (cibles de E2F) sont éteints par triméthylation
de H3K9 par Suv39h1 (Ait-Si-Ali et al, EMBO J 2004;
Guasconi et al, Epigenetics 2010…). Or, la tri-méthylase
Suv39h1 utilise comme substrat H3K9 qui est déjà monoou diméthylé (Rice et al, Mol Cell 2003), suggérant que
Suv39h1 coopérerait avec des mono-/di-méthylases de
H3K9. De fait, notre équipe a montré que Suv39h1 forme
un mégacomplexe avec les mono/di-methylases GLP, G9a
Nous avons ensuite étudié l’effet de la protéine virale
EBNA-3A sur l’activation de la transcription induite par
Miz-1. Pour cela, nous avons comparé le niveau des transcrits de gènes cibles de Miz-1 dans des LCL exprimant ou
non EBNA-3A. De manière intéressante les gènes codant
les inhibiteurs du cycle cellulaire p21CIP1, p57KIP1 et
p15INK4B sont différemment exprimés en présence
d’EBNA-3A. L’utilisation d’un plasmide rapporteur portant
le gène de la Luciférase sous le contrôle du promoteur du
gène CDKN2B (codant l’inhibiteur p15INK4B) nous a
permis de montrer qu’EBNA-3A inhibe l’activation de ce
promoteur par Miz-1. De manière intéressante, l’expression
d’une protéine EBNA-3A mutée pour son interaction avec
Miz-1 n’est plus capable d’inhiber cette activation Miz-1
dépendante.
Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un γ-herpesvirus associé
à de nombreux cancers chez l’homme. In vitro, l’infection
de lymphocytes B primaires par EBV conduit à leur immortalisation (établissement de lignées lymphoblastoides).
Dans ces cellules, 9 protéines virales sont exprimées et
coopèrent pour stimuler la prolifération des cellules. Nos
objectifs sont de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les 3 protéines de la famille EBNA3
(-3A, -3B et -3C) participent à l’immortalisation des cellules
B. Pour cela, nous avons réalisé un crible deux-hybrides
dans la Levure en utilisant EBNA-3A, -3B ou -3C comme
appâts. Ce crible nous a permis d’identifier de nombreux
nouveaux partenaires particulièrement pertinents au vu
de ce que l’on connaît des rôles respectifs des protéines
EBNA3. Parmi les nouveaux partenaires de la protéine
EBNA-3A se trouve le facteur de transcription Miz-1,
protéine jouant un rôle clef dans l’arrêt du cycle cellulaire
par la transactivation de gènes codant les inhibiteurs du
cycle cellulaire p21CIP1, p57KIP1 et p15INK4B.
La protéine Miz-1 active la transcription de ses gènes cibles
grâce au recrutement de certains coactivateurs. Une de
ces protéines co-activatrices, la protéine NPM, interagit
avec le domaine POZ de Miz-1, domaine également ciblé
par EBNA-3A. Nous avons pu montrer que la protéine NPM
est moins présente sur le promoteur du gène CDKN2B
dans des LCL n’exprimant pas la protéine EBNA-3A par
rapport à des LCL sauvages. Enfin, par des expériences de
co-immunoprécipitation dans ces mêmes LCL nous avons
pu montrer que Miz-1 interagit beaucoup plus faiblement
avec NPM en présence d’EBNA-3A. La protéine virale
EBNA-3A est donc capable de moduler l’expression de
certains gènes cibles de Miz-1 en inhibant le recrutement
de la protéine co-activatrice NPM.
Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes par lesquels la protéine EBNA-3A, et plus largement
EBV, dérégule le cycle cellulaire. ●
Dans un premier temps nous avons validé cette interaction
par GST-pull down ainsi que par co-immunoprécipitation
en cellules humaines. EBNA-3A interagit au niveau de deux
domaines de la protéine Miz-1, le domaine POZ et un
domaine situé en C-terminal dans une région contigüe au
domaine de liaison à l’ADN. Quant à Miz-1, l’interaction
avec EBNA-3A se fait via le domaine N-terminal
d’EBNA-3A.
Dans un deuxième temps nous avons étudié la localisation
cellulaire de la protéine cellulaire Miz-1. Cette dernière est
connue pour avoir une localisation nucléo-cytoplasmique,
cependant, en présence d’EBNA-3A, Miz-1 est retrouvée
majoritairement relocalisée dans le noyau.
30
31
Poster
Poster
Implication fonctionnelle de la protéine adaptatrice Lnk dans les cellules normales
et pathologiques du lignage mégacaryocytaire
Rôle de la Poly(ADP-ribose) polymérase-3 (PARP-3) dans la réponse cellulaire aux cassures
double-brin.
BEN MOUSSA Hajer
BOEHLER Christian
UFR DE SANTE MEDECINE ET BIOLOGIE HUMAINE DE PARIS XIII - BOBIGNY
UMR U978 Inserm - Adaptateurs de signalisation en hématologie
ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG - ILLKIRCH
UMR 7242 CNRS - Equipe « Poly(ADP-ribosyl)ation et Intégrité du génome »
PH de Lnk ont été identifiées dans les SMPs. De ce faite,
nous avons examiné l’effet de ces mutations sur l’interaction de Lnk avec JAK2WT et JAK2V617F. Nos résultats
ont montré que ces modifications de Lnk diminuent sa
liaison avec la kinase, notamment avec JAK2V617F. Nous
réalisons à présent des essais de prolifération cellulaire
dans un contexte SMPs (JAK2V617F) afin de confirmer le
rôle de ces mutations dans ces hémopathies.
L’adaptateur Lnk est exprimé dans le système hématopoïétique. Il possède différents domaines fonctionnels
[dimérisation (DD), PH et SH2]. Les souris Lnk-/- ont
montré son rôle comme régulateur négatif crucial des voies
de signalisation essentielles pour la prolifération des lignages hématopoïétiques, tel que le lignage mégacaryocytaire. En effet, Lnk est exprimé tout au long de la
différenciation mégacaryocytaire et son absence entraîne
une hyperprolifération de ce lignage due à l’hypersensibilité
à la thrombopoïétine et à la dérégulation des ces voies de
signalisation (JAK/STAT et MAPK). Lnk interagit et inhibe,
de manière-dose dépendante, la kinase JAK2 via son domaine SH2 est un nouveau site d’interaction dans sa région
Nterminale. Le phénotype des souris Lnk-/- s’assimile à
celui retrouvé dans les syndromes myéloprolifératifs
(SMPs) caractérisés par la surproduction d’une ou plusieurs lignages myéloïdes. Un grand avancé dans ces hémopathies a été fait avec l’identification des mutations dans
la kinase JAK2 (V617F, 90%). Récemment, des mutations
de Lnk (13%) ont été identifiées dans les SMPs. Ces données ont suggéré un rôle clé de Lnk et JAK2 dans l’origine
et/ou le développement de ces syndromes. Cependant,
les mécanismes moléculaires impliquant ces deux protéines dans ces pathologies restent à élucider. Mon projet
de thèse vise à définir la signification moléculaire de l’interaction Lnk/JAK2 dans la mégacaryopoïèse normale et
pathologique notamment de SMPs.
Afin de caractériser le nouveau site de liaison de JAK2 en
Lnk, nous avons examiné l’effet des formes tronquées de
Lnk, ayant sa région Nterminale, sur leur association avec
JAK2. Nos résultats ont montré que l’interaction de Lnk
avec JAK2V617F est significativement plus forte qu’avec
JAK2WT, suggérant une régulation différentielle de deux
formes de la kinase par Lnk. L’analyse de l’effet de cette
interaction sur l’activité kinase de JAK2, est en cours, et
déterminera l’éventuelle utilisation de cette région de Lnk
pour inhiber spécifiquement JAK2 mutée dans les SMPs.
Nous avons développés une approche appliquée sur l’analyse de Lnk dans des cellules des patients SMPs. Nos résultats précédents ont montré une différence de l’expression
de Lnk entre les cellules des patients et celles des contrôles
sains. Afin d’examiner l’effet de cette expression différentielle de Lnk sur l’activation de la voie JAK/STAT, nous
développons l’analyse par cytométrie en flux de l’activation
de cette voie de signalisation et l’expression de Lnk dans
les plaquettes SMPs. Nos résultats préliminaires montrent
une corrélation entre le niveau d’activation de la voie JAK/
STAT et le niveau d’expression de Lnk.
L’ensemble de nos résultats suggèrent que l’altération du
complexe Lnk/JAK2 module les réponses cellulaires
médiées par JAK2 dans les SMPs. L’identification de la
séquence dans la région Nterminale de Lnk permettra son
éventuelle utilisation comme inhibiteur spécifique de
JAK2V617F pour le traitement de ces maladies. ●
Publications :
Expression level and differential JAK2-V617F-binding of
the adaptor protein Lnk regulates JAK2-mediated signals
in myeloproliferative neoplasms. Baran-Marszak F,
Magdoud H, Desterke C, Alvarado A, Roger C, Harel S,
Mazoyer E, Cassinat B, Chevret S, Tonetti C, Giraudier S,
Fenaux P, Cymbalista F, Varin-Blank N, Le Bousse-Kerdilès
MC, Kiladjian JJ, Velazquez L. Blood. 2010 Dec
23;116(26):5961-71.
Des mutations dans la région Nterminale et le domaine
32
La réaction de Poly(ADP-ribosyl)ation, catalysée par les
Poly(ADP-Ribose) Polymérases (PARP, 17 membres),
intervient dans un nombre croissant de processus biologiques, parmi lesquels la réparation de l’ADN. PARP-1 et
PARP-2 sont décrits comme des acteurs clés du système
de réparation par excision de bases. Leur inhibition présente un intérêt thérapeutique double : elle potentialise la
radiotoxicité et la cytotoxicité d’agents génotoxiques lors
des traitements des cancers par radio- et chimiothérapie,
et protège de la mort cellulaire dans des situations pathologiques mettant en jeu un stress oxydatif aigu. Certains
inhibiteurs sont déjà engagés dans des essais cliniques
pour le traitement de cancers du sein. Nous avons entrepris
la caractérisation fonctionnelle de PARP-3, une protéine
jusqu’alors peu étudiée.
D’une part, nous avons identifié l’existence d’une interaction
physique et fonctionnelle de PARP-3 avec les facteurs mitotiques NuMA et Tankyrase-1 (PARP-5a). Ce complexe joue
un rôle fondamental dans l’intégrité des télomères et la
dynamique du fuseau de microtubules lors de la mitose.
donc capables de réparer leurs DSB que via le NHEJ. L’interaction de PARP-3 avec des composants du NHEJ et
l’inefficacité des extraits nucléaires de splénocytes issus
des souris PARP-3-/- à catalyser le NHEJ dans un système
in vitro, implique un rôle important de cette protéine dans
cette voie de réparation. Suivant le principe de létalité
synthétique, nous avons alors émis l’hypothèse que le
ciblage de PARP-3 dans de telles lignées pourrait induire
une forte mortalité cellulaire, aussi bien spontanément que
suite à un traitement générateur de DSB.
D’autre part, nous avons identifié PARP-3 comme un acteur
clé de l’intégrité du génome. Par microirradiation laser nous
avons montré que PARP-3 est recrutée au niveau des sites
de cassure de l’ADN. La déplétion de PARP-3 dans des
cellules humaines MRC5 entraîne (i) une accumulation
spontanée et une persistance significative des foyers
γH2AX, marqueur des cassures double-brin (DSB) après
irradiation, (ii) ainsi qu’un délai dans la réparation de ces
cassures. De plus la disruption de PARP-1 et -3 chez la souris
entraîne une radiosensibilité accrue indiquant un rôle synergique des deux protéines dans la réponse aux dommages.
Ces résultats apparaissent comme prometteurs et présentent PARP-3 comme une cible potentielle en thérapie
du cancer du sein. ●
En accord avec cette hypothèse, nos résultats préliminaires
indiquent une très forte diminution de la survie de cellules
cancéreuses déficientes en RH après déplétion de PARP-3,
et ce même en absence de traitement génotoxique additionnel. Cette létalité est encore augmentée après induction
de DSB. La mortalité cellulaire induite par l’absence de
PARP-3 s’explique par une instabilité génomique augmentée caractérisée par la génération de micronoyaux et une
amplification centrosomale exacerbée.
Publications :
Boehler, C. and Dantzer, F. PARP-3, a DNA-dependent
PARP with emerging roles in double-strand break repair
and mitotic progression (2011) Cell Cycle 10(7), 1023-4
Boehler, C., Gauthier, LR., Mortusewicz, O., Biard, DS.,
Saliou, JM., Bresson, A., Sanglier-Cianferani, S., Smith, S.,
Schreiber, V., Boussin, F. and Dantzer, F. Poly(ADP-ribose)
polymerase 3 (PARP3), a newcomer in cellular response
to DNA damage and mitotic progression (2011) Proc Natl
Acad Sci USA 108(7), 2783-8
Boehler, C., Gauthier, LR., Yelamos, J., Noll, A., Schreiber,
V. and Dantzer F. Phenotypic characterization of Parp-1
and Parp-2 deficient mice and cells (2010) Methods Mol
Biol 780, 313-36
La cellule humaine dispose de deux mécanismes distincts
pour réparer les DSB : la Recombinaisoon Homologue (RH)
et la recombinaison non-homologue (NHEJ pour NonHomologous End-Joining). Près de 20% des cancers du
sein sont mutés en BRCA-1/2, protéines jouant un rôle
essentiel dans la RH. Ces cellules cancéreuses ne sont
33
Poster
Le complexe CRL2(LRR-1) E3 ubiquitine-ligase régule la stabilité de HTP-3 afin d’inhiber
la mise en place de la méiose dans les cellules souches germinales chez C. elegans
Poster
Modifications de la chromatine associées à la sénescence cellulaire
CONTREPOIS Kévin
BURGER Julien
COMMISSARIAT A L’ENERGIE ATOMIQUE DE SACLAY - GIF-SUR-YVETTE
CEA/DSV/iBiTec-S/SBIGeM/Equipe stabilité génomique et sénescence
INSTITUT JACQUES MONOD - PARIS
UMR7592 - Laboratoire Cycle Cellulaire et Développement
recombination. More specifically, our results indicate that
CRL2LRR-1 targets for proteolytic destruction the HORMA
domain- containing protein HTP-3, which is required for
loading structural proteins onto meiotic chromosomes and
for the formation of the double-strand breaks that initiate
meiotic recombination. We propose that the ubiquitinproteolytic system may similarly regulate progression
through meiosis in other organisms. ●
Precise control of the transition from self-renewal to terminal differentiation in stem cells is critical to maintain a
balance between cell populations: an excess of stem cell
self-renewal can lead to tumourigenesis, whereas an excess of differentiation can deplete the stem-cell pool. In
the adult Caenorhabditis elegans germline, Notch signals
emanate from the somatic distal tip cell to maintain germline stem cells (GSCs) in a proliferative state by repressing
the expression of meiotic promoting factors. In this study,
we show that the ubiquitin-proteolytic system act synergistically with the Notch pathway to prevent meiotic entry.
Using a novel temperature-sensitive allele of the cul-2
gene, we found that the CUL-2 RING E3 ubiquitin ligase in
combination with the Leucine Rich Repeat 1 substrate
recognition subunit (CRL2LRR-1) negatively regulates the
meiotic program of chromosome pairing, synapsis, and
Publications :
CRL2LRR-1 E3-Ligase acts through HTP-3 to prevent progression through meiotic prophase in germline stem cells
in C. elegans
J. Burger* , J. Merlet*, N. Tavernier, B. Richaudeau, A. T.
Moerkamp, R. Ciosk, B. Bowerman and L. Pintard (Soumis
à Developmental cell)
without DNA damage by expression of the RAF1 kinase.
Accumulation of these two variants is regulated by posttranscriptional mechanisms. Interestingly, in contrast to
other H2A variants, H2A.J is expressed solely from replication-independent polyA mRNA. H2A.J represents only
about 1% of all H2A species in proliferating cells, but it
accumulates to nearly 20% of H2A species during longterm replicative senescence. Remarkably, H2A.J, like
H2A.X, contains a Ser-Gln (SQ) motif near the C-terminus
of the protein. SQ motifs are potential phosphorylation
sites for the DNA damage checkpoint kinases ATM/ATR/
DNA-PK. Hence, phospho-H2A.J could play essential roles
regarding DNA damage repair in conditions of long-term
senescence with persistent DNA damages. H2A.J may
thus represent a novel biomarker of senescent cells in
mammalian tissues during aging or in different disease
processes. ●
Cellular senescence is a stress response of mammalian
cells leading to a durable arrest of cell proliferation that
has been implicated in tumor suppression, wound healing,
and aging. The proliferative arrest is mediated by transcriptional repression of genes essential for cell division
by the retinoblastoma protein family. This repression is
accompanied by varying degrees of large-scale heterochromatin assembly, but little is known regarding the
molecular mechanisms involved. We found that both
deacetylation of H4-K16Ac (histone H4 acetylation on
Lys-16) and expression of HMGA1/2 (high mobility group
A) can contribute to DNA compaction during senescence.
SIRT2, an NAD-dependent class III histone deacetylase,
contributes to H4-K16Ac deacetylation and DNA compaction in human fibroblast cell lines that assemble striking
senescence-associated heterochromatic foci (SAHFs).
Decreased H4-K16Ac was observed in both replicative
and oncogene-induced senescence of these cells. Inhibition
of SAHFs formation did not noticeably affect the stability
of the senescent state. These results are important in interpreting reported decreases in H4-K16Ac levels during
mammalian aging and in cancer cells.
Publications :
- Contrepois K, Thuret JY, Courbeyrette R, Fenaille F, Mann
C. (Epigenetics & Chromatin – manuscrit en révision).
SIRT2 deacetylation of H4-K16Ac and heterochromatin
assembly in senescence.
- Jeanblanc M, Ragu S, Gey C, Contrepois K, Courbeyrette
R, Thuret JY, Mann C. (2012). Parallel pathways in RAFinduced senescence and conditions for its reversion.
Oncogene. Jun 21;31(25):3072-85. doi: 10.1038/
onc.2011.481. Epub 2011 Oct 24.
- Contrepois K, Ezan E, Mann C, Fenaille F. (2010). UltraHigh Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for the Fast Profiling of Histone Post-Translational
Modifications. J Proteome Res. 9: 5501-5509.
Moreover, we identified profound modifications over time
in the chromatin of post-mitotic human fibroblasts in vitro.
Remarkably, mass spectrometry revealed an enrichment
over time of specific H2A/H2B variants (i.e. H2B type 1-K
and H2A.J) at the protein and peptide levels in long-term
senescent conditions (20-30 days) with persistent DNA
damages (i.e. continuous activation of DNA damage repair
pathways). This accumulation was not observed in longterm quiescent cells or in cells induced into senescence
34
35
Poster
Poster
Régulation du trafic et de l’activité de la métalloprotéase ADAM10 par les Tétraspanines
à 8 cystéines
Etude de l’immunité cellulaire T CD4 dirigée contre la télomérase : implications pour
l’immunothérapie antitumorale et l’immunosurveillance des cancers.
DORNIER Emmanuel
DOSSET Magalie
HOPITAL PAUL BROUSSE - VILLEJUIF
UMRS 1004 Inserm/P11- Réponses cellulaires au microenvironnement et cancer
ETABLISSEMENT FRANCAIS DU SANG - BESANCON
UMR1098 - Interaction Hôte Greffon Tumeur et Ingénierie Cellulaire et Génique
L’importance des activités protéolytiques associées à la
membrane plasmique dans la progression tumorale est de
mieux en mieux définie. Parmi ces molécules, les membres
de la famille ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease),
et ADAM10 en particulier, ont suscité un intérêt tout
particulier du fait de la nature de leurs substrats (récepteur
de l’EGF, TNFalpha, Notch,…). Dans cette étude nous nous
intéressons à la régulation d’ADAM10 par les membres
d’une sous-famille de tétraspanines à 8 cystéines (les
8CysTspans). J’ai montré que certaines de ces molécules
sont capables d’interagir directement avec ADAM10 et
de contrôler sa sortie du réticulum. Au cours de ma dernière
année de thèse, j’analyserai l’importance de ces interactions multiples, que ce soit en matière de trafic intracellulaire d’ADAM10 ou de sa fonction dans l’activation de la
36
voie Notch. Mon travail a déjà mis en évidence un nouveau
mécanisme de régulation de la protéase ADAM10, et
pourrait montrer un nouveau mécanisme de régulation de
la voie Notch.Régulation du trafic et de l’activité de la
métalloprotéase ADAM10 par les Tétraspanines à 8
cystéines ●
The stimulation of CD4+ T helper cell responses has gained
considerable interest for cancer immunotherapy. We
evaluate the antitumor potential of CD4 T cells specific of
novel telomerase-derived peptides referred as universal
cancer peptide (UCP) that bind to most commonly found
HLA-DR alleles.
Publications :
“TspanC8 tetraspanins regulate the trafficking of
ADAM10/Kuzbanian and Notch receptor activation in flies
and mammals”
Emmanuel Dornier, Franck Coumailleau, Jean-François
Ottavi, Julien Moretti, Michael Tomlinson, Claude Boucheix, Philippe Mauduit, François Schweisguth and Eric
Rubinstein, En révision à Journal of Cell Biology
We prospectively studied a cohort of 84 advanced NSCLC
patients for the presence of naturally occurring UCPspecific CD4 T cells prior chemotherapy (CT). A relevant
preclinical HLA-A2/DR1 transgenic mouse model was
used to evaluate the potential of UCP-based cancer
vaccine.
to generate potent tumor-specific CTL responses. Furthermore the use of UCPs in therapeutic vaccination breaks
self tolerance against telomerase and eradicates established mouse melanoma by promoting massive CD8+ T
cells recruitment at the tumor site.
Together with the presence of natural UCP-specific T cell
responses in many other cancers, these results support
that the stimulation of UCP-specific CD4+ helper T cells
is a powerful method to improve cancer vaccines efficiency
and provides a new tool for comprehensive monitoring of
antitumor responses in cancer patients. ●
Publications :
Dosset M, Godet Y, Vauchy C et al. Universal cancer
peptide-based therapeutic vaccine breaks tolerance
against telomerase and eradicates established tumor (En
révision, Clin Can Res, 2012).
Godet Y, Fabre E, Dosset M et al. Analysis of spontaneous
tumor-specific CD4 T-cell immunity in lung cancer using
promiscuous HLA-DR telomerase-derived epitopes: potential synergistic effect with chemotherapy response. Clin
Cancer Res. 2012 May 15;18(10):2943-53.
Significant frequency (38%) of naturally occurring UCPspecific CD4 T-cell responses were detected before CT in
advanced NSCLC but not in healthy volunteers. UCPspecific CD4 T-cell clones generated from cancer patients
exhibited high avidity and are Th1 polarized. Interestingly,
the presence of UCP-specific T cell response was shown
to significantly increase overall survival (OS) of patients
responding to CT. By using a HLA-A2/DR1 transgenic
mouse model, we showed that UCP-specific CD4+ T cells
induced after vaccination fulfilled helper features necessary
37
Poster
Exploration d’une polythérapie ciblée dans le traitement des rhabdomyosarcomes
DUMONT Sarah
CENTRE LEON BERARD - LYON
INSERM U 1052/CNRS UMR 5286 - Equipe 11 : Ciblage thérapeutique de la tumeur et de son environnement
immunitaire
Despite its initial chemosensitivity, rhabdomyosarcoma
(RMS) is a deadly tumor, due to rapid chemoresistance
onset. While little is known regarding adult RMS, it carcinogenesis seems to be driven by the PAX3/7-FOXO1 translocation in childhood alveolar RMS, suggesting a possible benefit
of a targeted approach. This work sought to better understand adult RMS through the study of clinicopathologic and
molecular factors and to offer in vitro evidence of targeted
therapy efficacy to offer alternative cure strategy.
We retrospectively analyzed 239 patients, 10 years of age
and greater, diagnosed with RMS at MD Anderson Cancer
Center from 1957 through 2003 and evaluated the PAX3/7
translocation status for 105 of them. These samples were
formatted into a tissue microarray and fluorescent in situ
hybridization (FISH) using break-apart probes for PAX3,
PAX7 and FOXO1 was employed. Three small cell sarcoma
cell lines were studied RD18 (rhabdomyosarcoma), A204
(undifferentiated sarcoma) and TC 71 (Ewing’s sarcoma).
Each cell line was exposed to increasing concentrations of
vorinostat (HDAC inhibitor), 17-DMAG (Hsp90 inhibitor),
abacavir (anti-telomerase) and sorafenib (tyrosine kinase
inhibitor) alone, combined 2 by 2, then with doxorubicin.
Viability was assessed by MTS assay. The Chou and Talalay
combination index (CI) was used to determine additive (CI=1),
synergistic (CI1). Cell cycle analysis, measure of apoptosis
by Annexin V and caspase 3/7 activity were studied using
flow cytometry analysis and luminescent assays.
The translational part of the study showed that less aggressive management of rhadomyosarcoma patients reduced
the chance of cure, stressing the need of multimodality
therapy. Morevover, there was a trend towards better outcomes for patients with fusion-negative RMS suggesting a
possible benefit of a targeted approach to its transcriptional
target pathways. The in vitro study showed that, in monotherapy, each agent lead to 30% to 90% decrease in viability
but abacavir, which remained less active. Combination
therapies with vorinostat, sorafenib and 17-DMAG showed
strong synergism. Abacavir was found antagonistic with
each drug. Either vorinostat or 17DMAG synergized with
38
Poster
Effet anti-angiogénique des inhibiteurs des kinésines Eg5 et Mklp2: Etude de leur potentiel
anti-tumoral dans des modèles pré-cliniques.
EXERTIER Prisca
UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIES DE BORDEAUX - TALENCE
Inserm U1029 - Laboratoire de l’angiogenèse et du micro-environnement des cancers
doxorubicin, achieving 60% cell killing compared to doxorubicin alone 12% (p=0.007). However, no synergy was
observed for sorafenib with doxorubicin. The triple therapy
vorinostat, 17DMAG and Doxorubicin did not show synergism but transiently increased the subG1 population at 24H,
70% compared to 30% in monotherapy with an increase in
early caspase-independent apoptosis (11% to 36%, p=
0.0008).
This present work provides clinical, molecular and in vitro
evidence of targeted polytherapy relevance in rhabdomyosarcoma. The combinaison screening demonstrated the
synergism of dual combinations of vorinostat, 17DMAG and
sorafenib. In adjunction to doxorubicin, these combinations
enhanced doxorubicin cytotoxicity at therapeutically relevant
concentrations. Such data supports the pursuing of targeted
therapy combination investigation through clinical trials. ●
L’angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux à partir
de vaisseaux pré-existants, est indispensable à la progression tumorale. Elle est dépendante de nombreux facteurs
tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF).
Nous avons modélisé l’angiogenèse induite par le VEGF
sur la membrane chorio-allantoidienne (CAM) de l’embryon de poulet. Ce tissu a été isolé et l’expression de gènes
a été comparée aux CAMs contrôles par analyse transcriptomique (Affymetrix). En dehors des gènes endothéliaux
« classiques » régulés par VEGF, certains gènes codant pour
des kinésines mitotiques (KIF4A, KIF11, KIF15, KIF20A et
KIF23) ont été induits de manière reproductible.
Publications :
Sarah N. Dumont SN, Alexander J. Lazar, Julia A. Bridge ,
Robert S. Benjamin, Jonathan C. Trent.
«PAX3/7-FOXO1 Fusion Status in Older Rhabdomyosarcoma Patient Population by Fluorescent In Situ Hybridization», Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,J
Cancer Res Clin Oncol. 2012 Feb;138(2):213-20. Epub 2011
Nov 17.
Poster ASCO 2010 et 2011, Poster CTOS 2010 et presentation orale CTOS 2011
Soumis au journal Cancer:
Sarah N. Dumont, Dejka M. Araujo, Mark F. Munsell, Jason
Salganick, Amaury G. Dumont, Claude Linassier, Shreyaskumar Patel, Robert S. Benjamin, Jonathan C. Trent
Management and Outcome of 239 Adolescent and Adult
Rhabdomyosarcoma Patients
En ecriture:
Sarah N. Dumont, Amaury G. Dumont, Robert S. Benjamin,
Jonathan C. Trent
Rational for targeted polytherapy in rhabdomyosarcoma:
get the genie out of the bottle
e-publication ASCO 2012
In vitro, des inhibiteurs chimiques spécifiques d’Eg5 tels
que le dimethylenastron (DMN) et l’ispinesib mesilate
(ISP, utilisé dans des essais cliniques actuellement),
bloquent la prolifération, l’adhésion et la migration des
cellules endothéliales ainsi que la tubulogenèse.
In vivo, l’injection d’un morpholino contre KIF11 induit des
défauts vasculaires des vaisseaux intersomitiques et du
vaisseau longitudinal dorsal et, a plus forte dose, une létalité
de l’embryon. Dans des modèles pré-cliniques de greffe
de cellules tumorales chez la souris et l’embryon de poulet,
l’inhibition d’Eg5 réduit l’angiogenèse tumorale d’une
manière significative.
En conclusion, nos résultats montrent pour la première
fois une implication importante d’une kinésine dans l’angiogenèse et suggèrent que l’endothélium représente une
cible pharmacologique pour les inhibiteurs des kinésines
mitotiques, ce qui devrait avoir des conséquences majeures
sur l’élaboration de nouveaux agents anti-kinésine. ●
Nous avons focalisé notre recherche sur la kinésine KIF11
(codant pour la protéine Eg5) et son rôle dans
l’angiogenèse.
Publications :
«Kinesin KIF11/Eg5 plays a critical role in physiological and
pathological angiogenesis in chick and zebrafish embryos
and murine tumor models» en soumission chez Blood
39
Poster
Rôle des isoformes des membres du pore de transition de perméabilité (PTP) mitochondrial
dans la communication apoptotique entre le réticulum endoplasmique (RE) et la
mitochondrie en réponse au stress RE dans des lignées cancéreuses humaines
GALLERNE Cindy
FACULTE DE PHARMACIE DE L’UNIVERSITE PARIS XI - CHÂTENAY-MALABRY
INSERM U769 - LabEx LERMIT - Signalisation et Physiopathologie Cardiaque
Introduction : Les approches et outils disponibles (anticorps, shRNAmir) pour mener à bien mon projet initial ont
généré de nombreuses incertitudes (manque de spécificité
de reconnaissance et d’extinction des isoformes de VDAC
et d’ANT), ne nous permettant pas d’interpréter correctement les résultats obtenus avec les clones stables que
nous avons générés. Nous avons donc décidé, de réorienter
mon projet de thèse et d’étudier les mécanismes cellulaires
et moléculaires d’un inhibiteur de Hsp90 (Heat shock
protein 90) le PU-H71, sur le devenir des cellules cancéreuses. La protéine chaperonne Hsp90, dont l’expression
et l’activité augmentent dans les cellules cancéreuses, est
essentielle à l’activation et la stabilité de nombreuses oncoprotéines. Les Hsp90 ont donc récemment émergé comme
nouvelles cibles thérapeutiques anticancéreuses, entrainant le développement de nombreux inhibiteurs de cette
chaperonne. Parmi ceux-ci, le PU-H71 s’est avéré efficace
pour induire l’apoptose de différentes tumeurs chez la
souris. Néanmoins, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse apoptotique induite par
PU-H71 sont encore mal connus.
l’induction de la voie mitochondriale de l’apoptose, alors
que cet inhibiteur s’avère non toxique pour les fibroblastes
humains sains. L’apoptose induite par PU-H71 est caractérisée par une perméabilisation de la membrane interne
de la mitochondrie, une chute du potentiel membranaire
mitochondrial, une surexpression et une activation de la
protéine pro-apoptotique Bax, un relargage de cytochrome
c et une activation de la caspase-3. De plus, et contrairement à l’inducteur de stress RE thapsigargine, PU-H71 est
capable de provoquer l’apoptose dans des cellules cancéreuses qui surexpriment la protéine anti-apoptotique Bcl-2,
à un niveau similaire à celui observé dans les cellules qui
ne surexpriment pas Bcl-2. Ce résultat indique que PU-H71
contourne la résistance à l’apoptose conférée par la surexpression de Bcl-2. Nous avons également observé que des
cellules déficientes pour Bax, qui sont résistantes à l’apoptose induite par PU-H71, peuvent être sensibilisées de
façon significative par un traitement combinatoire utilisant
PU-H71 et le melphalan ou le cisplatine.
Conclusion et perspectives: L’ensemble de ces résultats
indique que PU-H71 semble être une molécule très prometteuse dans le cadre du traitement des cancers, en
particulier ceux qui présentent une surexpression de Bcl-2.
Par ailleurs, PU-H71 pourrait être utilisé efficacement en
combinaison avec d’autres molécules à potentiel chimiothérapeutique, notamment dans le cas de tumeurs résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. ●
Description du projet : Nous avons cherché à (i) décrypter
le mode d’action du PU-H71, (ii) déterminer le rôle des
protéines Bcl-2 et Bax et (iii) sensibiliser à l’apoptose des
cellules cancéreuses résistantes au PU-H71. Nous avons
observé que PU-H71 induit l’épissage de l’ARNm de XBP1,
et une augmentation de l’expression de Grp94, Grp78,
ATF4 et CHOP, démontrant que cette molécule active la
voie UPR (Unfolded Protein Response) et induit un stress
du réticulum endoplasmique (RE). Par ailleurs, nous avons
mis en évidence une augmentation des sites de contact
entre le RE et les mitochondries, suggérant une communication apoptotique entre ces deux organites. Dans cinq
lignées cancéreuses humaines, nous avons montré que la
réponse au stress RE induite par PU-H71 est associée à
Publications :
Cindy Gallerne, Alexandre Prola and Christophe Lemaire
The purine scaffold Hsp90 inhibitor PU-H71 induces endoplasmic reticulum stress and mitochondrial pathway of
apoptosis in human cancer cells and overcomes Bcl-2-mediated resistance (article soumis)
40
Poster
Rôle et mécanisme d’action du ligand ADMP1 et du récepteur Alk1/2 dans la signalisation
BMP au cours du développement de l’embryon d’oursin Paracentrotus lividus
HAILLOT Emmanuel
STATION ZOOLOGIQUE - VILLEFRANCHE-SUR-MER
UMR7009- Biologie du développement
BMP2/4 ligand. Moreover this phenotype is associated
with a loss of dorsal gene expression. We also identified
a new BMP-related factor that cooperates with BMP2/4
during dorsal ventral axis formation. We called this TGFbeta Maverick/GDF since it is mostly related to Drosophila
Maverick and Vertebrate GDF. Inactivation of Maverick
caused a mild ventralisation accompanied by ectopic expression of nodal during blastula stages while the double
inactivation of BMP2/4 and Maverick caused an extreme
ventralization. This is very similar to the phenotype caused
by the double inactivation of Alk1/2 and Alk3/6. Surprisingly, although Maverick appears to play a key role in the
initiation of dorsal-ventral axis specification, it is expressed
at a very low level and we detected a gradient of Maverick
mRNA present at 60-cell stage.
In sea urchin, TGFβ ligands Nodal and BMP2/4 play crucial
roles in establishment of dorso-ventral polarity. Expression
of nodal is initiated around the 32- 60 cells stage in the
ectoderm. Nodal expression is initially broad but is rapidly
restricted to the ventral ectoderm by mechanisms that are
not yet understood. Nodal is absolutely required to specify
ventral but also dorsal ectoderm. When translation of nodal
transcript is prevented, specification of both the ventral
and the dorsal ectoderm fails and the ectoderm differentiates into a neurogenic ectoderm. Nodal expressing cells
have a long range organizing activity on the ectoderm. This
long- range activity of Nodal is assured by BMP2/4. It acts
as a relay molecule synthetized in the ventral ectoderm,
then translocated to the opposite side. It binds at the
Alk3/6 type I receptor and actives phosphorylation of
Smad1/5/8 inducing expression of dorsal ectoderm genes.
To better understand the role of BMP pathway in establishment of dorso-ventral polarity, we have studied the
role of new actors which could have a function in the BMP
pathway during the development of sea urchin embryo.
In conclusion, we have discovered 3 new actors which
participate at the BMP signaling. We showed that Admp1
ligand participate to a compensation system to regulate
BMP signaling perturbation. Then we have proved that
Alk1/2 receptor is essential to specify dorsal ectoderm as
Alk3/6. We have also discovered a BMP maternal GDF2
which contributes at the restriction of nodal at very early
stage. Finally we showed that when you repress all BMP
signaling, the ventral specification is the default fate in
ectoderm. So the dorso ventral axis formation in sea urchin
appeared associate with a direct antagonism between
Nodal and BMP pathway. ●
In this project, we studied the function of two new ligand
BMP called ADMP1 and GDF2, as well as a new BMP receptor of type I called Alk1/2. Admp1 ligand is with BMP2/4,
the only BMPs ligand expressed in ventral organizer center.
We have established that Nodal and FGF are essential to
the expression of ADMP1. Surprisingly we have also
showed that admp1 expression is negatively regulated by
the signaling BMP as it is the case with the vertebrate. To
understand the function of admp1, we have repress both
admp1 and BMP2/4 expression and showed that the
phenotype is stronger that the phenotype induces by
BMP2/4 repression alone.
Publications :
Saudemont A, Haillot E, Mekpoh F, Bessodes N, Quirin M,
Lapraz F, Duboc V, Röttinger E, Range R, Oisel A, Besnardeau L, Wincker P, Lepage T. Ancestral regulatory circuits
governing ectoderm patterning downstream of Nodal and
BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in
an echinoderm.; 2010, PLoS Genetics. 6(12):e1001259.
PMID:21203442
Alk1/2 is the second BMP receptor of type 1 present in the
sea urchin genome. In studying the function of Alk1/2, we
showed that it is essential for BMP signaling. The repression
of Alk1/2 induces a phenotype very similar to a loss of
41
Poster
Rôle des facteurs NER dans le processus de transcription
ILTIS Izarn
INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE - ILLKIRCH
CNRS UMR 7104 - INSERM U 964 - Laboratoire Expression et réparation du génome
coupures de l’ADN sur le promoteur afin de favoriser la
formation de boucle qui sera ensuite stabilisée par XPF.
Pour préserver l’intégrité du génome des différentes lésions
de l’ADN (UV, anti-tumoraux...) divers mécanismes de
réparations ont été mis en place par la cellule: le mécanisme
d’excision de bases (BER), le mécanisme d’excision de
nucléotides (NER), la recombinaison homologue ou la réparation par mésappariement. La NER se divise en 2 voies :
la GGR (global genome repair) qui élimine les lésions de
l’ensemble du génome et la TCR (transcription coupled
repair) qui permet de réparer les lésions du brin transcrit
de l’ADN. La mutation de gènes impliqués dans la NER
sont à l’origine de 3 maladies génétiques: Xeroderma
Pigmentosum (XP), la Trichothodystrophie (TTD) et le
syndrome de Cockayne (CS). Ces patients présentent une
grande variété de symptômes incluant une hypersensibilité
à la lumière et une prédisposition aux cancers de la peau.
Tous ces signes cliniques ne peuvent pas être expliqué
que par un défaut de réparation de l’ADN. On peut donc
imaginer que certains facteurs de réparation peuvent être
impliqués dans d’autres processus cellulaires. En effet dans
un système de gènes sous le contrôle de récepteurs nucléaires (RARβ2 et PPAR), nous avons observé lors de la
transcription, le recrutement de l’ARN polymérase II, de
ces partenaires, de TFIIH ainsi que celui des facteurs NER :
XPC, XPA, RPA, CSB, XPG et XPF. Nous avons également
montré que le co-recrutement des facteurs NER avec la
machinerie transcriptionnelle influence l’environnement
chromatinien du promoteur actif, en induisant une déméthylation de l’ADN autour du promoteur et des modifications post-traductionnelles des histones (PTMs).
Nous avons aussi montré que certaines PTMs de la chromatin, n’étaient pas présentes en absence de XPC. Dans
des cellules contrôles, on observe une acétylation de H3K9
conformes à l’état chromatinien de la transcription. L’enzyme GCN5 responsable de cette modification est recrutée
sur le promoteur de RARβ2 lors du pic d’acétylation de
H3K9. En absence de XPC, on observe une absence du
recrutement de GCN5 provoquant une déacétylation de
H3K9. Des résultats identiques ont été observés dans les
cellules de patients XP-C. On peut donc supposer que le
recrutement de GCN5 est dépendant de la présence de
XPC. Lors de ce projet de recherche, nous avons montré
que les mécanismes de transcription et de réparation
n’étaient pas deux processus distincts. En effet, nous avons
prouvé que les facteurs NER étaient recrutés lors de la
transcription et que XPC, XPG et XPF sont impliqué dans
des phénomènes de remodelage de la chromatine. Une
meilleure compréhension de ces mécanismes de régulation
de l’expression des gènes et du rôle des protéines NER
permettra de mieux comprendre la pathologie XP et la
prédisposition de ces patients à développer des cancers
de la peau. ●
Poster
MyD88 participe à la régulation des mécanismes de réparation de l’ADN et favorise
la résistance des cellules tumorales aux agents génotoxiques. MyD88 une nouvelle cible
thérapeutique ?
KFOURY Alain
CENTRE LEON BERARD - LYON
NRS UMR 5286 - INSERM U 1052 - Eqpe Signalisation Immunité Innée Oncogénèse
damage, resulting in cell death via the tumor suppressor
protein p53. Furthermore, we show that knocking down
MyD88 sensitizes cancer cells to genotoxic agents in vitro
and in vivo. Collectively, these results suggest a novel and
original link between inflammation, DNA repair, and
cancer, and provide further rationale for MyD88 as a
potential therapeutic target in Ras-dependent cancers, in
particular in the context of concomitant genotoxic
chemotherapy. ●
MyD88 is an adaptor molecule in TLR, IL-1R, and IL-18R
signalling that was previously shown to be implicated in
tumorigenesis through pro-inflammatory mechanisms.
We have recently reported that in addition to its role in
innate immunity, MyD88 plays a direct role in promoting
the optimal activation of the RAS/ERK transformation
pathway. Here we show that MyD88 is required for efficient
Ras- and ERCC1-dependent DNA repair in cancer cells,
and that its inhibition leads to the accumulation of DNA
Publications :
- NER factors are recruited to active promoters and facilitate chromatin modification for transcription in the absence of exogenous genotoxic attack.
Molecular Cell 2010. Le May N, Mota-Fernandes D, VélezCruz R, Iltis I, Biard D, Egly JM.
- XPG and XPF endonucleases trigger chromatin looping
and DNA demethylation for accurate expression of activated gene.
Molecular Cell 2012. Le May N, Fradin D, Iltis I, Bougnères
P and Egly JM.
Nous avons ensuite étudié le rôle de ces facteurs NER XPC,
XPG et XPF. Nous avons mis en évidence que XPG et XPF
sont essentiels pour l’établissement de boucles de chromatine entre le promoteur et le terminateur du gène RARβ2.
De plus l’abolition ou la mutations du domaine catalytique
de XPG et/ou de XPF perturbe la formation de boucle de
d’ADN ainsi que la transcription du gène. Nous avons
également montrés que l’endonucléase XPG générait des
42
43
Poster
Les G-quadruplexes constituent un obstacle pour la réplication et une menace pour
la stabilité du génome
PIAZZA Aurèle
UMR3244 - Laboratoire « recombinaison et instabilité génétique »
Les G-quadruplexes sont des structures à 4 brins formées
spontanément par certains acides nucléiques riches en
guanines dans des conditions physiologiques in vitro et
qui présentent une grande variété de conformations.
Lorsque j’ai entrepris ma thèse, de nombreux indices mais
peu de preuves expérimentales supportaient l’existence
de ces structures in vivo. La première partie de ma thèse
a consisté à montrer qu’ils se formaient in vivo, découvrir
les mécanismes en charge de leur métabolisme, et étudier
les conséquences pathologiques de leur persistance.
Publication #4 (en révision):
Piazza A, Serero A, Boulé J-B, Legoix-Né P, Lopès J, Nicolas
A. « Stimulation of gross chromosomal rearrangements
by the human HRAS1, CEB1 and CEB25 minisatellites in S.
cerevisiae depends on G-quadruplexes or Cdc13». En révision à PLoS Genetics.
Publication #3
Lopes J*, Piazza A*, Bermejo R, Kriegsman B, Colosio A,
Teulade-Fichou MP, Foiani M, Nicolas A. (2011), « G-quadruplex-induced genetic instability during leading strand
replication », The EMBO Journal, 30, 4033–4046, doi:
10.1038/emboj.2011.316
*: co-premier auteur
les G-quadruplexes se forment in vivo, (ii) que l’hélicase
Pif1 est impliquée dans leur déroulement, (iii) que leur
persistance pathologique perturbe la réplication, (iv) que
cette perturbation concerne uniquement le brin à synthèse
continue, et (v) que cette perturbation créée un substrat
recombinogène qui conduit à l’instabilité génomique de la
séquence sous-jacente. En plus d’induire des réarrangements internes aux séquences répétées, les G-quadruplexes stimulent la formation de grands réarrangements
chromosomiques associés à la perte de la partie terminale
du chromosome (publication #4). En collaboration avec
une équipe de biologie structurale qui détermine les structures tridimensionnelles de G-quadruplexes, j’étudie en
détail la relation structure-fonction des G-quadruplexes à
l’instabilité génomique.
Ce travail a été réalisé dans l’organisme modèle S. cerevisiae. Le système expérimental repose sur la mesure de la
stabilité de CEB1, une séquence répétée en tandem humaine
de type minisatellite (motif unitaire compris entre 10 et
100 pb). Le motif de CEB1 forme un G-quadruplexe in vitro,
efficacement déroulé par l’hélicase Pif1 purifiée. Dans un
mutant déficient pour l’hélicase Pif1, CEB1 est fréquemment
réarrangé (changement du nombre de motifs). Les réarrangements sont souvent complexes et leur formation
dépend de la recombinaison homologue. La mutagénèse
dirigé du motif de CEB1 m’a permis de montrer que cette
instabilité dépendait de la présence de quelques nucléotides
essentiels à la formation du G-quadruplexe in vitro (publication #1). Une seconde approche a consisté à traiter des
cellules sauvages par Phen-DC3, un ligand spécifique des
G-quadruplexes qui inhibe leur déroulement par l’hélicase
Pif1 in vitro. Ce ligand induit spécifiquement l’instabilité du
minisatellite CEB1, mais n’a pas d’effet sur le minisatellite
CEB1 muté. Ces résultats montrent que les G-quadruplexes
formés par CEB1, lorsque leur déroulement est inhibé en
absence de Pif1 ou en présence du ligand Phen-DC3,
conduisent à son réarrangement (publication #2). L’analyse
par gel bidimensionnel des intermédiaires de réplication
dans CEB1 a permis de montrer que cette instabilité survenait durant la réplication, principalement lorsque les
G-quadruplexes étaient formés sur la matrice du brin à
synthèse continue (publication #3).
Cette étude fondamentale a permis (i) de démontrer que
Les séquences capables de former un G-quadruplexe sont
présentes au niveau des télomères et des promoteurs de
nombreux oncogènes chez l’homme. De très nombreuses
molécules spécifiques de ces structures in vitro ont été
développées ces dernières années. Le système expérimental
que j’ai développé devrait maintenant permettre d’identifier
rapidement la spécificité de ces ligands pour des structures
G-quadruplexes diverses dans un contexte cellulaire. ●
Publications :
Publication #1:
Ribeyre C, Lopes J, Boulé JB, Piazza A, Guédin A, Zakian
VA, Mergny JL, Nicolas A. (2009) « The yeast Pif1 helicase
prevents genomic instability caused by G-quadruplexforming CEB1 sequences in vivo », PLoS Genetics, 5,
e1000475.
Publication #2:
Piazza A, Boulé J-B, Lopès J, Mingo K, Largy E, TeuladeFichou M-P, Nicolas A (2010), « Genetic instability triggered by G-quadruplex interacting Phen-DC compounds
in Saccharomyces cerevisiae », Nucleic Acids Research,
13, 4337-48.
44
45
Poster
Rôle des lymphocytes T CD4 régulateurs dans la suppression des réponses immunitaires
anti-tumorales
Poster
Contrôle de l’homéostasie protéique par un nouveau complexe du reticulum endoplasmique
RICHARD Magali
POMMIER Arnaud
INSTITUT COCHIN - PARIS
Inserm U1016, CNRS UMR 8104 -Département Immunologie-Hématologie
tively depleting various immune populations, here, we
show that Ly-6Chigh monocytes are potent anti-tumor
effectors playing a key role in the development of vitiligo
and in controlling tumor cell dissemination. Altogether,
our data suggest that regulatory CD4 T cells are involved
in dampening anti-tumor responses not only by suppressing conventional T cell responses, but also by inhibiting
Ly-6Chigh monocytes through an IL-10 dependent
mechanism. ●
Little is known about the interactions between regulatory
T cells and non-T cells in the context of cancer. To study
the role of regulatory CD4 T cells in the suppression of
anti-tumor responses, we used a model of spontaneous
melanoma (MT/ret mice) in which the primary uveal tumor
disseminates early, but remains dormant for several weeks.
Then, MT/ret mice develop cutaneous metastases and
finally distant metastases. Around one third of MT/ret
mice develop a vitiligo associated with a delay in tumor
progression. Interestingly, regulatory CD4 T cells are more
frequent only in the tumor draining lymph nodes of MT/
ret mice without vitiligo and their depletion leads both to
a critically increased development of vitiligo correlated to
a significant decrease in metastases incidence. By selec-
Publications :
Ly6Chigh monocytes are potent anti-tumor effectors
controlled by regulatory CD4 T cells. Soumis
INSTITU DE BIOLOGIE DE L’ECOLE NORMALE SUPERIEURE - PARIS
INSERM U1024 - Génétique et Neurobiologie de C. elegans
member of the ER Membrane protein Complex (EMC).
This complex is composed of six conserved proteins. RNAi
against EMC members causes developmental defects,
resistance to levamisole and activation of stress reporters.
These results suggest that EMC is required for ER homeostasis in metazoans, and especially for proper folding or
assembly of AChR subunits. ●
In C. elegans, levamisole activates acetylcholine receptors
(AChRs) present at the neuromuscular junction causing
death at high concentrations. In a screen for mutants
partially resistant to levamisole, we identified one mutant
allele of a previously uncharacterized gene, which we
tentatively named emc-6.
emc-6 encodes a small protein containing two predicted
transmembrane domains. It is widely conserved from plant
to human. EMC-6 is ubiquitously expressed and localizes
to the endoplasmic reticulum. AChR expression is reduced
by 80% in emc-6 mutants. Biochemical evidence suggests
that EMC-6 is acting prior or during AChR assembly.
Publications :
ER assembly of AChR depends on a new complex essential
for ER homeostasis.
Magali Richard, Thomas Boulin, Janet Richmond, JeanLouis Bessereau
Soumission à PNAS Juillet 2012
Recently, the yeast ortholog of EMC-6 was identified as a
46
47
Poster
Poster
Nouvelles molécules perturbant la vascularisation tumorale: Synthèse, évaluation biologique
et recherche de métabolites d’ analogues de la combrétastatine A-4.
Toxines bactériennes ciblant les GTPases Rho et la voie cyclic-AMP : régulation
du cytosquelette d’actine et conséquences sur la perméabilité vasculaire
SOUSSI Mohamed Ali
STEFANI Caroline
FACULTE DE PHARMACIE DE L’UNIVERSITE PARIS XI - CHÂTENAY-MALABRY
UMR 8076 Biocis - Laboratoire de Chimie thérapeutique
CENTRE MEDITERRANEEN DE MEDECINE MOLECULAIRE - NICE
INSERM U1065 - Eqpe Toxines Microbiennes Relation Hôte Pathogènes
Dans cette communication, nous présentons nos travaux
concernant l’étude in vitro du métabolisme de l’isoCA-4
en présence de microsomes hépatiques humains. Cette
étude a permis d’identifier par HPLC et spectrométrie de
masse 6 métabolites de phase I. La synthèse, la cytotoxicité
et l’inhibition de la polymérisation de la tubuline de ces 6
métabolites sont rapportées. ●
La combrétastatine A-4 (CA-4), molécule naturelle isolée
d’un saule Sud-Africain, qui est caractérisée par un motif
stilbène de géométrie Z, présente des activités cytotoxiques in vitro nanomolaires sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines et inhibe la polymérisation
de la tubuline en microtubules à des concentrations micromolaires. De plus, cette molécule qui détruit sélectivement
la néovascularisation tumorale est actuellement en phase
clinique III et est utilisée aux USA dans le traitement du
cancer de la thyroïde.
Publications :
1. Mohamed Ali Soussi, Silvio Aprile, Samir Messaoudi,
Olivier Provot, Erika Del Grosso, Jérome Bignon, Joelle
Dubois, Jean-Daniel Brion, Giorgio Grosa, and Mouad
Alami.»The Metabolic Fate of isoCombretastatin A-4 in
Human Liver Microsomes: Identification, Synthesis and
Biological Evaluation of Metabolites», ChemMedChem
2011, 6, 1781–1788.
2. Mohamed Ali Soussi, Davide Audisio, Samir Messaoudi,
Olivier Provot, Jean-Daniel Brion, and Mouâd Alami. «Palladium-Catalyzed Coupling of 3-Halo-Substituted Coumarins, Chromenes, and Quinolones with Various
Nitrogen-Containing Nucleophiles», Eur. J. Org. Chem.
2011, 5077–5088.
L’inconvénient majeur de cette molécule prometteuse est
l’isomérisation partielle de la double liaison en stilbène E
inactif en milieu biologique. Pour palier ce problème, des
travaux au sein de notre laboratoire ont permis récemment
d’identifier et d’évaluer l’isoCA-4, isomère non naturel de
la CA-4. Ce composé stable et non isomérisable est
constitué d’un motif 1,1-diaryléthylène et présente les
mêmes activités biologiques que la CA-4. De récents
travaux sur des souris xénogreffées avec des tumeurs
humaines richement vascularisées ont montré le caractère
antivasculaire de l’isoCA4.
48
bactériens que nous souhaitons apporter un éclairage
nouveau dans la compréhension des mécanismes d’induction de perméabilité endothéliale médiés par le remaniement du cytosquelette d’actine. ●
La néovascularisation des tumeurs et l’augmentation de
perméabilité des vaisseaux tumoraux sont deux étapes
critiques de la progression tumorale, contrôlée de façon
clés par le cytosquelette d’actine. La perméabilité de
l’endothélium est assurée par la formation de différentes
structures intra- et intercellulaires. La contraction des
cellules endothéliales, médiée par celle du cytosquelette
d’actomyosine, permet l’ouverture de jonctions intercellulaires. La formation de larges pores transcellulaires
(impliqués dans la transmigraton des leucocytes), de réseaux de tubules vésiculo-vaculaires (VVO) ou de fenestrae, entrainent quand à elles une perméabilité
intracellulaire. Il est aussi de plus en plus clair que l’organisation et la dynamique du cytsoquelette d’actomyosine
est sous le contrôle de voies de signalisation majeures que
sont les voies des MAPK, des GTPases de la famille Rho
ou du cyclic-AMP. Ces voies sont également la cible de
bactéries pathogènes. C’est par l’étude de ces facteurs
Publications :
Co first (Maddugoda MP*, Stefani C*), Gonzalez-Rodriguez
D, Saarikangas J, Torrino S, Janel S, Munro P, Doye A,
Prodon F, Aurrand-Lions M, Goossens PL, Lafont F, Bassereau P, Lappalainen P, Brochard F, Lemichez E (2011).
cAMP signaling by anthrax edema toxin induces transendothelial cell tunnels, which are resealed by MIM via
Arp2/3-driven actin polymerization. Cell host and
Microbe.
Gonzalez-Rodriguez D, Maddugoda MP, Stefani C, Janel
S, Lafont F, Cuvelier D, Lemichez E, Brochard-Wyart F
(2012). Cellular Dewetting: Opening of Macroapertures
in Endothelial Cells (2012). Physical Review Letters
49
Poster
Contrôle de la dynamique de réplication par Chk1 chez les mammifères.
TECHER Hervé
CNRS UMR 3244 - Dynamique de l’information génétique : bases fondamentales et cancer
sion of p53R2, the DNA damage-induced subunit of the
ribonucleotide reductase (RNR), in response to increased
lesions arising spontaneously in such deficient cells. Our
results thus identify a new pathway by which repair cross
talks with replication when damage arises in S phase. ●
In metazoan cells, inactivation or depletion of various
proteins of the DNA damage response (DDR) slows replication forks and increases initiation density suggesting
that a common mechanism modulates the replication
dynamics in all cases. Here we show that Chk1 or Rad51
deficiency in mammalian cells limits DNA precursor availability, which slows fork movement and, consequently,
increases initiation density. The activation of dormant
origins relies solely on fork speed, independently of Chk1.
We also show that fork slowing results from over-expres-
Publications :
DNA damage response perturbs replication dynamics via
p53R2-dependent modulation of dNTP availability.
Hervé Técher et al. Publication soumise.
Poster
Identification des gènes régulés par les produits du gène de fusion TMPRSS2-ERG dans
le cancer de la prostate
TIAN Tian
INSTITUT DE BIOLOGIE DE LILLE - LILLE
CNRS UMR8161 - Eqpe Virus Cancer Transcription
dans ces cellules. A partir des ARN d’échantillons humains
de cancer de la prostate, nous avons établi une corrélation
entre l’expression du gène OPN et celle de la fusion TMPRSS2-ERG de manière significative. Enfin, dans les tissus
cancéreux prostatiques, l’immuno-marquage de l’OPN
co-localise avec celui de TMPRSS2-ERG. Ces résultats
suggèrent que l’OPN est un gène directement régulé par
TMPRSS2-ERG dans le cancer de la prostate, et pourrait
contribuer à la formation de la métastase osseuse.
Issu de remaniements chromosomiques, le gène de fusion
TMPRSS2-ERG a été identifié dans plus de 50% des cas
de cancer de la prostate et est associé à un mauvais pronostic. Cette découverte a ouvert une nouvelle voie dans
la compréhension du processus de cancérisation de la
prostate. De manière intéressante, nous avons montré que
le gène ERG, qui code pour un facteur de transcription
membre de la famille ETS, est associé à la mise en place
du cartilage et du squelette et joue donc un rôle dans la
physiologie osseuse. Le cancer de la prostate, lorsqu’il
évolue, est connu pour métastaser à l’os dans 80% des
cas. Ces métastases sont essentiellement caractérisées
par une formation anarchique de l’os, on parle de métastases ostéocondensantes voir mixtes (lytique/condensantes). L’implication de ERG dans le cancer de la prostate
et dans la physiologie osseuse, nous a donc poussé à étudier
l’implication du gène de fusion TMPRSS2-ERG dans la mise
en place des métastases osseuses dérivées du cancer de
la prostate.
In vivo, ces lignées de cellules cancéreuses prostatiques,
qui expriment stablement TMPRSS2-ERG, ont été injectées
chez les souris SCID par la voie intra-tibiale afin d’étudier
leur capacité à induire la formation de métastases osseuses. L’évaluation par rayons X des surfaces ostéolytiques et de l’ostéoformation ainsi que du volume osseux
(BV/TV : Bone Volume/Tissu Volume) nous permettent
de souligner une augmentation de la formation osseuse
au niveau des métastases induites par les cellules qui expriment la fusion.
Pour notre étude, nous avons établi des lignées de cellules
cancéreuses prostatiques qui expriment stablement
TMPRSS2-ERG, comprenant l’essentiel des domaines
fonctionnels de la protéine ERG. Dans un premier temps,
parmi les gènes cibles potentiels des facteurs ERG, nous
avons étudié le gène de l’Ostéopontine (OPN) dont l’expression est associée au processus métastatique de
nombreux cancers. Nos résultats ont montré que son
expression est augmentée dans les cellules qui expriment
stablement TMPRSS2-ERG. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine ont montré la fixation
spécifique de la protéine ERG sur le promoteur de l’OPN
50
En conclusion, nos résultats suggèrent l’existence d’une
influence qualitative et quantitative de l’expression de la
fusion TMPRSS2-ERG dans la formation des métastases
osseuses dérivées du cancer de la prostate. ●
Publications :
Flajollet, S., Tian, T. V., Flourens, A., Tomavo, N., Villers,
A., Bonnelye, E., Aubert, S., Leroy, X., and Duterque-Coquillaud, M. Abnormal expression of the ERG transcription
factor in prostate cancer cells activates osteopontin. Mol
Cancer Res 9, 914-924 (2011).
51
PRIX HÉLÈNE STARCK - Post-doctorat
Communication orale
Identification de nouveaux facteurs angiocrines contrôlant positivement l’expansion
des cellules souches des gliomes
GALAN MOYA Eva Maria
INSTITUT COCHIN - PARIS
Department of Endocrinology, Metabolism and Cancer - Team: Vascular niche and tumor micro-environment
Financement de la Fondation ARC : 1er Post-doctorat en France (après la thèse)
PRIX HÉLÈNE STARCK
CATÉGORIE POST-DOCTORAT
Communication orale / Poster
INTRODUCTION:
Glioblastoma multiforme are malignant primary tumors
of the central nervous system that remain one of the most
deadly cancers in adults. These tumors contain self-renewing cancer stem cells (GSC), which are believed to be
responsible for the failure of current treatments by inducing
angiogenesis, tumour invasion and establishing drug resistance. Thus, targeting GSC population may be interesting for the design of therapies to treat these brain
tumours.
GSCs are inextricably associated with the brain vasculature, being lodged within an endothelial structure that
provides a specific and confined microenvironment, which
is probably involved in the regulation of its renewal and
fate (Galan-Moya and Gavard, Cell Cycle 2011). A study
recently published by our group provides insights on how
secreted factors from brain endothelium sustain the GSC
population (Galan-Moya et al. EMBO Reports 2011). We
show that the two mTOR complexes, mTORC1 and
mTORC2, act as an obligatory gateway to maintain GSC
expansion. Furthermore, the endothelial secretome sustains mTOR activity and GSC survival, and therefore targeting the communication between endothelial cells and
GSC may be an effective therapeutic strategy for glioma.
compared to differentiated cultures. Because mTOR is
aberrantly active in glioma, phosphorylation of its effectors
Akt and S6 were examined. Interestingly, only sphereforming cells exhibited basal activation of Akt and S6, while
no signal was detected in differentiated cells. Thus, our
data suggest that mTOR activation is lost upon differentiation. Hence, mTOR activation rather relies on environmental modifiers, such as non-adhesive cultures and presence
of mitogens, than intrinsic properties.
Next, to evaluate its contribution on GSC expansion, mTOR
was pharmacologically inhibited at three different levels:
mTOR complex 1 (rapamycin), mTOR kinase activity
(PP242) and a dual action on PI3K and mTOR (PI103). All
drugs significantly alter mTOR phosphorylation and downstream signalling in GSC as well as decrease Sox2-expressing neurospheres number and size, as well as cell viability.
Hence, pharmacological inhibition of the mTOR pathway
leads to a dramatic drop-off in the number of GSC.
To firmly establish the role of the mTOR machinery in GSC
maintenance, we knocked down mTOR expression by RNA
interference, as well as its partners Rictor and Raptor. We
observed that Akt and S6 activation were severely impaired
in the absence of mTOR, while Rictor and Raptor silencing
hampers only either Akt serine phosphorylation or S6
activation, respectively. Thus, signalling through Raptor
and Rictor could still be independently blocked, suggesting
that despite its constitutive activation, the mTOR axis is
not aberrantly regulated in GSC. Interestingly, Sox2 expression is weakened when either mTOR, Rictor or Raptor are
silenced. In addition, GSC expansion is severely diminished
as monitored by secondary neurosphere formation and
MTT. Altogether, our results suggest that the two mTOR
complexes cooperate to maintain GSC properties and that
their individual loss of function interferes with GSC
survival.
As previously mentioned, GSC reside within a specific and
confined microenvironment orchestrated by a vascular
unit. To further study this aspect, GSC were cultured on
brain EC monolayer, using an in vitro model for the human
PROJECT DESCRIPTION:
Adult GBM contain a subpopulation of cells that retain the
ability to expand ex vivo as neurospheres in mitogen-defined medium and share many characteristics with normal
stem cells, including self-renewal ability and multipotent
differentiation. Our group counts with four patient-derived
GSC lines, which can efficiently form neurospheres while
expressing neural stem cell markers: the transcription
factor Sox2 and the intermediate filament protein Nestin.
Upon differentiation assay by induction of cell adhesion
and mitogen withdrawal, most cells express Tubulin βIII,
a marker for neural lineage.
We further investigated whether intrinsic signalling pathways are differentially regulated in growing neurospheres
53
Communication orale
CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES:
In summary, our study reinforces the emerging concept
that brain vasculature supplies essential signals to maintain
GSC identity. Altogether, our results unveil an active communication between endothelial cells and GSC, and support
a model in which endothelial soluble factors uphold stemness. In this vital dialogue, the mTOR signalling nexus
emerges as a central player. Therefore, altering the molecular transmission between endothelial cells and cancer
stem cells may be an effective therapeutic strategy for
tumour treatment.
The identification and further characterization of the EC
secreted factors will be necessary for the successful advance of this project. For that purpose the effect of each
of these factors on GSC properties and survival will need
to be studied. ●
blood brain barrier. Surprisingly, in the absence of exogenous mitogens, GSC retained their identity, as evidenced
by Sox2 expression and lack of morphological signs of
differentiation. This suggests that EC could act as a feeding
bed for GSC by providing the essential microenvironment
that might recapitulate the vascular niche, at least at the
level of GSC protection. To challenge the effects of the
endothelial secretome, EC conditioned medium (CM) was
used to culture GSC. Interestingly the growth of Sox2/
Nestin-expressing neurospheres persists in the presence
of the EC secretome. Overall, our results support the idea
of an informative transference between EC and GSC,
whereby endothelial secreted factors could retain GSC
properties.
We next explored whether EC secretome might modulate
the mTOR signalling nexus in GSC. Fascinatingly, activation
of mTOR downstream effectors Akt and S6 are exclusively
restored with endothelial. Supporting this, the use of mTOR
inhibitors as well as siRNAs against the different component of the pathway halt endothelial-promoted secondary
neurosphere formation and cell viability. Thus, the endothelial secretome might substitute for the additive mitogens contained in GSC culture media and sustain
neurosphere integrity and mTOR activity.
Publications :
-”Semaphorin 3A elevates endothelial cell permeability
through PP2A inactivation”. Le Guelte A, Galan-Moya EM,
Dwyer J, Treps L, Kettler G, Hebda JK, Dubois S, Auffray
C, Chneiweiss H, Bidere N, Gavard J. J Cell Sci. 2012 Jun
8. [Epub ahead of print]
-”Differential proteomic analysis of human glioblastoma
and neural stem cells reveals HDGF as a novel angiogenic
secreted factor”. Thirant C, Galan-Moya EM, Dubois LG,
Pinte S, Chafey P, Broussard C, Varlet P, Devaux B, Soncin
F, Gavard J, Junier MP, Chneiweiss H. Stem Cells. 2012
May;30(5):845-53. doi: 10.1002/stem.1062.
- “Secreted factors from brain endothelial cells maintain
glioblastoma stem-like cell expansion through the mTOR
pathway”. Galan-Moya EM, Le Guelte A, Fernandes EL,
Thirant C, Dwyer J, Bidere N, Couraud PO, Scott MG, Junier
MP, Chneiweiss H, Gavard J. EMBO Rep. 2011 May
1;12(5):470-6. Epub 2011 Apr 1.
-”Feeding the hungry enemy: an endothelial recipe for
glioma stem cells”. Galan-Moya, E.M. and Gavard J. Cell
Cycle. 2011 Aug 1;10(15):2403-4. Epub 2011 Aug 1.
More recently, in collaboration with the proteomic platform
at the Cochin Institute, our group has identified several
secreted factors and confirmed their essential role in the
maintenance of the GSC phenotype, through the control
exerted on the mTor pathway and the regulation of the
expression of stemness markers, such as Nestin and Sox-2.
Our preliminary results suggest that blocking either the
endothelial production of these angiocrine factors or their
cognate GSC receptor activation might be of interest to
alter the endothelium/GSC dialogue, critical for the integrity of the GSC fraction, rendering glioblastoma more
susceptible to conventional therapies (Galan-Moya et al.
manuscript in preparation).
54
Isocitrate deshydrogénase et mutation Arg132His : impact pronostique et sur la réponse
à la radio- et chimiothérapie
LABUSSIERE Marianne
INSTITUT DU CERVEAU ET DE LA MOELLE EPINIERE - PARIS
CNRS UMR 7225 - INSERM U 975
Description du projet
Dans un premier temps, nous avons recherché la mutation
du gène IDH1 sur une série de 1838 tumeurs cérébrales. Nos
résultats montrent que la mutation de IDH1 n’est présente
que dans les gliomes et que sa fréquence est liée au grade
et au profil génétique de la tumeur. De façon intéressante,
nous avons montré que les gliomes porteurs de la co délétion
des chromosomes 1p19q (marqueur de chimiosensibilité)
présentaient systématiquement soit la mutation de IDH1,
soit une mutation de IDH2, isoforme mitochondriale de IDH1
(Labussiere, et al. Neurology 2010). Enfin, une analyse RPA
(recursive partitioning analysis) nous a montré que la mutation de IDH1 est le facteur pronostique indépendant le plus
puissant dans les gliomes (article soumis).
La mutation IDH1 est quai exclusivement retrouvée dans les
gliomes, elle revêt donc un impact diagnostique majeur. Pour
la mise au point d’un test diagnostique, nos investigations
ont porté sur la recherche de métabolites anormaux produit
par l’enzyme mutante et sur la détection de la mutation dans
les fluides biologiques. Des expérimentations en biochimie
ont été menées en collaboration avec le Dr C. Ottolenghi du
Service de Biochimie Métabolique de l’Hôpital Necker. Nous
avons recherché le 2 hydroxyglutarate dans le plasma et
dans les urines de patients atteints de gliomes. Nos résultats
montrent que les patients dont le gliome est porteur de la
mutation IDH1 ont un taux urinaire de 2 hydroxyglutarate
significativement plus élevé que les patients atteints d’un
gliome IDH1 non muté. En parallèle, nous avons mis au point
une technique de biologie moléculaire, la COLD PCR HRM,
permettant de détecter la mutation IDH1 dans un environnement très contaminé par de l’ADN normal. Nous avons
montré que cette approche permettait de mettre en évidence
la mutation IDH1 sur des prélèvements anatomopathologiques (berges de la cavité chirurgicale, biopsies non contributives) pour lesquelles l’observation histologique
n’identifiait pas de cellules tumorales (Boisselier et al., Human Mutation 2011). Nous avons ensuite entrepris de recherche la mutation du gène IDH1 dans le plasma, afin de
permettre le diagnostic à partir d’une simple prise de sang.
Introduction
Les gliomes sont les tumeurs cérébrales primitives les plus
fréquentes et les plus graves. En dépit des progrès réalisés
en imagerie, en neurochirurgie ainsi que dans les approches
thérapeutiques, le pronostic des patients atteints de tumeurs
cérébrales primitives reste très péjoratif : dans le cas des
formes les plus graves (glioblastome), la survie médiane
n’excède pas 15 mois.
Tout récemment, un nouveau gène IDH1 codant pour l’isocitrate deshydrogénase 1 a été retrouvé fréquemment muté
dans les gliomes. Les données rapportées dans la littérature
suggèrent que la mutation d’IDH1 jouerait un rôle important
dans la formation des tumeurs astrocytaires et oligodendrogliales. La mutation de IDH1 se traduit non seulement par
une perte de la fonction enzymatique normale (transformation de l’isocitrate en α-ketoglutarate), mais également par
un gain de fonction (transformation de l’α-ketoglutarate en
2 hydroxyglutarate). En outre, nous avons montré sur une
série de plus de 400 gliomes que cette mutation récurrente
Arg132His était très liée au grade histologique et au profil
génétique, mais surtout qu’elle était corrélée à un meilleur
pronostic. Outre sa valeur de marqueur pronostique, IDH1
revêt une importance fonctionnelle majeure dans la lutte
contre le stress oxydatif. En effet, cette enzyme catalyse la
carboxylation de l’isocitrate en α-ketoglutarate, conduisant
à la génération de NADPH, cofacteur indispensable à la
production cytosolique de glutathion réduit, composant
anti-oxydant majeur. A ce titre, IDH1 pourrait être impliquée
dans la réponse à la radio- et à la chimiothérapie en participant à la résistance à la mort cellulaire.
Dans ce cadre, nos objectifs étaient de :
1. démontrer la valeur pronostique sur une très large série
de gliomes,
2. élaborer un test simple rapide et reproductible permettant de détecter la présence de la mutation,
3. comparer d’abord in vitro puis in vivo la sensibilité de la
forme mutée, par rapport à la forme non mutée, à la radiothérapie et à la chimiothérapie
55
Communication orale
intracellulaire. Des analyses transcriptomiques sont également en cours afin d’étudier les patrons d’expression
des cellules tumorales porteuses de la mutation IDH1 par
rapport à des cellules tumorales non mutées, dans des
condition de normo- et d’hypoxie. Enfin, le rôle d’IDH1 dans
la réponse au stress oxydant reste à préciser. Au final, la
mutation de IDH1 a ouvert des perspectives à de multiples
niveaux dans la compréhension des mécanismes conduisant à la formation des gliomes, ainsi que dans les mécanismes de réponse aux traitements. ●
Nos données ont montré que la détection de la mutation
IDH1 est possible au niveau plasmatique avec une sensibilité
de 60% pour une spécificité de 100%, tous gliomes confondus (Boisselier et., Neurology 2012). Cette sensibilité atteint
71% pour les patients atteints de gliomes de haut grade. Ces
travaux font l’objet d’une demande de brevet déposée auprès
de l’office européen des brevets.
Nous nous sommes ensuite concentrés sur la place de IDH1
dans la réponse aux traitements par radiochimiothérapie et
chimiothérapie. Pour cela, nous avons transduit des cellules
tumorales gliales humaines (lignée HTB14) avec des systèmes lentiviraux permettant une surexpression de la forme
mutée d’IDH1. Nos résultats montrent qu’en conditions
classiques de culture cellulaire, la mutation de IDH1 ne modifie pas la sensibilité des cellules tumorales aux traitements
(témozolomide, carmustine, radiothérapie). En revanche, il
semble qu’en condition d’hypoxie modérée (1% O2) les
cellules porteuses de la mutation soient plus sensibles aux
effets cytotoxiques de la radiothérapie. Nous tentons de
confimer ces données sur des modèles in vivo de xénogreffes
orthotopiques chez la souris nude. Enfin, nous avons démarré
des premières investigations concernant la croissance des
cellules porteuses de la mutation IDH1. Il semble que leur
croissance soit fortement dépendante de la présence de
glutamine dans le milieu de culture. Des investigations
complémentaires sont en cours afin de mieux comprendre
cet aspect.
Publications :
Wang XW, Boisselier B, Rossetto M, Marie Y,Idbaih A,
Mokhtari K, Gousias K, Hoang-Xuan K, Delattre JY, Simon
M, Labussière M, et al.»IDH1 rs11554137 impact on glioblastoma patients prognosis». Cancer 2012, submitted.
Boisselier B, Gállego Pérez-Larraya J, Rossetto M, Labussière
M,et al. «Detection of IDH1 mutation in the plasma of glioma
patients». Neurology 2012, in press.
Rossetto M, Ciccarino P, Boisselier B, Labussière M, et al.
«Metabolism of glioma and IDH1/IDH2 mutations». Revue
Neurol. 2011, 167 (10), 699-703.
Ducray F, Idbaih A, Wang, XW, Cheneau C, Labussiere M
et al. “Predictive and prognostic factors for gliomas”. Expert
Rev Anticancer Ther. 2011, 11(5), 781-789.
Desestret V, Ciccarino P, Ducray F, Crinière E, Boisselier B,
Labussière M, et al. «Prognostic stratification of gliomatosis
cerebri by IDH1 R132H and INA expression». Journal of Neuro
Oncology. 2011, 105 (2), 219-224.
Boisselier B, Marie Y, Labussière M, et al. «Cold-PCR HRM:
a highly sensitive detection method for IDH1 mutation»
Human Mutation 2010, 31 (12), 1360-1365.
Labussière M, et al.»IDH1 gene mutations: a new paradigm
in glioma prognosis and therapy?». The Oncologist 2010,
15(2), 196-199.
Labussière M, et al. «IDH1/IDH2 is systematically mutated
in 1p19q codeleted gliomas.» Neurology 2010, 74,
1886-1890.
Labussière M, et al. «Prognostic markers in gliomas: a review»
Future Oncology 2010, 6 (5), 733-739.
Conclusion et perspectives
Nos travaux ont montré que la mutation du gène IDH1 était
un facteur pronostique de premier ordre dans les gliomes
et permettaient de raffiner la classification histologique
des gliomes. De plus, la mutation de IDH1 constitue un
élément diagnostique de premier ordre. La mesure de
l’accumulation de 2 hydroxyglutarate, ainsi que la détection
de la mutation dans le plasma apparaisse aujourd’hui
comme des outils diagnostiques prometteurs pour le suivi
des patients atteints de gliomes. Il semble en outre que la
mutation du gène IDH1 induise des modifications très
importantes au niveau du métabolisme et de la signalisation
Le rôle de Rpp30 (RNaseP protein 30) dans la formation de piRNAs et le contrôle d’éléments
transposables pendant l’ovogenèse chez D.melanogaster: une relation inattendue entre
les tRNAs et les piRNAs
MOLLA HERMAN Anahi
INSERM U934, CNRS 3215 - Eq. Développement des cellules germinales.
[Clegg,NJ.97] nous a invités à savoir si Rpp30 pourrait
être impliqué dans la formation des piRNAs et la régulation
des éléments transposables. Rpp30 est une sous-unité du
complexe RNase P, une ribozyme très conservé au cours
de l’évolution dont la fonction principale connue est le
clivage des pre-tRNAs pour former des tRNAs matures
[Phizicky.EM et Hopper,AK.2012]. Ainsi, nous nous
sommes intéressés à mieux comprendre la relation qui
pouvait avoir entre la formation des tRNAs, des piRNAs,
et la protection du génome dans la lignée germinale.
Dans le laboratoire nous nous intéressons au développement des cellules germinales chez la drosophile, car il s’agit
d’un modèle d’étude hautement compétitif et intéressant
qui permet de développer la créativité scientifique et
d’étudier toute sorte de question biologique. Les ovaires
de drosophile sont constitués d’ovarioles, formées des
chambres ovariennes issues des cellules souches germinales. Chaque chambre est constituée d’un ovocyte et de
15 cellules nourricières [Huynh,JR. 04]. L’ovocyte donnant
l’organisme adulte après fécondation, il est très important
de préserver le matériel génétique au sein de la lignée
germinale. Dans ce processus, la voie ARN interférence
(RNAi) joue un rôle principal, et son dysfonctionnement
est lié à des processus cancéreux par de mécanismes mal
compris [Esteller.M 2011]. Plusieurs composants de la voie
RNAi se trouvent localisés autour des noyaux des cellules
nourricières dans « le nuage » [Malone,CD.09]. Parmi les
ARNs non codants (ncRNAs) qui y participent nous nous
intéressons aux miRNAs, siRNAs et notamment aux piRNAs. Les piRNAs sont des ARNs qui répriment l’expression
d’éléments transposables (ET, éléments génétiques «égoïstes» qui peuvent s’insérer dans le génome altérant
l’expression génique). les piRNAs inhibent ces ET grâce à
leur interaction avec les protéines PIWI [Malone,CD.09].
La formation des piRNAs à partir du transcrit primaire
reste un mystère. En effet, il a été suggéré qu’un transcrit
serait formé à partir de clusters de piRNAs, et que ce
transcrit serait clivé par un facteur inconnu, formant les
piRNAs primaires. Puis, ces piRNAs primaires seraient
amplifiés au sein du «nuage» en formant les piRNAs secondaires [Senti,KA et Brennecke,J. 2010].
Grâce à des expériences de génétique et d’immunofluorescence, mes résultats ont permis de montrer que la mutation
de Rpp30 entraîne un arrêt précoce de l’ovogenèse. Parallèlement, j’ai pu montrer que la mutation d’autres composants
du complexe RNaseP provoque le même type d’arrêt. D’autre
part, j’ai observé que la mutation de Rpp30 entraîne une altération des quelques composants du «nuage». En accord avec
ces résultats, des analyses de séquençage à haut débit que
nous faisons en collaboration avec C. Antoniewski (Jussieu)
montrent que la population des piRNAs est très affectée dans
notre mutant. De plus, ceci s’accompagne d’une dérégulation
de certains retrotransposons et d’éléments transposables
(ET) comme j’ai pu montrer par qRT-PCR (PCR quantitative).
En effet, comme suggéré pour d’autres mutants de la voie
des piRNAs, les ET peuvent s’insérer dans le génome et
provoquer l’apparition de dommages à l’ADN et activer le
« checkpoint » Chk2. De façon intéressante, la mutation de
Chk2 dans notre mutant supprime l’arrêt de croissance dans
l’ovogenèse et restaure le phénotype.
En conclusion, nos résultats montrent que Rpp30 joue un
rôle dans la formation des piRNAs et dans la régulation de
certains éléments transposables dans la lignée germinale,
ouvrant des nouvelles perspectives dans l’étude de la relation des tRNAs et piRNAs.
Un crible génétique a été effectué au sein du laboratoire
afin de trouver des nouveaux gènes impliqués dans l’ovogenèse précoce. Parmi eux, j’ai pu démontrer que Rpp30
est le gène affecté dans un des mutants, dont la mutation
est responsable de la formation de femelle viables mais
stériles, avec des ovaires très atrophiés. Sa ressemblance
phénotypique avec un mutant de la voie des piRNAs
56
Ainsi, bien que le rôle principale de la RNase P est de cliver
des pre-tRNA, Rpp30 pourrait également être responsable
57
Communication orale
Publications :
-The ciliary pocket: a once-forgotten membrane domain
at the base of cilia.
Ghossoub R, Molla-Herman A, et al. Biol Cell. 2011
Mar;103(3):131-44. Review.
-The AP-1 clathrin adaptor facilitates cilium formation and
functions with RAB-8 in C. elegans ciliary membrane
transport.
Kaplan OI, Molla-Herman A et al. J Cell Sci. 2010 Nov
15;123(Pt 22):3966-77. Epub 2010 Oct 27.
-The ciliary pocket: an endocytic membrane domain at the
base of primary and motile cilia.
Molla-Herman A et al. J Cell Sci. 2010 May 15;123(Pt
10):1785-95. Epub 2010 Apr 27.
-Targeting of beta-arrestin2 to the centrosome and primary
cilium: role in cell proliferation control.
Molla-Herman A et al. PLoS One. 2008;3(11):e3728. Epub
2008 Nov 14.
-Clinical, cellular, and neuropathological consequences of
AP1S2 mutations: further delineation of a recognizable
X-linked mental retardation syndrome.
Molla-Herman A et al. Hum Mutat. 2008 Jul;29(7):
966-74.
-Intracellular trafficking of CD23: differential regulation in
humans and mice by both extracellular and intracellular
exons.
Montagnac G, Mollà-Herman A et al. J Immunol. 2005
May 1;174(9):5562-72
du clivage des transcrits primaires qui donnent les piRNAs
primaires, pouvant être le facteur tant recherché par la
communauté des ncRNAs. Ainsi, nous allons étudier par
qRT-PCR si le transcrit primaire est accumulé dans notre
mutant et nous allons étudier le processus de clivage des
pre-tRNAs en tRNAs matures par Northern Blot.
D’autre part, il a été montré très récemment que des tRNAs
peuvent former des fragments de tRNAs (tRFs), auparavant
considérés comme produits de dégradation. Cependant,
ces tRFs peuvent se lier aux protéines PIWI et AGO pouvant
jouer un rôle de piRNAs [Sobala,A. and Hutvagner,G.2011].
Ainsi, il est également possible que Rpp30 joue un rôle
dans la formation de tRFs qui se comportent comme des
piRNAs. Actuellement, nous étudions en détail les tRFs
que nous retrouvons dans notre séquençage à haut débit
et nos résultats préliminaires montrent qu’il y a une population de tRFs d’une taille similaire aux piRNAs qui disparait
dans notre mutant. Finalement, il a été montré que les
tRNAs servent des amorces pour le processus de retrotranscription en se liant à des séquences spécifiques de
retrovirus comme le HIV et des retrotransposons
[Li,Z.2012], ce qui suggère l’importance des tRFs dans la
protection du génome d’éléments transposables et met
en avant de nouvelles fonctions des ncRNAs, longtemps
négligés et très en vogue actuellement. Enfin, grâce à l’aide
de la fondation ARC je pourrai bientôt finir ces analyses
et soumettre un article scientifique de qualité à un journal
international de grande valeur, en aidant dans le futur à
une meilleure compréhension du rôle des ncRNAs dans la
protection du génome et les processus cancéreux. ●
L’éducation des cellules Natural Killers par le récepteur activateur NKp46 calibre leur
réactivité fonctionnelle anti-tumorale et anti-virale.
NARNI-MANCINELLI Emilie
CENTRE D’IMMUNOLOGIE DE MARSEILLE LUMINY - MARSEILLE
UMR7280 - laboratoire Cellules Natural Killers et immunité innée
Introduction
Le système immunitaire est classiquement divisé en 2
composantes : l’immunité innée et l’immunité adaptative.
La première ligne de défense de l’organisme dite ‘naturelle’
ou ‘innée’ est essentielle au contrôle rapide d’un stress
infectieux, physique ou encore chimique et n’est pas spécifique d’un antigène. La seconde ligne de défense dite
‘adaptative’ se met en place au bout de quelques jours et
est spécifique des antigènes rencontrés. L’immunité adaptative est représentée par les lymphocytes T et B qui ont
la capacité de garder en mémoire une primo-activation.
Lors de leur réexposition à l’agent ayant causé ce stress,
les lymphocytes mémoires se réactivent et contrôlent très
rapidement l’agression ce qui a pour conséquence de limiter la gravité des symptômes ainsi que leur durée. C’est
cette propriété du système immunitaire que nous cherchons à exploiter par la vaccination.
les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de
classe I (CMH-I) qui sont constitutivement exprimées par
les tissus sains mais dont l’expression peut être diminuée
à la suite du stress causé par l’infection ou à cause de
l’agent infectieux lui-même. Cette réduction du nombre
des molécules du CMH-I diminue les signaux inhibiteurs
délivrés aux cellules NK les rendant plus sensibles à l’activation. Celle-ci est la conséquence de l’engagement des
récepteurs activateurs comme les Killer cell immunoglobuline-like receptors (KIR) activateurs (KIR-S) chez
l’homme et les récepteurs Ly49 chez la souris, les récepteurs NKG2D et CD16 et la famille des natural cytotoxicity
receptors NKp46, NKp30 et NKp44. Afin de mieux comprendre la régulation de la réactivité des cellules NK, nous
avons cherché à générer des souris mutantes qui présentent des défauts d’activation des cellules NK. Pour cela,
nous avons induit des mutations de manière aléatoire à la
suite de l’injection dans des souris d’un agent mutagène
chimique, le N-nitroso-N-éthylurée (ENU), à la suite d’une
collaboration initialement mise en place avec le groupe de
Bruce Beutler.
Les cellules Natural Killers sont aussi des lymphocytes
mais sont généralement considérés comme des composants du système immunitaire inné parce qu’ils n’expriment
pas de récepteurs spécifiques à un antigène. Bien que le
nombre de cas de déficience NK chez l’homme soit extrêmement faible, les cellules NK ont été montrées, chez
l’homme et chez la souris, comme étant des acteurs majeurs de la lutte précoce contre des infections virales - et
notamment des infections par des virus de la famille des
herpesvirus - et de l’immunosurveillance tumorale.
Résultats
Nous avons identifié une souris, appelée Noé, chez laquelle
les cellules NK sont plus réactives face à des cellules tumorales in vitro. Ce phénotype est intrinsèque aux cellules
NK de la souris Noé et nous avons montré que l’hyperréactivité de ces cellules permet une meilleure résistance
des souris lors d’infections virales. Le séquençage du génome complet de la souris Noé a révélé une mutation dans
le gène codant pour le récepteur NKp46. Cette mutation
prévient l’expression de NKp46 à la surface des cellules.
Comme NKp46 était décrit comme étant un récepteur
activateur des cellules NK matures chez l’homme et chez
la souris, il était surprenant d’observer que l’absence
d’expression d’un récepteur activateur à la surface des
cellules NK puisse être responsable de leur hyperréactivité.
Cependant, grâce à une complémentation génétique des
souris Noé par un transgène NKp46 humain, nous avons
Les cellules NK reconnaissent les cellules stressées et/ou
infectées et elles les éliminent grâce à des activités effectrices cytolytiques. Les cellules NK sécrètent également
des cytokines et participent à l’élaboration des réponses
immunitaires adaptatives. L’activation des cellules NK doit
donc être strictement régulée afin que ces cellules soient
efficaces sans être dangereuses pour l’hôte. Les cellules
NK reconnaissent leurs cibles grâce à un système de détection composé de récepteurs inhibiteurs et activateurs. Les
récepteurs inhibiteurs des cellules NK interagissent avec
58
59
Communication orale
la conception de nouveaux traitements thérapeutiques
anti-tumoraux avec un intérêt particulier pour les patients
présentant des déficiences en lymphocytes T, tels que les
patients qui subissent une greffe de cellules souches hématopoïétiques ou une chimiothérapie anticancéreuse.
pu formellement démontrer que l’expression de NKp46
est nécessaire à la calibration du seuil de réactivité des
cellules NK.
Nous avons ensuite montré que cette régulation s’opère
par l’intermédiaire de la baisse d’expression de Helios, un
facteur de transcription de la famille Ikaros connue pour
réguler le seuil de réactivité des lymphocytes T et B. La
régulation de l’expression de Helios par le récepteur activateur NKp46 n’est pas sans rappeler la régulation des
facteurs de transcription de la famille Ikaros par le prérécepteur T et B, suggérant que le lignage lymphoïde utilise
des mécanismes similaires pour assurer sa différentiation
(discuté dans Narni-Mancinelli et al., Int Immunol., 2011).
Nous avons ensuite mis en évidence que la régulation de
l’activité des cellules NK est cruciale pour le développement
ultérieur de la réponse adaptative antimicrobienne primaire
et la génération de lymphocytes mémoires protecteurs.
Enfin, nous avons montré que l’injection d’anticorps bloquant anti-NKp46 chez des souris sauvages au cours du
développement des cellules NK permet de mimer le phénotype des cellules NK des souris Noé. Ainsi, nous arrivons
à programmer des cellules NK qui sont hyperréactives
contre des cellules tumorales in vitro. Ces travaux ont fait
l’objet d’une publication dans Science (Narni-Mancinelli
et al., Science, 2012) ainsi que d’un brevet.
Afin d’être en mesure d’exploiter le pouvoir fonctionnel
des cellules NK, nous allons également cherché à identifier
le(s) ligand(s) de NKp46 exprimé(s) par des cellules en
réponse au stress, caractériser l’activité fonctionnelle des
cellules NK activées à la suite de l’engagement de NKp46
et évaluer le rôle de cette réponse effectrice dans l’immunité. Nous pensons que les réponses à ces questions
constituent un enjeu majeur pour notre compréhension
du rôle biologique des cellules NK et pour la conception
rationnelle de nouvelles thérapies. ●
Publications :
E. Narni-Mancinelli, BN. Jaeger, C. Bernat, A. Fenis, S. Kung,
A. De Gassart, S. Mahmood, M. Gut, S. Heath, J. Estellé,
E. Bertosio, F. Vély, L. Gastinel, B. Beutler, B. Malissen, M.
Malissen, I. Gut, E. Vivier and S. Ugolini. Tuning of Natural
Killer Cell Reactivity by NKp46 and Helios Calibrates T
Cell Responses. 2012. Science. 335(6066):344-8.
E. Narni-Mancinelli, S. Ugolini and E. Vivier. NKp46-mediated NK cell tuning. Patent Number 61/499,485.
E. Narni-Mancinelli, E. Vivier, YM. Kerdiles. The ‘T-cellness’ of NK cells: unexpected similarities between NK cells
and T cells. 2011. Int Immunol. 23(7):427.
Perspectives
Ces résultats, à priori contre intuitifs, ouvrent la voie pour
Identification d’une nouvelle voie de signalisation aPKC-Cortactine-MT1-MMP requise
à l’invasion tumorale dans les cancers du sein
ROSSE Carine
CNRS UMR 144 - Laboratoire de la Dynamique du Cytosquelette et de la Membrane
Financement de la Fondation ARC : 2ème Post-doctorat en France (retour)
perdent leur architecture polarisée de type apico-basale,
deviennent moins adhérentes et acquièrent des capacités
migratoires plus importantes. La polarisation cellulaire
nécessite la distribution asymétrique de molécules de
signalisation, de l’adhérence cellulaire et du cytosquelette
ainsi que du trafic membranaire. Parmi les protéines essentielles à la polarité, les kinases C atypiques (aPKC) sont
localisées au niveau des jonctions serrées des cellules
épithéliales ainsi qu’au front de migration des cellules
migrantes, tout comme le complexe exocyste. Les aPKC,
PKC zêta et PKC iota, sont des sérine/thréonine kinases
qui, contrairement aux autres PKCs, ne sont régulées ni
par le diacylglycérol ni par le calcium. De manière notable,
PKC iota est oncogénique et surexprimée dans de nombreux cancers dont les cancers du sein.
Les cellules cancéreuses ont la capacité de proliférer de
manière non contrôlée formant ainsi une tumeur primaire.
Mais elles sont également capables d’envahir et ainsi
métastaser des organes distants. La formation de métastases est responsable de 90% de la mortalité due aux
cancers.
La formation de métastases issues de carcinomes requiert
tout d’abord une transition épithéliale mésenchymateuse,
puis l’invasion des cellules tumorales et enfin l’intravasation
de celles-ci qui vont disséminer dans le sang ou la lymphe
pour aller coloniser des organes distants. L’invasion tumorale nécessite à la fois la destruction de la membrane basale
et la migration des cellules cancéreuses. Les cellules tumorales invasives développent des protrusions membranaires,
appelées invadopodes, pour pénétrer la matrice extracellulaire et la remodeler. La dégradation de la matrice associée à ces structures est assurée par des métalloprotéases
de la matrice, qui sont membranaires comme MT1-MMP
(« membrane type 1 metalloprotease ») ou sécrétées,
comme MMP2 ou MMP9. Lors de l’invasion, ces protéases
sont délivrées et/ou activées au niveau de l’invadopode.
La métalloprotéase clé de ce processus est MT1-MMP :
elle est surexprimée dans de nombreux cancers, notamment dans les cancers du sein et est requise pour la dégradation du collagène interstitiel et l’invasion tumorale in
vivo. MT1-MMP est internalisée par endocytose puis recyclée pour être délivrée vers l’invadopode grâce à l’intervention d’une machinerie d’exocytose complexe
comprenant entre autre le complexe exocyste servant au
processus d’arrimage des vésicules de transport de MT1MMP avec la membrane plasmique.
Au cours d’un précédent stage postdoctoral à Londres,
j’avais montré que l’exocyste était requis pour la migration
cellulaire grâce à son interaction avec les aPKCs. Du fait
de l’implication de l’exocyste dans le transport de MT1MMP vers l’invadopode et de son interaction avec aPKC,
nous avons postulé un rôle des aPKCs dans le trafic de
MT1-MMP dans les cellules cancéreuses.
En utilisant la lignée de cellules d’adénocarcinome mammaire MDA-MB-231, j’ai premièrement montré que les
aPKCs sont nécessaires à la dégradation de la matrice
extracellulaire et à l’invasion des cellules tumorales dans
des matrices extracellulaires reconstituées (collagène de
type I et du matrigel), deux processus dépendant de MT1MMP. J’ai également observé une association de PKCiota
avec les endosomes tardifs contenant la majorité du pool
intracellulaire de MT1-MMP dont elle contrôle la vitesse
de déplacement et l’adressage à la membrane plasmique.’ai
également mis en évidence une association de l’actine, de
la cortactine (protéine liant l’actine et nécessaire à l’invasion tumorale et à la formation des invadopodes) et du
complexe nucléateur de l’actine Arp2/3 au niveau de
microdomaines sur la face cytoplasmique des endosomes
La perte de la polarité cellulaire est une des signatures des
cellules cancéreuses. Elle est corrélée avec « l’agressivité »
de la tumeur et la capacité invasive des cellules cancéreuses. Les cellules tumorales d’origine épithéliales (carcinomes) peuvent s’engager dans une transition
épithélio-mésenchymateuse au cours de laquelle elles
60
61
Communication orale
raux de patientes traitées à l’Inst. Curie, nous avons observé
une augmentation de l’expression de aPKC iota dans des
tumeurs et sa relocalisation dans des structures cytoplasmiques granulaires, similaire à l’association d’aPKC iota
avec les endosomes MT1-MMP dans les cellules MDAMB-231. De plus, cette relocalisation est corrélée avec le
grade tumoral.
MT1-MMP. J’ai observé une colocalisation entre la GTPase
rab7 et la cortactine au niveau de ces domaines, coïncidant
avec la formation d’extensions tubulaires dynamiques des
endosomes impliquées dans le trafic de MT1-MMP. J’ai
montré que la scission des tubules MT1-MMP/rab7 est
dépendante de l’interaction entre la cortactine et la dynamine2 (protéine nécessaire à la scission membranaire).
Ces résultats démontrent que la cortactine, l’actine et la
dynamine-2 associées aux endosomes tardifs, permettent
la génération d’intermédiaires de transport requis lors de
l’invasion tumorale.Dans le but de préciser le rôle de aPKC
dans le transport de MT1-MMP, j’ai identifié la cortactine
comme étant un substrat des kinases aPKCs et j’ai montré
que l’inhibition des aPKCs entraine une accumulation des
domaines de cortactine sur les endosomes MT1-MMP/
rab7. Dans ces conditions, la cortactine est hypophosphorylée et son interaction avec la dynamine-2 est inhibée ce
qui entraine un défaut de scission des tubules MT1-MMP.
Par conséquent, un défaut d’activité de aPKC s’accompagne de l’inhibition du transport de MT1-MMP aux invadopodes, entraînant une diminution de l’invasion
tumorale.
Ce travail, qui implique pour la première fois les aPKCs
dans le contrôle du trafic membranaire d’une protéine clé
de l’invasion, caractérise une nouvelle voie de signalisation
« maléfique » dans les tumeurs du sein. De plus cette étude
permet de proposer la cortactine et la phopsho-cortactine
comme de nouveaux bio-marqueurs et identifie les aPKC
comme de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles
dans les tumeurs du sein qui constituent une des causes
majeures de mortalité par cancer chez la femme. ●
Publications :
Rossé C, Irondelle M, Monteiro P, Lagoutte E, Sengmanivong L, Paul-Gilloteaux P, Linch M, Bièche I, Peter Parker
P and Chavrier P *. (2012) Breast tumor cell invasion requires formation of MT1-MMP transport intermediates
from late endosomes by atypical PKC. Dev Cell. Manuscript
en révision.
Monteiro P, Hertzog M, Rossé C, Desnos C, Zech T, Formstecher E, Darchen F, Machesky L, GautreauA and Chavrier
P (2012) Coordinated function of WASH and exocyst
complex underlies the mechanism of invadopodial matrix
degradation by tumor cells Nat Cell Biol. Manuscript
soumis.
Awadelkarim KD, Callens C, Rossé C, Susini A, Vacher S,
Rouleau E, Lidereau R, Bièche I. (2012) Quantification of
PKC gene family in sporadic breast cancer by qRTPCR
assays: Evidence that PKCι/λ overexpression is an independent prognostic factor. Int J Cancer. Papier sous presse.
Nous nous sommes ensuite intéressés aux rôles des aPKCs
dans les carcinomes mammaires, un des cancers majoritaires chez la femme. En collaboration avec le Dr I. Bièche
(Inst. Curie, Hôpital R. Huguenin, St Cloud), nous avons
mis en évidence une surexpression des ARNm de PKC zêta
et iota dans les tumeurs du sein, et avons observé une forte
corrélation positive entre la surexpression de PKC iota et
de MT1-MMP à partir d’une collection de 450 tumeurs
mammaires. De plus, en nous basant sur les données
cliniques de ces patientes nous avons pu établir que la
surexpression concomitante de MT1-MMP et aPKC iota
constitue un facteur de mauvais pronostique. En collaboration avec le Dr Anne Vincent-Salomon (Inst. Curie,
Service d’anatomo-pathologie), nous avons mis en évidence une localisation apicale de aPKCi dans les acini de
tissus mammaires normaux. A partir d’échantillons tumo-
62
Plasticité cellulaire et le cancer: le rôle d’une déméthylase histone lors d’un événement
reprogrammation cellulaire et l’identification de modificateurs de son activité
ZURYN Steven
INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE - STRASBOURG
CNRS UMR 7104 - INSERM U 964 - Eqpe Mécanismes Cellulaires Moléculaires Différenciation Système Nerveux
findings suggest may stem from their ability to be play a
key role in defining and altering cell identity. To further
dissect the role these factors play in Y-to-PDA conversion
we studied their subcelluar localisations within the changing cell and found that JMJD3 is temporally controlled in
a manner that regulates its interaction with the MLL
complex. Our results so far suggest that cells maintain an
inherent flexibility in cell fate that can moulded by the
combined activity of JMJD3 and the MLL complex, which
when mutated, as what occurs in many cancers, can go
awry. ●
Transdifferentiation – conversion of one cell fate to another
– either in a normal context (development), a pathological
context (cancer initiation), or in an artificial environment
(cell reprogramming) is fascinating because it necessitates
the shutting down of one cell-type genetic program and
uptake of a new program. This dynamic reorganisation of
gene expression suggests that active epigenetic reprogramming is critical. Little is known about how this occurs,
or what enzymes might mediate the process. We report
at the single-cell level that transdifferentiation requires a
highly orchestrated interaction of multiple modulators of
histone demethylation and methylation. We isolated mutations in the conserved Jumonji domain containing JMJD3
(H3K27 demethylase) in a forward genetic screen in C.
elegans where a stereotypical transdifferentiation event
– conversion of the Y cell (epithelial) into PDA (a motoneuron) – was blocked. We firstly confirmed that JMJD3
lysine demethylase activity was responsible for this function and then subsequently conducted an RNAi screen to
identify other histone modifying enzymes that may work
alongside JMJD3 to convert Y into PDA. We identified the
Mixed Linegage Lukemia (MLL) complex (H3K4 methyltransferase) as a parallel co-mediator of transdifferentaion,
suggesting that multiple histone modifiers combine to elicit
cellular identity changes. Interestingly, JMJD3 and the MLL
complex have well described roles in cancer, which our
Publications :
Richard, J.*, Zuryn, S*., Fischer, N., Pavet, V., Vaucamps,
N., Jarriault, S. (2011). Direct in vivo reprogramming involves transition through discrete, non-pluripotent steps.
Development. 138(8):1483-92. (*Co-first). Faculty of 1000
Recommended.
Zuryn, S., Daniele, T., Jarriault, S. (2012). Direct cellular
reprogramming in C. elegans: facts, models and promises
for regenerative medicine. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol.
1(1):138-152. Review.
Zuryn, S., Jarriault, S. (2012). Deep Sequencing Strategies
for Identifying Mutations from Genetic Screens. Invited
Review, Worm (In preparation).
63
Communication orale
Caractérisation des modifications épigénétiques du chromosome X dans les différents types
moléculaires de cancers du sein et de lignées cellulaires de cancers du sein
CHALIGNÉ Ronan
UMR3215 / U934 -Equipe Génétique Développement Cancer
l’expression de plusieurs gènes candidats. Nous espérons
à terme pouvoir définir des signatures spécifiques des
anomalies de chaque sous-type de cancer du sein et peutêtre proposer ainsi un nouvel outil diagnostique ou
prognostique. ●
Salomon). Nous aimerions définir des « signatures épigénétiques du Xi » qui seraient, soit communes, soit
spécifiques à chacun des sous-types moléculaires des
cancers du sein. Nous allons par conséquent tester au
niveau unicellulaire (RNA/DNA FISH sur tumeurs primaires) et aussi plus global (RNA-seq sur xénogreffe)
some X (combinaison d’une approche pan chromosome
X et gène candidat) révèle que, même si le Xi reste globalement éteint, certains gènes montrent une réexpression
anormale (i.e. bi-allélique) à partir du Xi dans les lignées
cellulaires tumorales par rapport aux cellules normales.
De plus, par immuno-précipition chromatinienne et analyse
de la méthylation des promoteurs des gènes qui échappent
à l’inactivation dans un contexte tumoral, nous avons
montré qu’il semble que ces gènes présentent une signature chromatienne particulière avec une absence de méthylation de l’ADN, une déplétion en H3K27me3 et un
enrichissement de H3Ac au niveau de leur région promotrice. Ceci est cohérent avec le fait que plusieurs mécanismes épigénétiques agissent en synergie pour
maintenir le Xi dans un état transcriptionnel inactif et que
par conséquent la déstabilisation de plusieurs de ces
mécanismes est nécessaire à la réexpression de gènes
présents sur le Xi. Grace à des techniques d’hybridation
in situ (RNA/DNA FISH), nous avons pu étudier, au niveau
unicellulaire, l’expression à partir du Xi de gènes échappant
à l’inactivation dans les lignées tumorales. Par cette approche, certains gènes ré-exprimés dans les lignées cellulaires ont également été retrouvés anormalement
réactivés dans des xénogreffes de tumeurs du sein et des
tumeurs primaires (provenant de cryosections et
d’empreintes de tumeurs issue d’exérèse chirurgicale). Ce
travail en cours de publication (Chaligné et al, en préparation) montre donc que le chromosome Xi est « épigénétiquement » perturbé dans certains cancers du sein et que
ces changements peuvent être à l’origine de l’expression
anormale de certains gènes à partir du Xi.
Un premier travail réalisé dans mon unité d’accueil a montré
l’existence d’une hétérogénéité importante du statut du
chromosome X inactif, à un niveau intra- et inter-tumoral
dans une série de cancer basal-like apparus dans un contexte de mutation du gène BRCA1 et dans certains carcinomes sporadiques utilisés alors comme contrôles
(Vincent-Salomon, Ganem-Elbaz et al., Cancer Research,
2007). Suite à ce travail, le but initial de mon projet était
d’étudier de manière systématique l’état épigénétique du
chromosome X dans les différents types moléculaires et
histologiques de carcinomes mammaires. Nous avons donc
analysé au cours de ce travail des marques épigénétiques
du chromosome X ainsi que son organisation nucléaire.
Nous nous sommes tout d’abord concentrés sur des
modèles de lignées cellulaires de cancer du sein pour
évaluer l’instabilité épigénétique du Xi via son organisation
nucléaire (recouvrement par l’ARN non codant XIST, statut
chromatinien). Dans des lignées cellulaires que nous avons
choisies pour représenter la diversité des types moléculaires les plus fréquents (ie ZR-75-1 : Luminal; SK-BR-3:
HER2+ et MDA-MB-436: Basal-like), il apparait que le Xi
a une organisation nucléaire perturbée (comportement
anormal de plusieurs marques chromatiniennes tel que
H3K27me3, H3K9Ac et H4AC ainsi qu’une disparition
partielle de la région DAPI dense que l’on nomme « Corpuscule de Barr »). A l’inverse, certaines marques chromatiniennes, tel que H3K4me2, apparaissent mieux
régulées au niveau du Xi. Enfin, le compartiment transcriptionnellement inactif que représente le Xi se caractérise
dans les cellules somatiques normales par une absence
d’expression des séquences génomiques répétées (Cot1)
et une absence de l’ARNpol II. Par IF/RNAFISH, nous avons
pu observer une désorganisation de cette structure dans
les cellules tumorales avec un défaut de déplétion de Cot1
et de l’ARNpolII. La première partie de notre travail a donc
montré que l’organisation du Xi est perturbée dans les
cellules tumorales. Nous avons ensuite étudié l’impact de
cette désorganisation sur le statut transcriptionnel du Xi.
L’analyse transcriptionnelle allèle spécifique du chromo-
Notre but initial était d’utiliser le Xi comme sentinelle de
l’instabilité épigénétique dans le cancer du sein. Nous
avons identifié plusieurs dérégulations épigénétiques du
Xi dans des lignées cellulaires. Maintenant, nous souhaitons étendre notre étude à un grand nombre de tumeurs
du sein qui sont disponibles grâce à notre collaboration
avec l’hôpital (et particulièrement le Dr Anne Vincent-
64
65
Poster
Etude de la participation d’une voie alternative de réparation de l’ADN dans les processus de
déméthylation de l’ADN chez l’homme: interconnexions entre les mécanismes de régulation
épigénétique, de réparation de l’ADN et de cancérogenèse
GRIN Inga
UMR 8200 CNRS - Unité Stabilité Génétique Oncogenèse
Comparison of protein concentrations dependence and
time course kinetics of hTDG, MBD4 and MBD4cat on
5hmU•G showed that hTDG is more efficient than MBD4
enzyme. Overall, these results show that MBD4 does not
act on 5fC and 5caC residues but can excise 5hmU with
good efficiency. MBD4 and MBD4cat proteins can remove
5hmU when opposite to G with good efficiency. Importantly, all tested enzymes were more efficient on 5hmU•G
than on T•G duplexes (about 1.5 fold for MBD4s and 6
fold for hTDG) suggesting that MBD4 and hTDG act more
specifically on 5hmU bases. Next, we investigated whether
5hmU, 5caC and 5fC residues are also substrates for the
previously characterized bacterial and human DNA glycosylases. All three human DNA glycosylases: TDG, MBD4
and SMUG1 excise 5hmU with good efficiency when it
present in duplex DNA but only SMUG1 was able to excise
5hmU in single-stranded form. In addition, the human
homolog of bacterial Nei, NEIL1 can excise, although with
weak efficiency, 5hmU residue in duplex DNA. No detectable activity on 5hmU-containing DNA substrates was
observed for hUNG2, hNTH1, ANPG70, hOGG1, NEIL2
glycosylases. Importantly, DNA repair activities of bacterial
and human enzymes on 5fC containing oligonucleotides
mimic those on 5caC. These results indicate that hTDG is
a main human enzyme removing carboxylated and formylated cytosines and confirms previous findings by other
laboratories [2-3]. The hUNG2, hNTH1, ANPG70, hOGG1,
NEIL2 and hSMUG1 glycosylases have no detectable activity on 5caC and 5fC substrates, whereas MBD4 and NEIL1
exhibited very weak activity on 5caC substrates.
Changes in DNA methylation patterns are generally associated with epigenetic changes in human cancers. Many
human cancers commonly exhibit global DNA hypomethylation concomitant with specific hypermethylation of
tumor-suppressor genes. Understanding dynamics of DNA
methylation in during development and cancerogenesis
requires studies of DNA demethylation processes. Active
DNA demethylation in mammals occurs via hydroxylation
of 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine
(5hmC) by the Ten-eleven translocation family of proteins
(TETs). 5hmC residues in DNA can be further oxidized by
TETs to 5-carboxylcytosines and/or deaminated by the
AID/APOBEC family proteins to 5-hydroxymethyluracil
(5hmU). The fact that 5hmU residues are intermediates
of active DNA demethylation that is produced enzymatically by combined action of TETs and AID/APOBEC
proteins implies that 5hmU may be generated at significant
amount in the cells during reprogramming and cancerogenesis. Excision and replacement of these intermediates is
initiated by DNA glycosylases such as thymine-DNA
glycosylase (TDG), methyl-binding domain protein 4
(MBD4) and single-strand specific monofunctional uracilDNA glycosylase 1 (SMUG1) in the base excision repair
(BER) pathway. In mammalian cells, both mismatch-specific thymine-DNA glycosylase (TDG) and methyl-binding
domain protein 4 (MBD4/MED1) prevent mutagenic
impact of 5mC deamination by excising thymine from T•G
mispairs that is replaced by cytosine in the base excision
repair (BER) pathway [1], suggesting a potential link
between post-replication repair, apoptosis and DNA
methylation. In our work, we report detailed biochemical
and structural characterization of human MBD4 which
contains mismatch-specific thymine-DNA glycosylase
activity.
reprogramming processes during cell differentiation and
carcinogenesis may lead to identification of the genetic
factors associated with cancer and therefore contribute
to development of new prevention and therapeutic strategies. ●
lar to AlkA and OGG1 and that the conserved amino acid
D534 is a putative catalytic residue [4]. To examine the
role of the corresponding catalytic D560 residue in human
MBD4 protein, we obtained mutant MBD4catD560A and
characterized its DNA glycosylase activity. As expected,
MBD4catD560A exhibits a drastic, more than 50 fold,
decrease in excision rate of 5hmU residue in 5hmU•G
duplex as compared to the wild type MBD4cat protein
suggesting that D560 is indeed essential for catalytic activity and that this inactive mutant protein can be used to
obtain complex with DNA substrate.
REFERENCES
1. Cortazar, D., et al., The enigmatic thymine DNA glycosylase. DNA Repair (Amst), 2007. 6(4): p. 489-504.
2. He, Y.F., et al., Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.
Science, 2011. 333(6047): p. 1303-7.
3. Maiti, A. and A.C. Drohat, Thymine DNA glycosylase
can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: potential implications for active demethylation of
CpG sites. J. Biol. Chem., 2011. 286(41): p. 35334-8.
4. Wu, P., et al., Mismatch repair in methylated DNA.
Structure and activity of the mismatch-specific thymine
glycosylase domain of methyl-CpG-binding protein MBD4.
J. Biol. Chem., 2003. 278(7): p. 5285-91.
These findings suggest a new unexpected role of the
mismatch-specific thymine/uracil DNA glycosylases in
the control of epigenetic information via removal of oxidation/deamination products of 5mC. In the present study,
we characterized and compared substrate specificities of
hTDG and MBD4 proteins and obtained high resolution
crystal structures of the catalytic domain of MBD4 (MBD4cat) in complex with duplex DNA containing T or 5hmU
base lesions. Finally, the current crystal structures can be
used as a template to develop inhibitors of MBD4cat in
the context of the active DNA demethylation process in
human cells. In conclusion, using integrated approaches
we aim to decipher and characterize at the molecular level
mechanisms involved in the active DNA demethylation in
human cells. Mechanistic understanding of the epigenetic
Publications:
Moréra, S., Grin, I., Vigouroux, A., Couvé, S., Henriot, V.,
Saparbaev, M., Ishchenko, A. A. (2012) Biochemical and
structural characterization of the glycosylase domain of
MBD4 bound to thymine and 5-hydroxymethyuracil
(5hmU)-containing DNA. Nucleic Acids Res. (soumises)
In order to get insight into the structural bases of substrate
specificity and catalytic mechanism of human MBD4, we
performed crystallographic studies of MBD4cat complexed with its DNA substrates. For this purpose, a catalytically inactive MBD4cat mutant has been generated.
Previous studies of the crystal structure of the C-terminal
domain of murine MBD4 revealed that it is a member of
the helix-hairpin-helix DNA glycosylase superfamily simi-
At first, we characterized substrate specificity of human
full-length MBD4 as well as of it’s catalytic domain (residues 426-580) (MBD4cat) and hTDG proteins by measuring the cleavage rates of 5hmU•G and T•G duplexes.
66
67
Poster
Rôle des altérations du locus PTEN dans l’instabilité génétique du cancer du sein. Etude par
CGH array haute résolution sur puce dédiée.
JONES Natalie
INSERM U916 - Validation et Identification de Nouvelles Cibles en Oncologie (VINCO)
tumeurs. Le faible taux de mutation ponctuelle détectée
est en accord avec la littérature. Les délétions du gène
PTEN sont plus fréquentes dans le cancer du sein et un
criblage des réarrangements de grande taille (RGT) a été
effectué par 2 techniques. La première, Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF), retrouve des
pertes de matériel dans 27/135 (20%) tumeurs. Pour
confirmer ces résultats et mieux caractériser ces altérations, une puce haute résolution de CGH-array a été
construite sous forme d’une puce à façon de la Société
AGILENT de format 4 fois 44 K comportant une couverture
pan-génomique et une densification de 1010 sondes couvrant le locus PTEN. Selon cette méthodologie, une perte
de matériel touchant le locus PTEN a été identifiée dans
27/48 tumeurs avec, par ailleurs, un profil génomique
particulier qui a été détecté pour 19 tumeurs montrant de
grandes variations du nombre de copies le long du gène
avec des pertes bialléliques localisées dans les grands
introns de PTEN. Curieusement, ces profils génomiques
s’accompagnent d’une conservation de l’expression immunohistochimique de PTEN.
La survenue aléatoire d’événements génétiques favorisés
par la perte de la stabilité du génome est une caractéristique fondamentale des proliférations tumorales. L’importance de celle-ci est soulignée par la mise en évidence de
déficits des systèmes de réparation des bases (MYH),
des nucléotides (gènes XP), et des mésappariements de
l’ADN (MLH1/MSH2) dans les processus tumoraux.
L’instabilité génétique ainsi induite se traduit certes par
l’introduction de mutations ponctuelles pouvant toucher
oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs, mais également par des aberrations caryotypiques ayant conduit
à la distinction entre tumeurs de type MIN (pour microsatellite instability) et de type CIN (pour chromosome
instability). Des anomalies constitutionnelles de 9 gènes
fortement impliqués dans la réparation d’ADN et menant
plutôt aux anomalies de type CIN (TP53, ATM, CHEK2,
BRCA1, BRCA2, PALB2, BRIP1, NBS1 et RAD50) ont été
décrites dans diverses situations de prédisposition héréditaire au cancer du sein. Un autre gène de prédisposition
au cancer du sein, le gène PTEN code pour une phosphatase qui est un régulateur négatif de la voie PI3K-AKT.
Des mutations somatiques de ce gène s’observent dans
de très nombreux types tumoraux incluant le cancer du
sein. Récemment, l’existence d’un role nucléaire de PTEN
a été proposée suggérant son implication dans le maintien
de la stabilité génétique. Le projet faisant l’objet de ce
rapport cherche à argumenter cette hypothèse en recherchant l’existence d’une corrélation entre les altérations
de PTEN et le niveau d’instabilité génétique dans le cancer
du sein.
de PARP nous a conduit à 2 développements de l’étude
précédente.
1/ une recherche d’une corrélation entre la perte d’expression de BRCA1 évaluée par RT-PCR quantitative et l’existence d’altération de PTEN dans une série de 71 cancers
de sein triples négatifs (équivalant IHC des tumeurs de
type basal-like).
2/ une recherche de mutations révertants de PTEN dans
des clones cellulaires montés en résistance vis-à-vis de
deux inhibiteurs de PARP à partir de lignées cellulaires
mutées pour PTEN et BRCA1. ●
tiente puisqu’un recul évolutif de 11 années est connu pour
ce groupe de tumeurs.
Aucune corrélation manifeste ne peut être établie entre le
statut PTEN et ces différentes caractéristiques anatomocliniques. Cependant deux points sont à souligner:
(i) les altérations de PTEN s’associent à une mutation de
TP53 dans 2 groupes de tumeurs seulement: les tumeurs
de type basal like qui présentent toutes une inactivation
de PTEN et pour la plupart une altération de p53 et les
tumeurs très instables sur le plan génomique qui montrent
une fréquente altération de p53 et incluent les profils PTEN
«unknown». Il semble donc que la concomitance des altérations de TP53 et PTEN soit fortement associée à des
génomes très instables alors que les altérations isolées,
soit de PTEN, soit de TP53 puissent s’observer dans des
tumeurs au génome relativement stable.
(ii) Une autre observation intéressante est que les 11 tumeurs «unknown» ont eu toutes une évolution péjorative
avec rechute métastatique alors qu’aucune n’avait présenté d’envahissement ganglionnaire axillaire lors du
traitement initial. Il s’agit d’un groupe de tumeurs dont
l’individualisation risque d’avoir une haute importance
clinique.
La mise en évidence récente de l’implication de PTEN dans
les cancers du sein survenant dans le contexte d’une prédisposition héréditaire liée à BRCA1 ainsi que le rôle de
PTEN dans la résistance au traitement par les inhibiteurs
Publications :
Jones N, Bonnet F, Sfar S, , Lafitte M, Lafon D, Sierankowski
G, Brouste V, Banneau G, Tunon de Lara C, Debled M, Mac
Grogan G, Longy M, Sevenet N. Comprehensive analysis
of PTEN status in breast carcinomas. Soumis pour publication (Oncogene)
Bonnet F, Guedj M, Jones N, Sfar S, Brouste V, Elarouci N,
Banneau G, Orsetti B, Primois C, Tunon de Lara C, Debled
M, de Mascarel I, Theillet C, Sevenet N, de Reynies A,
MacGrogan G, Longy M. An array CGH- based genomic
instability index (G2I) is predictive of clinical outcome in
breast cancer and reveals a subset of tumors without lymph
node involvement but with poor prognosis. Soumis pour
publication (Genome Research)
Finalement, l’ensemble des tumeurs a pu être classé en
4 catégories :
«complete loss» n=19 (14%), perte complete d’expression
et/ou inactivation biallélique
«reduced copy number» n=19 (14%), perte d’hétérozygotie
avec conservation d’une expression IHC
«unknown» n=11 (8%), profil génomique instable d’interprétation difficile
«wildtype» n= 86 (64%) sans altération détéctée.
Ces résultats ont été corrélés à diverses classifications
tumorales: 1/ la classification intrinsèque en tumeurs Luminales A, Luminales B, Basales like et HER2 enrichi. 2/ la
presence ou non d’une mutation de TP53. 3/ le niveau
d’instabilité génétique evalué par CGH array selon une
classification en 3 niveaux d’intensités croissantes. 4/
l’existence ou non d’un envahissement ganglionnaire
axillaire. 5/ l’évolution de la pathologie pour chaque pa-
Une exploration exhaustive de PTEN a été réalisée sur une
série de 135 cancers du sein sporadiques. L’expression de
la protéine a été évaluée par immunohistochimie (IHC).
Une absence d’expression a été identifiée dans 18/135
(13%) tumeurs. Les mutations ponctuelles de PTEN ont
été criblées par une nouvelle technique de criblage, Enhanced Mismatch Mutation Analysis (EMMA). Six mutations ponctuelles ont été identifiées dans 5/135 (4%)
68
69
Poster
Recherche et étude des protéines partenaires d’Hsp27 responsables de l’évolution
androgéno-indépendante des cancers de la prostate.
KATSOGIANNOU Maria
INSTITUT PAOLI CALMETTE - MARSEILLE
Inserm U1068 -Laboratoire d’Oncologie Moléculaire
lulaire d’eIF4E en le protégeant de sa dégradation par la
voie ubiquitine-protéasome ce qui augmente la survie des
cellules CaP. L’inhibition de l’intéraction entre Hsp27 et
eIF4E est en cours d’évaluation comme nouvelle stratégie
pour le traitement des CaPs AI. Afin de mettre en évidence
les protéines partenaires d’Hsp27 impliquées dans l’évolution AI du CaP, l’équipe a utilisé la technique du Double
Hybride par SoS Recrutment System (SRS). Cette technique possède l’avantage de générer un taux faible de faux
positifs, permet l’étude et l’identification de protéines
partenaires d’Hsp27 modifiées au niveau post-traductionnel dans le cytoplasme de la levure. Nous avons réalisé le
criblage des interacteurs d’Hsp27 sur deux banques : une
banque de testicule humain sain (Testis) et une banque
de cellules tumorales du col de l’utérus (HELA). Pour avoir
une estimation représentative de l’ensemble des protéines
interagissant avec Hsp27, nous avons testé 5 millions de
clones par banque. Ces résultats nous ont permis de mettre
en évidence 226 interacteurs potentiels d’Hsp27 dont
seulement 2 était déjà connus. Dans le but de comprendre
ce nouveau réseau d’interactions d’Hsp27 nous avons
réalisé des analyses bioinformatiques permettant de classer les interacteurs selon leurs fonctions biologiques. Dans
un premier temps, nous avons utilisé le programme DAVID
(Database for Annotation Visualization and Integrated
Discovery) (http://david.abcc.ncifcrf.gov/), dédié à l’investigation fonctionnelle de groupes de gènes, basé sur la
ressource du « Gene Ontology ». Ensuite, nous avons intégré nos données au sein de l’interactome humain, ce qui
nous a permis d’enrichir notre interactome Hsp27. L’analyse bio-informatique de notre interactome a permis de
mettre en évidence qu’Hsp27 interagit, comme attendu,
avec des protéines impliquées dans l’apoptose, le cycle
cellulaire, le catabolisme protéique, l’organisation du cytosquelette et la régulation de la traduction protéique. Mais
de façon plus intéressante, nous avons mis en évidence
de nouvelles fonctions d’Hsp27 jamais décrites auparavant
comme son rôle dans la maturation de l’ARN, l’homéostasie
ionique, le transport des protéines et des acides nucléiques,
Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus fréquent
chez l’homme dans les pays industrialisés. La suppression
androgénique (castration) demeure la seule thérapie efficace des CaPs métastatiques, permettant une réponse
objective dans plus de 80% des cas. Toutefois, elle
n’empêche pas la progression androgéno-indépendante
(AI) de la maladie qui survient ordinairement dans les 1 à
3 ans après le début du traitement. Ainsi, de nouvelles
stratégies thérapeutiques visant les mécanismes moléculaires de résistance doivent être développées. Une des
stratégies visant à améliorer la thérapie des CaPs avancés,
implique le ciblage de gènes activés lors de la suppression
des androgènes, pour retarder ou empêcher l’émergence
du phénotype AI. Récemment, P. Rocchi et collaborateurs
ont identifié la protéine Hsp27 comme étant hautement
surexprimée dans les CaPs AI. Il a été montré que l’inhibition d’Hsp27 par l’utilisation d’un oligonucléotide antisens (ASO) et d’un small interference RNA (siRNA)
augmente l’apoptose et améliore l’androgéno- et la chimiothérapie des CaPs. L’équipe a développé et breveté un ASO
de seconde génération (OGX-427) ciblant Hsp27 (Rocchi,
P., Patent PCT no 10/605, 498, 2005). Une licence internationale a été obtenue et des essais cliniques de phase
II utilisant OGX-427 sont en cours aux Etats-Unis et Canada
chez des patients porteurs d’un CaP (http://www.oncogenex.ca/). Malgré l’efficacité d’OGX-427, le rôle fonctionnel de la protéine de stress Hsp27 dans la résistance
à l’apoptose normalement induite par la castration reste
indéfini. Le but de notre projet est d’élucider les mécanismes responsables de l’action d’Hsp27 dans les CaPs AI
afin de 1/ Augmenter la sécurité pharmacologique
d’OGX-427 et 2/ trouver des nouvelles cibles thérapeutiques et stratégies dont l’action serait plus spécifique des
CaPs AI. Récemment, nous avons démontré par double
hybride et co-immunoprécipitation qu’Hsp27 interagit
avec le facteur eucaryotique d’initiation de la traduction
des protéines (eIF4E) actuellement étudié comme cible
thérapeutique dans plusieurs cancers y compris les CaPs.
Cette interaction permet à Hsp27 de réguler le taux cel-
70
la biodisponibilité et la délivrance de l’ASO TCTP en vue
d’une application clinique. Ce projet sera réalisé en collaboration avec l’équipe du Pr. Philippe Barthélémy (Inserm
U869, ChemBioMed, Bordeaux) qui est spécialiste dans
la chimie des oligonucléotides. ●
la régulation de la transcription, la régulation de l’activité
GTPase et le métabolisme. Des expériences sont en cours
afin de valider biologiquement ces résultats. La validation
biologique de notre intéractome nous a conduit à nous
intéresser particulièrement à la protéine TCTP (translationally controlled tumour protein) car des études de
microarray sur des tissus humains ont montré que TCTP
est exprimé dans 18,5% des adénocarcinomes prostatiques
avant castration et que sa présence est indétectable dans
les pathologies bénignes de la prostate et les échantillons
normaux, suggérant que le ciblage de TCTP aurait une
faible toxicité pour les cellules normales. Afin d’étudier
l’expression de TCTP durant la progression CR, des microarrays ont été réalisés à partir de tissus prélevés sur
des patients traités ou non par castration chimique. Les
résultats ont mis en évidence que l’expression de TCTP
diminue après castration pour devenir fortement exprimé
dans 75% des cancers métastatiques résistants. Nous
avons développé et breveté un ASO de première génération
ciblant TCTP (PCT/EP2011/073186). L’inhibition spécifique de TCTP par cet ASO conduit à une apoptose caspase-3 dépendante des cellules tumorales in vitro et à une
diminution de la progression tumorale in vivo chez des
souris nude. De façon intéressante, nous avons trouvé que
la progression CR était corrélée avec une perte de P53 et
que l’inhibition de TCTP par l’ASO restaurait l’expression
et la fonction de P53 dans les tumeurs prostatiques résistantes à la castration. Ce travail fait l’objet d’une publication
«Targeting TCTP as New Therapeutic Strategy to treat
Castration-Resistant Prostate Cancer» en révision et un
financement ANR « programme émergence » a été obtenu
pour développer un ASO de seconde génération (TCTPLASO) en conjuguant modifications lipidiques à l’oligonucléotide par «Click Chemistry» afin d’améliorer la stabilité,
Publications :
Katsogiannou, M., Baylot, V., Andrieu, C., Baudot, A.,
Dusetti, N., Brun, C. and Rocchi, P. Hsp27 interactome
mapping uncovers new cellular functions of Hsp27 and
reveals involvement in DNA repair and RNA splicing.
Soumise (Cancer Cell).
Baylot, V., Andrieu, C., Katsogiannou, M., Taieb, D., Acunzo,
J., Dusetti, N., Giusiano, S., Fazli, L., Gleave, M., Garrido,
C. and Rocchi, P. Translationally Controlled Tumor Protein:
a new Hsp27 Protein partner that mediates Cytoprotection
in Castration Resistant Prostate Cancer. En revision (Molecular therapy).
Baylot, V., Andrieu, C., Katsogiannou, M., Taieb, D., Garcia,
S., Giusiano, S., Acunzo, J., Iovanna, J., Gleave, M., Garrido,
C. and Rocchi, P. OGX-427 inhibits tumor progression and
enhances gemcitabine chemotherapy in pancreatic cancer.
Cell Death Dis. 2011 Oct 20;2:e221.
Publications de Revue
Acunzo, J., Katsogiannou, M. and Rocchi, P. Small Heat
Shock Protein as regulators of cell death. Int J Biochem
Cell Biol [Epub ahead of print], 2012.
Katsogiannou, M., Catapano, C., Peng, L. and Rocchi, P.
Active-targeted nanotherapy strategies for prostate cancer. Curr Cancer Drug Targets. 11(8):954-65, 2011.
Brevet
Baylot, V., Andrieu, C., Katsogiannou, M., Acunzo, J.,
Rocchi, P. Nucleic acids targeting TCTP for use in the
treatment of cancer. Patent PCT/EP2011/073186.
71
Poster
Le ciblage thérapeutique de Clusterin, par l’utilisation de l’antisens OGX-011 augmente,
de manière synergique, l’activité de thérapies ciblées (Acide Zolédronique et inhibiteurs
de Hsp90) dans le traitement des tumeurs osseuses.
LAMOUREUX François
FACULTE DE MEDECINE DE NANTES - NANTES
Inserm U957 - Laboratoire de physiopathologie de la résorption osseuse et thérapie des tumeurs osseuses primitives
CLU is upregulated after different stresses including hormone withdrawal, chemotherapy or targeted therapies;
hence CLU level is high in prostate cancer and osteosarcoma biopsies. Moreover, CLU level was increased in a
dose- and time-dependent manner after zoledronic acid
or Hsp90 inhibitors treatments in OS and prostate cancer
cell lines, by mechanisms including increased HSF-1 transcription activity. The development of OS cells resistant to
zoledronic acid showed a higher CLU expression level in
these cells than in the sensitive cells. CLU silencing, using
OGX-011 or siRNA, abrogates zoledronic acid or Hsp90
inhibitors induced HSF-1 transcriptional activity, while CLU
overexpression enhances drugs-induced HSF-1 transcription activity, identifying a role for CLU in the regulation of
HSF-1 and the heat shock response itself. CLU knockdown,
blocks the translocation to HSF-1 to the nucleus following
treatment with zoledronic acid or Hsp90 inhibitors. This
effect of CLU on HSF-1 activity is biologically relevant since
CLU overexpression protects while CLU silencing enhances, cytotoxicity of zoledronic acid or Hsp90 inhibitors
and in vitro in OS and prostate cancer cell lines.
Clusterin Inhibition using OGX-011 Synergistically Enhances Targeted Therapies (Zoledronic Acid and Hsp90
Inhibitors) Activity in Bone Tumors.
Despite recent improvements in therapeutic management
of bone tumors (sarcoma, prostate bone metastasis…),
poor therapeutic benefits to conventional chemotherapy
or targeted therapies are often observed; so that ongoing
challenges are to improve the response to treatments and
to enhance overall patient survival.
Among new therapeutic approaches, zoledronic acid,
currently in Phase III clinical trial in treatment of OS and
in clinical use in treatment of bone metastasis in prostate
cancer, and Hsp90 inhibitors, in Phase II clinical trials in
various solid tumors including prostate cancer and sarcoma, represent promising adjuvant molecules to chemotherapy. However, zoledronic acid and Hsp90 inhibitors
trigger the elevation of heat shock proteins (Hsp), including
Hsp27, Hsp70 and clusterin (CLU), mainly regulated by
the transcription factor, Heat Shock Factor-1 (HSF-1), that
could lead to resistance phenomenons and tumor progression. Clusterin is a cytoprotective chaperone protein that
promotes cell survival and confers broad-spectrum treatment resistance by inhibiting mitochondrial apoptosis by
suppressing p53-activating stress signals and stabilizes
cytosolic Ku70-Bax protein complex to inhibit Bax
activation.
We hypothesized that targeting (CLU) using siRNA or the
antisense drug, OGX-011 (2′-methoxyethyl–modified
phosphorothioate antisense oligonucleotide that is complementary to clusterin mRNA), will suppress treatmentinduced CLU induction and enhance Hsp90 inhibitors- or
zoledronic acid-induced cell death in osteosarcoma (OS)
or in prostate cancer cells.
The combined effects of OGX-011 with zoledronic acid or
Hsp90 inhibitors were investigated in vitro on cell growth,
viability, apoptosis and cell cycle repartition of human
osteosarcoma (SaOS2, U2OS, MG63 and HOS) and human
prostate cancer (PC-3 and LNCaP) cell lines, and in vivo
in PC-3 and LNCaP xenograft models.
OGX-011 suppressed treatment-induced increases in CLU
and synergistically enhanced the activity of zoledronic acid
or Hsp90 inhibitors on cell growth and apoptosis by increasing both caspase-3 expression and activity. These biologic
events were accompanied by decreased expression of
HSPs, Akt, and HSF-1 transcriptional activity. Moreover,
OGX-011 synergistically enhanced Hsp90 inhibitors activity in vivo in PC-3 and LNCaP xenograft models by enhancing treatment-induced apoptosis.
Collectively these results highlight, for the first time, a
biologically relevant feed-forward regulation loop of CLU
on HSF-1 and the heat shock response. These results also
indicate that zoledonic acid or Hsp90 inhibitors-mediated
induction of CLU can be attenuated by OGX-011, with
synergistic effects on delaying progression of OS or prostate cancer. ●
72
Poster
Validation fonctionnelle d’une nouvelle cible candidate pour le traitement du cancer
colorectal : un possible rôle oncogénique de la MAP3K ZAK
LARTIGUE Lydia
INSERM U916 - Validation et Identification de Nouvelles Cibles en Oncologie (VINCO)
Introduction. Le cancer colorectal est le 3° cancer le plus
commun en France, où il constitue la 2° cause de décès
par cancer. Son incidence augmente régulièrement et, la
maladie métastatique (CCRm), qui concerne plus de 50 %
des patients, est découverte dans 25 à 30% des cas au
moment du diagnostic du cancer primitif (métastases
synchrones). Le traitement de ces formes métastatiques,
basé classiquement sur la résection de la tumeur et la radiothérapie et/ou la chimiothérapie, a connu un nouvel essor
ces dernières années avec l’arrivée sur le marché de thérapies ciblées. Ces dernières reposent sur l’action d’anticorps monoclonaux (MoAb) comme (i) le cetuximab ou
le panitumumab dirigés contre le récepteur tyrosine kinase
pour le facteur de croissance épithélial, EGFR ou (ii) le
bevacizumab ciblant le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire VEGF.
Description du projet. Dans le but de rechercher de nouvelles cibles pharmacologiques spécifiquement dérégulées
dans le CCR, nous avons réalisé une étude combinant une
approche génomique sur des échantillons de tumeurs
colorectales (RNA microarray) à une exploration fonctionnelle à haut débit du « potentiel thérapeutique » des cibles
surexprimées, dans des modèles cellulaires de CCR in vitro.
En suivant des critères de sélection stricts, les CIBLES dont
la suppression s’avérait pro-apoptotique, anti-invasive et
anti-proliférative ont été retenues ; parmi celles-ci figure
la protéine ZAK.
ZAK (Zipper sterile-Alpha-motif Kinase) est une protéine
kinase (PK) de la famille des MLKs (Mixed-Lineage Kinase)
très peu connue. Elle appartient à la voie de signalisation
intracellulaire des MAPKs et, agit comme une MAP3K. Les
MLKs activent généralement p38 et JNK/SAP mais certains de leurs membres peuvent engager ERK.
Si le bénéfice certain de ces thérapies ciblées a été montré
en termes de survie sans progression et de survie globale,
des études rétrospectives ont cependant rapporté que les
patients ne profitaient pas tous de la même manière de ces
traitements, à cause de la présence ou de l’apparition de
mécanismes de résistance à ces MoAb. Il a par exemple été
montré que seulement 10 % à 20 % des patients avec CCRm
bénéficiaient cliniquement des anti-EGFR à cause de l’activation oncogénique de la voie en aval de l’EGFR (70 % des
patients non répondeurs (NR) portant des altérations sur
les protéines KRAS, BRAF, PI3K, PTEN). Bien qu’à une
moindre fréquence, les thérapies anti-VEGF se heurtent aussi
à des problèmes de résistance intrinsèque ou acquise des
cellules cancéreuses, et en absence de biomarqueurs prédictifs de réponse au bevacimumab, les bénéfices cliniques
de ces Moab sont difficilement prévisibles.
Deux isoformes de ZAK ont été décrites : ZAK-α et ZAK-β,
et leur rôle dans l’oncogenèse n’est pas bien connu. Seul
un article montre que ZAK-α pourrait favoriser la transformation néoplasique de cellules et le développement de
cancers in vitro et in vivo. Sa surexpression induirait en
effet la transformation tumorale de cellules épidermiques
murines traitées à l’EGF ou au TPA et, la formation de
tumeurs dans des souris athymiques. Sous stimulation à
l’EGF, ZAK-α s’associerait avec l’histone 3 pour la phosphoryler et participer au remodelage de la chromatine,
montrant une possible participation de ZAK-α dans la voie
oncogénique des MAPKs activée par l’EGF.
Des inhibiteurs spécifiques de ZAK ont été développés par
l’industrie pharmaceutique comme le DHP-2 dans le cadre
de l’hypertrophie cardiaque (dans laquelle ZAK est impliquée). Il a aussi été montré que le nilotinib et le dasatinib,
de nouveaux inhibiteurs de tyrosine kinases développés
pour traiter les formes mutées de BCR-ABL dans les leucémies myéloïdes chroniques inhibaient ZAK avec une
Ainsi, malgré l’apport indéniable des biothérapies ciblées,
l’identification de nouvelles cibles dans le traitement du
CCRm reste primordiale pour offrir des alternatives thérapeutiques aux patients résistants ou améliorer la survie
globale des patients répondeurs (18 à 24 mois).
73
Poster
naviguer entre deux compartiments cellulaires : le noyau
et le cytosol, alors que ZAK-b, semblerait, après surexpression, avoir une préférence pour le cytosol. En tant que
MAP3K, la surexpression de ces protéines induit l’activation des MAPK p38, JNK, ERK et c-JUN. Au niveau fonctionnel, ZAK participerait à la motilité cellulaire.
n de valider l’utilisation d’inhibiteurs de ZAK dans des
modèles animaux xénogreffés. Sous-réserve de l’obtention
de résultats in vitro probants. A cette fin, des lignées cellulaires de CCR sur- ou sous-exprimant de façon stable
ZAK-α et ZAK-β viennent d’être générées.
grande spécificité. Ainsi, si le rôle de ZAK dans le CCR se
confirmait, ces molécules, déjà utilisées en clinique, pourraient offrir une alternative thérapeutique dans cette
pathologie.
L’objectif de ce projet est d’explorer la pertinence de ZAK
comme cible thérapeutique dans le CCR, en particulier
dans le contexte de la résistance aux Moabs anti-EGFR.
Pour cela, nous nous proposons d’étudier :
n le statut d’expression/activation de ZAK dans des collections de tumeurs
A ce stade, nous disposons de données montrant une
surexpression de ZAK-α (par qPCR) et de ZAK-β (par
immunomarquage de puces à tissus ou TMA) dans le tissu
tumoral par rapport au tissu sain sur une nouvelle cohorte
de CCR. Des données cliniques préliminaires nous permettent par ailleurs de penser que la surexpression de
ZAK pourrait être impliquée dans la résistance au traitement, indépendamment du statut mutationnel de KRAS
et BRAF.
n les corrélations expression de ZAK/ réponse aux Moabs
EGFRs par bioinformatique
L’analyse in silico semble montrer une corrélation entre
l’expression de ZAK dans le panel des lignées du NCI et
la sensibilité au dasatinib (anti-Bcr-ABL) et lapatinib (antiHer1/Her2).
n le rôle fonctionnel de ZAK dans des modèles cellulaires
de CCR.
Conclusion et perspectives. A travers ce programme de
recherche, nous cherchons à étudier une cible thérapeutique potentielle dans sa globalité depuis la mise en évidence de sa dérégulation dans les cellules tumorales de
patients à son mécanisme d’action intracellulaire et au
rationnel de son ciblage dans le contexte de la pathologie
du CCR. L’étude de ZAK établira les fondements d’une
analyse structurée de « validation de cibles thérapeutiques » intégrant les données de patients et de divers
modèles biologiques, dont la seule combinaison pourra
déboucher sur l’identification de nouveaux traitements. A
plus long terme, ce modèle d’étude sera appliqué à d’autres
cibles potentielles. ●
Publications :
Un article est en cours d’écriture :
The MAP3K ZAK, a new regulator of colorectal cancer cell
migration can be blocked by Nilotinib
Au niveau intracellulaire, nous avons pu détecter la protéine
ZAK aussi bien dans les TMA que dans les lignées cellulaires tumorales de colon. ZAK-b paraîtrait capable de
74
Étude des voies de tolérance des lésions : introduction d’une lésion unique sur le
chromosome
NAIMAN Karel
CENTRE DE RECHERCHE EN CANCEROLOGIE DE MARSEILLE - MARSEILLE
UMR7258 - Instabilité du Génome et Cancérogenèse
bination system of phage lambda, and consists in introducing a single lesion at a specific site on the chromosome of
a living cell. The preliminary steps have been achieved in
the bacteria showing a robust and precise integration.
After introducing of a single lesion in the genome, we were
able to study the genetic control of the partitioning among
Translesion Synthesis and Damage avoidance pathways
for different lesions. In physiological conditions, for less
blocking lesions like hpG (7-(2-hydroxypropyl)guanine),
TLS is the major pathway. However, blocking lesions like
AAF-G (guanin modified by N-2-acetylaminofluorene) are
bypassed mainly by DA events whereas TLS events represent a minor pathway. We could affect this ratio by
modifying the pool of specialized DNA polymerases in the
cell. In conclusion, the partition between DA and TLS is
function of the nature of the lesion to be bypassed and the
pool of polymerases present in the cell. Also we showed
that RecA is responsible for the majority of the DA
pathway. ●
In this work we investigate the metabolism of damaged
DNA, using a new methodology that allows to introduce
a single lesion at a specific locus on the chromosome of a
living cell.
The replication of damaged DNA is a universal problem
faced by all organisms. DNA lesions arise continuously
due to endogenous or environmental agents. In proliferating cells some of these lesions are inevitably encountered
during DNA replication and lead to the stalling of the DNA
polymerase. Cells possess two main strategies to restore
transiently blocked replication forks: Translesion synthesis
(TLS) and Damage Avoidance (DA) pathways. While TLS
pathways are error-prone and are the major source of point
mutations, DA pathways are error-free as they rely on
mechanisms related to homologous recombination with
the sister chromatid. Whereas TLS has been extensively
studied over the past 10 years after the discovery of the
specialized translesion DNA polymerases, the damage
avoidance pathway remains poorly defined by lack of an
appropriate methodology. Therefore, it appeared essential
to develop a new technology that would allow to study
lesion bypass and determine the structure of the replication
fork that encounters a lesion in the genome. The approach
we have developed is based upon the site-specific recom-
Publications :
Monitoring bypass of single replication-blocking lesions
by damage avoidance in the Escherichia coli chromosome.
Pag s V, Mazón G, Naiman K, Philippin G, Fuchs RP, Nucleic
Acids Research (in press)
75
Poster
Poster
Nouveaux algorithmes d’identification de transcrits chimères dans les données de RNASequencing pour l’amélioration du diagnostic en cancérologie.
La voie de signalisation Notch comme outil pour suivre les cellules souches et leurs lignages
au cours du développement et de la tumorigenèse de la glande mammaire.
PHILIPPE Nicolas
RODILLA Véronica
CENTRE DE RECHERCHE EN BIOCHIMIE MACROMOLECULAIRE - MONTPELLIER
CNRS UMR 5237 - Groupe Etudes Transcriptomes
CNRS UMR 144 - Unité Compartimentation Dynamique Cellulaires
Enfin, à partir de données de cellules leucémiques, des
séquences seront sélectionnées par le pipeline précédemment décrit, puis des validations expérimentales seront
effectuées. ●
Un défi de la transcriptomique par séquençage haut débit
(SHD) est d’explorer l’ensemble du répertoire de transcription. L’identification et la caractérisation de nouveaux
transcrits, parmi lesquels on trouve les ARN non-codants
et les ARN chimères, représentent un enjeu majeur en
cancérologie. Nous proposons de relever ce défi en concevant des approches bioinformatiques capables d’identifier
des ARN chimères potentiels à partir de données haut
débit.
Publications :
1) Prédiction d’ARN chimériques à partir de séquençage
d’ARN
Philippe N.; Salson M.; Ruffle F; Bou Samara E; Boureux A;
Commes T.; Rivals E.
7èmes Journées du Cancéropôle GSO du 18 au 19 octobre
2011
2) «Querying large read collections in main memory: a
versatile data structure.»
Philippe N., Salson M., Lecroq T., Leonard M., Commes T.,
Rivals E.
BMC Bioinformatics 2011, 12:242.
3) A Scalable Indexing Solution to Mine Huge Genomic
Sequence Collections
E. Rivals, N. Philippe, M. Salson, M. Leonard, T. Commes,
T. Lecroq
ERCIM News, Vol. 89, p. 20-21, 2012.
4) «CRAC: an integrated approach to read analysis.»
Philippe N., Salson M., Commes T., Rivals E. soumis à
Genome Biology
La méthode permettra d’identifier ces ARN à partir de
données de RNA-Sequencing avec une application ciblée
en cancérologie pour la détection de nouveaux marqueurs
dans les leucémies myéloïdes. L’efficacité repose nécessairement sur la création d’une structure d’indexation
adaptée pour un grand ensemble de séquences et sur un
algorithme complexe de recherche de séquences dans un
génome. À cette approche, nous couplerons une analyse
bioinformatique, intégrant la fiabilité des séquences et
leurs annotations génomiques permettant, ainsi, une caractérisation et une classification précise des chimères.
Un des objectifs sera de constituer une chimèrothèque qui
pourra être étendue à un plus grand ensemble de
tumeurs.
INTRODUCTION. Breast cancer is the leading cause of
cancer death in women in Western countries. Although
60-80% of these patients positively respond to chemotherapy, the rate of relapse is 20-70%. Comprehensive
gene expression profiling of large sets of tumors have
revealed five major molecular subtypes of breast cancer:
basal-like, luminal A, luminal B, HER2+/ER–, and normal
breast–like (from worst to best prognosis). However, it
remains unclear if there are different origins for each different subtype. To answer this question, first we need to
understand the cell biology of this tissue, the mammary
gland. Mammary gland development occurs post-natally,
when the mammary epithelium begins to grow; around 3
weeks of age and during puberty, the distal ends of the
mammary ducts enlarge into bulbous structures that
proliferate, extend into the fat pad, and branch by bifurcation until the ducts reach the limits of the fat pad. During
pregnancy, the reproductive hormones induce the expansion and differentiation of the mammary epithelium into
secretory (milk-producing) alveoli. Upon weaning, the
alveoli disappear through massive apoptosis, and the gland
is remodeled back to a state resembling that of a virgin
female (involution). The mammary epithelium is composed
of differentiated cells (luminal and myoepithelial cells),
stem cells and progenitors. Recently, it has been demonstrated that the mammary gland contains different types
of long-lived stem cells (myoepithelial stem cell and luminal
stem cell). Nevertheless, there are no specific markers for
each specific population. My project suggests that Notch
signaling can be used as a tool to follow stem cells, progenitors and their progeny during normal development as
well as transformation of the mammary epithelium.
identify Notch1-expressing lineages in the mammary gland
at different developmental stages, using knock-in mice
that allow the conditional expression of a reporter gene
under the control of Notch1 promoter.
RESULTS. My project is aimed at dissecting the involvement of Notch1 signaling in mammary gland homeostasis
and its role in breast cancer. While the Notch signaling
pathway has been implicated in controlling stem cell
maintenance in a variety of tissues, its precise expression
and function in mammary gland stem cells is still under
debate. This uncertainty is due on one hand to the lack of
lineage tracing studies defining the stem cell hierarchy and
their progeny in this tissue and on the other, to the lack of
reliable tools to investigate Notch expression in vivo. For
this purpose, our laboratory has recently generated a new
set of transgenic mice that allows the visualization of Notch
expression and activation in normal and malignant cells in
virtually all tissue. These new experimental reagents include mice to perform cell lineage tracing of the four Notch
receptors; and novel knock-in animals that conditionally
express the active form of the four Notch paralogues in a
tissue-specific manner. Using these new tools, we have
identified a subpopulation of luminal cells that are the
responsible for the hormone response. By lineage tracing
experiments with Notch1-CreERT2 mice crossed to a
double fluorescent reporter line (Rosa26(mT/mG), we
characterized the Notch1-expressing cells as a luminal
subset population ER (Estrogen Receptor) negative, PR
(Progesterone Receptor) negative that is maintained
throughout mammary development (from puberty to
adulthood). Interestingly, during pregnancy, these cells
expand up to 80% of the luminal cells. These results
strongly suggest a link between Notch1 and hormone
stimulation. By immunofluorescence and FACS analysis,
we determined that Notch1-expressing cells are actively
diving cells at different developmental stages, correlating
with the major response after hormone stimuli. To test
their stem cell capacities, we performed transplantations
In mammals, there are four Notch receptors (Notch1-4),
whose expression patterns and functions can be redundant
or specific depending on the tissue context. It is unknown
which Notch paralogues are involved in physiological
mammary gland development and how specific is their
action. For this purpose, my first objective has been to
76
77
Poster
and tubulogenesis in vitro, facilitating their manipulation.
These experiments will be crucial to understand the relationship between the different cell populations coexisting
in the mammary gland. Preliminary experiments have
shown that treatment of miniglands with Notch inhibitors
severely impairs ex vivo tubulogenesis. Thus, we plan to
examine, how Notch-expressing cells contribute to tubulogenesis by monitoring these cells during minigland
morphogenesis in real time by time-lapse microscopy. To
assess the Notch function in vivo, we will use a set of gain
of function Notch transgenic mice (Rosa26-Notch1IC),
which conditionally express activated form of Notch1 receptor and understand the functional contribution of this
receptor to develop mammary tumors.
with Notch1-sorted cells injected in cleared fat pads of
host mice. This functional assay allows performing serial
transplantations to measure self-renewal and to determine
stem cell content of Notch1-positive cells. After first transplantation, they were not able to grow on their own, but
they did in co-transplantation with myoepithelial cells.
Importantly, they could give rise exclusively to luminal
cells.
PERSPECTIVES. Next, we are interested in elucidating the
function of Notch1 receptor during mammary gland development using a gain-of-function approach in vivo. In order
to further test the plasticity of these cells, we will then
ablate this cell population in vivo, by crossing mice carrying
a conditional allele expressing diphtheria toxin A (DTA)
with Notch1-CreERT2 mice. Upon tamoxifen injection,
these mice express DTA exclusively in the Notch1-expressing cells, leading to ablation of this cell population. In addition, we will eliminate Notch1-expressing cells in 3D
organotypic primary mammary cultures grown ex vivo
(henceforth referred to as miniglands). These miniglands
recapitulate the morphogenesis of glandular structures
CONCLUSIONS. By cell tracing experiments we have
identified a luminal cell population Notch1 positive that
responds to hormone stimulation and contains high proliferative capacities. Mutations in this specific population
could be the origin of the most aggressive type of breast
cancer, triple negative for ER, PR and HER2. ●
Dynamique et mécano-transduction des intégrines à haute-résolution: Mécanismes
cellulaires de détection de la rigidité des tissues et implication dans la croissance tumorale.
ROSSIER Olivier
INSTITUT INTERDISCIPLINAIRE DE NEUROSCIENCES - BORDEAUX
UMR 5297 CNRS - Biophysics of Adhesion and Cytoskeleton Lab
by α5β1 integrins (Roca-Cusachs, 2009). Integrins are
critical in many cellular functions including adhesion,
mechanotransduction, cell motility, growth, differentiation
and apoptosis. All those functions are implicated in tumor
progression (Desgrosellier and Cheresh, 2010). Interestingly, many malignant phenotypes of cancer cells are linked
to upregulation of specific integrin heterodimers including
α5β1 and αvβ3 (Weaver, 1997; Taddei, 2003).
Rigidity of tissues is now regarded as a crucial physical
parameter regulating cell behavior in many physiological
responses: development (Keller, 2003), stem cell differentiation (Engler, 2006), but also in pathological diseases
such as tumor progression (Paszek, 2005; Peyton, 2007)
and fibrosis (Ingber, 2003). In the body, cells can experience a wide range of rigidities spanning from soft tissues
as in brain or breast to hard ones like bones and cartilages
(Discher, 2005). In normal situation native cells, in a given
tissue, function and respond optimally to the given rigidity
associated within this tissue (Moore, 2010). In cancerous
tissues, tumor microenvironment possesses an often radically altered extra-cellular matrix (ECM) that is often
associated with tissue stiffening. Clinicians intuitively use
such alterations –that essentially «dedifferentiate» the
surrounding tissue- to detect tumors through palpation.
While the great majority of cancer research has focused
on the differences in signaling and gene expression within
cancer cells, the insoluble cues conferred by the altered
ECM to the tumor and other cells within the tumor stroma
are also critical. Whether matrix stiffening actively causes
cancer is uncertain, as is the precise mechanism by which
cells sense stiffening within the tumor stroma. However,
understanding the basis of rigidity sensing in tumor pathogenesis as well as in normal cells may possibly result in a
new class of cancer drugs focused on disrupting the
mechano-sensing portion of cell motility.
At the cellular level, integrins are the core of focal adhesions (FAs) which are micron-sized macromolecular
complexes composed of more than 150 different proteins,
including actin binding-proteins (ABPs), scaffolding and
signalling proteins (Geiger, 2009). Integrins in FAs bind
to actin filaments through several ABPs such as talin,
filamin and tensin (Delon, 2007). As the adhesion matures,
additional proteins are recruited to reinforce the linkage
(Burridge, 1984). Integrins in FAs mediate adhesion and
force transmission to ECM essential for cell motility and
growth. Different αβ-integrins binding to FN perform
distinct functions and are simultaneously present in FAs.
Although the static nanoscale organization of FAs was
described (Kanchanawong, 2010), the role of integrin
dynamics during biochemical and biomechanical processes
in FAs is still elusive.
Using single protein tracking (spt) and super-resolution
PALM imaging we revealed the dynamic nano-organizations of β-integrins and talin inside mature FAs. We used
mouse embryonic fibroblasts (MEFs) spread on FN and
co-transfected with GFP-paxillin as a reporter for FAs. We
performed spt using the photoconvertible protein mEOS2
fused to β-integrins and talin. This strategy reduces steric
hindrance present in crowded and confined structures
such as FAs compared to fluorescently labelled antibodies
against extracellular domains of integrins (Galbraith,
2007). By reconstructing thousand β-integrin trajectories
outside and inside FAs, we obtained molecular-scale information about β-integrin interactions with components
Being the primary links between the ECM and the cell’s actin
cytoskeleton, integrin adhesion receptors appear to be key
players in the mechanotransduction of ECM physical properties. Integrins are transmembrane heterodimers composed of an α and a β chain. In vertebrates, there are 24
different heterodimers. Integrins mediate binding to a variety
of ECM components, including fibronectin (FN), collagen,
laminin, and vitronectin. There are important functional
differences between integrin complexes. For instance for
FN-binding integrins, less stable αvβ3 integrins initiate
signal transduction, while higher matrix forces are supported
78
79
Poster
of F-actin and the ECM. We plotted the mean square
displacement, i.e. surface explored, versus time and extracted instantaneous diffusions (D), diffusion modes (free,
confined) and sizes of the confinement domains and dwell
times. We showed that integrins alternate between freediffusion and bound states, thus integrins are not constantly
active while they reside in FAs. Integrin activation promotes
immobilization, stabilized in FAs by simultaneous FN and
ABPs connections. The integrin activator talin is recruited
in FAs directly from the cytosol without membrane freediffusion, restricting integrin immobilization to FAs. β3integrins immobilizations are enriched and stationary
within FAs, whereas β1-integrins are less enriched and
display rearward movements. Using chimeric β1-β3integrins, we show that these differences are determined
by the extracellular domain of β-integrins. Talin is enriched
and partly moving rearward in FAs, consistent with the
formation of stable connections with both β-integrins.
Thus, differential transmission of F-actin motion to FN
occurs through specific integrins within FAs.
How can the rigidity of the matrix be sensed by integrins?
Integrin involvement in the mechanosensing process was
proposed by Ingber (1991), and several reports have shown
that extracellular rigidity causes strengthening of the integrin linkage (Choquet, 1997). The lifetime of a bond
generally shortens (slips) with applied force. Catch bonds
are exceptions to this rule. In response to applied force,
the energy landscape of catch bonds changes in such a
way as to increase their strength under certain force regimes. Recently, a catch bond between integrin α5β1 and
FN was observed in-vitro at forces of 10–30 pN (Kong,
2009). Our goal is to establish whether rigidity sensing of
ECM by living cells is based on the catch bond property of
integrin-ECM linkages. To this aim, we will develop sensitive force-sensing techniques enabling super resolution
microscopy imaging to probe in real time and at the nanometer level, the different nano-dynamics of single β1- and
β3-integrins when myosinII-contractile forces are modulated by pharmacological approaches or when ECM-rigidity
is varied. ●
In the first part of my project, I unraveled a dynamic nanopartitioning of β3- and β1-integrins within FAs which defines the precise location and duration of β-integrin-specific
signals that could control local forces during cellular
functions such as migration and ECM remodeling. We
show that this organization is remodeled in less than a
hundred seconds. This more dynamic view of FN-integrinABPs connection implies to reconsider integrin biochemical
and mechanical signaling as transient processes constantly
relocating within FAs.
Publications :
Rossier, O., Octeau, V., Sibarita, J.-B., Leduc, C., Tessier,
B., Deepak, N., Gatterdam, V., Destaing, O., Albigès-Rizo,
C., Tampé, R., Cognet, L., Choquet, D., Lounis, B., & Giannone, G. « β1- and β3-integrins display differential nanodynamic organizations inside focal adhesions. » (en
révision à Nature Cell Biology).
Etude de la réparation des adduits encombrants et des pontages interbrins de l’ADN induits
par le stresse oxydant et/ou les agents anti-canéreux. Applications aux mécanismes
de tumorigenèse et de résisatnce aux thérapeutiques anti-cancéreuses.
TALHAOUI Ibtissam
UMR8200 - Stabilité Génétique et Oncogenèse
INTRODUCTION
L’ADN est continuellement exposé aux effets délétères des
espèces réactives de l’oxygène qui sont à l’origine du stresse
oxydant dans les cellules, conduisant à l’altération de l’ADN.
La persistance ou l’accumulation des dommages oxydatifs
dans le génome est impliquée dans l’apparition de différentes
pathologies notamment le cancer, les maladies neurodégénératives et le vieillissement. Les espèces réactives de
l’oxygène produisent le 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8oxoG)
et le 7,8-dihydro-8-oxoadenine (8oxoA) qui sont des adduits
hautement mutagènes dans les cellules de mammifères.
La grande majorité des bases oxydées de l’ADN sont réparées via la voie BER (Base Excision Repair) initiée par les
DNA glycosylases qui coupent la liaison N-glycosidique
entre la base modifiée et le désoxyribose.
ration du 8oxoA•T et à caractériser, in vivo, les effets
physiologiques de ce type de dommage dans des cellules
de mammifères.
Dans un premier temps, nous avons testé une série
d’enzymes de réparation de l’ADN chez la levure, la bactérie
et les mammifères. Cette approche avait pour objectif
l’identification des cibles potentielles qui pourraient intervenir dans la réparation du 8oxoA•T.
Ainsi, cette étude a montré, pour la première fois, que
lorsque le 8oxoA se trouve en face de T (8oxoA•T) il est
réparé par la glycosylase hTDG (human Thymine DNA
Glycosylase) chez l’Homme et par MUG (Mismatch-specific Uracil DNA Glycosylase) chez la bactérie Escherichia
Coli. J’ai également montré que TDG peut réparer le
dommage 8oxoA non seulement lorsqu’il est apparié avec
T (8oxoA•T) mais également avec C (8oxoA•C) et G
(8oxoA•G). De plus, nous avons utilisé deux formes de la
glycosylase hTDG, la protéine complète et une forme
tronquée appelée hTDG « core » qui ne possède que le
domaine catalytique. La comparaison des constantes cinétiques de ces deux dernières et de la glycosylase MUG a
montré que la hTDG présente une meilleure efficacité
d’excision du 8oxoA•T. Cette activité enzymatique à été
mesurée à partir d’enzymes purifiées et également à partir
d’extraits protéiques de cellules de mammifères et de
bactéries E. Coli.
A l’heure actuelle, on ne dispose que de très peu de données
sur la réparation du 8oxoA chez les mammifères et les
mécanismes impliqués dans cette activité demeurent peu
étudiés.
Néanmoins, des investigations antérieures ont montré que
chez les eucaryotes il existe une glycosylase appelée
8-oxoguanine-DNA-Glycosylase 1 (OGG1) qui excise le
8oxoA exclusivement lorsqu’il est apparié avec une base
C (Cytosine) (Jensen A et al). Une étude plus récente a
identifié une nouvelle enzyme appelée NEIL1 (endonuclease VIII-like protein 1) qui assure cette même fonction
chez les mammifères suggérant une importance biologique
de la réparation de cette lésion. Il a été rapporté qu’une
autre glycosylase présente dans les cellules de mammifères
serait capable de réparer le 8oxoA apparié avec une guanine (8oxoA•G) (Girard PM et al).
La deuxième partie de cette étude a consisté à vérifier la
resynthèse de l’ADN après l’élimination du 8oxoA. Pour
atteindre cet objectif j’ai utilisé la technique de la reconstitution, in vitro, de la voie BER. Ainsi, j’ai pu montrer qu’après
l’action de la hTDG, la polymérisation et la ligation de l’ADN
peut avoir lieu et permettre de rétablir son intégrité.
Enfin, nous avons voulu déterminer l’impact de la persistance de 8oxoA dans des cellules de mammifère en culture.
Afin de générer ce dommage dans l’ADN j’ai utilisé des
cellules MEF sauvages (Mouse Embryonic Fibroblast) et
DESCRIPTION DE L’ETUDE
Malgré les effets néfastes de l’accumulation du 8oxoA•T
dans le génome, aucune étude n’a permis d’identifier une
enzyme capable de réparer ce dommage. Dans ce contexte,
nous avons cherché à identifier, in vitro, les voies de répa-
80
81
dependent excision of 7,8-dihydro-8-oxoadenine by the
Ogg1 protein of Saccharomyces cerevisiae. Carcinogenesis.
1998;19:1299–1305.
n Inga R. Grin, Grigory L. Dianov and Dimitry O.Zhakov.
The role of mammalian NEIL1 protein in the repair of
8-oxo-7,8-dihydroadenine in DNA. FEBS Lett. 2010; 584:
1553–1557.
n Jensen A, Calvayrac G, Karahalil B, Bohr VA, Stevnsner
T. Mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 incises
8-oxoadenine opposite cytosine in nuclei and mitochondria, while a different glycosylase incises 8-oxoadenine
opposite guanine in nuclei. J. Biol. Chem. 2003;278:
19541–19548. ●
des cellules MEF-tdg déficientes que j’ai irradié avec des
rayons gamma à différentes doses allant de 0 Gy à 20 Gy.
De façon intéressante, cette expérience a montré que les
cellules qui n’expriment pas TDG présentent un taux de
survie inférieur à celui des cellules sauvages au sixième et
huitième jour après irradiation-gamma.
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Le 8oxoA peut se former dans les cellules de mammifères
après une irradiation-gamma et l’augmentation de son
niveau a été détectée dans différents types de cancer chez
l’Homme (Evans LD et al). Notre étude à permis d’identifier
le rôle clé de TDG chez l’Homme dans la réparation du
dommage 8oxoA et constitue un pas importante dans la
caractérisation de cette glycosylase. Néanmoins, le rôle
physiologique de TDG dans la lutte contre l’effet mutagénique du 8oxoA nécessite une investigation plus approfondie pour élucider le rôle de cette enzyme in vivo.
Publications :
7,8-dihydro-8-oxoadenine, a Highly Mutagenic Adduct,
is repaired by E. coli and Human Mismatch-Specific Uracil/
Thymine-DNA Glycosylase.
Ibtissam TALHAOUI, Sophie COUVE, Alexander A.
ISHCHENKO, Christophe KUNZ, Primo SCHÄR, Murat
SAPARBAEV.
REFERENCES :
n Evans MD, Dizdaroglu M, Cooke MS. Oxidative DNA
damage and disease: induction, repair and significance.
Mutat. Res. 2004;567:1–61.
n Girard PM, D’Ham C, Cadet J, Boiteux S. Opposite base-
82
PRIX kerner de vulgarisation
PRIX KERNER
DE VULGARISATION
ABOU SERHAL DAOU Pascale
Centre de Recherche en Cancerologie de Marseille,
MARSEILLE
Comment dérouter une cellule cancéreuse
DAVID Alexandre
Institut de Génomique Fonctionnelle, MONTPELLIER
« Produco Ergo Sum » Une nouvelle approche pour isoler
les cellules initiatrices de tumeur
AGUERA GONZALEZ Sonia
Institut Pasteur, PARIS
Les gardiens de notre organisme
DE FORGES Hélène
Institut Curie, PARIS
Intersections dans les cellules
BARTOLETTI Mathieu
Centre de Génétique Moléculaire, GIF-SUR-YVETTE
A la découverte d’une famille de facteurs impliqués
dans le contrôle de la prolifération des cellules
DUFOUR Julie
Clermont Université, AUBIERE
Privée de cholestérol, la tumeur de la prostate fera moins
la maligne
BENSIMON Julie
Commissariat à l’Energie Atomique,
FONTENAY-AUX-ROSES
Cellules souches cancéreuses et instabilité génétique :
un dangereux duo à l’origine des rechutes de cancer
du sein ?
EL IDRISSI LALLA MANALE
Faculté de médecine Lyon Sud, PIERRE-BENITE
Hépatite B et Cancer du foie… Le virus prend la main
sur les télomères!
EXERTIER Prisca
Université de Bordeaux, TALENCE
Eg5, une double cible thérapeutique dans le traitement
du cancer du rein
BERTHON Annabel
Clermont Université, AUBIERE
Quand la surrénale s’affole… De la compréhension
au traitement d’un hyperaldostéronisme primaire
FATTET Laurent
Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, LYON
Cancer du sein : combattre les métastases sans transition
BOSSON Anouk
Institut des Neurosciences, LA TRONCHE
A la recherche d’une enzyme pour ralentir le cancer…
GALLERNE Cindy
Faculté de Pharmacie
Université Paris 11, CHATENAY MALABRY
PU-H71 : molécule porteuse d’espoirs.
Vers une chimiothérapie plus efficace et moins toxique
BRUCHARD Mélanie
INSERM , DIJON
Immunosuppression: les coupables démasqués et éliminés,
vous pourrez enfin guérir.
GEORGESS Dan
Ecole Normale Supérieure de Lyon, LYON
Une autre perspective sur les cancers
CARVALHO Kevin
Reconstruire une cellule pour mieux la comprendre
GOC Jérémy
Centre de Recherche des Cordeliers, PARIS
Le système immunitaire : en première ligne pour combattre
la tumeur
CHALIGNE Ronan
Les épimutations : une nouvelle cible dans le traitement
du cancer ?
ILBOUDO Adeodat
Institut de Recherche en Santé, Environnement
et Travail, RENNES
Recherche d’un nouveau moyen de lutte contre le Virus
de l’Hépatite C
CHAPELLIER Marion
BMPs, le Ying et le Yang des cellules souches
85
PRIX kerner de vulgarisation
POULARD Coralie
Centre Léon Bérard, LYON
Des points rouges qui font la différence
LABUSSIERE Marianne
Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, PARIS
La mutation IDH1 dans les gliomes : une mutation porteuse
d’espoir
RICHETTA Clémence
Centre Européen de Recherche en Virologie
et en Immunologie, LYON
Pour comprendre le Yin et le Yang de l’autophagie:
Identification des protéines régulatrices de l’autophagie
MACHICOANE Mickael
Institut Pasteur, PARIS
Un souci commun aux parents et aux cellules :
L’orientation de ses enfants
RUIZ Emmanuelle
« Le lion et le rat » : Nouvel espoir thérapeutique contre
le cancer
MARMIGNON Antoine
CNRS / Université Paris sud XI, GIF SUR YVETTE
Petits réarrangements entre amis
MARNEF Aline
Université Paul Sabatier, Toulouse
Les ARN non-codants pointent le bout du nez
dans la cancérogénèse
STEFANI Caroline
Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire, NICE
Mieux comprendre les bactéries pour soigner le cancer :
une idée à creuser
MOLLA HERMAN ANAHI
Comment l’intégrité du génome est-elle protégée
de génération en génération?
86
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