Diss. ETH Nr. 18144 Part I - Studies Towards On - ETH E

Diss. ETH Nr. 18144
Part I - Studies Towards On-chip Oligosaccharide Synthesis
Part II - Monosaccharides On Gold Surfaces Used For Biosensors
Part III - Facilitating the Detection of Oligosaccharides Isolated from Glycoproteins
Using Fluorous Tags
A dissertation submitted to the
ETH ZÜRICH
for the degree of
DOCTOR OF SCIENCES
Presented by
Laila H. Hossain
MSci (University of Bristol)
Born 12 June 1981
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Peter H. Seeberger, examiner
Prof. Dr. A. Dieter Schlüter, co-examiner
Zürich 2008
ABSTRACT
Carbohydrates play a pivotal role in a range of biological processes. This thesis will present
the exploration of various new tools to investigate carbohydrate-protein interactions. The first
chapter of this thesis will deal with attempts to synthesize an oligosaccharide directly onto a
functionalized, gold chip surface. The aim was to use the carbohydrate functionalized surface
as a microarray. For this purpose, a suitable set of building blocks were designed, synthesized
and the glycosylations optimized in solution. The glycosylations were then attempted on a
gold surface, functionalized with a self-assembled monolayer (SAM). Matrix assisted laser
desorption time of flight (MALDI-ToF) mass spectrometry was used to analyze compounds
present on the surface. Further analysis of samples were carried out using variable angle
spectroscopic ellipsometry (VASE), contact angle and polarization modulation-infrared
reflection-adsorption spectroscopy (PM-IRRAS).
The second part of this thesis will focus on the development of bio-sensors. A set of
fluorescent glycodendrimers were assembled by a one-pot approach and then tested with
Concavalin A (ConA) for binding. The effect of ConA binding on the glycodendrimer
fluorescence and turbidity was investigated, as well as the effect of increasing the density of
carbohydrates on the exterior of the glycodendrimer. Further investigations were made into
the development of a surface based approach for the detection of carbohydrates. Using ConA
immobilized onto a surface and a Ru(II) complex adorned with monosacharides, a method of
detecting several small sugars was developed. Following on from this, a protein binding
detection system was developed, involving gold islands and thiol functionalized
carbohydrates, which did not require the use of a Ru(II) complex.
VII
In the last chapter of this thesis, the detection of fluorous tagged glycans by MALDI-ToF
mass spectrometry was investigated. N-Glycans obtained from glycoprotein asialo fetuin were
labeled with a fluorous tag, purified by fluorous silica and high-pressure liquid
chromatography (HPLC). The tagged glycans were analyzed by MALDI-ToF mass
spectrometry and both the tri and biantennary glycans were detected.
VIII
RÉSUMÉ
Les carbohydrates jouent un rôle capital dans un grand nombre important de processus
biologique. Cette thèse a pour but d’explorer de nouvelles méthodes pour étudier les
intéractions carbohydrates-protéines. Le premier chapitre de cette thèse traitera des tentatives
de synthèse d’un oligosaccharide sur une surface d’or, fonctionalisée. Deux bloques de
glycoside pour la glycosylation ont été synthétisés et les glycosylations optimisées en
solution. Les glycosylations ont été tentées sur des surfaces d’or fonctionnalisées avec un
SAM. L’utilisation des systèmes SAM binaires pour faciliter la glycosylation sur la surface a
aussi été étudiée. L’analyse des produits présents sur la surface d’or a été réalisée
principalement à l’aide de Matrix assisted laser desorption time of flight (MALDI-ToF), ainsi
que l’ellipsométrie et PM-IRRAS.
La deuxième partie de cette thèse se concentrera sur la conception de bio-capteurs: une série
de glycodendrimères fluorescents ont été construits par auto-assemblage puis l’affinité de ces
derniers glycodendrimères pour la Concavaline A (ConA) a ensuite été testée. L’effet de la
reconnaissance de la protéine sur la fluorescence et la turbidité des glycodendrimères a été
examiné, ainsi que l’effet de l’augmentation de la densité de carbohydrate sur la partie
extérieure du glycodendrimère. Des études plus approfondies ont été menées sur le
développement d’une approche qui nécessite une surface pour la détection de carbohydrates.
Une méthode pour détecter plusieurs mono et disaccharides a été accomplie, en utilisant la
ConA (immobilisée sur une surface) et un complexe à base de Ru(II) décoré de
monosaccharide. Suite à ce projet, un système de détection de protéines sur une surface, basé
sur des îles d’or a été conçu et réalisé. Cette méthode repose sur la fonctionnalisation des îles
d’or par des carbohydrates portant un thiol et ne nécessite pas de complexes à base de Ru(II).
IX
Le dernier chapitre la détection par spectrométrie de masse MALDI-ToF de glycans marqués
au fluor a été étudiée. Les N-glycans obtenus de la glycoprotéine asialo fetuin ont été
étiquetés avec un marqueur fluoré, purifiés par silice fluorée et high-pressure liquid
chromatography (HPLC). Ces derniers ont été analysés par spectrométrie de masse MALDIToF et aussi bien les tri- et biantennaires ont été détectés.
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