Chapitre II: Stratégies pour l`étude des protéines

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Chapitre II: Stratégies pour l’étude des protéines
Pour l’étude d’une protéine, il faut:
¾ Isoler la protéine responsable d’une fonction
fractionnement cellulaire, ultracentrifugation, purification,
caractérisation, dosage…
¾ Analyser la composition chimique de la protéine
composition globale, séquençage, spectrométrie de masse…
¾ Découvrir la structure spatiale de la protéine
dichroïsme circulaire, diffraction des rayons X, RMN…
¾ Corréler la structure à la fonction de la protéine
II.1. Isolement de la protéine responsable d’une fonction
II.1.1. Fractionnement cellulaire
Collecter tissus ou secrétions
Séparation des composants de l’homogénat
La centrifugation
homogénat ou extrait cellulaire
centrifugation différentielle
Vitesse
de
déplacement
des
particules
proportionnelle à
- la force gravitationnelle à laquelle la particule est
soumise
- la masse de la particule
- la différence entre la densité de la particule et
celle du solvant
et inversement proportionnelle à
- la friction avec le milieu en fonction de la taille
- à la géométrie des particules.
coefficient de sédimentation s en unités Svedberg (S) 1 S = 1.10-13 s, qui est le
rapport entre vitesse de la particule et accélération due à la force centrifuge :
s=v/w2r ou s=dr/dt/w2r ou r est la distance à l’axe de rotation, w la vitesse
angulaire en rad/sec et t le temps en seconde
Différents types de centrifugeuse
selon les besoins expérimentaux
Et rotors verticaux ou à angle
fixe ou à godets mobiles.
centrifugations différentielles
Ultracentrifugation et gradient de densité.
Gradient faible
5 à 20%
Vitesse
de
sédimentation
Sédimentation à
l’équilibre
¾ Coefficient
sédimentation S
¾ Séparation selon
densité
de
flottaison
de
¾ Séparation selon
taille (masse) et
forme
Gradient important
20 à 70%
Densité
-
+
++
II.1.2. Fractionnement des protéines
¾ Extraction des protéines totales à partir de la
subcellulaire isolée.
Broyage, choc osmotique, détergent, French press…
fraction
¾ Fractionnement des protéines basé sur leur solubilité dans des
solutions salines.
Précipitation dans le sulfate d’ammonium. Séparation
surnageant et précipité
par
centrifugation.
Solubilisation
du
précipité
¾ Dialyse à travers une membrane semi-perméable
Eliminer les petites molécules. Conditions pH et force ionique
¾ Chromatographie sur colonne
composée d’une phase stationnaire solide et d’une phase mobile liquide
Fractions d’élution
temps
Analyses des fractions: dosage des protéines, masse, pI, activité biologique…
4 grands types de chromatographie
Séparation selon taille, charge, affinité de liaison ou hydrophobicité
Séparation selon la taille (rayon de Stokes)
Tamisage moléculaire ou chromatographie d’exclusion
Ve=volume d’élution pour molécule retardée
Taille des pores variable
séparation de 500 à 5 x 106 Da
Kd=Ve-Vo/Vt-Vo
ou plutôt
Kav=Ve-Vo/Vc-Vo
Vo
Vi+Vm
Vc=Vt+Vm
Vt=Vo+Vi
Relation linéaire inversement proportionnelle entre log(MM) et Kav
Séparation selon la charge
Chromatographie par échange d’ions
Charge globale = somme algébrique des charges des
chaînes latérales d’acides aminés
Point isolélectrique (pI): pH où charge globale nulle
pH > pI: charge globale négative
pH < pI: charge globale positive
Élution des protéines retenues
Gradient de pH
Gradient de force ionique
pH < pI
pH > pI
molécule chargée +
molécule chargée -
Échangeur de cations
Échangeur d’anions
Molécules + retenues
Molécules – retenues
Élution gradient force ionique
contre ion Na+
Gradient de pH croissant
Élution gradient force ionique
contre ion ClGradient de pH décroissant
pI P1<pI P2
Ordre d’élution
P1 puis P2
Ordre d’élution
P2 puis P1
Séparation selon l’affinité
Chromatographie d’affinité
Haute
affinité
de
certaines
protéines pour différents types
d’effecteurs biologiques
Effecteurs fixés par covalence
sur support inerte
Affinité enzyme-substrat:
substrats, analogues, inhibiteurs, coenzymes
Affinité ligand-récepteur:
hormones, peptides, analogues peptidiques
Élution des protéines par:
Changement de pH
Force ionique élevée
Compétition par ligand libre
Affinité antigène-anticorps:
haptènes, antigènes, anticorps
Affinité protéine-acide nucléique:
oligonucléotides
Affinité protéine-métal:
Nickel, cuivre
Séparation selon l’hydrophobicité
Chromatographie d’adsorption en phase inversée
Interactions hydrophobes entre molécules et phase stationnaire
¾ Phase stationnaire apolaire:
silice greffée de chaînes de 2 à 18 atomes de carbone
¾ Phase mobile polaire
¾ Élution par gradient de polarité
Adaptée à la séparation de lipides, acides aminés et peptides
S’applique en chromatographie liquide haute performance (HPLC)
II.1.3. Dosages des protéines
¾ Mesures physiques
DO= εlc à 280nm
Principalement lié à l’absorption de trp et de tyr
¾ Mesures colorimétriques
Biuret, Lowry, Bradford…
¾Mesures liées à l’activité biologique
activités enzymatiques…
La Spectrophotométrie: principe et applications.
Spectrophotométrie ou spectrométrie optique: méthode d’analyse physicochimique qui permet de déterminer qualitativement et quantitativement des
ions ou des molécules dans une solution.
Basée sur la propriété des ions ou des molécules de pouvoir passer de l’état
fondamental à un état excité par absorption d’un rayonnement de longueur
d’onde adéquate.
Le spectre électromagnétique
Principe de la spectrophotométrie
σ =1/λ=ν/c
E=hc/λ
h= constante de Planck
= 6,626x10-34Jxs
État excité
ΔE
ΔE =hc/λ
État fondamental
Le spectrophotomètre
Absorbance et loi de Beer-Lambert
I=Iox10-elc
L’absorption utilisée comme méthode d’identification
• Une espèce chimique caractérisée par son spectre d’absorption.
• Positions des pics d’absorption caractéristiques d’un ion, d’un atome, d’une
molécule ou d’un groupement particulier d’atomes.
• L’analyse des spectres d’absorption détermine la nature de l’espèce chimique
(analyse qualitative).
• Spectre d’absorption = «l’empreinte digitale » de la substance.
Chromophores élémentaires
> C = C < (alcène)
- C C - (alcyne)
> C = O (cétone)
- CH = O (aldéhyde)
- COOH (acide)
- COCl (chlorure d'acide)
- CONH2 (amide)
- COOR (ester)
- NO2 (nitro)
- N = N - (azométhane)
max (nm)
max (L.mol-1.cm-1)
173*
178*
290
279
208
220
220
211
214
338
10000
2000
16
15
32
100
63
57
17
4
Chromophore: groupe insaturé, responsable de l'absorption.
Auxochrome: groupe saturé, qui par son effet sur un groupe chromophore
modifie l'absorption de ce chromophore.
Effet bathochrome: déplacement d'un maximum d'absorption vers de plus
grandes longueurs d'onde.
Effet hypochrome: déplacement d'un maximum d'absorption vers de plus
faibles longueurs d'onde.
Chromophores
max
max
Remarques
>C=C-C=C< (linéaire)
220
30000
>C=C-C=O (dans un cycle)
244
10000
Adénosine
260
15000
Guanosine
255
14000
Thymidine
265
10000
Cytidine
270
9000
ADN double brin
260
1U.D.O.=50 g/ml
ADN simple brin
260
1U.D.O.= 33 g/ml
ARN
260
1U.D.O.= 40 g/ml
Chromophores conjugués
Acides nucléiques
sensible au pH
Protéines
Liaison peptidique
190
4-8000
sensible à la conformation
Pont disulfure
250
300
Phénylalanine
257
200
Tyrosine
275
1400
Tryptophane
280
5600
Flavine (FMN,FAD)
450
12700
déshydrogénases
NADH, NADPH
338
6400
déshydrogénases
390-500
6000
transaminases,
décarboxylases
Hème II bande
550
27700
Hème II bande Soret
400
120000
Cis-rétinal
498
4200
660-680
10000
sensible au pH
Coenzymes, hèmes...
Pyridoxal
Chlorophylle A
(--> couleur rouge)
rhodopsine
(--> couleur verte)
L’absorption utilisée comme méthode de dosage
(1)-La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans
le visible (substance colorée) ou dans l'UV: dosage direct.
(2)-La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption
caractéristique: dosage indirect après réalisation d’une réaction colorée:.
Caractéristiques d’une bonne méthode de dosage
Spécificité – solubilité – stabilité – proportionnalité – sensibilité
1er cas: on connaît ε de la substance à doser:
on mesure A et on calcule [C]
2ème cas: on ne connaît pas ε:
on réalise une gamme étalon et une courbe d’étalonnage A=f([C])
Application au dosage des protéines
Méthodes de dosage utilisent des propriétés des acides aminés
• Absorption à 280 nm: tryptophane, tyrosine, phénylalanine
• Méthode du biuret: formation d’un complexe pourpre entre
le réactif de biuret et deux liaisons peptidiques consécutives en
présence de Cu en milieu alcalin.
• Méthode de Lowry: combine une réaction au biuret et une réaction
au réactif de Folin-Ciocalteu qui réagit avec tyrosine: coloration
bleue
• Méthode au bleu de Coomassie: adsorption du bleu de Coomassie
qui réagit avec AA basiques et avec acides aminés hydrophobes.
Transfert du pic d’absorption, passe du rouge au bleu
•Méthode à l’acide bicinchonique: réagit avec liaisons peptidiques et
Cu: complexe pourpre
Chromatographie échangeuse d’ions
Schéma de purification d’une enzyme
Chromatographie gel filtration
n° fraction
Chromatographie d’affinité
n° fraction
Absorbance à 280 nm
Gradient de force ionique
Activité enzymatique spécifique
n° fraction
Bilan de purification d’une enzyme
Étape
Protéines
totales
Activité
totale
Activité
spécifique
Facteur de
purification
Rendement
(%)
(mg)
(U)
(U/mg
protéines)
Homogénat initial
600
6000
10.0
Surnageant
150
3750
25.0
2.5
63
Fraction 20-50% sat.
(NH4)2SO4
40
2500
62.5
6.3
42
Chromatographie
d'échange ionique
8
2000
250.0
25.0
33
100
Taux de purification: activité spécifique finale/activité spécifique initiale
Rendement de purification: activité totale finale/activité totale initiale, en %
II.1.4. Analyse des protéines par électrophorèse
Echantillon
cathode
Cuve en plastique
Déplacement de molécules
chargées sous l’effet d’un
champ électrique.
tampon
Gel entre
2 plaques
de verre
Anode
Gel: tamis moléculaire
tampon
Séparation des molécules en fonction
de la charge et de la masse
Électrophorèse monodimensionnelle
condition native ou condition dénaturante
Sodium dodécyl sulfate ou SDS: CH3-(CH2)11-O-SO3- Na+
Mercaptoéthanol: OH-CH2-CH2-SH
Protéine native
- SDS
- β-SH
Protéine dénaturée
+ SDS
- β-SH
+ SDS
+ β-SH
Après électrophorèse
et révélation
Cathode
-
100 kDa
40 kDa
Charge
et masse
Masse
globale
Masse de
chaque chaîne
Anode
+
15 kDa
1 2 3 4 5
Électrophorèse bidimensionnelle
10
1ère dimension
IEF
2ème dimension
SDS-PAGE
Gradient de pH
4
-
+
-
+
Séparation en fonction du pI
Séparation
en fonction
de la masse
Détection immuno-électrophorétique ou Western blot
RECONNAISSANCE SPÉCIFIQUE PAR ANTICORPS APRES ELECTROPHORESE
Electrotransfert des protéines du
gel sur membrane de nitrocellulose
Détection immuno-électrophorétique ou Western blot
II.1.5. Détermination de la masse molaire
¾ Chromatographie d’exclusion
¾ Électrophorèse SDS
¾ Sédimentation à l’équilibre
¾ Spectrométrie de masse
Estimation
Plus rigoureuse
Spectrométrie de masse
Très précise
300 Da à 300 kDa
Nécessite peu de matériel
+
+
+
(m/q)
Utilisée pour déterminer la masse de protéines et de peptides
pour déterminer la séquence de petits peptides
pour identifier une modification de la séquence due à une mutation
II.2. Analyse de la composition chimique d’une protéine
II.2.1. Composition globale
Echantillon protéique
Hydrolyse acide
HCL 6N, 110°C, 16-72h
Mélange d’acides aminés
Séparation par échangeuse d’ion
Modification chimique (PTCaa)
Révélation par ninhydrine
Séparation par RP-HPLC
Détecteur
Enregistreur et acquisiteur de données
1er cas:
Séparation par échangeuse d’ions
Résine sulfonée
Élution par gradient pH
Coloration par ninhydrine
O
C
C
OH
OH
O
Mesure de l’absorbance
Profil d’élution comparé à celui d’un mélange de standards
2ème cas:
Réaction avec isothiocyanate
de phényle (PITC) à pH9
Formation de dérivés
phénylthiocarbamyles
(PTCaa)
Séparation par RP-HPLC
Mesure de l’absorbance à 254 nm
Profil d’élution comparé à celui d’un mélange de PTCaa standards
Problèmes et solutions
¾ Asn (N) et Gln (Q) transformés en Asp (D) et Glu (E)
¾ Trp (W) est détruit
dosé après hydrolyse alcaline ou hydrolyse acide en présence d’antioxydant
¾ Cys (C) pas dosable
Oxydation ou réduction et carboxyméthylation avant hydrolyse acide
Résidu cystine
2 Résidus cystéine
¾ Destruction partielle de Ser (S), de Tyr (Y) et Thr (T)
Hydrolyse pendant
différents temps
et extrapolation
Composition globale en acides aminés
II.2.2. Séquençage des protéines
Insuline: 1ère structure primaire déterminée par F. Sanger en 1953
¾ Dégradation d’Edman
¾ Séquençage de l’ADN: Maxam et Gilbert; Sanger .
(Nobel, 1955)
Séquençage des protéines
¾ Rupture des liaisons disulfures.
Oxydation
Destruction du
tryptophane
Réduction et carboxyméthylation
Résidu cystine
Deux résidus cystéine
par la méthode d’Edman
Dérivé phénylthiohydantoïne (PTH)
Identification par chromatographie
par la méthode d’Edman
1er cycle
Identification des PTHaa par
RP-HPLC
Standards
2ème cycle
1er cycle
2ème cycle
3ème cycle
I
V
G
3ème cycle
v
Séquençage des protéines par la méthode d’Edman
Séquence N-terminale: S ou T ou V, CAGGDIRSGCNGDSGGPLN
Identification de 30 résidus à partir de quelques picomoles
Problèmes:
Ambiguïté possible au 1er cycle
Grande séquence et bruit de fond
Identification du résidu N-terminal
Identification du résidu C-terminal
Réaction d’hydrazinolyse
+ NH2-NH2
NH2-CH-C- NH-NH2 +
H
R O
Méthode enzymatique
Carboxypeptidase
X-Y
CPA
Y ≠ Lys, Arg ,Pro
CPB
Y = Arg, Lys
CPP
Y ≠ Ser, Gly
CPY
X et Y non spécifiques
Par récurrence, identification des 3 ou 4 derniers acides aminés
Clivage des protéines en petits peptides, purification et séquençage
Clivage chimique
Clivage enzymatique
Obtention de peptides chevauchants
pour
reconstituer
la
séquence
complète de la protéine.
Séquence nucléotidique
Synthèse de l’ADNc à partir de l’ARNm
Clonage
Séquence nucléotidique, technique de Sanger
Séquence protéique déduite
Localisation des ponts disulfure
Ponts intrachaînes
Ponts interchaînes
1
S
S
SH
SH
S
S
Réduction et carboxyméthylation
Élucidation des séquences
Position des cystéines.
SH
SH
SH
SH
2
Avec protéine native coupure de part et d’autre des ponts S-S
Isolement des fragments
Analyse des séquences
avant
S
S
1
2
et
4
3
SH
4a
1
après
SH
ouverture des ponts
4b
SH
1a
S
S
2
3
1b
SH
Analyses et comparaisons des séquences
Relations structure/fonction
¾ Mise en évidence d’homologie de séquence: signaux de localisation et de maturation
post-traductionnelle
(phosphorylation,
glycosylation…),
domaines
fonctionnels,
identification d’acides aminés essentiels.
¾ Familles de protéines
Phylogénie
¾ Construction d’arbres phylogénétiques
¾ Séquences d’une même protéine de différentes espèces: évaluation de la marge
évolutive de ces espèces.

Chapitre II: Stratégies pour l`étude des protéines

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