Les mycotoxines - Physiologie et Thérapeutique Ecole Véto

ECOLE
NATIONA
LE
VETERINAIRE
TOULOUSE
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE
Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse
Laboratoire Bioprocédés et systèmes Microbiens
Master 2 Recherche
« Elaboration de la Qualité et Sécurité Alimentaire »
Les mycotoxines :
production et voie de biosynthèse
présenté par
Nesrine BELKACEM
Responsable de stage : Ahmed LEBRIHI
Année 2007 – 2008
1
SOMMAIRE
RESUME INTRODUCTION 1. GENERALITE SUR LES MYCOTOXINES 1.1 Qu’est ce que les mycotoxines ?
1.2 Les différentes mycotoxines rencontrées
1.3 Les champignons producteurs de mycotoxines
1.4 Facteurs influençant la toxinogènése
1.4.1 Facteurs intrinsèques
1.4.2 Facteurs extrinsèques
1.4.3 Facteurs divers
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4
4
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7
7
9
2. OCHRATOXINE A 2.1 Nature de la molécule
2.2 L’alimentation vecteur d’OTA
2.3 Toxicité d’OTA
9
9
11
11
3. LES CHAMPIGNONS OCHRATOXINOGENES : A. niger, A. ochraceus
et A. carbonarius
3.1 A. niger
3.2 A.ochraceus
3.3 A. carbonarius
11
4. VOIE DE BIOSYNTHESE DES MYCOTOXINES 4.1 Organisation des gènes de la voie de biosynthèse d’un polycétone
4.1.1 Organisation d’un gène en cluster
4.1.2 Voie de biosynthèse des aflatoxines chez A. flavus
4.1.3 Voie de biosynthèse de l’OTA
13
13
13
14
14
5. CONCLUSION REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES Annexe 1 : Figure 2 Comparaison du cluster d’aflatoxine chez A. flavus
et celui de stérigmatocystine chez A. nidulans
Annexe 2 : Figure 3 Voie hypothétique de biosynthèse de l’OTA
15
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Tableau 1 Effets probables des principales mycotoxines sur l’homme
Tableau 2 Mycotoxines produites par certains champignons
Tableau 3 Différentes formes d’ochratoxines
Figure 1 Structure de Base et structures analogues de l’OTA
12
12
12
5
6
10
10
1
Résumé
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par des moisissures
appartenant principalement au genre Aspergillus, Penicillium et Fusarium. Elles sont
produites sur une large variété de denrées alimentaires et leur élaboration dépend de plusieurs
facteurs intrinsèques et extrinsèques comme le type d'espèces, la température etc., qui peuvent
influencer sur la toxinogénicité de ces espèces fongiques.
L'ochratoxine A (OTA) appartient à la famille des polycétoacide et plus précisément
au groupe des ochratoxines. Cette mycotoxine contamine plusieurs plantes incluant les
céréales, le café, les cacahuètes, la bière, le vin… mais aussi les produits carnés et le lait.
L’ochratoxine est toxique pour l’homme et les animaux et reçoit une attention particulière à
cause de ses propriétés néphrotoxiques, carcinogène, tératogène et immunosuppressive.
Parmi les diverses espèces appartenant au genre Aspergillus et secrétant de l’OTA, on
distingue A. niger, A. ochraceus et A. carbonarius. Chez ces espèces, la production de ces
métabolites est sous contrôle de cluster regroupant tous les gènes de la voie de biosynthèse.
Cependant, connaissant l'organisation de ces gènes, certaines voies de biosynthèse ne sont pas
encore complètement établies comme celle de l’ochratoxine A.
1
Introduction
La contamination des aliments par des substances toxiques produites par des
champignons est un phénomène connu de longue date. En effet, dés le moyen-âge furent
décrits les effets hallucinogènes produits par l’ingestion d’un parasite du seigle, l’ergot du
seigle ou Claviceps purpurea. De nos jours, on sait que le « Feu de Saint Antoine » est
attribuable à certains alcaloïdes produits par l’ergot de seigle. Enfin, au début des années 60,
la caractérisation des aflatoxines sera le point de départ de recherches systématiques sur les
mycotoxines et leurs effets. Le fait que les aflatoxines se soient avérées être les plus puissants
cancérigènes naturels ne sera pas étranger à ce soudain intérêt. Depuis cette date la liste des
moisissures reconnues aptes à produire des toxines ne cesse de s’allonger.
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires toxiques (ochratoxine A,
aflatoxines, fumonisines, trichothécènes, etc.) produits par de nombreux champignons
microscopiques (Aspergillus, Penicillium, Fusarium, etc.) sur une large variété de denrées
alimentaire avant, pendant et après récolte. Elles sont susceptibles d’être présentes dans de
très nombreux aliments d’origine végétale, mais aussi dans les produits d’origine animale
(aflatoxine M1 dans le lait, ochratoxine A dans les viandes), ceci d’autant plus que les
mycotoxines sont très résistantes aux conditions de process et d’utilisation des aliments
(cuisson, etc.). Elles ont selon le cas des effets immunodépresseurs, hémorragiques,
hépatotoxiques, néphrotoxiques, neurotoxiques, oestrogéniques ainsi que, à plus long terme et
pour certaines, des effets mutagènes et cancérigènes. On peut retenir les aflatoxines pour leurs
effets mutagènes et cancérigènes, les trichothécènes (vomitoxine, T2-toxine) pour leur
extrême toxicité aiguë, leurs effets nécrosants pour la peau ou les muqueuses, l’ochratoxine A
à l’origine de néphropathies, la zéaralénone pour ses effets oestrogéniques et les fumonisines
pour leurs effets cancérigènes. Bien entendu cette liste n’est pas exhaustive ni même
complète.
Si le risque infectieux ou parasitaire est bien compris, le risque associé à la présence
naturelle de toxines ou de leurs métabolites au sein de l’alimentation humaine ou animale
n'est pas très bien identifié. Afin de limiter le risque mycotoxique dans les produits
alimentaires, plusieurs pays ont établi des normes fixant la quantité maximale de mycotoxine
tolérée dans chaque produit. Cela va dans le sens des consommateurs qui sont de plus en plus
exigeants vis-à-vis d’une meilleure qualité sanitaire pour tous les produits qu’ils consomment.
2
Il est donc très important pour les industriels du domaine agroalimentaire de
développer des stratégies efficaces pour limiter l’occurrence des mycotoxines dans leurs
produits. Il s’agit d’une part de limiter la contamination des produits par les moisissures à
tous les stades de la chaîne de production (culture au champ, récolte, stockage,
transformation,…) et d’autre part de détecter la plus précocement possible les mycotoxines
dans les matières premières avant que ces dernières ne soient transformées en produit final.
Actuellement, les méthodes couramment utilisées permettent de quantifier directement
les mycotoxines. Ces techniques restent relativement onéreuses et ne permettent donc pas la
mise en œuvre de plan d’échantillonnage contenant plusieurs centaines voire milliers
d’échantillons à analyser. En plus, quand la mycotoxine est détectée, il est trop tard car il
n’existe pas de procédés fiables permettant de retirer la mycotoxine sans dénaturer le produit.
Une stratégie de prévention de la contamination par les mycotoxines est donc exigée.
Pour cela, il est indispensable de comprendre la voie de biosynthèse de ces
mycotoxines ainsi que les facteurs qui influencent leur production et de mettre au point des
techniques spécifiques, rapides et peu onéreuses pour quantifier rapidement les champignons
toxinogènes.
Dans ce présent travail, une première partie sera consacrée aux différentes
mycotoxines rencontrées ainsi qu’aux facteurs influençant leur production par les
champignons mycotoxinogènes. Certaines généralités sur l’ochratoxine A seront présentées
dans une seconde partie puis, une troisièmes partie concernera les champignons
ochratoxinogènes. Enfin, une dernière partie présentera l’organisation des gènes et la voie de
biosynthèse de certains polycétones.
3
1. Généralités sur les mycotoxines
1.1 Qu’est ce que les mycotoxines ?
Le terme mycotoxine vient du mot grec « mycos » qui signifie champignon et du latin
« toxicum » qui signifie poison. Il désigne des métabolites secondaires élaborés par des
moisissures appartenant principalement au genre Aspergillus, Penicillium et Fusarium.
Naturellement présentes dans l’air ambiant, le sol et sur les cultures [52], les mycotoxines
sont considérées comme faisant partie des contaminants alimentaires les plus significatifs en
termes d’impact sur la santé publique, la sécurité alimentaire et l’économie de certains pays
[42],[38]. Elles sont produites sur une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et
après la récolte. Elles affectent de nombreux produits agricoles dont les céréales, les fruits
secs, les noix, les grains de café, les raisins et graines oléagineuses [13]. La contamination
fongique des plantes et la synthèse de toxines dépendent d’un certains nombre de conditions
environnementales : états sanitaire de la plante précédent une récolte, conditions
météorologiques, techniques de récolte, délais et conditions hydro-thermiques avant la
stabilisation pour une bonne conservation.
1.2 Les différentes mycotoxines rencontrées
Les moisissures sont des champignons microscopiques filamenteux ubiquitaires [38]
qui peuvent élaborer des composés naturels : les mycotoxines, qui exercent un pouvoir
toxique réel pour le consommateur (l’Homme ou l’animal). Les mycotoxines sont produits
par de nombreuses espèces de moisissures et n’ont pas de rôle évident pour la biologie du
microorganisme.
Leurs structures chimiques est très diversifiée, ce qui explique leurs effets biologiques
différents : cancérigène, mutagène, tératogène, oestrogénique, neurotoxique, ou immunosuppressif. Plusieurs milliers de molécules toxiques ont été identifiées chez les champignons
mais seule une vingtaine de familles posséderait des caractéristiques toxiques préoccupants
pour l’humain (tableau 1) ou l’animale [7].
En effet, les aliments sont fréquemment contaminés par plusieurs moisissures capables
de produire chacune plusieurs toxines. En raison de leurs effets toxiques et de leurs propriétés
synergiques, les mycotoxines présentent un grave risque pour les consommateurs de ces
produits contaminés [52].
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Tableau 1 Effets probables des principales mycotoxines sur l’homme
Aflatoxine
Cancérigène: Cancer du foie et des voies biliaires, cancer broncho-pulmonaire et
bronchique (B1)
Mutagène : Anomalie de la synthèse des enzymes de réparation de l’ADN (B1)
Ochratoxine A
Cancérigène: Cancer du rein
Mutagène : Anomalie de la synthèse des enzymes de réparation de l’ADN
Immunosuppresseur
Néphrotoxique : Néphropathie endémique (Balkans), néphropathie interstitielle
chronique (Maghreb)
Patuline
Immunosuppresseur : Diminution du nombre de lymphocytes du sang
(lymphopénie) si intoxication chronique
Neurotoxique : Troubles nerveux (action antiacétylcholinestérase)
Fumonisine
Cancérigène : Association avec des cancers de l’œsophage, notamment chez les
femmes (Afrique du Sud), et du foie (Chine)
Trichotécène
Mutagène : Anomalie de la synthèse des enzymes de réparation de l’ADN (toxine
T2)
Immunodépresseur : Altération de la phagocytose, inhibition de la synthèse
proteique (Toxine T2 et Désoxynivalénole)
Respiratoire : Pneumopathie interstitielle desquamative
Aleucie (Union Soviétique, Europe Centrale, Etats-Unis, Finlande Chine)
Zéaralénone
Oestrogènique : Puberté précoce et gynécomastie (Porto-Rico)
Trémorgène
Respiratoires : Alvéolites allergiques
Citréoviridine
Neurotoxiques : Paralysie des extrémités, convulsion, mort par arrêt respiratoire
Acide
Respiratoires : Alvéolites allergiques
aspergillique
Fusarine C
Mutagène : Anomalie de la synthèse des enzymes de réparation de l’ADN
Gliotoxine
Immunosuppresseur : Mortalité des lymphocytes
Fusarochromanone Malformations osseuses chez les adolescents (Chine)
La même toxine peut être élaborée par diverses espèces fongiques mais pas
obligatoirement par toutes les souches appartenant à une même espèce. Les mycotoxines
appartiennent à différentes catégories : (i) les polyacétates : aflatoxines, citrinines,
ochratoxines, patuline, zéaralénone, fumonisine. (ii) les terpènes : tricothécènes (sesqui),
toxine T-2, verrucarine, roridines, fusarénone, trémorgènes (di), désoxynivalénol,
diacétoxyscirpénol. (iii) peptides : ergotamine, tryptoquivaline, acide aspergillique, acide
cyclopiazonique, slaframine. (iv) dicéto-pipérazines : gliotoxine, roquefortine, sporidesmine
[45], [46], [40].
5
1.3 Champignons producteurs de mycotoxines
L’élaboration des mycotoxines par certains champignons toxinogènes peut se faire à
tous stades de la chaîne alimentaire depuis le champ jusqu’au produit fini. Celles-ci peuvent
survenir au champ (avant récolte), lors du transport, pendant la transformation ou au cours de
toutes ces périodes. Les mycotoxines peuvent être présentent alors que l’agent responsable a
disparu, soit du fait de l’évolution de microflore, soit du fait de traitements technologiques.
En effet, lorsqu’elles sont produites dans les matières alimentaires, leurs décontamination est
très difficile, par conséquent, ces molécules ne sont pas détruites au cours d’un stockage
prolongé et sont souvent résistants aux traitements thermiques ou chimiques [28], [7].
Toutefois, la présence de champignons ne signifie pas nécessairement l’élaboration de
mycotoxines, mais qu’un potentiel de production existe. Cependant, plusieurs facteurs d’ordre
biologique, physique et chimique conditionnent la mycotoxinogénèse [13]. La nature et la
quantité des mycotoxines produites dépendent des espèces fongiques, des conditions
écologiques (tableau 2) et de la stabilité de ces toxines dans les milieux alimentaires.
Tableau 2 Mycotoxines produites par certains champignons
Mycotoxines
Aflatoxine B1, B2, G1 et G2
Ochratoxines A, B, C
Zéaralénone
Moisissures
A. parasiticus, A. flavus
A. ochraceus, A. carbonarius,
P. verrucosum, P. nordicum
Conditions favorables
Climats tropicaux et
subtropicaux
Climats frais et tempérés
Fusarium roseum, Fusarium sp.
Moisisssures ubiquistes
F. tricinctum, Fusarium sp.
Moisissures ubiquistes
F. moniliforme, F. proliferatum,
Climates tempérés et
Fusarium sp.
climates chauds
Citrinine
P. citrinum, Monascus ruber
Climats tempérés
Patuline
P. patulum, Byssochlamys nivea
Vomitoxine, Nivalenol, Fusarenone,
Toxine T2, Diacetoxyscirpenol
Fumonisine
Acide penicillique
A. ochraceus, P. cyclopium,
P. puberulum
Moniliformine
F. proliferatum, F. subglutinans
Acide cyclopiazonique
A. flavus
Traumatisme, défaut
d’aérobiose
Climats frais
Moisissures ubiquistes
Souvent en association aux
aflatoxines
6
1.4 Facteurs influençant la toxinogénèse
1.4.1 Facteurs intrinsèques
Les mycotoxines sont essentiellement élaborées par des espèces appartenant aux
genres Aspergillus, Fusarium et Penicillium. Certaines mycotoxines peuvent être produites
par plusieurs espèces appartenant à des genres différents. Par exemple l’ochratoxine A (OTA)
est produite par Penicillium nordicum, P. verrucosum [36], Aspergillus ochraceus [47] et A.
carbonarius. De même, une espèce peut élaborer plusieurs mycotoxines. Par exemple l’acide
penicillique et l’OTA sont produits par A. ochraceus. Cependant certaines mycotoxines sont
étroitement liées à certaines espèces fongiques : aflatoxines (A. flavus et A. parasiticus),
sporidesmines [14]. Au sein d’une même espèce réputée toxinogène, toutes les souches n’ont
cependant pas cette propriété.
Le type et la quantité de mycotoxine dépendent des espèces qui les produisent [26].
Elles différent dans leur caractère morphologique, génétique et dans leur place écologique
[10]. Les champignons toxinogènes peuvent être classés en deux groupes principaux [11]: (i)
les champignons de champs qui contaminent les produits agricoles avant et pendant la récolte,
principalement Fusarium et Alternaria mais aussi des Aspergillus dans le cas des raisins. ; (ii)
les champignons de stockage (par exemple Penicillium et Aspergillus) qui tendent à
contaminer les denrées alimentaires pendant le stockage.
1.4.2 Facteurs extrinsèques
a) Disponibilité en eau (AW)
La disponibilité en eau a une influence déterminante sur le développement du
champignon ainsi que sur sa production de mycotoxines, notamment dans les denrées peu
hydratées comme les céréales, les grains de cafés [7]. Dans ce cas, la toxinogénèse semble
proportionnelle à l’activité de l’eau. La plupart des moisissures préfèrent une Aw entre 0.85 et
0.99 pour leur développement. L’Aw minimale permettant le développement de la plupart des
champignons contaminant les céréales est de 0.7.
Certaines moisissures xérophiles (A. flavus ou P. restrictis) peuvent se développer dans les
fruits secs, le lait en poudre, les confitures, les charcuteries sèches dont l’Aw est moindre
[30], [5].
Généralement les espèces d’Aspergillus et de Penicillium sont des contaminants
typiques des céréales au stockage tandis que les espèces de Fusarium préfèrent le milieu dont
l’Aw est plus élevée [37].
7
b) Température
Les moisissures peuvent se développer entre 0 et 35°C. Certaines espèces sont
capables de se développer à des températures extrêmes : Cladosporium herbarum peut se
développer à des températures inférieures à 0°C et A. flavus ou A. fumigatus jusqu’à 60°C [5].
En général, la température optimale de toxinogénèse est voisine de la température optimale de
croissance. Pour d’autres toxines, telles que la zéaralénone élaborée par F. roseum, la
température optimale de toxinogénèse est généralement inférieure à celle de la croissance,
respectivement 15 et 25°C environ. Parfois l’apparition de mycotoxines dans les conditions
naturelles est favorisée par des températures relativement basses, au voisinage de la
température minimale de croissance : de l’ordre de 1 à 4°C pour les trichothécènes produites
par F. tricinctum.
c) Composition gazeuse
La plupart des moisissures sont aérobies. La réduction de la pression partielle en
oxygène et surtout l’accroissement de la teneur en CO2 ont un effet dépresseur important sur
la toxinogénèse. La production d’aflatoxines dans l’arachide, modérément réduite entre 21 et
5% d’O2, est pratiquement inhibée lorsque la proportion en O2 est inférieure à 1%.
L’augmentation de la teneur en CO2 (20%), surtout si elle est associée à une réduction en
oxygène, provoque une chute importante de la production d’aflatoxines [30]. Après
conservation dans une atmosphère confinée, dans laquelle les moisissures peuvent plus ou
moins se développer, la remise à l’air libre ou la ventilation provoque rapidement une intense
toxinogénèse.
d) Nature du substrat du milieu
La toxiogénèse des moisissures en comparaison à leur croissance dépend beaucoup de
la composition chimique de la denrée sur laquelle elles se développent. Sur une denrée
alimentaire, on trouve souvent une espèce dominante donc ses toxines. Par exemple, P.
verrucosum est le producteur principal d’OTA dans les céréales tandis que P. nordicum
contamine souvent les produits riches en protéines, des produits fermentés à base de viande,
de fromages [32].
Ainsi, les céréales sont, toutes conditions égales par ailleurs, beaucoup plus propices à
la toxinogénèse que le soja, le colza et les protéines d’origines animales (saucisson, jambon).
8
1.4.3 Facteurs divers
Les fourrages et les céréales sont naturellement en contact avec des spores fongiques
avant, pendant et après la récolte, durant le transport et le stockage. Les rongeurs, oiseaux,
insectes et acariens interviennent dans le processus de contamination en provoquant des
lésions physiques dans les tissus végétaux qui favorisent la pénétration des spores [29].
La contamination d’arachide, de coton, de maïs par A. flavus ou les aflatoxines avant
la récolte est souvent liée à l’attaque par les insectes. Dans le stockage, les échantillons de
grain hébergeant des charançons révèlent en général une population fongique importante et
parfois des mycotoxines (aflatoxine B1, ochratoxines A, citrinine dans le maïs ou l’orge).
Des micro-organismes dit « de concurrence » peuvent affecter la production de
mycotoxines sur les produits agricoles. Ils peuvent augmenter ou gêner la formation des
mycotoxines en changeant les conditions environnementales les rendants défavorables pour la
production de mycotoxines ou en produisant des composés inhibiteurs [26]. Les intéractions
avec d’autres microorganismes peuvent également être différentes dans les différentes
conditions environnementales [33], [8].
Plusieurs facteurs additionnels peuvent influencer la production des mycotoxines dans
le champ. Ils peut s’agir des pratiques agricoles comme le labourage et la rotation de récolte
[31], les fongicides utilisés [35], la variété de la plante [15] et les différences géographiques
[28].
2. Ochratoxine A
2.1 Nature de la molécule
L’Ochratoxine A a été isolée pour la première fois en 1965, par un groupe de
chercheur Sud-Africain à partir d’un isolat d’Aspergillus ochraceus. Elle est constituée d’une
molécule de 3-méthyl-5-chloro-8-hydroxy-3,4 dihydroisocoumarine liée par une liaison
peptidique, au niveau de son groupement carboxyle en C7, au groupement amine de la L-βphénylalanine [20]. L’ochratoxine A appartient à la famille des polycétoacides et plus
précisément au groupe des ochratoxines. Ce groupe comprend une structure générale qui peut
en fonction des groupements R donner en plus de l’OTA différents analogues de structures
(tableau 3, figure 1).
9
Tableau 3 Différentes formes d’ochratoxines
Figure 1 Structure de Base et structures analogues de l’OTA [3].
10
2.2 L’alimentation vecteur d’OTA
Si l’air et les matériaux de construction infestés par des spores et des champignons
sont des vecteurs de contamination très grave chez l’Homme et les animaux, l’alimentation
reste néanmoins, la voie de contamination essentielle aux mycotoxines. L’ochratoxine A est
une mycotoxine qui contamine différentes productions de plantes, incluant les céréales, le
café, les cacahuètes, la bière, le vin, les épices et les jus de fruits [48] mais elle peut toucher
aussi la viande de proc et de volaille [25] ainsi que le lait [39]. Selon les données Européenne,
les céréales sont manifestement les principales sources d’exposition à l’OTA pour l’homme
par le régime alimentaire.
L’OTA se formerait préférentiellement sur les aliments plutôt acides. Les
concentrations en OTA retrouvées dans les aliments sont très variables et allant de quelques
ng/kg jusqu'à plusieurs dizaines de mg/kg [23], [25]. Les moisissures produisant l’OTA,
peuvent également produire d’autres toxines ou cohabiter avec d’autres moisissures
produisant des toxines différentes comme la citrinine produite par des Penicillia [24] ou des
aflatoxines produites par Aspergillus flavus.
2.3 Toxicité d’OTA
L’OTA est une mycotoxine toxique pour l’homme et les animaux. Elle reçoit une
attention particulière à cause de ses propriétés nephrotoxiques, carcinogène, tératogenic et
immunosuppressive [12]. OTA se produit dans les céréales et la nourriture à base céréale et a
été associé à la néphropathie porcine à travers une alimentation contaminée [24].
L’exposition Humaine se fait soit par consommation directe des produits contaminés
ou indirectement, par consommation de viande ou a dérivé des produits d'animaux qui ont été
nourris avec des aliments contenant l’OTA. OTA a été associé classiquement, bien que d'une
manière peu concluante, à plusieurs problèmes sanitaires humains tels que la néphropathie
endémique des Balkans NEB et récemment à des désordres rénaux en Egypte et Tunisie [12].
3. Les champignons ochratoxinogènes : A. niger, A. ochraceus et A.
carbonarius
L’ochratoxine A est élaborée par des moisissures appartenant principalement au genre
Aspergillus, Penicillium et Fusarium. Parmi les différentes espèces appartenant au genre
Aspergillus et secrétant cette mycotoxine on distingue Aspergillus niger, A. ochraceus et A.
carbonarius.
11
3.1 A. niger
Les Aspergillus sp. sont des microorganismes cosmopolites. Ils ont une valeur
économique très importante vue leur capacité à produire divers métabolites intéressants pour
l’homme mais sont également très dangereux par leur capacité à produire des métabolites
toxiques
Au sein du genre Aspergillus, la section « Nigri » ou « Black aspergilli » présente la
taxonomie la plus conflictuelle malgré tous les efforts fournis pour mieux l’élucider. Cette
section est très importante vue l’ochratoxigénicité qui a été récemment attribuée à certains de
ses représentants, A. niger et A. carbonarius [1], [50] prouvé comme contaminant majeurs de
certaines denrées tropicales et subtropicales tels que les raisins et dérivés [54]. Ils ont ainsi
contracté la mauvaise réputation d’organismes potentiellement destructeurs, malgré leur
grande et ancienne importance économique et industrielle dans le genre Aspergillus liée à
leurs potentiels producteurs de métabolites utiles pour l’homme (acide gras et enzymes
hydrolytiques) [9].
3.2 A. ochraceus
A. ochraceus est largement répondu dans l’environnement. Ce champignon a été
fréquemment isolé à partir des végétaux en décomposition. A. ochraceus est principalement
responsable de la pourriture des semences et des graines. Il peut produire plusieurs
métabolites secondaires dont les mycotoxines comme les ochratoxines, l’acide pénicillique, la
viomelleine, la xanthomegnine ou bien des herbicides comme la melleine, l’hydroxymelleine.
Il contamine plusieurs produits agricoles comme les céréales, le café, les épices, les
cacahuètes et le maïs [22], [51]. A. ochraceus est considéré comme la principale espèce
productrice d’ochratoxines A dans les climats chauds.
3.3 A. carbonarius
A carbonarius est l’espèce la plus distincte au sein de la section Nigri. C’est un
contaminant majeur de certaines denrées tropicales et subtropicales tels que le raisin et ses
dérivés [54]. Dans cette filière, le risque de contamination en OTA commence sur le terrain.
Quelques espèces de Black Aspergilli sont décrites comme étant capables de produire de
l’OTA, notamment l’agrégat A. niger et A. carbonarius [1], [44]. Ces espèces sont déjà
présentent à la vigne et ont la capacité de produire dans les baies une pourriture appelée
pourriture d’Aspergillus.
12
Parmi
les
espèces
de
ce
groupe,
A.
carbonarius
présente
le
potentiel
ochratoxinogènique le plus élevé [17]. Récemment, il a été montré que A carbonarius pourrait
être responsable de la production d’OTA dans les raisins [38], [49].
Dans le café, la contamination en OTA se développe surtout durant les opérations
post-récolte. Aucune espèces de Penicillium (P. verrucosum et P. nordicum) responsable de la
production d’OTA dans les céréales n’ont été isolées dans le café. En revanche trois espèces
d’Aspergillus peuvent jouer un rôle important dans le café : A. ochraceus, A. niger et
A. carbonarius. Bien que A. niger a été trouvé comme l’espèce dominante dans le café
(68-83 %), seule un faible pourcentage d’isolats (3%) est capable de produire de l’OTA dans
les conditions de laboratoire. A l’inverse, malgré une fréquence de la présence plus faible
d’A. carbonarius (6%), le pourcentage des isolats producteurs d’OTA est très grand (77%)
[6], [34], [43]. Ceci prouve, qu’en plus de A. ochraceus, A. carbonarius est aussi responsable
de la production d’OTA dans le café.
4. Voie de biosynthèse des mycotoxines
Les divers mycotoxines rencontrées, présentent des origines chimiques très diverses
correspondant à la différence de leurs voies de biosynthèse.
4.1 Organisation des gènes de la voie de biosynthèse d’un polycétone
4.1.1 Organisation d’un gène en cluster
L’adaptation d’un organisme aux conditions environnementales nécessite la
coopération de plusieurs gènes qui contribuent à sa survie. Dans une chaine métabolique, le
produit d’une réaction enzymatique doit être très rapidement repris par l’enzyme suivant afin
d’assurer une vitesse correcte de formation du produit final et d’éviter d’être détruit par des
réactions parasites possibles. Il existe donc une nécessité d’assemblage enzymatique sous
forme complexe ou cluster enzymatique. Si les gènes sont fortement liés, ils pourront former
des unités.
Les gènes catalysant des métabolites secondaires sont en général organisés en cluster.
Plusieurs clusters de polycétones sont identifiés chez les bactéries ainsi que chez les
champignons. Chez les champignons, plusieurs clusters codant pour des polycétones sont
étudiés. Il s’agit surtout du cluster de la biosynthèse d’aflatoxines et celui de l’ovastatine chez
A. flavus et A. terreus respectivement. La production de ces métabolites est sous contrôle des
clusters qui regroupent tous les gènes (ou presque) de la voie de biosynthèse de la molécule.
13
4.1.2 Voie de biosynthèse des Aflatoxines chez A. flavus
Les aflatoxines, un groupe de polycétones dérivé de furanocoumarine produit par de
nombreuses espèces du genre Aspergillus comme A. flavus et A. parasiticus. Elles sont parmi
les mycotoxines connues les plus toxiques et carcinogéniques. Au moins 16 structures
d’aflatoxines et leurs analogues sont caractérisées mais seulement 4 sont des aflatoxines
majeures, AFB1, AFB2, AFG1, et AFG2, contaminant des produits agricoles et posant des
problèmes pour la santé humaine.
La biosynthèse des aflatoxines débute par la conversion des malonyl-CoA en un
polycétone noranthrone (annexe 1) par deux acides gras synthases (Fas-1 et Fas-2) et une PKS
(PksA). La conversion de la noranthrone en acide norsolorinique (NOR), le premier
intermédiaire stable, est probablement assurée par la monooxygenase CypA et la
dehydrogenase NorB [4]. Le NOR peut être ensuite transformé en averantine (AVN) par
dehydrogenase Nor-1 ou NorA. Quelques étapes de conversion de AVR en versicolorine B
(VERB) ne sont pas encore établies. Cette conversion est probablement catalysée par les
enzymes CypX, MoxY et AvfA.
La versicolorine A est transformée en demethylsterigmatocystine (DMST) par une
ketoreductase Ver1 et une cytochrome P450 monooxygenase VerA. L’étape finale est la
conversion d’O-methyl-sterigmatocystine (OMST) ou dihydro-O-methylsterigmatocystine
(DHOMST) en aflatoxines B1, B2, G1 et G2 en présence de l’enzyme NADPH-dependant
monooxygenase OrdA.
Récemment quelques nouveaux gènes dont le rôle dans la production d’aflatoxines n’a
pas encore été confirmé ont été isolés dans le cluster des aflatoxines [53].
4.1.3 Voie de biosynthèse de l’OTA
En dépit du fait que l’OTA est une mycotoxine importante, sa voie de biosynthèse
n’est pas, jusqu’à ce jour, encore complètement établie. Cependant, des expériences en
utilisant les précurseurs marqués 14C et 13C ont montré que la partie de phénylalanine provient
de la voie des shikimates et la partie dihydroisocoumarine de la voie des pentaketides.
En 1979, Huff et Hamilton proposent une voie hypothétique de biosynthèse dans
laquelle la melleine et l’hydroxymelleine seraient probablement des précurseurs de l’OTA.
Cependant, des résultats plus récents [16] rendent cette hypothèse ambiguë et selon eux la
melleine ne jouerait pas un rôle dans la voie de biosynthèse de l’OTA.
14
L’étape centrale de la voie de biosynthèse de la partie isocoumarine de l’OTA consiste
à la condensation décarboxylative d’une unité acétate et de 4 unités malonate grâce à une
polycétone synthase (PKS).
Le squelette subit ensuite des réactions de cyclisation, aromatisation, méthylation,
oxydation et chlorination [40]. Une fois formée, la chaine de polykétide est modifiée par la
formation d’un noyau lactone (synthèse de la melleine) et par l’addition d’un groupe
carboxylique (synthèse d’ochratoxine). Plus tard, l’atome de chlore est incorporé par l’action
d’une chloroperoxidase (synthèse d’Ota). Finalement, l’ochratoxine A synthase catalyse
l’enchainement d’Ota à la phénylalanine (annexe 2).
Chaque champignon peut avoir quelques dizaines de polycétones synthases, qui sont
des enzymes clé de la voie de biosynthèse des métabolismes secondaires. Récemment, une
partie du gène des polycétones synthases impliqué dans voie de biosynthèse de l’OTA chez A.
ochraceus a été décrite par Ali [2] et Nafees et al. (soumis) ainsi que par Dobson [19]. Il
s’agit, respectivement, des polycétones synthases AoKS1 et AoLC 35-12, cependant leur rôle
dans la voie de biosynthèse n’est pas encore défini.
Selon les études menées par Karolewiez et Geisen [21] réalisées sur l’espèce P.
nordicum, la polycétone synthase otpksPN code pour le domaine d’une ketoacyl synthétase et
une acyltransférase, ce qui est typique pour les polycétones synthases fongiques. D’après
leurs résultats, il existe probablement une corrélation entre l’expression du gène otpksPN et la
production d’ochratoxine A chez P. nordicum dans les milieux propices à la formation d’OTA
où un haut niveau d’expression de gène est observé.
5. Conclusion
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par des moisissures
appartenant principalement au genre Aspergillus, Penicillium et Fusarium. Elles sont
produites sur une large variété de denrées alimentaires et leurs production dépend d’un certain
nombre de conditions environnementales.
Parmi les centaines de mycotoxines identifiées, seule une vingtaine posséderait des
caractéristiques toxiques préoccupant pour l’humain. Parmi ce panel, on distingue
l’ochratoxine A. L’OTA est une molécule produite par différentes espèces fongiques des
genres Aspergillus et Penicillium. Cette molécule est très stable et persistante et est très
toxique pour l’homme et pour les animaux.
L’OTA est produite principalement par des champignons ochratoxinogènes comme A.
niger, A. ochraceus et A. carbonarius cependant, sa voie de biosynthèse n’est toujours pas
bien définie. Jusqu’à présent, un nombre très restreint d’études a été réalisé sur la voie de
15
biosynthèse de l’OTA chez A. ochraceus et A. carbonarius où quelques gènes de polycétones
synthases ont été identifiés sans pour autant connaître leurs rôle dans la formation de ce
métabolite.
Dans le cadre de ce stage, Aspergillus carbonarius à été choisi comme modèle
d’étude afin de caractériser certains gènes de la voie de biosynthèse de l’ochratoxine A. Ce
champignon est un contaminant majeur de certaines denrées tropicales et subtropicales tels
que le raisin et ses dérivés et a un potentiel ochratoxinogènique le plus élevé parmi les
espèces du genre Aspergillus. Une meilleure connaissance des enzymes impliquées dans les
mécanismes moléculaires de la formation de l’OTA chez A. carbonarius est un des moyens
de lutte contre la formation de cette mycotoxine dans les diverses denrées alimentaires
contaminée par celle-ci.
16
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21
ANNEXE 1
Figure 2 Comparaison du cluster d’aflatoxine (AF) chez A. flavus (A) et celui de
stérigmatocystine (ST) chez A. nidulans (B). les fléches indiquent le sens de transcription du
gène. Les gènes homologues entre clusters sont numérotés par le même chiffre. Les étapes de
biosynthèse sont schématisées par (C). AVN : averantine, HAVN : 5’- hydroxyaveratine,
AVNN : averufanine, VHA : versiconal hemiacetal acetate, VAL : versiconal, DHDMST :
dihydrodemethylstegmatocystine, DHOMST : dihrydro-, OMST : O-methylsterigmatocystine
[4].
22
ANNEXE 2
Acetyl CoA +
Malonate
Polyketide
synthase
Shikimic Acid
Mellein
Ochratoxin β
Phenylalanine
Chloroperoxidase
Ochratoxin A
synthase
Ochratoxin α
Ochratoxin A
Figure 3 Voie hypothétique de biosynthèse de l’OTA [18].
23