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→ FOOD FROM SPIRULINA
→ INTRODUCTION
Le kit "Food from Spirulina" ainsi que les informations mentionnées ci-dessous constituent une
approche nouvelle et intéressante d'étudier la photosynthèse. Grâce à la lumière, les élèves peuvent
cultiver la spiruline et observer les cultures devenir de plus en plus denses au fur et à mesure de
la croissance de la cyanobactérie. A l'aide d'un milieu de culture contrôle, la nécessité du carbone
est clairement démontrée et l'intensité de la photosynthése est quantifiée en collectant l'oxygène
produit. Le fait de lier ce travail à la problématique des vols spatiaux habités en produisant de la
nourriture et de l'oxygène, ne peut que motiver les élèves dans leur travail et les pousser à une
réflexion plus poussée.
→ CONTEXTE
La spiruline (Arthrospira platensis - Figure 1) est un microbe photosynthétique unicellulaire. Elle
fait partie d'un groupe d'organismes qui se nomme cyanobactéries, du fait de leur couleur bleuvert. Ce groupe est souvent associé aux algues mais il s'agit d'une dénomination trompeuse. En
effet, les algues sont des organismes eucaryotiques (leurs cellules possèdent un noyau) alors que les
cyanobactéries, comme les autres bactéries, sont procaryotiques (leurs cellules ne possèdent pas de
noyau).
Les cyanobactéries sont considérées comme faisant partie des premiers organismes qui ont colonisé
la Terre, il y a 3,5 milliards d'années. C'est probablement leur abilité à produire de l'oxygène par
photosynthèse qui est à l'origine de l'atmosphère riche en oxygène que nous respirons aujourd'hui,
et qui a conduit à l'augmentation de la biodiversité sur la planète.
Les cyanobactéries sont plus grandes que la majorité des autres cellules bactériennes, ce qui signifie
qu'elles sont facilement observables au microscope optique, contrairement aux autres bactéries.
Bien que faisant partie des organismes unicellulaires, les cellules de la spiruline s'assemblent pour
former de longs filaments verts helicoïdaux.
Comme les plantes, la spiruline est autotrophe. Cela
signifique qu'elle fabrique sa propre nourriture en
utilisant l'énergie lumineuse pour convertir le dioxide
de carbone en glucose lors de la photosynthèse. Durant
ce processus, l'eau est oxydée en oxygène. L'équation de
la photosynthèse s'écrit comme suit:
6CO2 + 6H2O -> C6H12O6 + 6O2
Cette équation simplifiée masque le fait que la
photosynthèse se déroule en deux étapes distinctes.
La première étape est connue sous le nom d'étape
dépendante de la lumière car elle ne peut avoir lieu
qu'en présence d'une source d'énergie lumineuse. La
lumière est utilisée pour dissocier les molécules d'eau
en hydrogène et oxygène. Ce procédé produit également
de l'énergie qui sera utilisée plus tard, avec l'hydrogène,
lors du processus de photosynthèse.
2
Figure 1: La spiruline
(grossissement 250x)
vue
en
microscopie
optique
L'oxygène est un déchet de la photosynthèse bien qu'il soit bien sûr utilisé par les cellules pour la
respiration.
La seconde étape est connue sous le nom d'étape indépendante de la lumière car elle peut avoir
lieu même dans l'obscurité. Ici, l'énergie et l'hydrogène produits précédemment sont utilisés pour
convertir les molécules de dioxyde de carbone en sucre à six carbones, typiquement le glucose. C'est
à partir de ces sucres que des hydrates de carbone plus complexes, des acides aminés et d'autres
molécules chimiques sont produits.
C'est la capacité de fixer le dioxyde de carbone dans les sucres qui fait des organismes
photosynthétiques un élément essentiel du cycle du carbone; il y a plusieurs phénomènes qui
ajoute du dioxyde de carbone à l'atmosphère mais seulement la photosynthèse en retire. Bien que
minuscules lorsqu'ils sont pris individuellement, les microbes unicellulaires, comme la spiruline,
jouent un rôle primordial dans le cycle du carbone de part leur abondance.
Dans un écosystème fermé (c'est-à-dire qu'il n'y a pas d'échange net de la matière avec l'extérieur), il est
vital que le cycle du carbone soit parfaitement équilibré. Puisque les écosystèmes fermés obtiennent
de l'énergie (comme les rayons du soleil) de l'extérieur, un tel système pourrait théoriquement être
utilisé comme système de support de vie pour un vol spatial. Pour être à l'équilibre, les déchets
produits par une espèce doivent obligatoirement être utilsés par au moins une autre espèce. Il est
facile de voir comment la spiruline aurait sa place dans ce système, non seulement en produisant
de la nourriture pour les astronautes mais également en étant une source d'oxygène. D'un autre
côté, le dioxyde de carbone expiré par les astronautes pourrait être utilisé par la spiruline pour la
photosynthèse.
Un régime équilibré se compose d'hydrates de carbone, de lipides (graisses et huiles), de protéines,
de vitamines, de minéraux, de fibres alimentaires et, bien sûr d'eau. La spiruline peut fournir une
partie importante de ce régime et il est connu depuis le 16ème siècle que la spiruline était une source
de nourriture chez les Aztecs. La spiruline est particulièrement efficace pour convertir les sucres en
protéines.
Ce contenu important en protéines est à l'origine du succès commercial de la spiruline, qui est
vendue comme complément alimentaire. C'est un complément alimentaire rentable pour nourrir le
bétail mais c'est probablement en tant que nourriture pour les humains que le potentiel est le plus
important.
La spiruline contient tous les huit acides aminés essentiels (acides aminés que les humains sont
obligés d'obtenir à partir de leur nourriture puisqu'ils ne peuvent pas les produire eux-mêmes) et
elle est dés lors considérée très sérieusement par l'ESA pour faire partie des vols spatiaux habités. Il
s'agit du projet MELiSSA. Recycler le CO2 que les astronautes expirent en O2 et fournir de la biomasse
aux astronautes, nous rapproche du concept d'écosystème fermé. Les gnocchi de spiruline pourrait
être le premier plat de gourmet dégusté sur Mars!
3
→ ACTIVITÉ EXPERIMENTALE
Equipement
Inventaire du kit de la spiruline (Figure 2):
•
2 tubes contenant 10ml d'inoculum de spiruline. Si la spiruline est en bonne condition, le tube sera vert foncé
lorsqu'il arrive. Si le tube est vert clair ou vert-jaune, l'inoculum de spiruline pourrait être mal en endommagé.
Des amas de spiruline peuvent être visibles.
•
Un sac Ziploc contenant le milieu en poudre avec du bicarbonate (+). Le bicarbonate fournit une source
supplémentaire de carbone car l'air expiré par les élèves (voir ci-dessous) pourrait être insuffisant pour assurer
la survie de la spiruline.
•
Un sac Ziploc contenant le milieu en poudre sans bicarbonate (-).
•
2 tubes contenant 1mL de solution de micro-nutriments.
•
2 flacons de culture.
•
2 bouchons en caoutchouc.
•
2 longs tubes en silicone.
•
1 tube court en silicone.
•
Un filtre à air de 0,2 µm avec un tube fleixble pour l'assemblage.
Vous devez fournir:
•
Un marqueur indélébile.
•
Des ciseaux.
•
Une règle de 30cm.
•
Un élastique.
•
Des gants de laboratoire en latex (ou équivalent). Si cela n'est pas disponible, se laver les mains intensément
avant de commencer le montage.
•
Des chambres de collecte du gaz: deux seringues ou deux cylindres gradués (100mL minimum) pour collecter
l'oxygène produit. Cela fonctionne également avec deux petites bouteilles de 500mL propres.
•
2 grands gobelet/récipient capables de contenir les chambres de collecte du gaz.
•
De l'eau minérale (200mL) pour les flacons de spiruline et de l'eau du robinet pour les chambres de collecte du
gaz.
•
Petit bois ou bougie et allumettes.
•
Une horloge.
•
2 thermomètres + du papier collant.
•
Une caméra (la caméra d'un téléphone mobile est suffisante).
•
Du papier filter et un entonnoir.
•
Une lampe de bureau (avec ampoule incandescente de préférence mais uen ampoule économique peut
marcher également).
Figure 2: Inventaire du kit
4
Notes concernant la conservation de la spiruline
La spiruline est un organisme vivant qui requière de la lumière et des nutriments pour vivre. Vous
devriez dès lors utiliser le kit aussi vite que vous le pouvez et en tout cas dans les 5 jours de sa
réception.
Si vous n'utilisez pas le kit directement, stockez le à température ambiante et lumière ambiante.
La spiruline est sensible à la lumière. Des températures au-dessus de 40°C seront fatales alors
que des tempérautres en-dessous de 25°C ralentiront considérablement sa croissance et donc, la
production d'oxygène.
Une fois que l'expérience sera lancée, vous devrez contrôler la tempéraure de vos cultures et la
maintenir aussi proche que possible de l'optimal de température qui est 30°C. L'expérience pourrait
être située prés d'une source de chaleur (radiateur ou lampe de bureau). Evitez les fenêtres où la
température pourrait fluctuer.
Santé et sécurité
•
Ne pas aspirer par le tube court attaché au filtre à air.
•
Ne pas aspirer ou souffler dans les longs tubes.
•
Ne pas souffler trop fort dans le flacon à l'étape 34.
•
Ne pas manger ou boire les produits de cette expérience!
•
Vérifier que vos élèves n'ont pas d'allergie au latex avant d'utiliser les gants.
5
→ DISPOSITIF EXPERIMENTAL
Les élèves peuvent réaliser les étapes de ce protocole sous l'assistance de l'instituteur. Les étapes 13,
15 et 18 pourraient être physiquement difficiles pour les élèves – il est recommandé qu'elles soient
réalisées par un adulte.
Remarque: Si vous ne parvenez pas à insérer les tubes dans les bouchons en caoutchouc, essayez en
ajouter une petite quantité de lubrifiants à base d'eau ou du baume pour les lèvres ou similaire, sur
l'extrémité des tubes. Soyez très attentif à l'étape 13 si vous utilisez un lubrifiant.
Evaluer la distance/température et les conditions d'illumination
1. Se laver les mains correctement et enfiler les gants de laboratoire s'ils sont disponibles.
2. Déballer le kit.
3. S'assurer que l'inventaire est complet et que tous les accessoires sont intacts.
4. Utiliser votre marqueur pour écrirer "+" sur un flacon et "-" sur un autre.
5. Selectionner l'emplacement où l'expérience sera réalisée (évitez les endroits froids/venteux).
6. Placer le thermomètre à 50cm de la lampe de bureau et noter la température. Allumer la
lampe et noter de nouveau la température après 10 minutes.
7. Placer le thermomètre 10cm plus près et répeter la mesure après 10 minutes.
8. Répeter l'étape 7 jusqu'à ce que la température dépasse les 40°C. NE PAS dépasser la
température maximum de votre thermomètre.
9. Noter la distance à laquelle vous obtenez entre 30 et 40°C. Vos flacons de culture devront être
placés à cette distance de la source lumineuse.
10. Si disponible, utiliser un luxmètre et noter la valeur aux distances testées (il existe des
applications "luxmètre" pour smartphone). L'illumination idéale devrait être entre 2 et 20
klux.
11. Porter en graphique vos résultats de mesure de température et d'intensité lumineuse.
Remarque: Des conditions d'illumination trop importantes peuvent nuire à la spiruline, surtout
lorsque la culture est de faible densité. Veillez à rester dans la gamme de valeurs indiquée.
Mise en place des tubes pour le flacon "+"
12. A l'aide des ciseaux, faire des trous à travers un bouchon de caoutchouc. Ce bouchon devrait
maintenant avoir deux trous ouverts de part en part.
Remarque: Si vous utilisez le lubrifiant, assurez-vous que le lubrifiant ne sorte pas par la partie la
plus étroite du bouchon en caoutchouc à l'étape 13.
13. Prendre le tube de silicone court et le faire passer doucement à traver le bouchon jusqu'à ce
que 14cm sorte par la partie la plus étroite du bouchon.
14. Attacher le filtre à air à l'aide son tube flexible au tube sortant par la partie la plus large du
bouchon.
15. Prendre le long tube de silicone et le faire passer doucement au travers du bouchon jusqu'à
ce qu'il apparaîsse (pas plus) du côté le plus étroit du bouchon.
16. Mettre ce bouchon de côté.
6
Mise en place des tubes pour le flacon "-"
17. A l'aide des ciseaux, faire UN trou à travers l'autre bouchon de caoutchouc. Ce bouchon
devrait maintenant avoir seulement un trou ouvert de part en part.
18. Prendre le long tube de silicone et le faire passer doucement au travers du bouchon jusqu'à
ce qu'il apparaîsse (pas plus) du côté le plus étroit du bouchon.
19. Mettre ce bouchon de côté.
Mise en place de la chambre de collecte du gaz
20.Remplir de grand(s) gobelet(s) ou récipient(s) au ¾ de leur capacité avec de l'eau du robinet.
21. Remplir les cylindres de mesure (ou bouteilles de 500mL) avec de l'eau du robinet, en
s'assurant qu'ils soient pleins.
22. Inverser les cylindres/bouteilles de l'étape précédente dans les récipients, de sorte que leur
ouverture se trouve vers le bas et qu'ils contiennent toujours l'eau (il faudra les fermer lors
que mouvement d'inversion). Ces cylindres/bouteilles vont récolter les gaz produits par la
spiruline. Si du gaz est déjà présent dans le cylindre/bouteille après l'inversion, notez ce
niveau comme le niveau "0" avec votre marqueur.
23. Prendre le long tube de silicone destiné au flacon "-" (étapes 17-19) et insérer
précautionneusement son extrémité dans l'ouverture du cylindre/bouteille en le maintenant
en-dessous de l'eau. Le tube devrait remonter autant que possible dans le cylindre/bouteille
inversé.
24.Répeter l'étape 23 avec le tube de silicone destiné au flacon "+" (étapes 12-16).
Préparer le milieu de culture pour les flacons
25.Verser 100mL d'eau minérale tempérée dans chaque flacon ("-" et "+").
26.Dans chaque flacons, ajouter soigneusement le contenu (~1mL) d'un petit tube (Eppendorf).
Il faudra tapoter sur le tube afin de récuperer un maximum la poudre qu'il contient.
27. Au flacon "-", ajouter la poudre contenue dans le sachet marqué "-" (couper le sachet endessous de la fermeture Ziploc afin de faciliter le transfert de la poudre).
28.Au flacon "+", ajouter la poudre contenue dans le sachet marqué "+" (couper le sachet endessous de la fermeture Ziploc afin de faciliter le transfert de la poudre).
29.Refermer les flacons à l'aide du bouchon bleu et agiter doucement jusqu'à ce que tous les
composants soient dissous.
Commencer l'expérience
30.Enlever le bouchon du flacon "-" et ajouter l'entiéreté d'un inoculum de spiruline.
31. Agiter doucement le flacon "-" et placer le bouchon de caoutchouc avec un seul long tube
(étape 17 à 19).
7
32. Enlever le bouchon du flacon "+" et ajouter l'entiéreté d'un inoculum de spiruline.
33. Agiter doucement le flacon "+" et insérer le tube qui s'étend de l'extrémité étroite du
bouchon de caoutchouc "+" (étapes 12 à 16). NE PAS ENCORE FERMER CE FLACON.
34.Tout en maintenant le flacon ouvert, demander à un élève de souffler pendant environ 20
secondes dans le filtre à air, de sorte que l'air insufflé forme de petites bulles dans la culture
de spiruline.
35. Fermer le flacon "+" en enfonçant fermement le bouchon de caoutchouc.
36.Sceller le système du filtre en pliant le tube flexible près du filtre et en utilisant l'élastique
pour maintenir le tube plié en place.
37. Noter le niveau de gaz dans chaque chambre de collecte des gaz avec un marqueur.
38.Placer tout le dispositif, les flacons "+" et "-" et les chambre de collecte des gaz proches les
uns des autres à l'emplacement que vous aurez choisi (étapes 5 à 10).
39.Attacher un thermomètre sur chaque flacon afin de pouvoir suivre la température du
dispositif.
40.Maintenir les flacons droits pendant toutes la durée de l'expérience
Voyez la Figure A1 pour l'assemblage du flacon "+":
IMPORTANT: le positionnement de l'expérience
Bien que les conditions idéales soient 30°C
et un soleil de midi, cela n'est pas facilement
reproductible dans une classe d'école. Tentez
d'approcher ces conditions au maximum
en fournissant suffisament de lumière (en
suivant les étapes 5 à 10) et maintenez votre
expérience aussi proche que possible de 30°C.
Essayez d'éviter les variations de températures.
Pour une production de biomasse et d'oxygène
optimale, la lumière devrait rester allumée
tout le temps. Il faut éviter les cycles lumière/
obscurité.
Figure A1: Disposition du flacon "+" (système du filtre non encore scellé)
8
Sur base journalière (se référer à la feuille de travail)*
Remarque: L'expérience peut prendre plusieurs jours (5 à 7 jours) avant que la production de gaz
ne soit apparente. Cela est dû à la phase de latence que la spiruline doit subir lorsque vous diluez
l'inoculum 1/10
41. Prendre une photo du dispositif – essayer de prendre une photo similaire chaque jour.
42.Agiter doucement les flacons pour resuspendre la spiruline.
43.Noter la couleur de la culture (après resuspension) sur l'échelle fournie avec la feuille de
travail.
44.Arrêter l'expérience si vous constatez une croissance flagrante de bactérie ou moisissure
(production excessive de gaz sur une courte période).
45.Répeter les étapes 41 à 44 jusqu'à ce que vous constatiez qu'il n'y a plus ou peu de
production de gaz. La durée totale de l'expérience pourrait être de deux semaines.)
Remarque: Vous pourriez avoir envie de mesurer d'autres paramètres comme le pH mais rappelezvous qu'enlever le bouchon de caoutchouc va affecter la qualité du gaz collecté dans les chambres
de collecte du gaz.
A la fin de l'expérience
46.Porter en graphique vos données – gaz collecté en fonction du temps.
47.Porter en graphique vos données – analyse colorimétrique (en utilisant l'échelle fournie ou
similaire).
48.Tester le gaz produit: enlever le long tube des chambres de collecte du gaz. Inverser ces
chambres en les maintenant fermées. Maintenez une flamme près de l'ouverture de ces
chambres et enlever le bouchon/couvercle – l'oxygène devrait attiser la flamme (de la
bougie, par exemple).
49.Tester la biomasse produite: peser un papier filtre en utilisant une balance ayant une
précision de l'ordre du mg. Utiliser le filtre et l'entonnoir, filtrer doucement la culture de
spiruline. Essayer de maintenir le filtrat près du fond du filtre. Laisser le papier filtre sècher
naturellement pendant environ 4 jours. Peser le papier filtre avec le filtrat. La différence
de poids vous sera la masse de spiruline que vous avez produite (masse estimée: chaque
inoculum contient environ 10mg – à la fin de l'expérience, vous devriez avoir environ
100mg).
50.Si vous n'avez pas de balance adéquate à disposition, vous pouvez comparer la surface
occupée par la spiruline sur le filtre et comparer chaque flacon, "+" et "-".)
Attention: ne pas manger la spiruline!
Remarque finale: si vous voulez maintenir la culture de spiruline vivante dans votre classe/laboratoire,
nous incluons le SOP et recettes ci-dessous.
9
→ FEUILLES DE CALCUL
→ FEUILLE DE CALCUL 1
Distance (cm)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Luminosite
11
Temperature (C)
→ FEUILLE DE CALCUL 2
Jour
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Temperature (C)
Gaz (+)
Gaz (-)
Autre
LABORATORY FOR MOLECULAR
AND CELLULAR BIOLOGY
PROTOCOL VERSION :
02
DATE
STANDARD OPERATING PROCEDURE
: 2009-05-27
AUTHOR:
ZARROUK-UBP
PAGE :
Culture medium for Arthrospira sp
PCC8005
Ilse Coninx
1/1
1. Introduction
Zarrouk is an alkaline saline culture medium for the bluegreen photosynthetic cyanobacterium
Arthrospira sp.
2. Composition
The medium is prepared according to the optimization of G.Cogne from UBP (G. Cogne,2002
) In this optimised composition, the macro-elements solutions (solution 1 and 2) slightly
different from the original ZARROUK macro-elements solutions (Zarrouk, 1966 ). The number
of products in the trace-element solution are decreased and some elements are reduced in
concentration in the new protocol.
2.1. Macro-elements
Solution 1
Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL
Component
g/L
Authorized supplier
K2HPO4
0.5 g
MERCK MERCK / VWR
NaHCO3
10.5 g
MERCK / VWR
Na2CO3
7.6 g
MERCK / VWR
Solution 2
Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL
Component
g/L
Authorized supplier
NaNO3
2.5 g
MERCK / VWR
K2SO4
1.0 g
MERCK / VWR
NaCl
1.0 g
MERCK / VWR
MgSO4. 7 H2O
0.08 g or 8 mL from 1% solution
MERCK / VWR
CaCl2
0.03 g or 3 mL from 1% solution
MERCK / VWR
FeSO4. 7 H2O
0.01 g or 1 mL from 1% solution
SIGMA
EDTA
0.08 g or 8 mL from 1% solution
SIGMA
LABORATORY FOR MOLECULAR
AND CELLULAR BIOLOGY
STANDARD OPERATING PROCEDURE
ZARROUK-UBP
Culture medium for Arthrospira sp
PCC8005







PROTOCOL VERSION :
02
DATE
: 2009-05-27
AUTHOR:
PAGE :
Ilse Coninx
1/1
All products for trace-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 1 L milliQ water.
All products should be dissolved before autoclavation!
Check the pH of the solutions before autoclavation
The pH should be around 9.5
Sterilize all solutions by wet-heat sterilisation at 121°C, and 1 bar for 20 minutes.
After cooling of all the solutions, mix 250 mL macro-element solution 1 and 250 mL
macro-element solution 2
Add macro-element solution to the agar, approximately 60 à 70°C
Add 1 mL of the trace-elements to the macro-element (mixed) solution
4. Storage

Liquid zarrouk medium should be stored at 4°C and used within 6 months.

Trace-elements should be stored at 4°C and used within 1 year
5. Disposal

If the medium is contaminated or expired, disinfect and neutralise the medium before
storage in liquid waste containers.
6. References
G. Cogne et All; 2002, Uptake of Macrominerals and Trace Elements by the Cyanobacterium
Spirulina platensis (Arthrospira platensis PCC 8005) Under Photoautotrophic Conditions:
Culture Medium Optimization
DOI: 10.1002/bit.10504
LABORATORY FOR MOLECULAR
AND CELLULAR BIOLOGY
STANDARD OPERATING PROCEDURE
ZARROUK-UBP
Culture medium for Arthrospira sp
PCC8005
PROTOCOL VERSION :
02
DATE
: 2009-05-27
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Ilse Coninx
1/1
2.2. Trace-elements
Components for 1L medium,
Component
g/L
Authorized supplier
MERCK / VWR
MnCl2. 4H2O
0.23 g or 23 mL from 1% solution
ZnSO4. 7 H2O
0.11 g or 11 mL from 1% solution
CuSO4. 5 H2O
0.03 g or 3 mL from 1% solution
2.3. Agar
Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL
Component
g/L
Authorized supplier
Agar
15 g
INVITROGEN
3. Medium preparation
Liquid







Agar



All products for the macro-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 500 mL milliQ water.
All products for trace-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 1 L milliQ water.
All products should be dissolved before autoclavation !
Check the pH of the solutions,
The pH should be around 9,5
Sterilize all solutions by wet-heat sterilisation at 121°C, and 1 bar for 20 minutes.
After cooling of all the solutions, mix 500 mL macro-element solution 1 and 500 mL
macro-element solution 2
Add 1 mL of the trace-elements to the macro-element (mixed) solution
All products for the macro-elements should be double concentrated
All products for the macro-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 250 mL milliQ water.
500 mL 1,5% agar solution is prepared
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