Faculté de Pharmacie

Faculté de Pharmacie
Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques
Caractérisation des propriétés anticancéreuses de la fusicoccine A
et de l’ophioboline A au sein de modèles expérimentaux de
glioblastomes humains
Marina Bury
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur: Professeur Robert Kiss
Laboratoire de Toxicologie
Co-promoteur: Professeur Jacques Dubois
Laboratoire de Chimie Bioanalytique, Toxicologie et Chimie Physique Appliquée
Composition du jury :
Prof. Jean Nève (Président)
Prof. Caroline Stévigny (Secrétaire)
Prof. Jean-Michel Kauffmann
Prof. Ghanem Ghanem (Institut Jules Bordet, ULB)
Prof. Laurence Lagneaux (Institut Jules Bordet, ULB)
Prof. Thierry Cresteil (Institut de Chimie des Substances Naturelles, Gif-sur-Yvette)
Année académique 2012-2013
TABLE DES MATIÈRES
TABLE DES MATIÈRES
ABRÉVIATIONS.................................................................................................................. 5
BUT DU TRAVAIL ET RÉSUMÉ ............................................................................................ 8
INTRODUCTION .............................................................................................................. 10
I. Le glioblastome. ....................................................................................................... 10
1. Classification anatomo-pathologique. ...................................................................................................... 10
2. Épidémiologie. .......................................................................................................................................... 11
3. Tumorigenèse. .......................................................................................................................................... 11
4. Caractéristiques génétiques. .................................................................................................................... 12
4.1 Généralités. ........................................................................................................................................ 12
4.2 La voie des récepteurs à activité tyrosine kinase. .............................................................................. 12
4.3 La voie du gène suppresseur de tumeur p53. .................................................................................... 13
4.4 La voie de la protéine du rétinoblastome. ......................................................................................... 14
4.5 Les isocitrate déshydrogénases. ........................................................................................................ 14
5. Caractéristiques biologiques. ................................................................................................................... 15
5.1 Prolifération cellulaire. ....................................................................................................................... 15
5.2 Nécrose. ............................................................................................................................................. 15
5.3 Angiogenèse. ...................................................................................................................................... 16
5.4 Invasion. ............................................................................................................................................. 16
6. Traitements. ............................................................................................................................................. 17
6.1 Chirurgie. ............................................................................................................................................ 17
6.2 Radiothérapie et chimiothérapie standard. ....................................................................................... 18
6.3 Chimiothérapie de seconde ligne....................................................................................................... 18
6.4 Thérapies ciblées. ............................................................................................................................... 19
6.5 Thérapies locales. ............................................................................................................................... 20
7. Chimiorésistance. ..................................................................................................................................... 20
7.1 L’enzyme de réparation MGMT. ........................................................................................................ 20
7.2 Les pompes à efflux............................................................................................................................ 20
7.3 L’hypoxie. ........................................................................................................................................... 21
7.4 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose. ............................................................................ 23
II. La paraptose : une mort cellulaire non-apoptotique. ................................................ 25
1. Les principaux types de mort cellulaire. ................................................................................................... 25
1.1 L’apoptose. ......................................................................................................................................... 25
1.2 L’autophagie....................................................................................................................................... 26
1
1.3 La nécrose. ......................................................................................................................................... 27
1.4 La sénescence. ................................................................................................................................... 28
2. La paraptose. ............................................................................................................................................ 29
III. Les terpénoïdes. ..................................................................................................... 32
1. Généralités. .............................................................................................................................................. 32
2. Les terpénoïdes d’origine fongique étudiés dans ce travail. .................................................................... 33
2.1 La fusicoccine A. ................................................................................................................................. 33
2.1.1 Origine et propriétés connues à ce jour. .................................................................................... 33
2.1.2 La kinase d’adhérence focale, FAK. ............................................................................................ 35
2.2 L’ophioboline A. ................................................................................................................................. 36
2.2.1 Origine et propriétés connues à ce jour. .................................................................................... 36
2.2.2 Le canal ionique BKCa ................................................................................................................. 37
MATÉRIEL ET MÉTHODES ................................................................................................ 39
I. Origine des molécules utilisées dans le cadre du présent travail. ............................... 39
II. Étude de la stabilité physico-chimique. .................................................................... 39
III. Description des modèles expérimentaux. ................................................................ 39
1. Les modèles in vitro. ................................................................................................................................. 39
1.1 Lignées cellulaires établies. ................................................................................................................ 39
1.2 Primocultures. .................................................................................................................................... 40
1.3 Lignées cellulaires multi-drogues résistantes. ................................................................................... 40
1.4 Milieux et conditions de culture. ....................................................................................................... 41
1.5 Transfection. ...................................................................................................................................... 42
2. Le modèle B16F10 in vivo. ........................................................................................................................ 43
IV. Description des techniques utilisées. ...................................................................... 43
1. Analyses de l’expression et de l’activité des protéines. ........................................................................... 43
1.1 Le western blot. ................................................................................................................................. 43
1.2 La microscopie à fluorescence. .......................................................................................................... 45
1.3 Le test d’inhibition des protéines kinases. ......................................................................................... 46
2. Analyses de la croissance cellulaire. ......................................................................................................... 47
2.1 Le test colorimétrique MTT. ............................................................................................................... 47
2.2 La vidéomicroscopie quantitative : croissance et division cellulaire. ................................................ 48
2.3 La cytométrie de flux : analyse du cycle cellulaire. ........................................................................... 49
3. Analyses de la migration cellulaire. .......................................................................................................... 49
3.1 La vidéomicroscopie quantitative : motilité cellulaire. ...................................................................... 49
2
3.2 Les chambres d’invasion de Boyden. ................................................................................................. 50
3.3 Analyse des capacités d’adhésion des cellules. ................................................................................. 50
4. Analyses de la mort cellulaire. .................................................................................................................. 51
4.1 La coloration au bleu de trypan. ........................................................................................................ 51
4.2 La cytométrie de flux.......................................................................................................................... 51
4.2.1 Le marquage TUNEL.................................................................................................................... 51
4.2.2 Le double marquage annexine V/iodure de propidium ............................................................. 52
4.2.3 Le marquage à l’acridine orange. ............................................................................................... 53
4.3 Le test d’activité de la β-galactosidase. ............................................................................................. 53
4.4 Analyses des flux ioniques. ................................................................................................................ 54
4.4.1 Mesure de la concentration intracellulaire du calcium. ............................................................. 54
4.4.2 Le patch clamp : mesure de l’activité du canal BKCa. ................................................................. 55
5. Analyses statistiques. ............................................................................................................................... 56
5.1 Comparaison de groupes de données................................................................................................ 56
5.2 Analyse de survie. .............................................................................................................................. 56
RÉSULTATS ..................................................................................................................... 58
RÉSULTAT - I ................................................................................................................ 59
"Fusicoccin A, a phytotoxic carbotricyclic diterpene glucoside of fungal origin, reduces
proliferation and invasion of glioblastoma cells by targeting multiple tyrosine kinases".
................................................................................................................................... 59
RÉSULTAT - II ............................................................................................................... 62
"Ophiobolin A, a sesterterpenoid fungal phytotoxin, displays higher in vitro growthinhibitory effects in mammalian than in plant cells and it also displays in vivo antitumor
activity". ..................................................................................................................... 62
RÉSULTAT - III .............................................................................................................. 65
"Ophiobolin A induces paraptosis-like cell death in human glioblastoma cells by
decreasing BKCa channel activity". .............................................................................. 65
DISCUSSION .................................................................................................................... 68
I. L’intérêt de la fusicoccine A dans le traitement du glioblastome. .............................. 68
La protéine kinase FAK est une cible d’intérêt pour le traitement des glioblastomes. ................................ 69
II. L’intérêt de l’ophioboline A dans le traitement du glioblastome. .............................. 71
3
Le canal ionique BKCa est une cible d’intérêt pour le traitement des glioblastomes. ................................. 73
III. Perspectives de développement de la fusicoccine A et de l’ophioboline A. .............. 74
1. Évaluation in vivo...................................................................................................................................... 74
2. Hémisynthèse de dérivés de la fusicoccine A et de l’ophioboline A. ....................................................... 75
CONCLUSIONS................................................................................................................. 76
RÉFÉRENCES ................................................................................................................... 77
ANNEXE .......................................................................................................................... 94
4
ABRÉVIATIONS
ABRÉVIATIONS
5-ALA: 5-aminolevulinic acid
10-DAB: 10-déacetylbaccatine III
ABC: ATP-binding cassette
ABCB1: ABC sub-family B member 1
ABCC1: ABC sub-family C member 1
ABCG2: ABC sub-family G member 2
ADN: acide désoxyribonucléique
ALG-2: apoptosis linked gene 2
Alix: ALG-2-interacting protein X
AMPA: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor
ARNm: acide ribonucléique messager
ATCC: american type culture collection
Atg: autophagy-related gene
ATP: adénosine triphosphate
Bad: Bcl-2 antagonist of cell death
Bax: Bcl-2–associated X protein
BCA: bicinchoninic acid
Bcl-2: B-cell lymphoma 2
Bcl-XL: B-cell lymphoma-extra large
BCRP: breast cancer resistance protein
BHE: barrière hémato-encéphalique
BKCa: big conductance calcium-activated potassium channel
BSA: bovin serum albumin
CAD: caspase activated DNAse
CAM: cell adhesion molecule
CDK: cyclin-dependent kinase
CDKN2A: cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CSC: cellule souche cancéreuse
CSG: cellule souche de glioblastome
CSN: cellule souche neurale
DcR3: decoy receptor 3
DMSO: dimethylsulfoxide
DSMZ: deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen
dUTP: déoxyuridine triphosphate
EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid
EGF: epidermal growth factor
EGFR: epidermal growth factor receptor
EGTA: ethylene glycol tetraacetic acid
ERK: extracellular signal regulated kinase
FAK: focal adhesion kinase
FBS: fetal bovine serum
FITC: fluorescein isothiocyanate
GBM: glioblastome multiforme
GGDP: geranylgeranyl diphosphate
GGS: geranylgeranyl diphosphate synthase
Graf: GTPase regulator associated with focal adhesion kinase
Grb2: growth factor receptor-bound protein 2
5
Grb7: growth factor receptor-bound protein 7
HIF-1α: hypoxia inducible factor 1 alpha
HRP: horse radish peroxydase
HUVEC: human umbilical vein endothelial cells
IAP: inhibitor of apoptosis protein
IDH1: isocitrate déshydrogénase 1
IDH2: isocitrate déshydrogénase 2
IFN-α: interferon-α
IGF: insulin-like growth factor
IGF1R: insulin-like growth factor 1 receptor
IP: iodure de propidium
JNK: c-Jun N-terminal kinase
KGM-2: keratinocyte growth medium
LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3
LRP: low density lipoprotein regulated receptor protein
MAPK: mitogen-activated protein kinase
M-CSF: macrophage colony-stimulating factor
MDM2: murine double minute 2
MDM4: murine double minute 4
MDR1: multidrug resistance 1
MEC: matrice extracellulaire
MGMT: O6-methylguanine DNA methyltransferase
MIP: milieu intra-pipette
MMP: métalloprotéinase
MMR: mismatch repair
MRDO: maximal relative distance to the origin
MRP1: multidrug resistance protein 1
NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NCI: national cancer institute
NF1: neurofibromatosis 1
NFƘB: nuclear factor-kappa B
NK1R: neurokinin-1 receptor
NSCLC: non-small-cell lung carcinoma
Olig2: oligodendrocyte 2
OMS: organisation mondiale de la santé
PaFS: phomopsis amygdali fusicoccadiene synthase
PARP-1: poly (ADP-ribose) polymerase 1
PDGFR: platelet-derived growth factor receptor
P-gp: glycoprotéine-P
PI3K: phosphatidylinositol 3-kinase
pRB: protéine du rétinoblastome
PTEN: phosphatase and tensin homolog
PVDF: polyvinylidiène difluoride
Ras: rat sarcoma viral oncogene homolog
RIPK1: receptor-interacting protein kinase 1
RIPK3: receptor-interacting protein kinase 3
ROS: reactive oxygen species
RPMI: roswell park memorial institute medium
RTK: receptor tyrosine kinase
RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction
6
SA-β-Gal: senescence-associated beta-galactosidase
SDS: sodium dodecyl sulfate
siRNA: small interfering RNA
TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase
TMZ: témozolomide
TNF: tumor necrosis factor
TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling
VEGF: vascular endothelial growth factor
X-GAL: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
7
BUT DU TRAVAIL
ET
RÉSUMÉ
BUT DU TRAVAIL ET RÉSUMÉ
Le glioblastome est la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs cérébrales primaires.
Malgré un traitement standard pluridisciplinaire (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie),
la médiane de survie des patients atteints de ce type de tumeur est de 15 mois et aucun patient
n’a pu être guéri à ce jour. Ce pronostic très sombre est directement lié à la capacité
d’invasion diffuse du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales, ce qui rend
impossible une résection chirurgicale totale. De plus, ces cellules sont particulièrement
résistantes aux traitements chimiothérapeutiques de type pro-apoptotique, entrainant une
récidive quasi inévitable de la tumeur. De nombreuses stratégies thérapeutiques telles que
l’immunothérapie ou les thérapies ciblées sont actuellement explorées pour tenter de
combattre ces tumeurs. Cependant, leur efficacité au niveau clinique s’est avérée décevante. Il
devient donc indispensable d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques afin d’améliorer la
survie des patients atteints de glioblastome.
Dans ce travail, nous avons caractérisé les propriétés anticancéreuses in vitro et in vivo de
deux terpénoïdes extraits de champignons, la fusicoccine A et l’ophioboline A, puis nous
avons caractérisé en partie leur mécanisme d’action anti-tumoral dans des cellules de
glioblastome.
Tout d’abord, nous avons montré que l’activité inhibitrice de croissance in vitro de la
fusicoccine A et de l’ophioboline A n’était pas dépendante du degré de sensibilité ou de
résistance à l’apoptose des cellules gliales tumorales. Nous avons ensuite mis en évidence que
la fusicoccine A était capable de diminuer l’invasion des cellules de glioblastome in vitro en
ciblant la kinase focale d’adhérence (FAK). Dans le même temps, nous avons démontré que
l’ophioboline A était capable d’induire la mort de ces cellules par paraptose en inhibant
l’activité du canal ionique BKCa. Ces deux cibles sont intéressantes car en plus d’être
surexprimées dans les glioblastomes, elles interviennent dans de nombreux processus
cellulaires tels que la prolifération, la migration et la survie cellulaire.
Pour finir, nous avons analysé le pouvoir anti-tumoral in vivo de ces deux terpénoïdes en
utilisant un modèle murin de mélanome métastatique, couramment utilisé dans notre
laboratoire. Seule l’ophioboline A, injectée en intrapéritonéal à 10 mg/kg, augmentait de
manière significative la survie des souris traitées avec cette molécule par rapport aux souris
contrôles. Dans ce premier modèle, nous n’avions pas déterminé les conditions optimales
8
pour l’évaluation in vivo de la fusicoccine A et de l’ophioboline A. Lorsque celles-ci seront
définies, des modèles de xénogreffes orthotopiques de glioblastomes humains implantées dans
le cerveau de souris immunodéficientes seront utilisés.
En conclusion, l’ophioboline A, pouvant être produite en quantités industrielles par culture
du champignon qui la synthétise, possédant un mécanisme d’action original et montrant déjà
un début d’activité in vivo, pourrait représenter une molécule méritant des études plus
approfondies en termes d’agent thérapeutique susceptible de combattre les glioblastomes.
9
INTRODUCTION
Figure 1 : Classification mondiale des cancers en fonction de leur incidence et de leur
mortalité comprenant des individus des deux sexes et de tous âges (d’après International
Agency for Research on Cancer (IARC), Globocan, 2008).
INTRODUCTION
I. Le glioblastome.
1. Classification anatomo-pathologique.
Les gliomes, issus des cellules gliales, sont les plus communes des tumeurs cérébrales
primaires, par opposition aux tumeurs cérébrales secondaires ou métastases. Chaque année, ils
représentent 70 % des nouveaux cas de tumeurs malignes du système nerveux central
diagnostiqués chez l’adulte (Lima et coll., 2012 ; Ricard et coll., 2012). Bien que les gliomes
soient des cancers relativement rares (~2 % des tumeurs primaires), la mortalité associée à ce
type de tumeur est très élevée dans le monde (Figure 1) (Furnari et coll., 2007 ; Van Meir et
coll., 2010).
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) classe les gliomes en fonction de leur origine
histologique en tumeurs astrocytaires (60-70 % des gliomes), oligodendrogliales (20-30 %),
oligoastrocytaires (mixte) ou épendymaires (moins de 10 %) (Louis et coll., 2007). L’OMS
distingue également 4 grades de malignité au sein de ces tumeurs gliales, le grade I
correspondant aux tumeurs circonscrites et bénignes. Les gliomes malins, présentant la
caractéristique d’infiltrer de façon diffuse le parenchyme cérébral, sont appelés gliomes
« diffus » et incluent les tumeurs de grade II à IV. La détermination de la malignité repose
sur 6 caractéristiques biologiques: la différenciation de la tumeur, la densité cellulaire,
l’atypie nucléaire, l’activité mitotique, la prolifération micro-vasculaire et la nécrose (Table
1) (Furnari et coll., 2007 ; Ricard et coll., 2012).
Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes principalement intéressés au glioblastome
multiforme (GBM). Il représente le plus haut grade de malignité des gliomes d’origine
astrocytaire (grade IV) et est associé à un pronostic défavorable (Table 1). La médiane de
survie des patients diagnostiqués pour ce type de tumeur est de 15 mois et ce lorsqu’ils
suivent le traitement de référence associant la résection chirurgicale maximale de la tumeur
suivie d’une radiothérapie et d’un traitement concomitant de chimiothérapie avec le
témozolomide (TMZ). Moins de 10% des patients sont en vie après 5 ans et aucun n’a pu être
guéri à ce jour (Louis et coll., 2007; Stupp et coll., 2009 ; Ricard et coll., 2012).
10
Le glioblastome correspond à l’astrocytome de grade 4 dans ce tableau (d’après Ricard et coll., 2012).
Table 1 : Classification histologique des gliomes diffus (malins) et leur médiane de survie.
Les glioblastomes sont catégorisés en deux sous-types : les glioblastomes de novo ou
primaires (~90 %) et les glioblastomes secondaires, dérivant de la transformation progressive
des tumeurs astrocytaires de grade inférieur. Plus de 70 % des gliomes de grade II se
transforment en grade III puis en grade IV dans les 5 à 10 ans suivant le diagnostic (Furnari et
coll., 2007 ; Ricard et coll., 2012).
2. Épidémiologie.
En Europe et aux États-Unis (USA), le glioblastome représente plus de 50 % des tumeurs
gliales soit 3 à 4 nouveaux cas par an pour 100 000 habitants. Les glioblastomes secondaires
apparaissent principalement chez des personnes âgées de moins de 45 ans tandis que les
glioblastomes primaires surviennent dans la majorité des cas après 45 ans, avec un ratio
homme-femme de ~1.5 (Huang et coll., 2004; Furnari et coll., 2007 ; Ricard et coll., 2012).
À l’exception de l’exposition à des rayonnements ionisants et de certains syndromes
héréditaires tels que le syndrome de Li-Fraumeni et le syndrome de Cowden, peu de facteurs
sont actuellement connus sur l’origine des tumeurs cérébrales primaires (Ricard et coll.,
2012). Des altérations génétiques associées à des facteurs environnementaux encore inconnus
prédisposeraient les individus à développer un glioblastome (Chen et coll., 2012a). Les signes
cliniques des patients souffrant de cette tumeur ne sont pas spécifiques : ils traduisent
l’augmentation de la pression intracrânienne due au développement de la masse tumorale
(céphalées, nausées, vomissements et troubles de la vue). Dans un tiers des cas, ces
symptômes seront associés à des crises d’épilepsie (Gladson et coll., 2010).
3. Tumorigenèse.
Le terme de glioblastome « multiforme » provient de l’hétérogénéité des cellules présentes
au sein de la tumeur. Cette diversité a longtemps été expliquée par la présence de clones qui
assimileraient au cours de la progression tumorale différentes mutations génétiques (Nowell,
1976). Soumis à des pressions sélectives, comme l’environnement tumoral ou la radio- et la
chimiothérapie, seuls les clones agressifs et ayant acquis une résistance survivraient (Nowell,
1976; Bonavia et coll., 2011).
Actuellement, l’hypothèse « des cellules souches de glioblastome (CSGs) » semble être la
plus probable pour expliquer cette hétérogénéité cellulaire. Selon cette théorie, les cellules
11
Figure 2 : Tumorigenèse des glioblastomes. Au cours de la différenciation normale du
système nerveux central, les cellules souches neurales (CSNs) peuvent s’auto-renouveler et se
différencier afin de donner les différentes cellules matures présentes dans le cerveau par
l’intermédiaire des cellules progénitrices gliales et neuronales. Les cellules souches de
glioblastome (CSGs), à l’origine du processus tumoral, pourraient provenir de la
transformation des cellules CSNs, des cellules progénitrices gliales ou encore des astrocytes
(créé d’après Hadjipanayis et Van Meir, 2009 et Chen et coll., 2012b).
Localisation
Chromosome 1
Chromosome 2
Chromosome 3
Chromosome 4
Chromosome 5
Chromosome 7
Chromosome 9
Chromosome 10
Chromosome 12
Chromosome 13
Chromosome 17
Gène(s)
MDM4
(murine double minute 4)
IDH1
(isocitrate dehydrogenase 1)
PI3KCA (phosphatidylinositol 3kinase catalytic subunit)
PDGFR
(platelet-derived growth factor
receptor)
PI3KR1
(phosphatidylinositol 3-kinase
regulatory subunit)
EGFR
(epidermal growth factor receptor)
CDKN2A
(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)
PTEN
(phosphatase and tensin homolog)
CDK4
(cyclin-dependent kinase 4)
MDM2
(murine double minute 2)
RB1
(retinoblastoma 1)
NF1
(neurofribomatosis 1)
P53
(protein 53)
Altérations génétiques
Amplification (7%)
Mutation (11%)
Mutation (10%)
Amplification (7.5%)
Mutation (8%)
Amplification, mutation (35%)
Délétion (50%)
Mutation, délétion (30%)
Amplification (18%)
Amplification (14%)
Délétion, mutation (12%)
Mutation (15%)
Mutation (40%)
Table 2 : Modifications génétiques les plus fréquemment rencontrées dans les glioblastomes
(créé d’après Parsons et coll., 2008 ; Belden et coll., 2011).
souches neurales (CSNs), les cellules progénitrices gliales ainsi que les cellules matures, suite
à l’accumulation d’altérations génétiques, pourraient être à l’origine des cellules CSGs
(Figure 2). Ces dernières possèdent des caractéristiques similaires aux cellules CSNs, à savoir
la capacité de s’auto-renouveler, de proliférer et de se différencier en formant dès lors une
masse tumorale hétérogène (Wen et coll., 2008 ; Hadjipanayis et Van Meir, 2009 ; Chen et
coll., 2012b).
Les voies de signalisation de Sonic Hedgehog, de Notch, de Wnt ainsi que la voie de la
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et du facteur de transcription d’oligodendrocyte 2
(Olig2), essentielles au développement et à la régulation positive des cellules CSNs, sont
également actives dans les cellules CSGs (Van Meir et coll., 2010). Ces cellules CSGs
peuvent être identifiées par des marqueurs communs aux cellules CSNs comme la nestine,
Sox2, Olig2 ou encore par l’antigène de surface CD44 (Chen et coll., 2012b). Ces cellules
CSGs, localisées dans des niches vasculaires ainsi que dans les régions hypoxiques, sont
impliquées dans la résistance aux traitements radio-chimiothérapeutiques conventionnels que
nous détaillerons dans la suite de ce travail (Van Meir et coll., 2010 ; Chen et coll., 2012a-b).
4. Caractéristiques génétiques.
4.1 Généralités.
Dans la plupart des cancers, la tumorigenèse résulte de l’accumulation de plusieurs
évènements génétiques tels que des mutations, des amplifications ou des délétions (Table 2).
Dans le cas du glioblastome, les proto- et anti-oncogènes interviennent principalement dans 3
voies de signalisation : la voie des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTKs), la voie du
gène suppresseur de tumeur p53 et la voie de la protéine du rétinoblastome (pRB). Plus
récemment, il a été démontré que l’isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1) pouvait être impliquée
dans le processus de transformation des cellules gliales (Figure 3) (Van Meir et coll., 2010 ;
Belden et coll., 2011; Chen et coll., 2012b ; Ricard et coll., 2012).
4.2 La voie des récepteurs à activité tyrosine kinase.
La liaison de ligands aux récepteurs membranaires tels qu’EGFR (epidermal growth factor
receptor) et PDGFR (platelet-derived growth factor receptor) entraine l’activation des voies
de signalisation de PI3K et de Ras (rat sarcoma viral oncogene homolog). Il existe divers
12
Figure 3 : Voies principales de signalisation impliquées dans la tumorigenèse des
glioblastomes ; AKT= V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1, MAPK= mitogenactivated protein kinase, mTOR= mammalian target of rapamycin, Raf= V-raf murine
sarcoma viral oncogene homolog (créé d’après Belden et coll., 2011 et Ricard et coll., 2012).
régulateurs de ces voies : NF1 (neurofibromatosis 1) et PTEN (phosphatase and tensin
homolog) (Figure 3) (Oghaki et Kleihues, 2009 ; Belden et coll., 2011 ; Ricard et coll., 2012).
L’amplification des récepteurs RTKs en même temps que l’inactivation des gènes
suppresseurs de tumeur précédemment cités (PTEN et NF1) conduisent à une augmentation
anormale de la prolifération, de la migration et de la survie cellulaire ainsi qu’à une
augmentation de l’expression du facteur de transcription HIF-1α (hypoxia inducible factor 1
alpha) (Table 2 ; Figure 3) (Oghaki et Kleihues, 2007 et 2009 ; Belden et coll., 2011 ; Ricard
et coll., 2012). Le mutant le plus fréquent du récepteur EGFR, EGFRvIII (délétion des exons
2-7 de l’ARNm), peut également entrainer la sur-activation du récepteur EGFR en l’absence
de ligand (Huang et coll., 1997; Mellinghoff et coll., 2005 ; Oghaki et Kleihues, 2009). Cette
surexpression du récepteur EGFR est un marqueur de mauvais pronostic pour les patients
atteints de glioblastome (Nicolaidis, 2013).
4.3 La voie du gène suppresseur de tumeur p53.
Suite à l’exposition à des agents chimiques ou physiques, la protéine p53 peut soit stopper
temporairement le cycle cellulaire pour permettre la réparation éventuelle de l’ADN soit
induire l’apoptose des cellules lorsque les dommages sont trop importants (Van Meir et coll.,
2010). Le mécanisme d’action de p53 passe tout d’abord par la transcription du gène codant
pour la protéine p21. Cette dernière se lie et inhibe les protéines de la famille des cyclines D,
impliquées dans la progression du cycle cellulaire en phase G1. D’un autre côté, p53 peut
également contrôler la transcription de gènes pro-apoptotiques tels que Bax (Bcl-2–associated
X protein) et Fas (Van Meir et coll., 2010).
La voie de signalisation de p53 est régulièrement altérée dans les glioblastomes et ce, de
plusieurs façons : mutation/délétion de p53, surexpression des inhibiteurs de p53 tels que
MDM2 (murine double minute 2) et MDM4 (murine double minute 4) ou délétion de
CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), également appelé p16INK4a (Table 2 ;
Figure 3) (Oghaki et Kleihues 2009 ; Belden et coll., 2011 ; Ricard et coll., 2012). Les
altérations de p53 sont associées à un mauvais pronostic pour les patients atteints de ce type
de tumeur (Nicolaidis, 2013).
13
Figure 4 : Rôles de l’isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1) et de l’isocitrate déshydrogénase 2
(IDH2) dans les cellules de gliome. IDH1 dans le cytosol et IDH2 dans les mitochondries
interviennent dans le cycle de Krebs. Ils catalysent la décarboxylation oxydative de
l’isocitrate en α-cétoglutarate, réduisant le NADP+ en NADPH. Ce dernier est requis pour la
synthèse du glutathion qui protège les cellules du stress oxydatif et confère la résistance à
l’apoptose. De plus, le NADPH cytosolique sert de substrat aux NADPH oxydases, dont leur
production en peroxyde d’hydrogène inhibe les tyrosine-phosphatases, favorisant l’activation
des kinases impliquées dans la survie cellulaire. En plus de l’oxygène, les prolinehydroxylases, qui suppriment l’expression d’HIF-1α, requièrent l’α-cétoglutarate comme
substrat (d’après Thompson, 2009).
4.4 La voie de la protéine du rétinoblastome.
Lorsqu’elle n’est pas phosphorylée par des complexes cyclines/CDK (cyclin-dependent
kinase), la protéine du rétinoblastome (pRB) bloque l’entrée du cycle cellulaire en phase S via
la séquestration du facteur de transcription nucléaire E2F (Sherr et Roberts, 1999 ; Oghaki et
Kleihues, 2009 ; Van Meir et coll., 2010). La mutation de pRB, la dérégulation de CDK4
(cyclin-dependent kinase 4) directement suite à l’amplification du gène ou indirectement suite
à la délétion de CDKN2A, sont des altérations fréquemment rencontrées dans les cellules de
glioblastome (Table 2 ; Figure 3) (Oghaki et Kleihues, 2007 et 2009 ; Belden et coll., 2011 ;
Ricard et coll., 2012).
4.5 Les isocitrate déshydrogénases.
IDH1 dans le cytosol et IDH2 (isocitrate déshydrogénase 2) dans les mitochondries
interviennent dans le cycle de Krebs. Ces deux enzymes catalysent la décarboxylation
oxydative de l’isocitrate en α-cétoglutarate, réduisant le NADP+ en NADPH (nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate). La forme mutée d’IDH1, retrouvée principalement dans les
glioblastomes secondaires, permet la conversion de l’α-cétoglutarate en D2-hydroxyglutarate.
Cette réaction diminue la formation de NADPH et donc la synthèse de glutathion qui est
capable d’éliminer les espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Thompson, 2009 ; Singh S et
coll., 2012). L’altération d’IDH1 va augmenter la sensibilité au stress oxydatif et par
conséquent la sensibilité à la radio- et chimiothérapie (Chen et coll., 2012b). En effet, les
radiations ionisantes entrainent la formation de radicaux libres ainsi que des lésions au niveau
de l’ADN, induisant la mort des cellules (Verrelle, 1998). De plus, il a été démontré que le
témozolomide pouvait également induire la production de ROS suite aux dommages de
l’ADN (Zhang et coll., 2010 ; Oliva et coll., 2011). La mutation d’IDH1 est un facteur
pronostic favorable à la survie des patients atteints de glioblastome (Ricard et coll., 2012).
Cependant, paradoxalement, cette mutation augmente l’expression d’HIF-1α, favorisant la
glycolyse et stimulant l’angiogenèse (Figure 4) (Thompson, 2009 ; Zhao et coll., 2009).
Plus récemment, Verhaak et ses collaborateurs ont proposé une classification des
glioblastomes en fonction de leur profil génétique. Elle distingue 4 sous-types : classique,
mésenchymal, neural et proneural (Verhaak et coll., 2010). Bien que les différentes voies de
signalisation dont nous venons de discuter soient altérées dans la majorité des glioblastomes,
14
Table 3 : Classification des glioblastomes basée sur leur profil génétique (d’après Belden et
coll., 2011).
des altérations génétiques spécifiques peuvent être observées dans chacun des sous-types
(Table 3). On retrouve par exemple préférentiellement les altérations d’EGFR, de NF1 et de
PDGFR/IDH1 dans les sous-types classique, mésenchymal et proneural (Van Meir et coll.,
2010 ; Verhaak et coll., 2010). Ces sous-types présentent des caractéristiques génétiques
distinctes, expliquant la différence de survie et de sensibilité aux traitements observée chez les
patients atteints de glioblastome (Van Meir et coll., 2010 ; Verhaak et coll., 2010). Cette
classification ouvre la voie aux traitements personnalisés en fonction de la signature génétique
de chacune des tumeurs (Verhaak et coll., 2010 ; Nicolaidis, 2013). Par exemple, le géfitinib
(Iressa®), un inhibiteur du récepteur EGFR, pourrait être utilisé chez les patients atteints d’un
glioblastome de sous-type classique tandis que l’imatinib (Glivec®), un inhibiteur du
récepteur PDGFR pourrait être utilisé pour le sous-type proneural (Perry et coll., 2013).
5. Caractéristiques biologiques.
L’altération de la prolifération, la présence de zones nécrotiques, une angiogenèse
imparfaite ainsi qu’une grande capacité d’invasion des glioblastomes sont des conséquences
des altérations génétiques décrites précédemment. Ils sont des indicateurs de l’agressivité de
la tumeur et permettent de distinguer les glioblastomes des tumeurs de grade inférieur
(Furnari et coll., 2007).
5.1 Prolifération cellulaire.
Les gliomes de haut grade histologique se différencient des tumeurs de bas grade par une
activité mitotique importante. En effet, la progression des gliomes de grade II en grade III ou
IV est associée à l’accumulation d’évènements génétiques comme l’activation de la voie de
signalisation des récepteurs RTKs ou l’inactivation des voies de signalisation impliquées dans
le contrôle du cycle cellulaire telles que la voie de p53 et celle de RB1 (Louis, 2006 ; Belden
et coll., 2011).
5.2 Nécrose.
Les glioblastomes sont caractérisés par de larges zones nécrotiques liées à la croissance
rapide des cellules et aux phénomènes micro-thrombotiques des vaisseaux adjacents (Louis,
2006). En effet, les cellules de glioblastome, de par leur prolifération rapide, s’éloignent des
vaisseaux sanguins qui représentent la source d’oxygène et de nutriments nécessaires au
15
Figure 5 : Lien entre hypoxie, nécrose et angiogenèse dans les cellules gliales tumorales ; (a)
L’hypoxie localisée suite à un manque d’oxygène et de nutriments entraine l’expression de
gènes impliqués dans la migration, (b) conduisant les cellules à migrer hors de cette zone
hypoxique. (c) S’ensuit l’apparition d’une zone nécrotique centrale autour de laquelle se
trouvent les cellules pseudopalissadiques, (d) capables d’exprimer des facteurs angiogéniques
tels que VEGF induisant de l’angiogénèse adjacente (d’après Louis, 2006).
développement tumoral. La diminution de l’apport en oxygène induit la formation de zones
nécrotiques. Pour contrebalancer cet effet de l’hypoxie, les cellules tumorales surexpriment le
facteur de transcription HIF-1α qui va induire l’expression des métalloprotéinases (MMPs)
(Louis, 2006). Ces enzymes sont capables de remodeler la matrice extracellulaire facilitant la
migration de certaines cellules hors de la zone nécrosée. Ces cellules situées en périphérie
sont appelées «pseudopalissadiques » et forment le front de migration de la tumeur (Figure 5)
(Brat et Van Meir, 2004 ; Louis, 2006 ; Rong et coll., 2006).
5.3 Angiogenèse.
De par leur prolifération importante, les cellules de glioblastome s’exposent à un stress
hypoxique (Louis, 2006). Afin de survivre dans cet environnement appauvri en nutriments et
en oxygène, les cellules pseudopalissadiques vont sécréter le facteur VEGF (vascular
endothelial growth factor), qui est sous le contrôle d’HIF-1α. Le facteur VEGF en se liant à
des récepteurs spécifiques au niveau de la surface des cellules endothéliales des vaisseaux
sanguins, va inciter ces derniers à proliférer en direction du foyer tumoral. Cette « néoangiogenèse adjacente », aussi appelée prolifération micro-vasculaire gloméruloïde, faisant
référence à la forme anarchique de ces vaisseaux sanguins, est caractéristique des
glioblastomes (Figure 5) (Brat et Van Meir, 2004 ; Louis, 2006 ; Rong et coll., 2006).
Les mutations de PTEN, d’IDH1 et d’EGFR peuvent également favoriser le phénomène de
néo-angiogenèse en stabilisant HIF-1α comme nous l’avons vu précédemment (Belden et
coll., 2011).
5.4 Invasion.
Les cellules tumorales gliales migrent dans le parenchyme cérébral préférentiellement le
long de la lame basale des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses ainsi qu’autour des
neurones et sous la pie-mère (Louis, 2006). L’invasion des cellules de glioblastome résulte de
la coordination de plusieurs mécanismes cellulaires distincts. Dans un premier temps,
l’activité des protéines d’adhésion cellulaire (CAMs) dont les cadhérines sera réprimée
permettant le détachement de certaines cellules tumorales gliales de la masse tumorale
(Belden et coll., 2011). Dans un second temps, les cellules de glioblastome vont s’attacher à la
matrice extracellulaire par l’intermédiaire des intégrines capables d’activer la kinase FAK
(focal adhesion kinase) ainsi que d’autres médiateurs de l’adhésion et de la migration
16
Figure 6 : Photographies d’un glioblastome lors d’une résection chirurgicale. (A) Illustration
du glioblastome lorsque le microscope émet une lumière blanche. (B) Illustration après
l’administration de 5-ALA qui va induire l’accumulation de la protoporphyrine IX. Suite à
une excitation dans le bleue, cette dernière devient rouge fluorescente dans les cellules
tumorales (d’après Colditz et coll., 2012).
Figure 7 : Mécanisme d’action du témozolomide (d’après Fukushima et coll., 2009).
cellulaire (Belden et coll., 2011). Le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC),
nécessaire à l’établissement d’un microenvironnement favorable à l’expansion de la tumeur,
se fait ensuite principalement grâce à la sécrétion de protéases telles que les MMPs et les
cathepsines. Enfin, diverses voies de signalisation liées à des facteurs de croissance jouent
également un rôle important dans la motilité cellulaire en activant, par exemple, les RhoGTPases impliquées dans la réorganisation du cytosquelette d’actine (Nakada et coll., 2007 ;
Belden et coll., 2011).
La dérégulation des cadhérines, la surexpression des intégrines αvβ1, αvβ3 et αvβ5 ainsi que
la surexpression des protéases MMPs 2, 9 et 12,
participent au phénotype invasif des
glioblastomes (Maret et coll., 2010 ; Belden et coll., 2011).
6. Traitements.
6.1 Chirurgie.
Le traitement de première intention pour les patients atteints de glioblastome est la
résection chirurgicale. Dans ce type de tumeur, la chirurgie n’est pas curative pour deux
raisons. Tout d’abord, la localisation de la tumeur est un facteur limitant dont il faut tenir
compte. Actuellement, la chirurgie éveillée avec électrostimulation intra-opérative permettant
de cartographier les zones du cerveau impliquées dans les fonctions motrices, cognitives et du
langage, est devenu un outil essentiel (Szelényi et coll., 2010 ; Moliterno et coll., 2012).
Ensuite, le caractère infiltrant des glioblastomes empêche la résection totale de la tumeur, qui
récidivera quelques mois plus tard. Afin d’améliorer la visualisation de la tumeur lors d’une
opération, la chirurgie, guidée par fluorescence avec l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA)
commercialisé sous le nom de Gliolan®, peut être pratiquée : l’administration de 5-ALA va
induire l’accumulation de la protoporphyrine IX fluorescente au sein des cellules tumorales
(Figure 6) (Cortnum et Laursen, 2012 ; Moliterno et coll., 2012). Cette chirurgie
cytoréductive permet de diminuer les symptômes liés à l’effet de masse de la tumeur. Elle
permet aussi d’augmenter la réponse aux traitements adjuvants, améliorant la survie des
patients (Moliterno et coll., 2012 ; Ricard et coll., 2012).
17
Figure 8 : Taux de survie des patients atteints de glioblastome traités par radiothérapie seule
ou en combinaison avec le témozolomide (modifié d’après Stupp et coll., 2009).
Figure 9 : Agents chimiothérapiques de seconde ligne utilisés dans le traitement du
glioblastome.
6.2 Radiothérapie et chimiothérapie standard.
Après la chirurgie, le témozolomide (TMZ, Temodal®) est utilisé comme traitement de
référence de façon concomitante puis adjuvante à la radiothérapie (Stupp et coll., 2009). Le
témozolomide est un agent alkylant de la famille des triazènes, caractérisé par une
biodisponibilité orale élevée. De plus, ce composé est capable de passer la barrière hématoencéphalique (Friedman et coll., 2000 ; Tentori et Graziani, 2009 ; Ricard et coll., 2012). À
pH physiologique, le témozolomide est hydrolysé en 5-(3-méthyltriazène-1-yl) imidazole-4carboxamide (MTIC) qui libère l’ion méthyldiazonium capable de méthyler les guanines en
position O6 de l’ADN (Fukushima et coll., 2009). En cas de déficience de l’enzyme de
réparation MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase), la guanine méthylée est
incapable de se lier avec la cytosine durant la réplication de l’ADN engendrant un
appariement incorrect (Figure 7) (Ochs et Kaina, 2000 ; Neidle et Thurston, 2005 ;
Fukushima et coll., 2009 ; Ricard et coll., 2012). L’accumulation de mésappariements
provoque un arrêt prolongé du cycle cellulaire en phase G2 et induit le processus
d’autophagie qui sera suivi de mort par apoptose (Kanzawa et coll., 2004 ; Roos et coll.,
2007).
Le témozolomide administré pendant (75 mg/m2 par jour) et après (150-200 mg/m2 par
jour, 6 cycles de 5 jours espacés de 28 jours) la radiothérapie conventionnelle (60 Gy
fractionnés en doses de 2 Gy délivrées 5 jours par semaine pendant 6 semaines) apporte un
bénéfice thérapeutique réel pour les patients atteints de glioblastome. En effet, les taux de
survie des patients traités par ce protocole thérapeutique sont augmentés par rapport à ceux
traités par radiothérapie seule (Figure 8) (Stupp et coll., 2009 ; Ricard et coll., 2012).
6.3 Chimiothérapie de seconde ligne.
Les chimiothérapies de seconde ligne peuvent être utilisées en cas d’échec du traitement de
référence notamment en cas d’expression de l’enzyme de réparation MGMT. Les nitrosourées telles que la carmustine et la lomustine, qui sont des agents alkylants de l’ADN, sont
des alternatives couramment employées (Figure 9) (Johnson et Chang, 2012). Cependant, ces
nitroso-urées n’apportent qu’un bénéfice modeste avec un taux de réponse inférieur à 10 % et
un taux de survie sans progression à 6 mois de 15 % (Ricard et coll., 2012). Dans le cas d’un
glioblastome récurrent, la lomustine est souvent utilisée en combinaison avec la procarbazine,
18
Figure 10 : Nouvelles thérapies ciblées utilisées dans le traitement du glioblastome (d’après Perry et coll., 2012).
un autre agent alkylant de l’ADN et la vincristine (Vincrisin®), un inhibiteur de la
polymérisation des microtubules, pour former le traitement connu sous le nom de PCV
(procarbazine-lomustine-vincristine) (Figure 9) (Johnson et Chang, 2012 ; Ricard et coll.,
2012).
6.4 Thérapies ciblées.
Actuellement, l’utilisation de molécules ciblant de manière spécifique certaines protéines
altérées dans diverses voies de signalisation, responsables de la progression tumorale ou de la
résistance aux traitements conventionnels est favorisée. Ces thérapies ciblées sont testées
seule ou en combinaison avec d’autres traitements (Ricard et coll., 2012). Plus de 800 essais
cliniques sont en cours pour le glioblastome (avril 2013, www.clinicaltrials.gov).
Les essais qui ont été les plus initiés dans le traitement des glioblastomes ciblent
principalement les récepteurs RTKs, la voie de signalisation de PI3K/Akt ainsi que les
facteurs angiogéniques (Figure 10) (Perry et coll., 2013). Le bevacizumab (Avastin®), un
anticorps monoclonal humanisé anti-VEGF, est pressenti comme prometteur dans le
traitement du glioblastome. Des études cliniques ont montré que le bevacizumab, administré
seul ou en combinaison avec l’irinotecan (Campto® ; inhibiteur de la topoisomérase I), était
associé à un taux de survie sans progression à 6 mois de 35 à 50 % dans le cas des
glioblastomes récurrents (Friedman et coll., 2009).
D’autres approches sont en cours d’études notamment par le ciblage de la voie Notch
(importante dans la biologie des cellules souches) ou par l’inhibition des mécanismes de
réparation de l’ADN (Perry et coll., 2013). Le traitement par virus oncolytiques ainsi que
l’immunothérapie sont également des voies explorées dans le traitement des glioblastomes
(Hadjipanayis et Van Meir, 2009 ; Van Meir et coll., 2010 ; Perry et coll., 2013).
Rindopepimut, un vaccin dirigé contre l’oncogène EGFRvIII, est un exemple de ces nouveaux
candidats thérapeutiques (Ricard et coll., 2012). Malgré le réel intérêt théorique de développer
ce type de traitement, leur efficacité au niveau clinique s’est avérée décevante. L’optimisation
de la distribution de ces thérapies ciblées en fonction du profil génétique des tumeurs sera un
des défis majeurs dans les années à venir (Nicolaidis, 2013).
19
Figure 11 : Après la résection chirurgicale, le Gliadel® est implanté directement dans la
cavité, permettant le relargage local de la carmustine (d’après Lesniak et Brem, 2004).
6.5 Thérapies locales.
Des traitements locaux ont été envisagés suite à la difficulté de la plupart des molécules
administrées de manière systémique à passer la barrière hémato-encéphalique (BHE) (Lesniak
et Brem, 2004). Le Gliadel®, constitué de gaufrettes imprégnées de carmustine est inséré dans
la cavité chirurgicale formée après la résection tumorale (Figure 11) (Zhou et coll., 2012).
Une première étude clinique a pu mettre en évidence que ce système de relargage contrôlé
était plus efficace que les thérapies standards dans le cas de glioblastomes récurrents (Brem et
coll., 1995). Récemment, un système de délivrance par convection, utilisant des nanovecteurs
tels que des liposomes, a également été testé sur des patients atteints de glioblastome (Zhou et
coll., 2012). Soumis à un gradient de pression continu, les molécules chargées dans ces
nanovecteurs, sont dispersées dans le cerveau via l’écoulement au travers d’une canule. Ce
système de délivrance prometteur pourra être utilisé par exemple avec des agents de thérapie
ciblée (Zhou et coll., 2012).
7. Chimiorésistance.
7.1 L’enzyme de réparation MGMT.
L’O6-méthylguanine DNA méthyltransférase (MGMT) est une enzyme de réparation de
l’ADN qui élimine les groupements alkyles mutagéniques se fixant en position O6 de la
méthylguanine (Hegi et coll., 2005). Le silence épigénétique du gène MGMT suite à la
méthylation de son promoteur est fréquent dans les glioblastomes (~ 50 %). Il prédit une
meilleure survie pour les patients atteints de ce type de tumeur, qui en association avec une
radiothérapie, ont été traités avec des agents alkylants tels que le témozolomide (Hegi et coll.,
2005). En effet, dans le cas d’une défaillance de l’enzyme MGMT, le système enzymatique
MMR (mismatch repair), suite à l’accumulation de mésappariements dans l’ADN, peut
induire l’apoptose des cellules tumorales (Allan et Travis, 2005 ; Hegi et coll., 2005 ; Oghaki
et Kleihues, 2009 ; Stupp et coll., 2009).
7.2 Les pompes à efflux.
Les transporteurs à ATP-binding cassette (ABC), surexprimés dans les gliomes, sont
impliqués dans la résistance « multi-drogue » en exportant les agents chimiothérapeutiques à
l’extérieur de la cellule. La glycoprotéine-P (P-gp), la protéine de résistance multi-drogue 1
20
Figure 12 : Symbiose métabolique des cellules tumorales hypoxiques et normoxiques. Les
cellules gliales tumorales ont la capacité de moduler leur métabolisme afin de s’adapter à un
microenvironnement faible en oxygène. La surexpression d’HIF-1 en condition hypoxique
induit l’expression de protéines qui favorisent la glycolyse (effet Warburg) conduisant à
l’absorption du glucose par le transporteur GLUT1 (glucose transporter 1), à la conversion du
glucose en pyruvate par les enzymes glycolytiques, à la génération de lactate et d’H+ par la
LDHA (lactate dehydrogenase A) et à l’efflux de ces molécules hors de la cellule grâce à
l’anhydrase carbonique IX (CA9), au MCT4 (monocarboxylate transporter 4) et à l’échangeur
sodium-hydrogène (NHE1). L’acidification résultante va permettre l’expansion tumorale en
créant un environnement hostile pour le tissu sain. Par ailleurs, les cellules tumorales en
aérobie sont capables de récupérer le lactate grâce au transporteur MCT1 et de l’utiliser
comme principal substrat pour la phosphorylation oxydative mitochondriale, permettant une
symbiose métabolique entre les cellules tumorales hypoxiques et normoxiques (d’après
Semenza, 2008).
(MRP1) ainsi que la protéine de résistance au cancer du sein (BCRP) sont les principales
protéines appartenant à cette famille de transporteurs (Yamada et Nakano, 2012). Dans les
glioblastomes, la résistance au témozolomide est associée à l’expression du gène MDR1
(multidrug resistance 1) codant la protéine P-gp. De plus, similairement au statut MGMT, la
survie des patients traités avec le témozolomide est directement corrélée à l’expression d’un
variant génétique de ce gène (Schaich et coll., 2009). La protéine MRP1 serait, quant à elle,
liée à la chimiorésistance dans les traitements à l’étoposide (Celltop® ; un inhibiteur des
topoisomérases II) et à base de vincristine (Vincrisin®) dans les gliomes de haut grade
(Benyahia et coll., 2004). De même, la distribution dans le cerveau des inhibiteurs du
récepteur EGFR, tels que l’erlotinib (Tarceva®) et le géfitinib (Iressa®), est limitée par les
protéines P-gp et BCRP (Agarwal et coll., 2010 ; de Vries et coll., 2010). Cette protéine
BCRP, codée par le gène ABCG2 (ABC sub-family G member 2), ainsi que la protéine
MRP1, codée par le gène ABCC1 (ABC sub-family C member 1), seraient également
impliquées dans la chimiorésistance des cellules CSCs (Hirschmann et coll., 2004 ; Caldera et
coll., 2012 ; Yamada et Nakano, 2012).
7.3 L’hypoxie.
Comme décrit précédemment, les glioblastomes sont caractérisés par de larges zones
d’hypoxie (Haar et coll., 2012). Les facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF) sont des
médiateurs clés de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie. Ils jouent un rôle crucial dans la
progression des gliomes, le métabolisme, l’angiogenèse, la résistance à la radio- et
chimiothérapie et le maintien du phénotype des cellules souches cancéreuses (CSCs) (Yang et
coll., 2012). Par conséquent, l’hypoxie tumorale est un élément clé qui explique la faible
réponse aux traitements actuels ainsi que le mauvais pronostic associés à ce type de tumeur
(Yang et coll., 2012).
HIF-1 est un hétérodimère constitué de 2 sous-unités : HIF-1α et HIF-1β. Tandis qu’HIF1β est exprimé de manière constante dans les cellules, la sous-unité HIF-1α est rapidement
dégradée par le protéasome en normoxie. Cependant, en condition hypoxique, HIF-1α n’est
plus réprimée : le dimère HIF-1 peut ainsi se former et se lier à l’ADN des gènes cibles
(Adams et coll., 2009).
En hypoxie, l’expression d’HIF-1α entraine la transcription de gènes conduisant les cellules
gliales tumorales à privilégier la glycolyse (effet Warburg) (Figure 12) (Semenza, 2008).
21
Figure 13 : La niche vasculaire et la niche hypoxique des cellules souches de gliome. Les
niches vasculaires sont importantes dans la croissance des gliomes, probablement grâce aux
facteurs sécrétés par les cellules endothéliales (EC) présentes dans la niche ainsi qu’à l’apport
en nutriments provenant des vaisseaux sanguins. D’autre part, les cellules souches de gliome
(GSCs) maintiennent probablement leur caractère de cellules souches par l’activation de voies
de signalisation liées à l’hypoxie. Les cellules GSCs peuvent également recruter les cellules
endothéliales en sécrétant des facteurs angiogéniques ou en se différenciant directement en
cellules de la lignée endothéliale, qui à son tour supporte la croissance des gliomes (d’après
Chen et al., 2012b).
Figure 14 : IRM (imagerie par résonnance magnétique) d’un patient atteint d’un
glioblastome. Malgré la résection chirurgicale de la tumeur suivie de chimiothérapie
concomitante à la radiothérapie, le patient montre une récidive tumorale adjacente au premier
foyer (d’après Nakada et coll., 2007).
Cette voie métabolique favorise la synthèse d’ATP (adénosine triphosphate) par la
transformation du glucose en pyruvate au détriment de la phosphorylation oxydative
consommatrice en oxygène. Malgré le faible rendement énergétique associé à la glycolyse (2
moles d’ATP/mole de glucose), cette voie permet de résister à un microenvironnement
tumoral faiblement vascularisé (Figure 12) (DeBerardinis et coll., 2007 ; Semenza, 2008). De
plus, l’acidification de la matrice suite au relargage du lactate et des ions H+, issus de la
conversion du pyruvate, va créer un environnement hostile pour le tissu sain facilitant
l’expansion tumorale (Mathupala et coll., 2010). Ce changement métabolique confère aux
cellules de glioblastome un avantage au niveau de la résistance aux agents
chimiothérapeutiques (Egler et coll., 2008 ; Oliva et coll., 2011). En effet, les cellules
cancéreuses en condition normoxique favorisent la phosphorylation oxydative, produisant des
niveaux élevés de ROS impliqués dans le stress oxydatif intrinsèque. Elles sont par
conséquent plus vulnérables aux agents chimiothérapeutiques générant des ROS exogènes
comme le témozolomide (Oliva et coll., 2011).
Malgré qu’HIF-1α puisse favoriser l’angiogenèse via la surexpression du facteur VEGF, le
système vasculaire provenant d’une prolifération trop rapide, est souvent tortueux et mal
organisé, ce qui diminue l’exposition des cellules gliales tumorales aux agents chimiothérapeutiques (Bar, 2011 ; Haar et coll., 2012). L’activation de la voie de signalisation des
récepteurs RTKs, diminuant l’activité de la protéine pro-apoptotique Bad (Bcl-2 antagonist of
cell death) ainsi que l’activation des protéines P-gp, en condition hypoxique, contribuent
également à la chimiorésistance des glioblastomes (Comerford et coll., 2002 ; Merighi et coll.,
2007).
Les cellules souches de glioblastome (CSGs) résident dans des niches vasculaires afin de
s’approvisionner en oxygène et nutriments et dans les régions d’hypoxie, afin de maintenir
leur phénotype de cellules CSCs (Figure 13) (Bar, 2011 ; Chen et coll., 2012b ; Yang et coll.,
2012). HIF-1α entraine l’activation de facteurs de transcription tels que Notch et Oct4
contrôlant la capacité d’auto-renouvelement et de multipotence de ces cellules (Yang et coll.,
2012). Les cellules CSGs, en surexprimant l’enzyme MGMT et les transporteurs ABC, sont
résistantes aux agents chimiothérapeutiques (Caldera et coll., 2012). De plus, les cellules
CSGs possèdent la capacité de réduire les lésions de l’ADN induites par les radiations (Bao et
coll., 2006 ; Pisollato et coll., 2010 ; Haar et coll., 2012).
22
Figure 15 : Dans la voie extrinsèque, l’activation des récepteurs de mort (DR, death receptor)
(p.ex. TRAILR (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor), TRAMP (TNF-receptorrelated apoptosis-mediated protein), TNFR (tumor necrosis factor receptor 1), FAS, CD95 par
leurs ligands respectifs va entrainer leur trimérisation et le recrutement de la protéine FADD
(Fas-associated protein with death domain). Ensuite, le domaine effecteur de mort de FADD
permet d’attirer les caspases initiatrices 8 et 10 afin de former le complexe DISC (death
inducing signal complex) dans lequel les caspases initiatrices sont activées par protéolyse. Les
caspases 8 et 10 activées vont ensuite cliver la caspase effectrice 3 qui va à son tour entrainer
l’activation des CADs (caspases activated DNase) conduisant à la fragmentation
internucléosomale de l’ADN. La voie intrinsèque est, quant à elle, sollicitée en réponse à la
privation de facteurs de croissance ou en réponse à un stress cellulaire (lésions de l’ADN
pouvant être induites par radio- et chimiothérapie, hypoxie, privation de nutriments, troubles
ioniques) et est contrôlée par des protéines de la famille de Bcl-2. La protéine p53 activée
favorise l’apoptose en induisant l’expression de gènes pro-apoptotiques tels que PUMA (p53
upregulated modulator of apoptosis) et NOXA (en latin, lésion). L’activation des protéines
BAX (Bcl-2–associated X) et BAK (Bcl-2 homologous antagonist/killer) conduit ensuite à la
perméabilisation des membranes mitochondriales, libérant la protéine Smac/DIABLO (second
mitochondria-derived activator of caspases) / (direct IAP-binding protein with low pI) et le
cytochrome C. Celui-ci se retrouve dans le cytoplasme où il est complexé avec Apaf1(apoptotic peptidase activating factor 1). Après le recrutement de la pro-caspase 9, on aboutit
à la formation de l’apoptosome. L’activation subséquente de la caspase 9 conduit au clivage
des caspases effectrices 3, 6 et 7. Smac/DIABLO favorise l’apoptose en bloquant l’activité
des IAPs (inhibitors of apoptosis proteins). Il existe une communication entre les deux voies
grâce à une protéine de la famille Bcl-2: BID. En effet, la voie extrinsèque peut activer la voie
intrinsèque grâce à BID qui, clivée, va à la mitochondrie et amplifie le signal (d’après Kang et
coll., 2012).
7.4 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose.
L’invasion des cellules tumorales dans le parenchyme cérébral explique aussi l’échec
thérapeutique actuel. Plus de 90 % des patients atteints de glioblastome développent une
tumeur récurrente après chirurgie et traitements radio- et chimiothérapeutiques, en général à
quelques centimètres du site d’origine (Figure 14) (Furnari et coll., 2007 ; Nakada et coll.,
2007).
Afin de privilégier la migration, les cellules tumorales gliales invasives voient diminuer
leur capacité à proliférer (Giese et coll., 2003). De plus, ces cellules sont résistantes à
l’apoptose afin de se protéger contre l’anoïkose (forme spécifique d’apoptose due à un défaut
d’interaction entre la cellule et la matrice extracellulaire) pouvant survenir lors de la migration
cellulaire (Taddei et coll., 2012). Or, la plupart des agents anticancéreux utilisés actuellement
pour combattre les glioblastomes sont des agents pro-apoptotiques (Giese et coll., 2003 ;
Furnari et coll., 2007 ; Belden et coll., 2011). Plusieurs mécanismes moléculaires confèrent
aux cellules tumorales gliales migrantes cette résistance à l’apoptose (Krakstad et Chekenya,
2010).
L’apoptose peut être déclenchée par deux voies de signalisation, la voie extrinsèque ou «
des récepteurs de mort » et intrinsèque dite « mitochondriale » (Figure 15). Tout d’abord,
trois changements moléculaires majeurs, intervenant dans ces deux voies, augmentent le
phénotype anti-apoptotique des glioblastomes:
(a) la diminution de l’efficacité des facteurs extracellulaires de l’apoptose. Par exemple, la
protéine DcR3 (decoy receptor 3), dont l’expression est augmentée dans les gliomes de haut
grade, est capable de se lier et d’inactiver le ligand de mort CD95L (Roth et coll., 2001 ;
Furnari et coll., 2007),
(b) la diminution de l’activité des récepteurs de mort (Aggarwal, 2003 ; Furnari et coll.,
2007), et
(c) la diminution de l’activité des protéines pro-apoptotiques (Bax, caspases, p53) ainsi que la
surexpression des protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) et Bcl-XL
(B-cell lymphoma-extra large) (Giese et coll., 2003 ; Krakstad et Chekenya, 2010 ; Belden et
coll., 2011 ; Squatrito et Holland, 2011, Kang et coll., 2013).
23
Ensuite, la sur-activation de la voie de signalisation de PI3K en aval des intégrines et des
récepteurs RTKs, peut également être impliquée dans la résistance à l’apoptose des cellules
gliales tumorales. PI3K en activant Akt, va entrainer l’inhibition de la cascade apoptotique
engendrée par BAD ainsi que l’activation de NFƘB (nuclear factor-kappa B), responsable de
l’augmentation des protéines inhibitrices de l’apoptose (IAPs) (Belden et coll., 2011 ; Cartier
et coll., 2012). Celles-ci, en conduisant à l’inhibition du clivage de la pro-caspase 3, protègent
les cellules de l’apoptose. De plus, la mutation du gène PTEN favorise l’activation d’Akt, un
inhibiteur de la protéine pro-apoptotique BAD (Belden et coll., 2011 ; Cartier et coll., 2012 ;
Kang et coll., 2013).
24
II. La paraptose : une mort cellulaire non-apoptotique.
L’induction d’une mort cellulaire non-apoptotique représente une alternative thérapeutique
dans le traitement des glioblastomes afin de court-circuiter leur résistance intrinsèque à
l’apoptose. Nous nous sommes principalement intéressés, dans le cadre de ce travail, à la
paraptose récemment mise en évidence par Sperandio et ses collaborateurs (Sperandio et coll.,
2000). Nous décrirons dans un premier temps les principaux types de mort cellulaire ainsi que
leurs caractéristiques biochimiques et morphologiques avant de détailler les spécificités de la
paraptose au niveau de ces divers types de mort cellulaire.
1. Les principaux types de mort cellulaire.
1.1 L’apoptose.
L’apoptose, également appelée « mort cellulaire programmée de type I », est le processus
physiologique par lequel l’organisme élimine les cellules non désirées, endommagées ou
infectées. Elle joue un rôle crucial dans le développement des organismes pluricellulaires et le
maintien de l’homéostasie cellulaire (Kerr et coll., 1972 ; Rudel et coll., 2010). Le nom
apoptose fait référence à la chute des feuilles à l’automne : apo pour « éloignement » et ptôsis
pour « chute ». Ce processus de mort cellulaire est activé par de nombreux stimuli
physiologiques ou pathologiques, comprenant par exemple : l’activation des récepteurs de
mort, une carence en facteurs trophiques, une infection virale, un stress oxydatif ou encore des
agents génotoxiques (Rudel et coll., 2010 ; Kang et coll., 2012). En fonction des signaux proapoptotiques, deux voies sont susceptibles d’engendrer cette mort cellulaire : la voie des
récepteurs de mort ou la voie mitochondriale (Figure 15). Malgré que ces voies de
signalisation soient différentes, elles aboutissent toutes deux à l’activation des protéines à
cystéine appelées caspases (Rudel et coll., 2010 ; Kang et coll., 2012). Celles-ci vont ensuite
activer l’endonucléase CAD (caspase activated DNAse), une enzyme capable de cliver l’ADN
entre les nucléosomes, engendrant des fragments d’environ 200 paires de base (pB) ou
multiples de cette longueur (Saraste et Pulkki, 2000). La protéine PARP-1 (poly (ADP-ribose)
polymerase 1) est une enzyme nucléaire de 113kD impliquée dans la réparation de l’ADN. Au
cours du processus d’apoptose, PARP est clivée par les caspases effectrices 3 et 7 en
fragments de 89kD et 24kD (D’Amours et coll., 2001). L’externalisation de la
phosphatidylsérine, un phospholipide anionique initialement situé sur le feuillet interne de la
25
Figure 16 : Changements morphologiques apparaissant au cours du processus d’apoptose.
Tout d’abord, la cellule rétrécit, la chromatine se condense et la membrane plasmique
bourgeonne. Il y a ensuite formation de corps apoptotiques qui vont être phagocytés (modifié
d’après Gewies, 2003).
membrane plasmique, est également observée lors de ce processus de mort cellulaire (Fadok
et coll., 2001).
Lorsqu’une cellule entre en apoptose, les premières manifestations morphologiques
observables sont la condensation de la chromatine et du cytoplasme ainsi que la déformation
de la membrane plasmique aboutissant à la fragmentation de la cellule et de son ADN (Figure
16) (Saraste et Pulkki, 2000 ; Rodriguez-Rocha et coll., 2011). S’ensuit la formation de
vésicules membranaires contenant le cytoplasme, les organites et la chromatine condensée,
appelées corps apoptotiques. Ces derniers sont rapidement phagocytés par les macrophages ou
les cellules voisines, sans aucune réaction inflammatoire (Saraste et Pulkki, 2000 ; Rudel et
coll., 2010 ; Rodriguez-Rocha et coll., 2011).
1.2 L’autophagie.
L’autophagie (d’autos pour « soi-même » et de fagos pour « manger ») permet l’équilibre
entre la synthèse et la dégradation des constituants cellulaires (Codogno, 2004 ; Kreuzaler et
Watson, 2012). Elle peut également représenter un mécanisme de défense et de survie lorsque
la cellule est en condition de stress (carence en facteurs de croissance, hypoxie,…) ou est
exposée à des agents toxiques, notamment par le recyclage des acides aminés et l’élimination
des macromolécules et des structures cellulaires altérées (Codogno, 2004 ; Kondo et coll.,
2005 ; Kreuzaler et Watson, 2012).
Suite à l’induction de l’autophagie, de nombreuses protéines Atg (autophagy-related gene)
incluant bécline-1 et LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) sont recrutées
(Kreuzaler et Watson, 2012). Ces protéines participent à la formation des vésicules
cytosoliques à double membranes, appelées autophagosomes, dans lesquelles peuvent être
séquestrés des organites cellulaires (mitochondries, réticulum endoplasmique…), des
protéines agrégées et des agents pathogènes (Kondo et coll., 2005 ; Rodriguez-Rocha et coll.,
2011). Ces vésicules vont fusionner avec des lysosomes pour former des autolysosomes. Les
hydrolases lysosomales vont dégrader le matériel séquestré afin de générer des acides aminés
qui pourront être recyclés, fournissant ainsi l’énergie nécessaire à la survie de la cellule. Les
enzymes lysosomales, actives à pH acide, peuvent également éliminer les protéines et les
organelles endommagées pouvant être toxiques pour la cellule (Figure 17) (Rodriguez-Rocha
et coll., 2011 ; Jing et Lim, 2012). La voie de signalisation de PI3K/Akt, par l’intermédiaire
26
Figure 17 : L’autophagie peut être induite par divers stimuli, incluant des dommages à
l’ADN. L’autophagie implique la séquestration de protéines cytosoliques et d’organelles dans
une structure à double membranes appelée autophagosome, qui va ensuite être dégradé par les
hydrolases lysosomales. Dans certaines conditions, l’autophagie peut induire la mort des
cellules qui sont endommagées (d’après Rodriguez-Rocha et coll., 2011).
de mTOR (mammalian target of rapamycin), régule l’induction de l’autophagie (Kreuzaler et
Watson, 2012).
Si le processus autophagique perdure dans le temps, il peut conduire à la mort des cellules,
dénommée « mort cellulaire programmée de type II » (Galluzzi et coll., 2011 et 2012 ;
Kreuzaler et Watson, 2012). La mort cellulaire par autophagie peut aussi être enclenchée en
réponse à des agents chimiothérapeutiques lorsque la voie apoptotique est inhibée (Galluzzi et
coll., 2012 ; Kreuzaler et Watson, 2012). L’induction prolongée d’autophagie, dans les
cellules de glioblastome traitées avec le témozolomide, conduit à la mort de ces cellules par
apoptose tardive (Kanzawa et coll., 2004 ; Roos et coll., 2007 ; Palumbo et coll., 2012). Sur le
plan morphologique, cette mort cellulaire est caractérisée par la présence de nombreuses
vacuoles autophagiques et l’absence de condensation de la chromatine (Rodriguez-Rocha et
coll., 2011 ; Galluzzi et coll., 2012).
1.3 La nécrose.
Le terme nécrose (de nekros pour « cadavre ») a longtemps été utilisé par défaut pour
définir une mort cellulaire, survenant de façon accidentelle, qui ne présente pas les
caractéristiques morphologiques de l’apoptose et de l’autophagie (Edinger et Thompson,
2004 ; Galluzzi et coll., 2011). Récemment, la nécrose a été classée dans les morts cellulaires
programmées. Lorsque la voie de signalisation de l’apoptose est inhibée, cette mort cellulaire
peut être enclenchée (Galluzzi et coll., 2012). Les processus biochimiques menant à
l’exécution de la nécrose programmée décrits dans la littérature sont nombreux et
comprennent, entre autres :
(a) l’activation des protéines kinases RIPK1 (receptor-interacting protein kinase 1) et RIPK3
(receptor-interacting protein kinase 3), notamment lorsque la nécrose est initiée par la liaison
du facteur TNF (tumor necrosis factor) à son récepteur (Rudel et coll., 2010 ; Galluzzi et
coll., 2011 ; Han et coll., 2011) ;
(b) la production excessive de ROS par les mitochondries (Rudel et coll., 2010 ; Galluzzi et
coll., 2011) ;
(c) l’hyper-activation de PARP-1 suite à des lésions au niveau de l’ADN, diminuant les
stocks de NAD+ dans le cytosol, et par conséquent la production d’ATP dans les cellules
27
Figure 18 : Changements morphologiques apparaissant au cours du processus de nécrose.
Tout d’abord, la cellule gonfle et devient perméable On peut ensuite voir le bourgeonnement
et la dislocation de la membrane plasmique qui entraine la libération du contenu cellulaire
dans le milieu environnant, induisant de l’inflammation (modifié d’après Gewies, 2003).
Figure 19 : La sénescence est contrôlée par les
voies p53 et p16/pRB. La plupart des stimuli
induisant la sénescence tels que les lésions de
l’ADN ou les facteurs de stress déclenchent
une de ces deux voies de signalisation.
Certains signaux, comme les oncogènes RAS,
active les deux voies. La protéine p53 est
régulée négativement par la protéine HDM2
(human double minute 2), elle-même inhibée
par ARF (alternate-reading-frame protein). La
protéine p53 active établit l’arrêt de la
croissance,
notamment
en
induisant
l’expression de p21, un inhibteur de CDK
(cyclin-dependent kinase), qui peut supprimer
la phosphorylation et donc l’inactivation de la
protéine pRB. Les signaux qui activent la voie
de p16/pRB le font généralement en induisant
l’expression de p16, un autre inhibiteur de
CDK, qui empêche de nouveau la
phosphorylation et l’inactivation de pRB. La
protéine pRB arrête la prolifération cellulaire
en supprimant l’activité d’E2F, un facteur de
transcription qui stimule l’expression de gènes
requis pour la progression du cycle cellulaire
(d’après Campisi et d’Adda di Fagagna, 2007).
glycolytiques (Rudel et coll., 2010 ; Galluzzi et coll., 2011 ; Speirs et coll., 2011).
Les premiers changements morphologiques observés au cours de la nécrose programmée
s’apparentent à ceux de la nécrose : vacuolisation du cytoplasme, dilation des organelles,
augmentation du volume cellulaire et déformation de la membrane cellulaire. Ces évènements
entraineront la perte de l’intégrité membranaire qui sera caractérisée par la libération du
contenu cellulaire dans le milieu environnant. La réaction inflammatoire locale qui en résulte
permet la dégradation et l’élimination des cellules nécrosées (Figure 18) (Edinger et
Thompson, 2004 ; Rodriguez-Rocha et coll., 2011).
1.4 La sénescence.
La sénescence (de senescere pour « vieillir ») est un état d’arrêt irréversible de la
croissance cellulaire qui peut conduire in fine à la mort des cellules (Unterluggauer et coll.,
2003 ; Eom et coll., 2005 ; Diener et coll., 2010 ; Acosta et Gil, 2012). L’expression de
l’oncogène Ras, les radiations, les agents altérant l’ADN, le stress oxydatif ainsi que certains
médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire de la sénescence (Acosta et Gil, 2012). En
fonction des stimuli qui la déclenchent, elle peut être réplicative ou accélérée. La sénescence
réplicative est définie comme un processus physiologique induit par le raccourcissement des
télomères suite à une accumulation de divisions cellulaires (Hayflick, 1965). Dans les cellules
cancéreuses, la surexpression de l’enzyme télomèrase permet de maintenir la longueur des
télomères (Kim et coll., 1994). Le terme de sénescence accélérée a été attribué aux cellules en
arrêt de la croissance cellulaire, ayant subi un stress oxydatif, des lésions de leur ADN ou
après un traitement par des agents chimiothérapeutiques tels que la doxorubicine, la
camptothécine, la vincristine, le cisplatine ou le paclitaxel (Chang et coll., 1999 ; Serrano et
Blasco, 2001 ; Shay et Roninson, 2004 ; Collado et Serrano, 2006 ; Varna et Artenie, 2007).
La sénescence accélérée est indiscernable de la sénescence réplicative car des lésions de
l’ADN peuvent également induire un raccourcissement des télomères suite à des divisions
trop rapides (Roninson et Dokmanovic, 2003). Les voies de signalisation de p53 et de
p16/pRB contrôlent la sénescence (Figure 19) (Campisi et d’Adda di Fagagna, 2007).
Les cellules sénescentes sont caractérisées morphologiquement par l’aplatissement du
cytoplasme, l’apparition de nombreuses vacuoles cytoplasmiques et l’augmentation de la
masse lysosomique (Schmitt, 2007). D’un point de vue biochimique et moléculaire, on peut
28
Figure 20 : Voies de signalisation impliquées dans l’autophagie et la paraptose. L’autophagie
serait déclenchée par Ras, ce qui conduirait directement ou indirectement à la formation du
lysophagosome et des vacuoles autophagiques. Par contre, la paraptose, caractérisée par de
larges vacuoles cytoplasmiques, serait liée à l’activation d’IGFR1 (insulin-like growth factor 1
receptor), de NK1R (neurokinin 1 receptor) ou d’EGFR. La participation d’Alix et de la voie
de signalisation MAPK seraient également impliquées dans cette mort cellulaire programmée,
cependant ces dernières seraient spécifiques à certains types cellulaires (d’après Krantic et
coll., 2007)
observer la surexpression des protéines p53, p21 et p16 qui exercent un effet inhibiteur sur le
cycle cellulaire ainsi que l’augmentation de l’activité de la SA-β-Gal (senescence-associated
beta-galactosidase) qui reflète l’augmentation de la biogenèse des lysosomes observée dans
les cellules sénescentes (Campisi et d’Adda di Fagagna, 2007 ; Schmitt, 2007). La bêtagalactosidase est une hydrolase localisée dans les lysosomes qui permet le clivage des résidus
beta-galactosides en beta-D-galactose. Les cellules sénescentes, à pH acide, vont donner une
coloration bleue après incubation avec le substrat X-Gal (Dimri et coll., 1995).
2. La paraptose.
Le terme paraptose (de para pour « à côté de » et d’apoptôsis) a récemment été introduit
par Sperandio et ses collaborateurs pour désigner une nouvelle mort cellulaire programmée
(Sperandio et coll., 2000). Dans la littérature, il est décrit que ce processus de mort cellulaire
peut être induit en réponse à :
(1) l’expression du domaine intracytoplasmique d’IGF1R (insulin-like growth factor 1
receptor) dans les cellules embryonnaires de rein humain 293T (Figure 20). L’activation de
la voie de MAPK (mitogen-activated protein kinase) et de JNK (c-Jun N-terminal kinase)
peut être observée lorsque la paraptose est induite par ce récepteur (Sperandio et coll., 2000,
2004 et 2010) ;
(2) la liaison de la substance P à son récepteur NK1R (neurokinin-1 receptor) dans les
neurones de l’hippocampe, du striatum et du cortex (Castro-Obregon et coll., 2002) ;
(3) l’expression de TAJ/TROY, un récepteur de la famille du TNF, dans les cellules de rein
embryonnaire humain 293T (Wang et coll., 2004) ;
(4) l’inhibition de l’échangeur Na+/H+ dans les neurones granulaires cérébelleux (Schneider et
coll., 2004) ;
(5) à l’expression d’EGF (epidermal growth factor) dans la lignée hypophysaire GH4C1
(Fombonne et coll., 2006).
29
Table 4 : Comparaison d’éléments permettant de distinguer l’apoptose de la nécrose et de la
paraptose (d’après Sperandio et coll., 2000).
La protéine Alix (ALG-2-interacting protein X) a été identifiée comme le premier
inhibiteur endogène de la paraptose (Sperandio et coll., 2004). Bien que la fonction de cette
protéine soit encore mal définie, il a été proposé que son interaction avec la protéine ALG-2
(apoptosis linked gene 2) puisse induire de l’apoptose tout en inhibant la paraptose. BRO1,
l’homologue de la protéine Alix chez la levure, intervient dans la voie de signalisation de
MAPK et dans la réponse au stress cellulaire, montrant l’implication potentielle de cette voie
dans la régulation de la paraptose. En revanche, l’expression de la protéine ne présentant pas
la partie N-terminale, appelée Alix CT, pourrait être impliquée dans l’induction de la
paraptose, notamment par son interaction avec les endophilines (Figure 20) (ChatellardCausse et coll., 2002 ; Sperandio et coll., 2004).
D’un point de vue morphologique, la paraptose est caractérisée par la dilatation des
mitochondries et la formation de vacuoles cytoplasmiques (Table 4) (Sperandio et coll.,
2000). À l’inverse du processus d’autophagie, ces vacuoles ne contiennent pas de composants
cytosoliques (Krantic et coll., 2007). La condensation de la chromatine, la fragmentation de
l’ADN et la formation de corps apoptotiques, contrairement à l’apoptose, ne sont pas observés
dans cette mort cellulaire (Sperandio et coll., 2000). Lorsque la synthèse des protéines est
inhibée, le nombre de cellules en paraptose est souvent diminué (Sperandio et coll., 2000 ;
Sun et coll., 2010). Ce processus de mort cellulaire ne nécessite pas l’activation des caspases
ou le clivage de la protéine PARP et est maintenu malgré la présence d’inhibiteurs de
l’apoptose ou de l’autophagie (Table 4) (Sperandio et coll., 2000 et 2010 ; Krantic et coll.,
2007). L’augmentation de l’activité de la SA-β-Gal n’a pas été observée dans les cellules en
paraptose, lui permettant de se distinguer de la sénescence (Wang et Chen, 2012).
Dernièrement, Hoa et ses collaborateurs ont mis en évidence l’implication du canal BKCa
(large conductance calcium-activated potassium channel) dans la modification de la
morphologie et la formation des vacuoles cytoplasmiques observées dans les cellules en
paraptose (Hoa et coll., 2007). Lorsque les canaux BKCa sont activés, ils entrainent un efflux
d’ions potassium (K+) hors de la cellule et des organites comme les mitochondries et le
réticulum endoplasmique. Afin de maintenir l’électroneutralité, des ions sodium (Na+) entrent
dans les différents compartiments. Ces mouvements ioniques s’accompagnent d’une entrée
d’eau, entrainant la dilatation des cellules et la formation de vacuoles cytoplasmiques dérivées
des organelles. Les mécanismes cellulaires homéostatiques devraient expulser les ions Na+
intracellulaires trop abondants par l’échangeur Na+/H+-ATP dépendant. Cependant, dans la
30
Figure 21 : Mécanisme proposé par lequel les monocytes induiraient la mort dans les cellules
de gliome U251 exprimant mM-CSF (membrane macrophage colony-stimulating factor). (a)
Temps avant que les monocytes ne soient en contact avec les cellules exprimant mM-CSF. La
cellule cible présente un taux de potassium intracellulaire élevé (K+) et un faible taux de
sodium (Na+) ; les canaux BK et les échangeurs Na+/H+ sont fermés. (b) La liaison des
monocytes via le récepteur M-CSF avec les facteurs mM-CSF (membrane macrophage
colony-stimulating factor) exprimés au niveau de la membrane des cellules de gliome,
entrainerait la production de ROS. En présence d’O2 et de la NADPH cytochrome P450
réductase (450red), l’hémoxygénase (HO) catalyserait la dégradation de l’hème produisant du
monoxyde de carbone (CO). Ce CO, en ouvrant les canaux BK, va entrainer l’expulsion des
ions K+ intracellulaires. Afin de maintenir l’électroneutralité, des ions Na+ vont entrer ainsi
que de l’eau qui va induire le gonflement et la vacuolisation de la cellule. L’échangeur Na+/H+
ouvert utilise l’ATP afin d’expulser les ions Na+ indésirables. Cependant, comme les
mitochondries sont ciblées dans la paraptose, elles ne peuvent plus produire l’énergie
nécessaire au bon fonctionnement de cet échangeur, ce qui va entrainer la lyse osmotique de
la cellule (d’après Hoa et coll., 2007).
paraptose, les mitochondries sont ciblées et ne pourraient donc plus produire l’énergie
nécessaire au bon fonctionnement de cet échangeur, conduisant à la rupture osmotique de la
cellule (Figure 21) (Hoa et coll., 2007 et 2009).
31
Figure 22 : Origines des médicaments anticancéreux approuvés et découverts de 1981 à
2010 ; B=origine biologique, N=origine naturelle, NB=origine naturelle botanique,
ND=dérivés hémisynthétiques d’origine naturelle, S=origine synthétique, S/NM=origine
synthétique (mimant composé naturel), S*=origine synthétique avec pharmacophore naturel,
S*/NM= origine synthétique avec pharmacophore naturel (mimant composé naturel),
V=vaccin (d’après Newman et Cragg, 2012).
III. Les terpénoïdes.
1. Généralités.
Les produits naturels sont largement explorés dans la recherche de nouveaux médicaments.
Cela est particulièrement évident dans le domaine des traitements contre le cancer où plus de
50 % des médicaments, découverts au cours de ces deux dernières décennies, sont d’origine
naturelle (Figure 22) (Newman et Cragg, 2012). La vincristine, l’irinotécan, l’étoposide ou
encore le paclitaxel ont une place incontestable de nos jours en chimiothérapie anticancéreuse
(Huang et coll., 2012).
Les terpénoïdes représentent une classe de molécules naturelles extrêmement abondante,
avec plus de 25 000 composés répertoriés (Gershenzon et Dudareva, 2007). En fonction du
nombre d’unités isopréniques présentes dans la structure, les terpénoïdes peuvent être classés
en hémiterpénoïdes (C5), monoterpénoïdes (C10), sesquiterpénoïdes (C15), diterpénoïdes (C20),
sesterterpénoïdes (C25), triterpénoïdes (C30), tétraterpénoïdes (C40) et polyterpénoïdes (C5n)
(Huang et coll., 2012).
Le paclitaxel est le terpénoïde naturel le plus connu dans le domaine de l’oncologie. Ce
composé a été identifié par le National Cancer Institute (NCI, Bethesda, USA) en 1962 dans
le cadre d’une campagne de criblage de molécules cytotoxiques à partir de produits naturels.
Il a été isolé à partir de l’écorce de Taxus brevifolia (if du Pacifique) (Zubrod et coll., 1966 ;
Wani et coll., 1971 ; Patel, 1998). De par son mécanisme d’action original, le paclitaxel
définit une nouvelle classe d’agents thérapeutiques, les taxanes, qui présentent un squelette
diterpénique.
Plus
précisément,
en
se
liant
à
la
β-tubuline,
il
stabilise
les
microtubules, inhibant leur dépolymérisation. La formation incorrecte du fuseau mitotique va
entrainer l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M et la mort des cellules (Jordan et coll.,
1996 ; Patel, 1998 ; Kavallaris, 2010). Le mécanisme par lequel le paclitaxel induit la mort
des cellules est dépendant de sa concentration. À de faibles concentrations (de l’ordre du nM),
le paclitaxel induit de la sénescence suivie d’apoptose tandis qu’à de fortes concentrations
(>30µM), il induit de la paraptose (Torres et Horwitz, 1998 ; Chen et coll., 2008). Connu sous
le nom de Taxol®, il est utilisé dans le traitement de nombreux cancers tels que le cancer du
poumon, du sein, de l’ovaire ainsi que le sarcome de Kaposi (Yared et Tkaczuk, 2012).
32
A
B
Figure 23 : A.Hémisynthèse du Taxol® par l’équipe de Pierre Potier (Gif-sur-Yvette, France).
La 10-déacetylbaccatine III (10-DAB) est sélectivement protégée en 7-triethylsilyl(TES)baccatine III. Elle est ensuite couplée à la chaine latérale au moyen de di-2-pyridyl carbonate
(DPC) et de 4-diméthylaminopyridine (DMAP). Une hydrolyse permet par la suite d’obtenir
le Taxol® (d’après Aouzal, 2010). B. Structure du docétaxel (Taxotère®).
À l’origine, le paclitaxel était extrait de Taxus brevifolia avec un rendement très faible :
0,01% du poids sec de l’écorce. De plus, la récolte de cette écorce nécessitait l’abattage de
nombreux arbres, limitant son exploitation (Wani et coll., 1971 ; Patel, 1998). Le
développement de nouvelles techniques de production a fait l'objet de divers projets de
recherche. Au milieu des années 80, Potier et ses collaborateurs publièrent la première
hémisynthèse du Taxol®. Ils découvrirent que l’on pouvait extraire des aiguilles de Taxus
baccata (if européen) un précurseur de cette molécule, la 10-déacetylbaccatine III (10-DAB),
permettant la synthèse en peu d’étapes et en grandes quantités du Taxol® (Figure 23A)
(Guéritte-Voegelein et coll., 1986 ; Denis et coll., 1988). Cette équipe de recherche a
également synthétisé à partir de la 10-DAB, le docétaxel (Taxotère®), un composé qui s’est
révélé plus actif que le paclitaxel (Figure 23B) (Guéritte-Voegelein et coll., 1994).
Parallèlement, Holton et Nicolaou publièrent les premières synthèses totales du paclitaxel,
nécessitant de nombreuses étapes et ayant des rendements très faibles (Holton et coll., 1994 ;
Nicolaou et coll., 1994). À l’heure actuelle, la production industrielle du paclitaxel se fait
principalement par culture de cellules végétales en utilisant des lignées cellulaires dérivées
d’espèces de Taxus (Zhong, 2002 ; Kolowe et coll., 2008 ; Chandra, 2012).
Récemment, Zhou et ses collaborateurs ont démontré que la fermentation de champignons
pouvait être une méthode alternative de production du Taxol® (Chandra, 2012 ; Zhou et coll.,
2010). Taxomyces andreanae est le premier champignon capable de biosynthétiser le
paclitaxel qui a été isolé (Stierle et coll., 1993). D’autres agents anticancéreux tels que la
camptothécine et la vincristine peuvent également être produits par des champignons faisant
d’eux une source de nouveaux composés à visée thérapeutique (Shweta et coll., 2010 ;
Chandra, 2012).
2. Les terpénoïdes d’origine fongique étudiés dans ce travail.
2.1 La fusicoccine A.
2.1.1 Origine et propriétés connues à ce jour.
Il y a près de 50 ans, Graniti a découvert que le champignon Phomopsis amygdali
(anciennement connu sous le nom de Fusicoccum amygdali Del.) était responsable des
chancres et du flétrissement des rameaux des pêchers (Prunus persica) et des amandiers
(Prunus dulcis) en Italie (Graniti, 1962). Quelques années plus tard, le principal métabolite
33
Figure 24 : Voie de biosynthèse de la fusicoccine A dans les champignons (créé d’après
Toyomasu et coll., 2007 et de Boer et de Vries-van Leeuwen, 2012).
actif de l’extrait fongique a été identifié et fut appelé fusicoccine A (Ballio et coll., 1964 et
1968 ; Barrow et coll., 1968). Depuis, de nombreux analogues naturels de cette molécule ont
été découverts (Ballio et coll., 1970).
La fusicoccine A (C36H56O12) est un diterpénoïde tricyclique glycosylé. Sa voie de
biosynthèse a été mise en évidence suite à l’identification d’un diterpène synthase chimère de
Phomopsis amygdali appelé PaFS (P. amygdali fusicoccadiene synthase) (Muromstev et coll.,
1994 ; Toyomasu et coll., 2007). PaFS possède deux domaines fonctionnels : un domaine
terpène cyclase à l’extrémité N-terminale et un domaine GGDP (géranylgéranyl diphosphate)
synthase (GGS) à l’extrémité C-terminale. Le domaine GGS est responsable de la conversion
des unités isoprènes en GGDP, tandis que le domaine cyclase convertit ce GGDP en
précurseur de la molécule fusicoccine A, la fusicocca-2,10(14)diène. Ensuite, les étapes
d’oxydation et de glycosylation nécessaires à la formation de la fusicoccine A sont
dépendantes d’enzymes spécifiques (Figure 24) (de Boer et de Vries-van Leeuwen, 2012).
Dans les plantes, les protéines 14-3-3 peuvent se lier avec les pompes à protons (H+ATPases) entrainant leur activation. Les H+-ATPases activées vont générer un gradient
électrochimique de protons à travers la membrane plasmique, conduisant à l’activation des
transporteurs de nutriments et à la régulation de la turgescence des cellules végétales. La
fusicoccine A entraine l’activation continue de cette pompe à protons, en stabilisant d’un
facteur 100 sa liaison avec les protéines 14-3-3. La perte du contrôle de la turgescence qui en
résulte conduit à la sortie d’eau et au flétrissement des plantes infectées (Bowles, 1998;
Mackintosh, 2004; Ottmann et coll., 2007 et 2009). La fusicoccine A est largement étudiée
dans le domaine des cellules végétales et particulièrement en agriculture car en plus des effets
que nous venons de décrire, elle peut à faible concentration stimuler l’élongation cellulaire et
la germination des graines en acidifiant le milieu extérieur (« théorie de la croissance acide »)
(Mackintosh, 2004 ; de Boer et de Vries-van Leeuwen, 2012).
Actuellement, les effets de la fusicoccine A sur les cellules animales sont encore peu
connus. Bunney et ses collaborateurs ont montré que l’exposition d’embryons amphibiens à la
fusicoccine A, pendant les premières phases du développement, se traduisait par une
hétérotaxie, impliquant les protéines 14-3-3 (Bunney et coll., 2003 ; de Boer et de Vries-van
Leeuwen, 2012). Dans les adipocytes, la fusicoccine A inhibe la fusion des vésicules de
stockage avec la membrane plasmique. Les transporteurs GLUT4 (glucose transporter type 4)
34
Figure 25 : Structure de la focal adhesion kinase (FAK). La protéine FAK est constituée de
trois domaines, un domaine amino-terminal et un domaine carboxy-terminal délimitant un
domaine central supportant l’activité catalytique. Son autophosphorylation au niveau de la
tyrosine 397 (Y397) permet la liaison avec les protéines de la famille Src. Ces protéines
kinases activées vont entrainer la phosphorylation des autres résidus tyrosine de la kinase
FAK ainsi que des résidus des autres protéines liées à FAK. On retrouve dans la partie Nterminale, un domaine homologue avec les protéines du groupe bande 4,1/ERM (ezrine,
radixine, moésine) qui permet les interactions cytoplasmiques (intégrines, facteurs de
croissance). FAK est reliée à la paxilline par sa région FAT (focal adhesion targeting),
localisée dans la partie C-terminale, qui est nécessaire pour la liaison et dont l’intégrité est
indispensable pour l’activation de la paxilline. Sur cette figure, les principales protéines
interagissant avec FAK sont représentées ainsi que leur site de liaison : ASAP1: ARF (ADP
ribosylation factor)-GAP (GTPase-activating protein); Graf: GTPase regulator associated with
focal adhesion kinase; Grb2, Grb7: growth factor receptor-bound protein 2, 7; PI3K:
phosphatidylinositol 3-kinase; p85: sous-unité régulatrice de la PIP3K; PLCγ: phospholipase
C γ; p130Cas: protéine de 130 kDa associée à Crk (Crk-associated substrate); c- SRC:
tyrosine kinase src; bandes bleu foncé: sites riches en proline, permettant les liaisons avec des
domaines SH3; Y: résidus tyrosine permettant des liaisons avec des domaines SH2 (d’après
Cornillon et coll., 2003).
localisés dans ces vésicules ne peuvent plus participer au stockage du glucose (Koumanov et
coll., 2011). De plus, cette phytotoxine peut renforcer l’interaction du complexe glycoprotéine
Ib-IX-V avec les protéines 14-3-3, stimulant l’agrégation des plaquettes et l’adhésion du
facteur de von Willebrand, importante dans l’hémostase (Camoni, 2011).
L’article publié par de Vries-van Leeuwen et ses collaborateurs est pour le moment le seul
décrivant les effets anticancéreux de la fusicoccine A. Ce terpénoïde peut inhiber la
croissance de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines d’origine histologique
différente (poumon, prostate, colon et ovaire). Cet effet peut être potentialisé suite à un prétraitement avec l’interféron-α (IFN-α). Dans la lignée cancéreuse humaine d’ovaire OVCAR3
plus particulièrement, elle induit de l’apoptose par l’intermédiaire de TRAIL. Par contre, la
viabilité des cellules HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) n’est pas altérée par la
fusicoccine A aux mêmes concentrations que celles utilisées pour la lignée OVCAR3,
démontrant la biosélectivité potentielle de cette molécule (de Vries-van Leeuwen et coll.,
2010).
2.1.2 La kinase d’adhérence focale, FAK.
Comme nous le verrons dans le chapitre « Résultats », la fusicoccine A diminue
l’expression de la forme activée de la kinase d’adhérence focale (pFAK), faisant de cette
molécule un agent anticancéreux potentiel pour le traitement des glioblastomes comme nous
le détaillerons au cours de ce travail.
La kinase FAK est une protéine cytoplasmique de la famille des tyrosines kinases, jouant
un rôle crucial dans l’agressivité des cellules de glioblastome. Son activation par les
intégrines ou les facteurs de croissance comme IGF (insulin-like growth factor) se traduit par
l’autophosphorylation du résidu tyrosine 397 (Y397) libérant un site de fixation pour la
protéine Src (Figure 25). Cette liaison va entrainer l’activation des protéines du complexe
d’adhérence qui peuvent être impliquées dans la migration, la prolifération et la survie des
cellules tumorales (Cornillon et coll., 2003 ; Gabarra-Niecko et coll., 2005 ; McLean et coll.,
2005 ; Skuli et coll., 2009).
Plus précisément, FAK entraine l’activation de Graf (GTPase regulator associated with
focal adhesion kinase), de Grb7 (growth factor receptor-bound protein 7) et de PLCγ
(phospholipase C γ). Ces protéines, en régulant l’activité de Rho, vont contribuer au
35
Figure 26 : Les voies de signalisation de l’adhérence focale. Initialement, la kinase FAK est
activée par les intégrines et/ou des facteurs de croissance. Cette activation va entrainer la
liaison et l’activation de diverses protéines. (1) Graf, Grb7 et PLCγ participent au
remaniement du cytosquelette d’actine ainsi qu’à la restructuration et déstructuration des
complexes d’adhérence, nécessaires à la migration par la régulation de Rho. p130CAS, Grb2 et
PI3K vont dans un second temps activer en cascade plusieurs voies de signalisation
intracellulaires, la voie de ERK (2 et 3), la voie de JNK (4) et la voie de PI3K (5) qui régulent
la survie, la prolifération et la migration cellulaire en favorisant l’activation de facteurs de
transcription (d’après Cornillon et coll., 2003).
remaniement du cytosquelette d’actine, engendrant des étapes successives de déstructuration
et restructuration des complexes d’adhérence, nécessaires à la migration (Figure 26). Le
complexe Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2)-Crk, activé par FAK, exerce un
rétrocontrôle sur cette dernière par un cycle de phosphorylation-déphosphorylation (Cornillon
et coll., 2003 ; Parsons, 2003 ; Torsoni et coll., 2005). Ensuite, en activant les voies de
signalisation d’ERK (extracellular signal-regulated kinase) et de JNK, FAK facilite le
passage de la phase G1 à la phase S du cycle cellulaire augmentant la prolifération (Zhao et
coll., 1998 ; Cornillon et coll., 2003). FAK va aussi contribuer à la résistance à l’apoptose des
cellules en activant la voie de signalisation de la PI3K. L’activation consécutive d’Akt va
entrainer l’inhibition de la cascade apoptotique déclenchée par Bad et va activer le facteur
NFƘB dont la fonction première est de régler l’expression des gènes anti-apoptotiques
(Sonoda et coll., 2000 ; Cornillon et coll., 2003). De plus, Skuli et ses collaborateurs ont
également mis en évidence, dans les cellules de glioblastome, que les intégrines αvβ3 et αvβ5,
lorsqu’elles sont activées en condition hypoxique, régulent la stabilisation d’HIF-1α par
l’intermédiaire de FAK (Skuli et coll., 2009).
Par conséquent, FAK constitue une cible intéressante dans le traitement des glioblastomes
de par son rôle central dans divers processus cellulaires et de par sa surexpression dans les
gliomes de haut grade (Natarajan et coll., 2003).
2.2 L’ophioboline A.
2.2.1 Origine et propriétés connues à ce jour.
Les ophiobolines sont des métabolites secondaires de type sesterterpénoïde produits par
des champignons phytopathogènes, principalement du genre Bipolaris. Ils contaminent de
nombreuses cultures comme le riz, le maïs et le sorgho provoquant des taches brunes au
niveau des feuilles. L’intérêt pour les espèces Bipolaris et leurs métabolites actifs dérive de
leur implication dans deux épidémies dévastatrices: la famine au Bengale en 1943 et
l’infection du maïs dans le sud des Etats-Unis en 1972 (Au et coll., 2000). Le squelette des
ophiobolines résulte d’une cyclisation du géranylfarnésyl pyrophosphate. Cependant, les
gènes et les enzymes impliqués dans la biosynthèse de ces molécules n’ont pas encore été
isolés (Figure 27) (Au et coll., 2000).
36
Figure 27 : Voie de biosynthèse de l’ophioboline A, un métabolite secondaire du champignon
Bipolaris oryzae capable d’induire des taches brunes au niveau des feuilles des
monocotylédones (créé d’après Au et coll., 2000)
Dans le milieu des années 1960, Nozoe et ses collaborateurs ont caractérisé le premier
métabolite de ce groupe qui fut appelé ophioboline A (C25H36O4) (Nozoe et coll., 1965 ;
Canonica et coll., 1966). Depuis, plus de 20 analogues naturels ont été identifiés (Au et coll.,
2000). Les activités phytotoxiques de l’ophioboline A sont diverses. Elle peut induire
l’inhibition de la croissance des racines des plantules de blé et de riz ainsi que l’inhibition de
la germination des graines. Les changements de perméabilité membranaire, induits par
l’ophioboline A, incluent la stimulation des fuites d’électrolytes et de glucose ainsi que
l’inhibition de l’efflux de protons, liée à une modification des flux potassiques (Tipton et
coll., 1977 ; Cocucci et coll., 1983 ; Au et coll., 2000). Ce terpénoïde peut également inhiber
la calmoduline et la β-1,3 glucane synthase des cellules végétales (Leung et coll., 1984 ; Au et
coll., 2000). L’ophioboline A est aussi toxique pour les animaux. Chez la souris, les doses
létales médianes (DL50) observées sont de 21 mg/kg en administrations intrapéritonéales, de
12 mg/kg en administrations intraveineuses et de 73 mg/kg en per os (Au et coll., 2000).
Actuellement, les effets biologiques de l’ophioboline A sur les cellules cancéreuses sont
très peu décrits dans la littérature. Elle est capable d’induire de l’apoptose dans des lignées
cellulaires de leucémie murine et inhibe la croissance de plusieurs lignées cellulaires
cancéreuses humaines mais son mécanisme d’action n’est pas encore établi (Shen et coll.,
1999 ; Fujiwara et coll., 2000 ; de Vries-van Leeuwen et coll., 2010).
2.2.2 Le canal ionique BKCa
L’ophioboline A, comme nous pourrons le voir dans la partie consacrée aux
« Résultats », diminue la prolifération et la migration des cellules de glioblastome et induit la
mort de ces cellules par paraptose et ce, en diminuant l’activité du canal BKCa (big
conductance calcium-activated potassium channel).
Les canaux BKCa, exprimés dans de nombreux types cellulaires, se distinguent des autres
canaux potassiques, par une grande conductance mais aussi par le fait que leur activité est
régulée par le potentiel membranaire et la concentration calcique intracellulaire. Une
dépolarisation de la membrane associée à une augmentation de la concentration intracellulaire
en calcium (Ca2+) entraine l’ouverture des canaux BKCa. L’efflux de K+ conduit ensuite à
l’hyperpolarisation de la membrane et à la fermeture des canaux calciques voltagedépendants, contrôlant l’influx de Ca2+ dans la cellule (Yuan et coll., 2010). Les canaux BKCa
régulent de nombreux processus cellulaires tels que l’excitabilité neuronale, la contractilité
37
Figure 28 : Structure du canal BKCa. La sous-unité α est constituée de 11 domaines
hydrophobes en hélice α dont 7 domaines transmembranaires (S0-S6) et 4 domaines
intracellulaires (S7-S10). La boucle entre les segments S5 et S6 du canal possède une
séquence caractéristique conférant au pore la sélectivité aux ions potassium. L’interaction du
segment S4 porteur de charges positives avec les segments S1, S2 et S3 porteurs de charges
négatives suite à une variation de voltage, entraine l’ouverture du canal. La région des sites
principaux de fixation du calcium, appelée « calcium bowl », se trouvent dans la partie Cterminale intracellulaire entre les régions S9 et S10. En possédant des sites de
phosphorylation, de glycosylation et de fixation de toxines inhibitrices comme la
charybdotoxine, la sous-unité β régule également l’activité du canal BKCa (d’après Tran,
2008).
Figure 29 : Changements morphologiques des cellules de gliome facilitant l’invasion (d’après
Sontheimer, 2008).
des muscles lisses, l’homéostasie calcique ainsi que la prolifération cellulaire (Weaver et coll.,
2006 ; Singh H et coll., 2012).
Les canaux BKCa sont constitués d’un tétramère d’isoformes de la sous-unité α pouvant
être chacune complexée à une sous-unité β. La sous-unité α, codée par le gène hslo pour
human slowpoke, possède les sites régulateurs de l’activité de BKCa et forme le pore ionique
(Figure 28). Malgré que cette dernière soit ubiquitaire, l’expression des sous-unités β est
spécifique à certains types cellulaires et module la fixation de certaines toxines (Kaczorowski
et coll., 1996 ; Orio et coll., 2002).
Les canaux BKCa sont localisés au niveau de la membrane plasmique mais peuvent
également être exprimés dans le noyau, l’appareil de Golgi, les mitochondries et le réticulum
endoplasmique (Singh H et coll., 2012). Ces différentes localisations expliquent et renforcent
le fait que le canal BKCa puisse être impliqué dans le processus de paraptose et plus
particulièrement dans le gonflement des mitochondries et la formation de vacuoles
cytoplasmiques comme nous l’avons décrit précédemment (Hoa et coll., 2007).
Les canaux BKCa pourraient également être impliqués dans le phénomène d’invasion des
gliomes de haut grade. L’activation des récepteurs AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4isoxazolepropionic acid receptor) entrainerait une augmentation de la concentration de
calcium intracellulaire. Celle-ci activerait les canaux potassiques BKCa et les canaux
chlorures ClC-3, surexprimés dans les glioblastomes. Les efflux de K+ et de Cl- conduiraient à
la sortie de molécules d’eau par osmose. Le volume ainsi diminué de la cellule faciliterait
ensuite la migration des cellules dans le parenchyme cérébral (Figure 29) (Sontheimer, 2008).
38
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Fusicoccine A
PM : 680 g/mol
3’-O-déacétyl
fusicoccine A
Ophioboline A
PM : 400 g/mol
19-O-déacétyl
fusicoccine A
3-anhydro-6-epi
ophioboline A
Figure 30 : Terpénoïdes étudiés dans ce travail.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
I. Origine des molécules utilisées dans le cadre du présent travail.
La production, l’extraction et la purification des terpénoïdes utilisés au cours de ce travail
ont été réalisées par l’équipe du Professeur A. Evidente (Dipartimento di Scienze Chimiche,
Complesso Universitario Monte Sant’Angelo, Napoli, Italy) selon des procédés décrits
antérieurement (Figure 30) (Ballio et coll., 1968b, Evidente et coll., 2006 a et b). La
fusicoccine A est extraite du champignon Phomopsis amygdali tandis que l’ophioboline A est
extraite du champignon Drechslera gigantea (Evidente et coll., 2006 a et b). Les produits de
dégradation de la fusicoccine A, le 3′-O- déacetylfusicoccine A et le 19-Odéacetylfusicoccine A, ont été obtenus par déacétylation (Bury et coll., 2013a). Le produit de
dégradation de l’ophioboline A, le 3-anhydro-6-epi-ophioboline A, correspond quant à lui, à
un autre métabolite extrait de Drechslera gigantea (Evidente et coll., 2006b).
II. Étude de la stabilité physico-chimique.
L’évaluation de la stabilité physico-chimique a pour but de prédire la dégradation des
molécules étudiées dans ce travail dans des conditions similaires à celles que nous utilisons
lors d’analyses pharmacologiques in vitro. Plus précisément, elle est étudiée pendant 3 et 7
jours à 37°C dans du milieu de culture MEM (Minimal Essential Medium) sans ajout de
sérum. La stabilité physico-chimique de la fusicoccine A a été réalisée par l’équipe du
Professeur A. Evidente (Bury et coll., 2013a). Par contre, c’est l’équipe du Professeur P. van
Antwerpen (Laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique et Plate-Forme Analytique,
Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique) qui a étudié la
stabilité de l’ophioboline A (Bury et coll., 2013b).
III. Description des modèles expérimentaux.
1. Les modèles in vitro.
1.1 Lignées cellulaires établies.
Les lignées cellulaires cancéreuses établies utilisées dans ce travail proviennent de
l’American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA) et de la Deutsche Sammlung
39
von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany) et sont référencées
de la manière suivante :
-U373-MG, glioblastome, code ATCC: HTB-17
-T98G, glioblastome, code ATCC : CRL-1690
-Hs683, oligodendrogliome de grade III, code ATCC : HTB-138
-A549, carcinome du poumon non à petites cellules (NSCLC), code DSMZ : ACC107
-SKMEL28, mélanome, code ATCC : HTB-72
-B16F10, mélanome murin, code ATCC : CRL-6475.
1.2 Primocultures.
La primoculture de glioblastome humain GL19 nous a été fournie par le Professeur Walter
Berger (Department of Medicine I, Comprehensive Cancer Center and Institute of Cancer
Research, Medical University Vienna, Vienna, Austria). Elle a été établie dans le
Département de Neurochirurgie de l’Hôpital Wagner-Jauregg situé à Linz en Autriche comme
décrit précédemment (Berger et coll., 2001). Cette primoculture a été utilisée entre le
troisième et le dixième passage afin d’éviter toute déviance de la culture.
Les lignées cellulaires de kératinocytes sont issues du laboratoire du Professeur Y. Poumay
(Laboratoire Cellules et Tissus, URPHYM, Faculté Universitaire Notre-Dame-de-la-Paix
(FUNDP), Namur, Belgique) et proviennent de la résection chirurgicale de peau pratiquée par
le Dr B. Bienfait (Clinique Saint-Luc Bouge, Namur, Belgique) sur des adultes humains.
Les astrocytes murins proviennent du laboratoire du Professeur B. Rogister (Laboratoire de
Neurobiologie du Développement, GIGA-Neurosciences, Université de Liège, Sart-Tilman B,
Belgique).
1.3 Lignées cellulaires multi-drogues résistantes.
La lignée cellulaire HL60 issue de leucémie pro-myéloïde ainsi que ses sous-lignées
résistantes à l’adriamycine (surexprimant MRP1, gène ABCC1), à la vincristine
(surexprimant P-gp, gène ABCB1) et à la mitoxantrone (surexprimant BCRP, gène ABCG2),
ont été fournies par le Dr M. Center (Kansas State University, Manhattan, USA) au Professeur
W. Berger (McGrath et Center, 1988 ; Heffeter et coll., 2005). La lignée cellulaire A2780 de
carcinome d’ovaire et sa variante résistante au cisplatine ont été obtenues auprès de Sigma-
40
Aldrich. La lignée cellulaire GLC4 de carcinome de poumon à petites cellules ainsi que sa
sous-lignée résistante à l’adriamycine, surexprimant MRP1 et LRP, ont été données par le Dr
EG. de Vries (Groningen, Pays-Bas) au Prof. W. Berger (Zijlstra et coll., 1987 ; Heffeter et
coll., 2007). La lignée cellulaire HCT116 du cancer du côlon exprimant la protéine p53 et son
clone dans lequel la protéine p53 est délétée, ont été fournis par le Dr B. Vogelstein (John
Hopkins University, Baltimore, USA) au Prof W. Berger. La surexpression des transporteurs
ABC et la délétion de p53 ont été vérifiées par western blot au sein de l’équipe du Prof. W.
Berger.
1.4 Milieux et conditions de culture.
Toutes les lignées cellulaires cancéreuses sont cultivées dans des incubateurs
thermostatisés à 37°C sous atmosphère contrôlée à 21% d’O2, 5% de CO2 et saturée en eau.
Une chambre à hypoxie contenant 1% d’O2 a également été utilisée pour la culture des
cellules lors de certaines expériences. Le milieu de culture cellulaire RPMI (Roswell Park
Memorial Institute medium) est complémenté avec de la glutamine (0.6 mg/ml), un mélange
de pénicilline et de streptomycine (200 UI/ml) et de la gentamycine (0.1 mg/ml) (Lonza,
Verviers, Belgique). Ce milieu est aussi enrichi avec 10% de sérum fœtal de veau (FBS), qui
est préalablement décomplémenté pendant 1 heure à 56°C (Lonza, Verviers, Belgique). Dans
le cas des lignées multi-drogues résistantes, l’agent chimiothérapeutique en question est
ajouté dans le milieu comme détaillé précédemment (Heffeter et coll., 2005 et 2007).
Ces lignées cellulaires adhérentes sont cultivées en monocouche dans des boîtes de culture
en plastique (Sarstedt, Essen, Belgique). En fonction de la vitesse de croissance des lignées, le
milieu de culture est changé 1 à 2 fois par semaine. Lors du repiquage des lignées cellulaires,
le milieu est retiré et les cellules sont rincées rapidement avec de la trypsine-EDTA
(ethylenediaminetetraacetic acid) (Lonza, Verviers, Belgique). Elles sont ensuite incubées
avec cette solution durant 3 à 5 minutes à 37°C. Lorsque les cellules sont détachées de leur
support, la trypsine est neutralisée par ajout d’un volume double de milieu contenant du sérum
FBS. Les cellules peuvent alors être ensemencées à des taux variables en fonction de la lignée
considérée et des expériences prévues.
Pour l’obtention des astrocytes, le cortex d’une souris néonatale, haché en petits morceaux
avec des micro-ciseaux, est mis en suspension dans du milieu MEM dans lequel sont ajoutés
41
du glucose (6 g/l) et 10% de FBS (Invitrogen, Merelbeke, Belgique). La suspension cellulaire
filtrée est ensuite étalée dans une boîte de culture de 25 cm2 pendant 72 heures avant que le
milieu ne soit changé.
Après leur prélèvement, les kératinocytes sont placés dans du milieu de culture KGM-2
(keratinocyte growth medium) (BioWhittakerTM, Lonza, Verviers, Belgique). Ensuite, les
kératinocytes sont maintenus sous-confluents dans du milieu Epilife complémenté avec des
antibiotiques, des facteurs de croissance ainsi que des hormones (Cascade Biologics, Portland,
USA). Lorsque le pourcentage de confluence dépasse 40%, les facteurs de croissance sont
enlevés du milieu afin de permettre aux kératinocytes de se multiplier en condition autocrine
(Atanasova et coll., 2005).
1.5 Transfection.
Afin d’augmenter spécifiquement et stablement l’expression de la kinase d’adhérence
focale (FAK), les cellules U373-MG ont été transfectées avec le plasmide pCMV6-PTK2
(OriGene, Rockville, USA). Celui-ci permet le transfert d’un gène (ADNc ; acide
désoxyribonucléique complémentaire) codant pour la protéine d’intérêt ainsi que le transfert
d’un gène de résistance à l’antibiotique G418. Le plasmide pCMV6-XL4 (OriGene,
Rockville, USA) a été utilisé comme contrôle. Un jour avant la transfection (J-1), les cellules
sont ensemencées dans des plaques 6 puits de 9.6 cm2 de façon à ce que la confluence soit de
60-70% le jour de la transfection (J0). À J0, le milieu de culture est remplacé par 4 ml de
milieu DMEM GlutaMAX (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, Merelbeke,
Belgique) sans sérum et sans antibiotiques. La solution de transfection contenant 4µg d’ADN,
600µl de milieu et 6 µl d’agent TurboFect® (Fermentas, Waltham, USA) est incubée pendant
20 minutes à température ambiante. Avant que les cellules ne soient placées dans des
incubateurs à 37°C, 400µl de la solution de transfection est ajouté dans chaque puits au milieu
de culture. Le lendemain (J1), les cellules sont rincées avec du milieu DMEM GlutaMAX
complémenté avec 10% de FBS et un mélange de pénicilline et de streptomycine (200 UI/ml).
Des concentrations croissantes de G418 (Geneticin® ; Invitrogen, Merelbeke, Belgique) allant
jusqu’à 300 µg/ml ont été ajoutées au milieu pendant 30 jours afin de sélectionner les clones
exprimant la protéine d’intérêt.
42
Figure 31 : Exemples macroscopique et microscopique des poumons d’une souris présentant
des métastases. (A) Poumons d’une souris qui a développé des nodules tumoraux pulmonaires
(noir) 23 jours après l’injection de 2.5 x 105 cellules B16F10 de mélanome dans la veine de la
queue. (B) Histologie typique d’une telle tumeur, représentée à un grossissement optique de
40X (d’après Wauthoz et coll., 2010).
2. Le modèle B16F10 in vivo.
Suite à l’acceptation du protocole d’expérience par la Commission d’Ethique du Bien-Être
Animal (CEBEA, autorisation n° LA1230568), nous avons réalisé une expérience permettant
d’évaluer les effets anticancéreux in vivo de l’ophioboline A. Celle-ci s’est faite avec l’aide du
Dr. Nathalie Wauthoz (Laboratoire de Pharmacie Galénique et Biopharmacie, Faculté de
Pharmacie, ULB). Le modèle murin que nous avons utilisé consiste en l’injection
intraveineuse de 2.5 x 105 cellules de la lignée B16F10 de mélanome dans la veine de la
queue de la souris. Ce modèle est relativement agressif et conduit rapidement à la formation
de pseudométastases pulmonaires (Figure 31) (Mathieu et coll., 2007). Chaque groupe
expérimental comprend 10 souris femelles B6D2F1 âgées de 6 semaines (18-22 g; Charles
Rivers, Arbresle, France). Nous avons comparé la survie des souris traitées avec l’ophioboline
A à la survie des souris contrôles. L’ophioboline A a été administrée par voie intrapéritonéale
à 5 et 10 mg/kg sous forme de suspension microcristalline dans du NaCl 0.9%. Les souris sont
traitées 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi) pendant 3 semaines consécutives. Ces
traitements commencent au 5ème jour suivant la greffe des cellules. La survie des souris a été
vérifiée tous les jours tandis que le poids des souris a été mesuré tous les 3 jours au cours de
l’expérience. Les souris ayant perdu plus de 20% de leur poids par rapport au début de
l’expérience ou suffocant sont euthanasiées. La fusicoccine A a également été testée sur ce
modèle in vivo dans les mêmes conditions à une dose de 80 mg/kg mais n’a pas montré
d’effets bénéfiques significatifs sur la survie des souris à cette concentration.
IV. Description des techniques utilisées.
1. Analyses de l’expression et de l’activité des protéines.
1.1 Le western blot.
La technique du western blot permet la détection et éventuellement une analyse semiquantitative du taux d’expression d’une protéine dans un échantillon cellulaire. Tout d’abord,
les extraits protéiques sont obtenus en lysant les cellules avec du CelLytic® (50 µl/25 cm2 ;
Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Lorsque nous avons analysé l’expression de pFAK, nous
avons ajouté 1mM d’orthovanadate sodique (Na3VO4, Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) au
CelLytic®. Ensuite, la concentration protéique est dosée à l’aide d’un test colorimétrique
(BCA protein assay Kit, Pierce, Perbio Science, Aalst, Belgique). Il se base sur la capacité des
43
protéines à réduire en milieu alcalin le Cu2+ en Cu+. Le complexe formé par le Cu+ et l’acide
bicinchonique (BCA) va donner une couleur pourpre. La densité optique des échantillons est
mesurée à une longueur d’onde de 562 nm (Microplate Reader, Bio-Rad, Nazareth Eke,
Belgique). Les mesures seront comparées à une courbe standard de concentrations connues
d’albumine bovine (BSA). Lorsque la teneur en protéine est quantifiée, 10 à 40 µg
d’échantillon protéique est déposé dans un gel d’électrophorèse, en présence de SDS (sodium
dodecyl sulfate) qui dénature les protéines et leur confère une charge négative. La
concentration en polyacrylamide du gel varie de 5 à 15% en fonction du poids moléculaire de
la protéine d’intérêt. Dans chaque puits du gel, on charge la même quantité de protéines.
Celles-ci sont au préalable mélangées à un tampon de charge (500 mM Tris-HCl à pH 6.8,
30% glycérol, 10% SDS, 0.012% bleu de bromophénol) et dénaturées en les chauffant à 95°C
durant 5 minutes. Un marqueur de poids moléculaire, composé de différentes protéines de
poids moléculaire connu, est placé dans un puits en parallèle ce qui permet d’identifier la
protéine d’intérêt. Sous l’influence d’un courant électrique, les protéines chargées vont migrer
dans le gel vers l’anode et sont ainsi séparées en fonction de leur poids moléculaire. La
migration, réalisée sous une tension de 200 Volts, se fait dans un tampon de migration
composé de 25 mM de Tris HCl, 192 mM de glycine et 0.1% de SDS. Les protéines sont
ensuite transférées sur une membrane de polyvinylidiène difluoride (PVDF) sous une tension
de 100 Volts à 4°C pendant 90 minutes dans un tampon de transfert composé de 25 mM de
Tris HCl, 192 mM de glycine et 20% de méthanol. Afin de limiter les liaisons aspécifiques
des anticorps, la membrane est incubée pendant 1 heure sous agitation dans un tampon de
blocage à pH 7.4 contenant une solution de TBS (20 mM Tris-HCl à pH 7.6, 137 mM NaCl),
0.2% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) et 5% de lait en poudre ou 5% de
BSA (MP Biomedicals, Bruxelles, Belgique). La membrane est ensuite incubée une nuit à
4°C sous agitation en présence de l’anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt dilué
dans le tampon de blocage utilisé. Après plusieurs rinçages avec le tampon TBS contenant
0.2% de Tween, la membrane est incubée 1 heure à température ambiante avec un anticorps
secondaire, couplé à une péroxydase (Horse Radish peroxydase, HRP), reconnaissant
l’anticorps primaire. La révélation est réalisée au moyen du Kit SuperSignal (Pierce, Perbio
Science, Aalst, Belgique). Elle repose sur la libération de lumière émise suite à l’oxydation du
luminol qui est catalysée par la réduction en milieu alcalin du péroxyde d’hydrogène par la
péroxydase présente sur l’anticorps secondaire. L’analyseur d’image BioRad ChemiDoc XRS
(Bio-Rad Laboratories, Nazareth Eke, Belgique) permet pour finir de quantifier le taux
44
Anticorps primaires
Firme
Dilution
Phosphorylated FAK
FAK
HIF-1α
CD-44
Nestin
PARP
KCa1.1
Tubulin
R&D Systems
R&D Systems
Abcam
Abcam
Abcam
BD Pharmingen
Alomone Labs
Abcam
1/100
1/100
1/200
1/2500
1/60
1/250
1/500
1/5000
Anticorps secondaires
Firme
Dilution
Souris
Lapin
Chèvre
Pierce
Pierce
Pierce
1/1000-1/10000
1/1000-1/10000
1/1000
Table 5 : Dilution et origine des anticorps utilisé en western blot dans ce travail.
Anticorps primaires
Firme
Dilution
KCa1.1
GRP78
Alomone Labs
Santa Cruz Biotech
1/50
1/100
Anticorps secondaires
Firme
Dilution
Lapin
Souris
Alexa Fluor Invitrogen
Alexa Fluor Invitrogen
1/500
1/500
Table 6 : Dilution et origine des anticorps utilisé en immunofluorescence dans ce travail.
d’expression des protéines. Un contrôle d’expression protéique avec la tubuline est effectué
dans chaque condition expérimentale. Les anticorps primaires et secondaires utilisés en
western blot ainsi que leur origine et leur dilution sont décrits dans la Table 5.
1.2 La microscopie à fluorescence.
L’immunofluorescence permet de visualiser à l’aide d’un microscope à fluorescence
l’expression ainsi que la localisation d’une protéine d’intérêt au sein des cellules. Les cellules
sont cultivées en plaque 6 puits (Sarstedt, Essen, Belgique) dans lesquelles sont déposées des
lamelles de verre de 18*18 mm qui ont été stérilisées (Menzel-Gläser, Braunschweig,
Allemagne). Les cellules sont ensemencées à la concentration voulue dans 4 ml de milieu de
culture. Après 24 heures ou un autre temps de traitement, le milieu de culture est retiré et les
cellules sont rincées 2 fois au PBS (Lonza, Verviers, Belgique). Elles sont ensuite fixées avec
une solution de formaldéhyde à 4% tamponnée à pH 7.4 pendant 20 minutes à 4°C. Après un
rinçage au PBS, les cellules sont perméabilisées avec une solution de PBS contenant 0.2% de
TritonX-100 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) durant 5 minutes. Une fois rincées au PBS,
les cellules sont saturées avec un tampon de blocage (5% BSA dans du PBS) afin de limiter
toutes liaisons aspécifiques éventuelles. Les lamelles sont ensuite successivement incubées 2
heures avec l’anticorps primaire dilué dans une solution PBS-BSA (5%), rincées au PBS puis
incubées 1 heure à l’abri de la lumière avec l’anticorps secondaire couplé à un fluorochrome
spécifique de l’anticorps primaire. Cette étape peut être répétée si on souhaite observer
plusieurs protéines d’intérêt en même temps. Pour finir, les lamelles sont montées sur des
lames en verre avec 10 µl d’alcool polyvinylique associé à un réactif DABCO® « antifading »
(Fluka, Belgique). La lecture des lames s’effectue au moyen d’un microscope à fluorescence
Zeiss Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen, Germany) équipé d’une caméra AxioCam HRm et
couplé à un système d’analyse d’image (AxioVision Rel 4.6). Les anticorps primaires et
secondaires utilisés en immunofluorescence ainsi que leur origine et leur dilution sont décrits
dans la Table 6. Le MitoTracker Green FM (100 nM, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) a été
utilisé pour marquer les mitochondries des cellules vivantes et fixées tandis que l’ER-Tracker
Blue-White DPX (1µM, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) n’a été utilisé que pour marquer le
réticulum endoplasmique des cellules vivantes. Les cellules vivantes, ensemencées sur des
lamelles en verre, sont incubées pendant 30 minutes avec ces marqueurs avant d’être
visualisées par microscopie à fluorescence.
45
L’analyse de l’organisation du cytosquelette d’actine se fait également par microscopie à
fluorescence. L’actine fibrillaire est marquée avec la phallacidine conjuguée à un
fluorochrome Bodipy-FL® (Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) tandis que
l’actine globulaire est marquée avec de la DNase I couplée au Texas Red® (Molecular Probes,
Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Après les mêmes étapes de culture, de fixation, de
perméabilisation et de rinçage, les cellules sont incubées 2 heures à température ambiante
dans l’obscurité avec un mélange de phallacidine et de DNase fluorescentes contenant du
glycérol et de la BSA, avant d’être montées sur lames en verre.
1.3 Le test d’inhibition des protéines kinases.
La société ProQinase (Fribourg, Allemagne) a déterminé l’effet des terpénoïdes étudiés
dans ce travail sur un éventail de 288 protéines kinases (Annexe I). Leur test repose sur un
dosage radiométrique (33PanQinase® Activity Assay) réalisé en plaques 96 puits (FlashPlates,
Perkin Elmer, Boston, USA). Les protéines kinases humaines recombinantes sont extraites à
partir de cellules d’insectes de la lignée Sf9 ou d’Escherichia coli ; leur purification est
obtenue par chromatographie d’affinité sur gel d’agarose (type GSH-agarose ou Ni-NTAagarose). La société ProQinase vérifie par spectrométrie de masse l’identification de chaque
protéine kinase.
L’activité d’une protéine kinase est mesurée en suivant la phosphorylation d’une protéine
donnée ou substrat via le transfert d’un groupement phosphate provenant de l’ATP marqué.
Plus précisément, 10 µl d’ATP solubilisé dans de l’eau, 25 µl d’un tampon contenant de
l’ATP radioactif [γ-33P], 5 µl du produit testé et 10 µl du mélange enzyme/substrat sont
déposés dans chaque puits. Les plaques sont placées dans un incubateur thermostatisé à 30°C
durant 1 heure. La réaction est arrêtée avec 50 µl d’une solution d’H3PO4 2%. Après que les
puits aient été rincés plusieurs fois avec 200 µl de NaCl 0.9%, la radioactivité (incorporation
du 33Pi) est déterminée grâce à un compteur de scintillation (Wallac Microbeta, Perkin Elmer,
USA). Ces tests sont réalisés dans un système robotisé (Beckman Coulter Biomek 2000/SL
robotic system, Allemagne).
Un « contrôle faible » et un « contrôle élevé » sont définis sur chaque plaque. Le
« contrôle faible » correspond à la fixation non spécifique de la radioactivité en présence du
substrat mais pas de la protéine kinase. Il se calcule en déterminant la valeur médiane du
nombre de coups par minute (cpm) mesuré pour la colonne 1 (n=3) de la plaque 96 puits. Le
46
Figure 32 : Illustration du test colorimétrique MTT. Les cellules sont ensemencées dans une
plaque 96 puits. Après 24 heures, des concentrations croissantes du produit à analyser sont
mises en présence des cellules. Après 72 heures, le réactif MTT ajouté va être transformé en
cristaux de formazan qui vont être solubilisés avec du diméthylsulfoxide. L’intensité de la
coloration est mesurée par spectrométrie (créé d’après Stockert et coll., 2012).
« contrôle élevé » correspond, quant à lui, à l’activité totale mesurée en l’absence de tout
inhibiteur potentiel. Il se calcule en déterminant la valeur médiane du nombre de cpm mesuré
pour la colonne 2 (n=3) de la plaque. La différence entre ces deux contrôles équivaut à une
activité de 100%. L’activité résiduelle de chaque puits est déterminée de la façon suivante :
Activité résiduelle (%) = [(cpm du composé étudié – contrôle faible)/(contrôle élevé –
contrôle faible)] x 100
La fusicoccine A a été testée à une concentration finale de 50 µM tandis que l’ophioboline
A a été testée à une concentration finale de 0.5 µM. Ces tests ont été réalisés en duplicat.
2. Analyses de la croissance cellulaire.
2.1 Le test colorimétrique MTT.
La croissance globale d’une population cellulaire peut être évaluée indirectement grâce au
test colorimétrique MTT. Le principe de ce test repose sur le fait que la succinate
déshydrogénase, présente dans les mitochondries des cellules métaboliquement actives, réduit
le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium)
de couleur jaunâtre en cristaux de formazan. Ces cristaux de couleur violacée sont ensuite
dissouts dans du diméthylsulfoxide (DMSO). L’intensité de la coloration, mesurée par un
spectromètre, est proportionnelle au nombre de cellules vivantes à la fin de l’expérience.
Les cellules sont ensemencées au jour 0 dans des plaques 96 puits (Sarstedt, Essen,
Belgique). Le taux d’ensemencement des différentes lignées cellulaires utilisées est déterminé
sur base de leur courbe de croissance respective afin d’effectuer le test dans leur phase de
croissance exponentielle. À J1, les cellules sont mises en présence de doses croissantes du
produit à analyser, ces doses s’échelonnant en général de 10-8M à 10-4M (Figure 32). Chaque
condition expérimentale est réalisée en sextuplicat. Après 72 heures de traitement
correspondant à J4, le milieu de culture est remplacé par du milieu RPMI blanc dans lequel
est dilué le réactif MTT (0.5 mg/ml ; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique). Après 3 à 5 heures
d’incubation à 37°C, les plaques 96 puits sont centrifugées à 1000 tours/minute durant 8
minutes afin de fixer les cristaux de formazan dans le fond des puits. La solution de MTT est
alors retirée et remplacée par du DMSO (Merck, Darmstadt, Allemagne) qui solubilise les
47
Figure 33 : La vidéomicroscopie quantitative. (A) Les boites de culture sont déposées sous un
microscope à contraste de phase, muni d’une caméra et placées dans une enceinte en
plexiglass thermostatisé à 37°C. (B) La caméra, via un programme d’acquisition, prend une
image toutes les 4 minutes pendant 72 heures et les envoie à un ordinateur qui les numérise.
(C) Le logiciel d’analyse permet de suivre la trajectoire de chaque cellule au cours de cette
période. (D) Le logiciel permet ensuite de calculer la variable MRDO (Maximal Relative
Distance to the Origin) qui correspond à la distance maximale, par rapport à l’origine,
parcourue par une cellule au cours du temps.
cristaux. Après une agitation légère, l’intensité de la coloration violette est mesurée par
spectrophotométrie à 570 nm avec une longueur d’onde de référence de 655 nm (Microplate
Reader, Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgique). La moyenne d’intensité de chaque concentration
est calculée. Ensuite, une valeur d’IC50 par plaque MTT est déterminée à partir d’une droite
de régression. À l’aide du test colorimétrique MTT, on a également mesuré après combien de
temps les effets d’une molécule sont irréversibles.
2.2 La vidéomicroscopie quantitative : croissance et division cellulaire.
La croissance globale d’une population cellulaire peut être évaluée de manière directe à
l’aide de la vidéomicroscopie assistée par ordinateur. Elle est associée à un logiciel d’analyse
d’images développé par le Dr O. Debeir en collaboration avec le Dr C. Decaestecker
(Laboratoire de l’Image : Synthèse et Analyse (LISA), Faculté des Sciences Appliquées,
ULB) (Debeir et coll., 2005 et 2008).
Les cellules sont ensemencées 24 heures avant le début de l’expérience dans des boites de
culture de 25 cm2 à des concentrations cellulaires variables suivant la lignée étudiée. Le jour
du lancement du test, le milieu est renouvelé et le traitement avec la molécule d’intérêt est
ajouté ou non (contrôles). Les boites de culture cellulaire sont ensuite placées pendant 72
heures sous un microscope à contraste de phase (grossissement 100X, Olympus, Anvers,
Belgique) dans une enceinte en plexiglass maintenue à 37°C par un système contrôlé de
manière électronique (Figure 33). La vidéomicroscopie est basée sur la prise d’image d’un
champ cellulaire toutes les 4 minutes pendant la durée de l’expérience par une caméra reliée
au microscope. Par la suite, les images sont récupérées et trois paramètres de la croissance
cellulaire peuvent être déterminés : le nombre de divisions cellulaires et leur durée ainsi que la
croissance globale, qui correspond au rapport entre le nombre de cellules présentes dans la
dernière image sur celui dans la première image pour chaque condition expérimentale. Le
ratio global de la croissance cellulaire est le rapport de croissance de la condition traitée
divisée par le rapport de la condition contrôle. À titre d’exemple, si l’on dénombre 200
cellules dans la dernière image numérisée (1080ème image) en fin d’expérience et 20 cellules
dans la première image de la condition contrôle, le rapport de croissance dans cette condition
est de 10. Si ce rapport est de 5 dans la condition traitée, le ratio global de croissance est de
0.5 (5/10) ce qui signifie qu’il y a 50% de cellules en moins dans la condition traitée par
rapport à la condition contrôle.
48
2.3 La cytométrie de flux : analyse du cycle cellulaire.
L’analyse du cycle cellulaire s’effectue par marquage de l’ADN à l’iodure de propidium
en cytométrie de flux. La propriété de l’iodure de propidium est de s’intercaler entre les bases
de l’ADN. Lorsqu’il est soumis à une longueur d’onde d’excitation de 530 nm, il émet une
longueur d’onde de 617 nm. Ce marquage est proportionnel à la quantité d’ADN présente
dans la cellule ce qui permet de déterminer la proportion de cellule dans chacune des phases
du cycle cellulaire (G0/G1, S, G2/M) en fonction de la réplication de leur ADN.
Les cellules sont cultivées en présence de la molécule d’intérêt. Après les temps d’analyse
souhaités, les cellules sont détachées de leur support de culture (boîtes de 25 cm²) par
trypsinisation et rincées deux fois au PBS avec entre chaque rinçage une étape de
centrifugation à 1000 tours/min. Elles sont ensuite fixées et perméabilisées par incubation
pendant au moins une nuit à -20°C dans de l’éthanol à 70%. Le jour de l’analyse, les
suspensions cellulaires sont rincées deux fois dans du PBS et mises en suspension dans une
solution d’iodure de propidium à 1 mg/ml (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) avec de la
RNAse également à 1 mg/ml (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany) pendant 30
minutes dans l’obscurité. Pour chacune des mesures, 10 000 cellules sont analysées.
L’ensemble des mesures est faite avec un cytomètre de flux de type Quanta SC flow
(Beckman Coulter Analis, Suarlée, Belgique).
3. Analyses de la migration cellulaire.
3.1 La vidéomicroscopie quantitative : motilité cellulaire.
L’analyse de la motilité cellulaire à 2 dimensions, c’est-à-dire lorsque les cellules sont
cultivées sur un support solide, est réalisée à l’aide du système de vidéomicroscopie assistée
par ordinateur et du logiciel d’analyse d’images qui ont été décrits précédemment dans ce
travail (Debeir et coll., 2005 et 2008). Ce logiciel d’analyse permet en effet de suivre chaque
cellule d’image en image et de déterminer sa trajectoire au cours du temps (Figure 33)
(Debeir et coll., 2005). La distance maximale par rapport au point d’origine est ainsi mesurée
et rapportée au temps d’observation. Cette variable, dénommée MRDO (Maximal Relative
Distance to the Origin), est exprimée en µm/h.
49
Figure 34 : Schéma d’une chambre d’invasion de Boyden. Le fond de l’insert est constitué
d’une membrane poreuse de polytéthylène recouvert d’une fine couche de MatrigelTM. Cet
insert, placé dans une plaque 24 puits, permet de séparer la chambre en deux parties. Les
cellules sont ensemencées dans la partie supérieure et incubées pendant 24 heures à 37°C avec
du milieu de culture contenant la molécule d’intérêt afin de tester leur capacité invasive, c’està-dire leur capacité à traverser la membrane.
3.2 Les chambres d’invasion de Boyden.
Les propriétés invasives des cellules peuvent être mesurées in vitro grâce à des chambres
d’invasion de Boyden. Elles sont constituées de deux chambres distinctes séparées par une
membrane de polyéthylène poreuse ayant des pores de 8 µM de diamètre. Cette membrane est
recouverte d’une fine couche de MatrigelTM mimant une matrice extracellulaire (Figure 34)
(BD BioCoat™ BD MatrigelTM Invasion Chambers, BD Biosciences, Aalst, Belgique). Les
cellules sont ensemencées dans la partie supérieure de la chambre sur la couche de
MatrigelTM, immergées dans du milieu de culture contenant la molécule d’intérêt, puis placées
dans un incubateur à 37°C. Après 24 heures, les cellules restées dans la partie supérieure de la
chambre sont retirées à l’aide d’un coton-tige. Les cellules ayant digéré le MatrigelTM et ayant
traversé la membrane pour passer sur la face inférieure, sont par contre fixées et colorées avec
le kit Diff-Quick (Merz+Dade AG, Baxter, Belgique) selon les recommandations du
fabriquant. Les cellules invasives sont ensuite visualisées au microscope (grossissement
100X, Olympus, Anvers, Belgique) et comptées manuellement à l’aide d’une grille insérée
dans l’oculaire du microscope. Afin de calculer le pourcentage de cellules invasives et de
normaliser les résultats par rapport à un effet éventuel sur la croissance cellulaire, un nombre
identique de cellules est ensemencé en parallèle dans une plaque 24 puits recouverte avec du
MatrigelTM. Le milieu de culture contient également la molécule d’intérêt à la concentration
testée. Le pourcentage d’invasion est alors calculé en comptant le nombre de cellules
présentes sur la face inférieure de la membrane normalisé par le nombre de cellules présentes
dans la plaque 24 puits.
3.3 Analyse des capacités d’adhésion des cellules.
Les capacités d’adhésion des cellules sur un support de MatrigelTM sont mesurées de la
façon suivante. Une couche de MatrigelTM (dilution 1/3 dans du milieu RPMI) est coulée sur
des lamelles de verre déposées dans le fond de plaques 24 puits. Après 1 heure d’incubation à
37°C, les puits sont rincés et bloqués avec une solution de BSA diluée à 0.1% dans du PBS
durant 30 minutes. Après avoir été détachées de leur support par trypsinisation, les cellules
sont ensemencées dans les plaques 24 puits préalablement recouverts avec le MatrigelTM.
Elles sont ensuite incubées pendant 24 heures à 37°C en présence ou non de la molécule
d’intérêt. Après ce temps d’incubation, les cellules sont rincées doucement avec du PBS afin
d’éliminer les cellules qui n’ont pas adhéré. Les cellules adhérentes sont alors fixées et
50
colorées avec le colorant Diff-Quick, avant d’être visualisées au microscope (grossissement
100X, Olympus, Anvers, Belgique). Ensuite, les cellules sont comptées manuellement à l’aide
d’une grille insérée dans l’oculaire du microscope.
4. Analyses de la mort cellulaire.
4.1 La coloration au bleu de trypan.
La coloration au bleu de trypan est une méthode qui permet d’évaluer le pourcentage de
cellules mortes au sein d’une population. Lorsque le bleu de trypan entre dans les cellules,
elles déclenchent un mécanisme d’exclusion qui nécessite de l’énergie. Les cellules vivantes,
possédant une source d’ATP, sont donc capables d’éjecter ce colorant tandis que les cellules
mortes ne peuvent pas le faire et présentent une couleur bleue au microscope.
Les cellules sont ensemencées dans des boites de culture de 25 cm2. Après 72 heures de
traitement avec la molécule d’intérêt, le milieu de culture est retiré. Ensuite, 3 ml d’une
solution de bleu de trypan (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) dilué dans du PBS (dilution ½)
est ajouté aux cellules. Après 5 minutes d’incubation à température ambiante, la solution
colorante est remplacée par 1 ml de PBS. Le nombre de cellules mortes est immédiatement
calculé manuellement à l’aide d’un microscope (grossissement 10X, Olympus, Anvers,
Belgique).
4.2 La cytométrie de flux.
4.2.1 Le marquage TUNEL.
Le marquage de type TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end
labeling) en cytométrie de flux permet de déterminer le taux de mort cellulaire d’une
population en mesurant les fragmentations de l’ADN, pouvant notamment survenir lors du
processus apoptotique. Lors de cette fragmentation de l’ADN, de nombreux groupements
3’OH libres sont générés. L’enzyme TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) permet
d’ajouter à ces extrémités des déoxyuridines triphosphates (dUTPs) bromées pouvant être
reconnues par un anticorps spécifique couplé à un fluorochrome FITC (fluorescein
isothiocyanate) qui émet une fluorescence à 520 nm.
51
Pour réaliser cette analyse, nous avons utilisé le Kit APO-DIRECTTM (BD Pharmingen,
Erembodegem-Aalst, Belgique) en suivant les instructions fournies par le fabriquant. Les
cellules cancéreuses sont traitées aux différents temps d’analyse souhaités par la molécule
d’intérêt. Après ces traitements, les cellules sont détachées de leur support par trypsinisation,
centrifugées puis rincées deux fois au PBS. Les cellules sont fixées par incubation pendant 30
minutes à 4°C dans du paraformaldéhyde 1% puis pendant une nuit à -20°C dans de l’éthanol
70%. Le jour de l’analyse, les cellules sont rincées avec du PBS et mises en présence de
l’enzyme TdT et des Br-dUTPs pendant 1 heure à 37°C. Ensuite, les cellules sont incubées
avec l’anticorps anti-Br-dUTP couplé au fluorochrome FITC pendant 30 minutes à
température ambiante à l’abri de la lumière. La suspension cellulaire est alors analysée avec
un cytomètre de flux de type Quanta SC flow (Beckman Coulter Analis, Suarlée, Belgique).
4.2.2 Le double marquage annexine V/iodure de propidium
Le double marquage à l’annexine V et l’iodure de propidium est utilisé principalement
pour la détection précoce de l’apoptose. Ce test repose sur la capacité de l’annexine V à se lier
aux phosphatidylsérines présentes au niveau de la partie externe de la membrane plasmique.
Lors de l’induction de l’apoptose, des phénomènes d’inversion de type « flip-flop »
surviennent entre les couches phospholipidiques internes et externes de la membrane
plasmique, entrainant l’exposition des phosphatidylsérines au milieu extracellulaire. Ce test
fait également intervenir l’iodure de propidium (IP) qui est un agent fluorescent intercalant de
l’ADN. Lorsque la membrane plasmique est altérée en phase tardive de l’apoptose ou lors de
la nécrose, il peut pénétrer à l’intérieur des cellules. On peut par conséquent avec ce double
marquage distinguer les cellules en apoptose de celles en nécrose selon les critères suivants :
-Annexine V - / IP - cellules vivantes
-Annexine V + / IP - cellules en phase précoce de l’apoptose
-Annexine V + / IP +  cellules en phase tardive de l’apoptose
-Annexine V - / IP + cellules en nécrose
Cette analyse a été réalisée avec le Kit Alexa Fluor® 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis
(Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) selon les recommandations du
fabriquant. Les cellules cancéreuses sont traitées aux différents temps d’analyse souhaités par
la molécule d’intérêt. Après ces traitements, les cellules sont trypsinisées et rincées deux fois
52
au PBS. Les cellules lavées sont ensuite centrifugées et suspendues dans le tampon de liaison
du kit à une concentration de 106 cellules/ml. Les cellules sont incubées pendant 15 minutes à
température ambiante avec 100µl d’une solution contenant 5 µl d’annexine V couplée au
FITC et 1µl d’iodure de propidium préparé à une concentration de 100µg/ml. Après ce temps
d’incubation, 400µl de tampon de liaison du kit sont ajoutés. Les cellules marquées sont pour
finir analysées par un cytomètre de flux de type Quanta SC flow (Beckman Coulter Analis,
Suarlée, Belgique), mesurant l’émission fluorescente à 530 nm (annexine V-FITC) et à 620
nm (IP).
4.2.3 Le marquage à l’acridine orange.
Le taux d’autophagie peut être déterminé par cytométrie de flux grâce à un marquage à
l’acridine orange. Ce marquage n’est toutefois pas spécifique de l’autophagie mais un
processus autophagique ne peut survenir sans être détecté par cette approche. L’acridine
orange est un colorant biologique ayant la capacité d’émettre une fluorescence verte (530nm)
en milieu basique et une fluorescence rouge (630 nm) lorsqu’il est protoné en milieu acide.
L’intensité de la fluorescence rouge sera donc proportionnelle au volume et à la quantité de
compartiments acides dans la cellule. Une caractéristique du processus autophagique est la
formation de vésicules acides appelées autophagolysosomes. Ces vésicules pourront donc être
mises en évidence par un marquage à l’acridine orange. Par contre, la perméabilisation des
membranes lysosomales est associée à une augmentation de la fluorescence verte suite à la
fuite du contenant dans le cytosol.
Après traitement, les cellules sont incubées pendant 15 minutes à 37°C avec 1µg/ml
d’acridine orange (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique). Les cellules sont ensuite trypsinisées
et resuspendues dans du milieu RPMI blanc. La suspension cellulaire est analysée en
cytométrie de flux dans les deux longueurs d’onde émises (Quanta SC flow, Beckman Coulter
Analis, Suarlée, Belgique).
4.3 Le test d’activité de la β-galactosidase.
Le taux de sénescence dans les cellules peut être mesuré à l’aide du test d’activité de la
SA-β-Gal (senescence-associated beta-galactosidase). L’augmentation de la biogenèse des
lysosomes observée dans les cellules sénescentes conduit à l’augmentation de l’activité de la
β-galactosidase. La β-galactosidase est une hydrolase localisée dans les lysosomes qui permet
53
Figure 35 : Principe du test d’activité de la β-galactosidase. Lorsque la β-galactosidase clive
la liaison glycosidique du substrat X-Gal, un monomère indoxyle incolore et soluble se forme.
Par la suite, il y a formation d’un dimère qui sera oxydé produisant un composé insoluble bleu
et stable. La réaction d’oxydation nécessite le transfert d’un électron, qui est facilité par la
présence d’accepteurs d’électrons. Les ions ferreux et ferriques présents dans la solution de
X-Gal assureront cette fonction (d’après http://www.tcichemicals.com).
le clivage des résidus beta-galactosides en beta-D-galactose. Les cellules sénescentes, à pH
acide, vont donner une coloration bleue après incubation avec le substrat 5-bromo-4-chloro-3indolyl-ß-D-galactoside (X-Gal) (Figure 35). Cette augmentation de l’activité de la βgalactosidase n’est toutefois pas spécifique de la sénescence mais elle ne peut survenir sans
être détectée par cette approche.
Pour réaliser ce test, nous avons utilisé le Kit Senescence Cells Histochemical Staining
(Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) en suivant les instructions du fabricant. Après traitement,
le milieu des cellules cultivées en boite de culture de 12.5 cm2 (Sarstedt, Essen, Belgique) est
retiré. Après avoir rincé les cellules avec du PBS, elles sont incubées pendant 6-7 minutes à
température ambiante avec 2 ml du tampon de fixation du kit contenant 20 % de
formaldéhyde. Les cellules sont ensuite lavées trois fois avec du PBS avant d’être incubées
pendant une nuit à 37°C avec 1.5 ml de la solution de marquage du kit contenant le substrat
X-Gal ainsi que du ferricyanure et du ferrocyanure de potassium (Sigma-Aldrich, Bornem,
Belgique). Ce marquage, pH dépendant, ne peut pas se faire dans une atmosphère enrichie en
CO2. Le lendemain, les cellules sénescentes présentant une couleur bleue sont comptées
manuellement à l’aide d’un microscope (grossissement 10X, Olympus, Anvers, Belgique).
4.4 Analyses des flux ioniques.
4.4.1 Mesure de la concentration intracellulaire du calcium.
L’évaluation de la concentration intracellulaire du calcium ([Ca2+]i) a été réalisée dans le
laboratoire de Physiologie cellulaire du Professeur P. Gailly (Institut des Neurosciences,
Université Catholique de Louvain, Bruxelles, Belgique). La sonde Fura-2 est utilisée sous la
forme de son ester acétoxyméthylique, appelée Fura-2AM. Cet ester lipophile diffuse à
travers la membrane plasmique et est hydrolysé par les estérases cytosoliques en Fura-2 qui
va pouvoir ensuite se chélater aux ions calcium présents dans le cytosol. L’émission de
fluorescence à 510 nm du Fura-2 est obtenue en réponse à une excitation à 340 nm (F340) et
380 nm (F380) en présence et en absence de Ca2+. Une augmentation de la concentration
intracellulaire de calcium se traduit par une augmentation de F340 et une diminution de F380.
Les cellules sont ensemencées sur des lamelles en verre rondes de 22 mm de diamètre
dans une plaque 6 puits. Après traitement avec la molécule d’intérêt, les cellules sont incubées
avec 1µM de Fura-2AM (Calbiochem, Camarillo, CA) dans un tampon Krebs-HEPES (10
54
Figure 36 : Schéma de l’installation du « patch clamp » utilisé dans le Laboratoire Nutrition
Croissance Cancer du Professeur C. Vandier (Université de Tours, France). Le dispositif
expérimental est placé sur une table à coussin d’air limitant les vibrations extérieures et est
isolé de l’environnement électrique grâce à une cage de Faraday reliée à la terre. Les cellules
cultivées dans une boite de Pétri sont placées sur un microscope inversé. Un
micromanipulateur piézoélectrique permet d’approcher la micropipette d’une cellule d’intérêt
tandis que la tête de perfusion est approchée à l’aide d’un micromanipulateur hydraulique. Ce
système est relié à des capillaires dont l’ouverture peut être contrôlée mécaniquement par un
système d’électrovannes. La pipette de patch sert d’électrode de mesure et d’électrode
d’imposition du voltage ou du courant. Elle est remplie de milieu intra-pipette (MIP) et est
reliée à la tête de l’amplificateur servant d’adaptateur d’impédance. Un fil d’argent chloruré,
baignant dans le MIP, permet la liaison électrique de l’électrode à l’amplificateur. Afin de
fermer le système électrique, une électrode de référence est plongée dans le bain environnant
les cellules. Ces deux électrodes sont reliées à un amplificateur de patch clamp qui réalise la
conversion courant‐tension avant de réaliser l’amplification du signal. Cet amplificateur est
relié à une carte de conversion analogique/numérique‐numérique/analogique permettant la
conversion du signal physique, la tension, en un signal numérique analysable par un
ordinateur. L’enregistrement des données ainsi que le contrôle des protocoles se font à l’aide
de ce dernier élément de la chaine d’acquisition (imposition des voltages/courants). Le
logiciel pClamp 9.2 (Molecular Devices, USA) est employé pour l’imposition des protocoles
et les enregistrements (Clampex) ainsi que pour l’analyse des signaux et des courants
(Clampfit) ; A : ordinateur, B : carte de conversion analogique/numérique et
numérique/analogique, C : amplificateur de patch clamp, D : microscope inversé, E : table
anti‐vibration, F : micromanipulateurs, G : système de perfusion, H : cage de Faraday
(d’après Girault A, 2011).
mM HEPES, 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM glucose, pH
7.4) pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, les lamelles sont montées dans une
chambre de microscope et les cellules sont alternativement excitées (1Hz) à 340 et 380 nm en
utilisant un Lambda DG-4 Ultra High Speed Wavelenght Switcher (Sutter Instrument,
Novato, CA) couplé à un microscope inversé Zeiss Axiovert 200 M (Zeiss Belgium,
Zaventem, Belgique). Les images sont acquises avec une caméra Zeiss Axiocam couplée à un
filtre d’émission de 510 nm et analysées avec le logiciel Axiovision software. Lorsque le
rapport des intensités de fluorescence est déterminé, la concentration calcique intracellulaire
est calculée à l’aide la formule suivante :
[Ca2+]i = Kd [(R-Rmin) / (Rmax-R)] ß
où Kd est la constante d’affinité du complexe Fura-2/calcium (=227nm), R est le rapport des
intensités de fluorescence, mesuré dans les conditions expérimentales et corrigé pour
l’autofluorescence (Rrepos est défini en fin d’expérience après addition du Mn2+), Rmin est le
rapport minimal des intensités de fluorescence calculé après addition de 5 µM d’ionomycine
et lavage consécutif à l’EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid, à 2mM, pour chélater le
calcium restant), Rmax est le rapport maximal des intensités de fluorescence calculé après
addition d’une concentration saturante de calcium (0.25 M de CaCl2) et ß est le rapport des
valeurs de fluorescence obtenues en l’absence de calcium et à saturation de calcium pour
l’excitation à 380 nm.
4.4.2 Le patch clamp : mesure de l’activité du canal BKCa.
La technique de patch clamp permet d’enregistrer les courants ioniques de cellules uniques
en réponse à un stimulus chimique ou physique. Le dispositif expérimental est illustré dans la
Figure 36. Le principe de cette technique est d’approcher une micropipette en verre, dont le
diamètre à la pointe est de l’ordre du micromètre, d’une cellule. Lorsque la pipette est en
contact avec la cellule, une résistance importante va se créer suite aux propriétés d’adhérence
et d’interaction du verre avec la bicouche lipidique. Le contact ainsi formé est appelé « Seal »
et le morceau de membrane isolé sous la pointe de la pipette est désigné par le terme
« Patch ». La qualité de ce scellement électrique est contrôlée par la valeur de la résistance qui
doit être supérieure à 1GΩ. Ensuite, une pression négative brève avec un retour à la pression
normale rapide est appliquée afin de rompre la membrane (configuration « whole cell »,
Figure 37). La micropipette, qui contient un milieu intra-pipette (MIP) de composition
55
Figure 37 : Schéma de la configuration « whole cell » ou « cellule entière ». Afin de rompre
la membrane, une pression négative brève avec un retour à la pression normale rapide est
appliquée. Le milieu intracellulaire est ainsi dialysé par le MIP de composition connue
permettant le contrôle du milieu intracellulaire. Cette configuration donne un accès électrique
direct à l’intérieur de la cellule ce qui permet d’enregistrer les courants macroscopiques
générés par l’ensemble des canaux ioniques présents à la membrane (d’après Girault A.,
2011).
connue dans lequel baigne un fil d’argent chloruré, sert d’électrode de mesure et d’électrode
d’imposition du potentiel. En effet, les effets d’une molécule d’intérêt sur le courant
membranaire peuvent être mesurés suite à une imposition de voltage, ce qui correspond à la
configuration « voltage clamp ».
Les mesures d’activité du canal BKCa en présence d’ophioboline A ont été réalisées par le
Dr A. Girault sous la direction du Professeur C. Vandier (INSERM U1069, Laboratoire
Nutrition Croissance Cancer, Université de Tours, France) selon un protocole décrit
antérieurement (Roger et coll., 2004).
5. Analyses statistiques.
Dans ce travail, les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel STATISTICA
(StatSoft, Tulsa, Oklaoma, USA).
5.1 Comparaison de groupes de données.
Les conditions d’applicabilité des tests paramétriques (taille des échantillons, distribution
normale des données et égalité des variances) n’étant généralement pas remplies dans le cas
de nos expériences, nos analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de tests nonparamétriques. Plus précisément, nous avons utilisé le test de Mann-Whitney pour la
comparaison de deux groupes.
5.2 Analyse de survie.
Les analyses de survie ont été réalisées grâce au test de Kaplan-Meier. Ce type d’analyse
permet d’étudier la chronologie des apparitions d’un événement particulier dans le temps au
sein d’une population. Dans le cadre de ce travail, cet événement est la mort d’un animal lors
d’une expérience in vivo. La méthode de Kaplan-Meier permet ainsi d’établir des courbes de
survie entre différents groupes. Les courbes se construisent sous la forme d’escaliers dont les
paliers indiquent les intervalles de temps pendant lesquels il n’y a pas de décès. Les marches
indiquent les moments des décès et leur hauteur, la proportion des survivants à un moment
donné. Le test de Log-rank a ensuite été utilisé pour comparer ces courbes de survie. Le
principe de ce test est de comparer, dans chaque groupe, le nombre observé et le nombre
attendu d’évènements si la survie était identique dans les deux groupes sur l’ensemble de la
56
période étudiée. Il permet d’identifier s’il y a des différences significatives de survie entre les
groupes étudiés.
57
RÉSULTATS
RÉSULTATS
La nature constitue une ressource illimitée de molécules à potentiels thérapeutiques. Dans
le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux propriétés anticancéreuses de deux
métabolites secondaires extraits de champignons, la fusicoccine A et l’ophioboline A. Les
résultats que nous avons obtenus sont décrits dans les trois articles qui suivent.
58
RÉSULTAT - I
"Fusicoccin A, a phytotoxic carbotricyclic diterpene
glucoside of fungal origin, reduces proliferation and
invasion of glioblastoma cells by targeting multiple
tyrosine kinases".
Marina Bury, Anna Andolfi, Bernard Rogister, Alessio Cimmino, Véronique Mégalizzi,
Véronique Mathieu, Olivier Feron, Antonio Evidente and Robert Kiss
Translational Oncology, 2013
59
Résumé
Ce premier article décrit les effets anticancéreux de la fusicoccine A sur des cellules de
glioblastome. La fusicoccine A est le principal métabolite secondaire produit par le
champignon Fusicoccum amygdali, qui est responsable des chancres et du flétrissement des
rameaux des pêchers et des amandiers en Italie.
Dans ce travail, nous avons tout d’abord caractérisé la stabilité physicochimique de cette
molécule dans du milieu de culture sans sérum à 37°C pendant 3 jours. À la fin de l’analyse,
la fusicoccine A était encore présente à raison de 50 % dans l’échantillon. Cependant, nous
avons identifié deux produits de dégradation : le 3’-O-monodéacétyl-fusicoccine et le 19-Omonodéacétyl-fusicoccine.
L’activité inhibitrice de croissance in vitro de la fusicoccine A et de ses deux produits de
dégradation a été évaluée sur deux lignées cellulaires de gliome humain à l’aide du test
colorimétrique MTT. La lignée U373-MG de glioblastome est intrinsèquement résistante aux
stimuli pro-apoptotiques tandis que la lignée Hs683 d’oligodendrogliome est sensible à ceuxci. La concentration inhibitrice de croissance de 50 % (IC50) (après trois jours de mise en
présence des cellules avec le produit) de la fusicoccine A est de 92 µM sur la lignée U373MG et de 83 µM sur la lignée Hs683, indiquant qu’il n’y a pas de différence de sensibilité
entre ces deux lignées. Les indices IC50 des produits de dégradation étant compris entre 80 et
130 µM, seule la fusicoccine A a été étudiée dans les analyses pharmacologiques suivantes.
Par test colorimétrique MTT, nous avons également pu montrer que l’index de biosélectivité
entre cellules normales et cellules cancéreuses de cette molécule était supérieur à 10. En effet,
alors que la fusicoccine à une concentration de 100µM diminue de plus de 50 % la croissance
des cellules cancéreuses, elle ne diminue pas la croissance d’astrocytes normaux à une
concentration de 1 mM.
À l’aide de la microscopie à contraste de phase assistée par ordinateur, nous avons analysé
les effets inhibiteurs de croissance de la fusicoccine A révélés par le test colorimétrique MTT.
Les cellules U373-MG traitées avec la fusicoccine A ont présenté des taux de croissance plus
faibles au cours du temps que les cellules contrôles, comme l’a révélé le calcul du rapport
entre la croissance globale des cellules traitées et celle des cellules contrôles (indice GGR).
Selon ces calculs de l'indice GGR, il est apparu que 100 µM de fusicoccine A pendant 72
heures diminue de ~ 60 % (GGR = 0,4) le taux de la croissance in vitro des cellules de
60
glioblastome. Les analyses quantitatives de vidéomicroscopie ont révélé que l'activité
d'inhibition de croissance de la fusicoccine A était liée à une diminution marquée des taux de
division et à une augmentation de la durée de celles-ci. Des études de microscopie par
fluorescence ont révélé que les modifications de l’organisation du cytosquelette d’actine
induites par la fusicoccine A expliquent en partie les effets cytostatiques de cette molécule et
la diminution de la migration des cellules U373-MG de glioblastome telles que révélées par la
vidéomicroscopie quantitative. De plus, cette molécule diminue aussi les capacités d'adhésion
de ces cellules gliales tumorales sur une matrice de Matrigel.
L'organisation du cytosquelette d'actine ainsi que le contrôle des caractéristiques invasives
des cellules de glioblastome dépendent de multiples voies de signalisation dans lesquelles
peuvent être impliquées des protéines kinases. À 50 µM, la fusicoccine A inhibe de plus de 50
% l'activité de 13 kinases sur les 288 analysées dans le cadre du présent travail. Nous avons
porté une attention particulière à la kinase d’adhérence focale (FAK) car elle est importante
dans l'acquisition du phénotype agressif des glioblastomes en étant impliquée dans de
nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, l'invasion, l'angiogenèse et la survie.
Par western blot, nous avons mis en évidence que la fusicoccine A diminuait de manière
dose-dépendante l’autophosphorylation du résidu tyrosine 397 de la kinase FAK dans les
cellules U373-MG en conditions normoxiques et hypoxiques. Pour finir, nous avons
transfecté les cellules U373-MG avec le plasmide pCMV6-PTK2 afin de surexprimer la
kinase FAK dans ces cellules. Par test colorimétrique MTT, nous avons pu mettre en évidence
que l’indice IC50 de la fusicoccine A était doublé dans ces cellules surexprimant la kinase
FAK par rapport aux cellules contrôles, confirmant ainsi que la kinase FAK est associée, tout
au moins en partie, aux effets anticancéreux de la fusicoccine A.
En conclusion, la fusicoccine A présente une activité anticancéreuse intéressante en ciblant
la kinase FAK ce qui entraine une diminution de la prolifération et de la migration des
cellules gliales tumorales. En plus d’être biosélective, cette molécule peut également
maintenir son activité thérapeutique en conditions hypoxiques.
61
Tr a n s l a t i o n a l O n c o l o g y
Volume 6 Number 2
April 2013
pp. 112–123 112
www.transonc.com
Fusicoccin A, a Phytotoxic
Carbotricyclic Diterpene
Glucoside of Fungal Origin,
Reduces Proliferation and
Invasion of Glioblastoma
Cells by Targeting Multiple
Tyrosine Kinases1
Marina Bury*, Anna Andolfi†, Bernard Rogister‡,
Alessio Cimmino†, Véronique Mégalizzi*,
Véronique Mathieu*, Olivier Feron§,
Antonio Evidente† and Robert Kiss*
*Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie,
Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium;
†
Dipartimento di Scienze Chimiche, Complesso
Universitario Monte Sant’Angelo, Napoli, Italy;
‡
Laboratoire de Neurobiologie du Développement,
GIGA-Neurosciences, Université de Liège, Sart-Tilman B,
Belgium; §Pole of Pharmacology and Therapeutics
(UCL-FATH), Angiogenesis and Cancer Research
Laboratory, Institut de Recherche Expérimentale
et Clinique, Université Catholique de Louvain (UCL),
Brussels, Belgium
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) is a deadly cancer that possesses an intrinsic resistance to pro-apoptotic insults,
such as conventional chemotherapy and radiotherapy, and diffusely invades the brain parenchyma, which renders
it elusive to total surgical resection. We found that fusicoccin A, a fungal metabolite from Fusicoccum amygdali,
decreased the proliferation and migration of human GBM cell lines in vitro, including several cell lines that exhibit
varying degrees of resistance to pro-apoptotic stimuli. The data demonstrate that fusicoccin A inhibits GBM cell proliferation by decreasing growth rates and increasing the duration of cell division and also decreases two-dimensional
(measured by quantitative video microscopy) and three-dimensional (measured by Boyden chamber assays) migration. These effects of fusicoccin A treatment translated into structural changes in actin cytoskeletal organization and
a loss of GBM cell adhesion. Therefore, fusicoccin A exerts cytostatic effects but low cytotoxic effects (as demonstrated by flow cytometry). These cytostatic effects can partly be explained by the fact that fusicoccin inhibits the
activities of a dozen kinases, including focal adhesion kinase (FAK), that have been implicated in cell proliferation
and migration. Overexpression of FAK, a nonreceptor protein tyrosine kinase, directly correlates with the invasive
phenotype of aggressive human gliomas because FAK promotes cell proliferation and migration. Fusicoccin A led
to the down-regulation of FAK tyrosine phosphorylation, which occurred in both normoxic and hypoxic GBM cell
culture conditions. In conclusion, the current study identifies a novel compound that could be used as a chemical
template for generating cytostatic compounds designed to combat GBM.
Translational Oncology (2013) 6, 112–123
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM; World Health Organization grade IV)
is the most common malignant primary brain tumor in adults and
children and is associated with a dismal prognosis. The mean survival
time after the current standard treatment that includes a combination
of neurosurgery, radiotherapy, and concomitant chemotherapy with
temozolomide (TMZ) is only 15 months [1–3]. The low survival rate
for patients with GBM reflects the inability to achieve total surgical
Address all correspondence to: Robert Kiss, PhD, Laboratoire de Toxicologie, Faculté de
Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, Campus de la Plaine, Boulevard du Triomphe,
1050 Brussels, Belgium. E-mail: [email protected]
1
M.B. has a FRIA grant from the Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS,
Brussels, Belgium) and R.K. is a Director of Research at the FNRS. The authors declare
no conflict of interest.
Received 14 November 2012; Revised 29 January 2013; Accepted 30 January 2013
Copyright © 2013 Neoplasia Press, Inc. All rights reserved 1944-7124/13/$25.00
DOI 10.1593/tlo.12409
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
resection, mainly because GBM cells possess the ability to invade the
surrounding normal brain and have a high propensity for recurrence
[2–5]. GBMs are characterized by a number of genetic and signaling
abnormalities that ultimately lead to uncontrolled cellular proliferation and invasion, angiogenesis, necrosis, and resistance to cytotoxic
therapies [2–5]. Among these aberrancies are an abnormal activation of
the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT and Ras/Raf/mitogenactivated protein kinase (MAPK) signal transduction pathways [2].
Therefore, to improve the prognosis of patients with GBM, it is essential
to find novel therapeutic agents that can manage the growth, invasion,
and progression of these tumor cells by interfering with signaling molecules or pathways that are critical for the malignant phenotype of gliomas,
including GBMs. Numerous clinical trials are currently investigating
the benefits of synthetic agents called targeted therapeutics [6–8].
Natural products are a valuable resource that could yield novel efficacious anticancer agents [9,10]. Various attempts have been made to
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
113
treat GBM patients with paclitaxel [11], a microtubule inhibitor, or
with irinotecan [12], a topoisomerase inhibitor, but these drugs have
had limited success, even when locally delivered to bypass the bloodbrain barrier. These compounds are cytotoxic and rapidly induce GBM
chemoresistance processes, including the activation of the multidrug
resistance phenotype [13]. In our research programs, we are searching
for novel natural compounds that display 1) growth inhibitory effects
in malignant glioma cells that exhibit varying degrees of resistance to
pro-apoptotic stimuli, 2) cytostatic rather than cytotoxic effects, and
3) bioselectivity between normal and tumor glial cells. The current
study shows that fusicoccin A fits these various criteria.
Fusicoccin A is the α-D-glucopyranoside of a carbotricyclic diterpene (Figure 1) that is the main phytotoxin produced by Fusicoccum
amygdali, the causative fungal agent of peach and almond canker
[14]. Several reports have previously described the biologic effects of
fusicoccin A in plant and mammalian cells. Fusicoccin A activates
Figure 1. Physicochemical stability of fusicoccin A. The determination of fusicoccin A (1) physicochemical stability and the identification of
its two major degradation products [3′-O-deacetyl fusicoccin (2) and 19-O-deacetyl fusicoccin (3)] when maintained for 3 days (B) at 37°C in
MEM compared to day 0 (A).
114
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
the plasma membrane H+-ATPase by stabilizing its binding to 14-3-3
proteins, which results in water loss and the wilting of infected plants
[15]. Bunney et al. [16] demonstrated that fusicoccin A–related signaling reveals 14-3-3 protein function as a novel step in left-right patterning during amphibian embryogenesis. Fusicoccin A also targets 14-3-3
proteins in cancer cells [17] and it promotes isoform-specific expression
of 14-3-3 proteins in human gliomas [18]. Takahashi et al. [17] found
that these 14-3-3 proteins play a critical role in serine/threonine kinase–
dependent signaling pathways through protein-protein interactions
with multiple phosphorylated ligands. Fusicoccin A also induces apoptosis in tumor cells by activating the tumor necrosis factor–related
apoptosis-inducing ligand pathway when it is applied to cells after or
combined with interferon-α priming [19]. Here, we report the bioselective effects of fusicoccin A between normal and tumor glial cells,
with fusicoccin A–mediated targeting of several kinases (that are implicated in the actin cytoskeleton organization) and a special emphasis on
focal adhesion kinase (FAK), which is implicated in GBM cell proliferation and migration phenotypes.
Materials and Methods
Fusicoccin A, 3′-O-Deacetyl Fusicoccin A, and
19-O-Deacetyl Fusicoccin A
Fusicoccin A was harvested from F. amygdali as reported previously
[20,21]. Fusicoccin A samples were purified by column chromatography
[eluent CHCl3-iso-PrOH (9:1)] and crystallized from EtOAc–n-hexane
as detailed previously [21]. The electrospray ionization–mass spectrometry (ESI-MS) spectrum of the major degradation product revealed a
molecular sodium cluster at 661 m/z, which corresponded to 3′-Odeacetyl fusicoccin A and this result was confirmed by the 1H nuclear
magnetic resonance (NMR) and electron impact–mass spectrometry
(EI-MS) spectra. The minor degradation product’s ESI-MS spectrum
displayed sodium and potassium cluster ions at m/z 661 and 677,
respectively. These data completed by 1H NMR analyses enabled the
identification of the structure as 19-O-deacetyl fusicoccin A.
To obtain sufficient amounts of these two degradation products
to test their in vitro growth inhibitory concentrations in glioma cell
lines (see below), both products were obtained from the deacetylation of fusicoccin A. Fusicoccin A (100 mg) was dissolved in 250 ml
of MeOH and left at 37°C for 1 week. Next, the solvent was evaporated under reduced pressure and the residue was purified by preparative thin-layer chromatography (TLC) and eluted with solvent
system A (see below) to yield 3′-O- and 19-O-deacetylfusicoccin A as
amorphous solids (70 and 9 mg, respectively).
Physicochemical Stability Analyses
Fusicoccin A stability in minimal essential cell culture medium (MEM)
was characterized at 37°C for 3 days. Fusicoccin A (100 μg/ml) was
prepared by diluting a DMSO stock solution in MEM (Invitrogen,
Merelbeke, Belgium). After 3 days of incubation at 37°C, the solution
was diluted with the appropriate solvent (see below) at 1 μg/ml final
concentration for analysis. For improved observation of the degradation
peaks, the volume injected into high-performance liquid chromatography (HPLC) D3 (V inj = 2X) was doubled compared to D0 (V inj = 1X).
The chromatograms were recorded on Agilent Technologies 1200 series
with a UV-VIS detector. The column used for this analysis was a C-18
HD, the solvent was CH3OH/H2O (7:3), the flow rate was 0.5 ml/min,
and λ = 220 nm. Analytical and preparative TLCs were performed on
silica gel (Merck, Darmstadt, Germany; Kieselgel 60 F254, 0.25 and
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
0.50 mm, respectively). The spots were visualized by exposure to UV light
and/or by first spraying them with a 10% H2SO4 solution in MeOH
and then with 5% phosphomolybdic acid in ethanol, which was followed
by heating at 110°C for 10 minutes. Solvent system (A) was CHCl3-iPrOH (93:7). 1H NMR spectra were recorded at 400 MHz in CDCl3
by Bruker spectrometers. ESI-MS spectra were recorded on Agilent
Technologies 1100 series quadrupole 6120 and the EI-MS spectra were
taken at 70 eV on a QP 5050 Shimadzu spectrometer.
Cell Lines, Culture Conditions, and Transfection
Cancer cell lines were obtained from the American Type Culture
Collection (ATCC, Manassas, VA). The U373-MG (ATCC code
HTB-17) human glioblastoma, the Hs683 (ATCC code HTB-138)
human oligodendroglioma, and the B16F10 (ATCC code CRL6475) mouse melanoma cell lines were cultured in RPMI (Invitrogen)
culture media supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum
(FCS; Invitrogen), 4 mM glutamine, 100 μg/ml gentamicin, and
penicillin-streptomycin (200 U/ml and 200 μg/ml; Invitrogen) at
5% CO2, 21% O2, and 37°C. Hypoxia (1% O2) was achieved as previously described [22]. For FAK overexpression, pCMV6-PTK2 (FAK)
and pCMV6-XL4 (control) from OriGene (Rockville, MD) were transfected into U373-MG cells with TurboFect (Fermentas, Waltham,
MA) as previously described [23]. Transfected cells were selected with
G418 (Invitrogen) at 300 μg/ml during 2 weeks. All cancer cell lines
used in this work have been previously cultured with DMSO concentrations up to 5% without any modifications in their growth levels when
compared to control cells.
Normal astrocytes were obtained from neonatal nuclear magnetic
resonance imaging (NMRI) mouse cortices that were freed of
meninges, minced into small pieces of tissue with microscissors, and
then suspended in MEM (Invitrogen) supplemented with 6 g/l glucose
and 10% FCS (Invitrogen). The cell suspension was then filtered
through 225- and 25-μm pore filters. The filtered cell suspension
was plated on an uncoated T25 flask for 72 hours. The medium
was then changed and the cells were grown until confluence. Control
astrocytes were exposed to the percentages of DMSO used in fusicoccin
A–related treated conditions.
Cell Growth Inhibition Assay
The colorimetric 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT) viability assay (Sigma, Bornem, Belgium) was used
to determine the overall growth rate of each cell line as previously
described [24]. The number of living cells was determined after 72 hours
of culture in the presence of fusicoccin A, 3′-O-deacetyl fusicoccin A,
or 19-O-deacetyl fusicoccin A. Fusicoccin A was also tested on mouse
astrocytes. Each experimental condition was performed in triplicate.
To investigate whether fusicoccin A–induced growth inhibitory
effects in glioma cells were irreversible or not, U373-MG and Hs683
cells were treated with 100 μM fusicoccin A and were washed after 3,
24, and 48 hours after treatment. The number of viable cells was determined 72 hours after having removed fusicoccin A from the culture
media. Each experimental condition was performed in six replicates.
Computer-assisted Phase-Contrast Microscopy
(Video Microscopy)
Using the human U373-MG GBM cell line, the effects of treatment
with 100 μM fusicoccin A on cell viability and cell division were characterized in vitro by computer-assisted phase-contrast video microscopy
as described elsewhere [25]. The cells were monitored for 72 hours.
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
Films were compiled from the obtained time-lapse image sequences,
which enabled a rapid screening of cell viability. Each experimental
condition was performed in triplicate.
Cell count–based determination of global growth ratio.
In each
(control or treated) condition, the cell growth rate was evaluated by the
ratio between the number of cells counted in the first and last frames of
the image sequences. The global growth ratio (GGR) was defined as the
ratio between the two growth levels obtained in the treated and control
conditions. All of the cell counts were performed in triplicate using an
interactive computer tool [25,26]. The GGRs were computed at the
24th, the 48th, and the 72nd hour of quantitative video microscopy
analyses by dividing the cell growth rate in fusicoccin A–treated
U373-MG cell populations by the cell growth rate at the same experimental times in the corresponding control U373-MG cell populations.
Specific analysis of cell division rate and duration.
Cells undergoing division exhibit very bright patterns compared to nondividing
cells. On the basis of this observation, we developed a custom division detection system that is capable of identifying cells undergoing
division in time-lapse sequences. This detection method is based on
an automatic event detection completed by an interactive validation/
correction procedure as previously described [25,26]. At the end of
the sequence analysis, all of the events are linked to different cell
divisions, which reveal the number of cell divisions as well as their
durations [25,26]. We computed the cell division numbers normalized by the number of cells that were counted in the first frame.
Quantitative determination of cell migration.
The effect of fusicoccin A (100 μM) on cell motility in the U373-MG GBM cell line
was investigated. Figure 5A shows typical analyses based on the individual cell trajectories that are established by a cell-tracking algorithm
based on an image series acquired during a cell migration experiment.
The greatest linear distance between a starting point of a cell and the
farthest point reached in its trajectory, also known as the maximum
relative distance from the point of origin (MRDO), was the quantitative variable used to characterize compound-mediated effects on cancer
cell migration [27].
Determination of In Vitro Cell Death
To evaluate viability in U373-MG cells that were treated with fusicoccin A, an assay measuring DNA fragmentation was used. The
terminal deoxynucleotidyl transferase–mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling (TUNEL) assay was performed according to
a procedure previously described [28,29] using the APO-Direct Kit
(BD Pharmingen, Erembodegem-Aalst, Belgium). The protocol was
performed according to the manufacturer’s instructions, including the
use of positive and negative controls. Briefly, U373-MG GBM cells
were treated with 100 μM fusicoccin A for either 24 or 72 hours in
culture media or left untreated. Adherent and nonadherent cells were
collected, fixed with 1% paraformaldehyde (1 hour) at 4°C, permeabilized, and stored in 70% ethanol at −20°C. TUNEL labeling was
performed for 1 hour at 37°C and the stained cells were analyzed
on a CellLab Quanta SC flow cytometer (Beckman Coulter, Analis,
Suarlee, Belgium).
Analyses of Actin Cytoskeletal Organization
U373-MG cells were cultured for 30 hours in the absence (controls)
or presence of 100 μM fusicoccin A on glass coverslips as previously
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
115
described [30]. Fluorescent phalloidin conjugated with the Alexa Fluor
488 fluorochrome (Molecular Probes, Invitrogen) was used to label
fibrillar actin, and Alexa Fluor 594–conjugated DNAse I (Molecular
Probes, Invitrogen) was used to stain globular actin. The coverslips
were mounted on microscope slides with 10 μl of Moviol agent
(Calbiochem, VWR, Heverlee, Belgium). Three coverslips per experimental condition were analyzed and three pictures were taken for
each coverslip (with the same exposure time) using an AxioCamHRm
fluorescent microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany). The most
representative images are shown in Figure 4B.
Boyden Chamber Assay
The invasive features of U373-MG cells treated with 50 and 100 μM
fusicoccin A for 24 hours in vitro were assessed using the Boyden
transwell invasion system (BD BioCoatMatrigel invasion chambers;
BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA) as detailed elsewhere [31]. In parallel, the same number of U373-MG cells were
seeded in 24-well plates coated with Matrigel, and we treated the cells
with 0 (control), 50, or 100 μM fusicoccin A for 24 hours. To normalize the number of invasive cells, the number of viable cells in each condition was determined. Each experiment was performed in triplicate.
In Vitro Adhesion Assay
The adhesion assay was performed as described previously [31] with
modifications. Briefly, glass coverslips in 24-well plates were precoated
with Matrigel (diluted 1:3 in RPMI culture media with 10% FCS) for
1 hour at 37°C. The wells were washed and nonspecific binding was
then blocked with 0.1% BSA in phosphate-buffered saline for 30 minutes. U373-MG cells (20,000 cells per well) were allowed to adhere for
24 hours at 37°C in the presence of either 0 (control), 50, or 100 μM
fusicoccin A, after which nonadherent cells were gently washed away
with warm phosphate-buffered saline. Adherent cells were methanolfixed, hematoxylin-stained, and counted in 10 fields per well at a G ×
10 magnification using an Olympus microscope (Olympus, Antwerp,
Belgium). Each experimental condition was performed in triplicate.
Kinase Activity Determination
We originally provided ProQinase (Freiburg, Germany) with fusicoccin A as a stock solution in 100% DMSO and aliquots were further
diluted with water in 96-well microliter plates directly before use. A
radiometric protein kinase assay (33PanQinase Activity Assay) was used
for measuring the kinase activity of 288 recombinant protein kinases
as detailed previously [32]. Fusicoccin A was tested in two replicates in
each kinase assay, and the final concentration tested was 50 μM.
Western Blot Analyses
U373-MG cells, either untreated (control) or treated with 25, 50,
or 100 μM fusicoccin A, were incubated under normoxic or hypoxic
conditions (see the Cell Lines, Culture Conditions, and Transfection
section). U373-MG cells were also treated with 100 μM CoCl2 for
4 hours as a positive control for the expression of hypoxia-inducible
factor-1alpha (HIF-1α). Proteins were extracted using the CelLytic
M Cell Lysis Reagent (Sigma) with 1 mM Na3VO4. An equal amount
of cell extract was resolved on a sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS-PAGE) gel and transferred to a polyvinylidene
fluoride (PVDF) membrane. The membranes were blocked with 5%
milk or BSA for at least 1 hour, followed by an overnight incubation
116
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
at 4°C with the following primary antibodies: phosphorylated FAK (diluted 1:100; R&D Systems, Minneapolis, MN), FAK (diluted 1:100;
R&D Systems), HIF-1α (diluted 1:200; Abcam, Cambridge, United
Kingdom), and tubulin (diluted 1:5000, Abcam). Secondary antibodies
were purchased from Pierce (Aalst, Belgium) and the blots were analyzed using the Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager and were quantified
with Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Nazareth Eke, Belgium). The
experiments were performed in two independent replicates.
Statistical Analysis
The data obtained from two independent groups were compared using
the nonparametric Mann-Whitney U test. The statistical analysis was
performed using Statistica software (StatSoft, Tulsa, OK). When the
number of experiments was less than n = 4, the mean ± SD was used.
Results
Characterization of Fusicoccin A Physicochemical Stability
Figure 1 shows that fusicoccin A [retention time (RT) = 19.5 minutes] generates two degradation products when it is maintained at 37°C
for 3 days in MEM culture media. The major degradation product
has been identified (with comparisons to the available standards) as
3′-O-deacetyl fusicoccin (RT = 14.7 minutes) and the minor product
as 19-O-deacetyl fusicoccin (RT = 17.4 minutes) using TLC, HPLC,
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
ESI-MS, EI-MS, and NMR analyses according to a methodology that
was previously validated [21]. The ESI-MS spectra of these degradation products revealed a molecular sodium cluster at 661 m/z, which
corresponded to 3′-O-deacetyl fusicoccin A, and sodium/potassium
cluster ions at m/z 661 and 677, which corresponded to 19-O-deacetyl
fusicoccin A, confirmed by the EI- and ESI-MS and 1H NMR. HPLC
analyses revealed that approximately 50% of fusicoccin A remained
after 3 days (D3) at 37°C in MEM (Figure 1B). The in vitro growth
inhibitory activities of fusicoccin A, 3′-O-deacetyl fusicoccin A, and
19-O-deacetyl fusicoccin A were determined by calculating the means
from the MTT colorimetric assay performed on U373-MG and Hs683
glioma cell lines as detailed below.
In Vitro Growth Inhibitory Effect of Fusicoccin A in Normal
versus Cancer Cell Lines
The in vitro growth inhibitory activity of fusicoccin A and its two
degradation products was assayed using an MTT colorimetric assay
on two human glioma cancer cell lines (Figure 2A). The U373-MG
cancer cell line displays varying degrees of resistance to pro-apoptotic
stimuli [33], while the human Hs683 oligodendroglioma cell line
(1p19q co-deleted) displays sensitivity to pro-apoptotic stimuli [34].
The inhibitory effect of fusicoccin A on in vitro growth was also analyzed in normal astrocytes (Figure 2B). We observed no differences
in terms of sensitivity to fusicoccin A and its degradation products
between the two glioma cell lines with distinct sensitivities to proapoptotic stimuli. We identified the in vitro concentration of each
Figure 2. Anticancer activity of fusicoccin A and its degradation products. (A) Characterization of the in vitro growth inhibitory effects
induced by fusicoccin A, 3′-O-deacetyl fusicoccin, and 19-O-deacetyl fusicoccin in two human glioma cell lines (U373-MG and Hs683).
(B) Characterization of the in vitro growth inhibitory effects induced by 100 μM fusicoccin A 72 hours after having cultured the cancer
cells for 3, 24, and 48 hours before washing out fusicoccin A. (C) Doubling time of U373-MG and Hs683 glioma cells versus normal
astrocytes. (D) Determination of fusicoccin A–related bioselectivity between normal (astrocytes) and tumor (Hs683 and U373-MG) cells
using the MTT colorimetric assay.
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
117
Figure 3. Fusicoccin A decreases proliferation of GBM cells. (A) Video microscopy–related illustrations of the effects of 100 μM fusicoccin A
on the U373-MG GBM cell line after 72 hours. (B) In vitro global growth rate determination (using the GGR assessment as described in
Materials and Methods section) of fusicoccin A–treated U373-MG cells compared to their control counterparts. (C) The number of cell
division events detected during the 0- to 24-, 24- to 48-, and 48- to 72-hour treatments of U373-MG cells with 100 μM fusicoccin A. The
relative number of divisions is the number of cell divisions counted and normalized by the number of cells counted in the first frame.
(D) The duration of cell division events detected during the 0- to 24-, 24- to 48-, and 48- to 72-hour treatments of U373-MG cells with
100 μM fusicoccin A. The data are reported as the median values ± the 25th to 75th percentiles calculated in triplicate.
of the three compounds that induced a 50% reduction in growth
(IC50) after culturing the cells for 3 days either in the presence or the
absence (control) of the drug of interest: the IC50 growth inhibitory
concentration of fusicoccin A was 92 μM in the U373-MG cells and
83 μM in the Hs683 glioma cells, whereas the IC50 ranged between 80
and 130 μM for the two degradation products in these two glioma
cell lines (Figure 2A). Therefore, we focused on fusicoccin A and its
potential anti-GBM effects, which become irreversible after 24 hours
of treatment (Figure 2B). For assessment of differential sensitivity between normal and tumor glial cells to fusicoccin A, normal astrocytes
showing similar doubling time as cancer cells under study were used
(Figure 2C ). We observed that 1 mM fusicoccin A treatment did
not significantly decrease the growth of normal astrocytes, whereas
100 μM fusicoccin A treatment decreased the growth of the two tumor
glial cell lines by approximately 50% (Figure 2D). As the inhibitory
activity of fusicoccin A on in vitro growth was analyzed in human
glioma cell lines while the bioselectivity was determined in normal
mouse astrocytes, we also determined that fusicoccin A inhibited
in vitro growth with an IC 50 of ∼70 μM in mouse melanoma
B16F10 cells to rule out differences that could relate to interspecies
features. This result indicates that mouse and human cancer cells dis-
play similar sensitivity to fusicoccin A. Therefore, the bioselectivity
index between normal and tumor astrocytes is >10.
Fusicoccin A Displays Cytostatic Effects through an Increase
in the Duration of Cell Division in GBM Cells
Fusicoccin A induces cytostatic effects in U373-MG GBM cells,
which is demonstrated in Figure 3A. Using quantitative video microscopy analyses, we validated the growth inhibitory effects of fusicoccin A
on U373-MG cells that were observed in the MTT colorimetric assay.
Indeed, Figure 3B shows that fusicoccin A–treated U373-MG cells
displayed lower growth kinetic rates over time when compared with
control cells as measured by calculating GGR indices. According to
these GGR index calculations, 100 μM fusicoccin A treatment for
72 hours decreased the in vitro growth rate of U373-MG GBM cells
by approximately 60% (GGR = 0.4). Quantitative video microscopy
analyses also revealed that the growth inhibitory activity of fusicoccin
A was essentially due to cytostatic effects, including a marked decrease
in the mitotic rate of U373-MG GBM cells (Figure 3B) and an increased duration of cell division (Figure 3C). Indeed, the cell division
duration increased by 40 minutes in U373-MG GBM cells over the
118
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
72-hour period of 100 μM fusicoccin A treatment compared to control
cells (P < .001).
Fusicoccin A–treated U373-MG GBM Cells Display Marked
Modifications in the Actin Cytoskeletal Organization and
Few Cell Deaths Only
The morphologic changes observed in Figure 4A (a arrows) show an
elongated morphology of the U373-MG cells, suggesting cytoskeletal
changes. Fluorescence microscopy analyses confirmed that fusicoccin A
induced modifications in the actin cytoskeletal organization in these
cells (Figure 4B). Indeed, the levels of polymerized actin (green fluorescence) increased in U373-MG GBM cells after 30 hours of 100 μM
fusicoccin A treatment (Figure 4B). In contrast, as morphologically
illustrated in Figure 4A (b arrows), few cell deaths occur over the
72-hour period of fusicoccin A treatment as confirmed by flow
cytometry (FCM)/TUNEL analyses. The data in Figure 4C show
that fewer than 20% of the U373-MG cells treated with 100 μM
fusicoccin A for 72 hours underwent DNA degradation processes.
Fusicoccin A Affects the Migration Characteristics of
U373-MG GBM Cells
The dynamic organization of the F-actin cytoskeleton and the
regulation of focal adhesion assembly and disassembly are essential
processes required for efficient movement in cell migration. There-
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
fore, we analyzed the effects of fusicoccin A on the migration of
U373-MG cells. As shown in Figure 5, A and B (quantitative video
microscopy), fusicoccin A decreased both two-dimensional and threedimensional (Figure 5, C and D; Boyden chamber assay) migration
features of U373-MG GBM cells. The reduction in the number of
invading cells was not due to a decrease in cell proliferation or cytotoxicity because 1) as shown in Figure 5D, the number of invading
cells was normalized by the number of living cells counted in both the
control and fusicoccin A–treated conditions after a 24-hour period and
2) we show that fusicoccin A also decreased the adhesion of U373-MG
cells cultured on Matrigel in a dose-dependent manner (Figure 5,
E and F ).
Fusicoccin A Inhibits the Activity of Various Kinases,
Including FAK
Actin cytoskeletal organization and the invasive and adhesive characteristics of cells, in particular GBM cells, depend on multiple signaling pathways, including various protein kinases [35,36]. At 50 μM, a
concentration we tested in the invasion and adhesion assays (Figure 5)
that is weaker than the in vitro IC50 growth inhibitory concentrations
(92 μM in U373-MG and 83 μM in Hs683 glioma cells), fusicoccin A
decreased the activities of 13 (Figure 6A) of 288 kinases analyzed by
50%, especially tyrosine kinase (Figure 6B). As detailed later in the
Discussion section, of these 13 kinases targeted by fusicoccin A, we
Figure 4. Fusicoccin A is a cytostatic compound. (A) The panel represents illustrations of the morphologic changes of U373-MG cells
treated with 100 μM fusicoccin A after 30 and 72 hours compared to the untreated cells; a arrows represent the elongation of U373-MG
cells treated with fusicoccin A after 30 hours and b arrows indicate dead cells after 72 hours. (B) Fluorescence microscopy was employed
to visualize the fibrillar (polymerized) actin in green and the globular (unpolymerized) actin in red. The effects of 100 μM fusicoccin A were
monitored during 30 hours and compared to untreated cells. (C) FCM-related analyses (TUNEL) of the percentages of apoptotic U373-MG
GBM cells that were treated for 24 and 72 hours with 100 μM fusicoccin A. The positive and negative controls were furnished by the manufacturer of the TUNEL kit and are presented above the graph. The data are reported as the mean values ± SD calculated in triplicate.
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
119
Figure 5. Fusicoccin A decreases migration of GBM cells. (A) The evaluation of the antimotility activity of fusicoccin A in U373-MG GBM
cells. The motility of individual cells treated with 100 μM fusicoccin A for 24 hours was quantified by establishing the trajectory of each cell
centroid and by quantifying the MRDO variable (the maximum distance covered by a cell and normalized by its observation time, expressed
in μm/h). (B) The distribution of MRDO values obtained for U373-MG cells treated with 100 μM fusicoccin A for 24 hours compared to the
untreated cells. The data are reported as the median values ± the 25th to 75th percentiles calculated in triplicate. (C) The panel represents
illustrations of the U373-MG invasive cells that were either untreated or treated with 50 or 100 μM fusicoccin A for 24 hours. (D) Quantification of the in vitro invasive activity of U373-MG cells either untreated or treated with fusicoccin A in Boyden chambers coated with
Matrigel. The cells that penetrated through the Matrigel to the lower surface of the filters were stained. The number of invasive cells was
counted in 10 fields per chamber (the chamber surface includes 30 fields), and the experiment was conducted in triplicate. The sum of the
10 values was used to calculate the percentage of invasive cells in the population, and the control invasion rate was normalized to the
number of counted cells as 100%. We also normalized the invasion rate by the number of counted cells treated with 50 and 100 μM fusicoccin A. The results are expressed as the mean values ± SD calculated in triplicate. (E) Quantification of the in vitro adhesive activity of
U373-MG cells that were either untreated or treated with fusicoccin A. The cells that adhered on Matrigel supports were stained and then
determined by microscopy. The number of adhesive cells was counted in 10 fields per glass coverslip and the experiment was conducted
in triplicate. The sum of the 10 values was used to calculate the percentage of adhesive cells in the population, and the control adhesion rate
was reported to be 100%. The results are expressed as the mean values ± SD calculated in triplicate. (F) The panel represents illustrations
of the U373-MG adhesive cells either untreated or treated with 50 or 100 μM fusicoccin A for 24 hours.
focused specifically on FAK because 1) it is an important player in the
acquisition of the aggressive phenotype of GBM cells and 2) our data
show FAK’s potential implication in the defect of cell adhesion
(Figure 5E). Moreover, FAK is implicated in proliferation, morphology
modification, migration, invasion, adhesion, angiogenesis, and cancer
cell survival features [37–44].
Fusicoccin A Inhibits FAK Phosphorylation of U373-MG
GBM Cells in Both Normoxic and Hypoxic Conditions
FAK is activated by autophosphorylation of tyrosine 397, which
is necessary for FAK-induced cell invasion [37–40]. To determine
whether FAK is involved in the fusicoccin A–induced inhibition of
U373-MG cell invasion and adhesion, we performed immunoblot
120
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
experiments using a phosphorylation-specific antibody against FAK
in both normoxic and hypoxic cell culture conditions. We analyzed
FAK activity in both normoxic and hypoxic conditions because it has
been previously shown that the activated form of FAK is increased in
GBM cells grown in hypoxic conditions [43] [see also phosphorylated
focal adhesion kinase (pFAK) signals in normoxic versus hypoxic conditions in untreated cells in Figure 7C].
First, we determined whether the in vitro IC50 of fusicoccin A in
U373-MG cells (as determined above) differed in normoxic versus
hypoxic conditions. As shown in Figure 7A, this was not the case. In
addition, as shown in Figure 7C, at concentrations ranging from 25 to
100 μM, fusicoccin A reduced FAK phosphorylation at tyrosine 397
under both normoxic and hypoxic conditions in a dose-dependent
manner. We also verified that hypoxic conditions were actually induced
Figure 6. Characterization of fusicoccin A–induced anti-kinase activity. (A) In vitro anti-kinase profiles of fusicoccin A. The data are
presented as the means ± SD values calculated in duplicate. (B) A
schematic illustration of the kinases in the human dendrogramrelated kinome that were targeted at 50 μM fusicoccin A with analyses of <50% of kinase residual activity. The various classes of kinases
included tyrosine kinases (TK), tyrosine kinase–like kinases (TKL),
serine/threonine protein kinases (STE), casein kinases (CK1), cyclic
adenosine monophosphate (cAMP)–dependent protein kinases
(AGC), calcium/calmodulin protein kinase II kinases (CAMK), and the
CMGC subclass, which includes cyclin-dependent kinase, MAPK,
glycogen synthase kinase, and cyclin-dependent kinase–like groups
of kinases.
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
in U373-MG GBM cells by confirming the increase in HIF-1α expression in GBM cells maintained under 1% O2 conditions (Figure 7B).
FAK Overexpression in U373-MG Cells Reduces
Fusicoccin A–Induced Growth Inhibition
To confirm that FAK is actually associated with the in vitro growth
inhibitory activity of fusicoccin A, U373-MG cells were transfected
with pCMV6-PTK2 (FAK) or with pCMV6-XL4 (control) and then
their growth levels in the presence or the absence (control) of fusicoccin
A was evaluated by means of the MTT colorimetric assay. FAK overexpression after transfection was confirmed by Western blot analysis
(Figure 7D). As shown in Figure 7E, FAK overexpression in U373-MG
cells reduced by about two times the in vitro growth inhibitory effects
induced by fusicoccin A.
Discussion
GBM is currently an incurable disease with a median survival time of
approximately 15 months [3]. The search for low–molecular weight
drugs that target growth-related kinases, especially tyrosine kinases,
has become an attractive area of research that aims to identify new
therapies that can extend the survival and standard of life of patients
with cancer [36]. In this report, fusicoccin A was identified as an inhibitor of several kinases, including FAK. Because FAK is a key molecule
that is necessary for cell proliferation, migration, angiogenesis, and
invasion during cancer progression [37–44], FAK, in addition to other
kinases implicated in the control of the actin cytoskeletal organization,
could potentially be a target in GBMs [45].
In the current study, the anticancer activity of fusicoccin A, a
phytotoxic carbotricyclic diterpene glucoside of fungal origin, was characterized in glioma cells. First, we analyzed whether fusicoccin A displays bioselectivity between normal and tumor glial cells, and the data
clearly indicated that the bioselectivity level is at least above 10. The
bioselectivity of fusicoccin A therefore suggests that it could be used
to target cancer cells alone, with minor effects on normal surrounding
tissues. In addition, we observed the same in vitro sensitivity to fusicoccin A on two glioma cell lines despite their different levels of resistance to pro-apoptotic stimuli. The fact that fusicoccin A overcomes,
at least partly, the intrinsic resistance of GBM cells to pro-apoptotic
stimuli relates to the cytostatic, not cytotoxic, properties of this compound. Indeed, we demonstrated that the fusicoccin A–induced growth
inhibitory effects in malignant glioma cells are related to an increase in
the duration of cell division.
Fusicoccin A–induced cytostatic effects occur through modifications of actin cytoskeletal organization, a feature that, in turn, can be
explained in part by the fact that fusicoccin A inhibits the activity of
several kinases necessary for controlling actin cytoskeletal organization.
Indeed, inhibiting various protein kinases, such as FAK and ephrins
(four of them are targeted by fusicoccin A; Figure 6A), perturbs Rho
GTPase signaling and therefore alters actin cytoskeletal organization
through the Rho/ROCK-dependent formation of actin stress fibers
[46,47]. Lamalice et al. demonstrated that the activation of the tyrosine
kinase receptor, vascular endothelial growth factor receptor 2 (also targeted by fusicoccin A; Figure 6A), by vascular endothelial growth factor
leads to actin polymerization and reorganization into stress fibers in
endothelial cells [48]. Another kinase inhibited by fusicoccin A is C-Src
kinase (CSK), which plays a critical role in mediating G-protein signaling in actin cytoskeletal reorganization [49]. Therefore, the majority of
the dozen of kinases impaired by fusicoccin A (Figure 6A) are tyrosine
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
121
Figure 7. Characterization of fusicoccin A–induced anti-kinase activity, with a focus on FAK. (A) Determination of the in vitro IC50 of fusicoccin A in U373-MG cells cultured under normoxic and hypoxic conditions using the MTT colorimetric assay. The data are reported as
the mean values ± SD calculated in triplicate. (B) U373-MG cells were incubated under normoxic versus hypoxic conditions for 24 hours.
CoCl2-treated U373-MG cells were used as a positive control for HIF-1α expression. Total cell lysates were resolved on SDS-PAGE
and immunoblotted with the anti–HIF-1α antibody. (C) U373-MG cells either untreated or treated with 25, 50, or 100 μM fusicoccin A
for 24 hours were incubated under normoxic or hypoxic culture conditions. Total cell lysates were resolved on SDS-PAGE and immunoblotted with anti–pFAK, total anti-FAK, and anti-tubulin antibodies. The Western blot bands have been digitized, and quantitative data
below the Western blot bands represent the number of pixels of the pFAK band multiplied by pixel intensity, the final result of which
has been normalized to the corresponding tubulin band. (D) Immunoblot analysis demonstrated FAK overexpression in U373-MG cells when
transfected with pCMV6-PTK2 (FAK); pCMV6-XL4 was used for control. The Western blot bands have been digitized, and quantitative
data below the Western blot bands represent the number of pixels of the FAK band multiplied by pixel intensity, the final result of which
has been normalized to the corresponding tubulin band. (E) Characterization of the in vitro growth inhibitory effects induced by fusicoccin A
in U373-MG cells transfected with pCMV6-XL4 (control) and pCMV6-PTK2 (FAK).
kinases (Figure 6B), which are involved in the migratory and invasive
features of malignant glioma cells [44,46,50–53].
Of the various kinases that are impaired by fusicoccin A, we focused
on FAK, which is a nonreceptor cytoplasmic tyrosine kinase that is
recruited at an early stage to focal adhesions [39]. Various stimuli
can induce activation of FAK by autophosphorylation on a particular
tyrosine residue, Y397, including integrin and growth factor receptor
engagement [39]. Activated FAK creates a high-affinity binding site
for Src homology 2 domain–containing proteins that subsequently
interact with a number of downstream signaling proteins such as the
adaptor protein Grb2 and PI3K [37,39]. Consequently, FAK plays
a critical role in malignant GBM cell behavior because it is involved
in the regulation of GBM cell growth and survival through the acti-
vation of the PI3K/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR)
and the extracellular signal–regulated kinase/MAPK signaling pathways
[2,37]. Furthermore, several studies report that FAK is overexpressed in
cancer cells, including GBM cells, and that the status of FAK correlates
with tumor progression and poor clinical outcomes [44,54]. On the
basis of the central function of FAK and its ability to regulate different
pathways implicated in dismal prognosis of GBM, FAK represents a
target of interest, which is further reinforced by the failure of receptor
tyrosine kinase inhibitors.
In GBMs, necrotic foci are surrounded by “pseudopalisading” cells,
which are severely hypoxic [55]. Hypoxia in GBM is correlated with
aggressiveness and invasiveness by the switch in metabolism, resistance
to apoptosis, and neovascularization. All of these phenomena induce
122
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
the apparition of TMZ resistance in hypoxic areas [56]. Furthermore,
GBM cells are maintained by cancer stem cells that are inherently
radiotherapy and chemotherapy resistant and may be preserved in vivo
in a niche characterized by hypoxia [57,58]. Thus, testing fusicoccin A
in different in vitro and in vivo models containing cancer stem cells, to
prove the activity of our molecule on this subtype of cells, would
be interesting. Moreover, Skuli et al. [43] have also shown that the
integrin/FAK pathway is involved in hypoxic regulation in GBMs. In
our report, we found that the hypoxic state of GBM cells does not
impair in vitro fusicoccin A–induced growth inhibitory activity or its
inhibitory effects on FAK activity.
Finally, it should be emphasized that the coefficient partition of
fusicoccin A in hydrophilic/lipophilic solutions is more favorable than
that of most natural antitumor compounds. Indeed, the theoretical predicted log P value (software calculation) of fusicoccin A is 3.4, which
suggests that this compound should be able to cross the blood-brain
barrier without the need to tremendously adapt its formulation.
In conclusion, this report identifies fusicoccin A, a fungal metabolite,
as an in vitro cytostatic and antimigratory compound in human GBM
cells that display varying degrees of resistance to pro-apoptotic stimuli.
Importantly, fusicoccin A maintains its therapeutic activity in targeting FAK, at least partly, even under hypoxic conditions and displays
bioselectivity between normal and tumor glial cells. Altogether, these
data open new perspectives for GBM treatment and in particular
warrant further studies examining the in vivo effects of fusicoccin A
on TMZ-resistant brain tumors.
Acknowledgments
We thank Benjamin Lallemand and Laurenne Petit for their excellent
technical assistance.
References
[1] Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A,
Scheithauer BW, and Kleihues P (2007). The 2007 WHO classification of
tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol 114, 97–109.
[2] Furnari FB, Fenton T, Bachoo RM, Mukasa A, Stommel JM, Stegh A, Hahn
WC, Ligon KL, Louis DN, Brennan C, et al. (2007). Malignant astrocytic glioma:
genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev 21, 2683–2710.
[3] Stupp R, Hegi ME, Mason WP, van den Bent MJ, Taphoorn MJ, Janzer RC,
Ludwin SK, Allgeier A, Fisher B, Belanger K, et al. (2009). Effects of radiotherapy
with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the
EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol 10, 459–466.
[4] Louis DN (2006). Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol
1, 97–117.
[5] Parsons DW, Jones S, Zhang X, Lin JC, Leary RJ, Angenendt P, Mankoo P,
Carter H, Siu IM, Gallia GL, et al. (2008). An integrated genomic analysis of
human glioblastoma multiforme. Science 321, 1807–1812.
[6] Yung WK, Vredenburgh JJ, Cloughesy TF, Nghiemphu P, Klencke B, Gilbert
MR, Reardon DA, and Prados MD (2010). Safety and efficacy of erlotinib in firstrelapse glioblastoma: a phase II open-label study. Neuro Oncol 12, 1061–1070.
[7] De Fazio S, Russo E, Ammendola M, Donato Di Paola E, and De Sarro G
(2012). Efficacy and safety of bevacizumab in glioblastomas. Curr Med Chem
19, 972–981.
[8] Gilbert MR, Kuhn J, Lamborn KR, Lieberman F, Wen PY, Mehta M,
Cloughesy T, Lassman AB, Deangelis LM, Chang S, et al. (2012). Cilengitide
in patients with recurrent glioblastoma: the results of NABTC 03-02, a phase II
trial with measures of treatment delivery. J Neurooncol 106, 147–153.
[9] Greve H, Mohamed IE, Pontius A, Kehraus S, Gross H, and Konig GM (2010).
Fungal metabolites: structural diversity as incentive for anticancer drug development. Phytochem Rev 9, 537–545.
[10] Newman DJ and Cragg GM (2012). Natural products as sources of new drugs
over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod 75, 311–335.
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
[11] Fountzilas G, Karavelis A, Capizzello A, Kalogera-Fountzila A, Karkavelas G,
Zamboglou N, Selviaridis P, Foroglou G, and Tourkantonis A (1999). Radiation
and concomitant weekly administration of paclitaxel in patients with glioblastoma
multiforme. A phase II study. J Neurooncol 45, 159–165.
[12] Vredenburgh JJ, Desjardins A, Reardon DA, and Friedman HS (2009). Experience
with irinotecan for the treatment of malignant glioma. Neuro Oncol 11, 80–91.
[13] Fruehauf JP, Brem H, Brem S, Sloan A, Barger G, Huang W, and Parker R
(2006). In vitro drug response and molecular markers associated with drug
resistance in malignant gliomas. Clin Cancer Res 12, 4523–4532.
[14] Ballio A, Chain EB, De Leo P, Erlanger BF, Mauri M, and Tonolo A (1964).
Fusicoccin: a new wilting toxin produced by Fusicoccum amygdali. Nature 203,
297.
[15] Mackintosh C (2004). Dynamic interactions between 14-3-3 proteins and
phosphoproteins regulate diverse cellular processes. Biochem J 381, 329–342.
[16] Bunney TD, De Boer AH, and Levin M (2003). Fusicoccin signaling reveals
14-3-3 protein function as a novel step in left-right patterning during amphibian
embryogenesis. Development 130, 4847–4858.
[17] Takahashi M, Kawamura A, Jato N, Nishi T, Hamachi I, and Ohkanda J
(2012). Phosphopeptide-dependent labeling of 14-3-3ζ proteins by fusicoccinbased fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl 51, 509–512.
[18] Yang X, Cao W, Lin H, Zhang W, Lin W, Cao L, Zhen H, Huo J, and Zhang
X (2009). Isoform-specific expression of 14-3-3 proteins in human astrocytoma.
J Neurol Sci 276, 54–59.
[19] de Vries-van Leeuwen IJ, Kortekaas-Thijssen C, Nzigou Mandouckou JA, Kas S,
Evidente A, and de Boer AH (2010). Fusicoccin-A selectively induces apoptosis in
tumor cells after interferon-α priming. Cancer Lett 293, 198–206.
[20] Ballio A, Carilli A, Santurbano B, and Tuttobello L (1968). Produzione di fusicoccina in scala pilota. Ann Ist Super Sanita 4, 317–332.
[21] Evidente A, Andolfi A, Fiore A, Boari A, and Vurro M (2006). Stimulation of
Orobanche ramosa seed germination by fusicoccin derivatives: a structure-activity
relationship study. Phytochemistry 67, 19–26.
[22] Martinive P, De Wever J, Bouzin C, Baudelet C, Sonveaux P, Grégoire V,
Gallez B, and Feron O (2006). Reversal of temporal and spatial heterogeneities
in tumor perfusion identifies the tumor vascular tone as a tunable variable to
improve drug delivery. Mol Cancer Ther 5, 1620–1627.
[23] Lee S, Qiao J, Paul P, O’Connor KL, Evers BM, and Chung DH (2012). FAK
is a critical regulator of neuroblastoma liver metastasis. Oncotarget.
[24] Mosmann T (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65,
55–63.
[25] Debeir O, Mégalizzi V, Warzée N, Kiss R, and Decaestecker C (2008). Videomicroscopic extraction of specific information on cell proliferation and migration
in vitro. Exp Cell Res 314, 2985–2998.
[26] Mégalizzi V, Decaestecker C, Debeir O, Spiegl-Kreinecker S, Berger W, Lefranc F,
Kast RE, and Kiss R (2009). Screening of anti-glioma effects induced by sigma-1
receptor ligands: potential new use for old anti-psychiatric medicines. Eur J Cancer
45, 2893–2905.
[27] Debeir O, Van Ham P, Kiss R, and Decaestecker C (2005). Tracking of migrating
cells under phase-contrast video microscopy with combined mean-shift processes.
IEEE Trans Med Imaging 24, 697–711.
[28] Le Calvé B, Lallemand B, Perrone C, Lenglet G, Depauw S, Van Goietsenoven G,
Bury M, Vurro M, Herphelin F, Andolfi A, et al. (2011). In vitro anticancer
activity, toxicity and structure-activity relationships of phyllostictine A, a natural
oxazatricycloalkenone produced by the fungus Phyllosticta cirsii. Toxicol Appl
Pharmacol 254, 8–17.
[29] Lallemand B, Chaix F, Bury M, Bruyère C, Ghostin J, Becker JP, Delporte C,
Gelbcke M, Mathieu V, Dubois J, et al. (2011). N -(2-{3-[3,5-bis(trifluoromethyl)
phenyl]ureido}ethyl)-glycyrrhetinamide (6b): a novel anticancer glycyrrhetinic
acid derivative that targets the proteasome and displays anti-kinase activity.
J Med Chem 54, 6501–6513.
[30] Mégalizzi V, Mathieu V, Mijatovic T, Gailly P, Debeir O, De Neve N, Van
Damme M, Bontempi G, Haibe-Kains B, Decaestecker C, et al. (2007). 4-IBP, a
sigma1 receptor agonist, decreases the migration of human cancer cells, including
glioblastoma cells, in vitro and sensitizes them in vitro and in vivo to cytotoxic
insults of proapoptotic and proautophagic drugs. Neoplasia 9, 358–369.
[31] Le Mercier M, Fortin S, Mathieu V, Roland I, Spiegl-Kreinecker S, HaibeKains B, Bontempi G, Decaestecker C, Berger W, Lefranc F, et al. (2009).
Galectin 1 proangiogenic and promigratory effects in the Hs683 oligodendroglioma model are partly mediated through the control of BEX2 expression.
Neoplasia 11, 485–496.
Translational Oncology Vol. 6, No. 2, 2013
[32] Lamoral-Theys D, Wauthoz N, Heffeter P, Mathieu V, Jungwirth U, Lefranc F,
Nève J, Dubois J, Dufrasne F, Amighi K, et al. (2012). Trivanillic polyphenols
with anticancer cytostatic effects through the targeting of multiple kinases and
intracellular Ca2+ release. J Cell Mol Med 16, 1421–1434.
[33] Gomez-Manzano C, Fueyo J, Kyritsis AP, McDonnell TJ, Steck PA, Levin VA,
and Yung WK (1997). Characterization of p53 and p21 functional interactions
in glioma cells en route to apoptosis. J Natl Cancer Inst 89, 1036–1044.
[34] Dittmann LM, Danner A, Gronych J, Wolter M, Stühler K, Grzendowski M,
Becker N, Bageritz J, Goidts V, Toedt G, et al. (2012). Downregulation of
PRDX1 by promoter hypermethylation is frequent in 1p/19q-deleted oligodendroglial tumours and increases radio- and chemosensitivity of Hs683 glioma
cells in vitro. Oncogene 31, 3409–3418.
[35] Carragher NO and Frame MC (2004). Focal adhesion and actin dynamics:
a place where kinases and proteases meet to promote invasion. Trends Cell Biol
14, 241–249.
[36] Traxler P (2003). Tyrosine kinases as targets in cancer therapy—successes and
failures. Expert Opin Ther Targets 7, 215–234.
[37] McLean GW, Carragher NO, Avizienyte E, Evans J, Brunton VG, and Frame
MC (2005). The role of focal-adhesion kinase in cancer—a new therapeutic
opportunity. Nat Rev Cancer 5, 505–515.
[38] Zhao X and Guan JL (2003). Focal adhesion kinase and its signaling pathways
in cell migration and angiogenesis. Adv Drug Deliv Rev 63, 610–615.
[39] Parsons JT (2003). Focal adhesion kinase: the first ten years. J Cell Sci 116,
1409–1416.
[40] Kim LC, Song L, and Haura EB (2009). Src kinases as therapeutic targets for
cancer. Nat Rev Clin Oncol 6, 587–595.
[41] Xu LH, Owens LV, Sturge GC, Yang X, Liu ET, Craven RJ, and Cance WG
(1996). Attenuation of the expression of the focal adhesion kinase induces
apoptosis in tumor cells. Cell Growth Differ 7, 413–418.
[42] Gabarra-Niecko V, Schaller MD, and Dunty JM (2003). FAK regulates biological processes important for the pathogenesis of cancer. Cancer Metastasis Rev
22, 359–374.
[43] Skuli N, Monferran S, Delmas C, Favre G, Bonnet J, Toulas C, and CohenJonathan Moyal E (2009). αvβ3/αvβ5 Integrins-FAK-RhoB: a novel pathway for
hypoxia regulation in glioblastoma. Cancer Res 69, 3308–3316.
[44] Natarajan M, Hecker TP, and Gladson CL (2003). FAK signaling in anaplastic
astrocytoma and glioblastoma tumors. Cancer J 9, 126–133.
Fusicoccin-Induced FAK Inhibition in Glioblastoma
Bury et al.
123
[45] Reardon DA, Rich JN, Friedman HS, and Bigner DD (2006). Recent advances
in the treatment of malignant astrocytoma. J Clin Oncol 24, 1253–1265.
[46] Nakada M, Hayashi Y, and Hamada J (2011). Role of Eph/ephrin tyrosine
kinase in malignant glioma. Neuro Oncol 13, 1163–1170.
[47] Torsoni AS, Marin TM, Velloso LA, and Franchini KG (2005). RhoA/ROCK
signaling is critical to FAK activation by cyclic stretch in cardiac myocytes. Am J
Physiol Heart Circ Physiol 289, 1488–1496.
[48] Lamalice L, Houle F, Jourdan G, and Huot J (2004). Phosphorylation of
tyrosine 1214 on VEGFR2 is required for VEGF-induced activation of Cdc42
upstream of SAPK2/p38. Oncogene 23, 434–445.
[49] Lowry WE, Huang J, Ma YC, Ali S, Wang D, Williams DM, Okada M, Cole
PA, and Huang XY (2002). Csk, a critical link of g protein signals to actin
cytoskeletal reorganization. Dev Cell 2, 733–744.
[50] Angers-Loustau A, Hering R, Werbowetski TE, Kaplan DR, and Del Maestro
RF (2004). SRC regulates actin dynamics and invasion of malignant glial cells in
three dimensions. Mol Cancer Res 2, 595–605.
[51] Wadhwa S, Nag TC, Jindal A, Kushwaha R, Mahapatra AK, and Sarkar C
(2003). Expression of the neurotrophin receptors Trk A and Trk B in adult
human astrocytoma and glioblastoma. J Biosci 28, 181–188.
[52] Sjöström S, Wibom C, Andersson U, Brännström T, Broholm H, Johansen C,
Collatz-Laier H, Liu Y, Bondy M, Henriksson R, et al. (2011). Genetic variations
in VEGF and VEGFR2 and glioblastoma outcome. J Neurooncol 104, 523–527.
[53] Lipinski CA, Tran NL, Menashi E, Rohl C, Kloss J, Bay RC, Berens ME, and
Loftus JC (2005). The tyrosine kinase pyk2 promotes migration and invasion of
glioma cells. Neoplasia 7, 435–445.
[54] Siesser PM and Hanks SK (2006). The signaling and biological implications of
FAK overexpression in cancer. Clin Cancer Res 12, 3233–3237.
[55] Rong Y, Durden DL, Van Meir EG, and Brat DJ (2006). ‘Pseudopalisading’
necrosis in glioblastoma: a familiar morphologic feature that links vascular pathology, hypoxia, and angiogenesis. J Neuropathol Exp Neurol 65, 529–539.
[56] Pistollato F, Abbadi S, Rampazzo E, Persano L, Della Puppa A, Frasson C, Sarto E,
Scienza R, D’avella D, and Basso G (2010). Intratumoral hypoxic gradient drives stem
cells distribution and MGMT expression in glioblastoma. Stem Cells 28, 851–862.
[57] Bar EE (2011). Glioblastoma, cancer stem cells and hypoxia. Brain Pathol 21,
119–129.
[58] Frosina G (2011). Frontiers in targeting glioma stem cells. Eur J Cancer 47,
496–507.
RÉSULTAT - II
"Ophiobolin A, a sesterterpenoid fungal phytotoxin,
displays higher in vitro growth-inhibitory effects in
mammalian than in plant cells and it also displays in vivo
antitumor activity".
Marina Bury, Esther Novo-Uzal, Anna Andolfi, Sara Cimini, Nathalie Wauthoz,
Petra Heffeter, Benjamin Lallemand, Fabiana Avolio, Cédric Delporte, Alessio Cimmino,
Jacques Dubois, Pierre Van Antwerpen, Maria Chiara Zonno, Maurizio Vurro,
Yves Poumay, Walter Berger, Antonio Evidente, Laura De Gara, Robert Kiss, Vittoria Locato
International Journal of Oncology, 2013, sous presse
62
Résumé
Les effets de l’ophioboline A sur la croissance à la fois des cellules végétales et animales
sont décrits dans ce second article. Cependant, seule l’activité de l’ophioboline A sur les
cellules animales, qui a été étudiée au sein de notre laboratoire et qui fait partie du sujet de
cette thèse, sera abordée. Les expériences concernant les cellules végétales ont été réalisées
par l’équipe du Dr L. De Gara (Centro Integrato di Ricerca, Università Campus Bio-Medico,
Roma, Italy).
Les ophiobolines sont des métabolites secondaires de type sesterterpénoïde, produits par
des champignons phytopathogènes, principalement du genre Bipolaris. Ils contaminent de
nombreuses cultures comme le riz, le maïs et le sorgho provoquant des taches brunes au
niveau des feuilles. L’ophioboline A a été le premier métabolite de ce groupe à être identifié.
Dans ce travail, nous avons caractérisé les effets biologiques de cette molécule sur des
cellules animales normales et cancéreuses d’origine histologique diverse.
Suite à l’analyse de la stabilité physicochimique, nous avons pu montrer que l’ophioboline
A se dégradait légèrement (< 30 %) en milieux biologiques purs (sans sérum) après 7 jours à
37°C et entrainait l’apparition d’un produit de dégradation, identifié comme le 3-anhydro-6epi-ophioboline A.
Afin d’étudier l’activité inhibitrice de croissance in vitro de l’ophioboline A et de son
produit de dégradation, nous avons utilisé quatre lignées cellulaires cancéreuses en test
colorimétrique MTT. Les lignées cellulaires humaines A549 (cancer du poumon non à petites
cellules) et SKMEL-28 (mélanome) sont intrinsèquement résistantes aux stimuli proapoptotiques tandis que la lignée cellulaire humaine Hs683 (oligodendrogliome) et la lignée
cellulaire murine B16F10 (mélanome) sont sensibles à ceux-ci. Les concentrations inhibitrices
de croissance de 50 % (IC50) de l’ophioboline A, étant comprises entre 0.3 et 0.6 µM,
montrent qu’il n’y a pas de différence de sensibilité entre ces quatre lignées. Par contre,
comme le 3-anhydro-6-epi-ophioboline A a montré une activité anti-tumorale plus de 30 fois
inférieure à celle de l’ophioboline A, nous avons décidé de ne pas l’inclure dans la suite de
nos tests pharmacologiques. Quatre primocultures de kératinocytes en conditions de
confluence et de sous-confluence ont également été utilisées en test colorimétrique MTT.
Nous avons pu montrer que l’ophioboline A avait des indices IC50 sur les kératinocytes sousconfluents légèrement plus élevés que ceux observés sur les lignées cellulaires cancéreuses.
63
Cependant, lorsque nous avons utilisé les kératinocytes confluents, les indices IC50 étaient
entre 5 et 10 fois plus élevés, suggérant que l’ophioboline A joue probablement un rôle au
niveau des mécanismes de prolifération cellulaire. Ces résultats sont cohérents avec ceux que
nous avons obtenus en microscopie à contraste de phase assistée par ordinateur. En effet, nous
avons pu observer que dans les premières 24 heures de traitement, l’ophioboline A diminuait
la prolifération des cellules Hs683. Ce n’est qu’après 48 heures de traitement que cette
molécule commençait à induire la mort de ces cellules Hs683.
Alors que l’ophioboline A induit des effets cytotoxiques sur les cellules cancéreuses après
72 heures, elle n’est pas le substrat de pompes à efflux impliquées dans le phénotype de
résistance multi-drogue. Plus précisément, l’ophioboline A montre la même activité
inhibitrice de croissance in vitro sur les cellules du carcinome d’ovaire A2780 sensibles et
résistantes au cisplatine, sur les cellules du cancer du poumon à petites cellules GLC-4
sensibles et résistantes à l’adriamycine ainsi que sur des cellules de leucémie sensibles et
résistantes à la mitoxantrone, à la vincristine et à l’adriamycine. Ces lignées résistantes sont
connues pour exprimer de nombreux transporteurs ABC. L’activité de l’ophioboline A est
également similaire sur les cellules du cancer du côlon HCT-116 possédant une protéine p53
fonctionnelle ou au contraire déficiente.
Pour finir, nous avons analysé le pouvoir anti-tumoral in vivo de l’ophioboline A en
utilisant un modèle murin de mélanome métastatique. Nous avons pu mettre en évidence que
l’ophioboline A injectée en intrapéritonéal à 10 mg/kg augmentait de manière significative la
survie des souris traitées avec cette molécule par rapport aux souris contrôles.
En conclusion, l’ophioboline A possède une activité anticancéreuse in vitro, notamment en
diminuant la prolifération de lignées cellulaires cancéreuses sensibles ou résistantes aux
stimuli apoptotiques ou ayant acquis un phénotype de résistance multi-drogue. De plus, cette
molécule est également active in vivo.
64
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
Ophiobolin A, a sesterterpenoid fungal phytotoxin, displays
higher in vitro growth-inhibitory effects in mammalian than
in plant cells and displays in vivo antitumor activity
MARINA BURY1*, ESTHER NOVO-UZAL6*, ANNA ANDOLFI7, SARA CIMINI6, NATHALIE WAUTHOZ2,
PETRA HEFFETER8, BENJAMIN LALLEMAND3, FABIANA AVOLIO7, CÉDRIC DELPORTE4,
ALESSIO CIMMINO7, JACQUES DUBOIS3, PIERRE VAN ANTWERPEN4,5, MARIA CHIARA ZONNO9,
MAURIZIO VURRO9, YVES POUMAY10, WALTER BERGER8, ANTONIO EVIDENTE7,
LAURA DE GARA6, ROBERT KISS1 and VITTORIA LOCATO6
1
Laboratoire de Toxicologie, 2Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie, 3Laboratoire de Chimie BioAnalytique,
Toxicologie et Chimie Physique Appliquée, 4Laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique and 5Plate-Forme Analytique,
Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium; 6Centro Integrato di Ricerca,
Università Campus Bio-Medico, Rome; 7Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Napoli Federico II,
Complesso Universitario Monte S. Angelo, I-80126 Naples, Italy; 8Department of Medicine I, Institute of Cancer Research,
Medical University Vienna, Vienna, Austria; 9Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari,
Consiglio Nazionale delle Ricerche, Bari, Italy; 10Cell and Tissue Laboratory,
URPHYM, Université de Namur, Namur, Belgium
Received February 2, 2013; Accepted March 21, 2013
DOI: 10.3892/ijo.2013.1979
Abstract. Ophiobolin A, a sesterterpenoid produced by
plant pathogenic fungi, was purified from the culture extract
of Drechslera gigantea and tested for its growth-inhibitory
Correspondence to: Dr Vittoria Locato, Centro Integrato di
Ricerca, Università Campus Bio-Medico di Roma, Via Alvaro del
Portillo 21, I-00128 Rome, Italy
E-mail: [email protected]
Dr Robert Kiss, Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie,
Université Libre de Bruxelles (ULB), Campus de la Plaine, CP205/1,
Boulevard du Triomphe, 1050 Brussels, Belgium
E-mail: [email protected]
*
Contributed equally
Abbreviations: CTAB, hexadecyltrimethylammonium bromide;
DHR, dihydrorhodamine; EI-MS, electron ionization mass
spectrometry; ESI-MS, electrospray ionization mass spectrometry;
HPLC,
high-performance
liquid
chromatography;
HR,
hypersensitive response; MDR, multidrug resistance; LC-MS, liquid
chromatography-mass spectroscopy; MEM, minimal essential
media; MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide; NMR, nuclear magnetic resonance; NSCLC, non-small
cell lung cancer; OD, optical density; PCD, programmed cell death;
PCV, package cell volume; SD, standard deviation; TBY-2, Nicotiana
tabacum L. cv. Bright-Yellow 2; TLC, thin layer chromatography
Key words: ophiobolin A, plant cells, mammalian cells, cytotoxicity,
in vivo antitumor activity
activity in both plant and mammalian cells. Ophiobolin A
induced cell death in Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2
(TBY-2) cells at concentrations ≥10 µM, with the TBY-2 cells
showing typical features of apoptosis-like cell death. At a
concentration of 5 µM, ophiobolin A did not affect plant cell
viability but prevented cell proliferation. When tested on
eight cancer cell lines, concentrations <1 µM of ophiobolin A
inhibited growth by 50% after 3 days of culture irrespective of
their multidrug resistance (MDR) phenotypes and their resistance levels to pro-apoptotic stimuli. It is, thus, unlikely that
ophiobolin A exerts these in vitro growth-inhibitory effects
in cancer cells by activating pro-apoptotic processes. Highly
proliferative human keratinocytes appeared more sensitive
to the growth-inhibitory effects of ophiobolin A than slowly
proliferating ones. Ophiobolin A also displayed significant
antitumor activity at the level of mouse survival when assayed
at 10 mg/kg in the B16F10 mouse melanoma model with lung
pseudometastases. Ophiobolin A could, thus, represent a novel
scaffold to combat cancer types that display various levels
of resistance to pro-apoptotic stimuli and/or various MDR
phenotypes.
Introduction
Ophiobolins are secondary metabolites belonging to the
family of sesterterpenoid compounds and are produced by
phytopathogenic fungi, mainly of the genus Bipolaris. Their
discovery filled the gap between diterpenes (C20), which
have four isoprene units and triterpenes (C30), which have
six isoprene units (1). Ophiobolin A was the first member of
the group to be isolated and characterized in the mid-1960s
2
BURY et al: OPHIOBOLIN A VERSUS PLANT AND MAMMALIAN CELL TOXICITY
(2,3). Currently, 25 biogenic ophiobolins have been identified and marine-derived fungal ophiobolins were recently
identified and demonstrated to inhibit the biofilm formation of
Mycobacterium species (4).
Ophiobolin-producing terrestrial fungi attack several
crops, such as rice, maize and sorghum, by causing brown spot
lesions on the leaves. These fungi mainly attack monocotyledons, but they can also attack various herbaceous dicotyledon
species, although grass weeds proved to be more sensitive to
the phytotoxins (5). The interest in Bipolaris spp. and their
bioactive metabolites derives from their previous implication
in two devastating plant disease epidemics: the Bengal rice
famine in India in 1943 and the Southern corn leaf blight
epidemic in the USA in 1972 (1).
Ophiobolins can lead to cell death in plants through
multiple mechanisms of action, including inhibition of root
and coleoptile growth in wheat seedlings, inhibition of seed
germination, changes in cell membrane permeability, stimulation of β-cyanin leakage, releases of electrolytes and glucose
from the roots and decreases in photosynthetic CO2-fixation,
which cause respiratory changes and enhance stomatal opening
(reviewed in ref. 1). Ophiobolin A is able to inhibit protein and
nucleic acid synthesis or act as an inhibitor of β-1,3-glucan
synthetase in plant cells (1).
While a body of information on the deleterious effects of
ophiobolin A in plants is already available, only a few of these
reports mention the anticancer effects of ophiobolin A and
these reports are limited to in vitro studies. Cytotoxic effects
were reported for ophiobolin A (6,7) and ophiobolin O (8) but
not for ophiobolin I (6) in various cancer cell lines.
The present study further aims to characterize ophiobolin A-mediated effects on cell proliferation versus cell
death in normal plant (tobacco) versus normal mammalian
cells and then in mammalian cancer cells.
cells. A 10-3 M solution of ophiobolin A was prepared from a
stock solution in DMSO (10-2 M) diluted in minimal essential
cell culture medium (MEM) (Invitrogen, Merelbeke, Belgium)
and used for growing mammalian cells. After 7 days of incubation at 37˚C, the solution was diluted with the appropriate
solvent (see below) to a final concentration of 10 -5 M; it was
analyzed by LC-MS and compared to freshly prepared ophiobolin A (10 -5 M) and 3-anhydro-6-epi-ophiobolin (10 -5 M)
solutions, this latter being a degradation product of the main
metabolite. The LC-MS analyses were performed using an
Agilent RRLC-UV-VIS 1200 series coupled to a quadrupole
time-of-flight mass spectrometer (Q-TOF) 6520 (Palo Alto,
CA, USA). The LC conditions were the same as for the purity
test described above. ESI-Q-TOF parameters were as follows:
positive mode; high resolution acquisition mode (4 GHz);
gas temperature of 350˚C; drying gas flow rate of 11 l/min;
nebulizer pressure of 50 psig; capillary voltage of 4500 V;
skimmer voltage of 150 V; MS scan range and rate, 50-1,700
at 2 spectra/s. The data were acquired and analyzed using the
Mass Hunter Acquisition® and Qualitative Analysis® software,
respectively (Agilent Technologies).
The ophiobolin A stability in tobacco cell culture media
was monitored for 4 days. Solutions of 5x10 -6 M and 10 -5 M
ophiobolin A were incubated in the same conditions as the
plant cell culture (modified Linsmaier and Skoog media on
a rotary shaker at 130 rpm at 27˚C in the dark; see below for
details). At one-day intervals, the stability of ophiobolin A
and the generation of degradation products were assayed
as described below. The chromatograms were recorded on
Agilent Technologies 1200 series UV-VIS detector. The
column used was C18 HD 250x4.6-mm I.D. Nucleosil 100-5
(Macherey-Nagel, GmbM & Co. KG, Duren, Germany). The
solvents were CH3OH:H2O (8:2), with a flow rate of 0.5 ml/
min and λ = 240 nm.
Materials and methods
Ophiobolin A and plant cells
Growing conditions, mitotic index and viability of plant cells.
A suspension of tobacco (Nicotiana tabacum L. cv BrightYellow 2) cells, hereafter referred to as TBY-2 cells, was
routinely propagated and cultured at 27˚C, according to Nagata
et al (9). A stationary culture was diluted 4:100 (v:v) and cultured
for 3 days as described by Vacca et al (10). An ethanolic solution
of ophiobolin A was used for the treatments. The final concentration of ethanol in the media never exceeded 0.2%.
Cell growth was evaluated by optical density at 600 nm
(11) and by package cell volume (PCV), which is the ratio
between the cell volume after centrifugation at 250 x g for
6 min and the total suspension volume (12).
TBY-2 cell viability was measured using trypan blue
staining and cell morphology was investigated by means of a
phase contrast light microscope, as described previously (13).
The mitotic index was calculated as the percentage of cells
undergoing mitosis. For this assay, TBY-2 cells were stained
with Hoechst 33258, as reported in Houot et al (14) and visualized using a fluorescence microscope (DMLS, Leica, Wetzlar,
Germany) with an excitation filter of 340-380 nm and a barrier
filter of 410 nm.
Ophiobolin A production and stability
Fungus. A strain of Drechslera gigantea (Heald & Wolf)
was used to produce ophiobolin A. This fungus is stored in
the Fungal Collection at the Institute of Sciences of Food
Production in Bari, Italy (# ITEM 7004) and it was previously
reported to produce ophiobolin A (5). The fungus was grown
and maintained on Petri dishes containing PDA (potatodextrose-agar, Oxoid, UK).
Production, extraction and purification of ophiobolin A.
Ophiobolin A was produced by growing the fungus, extracted
from the fungal culture, purified and its identity confirmed as
described previously (5). The ophiobolin A purity (>95%) was
confirmed by RP-HPLC-UV. HPLC analyses were performed
on an Agilent 1100 series HPLC system (Agilent, Diegem,
Belgium). The chromatographic system was a C8 SunFire
150x4.6-mm I.D., 3.5-µm particle size (Waters, Milford, MA,
USA). The solvents were CH3OH:TFA 0.1% in water (65:35),
with a flow rate of 0.75 ml/min and λ = 240 nm.
Physicochemical stability measurements for ophiobolin A.
The stability of ophiobolin A was assayed by using the same
conditions used for the growth of both mammalian and plant
Nuclear morphology and DNA fragmentation analysis.
The nuclear morphology of the TBY-2 cells was analyzed
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
by staining the cells with Hoechst 33258 and visualized as
previously described (14). The DNA from the TBY-2 cells was
isolated according to the CTAB method described by Edwards
et al (15). DNA fragments were separated by electrophoresis
on a 1.5% (w/v) agarose gel and then visualized by staining
with ethidium bromide as detailed previously (16).
H2O2 production in plant cells. The extracellular release of
hydrogen peroxide (H2O2) was determined by measuring the
absorbance at 560 nm of the Fe3+-xylenol orange complex,
according to Locato et al (13). The intracellular production of
H2O2 was also observed by staining the cells with the fluorescent probe dihydrorhodamine (DHR) 123 (17) and visualized
using a fluorescence microscope with an excitation filter of
450-490 nm and a barrier filter of 510 nm.
Ophiobolin A and mammalian cells
Determination of in vitro growth-inhibitory activity in normal
human cells. Normal human adult keratinocytes were isolated
and grown as detailed previously (18). At ~40% culture confluence, the keratinocytes were grown under autocrine conditions
by excluding all of the growth factors from the culture media;
2 days later, hyperproliferating undifferentiated cultures were
analyzed while still subconfluent (SC). After four additional
days of incubation, the cultures had become confluent (C)
and were analyzed as differentiating cultures; in these culture
conditions, confluent cultures are growth-arrested and express
suprabasal markers of epidermal differentiation (19,20).
The in vitro global growth levels of SC versus C keratinocytes that were left untreated (control) or treated with
ophiobolin A were determined by means of the MTT colorimetric assay, as detailed below.
Determination of the in vitro growth-inhibitory activity in
mouse and human cancer cells. Three human and one mouse
cancer cell lines were obtained from the American Type
Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) and from the
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Germany). The three human cancer
cell lines were the A549 non-small cell lung cancer cell line
(NSCLC; DSMZ code ACC107), the SKMEL-28 melanoma
cell line (ATCC code HTB-72) and the Hs683 oligodendroglioma (ATCC code HTB-138) cell line; the mouse cancer cell
line used was the B16F10 melanoma (ATCC code CRL-6475)
model, which was also assayed in vivo as detailed below. The
cells were cultured in RPMI (Invitrogen) media supplemented
with 10% heat-inactivated fetal calf serum (Invitrogen), 4 mM
glutamine, 100 µg/ml gentamicin and penicillin-streptomycin
(200 U/ml and 200 µg/ml; Invitrogen). The overall growth
level of each cell line was determined using the colorimetric
MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium
bromide, Sigma, Belgium) assay as previously described
(18,21). The data are presented as the means ± SD values
obtained from three experiments, each of which was performed
on six replicates.
Multidrug resistant (MDR) cancer cell cultures. Human cell
lines and their chemoresistant sub-lines used in this study were
obtained as described below. The pro-myelocytic leukemia
HL60 cell line and its P-glycoprotein overexpressing sub-lines
3
that have been rendered resistant to adriamycin (HL60/adr),
vincristine (HL60/vinc) or mitoxantrone (HL60/mx) (22,23)
were generously donated by Dr M. Center (Kansas State
University, Manhattan, KS, USA). The A2780 ovarian carcinoma cell line and its variant that is resistant to cisplatin were
obtained from Sigma-Aldrich. The small cell lung carcinoma
cell line GLC4 and its MRP1- and LRP-overexpressing adriamycin-resistant sub-line GLC4/ADR (24,25) were generously
donated by Dr E.G. deVries (Groningen, The Netherlands).
The human colon cancer HCT116 p53 wild-type cell line and
its p53 (-/-) delete clone (26) were generously donated by Dr B.
Vogelstein (John Hopkins University, Baltimore, MD, USA).
Immunoblotting validation of overexpressed ABC transporters and p53 deletion are available upon request. All cell
lines were cultured in RPMI-1640 media supplemented with
10% fetal bovine serum, with the exception of HCT116 cells,
which were grown in McCoy's media. In case of the resistant
sub-lines, the respective selective drug was added as detailed
previously (23,25).
For the cell viability assays, 2x103 cells in 100 µl were
plated into individual wells in 96-well plates and allowed to
attach for 24 h. Appropriate concentrations of ophiobolin A
were added to the wells in another 100 µl of growth media for
72 h. The proportion of viable cells at the end of the treatment
was then determined by means of the MTT assay colorimetric
assay, as in the previous section.
Computer-assisted phase-contrast microscopy analyses.
Direct visualization of ophiobolin A-induced effects on the
cell proliferation and morphology of human Hs683 glioma
cells was performed by means of time-lapse computer-assisted
phase contrast microscopy, i.e., quantitative videomicroscopy,
as detailed previously (27,28).
Characterization of in vivo ophiobolin A-mediated anticancer
activity. B16F10 melanoma pulmonary pseudometastases were
obtained by i.v. (lateral tail vein) injection of 2.5x105 B16F10
cells (200 µl), as we detailed previously (29). The B16F10
melanoma cells used for these in vivo experiments were also
assayed in vitro with respect to ophiobolin A-mediated growthinhibitory effects (Table II). As we only had limited amounts
of ophiobolin A available, we referred to the published data to
select the doses to be administered to the mice. The LD50 doses
of ophiobolin A for mice are 238 mg/kg when administered
subcutaneously, 21 mg/kg when administered intraperitoneally, 12 mg/kg when administered intravenously and 73 mg/kg
when administered orally (1). A suspension of microcrystalline
ophiobolin A in 0.9% NaCl was intraperitoneally administered at 5 and 10 mg/kg to the B16F10 melanoma-bearing
mice three times a week (Monday, Wednesday, Friday) for
three consecutive weeks. Treatments began on the 5th day
after the tumor grafting procedure. Each experimental group
included 10 mice. Mouse survival was checked daily, while
mouse weight was recorded three times per week (Monday,
Wednesday, Friday). Each B16F10 melanoma-bearing mouse
was sacrificed either when it had lost 20% of its weight
compared to its weight at the time of the tumor graft or if it was
suffocating. The animal experiment used 6-week-old female
B6D2F1 mice (18-22 g; Charles Rivers, Arbresle, France) and
was performed on the basis of authorization no. LA1230568
4
BURY et al: OPHIOBOLIN A VERSUS PLANT AND MAMMALIAN CELL TOXICITY
Figure 1. The stability of ophiobolin A in MEM culture media. Ophiobolin A was present at 97% at day 0 (D0). After 7 days of incubation at 37˚C in MEM,
some of the ophiobolin A was degraded to 3-anhydro-6-epi-ophiobolin A.
Table I. Ophiobolin A stability in TBY-2 plant cell culture media over time.a
Time (days)
1
2
3
4
Starting solution 5 µM
Starting solution 10 µM
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Ophiobolin A
3-anhydro-6-epi-ophi-A
Ophiobolin A
3-anhydro-6-epi-ophi-A
93±1
78±2
72±1
59±2
7±1
22±1
27±1
41±2
92±1
76±1
71±2
57±1
7±2
24±1
29±2
43±1
The production of 3-anhydro-6-epi-ophiobolin A (3-anhydro-6-epi-ophi-A) by ophiobolin A degradation was measured over time by incubating ophiobolin A at two different concentrations in TBY-2 culture media and in the same cell growth conditions (at 27˚C in the dark on a
rotary shaker at 130 rpm). The amounts of ophiobolin A and 3-anhydro-6-epi-ophiobolin A were assayed over time as described in Materials
and methods. The results are expressed as the percentage of ophiobolin A present at time 0 and are the mean values ± SD of three different
experiments.
a
from the Animal Ethics Committee of the Federal Department
of Health, Nutritional Safety and the Environment (Belgium).
Statistical analyses. Survival analyses were carried out by
means of Kaplan-Meier curves, which were compared with
the log-rank test. All the statistical analyses were performed
using Statistica (StatSoft, Tulsa, OK, USA). The data from
the in vitro experiments were statistically analyzed via the
one-way ANOVA test using the Sigma Plot software (Systat
Software Inc., San Jose, CA, USA).
Results
Characterization of ophiobolin A stability. The physicochemical stability of ophiobolin A was analyzed in the two
culture conditions in order to establish whether the different
sensitivities of plant and animal cells to ophiobolin A were
due to the compound itself or to its degradation product(s)
in the culture media used for animal and plant cell growth.
The data show that ophiobolin A can be almost completely
recovered immediately after its dissolution in MEM as a major
peak corresponding to 97% of the sesterterpenoid (peak 1;
Fig. 1). One major degradation product was obtained when
ophiobolin A was maintained for 7 days at 37˚C in MEM
culture media (peak 2; Fig. 1); this product has been identified as 3-anhydro-6-epi-ophiobolin A (Fig. 1) by means of
TLC (with comparisons to the available standards), ESI-MS,
EI-MS and NMR analyses, according to the previously
reported spectroscopic data (5). HPLC analyses revealed that
71% of ophiobolin A remained after one week (D7) at 37˚C in
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
5
Table II. Characterization of the in vitro growth-inhibitory activity (MTT colorimetric assay) of ophiobolin A and 3-anhydro6-epi ophiobolin A on four cancer cell lines.a
Mean IC50 in vitro growth inhibitory concentration (µM) ± SD
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Cancer cells displaying
Cancer cells displaying
various levels of resistance
actual sensitivity to
to pro-apoptotic stimuli
pro-apoptotic stimuli
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Compound
A549
SKMEL28
Hs683
B16F10
Ophiobolin A
3-anhydro-6-epi ophiobolin A
0.42±0.01
30±1
0.37±0.03
27.0±0.4
0.62±0.04
30±3
0.29±0.05
22±3
Global mean IC50 ± SD
0.4±0.1
27±4
Treatments were performed for 72 h. The data are presented as the mean ± SD from three experiments, with each experiment having six
replicates.
a
Figure 2. The effects of ophiobolin A on TBY-2 cell growth. TBY-2 cells
in exponential phases were incubated with different concentrations of ophiobolin A. (A) PCV, an indicator of the increase in cell number and volume,
was measured. (B) Time course of the growth rate of the TBY-2 control cells
and the ophiobolin A-treated cells; the latter were washed and re-cultured
in fresh ophiobolin A-free media after 24 h of treatment with 5 µM ophiobolin A. These values are the mean of three independent experiments ± SD.
MEM (Fig. 1). A minor peak of 3% was observed at D0 and
remained stable up to 7 days. This minor peak corresponds to
an unidentified compound; however, the ophiobolin A used in
the present study was 97% pure.
The degradation of ophiobolin A was faster in TBY-2 plant
cell culture media (Table I) than in mammalian MEM (Fig. 1).
Indeed, after 4 days of incubation, ~40% of the ophiobolin A
was degraded to 3-anhydro-6-epi-ophiobolin A (Table I).
Plant cell sensitivity to ophiobolin A. Ophiobolin A affected
plant cell growth, with 5 µM being the lowest concentration
required for altering culture growth (Fig. 2A). At this concentration, ophiobolin A completely blocked the growth of TBY-2
cells, as the package cell volume (PCV) remained unchanged
over time, while lower ophiobolin A concentrations did not
alter TBY-2 growth (Fig. 2A). Similar results were obtained
by measuring cell culture growth via monitoring the increase
in optical density (OD) at 600 nm of the cell suspension (data
not shown). Analysis of the mitotic index confirmed that 5 µM
ophiobolin A blocked cell division, reducing the number of
cells undergoing mitosis by 69±5% 24 h post-treatment.
TBY-2 cells regained their proliferative ability when they
were washed and cultured in ophiobolin A-free media after
24 h of 5 µM ophiobolin A treatment, even if a weak but nevertheless statistically significant delay in reaching the exponential
phase was observed (*p<0.05; Fig. 2B). Higher concentrations
of ophiobolin A (10 and 20 µM) showed similar effects on cell
growth when compared to treatment with 5 µM ophiobolin A
but also caused cell death, as detailed below.
The effects of ophiobolin A and its degradation product
3-anhydro-6-epi-ophiobolin A on TBY-2 plant cell viability
were analyzed using the trypan blue assay, as the trypan blue
dye selectively enters dead cells. The data from this analysis
revealed that ophiobolin A was lethal for TBY-2 cells at
concentrations ≥10 µM (Fig. 3A). Indeed, TBY-2 cell viability
was almost negligible 24 h after treatments with 10 and 20 µM
ophiobolin A, whereas treatment with 1 or 5 µM ophiobolin A
did not induce any decrease in cell viability until 72 h after
the treatments (Fig. 3A). Furthermore, 3-anhydro-6-epi-ophiobolin had no effect on the TBY-2 cells; neither the growth
nor the viability of the cells were altered, even after 72 h of
treatment and at concentrations ≤10 µM of 3-anhydro-6-epiophiobolin (data not shown).
Cytoplasm shrinkage has been recognized as a useful
hallmark to distinguish programmed cell death (PCD) from
the necrotic processes in plant cell cultures (30). Fig. 3B shows
that treatment with 10 µM ophiobolin A induced cytoplasm
shrinkage in nearly all trypan blue-positive cells, suggesting that
the compound induced apoptosis-like cell death in the TBY-2
plant cells. No cellular shrinkage was detected in the control
cells or in cells treated with 5 µM ophiobolin A (Fig. 3B).
The analysis of the nuclear morphology of the cells further
supports the activation of PCD in cells treated with 10 µM
6
BURY et al: OPHIOBOLIN A VERSUS PLANT AND MAMMALIAN CELL TOXICITY
Figure 3. The effect of ophiobolin A on TBY-2 cell viability. (A) Viability of the TBY-2 cells was followed over time in the presence of different ophiobolin A
concentrations. The values are the means of three independent experiments ± SD. (B) Cellular morphology of the control cells and the ophiobolin A-treated
cells stained with trypan blue after 24 h of treatment. Cytoplasmic shrinkage of dying cells was evident only in cells treated with 10 µM ophiobolin A.
(C) Nuclear morphology of the control cells and the ophiobolin A-treated cells. The cells were stained with Hoechst 33258 to visualize the nuclear morphology
under fluorescence microscopy. The images show cell nuclei 24 h after treatment. Bar, 20 µm. (D) Analyses of DNA laddering in the control cells and the
ophiobolin A-treated cells. The cells were collected after 72 h of treatment. The image shows a representative electrophoretic run; 100 µg of DNA were loaded
in each line. (E) Intracellular production of H2O2 in TBY-2 cells under all the analyzed experimental conditions. The TBY-2 cells were stained with DHR 123
and visualized under fluorescence microscopy. The images show the control cells and the ophiobolin A-treated cells 24 h after treatment. Bar, 20 µm.
ophiobolin A because the micronuclei formation that typically occurs in apoptotic-like plant cell death was observed
in TBY-2 cells undergoing ophiobolin A-dependent cell death
(Fig. 3C). In contrast, nuclei from TBY-2 cells treated with
5 µM ophiobolin A had the same morphology as those from the
control cells (data not shown). DNA laddering induced by the
activation of endonucleases during the PCD process was also
evident in TBY-2 cells treated with 10 µM ophiobolin A but
was not apparent in either cells subjected to 5 µM ophiobolin
treatment (data not shown) or the control cells (Fig. 3D).
It is well known that early H2O2 production acts as a signal
to activate PCD-dependent defense mechanisms in plant
cells (30). Under ophiobolin A treatment, H 2O2 production
only occurred in tobacco cells when PCD had already been
activated (Table III). Indeed, H2O2 accumulation was observed
only in dying cells (Fig. 3E). H2O2 production was not detect-
able in either the control cells or the cells treated with 5 µM
ophiobolin A over all the analyzed periods (Fig. 3E).
Effects of ophiobolin A and its degradation product on
mammalian cells. Three human cancer cell lines and one
mouse cancer cell line were used to determine the in vitro
growth-inhibitory effects induced by ophiobolin A and its
degradation product 3-anhydro-6-epi-ophiobolin A (Table II).
The data obtained revealed that the mean IC50 growth inhibitory concentrations for 3-anhydro-6-epi-ophiobolin A were
approximately 60 times higher than those for ophiobolin A
(Table II). We thus pursued our investigations with ophiobolin A only.
Ophiobolin A delays cell proliferation in both normal and
cancer mammalian cells. Treatment with 1 µM ophiobolin A
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
Table III. The extracellular release of H2O2 by TBY-2 cells
after 10 µM ophiobolin A treatment.a
Time after treatment (h)
0
4
8
15
Cell viability (%)
H2O2
(µM)
100.0±0.1
98±2
95±5
42±10
ND
ND
0.3±0.2
9±2
The production of H2O2 by tobacco cells was detectable only as cultured cells started dying (see also Fig. 3E). The data are presented as
the mean ± SD of three independent experiments; ND, not detectable.
a
7
was found to decrease the cell proliferation of human Hs683
oligodendroglioma cells during the first 72 h of treatment, as
revealed by quantitative videomicroscopy analyses (Fig. 4A).
However, in contrast to the TBY-2 plant cells, the human
Hs683 cancer cells did not regain growth potential when the
cancer cells were cultured for 24 h with 1 µM ophiobolin A
and then washed and cultured in ophiobolin A-free media
(data not shown).
The data shown in Fig. 4A suggest that ophiobolin A might
exert cytostatic effects, such as delaying cell proliferation,
rather than cytotoxic effects, such as directly killing cells,
during the first 24 h of contact with Hs683 cancer cells. We
thus investigated whether the global growth rates of mammalian cell populations could influence the growth-inhibitory
effects of ophiobolin A, at least in vitro. We used four primocultures of keratinocytes and each primoculture was analyzed
both while highly proliferating (in a subconfluent stage) and
while weakly or non-proliferating (in a confluent stage), as
detailed in Materials and Methods. The data revealed that
the non-proliferating keratinocytes displayed 5-10 times less
sensitivity to the ophiobolin A-induced growth-inhibitory
effects than the cancer cells, while the subconfluent keratinocytes displayed intermediate sensitivity (Fig. 4B).
Ophiobolin A is active in vitro against MDR cancer cells.
While ophiobolin A induces growth-inhibitory effects in
submolar concentrations in various cancer cell lines (Table II),
it is not a substrate for MDR-related efflux pumps. Indeed, the
data obtained clearly show that ophiobolin A displays similar
in vitro growth-inhibitory activity in ovarian cancer cells that
are either sensitive or resistant to cisplatin (Fig. 5A), in GLC-4
small cell lung cancer cells that are either sensitive or resistant
to adriamycin (Fig. 5B) and in leukemia cells that are either
sensitive or resistant to mitoxantrone, vincristine or adriamycin (Fig. 5C). These cell lines are known to overexpress
also other resistance mechanism key ABC transporter proteins
important for MDR such as ABCB1 [HL60/vinc (22,23)],
ABCCs [HL60/adr (22,23)], GLC4/ADR (24,25) and ABCG2
[HL60/mx (22,23)]. The efficiency of ophiobolin A in terms of
growth-inhibitory activity also remained similar in HCT-116
colon cancer cells that displayed either functional or deficient
p53 (26) (Fig. 5D).
Figure 4. (A) Computer-assisted phase-contrast microscopy (quantitative
videomicroscopy) characterization of ophiobolin A-induced cytotoxic effects.
Human Hs683 oligodendroglioma cells were maintained in the presence of
1 µM ophiobolin A for 72 h. (B) Determination of the growth-inhibitory
effects induced by ophiobolin A by means of the MTT colorimetric assay in
four cancer cell lines (Table II) and four normal cell lines, which included
four keratinocyte primocultures. We used proliferating subconfluent keratinocytes versus non-proliferating confluent keratinocytes for each of the four
keratinocyte primocultures. The effects of ophiobolin A are illustrated as
IC50 growth-inhibitory concentrations (calculated from three replicates at
least for each cell line; the open dots) and their median values (the horizontal
black bars).
Ophiobolin A displays in vivo anticancer activity. At first
glance, the data illustrated in Fig. 4B might seem to suggest
that ophiobolin A could be weakly bioselective and thus
toxic, between normal mammalian cells and cancer cells. We
thus transplanted in vivo the B16F10 melanoma cell line that
displayed actual in vitro sensitivity to the growth-inhibitory
effects of ophiobolin A (Table II) to determine whether
ophiobolin A could represent a potential anticancer agent;
i.v. injection of the B16F10 melanoma cells into the tail vein
of mice leads to the development of highly aggressive lung
pseudometastases in 100% of the injected mice (29).
As detailed in Materials and methods, the in vivo
dosages used for ophiobolin A (5 and 10 mg/kg chronically
administered intraperitoneally three times a week over three
consecutive weeks) induced no apparent toxicity as assessed
by monitoring the behavior (daily) and weight (twice a week)
of the mice (data not shown). In contrast, we observed a
8
BURY et al: OPHIOBOLIN A VERSUS PLANT AND MAMMALIAN CELL TOXICITY
Figure 5. Characterization of the in vitro anticancer activity of ophiobolin A in various human MDR cancer cell lines. The anticancer activity of ophiobolin A
was assayed in cisplatin-sensitive versus cisplatin-resistant A2780 ovarian cells (A), in adriamycin-sensitive versus adriamycin-resistant small-cell lung cancer
cells (B) and in sensitive (HL60) versus adriamycin- (HL60/adr), vincristine- (HL60/vinc) and mitoxantrone- (HL60/mx) resistant pro-myelocytic leukemia
HL60 cells (C). Wild-type (wt) versus p53 knock-out (ko) HCT-116 colon cancer cells were also treated with ophiobolin A (D). The charts of the positive
controls are available upon request.
Figure 6. The effects of ophiobolin A on the survival of mice bearing B16F10
melanoma pulmonary pseudometastases obtained by the i.v. administration
of 2.5x105 B16F10 cells. Treatments began 5 days after the grafting procedure. Ophiobolin A (5 versus 10 mg/kg) was administered intraperitoneally
three times a week for three consecutive weeks.
significant (p<0.01) increase in the survival periods of the
B16F10 melanoma-bearing mice that were chronically treated
with 10 mg/kg (but not with 5 mg/kg) ophiobolin A (Fig. 6).
Discussion
The data from the present study reveal that plant cells are
less sensitive to ophiobolin A-induced growth-inhibitory
effects in vitro than mammalian cells and that slowly
proliferating mammalian cells are less sensitive to these
ophiobolin A-induced growth-inhibitory effects than highly
proliferative ones.
Morphological effects in terms of coleoptile growth
and the inhibition of seed germination have been reported
in monocot-susceptible plants (1). The data obtained in this
study suggest that this inhibitory effect could be correlated
with the ability of ophiobolin A to inhibit cell division. At a
threshold concentration (5 µM in TBY-2 cells, as shown in the
present study), ophiobolin A is able to block cell proliferation
without affecting viability. At higher concentrations (>10 µM),
ophiobolin A induces cell death and displays PCD hallmarks,
suggesting that the compound is able to activate an apoptosislike process, depending on the applied dose. In plants, PCD
is activated in specific cells during normal developmental
processes or as a consequence of stress (13,31). Interestingly,
PCD is also part of the hypersensitive response (HR), a defense
response activated against pathogens by resistant plants to
block the penetration of pathogens by surrounding them
with a barrier of dead tissue (32). The activation of PCD in
tobacco cells by ophiobolin A suggests the ability to activate
defense responses against ophiobolin-producing fungi, which
is consistent with the fact that dicot plants have been reported
to be more resistant than monocots to Bipolaris spp. (5). In
addition, the plant cell wall is endowed with a plethora of
enzymatic systems aimed at degrading pathogen-produced
molecules and using them as signal molecules for activating
HR or other defense responses (33). During biotic stress, the
production of reactive oxygen species (ROS) occurs via the
activation of a plasma membrane NADPH oxidase and/or cell
wall enzymes. This ROS overproduction is used to promote
pathogen killing, to strengthen the cell wall by means of
peroxidative crosslinking reactions and to induce the PCD
signaling pathway (30). Among ROS, H2O2 has been reported
as the pivotal signal molecule because of its ability to cross
cell membranes and its long half-life relative to those of the
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
radical ROS (34). Consistently, a biphasic production of H2O2
characterizes HR, with the first peak occurring very early after
infection, before any morphological symptoms of cell death are
evident (35). Surprisingly, the ophiobolin A-dependent PCD
was not preceded by any H2O2 production; only a late H2O2
increase was observed after the death process was already
well evident. Recently, an uncommon model of PCD has been
demonstrated to be induced by fumonisin B1 and AAL toxin,
which are mycotoxins produced by phytopathogenic fungi; in
this case, it has been demonstrated that PCD activation was
not dependent on H2O2 production (36). As these molecules
are not chemically related to ophiobolin A and because they
are both produced by phytopathogenic fungi, our data suggest
that H 2O2-independent PCD could be a plant response to
pathogens that occur with a certain frequency. Further studies
are required to identify the signaling pathway leading to this
H2O2-independent PCD.
The fact that plant cells are less sensitive than mammalian
cells to the growth-inhibitory effects of ophiobolin A, at least
in vitro, could be related to two facts: i) when their viability
is not affected, plant cells appear to be able to degrade ophiobolin A, while mammalian cells cannot, and ii) plant cells
have been reported to be more resistant to apoptosis-inducing
stimuli than mammalian cells (37).
Ophiobolin A was described as an apoptosis-inducer in
leukemia cells (38) and more recently, this feature was observed
for ophiobolin O in MCF-7 mammary cancer cells (8). Both
leukemia and MCF-7 mammary cancer cells are highly sensitive to pro-apoptotic stimuli. In addition, in the four cancer cell
lines examined here, the IC50 growth inhibitory concentrations
were in the same range as those reported in the literature for the
ovarian cancer cell line OVCAR3 (6). An interesting feature
revealed by the present study is that, of the four cancer cell lines
analyzed, the A549 NSCLC and the SKMEL-28 melanoma
cell lines displayed various levels of resistance to pro-apoptotic
stimuli (39), while the human Hs683 oligodendroglioma (40)
and the mouse B16F10 melanoma (41) cell lines displayed
actual sensitivity to pro-apoptotic stimuli. No differences in
the sensitivity to ophiobolin A were observed between these
four cancer cell lines in the MTT assay colorimetric (Table II);
it is therefore unlikely that ophiobolin A would mainly exert
its growth-inhibitory effects through pro-apoptotic signals
in all of these cancer cell lines. Accordingly, we performed
flow cytometry analyses of ophiobolin A-induced apoptosis
in human cancer cell lines and we indeed observed that ophiobolin A at IC50 concentrations induced only weak, if any,
pro-apoptotic signals (data not shown). Furthermore, the efficiency of ophiobolin A in terms of growth-inhibitory activity
remained similar to that of HCT-116 colon cancer cells that
display either functional or deficient p53 (Fig. 5D).
While ophiobolin A induces cytotoxic effects in cancer
cells after 72 h (Fig. 4A), it is not a substrate for MDR-related
efflux pumps. We used a panel of MDR cancer cell lines
exhibiting numerous MDR phenotypes, including the resistant
HL60 leukemia cell line that is associated with the ABCC1,
ABCB1 and ABCG2 MDR phenotypes (23,25) and the resistant GLC-4 cell line associated with the ABBC1 (MRP1) and
LRP MDR phenotypes (25). Ophiobolin A has already been
shown to exert weak but nevertheless significant inhibitory
effects on P-glycoprotein-mediated transports of drugs (42).
9
An in vitro interaction of ophiobolin A with maize calmodulin has been reported, which supports the hypothesis that the
latter could be the target for ophiobolin A in plant cells (43,44).
Calmodulin, which acts as a regulator of cell cycle progression, is the principal Ca2+ sensor in eukaryotes and is essential
for the activation of the cell cycle machinery involved in cell
cycle progression (45). The concentration of ophiobolin A
required to reach the half-maximal inhibition of calmodulindependent cyclic nucleotide phosphodiesterase activity is
~10 µM (43), which is a lethal dose for the plant cells used in
the present study. In addition, the concentration required for
in vitro experiments to reach 50% of the maximum inhibition
of the calmodulin-dependent pathways (10 µM) (43) is much
higher than either the IC50 growth inhibitory concentrations
observed in cancer cells (0.3-0.6 µM) or the concentration that
completely blocks plant cell growth (<5 µM). More detailed
studies are required to determine whether the responses triggered by ophiobolin A in mammalian and plant cells could be
closely related to the inhibitory activity of the toxin toward
calmodulin.
The fact that ophiobolin A is not a simple poisonous fungal
metabolite is evidenced by its ability to increase the survival
of mice bearing very aggressive lung pseudometastases, even
though the experimental schedule and dosing used to assay the
ophiobolin A-mediated in vivo antitumor effects were not optimized because of the limited amounts of the compound that
were available. These data are encouraging because the B16F10
melanoma model displays a limited response (e.g., no single
mouse can be cured) to potent anticancer agents, including
temozolomide, cisplatin, adriamycin, irinotecan and taxol (29).
In conclusion, ophiobolin A is a fungal metabolite that has
been considered to be a phytotoxin for decades. The present
study indeed shows that ophiobolin A causes tobacco plant
cell death at certain concentrations but decreases only tobacco
plant cell proliferation, not viability, at lower concentrations.
The capacity of ophiobolin A to affect either plant cell proliferation or plant viability, according to its concentration, makes
it an interesting tool for the study of the different responses
of the plant-microorganism interaction. Moreover, this study
reports additional evidence supporting the hypothesis that H2O2
production might not be implicated in all types of plant PCD.
Mammalian cancer cells appear to be more sensitive to
the ophiobolin A-induced growth-inhibitory effects in vitro
and this fungal metabolite displays antitumor activity in vivo
for mice bearing lung pseudometastases. While the growthinhibitory effects mediated by ophiobolin A in plant cells seem
related to the activation of apoptotic processes, in mammalian
cancer cells, ophiobolin A treatment causes similar activity in
both apoptosis-sensitive and apoptosis-resistant cancer cells
and also in cancer cells displaying various MDR phenotypes.
Current investigations aimed at deciphering the mechanisms
of action through which ophiobolin A exerts its anticancer
effects are ongoing.
Acknowledgements
Esther Novo-Uzal received a grant from the Fundación Barrié
de la Maza, Spain. Marina Bury holds a grant from the FRIAFNRS (Fonds National de la Recherche Scientifique, Belgium)
and Robert Kiss, a director of research with the FNRS. The
10
BURY et al: OPHIOBOLIN A VERSUS PLANT AND MAMMALIAN CELL TOXICITY
authors warmly thank Françoise Herphelin and Thierry Gras
for their excellent technical contributions to the keratinocyte
and cancer cell culture processes, respectively.
References
1.Au TK, Chick WSH and Leung PC: The biology of ophiobolins.
Life Sci 67: 733-742, 2000.
2.Canonica L, Fiecchi A, Kienle MG and Scala A: The constitution
of cochliobolin. Tetrahedron Lett 11: 1211-1218, 1966.
3.Nozoe S, Morisaki M, Tsuda K, Takahashi N, Tamura S,
Ishibashi K and Shirasaka M: The structure of ophiobolin,
a C25 terpenoid having a novel skeleton. J Am Chem Soc 87:
4968‑4970, 1965.
4.Arai M, Niikawa H and Kobayashi M: Marine-derived
sesterterpenes, ophiobolins, inhibit biofilm formation of
Mycobacterium species. J Nat Med 67: 271-275, 2013.
5.Evidente A andolfi A, Cimmino A, Vurro M, Fracchiolla M and
Charudattan R: Herbicidal potential of ophiobolins produced
by Drechslera gigantea. J Agric Food Chem 54: 1779-1783,
2006.
6.De Vries-van Leeuwen IJ, Kortekaas-Thijssen C, Nzigou
Mandouckou JA, Kas S, Evidente A and de Boer AH:
Fusicoccin-A selectively induces apoptosis in tumor cells after
interferon-alpha priming. Cancer Lett 293: 198-206, 2010.
7.Shen X, Krasnoff SB, Lu SW, Dunbar CD, O'Neal J, Turgeon BG,
Yoder OC, Gibson DM and Hamann MT: Characterization of
6-epi-3-anhydroophiobolin B from Cochliobolus heterostrophus.
J Nat Prod 62: 895-897, 1999.
8.Yang T, Lu Z, Meng L, Wei S, Hong K, Zhu W and Huang C: The
novel agent ophiobolin O induces apoptosis and cell cycle arrest
of MCF-7 cells through activation of MAPK signaling pathways.
Bioorg Med Chem Lett 22: 579-585, 2012.
9.Nagata T, Nemoto Y and Hasezawa S: Tobacco BY-2 cell line as
the ‘HeLa’ cell in the cell biology of higher plants. Int Rev Cytol
132: 1-30, 1992.
10.Vacca RA, de Pinto MC, Valenti D, Passerella S, Marra E and
De Gara L: Reactive oxygen species production, impairment of
glucose oxidation and cytosolic ascorbate peroxidase are early
events in heat-shock-induced programmed cell death in tobacco
BY-2 cells. Plant Physiol 134: 1100-1112, 2004.
11. Pellny TK, Locato V, Vivancos PD, Markovic J, De Gara L,
Pallardó FV and Foyer CH: Pyridine nucleotide cycling and
control of intracellular redox state in relation to poly (ADP-ribose)
polymerase activity and nuclear localization of glutathione
during exponential growth of Arabidopsis cells in culture. Mol
Plant 2: 442-456, 2009.
12.Locato V, Balestrazzi A, De Gara L and Carbonera D: Reduced
expression of top1b gene induces programmed cell death and
alters ascorbate metabolism in Daucus carota cultured cells.
J Exp Bot 57: 1667-1676, 2006.
13.Locato V, Gadaleta C, De Gara L and de Pinto MC: Production
of reactive species and modulation of antioxidant network in
response to heat shock: a critical balance for cell fate. Plant Cell
Environ 31: 1606-1619, 2008.
14.Houot V, Etienne P, Petitot AS, Barbier S, Blein JP and Suty L:
Hydrogen peroxide induces programmed cell death features in
cultured tobacco BY-2 cells in a dose-dependent manner. J Exp
Bot 52: 1721-1730, 2001.
15.Edwards K, Johnstone C and Thompson A: A simple and rapid
method for the preparation of plant genomic DNA for PCR
analysis. Nucleic Acids Res 19: 1349, 1991.
16.de Pinto MC, Paradiso A, Leonetti P and De Gara L: Hydrogen
peroxide, nitric oxide and cytosolic ascorbate peroxidase at the
crossroad between defense and cell death. Plant J 48: 784-795,
2006.
17.Royall JA and Ischiropoulos H: Evaluation of 2',7'-dichlorofluorescin and dihydrorhodamine 123 as fluorescent probes for
intracellular H2O2 in cultured endothelial cells. Arch Biochem
Biophys 302: 348-355, 1993.
18.Le Calvé B, Lallemand B, Perrone C, Lenglet G, Depauw S,
Van Goietsenoven G, Bury M, Vurro M, Herphelin, F andolfi A,
Zonno MC, Mathieu V, Dufrasne F, Van Antwerpen P, Poumay Y,
David-Cordonnier MH, Evidente A and Kiss R: In vitro anticancer activity, toxicity and structure-activity relationships of
phyllostictine A, a natural oxazatricycloalkenone produced by
the fungus Phyllosticta cirsii. Toxicol Appl Pharmacol 254: 8-17,
2011.
19.Atanasova G, Jans R, Zhelev N, Mitev V and Poumay Y: Effects
of the cyclin-dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine)
on the physiology of cultured human keratinocytes. Biochem
Pharmacol 70: 824-836, 2005.
20.Minner F, Herphelin F and Poumay Y: Epidermal cells methods
and protocols. In: Methods in Molecular Biology. 2nd edition.
Turksen K (ed). Humana Press, New York, NY, Vol. 585, pp71-82,
2010.
21.Janssen T, Darro F, Petein M, Raviv G, Pasteels JL, Kiss R and
Schulman CC: In vitro characterization of prolactin-induced
effects on proliferation in the neoplastic LNCaP, DU145 and
PC-3 models of the human prostate. Cancer 77: 144-149, 1996.
22.McGrath T and Center MS: Mechanisms of multidrug resistance
in HL60 cells: evidence that a surface membrane protein distinct
from P-glycoprotein contributes to reduced cellular accumulation
of drug. Cancer Res 48: 3959-3963, 1988.
23.Heffeter P, Pongratz M, Steiner E, Chiba P, Jakupec MA,
Elbling L, Marian B, Körner W, Sevelda F, Micksche M,
Keppler BK and Berger W: Intrinsic and acquired forms of
resistance against the anticancer ruthenium compound KP1019
(indazolium trans-[tetrachlorobis(1H-indazole)ruthenate (III)
(FFC1A4)). J Pharmacol Exp Ther 312: 281-289, 2005.
24.Zijlstra JG, de Vries EG and Mulder NH: Multifactorial drug
resistance in an adriamycin-resistant human small cell lung
carcinoma cell line. Cancer Res 47: 1780-1784, 1987.
25.Heffeter P, Jakupec MA, Korner W, Chiba P, Pirker C,
Dornetshuber R, Elbling L, Sutterlüty H, Micksche M, Keppler BK
and Berger W: Multidrug-resistant cancer cells are preferential
targets of the new antineoplastic lanthanum compound KP772
(FFC24). Biochem Pharmacol 73: 1873-1886, 2007.
26.Bunz F, Fauth C, Speicher MR, Dutriaux A, Sedivy JM,
Kinzler KW, Vogelstein B and Lengauer C: Targeted inactivation
of p53 in human cells does not result in aneuploidy. Cancer Res
62: 1129-1133, 2002.
27.Delbrouck C, Doyen I, Belot N, Decaestecker C, Ghanooni R,
de Lavareille A, Kaltner H, Choufani G, Danguy A,
Vandenhoven G, Gabius HJ, Hassid S and Kiss R: Galectin-1
is overexpressed in nasal polyps under budesonide and inhibits
eosinophil migration. Lab Invest 82: 147-158, 2002.
28.Mégalizzi V, Mathieu V, Mijatovic T, Gailly P, Debeir O,
De Neve N, Van Damme M, Bontempi G, Haibe-Kains B,
Decaestecker C, Kondo Y, Kiss R and Lefranc F: 4-IBP, a sigma1
receptor agonist, decreases the migration of human cancer cells,
including glioblastoma cells, in vitro and sensitizes them in vitro
and in vivo to cytotoxic insults of proapoptotic and proautophagic
drugs. Neoplasia 9: 358-369, 2007.
29.Mathieu V, Le Mercier M, De Neve N, Sauvage S, Gras T,
Roland I, Lefranc F and Kiss R: Galectin-1 knockdown increases
sensitivity to temozolomide in a B16F10 mouse metastatic
melanoma model. J Invest Dermatol 127: 2399-2410, 2007.
30.de Pinto MC, Locato V and De Gara L: Redox regulation in
plant programmed cell death. Plant Cell Environ 35: 234-244,
2012.
31.Paradiso A, de Pinto MC, Locato V and De Gara L: Galactoneγ-lactone-dependent ascorbate biosynthesis alters wheat kernel
maturation. Plant Biol 14: 652-658, 2012.
32.Mur LAJ, Kenton P, Lloyd AJ, Ougham H and Prats E: The
hypersensitive response; the centenary is upon us but how much
do we know? J Exp Botany 59: 501-520, 2008.
33.Dodds PN and Rathjen JP: Plant immunity: towards an integrated
view of plant-pathogen interactions. Nat Rev Genet 11: 539-548,
2010.
34.Gechev TS and Hille J: Hydrogen peroxide as a signal controlling
plant programmed cell death. J Cell Biol 168: 17-20, 2005.
35.Levine A, Tenhaken R, Dixon R and Lamb C: H2O2 from the
oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease
resistance response. Cell 79: 583-593, 1994.
36.Lachaud C, Da Silva D, Amelot N, Béziata C, Briére C,
Cotelle V, Graziana A, Grata S, Mazars C and Thuleau P:
Dihydrosphingosine-induced programmed cell death in tobacco
BY-2 cells is independent of H 2O2 production. Mol Plant 4:
310-318, 2011.
37.De Gara L, Locato V, Dipierro S and de Pinto MC: Redox
homeostasis in plants. The challenge of living with endogenous
oxygen production. Respir Physiol Neurobiol 173 (Suppl):
S13-S19, 2010.
38.Fujiwara H, Matsunaga K, Kumagai H, Ishizuka M and
Ohizumi Y: Ophiobolin A, a novel apoptosis-inducing agent from
fungus Strain f-7438. Pharm Pharmacol Commun 6: 427-431,
2000.
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
39.Shen L, Kondo Y, Ahmed S, Boumber Y, Konishi K, Guo Y,
Chen X, Vilaythong JN and Issa JP: Drug sensitivity prediction
by CpG island methylation profile in the NCI-60 cancer cell line
panel. Cancer Res 67: 11335-11343, 2007.
40.Dittmann LM, Danner A, Gronych J, Wolter M, Stühler K,
Grzendowski M, Becker N, Bageritz J, Goidts V, Toedt G,
Felsberg J, Sabel MC, Barbus S, Reifenberger G, Lichter P and
Tews B: Downregulation of PRDX1 by promoter hypermethylation is frequent in 1p/19q-deleted oligodendroglial tumours
and increases radio- and chemosensitivity of Hs683 glioma cells
in vitro. Oncogene 31: 3409-3418, 2012.
41.de Lange J, Ly LV, Lodder K, Verlaan-de Vries M, Teunisse AF,
Jager MJ and Jochemsen AG: Synergistic growth inhibition
based on small-molecule p53 activation as treatment for intraocular melanoma. Oncogene 31: 1105-1116, 2012.
11
42.Yoshida N, Koizumi M, Adachi I and Kawakami J: Inhibition
of P-glycoprotein-mediated transport by terpenoids contained in
herbal medicines and natural products. Food Chem Toxicol 44:
2033-2039, 2006.
43.Leung PC, Taylor WA, Wang JH and Tipton CL: Ophiobolin A.
A natural product inhibitor of calmodulin. J Biol Chem 259:
2742-2747, 1984.
44.Leung PC, Taylor WA, Wang JH and Tipton CL: Role of
calmodulin inhibition in the mode of action of ophiobolin A.
Plant Physiol 77: 303-308, 1985.
45.Kahl CR and Means AR: Regulation of cell cycle progression
by calcium/calmodulin-dependent pathways. Endocr Rev 24:
719-736, 2003.
RÉSULTAT - III
"Ophiobolin A induces paraptosis-like cell death in human
glioblastoma cells by decreasing BKCa channel activity".
Marina Bury, Alban Girault, Véronique Mégalizzi, Sabine Spiegl-Kreinecker, Véronique
Mathieu, Walter Berger, Antonio Evidente, Alexander Kornienko, Philippe Gailly, Christophe
Vandier and Robert Kiss
Cell Death and Disease, 2013
65
Résumé
Dans ce troisième article, nous nous sommes intéressés au mécanisme d’action de
l’ophioboline A dans les cellules cancéreuses et plus particulièrement dans les glioblastomes.
Dans un premier temps, nous avons déterminé à l’aide du test colorimétrique MTT
l’activité inhibitrice de croissance in vitro de l’ophioboline A sur deux lignées cellulaires
établies de glioblastome humain (U373-MG et T98G) et une lignée de primoculture de
glioblastome (GL19) exprimant toutes les trois des marqueurs de cellules souches tels que la
nestine et la protéine CD44. La concentration inhibitrice de croissance de 50 % (IC50) de cette
molécule est d’environ 1 µM sur la lignée U373-MG, de 2 µM sur la lignée T98G et de 4 µM
sur la lignée GL19. En microscopie à contraste de phase assistée par ordinateur, nous avons
observé que l’ophioboline A à sa concentration IC50 avait des effets antiprolifératifs sur les
cellules de glioblastome. Grâce à des analyses en cytométrie de flux, nous avons vérifié ces
résultats et montré que l’ophioboline A inhibait la progression du cycle cellulaire au cours du
temps avec d’abord une augmentation en phase G0/G1 dans les premières 24 heures suivie
d’une augmentation en phase S après 72 heures de traitement. Ensuite, nous avons mis en
évidence que les changements d’organisation du cytosquelette d’actine et l’augmentation de la
concentration intracellulaire en calcium induits par l’ophioboline A étaient corrélés à la
diminution de la migration des cellules quantifiée par vidéomicroscopie.
Dans un second temps, nous avons voulu déterminer par quel mécanisme l’ophioboline A
induisait la mort des cellules de glioblastome. En microscopie par fluorescence, nous avons
observé que les cellules traitées avec de l’ophioboline A présentaient des caractéristiques
morphologiques de la paraptose telles que la dilatation des mitochondries et la présence de
nombreuses vacuoles cytoplasmiques. Vu qu’actuellement peu de choses sont connues sur ce
processus cellulaire, c’est principalement en excluant les autres types de mort cellulaire que la
paraptose est identifiée. Tout d’abord, nous avons vérifié que ces vacuoles n’étaient pas
acides comme dans le processus d’autophagie grâce à un marquage à l’acridine orange.
Ensuite, nous avons quantifié par coloration au bleu de trypan le pourcentage de cellules
mortes d’une population cellulaire traitée pendant 72 heures avec de l’ophioboline A.
L’apoptose et la nécrose ont été exclues suite aux résultats obtenus par cytométrie de flux à
l’aide d’un marquage de type TUNEL et d’un double marquage annexine V/iodure de
propidium mais également par western blot où nous n’avons pas observé de clivage de la
66
protéine PARP. La sénescence a été exclue par l’absence d’augmentation de l’activité de la βgalactosidase. Le fait qu’un prétraitement au cycloheximide diminue le taux de morts
cellulaires confirme également que l’ophioboline A induit probablement de la paraptose dans
les cellules gliales tumorales.
Pour finir, nous avons voulu tester les effets de l’ophioboline A sur l’activité du canal
BKCa qui serait impliqué dans le processus de paraptose. Nous avons d’abord vérifié que ce
canal était bien localisé sur les organelles d’où dérivent les vacuoles à savoir les
mitochondries et le réticulum endoplasmique. Après avoir démontré que ce canal ionique était
bien fonctionnel dans nos cellules de glioblastome, nous avons mesuré en patch clamp son
activité en présence d’ophioboline A. Nous avons pu constater que l’ophioboline A diminuait
de manière dose-dépendante l’activité de ce canal BKCa.
En conclusion, l’ophioboline A pourrait être utilisée afin de court-circuiter la résistance
intrinsèque aux stimuli pro-apoptotiques des cellules de glioblastome car cette molécule est
capable d’induire de la paraptose dans ces cellules en ciblant le canal BKCa.
67
OPEN
Citation: Cell Death and Disease (2013) 4, e561; doi:10.1038/cddis.2013.85
& 2013 Macmillan Publishers Limited All rights reserved 2041-4889/13
www.nature.com/cddis
Ophiobolin A induces paraptosis-like cell death in
human glioblastoma cells by decreasing BKCa
channel activity
M Bury1, A Girault2, V Mégalizzi1, S Spiegl-Kreinecker3, V Mathieu1, W Berger4, A Evidente5, A Kornienko6, P Gailly7, C Vandier2
and R Kiss*,1
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most lethal and common malignant human brain tumor. The intrinsic resistance of highly
invasive GBM cells to radiation- and chemotherapy-induced apoptosis accounts for the generally dismal treatment outcomes.
This study investigated ophiobolin A (OP-A), a fungal metabolite from Bipolaris species, for its promising anticancer activity
against human GBM cells exhibiting varying degrees of resistance to proapoptotic stimuli. We found that OP-A induced marked
changes in the dynamic organization of the F-actin cytoskeleton, and inhibited the proliferation and migration of GBM cells, likely
by inhibiting big conductance Ca2 þ -activated K þ channel (BKCa) channel activity. Moreover, our results indicated that OP-A
induced paraptosis-like cell death in GBM cells, which correlated with the vacuolization, possibly brought about by the swelling
and fusion of mitochondria and/or the endoplasmic reticulum (ER). In addition, the OP-A-induced cell death did not involve the
activation of caspases. We also showed that the expression of BKCa channels colocalized with these two organelles
(mitochondria and ER) was affected in this programmed cell death pathway. Thus, this study reveals a novel mechanism
of action associated with the anticancer effects of OP-A, which involves the induction of paraptosis through the disruption of
internal potassium ion homeostasis. Our findings offer a promising therapeutic strategy to overcome the intrinsic resistance
of GBM cells to proapoptotic stimuli.
Cell Death and Disease (2013) 4, e561; doi:10.1038/cddis.2013.85; published online 28 March 2013
Subject Category: Cancer
Glioblastoma multiforme (GBM), also known as grade IV
astrocytoma, is the most common primary malignant brain
tumor.1 Despite the use of aggressive surgical resection,
intensified radiation therapy and concomitant chemotherapy
with temozolomide, the 5-year overall survival rate for GBM
patients remains o10%.2 This extremely unfavorable prognosis for GBM patients is accounted for by tumor recurrence,
arising in part from the tumor cells’ intrinsic resistance to
apoptosis.1,2 The resistance of GBM cells to proapoptotic
stimuli is believed to be associated with genetic alterations,
affecting the key regulatory molecules involved in mitogenic
signaling, most prominently receptor tyrosine kinases and the
PI3K-PTEN-Akt-signaling axis. Genetic alterations having an
impact on regulatory and effector molecules, residing in the
classical cell death networks of apoptosis, such as alterations
of the TP53 gene, are also involved.1,3
The induction of paraptotic cell death could be an
alternative and emerging strategy to trigger GBM cell death
and to exploit apoptosis-independent programmed cell death
(PCD) pathways for the development of novel GBM therapies.
Paraptosis is a form of non-apoptotic cell death characterized
by a process of vacuolization that begins with the physical
enlargement of mitochondria and the endoplasmic reticulum
(ER).4,5 This PCD does not involve the apoptotic characteristics of pyknosis, DNA fragmentation or caspase activation,
and is known to require new protein synthesis.4 Although the
mechanisms underlying paraptosis, in particular, the signals
responsible for triggering mitochondrial and ER dilatation,
have not yet been fully elucidated, they could be associated
with the disruption of internal potassium ion homeostasis
involving the big/large conductance Ca2 þ -activated K þ
channel (BKCa).5
Ophiobolin A (OP-A) is a sesterterpenoid phytotoxin
produced by pathogenic fungi of the genus Bipolaris, which
usually infect rice, maize and sorghum.6,7 OP-A has been
reported to cause ion leakage, block hexose transport in
1
Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium; 2INSERM U1069, Laboratoire Nutrition Croissance Cancer,
Université de Tours, Tours, France; 3Department of Neurosurgery, Landesnervenklinik Wagner-Jauregg Hospital, Linz, Austria; 4Department of Medicine I,
Comprehensive Cancer Center and Institute of Cancer Research, Medical University Vienna, Vienna, Austria; 5Dipartimento di Scienze Chimiche, Complesso
Universitario Monte Sant’Angelo, Napoli, Italy; 6Department of Chemistry and Biochemistry, Texas State University, San Marcos, TX, USA and 7Laboratoire de
Physiologie Cellulaire, Institut des Neurosciences, Université Catholique de Louvain, Brussels, Belgium
*Corresponding author: R Kiss, Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Campus de la Plaine, Boulevard du Triomphe,
Brussels 1050, Belgium. Tel: þ 32 477 62 20 83; Fax: þ 322 332 53 35; E-mail: [email protected]
Keywords: ophiobolin A; glioblastoma; paraptosis; BKCa channel
Abbreviations: AO, acridine orange; BKCa, Big conductance Ca2 þ -activated K þ channel; CHX, cycloheximide; ER, endoplasmic reticulum; FCM, flow cytometry;
GBM, glioblastoma multiforme; GG, global growth; KCa, Ca2 þ -activated K þ channel; MRDO, maximum relative distance from the point of origin; OP, ophiobolin; PCD,
programmed cell death; SA-b-gal, senescence-associated b-galactosidase
Received 17.1.13; revised 19.2.13; accepted 25.2.13; Edited by A Verkhratsky
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
2
higher plants8 and inhibit calmodulin activity.7 Cocucci et al.9
also demonstrated that the inhibition of proton extrusion by
OP-A in plant cells was the result of an effect on the
permeability of the plasma membrane to potassium. However, few reports have previously described the biological
effects of OP-A on human cancer cells. OP-A was shown to
induce apoptosis in mouse leukemia cells10 and potently
inhibit human cancer cell growth,7 but the precise mechanisms of action have remained unclear.
In the current study, we characterized the OP-A-mediated
effects on proliferation and migration, as well as death
induction of human GBM cells, and found that OP-A triggers
a paraptosis-like cell death. We also showed that the inhibition
of the BKCa channel by OP-A most likely disrupts internal
potassium ion homeostasis, which is responsible, at least in
part, for this type of PCD.
Results
OP-A inhibits the growth and alters the cell cycle
progression of GBM cells. Data obtained from the NCI
(Developmental Therapeutic Program, Division of Cancer
Treatment and Diagnosis) indicate that OP-A (Structure in
Figure 1a) potently inhibits the proliferation of GBM cell lines
(Figure 1b) through a possibly novel mechanism of action
compared with the 763 000 compounds in the NCI database.
Indeed, the highest ‘COMPARE correlation coefficients’ for
OP-A were 0.524 0.645 found for five compounds, which
are mainly antibiotics.
A subpopulation of GBM cells with self-renewal capacity
and propensity of generating heterogeneous cancer cell
populations, known as GBM stem cells, is highly resistant to
conventional therapies.11,12 Thus, in this study, two established (U373-MG and T98G) and one primoculture (GL19)
GBM cell lines expressing GBM stem cell markers, such as
nestin and CD44, were used (Figure 1c). Moreover, U373-MG
and T98G were previously shown to contain the mutated p53
tumor-suppressor gene, making them resistant to proapoptotic stimuli.13,14
The half maximal inhibitory concentration (IC50) values of
OP-A for U373-MG, T98G and GL19 cells determined using
dose-response curves (MTT colorimetric assay) were 0.87,
1.9 and 3.7 mM, respectively (Figure 1d). Using quantitative
video microscopy, we observed that OP-A had antiproliferative effects on GBM cells (Figures 2a–c). OP-A-treated
GBM cells displayed, at their IC50 values, lower growth rates
over time relative to control cells as measured by calculating
the global growth (GG) indices (Figures 2d–f). Moreover,
we used flow cytometry (FCM) to analyze cell cycle kinetics,
and observed that OP-A strongly inhibits U373-MG cell
cycle progression. Indeed, after 24 h, we observed an
increase in the number of cells in G0/G1 phase from 50%
for the control to 74% for the OP-A-treated cells (Po0.01),
whereas, after 72 h, OP-A induced a sharp increase in the
number of cells in S phase from 24% (control) to 55%
(Po0.01) (Figure 2g).
OP-A induces morphological changes and inhibits the
migration of GBM cells. As shown in Figure 2a, the U373MG cells exhibited an elongated morphology (a-arrows) after
treatment with OP-A, suggesting cytoskeletal changes.
Fluorescence microscopy analyses showed that the control
U373-MG cells possessed a highly developed actin cytoskeleton with numerous stress fibers (Figure 3aI). Immediately after 6 h of treatment with 1 mM OP-A, we observed
distinct changes in the U373-MG cell morphology and the
reorganization of actin filaments. The number of small,
shrunken cells with intensely polymerized actin (green
Figure 1 Ophiobolin A has anticancer activity in GBM cells. (a) Structure of ophiobolin A. (b) NCI five-dose screen of ophiobolin A on four human GBM (SF-268, SNB-19,
SF-295, SNB-75 and U251) cell lines and one human gliosarcoma (SF-539) cell line after 48 h of treatment. The response parameters IC50 (50% growth inhibition) and LC50
(50% lethal concentration) are shown on the graph. (c) Expression of stem cells markers such as CD44 and nestin in U373-MG, T98G and GL19 cells determined by
immunoblot. (d) Growth inhibitory effects of ophiobolin A on the U373-MG, T98G and GL19 GBM cell lines as determined using the MTT assay. The data represent the mean
values±S.D. (two independent experiments, each condition performed in sextuplicate)
Cell Death and Disease
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
3
Figure 2 Ophiobolin A (OP) inhibits the proliferation of GBM cells. (a–c) Computer-assisted phase contrast microscopy images of U373-MG, T98G and GL19 GBM cells
showing the antiproliferative effects induced by OP at 1, 2 and 4 mM (BIC50), respectively. The a-arrows represent the elongation of U373-MG cells treated with 1 mM OP for
72 h. (d–f) In vitro global growth (GG) of OP-treated GBM cells compared with their control counterparts. The GGs were determined as described in the Materials and Methods.
OP treatment resulted in slower growth kinetics rates over time. The data represent the mean values±S.E.M. (two independent experiments, each performed in triplicate;
*denotes Po0.05; **denotes Po0.01). (g) Flow cytometry analysis (IP staining, n ¼ 6) of U373-MG cells to analyze the cell cycle distribution. 1 mM OP strongly slowed cell
cycle progression
fluorescence) and normal globular actin (red fluorescence)
increased (Figure 3aII). After 30 h of incubation, OP-A
caused a significant increase in the number of cells without
(or with very low) fibrillar actin fluorescence signals, but with
strongly labeled globular actin (Figure 3aIII and IV). Because
the organization of the actin cytoskeleton is sensitive to
changes in calcium, we determined the intracellular calcium
concentrations in U373-MG cells with and without OP-A
treatment. Our data show that the observed increases in the
amount of F-actin in OP-A-treated U373-MG cells at 6 h
(Figure 3a) correlated with the increased intracellular
calcium concentration (Figure 3b). Furthermore, the
dynamics of the actin cytoskeleton are critical for cell
motility,15 and our data accordingly show that OP-A (1 mM)
decreased the two-dimensional-migration potential of
U373-MG GBM cells over a 24-h period (Po0.001)
(Figures 3c and d).
OP-A induces cytoplasmic vacuolization and mitochondrial damage. U373-MG, T98G and GL19 cells were
Cell Death and Disease
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
4
Figure 3 Ophiobolin A (OP) induces morphological changes and inhibits the migration of U373-MG GBM cells. (a) Fluorescence microscopy was employed to visualize the
fibrillar (polymerized) actin in green and the globular (unpolymerized) actin in red. The effects of 1 mM OP were assessed at 2, 6 and 30 h. (I) Cells with highly developed actin
cytoskeletons with numerous stress fibers; (II) small, shrunken cells with intensely polymerized actin and globular actin; (III) disintegrated cells with very low fibrillar actin
fluorescence signals and (IV) cells strongly labeled for globular actin. (b) Measurement of the intracellular calcium concentration using the FURA-2 fluorescence ratio. The
cytosolic free Ca2 þ concentrations in control and OP-treated (1 mM) U373-MG cells were 62±4 nmol/l (n ¼ 41) and 84±4 nmol/l (n ¼ 77; ***denotes Po0.001),
respectively (c) The motility of individual cells treated with 1 mM OP was quantified by establishing the trajectory of each cell centroid and by quantifying the MRDO variable (the
maximum distance covered by a cell normalized by the observation time, expressed in mm/h). (d) The distribution of MRDO values obtained for U373-MG cells treated with
1 mM OP for 6, 12 and 24 h (n ¼ 82) compared with the MRDO values for untreated cells (n ¼ 141; ***denotes Po0.001). OP decreased the two-dimensional-migration of
U373-MG GBM cells over a 24-h period
exposed to OP-A for 72 h and were assessed by phase
contrast microscopy (Figures 2a–c). The images in Figure 4a
indicate that OP-A (1 mM) caused a dramatic increase in
vacuolization processes in U373-MG cells after 6 h of
exposure. We noticed that these vacuoles were ejected from
the cells over time (Figure 4a, white arrows) and similar
results were also observed with T98G and GL19 (data not
shown). To further characterize the morphological dynamics
of the cytoplasmic vacuolization process, experiments were
performed at a single living cell level using MitoTracker and
ER-Tracker stains (Figures 4b–d). The mitochondrial and ER
fluorescence in OP-A-treated (IC50) GBM cells indicated that
the OP-A-induced vacuoles originated from both the mitochondria and the ER (Figures 4b and c). In addition, as is
seen in Figure 4d, the analyses revealed that cytoplasmic
vacuolization was at least partly due to mitochondrial
swelling caused by OP-A exposure. Indeed, OP-A-treated
(IC50) GBM cells possessed many enlarged green fluorescent mitochondria, in contrast to control cells, which
contained small green mitochondria with a fine fibrous
distribution (Figure 4d). Cytoplasmic vacuolization and
enlarged mitochondria have been reported to be the typical
features of paraptosis.4 Moreover, the number of cells with
high levels of red staining (acridine orange (AO) staining) did
not increase, indicating that these vacuole-like organelles,
which appeared to interact directly with the plasmalemma,
Cell Death and Disease
were not acidic and thus not autophagic after (IC50) OP-A
treatment (illustrated in Figures 5a and b). We also observed
that the number of cells with high levels of green staining
(AO staining) did not increase, indicating that OP-A did not
induce membrane permeabilization of lysosomes (data not
shown).
OP-A induces paraptosis-like cell death. The abovementioned findings prompted us to further investigate
whether the anticancer effects of OP-A in GBM cancer cells
share other characteristics with paraptosis. First, using
trypan blue staining, we demonstrated that OP-A induced
the death of B45% of GBM cells after 72 h (Po0.001)
(Figure 5c and d). However, as shown in Figure 6a, FCMrelated TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP
nick end labeling) analysis demonstrated that fewer than
30% (after 48 h, data for 72 h not shown) of U373-MG cells
treated with 1 mM OP-A underwent DNA degradation
processes. To confirm that OP-A-induced cell death does
not involve apoptosis, we used annexin V staining assay to
assess the extent of phosphatidyl-serine externalization. We
found that there is no change in the percentages of annexin
V-positive cells between control and OP-A-treated (IC50)
U373-MG, T98G and GL19 cells after 72 h (data not shown).
Then, to determine whether OP-A induced necrotic cell
death, we examined the effect of OP-A on the disruption of
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
5
Figure 4 Ophiobolin A induces cytoplasmic vacuolization and mitochondrial swelling. (a) Computer-assisted phase contrast microscopy image of the cytoplasmic
vacuolization induced by ophiobolin A at 1 mM in human U373-MG GBM cells. Ophiobolin A caused a dramatic increase in vacuolization in GBM cells after 6 h of exposure. We
observed that these vacuoles were ejected from the cell over time (white arrows). (b) ER-Tracker- and MitoTracker-labeled living U373-MG and GL19 GBM cells were exposed
to culture media alone (control) or with 1 and 4 mM ophiobolin A for 6 h, respectively. Ophiobolin A-induced vacuoles originated from both the mitochondria and the ER.
(c) High-magnification fluorescence images of U373-MG cells treated for 6 h with 1 mM ophiobolin A and stained with ER-Tracker and MitoTracker. (d) Typical fluorescence
images of mitochondria at 0 and 6 h after ophiobolin treatment. Ophiobolin A-treated U373-MG and GL19 cells possessed many enlarged green fluorescent mitochondria, in
contrast to control cells, which contained small green mitochondria with a fine fibrous distribution
the cell membrane by PI staining. The data obtained also ruled
out necrosis as a potential mode of OP-A-induced cell death
because the percentages of PI-positive cells were similar
between control and OP-A-treated GBM cells after 72 h (data
not shown). These last results were confirmed in U373-MG by
immunoblot analyses, which showed that treatment with OP-A
(1 mM) did not induce poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)
cleavage, suggesting that the cell death was independent of
caspases (Figure 6b), unlike the cell death induced by the
positive control 4IBP, a sigma 1 receptor agonist, which
induced PARP cleavage (Figure 6b).16
In another set of experiments, we quantified senescence
based on the enlarged, flattened morphology and vacuolization,17 as well as using a typical marker of senescence
in human cells, senescence-associated b-galactosidase
(SA-b-gal).18 A549 NSCLC cells treated with 100 nM
Cell Death and Disease
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
6
Figure 5 Ophiobolin A (OP) induces a type of cytoplasmic vacuoles which are not autophagic and induces cell death in GBM cells. (a and b) Acridine orange (AO)-labeled
U373-MG and GL19 GBM cells were exposed to 1 and 4 mM OP for 6 h, respectively. The cytoplasmic vacuoles induced by OP (Figure 4) are not acidic. Moreover, OP did not
induce membrane permeabilization of lysosomes. (c) Images of U373-MG cells that were either untreated or treated with 1 mM OP for 72 h; the cells were stained with trypan
blue, and dead cells appear blue. (d) Cell viability was assessed after 72 h of OP treatment (IC50) and subsequent trypan blue staining. The percentages of dead cells among
the control and OP-treated GBM cells were 0.34±0.06 and 40±2 (U373-MG), 0.9±0.2 and 45.0±0.9 (T98G), 1.2±0.2 and 52±1 (GL19), respectively (two independent
experiments, each performed in triplicate; ***denotes Po0.001)
doxorubicin were used as a positive control.19 The data
presented in Figure 6c show that doxorubicin indeed induced a
markedly increased level of senescence processes in A549
NSCLC cells, in contrast to OP-A, which did not produce
similar effects in U373-MG GBM cells. Moreover, the
pretreatment of U373-MG cells with 0.25 mg/ml cycloheximide
(CHX) effectively decreased the level of OP-induced cell death
(Po0.001; Figure 6d), suggesting that protein synthesis is
required for this process, another characteristic of paraptosis.4
BKCa channels are found in the organelles involved in
paraptosis. The OP-A-induced increase in the intracellular
calcium level (Figure 3b) then prompted us to determine
whether some types of ion channels, such as Ca2 þ -activated
K þ (KCa) channels, could be potential targets for the OP-Amediated anticancer effects observed in human U373-MG
GBM cells. Indeed, the inhibition of proton extrusion by
OP-A in plant cells was found to be because of an effect on
the permeability of the plasma membrane to potassium.9
Therefore, we tested the effects of OP-A on KCa channels,
specifically BKCa channels, because these channels are
Cell Death and Disease
involved in paraptosis.5 We hypothesized that the modulation
of BKCa channel activity by OP-A in GBM cells would disrupt
the normal internal ion homeostasis and the osmotic
balance, initiating the swelling process observed in paraptosis.5 Using the immunofluorescence pseudo-confocal
microscopy with a BKCa a-subunit-specific antibody, we
identified the sub-cellular localization of the BKCa channels
in control U373-MG GBM cells. The top and bottom panels in
Figure 7a show that BKCa channels were found at several
membrane locations (the mitochondria, the ER and the
nucleus) within the cell as well as along the edges of the cell
membrane (Figure 7a). In colocalization studies, the mitochondria were stained with a specific green stain (MitoTracker Green) in combination with the red fluorescent antiBKCa channel antibody. The overlay Figure shows yellow
staining at many sites within the cells where mitochondria are
present (Figure 7a). A similar approach was used to stain the
ER with a green fluorescent mouse anti-GRP78 antibody and
the anti-BKCa channel antibody. The BKCa channels and the
ER appear to colocalize to a greater extent than did the
BKCa channels and mitochondria (Figure 7a).
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
7
Figure 6 Ophiobolin A (OP) induces paraptosis-like cell death in U373-MG glioma cells. (a) Flow cytometry (FCM)-related analyses (TUNEL) of the percentages of
apoptotic U373-MG GBM cells that were treated for 24 and 48 h with 1 mM OP (two independent experiments, each performed in triplicate; **denotes Po0.01; ***denotes
Po0.001). The positive and negative controls were provided by the manufacturer of the TUNEL kit and are presented above the graph. (b) U373-MG cells were treated with
1 mM OP for 0, 24, 48 and 72 h. Total cell lysates were resolved on SDS-PAGE gels and immunoblotted with an anti-PARP antibody. Equal loading was verified by anti-tubulin
immunoblotting (lower blot). The data are representative of at least two different experiments; 4IBP-treated U373-MG cells were used as a positive control for the cleavage of
PARP. (c) The percentages of b-gal-positive cells determined by counting 10 random fields under a phase contrast microscope (two independent experiments, each
performed in triplicate; *** denotes Po0.001). Doxorubicin induced a marked increase in senescence processes in A549 NSCLC cells, whereas OP did not induce
senescence in U373-MG GBM cells. (d) Effects of 0.25 mg/ml cycloheximide (CHX) on cell death. Cells were exposed to OP (1 mM) for 24 h with or without CHX and were
analyzed with the MTT colorimetric assay to determine the global growth levels under each experimental condition (n ¼ 12; ***denotes Po0.001). The pretreatment of U373MG cells with CHX decreased the level of OP-induced cell death
GBM cells possess functional BKCa channels. The
expression of BKCa channels in U373-MG, T98G and
GL19 cells was verified using immunoblot (Figure 7b). The
use of the whole-cell patch-clamp technique further demonstrated that the U373-MG cells had functional BKCa
channels in the plasma membrane. The presence of
functional BKCa channels was confirmed using iberiotoxin,
a selective inhibitor of these channels (Figure 7c).20 These
results are consistent with the published data, concerning the
presence of functional BKCa channels in glioma cell lines.21
OP-A decreases BKCa channel activity. The various data
reported above indicate that BKCa channels may be
associated with paraptosis, as also suggested by reports in
the literature,5 and these results prompted us to test the
effects of OP-A on the potassium current of U373-MG cells
using a patch-clamp approach. Our results showed that 1 mM
OP-A significantly reduced, by 20%, the amplitude of the
outward currents of U373-MG cells at þ 70 mV (Figure 7e). It
is important to note that 1 mM tetraethylammonium, an
inhibitor of BKCa channel at this concentration, did not
produce a significant additive inhibitory effect (Figures 7e
and f). The inhibition observed in presence of OP-A
increased to B50% at 10 mM (Figure 7f). Altogether, these
data suggest that the OP-A-induced in vitro anticancer
effects are because of, at least in part, the modulation of
ion transport across the plasma membrane in U373-MG
cells, a feature that could be attributed to the modulation of
BKCa channels.
Discussion
GBM is the most common adult primary brain cancer and it
remains the deadliest of all forms of brain tumors despite the
many clinical trials that have attempted to improve the dismal
outcomes. Complete resection remains virtually impossible
due to the invasive nature of GBM cells into the brain
parenchyma. In addition, the intrinsic resistance of GBM cells
to radiation- and chemotherapy-induced apoptosis contributes to treatment failure.1,2 Therefore, it is essential to find
novel therapeutic agents that can overcome this intrinsic
resistance of GBM cells to apoptosis.
The evaluation of biopsy tissues from patients with
malignant gliomas revealed significant expression of BKCa
channel proteins, and studies of human glioma cell lines have
established that functional BKCa channels, the predominant
K þ channel type, are highly expressed in these cells,22 as we
observed with U373-MG, T98G and GL19 GBM cells (Figures
7a and b). In the current study, OP-A, a phytotoxic
sesterterpenoid of fungal origin, was shown to be an inhibitor
Cell Death and Disease
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
8
Figure 7 Ophiobolin A (OP) decreases BKCa channel activity. (a) U373-MG cells possess BKCa channels on the cell membrane and within the mitochondria and ER. The
top panel shows U373-MG GBM cells stained with MitoTracker or an anti-a-subunit-BKCa channel antibody. The bottom panel shows images for another preparation of the
U373-MG cells stained with anti-GRP78 or anti-a-subunit-BKCa channel antibodies. The merged yellow figures on the right represent one plane in which colocalization was
present. (b) Expression of a-subunit-BKCa channels in U373-MG, T98G and GL19 cells as determined by immunoblot. (c) U373-MG cells possess functional BKCa channels
as demonstrated by the patch-clamp technique with a selective inhibitor of this channel, iberiotoxin. An example of whole-cell current recordings in the absence (control) or
presence of 10 nM iberiotoxin. (d–f) Outward whole-cell current (in percent of control condition) elicited by a depolarizing pulse from a holding potential of 70 mV to
þ 70 mV under control conditions or in the presence of 1 mM tetraethylammonium (TEA) (d), 1 mM OP (e), 10 mM OP (f) or OP with 1 mM TEA. The data represent the mean
values±S.E.M. (two independent experiments, each performed in triplicate; *denotes Po0.05; **denotes Po0.01; ***denotes Po0.001).
of BKCa channels in U373-MG GBM cells. We demonstrated
that the blockade of BKCa channels with OP-A results in
decreased cell proliferation and migration and an increased
level of non-apoptotic cell death. Preliminary in vivo data
revealed that chronic administrations of 10 mg/kg of OP-A led
to significant increases in the survival of mice bearing lung
Cell Death and Disease
pseudometastases from the B16F10 melanoma (article in
submission).
Weaver et al.22 showed that iberiotoxin, a selective inhibitor
of BKCa channels, increases the percentage of glioma cells in
S phase, as shown for OP-A, whereupon cells undergo cell
death. Iberiotoxin interacts with specific residues in the outer
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
9
vestibules of the BKCa channel to physically occlude the
pore.23 The BKCa channel consists of two dissimilar subunits,
a and b. The a subunit is a member of the human slo KCa gene
family, which forms the ion conduction pore.24,25 There are
four types of b-subunits, b1–b4, and they have tissue-specific
distributions. These subunits act as receptors for drugs,
modify drug pharmacological properties and are known to
affect toxin binding.24,25 However, the mode of action of OP-A
does not seem to be the same as that of iberiotoxin. Indeed,
we tested OP-A on human embryonic kidney 293T cells
expressing only a-hslo, and we did not observe the reduction
in the amplitude of the outward currents in these cells,
suggesting that the b-subunit is involved in the reduced
amplitude. The loop of the b-subunit could in fact contribute to
the stabilization of the OP-A-bound state, either by a direct
interaction with OP-A or through an allosteric effect on the
a-subunit. McManus et al.26 have previously shown that the
agonist activity of glycosylated triterpenes, such as dehydrosoyasaponin I, requires the presence of the b-subunit.
BKCa channels have an important role in glioma cell
migration.27 Indeed, after an increase in the Ca2 þ concentration, the BKCa and ClC-3 channels are activated, and release
K þ and Cl ions together with water, causing the rapid
shrinkage of the cells, which facilitates the invasion of the cells
into the narrow extracellular brain spaces.27 Moreover,
calcium is a prominent regulator of cell motility that can exert
multiple effects on the structure and dynamics of the actin
cytoskeleton.28 Consequently, the blockade of BKCa channels and the resulting increase in the (Ca2 þ )i caused by OP-A
could explain, at least in part, the decrease in cell migration, as
previously shown with iberiotoxin, a specific inhibitor of this
channel.29
Hoa et al.5 have previously shown that paraptosis is related
to the modification of BKCa channel activity. Indeed, these
authors hypothesized that the opening of BKCa channels
gives rise to the expulsion of K þ in exchange for Na þ required
to maintain electroneutrality of the cell. The admission of Na þ
leads to the uptake of water, producing the observed cellular
swelling and vacuolization that occurs when the ER and
mitochondria swell. The proposed mechanism through which
OP-A causes death in GBM cells by paraptosis is presented in
Figure 8. We propose (Figure 8) that the closing of the BKCa
channels (Figure 7) in the cell membrane, the ER and the
mitochondria obstructs the expulsion of K þ . The retention of
K þ leads to a rapid increase in the water content to maintain
cell homeostasis, producing the observed cellular swelling
and the formation of cytoplasmic vacuoles (Figure 4). As the
compensatory mechanism, the cells try to expel these
vacuoles by exocytosis. In the second step, the consecutive
depolarization of the membrane most likely causes L-type
voltage-dependent calcium channels activation, causing a
progressive increase in the (Ca2 þ )i, as was detected in U373MG cells after only 6 h of treatment with 1 mM OP-A
(Figure 3b). The coassembly of these channels with BKCa
channels has been demonstrated in rat brains.30 One nonexclusive possibility is that there is an increase in the (Ca2 þ )i
involving IP3/ryanodine receptors, resulting from compensatory mechanisms of the organelles that allow them to maintain
homeostasis.31 A long-term increase in the concentration of
calcium and intracellular electrolytes could be the causes of
Figure 8 Proposed mechanism by which ophiobolin A induces paraptosis in
GBM cells. Ophiobolin A blocks the BKCa channels present on the cell membrane,
mitochondria and ER. The inhibition of BKCa induces an increase in the intracellular
K þ concentration. To maintain homeostasis, water enters the cell, inducing first
swelling and then vacuolization. In order to compensate the electrolyte disorders
because of the excess of the maintenance of homeostasis, these vacuoles could
then be expelled out of the cell by exocytosis. The consecutive depolarization of the
membrane most likely opens the calcium channels present in the membrane,
causing a progressive increase in the (Ca2 þ )i. Another possibility is that this
increase in the (Ca2 þ )i could result from the compensatory mechanisms that the
organelles (mitochondria and ER) use to maintain homeostasis; these mechanisms
could involve IP3/ryanodine receptors
the paraptotic cell death in GBM cells observed in the current
study.
In conclusion, the current report highlights the potential use
of OP-A to overcome the intrinsic resistance of glioblastoma
cells to proapoptotic stimuli through BKCa channel-mediated
induction of paraptosis. Further experiments are in progress
to evaluate the proposed mechanism in detail.
Materials and Methods
Established cell lines, primoculture and OP-A. The human GBM cell
lines U373-MG (ATCC code HTB-17) and T98G (ATCC code CRL1690) were
obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)
and maintained in our laboratory as described previously.32 One distinct primary
GBM cell culture of astrocytic origin (designated GL19 in the present study) was
established at the Department of Neurosurgery, Wagner Jauregg Hospital, Linz as
previously described.33 Briefly, surgical specimens of histocytologically confirmed
GBM lesions from various sites were blended mechanically and transferred into
culture flasks containing growth medium (RPMI 1640, 20% fetal calf serum, 1%
glutamine, 1% penicillin/streptomycin; PAA Laboratories, Linz, Austria). After
passage 3, the cells were cultured in growth medium supplemented with 10% fetal
calf serum and 1% glutamine without antibiotics. OP-A was isolated from
Drechslera gigantea as previously reported.34 The purity of OP-A (495%) was
determined by RP-HPLC-UV.
Assessment of cell viability. The colorimetric MTT viability assay (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide; Sigma, Bornem, Belgium)
was used to determine the overall growth level of each cell line at 72 h as
described previously.35 The level of cell death was assessed by trypan blue
(Sigma) exclusion and was calculated as the average percentage of dead cells in
six fields per T25 flask at a magnification of G 10 using an Olympus microscope
(Olympus, Antwerp, Belgium). For the assessment of cell death after treatment
with CHX (Sigma), U373-MG cells were seeded in 96-well plates. The next day,
0.25 mg/ml CHX was added for 4 h. Then, U373-MG cells were treated with 1 mM
OP-A for 24 h, and the level of cell viability was determined using the colorimetric
MTT assay.
Computer-assisted phase contrast microscopy (video microscopy). The effects of OP-A treatment on the viability of human U373-MG
(1 mM), T98G (2 mM) and GL19 (4 mM) GBM cells were characterized in vitro using
computer-assisted phase contrast video microscopy, as described elsewhere.36
Cell Death and Disease
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
10
Cell count-based determination of the GG indices: The GG indices
obtained under the treated and control conditions were computed by quantitative
video microscopy, dividing the number of cells at the 24th, 48th and 72nd hour of
analysis by the number of cells at time 0.
Quantitative determination of cell migration: The effect of OP-A (1 mM) on
cell motility in the U373-MG GBM cell line was investigated. Figure 3c shows
typical analysis based on the individual cell trajectories that were established by a
cell-tracking algorithm based on an image series acquired during a cell migration
experiment. The greatest linear distance between the starting point of a cell and
the farthest point reached in its trajectory, also known as the maximum relative
distance from the point of origin (MRDO), was the quantitative variable used to
characterize compound-mediated effects on cancer cell migration.37
Immunofluorescence/pseudo-confocal microscopy. U373-MG cells
were cultured on glass coverslips, fixed with 4% paraformaldehyde, permeabilized
in 0.2% Triton X-100 and stained as previously reported.38,39 Fluorescent phalloidin
conjugated with Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke,
Belgium) was used to label fibrillar actin, and Alexa Fluor 594-conjugated
DNAse I (Molecular Probes, Invitrogen) was used to stain globular actin. U373-MG
cells were probed with a rabbit anti-KCa1.1 (a-subunit BKCa) antibody (1 : 50,
Alomone Labs, Jerusalem, Israel). Mitochondria were stained with MitoTracker
Green FM (100 nM; Invitrogen). The ER was stained with ER-Tracker Blue-White
DPX (1 mM, Invitrogen) for living cells or with a mouse anti-GRP78 antibody
(1 : 100, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA). Secondary antibodies were
purchased from Pierce (Aalst, Belgium). Coverslips were mounted on microscope
slides with 10 ml of polyvinyl alcohol mounting medium with the DABCO antifading
reagent (Fluka, Belgium). Three coverslips per experimental condition were
analyzed, and three images were taken for each coverslip (with the same exposure
time) with an AxioCam HRm fluorescence microscope (Zeiss, Oberkochen,
Germany). The most representative images are shown.
Cytosolic Free Ca2 þ Measurements. U373-MG cells, plated on 22 mm
round glass coverslips, were incubated with 1 mM Fura-2/AM (Calbiochem,
Camarillo, CA, USA) in Krebs-HEPES buffer (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 6 mM
KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM glucose, pH 7.4) for 60 min at room
temperature. Coverslips were then mounted in a microscope chamber. Cells were
alternately excited (1 Hz) at 340 and 380 nm using a Lambda DG-4 Ultra High
Speed Wavelength Switcher (Sutter Instrument, Novato, CA, USA) coupled to a
Zeiss Axiovert 200 M inverted microscope (Zeiss Belgium, Zaventem, Belgium).
Images were acquired with a Zeiss Axiocam camera coupled to a 510-nm
emission filter and analyzed with Axiovision software. Calcium concentration was
evaluated from the ratio of fluorescence emission intensities excited at the two
wavelengths using the Grynkiewicz equation.40
Flow cytometry. For cell cycle analyses, U373-MG cells were stained with
1 mg/ml propidium iodide (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium) containing 1 mg/ml
RNase (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany) and analyzed using a
Cell Lab Quanta SC FCM (Beckman Coulter; Analis, Suarlee, Belgium).
Apoptosis was detected using an assay measuring DNA fragmentation and
annexin V staining. The TUNEL assay was performed according to a previously
described procedure32 with the APO-DIRECT Kit (BD Pharmingen, ErembodegemAalst, Belgium). The protocol provided by the manufacturer was followed, including
the use of positive and negative controls. The appearance of phosphatidyl-serine on
the extracellular side of the cell membrane was also quantified with the Alexa Fluor
488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (Molecular Probes, Invitrogen) as
recommended by the manufacturer using FCM.
AO (Sigma), used to stain acidic vacuoles (red staining: 568 nm) and to stain
membrane permeabilization of lysosomes (green staining: 488 nm), was added at a
final concentration of 1 mg/ml for a period of 15 min. The stained cells were
analyzed by a Cell Lab Quanta SC FCM (Beckman Coulter) and by an AxioCam
HRm fluorescence microscope (Zeiss).
Immunoblotting. Membranes were blotted with anti-CD44 (1 : 2500, Abcam,
Cambridge, UK), anti-nestin (1 : 60, Abcam), anti-PARP (1 : 250, BD Pharmingen,
Erembodegem-Aalst, Belgium), anti-KCa1.1 (a-subunit BKCa; 1 : 500, Alomone
Labs) and anti-tubulin (1 : 5000, Abcam). Secondary antibodies were purchased
from Pierce, and the blots were analyzed using the Bio-Rad ChemiDoc XRS
Imager (Bio-Rad Laboratories, Nazareth Eke, Belgium).
Cell Death and Disease
Senescence assay. Cell senescence analyses were performed according to
a previously described procedure18 using the Senescence Cells Histochemical
Staining Kit (Sigma), and the cells subsequently imaged using phase contrast
microscopy. The protocol provided by the manufacturer was followed. Doxorubicin
(100 nM)-treated A549 NSCLC cells were used as a positive control for SA-b-gal
expression.
Electrophysiology (patch clamp). Whole-cell potassium currents were
recorded as previously described.41 Briefly, U373-MG cells were seeded in 35-mm
petri dishes at 4000 cells/cm2. Before electrophysiological recording experiments,
the growth medium was discarded and replaced with a physiological solution.
Signals were captured using a 1322-A Digidata converter (Axon Instruments,
Union City, CA, USA) and pClamp 8.1 software (Axon Instruments). The analyses
were performed using Clampfit 8.1 and Origin 7.0 (Microcal Software,
Northampton, MA, USA).
Statistical analysis. Data are the mean±S.E.M. The nonparametric Mann–
Whitney U-test was used to compare data obtained from two independent groups.
The statistical analysis was performed using Statistica software (StatSoft, Tulsa,
OK, USA). A value of Po0.05 was considered statistically significant.
Conflict of Interest
The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgements. Marina Bury is the holder of a FRIA grant from the
Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS, Belgium) and Robert Kiss is a
director of research at the FNRS. We thank Dr. Maurizio Vurro and Dr. Maria Chira
Zonno, Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, CNR, Bari Italy, who
generously supplied the culture filtrates of D. gigantea.
1. Furnari FB, Fenton T, Bachoo RM, Mukasa A, Stommel JM, Stegh A et al. Malignant
astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev 2007; 21:
2683–2710.
2. Stupp R, Hegi ME, Mason WP, van den Bent MJ, Taphoorn MJ, Janzer RC et al. Effects of
radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on
survival in glioblastoma in a randomized phase III study: 5-year analysis of the EORTCNCIC trial. Lancet Oncol 2009; 10: 459–466.
3. McLendon R, Friedman A, Bigner D, Van Meir EG, Brat DJ, Mastrogianakis GM et al.
Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core
pathways. Nature 2008; 455: 1061–1068.
4. Sperandio S, de Belle I, Bredesen DE. An alternative, nonapoptotic form of programmed
cell death. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 14376–14381.
5. Hoa NT, Zhang JG, Delgado CL, Myers MP, Callahan LL, Vandeusen G et al. Human
monocytes kill M-CSF-expressing glioma cells by BK channel activation. Lab Invest 2007;
87: 115–129.
6. Sugawara F, Strobel G, Strange RN, Siedow JN, Van duyne GD, Clardy J. Phytotoxins
from the pathogenic fungi Drechslera maydis and Drechslera sorghicola. Proc Natl Acad
Sci USA 1987; 84: 3081–3085.
7. Au TK, Chick WS, Leung PC. The biology of ophiobolins. Life Sci 2000; 67: 733–742.
8. Tipton CL, Paulsen PV, Betts RE. Effects of ophiobolin A on ion leakage and hexose
uptake by maize roots. Plant Physiol 1977; 59: 907–910.
9. Cocucci SM, Morgutti S, Cocucci M, Gianani L. Effects of ophiobolin A on potassium
permeability, transmembrane electrical potential and proton extrusion in maize roots. Plant
Sci Lett 1983; 32: 9–16.
10. Fujiwara H, Matsunaga K, Kumagai H, Ishizuka M, Ohizumi Y. Ophiobolin A, a novel
apoptosis-inducing agent from fungus strain f-7438. Pharm Pharmacol Commun 2000; 6:
427–431.
11. Chen J, McKay RM, Parada LF. Malignant glioma: lessons from genomics, mouse models,
and stem cells. Cell 2012; 149: 36–47.
12. Haar CP, Hebbar P, Wallace GC 4th, Das A, Vandergrift WA 3rd, Smith JA et al. Drug
resistance in glioblastoma: a mini review. Neurochem Res 2012; 37: 1192–1200.
13. Van Meir EG, Kikuchi T, Tada M, Li H, Diserens AC, Wojcik BE et al. Analysis of the p53
gene and its expression in human glioblastoma cells. Cancer Res 1994; 54: 649–652.
14. Gomez-Manzano C, Fueyo J, Kyritsis AP, McDonnell TJ, Steck PA, Levin VA et al.
Characterization of p53 and p21 functional interactions in glioma cells en route to
apoptosis. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 1036–1044.
15. Rottner K, Stradal TE. Actin dynamics and turnover in cell motility. Curr Opin Cell Biol 2011;
23: 569–578.
16. Mégalizzi V. Implication des récepteurs sigma et de leurs ligands dans la biologie des
cancers. PhD Thesis, Université Libre de Bruxelles (ULB), 2011. Available at http://
Ophiobolin-induced paraptosis in glioblastoma
M Bury et al
11
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
theses.ulb.ac.be/ETD-db/collection/available/ULBetd-07042011-121707/unrestricted/
TheseVMegacorps.pdf.
O’Callaghan-Sunol C, Gabai VL, Sherman MY. Hsp27 modulates p53 signaling and
suppresses cellular senescence. Cancer Res 2007; 67: 11779–11788.
Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C et al. A biomarker that identifies
senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 1995;
92: 9363–9367.
Litwiniec A, Grzanka A, Helmin-Basa A, Gackowska L, Grzanka D. Features of senescence
and cell death induced by doxorubicin in A549 cells: organization and level of selected
cytoskeletal proteins. J Cancer Res Clin Oncol 2010; 136: 717–736.
Galvez A, Gimenez-Gallego G, Reuben JP, Roy-Contancin L, Feigenbaum P, Kaczorowski
GJ et al. Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high
conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus
tamulus. J Biol Chem 1990; 5: 11083–11090.
Ransom CB, Sontheimer H. BK channels in human glioma cells. J Neurophysiol 2001; 85:
790–803.
Weaver AK, Liu X, Sontheimer H. Role for calcium-activated potassium channels (BK) in
growth control of human malignant glioma cells. J Neurosci Res 2004; 15: 224–234.
Candia S, Garcia ML, Latorre R. Mode of action of iberiotoxin, a potent blocker of the large
conductance Ca(2 þ )-activated K þ channel. Biophys J 1992; 63: 583–590.
Kaczorowski GJ, Knaus HG, Leonard RJ, McManus OB, Garcia ML. High-conductance
calcium-activated potassium channels; structure, pharmacology, and function. J Bioenerg
Biomembr 1996; 28: 255–267.
Orio P, Rojas P, Ferreira G, Latorre R. New disguises for an old channel: MaxiK channel
beta-subunits. News Physiol Sci 2002; 17: 156–161.
McManus OB, Helms LM, Pallanck L, Ganetzky B, Swanson R, Leonard RJ. Functional
role of the b subunit of high conductance calcium-activated potassium channels. Neuron
1995; 14: 645–650.
Sontheimer H. An unexpected role for ion channels in brain tumor metastasis. Exp Biol
Med 2008; 233: 779–791.
Furukawa R, Maselli A, Thomson SA, Lim RW, Stokes JV, Fechheimer M. Calcium
regulation of actin crosslinking is important for function of the actin cytoskeleton in
Dictyostelium. J Cell Sci 2003; 116: 187–196.
Weaver AK, Bomben VC, Sontheimer H. Expression and function of calcium-activated
potassium channels in human glioma cells. Glia 2006; 54: 223–233.
Grunnet M, Kaufmann WA. Coassembly of big conductance Ca2 þ -activated K þ channels
and L-type voltage-gated Ca2 þ channels in rat brain. J Biol Chem 2004; 279: 36445–36453.
Calenda G, Suadicani SO, Iglesias R, Spray DC, Melman A, Davies KP. Silencing MaxiK
activity in corporal smooth muscle cells initiates compensatory mechanisms to maintain
calcium homeostasis. J Sex Med 2011; 8: 2191–2204.
32. Lallemand B, Chaix F, Bury M, Bruyère C, Ghostin J, Becker JP et al. N-(2-{3-[3,5bis(trifluoromethyl)phenyl]ureido}ethyl)-glycyrrhetinamide(6b): a novel anticancer glycyrrhetinic
acid derivative that targets the proteasome and displays anti-kinase activity. J Med Chem 2011;
54: 6501–6513.
33. Berger W, Spiegl-Kreinecker S, Buchroithner J, Elbling L, Pirker C, Fischer J et al. Overexpression of the human major vault protein in astrocytic brain tumor cells. Int J Cancer
2001; 94: 377–382.
34. Evidente A, Andolfi A, Cimmino A, Vurro M, Fracchiolla M, Charudattan R. Herbicidal
potential of ophiobolins produced by Drechslera gigantea. J Agric Food Chem 2006; 54:
1779–1783.
35. Mosmann T. Rapid colorimetrie assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Meth 1983; 65: 55–63.
36. Debeir O, Mégalizzi V, Warzée N, Kiss R, Decaestecker C. Video-microscopic extraction of
specific information on cell proliferation and migration in vitro. Exp Cell Res 2008; 314:
2985–2998.
37. Mégalizzi V, Decaestecker C, Debeir O, Spiegl-Kreinecker S, Berger W, Lefranc F et al.
Screening of anti-glioma effects induced by sigma-1 receptor ligands: potential new use for
old anti-psychiatric medicines. Eur J Cancer 2009; 45: 2893–2905.
38. Mégalizzi V, Mathieu V, Mijatovic T, Gailly P, Debeir O, De Neve N et al. 4-IBP, a sigma1
receptor agonist, decreases the migration of human cancer cells, including glioblastoma
cells, in vitro and sensitizes them in vitro and in vivo to cytotoxic insults of proapoptotic and
proautophagic drugs. Neoplasia 2007; 9: 358–369.
39. Le Calvé B, Rynkowski M, Le Mercier M, Bruyère C, Lonez C, Gras T et al. Long-term
in vitro treatment of human glioblastoma cells with temozolomide increases resistance
in vivo through up-regulation of GLUT transporter and aldo-keto reductase enzyme AKR1C
expression. Neoplasia 2010; 12: 727–739.
40. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly
improved fluorescence properties. J Biol Chem 1985; 260: 3440–3450.
41. Roger S, Potier M, Vandier C, Le Guennec JY, Besson P. Description and role in
proliferation of iberiotoxin-sensitive currents in different human mammary epithelial normal
and cancerous cells. Biochim Biophys Acta 2004; 1667: 190–199.
Cell Death and Disease is an open-access journal
published by Nature Publishing Group. This work is
licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercialNoDerivs 3.0 Unported License. To view a copy of this license, visit
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/
Cell Death and Disease
DISCUSSION
DISCUSSION
Le glioblastome est la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs cérébrales primaires.
Malgré que les patients atteints de glioblastome bénéficient d’un traitement pluridisciplinaire
associant la chirurgie suivie d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie concomitante avec le
témozolomide, leur médiane de survie est de 15 mois et aucun d’entre eux n’a pu être guéri à
ce jour (Stupp et coll., 2009). Le pronostic défavorable des glioblastomes est associé à leur
capacité d’invasion diffuse au sein du parenchyme cérébral qui rend impossible une résection
chirurgicale complète. De plus, les cellules tumorales gliales migrantes sont protégées contre
la majorité des agents chimiothérapeutiques actuellement utilisés en clinique en raison de leur
résistance aux stimuli pro-apoptotiques (Giese et coll., 2003).
Notre groupe de recherche est spécialisé dans l’identification de nouvelles substances
anticancéreuses d'origine naturelle susceptibles de court-circuiter la résistance de certains
types de cancers et plus particulièrement les glioblastomes aux stimuli pro-apoptotiques. Dans
ce travail, nous nous sommes intéressés aux propriétés antitumorales de la fusicoccine A et de
l’ophioboline A avec pour cibles privilégiées les cellules gliales tumorales.
I. L’intérêt de la fusicoccine A dans le traitement du glioblastome.
La fusicoccine A est un diterpénoïde tricyclique glycosylé extrait du champignon
Phomopsis amygdali. Dans un premier temps, nous avons démontré à l’aide du test
colorimétrique MTT que l’activité inhibitrice de croissance in vitro de cette molécule n’était
pas dépendante du degré de sensibilité ou de résistance à l’apoptose des cellules gliales
tumorales. Ce test nous a également permis de mettre en évidence que la fusicoccine A
possédait un indice de biosélectivité entre cellules normales et cellules cancéreuses supérieur
à 10, indiquant que la cible de cette molécule est probablement surexprimée dans les cellules
cancéreuses. Dans un second temps, la vidéomicroscopie quantitative a révélé que la
fusicoccine A avait principalement des effets cytostatiques sur les cellules de glioblastome,
notamment en augmentant la durée des divisions. En plus de ses effets sur la prolifération
cellulaire, la fusicoccine A peut diminuer la migration des cellules de glioblastome dans des
modèles de culture bidimensionnels (comme montré en vidéomicroscopie quantitative) et
tridimensionnels (chambres d’invasion de Boyden) mais également leur adhésion. Les
68
modifications de l’organisation du cytosquelette d’actine induites par la fusicoccine A
peuvent expliquer, au moins en partie, ces derniers résultats. Grâce aux tests proposés par la
société ProQinase, nous avons pu montrer que la fusicoccine A inhibait de plus de 50 %
l’activité résiduelle d’une dizaine de protéines kinases dont la plupart interviennent dans
l’organisation du cytosquelette d’actine. Nous avons décidé de nous intéresser
particulièrement à la kinase d’adhérence focale (FAK) pour les raisons que nous citerons cidessous. Nous avons observé par western blot que la fusicoccine A diminuait
l’autophosphorylation du résidu tyrosine 397 (Y397) de la kinase FAK dans les cellules de
glioblastome de manière dose-dépendante en conditions normoxiques et hypoxiques. Lorsque
la fusicoccine A a été testée sur des cellules de glioblastome surexprimant cette kinase FAK,
sa concentration d’inhibition de croissance IC50 a été doublée par rapport à celle obtenue sur
des cellules contrôles. Ces résultats ont d confirmé que la kinase FAK était associée aux effets
anticancéreux in vitro de la fusicoccine A. Cependant, nous n’avons pas encore pu identifier
le site de liaison de notre molécule avec la kinase FAK. La fusicoccine A présente des effets
anticancéreux similaires à ceux décrits pour le 1,2,4,5-benzene tetraamine tetrahydrocloride
(Y15) (Golubovskaya et coll., 2008). En effet, comme la fusicoccine A, ce composé diminue
la prolifération, l’invasion et l’adhésion des cellules cancéreuses et ce, en inhibant
l’autophosphorylation de la kinase FAK et l’activité kinase de cette protéine. À l’aide d’une
étude de liaison in silico (docking moléculaire), Golubovskaya et ses collaborateurs ont
démontré qu’Y15 avait une affinité pour le site Y397 (Golubovskaya et coll., 2008). Nous
envisageons de collaborer avec le Dr M. Prévost, spécialisée en docking moléculaire,
(Laboratoire de Structure et Fonction des Membranes Biologiques, Centre de Biologie
Structurelle et Bioinformatique, Faculté des Sciences, ULB) afin d’identifier le site de liaison
de la fusicoccine A avec la protéine kinase FAK.
La protéine kinase FAK est une cible d’intérêt pour le traitement des
glioblastomes.
La kinase FAK est une protéine cytoplasmique jouant un rôle important au sein du
complexe d’adhérence. Son activation par les intégrines ou les facteurs de croissance se
manifeste par l’autophosphorylation du résidu tyrosine 397 libérant un site de liaison pour la
protéine Src. Cette liaison entraine l’activation des protéines du complexe d’adhérence qui va
aboutir à l’activation des voies de signalisation de PI3K/Akt, de ERK et de JNK (Cornillon et
69
coll., 2003 ; McLean et coll., 2005). La protéine FAK est surexprimée dans différentes lignées
cellulaires cancéreuses dont des glioblastomes. La surexpression de la kinase FAK augmente
la prolifération et la migration des cellules tumorales mais également les protège de
l’apoptose. La surexpression de cette protéine est directement corrélée avec la progression
tumorale et est donc associée à un pronostic clinique défavorable (Cornillon et coll., 2003 ;
Natarajan et coll., 2003 ; McLean et coll., 2005 ; Siesser et Hanks, 2006).
De plus, Skuli et ses collaborateurs ont mis en évidence que les voies de signalisation de
l’adhérence cellulaire pouvaient être modulées par les conditions d’oxygénation des cellules
(Skuli et coll., 2009). Tout d’abord, ils ont démontré que dans les cellules de gliome U87 et
SF763, l’hypoxie augmente la formation de points focaux d’adhérence impliquant les
intégrines αVβ3 et αVβ5 et que cette augmentation était corrélée avec l’expression de la
protéine FAK. Ils ont également montré que les voies d’adhérence cellulaire, via l’inhibition
des intégrines et de la kinase FAK par des siRNA spécifiques, pouvaient réguler la réponse et
l’adaptation des cellules à l’hypoxie en contrôlant le taux intracellulaire de la sous-unité HIF1α. Dans les cellules U87 et SF763, l’inhibition des intégrines αVβ3 et αVβ5 et de la protéine
FAK diminue l’expression du facteur HIF-1α. Ensuite, ces auteurs ont vérifié in vivo sur des
xénogreffes de cellules U87 l’effet de l’inhibition des voies de l’adhérence cellulaire en
injectant directement dans les tumeurs des siRNA ciblant l’intégrine αVβ3 et la kinase FAK.
Ces expériences in vivo leur ont permis de mettre en évidence que l’inhibition de ces deux
protéines entrainait une ré-oxygénation des xénogreffes corrélée avec une diminution de
l’expression de HIF-1α et une normalisation de la vascularisation des tumeurs (Skuli et coll.,
2009).
De par sa surexpression et sa capacité à réguler les différentes voies de signalisation
impliquées dans le pronostic défavorable des glioblastomes, la kinase FAK représente une
cible d’intérêt (Cornillon et coll., 2003 ; Gabarra-Niecko et coll., 2005 ; McLean et coll.,
2005; Skuli et coll., 2009). La fusicoccine A est par conséquent un agent thérapeutique
potentiel pour combattre les glioblastomes. Notre groupe de recherche a déjà montré
auparavant que l’utilisation d’un agent anti-invasif pouvait améliorer la sensibilité des cellules
de glioblastome in vitro et in vivo aux insultes cytotoxiques d’agents pro-apoptotiques et proautophagiques (Mégalizzi et coll., 2007). Golubovskaya et ses collaborateurs ont récemment
démontré qu’Y15, un inhibiteur de l’autophosphorylation de FAK, pouvait agir en synergie
avec le témozolomide et ainsi bloquer totalement la croissance de la tumeur in vivo. Une dose
70
de 100 mg/kg d’Y15 a été administrée quotidiennement par voie orale à des souris
immunodéficientes porteuses de xénogreffes de glioblastome (Golubovskaya et coll., 2013).
Alors qu’il faut 50 µM de fusicoccine A pour diminuer de 50 % l’invasion in vitro des
cellules de glioblastome après 24 heures de traitement, ce groupe de recherche a montré qu’1
µM d’Y15 suffisait à obtenir ces mêmes résultats. Cette différence d’activité in vitro peut
expliquer que n’avons pas observé de bénéfices thérapeutiques avec la fusicoccine A dans
notre modèle in vivo, la dose de 80 mg/kg injectée 3 fois par semaine en intrapéritonéal étant
probablement trop faible.
II. L’intérêt de l’ophioboline A dans le traitement du
glioblastome.
L’ophioboline A est un sesterterpénoïde isolé du champignon Drechslera gigantea. Tout
d’abord, nous avons montré à l’aide du test colorimétrique MTT que l’activité inhibitrice de
croissance in vitro de cette molécule n’était pas dépendante du degré de sensibilité ou de
résistance à l’apoptose des cellules gliales tumorales. Nous avons également mis en évidence
par ce test que les effets antiprolifératifs in vitro de l’ophioboline A ne dépendaient pas de
mécanismes de résistance multi-drogue. Plus précisément, les cellules cancéreuses
surexprimant les principaux transporteurs ABC à savoir P-gp, MRP1 et BCRP, se sont
comportés en termes de croissance exactement comme les cellules chimiosensibles face à
l’ophioboline A. Ensuite, nous avons observé que les changements d’organisation du
cytosquelette d’actine et l’augmentation de la concentration intracellulaire en calcium induits
par l’ophioboline A étaient corrélés à la diminution de la migration quantifiée par
vidéomicroscopie. Cette technique a aussi révélé que l’ophioboline A avait des effets
cytotoxiques sur les cellules de glioblastome. Nous avons ensuite démontré que l'ophioboline
A induisait la mort de ces cellules par une mort non-apoptotique, la paraptose. Et pour finir,
nous avons identifié le canal ionique BKCa comme cible de l’ophioboline A. Par contre,
comme pour la fusicoccine A et la kinase FAK, nous n’avons pas étudié précisément les
interactions de l’ophioboline A avec BKCa. Weaver et ses collaborateurs ont montré que
l’ibériotoxine, qui est une toxine peptidique isolée du venin de scorpion Buthus tamulus
bloquant spécifiquement les canaux BKCa, diminue la prolifération des cellules de gliome en
augmentant le pourcentage de cellules en phase S du cycle cellulaire avant d’induire la mort
de ces cellules (Candia et coll., 1992 ; Weaver et coll., 2006). L’ibériotoxine se fixe sur la
71
partie externe du canal et empêche par encombrement stérique le passage des ions potassium
(Candia et coll., 1992). Les canaux BKCa sont constitués d’un tétramère d’isoformes de la
sous-unité α pouvant être chacune complexée à une sous-unité β. La sous-unité α ubiquitaire,
codée par le gène hslo pour human slowpoke, possède les sites régulateurs de l’activité de
BKCa et forme le pore ionique. Il existe quatre types de sous-unités β (β1-4) dont la
distribution est spécifique à certains types cellulaires. Ces sous-unités β peuvent moduler la
fixation de certaines toxines (Kaczorowski et coll., 1996 ; Orio et coll., 2002). Même si les
effets de l’ibériotoxine sont similaires à ceux que nous avons obtenus avec l’ophioboline A
sur les cellules de gliome, le mode d’action de l’ophioboline A ne semble pas être le même
que celui de cette toxine comme l’indique nos résultats préliminaires. En effet, lorsque nous
avons testé l’ophioboline A sur des cellules de rein embryonnaire humain HEK293T
exprimant seulement la sous-unité α, nous n’avons pas observé une diminution de l’activité du
canal BKCa. Ceci suggère qu’une ou plusieurs sous-unités β seraient impliquées dans le
mécanisme d’action de l’ophioboline A. Ces sous-unités β pourraient contribuer à stabiliser la
liaison de l’ophioboline A au canal BKCa par une interaction directe avec la molécule ou par
un effet allostérique sur la sous-unité α. McManus et ses collaborateurs ont déjà montré que
l’activité agoniste de la déhydrosoyasaponine I, un triterpène glycosylé, nécessite la présence
de la sous-unité β alors que le site de fixation se trouve sur la sous-unité α. Plus précisément,
la sous-unité β2 modifie la pharmacologie du canal BKCa en augmentant son affinité par
rapport à un canal formé de sous-unités α uniquement (McManus et coll., 1993 et 1995 ;
Wallner et coll., 1999). Vu qu’actuellement seule la structure de la sous-unité α du canal
BKCa est cristallisée, nous ne pouvons pas utiliser le docking moléculaire afin d’étudier de
manière plus approfondie le mécanisme d’action de l’ophioboline A (Wu et coll., 2010 ; Yuan
et coll., 2010). Par contre, nous pourrions analyser l’expression des sous-unités α et β dans les
différentes lignées de gliome utilisées dans ce travail par RT-PCR. En fonction des résultats
obtenus, nous pourrions utiliser des siRNA dirigés contre les sous-unités β exprimées afin de
tester les effets anticancéreux de l’ophioboline A dans ces cellules gliales tumorales
déficientes pour l’une ou l’autre des sous-unités du canal BKCa.
72
Le canal ionique BKCa est une cible d’intérêt pour le traitement des
glioblastomes.
Le canal ionique BKCa est le principal canal potassique exprimé dans les cellules gliales
tumorales (Weaver et coll., 2006). De plus, l’évaluation des tissus prélevés par biopsie chez
des patients atteints de gliome de haut grade a révélé une surexpression de ce canal dans ces
tumeurs (Weaver et coll., 2006). Il a été démontré que ce canal BKCa avait un rôle dans la
prolifération et la migration des gliomes diffus mais également qu’il pouvait être impliqué
dans la paraptose (Weaver et coll., 2006 ; Hoa et coll., 2007 ; Sontheimer, 2008). En
intervenant dans ces différents processus cellulaires, il constitue une cible d’intérêt pour le
traitement des glioblastomes.
Le rôle du canal BKCa dans la migration des cellules gliales tumorales a été mis en avant
par Sontheimer : suite à une augmentation de calcium, les canaux potassiques BKCa et les
canaux chlorures ClC-3 seraient activés (Sontheimer, 2008). Les efflux de K+ et de Clconduiraient à la sortie de molécules d’eau par osmose. Le volume ainsi diminué de la cellule
faciliterait ensuite la migration des cellules dans le parenchyme cérébral (Sontheimer, 2008).
La chlorotoxine, qui est une toxine peptidique extraite du venin de scorpion Leiurus
quinquestriatus, est capable de diminuer la migration des gliomes en bloquant les canaux
ClC-3 (Yin et coll., 2007). Les effets de cette molécule ont été testés en essais cliniques de
phase I sur des patients atteints de gliomes récurrents. Les résultats ont montré que la
chlorotoxine était spécifique au tissu glial tumoral, bien tolérée et pouvait avoir un effet antitumoral (Mamelak et coll., 2006 ; Yin et coll., 2007). Le fait que cette molécule soit
actuellement en phase II clinique est encourageant et montre le potentiel des inhibiteurs des
canaux ioniques dans le traitement des glioblastomes.
Hoa et ses collaborateurs ont démontré que la paraptose pouvait être liée aux modifications
de l’activité du canal BKCa (Hoa et coll., 2007). En effet, ces auteurs ont émis l’hypothèse
selon laquelle lorsque les canaux BKCa étaient activés, ils entraineraient un efflux d’ions
potassium hors de la cellule et des organites comme les mitochondries et le réticulum
endoplasmique. Afin de maintenir l’électroneutralité, des ions sodium entreraient dans les
différents compartiments. Ces mouvements ioniques s’accompagneraient d’une entrée d’eau,
entrainant la dilatation des cellules et la formation de vacuoles cytoplasmiques dérivées des
73
organelles, spécifiques de la paraptose (Hoa et coll., 2007). Dans notre travail, le mécanisme
proposé par lequel l’ophioboline A induirait la mort des cellules de glioblastome par
paraptose est différent. Nous avons suggéré que la fermeture des canaux BKCa au niveau de
la membrane, du réticulum endoplasmique et des mitochondries induite par l’ophioboline A
empêcherait l’expulsion des ions potassium. La rétention de ces ions conduirait rapidement à
une augmentation de l’eau dans les différents compartiments afin de maintenir l’homéostasie
cellulaire, entrainant la dilatation des cellules et la formation de vacuoles cytoplasmiques.
Dans un premier temps, les cellules expulseraient ces vacuoles par exocytose. Ensuite, la
dépolarisation consécutive de la membrane entrainerait probablement l’activation des canaux
calciques dépendants du voltage de type L qui vont augmenter progressivement la
concentration intracellulaire en calcium. Le co-assemblage de ces canaux avec BKCa a été
démontré dans le cerveau de rat (Grunnet et Kaufmann, 2004). L’augmentation de la
concentration intracellulaire en calcium pourrait également s’expliquer par le fait que les
organelles pour maintenir leur propre homéostasie activeraient les récepteurs de la ryanodine
ou de l’IP3 (inositol 1,4,5-triphosphate) (Calenda et coll., 2011). Une augmentation à longterme de la concentration du calcium et des électrolytes pourrait être la cause de la mort par
paraptose des cellules de glioblastome observée dans ce travail.
III. Perspectives de développement de la fusicoccine A et de
l’ophioboline A.
1. Évaluation in vivo.
Les quantités de fusicoccine A et d’ophioboline A en notre possession n’étant pas
suffisantes, nous n’avons pas pu optimiser les expériences in vivo utilisant le modèle B16F10
en testant différentes doses. Cependant, l’ophioboline A a montré une augmentation
significative de la survie dans ce modèle. Avec des quantités plus importantes de fusicoccine
A et d’ophioboline A, nous souhaiterions dans un premier temps analyser leurs
caractéristiques physicochimiques qui sont des paramètres essentiels à l’évaluation
préclinique de ces composés. La « règle des cinq de Lipinski » permet d’estimer in silico la
biodisponibilité d’un composé par voie orale à partir de sa structure bidimensionnelle
(Lipinski et coll., 2001). L’ophioboline A s’inscrit dans les marges des critères imposés par
cette règle, contrairement à la fusicoccine A. La formulation galénique devra donc être
74
adaptée aux paramètres physicochimiques de chaque composé et à la voie d’administration
souhaitée. Nous devrons également tenir compte du fait que la délivrance thérapeutique pour
les tumeurs cérébrales est limitée par la barrière hémato-encéphalique (BHE) (Lesniak et
Brem, 2004). Les principales stratégies favorisant l’apport des médicaments au niveau du
cerveau consistent à améliorer la perméabilité des composés à traverser la BHE, à moduler la
BHE ou à utiliser des systèmes d’administrations localisés (Lesniak et Brem, 2004).
Dans le cas où nous envisagerions une administration orale, la stabilité métabolique de nos
composés pourrait être prédite à l’aide du test des microsomes hépatiques humains et de
souris développé au sein du laboratoire (Lallemand, 2012). Cette simulation de métabolisation
in vitro permet d’observer s’il y a formation ou non d’un métabolite en présence d’un panel
important d’enzymes hépatiques.
Ensuite, il faudra déterminer la dose maximale tolérée (DMT) de ces composés chez la
souris de manière chronique selon un schéma d’administrations qui pourrait être utilisé
ultérieurement pour des études d’activité anti-tumorale in vivo chez des souris porteuses de
tumeur.
Une
fois
cette
dose
DMT
déterminée,
nous
caractériserons
le
profil
pharmacocinétique plasmatique de ces molécules ainsi que leur distribution dans les organes
et plus particulièrement dans le cerveau. Pour finir, nous envisagerons de tester la fusicoccine
A et l’ophioboline A seules ou en combinaison avec d’autres agents anticancéreux comme le
témozolomide dans des modèles de xénogreffes orthotopiques de glioblastomes humains
implantées dans le cerveau de souris immunodéficientes (Mégalizzi et coll., 2007, Le Calvé et
coll., 2010, Golubovskaya et coll., 2013).
2. Hémisynthèse de dérivés de la fusicoccine A et de l’ophioboline A.
La fusicoccine A et l’ophioboline A, étant des molécules naturelles, ne peuvent pas être
brevetées. C’est pourquoi nous envisageons, via une collaboration avec le Prof. A. Evidente,
la synthèse d’hémidérivés de ces deux molécules. Dans le cas de la fusicoccine A, nous
pourrions utiliser le docking moléculaire dont on a parlé précédemment pour orienter la
synthèse de ces hémidérivés.
75
CONCLUSIONS
CONCLUSIONS
Au cours de ce travail, nous avons caractérisé l’activité anticancéreuse de la fusicoccine A
et de l’ophioboline A mais également identifié, au moins en partie, leur mécanisme d’action.
Nous nous sommes particulièrement intéressés aux glioblastomes qui sont associés à un
pronostic très sombre de par leur caractère très invasif et leur résistance aux stimuli proapoptotique.
Tout d’abord, nos résultats ont révélé que l’activité inhibitrice de croissance in vitro de la
fusicoccine A et de l’ophioboline A n’était pas dépendante du degré de sensibilité ou de
résistance à l’apoptose des cellules gliales tumorales. Nous avons ensuite mis en évidence que
la fusicoccine A diminuait l’invasion in vitro des cellules de glioblastome en ciblant la kinase
d’adhérence focale (FAK). Par contre, nous avons montré que l’ophioboline A était capable
d’induire la mort de ces cellules par paraptose en diminuant l’activité du canal ionique BKCa.
La fusicoccine A et l’ophioboline A sont des agents chimiothérapeutiques potentiels pour le
traitement du glioblastome car les cibles de ces deux molécules sont surexprimées dans les
cellules de glioblastome et interviennent dans de nombreux processus cellulaires tels que la
prolifération, la migration et la survie. Enfin, l’activité anti-tumorale in vivo de la fusicoccine
A et de l’ophioboline A, dans des conditions non optimisées, a été évaluée sur un modèle
murin de mélanome métastatique. Seule l’ophioboline A apportait un bénéfice thérapeutique
in vivo lorsqu’elle était administrée par voie intrapéritonéale à une concentration de 10 mg/kg.
Lorsque nous aurons défini la formulation galénique adéquate, la dose maximale tolérée et le
profil pharmacocinétique de ces deux molécules, nous testerons leur activité sur des modèles
de xénogreffes orthotopiques de glioblastomes humains implantées dans le cerveau de souris
immunodéficientes.
76
RÉFÉRENCES
RÉFÉRENCES
Acosta JC, Gil J. (2012) Senescence: a new weapon for cancer therapy. Trends Cell Biol. 22:
211-219.
Adams JM, Difazio LT, Rolandelli RH, Lujan JJ, Hasko G, Csoka, Selmeczy Z, Németh ZH.
(2009) HIF-1: a key mediator in hypoxia. Acta Physiol Hung. 96:19-28.
Agarwal S, Sane R, Gallardo JL, Ohlfest JR, Elmquist WF. (2010) Distribution of gefitinib to
the brain is limited by P-glycoprotein (ABCB1) and breast cancer resistance protein
(ABCG2)-mediated active efflux. J Pharmacol Exp Ther. 334:147-155.
Aggarwal BB. (2003) Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword.
Nat Rev Immunol. 3: 745-756.
Allan JM, Travis LB. (2005) Mechanisms of therapy-related carcinogenesis. Nat Rev Cancer.
5: 943-955.
Aouzal R. (2010) Vers la synthèse du tricyclique ABC du Taxol. PhD Thesis- École
Polytechnique
ParisTech,
Palaiseau,
France,
http://hal.inria.fr/docs/00/51/61/41/PDF/ThA_se_-_RA_mi_Aouzal.pdf.
Atanasova G, Jans R, Zhelev N, Mitev V, Poumay Y (2005) Effects of the cyclin-dependent
kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine) on the physiology of cultured human keratinocytes.
Biochem Pharmacol. 70: 824-836.
Au TK, Chick WS, Leung PC. (2000) The biology of ophiobolins. Life Sci. 67: 733-742.
Ballio A, Chain EB, De Leo P, Erlanger BF, Mauri M, and Tonolo A. (1964) Fusicoccin: a
new wilting toxin produced by Fusicoccum amygdali. Nature. 203, 297.
Ballio A, Brufani M, Casinovi CG, Cerrini S, Fedeli W, Pellicciari R, Santurbano B, Vaciago
A. (1968) Structure of fusicoccin A. Experientia. 24: 631–635.
Ballio A, Casinovi CG, Randazzo G, Rossi C. (1970) Characterization of by-products of
fusicoccin in culture filtrates of Fusicoccum amygdali. Experentia. 26: 349–351.
Bao S, Wu Q, McLendon RE, Hao Y, Shi Q, Hjelmeland AB, Dewhirst MW, Bigner DD,
Rich JN. (2006) Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the
DNA damage response. Nature. 444: 756-760.
Bar EE. (2011) Glioblastoma, cancer stem cells and hypoxia. Brain Pathol. 21: 119-129.
Barrow KD, Barton DHR, Chain E, Ohnsorge UFW, Thomas R. (1968) The constitution of
fusicoccin. Chem Commun., 1198–1200.
Belden CJ, Valdes PA, Ran C, Pastel DA, Harris BT, Fadul CE, Israel MA, Paulsen K,
Roberts DW. (2011) Genetics of glioblastoma: a window into its imaging and histopathologic
variability. Radiographics. 31: 1717-1740.
77
Benyahia B, Huguet S, Declèves X, Mokhtari K, Crinière E, Bernaudin JF, Scherrmann JM,
Delattre JY. (2004) Multidrug resistance-associated protein MRP1 expression in human
gliomas: chemosensitization to vincristine and etoposide by indomethacin in human glioma
cell lines overexpressing MRP1. J Neurooncol. 66: 65-70.
Berger W, Spiegl-Kreinecker S, Buchroithner J, Elbling L, Pirker C, Fischer J, Micksche M.
(2001) Over-expression of the human major vault protein in astrocytic brain tumor cells. Int J
Cancer. 94: 377-382.
Bonavia R, Inda MM, Cavenee WK, Furnari FB. (2011) Heterogeneity maintenance in
glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71: 4055-4060.
Bowles D. (1998) Signal transduction in the wound response of tomato plants. Philos Trans R
Soc Lond B Biol Sci. 353: 1495-510.
Brat DJ, Van Meir EG. (2004) Vaso-occlusive and prothrombotic mechanisms associated
with tumor hypoxia, necrosis, and accelerated growth in glioblastoma. Lab invest. 84: 397405.
Brem H, Piantadosi S, Burger PC, Walker M, Selker R, Vick NA, Black K, Sisti M, Brem S,
Mohr G, et al. (1995) Placebo-controlled trial of safety and efficacy of intraoperative
controlled delivery by biodegradable polymers of chemotherapy for recurrent gliomas. The
Polymer-brain Tumor Treatment Group. Lancet. 345: 1008-1012.
Bunney TD, De Boer AH, Levin M. (2003) Fusicoccin signaling reveals 14-3-3 protein
function as a novel step in left-right patterning during amphibian embryogenesis.
Development. 130: 4847-4858.
Bury M, Andolfi A, Rogister B, Cimmino A, Mégalizzi V, Mathieu V, Feron O, Evidente A,
Kiss R. (2013a) Fusicoccin a, a phytotoxic carbotricyclic diterpene glucoside of fungal origin,
reduces proliferation and invasion of glioblastoma cells by targeting multiple tyrosine kinases.
Transl Oncol. 6:112-123.
Bury M, Novo-Uzal E, Andolfi A, Cimini S, Wauthoz N, Heffeter P, Lallemand B, Avolio F,
Delporte C, Cimmino A, Dubois J, Van Antwerpen P, Zonno MC, Vurro M, Poumay Y,
Berger W, Evidente A, De Gara L, Kiss R, Locato V. (2013b) Ophiobolin A, a sesterterpenoid
fungal phytotoxin, displays higher in vitro growth-inhibitory effects in mammalian than in
plant cells and it also displays in vivo antitumor activity. Int J Oncol., in press.
Caldera V, Mellai M, Annovazzi L, Monzeglio O, Piazzi A, Schiffer D. (2012) MGMT
hypermethylation and MDR system in glioblastoma cancer stem cells. Cancer Genomics
Proteomics. 9: 171-178.
Calenda G, Suadicani SO, Iglesias R, Spray DC, Melman A, Davies KP. (2011) Silencing
MaxiK activity in corporal smooth muscle cells initiates compensatory mechanisms to
maintain calcium homeostasis. J Sex Med. 8: 2191-2204.
Camoni L, Di Lucente C, Visconti S, Aducci P. (2011) The phytotoxin fusicoccin promotes
platelet aggregation via 14-3-3-glycoprotein Ib-IX-V interaction. Biochem J. 436: 429-436.
78
Campisi J, d'Adda di Fagagna F. (2007) Cellular senescence: when bad things happen to good
cells.Nat Rev Mol Cell Biol. 8: 729-740.
Candia S, Garcia ML, Latorre R. (1992) Mode of action of iberiotoxin, a potent blocker of the
large conductance Ca(2+)-activated K+ channel. Biophys J. 63: 583-590.
Canonica L, Fiecchi A, Kienle MG, Scala A. (1966) The constitution of cochliobolin.
Tetrahedron Lett. 11: 1211-1218.
Cartier J, Marivin A, Berthelet J, Dubrez L. (2012) IAPs: a central element in the NF-ΚB
activating signaling pathway. Med Sci. 28: 69-75.
Castro-Obregón S, Del Rio G, Chen SF, Swanson RA, Frankowski H, Rao RV, Stoka V,
Vesce S, Nicholls DG, Bredesen DE. (2002) A ligand-receptor pair that triggers a nonapoptotic form of programmed cell death. Cell Death Differ. 9: 807-817.
Chandra S. (2012) Endophytic fungi: novel sources of anticancer lead molecules. Appl
Microbiol Biotechnol. 95: 47-59.
Chang BD, Broude EV, Dokmanovic M, Zhu H, Ruth A, Xuan Y, Kandel ES, Lausch E,
Christov K, Roninson IB. (1999) A senescence-like phenotype distinguishes tumor cells that
undergo terminal proliferation arrest after exposure to anticancer agents. Cancer Res. 59:
3761-3767.
Chatellard-Causse C, Blot B, Cristina N, Torch S, Missotten M, Sadoul R. (2002) Alix (ALG2-interacting protein X), a protein involved in apoptosis, binds to endophilins and induces
cytoplasmic vacuolization. J Biol Chem. 277: 29108-29115.
Chen J, Li Y, Yu TS, McKay RM, Burns DK, Kernie SG, Parada LF. (2012a) A restricted cell
population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488: 522-526.
Chen J, McKay RM, Parada LF. (2012b) Malignant glioma: lessons from genomics, mouse
models, and stem cells. Cell. 149: 36-47.
Chen TS, Wang XP, Sun L, Wang LX, Xing D, Mok M. (2008) Taxol induces caspaseindependent cytoplasmic vacuolization and cell death through endoplasmic reticulum (ER)
swelling in ASTC-a-1 cells. Cancer Lett. 270: 164-172.
Cocucci SM, Morgutti S, Cocucci M, Gianani L. (1983) Effects of ophiobolin A on potassium
permeability, transmembrane electrical potential and proton extrusion in maize roots. Plant
Science Letters. 32: 9-16.
Codogno P. (2004) Les gènes ATG et la macro-autophagie / Regulation of macroautophagy.
M/S : médecine sciences, vol. 20, n° 8-9, p. 734-736.
Colditz MJ, Leyen Kv, Jeffree RL. (2012) Aminolevulinic acid (ALA)-protoporphyrin IX
fluorescence guided tumour resection. Part 2: theoretical, biochemical and practical aspects. J
Clin Neurosci. 19: 1611-1616.
79
Collado M, Serrano M. (2006) The power and the promise of oncogene-induced senescence
markers. Nat Rev Cancer. 6: 472-476.
Comerford KM, Wallace TJ, Karhausen J, Louis NA, Montalto MC, Colgan SP. (2002)
Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance (MDR1) gene.
Cancer Res. 62: 3387-3347.
Cornillon J, Campos L, Guyotat D. (2003) « Focal adhesion kinase (FAK), une protéine aux
fonctions
multiples ».
M/S :
médecine
sciences.
19 :
743-752,
http://id.erudit.org/iderudit/006837ar.
Cortnum S, Laursen RJ. (2012) Fluorescence-guided resection of gliomas. Dan Med J.
59:A4460.
D'Amours D, Sallmann FR, Dixit VM, Poirier GG. (2001) Gain-of-function of poly(ADPribose) polymerase-1 upon cleavage by apoptotic proteases: implications for apoptosis. J Cell
Sci. 114: 3771-3778.
Debeir O, Van Ham P, Kiss R, Decaestecker C. (2005) Tracking of migrating cells under
phase-contrast video microscopy with combined mean-shift processes. IEEE Transations on
medical imaging. 6: 697-711.
Debeir O, Mégalizzi V, Warzéea N, Kiss R, Decaestecker C. (2008) Videomicroscopic
extraction of specific information on cell proliferation and migration in vitro. Experimental
cell research. 314: 2985-2998.
de Boer AH, de Vries-van Leeuwen IJ. (2012) Fusicoccanes: diterpenes with surprising
biological functions. Trends Plant Sci. 17: 360-368.
Denis JN, Greene AE, Guénard D, Guéritte-Voegelein F, Mangatal L, Potier P. (1988) A
highly efficient, practical approach to natural taxol. J Am Chem Soc. 110: 5917-5919.
de Vries NA, Buckle T, Zhao J, Beijnen JH, Schellens JH, van Tellingen O. (2010) Restricted
brain penetration of the tyrosine kinase inhibitor erlotinib due to the drug transporters P-gp
and BCRP. Invest New Drugs. 30: 443-449.
de Vries-van Leeuwen IJ, Kortekaas-Thijssen C, Nzigou Mandouckou JA, Kas S, Evidente A,
de Boer AH. (2010) Fusicoccin-A selectively induces apoptosis in tumor cells after
interferon-alpha priming. Cancer Lett. 293: 198-206.
Diener T, Neuhaus M, Koziel R, Micutkova L, Jansen-Dürr P. (2010) Role of endonuclease G
in senescence-associated cell death of human endothelial cells. Exp Gerontol. 45: 638-644.
Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C et al. (1995) A biomarker that
identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA.
92: 9363-9367.
Edinger AL, Thompson CB. (2004) Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Curr
Opin Cell Biol. 16: 663-669.
80
Egler V, Korur S, Failly M, Boulay JL, Imber R, Lino MM, Merlo A. (2008) Histone
deacetylase inhibition and blockade of the glycolytic pathway synergistically induce
glioblastoma cell death. Clin Cancer Res. 14: 3132-3140.
Eom YW, Kim MA, Park SS, Goo MJ, Kwon HJ, Sohn S, Kim WH, Yoon G, Choi KS.
(2005) Two distinct modes of cell death induced by doxorubicin: apoptosis and cell death
through mitotic catastrophe accompanied by senescence-like phenotype. Oncogene. 24: 47654777.
Evidente A, Andolfi A, Fiore A, Boari A, Vurro M. (2006a) Stimulation of Orobanche ramosa
seed germination by fusicoccin derivatives: a structure-activity relationship study.
Phytochemistry. 67: 19–26.
Evidente A, Andolfi A, Cimmino A, Vurro M, Fracchiolla M, Charudattan R. (2006b)
Herbicidal potential of ophiobolins produced by Drechslera gigantea. J Agric Food Chem. 54:
1779-1783.
Fadok VA, de Cathelineau A, Daleke DL, Henson PM, Bratton DL. (2001) Loss of
phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is required for
phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. J Biol Chem. 276: 10711077.
Fombonne J, Padrón L, Enjalbert A, Krantic S, Torriglia A. (2006) A novel paraptosis
pathway involving LEI/L-DNaseII for EGF-induced cell death in somato-lactotrope pituitary
cells. Apoptosis. 11: 367-375.
Friedman HS, Kerby T, Calvert H. (2000) Temozolomide and treatment of malignant glioma.
Clin Cancer Res. 6: 2585-2597.
Fujiwara H, Matsunaga K, Kumagai H, Ishizuka M, Ohizumi Y. (2000) Ophiobolin A, a
novel apoptosis-inducing agent from fungus strain f-7438. Pharm Pharmacol Commun. 6:
427-431.
Fukushima T, Takeshima H, Kataoka H. (2009) Anti-glioma therapy with temozolomide and
status of the DNA-repair gene MGMT. Anticancer Res. 29: 4845-4854.
Furnari FB, Fenton T, Bachoo RM, Mukasa A, Stommel JM, Stegh A, Hahn WC, Ligon KL,
Louis DN, Brennan C, Chin L, De Pinho RA, and Cavenee WK. (2007) Malignant astrocytic
glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev. 21: 2683-2710.
Furukawa R, Maselli A, Thomson SA, Lim RW, Stokes JV, Fechheimer M. (2003) Calcium
regulation of actin crosslinking is important for function of the actin cytoskeleton in
Dictyostelium. J Cell Sci. 116: 187-196.
Gabarra-Niecko V, Schaller MD, Dunty JM. (2003) FAK regulates biological processes
important for the pathogenesis of cancer. Cancer Metastasis Rev. 22: 359-374.
Galluzzi L, Vitale I, Vacchelli E, Kroemer G. (2011) Cell death signaling and anticancer
therapy. Front Oncol. 1:5.
81
Galluzzi L, Vitale I, Abrams JM, Alnemri ES, Baehrecke EH, Blagosklonny MV, Dawson
TM, Dawson VL, El-Deiry WS, Fulda S, Gottlieb E, Green DR, Hengartner MO, Kepp O,
Knight RA, Kumar S, Lipton SA, Lu X, Madeo F, Malorni W, Mehlen P, Nuñez G, Peter ME,
Piacentini M, Rubinsztein DC, Shi Y, Simon HU, Vandenabeele P, White E, Yuan J,
Zhivotovsky B, Melino G, Kroemer G. (2012) Molecular definitions of cell death subroutines:
recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ.
19:107-120.
Gershenzon J, Dudareva N. (2007) The function of terpene natural products in the natural
world. Nat Chem Biol. 3: 408-414.
Gewies A. (2003) Introduction to apoptosis. ApoReview. 1-26.
Giese A, Bjerkvig R, Berens ME, Westphal M. (2003) Cost of migration: invasion of
malignant gliomas and implications for treatment. J Clin Oncol. 21: 1624-1636.
Girault A. (2011) Inhibition du canal SK3 et du développement de métastases par un étherlipide synthétique. PhD Thesis – Université François-Rabelais (Tours, France).
Gladson CL, Prayson RA, Liu WM. (2010) The pathobiology of glioma tumors. Annu Rev
Pathol. 5: 33-50.
Golubovskaya VM, Nyberg C, Zheng M, Kweh F, Magis A, Ostrov D, Cance WG. (2008) A
small molecule inhibitor, 1,2,4,5-benzenetetraamine tetrahydrochloride, targeting the y397
site of focal adhesion kinase decreases tumor growth. J Med Chem. 51: 7405-7416.
Golubovskaya VM, Huang G, Ho B, Yemma M, Morrison CD, Lee J, Eliceiri BP, Cance WG.
(2013) Pharmacologic Blockade of FAK Autophosphorylation Decreases Human
Glioblastoma Tumor Growth and Synergizes with Temozolomide. Mol Cancer Ther. 12: 162172.
Graniti, A. (1962) Azione fitotossica di Fusicoccum amygdali Del. Su Mandorlo (Prunus
amygdali St.). Phytopath Medit. 1: 182–185.
Greve H, Mohamed IE, Pontius A, Kehraus S, Gross H and König GM. (2010) Fungal
metabolites: structural diversity as incentive for anticancer drug development. Phytochem
Rev. 9: 537-545.
Grunnet M, Kaufmann WA. (2004) Coassembly of big conductance Ca2+-activated K+
channels and L-type voltage-gated Ca2+ channels in rat brain. J Biol Chem. 279: 36445-36453.
Guéritte-Voegelein F, Senilh V, David B, Guenard D, Potier P. (1986) Chemical studies of
10-deacetyl baccatin III. Hemisynthesis of taxol derivatives. Tetrahedron. 42: 4451–60.
Guéritte-Voegelein F, Guénard D, Dubois J, Wahl A, Potier P. (1994) Chemical and
biological studies on Taxol (Paclitaxel) and Taxotere (Docetaxel), new antineoplastic agents.
J Pharm Belg. 49: 193-205.
82
Haar CP, Hebbar P, Wallace GC 4th, Das A, Vandergrift WA 3rd, Smith JA, Giglio P, Patel
SJ, Ray SK, Banik NL. (2012) Drug resistance in glioblastoma: a mini review. Neurochem
Res. 37: 1192-1200.
Hadjipanayis CG, Van Meir EG. (2009) Brain cancer propagating cells: biology, genetics and
targeted therapies. Trends Mol Med. 15: 519-530.
Han J, Zhong CQ, Zhang DW. (2011) Programmed necrosis: backup to and competitor with
apoptosis in the immune system. Nat Immunol. 12: 1143-1149.
Hayflick L. (1965) The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res.
37: 614-636.
Heffeter P, Pongratz M, Steiner E, Chiba P, Jakupec MA, Elbling L, Marian B, Körner W,
Sevelda F, Micksche M, Keppler BK, Berger W. (2005) Intrinsic and acquired forms of
resistance against the anticancer ruthenium compound KP1019 (indazolium trans[tetrachlorobis(1H-indazole)ruthenate (III) (FFC1A4)). J Pharmacol Exp Ther. 312: 281-289.
Heffeter P, Jakupec MA, Korner W, Chiba P, Pirker C, Dornetshuber R, Elbling L, Sutterlüty
H, Micksche M, Keppler BK, Berger W. (2007) Multidrug-resistant cancer cells are
preferential targets of the new antineoplastic lanthanum compound KP772 (FFC24). Biochem
Pharmacol. 73: 1873-1886.
Hegi ME, Diserens AC, Gorlia T, Hamou MF, de Tribolet N, Weller M, Kros JM, Hainfellner
JA, Mason W, Mariani L, Bromberg JE, Hau P, Mirimanoff RO, Cairncross JG, Janzer RC,
Stupp R. (2005) MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N
Engl J Med. 352: 997-1003.
Hirschmann-Jax C, Foster AE, Wulf GG, Nuchtern JG, Jax TW, Gobel U, Goodell MA,
Brenner MK. (2004) A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in
human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101: 14228-14233.
Hoa NT, Zhang JG, Delgado CL, Myers MP, Callahan LL, Vandeusen G, Schiltz PM, Wepsic
HT, Jadus MR. (2007) Human monocytes kill M-CSF-expressing glioma cells by BK channel
activation. Lab Invest. 87: 115-129.
Hoa N, Myers MP, Douglass TG, Zhang JG, Delgado C, Driggers L, Callahan LL,
VanDeusen G, Pham JT, Bhakta N, Ge L, Jadus MR. (2009) Molecular mechanisms of
paraptosis induction: implications for a non-genetically modified tumor vaccine. Plos One.
4:e4631.
Holton RA, Somoza C, Kim HB, Liang F, Biediger RJ, et al. (1994) First total synthesis of
taxol. 1. Functionalization of the B ring. J Am Chem Soc. 116: 1597–1660.
Huang K, Whelan EA, Ruder AM, Ward EM, Deddens JA, Davis-King KE, Carreón T,
Waters MA, Butler MA, Calvert GM, Schulte PA, Zivkovich Z, Heineman EF, Mandel JS,
Morton RF, Reding DJ, Rosenman KD; Brain Cancer Collaborative Study Group. (2004)
Reproductive factors and risk of glioma in women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 13:
1583-1588.
83
Huang M, Lu JJ, Huang MQ, Bao JL, Chen XP, Wang YT. (2012) Terpenoids: natural
products for cancer therapy. Expert Opin Investig Drugs. 21:1801-1818.
International Agency
http://globocan.iarc.fr/
for
Research
on
Cancer
(IARC).
Globocan
(2008)
Jadus MR, Chen Y, Boldaji MT, Delgado C, Sanchez R, Douglass T, Al-Atar U, Schulz W,
Lloyd C, Wepsic HT. (2003) Human U251MG glioma cells expressing the membrane form of
macrophage colony-stimulating factor (mM-CSF) are killed by human monocytes in vitro and
are rejected within immunodeficient mice via paraptosis that is associated with increased
expression of three different heat shock proteins. Cancer Gene Ther. 10: 411-420.
Jing K, Lim K. (2012) Why is autophagy important in human diseases? Exp Mol Med. 44:
69-72.
Johnson DR, Chang SM. (2012) Recent medical management of glioblastoma. Adv Exp Med
Biol. 746: 26-40.
Jordan MA, Wendell K, Gardiner S, Derry WB, Copp H, Wilson L. (1996) Mitotic block
induced in HeLa cells by low concentrations of paclitaxel (Taxol) results in abnormal mitotic
exit and apoptotic cell death. Cancer Res. 56: 816-25.
Kaczorowski GJ, Knaus HG, Leonard RJ, McManus OB, Garcia ML. (1996) Highconductance calcium-activated potassium channels; structure, pharmacology, and function. J
Bioenerg Biomembr. 28: 255-267.
Kang Z, Sun SY, Cao L. (2013) Activating Death Receptor DR5 as a Therapeutic Strategy for
Rhabdomyosarcoma. ISRN Oncol., in press.
Kanzawa T, Germano IM, Komata T, Ito H, Kondo Y, Kondo S. (2004) Role of autophagy in
temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells. Cell Death Differ. 11: 448-57.
Kavallaris M. (2010) Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat Rev Cancer.
10: 194-204.
Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26:239-257.
Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright
WE, Weinrich SL, Shay JW. (1994) Specific association of human telomerase activity with
immortal cells and cancer. Science. 266: 2011-2015.
Kolewe ME, Gaurav V, Roberts SC. (2008) Pharmaceutically active natural product synthesis
and supply via plant cell culture technology. Mol Pharm. 5: 243-256.
Kondo Y, Kanzawa T, Sawaya R, Kondo S. (2005) The role of autophagy in cancer
development and response to therapy. Nat Rev Cancer. 5: 726-734.
84
Koumanov F, Richardson JD, Murrow BA, Holman GD. (2011) AS160 phosphotyrosinebinding domain constructs inhibit insulin-stimulated GLUT4 vesicle fusion with the plasma
membrane. J Biol Chem. 286: 16574-16582.
Krakstad C, Chekenya M. (2010) Survival signalling and apoptosis resistance in
glioblastomas: opportunities for targeted therapeutics. Mol Cancer. 9:135.
Krantic S, Mechawar N, Reix S, Quirion R. (2007) Apoptosis-inducing factor: a matter of
neuron life and death. Prog Neurobiol. 81: 179-196.
Kreuzaler P, Watson CJ. (2012) Killing a cancer: what are the alternatives? Nat Rev Cancer.
12: 411-424.
Lallemand B. (2012) Synthèse et évaluation pharmacologique de nouveaux dérivés de l’acide
18β-glycyrrhétinique
comme
agents
anticancéreux.
PhD
Thesis-ULB.
http://theses.ulb.ac.be/ETD-db/collection/available/ULBetd-12192012-095930/
Le Calvé B, Rynkowski M, Le Mercier M, Bruyère C, Lonez C, Gras T, Haibe-Kains B,
Bontempi G, Decaestecker C, Ruysschaert JM, Kiss R, Lefranc F. (2010) Long-term in vitro
treatment of human glioblastoma cells with temozolomide increases resistance in vivo
through up-regulation of GLUT transporter and aldo-keto reductase enzyme AKR1C
expression. Neaplasia. 12: 727-739.
Lesniak MS, Brem H. (2004) Targeted therapy for brain tumours. Nat Rev Drug Discov. 3:
499-508.
Leung PC, Taylor WA, Wang JH, Tipton CL. (1984) Ophiobolin A. A natural product
inhibitor of calmodulin. J Biol Chem. 259: 2742-2747.
Lima FR, Kahn SA, Soletti RC, Biasoli D, Alves T, da Fonseca AC, Garcia C, Romão L,
Brito J, Holanda-Afonso R, Faria J, Borges H, Moura-Neto V. (2012) Glioblastoma:
therapeutic challenges, what lies ahead. Biochim Biophys Acta. 1826:338-349.
Lipinski C, Lombardo F, Dominy B, Feeney P. (2001) Experimental and computational
approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development
settings. Adv Drug Deliver Rev. 46: 3-26.
Louis DN. (2006) Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol. 1: 97-117.
Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK. (2007) WHO classification of tumors of
the central nervous system, 4th edition. International Agency for Research on Cancer (IARC),
Lyon.
Mackintosh C. (2004) Dynamic interactions between 14-3-3 proteins and phosphoproteins
regulate diverse cellular processes. Biochem J. 381: 329-342.
Mamelak AN, Rosenfeld S, Bucholz R, Raubitschek A, Nabors LB, Fiveash JB, Shen S,
Khazaeli MB, Colcher D, Liu A, Osman M, Guthrie B, Schade-Bijur S, Hablitz DM, Alvarez
VL, Gonda MA. (2006) Phase I single-dose study of intracavitary-administered iodine-131TM-601 in adults with recurrent high-grade glioma. J Clin Oncol. 24: 3644-3650.
85
Maret D, Gruzglin E, Sadr MS, Siu V, Shan W, Koch AW, Seidah NG, Del Maestro RF,
Colman DR. (2010) Surface expression of precursor N-cadherin promotes tumor cell
invasion. Neoplasia. 12: 1066-1080.
Mathieu V, Le Mercier M, De Neve N, Sauvage S, Gras T, Roland I, Lefranc F, Kiss R
(2007) Galectin-1 knockdown increases sensitivity to temozolomide in a B16F10 mouse
metastatic melanoma model. J Invest Dermatol. 127: 2399-2410.
McGrath T and Center MS. (1988) Mechanisms of multidrug resistance in HL60 cells:
evidence that a surface membrane protein distinct from P-glycoprotein contributes to reduced
cellular accumulation of drug. Cancer Res. 48: 3959-3963.
McLean GW, Carragher NO, Avizienyte E, Evans J, Brunton VG, Frame MC. (2005) The
role of focal-adhesion kinase in cancer-a new therapeutic opportunity. Nat Rev Cancer. 5:
505-515.
McManus OB, Harris GH, Giangiacomo KM, Feigenbaum P, Reuben JP, Addy ME, Burka
JF, Kaczorowski GJ, Garcia ML. (1993). An activator of calciumdependent potassium
channels isolated from a medicinal herb. Biochemistry. 32: 6128-6133.
McManus OB, Helms LM, Pallanck L, Ganetzky B, Swanson R, Leonard RJ. (1995)
Functional role of the β subunit of high conductance calcium-activated potassium channels.
Neuron. 14: 645-650.
Mégalizzi V, Mathieu V, Mijatovic T, Gailly P, Debeir O, De Neve N, Van Damme M,
Bontempi G, Haibe-Kains B, Decaestecker C, Kondo Y, Kiss R, Lefranc F. (2007) 4-IBP, a
s1 receptor agonist, decreases the migration of human cancer cells, including glioblastoma
cells, in vitro and sensitizes them in vitro and in vivo to cytotoxic insults of proapoptotic and
proautophagic drugs. Neoplasia. 9:358–369.
Mellinghoff IK, Wang MY, Vivanco I, Haas-Kogan DA, Zhu S, Dia EQ, Lu KV, Yoshimoto
K, Huang JH, Chute DJ, Riggs BL, Horvath S, Liau LM, Cavenee WK, Rao PN, Beroukhim
R, Peck TC, Lee JC, Sellers WR, Stokoe D, Prados M, Cloughesy TF, Sawyers CL, Mischel
PS. (2005) Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase
inhibitors. N Engl J Med. 353: 2012-2024.
Merighi S, Benini A, Mirandola P, Gessi S, Varani K, Leung E, Maclennan S, Baraldi PG,
Borea PA. (2007) Hypoxia inhibits paclitaxel-induced apoptosis through adenosine-mediated
phosphorylation of bad in glioblastoma cells. Mol Pharmacol. 72: 162-172.
Moliterno JA, Patel TR, Piepmeier JM. (2012) Neurosurgical approach. Cancer J. 18: 20-25.
Munson JM, Fried L, Rowson SA, Bonner MY, Karumbaiah L, Diaz B, Courtneidge SA,
Knaus UG, Brat DJ, Arbiser JL, Bellamkonda RV. (2012) Anti-invasive adjuvant therapy
with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci Transl Med. 4:
127ra36
Muromstev GS, Voblikova VD, Kobrina NS, Koreneva VM, Krasnopolskaya LM,
Sadovskaya VL. (1994) Occurrence of Fusicoccanes in Plants and Fungi. J Plant Growth
Regul. 13: 39-49.
86
Nakada M, Nakada S, Demuth T, Tran NL, Hoelzinger DB, Berens ME. (2007) Molecular
targets of glioma invasion. Cell Mol Life Sci. 64: 458-478.
Natarajan M, Hecker TP, Gladson CL. (2003) FAK signaling in anaplastic astrocytoma and
glioblastoma tumors. Cancer J. 9: 126-133.
Neidle S, Thurston DE. (2005) Chemical approaches to the discovery and development of
cancer therapies. Nat Rev Cancer. 5:285-296.
Newman DJ, Cragg GM. (2012) Natural products as sources of new drugs over the 30 years
from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75: 311-335.
Nicolaidis S. (2013) Personalized medicine in neurosurgery. Metabolism., in press.
Nicolaou KC, Yang Z, Liu JJ, Ueno H, Nantermet PG, Guy RK, Claiborne CF, Renaud J,
Couladouros EA, Paulvannan K, et al. (1994) Total synthesis of taxol. Nature. 367: 630-634.
Nowell PC. (1976) The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194: 23-28.
Nozoe S, Morisaki M, Tsuda K, Takahashi N, Tamura S, Ishibashi K, Shirasaka M. (1965)
The structure of ophiobolin, a C25 terpenoid having a novel skeleton. J Am Chem Soc. 87:
4968-4970.
Ochs K, Kaina B. (2000) Apoptosis induced by DNA damage O6-methylguanine is Bcl-2 and
caspase-9/3 regulated and Fas/caspase-8 independent. Cancer Res. 60: 5815-5824.
Ohgaki H, Kleihues P. (2007) Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma. Am
J Pathol. 170: 1445-1453.
Ohgaki H, Kleihues P. (2009) Genetic alterations and signaling pathways in the evolution of
gliomas. Cancer Sci. 100: 2235-2241.
Olbrich JM, Tate PL, Corbett JT, Lindsey JM, Nagatomi SD, Shalaby WS, Shalaby SW.
(2012) Injectable in situ forming controlled release implant composed of a poly-ether-estercarbonate and applications in the field of chemotherapy. J Biomed Mater Res. 100: 23652372.
Oliva CR, Moellering DR, Gillespie GY, Griguer CE. (2011) Acquisition of chemoresistance
in gliomas is associated with increased mitochondrial coupling and decreased ROS
production. Plos One. 6:e24665.
Orio P, Rojas P, Ferreira G, Latorre R. (2002) New disguises for an old channel: MaxiK
channel beta-subunits. News Physiol Sci. 17: 156-161.
Ottmann C, Marco S, Jaspert N, Marcon C, Schauer N, Weyand M, Vandermeeren C, Duby
G, Boutry M, Wittingghofer A, Rigaud J-L, Oecking C. (2007) Structure of a 14-3-3
coordinated hexamer of the plant plasma membrane H+-ATPase by combining X-ray
crystallography abs electron cryomicroscopy. Mol Cell. 25: 427-440.
87
Ottmann C, Weyand M, Sassa T, Inoue T, Kato N, Wittinghofer A, Oecking C. (2009) A
structural rationale for selective stabilization of anti-tumor interactions of 14-3-3 proteins by
cotylenin A. Mol Biol. 386: 913-9.
Palumbo S, Pirtoli L, Tini P, Cevenini G, Calderaro F, Toscano M, Miracco C, Comincini S.
(2012) Different involvement of autophagy in human malignant glioma cell lines undergoing
irradiation and temozolomide combined treatments. J Cell Biochem. 113: 2308-2318.
Parsons JT. (2003) Focal adhesion kinase: the first ten years. J Cell Sci. 116: 1409-1416.
Parsons DW, Jones S, Zhang X, Lin JC, Leary RJ, Angenendt P, Mankoo P, Carter H, Siu IM,
Gallia GL, Olivi A, McLendon R, Rasheed BA, Keir S, Nikolskaya T, Nikolsky Y, Busam
DA, Tekleab H, Diaz LA Jr, Hartigan J, Smith DR, Strausberg RL, Marie SK, Shinjo SM,
Yan H, Riggins GJ, Bigner DD, Karchin R, Papadopoulos N, Parmigiani G, Vogelstein B,
Velculescu VE, Kinzler KW. (2008) An integrated genomic analysis of human glioblastoma
multiforme. Science. 321: 1807-1812.
Patel RN. (1998) Tour de paclitaxel: biocatalysis for semisynthesis. Annu Rev Microbiol. 52 :
361-395.
Perry J, Okamoto M, Guiou M, Shirai K, Errett A, Chakravarti A. (2013) Novel therapies in
glioblastoma. Neurol Res Int., in press.
Ricard D, Idbaih A, Ducray F, Lahutte M, Hoang-Xuan K, Delattre JY. (2012) Primary brain
tumours in adults. Lancet. 379: 1984-1996.
Rodriguez-Rocha H, Garcia-Garcia A, Panayiotidis MI, Franco R. (2011) DNA damage and
autophagy. Mutant Res. 711 : 158-166.
Roger S, Potier M, Vandier C, Le Guennec JY, Besson P. (2004) Description and role in
proliferation of iberiotoxin-sensitive currents in different human mammary epithelial normal
and cancerous cells. Biochim Biophys Acta. 1667: 190-199.
Rong Y, Durden DL, Van Meir EG, Brat DJ. (2006) 'Pseudopalisading' necrosis in
glioblastoma: a familiar morphologic feature that links vascular pathology, hypoxia, and
angiogenesis. J Neuropathol Exp Neurol. 65:529-539.
Roninson IB, Dokmanovic M. (2003) Induction of senescence-associated growth inhibitors in
the tumor-suppressive function of retinoids. J Cell Biochem. 88: 83-94.
Roos WP, Batista LF, Naumann SC, Wick W, Weller M, Menck CF, Kaina B. (2007)
Apoptosis in malignant glioma cells triggered by the temozolomide-induced DNA lesion O6methylguanine. Oncogene. 26: 186-197.
Roth W, Isenmann S, Nakamura M, Platten M, Wick W, Kleihues P, Bähr M, Ohgaki H,
Ashkenazi A, Weller M. (2001) Soluble decoy receptor 3 is expressed by malignant gliomas
and suppresses CD95 ligand-induced apoptosis and chemotaxis. Cancer Res. 61: 2759-2765.
Rudel T, Kepp O, Kozjak-Pavlovic V. (2010) Interactions between bacterial pathogens and
mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8:693-705.
88
Saraste A, Pulkki K. (2000) Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovasc
Res. 45: 528-537.
Schaich M, Kestel L, Pfirrmann M, Robel K, Illmer T, Kramer M, Dill C, Ehninger G,
Schackert G, Krex D. (2009) A MDR1 (ABCB1) gene single nucleotide polymorphism
predicts outcome of temozolomide treatment in glioblastoma patients. Ann Oncol. 20: 175181.
Schmitt CA. (2007) Cellular senescence and cancer treatment. Biochim Biophys Acta. 1775:
5-20.
Schneider D, Gerhardt E, Bock J, Müller MM, Wolburg H, Lang F, Schulz JB. (2004)
Intracellular acidification by inhibition of the Na+/H+-exchanger leads to caspaseindependent death of cerebellar granule neurons resembling paraptosis. Cell Death Differ. 11:
760-770.
Semenza GL. (2008) Tumor metabolism: cancer cells give and take lactate. J Clin Invest. 118:
3835-3837.
Serrano M, Blasco MA. (2001) Putting the stress on senescence. Curr Opin Cell Biol. 13:
748-753.
Shay JW, Roninson IB. (2004) Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.
Oncogene. 23: 2919-2933.
Shen X, Krasnoff SB, Lu SW, Dunbar CD, O'Neal J, Turgeon BG, Yoder OC, Gibson DM,
Hamann MT. (1999) Characterization of 6-epi-3-anhydroophiobolin B from Cochliobolus
heterostrophus. J Nat Prod. 62: 895-897.
Sherr CJ, Roberts JM. (1999) CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase
progression. Genes Dev. 13: 1501-1512.
Shweta S, Zuehlke S, Ramesha BT, Priti V, Mohana Kumar P, Ravikanth G, Spiteller M,
Vasudeva R, Uma Shaanker R. (2010) Endophytic fungal strains of Fusarium solani, from
Apodytes dimidiata E. Mey. ex Arn (Icacinaceae) produce camptothecin, 10hydroxycamptothecin and 9-methoxycamptothecin. Phytochemistry. 71: 117-122.
Siesser PM, Hanks SK. (2006) The signaling and biological implications of FAK
overexpression in cancer. Clin Cancer Res. 12: 3233-3237.
Singh H, Stefani E, Toro L. (2012) Intracellular BK(Ca) (iBK(Ca)) channels. J Physiol. 590:
5937-5947.
Singh S, Khan AR, Gupta AK. (2012) Role of glutathione in cancer pathophysiology and
therapeutic interventions. J Exp Ther Oncol. 9: 303-316.
Skuli N, Monferran S, Delmas C, Favre G, Bonnet J, Toulas C, Cohen-Jonathan Moyal E.
(2009) αvβ3/αvβ5 Integrins-FAK-RhoB: a novel pathway for hypoxia regulation in
glioblastoma. Cancer Res. 69: 3308-3316.
89
Sontheimer H. (2008) An unexpected role for ion channels in brain tumor metastasis. Exp
Biol Med. 233: 779-791.
Sonoda Y, Matsumoto Y, Funakoshi M, Yamamoto D, Hanks SK, Kasahara T. (2000)
Antiapoptotic role of focal adhesion kinase (FAK). Induction of inhibitor-ofapoptosis proteins
and apoptosis suppression by the overexpression of FAK in a human leukemic cell line, HL60. J Biol Chem. 275: 16309-16315.
Speirs CK, Hwang M, Kim S, Li W, Chang S, Varki V, Mitchell L, Schleicher S, Lu B.
(2011) Harnessing the cell death pathway for targeted cancer treatment. Am J Cancer Res. 1:
43-61.
Sperandio S, de Belle I, Bredesen DE. (2000) An alternative, nonapoptotic form of
programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 14376-14381.
Sperandio S, Poksay K, de Belle I, Lafuente MJ, Liu B, Nasir J, Bredesen DE. (2004)
Paraptosis: mediation by MAP kinases and inhibition by AIP-1/Alix. Cell Death Differ. 11:
1066-1075.
Sperandio S, Poksay KS, Schilling B, Crippen D, Gibson BW, Bredesen DE. (2010)
Identification of new modulators and protein alterations in non-apoptotic programmed cell
death. J Cell Biochem. 111: 1401-1412.
Squatrito M, Holland EC. (2011) DNA damage response and growth factor signaling
pathways in gliomagenesis and therapeutic resistance. Cancer Res. 71: 5945-5949.
Stierle A, Strobel G, Stierle D. (1993) Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae,
an endophytic fungus of Pacific yew. Science. 260: 214-216.
Stockert JC, Blázquez-Castro A, Cañete M, Horobin RW, Villanueva A. (2012) MTT assay
for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta
Histochem. 114: 785-796.
Stupp R, Hegi ME, Mason WP, van den Bent MJ, Taphoorn MJ, Janzer RC, Ludwin SK,
Allgeier A, Fisher B, Belanger K, Hau P, Brandes AA, Gijtenbeek J, Marosi C, Vecht CJ,
Mokhtari K, Wesseling P, Villa S, Eisenhauer E, Gorlia T, Weller M, Lacombe D, Cairncross
JG, Mirimanoff RO; European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain
Tumour and Radiation Oncology Groups; National Cancer Institute of Canada Clinical Trials
Group. (2009) Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus
radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomized phase III study: 5-year
analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol. 10: 459-466.
Sun Q, Chen T, Wang X, Wei X. (2010) Taxol induces paraptosis independent of both protein
synthesis and MAPK pathway. J Cell Physiol. 222: 421-432.
Szelényi A, Bello L, Duffau H, Fava E, Feigl GC, Galanda M, Neuloh G, Signorelli F, Sala F;
Workgroup for Intraoperative Management in Low-Grade Glioma Surgery within the
European Low-Grade Glioma Network. (2010) Intraoperative electrical stimulation in awake
craniotomy: methodological aspects of current practice. Neurosurg Focus. 28:E7.
90
Taddei ML, Giannoni E, Fiaschi T, Chiarugi P. (2012) Anoikis: an emerging hallmark in
health and diseases. J Pathol. 226: 380-393.
Tentori L, Graziani G. (2009) Recent approaches to improve the antitumor efficacy of
temozolomide. Curr Med Chem. 16: 245-257.
Tipton CL, Paulsen PV, Betts RE. (1977) Effects of ophiobolin A on ion leakage and hexose
uptake by maize roots. Plant Physiol. 59: 907-910.
Thompson CB. (2009) Metabolic enzymes as oncogenes or tumor suppressors. N Engl J Med.
360: 813-815.
Torres K, Horwitz SB. (1998) Mechanisms of Taxol-induced cell death are concentration
dependent. Cancer Res. 58: 3620-3626.
Torsoni AS, Marin TM, Velloso LA, Franchini KG. (2005) RhoA/ROCK signaling is critical
to FAK activation by cyclic stretch in cardiac myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
289: 1488-1496.
Toyomasu T, Tsukahara M, Kaneko A, Niida R, Mitsuhashi W, Dairi T, Kato N, Sassa T.
(2007) Fusicoccins are biosynthesized by an unusual chimera diterpene synthase in fungi.
Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 3084-3088.
Tran T. (2003) Mécanismes d’interaction
http://www.theses.fr/2008TOUR4025.
cellules-microbulles
et
ultrasons.
Unterluggauer H, Hampel B, Zwerschke W, Jansen-Dürr P. (2003) Senescence-associated cell
death of human endothelial cells: the role of oxidative stress. Exp Gerontol. 38: 1149-1160.
Van Meir EG, Hadjipanayis CG, Norden AD, Shu HK, Wen PY, Olson JJ. (2010) Exciting
new advances in neuro-oncology: the avenue to a cure for malignant glioma. CA Cancer J
Clin. 60: 166-193.
Varna M, Artenie V. (2007) La sénescence cellulaire. Analele Ştiinţifice ale Universităţii,
Alexandru Ioan Cuza”, Secţiunea Genetică şi Biologie Moleculară, TOM VIII.
Verhaak RG, Hoadley KA, Purdom E, Wang V, Qi Y, Wilkerson MD, Miller CR, Ding L,
Golub T, Mesirov JP, Alexe G, Lawrence M, O'Kelly M, Tamayo P, Weir BA, Gabriel S,
Winckler W, Gupta S, Jakkula L, Feiler HS, Hodgson JG, James CD, Sarkaria JN, Brennan C,
Kahn A, Spellman PT, Wilson RK, Speed TP, Gray JW, Meyerson M, Getz G, Perou CM,
Hayes DN; Cancer Genome Atlas Research Network. (2010) Integrated genomic analysis
identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in
PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17: 98-110.
Verrelle P. (1998) L’apoptose radio-induite. Revue de l’ACOMEN. 4: 315-324.
Wallner M, Meera P, Toro L. (1999). Molecular basis of fast inactivation in voltage and Ca2+activated K+ channels: a transmembrane beta-subunit homolog. Proc Natl Acad Sci U S A.
96: 4137-4142.
91
Wang Y, Li X, Wang L, Ding P, Zhang Y, Han W, Ma D. (2004) An alternative form of
paraptosis-like cell death, triggered by TAJ/TROY and enhanced by PDCD5 overexpression.
J Cell Sci. 117:1525-1532.
Wang C, Chen T. (2012) Intratumoral injection of taxol in vivo suppresses A549 tumor
showing cytoplasmic vacuolization. J Cell Biochem. 113: 1397-1406.
Wani MC, Aylor HL, Wall ME, et al. (1971). Plant antitumor agents. VI. The isolation and
structure of taxol, a novel antileukimic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J Am
Chem Soc. 93: 2325-2327.
Wauthoz N, Deleuze P, Hecq J, Roland I, Saussez S, Adanja I, Debeir O, Decaestecker C,
Mathieu V, Kiss R, Amighi K. (2010) In vivo assessment of temozolomide local delivery for
lung cancer inhalation therapy. Eur J Pharm Sci. 39: 402-411.
Weaver AK, Bomben VC, Sontheimer H. (2006) Expression and function of calciumactivated potassium channels in human glioma cells. Glia. 54: 223-233.
Wen PY, Kesari S. (2008) Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359: 492-507.
Williams SE, Wootton P, Mason HS, Bould J, Iles DE, Riccardi D, Peers C, Kemp PJ. (2004)
Hemoxygenase-2 is an oxygen sensor for a calcium-sensitive potassium channel. Science.
306: 2093-2097.
Wu Y, Yang Y, Ye S, Jiang Y. (2010) Structure of the gating ring from the human largeconductance Ca(2+)-gated K(+) channel. Nature. 466: 393-397.
Yamada R, Nakano I. (2012) Glioma stem cells: their role in chemoresistance. World
Neurosurg. 77: 237-240.
Yang L, Lin C, Wang L, Guo H, Wang X. (2012) Hypoxia and hypoxia-inducible factors in
glioblastoma multiforme progression and therapeutic implications. Exp Cell Res. 318: 24172426.
Yared JA, Tkaczuk KH. (2012) Update on taxane development: new analogs and new
formulations. Drug Des Devel Ther. 6: 371-384.
Yin LT, Fu YJ, Xu QL, Yang J, Liu ZL, Liang AH, Fan XJ, Xu CG. (2007) Potential
biochemical therapy of glioma cancer. Biochem Biophys Res Commun. 362: 225-229.
Yuan P, Leonetti MD, Pico AR, Hsiung Y, MacKinnon R. (2010) Structure of the human BK
channel Ca2+-activation apparatus at 3.0 A resolution. Science. 329: 182-186.
Zhang WB, Wang Z, Shu F, Jin YH, Liu HY, Wang QJ, Yang Y. (2010) Activation of AMPactivated protein kinase by temozolomide contributes to apoptosis in glioblastoma cells via
p53 activation and mTORC1 inhibition. J Biol Chem. 285: 40461-40471.
Zhao JH, Reiske H, Guan JL. (1998) Regulation of the cell cycle by focal adhesion kinase. J
Cell Biol. 143: 1997-2008.
92
Zhao S, Lin Y, Xu W, Jiang W, Zha Z, Wang P, Yu W, Li Z, Gong L, Peng Y, Ding J, Lei Q,
Guan KL, Xiong Y. (2009) Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1
catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324: 261-265.
Zhong JJ. (2002) Plant cell culture for production of paclitaxel and other taxanes. J Biosci
Bioeng. 94: 591-599.
Zhou J, Atsina KB, Himes BT, Strohbehn GW, Saltzman WM. (2012) Novel delivery
strategies for glioblastoma. Cancer J. 18: 89-99.
Zhou X, Zhu H, Liu L, Lin J, Tang K (2010) A review: recent advances and future prospects
of taxol-producing endophytic fungi. Appl Microbiol Biotechnol. 86: 1707–1717.
Zijlstra JG, de Vries EG, Mulder NH. (1987) Multifactorial drug resistance in an adriamycinresistant human small cell lung carcinoma cell line. Cancer Res. 47: 1780-1784.
Zubrod CG, Schepartz SA, Leiter J, Endicott KM, Carrese LM, et al. (1966). The
chemotherapy program of the NCI: history, analysis, and plans. Cancer Chemother Rep. 50:
349–355.
93
ANNEXE
ANNEXE
Liste des kinases testées et leur substrat :
94
95
96
97
98
99