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THESE DE DOCTORAT
DE L’UNIVERSITE PARIS XII - VAL DE MARNE
Présentée par Carole KARAKASYAN
Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS XII
Spécialité : Physico-Chimie des Polymères
FONCTIONNALISATION DE SURFACES
PAR L’INTERMEDIAIRE DU COUPLE
ADAMANTANE / β-CYCLODEXTRINE ;
APPLICATION DU PROCEDE POUR L’ELABORATION
D’UN IMMUNOCAPTEUR
Soutenue le 24 Juin 2005 devant le jury composé de
Mr André DERATANI (rapporteur)
Mr Michel MORCELLET (rapporteur)
Mr Michaël CANVA
Mme Marie-Claude MILLOT (directeur de thèse)
Mr Gabriel PELTRE
Mme Myriam TAVERNA
Ce travail a été effectué au sein du Laboratoire de Recherche sur les Polymères au
CNRS de Thiais dirigé par Monsieur Philippe Guerin, Professeur à l'Université Paris XII-Val
de Marne, puis par Monsieur Jacques Penelle, Directeur de recherche au CNRS. J’aimerais les
remercier pour m'avoir accueillie dans leur laboratoire et m’avoir ainsi permis de mener à
bien mes travaux de recherche.
J'aimerais adresser toute ma reconnaissance à Madame Marie Claude Millot,
Professeur à l'Université Paris XII, pour la confiance qu'elle m'a témoignée en m’intégrant
dans son équipe de recherche et en me confiant un volet de ses projets scientifiques. Je
souhaiterais également lui adresser mes plus sincères remerciements pour la grande rigueur de
ses conseils scientifiques ainsi que pour sa disponibilité, sa patience et son écoute dans les
moments parfois difficiles de la thèse.
Je suis également très sensible à l’intérêt que Monsieur André Deratani, Directeur de
Recherche au CNRS à l’Institut Européen des Membranes de l’Université de Montpellier II,
et Monsieur Michel Morcellet, Professeur à l’Université des Sciences et Technologies de Lille
et Directeur du Laboratoire de Chimie Organique et Macromoléculaire de Villeneuve d’Ascq,
ont accordé à ce travail en acceptant d’examiner mes travaux de recherche et de faire partie du
jury de thèse. Je les en remercie.
Mes remerciements vont également à Monsieur Yves Levy, Directeur de recherche au
CNRS, et à Monsieur Michaël Canva, Chargé de recherche au CNRS, du Laboratoire Charles
Fabry à l’Institut d’Optique de l’Université Paris Sud, pour leur contribution à l’étude par
résonance des plasmons de surface. Je remercie tout particulièrement Monsieur Michaël
Canva pour avoir accepté d’être membre du jury de thèse et pour ses conseils quant à la
rédaction du dernier chapitre du manuscrit.
J’aimerais adresser mes remerciements à Madame Myriam Taverna, Professeur à
l’Université Paris XI, pour m’avoir accueillie au sein du Groupe de Chimie Analytique de
Paris Sud à la Faculté de Pharmacie de Chatenay Malabry et de m’avoir formée à la technique
d’électrophorèse capillaire. Je lui adresse également ma reconnaissance pour avoir accepté de
participer au jury de thèse.
Je tiens également à remercier Monsieur Gabriel Peltre, Chargé de Recherche au
CNRS et membre du Laboratoire Environnement et Chimie Analytique de l’Ecole Supérieure
de Physique et Chimie Industrielles de la ville de Paris, pour sa contribution dans la dernière
partie de mon travail de thèse qui a consisté à l’élaboration d’un immunocapteur et pour avoir
bien voulu faire partie du jury de thèse.
J’aimerais également adresser mes sincères remerciements à Madame Claire Vidal
Madjar, Directrice de Recherche au CNRS et membre du Laboratoire de Recherche sur les
Polymères, pour les recommandations scientifiques qu’elle m’a prodiguées lors de l’étude
théorique des interactions par chromatographie d'affinité. Je la remercie également pour son
écoute, sa gentillesse et pour sa générosité.
Je tiens également à remercier Monsieur Mohammed Guerrouache, Ingénieur d’Etude
au CNRS au Laboratoire de Recherche sur les Polymères, pour m’avoir apporté une aide
précieuse pour la modification chimique de certains polymères.
Enfin, je remercie l’ensemble des membres du laboratoire qui ont su créer une
ambiance de travail sympathique et qui m’ont apporté par certains moments leur soutien
scientifique et moral.
TABLE DES MATIERES
Pages
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................11
LISTE DES FIGURES .....................................................................................................13
LISTE DES REACTIONS .................................................................................................15
LISTE DES TABLEAUX ...................................................................................................16
LISTE DES EQUATIONS .................................................................................................17
LISTE DES ANNEXES ....................................................................................................19
INTRODUCTION .......................................................................................................21
CHAPITRE I :
PRESENTATION ET SYNTHESE
DES SYSTEMES ASSOCIATIFS DE L’ETUDE
I – PRESENTATION GENERALE DES CYCLODEXTRINES ..................................26
I.1 – Nomenclature et aspects structuraux.........................................................................................................26
I.2 – Propriétés physico-chimiques .....................................................................................................................28
I.3 – Propriétés de complexation.........................................................................................................................29
I.4 – Mécanisme de formation des complexes d’inclusion ................................................................................30
I.5 – Applications..................................................................................................................................................31
II - PRESENTATION GENERALE DES SYSTEMES MACROMOLECULAIRES
ASSOCIATIFS A BASE DE CYCLODEXTRINE ......................................................32
II.1 – Formation de complexes supramoléculaires cristallins : les polyrotaxanes..........................................33
II.2 – Formation de complexes supramoléculaires en solution ........................................................................37
III - SYNTHESE DES MOLECULES HOTE ET INVITE DU SYSTEME ASSOCIATIF
DE L’ETUDE .............................................................................................................40
III.1 - Synthèse des molécules hôtes : dérivés de β-cyclodextrine ....................................................................41
1
III.1.1 - Synthèse et caractérisation d’un polymère de β-cyclodextrine ............................................................41
III.1.2 – Synthèse et caractérisation d’une β-cyclodextrine monoaminée.........................................................43
a) Principe.....................................................................................................................................................43
b) Synthèse et caractérisation de l'intermédiaire β-cyclodextrine tosylée ....................................................44
c) Synthèse et caractérisation de l'intermédiaire β-cyclodextrine azidée......................................................45
d) Synthèse et caractérisation de la β-cyclodextrine aminée ........................................................................45
III.2 – Immobilisation du polymère de β -cyclodextrine sur de la silice : élaboration d’un support
chromatographique de silice-polyβ
β-CD..............................................................................................................46
III.3 - Synthèse des molécules invitées : dérivés amphiphiles de poly(éthylène glycol) et de dextrane.........48
III.3.1 – Présentation de l’ensemble des polymères amphiphiles synthétisés ...................................................49
a) Choix du groupement hydrophobe ...........................................................................................................49
b) Présentation des polymères amphiphiles synthétisés et de leurs applications ..........................................50
III.3.2 - Caractérisation des polymères hydrophiles initiaux.............................................................................51
III.3.3 – Synthèse et caractérisation des polymères amphiphiles à base de PEG ..............................................52
a) Synthèse et caractérisation des MPEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) à une extrémité de
chaîne : MPEG-AdPh ...................................................................................................................................53
b) Synthèse et caractérisation des PEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) à une extrémité de
chaîne et une fonction acide carboxylique à l’autre extrémité : COOH-PEG-AdPh ....................................55
b.1) Synthèse et caractérisation des PEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) à une extrémité de
chaîne : OH-PEG-AdPh...........................................................................................................................56
b.2) Synthèse et caractérisation des PEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) et une fonction
carboxylique (COOH) à l’autre extrémité : COOH-PEG-AdPh ..............................................................64
III.3.4 – Synthèse et caractérisation des polymères amphiphiles à base de dextrane ........................................66
a) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) le long de la chaîne : DextAd .................................................................................................................................................................67
b) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et diéthylaminoéthyle
(DEAE) le long de la chaîne : Dext-Ad-DEAE ............................................................................................69
c) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et des fonctions acide
carboxylique (COOH) le long de la chaîne : Dext-Ad-COOH .....................................................................74
d) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et des chaînons alkyle (C8)
le long de la chaîne : Dext-Ad-C8 .................................................................................................................76
III.4 - Conclusion..................................................................................................................................................80
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .....................................................................81
CHAPITRE II :
ETUDE THEORIQUE PAR ACE ET PAR CLHP DE L’INTERACTION
ENTRE UN POLYMERE MODELE MODIFIE ADAMANTYLE
ET LA β-CYCLODEXTRINE
I – DETERMINATION DES CONSTANTES D’AFFINITE PAR ELECTROPHORESE
CAPILLAIRE .............................................................................................................88
I.1 – Principe de l’électrophorèse capillaire (EC)..............................................................................................89
I.1.1 - Généralités ..............................................................................................................................................89
I.1.2 - Principe de séparation : flux électrophorétique et flux électroosmotique ...............................................90
a) La mobilité électrophorétique...................................................................................................................90
b) La mobilité électroosmotique...................................................................................................................91
2
c) La mobilité apparente ...............................................................................................................................93
I.1.3 - Instrumentation .......................................................................................................................................94
a) Modes d’injection.....................................................................................................................................94
b) Modes de détection...................................................................................................................................95
I.1.4 – L’électrophorèse capillaire de zone (CZE) ............................................................................................96
I.2 –Détermination des constantes d’affinité en solution par EC.....................................................................98
I.2.1 - Détermination des constantes d’affinité par des mesures de concentrations ; considérations théoriques
.........................................................................................................................................................................100
I.2.2 - Détermination des constantes d’affinité par des mesures de concentrations ; les méthodes
expérimentales.................................................................................................................................................102
a) Méthode d’Hummel-Dreyer (HD)..........................................................................................................102
b) Méthode du pic de vacance (VP) ...........................................................................................................104
c) Méthode d’analyse frontale (FA) ...........................................................................................................106
d) Méthode de l’analyse frontale en continu (FACCE) ..............................................................................108
I.2.3 - Détermination des constantes d’affinité par des mesures de mobilités ; considérations théoriques .....111
a) Détermination de la constante d’affinité à partir de l’Equation II-24.....................................................113
b) Détermination de la constante d’affinité à partir de l’Equation II-25.....................................................114
c) Linéarisation des isothermes ..................................................................................................................115
d) Sources d’erreurs....................................................................................................................................119
I.2.4 - Détermination des constantes d’affinité par mesures de mobilités ; méthodes expérimentales............123
a) Méthode d’électrophorèse capillaire d’affinité (ACE) ...........................................................................123
b) Méthode d’électrophorèse capillaire d’affinité et de vacance (VACE).................................................125
I.2.5 – Conclusion ...........................................................................................................................................127
I.3 – Détermination de la constante d’affinité MPEG-AdPh / β -CD par ACE .............................................129
I.3.1 - Eudes préliminaires ..............................................................................................................................131
a) Etude de l’adsorption du MPEG-AdPh ou de la β-CD-Sulf à la surface du capillaire ...........................131
b) Evolution de la viscosité du tampon d’analyse lors de l’addition de la β-CD-Sulf................................131
I.3.2 - Détermination des constantes d’interaction ..........................................................................................132
a) Détermination des constantes à partir des isothermes d’association ......................................................133
b) Détermination des constantes à partir des représentations linéaires.......................................................138
c) Comparaison des résultats ......................................................................................................................139
I.3.3 - Conclusion ............................................................................................................................................141
II – DETERMINATION DES CONSTANTES D’AFFINITE PAR
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE..............................142
II.1 – Aspects théoriques de la chromatographie d'affinité par compétition : mesures à l'équilibre .........142
II.1.1 - Rappels chromatographiques...............................................................................................................142
II.1.2 – Présentation des modèles permettant la détermination des constantes d’affinité par des mesures à
l’équilibre ........................................................................................................................................................144
a) Cas où le soluté interagit avec un seul type de site sur le support ..........................................................144
b) Cas où le soluté interagit avec deux types de sites sur le support ..........................................................150
II.2 – Détermination de la constante d’affinité MPEG-AdPh / β -CD par chromatographie d’affinité par
compétition .........................................................................................................................................................153
II.2.1 – Détermination de la constante d’affinité en solution K AL .................................................................155
II.2.2 – Détermination des constantes d’affinité aux interfaces
K AX1 et K AX 2 ............................................157
III – CONCLUSION .................................................................................................162
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................................163
3
CHAPITRE III :
MODIFICATION DES PROPRIETES DE SURFACE DE LA SILICE
ADAMANTANE / β-CYCLODEXTRINE :
ETUDE PAR CLHP DES SILICES MODIFIEES
I – ANALYSE ET PURIFICATION DES PROTEINES PAR CHROMATOGRAPHIE
LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE (CLHP) SUR DES SUPPORTS DE SILICE :
ETAT DE L’ART..................................................... ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.
I.1 – Utilisation de la silice comme support de base pour l’analyse ou la purification des protéines par
CLHP ..............................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.1.1 - Structure de la silice......................................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.1.2 – Exigences relatives aux particules de silice utilisées comme support pour la CLHP des protéines
..................................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.1.3 – Les monolithes de silice pour la CLHP des protéines...................................Erreur ! Signet non défini.
I.2 – Analyse et purification des protéines par chromatographie d’exclusion stérique (SEC).. Erreur ! Signet
non défini.
I.2.1 - Phases stationnaires à base de silice utilisées pour l’analyse des protéines en SEC . Erreur ! Signet non
défini.
a) Modification chimique de la silice ..................................................................Erreur ! Signet non défini.
b) Diamètre des pores de la silice ........................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.2.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en SEC ......................Erreur ! Signet non défini.
I.3 – Analyse et purification des protéines par chromatographie liquide à haute performance sur phase
inversée (RP-CLHP) sur des supports à base de silice................................................Erreur ! Signet non défini.
I.3.1 - Phases stationnaires à base de silice utilisées pour l’analyse des protéines en RP-CLHP Erreur ! Signet
non défini.
I.3.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en RP-CLHP .............Erreur ! Signet non défini.
I.3.3 - Prévision de la rétention des protéines en RP-CLHP : modèles théoriques...Erreur ! Signet non défini.
I.4 – Analyse et purification des protéines par chromatographie d’interaction hydrophobe à haute
performance (HIC) ........................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.4.1 - Phases stationnaires à base de silice utilisées pour l’analyse des protéines en HIC . Erreur ! Signet non
défini.
I.4.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en HIC.......................Erreur ! Signet non défini.
I.4.3 - Prévision de la rétention des protéines en HIC : modèle théorique ...............Erreur ! Signet non défini.
I.5 – Analyse et purification des protéines par chromatographie d’échange d’ions à haute performance
(IEC)................................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.5.1 - Phases stationnaires à base de silice utilisées pour l’analyse des protéines en IEC.. Erreur ! Signet non
défini.
I.5.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en IEC .......................Erreur ! Signet non défini.
I.5.3 - Prévision de la rétention des protéines en IEC : modèles théoriques.............Erreur ! Signet non défini.
I.6 – Analyse et purification des protéines par chromatographie d’affinité et d’immunoaffinité à haute
performance....................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.6.1 - Analyse et purification des protéines par chromatographie d’affinité à haute performance (CAHP)
I.6.2 – La chromatographie d’immunoaffinité à haute performance (HICP) ...........Erreur ! Signet non défini.
a) Principe de la chromatographie d’immunoaffinité ..........................................Erreur ! Signet non défini.
4
b) Capacité de liaison d’un support d’immunoaffinité et activité spécifique des anticorps....Erreur ! Signet
non défini.
c) Modes de fixation d’un anticorps ou d’un antigène sur un support à base de silice pour l’élaboration de
phases stationnaires destinées à la HICP .............................................................Erreur ! Signet non défini.
II - MISE EN JEU D’UN COMPLEXE D’INCLUSION A BASE DE CYCLODEXTRINE
ET D’ADAMANTANE POUR L’ELABORATION DE SUPPORTS
CHROMATOGRAPHIQUES DE FONCTIONNALITES VARIABLES, DESTINES A
L’ANALYSE DE PROTEINES................................ ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.
II.1 – Préparation de supports chromatographiques de fonctionnalités variables destinés à l’analyse de
protéines..........................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
II.2 – Propriétés de surface du support de base de silice-polyβ
β-CD ..........................Erreur ! Signet non défini.
II.3 – Analyse des protéines sur les supports échangeurs d’ions................................Erreur ! Signet non défini.
II.3.1 – Détermination de la capacité d’échange ionique des supports.....................Erreur ! Signet non défini.
II.3.2 – Rétention des protéines sur le support échangeur d’anions de type silice-polyβ-CD-(Dext-AdDEAE) : application du modèle du déplacement stoechiométrique .........................Erreur ! Signet non défini.
II.3.3 – Analyse et séparation des protéines sur le support échangeur de cations de type silice-polyβ-CD(Dext-Ad-COOH).....................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
a) Analyse des protéines sur le support échangeur de cations de type silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-COOH) :
application du modèle du déplacement stoechiométrique ...................................Erreur ! Signet non défini.
b) Influence du pH sur la rétention des protéines et sur les paramètres caractéristiques des systèmes
protéine-support mis en jeu .................................................................................Erreur ! Signet non défini.
c) Séparation d’un mélange de protéines .............................................................Erreur ! Signet non défini.
II.4 – Analyse des protéines sur le support d’interaction hydrophobe de type silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-C8)
.........................................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
II.4.1 – Analyse des protéines sur le support d’interaction hydrophobe de type silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8)
II.4.2 – Séparation d’un mélange de protéines à caractère hydrophobe sur le support........ Erreur ! Signet non
défini.
II.5 – Amélioration de l’efficacité des colonnes ...........................................................Erreur ! Signet non défini.
II.6 – Régénération des colonnes...................................................................................Erreur ! Signet non défini.
III - MISE EN JEU D’UN COMPLEXE D’INCLUSION A BASE DE
CYCLODEXTRINE POUR L’ELABORATION DE SUPPORTS
CHROMATOGRAPHIQUES DESTINES A LA PURIFICATION D’ANTIGENES
............................................................................... ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.
III.1 – Présentation du système antigène-anticorps étudié .........................................Erreur ! Signet non défini.
III.1.1 - Albumine du sérum humain (ASH) ............................................................Erreur ! Signet non défini.
a) Composition de l’albumine du sérum humain (ASH) .....................................Erreur ! Signet non défini.
b) Conformation de l’albumine ...........................................................................Erreur ! Signet non défini.
c) Fonctions de l’albumine ..................................................................................Erreur ! Signet non défini.
III.1.2 – Anticorps anti-albumine du sérum humain.................................................Erreur ! Signet non défini.
a) Introduction à la réponse immunitaire chez les vertébrés : notions d’antigène et d’anticorps ...... Erreur !
Signet non défini.
b) Structure des molécules typiques d’anticorps .................................................Erreur ! Signet non défini.
c) Les chaînes lourdes et légères possèdent des régions variables pour la reconnaissance des antigènes et
des régions constantes pour leurs fonctions effectrices .......................................Erreur ! Signet non défini.
5
d) Interaction antigène-anticorps .........................................................................Erreur ! Signet non défini.
e) Présentation des différentes classes d’anticorps ..............................................Erreur ! Signet non défini.
III.2 – Préparation du support chromatographique d’immunoaffinité destiné à la purification de
l’albumine du sérum humain (ASH) ............................................................................Erreur ! Signet non défini.
III.2.1 – Préparation du support d’immunoaffinité en mode statique (voie 1) .........Erreur ! Signet non défini.
III.2.2 – Préparation in situ du support d’immunoaffinité (mode dynamique, voie 2) ........ Erreur ! Signet non
défini.
III.3 – Propriétés des supports d’immunoaffinité obtenus .........................................Erreur ! Signet non défini.
III.3.1 - Vérification de l’inertie des supports d’immunoaffinité (élaborés selon les voies 1 et 2) vis à vis des
protéines acides ........................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
III.3.2 - Adsorption de l’albumine du sérum humain sur l’anticorps polyclonal immobilisé selon la voie 1
III.3.3 - Régénération du support au niveau anti-ASH/ASH (support issu de la voie 1)..... Erreur ! Signet non
défini.
III.3.4 - Détermination de la capacité d’adsorption maximale en ASH du support d’immunoaffinité (support
issu de la voie 1).......................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
III.3.5 - Régénération du support au niveau du polymère de β-cyclodextrine (support issu de la voie 1)
III.3.6 - Adsorption de l’albumine du sérum humain sur l’anticorps polyclonal immobilisé, selon la voie 2, par
une méthode d’analyse frontale................................................................................Erreur ! Signet non défini.
IV – CONCLUSION ................................................ ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.
CHAPITRE IV :
FONCTIONNALISATION D’UNE SURFACE D’OR
ELABORATION D’UN IMMUNOCAPTEUR
I – INTRODUCTION A LA RESONANCE DES PLASMONS DE SURFACE (RPS)
................................................................................................................................273
I.1 – Propriétés des ondes plasmons de surface ...............................................................................................274
I.2 – Excitation des plasmons de surface à l’aide d’un couplage par prisme................................................275
I.3 – Mesure de l’épaisseur d’une couche mince par RPS ..............................................................................278
I.4 - Imagerie par résonance des plasmons de surface (SPR) et méthodologie .............................................280
II – METHODES D’IMMOBILISATION DES PROTEINES SUR UNE SURFACE
D’OR : ETAT DE L’ART..........................................................................................283
II.1 – Immobilisation des protéines par adsorption passive ...........................................................................284
6
II.2 – Immobilisation directe de protéines sur une monocouche organique auto assemblée (SAM) ..........285
II.2.1 – Propriétés des monocouches de type SAMs .......................................................................................286
II.2.2 – Exemples d’immobilisation directe de protéines sur une SAM..........................................................287
II.3– Immobilisation des protéines par l’intermédiaire d’un assemblage macromoléculaire .....................289
II.3.1 – Immobilisation des protéines sur un dextrane carboxyméthylé ..........................................................289
II.3.2 – Immobilisation des protéines sur d’autres types de polymères...........................................................291
II.4– Immobilisation des protéines par l’intermédiaire d’un complexe de haute affinité de type avidine /
biotine..................................................................................................................................................................293
II.4– Conclusion .................................................................................................................................................298
III – ELABORATION D’UN IMMUNOCAPTEUR : PRESENTATION DES DEUX
VOIES UTILISEES DANS CE TRAVAIL POUR IMMOBILISER LA βLACTOGLOBULINE SUR UNE SURFACE D’OR..................................................298
III.1 – Présentation des deux voies de fixation de la β-lactoglobuline sur une surface d’or........................298
III.2 – Elaboration de l’interface de complexation commune aux deux voies par immobilisation d’une
couche de β -CD sur une surface d’or ...............................................................................................................301
IV – IMMUNOCAPTEUR OBTENU PAR IMMOBILISATION D’UNE β LACTOGLOBULINE MODIFIEE PAR DES GROUPEMENTS ADAMANTYLE :
METHODE A ...........................................................................................................306
IV.1 – Préparation et caractérisation d’une β-lactoglobuline modifiée par des groupements adamantyle
.............................................................................................................................................................................308
IV.1.1 – Modification de la β-lactoglobuline par des groupements adamantyle .............................................308
IV.1.2 – Caractérisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh par électrophorèse .............................................312
a) Caractérisation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de détergent SDS (SDS
PAGE) ........................................................................................................................................................312
b) Caractérisation par isoélectrofocalisation (IEF) .....................................................................................315
c) Caractérisation par électrophorèse capillaire..........................................................................................317
IV.1.3 – Conclusion ........................................................................................................................................318
IV.2 – Immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface d’or recouverte de β-cyclodextrine
.............................................................................................................................................................................319
IV.2.1 – Etude de la spécificité de l’interaction entre la β-lactoglobuline et la surface d’or recouverte de βcyclodextrine ...................................................................................................................................................319
IV.2.2 - Immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface d’or recouverte de β-cyclodextrine
.........................................................................................................................................................................321
IV.3 – Reconnaissance de la β-lactoglobuline immobilisée (méthode A) par l’anti-β
β -lactoglobuline .........327
IV.4 – Etude de faisabilité d’une puce à allergènes.........................................................................................330
V – IMMUNOCAPTEUR OBTENU PAR IMMOBILISATION DE LA βLACTOGLOBULINE SUR UN DEXTRANE CARBOXYMETHYLE MODIFIE PAR
DES GROUPEMENTS ADAMANTYLE : METHODE B..........................................333
V.1 – Immobilisation d’un dextrane modifié par des groupements adamantyle et des fonctions COOH
(Dext-Ad-COOH) sur la surface d’or recouverte de β -cyclodextrine............................................................335
7
V.2 - Immobilisation à pH = 7,4 de la β-lactoglobuline sur la surface d’or recouverte de Dext-Ad-COOH
.............................................................................................................................................................................337
V.3 - Immobilisation à pH = 4,5 de la β-lactoglobuline sur la surface d’or recouverte de Dext-Ad-COOH
.............................................................................................................................................................................338
a) Phénomène d’accumulation de la β-lactoglobuline à proximité du Dext-Ad-COOH par mise en jeu
d’interactions électrostatiques ....................................................................................................................339
b) Greffage à pH = 4,5 de la β-lactoglobuline sur la surface d’or recouverte de Dext-Ad-COOH ............342
V.4 - Reconnaissance de la β-lactoglobuline immobilisée (méthode B) par l’anti-β
β-lactoglobuline............346
VI – REGENERATION DE L’IMMUNOCAPTEUR ..................................................350
VI.1 – Régénération de l’immunocapteur au niveau de la couche de β-cyclodextrine.................................350
VI.2 – Régénération de l’immunocapteur au niveau de l’antigène β-lactoglobuline ...................................354
VII – COMPARAISON DES DEUX VOIES D’ELABORATION DE
L’IMMUNOCAPTEUR .............................................................................................358
VII – CONCLUSION ................................................................................................360
CONCLUSION GENERALE....................................................................................369
ANNEXES EXPERIMENTALES ..............................................................................375
8
LISTES
ABREVIATIONS - FIGURES - REACTIONS - TABLEAUX - EQUATIONS
9
10
LISTE DES ABREVIATIONS
Techniques expérimentales :
ACE : Electrophorèse capillaire d’affinité
CAHP : Chromatographie d’affinité à haute performance
CIHP : Chromatographie d’immunoaffinité à haute performance
CLHP : Chromatographie liquide à haute performance
EC : Electrophorèse capillaire
FA : Analyse frontale
FACCE : Electrophorèse capillaire d’analyse frontale en continu
HD : Méthode d’Hummel-Dreyer
HIC : Chromatographie d’interaction hydrophobe
IEC : Chromatographie d’échange d’ions
IEF : Isoélectrofocalisation
IR : Infrarouge
RMN : Résonance magnétique nucléaire
RP-CLHP : Chromatographie liquide à haute performance sur phase inversée
RPS : Résonance des plasmons de surface
SDS PAGE : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de détergent ionique SDS
SEC : Chromatographie d'exclusion stérique
UV : Ultraviolet
VACE : Electrophorèse capillaire d’affinité et de vacance
VP : Méthode du pic de vacance
Produits chimiques :
Ad : Groupement adamantyle
AdPh : Groupement phényladamantyle
ASH : Albumine du sérum humain
ASB : Albumine du sérum bovin
β-CD-NH2 : β-cyclodextrine aminée
CD : Cyclodextrine
CHAPS : 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonium]-1-propanesulfonate
11
DBLT : Dilaurate de dibutylétain
DEAE : Groupement diéthylaminoéthyle
DMAP : 4-diméthylaminopyridine
DMF : Diméthylformamide
DMSO : Diméthylsufoxyde
EDC : 1,3-(diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide
EP : Epichlorhydrine
HPβ-CD : hydroxypropylβ-cyclodextrine
IgG : Immunoglobuline G
MPEG : Méthoxy(polyéthylène glycol)
Nap : Naphtyle
NHS : N-hydroxysuccinimide
PBS : Tampon phosphate
PEEK : poly(éther éther cétone)
PEI : Polyéthylèneimine
PEG : Polyéthylène glycol
Polyβ-CD : Polymère de β-CD
SDS : dodécylsulfate de sodium
TA : Tampon acétate
THF : Tétrahydrofurane
Tris : tris(hydroxyméthyl)amino-méthane
Ts : Tosyle
Tween 20 : Tensioactif neutre
Divers :
pI : Point isoélectrique
psi : unité de pression, 1 psi = 6894,76 Pa
SAM : Monocouche auto assemblée
12
LISTE DES FIGURES
Pages
Figure I-1 ...............................................................................................................................................................27
Figure I-2 ...............................................................................................................................................................27
Figure I-3 ...............................................................................................................................................................31
Figure I-4 ...............................................................................................................................................................35
Figure I-5 ...............................................................................................................................................................36
Figure I-6 ...............................................................................................................................................................36
Figure I-7 ...............................................................................................................................................................37
Figure I-8 ...............................................................................................................................................................38
Figure I-9. ..............................................................................................................................................................42
Figure I-10 .............................................................................................................................................................45
Figure I-11 .............................................................................................................................................................49
Figure I-12 .............................................................................................................................................................50
Figure I-13 .............................................................................................................................................................53
Figure I-14 .............................................................................................................................................................58
Figure I-15 .............................................................................................................................................................60
Figure I-16 .............................................................................................................................................................64
Figure I-17 .............................................................................................................................................................66
Figure I-18 .............................................................................................................................................................67
Figure I-19 .............................................................................................................................................................70
Figure I-20 .............................................................................................................................................................78
Figure II-1 ..............................................................................................................................................................89
Figure II-2 ..............................................................................................................................................................91
Figure II-3 ..............................................................................................................................................................97
Figure II-4 ............................................................................................................................................................103
Figure II-5 ............................................................................................................................................................105
Figure II-6 ............................................................................................................................................................107
Figure II-7 ............................................................................................................................................................110
Figure II-8 ............................................................................................................................................................124
Figure II-9 ............................................................................................................................................................126
Figure II-10 ..........................................................................................................................................................133
Figure II-11 ..........................................................................................................................................................139
Figure II-12 ..........................................................................................................................................................149
Figure II-13 ..........................................................................................................................................................155
Figure II-14. .........................................................................................................................................................157
Figure III-1....................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
Figure III-10..................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
13
Figure IV-1...........................................................................................................................................................275
Figure IV-2...........................................................................................................................................................277
Figure IV-3...........................................................................................................................................................279
Figure IV-4...........................................................................................................................................................281
Figure IV-5...........................................................................................................................................................282
Figure IV-6...........................................................................................................................................................283
Figure IV-7...........................................................................................................................................................285
Figure IV-8...........................................................................................................................................................290
Figure IV-9...........................................................................................................................................................294
Figure IV-10.........................................................................................................................................................296
Figure IV-11.........................................................................................................................................................297
Figure IV-12.........................................................................................................................................................300
Figure IV-13.........................................................................................................................................................303
Figure IV-14.........................................................................................................................................................304
Figure IV-15.........................................................................................................................................................305
Figure IV-16.........................................................................................................................................................311
Figure IV-17.........................................................................................................................................................314
Figure IV-18.........................................................................................................................................................316
Figure IV-19.........................................................................................................................................................317
Figure IV-20.........................................................................................................................................................319
Figure IV-21.........................................................................................................................................................322
Figure IV-22.........................................................................................................................................................323
Figure IV-23.........................................................................................................................................................324
Figure IV-24.........................................................................................................................................................326
Figure IV-25.........................................................................................................................................................328
Figure IV-26.........................................................................................................................................................329
Figure IV-27.........................................................................................................................................................331
Figure IV-28.........................................................................................................................................................332
Figure IV-29.........................................................................................................................................................335
Figure IV-30.........................................................................................................................................................336
Figure IV-31.........................................................................................................................................................339
Figure IV-32.........................................................................................................................................................340
Figure IV-33.........................................................................................................................................................341
Figure IV-34.........................................................................................................................................................342
Figure IV-35.........................................................................................................................................................343
Figure IV-36.........................................................................................................................................................345
Figure IV-37.........................................................................................................................................................347
Figure IV-38.........................................................................................................................................................348
Figure IV-39.........................................................................................................................................................352
Figure IV-40.........................................................................................................................................................355
Figure IV-41.........................................................................................................................................................357
14
LISTE DES REACTIONS
Pages
Réaction I-1............................................................................................................................................................41
Réaction I-2............................................................................................................................................................43
Réaction I-3............................................................................................................................................................47
Réaction I-4............................................................................................................................................................54
Réaction I-5............................................................................................................................................................55
Réaction I-6............................................................................................................................................................59
Réaction I-7............................................................................................................................................................61
Réaction I-8............................................................................................................................................................68
Réaction I-9............................................................................................................................................................69
Réaction I-10..........................................................................................................................................................73
Réaction I-11..........................................................................................................................................................75
Réaction I-12..........................................................................................................................................................77
Réaction III-1 ................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
Réaction IV-1.......................................................................................................................................................302
Réaction IV-2.......................................................................................................................................................307
Réaction IV-3.......................................................................................................................................................309
Réaction IV-4.......................................................................................................................................................334
15
LISTE DES TABLEAUX
Pages
Tableau I-1 .............................................................................................................................................................28
Tableau I-2 .............................................................................................................................................................29
Tableau I-3 .............................................................................................................................................................34
Tableau I-4 .............................................................................................................................................................39
Tableau I-5 .............................................................................................................................................................43
Tableau I-6 .............................................................................................................................................................45
Tableau I-7 .............................................................................................................................................................51
Tableau I-8 .............................................................................................................................................................52
Tableau I-9. ............................................................................................................................................................56
Tableau I-10 ...........................................................................................................................................................62
Tableau I-11 ...........................................................................................................................................................68
Tableau I-12 ...........................................................................................................................................................72
Tableau I-13 ...........................................................................................................................................................74
Tableau I-14 ...........................................................................................................................................................76
Tableau I-15 ...........................................................................................................................................................79
Tableau I-16 ...........................................................................................................................................................80
Tableau II-1............................................................................................................................................................88
Tableau II-2............................................................................................................................................................99
Tableau II-3..........................................................................................................................................................118
Tableau II-4..........................................................................................................................................................128
Tableau II-5..........................................................................................................................................................135
Tableau II-6..........................................................................................................................................................137
Tableau II-7..........................................................................................................................................................156
Tableau II-8..........................................................................................................................................................158
Tableau II-9..........................................................................................................................................................161
Tableau III-1 .................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
Tableau III-4. ................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
Tableau III-10 ...............................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
Tableau IV-1 ........................................................................................................................................................320
Tableau IV-2 ........................................................................................................................................................327
Tableau IV-3 ........................................................................................................................................................350
Tableau IV-4 ........................................................................................................................................................353
Tableau IV-5 ........................................................................................................................................................359
16
LISTE DES EQUATIONS
Pages
Equation II-1 ..........................................................................................................................................................90
Equation II-2 ..........................................................................................................................................................90
Equation II-3 ..........................................................................................................................................................92
Equation II-4 ..........................................................................................................................................................92
Equation II-5 ..........................................................................................................................................................92
Equation II-6 ..........................................................................................................................................................93
Equation II-7 ..........................................................................................................................................................93
Equation II-8 ..........................................................................................................................................................93
Equation II-9 ..........................................................................................................................................................93
Equation II-10 ........................................................................................................................................................94
Equation II-11 ........................................................................................................................................................94
Equation II-12 ........................................................................................................................................................94
Equation II-13 ........................................................................................................................................................94
Equation II-14 ........................................................................................................................................................98
Equation II-15 ......................................................................................................................................................100
Equation II-16 ......................................................................................................................................................100
Equation II-17 ......................................................................................................................................................100
Equation II-18 ......................................................................................................................................................101
Equation II-19 ......................................................................................................................................................101
Equation II-20 ......................................................................................................................................................101
Equation II-21 ......................................................................................................................................................112
Equation II-22 ......................................................................................................................................................112
Equation II-23 ......................................................................................................................................................112
Equation II-24 ......................................................................................................................................................113
Equation II-25 ......................................................................................................................................................113
Equation II-26 ......................................................................................................................................................113
Equation II-27 ......................................................................................................................................................114
Equation II-28 ......................................................................................................................................................114
Equation II-29 ......................................................................................................................................................115
Equation II-30 ......................................................................................................................................................115
Equation II-31 ......................................................................................................................................................115
Equation II-32 ......................................................................................................................................................116
Equation II-33 ......................................................................................................................................................116
Equation II-34 ......................................................................................................................................................116
Equation II-35 ......................................................................................................................................................120
Equation II-36 ......................................................................................................................................................122
Equation II-37 ......................................................................................................................................................122
Equation II-38 ......................................................................................................................................................134
Equation II-39 ......................................................................................................................................................143
Equation II-40 ......................................................................................................................................................143
Equation II-41 ......................................................................................................................................................144
Equation II-42 ......................................................................................................................................................144
Equation II-43 ......................................................................................................................................................145
Equation II-44 ......................................................................................................................................................145
Equation II-45 ......................................................................................................................................................145
Equation II-46 ......................................................................................................................................................145
Equation II-47 ......................................................................................................................................................146
Equation II-48 ......................................................................................................................................................146
Equation II-49 ......................................................................................................................................................147
Equation II-50 ......................................................................................................................................................147
Equation II-51 ......................................................................................................................................................147
Equation II-52 ......................................................................................................................................................147
Equation II-53 ......................................................................................................................................................148
Equation II-54 ......................................................................................................................................................148
Equation II-55 ......................................................................................................................................................148
Equation II-56 ......................................................................................................................................................148
Equation II-57 ......................................................................................................................................................150
17
Equation II-58 ......................................................................................................................................................150
Equation II-59 ......................................................................................................................................................150
Equation II-60 ......................................................................................................................................................150
Equation II-61 ......................................................................................................................................................151
Equation II-62 ......................................................................................................................................................151
Equation II-63 ......................................................................................................................................................151
Equation II-64 ......................................................................................................................................................152
Equation II-65 ......................................................................................................................................................152
Equation II-66 ......................................................................................................................................................152
Equation II-67 ......................................................................................................................................................152
Equation II-68 ......................................................................................................................................................154
Equation II-69 ......................................................................................................................................................154
Equation II-70 ......................................................................................................................................................154
Equation III-1................................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
Equation III-10..............................................................................................................Erreur ! Signet non défini.
Equation IV-1.......................................................................................................................................................275
Equation IV-2.......................................................................................................................................................276
Equation IV-3.......................................................................................................................................................277
Equation IV-4.......................................................................................................................................................277
Equation IV-5.......................................................................................................................................................280
Equation IV-6.......................................................................................................................................................313
18
LISTE DES ANNEXES
Pages
Annexe 1 : Synthèse du polymère de β-cyclodextrine .........................................................................................376
Annexe 2 : Synthèse de la β-CD aminée..............................................................................................................381
Annexe 3 : Synthèse des supports de silice-polyβ-CD ........................................................................................385
Annexe 4 : Caractérisation des polymères hydrophiles initiaux ..........................................................................388
Annexe 5 : Synthèse des MPEGs modifiés phényladamantyle : MPEG-AdPh ...................................................392
Annexe 6 : Synthèse des PEGs modifiés phényladamantyle et COOH : COOH-PEG-AdPh..............................399
Annexe 7 : Analyse par CLHP des lots de polymère OH-PEG-AdPh synthétisés...............................................404
Annexe 8 : Synthèse des dextranes modifiés adamantyle : Dext-Ad ...................................................................406
Annexe 9 : Synthèse des dextranes modifiés adamantyle et diéthylaminoéthyle : Dext-Ad-DEAE....................409
Annexe 10 : Synthèse des dextranes modifiés adamantyle et COOH : Dext-Ad-COOH ....................................413
Annexe 11 : Synthèse des dextranes modifiés adamantyle et octyle : Dext-Ad-C8 .............................................417
Annexe 12 : Conditions expérimentales relatives à la détermination des constantes d’affinité en ACE ...............27
Annexe 13 : Appareillage chromatographique et remplissage des colonnes........................................................424
Annexe 14 : Quelques grandeurs chromatographiques ........................................................................................426
Annexe 15 : Préparation du support d’immunoaffinité ........................................................................................428
Annexe 16 : Caractéristiques de la cellule d’interactions du système optique de RPS ........................................431
Annexe 17 : Immobilisation de la β-cyclodextrine aminée (β-CD-NH2) sur une surface d’or ............................432
Annexe 18 : Synthèse de la β-lactoglobuline modifiée par des greffons de PEG-AdPh : β-lactoglobuline-PEGAdPh ....................................................................................................................................................................435
Annexe 19 : Analyse de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh par EC .........................................................................437
19
20
INTRODUCTION
INTRODUCTION
21
INTRODUCTION
Les avancées scientifiques enregistrées ces dernières décennies dans le domaine des
sciences de la vie et de la santé permettent d’envisager dans un futur proche une évolution
fondamentale des outils liés au diagnostic médical et à la thérapeutique. En particulier, on
observe depuis quelques années un développement de microsystèmes analytiques permettant
de répondre aux besoins de la génomique et de la protéomique (puces à ADN, puces à
protéines, laboratoire sur puces, …). La conception de ces dispositifs miniaturisés nécessite
selon le cas, de fonctionnaliser des surfaces planes, des capillaires, des microcanaux… par des
ligands variés (molécules d’intérêt biologique, molécules organiques). Quel que soit le type
d’application envisagée, les méthodes utilisées pour le traitement de surface doivent répondre
à un certain nombre d’exigences. Elles doivent en particulier être simples à mettre en œuvre et
conduire à des surfaces stables, reproductibles et biocompatibles.
L’utilisation de polymères associatifs pour la fonctionnalisation des matériaux peut
être une méthode permettant de répondre à ces exigences. Les polymères associatifs sont des
macromolécules hydrosolubles comportant une faible quantité de groupements attracteurs.
Les interactions mises en jeu peuvent être de différentes natures telles que des liaisons
hydrogène, des interactions électrostatiques ou des interactions hydrophobes. La présence de
ces interactions confère aux polymères associatifs une capacité à former des structures
macromoléculaires réversibles qui peuvent être mises à profit pour l’élaboration d’édifices à
couches multiples aux interfaces.
Amiel et coll.1,2 ont développé depuis 1995 des systèmes associatifs originaux mettant
en jeu un mécanisme d’interaction par formation de complexes d’inclusion. Ces systèmes sont
basés sur la complexation d’un polymère de β-cyclodextrine (molécule hôte) avec des
polymères amphiphiles (molécules invitées) contenant des groupements hydrophobes
capables de s’inclure dans les cavités de β-cyclodextrine. De nombreuses études ont été
menées pour évaluer l’influence de la structure des polymères sur la formation des complexes
en solution. En particulier, des paramètres tels que la structure de la chaîne macromoléculaire,
la nature et la proportion des substituants hydrophobes ont été étudiés. Ces travaux ont permis
de révéler une interaction relativement forte entre des groupements hydrophobes de type
adamantane et les cavités de β-cyclodextrine. Elles ont par ailleurs montré l’intérêt de tels
systèmes pour le contrôle des propriétés macroscopiques en solution.
L’objectif de ce travail de thèse est de mettre à profit l’association spécifique et
réversible de ces systèmes à base d’adamantane et de β-cyclodextrine pour introduire divers
22
INTRODUCTION
types de fonctionnalités sur des surfaces. Ce procédé nécessite de recouvrir le support à
modifier par des cavités de β-cyclodextrine, puis de fixer par formation de complexes
d’inclusion une couche de molécules fonctionnalisées sur la surface. Ces molécules doivent
posséder
d’une
part
des
groupements
hydrophobes
adamantane
permettant
leur
immobilisation sur la couche de β-cyclodextrine et d’autre part des entités variables telles que
des sites ioniques, des sites hydrophobes ou des molécules d’intérêt biologique.
Afin d’atteindre cet objectif, une étude préalable du système associatif adamantane /βcyclodextrine a été réalisée non seulement en solution, mais également à l’interface solide /
liquide en raison des applications envisagées. Par la suite nous avons cherché à démontrer la
faisabilité d’un procédé basé sur la formation de complexes d’inclusion pour la
fonctionnalisation de surfaces. Pour ce faire, nous avons appliqué cette méthode à des
particules de silice poreuse et évalué les propriétés des matériaux ainsi obtenus par
chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Enfin, nous avons testé ce procédé
pour l’élaboration d’interfaces susceptibles d’être utilisées, à terme, pour le diagnostic in vitro
de 95 % des allergies actuellement connues.
L’exposé de ce travail se divise en quatre parties :
Dans une première partie sont tout d’abord présentés les systèmes macromoléculaires
de type associatif impliquant des cyclodextrines. Puis, les procédés de synthèse et la
caractérisation des différentes molécules hôtes et invitées constituant les systèmes associatifs
de cette étude sont décrits.
Dans une seconde partie, la stabilité des complexes formés entre la β-cyclodextrine et
des polymères modèles porteurs de groupements adamantyle a été étudiée. Pour ce faire, des
méthodes d’électrophorèse capillaire d’affinité et de chromatographie liquide à haute
performance ont été appliquées. La technique électrophorétique mise en œuvre n’a permis
d’accéder
qu’aux
constantes
en
solution
tandis
que
l’utilisation
d’un
support
chromatographique constitué de β-cyclodextrine a conduit aux constantes de complexation en
solution mais également aux interfaces.
La troisième partie du manuscrit consiste à étudier la faisabilité d’un procédé basé sur
la formation de complexes d’inclusion pour la fonctionnalisation et la modification des
propriétés de surface. Pour cela, une méthode chromatographique a été utilisée. Sur un même
support solide à base de silice poreuse préalablement modifiée par des molécules de βcyclodextrine, ont été immobilisés différents polymères portant des groupements adamantyle
23
INTRODUCTION
et des groupements de fonctionnalités diverses (ioniques, hydrophobes ou molécules
biologiques telles qu’un anticorps). La fixation sur la silice a été vérifiée par l’analyse des
propriétés chromatographiques des supports obtenus.
La dernière partie de ce travail met en œuvre ce procédé particulier de
fonctionnalisation des surfaces pour l’élaboration de biocapteurs à allergènes. Deux voies de
préparation basées sur la formation de complexes d’inclusion ont été testées. Les différentes
étapes ont été suivies en temps réel à l’aide d’une méthode optique par résonance des
plasmons de surface. Cette même technique a été utilisée pour examiner les propriétés de
reconnaissance des biocapteurs ainsi constitués ainsi que les propriétés de régénération des
surfaces.
(1)
(2)
AMIEL, C.; SANDIER, A.; SEBILLE, B.; VALAT, P.; WINTGENS, V. Int. J.
Polymer Analysis and Characterization 1995, 1, 289-300.
AMIEL, C.; MOINE, L.; SANDIER, A.; BROWN, W.; DAVID, C.; HAUSS, F.;
RENARD, E.; GOSSELET, N. M.; SEBILLE, B. ACS Symposium series ; in StimuliResponsive Water-Soluble and Amphipatic Polymers 2001, 780, 58-81.
24
CHAPITRE I
CHAPITRE I :
PRESENTATION ET SYNTHESE
DES SYSTEMES ASSOCIATIFS DE L’ETUDE
25
CHAPITRE I
Le système associatif de l’étude est composé de molécules de cyclodextrine et de
différents polymères. Dans un premier temps, la structure et les propriétés des molécules de
cyclodextrine ainsi que les systèmes associatifs à base de cyclodextrine seront décrits. Puis, la
synthèse des molécules associatives de l’étude, notamment des dérivés de cyclodextrine et des
polymères modifiés par des groupements hydrophobes, sera présentée.
I – Présentation générale des cyclodextrines
Les cyclodextrines (CDs), également nommées cycloheptaamyloses ou «Dextrines de
Schardinger » ont été isolées en 1891 par Villiers1 à partir de produits de dégradation de
l’amidon. Leurs préparations détaillées et leurs premières caractérisations ont été réalisées par
Schardinger2 en 1903.
I.1 – Nomenclature et aspects structuraux
Les cyclodextrines sont le produit de dégradation de l’amidon par une enzyme, la
CGTase (« Cyclodextrin Glycosyl Transferase »), présente dans de nombreux microorganismes3 (Bacillus macerans, Klebsiella oxytoca, Bacillus circulans, et Alkalophylic
bacillus…). Cette enzyme n’étant pas spécifique, il se forme en même temps des
cyclodextrines comprenant de six à douze unités D(+)glucopyrannose. Les trois principales
cyclodextrines notées α-, β- et γ-CD (Figure I-1) contiennent respectivement six, sept et huit
unités glucose reliées entre elles par des liaisons α-1,4. Les trois cyclodextrines sont séparées
par précipitation sélective en présence de composés organiques appropriés4 ; la β-CD est le
résidu formé en majorité à 80% environ.
26
CHAPITRE I
O(6)H
6
4
1
O(4)
HO(3)
O(5)
5
3
2
1
O(2)H
α(1-4)
α-CD
β-CD
γ-CD
Figure I-1 : Structures chimiques des CDs
Les unités glucopyranose des CDs, associées par des liaisons α-1,4, sont toutes dans
une conformation de type chaise. Cet arrangement spatial confère aux différentes CDs la
forme d’un cône tronqué5 dont l’extrémité la plus large est bordée par les groupements
hydroxyle secondaires OH(2) et OH(3), et la plus étroite par les groupements hydroxyle
primaires OH(6) (Figure I-2). Les dimensions des CDs sont déterminées par le nombre
d’unités glucopyranose (Tableau I-1) et la structure cyclique des CDs est stabilisée par un
enchaînement de liaisons hydrogène intramoléculaires entre les groupements hydroxyle
OH(2) et OH(3) des unités glucopyranose adjacentes.
15,3 Å
7,8 Å
7,9 Å
Figure I-2 : Forme en cône tronqué de la β-CD
27
CHAPITRE I
Nombre
Masse
d’unités
molaire
glucose
(g.mol-1)
α
6
β
γ
CD
Diamètre
Diamètre
Hauteur de
interne (Å)
externe (Å)
la cavité (Å)
972
5,1 ± 0,6
14,2 ± 0,4
7,9 ± 0,1
7
1135
7,8 ± 0,9
15,3 ± 0,4
7,9 ± 0,1
8
1297
8,5 ± 1,0
17,2 ± 0,3
7,9 ± 0,1
Tableau I-1 : Caractéristiques structurales des CDs
I.2 – Propriétés physico-chimiques
Les propriétés physico-chimiques et les propriétés d’inclusion (paragraphe I.3 de ce
chapitre) des cyclodextrines ont été étudiées essentiellement des années 1930 à 1970.
En raison de la conformation chaise des unités glucopyranose et de l’orientation
équatoriale des fonctions hydroxyle, la cavité de la cyclodextrine est tapissée de liaisons C-H
qui lui confèrent un caractère relativement hydrophobe, tandis que ses faces externes sont
hydrophiles. Des études ont montré que la polarité des cavités de la cyclodextrine est voisine
de celle de l’octanol6. Les paires d’électrons libres portées par les oxygènes glucidiques sont
dirigées vers l’intérieur de la cavité ; cette densité électronique élevée donne à la
cyclodextrine un caractère de base de Lewis.
Les CDs sont solubles dans l’eau et dans des solvants polaires aprotiques tels que le
diméthylsufoxyde (DMSO), le diméthylformamide (DMF) et la pyridine. Les CDs sont
stables en milieu alcalin mais peuvent subir une hydrolyse partielle à un pH inférieur à 3,5 à
une température supérieure à 60°C, produisant ainsi du glucose et une série de
maltosaccharides acycliques. Quelques caractéristiques physico-chimiques des principales
CDs sont présentées dans le Tableau I-2.
28
CHAPITRE I
Solubilité dans
pKa
l’eau à 25°C
(par potentiométrie)
(g.L-1)
à 25°
α
145
12,33
+150
β
18,5
12,20
+163
γ
232
12,08
+177
CD
Pouvoir rotatoire
à 25°
Tableau I-2 : Caractéristiques physico-chimiques des trois principales CDs
I.3 – Propriétés de complexation
La bipolarité des cyclodextrines, hydrophile à l’extérieur et hydrophobe à l’intérieur,
est l’une des plus importantes caractéristiques de ces molécules. En effet, cette propriété
permet aux cyclodextrines de former des complexes d’inclusion à l’état solide ou en solution
avec une grande variété de substances allant des composés organiques ou inorganiques,
neutres ou ioniques, polaires ou apolaires aux gaz nobles. Le terme de complexe d’inclusion
introduit pour la première fois par Schlenk en 1950 désigne l’association de deux ou de
plusieurs composés dont l’un (la molécule invitée) est entièrement ou partiellement inclus
dans une cavité formée par la molécule hôte. Les molécules invitées doivent satisfaire à deux
conditions : elles doivent comporter un groupement moins polaire que l’eau et être de taille
adaptée aux dimensions de la cavité de la molécule hôte7. En effet, des molécules trop
hydrophiles ne pourraient être complexées ainsi que des molécules trop petites qui passeraient
au travers de la cavité. Ainsi, la présence sur la molécule invitée, d’un groupement
relativement hydrophobe et de taille proche de la cavité de la molécule hôte permet d’obtenir
des complexes d’inclusion stables.
D’une manière générale, les petites molécules possédant un seul noyau aromatique
(dérivés du benzène) ou une chaîne aliphatique courte épousent bien la cavité de l’α-CD ;
celles composées de deux noyaux (dérivés du naphtalène, du biphényle…) se complexent à la
β-CD et les pyrènes substitués s’incluent dans les cavités de la γ-CD. Des molécules plus
volumineuses peuvent également se complexer aux CDs en ne pénétrant que partiellement
dans la cavité ou en mobilisant deux molécules de cyclodextrine8.
29
CHAPITRE I
La faculté de complexation des CDs peut être améliorée par une modification
chimique de ces dernières, notamment par substitution des atomes d’hydrogène des fonctions
hydroxyle ou des groupements hydroxyle eux mêmes.
I.4 – Mécanisme de formation des complexes d’inclusion
En solution aqueuse, la cavité apolaire de la cyclodextrine est occupée par des
molécules d’eau qui se trouvent dans un état énergétique défavorable du fait des interactions
polaires/apolaires. Ces molécules, qui possèdent une énergie enthalpique plus importante que
les autres molécules en solution, sont par conséquent facilement exclues au profit de
composés moins polaires que l’eau. La complexation de molécules hydrophobes est
énergétiquement favorable (∆H<0) puisqu’elle s’accompagne d’une augmentation des
interactions solvant-solvant au détriment des interactions solvant-molécule invitée et solvantmolécule hôte. D’autre part, les molécules d’eau expulsées acquièrent un degré de liberté plus
élevé qu’à l’intérieur de la cavité et, de ce fait, un gain d’entropie (∆S>0) peut également
favoriser la complexation. Cependant, il a été montré que le processus de complexation
s’accompagnait parfois d’un gain d’enthalpie (∆H>0) et d’une perte d’entropie (∆S<0)
indiquant alors que le phénomène de complexation n’est pas limité au processus hydrophobe
classique décrit ci dessus. En effet, trois principaux phénomènes seraient responsables de
l’inclusion de molécules invitées dans les cyclodextrines3,8,9 :
(i)
des interactions hydrophobes entre l’hôte et l’invité,
(ii)
des interactions de Van der Waals (liaisons faibles de type dipôle/dipôle),
(iii)
des liaisons hydrogène entre les groupements hydroxyle des CDs et les groupes
polaires de la molécule invitée.
L’importance de la contribution de chacune de ces forces dépend de la nature des molécules
incluses et de l'adéquation entre leur taille et celle de la molécule hôte.
Les cyclodextrines peuvent également complexer des molécules volumineuses et dans
le cas de composés amphiphiles, comportant une partie hydrophile et une partie hydrophobe
distincte, la molécule s’oriente de manière à inclure la partie apolaire dans la cavité de la
cyclodextrine (Figure I-3). La partie polaire reste alors à l’extérieur de la cavité et assure un
contact maximum avec le solvant et les groupes hydroxyle de la cyclodextrine.
30
CHAPITRE I
cyclodextrine
partie polaire
partie apolaire
molécule
amphiphile
molécule d’eau
Figure I-3 : Représentation schématique de la formation d’un complexe d’inclusion ; d’après Szejtli7
I.5 – Applications
Dans les années 1940, cinquante ans après la découverte des cyclodextrines, seule une
cinquantaine de publications était recensée. Aujourd’hui, un bond considérable dans
l’utilisation et l’étude des cylodextrines est observé puisque plus de treize mille travaux sur
les CDs ont été publiés10. Cet essor est dû, d’une part, à la non toxicité des cyclodextrines et,
d’autre part, aux progrès spectaculaires réalisés dans la production et la purification qui ont
permis de baisser considérablement les prix.
La production industrielle et l’utilisation des cyclodextrines se sont développées
essentiellement depuis les années 1970. Les CDs et leurs complexes d’inclusion trouvent de
nombreuses applications dans les domaines de l’industrie chimique, biochimique,
pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. Pour donner quelques exemples d’applications,
dans le domaine pharmaceutique les CDs naturelles et leurs dérivés synthétiques peuvent être
utilisés comme agent de libération de principes actifs11,12 et peuvent améliorer la solubilité13,
la stabilité et la biocompatibilité de certains médicaments14,15. Dans le domaine de la thérapie
génique, les CDs et leurs dérivés sont capables d’interagir avec les membranes de certaines
cellules et donc de favoriser la pénétration d’acides nucléiques au sein des cellules16 ; un
31
CHAPITRE I
exemple d’application de polymères dérivés de cyclodextrine est leur possible utilisation
comme moyen de transfection des cellules hépatiques17.
Les cyclodextrines sont également utilisées dans le domaine des méthodes séparatives
et analytiques telles que la chromatographie gazeuse, la chromatographie liquide à haute
performance et l’électrophorèse capillaire où elles jouent le rôle d’éluant ou de support chiral.
Aujourd’hui la synthèse de nombreux dérivés de cyclodextrine et leurs utilisations
dans de nombreuses technologies étant bien connues, il est probable que les cyclodextrines
trouveront de nouvelles applications dans la protection de l’environnement, dans le domaine
des biotechnologies et dans l’industrie textile.
II - Présentation générale des systèmes macromoléculaires
associatifs à base de cyclodextrine
L’association non covalente mais hautement spécifique par formation de complexes
d’inclusion, entre des cyclodextrines hôtes et des groupements invités portés par des chaînes
de polymères permet de créer des structures supramoléculaires. L’utilisation d’un polymère
hydrosoluble comme molécule invitée peut donner naissance à deux types de structures :
(i)
lorsque les cyclodextrines interagissent directement avec le squelette du polymère,
des configurations appelées polyrotaxanes (ou pseudopolyrotaxanes) sont
obtenues. Ces dernières sont caractérisées par une structure en collier de perles où
plusieurs unités cycliques de cyclodextrine sont enfilées le long de la chaîne
polymérique
(ii)
lorsque les cyclodextrines sont mélangées à des copolymères hydrosolubles de
type associatif, possédant des groupements secondaires capables de s’inclure dans
les cavités, elles peuvent agir comme agent déstructurant ou agent de contrôle de
la structure supramoléculaire.
32
CHAPITRE I
II.1 – Formation de complexes supramoléculaires cristallins : les
polyrotaxanes
Harada et coll. ont mis en évidence la formation de complexes cristallins de type
polyrotaxanes à partir de divers polymères organiques linéaires neutres. En particulier, le
poly(éthylène glycol) (PEG)18-21, le poly(propylène glycol) (PPG)20,22, le polyisobutylène
(PIB)23,24, le poly(méthyl vinyl éther) (PMeVE)20,25, ou certains polyesters aliphatiques26 [O(CH2)xOCO(CH2)4CO]n- comme le poly(adipate d’éthylène) (PEA, x = 2), le poly(adipate
de triméthylène) (PTA, x = 3) et le poly(adipate de 1,4-butylène) (PBA, x = 4) ont été étudiés.
Quelques résultats issus de ces travaux sont regroupés dans le Tableau I-3.
Formation du complexe
α-CD
β-CD
γ-CD
−
Trace
+
+
(pour
(pour
Mpolymère>400g/mol)
Mpolymère≥400g/mol
maximum pour
maximum pour
Mpolymère=1000g/mol
2:1
2:1
Polyglycols :
+
(à partir de n≥4 ou
Mpolymère>200g/mol)
↑ si Mpolymère↑
PEG18-21
Rendement
vitesse formation du
-(CH2-CH2-O)n-
complexe maximale
pour
Stoechiométrie
2:1 (n≥6)
monomère:CD
1:2 (n = 4 ou 5)
−
PPG20,22
Rendement
-(CH2-CH(CH3)-O)n-
Stoechiométrie
monomère:CD
33
CHAPITRE I
Formation du complexe
α-CD
β-CD
γ-CD
+
+
↓si Mpolymère↑
↑ si Mpolymère↑
Polymères aliphatiques :
PIB23,24
-(CH2-C(CH3)2)n-
Rendement
−
Stoechiométrie
3:1
monomère:CD
Polyéthers :
PMeVE20,25
Rendement
−
−
+
Stoechiométrie
-(CH2-CH(OCH3))n-
3:1
monomère:CD
Polyesters aliphatiques :
+
PEA
+
26
Rendement
↓peu si Mpolymère↑
moyen
maximum pour
-[O(CH2)2OCO(CH2)4CO]n-
Stoechiométrie
monomère:CD
1,3:2
1,5:1
PTA26
+
Ou
PBA26
Rendement
+
↓ si Mpolymère↑
maximum pour
moyen
Tableau I-3 : Quelques résultats issus des travaux menés par Harada et coll. sur la formation de
complexes cristallins entre les trois principales cyclodextrines (α
α-, β-et γ-CD) et une variété de polymères
neutres (+ : formation de complexes d’inclusion avec un important rendement, - : pas de formation de
complexes d’inclusion)
Ces travaux mettent en évidence la capacité des cyclodextrines à former des
complexes d’inclusion avec des macromolécules pour créer des systèmes d’ordre supérieur
(systèmes supramoléculaires). De plus, les résultats mettent en avant la nécessité d’une bonne
corrélation entre la taille de la molécule invitée et la cavité des cyclodextrines afin de former
des complexes et ce, avec un haut rendement. Les polymères étudiés sont constitués d’unités
monomères de différentes tailles et possèdent un encombrement stérique variable autour de la
chaîne principale ; ces deux paramètres gouvernent alors la stoechiométrie du complexe
34
CHAPITRE I
formé ainsi que le nombre de chaînes macromoléculaires pénétrant les cavités de
cyclodextrine (Figure I-4).
a)
b)
Figure I-4 : Stuctures possibles des complexes α-CD/PEA (a) et γ-CD/PEA (b) proposées par Harada et
coll.26
Jiao et coll.27 ainsi que Sabadini et Cosgrove28 ont montré que des PEGs de formes
étoilées, contenant 3 à 15 bras, sont également capables de former des complexes cristallins
avec l’α-CD et la γ-CD mais pas avec la β-CD.
Les premières études menées sur les polymères de plus faibles masses27 (3, 4 et 6 bras) ont
mis en évidence, pour l’ensemble des systèmes mettant en jeu l’α-CD et la γ-CD, des
structures cristallines en colliers de perles. Quelles que soient les masses des polymères, des
stoechiométries éthylène glycol:CD de l’ordre de 2:1 pour l’α-CD et 4:1 pour la γ-CD ont été
obtenues. Compte tenu de la hauteur constante des CDs mais des différentes largeurs de
cavités, des structures présentant soit une chaîne macromoléculaire soit deux chaînes accolées
à l’intérieur de la cavité ont été déterminées respectivement pour l’α-CD et la γ-CD (Figure I5). La β-CD, quant à elle, possédant une cavité de taille intermédiaire, est trop large pour
inclure fortement une chaîne de PEG mais trop petite pour pouvoir accueillir deux bras.
35
CHAPITRE I
a
b
c
Figure I-5 : Structures possibles des complexes γ-CD/PEG-3bras (ethoxylate glycérol) (a), γ-CD/PEG4bras (b), γ-CD/PEG-6bras
(c) proposées par Jiao et coll.27
γ
Les études ultérieures menées sur les PEGs de plus fortes masses28 (13 et 15 bras) ont
confirmé les résultas précédents et ont mis en évidence, pour la première fois, la formation
d’un hydrogel au terme du phénomène de complexation. Les auteurs ont également montré
que le nombre d’unités éthylène glycol complexées par bras de polymère est plus faible pour
la γ-CD que pour l’ α-CD du fait de la difficulté de faire pénétrer deux chaînes
macromoléculaires dans une cyclodextrine dans ce dernier cas (Figure I-6).
a
b
Figure I-6 : Représentation schématique des complexes formés entre un PEG-13bras et l’α
α-CD (a) ou la γ28
CD (b) selon Sabadini et Cosgrove
La capacité de l’α-cyclodextrine à former des structures stables avec des PEGs a été
utilisée afin de créer des systèmes macromoléculaires plus élaborés. Pour ce faire, des brins
de PEGs linéaires sont préalablement greffés sur des chaînes macromoléculaires telles que des
36
CHAPITRE I
dextranes29,30 ou des lipides31 pour permettre la création de systèmes d’ordre supérieur par
phénomène de complexation avec des cyclodextrines.
II.2 – Formation de complexes supramoléculaires en solution
Les polymères associatifs sont des macromolécules hydrosolubles comportant, en
faible proportion, des groupements attracteurs. Les interactions alors mises en jeu (liaisons
hydrogène, interactions électrostatiques, interactions hydrophobes, complexes d’inclusion…)
conduisent à la formation de macrostructures réversibles.
Zhang et Hogen-Esch32 ont montré une application possible des cyclodextrines comme
agent déstructurant lorsqu’elles sont ajoutées à des polymères associatifs. Les travaux menés
ont fait appel à un polymère associatif amphiphile de PEG modifié à ses extrémités de chaîne
par des groupements attracteurs fluorocarbonés. Dans la mesure où les groupes secondaires
hydrophobes du polymère possèdent une affinité pour les cyclodextrines, l’ajout de ces
dernières a permis de dissocier totalement les agrégats hydrophobes issus des associations
intermoléculaires (Figure I-7). La déstructuration (par formation de complexes d’inclusion) du
système initial s’est manifestée par une importante diminution de la viscosité du système.
PEG
+
+
C6F13
Figure I-7 : Formation de complexes d’inclusion en solution entre la β-cyclodextrine et un PEG
fonctionnalisé en bout de chaîne par des groupements fluorocarbonés C6F13
37
CHAPITRE I
Par ailleurs, Amiel et coll. ont utilisé les cyclodextrines comme agent de contrôle des
interactions entre polymères associatifs
33-39
. Les études ont été réalisées en mettant en
présence un polymère de β-cyclodextrine avec des polymères amphiphiles contenant des
substituants hydrophobes capables de s’inclure dans les cavités de cyclodextrine (Figure I-8).
Figure I-8 : Représentation schématique des associations entre un polymère de β-cyclodextrine et des
polymères amphiphiles37 (les polymères étudiés possèdent une faible proportion de groupements
hydrophobes, ces derniers étant symbolisés ci-dessus par des boules noires)
Afin d’étudier les relations structure-propriétés des systèmes obtenus, la nature
chimique et la structure des polymères amphiphiles ont été modifiées en changeant (i) la
nature du groupement hydrophobe (naphtyle, adamantyle ou alkyle) et le nombre de
substituants par chaîne de polymère, (ii) la structure de la chaîne macromoléculaire (linéaire,
en peigne ou étoilée). Ainsi, différentes études ont porté sur la complexation d’un polymère
de β-cyclodextrine (de structure ramifiée) avec des polymères neutres de poly(éthylène
glycol) (PEG) linéaires33-37 ou de formes étoilées35,37, modifiés par des groupements
naphtyle33-35 ou adamantyle34-37 terminaux. Des polymères en peigne dérivés du
poly(diméthylacrylamide)38 et du dextrane37,39, modifiés par des groupements adamantyle37,38
ou alkyle37,39 le long de la chaîne, ont également été étudiés.
Des études au plan microscopique menées par fluorimétrie
34,35,37
ou dialyse 35,37 ont
permis de déterminer les constantes de complexation en solution entre des PEGs
38
CHAPITRE I
téléchéliques, modifiés en extrémités de chaîne par des groupements napthyle ou adamantyle,
et un polymère de β-cyclodextrine (Tableau I-4).
Polymère
Groupe
MPEG (g/mol)
K (M-1)
Méthode
6000
400
Anisotropie
terminal
PEG-Nap2
linéaire
2-Naphtyle
34,35
PEG-Ad2
de fluorescence
1-Adamantyle
6000
3200
linéaire34,35,37
Fluorescence
avec marqueur
6000
3200
Dialyse
20000
2300
Fluorescence
avec marqueur
20000
1600
Dialyse
35000
2000
Fluorescence
avec marqueur
PEG-Ad3
3bras
1-Adamantyle
15000
2800
Dialyse
1-Adamantyle
20000
2300
Dialyse
1-Adamantyle
40000
6300
Dialyse
35
PEG-Ad4
4bras35
PEG-Ad8
8bras
35
Tableau I-4 : Constantes de complexation entre des dérivés de PEGs et un polymère de β-cyclodextrine
Méthodes utilisées : 1 – Spectroscopie de fluorescence (technique d’anisotropie de fluorescence ou emploi
d’un marqueur 1-8-anilinonaphatlène sulfonate ANS) ; 2 – dialyse
L’ adamantyle, du fait de sa structure sphérique, s’incorpore parfaitement dans les
cavités de β-cyclodextrine et possède une affinité plus importante que le substituant naphtyle.
39
CHAPITRE I
D’autre part, l’influence de la masse moléculaire du PEG a été soulignée et montre une
diminution des constantes de complexation lors d’une augmentation de la taille des chaînes
macromoléculaires. Ce dernier résultat s’expliquerait par un effet entropique : en effet, la
complexation s’accompagnerait d’une diminution de l’entropie de la chaîne d’autant plus
marquée que la masse du polymère est importante. Enfin l’architecture de la chaîne influe la
complexation puisque à partir d’un nombre de bras égal à quatre, l’affinité du polymère pour
les cyclodextrines augmente fortement. Ce phénomène pourrait s’expliquer par la proximité
des groupements adamantyle qui conduirait à des mécanismes d’interaction coopératifs. Cet
effet a été confirmé par l’étude d’un dextrane modifié, de masse égale à celle du PEG-8bras
mais possédant un rapport molaire d’hydrophobicité supérieur (3 groupes adamantyle pour
100 unités monomères), pour lequel une constante d’affinité élevée de l’ordre de 104M-1 a été
déterminée 37.
D’autre part, les études des propriétés macroscopiques des systèmes ont mis en
évidence soit des phénomènes d’agrégation en solution pouvant mener à des structures de
type gel35,37, soit des phénomènes de séparation de phases associatives 35,37. Les auteurs ont
montré que ces processus sont contrôlés par la force des interactions entre les macromolécules
et notamment par le nombre de groupements hydrophobes (nh) par chaîne de polymère. Ainsi
des comportements de gels réversibles ont été obtenus au-delà d’une valeur critique de (nh)
comprise entre 10 et 40 et ceci indépendamment de la structure du polymère. Par ailleurs, des
phénomènes de séparation de phases associatives n’ont été observés que pour des
macromolécules contenant au minimum 3 motifs hydrophobes par chaîne, et ce, quelle que
soit la nature du groupement (adamantyle ou alkyle).
III - Synthèse des molécules hôte et invité du système
associatif de l’étude
Le système associatif de l’étude est constitué d’un dérivé de la β-cyclodextrine (sous
forme monomère ou polymère) immobilisé sur un support et d'un polymère amphiphile
(poly(éthylène glycol) ou dextrane porteurs de groupements hydrophobes).
40
CHAPITRE I
III.1 - Synthèse des molécules hôtes : dérivés de β-cyclodextrine
En vue de différentes applications, deux dérivés de β-cyclodextrine ont été
synthétisés :
•
un polymère de β-cyclodextrine a été élaboré pour créer des supports de
chromatographie liquide (Cf. Synthèse du support au paragraphe III.2 de ce chapitre et
applications du support aux chapitres II et III),
•
une monoamination de la β-cyclodextrine a été effectuée pour permettre son
immobilisation sur une surface d’or et conduire à l’élaboration de puces à allergènes
(Chapitre IV).
III.1.1 - Synthèse et caractérisation d’un polymère de β-cyclodextrine
Une méthode de synthèse d’un copolymère β-cyclodextrine/épichlorhydrine a été mise
au point par Renard et coll.40. Cette méthode consiste en une polycondensation de la βcyclodextrine et de l’épichlorhydrine (EP) en milieu fortement alcalin (Réaction I-1). Un tel
polymère a été synthétisé et le mode opératoire suivi est résumé en annexe 1.
O
OH
CH2Cl
NaOH
β-CD
polyβ
β-CD
Réaction I-1 : Réaction simplifiée de la polycondensation de la β -CD et de l'épichlorhydrine (EP) :
synthèse d’un copolymère β -CD/EP
41
CHAPITRE I
La polycondensation, reliant les cyclodextrines par des liaisons covalentes, permet
d’obtenir un matériau relativement stable. Par ailleurs, le copolymère obtenu possède une
structure branchée41 mais sa structure exacte reste difficile à déterminer. En effet, la β-CD
possède de nombreux groupements hydroxyle fonctionnels susceptibles d’être substitués (21
par molécule de β-CD) et de plus, l’EP peut réagir soit sur les fonctions hydroxyle de la
cyclodextrine soit sur elle-même (annexe 1). De ce fait, les molécules de β-CD peuvent être
modifiées par des séquences plus ou moins longues de poly(2-hydroxypropyl)éther libres à
une extrémité, ou bien jouant le rôle de pontages entre plusieurs CDs (Figure I-9).
H
O(6)R
O
*
O
RO(3)
*
O(2)R
O
*
R=
CH2
CH
CH2O
H
m
OH
*
CH2
7
CH
CH2O
glucose
n
OH
Figure I-9 : Structure schématique des unités de β-CD dans le copolymère β-CD/EP.
Les masses molaires moyennes du copolymère ont été déterminées par
chromatographie d'exclusion stérique (SEC) en milieu aqueux avec une détection par
réfractométrie différentielle. Deux colonnes TSK-gel (montées en série) de type SW 4000 et
3000 ont été utilisées après un étalonnage avec des standards de pullulane. Les résultats sont
reportés dans le Tableau I-5.
La proportion de cavités de β-CD par rapport à l’épichlorhydrine et le nombre moyen
de cavités de β-CD par chaîne ont été déterminés par RMN du proton dans de l’eau deutérée
(D2O). Le spectre de RMN relatif au copolymère β-CD/EP et les calculs sont donnés en
annexe 1. Les résultats obtenus sont reportés dans le Tableau I-5.
42
CHAPITRE I
Mn(a)
Mp(a)
(g.mol-1)
(g.mol-1)
11000
15000
Nom
polyβ-CD
Ip(a)
% massique
Nb de β-CD
β-CD(b)
par chaîne(b)
70
7
1,4
Tableau I-5 : Caractéristiques chimiques du copolymère β-CD/EP déterminées par (a) SEC sur colonnes
TSK-gel de type SW 3000 et 4000 (montées en série) ; détection par réfractométrie différentielle
(étalonnage avec des standards de pullulane), (b) RMN du proton en solution dans le D2O
III.1.2
–
Synthèse
et
caractérisation
d’une
β-cyclodextrine
monoaminée
a) Principe
La monoamination de la β-CD a été effectuée suivant un procédé inspiré de celui
décrit par Melton et Slessor42 et consiste en une tosylation des fonctions hydroxyle de la βCD, suivie d’une réaction avec l’azoture de sodium, puis d’une réduction. Ces trois étapes
sont résumées par la Réaction I-2 et le mode opératoire suivi est détaillé en annexe 2.
1ère étape
OH
OSO2
SO2Cl
H3C
2ème étape
TA, 24h, Pyridine
β-CD
CH3
NaN3, KI
70°, 24h, DMF
3ème étape
N
NH2
N+
N-
NaBH4, Ni
70°, 24h, H2O
β-CD-NH2
Réaction I-2 : Monoamination de la β-CD par modification chimique des fonctions hydroxyle de la β-CD
43
CHAPITRE I
b) Synthèse et caractérisation de l'intermédiaire β-cyclodextrine tosylée
L’étape de tosylation consiste à faire réagir le chlorure de tosyle sur les fonctions
hydroxyle de la β-cyclodextrine. Afin de privilégier la monotosylation de la β-CD, un défaut
molaire de tosyle par rapport aux molécules de CD a été utilisé. La β-CD non modifiée est
éliminée au cours d’une étape de recristallisation dans l’eau. La cyclodextrine tosylée est
ensuite analysée par IR et RMN du proton.
En IR, la tosylation de la β-CD est confirmée par l’apparition d’une bande à 1385 cm-1
caractéristique de la liaison R1-OSO2-R2 (Cf. Annexe 2). La β-CD tosylée étant insoluble dans
l’eau, l’analyse par RMN de la CD intermédiaire est effectuée en solution dans le
diméthylsulfoxyde (DMSO) deutéré (Figure I-10). Ce solvant aprotique permet d'observer les
protons des fonctions hydroxyle de la β-CD.
1
3
4
2
6
5
5
DMSO
N° pic
Déplacement (ppm)
Multiplicité
Attribution
5
7,4 – 7,75
Doublet de doublet
H aromatiques du tosyle
3
5,75
Singulet large
OH secondaires de la β-CD
1
4,85
Doublet
H anomérique
44
CHAPITRE I
4
4,5
Singulet large
OH primaires de la β-CD
2
3,2 à 3,8
Multiplet
CH et CH2 de la β-CD
6
2,42
Singulet
CH3-O du tosyle
Figure I-10 : Spectre de RMN du proton de la β -CD tosylée en solution dans le DMSO deutéré
La tosylation de la β-CD est confirmée par l’apparition de nouveaux signaux relatifs
au groupement tosyle (pics 5 et 6). Le taux de substitution moyen en fonctions tosyle par
cavité de CD a été calculé (Cf. Annexe 2). Les caractéristiques de la β-CD tosylée synthétisée
sont résumées dans le Tableau I-6.
Nom
Rapport molaire
Rapport molaire
Nb tosyle
de synthèse
de synthèse
par cavité de β-CD
(tosyle/cavité de β-CD) (tosyle/OHprimaire)
β-CD tosylée
0,5
0,07
(RMN)
1
Tableau I-6 : Caractéristiques de la β -CD tosylée
c) Synthèse et caractérisation de l'intermédiaire β-cyclodextrine azidée
La seconde étape consiste à faire réagir un excès molaire d’azoture de sodium sur la
cyclodextrine tosylée. La réaction d’azidation est vérifiée par IR par la disparition de la bande
à 1385 cm-1 au profit d’une autre à 2105 cm-1 caractéristique des fonctions N3 (ν-N=N+=N-) (Cf.
Annexe 2) et par RMN avec la disparition des signaux caractéristiques du groupement tosyle
à 7,75-7,4 ppm et 2,42 ppm.
d) Synthèse et caractérisation de la β-cyclodextrine aminée
La dernière étape consiste à réduire les fonctions azoture de la cyclodextrine en
fonctions amine primaire par l’utilisation d’un excès de borohydrure de sodium en présence
45
CHAPITRE I
de Nickel de Raney. La modification de la CD azidée est vérifiée en IR par la disparition de la
bande à 2105 cm-1 caractéristique des fonctions N3 (Cf. Annexe 2).
III.2 – Immobilisation du polymère de β-cyclodextrine sur de la silice :
élaboration d’un support chromatographique de silice-polyβ
β-CD
Pour certaines applications, le polymère de β-cyclodextrine (polyβ-CD), dont la
synthèse a été décrite au paragraphe III.1.1 de ce chapitre, a été immobilisé sur de la silice
poreuse. Le support chromatographique de silice-polyβ-CD ainsi obtenu a été utilisé dans un
premier temps, comme support d’affinité pour l’étude théorique des interactions entre les
polymères modèles de PEGs modifiés par des groupements phényladamantyle et des
molécules de β-CD (Cf. Chapitre II), puis comme support de base pour l’élaboration de
phases stationnaires de fonctionnalités variables et de phases stationnaires d’immunoaffinité
(Cf. Chapitre III).
L’immobilisation du polymère de β-cyclodextrine sur la silice a été effectuée suivant
le procédé décrit par David et coll.43. Celui-ci consiste à greffer le polymère β-cyclodextrine
sur une silice diol par l’intermédiaire d’un agent difonctionnel, le 1,4-diisocyanatobutane. Les
deux étapes nécessaires à cette modification chimique sont décrites par la Réaction I-3 et les
conditions expérimentales correspondantes sont données en annexe 3.
46
CHAPITRE I
1er étape
Si
+
O
C
N
(CH2)4
N
C
Si
O
OH OH
OH O
H
N
C
N(C2H5)3, DBLT
65°C, 6h, C2H4Cl2
(CH2)4
N
C
O
O
Silice diol
Silice-isocyanate
2ème étape
polyβ
β-CD
DMAP
TA, 48h, Pyridine
avec DBLT = dilaurate de dibutyle étain
C11H23CO
Si
OH O
C4H9
C 4 H9
H
N
(CH2)4
H
N
O
Sn
C11H23CO
C
C
O
O
Silice-polyβ
β-CD
Réaction I-3 : Synthèse du support chromatographique de silice-polyβ
β-CD par greffage d’un polymère de
β-cyclodextrine (polyβ
β-CD) sur la silice diol ; mise en jeu d’un agent de couplage bifonctionnel, le 1,4diisocyanatobutane. La réaction indiquée ci-dessus est simplifiée et ne tient pas compte des réactions de
réticulation pouvant se produire lors de la fixation du 1,4-diisocyanatobutane
La première étape consiste à greffer l’intermédiaire difonctionnel, le 1,4diisocyanatobutane, sur la silice diol. La silice obtenue est appelée silice-isocyanate. Le
greffage du 1,4-diisocyanatobutane sur les fonctions alcool de la silice diol est confirmé par
analyse élémentaire (Cf. annexe 3) et par analyse IR avec l’apparition d’une nouvelle bande
par rapport au spectre initial de silice, à 1703 cm-1 caractéristique des fonctions uréthane (OCO-NH). Par ailleurs, la présence d’une seconde bande à 2273 cm-1 caractéristique des
fonctions isocyanate libres permet d’envisager le greffage du poly-β-CD
La seconde étape consiste à greffer le polymère de β-CD sur la silice-isocyanate par
couplage entre les fonctions hydroxyle portées par le poly-β-CD et les fonctions isocyanate
libres du support. Cette fixation est confirmée par analyse élémentaire (Cf. annexe 3) et par
47
CHAPITRE I
analyse IR avec la disparition de la bande à 2273 cm-1 caractéristique des fonctions isocyanate
libres.
Selon les applications envisagées, des supports de silice-polyβ-CD de différentes
porosités (de 10 nm à 400 nm) ont été élaborés (Cf. annexe 3). D’autre part, les
caractéristiques des supports chromatographiques obtenus, notamment les quantités de cavités
de β-CD immobilisées par gramme et par mètre carré de silice, ont été reportées dans
l’annexe 3.
III.3 - Synthèse des molécules invitées : dérivés amphiphiles de
poly(éthylène glycol) et de dextrane
Deux catégories de polymères amphiphiles jouant le rôle de molécules invitées ont été
synthétisées (Figure I-11) :
•
des poly(éthylène glycol)s (PEG)s linéaires portant un groupe hydrophobe à une
extrémité de leur chaîne,
•
des dextranes présentant une répartition statistique de motifs hydrophobes le long
de leur chaîne.
Les dérivés de poly(éthylène glycol)s ont été principalement utilisés en tant que
polymères modèles pour étudier les interactions d’une part en solution et d’autre part aux
interfaces entre ces PEGs portant un groupement hydrophobe en bout de chaîne et des βcyclodextrines (Chapitre II). Les dextranes, quant à eux, pouvant être modifiés par de
nombreux groupements hydrophobes le long de leur chaîne et par d’autres fonctions réactives,
ont été utilisés pour introduire sur des surfaces recouvertes de cyclodextrine, diverses
fonctions (fonction acide carboxylique, fonction amine, chaînons alkyle), le but recherché
étant d’élaborer des édifices macromoléculaires à finalité analytique tels que des supports
chromatographiques ou des puces à allergènes (Chapitres III et IV).
48
CHAPITRE I
O
O
H3CO
n
HO
H
MéthoxyPoly(EthylèneGlycol)
MPEG
n
H
Poly(EthylèneGlycol)
PEG
6
4
O
5
HO
HO
2
3
1
Hanomérique
OH
O
n
Dextrane
Figure I-11 : Structures chimiques des polymères hydrophiles avant modification
III.3.1 – Présentation de l’ensemble des polymères amphiphiles
synthétisés
a) Choix du groupement hydrophobe
La littérature répertorie de nombreuses constantes d’affinité entre les cyclodextrines et
des petites molécules44-46. Par exemple, Eftink et coll.47,48 se sont intéressés à des dérivés de
l’adamantane et une constante de 3.105M-1 a été déterminée pour l’inclusion de l’acide
adamantane-1-carboxylique dans les cavités de β-CD, démontrant ainsi la forte stabilité du
complexe adamantyle / β-CD48.
Amiel et coll.34-38 et David et coll.43 ont élargi l’étude du système adamantyle / β-CD à
un ordre supérieur en travaillant avec des polymères modifiés par des groupes adamantyle.
Les auteurs ont mis en évidence des interactions spécifiques entre les groupements
hydrophobes adamantyle (Figure I-12), portés par des poly(éthylèneglycol)s ou des dextranes,
et les cavités de β-cyclodextrine.
49
CHAPITRE I
R
R
Groupement Adamantyle
(Ad)
R = PEG ou dextrane
Groupement Phényladamantyle
(AdPh)
Figure I-12 : Structure chimique des groupes hydrophobes à base d’adamantane greffés aux polymères
hydrophiles (PEGs et dextranes)
Les complexes obtenus présentent une bonne stabilité en milieu aqueux, avec des
constantes d’interaction en solution allant de 3.103 M-1 à 104 M-1, respectivement pour un
dérivé de PEG linéaire de masse 6000g/mol34 et un dérivé de dextrane de masse 40000g/mol37
(Cf. Tableau I-4, paragraphe II-2). La spécificité et la stabilité du complexe adamantyle / βCD ont été mises à profit pour immobiliser de façon simple et rapide (par formation de
complexe d’inclusion) des polymères modifiés par des groupements adamantyle sur des
surfaces recouvertes de β-CD17,49,50 et ont permis l’élaboration de biocapteurs optiques49.
Ainsi, la stabilité du complexe adamantyle / β-CD et son application possible comme
moyen d’ancrage de macromolécules sur des surfaces recouvertes de cyclodextrine en font un
bon candidat pour l’élaboration de systèmes macromoléculaires à finalité analytique.
Les travaux de modélisation des interactions par chromatographie liquide à haute
performance (CLHP) et électrophorèse capillaire (EC) (Chapitre II) ont nécessité l’utilisation
d’espèces absorbant en UV ; de ce fait, le groupement adamantyle a dû être remplacé par le
groupement phényladamantyle (Figure I-12) répondant à ce critère.
b) Présentation des polymères amphiphiles synthétisés et de leurs applications
Diverses modifications ont dû être apportées aux polymères hydrophiles de base
(PEGs et dextranes) en fonction de l’application escomptée. Un récapitulatif de l’ensemble
des polymères amphiphiles synthétisés ainsi que leurs applications potentielles est donné dans
le Tableau I-7.
50
CHAPITRE I
Polymère
hydrophile de base
Nature des
groupements
greffés
Notation
Application
Chapitre
MPEG
AdPh
MPEG-AdPh
Modélisation des interactions
par CLHP et EC
II
Modélisation des interactions
par EC
II
PEG
AdPh
+
COOH
Puces à allergènes
IV
Supports
chromatographiques
III
Puces à allergènes
IV
Dextrane
Ad
+
COOH
COOH-PEG-AdPh
Dext-Ad-COOH
Ad
+
N+H(C2H5)2
Dext-Ad-DEAE
Supports
chromatographiques
III
Ad
+
C8H17
Dext-Ad-C8
Supports
chromatographiques
III
Tableau I-7 : Ensemble des polymères amphiphiles synthétisés et leurs applications potentielles
III.3.2 - Caractérisation des polymères hydrophiles initiaux
Les masses molaires et les indices de polymolécularité des polymères initiaux ont été
déterminés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) en milieu aqueux et dans certains
cas par RMN du proton. Les résultats sont regroupés dans le Tableau I-8. Les conditions
d'analyse et les calculs sont présentés en annexe 4.
51
CHAPITRE I
Polymère
Fournisseur
Mn(a)
Mw(a)
-1
Ip(a)
-1
Mn(b)
-1
(g.mol ) (g.mol )
(g.mol )
Nb d’unités
monomère
par chaîne(b)
MPEG 5000
Aldrich
5600
5900
1,05
4900
112
MPEG 2000
Aldrich
2300
2400
1,06
2100
48
PEG 4600
Aldrich
4700
5200
1,10
4700
108
Dextrane 40000
Amersham
43000
63000
1,5
12000
15000
1,3
Biosciences
Dextrane 10000
Aldrich
Tableau I-8 : Masses molaires (g.mol-1) et indices de polymolécularité des polymères hydrophiles initiaux
déterminés par : (a) SEC sur colonnes PL aquagel-OH 40 et 30 (montées en série) ; détection par diffusion
de la lumière et réfractométrie différentielle (étalonnage avec des standards de PEG), (b) RMN du proton
dans du DMSO deutéré
III.3.3 – Synthèse et caractérisation des polymères amphiphiles à base
de PEG
Les dérivés amphiphiles synthétisés à partir de PEGs ont été dans un premier temps
utilisés comme polymères modèles pour l’étude des interactions entre les groupements
hydrophobes, portés par les PEGs modifiés en question, et des cavités de β-cyclodextrine
(Chapitre II). Par la suite, un polymère de PEG modifié sera également utilisé pour introduire
des fonctions hydrophobes sur une protéine en vue d’élaborer un biocapteur (Chapitre IV,
paragraphe IV.1). Les méthodes analytiques CLHP et EC employées impliquent l’utilisation
de composés absorbant en UV. De ce fait, les PEGs ont été modifiés par des groupements
hydrophobes phényladamantyle (AdPh) possédant des propriétés chromophores. Deux types
de polymères à base de PEGs ont été élaborés (Figure I-13).
52
CHAPITRE I
H3CO
O
MPEG-AdPh
HOOC
O
COOH-PEG-AdPh
La chaîne macromoléculaire du PEG, de formule -(CH2-CH2-0)n-,
est représentée par le symbole
Figure I-13 : Structures chimiques des polymères amphiphiles synthétisés à base de PEGs
a) Synthèse et caractérisation des MPEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) à
une extrémité de chaîne : MPEG-AdPh
Afin de simplifier la modélisation des interactions, un PEG modifié par un
groupement hydrophobe en une seule de ses extrémités de chaîne a été élaboré : le MPEGAdPh. Pour ce faire, un méthoxypoly(ethylène glycol) (MPEG) ne possédant plus qu’une
extrémité de chaîne OH réactive a été utilisé comme polymère de départ.
La modification chimique des PEGs par un chromophore de type phényladamantyle a
été mise au point par David et coll.51. Cette modification nécessite deux étapes : la formation
d’un intermédiaire tosylé puis une substitution nucléophile par le phénolate d’adamantyle
(Réaction I-4). La synthèse détaillée et la caractérisation des produits sont présentées en
annexe 5.
53
CHAPITRE I
1ère étape
H3C
SO2Cl
NEt3
0°C, 2h, CH2Cl2
OH
H3CO
OSO2
H3CO
CH3
MPEG-Ts
MPEG
2ème étape
HO
NaH
40°C, 48h, CH2Cl2
H3CO
O
MPEG-AdPh
Réaction I-4 : Modification chimique d’un MPEG hydrophile en un MPEG-AdPh amphiphile
L’étape de tosylation consiste à faire réagir le chlorure de tosyle sur les extrémités OH
libres d’un MPEG. Cette étape est effectuée en présence de triéthylamine comme capteur
d'acide afin d’éviter les coupures de chaîne51,52 et en présence d’un excès molaire de chlorure
de tosyle par rapport aux fonctions hydroxyle initiales de l’ordre de cinq pour obtenir 100%
de modification51.
Le polymère tosylé est caractérisé par IR, UV et RMN du proton (Cf. Annexe 5). Le
taux de modification des fonctions hydroxyle en groupement tosyle est déterminé à partir des
spectres de RMN du proton à l’aide des intégrations des signaux relatifs à la présence du
tosyle et à la présence de fonctions hydroxyle résiduelles (Cf. Annexe 5).
La seconde étape consiste à transformer l'adamantylphénol en alcoolate (par réaction
avec un excès d’hydrure de sodium) puis à ajouter l'intermédiaire tosylé au mélange
54
CHAPITRE I
réactionnel. Un excès molaire d’adamantylphénolate par rapport aux fonctions tosyle initiales
de l’ordre de cinq est utilisé pour obtenir 100% de modification51.
L’espèce finale est caractérisée par IR, UV et RMN du proton (Cf. Annexe 5). Le taux
de modification des fonctions tosyle en phényladamantyle est déterminé à partir des spectres
de RMN du proton, à l’aide des intégrations des signaux relatifs à la présence des
groupements phényladamantyle et à la présence des fonctions OH résiduelles (Cf. Annexe 5).
b) Synthèse et caractérisation des PEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) à une
extrémité de chaîne et une fonction acide carboxylique à l’autre extrémité : COOH-PEGAdPh
La modification d’un PEG, possédant des fonctions OH réactives à ses deux
extrémités de chaîne, en un polymère amphiphile COOH-PEG-AdPh nécessite deux étapes
principales (Réaction I-5).
1ère étape
1)
H3C
2)
HO
SO2Cl , NEt3, 0°C, 2h, CH2Cl2
, détermination de nouvelles conditions
OH
HO
O
HO
PEG
PEG-AdPh
2ème étape
O
O
O
DMAP, NEt3
TA, 48h, THF
HOOC
O
COOH-PEG-AdPh
Réaction I-5 : Modification chimique d’un PEG hydrophile en un COOH-PEG-AdPh amphiphile
55
CHAPITRE I
b.1) Synthèse et caractérisation des PEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) à une
extrémité de chaîne : OH-PEG-AdPh
La première étape consiste à modifier le PEG à une extrémité de chaîne par le
groupement hydrophobe phényladamantyle ; de ce fait, des conditions opératoires identiques
à celle décrites ci-dessus, dans le cas d’un MPEG comme polymère initial (Réaction I-4), ont
d’abord été reprises.
Synthèse et caractérisation de l'intermédiaire tosylé à une extrémité de chaîne : OH-PEG-Ts
La tosylation du PEG a été effectuée selon les conditions opératoires de réactifs et de
solvants décrites pour la Réaction I-4. Il a fallu optimiser le rapport molaire tosyle/fonctions
OH de façon à obtenir un PEG-Ts modifié à une seule de ses deux extrémités de chaîne. En
définissant le 100% de modification par la fixation du tosyle aux deux extrémités de chaîne du
PEG, le polymère souhaité doit être modifié à 50%. Le pourcentage de modification moyen
des fonctions hydroxyle en groupements tosyle est calculé à partir des spectres de RMN du
proton à l’aide des intégrations des signaux relatifs à la présence des groupements tosyle et
des fonctions OH résiduelles (Cf. Annexe 6).
En vue d’élaborer un polymère modifié à 50% en tosyle, l’influence du rapport molaire de
réactif par rapport aux fonctions hydroxyle du PEG sur le taux de modification en tosyle a été
étudiée (Tableau I-9).
Rapport molaire de synthèse
% Ts
chlorure de tosyle/OH
(par RMN)
0,5
22
1
43
1,1
50 à 58
Tableau I-9 : Variation du taux de modification en tosyle du PEG-Ts en fonction du rapport molaire de
synthèse en réactifs.
Il apparaît qu’un excès molaire de chlorure de tosyle par rapport aux fonctions hydroxyle
initiales du PEG de l’ordre de 1,1 conduit au taux de modification recherché (50%).
56
CHAPITRE I
Synthèse et caractérisation du PEG modifié par le phényladamantyle(AdPh) à une extrémité
de chaîne : OH-PEG-AdPh
Dans un premier temps, la modification chimique du OH-PEG-Ts intermédiaire
(modifié à 50%) par des groupements phényladamantyle a été effectuée dans du
dichlorométhane suivant des conditions identiques à celles décrites par la Réaction I-4
(annexe 5). Le pourcentage de substitution des fonctions tosyle par les groupements
phényladamantyle peut être déterminé à partir des spectres de RMN à l’aide des intégrations
des signaux relatifs à la présence des groupements phényladamantyle et des fonctions OH
(annexe 6). Le spectre de RMN du proton d’un PEG-AdPh obtenu par cette méthode est
donné sur la Figure I-14.
2
H2O
DMSO
6
6
4
6
4
5
N° pic
Déplacement (ppm)
Multiplicité
Nb de H
Attribution
par chaîne de
OH-PEG-AdPh
4
7,3 et 6,9
2 Doublets A2B2
4
H aromatique
(J=8,1 Hz)
1
4,58
Triplet
1
H fonction OH
5
4,05
Triplet (J = 6 Hz)
2
-CH2OAdPh
57
CHAPITRE I
2
3,51
Singulet large
6
2,0 - 1,8 - 1,7
Singulets larges
H motif répétition
15
H adamantyle
Figure I-14 : Spectre de RMN du proton du OH-PEG-AdPh (obtenu à partir d’un OH-PEG-Ts modifié à
50% en Ts) en solution dans le DMSO deutéré ; la modification chimique du polymère a été effectuée dans
le dichlorométhane.
La modification totale des fonctions tosyle du PEG-Ts par le phényladamantyle est
vérifiée par la disparition des signaux relatifs au tosyle au profit de nouveaux caractéristiques
du phéyladamantyle. Néanmoins, les OH résiduels du polymère (4,58 ppm) semblent avoir
totalement disparu. De plus, un dédoublement des doublets aromatiques du phényladamantyle
ainsi que l’apparition d’un singulet à 5,2 ppm sont observés. Par ailleurs, l’intégration des
protons de l’adamantyle comparée à celle des protons du CH2 en α de ce groupement (CH2OAdPh) conduit à un rapport proche de 11 très supérieur à la valeur théorique (7,5). Ces
phénomènes n’avaient pas été observés dans le cas de la modification d’un PEG possédant un
groupement méthoxyle en bout de chaîne (MPEG). L’ensemble de ces résultats suggère
l’existence d’une réaction secondaire qui mènerait à la fixation de l’adamantylphénol sur
l’extrémité hydroxyle libre du PEG-Ts. Un possible mécanisme rendant compte de cette
réaction est décrit par la Réaction I-6.
L’adamantylphénol sous forme phénolate pourrait interagir avec le dichlorométhane
par substitution nucléophile de type SN2. Puis les extrémités hydroxyle du PEG-AdPh étant
sous forme basique pourraient réagir sur le composé intermédiaire ainsi formé et conduire à la
formation d’un PEG doublement substitué en phényladamantyle. De ce fait, le profil des
spectres de RMN est justifié : les hydrogènes des CH2 en α des unités A et B se manifestent
respectivement par le singulet à 5,2ppm et le triplet à 4,05ppm alors que les couplages entre
les protons Ha/Hb d’une part et Hc/Hd d’autre part se traduit par l’apparition des 4 doublets.
58
CHAPITRE I
HO
NaH
Cl
CH2
O
Cl
O
CH2
O
Cl
H2C
H2C H2C O
H2C O
n
Ha
Hb
O
CH2 O
(α)
H2C
H2C O
n
Ha
Hb
A
Hc
Hd
Hc
Hd
H2C H2C O
(α)
B
Réaction I-6 : Réaction secondaire soupçonnée au cours de la modification chimique d’un OH-PEG-Ts
par de l’adamantylphénol dans du dichlorométhane
Du fait de l’existence de réactions secondaires avec le dichlorométhane, l’utilisation
d’un solvant chloré s’est avérée inadéquate à la modification d’un PEG tosylé possédant des
fonctions hydroxyle libres. Des solvants de natures différentes ont donc été testés.
Des premiers essais effectués dans le toluène ont mis en évidence une solubilisation
difficile du polymère. De ce fait, le toluène a été abandonné et une modification chimique
d’un OH-PEG-Ts dans du tétrahydrofurane (THF) a été testée. Les autres conditions
opératoires quant à elles, ont été identiques à celles utilisées pour la synthèse dans le
dichlorométhane (notamment l’excès molaire NaH/AdPh = 2,5). Le spectre de RMN du
proton caractéristique du OH-PEG-AdPh obtenu (modifié à 58% en phényladamantyle) est
59
CHAPITRE I
6
2
H2 O
6
DMSO
4
4
6
5
1
Figure I-15 : Spectre de RMN du proton du OH-PEG-AdPh (modifié à 58% en AdPh) en solution dans le
DMSO deutéré ; la modification chimique du polymère a été effectuée dans le tétrahydrofurane.
Le THF semble être un solvant approprié à la modification recherchée. En effet,
l’analyse par RMN du PEG-AdPh révèle la disparition des signaux relatifs aux groupements
tosyle au profit de ceux caractéristiques du phényladamantyle. De plus, l’absence du singulet
à 5,2ppm et l’absence du dédoublement des doublets aromatiques suggèrent qu’il n’y a pas de
réaction secondaire avec le solvant. Ce résultat est confirmé par une valeur de l’intégration
des protons de l’adamantyle rapportée à celle des protons du CH2 en α de ce groupement de
7,5, valeur qui est égale à la valeur théorique. Cependant, l’analyse par SEC du polymère a
révélé la présence de trois populations suggérant la formation de « dimère » et « trimère » de
PEG. Ce dernier résultat pourrait être la conséquence de l’excès de NaH introduit (rapport
molaire NaH/AdPh = 2,5) qui conduirait à un autre type de réaction secondaire (Réaction I-7).
60
CHAPITRE I
HO
H2C
H2C
H2C O
CH2
O
Ts
CH2
O
Ts
n
NaH
O
H2C
H2C
H2C O
n
O
HO
H2C
H2C
H2C O
CH2
O
Ts
n
HO
H2C
H2C
H2C O
CH2
O
H2C
n
H2C
H2C O
CH2
O
n
Réaction I-7 : Réaction secondaire soupçonnée au cours de la modification chimique d’un OH-PEG-Ts
par de l’adamantylphénol dans du tétrahydrofurane en présence d’un excès de NaH : exemple du
mécanisme de formation d’un « dimère » de PEG
Du fait de la présence d’un excès de NaH, les extrémités hydroxyle libres du OHPEG-Ts se trouvent sous forme basique. De ce fait, les deux extrémités du -0-PEG-Ts formé
peuvent être mises en jeu et conduire à la formation de PEGs de masses plus élevées. En effet,
l’extrémité tosyle peut être substituée par l’adamantylphénol (sous forme phénolate) alors que
l’extrémité hydroxyle sous forme basique peut réagir sur l’extrémité tosyle d’un homologue
OH-PEG-Ts ou -0-PEG-Ts.
Afin de pallier à cette réaction secondaire, un défaut molaire de NaH par rapport à
l’adamantylphénol (rapport molaire de l’ordre de 0,8) a été utilisé. Dans ces conditions, le
NaH qui est totalement consommé dans la première étape (réaction avec l’adamantylphénol)
ne peut plus déclencher de réactions secondaires avec le polymère. L’absence de réaction
secondaire est d’ailleurs confirmée par l’analyse SEC de l’espèce finale OH-PEG-AdPh
puisque celle-ci révèle la présence d’une unique population. Les conditions opératoires ayant
conduit à la synthèse du polymère recherché sont reportées dans le Tableau I- 10.
61
CHAPITRE I
Rapport molaire de
Rapport molaire de
synthèse
synthèse
NaH/AdPh
AdPh/fonction Ts
0,8
5
T (°C)
Durée (h)
40
48
Tableau I- 10 : Conditions expérimentales de la synthèse du OH-PEG-AdPh (à partir du OH-PEG-Ts)
dans le tétrahydrofurrane
La modification chimique d’un OH-PEG-Ts possédant des fonctions hydroxyle libres
par le 4-(1-adamantyl)phénol requiert de prendre deux précautions. En premier lieu,
l’utilisation d’un solvant non chloré permet d’éliminer les possibles réactions secondaires
avec le solvant puis l’utilisation d’un défaut molaire de NaH par rapport au réactif
adamantylphénol permet d’empêcher la formation de PEGs de masses plus élevées.
Il est important de noter que le pourcentage de modification calculé à partir des
résultats de RMN correspond à un taux moyen. En effet, cette méthode ne permet pas de
distinguer les différentes populations de polymères issues de la réaction de l’adamantylphénol
sur le PEG initial. Trois catégories de polymères peuvent être formées au cours de cette
étape :
•
des PEGs possédant une extrémité OH libre et un groupement phényladamantyle,
OH
•
des
PEGs
modifiés
à
leurs
deux
extrémités
par
des
groupements
phényladamantyle,
•
des PEGs n’ayant pas réagi donc non substitués.
HO
OH
Les différents lots de OH-PEG-AdPh issus de cette première étape ont pu être
caractérisés par CLHP. En effet, des études menées par David et coll.43 ont montré l’existence
d’interactions de forte affinité entre des MPEG-AdPh et une phase stationnaire de silice
62
CHAPITRE I
greffée par un polymère de β-cyclodextrine. Ce résultat a été expliqué par la formation de
complexes d’inclusion entre le groupement hydrophobe AdPh à l’extrémité des MPEGs et les
cavités de β-cyclodextrine du support. Un tel support, dont la synthèse a été décrite au
paragraphe III.2 de ce chapitre, a donc été utilisé pour analyser les lots de OH-PEG-Adph
globalement modifiés à 50-58% d’après l’analyse de RMN. Les conditions expérimentales
relatives à cette caractérisation sont données dans l’annexe 7. Les trois types de populations
attendues ont été observées : l’espèce PEG non modifié a été révélée du fait qu’elle n’a
présenté aucune affinité pour le support tandis que les deux autres composés, mono et disubstitué en AdPh, ont été mis en évidence par une forte affinité pour le support, avec une
interaction d’autant plus élevée que la substitution en groupement hydrophobe est importante.
Finalement, l’analyse par CLHP des lots de OH-PEG-AdPh a conduit à la composition
suivante : 60 à 80 % de PEG monosubstitué AdPh, 10 à 20 % de disubstitué et 10 à 20% de
PEG non modifié. Dans tous les cas, les pourcentages obtenus conduisent à un pourcentage
moyen de modification en AdPh en bon accord avec celui déterminé par RMN.
Les lots de OH-PEG-AdPh étant constitués d’espèces non désirées, il a été démontré
qu’une purification des mélanges par chromatographie préparative serait possible le cas
échéant. La faisabilité de cette purification a été étudiée sur le même support de silice-polyβcyclodextrine avec un lot de polymère modifié à 50 % en AdPh d’après l’analyse de RMN.
Des études antérieures ont montré que la rétention d’un MPEG-Adph sur le support de silicepolyβ-cyclodextrine est fonction du type d’éluant utilisé43. Le MPEG-AdPh, retenu par le
support lorsque de l’eau est utilisée comme éluant, voit sa rétention fortement diminuée en
présence de solvant organique tels que le diméthylformamide ou l’acétonitrile. De ce fait, un
éluant permettant, d’une part la sortie rapide mais distincte des espèces non modifiée et
monosubstituée et d’autre part la fixation de l’espèce disubstituée sur le support, a donc été
recherché. Les rétentions des trois espèces composant le lot de OH-PEG-AdPh ont été
étudiées en fonction de la composition d’un mélange acétonitrile/eau (Figure I-16).
63
CHAPITRE I
PEG
OH-PEG-AdPh
AdPh-PEG-AdPh
30
25
20
VR (mL)
15
10
5
0
30
35
40
45
50
55
60
% volumique en acétonitrile
Figure I-16 : Rétention (VR = volume de rétention) des différentes espèces présentes dans un lot de OHPEG-AdPh (modifié à 50% en AdPh, en moyenne, d’après la RMN) en fonction de la composition d’un
mélange acétonitrile/eau (v/v) sur un support de silice-polyβ
β-cyclodextrine
Le PEG non modifié, ne présentant aucune affinité pour la phase stationnaire, ressort
au volume mort de la colonne et ce quelle que soit la composition du solvant. Les PEGs mono
et disubstitués quant à eux voient comme prévu43, leur rétention diminuer avec l’augmentation
du pourcentage volumique en solvant organique de la phase mobile. Le PEG disubstitué,
possédant deux groupements hydrophobes AdPh capables d’interagir avec le support, présente
une affinité pour la phase stationnaire plus élevée que le monosubstitué, de ce fait un
pourcentage de solvant organique plus important est nécessaire pour le désorber. A la vue des
résultats, une purification par chromatographie préparative serait possible. En effet, pour un
éluant constitué à 30% d’acétonitrile, le PEG non modifié sort au volume mort, le PEG-AdPh
monosubstitué ressort bien distinctement au bout de 5mL et l’espèce disubstituée reste fixée
sur le support. Celle-ci pourrait être recueillie ultérieurement, de façon rapide, grâce à la
percolation d’un éluant à 60% minimum en acétonitrile.
b.2) Synthèse et caractérisation des PEGs portant un motif phényladamantyle (AdPh) et une
fonction carboxylique (COOH) à l’autre extrémité : COOH-PEG-AdPh
La deuxième étape consiste à modifier le polymère intermédiaire OH-PEG-AdPh par
des fonctions acide carboxylique. Cette seconde étape se fait par réaction de l’anhydride
64
CHAPITRE I
succinique sur les fonctions hydroxyle restantes du OH-PEG-AdPh53,54. Le spectre de RMN
du proton du COOH-PEG-AdPh obtenu lors de cette deuxième étape est donné sur la Figure
I-17.
6
COOH-PEG-AdPh :
2
O
C CH2 CH2 C O CH2 CH2
HO
(α1) (β1) O
(α2)
Pic 8
4
O
H2C
DMSO
H2C H2C O
H2C O
H2O
6
n
Pic 7
4
8
7 5
N° pic
Déplacement (ppm)
Multiplicité
Nb de H
6
Attribution
par chaîne
de COOHPEG-AdPh
4
7,3 et 6,9
2 Doublets A2B2
4
H aromatique
2
CH2 (α2) du
(J=8,1 Hz)
7
4,1
Triplet
groupement -COO5
4,05
Triplet (J = 6 Hz)
2
3,51
Singulet large
65
2
-CH2OAdPh
CHAPITRE I
8
2,45
Triplet
2+2
CH2 (α1)
et CH2 (β1) de
l’extrémité COOH
6
2,0 - 1,8 - 1,7
Singulets larges
15
H adamantyle
Figure I-17 : Spectre de RMN du proton du COOH-PEG-AdPh en solution dans le DMSO deutéré
La réaction de l’anhydride succinique sur le OH-PEG-AdPh est confirmée par la
disparition du signal relatif aux fonctions OH et par l’apparition d’un nouveau signal à 4,1
ppm relatif au CH2 en α du groupement succinate (CH2 (α2)). Un excès molaire d’anhydride
succinique par rapport aux fonctions hydroxyle du OH-PEG-AdPh intermédiaire de l’ordre de
dix a permis la modification totale des fonctions OH restantes en fonctions acide
carboxylique.
III.3.4 – Synthèse et caractérisation des polymères amphiphiles à base
de dextrane
Les dérivés amphiphiles synthétisés à partir de dextranes ont été utilisés pour
l’élaboration d’édifices macromoléculaires à finalité analytique tels que des supports
chromatographiques de fonctionnalités variables (Chapitre III) et des puces à allergènes
(Chapitre IV).
Trois types de polymères à base de dextrane ont été élaborés, leurs formules chimiques
sont données sur la Figure I-18 et leurs domaines d’utilisation ont été résumés dans le Tableau
I-7, paragraphe III.3.1 de ce chapitre.
66
CHAPITRE I
OCOAd
OCOAd
OH
OH
O(CH2)2N+H(C2H5)2
COOH
Dextrane-Adamantane-COOH
Dext-Ad-COOH
Dextrane-Adamantane-Diéthylaminoéthyle
Dext-Ad-DEAE
OCOAd
OH
OCO(CH2)7CH3
Dextrane-Adamantane-Octyle
Dext-Ad-C8
Figure I-18: Structures chimiques des polymères amphiphiles synthétisés à base de dextranes
a) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) le long de
la chaîne : Dext-Ad
Les trois types de dextranes amphiphiles synthétisés ont en commun la présence de
groupements hydrophobes adamantyle le long de la chaîne. La modification chimique du
dextrane par des groupements adamantyle a été décrite par David55 et consiste en une
estérification des fonctions hydroxyle par le chlorure de 1-adamantoyle (Réaction I-8). Les
conditions expérimentales et le spectre de RMN du proton caractéristique du Dext-Ad en
solution dans le D2O sont donnés dans l’annexe 8.
67
CHAPITRE I
O
CH2
C
OH
LiCl, DMAP,Pyridine
80°C, 3h, DMF
O
HO
O
Cl
H2 C
O
HO
O
OH
O
O
OH
C
CH2
O
OH
O
OH
OH
n
CH2
O
OH
OH
Dext
O
OH
CH2
O
OH
O
OH
OH
Dext-Ad
Réaction I-8 : Synthèse des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) le long de la chaîne : Dext-Ad
La modification chimique du dextrane initial est vérifiée par RMN du proton avec
l’apparition de signaux caractéristiques de l’adamantyle à 1,9 - 1,75 et 1,55ppm. Le taux
moyen de substitution du polymère (supposé statistique le long de la chaîne de dextrane) peut
être déterminé à partir des spectres de RMN par la comparaison des signaux de l’adamantyle
et de celui relatif à l’ensemble des protons anomériques (annexe 8). D’après David55, un
rapport molaire de chlorure d'adamantyle par rapport aux unités glucose égal à 0,2 conduit à
un pourcentage de substitution molaire de 7% (soit 7Ad pour 100 unités glucose). Un tel taux
de groupement hydrophobe étant approprié pour les applications escomptées, des conditions
expérimentales identiques ont été reprises. Les caractéristiques des Dext-Ad synthétisés sont
résumées dans le Tableau I-11.
Mdextrane
Notation
(g/mol)
Rapport molaire de
% Ad(*)
Nb Ad/chaîne
de dextrane(*)
synthèse (chlorure
d’adamantoyle/unités
♦)
glucose)(♦
40 000
10 000
Dext40-Ad
Dext10-Ad
0,2
Tableau I-11 : Caractéristiques des Dext-Ad synthétisés.
glucose est la plus réactive.
(*)
(♦
♦)
6,2
15
7,3
4à5
La fonction OH portée par le C2 de l’unité
Résultats obtenus à partir de l’analyse de RMN (x% correspond à x motifs
Ad pour 100 unités glucose)
68
CHAPITRE I
b) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et
diéthylaminoéthyle (DEAE) le long de la chaîne : Dext-Ad-DEAE
La synthèse de dextranes modifiés par des groupements amine tertiaire
diéthylaminoéthyle (DEAE) a été mise au point par Santarelli et coll.56. La réaction du
dextrane avec la 2-chloro-N,N-diéthyléthylamine consiste en une substitution nucléophile ;
celle ci est réalisée à 60°C dans de l’eau ultra pure en présence d’un excès d’hydroxyde de
sodium (Réaction I-9). Les conditions expérimentales sont développées en annexe 9.
CH2
H2C
OH
DEAE, NaOH
60°C, H2O
O
HO
O
1er étape
O
OH
OH
HO
OH
CH2
O
OH
O
OH
O
O
n
CH2
O
OH
CH2
OH
CH2
Dext
pKa = 9.5
Cl
O
OH
N(C2H5)2
H
CH2
O
OH
O
OH
O
greffons type A
CH2
Chaîne A
CH2
Cl
N(C2H5)2
C2H4
pKa = 5.7
Cl
N(C2H5)2
H
Dext-DEAE
greffons type B
Chaîne B
Réaction I-9 : Synthèse des dextranes portant des motifs diéthylaminoéthyle (DEAE) le long de la chaîne :
Dext-DEAE
La modification par les groupes DEAE s’effectuant avec un excès de soude, il est
préférable de synthétiser le Dext-Ad-DEAE en modifiant d’abord le dextrane initial par le
DEAE puis par les groupes adamantyle. Dans le cas inverse, les liaisons ester présentes dans
le Dext-Ad pourraient subir une hydrolyse en milieu basique, notamment à une température
de 60°C.
69
CHAPITRE I
Le spectre de RMN du proton caractéristique du Dext-DEAE en solution dans le D2O est
D2O
3
2
1
3’
1
N° pic Déplacement (ppm)
1
2
5,05 - 4,8
4,0 à 3,1
Multiplicité
Attribution
Singulet
H anomériques
et
des unités glucose modifiées
Doublet
et non modifiées
Multiplet
Autres H du dextrane
+
Autres H du DEAE
3
1,15
CH3 de l’amine tertiaire
Triplet
(présents dans greffons A et B)
3’
0,95
CH3 de l’ammonium quaternaire
Triplet
(présents dans greffons B)
Figure I-19 : Spectre de RMN du proton du Dext-DEAE en solution dans le D2O
70
CHAPITRE I
Les analyses de RMN montrent l’apparition de deux types de protons CH3 liés à
l’existence de deux types de greffons DEAE sur le dextrane : des fonctions amine tertiaire et
des fonctions ammonium quaternaire (Cf. Réaction I-9). Les deux types de greffons sont
respectivement dus à une substitution nucléophile au niveau de l’oxygène des fonctions
hydroxyle du dextrane et au niveau de l’atome d’azote du DEAE. Appelons « chaînes A » et
« chaînes B » (Cf. Réaction I-9) les unités glucose modifiées respectivement par un greffon de
type A (amine tertiaire de pKa = 9,5) et par un greffon de type B (amine tertiaire de pKa = 5,7
+ ammonium quaternaire). La proportion relative des deux types de chaînes et le degré de
substitution global moyen en DEAE peuvent être déterminés par l’analyse RMN en
comparant les signaux relatifs aux CH3 (de l’amine tertiaire ou de l’ammonium quaternaire) à
ceux correspondants aux H anomériques (annexe 9).
L’influence de la quantité de réactif DEAE et l’effet du temps de réaction sur le degré
de substitution ont été étudiés, les résultats obtenus sont portés dans le Tableau I-12.
N° du Dext-DEAE
Dext40-
Dext40-
Dext40-
(M = 40000g/mol)
DEAE 1
DEAE 2
DEAE 3
Rapport molaire de synthèse
DEAE/unités glucose
2
2
4
Temps de réaction (h)
1
4
4
Taux de chaînes (A + B) (%)
26
41
138
4
8
63
22
33
75
=
Taux total de modification
en amine tertiaire de pKa = 9,5 et de pKa = 5,7 (%)
Taux de chaînes B (%)
=
Taux de modification en ammonium quaternaire (%)
=
Taux de modification en amine tertiaire de pKa = 5,7 (%)
Taux de chaînes A (%)
=
Taux de modification en amine tertiaire de pKa = 9,5 (%)
71
CHAPITRE I
30
49
201
Taux global moyen de modification en DEAE (%)
Rapport molaire chaînes B / chaînes A
0,18
0,24
0,84
Nb moyen de chaînes (A + B)/chaîne de dextrane
64
101
341
Taux de chaînes A + 2 × Taux de chaînes B (%)
=
Tableau I-12 : Influence de l’excès de réactif DEAE et du temps de réaction sur la modification en DEAE
du dextrane (x% correspond à x motifs DEAE pour 100 unités glucose)
L’augmentation du temps de réaction et de l’excès de réactif ont pour effet d’élever le
taux global de modification en DEAE. Cependant, le rapport molaire chaînes B / chaînes A
augmente avec la durée de réaction et à durée égale, ce rapport augmente d’un facteur
supérieur à trois lorsque l’excès de réactif augmente seulement d’un facteur deux.
L’accroissement du temps de réaction et de l’excès de réactif favorise donc la réaction
secondaire (substitution nucléophile au niveau de l’atome d’azote du DEAE) qui conduit à la
modification du dextrane par des fonctions ammonium quaternaire.
La deuxième étape de l’élaboration du Dext-Ad-DEAE consiste à modifier le DextDEAE intermédiaire par des groupements adamantyle (Réaction I-10). La méthode
précédemment décrite (paragraphe III.3.4.a de ce chapitre) a donc été reprise à la différence
près qu’un rapport molaire (chlorure d’adamantyle/unités glucose) deux fois plus élevé a dû
être utilisé pour favoriser la réaction. En effet, le Dext-DEAE2 à modifier est déjà fortement
greffé en groupements DEAE (41 % de chaînes (A+B)) et ne possède plus qu’un faible
nombre de OH réactifs. De même, le Dext-DEAE3 contenant déjà 138 % de chaînes (A+B)
ne doit plus posséder de fonctions hydroxyle réactives et ses autres fonctions OH doivent
également être touchées.
72
CHAPITRE I
2e étape
O
C
Cl
LiCl, DMAP,Pyridine
80°C, 3h, DMF
CH2
CH2
O
O
OH
OH
O
OH
OH
CH2
O
O
OH
O
OH
O
CH2
Cl
O
N(C2H5)2
H
C
OH
CH2
O
OH
O
OH
O
OH
CH2
OH
CH2
pKa = 9.5
O
O
O
OH
CH2
O
OH
CH2
OH
CH2
O
OH
Cl
O
OH
CH2
N(C2H5)2
H
O
OH
CH2
O
OH
O
O
CH2
CH2
CH2
Cl
CH2
Cl
N(C2H5)2
C2H4
pKa = 5.7
Cl
O
OH
N(C2H5)2
C2H4
Cl
N(C2H5)2
H
N(C2H5)2
H
Dext-DEAE
Dext-Ad-DEAE
Réaction I-10 : Synthèse des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et diéthylaminoéthyle (DEAE)
le long de la chaîne : Dext-Ad-DEAE (à partir de l’espèce intermédiaire Dext-DEAE)
L’analyse par RMN du proton de l’espèce finale Dext-Ad-DEAE conduit au taux de
modification en adamantyle (Cf. paragraphe III.3.4.a de ce chapitre et annexe 9). Les
caractéristiques des polymères synthétisés sont portées dans le Tableau I-13.
73
CHAPITRE I
Notation
% Ad(*)
Nb Ad/chaîne de dextrane(*)
4
10
10
25
(M = 40000g/mol)
Dext40-Ad-DEAE 2
(issu du Dext40-DEAE 2)
Dext40-Ad-DEAE 3
(issu du Dext40-DEAE 3)
Tableau I-13 : Taux de modification en adamantyle des Dext-Ad-DEAE synthétisés,
(*)
résultats obtenus à
partir de l’analyse de RMN (x% correspond à x motifs Ad pour 100 unités glucose)
c) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et des
fonctions acide carboxylique (COOH) le long de la chaîne : Dext-Ad-COOH
Dans des travaux antérieurs, David et coll.49 ont étudié deux méthodes de modification
chimique des dextranes par des fonctions acide carboxylique. La première méthode, inspirée
de Gekko et coll.57 a consisté à faire réagir de l’acide monochloroacétique sur les fonctions
hydroxyle d’un dextrane préalablement déprotoné par une solution de soude. Un très fort
excès de réactif (rapport molaire réactif/fonctions OH réactives = 300) a été nécessaire pour
obtenir un taux de substitution voisin de 30%, en considérant qu’un taux de 100% correspond
à un motif COOH par unité glucose. Pour augmenter le taux de substitution il aurait été
nécessaire de répéter plusieurs fois la réaction. Une deuxième méthode, inspirée de Zalipsky
et coll.58 a consisté à faire réagir de l’anhydride succinique sur les fonctions hydroxyle du
dextrane49. Un rapport équimolaire de réactif par rapport aux fonctions OH a permis une
modification chimique du polymère à 100%.
Les applications envisagées à partir du Dext-Ad-COOH nécessitent une modification
en fonctions acide carboxylique assez importante ; la deuxième voie a donc été utilisée. Dans
ce travail, un polymère intermédiaire de Dext-Ad, synthétisé selon le protocole décrit au
paragraphe III.3.4.a de ce chapitre, a été modifié par de l’anhydride succinique selon la
Réaction I-11. Les conditions expérimentales relatives à cette synthèse sont données en
annexe 10.
74
CHAPITRE I
O
O
O
DMAP, NEt3
80°C, 16 h, DMF
CH2
CH2
O
O
OH
O
OH
O
O
C
OH
CH2
O
OH
OH
O
OH
O
O
OH
CH2
O
O
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
C
CH2
O
OH
CH2
CH2
O
OH
O
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
O
O
CH2
C
O
OH
O
H2C
Dext-Ad
CH2
COO-
Dext-Ad-COOH
Réaction I-11 : Synthèse des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et des fonctions acide
carboxylique (COOH) le long de la chaîne : Dext-Ad-COOH (à partir de l’espèce intermédiaire Dext-Ad)
Le spectre de RMN du proton caractéristique du Dext-Ad-COOH en solution dans le
D2O est donné en annexe 10. La fonctionnalisation du dextrane par les fonctions acide
carboxylique est vérifiée par l’apparition d’un signal caractéristique de l’anhydride succinique
vers 2,55 ppm. Le taux de modification en fonction carboxylique du Dext-Ad-COOH peut
être déterminé à partir de l’intégration des protons relatifs à l’anhydride succinique (ROOCCH2-CH2-COOH) comparée à celle des protons anomériques (annexe 10). Les
caractéristiques des polymères synthétisés sont reportées dans le Tableau I-14.
75
CHAPITRE I
N° du dextrane
Rapport molaire de
% COOH
% COOH
Nb
(M = 40000g/mol
synthèse (anhydride
(par RMN)
théorique
COOH/chaîne
et 10000g/mol)
succinique/unités
de dextrane (*)
glucose)
Dext40-Ad-COOH1
0,62
65
62
153
0,62
65
62
38
(issu du Dext40-Ad)
Dext10-Ad-COOH1
(issu du Dext10-Ad)
Tableau I-14 : Caractéristiques des Dext-Ad-COOH synthétisés,
(*)
Valeurs déterminées à partir du
pourcentage théorique de COOH
Le pourcentage de modification en fonctions COOH déterminé par RMN du proton
pour les deux polymères est de 65 %. Cette valeur est légèrement supérieure à la valeur
théorique de 62 % calculée à partir de l’excès d’anhydride succinique/unités glucose introduit
et en supposant une réaction totale. Ce résultat suggère que la réaction de carboxylation du
dextrane a été totale et la faible différence de pourcentage observée doit être due à
l’incertitude sur les intégrations des signaux obtenus en RMN du proton. Dans la suite de
l’étude, le pourcentage théorique de 62 % en COOH sera utilisé pour caractériser les deux
polymères.
d) Synthèse et caractérisation des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et des
chaînons alkyle (C8) le long de la chaîne : Dext-Ad-C8
Un polymère intermédiaire de Dext-Ad (synthétisé selon le protocole décrit au
paragraphe III.3.4.a de ce chapitre) a été modifié par des chaînons alkyle selon la Réaction I12. Cette étape consiste en une estérification des fonctions OH restantes du Dext-Ad par le
chlorure de nanoyle. Les conditions opératoires de la synthèse sont décrites dans l’annexe 11.
76
CHAPITRE I
O
H3C
(CH2)7
C
Cl
LiCl, DMAP, Pyridine
80°C, 3h, DMF
CH2
CH2
O
O
OH
O
OH
O
O
C
OH
CH2
O
O
O
OH
OH
CH2
O
OH
O
OH
CH2
O
O
OH
O
OH
OH
OH
C
OH
O
OH
CH2
CH2
O
OH
OH
O
OH
CH2
O
O
OH
O
O
OH
O
O
C
O
OH
O
(H2C)7
Dext-Ad
CH3
Dext-Ad-C8
Réaction I-12 : Synthèse des dextranes portant des motifs adamantyle (Ad) et des chaînons octyle (C8) le
long de la chaîne : Dext-Ad-C8 (à partir de l’espèce intermédiaire Dext-Ad)
Le spectre de RMN du proton relatif au Dext-Ad-C8 en solution dans le D2O est donné
sur la Figure I-20. L’estérification des fonctions hydroxyle du Dext-Ad par le chlorure de
nanoyle est vérifiée par l’apparition de nouveaux signaux caractéristiques des chaînons alkyle
vers 1,6 - 1,15 et 0,75 ppm. Le taux de modification en C8 peut alors être déterminé par
comparaison de l’intégration relative au -CH3 du C8 par rapport au H anomérique (annexe 11).
Les caractéristiques des Dext-Ad-C8 synthétisés sont reportées dans le Tableau I-15.
77
CHAPITRE I
D2O
2
1
3
3
1
3+5
4
6
7
N° pic
Déplacement (ppm)
Multiplicité
Attribution
1
4,95 - 4,8
Singulet
H anomériques
et
des unités glucose modifiées et non
Doublet
modifiées
2
3,9 à 3,3
Multiplet
4
2,3
Singulet large
CH2 en α du -COOH3C-(CH2)5-CH2-CH2(αα)-COO-Dext
3
1,9 - 1,75 - 1,55
Singulets larges
H adamantyle
5
1,6
Singulet large
CH2 en β du -COOH3C-(CH2)5-CH2(ββ)-CH2-COO-Dext
6
1,15
Singulet large
Autres -CH2- du C8 :
H3C-(CH2)5-CH2-CH2-COO-Dext
7
0,75
Singulet large
-CH3 du C8 :
H3C-(CH2)5-CH2-CH2-COO-Dext
Figure I-20 : Spectre de RMN du proton du Dext-Ad-C8 en solution dans le D2O
78
CHAPITRE I
N° du dextrane
Rapport molaire de
% C8
Nb C8
(M = 40000g/mol
synthèse (chlorure de
(par RMN)
/chaîne de dextrane
et 10000g/mol)
nanoyle/unités
glucose)
Dext40-Ad-C81
0,03
2,3
6
Dext40-Ad-C82
0,21
1,5
4
Dext10-Ad-C81
0,37
0,7
<1
Tableau I-15 : Caractéristiques des Dext-Ad-C8 synthétisés à partir de l’espèce intermédiaire Dext-Ad
Les quelques essais effectués semblent indiquer un manque de reproductibilité des
résultats.
Les conditions expérimentales de modification du dextrane par l’adamantyle et par les
chaînons alkyle étant identiques, la modification chimique en une seule étape d’un dextrane
en Dext-Ad-C8 a ensuite été testée. Un désavantage de cette méthode est que le taux de
modification en adamantyle ne peut être déterminé précisément. En effet, le signal relatif au
groupement CH2 en position β par rapport au COOH et parfois les signaux des autres CH2 du
C8 se superposent aux pics des protons de l’adamantyle. Le taux de modification en C8 peut
néanmoins être déterminé précisément puisque le signal relatif au -CH3 du C8 est bien distinct.
Les caractéristiques des Dext-Ad-C8 synthétisés en une étape sont reportées dans le Tableau I16. Seuls sont donnés les pourcentages de modification en chaînons octyle.
N° du dextrane
Rapport
Rapport
% C8
Nb C8
(M = 40000g/mol
molaire de
molaire de
(par RMN)
/chaîne de
et 10000g/mol)
synthèse
synthèse
(chlorure
(chlorure
d’adamantyle/
de nanoyle/
unités glucose)
unités glucose)
Dext40-Ad-C83
0,19
0,036
3,6
9
Dext40-Ad-C84
0,19
0,19
3,7
9
Dext40-Ad-C85
0,19
0,38
10,5
26
79
dextrane
CHAPITRE I
Dext10-Ad-C82
0,19
0,38
17
10 à 11
Dext10-Ad-C83
0,26
0,49
20
12
Tableau I-16 : Caractéristiques des Dext-Ad-C8 synthétisés en une seule étape à partir du dextrane
La synthèse de polymères Dext-Ad-C8 en une unique étape conduit à des espèces plus
fortement substituées en C8 par rapport aux produits issus de la synthèse en deux étapes et
dont les taux de modification semblent être en meilleur accord avec les proportions de
réactifs. Cette différence par rapport à la synthèse en deux étapes pourrait être expliquée par
le degré de déshydratation du polymère initial utilisé. En effet, la synthèse en une étape
démarre d’un dextrane fortement déshydraté (polymère desséché sous vide à 100°C) alors que
la modification en deux temps débute d’un Dext-Ad non séché (afin d’éviter tout risque de
dégradation). La présence d’eau résiduelle dans le polymère initial pourrait alors conduire à
une réaction secondaire d’hydrolyse du chlorure de nanoyle.
III.4 - Conclusion
En conclusion, deux types de molécules hôtes à base de cyclodextrine ont été
synthétisées : un polymère de β-cyclodextrine qui sera greffé sur de la silice afin d’élaborer
des supports chromatographiques et une β-cyclodextrine aminée qui sera utilisée pour la
formation de biocapteurs. Par ailleurs, différents types de molécules invitées ont été élaborées.
Les connaissances actuelles sur la modification chimique des PEGs ont permis de synthétiser
des MPEGs modifiés en une extrémité de chaîne par des groupements hydrophobes
adamantyle. Les conditions expérimentales ont ensuite été optimisées afin de synthétiser des
PEGs modifiés à une extrémité de chaîne par le groupe adamantyle et à la seconde extrémité
par une fonction réactive acide carboxylique. Par ailleurs, des dextranes bifonctionnels
modifiés par des groupements adamantyle et par différents substituants tels que des fonctions
acide carboxylique, des fonctions amine et des chaînons alkyle, ont également été élaborés.
L’ensemble de ces polymères sera par la suite mis en jeu pour des études théoriques d’affinité
ou pour l’élaboration de systèmes analytiques tels que des supports chromatographiques et
des biocapteurs.
80
CHAPITRE I
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES DU CHAPITRE I
81
CHAPITRE I
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
(24)
(25)
(26)
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82
CHAPITRE I
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(47)
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83
84
CHAPITRE II
CHAPITRE II :
ETUDE THEORIQUE PAR ACE ET PAR CLHP DE L’INTERACTION
ENTRE UN POLYMERE MODELE MODIFIE ADAMANTYLE
ET LA β-CYCLODEXTRINE
85
CHAPITRE II
La littérature répertorie de nombreuses valeurs de constantes pour la formation de
complexes en solution entre des dérivés de l’adamantane et de la β-cyclodextrine (Tableau II1). La stabilité des complexes formés dépend du type d’adamantane mis en jeu, de la nature et
de la position des substituants portés par l’adamantane. Par ailleurs, des études de pH menées
sur des molécules ionisables dérivées de l’adamantane ont généralement mis en évidence une
diminution importante de la constante d’affinité lorsque la molécule invitée est chargée.
D’autre part, les valeurs de constantes reportées dans la littérature semblent assez dépendantes
de la technique expérimentale utilisée.
Molécule invitée complexée
à la β -CD
Adamantan-1-amine
(ou amantadine)
(pKa = 9,25, d’après Janshoff et
K en solution
Technique
pH
Microcalorimétrie
4,0
7 800
Ref3
Voltamétrie (a)
5,5
13 000
Ref1,4
(M-1)
Référence
K en surface
coll.1 et pKa ≈ 10 d’après Palepu
9,7
3 700
Ref2
6,5
2 200
Ref2
4,0
1 900
Ref2
9,0
9 200
Ref5
5,0
11 000
Ref5
7,0
200
Ref6
9,7
2 900
Ref2
6,5
3 300
Ref2
NH2
4,0
4 400
Ref2
Adamantan-1-ol
10,0
17 000
Ref5
9,0
30 000
Ref5
et Reinsborough2)
Conductimétrie
NH2
Déplacement spectral
Electrophorèse
capillaire (b)
Adamantan-2-amine
(pKa ≈ 10 d’après Palepu et
Reinsborough2)
OH
Conductimétrie
86
CHAPITRE II
Acide adamantane-1carboxylique
(pKa=4,75, d’après Janshoff et
Microcalorimétrie
coll.1 ou
pKa = 4,9 (acide libre) et pKa =
6,2 (acide en présence de 0,01M
de β-CD), d’après Eftink et coll.7)
Voltamétrie (a)
COOH
Conductimétrie
Potentiométrie
Electrophorèse
8,5
32 400
Ref8
8,5
18 000
Ref7
7,2
40 000
Ref7
4,05
300 000
Ref7
8,0
2 400
K en surface
Ref1,4
10,0
12 000
Ref2
9,7
19 000
Ref2
8,3
33 000
Ref2
6,5
78 000
Ref2
4,0
105 000
Ref2
6,0
950 000
Ref7
10,0
16 000
Ref7
9,0
42 000
Ref5,7
7-8
500
Ref9
7,2
20 000
Ref7
8,1
20 000
Ref2
6,3
19 000
Ref2
8,5
5 000
Ref7
7,2
5 400
Ref7
4,05
70 000
Ref7
4,5
140 000
Ref7
capillaire
Acide adamantane-1-acétique
Microcalorimétrie
COOH
Conductimétrie
Acide noradamantane-3carboxylique
Microcalorimétrie
COOH
Potentiométrie
87
CHAPITRE II
Acide homoadamantane-3carboxylique
COOH
PEG-Ad2
Microcalorimétrie
7,2
14 000
Ref7
9
44 000
Ref5,7
3 200
Ref10
Fluorimétrie (c)
PEG
Tableau II-1 : Constantes d’affinité en solution (sauf indication contraire) à 25°C ou à température
ambiante entre des dérivés de l’adamantane et de la β-CD (excepté (a) 3,3’-Dithiobis(propane-(N-mono-6
déoxy-β
β-cyclodextrine) amide immobilisé sur une surface d’or; (b) Hydroxypropylβ
β-CD (HP β-CD),
(c)
β
polymère de β -CD
Dans la suite de cette étude, nous serons amenés à utiliser les complexes d’inclusion
formés entre des polymères modifiés par de l’adamantane et des cavités de β-cyclodextrine.
Nous avons donc choisi de déterminer la constante d’affinité entre un polymère modèle neutre
de PEG modifié adamantyle et de la β-CD. Deux méthodes faisant appel respectivement à
l’électrophorèse capillaire (EC) et à la chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
seront mises en oeuvre.
I
–
Détermination
des
constantes
d’affinité
par
électrophorèse capillaire
L’électrophorèse capillaire est apparue au début des années 90, il s’agit d’une méthode
séparative d’analyse qui s’est développée grâce aux acquis de la chromatographie liquide
haute performance et des procédés plus anciens d’électrophorèse. Elle permet de séparer aussi
bien les biomolécules pour lesquelles la chromatographie liquide s’avère parfois moins
performante que les composés de faible masse moléculaire difficiles à étudier par les procédés
classiques d’électromigration sur support.
88
CHAPITRE II
I.1 – Principe de l’électrophorèse capillaire (EC)
I.1.1 - Généralités
L’électrophorèse capillaire (EC) est une technique qui permet, sous l’effet d’un champ
électrique, de séparer des espèces chargées en solution au contact d’une surface appropriée.
Cette technique met en œuvre un tube capillaire en verre de silice de très faible
diamètre interne (15 à 150 µm) et de longueur variant entre 20 et 80 cm. Afin d’assurer la
flexibilité des capillaires, ces derniers sont recouverts d’une gaine de polyimide. Les deux
extrémités du capillaire plongent dans deux compartiments remplis d’électrolyte tampon
(Figure II-1). Une alimentation à haute tension permet d’appliquer une différence de potentiel
entre les bornes du capillaire. Ce champ électrique peut atteindre 600 V/cm mais l’intensité ne
doit pas dépasser une centaine de microampères afin que la puissance dissipée reste faible
pour éviter une perte d’efficacité du système. D’autre part, afin de limiter l’échauffement du
capillaire par effet Joule, ce dernier est placé dans une enceinte thermostatée. La détection se
fait près du compartiment cathodique à la distance l de l’extrémité amont du capillaire. La
cellule du détecteur est constituée par le capillaire lui-même en enlevant au niveau de la
cellule la gaine opaque de polyimide recouvrant le capillaire.
Capillaire
(longueur effective l, longueur totale L)
Sens de migration
Détecteur
Source
-
+
Electrolyte
Electrolyte
+
Anode
Alimentation
haute tension
0 - 30 kV
Figure II-1 : Schéma d’une installation d’électrophorèse capillaire
89
Cathode
CHAPITRE II
I.1.2 - Principe de séparation : flux électrophorétique et flux
électroosmotique
Lukacs et Jorgenson11 ont décrit la théorie de base de l’électrophorèse capillaire et ont
défini les deux effets principaux se manifestant sur les espèces présentes dans le capillaire : le
flux électrophorétique et le flux ou écoulement électroosmotique.
a) La mobilité électrophorétique
Sous l’action d’un champ électrique, toute espèce chargée contenue dans l’électrolyte
se déplace à une vitesse linéaire Vep qui dépend de l’intensité E du champ électrique appliqué
et de la mobilité électrophorétique vraie µ ep de l’espèce considérée. La grandeur µ ep peut
alors être définie à partir des paramètres Vep et E suivant l’égalité :
µ ep =
Vep
E
= Vep
L
U
Equation II-1
avec L la longueur totale du capillaire et U la différence de potentiel appliquée à ses
extrémités.
La mobilité électrophorétique vraie µ ep d’une molécule est fonction de sa charge
globale q , de son rayon de Stokes r et de la viscosité η du milieu environnant suivant
l’expression :
µ ep =
q
6π η r
Equation II-2
Elle dépend donc des conditions expérimentales telles que la nature, le pH, la force ionique et
la température de l’éluant.
Il apparaît que la mobilité électrophorétique vraie µep est positive dans le cas
d’espèces cationiques, négative dans le cas d’espèces anioniques ou encore nulle pour des
90
CHAPITRE II
composés globalement neutres. Par ailleurs, la mobilité µ ep d’une molécule est fonction de
son rapport charge/volume, ou en première approximation de son rapport charge/masse.
Ainsi, des particules posséderont des vitesses électrophorétiques d’autant plus importantes en
valeur absolue qu’elles seront plus petites et porteuses de charges plus importantes.
Expérimentalement, la valeur de la mobilité électrophorétique µep d’un composé dans
un champ E connu peut être déterminée à partir du temps de migration de l’espèce en tenant
compte de la mobilité du flux électroosmotique de l’électrolyte (Cf. Paragraphe I.1.2.c de ce
chapitre).
b) La mobilité électroosmotique
Le second facteur responsable de la migration des solutés est l’écoulement de
l’électrolyte encore appelé flux électroosmotique. Ce flux, qui règle le déplacement de toutes
les espèces présentes dans l’échantillon, résulte de l’existence d’une double couche électrique
à l’interface solide-liquide du capillaire (Figure II-2).
Paroi du capillaire de silice
- - - - - - - - - - - - - -
Couche statique
→ ions adsorbés
+
Couche mobile
→ ions mobiles
+
+
+
+ +
-
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+ + +
+
-
+
+
+
Electrolyte
Sens du flux électroosmotique
+
Champ électrique
Anode
Cathode
Figure II-2 : Apparition d’un flux électroosmotique dans un électrolyte par suite de la nature de la paroi
interne du capillaire
91
CHAPITRE II
Lors de l’application d’un champ électrique, les cations de la couche mobile se mettent
en mouvement et migrent vers la cathode. Ces ions étant solvatés par des molécules d’eau,
c’est toute la solution qui se dirige vers la cathode, y compris les anions dont le flux
électrophorétique s’oppose au flux électroosmotique. En règle générale, une surface négative
provoque un flux électroosmotique dirigé vers la cathode. En revanche si un surfactant, tel un
ion tétra-alkylammonium, est ajouté pour inverser la polarité de la paroi, le flux
électroosmotique se dirige vers l’anode.
Le flux électroosmotique, de vitesse Veo , est caractérisé par sa mobilité
électroosmotique µ eo . Ce dernier paramètre est défini par la relation suivante :
µ eo =
Veo
L
= Veo
E
U
Equation II-3
La vitesse Veo est déterminée expérimentalement à partir du temps de migration
t marqueur que met un marqueur neutre à usage de traceur pour parcourir la distance effective l
du capillaire :
Veo =
l
t marqueur
Equation II-4
La détermination de Veo permet d’accéder à la mobilité électroosmotique µ eo .
La mobilité électroosmotique µ eo .est reliée au potentiel de surface ζ du capillaire,
appelé également « potentiel Zéta ( ζ ) », selon la relation :
µ eo = −
ε 0 .ε .ζ
η
Equation II-5
avec ε la constante diélectrique du milieu, ε 0 la permittivité du vide et η la viscosité de
l’éluant.
92
CHAPITRE II
Le potentiel ζ est relié à la densité de charges par unité de surface σ et à l’épaisseur
de la double couche δ par la relation :
ζ =
δ .σ
ε 0 .ε
Equation II-6
Le potentiel ζ dépend donc du pH et de la concentration de l’électrolyte.
La combinaison des Equations II-5 et II-6 conduit à l’égalité :
µ eo = −
δ .σ
η
Equation II-7
La mobilité électroosmotique, et de fait la vitesse du flux électroosmotique, sont donc
fonction des conditions expérimentales telles que la nature, le pH, la viscosité et la
concentration de l’éluant. Ces grandeurs dépendent également de la nature physico-chimique
du capillaire et peuvent être modifiées par des traitements de surface12-15 (greffage chimique,
adsorption d’espèces ioniques ou moléculaires).
c) La mobilité apparente
En fonction des deux phénomènes définis précédemment, chaque espèce a donc une
vitesse apparente Vapp de migration qui dépend de la vitesse électrophorétique et de la vitesse
du flux électroosmotique :
Vapp = Vep + Veo
Equation II-8
La vitesse Vapp est déterminée expérimentalement de façon simple à partir du temps de
migration t m que met l’espèce considérée pour parcourir la distance effective l du capillaire :
Vapp =
l
tm
Equation II-9
93
CHAPITRE II
La mobilité électrophorétique apparente µ app , définie par une relation analogue aux
Equations II-1 et II-3, est telle que :
µ app =
Vapp
E
= Vapp
L
U
Equation II-10
En remplaçant Vapp dans cette dernière équation par l’expression donnée dans l’Equation II-9,
l’égalité suivante apparaît :
µ app =
l .L
t m .U
Equation II-11
En combinant la mobilité électroosmotique de l’électrolyte et la mobilité apparente, il
est donc possible de calculer la mobilité électrophorétique vraie des espèces porteuses de
charges. A partir de l’Equation II-8, l’expression de µ ep est donnée par :
µ ep = µ app − µ eo
Equation II-12
ou
µ ep =
l .L  1
1
−

U  t m t marqeur




Equation II-13
I.1.3 - Instrumentation
a) Modes d’injection
Le volume d’échantillon injecté en EC ne doit pas dépasser 1% du volume effectif du
capillaire au risque de voir la résolution diminuer. Ainsi, le volume injecté est relativement
faible avec un ordre de grandeur de quelques nanolitres. Les appareils d’électrophorèse
capillaire automatisés présentent deux modes d’injection de l’échantillon : le mode
hydrodynamique et le mode électrocinétique.
94
CHAPITRE II
Injection hydrodynamique :
L’échantillon est injecté par différence de pression entre l’entrée et la sortie du
capillaire en exerçant une pressurisation sur la solution d’échantillon ou par une aspiration à
l’autre extrémité du capillaire, pendant un temps donné de l’ordre de quelques secondes.
Injection électrocinétique :
L’extrémité du capillaire est plongée dans la solution échantillon et un potentiel donné
est appliqué pendant un certain temps, de l’ordre de quelques secondes, pour faire migrer les
ions dans le capillaire. L’échantillon est alors injecté dans le capillaire par combinaison de
l’électroosmose et de l’électromigration.
Par opposition avec la méthode hydrodynamique, ce procédé provoque une action
discriminante sur les composés présents dans l’échantillon, ce qui conduit à faire l’analyse sur
une fraction dont la composition est différente de celle de l’échantillon initial. Cette méthode
doit donc être optimisée pour chaque type de mélange.
b) Modes de détection
Quatre modes de détection sont utilisés en EC : la détection UV/VIS, la fluorimétrie,
la détection électrochimique et le couplage avec un spectromètre de masse, les deux premiers
procédés étant les plus fréquents.
La détection UV/VIS consiste à mesurer l’intensité de la lumière passant à travers le
capillaire dont une petite zone de revêtement opaque a été éliminée. Le capillaire est placé de
façon à couper le trajet optique allant d’une source au photomultiplicateur (Cf. Figure II-1,
paragraphe I.1.1 de ce chapitre). Ainsi, tout volume mort est éliminé. Cependant, le parcours
optique dans le capillaire est très faible et ceci rend alors peu sensible ce mode de détection si
la solution absorbe peu.
Le mode de détection par fluorescence permet une détection plus sensible si l’on
emploie une source laser très intense. Par contre ce mode nécessite un procédé de pré- ou
postdérivation des analytes qui ne sont pas porteurs d’un fluorophore.
95
CHAPITRE II
I.1.4 – L’électrophorèse capillaire de zone (CZE)
Plusieurs techniques électrophorétiques peuvent être distinguées :
-
l’électrophorèse de zone (CZE)
-
la chromatographie électrocinétique micellaire (MEKC)
-
l’électrophorèse capillaire sur gel (CGE)
-
l’électrophorèse à focalisation électrique (CIEF)
-
l’isotachophorèse (ITP)
-
l’électrochromatographie capillaire (CEC)
L’électrophorèse capillaire de zone (CZE) a été mise au point par Jorgenson et Lukacs
à partir de 198111,16,17. Il s’agit du procédé électrophorétique le plus simple et le plus
couramment utilisé. Les études d’EC qui seront présentées par la suite ont été menées suivant
ce procédé. En CZE, le capillaire est rempli uniquement avec une solution d’électrolyte de pH
et de force ionique donnés et la séparation des analytes est basée sur l’existence d’un flux
électroosmotique auquel s’ajoute un flux électrophorétique propre à chaque analyte.
L’échantillon injecté est schématisé sous la forme d’une zone entourée par la solution
tampon (Figure II-3). A l’application du champ électrique, l’ensemble de la solution est
entraîné vers la cathode du fait du flux électroosmotique, et simultanément, chaque type de
constituant (anionique, cationique ou neutre) contenu dans la zone initiale se sépare selon sa
mobilité électrophorétique propre. Dans le cas idéal, chaque constituant de l’échantillon se
sépare de ses voisins en formant une zone « propre ». L’utilisation de capillaires de silice en
CZE permet donc de séparer des solutés cationiques, neutres et anioniques à l’extrémité
cationique du capillaire.
96
CHAPITRE II
Principe de la séparation en CEZ :
Mélange
(a)
+
A- + N + C+
…..
…..
…..
-
Electrolyte
...
(b)
+
-
...
…
(c)
+
µep
A-
µeo
…..
. N . µeo C+ µeo
µep
…..
Composé
Anionique
…
…
Composé
Neutre
Composé
Cationique
N
C+
A-
Electrophérogramme correspondant :
Signal
C+
0
tm(C+)
N
A-
tm(N)
=
tm(A-)
Temps
tmarqueur
Figure II-3 : Principe de la séparation d’analytes en électrophorèse capillaire de zone (CZE). Position
respective des composés anioniques, neutres, cationiques, au moment de l’injection (a), en cours d’analyse
(b) et en fin d’analyse(c). Présentation de l’électrophérogramme correspondant
97
-
CHAPITRE II
I.2 –Détermination des constantes d’affinité en solution par EC
Depuis ces vingt dernières années, un nombre important de techniques permettant la
détermination des constantes d’affinité a été développé18, la plupart d’entre elles mettant en
jeu une séparation dans des conditions d’équilibre. Parmi ces techniques, l’EC est devenue
une méthode privilégiée de par le fait qu’elle présente de nombreux avantages parmi lesquels
une rapidité d’analyse, une efficacité et une résolution élevées19.
En EC, les interactions sont susceptibles de se produire dans trois phases : une phase
stationnaire, une phase pseudostationnaire ou la phase mobile. Dans le premier cas,
l’interaction d’un soluté peut avoir lieu à la surface de la paroi interne d’un capillaire modifié
ou avec une phase stationnaire présente dans le capillaire. Ceci implique que le ligand
d’affinité soit préalablement immobilisé sur la paroi du capillaire20 ou soit lié au matériau ou
gel implanté dans le capillaire21-23. Le terme de phase pseudostationnaire est utilisé lorsque le
soluté interagit avec des systèmes vésiculaires telles que des micelles, des microémulsions ou
encore des liposomes24 introduits dans la phase mobile. Enfin, l’interaction du soluté peut
avoir lieu avec un ligand libre en solution dans la phase mobile. Seul ce dernier cas sera
approfondi par la suite.
Plusieurs méthodes d’EC permettent de quantifier les interactions moléculaires en
solution25-30 : l’électrophorèse capillaire d’affinité (ACE), la méthode d’Hummel-Dreyer
(HD), l’électrophorèse capillaire d’affinité et de vacance (VACE), la méthode du pic de
vacance (VP) et l’analyse frontale (FA). A l’exception de la VACE, l’ensemble des ces
méthodes avait été développé à l’origine pour la CLHP avant d’être transféré à l’EC31,32. Ces
techniques seront présentées aux paragraphes I.2.2 et I.2.4.
Seuls les modèles les plus simples décrivant l’interaction entre un soluté A et un
ligand soluble L seront exposés. En particulier, l’équilibre d’association entre les deux
espèces sera supposé être de stoechiométrie 1:1, et on fera l’hypothèse que ni le soluté A , ni
le ligand L , ne présentent d’affinité pour la surface du capillaire.
L’interaction mise en jeu peut alors être schématisée par l’équilibre suivant :
A + L ⇔ AL
K AL =
[AL]
[A][L]
Equation II-14
98
CHAPITRE II
où K AL représente la constante d’affinité en solution entre le soluté A et le ligand soluble L .
Les espèces entre crochets [ ] étant en solution dans la phase mobile, leur concentration est
exprimée en mol/L.
Afin de déterminer la constante relative à cet équilibre, une série d’expériences doit
être effectuée en modifiant la concentration d’une des deux espèces (ligand ou soluté), tout en
maintenant constante la concentration de la seconde. Selon la méthode électrophorétique
utilisée (Tableau II-2), la constante d’interaction K AL peut alors être déterminée à partir de
mesures de concentrations ou à partir de mesures de mobilités électrophorétiques.
Méthode
Echantillon
Phase mobile
Paramètre
mesuré
pour
l’estimation de K AL
ACE30
A
Tampon + L
Changement de mobilité de A
L
Tampon + A
Changement de mobilité de L
Tampon
Tampon + A + L
Changement de mobilité de A
ou
VACE33
(ou L) (pics vacants)
HD25
Tampon + A
Tampon + L
ou
VP25
Aire
du
pic
de
vacance
correspondant à [AL]
Tampon + L
Tampon + A
Tampon
Tampon + A + L
Aire
du
pic
de
vacance
correspondant à [A] (ou [L])
FA
30
Tampon + A + L
Tampon
Hauteur
du
plateau
34
FACCE
Tampon + A + L
Tampon
Hauteur
du
plateau
Tableau II-2 : Méthodes d’EC et procédés expérimentaux correspondants permettant la détermination
des constantes d’interaction en solution. A=soluté, L=ligand, [A]=concentration en soluté libre,
[L]=concentration en ligand libre et [AL]=concentration en soluté lié
99
CHAPITRE II
I.2.1 - Détermination des constantes d’affinité par des mesures de
concentrations ; considérations théoriques
Le rappel théorique suivant considère une étude d’affinité effectuée en faisant varier la
concentration en ligand et en maintenant fixe la concentration du soluté.
Rappelons l’équilibre en solution entre le soluté A et le ligand soluble L :
A + L ⇔ AL
K AL =
[AL]
[A][L]
Equation II-15
Dans l’hypothèse où cet équilibre s’établit très rapidement, le rapport r du nombre de
molécules de soluté lié sur le nombre total de molécules de soluté est défini par l’égalité
suivante18,25,26 :
r=
[AL]
[A]Tot
=
[L].K AL
1 + [L ].K AL
Equation II-16
avec [ A]Tot la concentration totale en soluté.
La constante d’interaction en solution K AL peut être déterminée expérimentalement à
partir de l’Equation II-16 par régression non linéaire du tracé expérimental portant r en
fonction de [L] 25,26.
Ce tracé nécessite de connaître les concentrations [L ] et [ AL ] . Or, la concentration
totale en ligand [L ]Tot dans l’électrolyte est reliée aux espèces libres par l’égalité suivante :
[L]Tot = [L] + [AL]
Equation II-17
[L]Tot
étant connue, il suffit alors de déterminer expérimentalement l’une des deux
concentrations [L ] ou [ AL ] . Les méthodes expérimentales d’Hummel-Dreyer (HD), du pic de
vacance (VP), d’analyse frontale (FA) et d’analyse frontale en continu (FACCE), basées sur
100
CHAPITRE II
la détermination des concentrations [L ] ou [ AL ] , seront présentées par la suite au paragraphe
I.2.2.
Une seconde méthode permet également d’accéder à la constante d’affinité. En effet,
la concentration [ A]Tot est définie par la relation suivante :
[A]Tot = [A] + [AL]
Equation II-18
Ainsi, la combinaison de l’expression de la constante d’affinité (Equation II-15) avec
l’Equation II-18 permet de linéariser l’Equation II-15 :
[AL] = − K .[AL] + K .[A]
Tot
AL
AL
[L]
Equation II-19
soit :
r
= − K AL .r + K AL
[L]
Equation II-20
L’Equation II-20 porte le nom de forme x-réciproque, ou encore représentation de Scatchard
dans le cas particulier d’études d’interactions impliquant des protéines. Le rapport
r
variant
[L]
linéairement avec le paramètre r , la constante d’interaction en solution K AL peut-être
déterminée expérimentalement à partir de la pente de cette relation linéaire25,26. Une distorsion
à la linéarité peut parfois être observée. Celle-ci suggère alors une déviation par rapport au
modèle théorique du fait, par exemple, d’une stoechiométrie d’ordre supérieur à un équilibre
1:1, avec notamment dans le cas particulier de l’étude de protéines, la présence de sites
d’interactions multiples sur la biomolécule25,26,30.
101
CHAPITRE II
concentrations ; les méthodes expérimentales
Les méthodes expérimentales d’Hummel-Dreyer (HD), du pic de vacance (VP),
d’analyse frontale (FA) et d’analyse frontale en continu (FACCE) ont été souvent décrites
dans la littérature dans le cas d’interactions impliquant des protéines18,25-27,30,34-36 et
notamment au travers de l’étude du couple albumine/warfarine18,25,26. Ainsi, certains schémas
d’illustration présentés par la suite ont été tirés de travaux sur ce dernier couple. Néanmoins,
il est important de noter que ces méthodes peuvent être appliquées à d’autres types de couple
soluté-ligand29.
a) Méthode d’Hummel-Dreyer (HD)
Dans la méthode d’Hummel-Dreyer (HD) le capillaire est préalablement rempli avec
un tampon contenant le ligand L avant d’injecter un faible volume de tampon contenant le
soluté A. Une tension de séparation est ensuite appliquée au système. Une étude d’affinité par
HD s’effectue donc en injectant une quantité constante de soluté tout en faisant varier la
concentration du ligand soluble à l’intérieur du capillaire. Le procédé inverse peut également
être utilisé, autrement dit, une quantité constante de ligand peut être injectée dans un capillaire
rempli d’un tampon de concentrations variables en soluté.
Afin d’illustrer la migration de l’échantillon au sein du capillaire lors de l’application
de la tension, le profil de migration obtenu dans le cas particulier du couple ASB (albumine
du sérum bovin)/warfarine 25, est donné sur la Figure II-4. La protéine ASB représente ici le
soluté A et la warfarine correspond au ligand soluble L. Le profil type d’un
électrophérogramme obtenu dans ces conditions est également reporté sur la Figure II-4.
102
CHAPITRE II
Principe de la séparation par HD :
Injection de tampon
contenant A
(a)
+
-
(b)
+
-
(c)
+
(1) AL + A
(2) Défaut de L
ASB
= soluté A
Défaut de
Warfarine
= défaut de L
Warfarine
= ligand L
Complexe ASB / Warfarine + ASB
= Complexe AL + Soluté A
Densité optique
(unité d’absorbance)
(1) AL + A
Artefact
(2) Défaut de L
Temps
Figure II-4 : Représentation schématique de la méthode d’Hummel-Dreyer (HD) dans le cas particulier
du couple ASB / warfarine25 et présentation d’un électrophérogramme type correspondant26.
Le profil de séparation illustré sur la Figure II-4 suppose que les mobilités
électrophorétiques du soluté A et du complexe AL sont supérieures à celle du ligand libre L.
103
CHAPITRE II
D’autre part, dans le cas particulier exposé, la mobilité du soluté A (protéine ASB) est
similaire à la mobilité du complexe AL. Sur la Figure II-4, les pics sont représentés par des
signaux idéaux de forme rectangulaire mais de par le phénomène de dispersion des composés
au sein du capillaire, les signaux apparaissent en pratique plus ou moins sous la forme de pics
Gaussiens. L’électrophérogramme de la Figure II-4 présente successivement un pic positif et
un pic négatif. Le pic positif correspond à la sortie du complexe AL et du soluté A et le pic
négatif traduit un défaut local de concentration en ligand26. L’aire de ce dernier pic varie
linéairement avec la concentration
[AL] de
ligand lié. Ainsi, à l’aide d’une courbe de
calibration interne ou externe, la concentration [ AL] de ligand lié dans chacun des tampons
d’analyse peut être déterminée26. Connaissant la concentration totale [L]Tot en ligand du
tampon, la concentration [L] en ligand libre peut ensuite être calculée (Cf. Equation II-17).
Ceci permet alors d’établir le tracé expérimental relatif à l’Equation II-16 ou à l’Equation II20 et de déterminer la constante d’affinité (Cf. Paragraphe I.2.1 de ce chapitre).
b) Méthode du pic de vacance (VP)
Dans la méthode du pic de vacance (VP), le capillaire est rempli avec un tampon
contenant à la fois le soluté A et le ligand L. Un faible volume de tampon pur, ne contenant
aucune des espèces A ou L, est ensuite injecté dans le capillaire, puis une tension de
séparation est appliquée au système. Une étude d’affinité par VP s’effectue en maintenant
constante la concentration du soluté ou du ligand à l’intérieur du capillaire et en faisant varier
la concentration de la seconde espèce.
La migration de l’échantillon de tampon au sein du capillaire est décrite sur Figure II-5
dans le cas particulier du couple ASB/warfarine25 , un électrophérogramme type y est
également reporté.
104
CHAPITRE II
Principe de la séparation par VP :
Injection de tampon
(a)
+
-
(b)
+
-
(c)
+
-
(1) Défaut de AL + A
(2) Défaut de L
Tampon
Défaut de
Warfarine
= défaut de L
Défaut de complexe
ASB / Warfarine et de ASB
= défaut de AL + A
Complexe ASB / Warfarine
= complexe AL
Densité optique
Artefact
(1) Défaut de AL + A
(2) Défaut de L
Temps
Figure II-5 : Représentation schématique de la méthode du pic de vacance (VP) dans le cas particulier du
couple ASB / warfarine25 et présentation d’un électrophérogramme type correspondant26. Ce profil de
séparation suppose que (i) les mobilités électrophorétiques du soluté A et du complexe AL sont
supérieures à celle du ligand libre L, (ii) la mobilité du soluté A est similaire à celle du complexe AL.
105
CHAPITRE II
L’électrophérogramme de la Figure II-5 présente deux pics négatifs. Le premier pic
résulte d’un défaut local de concentration en complexe AL et en soluté libre A au sein du
capillaire et le second est provoqué par un défaut de concentration en ligand libre L26,27.
L’aire du second signal varie linéairement avec la concentration [L ] de ligand libre dans le
tampon. A l’aide d’une courbe de calibration interne, la concentration [L ] contenue dans
chacun des tampons étudiés peut être déterminée26. La concentration [ AL ] des différents
tampons peut ensuite être calculée (Cf. Equation II-17) et les Equations II-16 ou II-20 peuvent
être appliquées pour déterminer la constante d’affinité.
En HD et en VP, l’équilibre d’interaction soluté/ligand s’établit dans le capillaire au
cours de la séparation. Ainsi, dans le cas d’une cinétique d’association lente par rapport à la
durée de l’analyse, un manque de reproductibilité des signaux peut être observé34.
L’utilisation de ces techniques pour des études d’affinité est alors déconseillée et d’autres
procédés tels que la FA et la FACCE peuvent être recommandés.
c) Méthode d’analyse frontale (FA)
En analyse frontale (FA), le soluté A et le ligand L sont mis à équilibrer dans le
tampon d’analyse. Une fois la solution équilibrée, celle-ci est injectée dans le capillaire
préalablement rempli de tampon pur. La quantité d’échantillon injectée en FA est plus
importante comparativement à l’HD et la VP, avec un volume généralement compris entre
100 et 200 nL. Une tension est ensuite appliquée aux bornes du capillaire afin de séparer les
espèces en solution. Une étude d’affinité par FA s’effectue donc en fixant la concentration du
soluté ou du ligand de la solution échantillon injectée et en faisant varier la concentration de
la seconde espèce.
Le principe de la séparation des composés par FA et un électrophérogramme type
obtenu dans pour le cas particulier du couple ASB/warfarine sont présentés sur la Figure II-6.
106
CHAPITRE II
Principe de la séparation par FA :
Injection de tampon
contenant A + L
(a)
+
-
(b)
+
-
(c)
+
(1) AL + A
(2) L
Tampon
Warfarine
= ligand L
Complexe ASB / Warfarine + ASB
= complexe AL + soluté A
Densité optique
(1) AL + A
(2) L
Temps
Figure II-6 : Représentation schématique de la méthode d’analyse frontale (FA) dans le cas particulier du
couple ASB / warfarine et présentation d’un électrophérogramme type correspondant26. Ce profil de
séparation suppose que (i) les mobilités électrophorétiques du soluté A et du complexe AL sont
supérieures à celle du ligand libre L, (ii) la mobilité du soluté A est similaire à celle du complexe AL.
107
CHAPITRE II
Du fait de l’importante quantité d’échantillon injectée, les signaux obtenus en FA sont
larges et présentent un plateau. L’électrophérogramme de la Figure II-6 présente deux
plateaux distincts : le premier plateau traduit la sortie du complexe AL et du soluté libre A et
le second reflète la sortie du ligand L26. La hauteur de ce dernier plateau variant linéairement
avec la quantité de ligand libre L, il est alors possible, à partir d’une mesure de calibration
préalablement effectuée, de déterminer la concentration [L ] de ligand libre de chacun des
échantillons injectés26. Ceci permet alors de déterminer la constante d’affinité (Cf. Equations
II-16 ou II-20, Paragraphe I.2.1 de ce chapitre).
En FA, la réaction d’association entre le soluté et le ligand est effectuée en dehors du
capillaire par incubation préalable des deux composés dans le tampon d’analyse. Ainsi, cette
technique peut uniquement être utilisée pour des couples soluté/ligand dont la vitesse de
dissociation du complexe est relativement faible comparativement à la durée de l’analyse.
D’autre part, d’après McDonnell et coll.37 la FA permettrait d’estimer uniquement des
constantes d’interaction comprise entre 103 et 108 M-1. Pour des interactions faibles avec des
constantes inférieures à 103 M-1, la concentration de ligand lié AL est très faible et la hauteur
correspondante à la zone frontale du ligand libre L est trop proche de la celle obtenue pour la
mesure de calibration (mesure effectuée par injection du ligand seul dans le capillaire). Dans
ce cas, l’utilisation de l’ACE (Cf. Paragraphe I.2.4.a de ce chapitre) serait préférable pour
l’estimation de la constante. D’autre part, lorsque la constante est supérieure à 108 M-1, la
concentration de ligand libre L serait trop faible par rapport à la concentration de ligand lié
AL et la hauteur correspondante à la zone frontale du ligand libre L serait trop faible pour
conduire à des mesures précises.
La FA peut également être utilisée pour séparer des énantiomères38,39 et pour
déterminer simultanément les constantes d’affinité de deux énantiomères présents dans un
mélange racémique.
d) Méthode de l’analyse frontale en continu (FACCE)
Récemment, une nouvelle méthode d’EC, l’électrophorèse capillaire d’analyse frontale
en continu (FACCE) a été développée par Gao et coll.34. Pour introduire cette nouvelle
technique, les auteurs se sont intéressés à l’interaction entre un polyanion, le poly(styrène
sulfonate), défini comme le soluté, et la β-lactoglobuline considérée comme le ligand L. Les
108
CHAPITRE II
schémas d’illustration présentés par la suite sont relatifs au cas particulier du couple
poly(styrène sulfonate)/ β-lactoglobuline.
En FACCE, le capillaire est tout d’abord rempli avec le tampon pur, puis l’extrémité
d’entrée du capillaire est plongée dans l’échantillon de tampon contenant un mélange pré
équilibré de soluté et de ligand. Une tension est ensuite appliquée aux bornes du capillaire
afin d’introduire la solution échantillon dans le capillaire (mode électrocinétique).
L’échantillon est introduit en continu dans le capillaire durant l’analyse et le processus de
séparation progresse en même temps. L’étude d’affinité en FACCE s’effectue comme en FA
en maintenant constante la concentration du soluté ou du ligand et en faisant varier la
concentration du second composé.
Le principe de la séparation des composés en FACCE et un électrophérogramme type
obtenu pour le cas particulier du couple poly(styrène sulfonate)/ β-lactoglobuline sont
présentés sur la Figure II-7.
Principe de la séparation par FACCE :
Injection de tampon
contenant A + L
(a)
+
-
(b)
+
-
(c)
+
AL + L
L
Tampon
Complexe poly(styrène sulfonate) / β -lactoglobuline
+ β -lactoglobuline
= complexe AL + ligand L
β -lactoglobuline
= ligand L
109
CHAPITRE II
Densité optique
(2) AL + A
(1) L
Temps
Figure II-7 : Représentation schématique de la méthode d’analyse frontale en continu (FACCE) dans le
cas de l’étude de l’interaction poly(styrène sulfonate)/ β -lactoglobuline et présentation d’un
électrophérogramme type correspondant34
Le schéma de la Figure II-7 suppose que la mobilité électrophorétique du ligand L est
supérieure à celle du complexe AL. D’autre part, les auteurs ont considéré que la
concentration [ A] en soluté libre est nulle. L’électrophérogramme de la Figure II-7 présente
deux plateaux, le premier correspondant au ligand libre L et le second au complexe AL
additionné du ligand libre L. La hauteur du premier plateau étant liée à la quantité de ligand
libre L, il est alors possible, à partir d’une mesure de calibration préalablement effectuée, de
déterminer la concentration
[L]
de ligand libre contenu dans chacun des échantillons
injectés34. Ceci permet ensuite de déterminer la constante d’affinité (Cf. Equations II-16 ou II20, Paragraphe I.2.1 de ce chapitre).
Gao et coll.34 ont comparé, au travers de l’étude du système poly(styrène sulfonate)/ βlactoglobuline, les méthodes classiques d’HD et de FA à la méthode plus récente de FACCE.
Cette dernière présente le désavantage de consommer une quantité plus importante
d’échantillon par rapport aux autres méthodes d’EC. Néanmoins, de par cet important volume
d’injection, la limite de détection en FACCE se trouve améliorée en comparaison avec la HD
et la FA. D’autre part, l’incubation préalable du soluté et du ligand dans le tampon supprime
le manque de reproductibilité parfois rencontré en HD du fait d’une cinétique d’association
110
CHAPITRE II
lente. Enfin, le signal obtenu en FACCE est plus net que celui issu d’une étude classique de
FA ce qui permet une détermination plus exacte des concentrations des espèces.
mobilités ; considérations théoriques
La méthode la plus courante utilisée pour déterminer les constantes d’interaction en
EC implique de mesurer l’évolution de la mobilité électrophorétique d’un soluté lors de
l’utilisation de tampons à différentes concentrations en ligand soluble. L’utilisation de cette
méthode implique que plusieurs conditions soient respectées :
(i) le soluté doit subir un changement de mobilité électrophorétique au cours de sa
complexation avec le ligand ; ceci suppose que soit le soluté soit le ligand soit chargé dans les
conditions expérimentales appliquées. D’autre part, des différences significatives entre la
mobilité du soluté sous forme libre et sous forme complexée sont nécessaires afin d’obtenir
les meilleurs résultats. Dans le cas où le soluté subirait un trop faible changement de mobilité
au cours de son association, l’utilisation de cette méthode s’avérerait impossible,
(ii) l’équilibre doit être atteint rapidement afin qu’il s’établisse dans un temps bien
inférieur à celui de l’analyse,
(iii) la fraction en complexe soluté-ligand doit être comprise entre 0,2 et 0,8 (pour un
équilibre de stoechiométrie 1:1).
Le procédé inverse peut également être utilisé. Dans ce cas, le ligand est introduit dans
le capillaire contenant une concentration variable de soluté et l’évolution de la mobilité
électrophorétique du ligand dans les différents tampons est alors mesurée.
La modélisation mathématique des isothermes d’association obtenues en EC dans le
cas d’une stoechiométrie 1:1 a été discutée par de nombreux auteurs23,40-45. Même si ces
modélisations sont légèrement différentes les unes des autres, elles sont fondamentalement
équivalentes41.
111
CHAPITRE II
Soit l’équilibre d’association en solution entre le soluté A et le ligand soluble L
considéré dans l’ensemble de ces modèles :
A + L ⇔ AL
K AL =
[AL]
[A][L]
Equation II-21
Dans le cas idéal, la variation de mobilité du soluté observée lorsque le ligand est
introduit dans le système est provoquée uniquement par l’association du soluté avec le ligand.
Si tel est le cas, la mobilité électrophorétique du soluté déterminée expérimentalement, dans
une solution contenant du ligand, est une moyenne pondérée des mobilités du soluté à l’état
libre et à l’état complexé :
µ i = χ f .µ f + χ c .µ c
Equation II-22
où µi est la mobilité électrophorétique déterminée expérimentalement, µ f est la mobilité
électrophorétique du soluté libre, µc est la mobilité électrophorétique du complexe solutéligand et χ est la fraction molaire du soluté à l’état libre ( χ f ) ou à l’état complexé ( χ c ).
Les mobilités électrophorétiques mentionnées précédemment sont dues uniquement à
la charge des molécules et n’incluent pas de contribution du flux électroosmotique.
Expérimentalement, ces mobilités sont donc déterminées en retranchant la mobilité
électroosmotique aux mobilités apparentes mesurées (Cf. Equation II-12, paragraphe I.1.2.c
de ce chapitre).
L’Equation II-22 peut être exprimée en terme de concentrations à l’équilibre du soluté
libre [ A] et du soluté complexé [ AL ] :
µi =
[A] µ + [AL] µ
[A] + [AL] f [A] + [AL] c
Equation II-23
112
CHAPITRE II
La combinaison de l’expression de la constante d’affinité (Equation II-21) avec
l’Equation
II-23
permet
de
relier
la
mobilité
électrophorétique
déterminée
µi
expérimentalement à la concentration de ligand libre [L ] dans l’électrolyte par les deux
expressions suivantes :
K AL .[L] =
µ f − µi
µi − µ c
Equation II-24
et
µi =
K AL .[L ]
1
µf +
µc
1 + K AL .[L]
1 + K AL .[L]
( ou µ i =
µ f + µ c .K AL .[L]
1 + K AL .[L]
)
Equation II-25
Le tracé expérimental des courbes relatives aux Equations II-24 et II-25 nécessite de
connaître la concentration de ligand libre [L ] dans la phase mobile. Or cette concentration ne
peut être mesurée directement. Néanmoins, la concentration totale en ligand soluble [L ]Tot est
connue, et définie par la relation suivante :
[L]Tot = [L] + [AL]
Equation II-26
Ainsi, dans le cas où la concentration totale de ligand soluble [L ]Tot utilisée est nettement
supérieure à la concentration totale de soluté [ A]Tot injectée, l’approximation [L ] ≈ [L ]Tot peut
être effectuée. Dans ces conditions, la constante d’interaction en solution K AL peut être
déterminée expérimentalement à partir de l’Equation II-24 ou de l’Equation II-25.
a) Détermination de la constante d’affinité à partir de l’Equation II-24
L’utilisation
de
l’Equation
II-24
nécessite
de
connaître
les
mobilités
électrophorétiques de l’espèce libre ( µ f ) et du complexe ( µc ). Ces paramètres doivent donc
être mesurés indépendamment. La mesure de µ f s’effectue simplement en injectant le soluté
dans un milieu ne contenant pas de ligand. La mesure de µc peut par contre s’avérer plus
délicate. La mobilité électrophorétique µc du complexe peut sous certaines conditions être
supposée égale à la mobilité de l’espèce chargée libre (soluté ou ligand selon le cas). Cette
113
CHAPITRE II
approximation suppose que la formation du complexe n’entraîne pas une variation de masse
importante de l’espèce chargée. Dans la plupart des cas, la détermination de la valeur exacte
de µc reste impossible. La constante d’interaction en solution K AL peut alors être déterminée
expérimentalement à partir de l’Equation II-25.
D’autre part, l’utilisation de l’Equation II-24 peut conduire à une valeur de la
constante erronée si celle-ci est déterminée à partir d’une mesure unique de µ i , pour laquelle
par ailleurs la concentration en ligand peut être mal choisie (Cf. Paragraphe I.2.3.d de ce
chapitre). Il est alors préférable d’effectuer une série de points à différentes concentrations en
ligand pour tracer la représentation portant
représentation
linéaire
étant
obtenue,
µ f − µi
en fonction de la concentration [L ] . Une
µi − µc
la
constante
K AL
est
alors
déterminée
expérimentalement à partir de la pente de la représentation46.
b) Détermination de la constante d’affinité à partir de l’Equation II-25
La constante K AL , mais aussi les mobilités électrophorétiques du soluté libre ( µ f ) et
du complexe ( µc ) peuvent être déterminées par régression non linéaire du tracé expérimental
portant µ i en fonction de [L ] 47. Plus précisément, certains logiciels tels qu’Origin permettent
d’ajuster le tracé expérimental portant µ i en fonction de [L] par une courbe à trois inconnues
P1 , P2 et P3 d’équation :
µi =
P1
P .[L]
+ 2
1 + P3 .[L ] 1 + P3 .[L ]
Equation II-27
Les paramètres P1 , P2 et P3 déterminés pas le logiciel conduisent alors aux paramètres K AL ,
µ f et µc à l’aide des égalités suivantes :
K AL = P3 ; µ f = P1 ; et µ c =
P2
P3
Equation II-28
114
CHAPITRE II
Par ailleurs, un simple réarrangement de l’Equation II-25 conduit à l’isotherme
d’association en EC :
(µ
i
− µf )=
(µ
c
− µ f ) K AL .[L]
1 + K AL .[L]
Equation II-29
La constante d’affinité K AL peut également être déterminée à partir de cette isotherme47 mais
l’utilisation de cette méthode nécessite de déterminer indépendamment la mobilité µ f du
soluté libre. Une régression non linéaire du tracé expérimental portant (µi − µ f ) en fonction
de [L ] par une courbe à deux inconnues P1 et P2 et d’équation :
(µ
i
− µf )=
P1 .[L ]
1 + P2 .[L ]
Equation II-30
permet d’accéder aux paramètres K AL et (µc − µ f ) grâce aux relations suivantes :
K AL = P2 et (µc − µ f ) =
P1
P2
Equation II-31
La mobilité du complexe ( µc ) peut ensuite être calculée à l’aide de la valeur de la mobilité de
l’espèce libre ( µ i ) indépendamment mesurée.
c) Linéarisation des isothermes
L’isotherme définie par l’Equation II-29 peut être linéarisée suivant trois formes
différentes (Equations II-32 à II-34), chacune d’entre elles permettant la détermination
expérimentale de la constante K AL :
115
CHAPITRE II
1
1
1
1
=
+
(µ i − µ f ) (µ c − µ f ) K AL [L] (µ c − µ f
)
Equation II-32
(µ
[L]
i
−µf
)
=
1
(µ c − µ f
)
[L] +
(µ
1
c
− µ f ) K AL
Equation II-33
(µ
i
−µf
[L]
)
= − K AL (µ i − µ f ) + K AL (µ c − µ f
)
Equation II-34
Les Equations II-32, II-33 et II-34 portent respectivement le nom de forme double
réciproque, y-réciproque et x-réciproque48. Historiquement, ces formes ont été les méthodes
privilégiées pour la détermination des constantes et elles sont apparues dans la littérature sous
différents noms46. La double réciproque est connue sous le nom de représentation de BenesiHildebrand en spectrophotométrie et représentation de Lineweaver-Burk dans les études
enzymatiques. La forme x-réciproque est appelée représentation de Eadie-Hofstee pour les
études de cinétiques enzymatiques et représentation de Scatchard pour les études
d’interactions de protéines.
La constante d’interaction en solution ( K AL ) ainsi que la différence de mobilité
(µ
c
− µ f ) peuvent être déterminées expérimentalement à partir de la pente et de l’ordonnée à
l’origine des relations linéaires précédentes (Tableau II-3). La mobilité du complexe ( µc )
peut ensuite être calculée à l’aide de la valeur de la mobilité de l’espèce libre ( µ f )
indépendamment mesurée.
Alors que les trois relations définies par les Equations II-32 à II-34 semblent être
identiques puisque l’une d’entre elles suffit à obtenir les deux autres formes, ces méthodes de
régression ne sont pas nécessairement équivalentes du fait de la différence d’incertitudes
relatives sur les variables (µ i − µ f ) et [L ] avant et après linéarisation41,48-50. L’incertitude
relative sur
[L]
(avec
[L]
assimilée à
[L]Tot )
116
peut être facilement contrôlée par
CHAPITRE II
l’expérimentateur par contre le paramètre (µi − µ f ) est soumis à plus ou moins d’erreurs
expérimentales.
L’utilisation des relations linéaires (Equations II-32 à II-34) peut conduire à des
constantes et autres paramètres identiques à ceux obtenus par régression non linéaire de
l’isotherme d’association (Equation II-29) à condition que les données expérimentales soient
correctement réajustées pour la régression linéaire. Lorsque les données ne sont pas
pondérées, les formes y-réciproque et double réciproque présentant la variable (µ i − µ f ) au
dénominateur conduisent à donner du poids aux points de plus faibles valeurs de (µi − µ f ) qui
correspondent aux mesures les plus incertaines41,48,50,51. Par ailleurs, le tracé de la forme yréciproque est plus fiable que celui de la forme x-réciproque lorsque l’erreur sur le paramètre
(µ
i
− µ f ) est faible, par contre l’inverse se produit si l’erreur sur (µi − µ f ) est élevée. Enfin,
la forme x-réciproque présente l’avantage d’accentuer les déviations à la linéarité51
50
qui
pourraient traduire par exemple la présence d’une stoechiométrie d’ordre 2. A l’inverse, la
forme double réciproque est de loin la moins sûre des représentations car elle tend à masquer
ces déviations au modèle théorique48,50. Ainsi, l’utilisation de la forme x-réciproque doit être
privilégiée pour vérifier que le processus étudié suit bien une stoechiométrie de type 1 :1.
Les différentes méthodes permettant de déterminer la constante K AL et les mobilités
électrophorétique du soluté libre ( µ f ) et du complexe ( µc ) sont résumées dans le Tableau II3. La méthode de régression non linéaire à partir de l’Equation II-25 est la méthode
privilégiée pour la détermination des constantes puisqu’elle ne nécessite pas de connaître
indépendamment les mobilités µ f et µc . Cependant la confrontation des résultats issus des
différentes approches reste intéressante.
117
CHAPITRE II
Equation
Courbe établie
II-24
µ f − µi
= f ( [L] )
µi − µc
µc
pente
i
− µ f ) = f ( [L] )
K AL , µc et µ f
doit être déterminé indépendamment
⇒ détermination de
réciproque
K AL et µc
1
ordonnée à l' origine
1
1
= f(
(µ i − µ f ) [L] )
Double
doivent être
Régression non linéaire
d’association
II-32
)
déterminés
⇒ détermination de
µf
(µ
µf
−µf
II-29
Isotherme
et
c
indépendamment
µ i = f ( [L ] )
II-25
(µ
K AL
pente
µf
doit être déterminé
indépendamment afin de
calculer
(µ
Y-réciproque
1
pente
[L]
II-33
i
µc
−µf
pente
) = f ( [L] )
µf
calculer
II-34
X-réciproque
(µ
i
−µf
[L]
)
µc
pente
− pente
= f ( (µ i − µ f ) )
µf
calculer
µc
Tableau II-3 : Résumé des différentes méthodes basées sur la variation du flux électrophorétique,
permettant la détermination de la constante d’interaction en solution associée à un équilibre de type 1:1.
118
CHAPITRE II
d) Sources d’erreurs
L’application des modèles théoriques pour la détermination des constantes
d’interaction en EC nécessite que certaines conditions expérimentales, relatives à la
concentration des espèces mises en jeu, soient vérifiées. Par ailleurs, l’utilisation d’une
méthode basée sur la variation de la mobilité du soluté requiert parfois de s’affranchir de
phénomènes secondaires, autres que l’association des espèces, qui modifient le flux du soluté.
Conditions relatives à la concentration des espèces en solution :
Dans les Equations II-24, II-25, II-29, II-32 à II-34, [L ] représente la concentration à
l’équilibre de ligand libre dans la phase mobile. Cette concentration peut être assimilée à la
concentration totale de ligand soluble ajouté au tampon ( [L] ≈ [L]Tot ) dans deux cas : (i) si la
concentration de soluté [ A]Tot injectée est nettement inférieure à la concentration [L ]Tot du
ligand ou (ii) si la constante d’affinité est faible47. Si ces conditions ne sont pas vérifiées, la
concentration [L ] peut alors être calculée par plusieurs méthodes dont l’itération ou le
développement des séries de Taylor48.
D’autre part, d’après Lynen et coll.52, il est important que la concentration de soluté
injectée soit largement inférieure à la concentration totale de ligand dans la phase mobile. En
effet, si la concentration du soluté dans l’échantillon est supérieure ou égale à la concentration
du ligand, l’ensemble des molécules de ligand disponibles est alors saturé par le soluté. Par
conséquent, une très faible variation de mobilité électrophorétique est observée et peut
conduire à surestimer la valeur de la constante de dissociation, et par suite à sous estimer la
constante d’affinité K AL . Expérimentalement, l’utilisation d’une concentration en soluté trop
élevée est difficilement décelable par le tracé de l’isotherme d’association (Equation II-29).
Par contre, ce problème apparaît très visiblement sur les régressions linéaires (Equations II-32
à II-34) par une forte déviation à la linéarité52. Il est important de souligner que ce phénomène
ne peut être détecté que si une gamme suffisante de concentrations en ligand a été étudiée.
D’après Deranleau53, la détermination de la constante d’affinité est plus précise si les
analyses sont effectuées sur un domaine de concentrations en ligand tel que la fraction f de
complexe soluté-ligand (Equation II-35) soit comprise entre 0,2 et 0,8 (pour une
119
CHAPITRE II
stoechiométrie d’ordre 1:1). En effet, lorsque la fraction f est inférieure à 0,2 ou supérieure à
0,8, les changements de mobilité résultant de l’association sont faibles comparativement à
l’erreur relative sur les mesures.
Expérimentalement, la fraction f de complexe soluté-ligand est calculée par la relation
suivante :
f =
[AL] = K AL .[L]
[A] + [AL] 1 + K AL .[L]
Equation II-35
Alors que la détermination expérimentale de la constante K AL nécessite de travailler
sur une gamme de f telle que 0,2 < f < 0,8, l’Equation II-35 montre que réciproquement la
détermination de f nécessite de connaître K AL . Expérimentalement, le procédé suivant peut
donc être suivi : (i) l’isotherme d’association est établie sur une large gamme de
concentrations en ligand ; le choix de cette gamme peut être plus ou moins aléatoire selon
qu’un ordre de grandeur de la constante est connu ou pas, (ii) une première estimation de la
constante K AL est effectuée par régression non linéaire de l’isotherme d’association (iii) la
fraction f de complexe soluté-ligand est calculée sur la gamme de concentration en ligand
étudiée à l’aide de la valeur de K AL préalablement déterminée, (iv) si la fraction f ainsi
calculée ne répond pas à la condition 0,2 < f < 0,8, une nouvelle gamme de concentrations en
ligand est estimée afin que cette condition puisse être vérifiée, (v) l’isotherme d’association
est établie sur cette nouvelle gamme de concentrations en ligand et (vi) la constante K AL est
déterminée par régression non linéaire de l’isotherme sur cette nouvelle gamme. La constante
K AL ainsi déterminée pouvant être assez différente de la première estimation, un procédé
itératif reprenant les étapes (i) à (vi) peut être nécessaire.
Par ailleurs, l’isotherme d’association doit être établie sur un large domaine d’environ
60 à 75% de son étendue48,53,54 afin d’être en mesure de détecter des distorsions par rapport au
modèle théorique appliqué. Les variations à la linéarité observées sur les représentations
relatives aux Equations II-32 à II-34 peuvent suggérer une stoechiométrie différente d’un
équilibre 1 :154,55. Dans ce cas, le profil des représentations obtenues peut mettre en évidence
des effets coopératifs, non-coopératifs ou anti-coopératifs54,55.
120
CHAPITRE II
L’étude d’un processus d’association doit donc être effectuée sur une gamme de
concentrations en ligand (i) large afin de s’assurer de la validité du modèle appliqué et (ii)
telle que la fraction f de complexe soluté-ligand soit comprise entre 0,2 et 0,8 (pour une
stoechiométrie d’ordre 1:1) pour déterminer la constante d’affinité avec exactitude.
Phénomènes secondaires pouvant influer sur la mobilité électrophorétique du soluté :
Afin de pouvoir déterminer la constante d’interaction par l’étude de la variation de la
mobilité électrophorétique du soluté lors de l’addition de ligand, le changement de mobilité
observé doit être exclusivement dû à l’association du soluté avec le ligand. Or de nombreux
autres facteurs peuvent modifier la mobilité électrophorétique déterminée expérimentalement.
Tout d’abord, la fluctuation de la mobilité électroosmotique peut modifier la mobilité
électrophorétique mesurée expérimentalement. Le conditionnement de la surface du capillaire
est donc une étape importante pour obtenir une mobilité électroosmotique reproductible. Afin
de s’affranchir d’une éventuelle variation du flux électroosmotique au cours d’une série
d’analyses, ce flux peut être mesuré à chaque étape à l’aide d’un marqueur du flux
électroosmotique (thiourée, DMSO, oxyde de mésityle) ajouté à l’échantillon.
D’autre part, certains composés tels que les protéines, les peptides et les composés
basiques, peuvent s’adsorber sur la paroi interne du capillaire. Ce phénomène provoque d’une
part l’élargissement des pics et d’autre part la modification des mobilités électrophorétiques
déterminées expérimentalement. Ainsi, le changement de mobilité électrophorétique engendré
par la variation de la concentration en ligand ne peut être directement relié à la constante
d’interaction. Afin d’éviter cette adsorption non spécifique, la force ionique du milieu et le pH
du tampon d’analyse doivent être choisis de façon adéquate. Une autre possibilité consiste à
utiliser des capillaires modifiés13-15,56. Récemment, les différentes méthodes de modification
chimique des capillaires de silice (méthode dynamique par adsorption ou permanente par
greffage) par de nombreux composés de recouvrement (polymères ou copolymères neutres ou
ioniques, polymères possédant des propriétés de tensioactifs, biopolymères) ont été résumées
par Horvath et Dolnik13 et Millot et Vidal-Madjar57. L’utilisation de ce type de méthodes
permet de modifier et de contrôler le flux électroosmotique12-15,56, voire de l’éliminer dans le
cas particulier de capillaires neutres12,13. Ainsi tous les problèmes évoqués précédemment
associés à l’existence du flux électroosmotique sont par là même éliminés.
121
CHAPITRE II
Par ailleurs, l’augmentation de la concentration en ligand dans l’électrolyte peut
entraîner un changement de viscosité, de conductivité et de force ionique de la solution
susceptibles de modifier la mobilité électroosmotique et la mobilité électrophorétique
déterminées expérimentalement 58. A titre d’exemple, l’influence de la variation de viscosité
de l’électrolyte sur les mobilités observées peut être prise en compte par l’introduction d’un
facteur de correction ν dans l’Equation II-23 ; l’expression suivante est alors obtenue59 :
ν .µ i =
[A] µ + [AL] µ
[A] + [AL] f [A] + [AL] c
Equation II-36
Différentes méthodes peuvent être utilisées pour déterminer ce facteur de correction46,60-63. La
méthode la plus fiable implique de mesurer directement la viscosité d’une solution par
viscosimétrie58,62. Par ailleurs, l’effet de la viscosité peut également être évaluée par EC en
comparant le temps nécessaire pour pousser, avec une pression constante, une quantité
d’échantillon au travers du tampon d’analyse avec et sans ligand63. En effet, d’après
l’équation de Poiseuille, le facteur de correction ν est défini de la manière suivante59 :
2
.t
∆P. rcapillaire
ν=
8Ll
η
t
=
= 0
0
2
0
η
∆P. rcapillaire . t
t
8Ll
Equation II-37
où η et η 0 représentent les viscosités du tampon d’analyse respectivement en présence et en
l’absence de ligand, ∆P est la pression appliquée pour conduire le liquide à travers le
capillaire, rcapillaire est le rayon du capillaire, L est la longueur totale du capillaire, l la
longueur effective du capillaire, t et t 0 sont les temps mis par l’échantillon injecté pour
parcourir la longueur effective du capillaire, respectivement dans un tampon avec et sans
ligand.
L’introduction du facteur ν dans le modèle théorique (Equation II-36) permet ainsi de
normaliser les mobilités électrophorétiques expérimentales. Cette correction est parfois
primordiale puisque, par exemple, lorsqu’un système à base de cyclodextrines est utilisé et
que la constante d’interaction est inférieure à 100 M-1, le changement de mobilité du soluté
provoqué par le changement de viscosité peut être supérieur à celui provoqué par l’association
moléculaire61.
122
CHAPITRE II
;I.2.4 - Détermination des constantes d’affinité par mesures de
mobilités ; méthodes expérimentales
a) Méthode d’électrophorèse capillaire d’affinité (ACE)
L’électrophorèse capillaire d’affinité (ACE) est la méthode d’EC la plus fréquemment
utilisée pour déterminer les constantes d’interaction. Le procédé expérimental de l’ACE est
identique à celui utilisé en HD (Cf. Paragraphe I.2.2.a de ce chapitre). Le profil des
électrophérogrammes obtenus par ces deux méthodes est donc similaire. La différence entre
l’HD et l’ACE provient du paramètre mesuré pour la détermination des constantes : en HD,
l’aire du pic négatif est mesurée afin de déterminer la concentration de l’espèce complexée
alors qu’en ACE, c’est la mobilité électrophorétique du soluté (pic positif) (ou du ligand selon
le cas) qui est mesurée.
Considérons le cas où le soluté est injecté dans un capillaire contenant différentes
concentrations de ligand (Figure II-8). Rappelons également que dans ce cas, l’application
d’une méthode d’ACE implique que le soluté subisse un changement de mobilité
électrophorétique lors de sa complexation avec le ligand ; autrement dit, la mobilité
électrophorétique du soluté à l’état libre ( µ f ) doit être différente de celle du soluté à l’état
complexé ( µ c ). Dans ce cas, lors de l’addition de ligand dans la phase mobile, la mobilité
électrophorétique mesurée du soluté ( µ i ) (pic positif (1)) varie entre deux valeurs limites32.
En l’absence de ligand dans le tampon, la mobilité µ i est égale à la mobilité µ f du soluté à
l’état libre et à concentrations élevées en ligand, la totalité du soluté étant liée, la mobilité µ i
observée est égale à la mobilité µ c du soluté dans l’état complexé. Ainsi la mesure du
paramètre µ i lors de l’ajout de ligand permet d’établir l’isotherme d’association du système
(Cf. Equation II-29) et de déterminer la constante d’affinité.
123
CHAPITRE II
(1)
Pic de soluté A
(2)
Pic de ligand L
→ Mobilité µi
→ Mobilité µf’
Augmentation de
[L]Tot
Signal
[L]Tot = 0
Déplacement du pic de soluté
lors de l’addition de ligand
⇔
Evolution de µi
Valeur de µi
en l’absence de ligand
Valeur de µi
à concentration élevée en ligand
=
=
µf
µc
Figure II-8 : Représentation schématique des électrophérogammes relatifs à la migration du soluté en
électrophorèse capillaire d’affinité (ACE). Ce profil de migration suppose que la mobilité
électrophorétique
µf
du soluté A à l’état libre est plus élevée que la mobilité électrophorétique
ligand L à l’état libre ( µ f >
µ f ' ). Par conséquent, la mobilité électrophorétique µ c
µf'
du
du soluté A à l’état
complexé est inférieure à celle du soluté A à l’état libre ( µ c <
µ f ).
mobilités électrophorétiques mentionnées ( µ i ,
est dû uniquement à la charge des
µf , µf'
et
µc )
Rappelons que l’ensemble des
molécules et n’inclut pas de contribution du flux électroosmotique.
L’utilisation de l’ACE implique que la mobilité µ f du soluté libre soit suffisamment
différente de la mobilité µ c du soluté lié. Ainsi par exemple, dans le cas du système
ASB/warfarine évoqué précédemment, la mobilité du soluté (protéine) étant similaire à celle
du complexe AL, la méthode d’ACE ne peut être appliquée26.
L’ACE présente plusieurs avantages : (i) une faible quantité d’échantillon (soluté ou
ligand) est nécessaire, (ii) l’échantillon injecté n’a pas besoin d’être hautement purifié, et (iii)
des constantes d’interaction de plusieurs solutés peuvent être déterminées simultanément61,64.
124
CHAPITRE II
Néanmoins l’utilisation de cette méthode peut parfois présenter certains désavantages (Cf.
Paragraphe I.2.3.d de ce chapitre) rendant délicate la détermination des constantes
d’interaction.
L’ACE est également souvent mise en jeu pour l’analyse d’énantiomères et dans ce
cas, les cyclodextrines sont fréquemment utilisées comme sélecteurs chiraux65. Le modèle
mathématique décrivant l’interaction énantiomère / CD reste le même que celui décrit
précédemment66,67 (Cf. Paragraphe I.2.3 de ce chapitre).
b) Méthode d’électrophorèse capillaire d’affinité et de vacance (VACE)
L’électrophorèse capillaire d’affinité et de vacance (VACE) est une technique d’EC
relativement récente permettant la détermination des constantes d’interaction32,33. Le procédé
expérimental relatif à la VACE est identique à celui de la méthode de VP (Cf. Paragraphe
I.2.2.b de ce chapitre) ; seul le paramètre étudié pour la détermination des constantes diffère.
En VP, l’aire d’un pic négatif est mesurée afin de déterminer la concentration de ligand libre
(ou soluté libre selon le cas) alors qu’en VACE, c’est la mobilité d’un des pics qui est
mesurée.
Considérons une expérience d’affinité effectuée en maintenant fixe la concentration du
soluté à l’intérieur du capillaire et en faisant varier la concentration du ligand (Figure II-9).
Au cours de l’addition de ligand dans la phase mobile, la mobilité électrophorétique mesurée
du soluté ( µ i ) (pic négatif (1)) varie comme en ACE entre les deux valeurs limites µ f et
µ c 32. Les équations théoriques données au paragraphe I.2.3 de ce chapitre sont donc
communes à l’ACE et à la VACE et la mesure du paramètre µ i lors de l’ajout de ligand
permet de déterminer la constante d’affinité (Cf. isotherme d’association, Equation II-29).
125
CHAPITRE II
(1)
Pic de soluté A
(2)
Pic de ligand L
→ Mobilité µi
→ Mobilité µi’
Augmentation de
[L]Tot
Signal
[L]Tot → 0
Déplacement du pic de soluté
⇔
Déplacement du pic de ligand
⇔
Evolution de µi
Evolution de µi’
Valeur de µi
en l’absence de ligand
Valeur de µi
Valeur de µi’
=
=
=
µf
Valeur de µi’
à concentration très faible de ligand
µf’
=
µc
Figure II-9 : Représentation schématique des électrophérogammes relatifs à la migration du soluté en
électrophorèse capillaire d’affinité et de vacance (VACE). Ce profil de migration suppose que la mobilité
électrophorétique
µf
du soluté A à l’état libre est plus élevée que la mobilité électrophorétique
ligand L à l’état libre ( µ f >
µ f ' ). Par conséquent, la mobilité électrophorétique µ c
inférieure à celle du soluté A à l’état libre ( µ c <
µf'
du
du complexe est
µ f ) et supérieure à celle du ligand à l’état libre ( µ c
µ f ' ). Notons que l’ensemble des mobilités électrophorétiques mentionnées ( µ i , µ i ' , µ f , µ f '
et
>
µc )
est dû uniquement à la charge des molécules et n’inclut pas de contribution du flux électroosmotique.
Afin de pouvoir suivre l’évolution de la mobilité électrophorétique du soluté en
VACE, il est à nouveau nécessaire que la mobilité du soluté libre ( µ i ) soit bien différente de
celle du complexe ( µ c ). Par contre, si cette condition n’est pas vérifiée (exemple du couple
ASB / warfarine), la VACE ne doit pas forcément être abandonnée.
126
CHAPITRE II
En effet, en VACE, le pic de ligand (pic négatif (2) lié au déficit de ligand) est
également sensible à la variation de concentration en ligand de l’éluant32(Figure II-9). Lors de
l’addition de ligand dans le tampon, la mobilité µ i ' de ce pic varie entre deux valeurs limites.
A concentrations très faibles en ligand, la quasi totalité de ce composé est sous forme
complexée et la mobilité électrophorétique mesurée µ i ' du ligand est égale à la mobilité µ c
du complexe. A fortes concentrations en ligand, celui-ci est principalement sous forme libre et
la mobilité mesurée µ i ' du ligand peut être assimilée à la mobilité µ f ' du ligand libre. Ainsi,
le suivi de la mobilité µ i ' du ligand en fonction de la concentration en ligand dans
l’électrolyte est un second moyen permettant de déterminer la constante d’affinité32. Les
équations théoriques définissant l’évolution de µ i ' lors de l’ajout de ligand dans le tampon
sont les mêmes que celles données au paragraphe I.2.3 de ce chapitre, seules les lettres A et L
doivent être interverties.
D’autre part, la VACE présente par rapport à l’ACE un avantage dans l’étude de
systèmes particuliers mettant en jeu une protéine possédant i types de sites de fixation vis-àvis du ligand. La VACE permet, à partir de la variation de la mobilité électrophorétique µ i '
du ligand, de calculer le nombre ni de sites d’interaction par mole de protéine relatif à chacun
des types de sites i 27,32. De plus, la VACE est une technique particulièrement adaptée pour la
détermination de constante d’interaction mettant en jeu un soluté faiblement soluble dans
l’eau du fait que cette solubilité peut être augmentée dans le tampon d’analyse contenant le
ligand32.
I.2.5 – Conclusion
L’électrophorèse capillaire est une méthode privilégiée pour la détermination des
constantes d’affinité du fait de sa rapidité d’analyse et de sa faible consommation
d’échantillon. Plusieurs techniques électrophorétiques peuvent être utilisées pour déterminer
la constante d’affinité en solution entre un soluté A et un ligand L. Ces techniques sont
l’électrophorèse
capillaire
d’affinité
(ACE),
la
méthode
d’Hummel-Dreyer
(HD),
l’électrophorèse capillaire d’affinité et de vacance (VACE), la méthode du pic de vacance
(VP), l’analyse frontale (FA) et l’analyse frontale en continu (FACCE). Quelle que soit la
127
CHAPITRE II
méthode expérimentale choisie, la détermination de la constante nécessite de faire varier la
concentration d’un des deux composés (soluté ou ligand) tout en maintenant constante celle
de la seconde espèce. Par contre, selon la technique appliquée, la constante est déterminée soit
à partir de mesures de concentrations des espèces en solution soit à partir de mesures de
mobilités électrophorétiques de l’un des composés. Dans tous les cas, les mobilités
électrophorétiques des espèces mises en jeu doivent vérifier certaines conditions. Par
exemple, si l’étude consiste à mesurer la concentration du ligand libre en solution, la mobilité
électrophorétique de celui-ci doit être différente de celle du soluté et du complexe. Par
ailleurs, si la détermination de la constante est basée sur l’étude de la variation de la mobilité
électrophorétique du soluté lors de l’addition de ligand dans l’électrolyte, le soluté doit alors
subir un changement de mobilité lors de sa complexation ce qui implique que la mobilité du
complexe soit différente de celle du soluté à l’état libre. D’autre part, quelques
caractéristiques relatives aux techniques électrophorétiques exposées précédemment sont
données dans le Tableau II-4.
Méthode
ACE
HD
VACE
VP
Consommation
de soluté A et de ligand L
FACCE
Remarque
- Peuvent être utilisées pour
A ou L en quantité importante
des constantes d’affinité
Cinétique d’association rapide
inférieures à 103 M-1
A et L en quantité importante
A et L en quantité plus
FA
Condition d’utilisation
importante par rapport
à l’ACE et l’HD
- Peuvent être utilisées pour
- Cinétique de dissociation
des cinétiques d’association
lente
lente
- Constante d’affinité
3
Consommation
8
- Limite de détection en
-1
comprise entre 10 et 10 M
FACCE meilleure par rapport
aux autres techniques
en FACCE > FA
électrophorétiques
Tableau II-4 : Quelques caractéristiques des méthodes électrophorétiques permettant la détermination des
constantes d’affinité en solution
128
CHAPITRE II
I.3 – Détermination de la constante d’affinité MPEG-AdPh / β-CD par ACE
L’objectif de cette étude a été de déterminer par une technique d’électrophorèse
capillaire la constante d’interaction entre un polymère modèle de PEG modifié par un
groupement phényladamantyle et des molécules de β-cyclodextrine. Une méthode classique
d’électrophorèse capillaire d’affinité (ACE) consommant peu d’échantillon a été utilisée.
L’ACE, basée sur la variation de la mobilité électrophorétique du soluté au cours de l’addition
de ligand soluble dans la phase mobile, implique que soit le soluté, soit le ligand soit chargé.
Ainsi, deux études se sont avérées possibles :
- (i) une étude de l’interaction entre un soluté chargé et un ligand neutre avec le
couple COO--PEG-AdPh / hydroxypropylβ-CD,
- (ii) une étude de l’interaction entre un soluté neutre et un ligand chargé avec le
couple MPEG-AdPh / β-CD sulfatée.
Dans un premier temps, l’étude de l’interaction entre un polymère chargé COO--PEGAdPh (Cf. Synthèse au chapitre I, paragraphe III.3.3.b) et des molécules neutres
d’hydroxypropylβ-CD (HPβ-CD) a été effectuée. Du fait de la charge portée par le polymère,
celui-ci possède une mobilité électrophorétique négative. Il devrait donc migrer dans le
capillaire avec une vitesse inférieure à celle du flux électroosmotique. De ce fait, l’ajout dans
l’électrolyte de quantités croissantes en HPβ-CD, agent de complexation neutre, est censé
entraîner une augmentation de la mobilité électrophorétique µ i du COO--PEG-AdPh. L’étude
de la variation de la mobilité électrophorétique µ i du polymère lors de l’addition d’HPβ-CD
dans l’électrolyte devrait donc permettre d’établir l’isotherme d’association du système et de
déterminer la constante d’interaction entre les deux espèces.
Le COO--PEG-AdPh (de masse 5000 g/mol) a été injecté dans un capillaire de silice
rempli d’un tampon phosphate à pH = 7 ne contenant pas d’HPβ-CD (Cf. Conditions
expérimentales en annexe 12). Il a été observé que le polymère était très peu retenu au sein du
capillaire et qu’il sortait quasiment au même temps qu’un marqueur du flux électroosmotique
avec une valeur de mobilité électrophorétique très faible de -0,14.10-4 cm2/(V.s) ; ce résultat
est la conséquence d’un rapport charge/masse peu important (1 charge / 5000 g).
L’établissement de l’isotherme d’association relatif au couple COO--PEG-AdPh / HPβ-CD
129
CHAPITRE II
n’a pu être envisagé car la gamme de mobilité ∆µ i pouvant être balayée ( ∆µ i ≤ 0,14.10-4
cm2/(V.s)) est bien trop faible pour conduire à des résultats fiables. Ce type d’étude
nécessiterait l’utilisation de PEGs modifiés de faible masse moléculaire.
Dans un second temps, l’étude de l’affinité entre le polymère neutre de MPEG-AdPh
(Cf. Synthèse au chapitre I, paragraphe III.3.3.a) et des molécules chargées de β-CD sulfatée a
été effectuée. Le principe de cette seconde voie est différent de celui du premier système. En
l’absence d’agent de complexation, le MPEG-AdPh, neutre, est censé sortir à un temps égal à
celui du flux électroosmotique (mobilité
du polymère à l’état libre µ f =0). L’ajout de
quantités croissantes en β-CD sulfatée chargée négativement dans l’électrolyte devrait donc
conduire à une diminution de la mobilité électrophorétique µ i du MPEG-AdPh. Aux fortes
concentrations en HPβ-CD, la mobilité électrophorétique µ i observée pour le polymère
devrait tendre vers la mobilité électrophorétique µ c du complexe. Dans l’hypothèse où la
mobilité électrophorétique µ c du complexe est suffisamment différente de la mobilité µ f du
polymère à l’état libre (Cf. Paragraphe I.2.3 de ce chapitre), l’étude de la variation de la
mobilité électrophorétique µ i du polymère lors de l’addition de β-CD-Sulf dans l’électrolyte
permettrait alors de tracer l’isotherme d’association du système et de déterminer la constante
d’affinité entre les deux espèces. La condition sur les valeurs de µ c et µ f devrait être
respectée dans le cas présent car le ligand utilisé, la β-CD-Sulf, possède de nombreuses
charges (7 à 11 moles de sulfate par mole de β-CD).
Avant d’appliquer les modèles théoriques permettant la détermination de la constante
d’affinité en solution relative au couple MPEG-AdPh / β-CD-Sulf, des études préliminaires
ont été effectuées afin de s’assurer que les conditions requises pour l’application de ces
modèles (Cf. Paragraphe I.2.3.d de ce chapitre) sont bien vérifiées. Pour ce faire, la possible
adsorption du MPEG-AdPh ou de la β-CD-Sulf à la surface du capillaire ainsi que l’influence
de l’addition de la β-CD-Sulf sur la viscosité du tampon ont été étudiées.
130
CHAPITRE II
I.3.1 - Eudes préliminaires
a) Etude de l’adsorption du MPEG-AdPh ou de la β-CD-Sulf à la surface du capillaire
L’étude de l’association du MPEG-AdPh avec la β-CD-Sulf a été effectuée sur un
capillaire de silice. Or, le poly(éthylène oxide) (PEO) est connu pour être un agent de
recouvrement efficace pouvant être utilisé pour contrôler le flux électroosmotique et les
propriétés de surface de la paroi interne des capillaires de silice12,13. L’adsorption possible du
polymère de MPEG-AdPh à la surface de la silice a donc été étudiée. Pour ce faire, la mobilité
électroosmotique a été mesurée après des injections successives du MPEG-AdPh, en solution
dans un tampon phosphate de pH = 7 et ne contenant pas de β-CD-Sulf (Cf. Conditions
expérimentales en annexe 12). Il a ainsi été constaté qu’en utilisant une simple étape de
rinçage entre les différentes analyses, la mobilité électroosmotique reste constante après 25
injections consécutives de MPEG-AdPh. De ce fait, il peut être admis que l’adsorption du
MPEG-AdPh sur la paroi interne du capillaire est négligeable. Il doit être noté que les
procédés de recouvrement de la silice par du PEO nécessitent généralement une protonation
complète des groupes silanols. Ceci pourrait expliquer pourquoi dans les conditions actuelles
de l’analyse (tampon phosphate à pH = 7 et quantités très faibles de MPEG-AdPh injectées)
aucune adsorption significative n’est observée.
D’autre part, l’adsorption du ligand à la surface de la silice devrait également être
négligeable puisque le ligand soluble, la β-CD-Sulf, ainsi que les groupes silanol sont tous
deux chargés négativement à pH = 7. Ce point a néanmoins été étudié en utilisant une
méthode similaire à celle de l’étude d’adsorption du MPEG-AdPh (Cf. Conditions
expérimentales en annexe 12), et il a ainsi été montré que la β-CD-Sulf n’interagissait pas
avec la surface du capillaire.
b) Evolution de la viscosité du tampon d’analyse lors de l’addition de la β-CD-Sulf
Les concentrations de β-CD-Sulf utilisées pour la détermination de la constante (Cf.
Paragraphe I.3.2 de ce chapitre) varient entre 0 et 17 mM. Ainsi, l’effet de la concentration de
131
CHAPITRE II
la β-CD-Sulf sur la viscosité du tampon, et par là même sur la mobilité électrophorétique
mesurée, a été étudié. Dans cette étude, le facteur de correction ν (Cf. Equation II-37,
paragraphe I.2.3.d de ce chapitre) a été évalué suivant le procédé expérimental décrit en
annexe 12. Il est apparu que la valeur de ν fluctuait entre 1 et 1,02 sur la gamme de
concentrations en β-CD-Sulf étudiée (0 et 17 mM). De ce fait, il peut être supposé que la
mobilité électrophorétique du soluté n’est pas affectée par la viscosité du tampon lorsque la
concentration en ligand soluble est augmentée. Aucune correction de la mobilité
électrophorétique déterminée expérimentalement par le facteur ν ne sera alors appliquée dans
la suite de cette étude.
I.3.2 - Détermination des constantes d’interaction
Les polymères MPEG-AdPh du système étudié sont modifiés par un groupement
AdPh à une extrémité de chaîne et par un groupement méthoxy (-OCH3) à la seconde. Seule
l’extrémité AdPh devrait être susceptible de s’inclure dans les cavités de β-CD. En effet, des
études menées par Harada et coll.68 et par David et coll.69,70 ont montré que des PEGs
modifiés par des groupes -OCH3 en bout de chaîne n’interagissaient pas avec des cavités de βCD. Ainsi, un modèle théorique tenant compte d’une association en solution de
stoechiométrie 1:1 a été appliqué au système de l’étude MPEG-AdPh / β-CD-Sulf.
Dans l’hypothèse d’une association de stoechiométrie 1:1 entre les deux espèces,
l’interaction mise en jeu peut être schématisée par l’équilibre suivant :
A + L ⇔ AL
K AL =
[AL]
[A][L]
avec dans le cas présent A représentant le MPEG-AdPh injecté dans le capillaire et L la βCD-Sulf soluble dans l’électrolyte.
L’évolution de la mobilité électrophorétique du MPEG-AdPh a été étudiée en faisant
varier la concentration en β-CD-Sulf dans l’électrolyte (Cf. Conditions expérimentales en
annexe 12). Afin que la concentration de soluté injectée soit largement inférieure à celle de la
132
CHAPITRE II
β-CD-Sulf (Cf. paragraphe I.2.3.d de ce chapitre), cette étude a été effectuée en injectant des
faibles quantités de MPEG-AdPh (injection d’une solution à 0,2 mM sous 0,8 psi de pression
pendant 5 s) sur le support.
a) Détermination des constantes à partir des isothermes d’association
Dans un premier temps, la constante d’interaction K AL a été déterminée à partir de
l’établissement du tracé de l’isotherme d’association (Equation II-29, paragraphe I.2.3.b de ce
chapitre).
Cette
méthode
nécessite
de
déterminer
indépendamment
la
mobilité
électrophorétique µ f du MPEG-AdPh à l’état libre (Cf. Tableau II-3, paragraphe I.2.3.c de ce
chapitre). Le MPEG-AdPh étant un composé neutre, sa mobilité électrophorétique à l’état
libre doit théoriquement être nulle. Cette hypothèse a été confirmée en EC du fait que la
mobilité apparente du polymère est égale à la mobilité électroosmotique déterminée par
injection de la thiourée.
Le tracé de l’isotherme portant (µi − µ f ) en fonction de la concentration en β-CD-Sulf
libre dans l’électrolyte est donné sur la Figure II-10.
MPEG-AdPh
2000 g/mol
5000 g/mol
0,0
-0,5
µi-µf
-4
2
(10 cm /(Vs))
Régressions non linéaires du type :
-1,0
(µ
i
− µf )=
P1 .[L ]
1 + P2 .[L ]
-1,5
0
5
10
15
20
[βCD-Sulf] (mM)
Figure II-10 : Régressions non linéaires des isothermes d’association (Equation II-29) pour la
détermination des constantes d’affinité en solution ( K AL ) du MPEG-AdPh de masse 2000 et 5000 g/mol
sur l’ensemble de la gamme de concentrations étudiées (0 mM < [β
β-CD-Sulf] < 17 mM). Conditions
expérimentales : soluté : MPEG-AdPh à 0,2 mM dans l’eau ; éluant : tampon phosphate 25 mM de pH = 7
133
CHAPITRE II
contenant de 0 à 17 mM de β-CD-sulf ; injection du soluté sous 0,8 psi de pression pendant 5 s ; tension
appliquée 4 kV ; température 25°C ; longueur totale du capillaire 31 cm, longueur effective 21 cm ;
détection UV à 214 nm
Il apparaît que les points expérimentaux sont correctement ajustés par une régression non
linéaire à deux inconnues P1 et P2 du type (µi − µ f ) =
P1 .[L ]
(Equation II-30, paragraphe
1 + P2 .[L ]
I.2.3.b de ce chapitre) avec un coefficient de corrélation R2 = 0,993. Néanmoins, d’après
Bowser et Chen55, un coefficient de corrélation élevé ne suffit pas à prouver que le modèle de
type 1:1 ajuste au mieux les données expérimentales. Par ailleurs, en regardant plus
précisément les régressions non linéaires obtenues, la courbe du MPEG-AdPh de masse 2000
g/mol semble révéler, aux plus fortes concentrations en β-CD-Sulf, une légère déviation au
modèle de type 1:1. De ce fait, un modèle considérant à la fois une stoechiométrie de type 1:1
et 1:2 a été testé pour ajuster les données expérimentales obtenues pour le MPEG-AdPh de
masse 2000 et 5000 g/mol. L’isotherme associée à ce modèle est donnée par la relation
suivante55 :
(µ
i
−µf
)=
(µ
c1
)
(
)
2
− µ f K AL1 .[L ] + µ c2 − µ f K AL1 .K AL2 .[L ]
2
1 + K AL1 .[L] + K AL1 .K AL2 .[L]
Equation II-38
ou K AL1 , K AL2 et µ c1 , µ c2 sont respectivement les constantes macroscopiques à l’équilibre et
les mobilités électrophorétiques, correspondant au MPEG-AdPh simplement ou doublement
complexé à la β-CD-Sulf. Dans ce modèle, les extrémités AdPh et -OCH3 du polymère sont
supposées former un complexe d’inclusion avec les cavités de β-CD-Sulf. Bien que les
données expérimentales aient été correctement ajustées par la courbe de régression non
linéaire considérant un équilibre multiple (Equation II-38) sur l’ensemble de la gamme de
concentrations étudiées (0 mM < [β-CD-Sulf] < 17 mM), certains paramètres déterminés à
partir de cette régression sont incohérents. Par exemple, des valeurs de K AL2 négatives ont été
obtenues et dans certains cas, µ c2 a été trouvé positif (les valeurs ne sont pas reportées). De ce
fait, l’hypothèse d’une stoechiométrie à la fois de type 1:1 et 1:2 a été définitivement rejetée.
Ce résultat confirme les travaux de Harada et coll.68 et de David et coll.69,70 selon lesquels des
groupes -OCH3 en bout de chaîne d’un PEG n’interagissent pas avec des cavités de β-CD.
134
CHAPITRE II
L’hypothèse d’une stoechiométrie 1:1 étant confirmée, la constante d’affinité en
solution K AL ainsi que la mobilité du complexe µ c ont été calculées à partir des deux
inconnues P1 et P2 déterminées par le logiciel informatique (Cf. Equation II-31, paragraphe
I.2.3.b de ce chapitre). Les résultats obtenus sont portés dans le Tableau II-5.
MPEG-AdPh 2000 g/mol
K AL (M-1)
438 ± 38
437 ± 39
µ c (10-4 cm2/(V.s))
-1,63 ± 0,25
-0,85 ± 0,13
R2
0,993
0,993
Tableau II-5 : Estimation de la constante d’affinité
K AL en solution entre le MPEG-AdPh et la β -CD-Sulf
et de la mobilité électrophorétique du complexe
µc
par régression non linéaire de l’isotherme
d’association (Equation II-29) sur l’ensemble de la gamme de concentrations étudiées (0 mM < [β
β-CDSulf] < 17 mM)
Afin de minimiser l’erreur sur la détermination des constantes, la gamme de
concentrations étudiée a été ajustée. En effet, dans le cas d’un modèle de stoechiométrie 1:1,
Deranleau53 a suggéré que les points expérimentaux doivent être acquis à des concentrations
de ligand telles que la fraction f de complexe soluté-ligand soit comprise entre 0,2 et 0,8 (Cf.
paragraphe I.2.3.d de ce chapitre). Dans la présente étude, lorsque la concentration de β-CDSulf varie entre 0 et 17 mM, la fraction f de soluté dans l’état complexé, calculée à partir de
l’Equation II-35 (Cf. paragraphe I.2.3.d de ce chapitre) et de la valeur de K AL reportée dans le
Tableau II-5, varie de 0 à 0,88 pour les MPEG-AdPh de masse 2000 et 5000 g/mol. Cette
gamme expérimentale de f étant en dehors de l’encadrement théorique 0,2-0,8 requis, une
nouvelle gamme de concentrations en ligand qui permettrait de vérifier la condition sur f a été
déterminée. Ainsi, il a été calculé que lorsque la concentration de β-CD-Sulf varie entre 0,97
et 9,7 mM, la fraction f est comprise entre 0,30 et 0,81 pour les deux polymères étudiés. Afin
de minimiser l’erreur sur les valeurs des constantes et des mobilités électrophorétiques, la
régression non linéaire (Equation II-29, paragraphe I.2.3.b de ce chapitre) a donc été établie
sur cette nouvelle gamme de concentrations en β-CD-Sulf 0,97 - 9,7 mM ; les valeurs de K AL
et µ c ainsi déterminées sont reportées dans le Tableau II-6. La nouvelle valeur de la constante
étant légèrement différente de la précédente, la fraction f est recalculée en utilisant la nouvelle
135
CHAPITRE II
valeur de K AL reportée dans le Tableau II-6 et l’Equation II-35. Il apparaît alors que la valeur
de f varie de 0,28 à 0,80 et de 0,26 à 0,78 respectivement pour le MPEG-AdPh de masse 2000
et 5000 g/mol. La condition 0,2 < f < 0,8 étant vérifiée pour les deux polymères, la gamme de
concentrations en ligand étudiée n’est pas réajustée.
136
CHAPITRE II
Double réciproque
Y-réciproque
X-rciproque
MMPEG-AdPh
2000
5000
2000
5000
2000
5000
2000
5000
K AL (M-1)
398 ± 28
368 ± 27
337 ± 27
375 ± 36
402 ± 32
376 ± 28
364 ± 24
358 ± 25
µ c (10-4 cm2/(V.s))
-1.72 ± 0.20
-0.92 ± 0.11
-1.86 ± 0.09
-0.91 ± 0.05
-1.71 ± 0.04
-0.91 ± 0.02
-1.79 ± 0.19
-0.93 ± 0.10
R2
0.994
0.994
0.996
0.992
0.996
0.996
0.978
0.976
(g/mol)
Tableau II-6 : Constantes d’affinité
K AL en solution entre le MPEG-AdPh et la β-CD-Sulf et mobilités électrophorétiques du complexe µ c déterminées par
régressions non linéaires (Equation II-29) et linéaires (Equations II-32 à II-34) uniquement sur les points expérimentaux correspondant à une fraction f de complexe
comprise entre 0,2 et 0,8
137
CHAPITRE II
b) Détermination des constantes à partir des représentations linéaires
Les représentations linéaires correspondant aux formes double réciproque,yréciproque et x-réciproque (Equations II-32 à II-34, paragraphe I.2.3.c de ce chapitre) ont
également été établies dans la gamme de concentrations 0,97 - 9,7 mM en β-CD-Sulf (Figure
II-11).
MPEG-AdPh
2000 g/mol
5000 g/mol
-1
1/ (µi-µf)
4
-2
(10 cm Vs) -2
-3
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
3
1,0
-1
1/[βCD-Sulf] (10 M )
(a)
0
MPEG-AdPh
2000 g/mol
5000 g/mol
-50
[βCD-Sulf]/ (µi-µf)
-2
(M cm Vs)
-100
-150
0
2
4
6
[βCD-Sulf] (mM)
(b)
138
8
10
CHAPITRE II
MPEG-AdPh
2000 g/mol
5000 g/mol
-1
-2
(µi-µf)/[βCD-Sulf]
-2
2
(10 cm /(VsM))
-3
-4
-1,25
-1,00
-0,75
-4
-0,50
-0,25
2
(µi-µf) (10 cm /(Vs))
(c)
Figure II-11 : Régressions linéaires sur les formes double réciproque (Equation II-32) (a), y-réciproque
(Equation II-33) (b) et x-réciproque (Equation II-34) (c) pour la détermination des constantes d’affinité en
solution ( K AL ) du MPEG-AdPh de masse 2000 et 5000 g/mol uniquement sur les points expérimentaux
correspondant à une fraction f de complexe comprise entre 0,2 et 0,8. Les conditions expérimentales sont
les mêmes que celles relatives à la Figure II-10
D’après la Figure II-11, il apparaît que les représentations double réciproque, y-réciproque et
x-réciproque obtenues à partir des données expérimentales sont linéaires avec un coefficient
de régression R2 ≥ 0,976. Ce résultat confirme que la complexation entre le MPEG-AdPh et
la β-CD-Sulf peut être décrite par un modèle de stoechiométrie 1:1. Les valeurs de K AL et µ c
déterminées à partir des différentes relations linéaires sont reportées dans le Tableau II-6.
c) Comparaison des résultats
Le Tableau II-6 permet de comparer les constantes d’interaction et les mobilités
déterminées pour le MPEG-AdPh de masse 2000 et 5000 g/mol à partir des différentes
techniques graphiques. Il doit être souligné que les méthodes de régressions linéaires ont été
appliquées sans utiliser de méthode de pondération reportée dans la littérature52,59. Malgré
cela, les méthodes de régressions linéaires conduisent à des paramètres similaires à ceux
obtenus par la méthode d’ajustage non linéaire (Tableau II-6). Pour le MPEG-AdPh de masse
139
CHAPITRE II
5000 g/mol, une constante d’association en solution égale à 368 ± 27 M-1 a été calculée par
régression non linéaire. En comparant cette valeur avec celles obtenues par régression
linéaire, un écart inférieur ou égal à 3 % est observé. Pour le MPEG-AdPh de masse 2000
g/mol, la différence observée est généralement inférieure à 9 %. Ainsi, il peut être considéré
qu’une méthode de pondération des mobilités électrophorétiques n’est pas nécessaire à
l’application des modèles linéaires.
Il apparaît dans le Tableau II-6 que les constantes d’interaction en solution ( K AL )
obtenues pour les polymères de MPEG-AdPh de masses 2000 et 5000 g/mol sont similaires.
Ainsi, dans le domaine de masses étudiées, la constante d’interaction en solution semble
indépendante de la masse moléculaire du polymère. Un résultat analogue avait été obtenu par
par David.71 pour l’étude par CLHP de l’affinité de MPEGs modifiés par un groupement
naphtyle en extrémité de chaîne vis-à-vis de l’hydroxypropylβ-CD (HPβ-CD).
La valeur de K AL obtenue pour le système MPEG-AdPh / β-CD-Sulf, de l’ordre de
400 M-1, est assez faible par rapport à l’ensemble des constantes d’affinité reportées dans le
Tableau II-1 (en introduction du chapitre II). Ce résultat peut s’expliquer par la présence des
nombreuses charges négatives sur la β-CD-Sulf (7 à 11 mol /mol de β-CD) qui défavoriserait
la formation du complexe MPEG-AdPh / β-CD-Sulf.
Si l’on compare la valeur de K AL de la présente étude à celles de travaux menés par
électrophorèse capillaire par Wang et coll.6 (couple adamantan-1-amine chargé / β-CD neutre,
K AL = 200 M-1) et par Larsen et coll.9 (couple acide adamantane-1-carboxylique chargé / βCD neutre, K AL = 500 M-1) (Cf. Tableau II-1), il apparaît une bonne concordance des
résultats malgré le fait que dans notre étude la charge soit portée par le ligand et non par le
soluté. Par contre, la comparaison de la valeur de K AL de l’étude avec les valeurs de la
littérature obtenues par d’autres techniques expérimentales reste délicate car il semblerait que
les valeurs de constantes mesurées diffèrent de façon relativement importante suivant la
méthode expérimentale utilisée.
Par ailleurs, les mobilités électrophorétiques µ c des complexes formés avec le MPEGAdPh de masse 2000 et 5000 g/mol sont comparées dans le Tableau II-6. Les mobilités
électrophorétiques µ c obtenues pour les deux complexes sont négatives ce qui est normal
140
CHAPITRE II
puisque ceux-ci sont chargés négativement. D’autre part, la valeur absolue de µ c est plus
importante pour le complexe formé à partir du polymère MPEG-AdPh-2000 de plus faible
masse moléculaire. Ce résultat est en bon accord avec le rapport charge/masse des deux
complexes. En effet, d’après l’Equation II-2 (Cf. Paragraphe I.1.2.a de ce chapitre), la valeur
absolue de la mobilité électrophorétique augmente avec ce rapport. Ainsi, le MPEG-AdPh2000 est plus attiré vers l’anode que le MPEG-AdPh-5000.
I.3.3 - Conclusion
L’étude de l’interaction entre un polymère modèle de PEG modifié par un groupement
AdPh et des cavités de cyclodextrine a été menée avec succès par ACE, avec l’étude du
couple MPEG-AdPh / β-CD-Sulf. Une constante d’affinité en solution de l’ordre de 400 M-1 a
été déterminée pour des complexes formés à partir de polymères de masses 2000 et 5000
g/mol. Cette valeur assez faible de la constante est sans doute la conséquence des nombreuses
charges portées par la molécule de β-CD-Sulf. Or, l’élaboration des systèmes
macromoléculaires à finalité analytique (Chapitres III et IV) sera basée sur la formation de
complexes d’inclusion entre des polymères modifiés adamantyle et une couche neutre de βCD. Il serait donc intéressant de quantifier l’interaction entre un polymère modèle de MPEGAdPh et des molécules neutres de β-CD. La méthode d’ACE ne permettant pas d’étudier
l’association entre deux composés neutres, une technique plus classique de CLHP a été
utilisée pour réaliser cette étude d’affinité.
141
CHAPITRE II
II
–
Détermination
des
constantes
d’affinité
par
chromatographie liquide à haute performance
La chromatographie d’affinité est une méthode de séparation basée sur les interactions
biochimiques spécifiques entre un ligand immobilisé sur un support chromatographique et un
soluté présent dans la phase mobile (Cf. Chapitre III, paragraphe I.6.1). L’un, au moins, des
composés mis en jeu (soluté ou ligand) est une substance de forte masse moléculaire telle
qu’une protéine ou un acide nucléique. La chromatographie d’affinité est essentiellement
utilisée comme processus de purification des molécules biologiques mais il s’agit également
d’une méthode reconnue en biologie pour la mesure des constantes d’interaction soluté /
ligand. Suite à des travaux préliminaires69,71, cette technique a été adaptée à l’étude de
l’interaction entre un polymère modèle de MPEG-AdPh et des molécules neutres de β-CD.
II.1 – Aspects théoriques de la chromatographie d'affinité par compétition :
mesures à l'équilibre
Dans cette partie, les modèles théoriques les plus simples permettant la détermination
des constantes d’interaction soluté / ligand immobilisé et soluté / ligand soluble à partir du
signal chromatographique, seront exposés. Ces modèles seront ensuite appliqués au système
MPEG-AdPh / molécules neutres de β-CD de la présente étude (Cf. Paragraphe II.2 de ce
chapitre).
II.1.1 - Rappels chromatographiques
Le bilan de matière qui décrit la migration d’un soluté A au sein d’une colonne
chromatographique peut être déterminé à partir du principe de conservation de la masse. En
effet, en considérant que la quantité de matière entrant dans une tranche transversale de
colonne d'épaisseur infinitésimale dz est égale à la somme des quantités sortant et
s'accumulant dans les phases mobile et stationnaire, la migration d’un soluté A au travers
d’une colonne (de longueur L) est décrite par l’équation différentielle suivante72 :
142
CHAPITRE II
∂C
∂C
∂ 2C
1 ∂( Q A ,Tot )
+ u.
− D. 2 = − .
∂t
∂z
V0
∂t
∂z
Equation II-39
C représente la concentration du soluté A dans la phase mobile, QA ,Tot la quantité totale de
soluté A adsorbé, u la vitesse linéaire moyenne d'écoulement de la phase mobile, D le
coefficient de dispersion axiale, V0 le volume mort de la colonne, t le temps écoulé depuis
l’injection du soluté et z est l'abscisse le long de la colonne (avec z = 0 et z = L
respectivement à l’entrée et à la sortie de la colonne).
Cette équation met en jeu deux variables Q A ,Tot et C . A l’équilibre, la quantité totale
de soluté A adsorbé ( Q A ,Tot ) est une fonction de la concentration C du soluté dans la phase
mobile :
Q A ,Tot = f ( C )
Equation II-40
f ( C ) représente l’isotherme de partage du soluté A sur un support d’affinité X
Les isothermes les plus fréquemment rencontrées sont de type :
•
linéaire :
Q A ,Tot = K .C
•
« Langmuir » :
Q A ,Tot = Q X ,Tot
K .C
1 + K .C
voir «bi-Langmuir » (lorsque deux types de sites sont présents sur le support) :
Q A ,Tot = Q X1 ,Tot
•
rectangulaire :
K 1 .C
K 2 .C
+ Q X 2 ,Tot
1 + K 1 .C
1 + K 2 .C
Q A ,Tot = Q X ,Tot
avec K la constante relative à l'équilibre de partage du soluté entre la phase stationnaire et la
phase mobile et Q X ,Tot la quantité totale accessible de ligand immobilisé sur le support
appelée capacité d'adsorption de la colonne.
143
CHAPITRE II
II.1.2 – Présentation des modèles permettant la détermination des
constantes d’affinité par des mesures à l’équilibre
Les premières théories décrivant des situations où un soluté possédant un unique site
de liaison et interagissant avec un seul type de ligand immobilisé ont été introduites par
Nichol et coll.73 pour la chromatographie d’affinité en mode frontal et Dunn et Chaiken74,75
pour le mode zonal. Dans la partie suivante, les équations à l’équilibre issues de ces théories
et décrivant les interactions entre un soluté A , un ligand immobilisé X et un ligand soluble
L , ainsi que les méthodes permettant de déterminer les paramètres physico-chimiques à partir
des résultats expérimentaux seront présentées. Pour établir ces équations, on supposera que la
stoechiométrie des complexes soluté / ligand immobilisé et soluté / ligand soluble est de type
1:1 et que les ligands X et L ne présentent pas d’affinité l’un vis-à-vis de l’autre.
a) Cas où le soluté interagit avec un seul type de site sur le support
Expression de l’isotherme de partage à l’équilibre :
En chromatographie d’affinité, les volumes de rétention sont dépendants des équilibres
(Equation II-41 et Equation II-42) décrivant les interactions entre un soluté A , un ligand
immobilisé X et un ligand soluble L .
A + X ⇔ AX
K AX =
{AX }
[A]{X }
Equation II-41
A + L ⇔ AL
K AL =
[AL]
[A][L]
Equation II-42
où K AX et K AL représentent les constantes d’affinité respectivement entre le soluté A et le
ligand immobilisé X (constante aux interfaces) et entre le soluté A et le ligand soluble L
(constante en solution). Les espèces entre accolades { } sont immobilisées sur le support
d’immunoaffinité et leurs concentrations respectives sont rapportées à la surface de phase
144
CHAPITRE II
stationnaire et exprimées en mol/m2 ; les espèces entre crochets [ ] sont en solution dans la
phase mobile et leurs concentrations sont exprimées en mol/L.
La quantité totale de soluté adsorbé QA ,Tot (mol) sur le support peut être reliée à la
concentration [ A] de soluté libre en solution par la relation suivante :
Q A ,Tot = {AX }.S = Q X ,Tot
[A].K AX
1 + [ A].K AX
Equation II-43
où S (m2) est la surface de phase stationnaire et Q X ,Tot (mol) la quantité totale de ligands
accessibles immobilisés sur le support.
Par ailleurs, la concentration totale en soluté [ A]Tot dans la phase mobile est reliée aux
espèces libres par l’égalité suivante :
[A]Tot = [A] + [AL] = [A].(1 + [L].K AL )
Equation II-44
La combinaison des Equations II-43 et II-44 permet alors d’obtenir l’isotherme de
partage à l’équilibre, l’expression de cette isotherme est donnée ci dessous :
Q A ,Tot = Q X ,Tot
[A]Tot .K AX
1 + [ A]Tot .K AX + [L].K AL
Equation II-45
En posant K =
K AX
, l’isotherme précédente apparaît plus clairement comme une
1 + [L].K AL
isotherme de type Langmuir :
Q A ,Tot = Q X ,Tot
[A]Tot .K
1 + [ A]Tot .K
Equation II-46
145
CHAPITRE II
Généralement, la concentration de ligand soluble libre [L] ne peut être mesurée
directement alors que la concentration totale en ligand soluble [L ]Tot est connue. Par ailleurs,
[L ]Tot
est définie par la relation suivante :
[L]Tot = [L] + [AL]
Equation II-47
Ainsi, dans le cas particulier où la concentration totale de ligand soluble [L]Tot utilisée est
nettement supérieure à la concentration totale de soluté [ A]Tot introduite dans la colonne,
l’approximation [L ] ≈ [L ]Tot peut être effectuée.
L’ensemble des équations jusqu’ici présentées (Equations II-41 à II-47) sont valables
en chromatographies frontale et zonale. La chromatographie frontale présente le désavantage
de consommer une quantité importante de soluté, spécialement lorsque les temps de rétention
sont assez longs. De ce fait, la méthode zonale est plus souvent privilégiée. Cependant, ce
procédé suppose qu’un équilibre local soit atteint au sein de la colonne et cette hypothèse se
trouve validée si le volume de rétention est indépendant du débit de la phase mobile. D’autre
part, les quantités de soluté injectées doivent être très faibles (dilution infinie du soluté) de
telle sorte que le volume de rétention soit indépendant de la quantité injectée ; on parle alors
de chromatographie linéaire.
Volume de rétention et facteur de rétention en chromatographie zonale (conditions de
chromatographie linéaire) :
Selon Jaulmes et Vidal-Madjar72, en chromatographie zonale, le volume de rétention
( VZ ) d’un pic d’élution à dilution infinie est donné par la dérivée de l’isotherme pour une
concentration nulle en soluté (autrement dit par la pente de l’isotherme de partage à
l’équilibre au point d’origine) :
 ∂ Q A , Tot
V Z − V0 = 
 ∂ [A]Tot



 [ A]Tot = 0
Equation II-48
avec V0 le volume mort de la colonne.
146
CHAPITRE II
Ainsi, en dérivant l’isotherme exprimée par l’Equation II-45 et en considérant que [L] ≈ [L]Tot
puisque des conditions chromatographiques linéaires sont considérées, l’Equation II-48
(valable pour [ A]Tot = 0 ) conduit à l’expression suivante72 :
VZ − V0 =
Q X ,Tot .K AX
1 + [L]Tot .K AL
Equation II-49
Cette dernière expression est celle introduite par Chaiken74,75.
L’expression
du
facteur
de
rétention
d’un
soluté
dans
des
conditions
chromatographiques linéaires peut être donnée simplement à partir de l’Equation II-49 :
k' =
Q X , Tot .K AX
V Z − V0
=
V0
( 1 + [L]Tot .K AL ).V 0
Equation II-50
Détermination de la constante KAL (conditions de chromatographie linéaire) :
En prenant l’inverse de l’Equation II-49, une relation linéaire reliant
1
et la
V Z − V0
concentration totale en ligand soluble [L]Tot est alors obtenue :
K AL
1
1
[L]Tot
=
+
VZ − V0 Q X ,Tot .K AX Q X ,Tot .K AX
Equation II-51
La constante d’affinité K AL peut alors être déterminée expérimentalement à partir de la pente
et de l’ordonnée à l’origine du tracé expérimental portant
1
en fonction de [L]Tot :
V Z − V0
K AL = (pente / ordonnée à l’origine)
Equation II-52
Expérimentalement, l’établissement du tracé relatif à Equation II-51 s’effectue en maintenant
la concentration du soluté constante et en mesurant l’évolution du volume de rétention du
soluté lors de l’addition de ligand dans la phase mobile.
147
CHAPITRE II
Détermination de la constante KAX (conditions d’analyse en surchage) :
Il est important de rappeler que les Equations II-48 à II-52 sont valables uniquement
en chromatographie d’élution zonale et pour des conditions chromatographiques linéaires.
Des relations analogues, en l’absence d’effets dispersifs, ont été définies pour des conditions
d’analyse en surcharge72, autrement dit lorsque des concentrations en soluté plus importantes
sont utilisées. Ces relations permettent d’accéder à la valeur de la constante KAX.
Ainsi en chromatographie zonale idéale (absence d’effets dispersifs) et dans un cas
plus général d’analyse en surcharge, le volume de rétention ( VR ) d’un pic de soluté, élué avec
une concentration [ A]Max au sommet du pic, est donné par la dérivée de l’isotherme de partage
suivant la relation :
 ∂ Q A ,Tot
V R − V0 = 
 ∂ [ A]Tot


 [ A]Max
Equation II-53
En dérivant l’isotherme exprimée par l’Equation II-45 et en linéarisant l’expression
obtenue, le volume d’élution ( VR ) peut être relié à la concentration [ A]Max au sommet du pic
par l’expression générale suivante :
1 + [L].K AL
K AX
1
[A]Max
=
+
V R − V0
Q X ,Tot .K AX
Q X ,Tot .(1 + [L ].K AL )
Equation II-54
Le facteur
1
variant linéairement avec la concentration
VR − V0
[A]Max , les paramètres QX ,Tot
et K AX peuvent être déterminés expérimentalement à partir de la pente et de l’ordonnée à
l’origine de cette relation linéaire, et ce en appliquant les relations suivantes :
Q X ,Tot = 1/ (pente × ordonnée à l’origine)
K AX = (pente / ordonnée à l’origine) × (1 + [L ].K AL )
Equation II-55
Equation II-56
148
CHAPITRE II
La détermination de K AX nécessite donc d’avoir préalablement déterminé la valeur de K AL à
l’aide de l’Equation II-51.
Le tracé relatif à l’Equation II-54 nécessite de déterminer la concentration [ A]Max au
sommet du pic. Or du fait de l’étalement chromatographique, cette concentration est
inférieure à la concentration injectée et ne peut être mesurée directement à partir d’un
chromatogramme. Néanmoins, la concentration [ A]Max peut être déterminée à partir de la
hauteur hMax au sommet du pic (Figure II-12a) car ces deux grandeurs sont liées l’une à
l’autre par un facteur de proportionnalité a. Par ailleurs ce même facteur de proportionnalité
(a) relie l’aire du pic à la quantité de soluté injectée (Figure II-12b). Ainsi, l’établissement
d’une droite d’étalonnage, portant l’aire du pic de soluté (mesurée à l’aide d’un logiciel
informatique tel qu’Origin) en fonction de la quantité injectée, permet d’accéder au facteur a.
Ce facteur étant connu, la mesure expérimentale à partir d’un chromatogramme de la hauteur
hMax au sommet du pic permet d’accéder à la concentration [ A]Max au sommet du pic.
Densité optique
Aire du pic
(unité d’absorbance . mL)
[A]Max
×
×
hMax
×
[A]Max = hMax / a
×
Aire du pic = a . quantité injectée
×
VR
Volume (mL)
Quantité injectée (mol)
Chromatogramme expérimental
(a)
Courbe d’étalonnage
(b)
Figure II-12 : Méthode de détermination de la concentration
mesure de la hauteur
[A]Max
au sommet du pic à partir de la
hMax au sommet du pic (a) et grâce à l’établissement d’une droite d’étalonnage (b)
permettant d’accéder au facteur de proportionnalité a reliant
149
[A]Max et hMax
CHAPITRE II
Expérimentalement, le tracé relatif à Equation II-54 s’effectue en injectant dans la colonne
des solutions à différentes concentrations en soluté, la concentration en ligand étant par
ailleurs maintenue constante. De cette manière, l’évolution du volume de rétention du soluté
en fonction de sa concentration peut être suivie et la valeur de la constante K AX peut être
déterminée.
b) Cas où le soluté interagit avec deux types de sites sur le support
Expression de l’isotherme de partage à l’équilibre :
La rétention d’un soluté A sur un support présentant deux types de sites d’interaction
X 1 et X 2 et en présence d’un ligand soluble L est dépendante des équilibres suivants :
A + X 1 ⇔ AX 1
K AX =
{AX 1 }
[A]{X 1 }
Equation II-57
{AX 2 }
[A]{X 2 }
A + X 2 ⇔ AX 2
K AX =
A + L ⇔ AL
[AL]
K AL =
[A][L]
Equation II-58
Equation II-59
où K AX1 et K AX 2 représentent les constantes d’affinité aux interfaces entre le soluté A et les
deux types de ligand immobilisés X 1 et X 2 .
La présence de deux types de sites sur le support modifie la quantité totale de soluté
adsorbé Q A ,Tot selon la relation suivante :
Q A ,Tot = {AX 1 }.S + {AX 2 }.S = Q X 1 ,Tot
[A].K AX
1 + [A].K AX
1
+ Q X 2 ,Tot
1
[A].K AX
1 + [A].K AX
2
2
Equation II-60
150
CHAPITRE II
où S est la surface de phase stationnaire, Q X1 ,Tot et Q X 2 ,Tot les quantités totales des deux types
de ligands accessibles immobilisés sur le support.
Par contre, la concentration totale en soluté [ A]Tot dans la phase mobile est toujours définie
par l’Equation II-44 énoncée précédemment : [ A]Tot = [A] + [ AL] = [A].(1 + [L].K AL )
La combinaison des Equations II-43 et II-60 conduit à l’isotherme de partage à
l’équilibre suivant :
[A]Tot .K AX
1
1 + [ A]Tot .K AX1 + [L].K AL
+ Q X 2 ,Tot
[A]Tot .K AX
2
1 + [A]Tot .K AX 2 + [L].K AL
Equation II-61
En posant K 1 =
K AX1
1 + [L].K AL
et K 2 =
K AX 2
1 + [L].K AL
l’isotherme précédente apparaît comme une
isotherme de type bi-Langmuir :
[A]Tot .K1 + Q
[A]Tot .K 2
X ,Tot
1 + [A]Tot .K 1
1 + [ A]Tot .K 2
2
Equation II-62
Détermination de la constante KAL (conditions de chromatographie linéaire) :
Dans des conditions d’élution zonale et en chromatographie linéaire ( [ A]Tot = 0 et
[L] ≈ [L]Tot ),
la dérivation de l’isotherme précédente (Equation II-61) suivie d’une
linéarisation permet de relier le volume de rétention ( VZ ) d’un pic de soluté à la concentration
totale en ligand soluble [L]Tot par la relation suivante :
K AL
1
1
=
+
[L]Tot
VZ − V0 Q X1 ,Tot .K AX1 + Q X 2 ,Tot .K AX 2 Q X1 ,Tot .K AX1 + Q X 2 ,Tot .K AX 2
Equation II-63
151
CHAPITRE II
La constante d’affinité K AL peut alors être déterminée expérimentalement à partir de la pente
et de l’ordonnée à l’origine du tracé expérimental portant
1
en fonction de [L]Tot :
V Z − V0
K AL = (pente / ordonnée à l’origine)
Equation II-64
Le protocole suivi pour établir le tracé expérimental relatif à l’Equation II-63 est identique à
celui décrit précédemment dans le cas d’un seul type de site sur le support (Cf. Paragraphe
II.1.2.a de ce chapitre).
Détermination de la constante KAX (conditions d’analyse en surchage) :
Dans des conditions d’élution zonale en surcharge et en l’absence de phénomènes
dispersifs, la dérivation de l’isotherme exprimée par l’Equation II-62 permet de relier le
volume de rétention ( VR ) d’un pic de soluté à la concentration [ A]Max au sommet du pic par
l’égalité suivante :
V R − V0 =
Q X1 ,Tot .K 1
(1 + [A]Max .K1 )
2
+
Q X 2 ,Tot .K 2
(1 + [A]Max .K 2 )2
Equation II-65
Les paramètres K 1 , K 2 , Q X 1 ,Tot et Q X 2 ,Tot peuvent être déterminés par régression non linéaire
du tracé expérimental portant VR − V0 en fonction de [ A]Max . Plus précisément, les résultats
expérimentaux sont ajustés à l’aide d’un logiciel par une courbe à quatre inconnues P1 , P2 , P3
et P4 d’équation :
V R − V0 =
P1
(P2 + [A]Max )
2
+
P3
(P4 + [A]Max )2
Equation II-66
Les paramètres P1 , P2 , P3 et P4 déterminés pas le logiciel conduisent alors aux paramètres
K 1 , K 2 , Q X1 ,Tot et Q X 2 ,Tot à l’aide des égalités suivantes :
K1 =
P
P
1
1
; K2 =
; Q X 1 ,Tot = 1 et Q X 2 ,Tot = 3
P2
P4
P2
P4
Equation II-67
152
CHAPITRE II
De plus K 1 et K 2 étant définis par K 1 =
K AX1
1 + [L].K AL
et K 2 =
K AX 2
1 + [L].K AL
, les paramètres
K AX1 et K AX 2 peuvent alors être calculés à condition d’avoir préalablement déterminé la
valeur de K AL à l’aide de l’Equation II-63.
Le protocole suivi pour établir le tracé expérimental relatif à l’Equation II-65 est identique à
celui décrit précédemment dans le cas d’un seul type de site sur le support (Cf ; Paragraphe
II.1.2.a de ce chapitre).
II.2 – Détermination de la constante d’affinité MPEG-AdPh / β-CD par
chromatographie d’affinité par compétition
Des études antérieures menées par David71 ont montré que les modèles théoriques
décrits précédemment (Cf. Paragraphe II.1 de ce chapitre) et développés pour des molécules
biologiques pouvaient être appliqués à des systèmes macromoléculaires associatifs analogues
à ceux de la présente étude. Notamment, les interactions entre des cavités de β-CD et des
MPEGs modifiés en extrémités de chaîne par des groupements naphtyle (MPEG-Nap) ont été
étudiées sur un support chromatographique de silice-polyβ-CD. En particulier, il a été montré
qu’il existait deux types de sites sur le support de silice-polyβ-CD capables d’interagir avec
les polymères MPEG-Nap injectés : des sites d’interactions spécifiques engendrés par les
cavités de β-CD et des sites d’interactions non spécifiques dus à la présence de l’agent de
couplage utilisé lors de l’élaboration du support.
David71 s’est également intéressée à l’étude de la complexation entre un MPEG-AdPh
(de masse moléculaire 5000 g/mol) et des cavités de β-CD. Cependant, dans ce cas, l’auteur
n’a appliqué qu’un modèle supposant un unique type de site sur le support. De ce fait, il est
possible que les constantes obtenues soient erronées.
L’objectif de la présente étude est donc de compléter et d’affiner les résultats obtenus
précédemment pour le système MPEG-AdPh / β-CD. D’autre part, David et coll.69 ont montré
que l’utilisation d’une silice-polyβ-CD de porosité 10 nm permettait l’accessibilité de MPEGNap de masse moyenne pouvant atteindre 20 000 g/mol. Dans le cas présent les polymères
étudiés possédant des masses de 2000 et 5000 g/mol, un support de porosité identique a donc
été choisi. La synthèse du support chromatographique de l’étude a été décrite au chapitre I,
153
CHAPITRE II
paragraphe III.2 et les caractéristiques du support de silice-polyβ-CD élaboré sont reportées
dans l’annexe 3.
Dans un premier temps, il a été vérifié en portant le facteur
1
en fonction de la
VR − V0
concentration [MPEG − AdPh ]Max au sommet du pic que les résultats expérimentaux obtenus
ne pouvaient pas être ajustés avec le modèle supposant un unique type de site (Equation II54). En effet, une déviation à la linéarité a été observée aux faibles concentrations, justifiant
l’utilisation d’un modèle impliquant deux types de sites. Seul le traitement des résultats
expérimentaux à l’aide du modèle à deux types de sites sera présenté.
En supposant la présence de deux types de sites d’interaction sur le support de silicepolyβ-CD, la rétention du polymère de MPEG-AdPh en présence d’hydroxypropylβ-CD
(HPβ-CD) comme compétiteur soluble dans la phase mobile, est déterminée par les équilibres
suivants :
A + X 1 ⇔ AX 1
A + X 2 ⇔ AX 2
A + L ⇔ AL
K AX 1 =
K AX 2
{AX 1 }
[A]{X 1 }
{AX 2 }
=
[A]{X 2 }
K AL =
[AL]
[A][L]
Equation II-68
Equation II-69
Equation II-70
Dans le cas présent A représente le MPEG-AdPh, X 1 les cavités de β-CD immobilisées sur
le support (par l’intermédiaire du polyβ-CD), X 2 les motifs alkyle contenu dans l’agent de
couplage (1,4 diisocyanatobutane) utilisé pour élaborer le support et L l’hydroxypropylβ-CD
(HPβ-CD) introduite dans la phase mobile.
La constante d’affinité en solution K AL entre le MPEG-AdPh et le ligand soluble
HPβ-CD présent dans la phase mobile, puis les constantes d’interaction aux interfaces K AX 1
et K AX 2 entre le MPEG-AdPh et les deux types de sites présents sur le support de silicepolyβ-CD seront déterminées.
154
CHAPITRE II
II.2.1 – Détermination de la constante d’affinité en solution K AL
Afin de déterminer la constante d’affinité en solution K AL , l’évolution de la rétention
du MPEG-AdPh a été étudiée en faisant varier la concentration en HPβ-CD dans la phase
mobile (Cf. Appareillage chromatographique en annexe 13). Afin de se rapprocher d’une
chromatographie linéaire, cette étude a été effectuée en injectant des faibles volumes (20 µL)
de solutions peu concentrées en MPEG-AdPh (0,05 mg/mL) sur le support.
Le modèle représenté par l’Equation II-63, défini pour une chromatographie linéaire en
présence de deux types de sites et permettant de relier le volume de rétention ( VZ ) d’un pic de
soluté à la concentration totale en ligand soluble, a été appliqué au système étudié (Figure II13)
MPEG-AdPh
2000 g/mol
5000 g/mol
0,5
0,4
1/(VZ-V0)
-1
(mL )
0,3
0,2
0,1
0
1
2
3
4
5
[HPβ-CD]Tot (mM)
Figure II-13 : Application du modèle décrit par l’Equation II-63 au système chromatographique étudié :
évolution du paramètre 1/(VZ-V0) relatif au MPEG-AdPh de masse 2000 et 5000 g/mol en fonction de la
concentration totale en HPβ
β-CD de la phase mobile ([HPβ
β-CD]Tot). Conditions chromatographiques :
injection de 20 µL de MPEG-AdPh à 0,05 mg/mL dans l’eau ; éluant : eau contenant de 1 à 5 mM en HPβ
βCD ; débit de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 276 nm
Il apparaît que le facteur
1
varie linéairement avec la concentration totale en
VZ − V0
HPβ-CD de la phase mobile ([HPβ-CD]Tot) avec un coefficient de régression R2 ≥ 0,996. Ce
résultat confirme que le modèle théorique (défini par l’Equation II-63) introduit pour l’étude
de molécules biologiques est valable dans le cas du système de polymères associatifs étudiés.
155
CHAPITRE II
La constante d’affinité K AL en solution relative à l’interaction entre le MPEG-AdPh et l’HPβCD est alors déterminée expérimentalement à partir de la pente et de l’ordonnée à l’origine de
la relation linéaire précédente (Cf. Equation II-64) (Tableau II-7).
K AL (M-1)
5 100 ± 1480
5 200 ± 680
R2
0,996
0,999
Tableau II-7 : Constante d’affinité en solution
K AL entre le MPEG-AdPh et l’HPββ-CD, valeurs
déterminées à partir du modèle théorique décrit par l’Equation II-63
Il apparaît que les constantes d’interaction en solution ( K AL ) obtenues pour les
polymères de MPEG-AdPh de masses 2000 et 5000 g/mol sont semblables. Ainsi, dans le
domaine de masses étudiées, la constante d’interaction en solution semble indépendante de la
masse moléculaire du polymère. Ce résultat est en bon accord avec les travaux menés par
David71 en CLHP selon lesquels la constante de complexation relative au système MPEGNap/HPβ-CD reste constante lorsque la masse du polymère varie de 2000 à 5000 g/mol.
D’autre part, ce résultat confirme également les conclusions de l’étude menée par ACE avec
le même polymère de MPEG-AdPh (Cf. Paragraphe I.3.2 de ce chapitre).
La valeur de K AL pour le couple MPEG-AdPh / HPβ-CD, de l’ordre de 5000 M-1 (Cf.
Tableau II-7), est cohérente avec la valeur de 400 M-1 obtenue par ACE pour le système
MPEG-AdPh/β-CD-Sulf (Cf. Tableau II-6). La différence d’affinité observée pourrait
s’expliquer par la présence de charges sur la molécule hôte de β-CD-Sulf.
Amiel et coll.10 ont étudié par fluorimétrie un système proche de celui de la présente
étude mettant en jeu un PEG dépourvu de charges modifié à ses deux extrémités par un
groupement adamantyle (PEG-Ad2) et de l’HPβ-CD neutre. La constante d’interaction en
solution déterminée par les auteurs, de l’ordre de 3 200 M-1, est comparable avec la valeur de
la constante de l’étude ce qui suggère un bon accord entre les méthodes fluorimétriques et
chromatographiques.
156
CHAPITRE II
II.2.2 – Détermination des constantes d’affinité aux interfaces K AX et
1
K AX 2
Afin de déterminer les constantes d’affinité aux interfaces K AX1 et K AX 2 , la
concentration en HPβ-CD de la phase mobile a été maintenue constante (à 1mM en HPβ-CD)
et des solutions de MPEG-AdPh à différentes concentrations ont été injectées sur le support.
L’évolution de la rétention du MPEG-AdPh en fonction de la concentration injectée a ainsi
été étudiée. Le modèle représenté par l’Equation II-65, permettant de relier le volume de
rétention ( VR ) d’un pic de soluté à la concentration au sommet du pic, a été appliqué au
système étudié (Figure II-14).
MPEG-AdPh
2000 g/mol
5000 g/mol
11
10
VR-V0
9
(mL)
8
7
Régressions non linéaires du type :
6
V R − V0 =
P1
(P2 + [A]Max )2
+
P3
P4 + [A]Max
2
5
0
2
4
6
8
10
12
14
-3
[MPEG-AdPh]Max (10 mol/mL)
Figure II-14 : Application du modèle décrit par l’Equation II-65 au système chromatographique étudié :
évolution du paramètre (VR-V0) relatif au MPEG-AdPh de masse 2000 et 5000 g/mol en fonction de la
concentration du MPEG-AdPh au sommet du pic ([MPEG-AdPh]Max). Conditions chromatographiques :
injection de 20 µL de MPEG-AdPh de concentrations variables de 0,05 à 6 mg/mL dans l’eau ; éluant :
eau contenant 1 mM en HPβ
β-CD ; débit de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 276 nm.
Il apparaît que les points expérimentaux sont correctement ajustés par une régression
non
linéaire
V R − V0 =
à
quatre
P1
(P2 + [A]Max )
2
+
inconnues
P3
P4 + [A]Max
2
P1 , P2 , P3
et
P4
du
type
. Ce résultat indique que le modèle théorique
157
CHAPITRE II
impliquant la présence de deux types de sites d’interaction sur le support (Equation II-65) est
vérifié par le système de polymères associatifs de l’étude.
Les paramètres K AX1 , K AX 2 , Q X 1 ,Tot et Q X 2 ,Tot relatifs à la présence des deux types de sites
sur le support sont alors déterminés expérimentalement à partir des quatre inconnues
P1 , P2 , P3 et P4 déterminées par le logiciel informatique Origin et des valeurs de K AL du
Tableau II-7 (Cf. Paragraphe II.2.1 de ce chapitre). Les résultats obtenus sont portés dans le
Tableau II-8.
K AX1 (M-1)
37 000 ± 14 000
33 000 ± 12 000
QX 1 ,Tot (µmol)
1,51 ± 0,18
1,11 ± 0,26
K AX 2 (M-1)
1 300 000 ± 560 000
5 300 000 ± 2 200 000
Q X 2 ,Tot (µmol)
0,012 ± 0,0036
0,001 ± 0,0004
R2
0,997
0,987
Tableau II-8 : Constantes d’affinité aux interfaces ( K AX1 ,
K AX 2 ) entre le MPEG-AdPh et l’HPββ-CD et
quantités totales de ligands accessibles immobilisés ( QX 1 ,
Tot
,
Q X 2 ,Tot ) relatifs aux deux types de sites
d’interaction sur le support. Paramètres déterminés à partir du modèle théorique exprimé par l’Equation
II-65 et des valeurs de
K AL du Tableau II-7
Des études antérieures menées par David71 ont permis d’attribuer les types de sites 1 et
2 respectivement aux sites d’interaction spécifiques présents sur le support, les cavités de βCD, et aux sites d’interaction non spécifiques engendrés par la présence de l’agent de
couplage, le 1,4-diisocyanatobutane.
Les constantes aux interfaces K AX1 traduisant l’interaction entre le MPEG-AdPh
injecté et les cavités de β-CD immobilisées sur le support sont relativement élevées avec une
valeur moyenne proche de 35 000 M-1 pour les deux polymères étudiés. Cette valeur est plus
élevée que celles rapportées par la littérature, décrivant par exemple la complexation du 1aminoadamantane (chargé positivement) et de l’acide adamantane-1-carboxylique (chargé
158
CHAPITRE II
négativement) avec un dérivé de β-CD immobilisé sur une surface d’or1, les constantes étant
respectivement de 13 000 M-1 et 2 400 M-1. Néanmoins, cette comparaison reste
approximative car la nature et la charge de la molécule invitée peuvent modifier les
interactions.
Les constantes d’affinité aux interfaces s’avérant relativement élevées, le système
adamantyle / β-CD immobilisée sera évalué dans la suite de ce travail pour élaborer des
supports chromatographiques de fonctionnalités variables (Chapitre III) et les capteurs à
allergènes (Chapitre IV).
Par ailleurs, quelle que soit la masse du MPEG-AdPh considéré, les constantes
d’interaction aux interfaces K AX1 sont environ 7 fois plus élevées que les constantes
respectives obtenues en solution ( K AL , Cf. Tableau II-7). Cette comparaison reste néanmoins
incertaine car les deux systèmes étudiés sont légèrement différents : la constante K AL
caractérise l’association du MPEG-AdPh avec des monomères d’HPβ-CD alors que la
constante K AX1 décrit une interaction avec un copolymère de β-CD et d’épichlorhydrine.
L’environnement des cavités de β-CD est donc différent dans les deux cas.
La différence d’affinité observée entre les systèmes en solution et aux interfaces pourrait
s’expliquer d’un point de vue thermodynamique puisque pour une température donnée, la
constante d’affinité d’un système est reliée aux variations d’enthalpie standard (∆H°) et
d’entropie standard (∆S°) provoquées par l’association des espèces. Néanmoins, la
comparaison des paramètres ∆H° et ∆S° pour les deux systèmes reste délicate car il est
difficile de prédire comment influe la phase d’interaction (phase liquide ou interface
solide/liquide) et la structure chimique des molécules sur les paramètres thermodynamiques
de l’association. D’ailleurs selon le système étudié, la littérature répertorie des constantes
d’interaction aux interfaces parfois plus élevées et parfois plus faibles par rapport aux
constantes en solution correspondantes. A titre d’exemple, la constante d’association entre des
protéines modifiées histidine et des récepteurs est plus importante aux interfaces qu’en
solution76. A l’inverse, le système avidine / biotine possède en solution une constante élevée
de 1015 M-1 alors que des dérivés biotinylés immobilisés sur une surface conduisent à des
constantes bien plus faibles77,78 de l’ordre de 108 à 1011 M-1. Enfin, pour des systèmes à base
d’adamantane plus proches du couple de l’étude, des résultats différents ont également été
constatés. Par exemple, l’interaction de l’adamantan-1-amine avec de la β-CD est plus
159
CHAPITRE II
importante en surface4 qu’en solution2 alors que le phénomène inverse est observé pour le
couple acide adamantane-1-carboxylique / β-CD2,4.
D’autre part, quelle que soit la masse du MPEG-AdPh injecté, le nombre de cavités de
β-CD accessibles de la colonne ( Q X1 ,Tot = 1,51 ou 1,11 µmol selon le polymère considéré) est
inférieur à la valeur obtenue par analyse élémentaire (2,8 µmol), ce qui montre que les
MPEG-AdPh n’ont pas accès à l’ensemble des sites immobilisés sur le support. Ce résultat
était prévisible puisque les groupements AdPh sont liés à la chaîne de polymère et sont
relativement encombrés. Par ailleurs, dans le domaine de masses étudiées, la quantité de sites
spécifiques accessibles aux MPEG-AdPh semble être fonction de la masse du polymère
injecté (Tableau II-8). En effet, le nombre de cavités de β-CD accessibles au polymère de
masse 5000 g/mol est près de 30% inférieur à celui relatif au polymère de masse 2000 g/mol.
Ce phénomène avait déjà été observé par David71 lors de l’étude de MPEG-Nap de masse
2000 et 5000 g/mol sur un support de silice-polyβ-CD de porosité identique (10 nm) à celle
de la présente étude. L’auteur ayant par la suite travaillé avec un support de porosité plus
élevée (40 nm), a montré que ce phénomène n’était pas dû à un problème de porosité du
support.
Ainsi,
ce
résultat
confirmerait l’encombrement
des
polymères
injectés,
encombrement qui semble d’autant plus important que la masse du polymère est élevée. En
effet, il est possible que l’extrémité AdPh responsable de l’interaction du polymère avec le
support, accède d’autant moins facilement aux cavités de β-CD qu’une chaîne
macromoléculaire de taille importante l’entoure.
Par ailleurs, quelle que soit la masse du MPEG-AdPh injecté, le nombre de sites non
spécifiques ( Q X 2 ,Tot = 0,012 ou 0,001 µmol selon le polymère considéré) est 4.104 à plus de
4.105 fois plus faible que la quantité de groupements diisocyanatobutane immobilisée sur la
silice-diol calculée par analyse élémentaire (470 µmol). L’interaction non spécifique
considérée naît sans doute de l’interaction du polymère avec les chaînes alkyle en C4 de
l’agent de couplage. La faible quantité de sites non spécifiques ( Q X 2 ,Tot ) suggère qu’une
grande partie de ces chaînes alkyle est inaccessible au polymère. Ce résultat pourrait
s’expliquer de la manière suivante : (i) les chaînes en C4 des greffons isocyanate qui
n’auraient réagi avec le polyβ-CD doivent être en partie masquées par cette couche de polyβCD et sont alors inaccessibles au MPEG-AdPh injecté, (ii) la quantité de groupements
diisocyanatobutane
calculée
par
analyse
160
élémentaire
représente
les
greffons
CHAPITRE II
diisocyanatobutane fixés soit par une, soit par deux extrémités (réaction de réticulation) à la
silice diol. Or, du fait d’un encombrement stérique, il est probable que seul les premiers types
de greffons soient accessibles au MPEG-AdPh, (iii) une grande quantité d’extrémités
isocyanate libres présentes à la surface de la silice-isocyanate a été impliquée dans la réaction
de greffage avec le polyβ-CD et de ce fait les chaînes alkyle portées par ces groupements ne
sont sans doute plus accessibles au polymère. Par ailleurs, il apparaît que le nombre de sites
non spécifiques accessibles au polymère de masse 5000 g/mol est près de 10 fois inférieur à
celui relatif au polymère de masse 2000 g/mol. Ce phénomène s’expliquerait à nouveau par
l’encombrement des polymères injectés qui serait d’autant plus important que la masse du
polymère est élevée.
D’autre part, quelle que soit la masse du MPEG-AdPh, le nombre de sites spécifiques
accessibles ( Q X 1 , Tot ) est plus bien plus élevé que le nombre de sites non spécifiques ( Q X 2 ,Tot )
avec un rapport proche de 130 et 1100 respectivement pour le polymère de masse 2000 et
5000 g/mol. Il semblerait donc que ce second type de site ait une influence négligeable sur la
rétention des polymères. Néanmoins, l’affinité des sites non spécifiques pour les MPEG-AdPh
est bien plus importante comparativement à celle présentée par les cavités de β-CD. Etant
donné que le facteur de rétention d’un soluté à dilution infinie est défini par l’égalité
k' =
Q X ,Tot .K AX
( 1 + [L]Tot .K AL ).V0
(Cf. Equation II-50, paragraphe II.1.2.a de ce chapitre), la
contribution approximative des deux types de sites dans le processus de rétention des
polymères peut être calculée à l’aide de cette expression (Tableau II-9).
k' 1 =
k' 2 =
9,2
5,9
2,6
0,8
28
14
Q X 1 , Tot .K AX 1
( 1 + [L ]Tot .K AL ).V0
Q X 2 , Tot .K AX 2
( 1 + [L]Tot .K AL ).V0
k' 2
(%)
k'1
Tableau II-9 : Contribution des deux types de sites présents sur le support d’affinité dans le processus de
rétention des MPEG-AdPh. Les valeurs de k’ sont calculées avec [L]Tot = [HPβ
β-CD]Tot = 1 mM et les
valeurs de KAL portées dans le Tableau II-7
161
CHAPITRE II
Il apparaît clairement que les sites non spécifiques ne peuvent être négligés dans le
processus de rétention des polymères et que l’utilisation du modèle à deux types de sites est
essentielle pour permettre une détermination rigoureuse des constantes. Ainsi, sur les Figure
II-13 et Figure II-14, la rétention du MPEG-AdPh de masse 2000 g/mol apparaît supérieure à
celle du polymère de masse 5000 g/mol. Dans le cas présent, cette différence s’explique
principalement par le fait que le polymère de masse 2000 g/mol accède à un nombre de sites
spécifiques mais surtout non spécifiques bien plus important comparativement au polymère de
masse 5000 g/mol. Par ailleurs, en utilisant un modèle considérant la présence d’un unique
type de site sur le support, David71 avait déterminé une constante K AX aux interfaces de
116 000 M-1 pour le MPEG-AdPh de masse 5000 g/mol. Cette valeur est plus élevée que la
constante K AX1 , relative au couple MPEG-AdPh / β-CD immobilisée, déterminée dans le cas
présent. Ceci peut s’expliquer par le fait que la valeur K AX déterminée par David reflète non
seulement les interactions spécifiques MPEG-AdPh / β-CD immobilisée mais également les
interactions de forte affinité MPEG-AdPh / sites secondaires.
III – Conclusion
La constante de complexation entre un polymère modèle de PEG modifié par un
groupement phényladamantyle et des cavités de β-cyclodextrine a été déterminée par des
techniques classiques d’EC et de CLHP. En EC, une constante d’association en solution de
l’ordre de 400 M-1 a été déterminée entre le polymère neutre de MPEG-AdPh et des
molécules chargées de β-cyclodextrine sulfatée. En CLHP, les interactions entre le polymère
neutre de MPEG-AdPh et des molécules neutres de β-cyclodextrine ont été étudiées d’une
part en solution et d’autre part à l’interface solide/liquide. Des constantes d’affinité en
solution et en surface respectivement de l’ordre de 5 000 M-1 et 35 000 M-1 ont été
déterminées. La constante relativement élevée en surface valide le choix d’une chimie de
surface à base de complexes d’inclusion adamantane / cyclodextrine pour l’élaboration de
systèmes analytiques.
162
CHAPITRE II
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES DU CHAPITRE II
163
CHAPITRE II
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
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167
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CHAPITRE III:
MODIFICATION DES PROPRIETES DE SURFACE DE LA SILICE
ETUDE PAR CLHP DES SILICES MODIFIEES
169
CHAPITRE III
La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) est une technique très
fréquemment utilisée pour l’analyse et la purification des biomacromolécules. Cette technique
offre de nombreux avantages tels qu’une résolution excellente, un contrôle simple de la
sélectivité de la colonne, une bonne récupération de l’activité biologique des biomolécules,
une excellente reproductibilité des analyses et l’estimation des paramètres physico-chimiques
caractéristiques du couple soluté / ligand. Les différentes techniques de CLHP permettant
l’analyse et la purification des protéines seront décrites dans la première partie de ce chapitre.
L’objectif de cette étude a été de démontrer la faisabilité d’un procédé basé sur la
formation de complexes d’inclusion pour la fonctionnalisation de surfaces. Pour cela, la
modification chimique des propriétés de surfaces de particules de silice poreuse, par
l’intermédiaire du couple adamantane / β-cyclodextrine, a été testée. Plus précisément, l’idée
a été d’élaborer à partir d’un même matériau de départ (silice modifiée par un polymère de βcyclodextrine) des supports chromatographiques de fonctionnalités variables permettant
l’analyse et la purification des protéines. L’élaboration de ces phases stationnaires et leurs
applications à l’analyse des protéines seront exposées dans une seconde partie. Puis, la
préparation d’un support immunoadsorbant et sa mise en œuvre pour la capture d’antigène
seront également présentées.
I
–
Analyse
et
purification
des
protéines
par
chromatographie liquide à haute performance (CLHP) sur
des supports de silice : état de l’art
I.1 – Utilisation de la silice comme support de base pour l’analyse ou la
purification des protéines par CLHP
Les principales caractéristiques de la silice et certains critères relatifs à son utilisation
comme support pour la CLHP des biomacromolécules ont été récemment résumés par Unger1.
L’utilisation de phases inorganiques à base de silice comme supports de séparation des
biopolymères par CLHP débuta vers 1980. Plusieurs considérations justifièrent ce
développement : (i) les gels mous traditionnels à base de cellulose, de dextrane, d’agarose, de
polyacrylamide ou d’autres polymères hydrophiles synthétiques2 n’offraient pas les mêmes
170
CHAPITRE III
performances de colonne, en terme de résolution et de vitesse, que les remplissages par des
microparticules de silice, employés jusqu’ici pour la CLHP de composés de faibles masses
moléculaires. Par ailleurs, (ii) la synthèse de silices macroporeuses, de porosité moyenne de
50 nm permettait d’envisager l’utilisation de ce matériau pour l’analyse des protéines et (iii)
les connaissances acquises dans les années 1970 sur la modification chimique de la silice
pouvaient être mises à profit pour l’élaboration de silices greffées permettant la séparation des
biomacromolécules3.
I.1.1 - Structure de la silice
La silice (ou dioxyde de silicium) est un polymère inorganique ayant pour formule
(SiO2(H20)m)n. L’agencement spatial autour des atomes de silicium est de type tétraédrique ou
octaédrique et engendre ainsi un système à trois dimensions. Certains atomes de silicium sont
reliés à des fonctions hydroxyle et constituent des groupements appelés silanols. La silice
possède soit une structure amorphe, tel est le cas des matériaux poreux utilisés pour le
remplissage des colonnes en CLHP, soit une structure cristalline4, avec une densité de
squelette (définie par le nombre d’unités SiO2 par unité de volume de phase de 1 nm3)
pouvant varier de 17 à 43. Selon la classification IUPAC, les matériaux poreux sont divisés en
différentes catégories en fonction du diamètre des pores (dp) : les solides microporeux sont
définis par un dp < 2 nm, les solides mésoporeux par un dp compris entre 2 et 50 nm et les
solides macroporeux par un dp > 50 nm. La majorité des supports de silice utilisés en CLHP
sont des matériaux de type mésoporeux ou macroporeux, dont la grandeur dp varie entre 6 et
50 nm, parfois plus, et présentant une interconnectivité des pores élevée.
La silice native est hydrophile et peut physisorber jusqu’à 5 à 10% de son poids en eau
lorsque celle-ci est placée en atmosphère humide. L’eau physisorbée peut être éliminée par
chauffage sous vide à 150 °C. Dans le cas d’une hydroxylation maximale5,6, la concentration
surfacique de groupements hydroxyle atteint 8 à 9 µmol/m2. Les groupes OH de la silice ont
des propriétés d’acide faible de Brøensted avec un pKa de l’ordre de 76,7. Cette valeur de pKa
est à considérer avec réserve puisque selon la méthode de détermination utilisée7 et selon la
pureté de la silice analysée, la grandeur reportée varie entre 2 et 10. Selon Dietrich et coll.8, le
point isoélectrique (pI) de la silice est compris entre 1,5 et 3. Par conséquent, à partir d’un pH
= 3, la surface de silice devient négative et acquiert des propriétés d’échangeur de cations. Les
171
CHAPITRE III
applications de la silice sont limitées en milieu basique. En effet, à partir d’un pH élevé de
l’ordre de 8, la silice devient chimiquement et physiquement instable du fait d’une hydrolyse
des liaisons siloxane et d’une dissolution du matériau, ce dernier phénomène augmentant de
façon exponentielle pour des pH supérieurs à 10.
I.1.2 – Exigences relatives aux particules de silice utilisées comme
support pour la CLHP des protéines
En CLHP des protéines, les objectifs primordiaux d’un chromatographiste sont de
deux ordres : (i) obtenir une séparation de haute résolution dans le cas d’une chromatographie
analytique, (ii) récupérer un produit biologiquement actif et en grande quantité en
chromatographie préparative. A la vue de ces considérations, il apparaît qu’un grand nombre
d’exigences, aussi bien d’un point de vue physique que chimique, doit être respecté.
D’un point de vue chimique, une silice de haute pureté est nécessaire à l’analyse des
protéines. En effet, la présence, même infime, d’ions métalliques dans le matériau conduit soit
à l’adsorption irréversible des protéines sur le support soit à l’apparition d’une traînée des pics
relatifs aux biomolécules.
D’autre part, la silice modifiée chimiquement de façon adéquate, peut servir de phase
inverse, de phase hydrophobe, d’échangeur d’ions ou de support d’affinité pour l’analyse et la
séparation des biomacromolécules9. Ainsi, le contrôle de la sélectivité de la colonne dans les
divers types de CLHP et l’obtention de supports spécifiques pour la reconnaissance
biologique nécessitent une modification et un façonnage de la phase stationnaire par une
chimie de surface parfois sophistiquée et qui doit être reproductible.
D’un point de vue physique, comme dans le cas de l’analyse des composés de faible
masse, les supports mis en jeu doivent être constitués de particules de forme et de taille
uniformes afin de garantir une bonne stabilité des colonnes et des propriétés
hydrodynamiques optimales quels que soient le débit et la composition de la phase mobile.
Par contre, du fait d’une masse moléculaire élevée, la diffusion des biomacromolécules au
travers des pores, remplis de phase mobile, est relativement lente, avec un coefficient de
diffusion de un à deux ordres de grandeur inférieur à celui des petites molécules. De plus, les
protéines possèdent des cinétiques d’adsorption et de désorption relativement lentes
172
CHAPITRE III
auxquelles s’ajoutent parfois, des équilibres secondaires d’association ou de dissociation
engendrant des changements conformationnels et devant alors être pris en compte dans les
modèles théoriques. Afin de pallier à ces problèmes, des petites particules mais des pores de
tailles relativement élevées doivent être utilisés pour permettre d’une part une bonne efficacité
et d’autre part un accès privilégié des solutés à la phase stationnaire. Plus précisément, des
particules de 3 à 5 µm permettent des analyses hautement efficaces. Parallèlement, la
diffusion des biopolymères au sein des pores de la silice et l’accès rapide au ligand greffé sont
facilités lorsque le diamètre de pores moyen (dp) utilisé est environ 10 fois plus élevé que le
diamètre de Stokes calculé pour le soluté.
Pendant
de
nombreuses
années,
les
systèmes
poreux
classiques
évoqués
précédemment ont représenté la majorité des supports utilisés pour l’analyse par CLHP des
protéines. Parallèlement à cette catégorie de support, d’autres types de structures ont été
développées spécialement pour la séparation des biomacromolécules : des silices non
poreuses10,11 de diamètre de particules très faible de l’ordre de 1 à 2 µm et des silices poreuses
monolithiques12 possédant une distribution bimodale de la taille des pores.
I.1.3 – Les monolithes de silice pour la CLHP des protéines
Afin de répondre aux problèmes rencontrés lors de l’utilisation de particules dans
l’élaboration de colonnes pour la CLHP et afin d’optimiser les propriétés du transport de
matière au sein des phases stationnaires, un nouveau type de support, dit monolithique, a été
élaboré12. La méthode utilisée est basée sur un procédé sol-gel. Un hydrogel de silice est tout
d’abord préparé en présence d’un polymère hydrophile, puis l’ensemble est porté à
combustion pour éliminer le polymère et conduire à un système de macropores
interconnectés, dont le squelette est constitué uniquement de silice. La silice est elle-même
poreuse et contient des mésopores. Les macropores permettent une diffusion rapide de
l’éluant au sein de la phase stationnaire, réduisant ainsi la durée de l’analyse. Les mésopores
quant à eux, forment la structure finement poreuse au sein de la colonne et créent ainsi une
surface d’échange importante avec le soluté présent dans la phase mobile. Les deux types de
pores obtenus peuvent être variés de façon indépendante. Cette nouvelle conception des
supports poreux, développée par Nakanishi12 et introduite par Tanaka13 en CLHP, permet des
173
CHAPITRE III
séparations rapides avec une très faible pression en tête de colonne et une efficacité
importante.
Certes la silice présente quelques inconvénients par rapport aux supports organiques
puisque même lorsque sa surface est recouverte de façon optimale, la matrice inorganique
reste accessible et peut conduire à des interactions non spécifiques induisant une perte de
résolution et un risque de dénaturation des protéines. D’autre part, la stabilité chimique
limitée de ce matériau en milieu basique impose certaines contraintes pour l’utilisation des
silices greffées. Néanmoins la silice reste un support privilégié pour l’analyse des protéines
par CLHP. En effet, comparativement aux gels mous, la silice est un matériau très stable
mécaniquement. De plus, sa surface spécifique et sa porosité peuvent être adaptées pour
contrôler le phénomène de transfert de masse et la rétention des solutés. Enfin, des sélectivités
importantes peuvent être obtenues en greffant sur le support d’origine des ligands présentant
une reconnaissance moléculaire spécifique.
I.2 – Analyse et purification des protéines par chromatographie d’exclusion
stérique (SEC)
Dans le domaine de la chimie des protéines, la chromatographie d’exclusion stérique
(SEC) est fréquemment utilisée comme première étape de purification afin d’isoler les
protéines d’intérêt des autres molécules possédant des tailles différentes. La SEC est
également une technique de mise en oeuvre facile permettant d’obtenir des informations sur la
taille et sur la forme d’une molécule.
I.2.1 - Phases stationnaires à base de silice utilisées pour l’analyse des
protéines en SEC
a) Modification chimique de la silice
Afin d’être adaptés à la SEC des protéines, les supports de silice utilisés doivent être
recouverts par une couche de composés organiques hydrophiles. Cette étape est essentielle car
174
CHAPITRE III
elle conduit à la passivation des silanols du support et, de ce fait, permet d’éliminer les
contacts ou les interactions non spécifiques entre la protéine et la phase stationnaire. Ainsi le
risque de dénaturation des biomolécules est diminué.
Les composés de « passivation » fréquemment employés sont des silanes, notamment
le 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane14, ou des polymères neutres15. Des dextranes chargés
positivement par des groupements diéthylaminoéthyle (DEAE) conduisent également à un
écrantage satisfaisant16,17. Les phases stationnaires obtenues sont généralement inertes
chimiquement mais peuvent tout de même présenter un faible caractère hydrophobe sous
certaines conditions de phase mobile, notamment pour des fortes concentrations en sel18.
D’autre part, le processus de passivation étant limité, quelques charges négatives subsistent et
confèrent au matériau des propriétés ioniques18. Néanmoins, les supports commerciaux
actuels possèdent des propriétés hydrophobes et ioniques réduites dans des conditions
standard d’utilisation (éluant de pH = 7 et constitué d’un sel à la concentration de 0,1 M).
b) Diamètre des pores de la silice
Le volume total de phase mobile (VM) dans la colonne peut être décomposé en deux
parties : le volume interstitiel ( VI ) extérieur aux pores et le volume poreux ( VP ). VI
représente le volume de phase mobile nécessaire pour transporter une molécule de grande
taille supposée exclue des pores. VM = VI + VP correspond au volume nécessaire pour éluer
une petite molécule pouvant pénétrer dans tous les pores. Les volumes de rétention sont donc
compris entre VI et VM . Plus particulièrement, en l’absence d’interactions avec le support, le
volume de rétention ( VR ) d’une molécule de taille intermédiaire est défini par la relation
suivante :
VR = VI + K D .VP
Equation III-1
avec K D , coefficient de partage ou coefficient de distribution, représentant le degré de
pénétration d’une espèce dans le volume poreux. Ce paramètre est donc compris entre 0 et 1
et est déterminé expérimentalement par :
KD =
VR − VI
VM − V I
Equation III-2
175
CHAPITRE III
Pour une série homogène de biomacromolécules, le logarithme décimal de la masse
moléculaire est une fonction linéaire du coefficient de distribution19 (Erreur ! Source du
renvoi introuvable.). La courbe ainsi obtenue, appelée courbe de calibration ou courbe
d’étalonnage, présente généralement une déviation à la linéarité pour des valeurs du
coefficient de distribution ( K D ) proches de 0 et de 1. Par contre, une déviation individuelle à
la linéarité peut refléter une différence de forme de la biomolécule ou l’existence
d’interactions avec la phase stationnaire.
DNA
106
Thyroglobulin
β-Amylase
ADH
BSA
Ovalbumin
β-Lactoglobulin
Carb. Anhydrase
RNase
Cytochrome C
104
MW
(g/mol)
Gly tyr
102
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
KD
Figure III-1 : Exemple d’une courbe d’étalonnage relative à des biomacromolécules en chromatographie
d’exclusion stérique. (Résultats obtenus sur une colonne SynChropak GPC 100, de dimensions 250 × 4,6
mm diamètre interne ; phase mobile : phosphate de potassium à 0,1 M, pH = 7 ; débit de la phase mobile :
0,5 mL/min). D’après Freiser et Gooding20
Le support de SEC le plus adapté à l’analyse d’un soluté est bien entendu celui qui
permet une élution dans le domaine linéaire de la courbe. La majorité des protéines
globulaires, possédant une masse inférieure à 200 000 g/mol, sont analysées selon leur masse
sur des supports de porosités égales à 10 ou 30 nm. Les protéines dénaturées quant à elles,
possèdent un volume hydrodynamique plus important et sont analysées sur des supports de
porosités plus élevées. L’homogénéité de la taille des pores d’un support est nécessaire à une
séparation de qualité. Une très bonne homogénéité se traduit par une pente de la courbe de
176
CHAPITRE III
calibration faible et par un domaine de linéarité étendu sur la gamme des coefficients de
distribution. De telles conditions sont alors idéales pour séparer au mieux des protéines de
masses moléculaires proches19. Le volume des pores est également un paramètre influençant
la qualité du support. En effet, la séparation des solutés s’effectue à l’intérieur des pores de la
phase stationnaire ; de ce fait, il est important de travailler avec des volumes poreux élevés.
Néanmoins, la fragilité du matériau aux pressions appliquées lors du remplissage de la
colonne limite le choix de ce paramètre.
I.2.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en SEC
Les analyses par SEC s’effectuent dans des conditions d’élution isocratique et sont
donc relativement rapides. Du fait d’un temps de contact limité avec le support, les protéines
étudiées peuvent conserver leur activité biologique à condition qu’un éluant approprié soit
également utilisé. Le pH de la phase mobile est limité à des valeurs comprises entre 2 et 8 du
fait de la solubilisation de la silice dans les milieux basiques. Ce point n’est en rien limitant
pour l’analyse des biomolécules puisque ce domaine correspond également à leur domaine de
stabilité. Les phases mobiles optimales utilisées avec des supports dérivés de la silice sont des
solutions salines de concentrations variables entre 0,05 et 0,2 M. Cette proportion en sel est
suffisante pour compenser la nature faiblement ionique du support et reste relativement basse
pour ne pas produire d’effets hydrophobes majeurs. Cependant, lors de l’analyse de certaines
protéines, ces deux phénomènes parasites ne sont pas toujours correctement masqués et une
modification de l’éluant est alors nécessaire. Par ailleurs, la solubilisation de certaines
biomolécules, telles que les protéines membranaires, nécessite l’utilisation d’additifs21 tels
que le glycérol22, les solvants organiques23,24 et les tensioactifs21,25,26. Malencontreusement
certains de ces additifs peuvent conduire à la dénaturation de la protéine, si bien, que les
changements résultants au niveau de la forme et du volume hydrodynamique de la
biomacromolécule doivent être pris en compte dans l’interprétation des résultats.
En conclusion, la chromatographie d’exclusion stérique permet de séparer des
protéines en fonction de leur taille. Cette technique peut être utilisée dans un but analytique et
préparatif. Les supports à base de silice employés en SEC sont recouverts d’une couche
organique hydrophile pour limiter les interactions non spécifiques protéine / support.
177
CHAPITRE III
L’hydrophilie de ces supports ainsi que l’application de conditions d’analyse rapide
permettent de limiter le risque de dénaturation des protéines.
I.3 – Analyse et purification des protéines par chromatographie liquide à
haute performance sur phase inversée (RP-CLHP) sur des supports à base
de silice
La CLHP sur phase inversée (RP-CLHP) est une méthode couramment utilisée pour
l’analyse et la purification des protéines27-29. De nombreuses raisons ont justifié la popularité
de ce système ; en effet, la chromatographie sur phase inversée présente :
- une excellente résolution même pour des composés de structures chimiques extrêmement
proches
- une sélectivité facilement contrôlable par modification de la nature de l’éluant
- une excellente reproductibilité des analyses sur des périodes de temps importantes.
La CLHP de phase inversée consiste à séparer des solutés selon leur caractère
hydrophobe. Deux mécanismes sont responsables de la rétention des protéines dans la
colonne : une expulsion hydrophobe de la biomolécule par la phase mobile polaire et une
adsorption concomitante sur les sites apolaires de la phase stationnaire. Les systèmes de RPCLHP sont couramment constitués par des phases de silice préalablement modifiée par des
chaînons n-alkyle. Les protéines sont alors éluées et séparées grâce à un gradient de
concentration croissante en solvant organique. L’instrumentation et les colonnes actuelles
permettent de séparer des mélanges complexes et de collecter des quantités infimes de solutés
de l’ordre de la picomole. Les séparations sont facilement contrôlables par la modification de
la pente du gradient, de la composition de l’éluant ou de la température.
protéines en RP-CLHP
Le choix de la phase stationnaire est une étape déterminante pour l’efficacité des
séparations obtenues. Les supports chromatographiques couramment utilisés en RP-CLHP
sont des microparticules de silice poreuse, modifiée par un dérivé silane contenant des
178
CHAPITRE III
chaînons hydrophobes alkyle3,30. Les ligands les plus couramment greffés sont le n-butyle, le
n-octyle et le n-octadécyle. Malgré le greffage d’une importante densité de greffons sur le
support, des groupes silanol résiduels restent accessibles. Par conséquent, deux paramètres
jouent un rôle essentiel dans le processus d’interaction chromatographique : (i) le caractère
hydrophobe relatif des ligands immobilisées et leur flexibilité (ii) la présence des groupes
silanol résiduels agissant comme des acides faibles avec les résidus basiques des protéines et
conduisant à une diminution de la résolution. La nature des chaînons greffés est donc un des
facteurs importants pouvant être varié afin de modifier la sélectivité de la colonne. Cependant,
les phases stationnaires à base de chaînes longues ne sont pas recommandées si l’on veut
éviter la dénaturation des biomacromolécules. En effet, les supports les plus hydrophobes
nécessitent l’utilisation de concentrations plus élevées en solvant organique pour désorber les
protéines de la colonne et peuvent alors conduire à la dénaturation des biomolécules. Dans
l’idée de contrôler le phénomène de dénaturation des protéines, des supports poreux et non
poreux à base de silice ont été modifiés par des polymères à base de polyméthacrylates plus
ou moins hydrophobes
31
. Parallèlement, ces supports ont été traités de façon à masquer
totalement l’ensemble des silanols résiduels, et ce, afin d’observer uniquement l’influence du
caractère hydrophobe du ligand immobilisé. Dans ces conditions, il a été montré que le
caractère hydrophobe du support conditionne le degré de dénaturation de la protéine en
conduisant à différents changements de conformation, et par là même, permet de contrôler la
sélectivité de la colonne. Plus précisément, les auteurs se sont intéressés à la séparation d’un
mélange composé de lysozyme, de cytochrome c et de myoglobine. Lors de l’injection de ce
mélange sur des supports à base de polyméthacrylates de caractère hydrophobe croissant, il
est apparu que la structure tertiaire du cytochrome c et de la myoglobine restait inchangée
alors que celle du lysozyme était modifiée. La dénaturation du lysozyme s’est révélée d’autant
plus marquée que le support utilisé était hydrophobe. Sachant que le cœur d’une protéine
native inclut la majorité des groupements hydrophobes de la biomolécule, la dénaturation du
lysozyme a engendré l’exposition de nouveaux groupes hydrophobes à la surface de la
protéine et a conduit d’une part à l’augmentation de sa rétention sur le support et d’autre part
à la modification de la sélectivité de la colonne.
En RP-CLHP, l’utilisation de phases hydrophobes de natures variées permet de
contrôler la sélectivité et la résolution de la colonne. Néanmoins, cette liberté de choix des
substituants hydrophobes du support est limitée si l’on veut éviter de dénaturer les protéines.
Dans ce cas, il est préférable d’utiliser des greffons de caractère hydrophobe moins marqué
tels que des chaînons n-butyle.
179
CHAPITRE III
I.3.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en RPCLHP
La possibilité de contrôler la résolution des séparations en RP-CLHP par un simple
changement de la composition de la phase mobile constitue une importante caractéristique de
ce type de chromatographie. Les analyses de biomolécules par chromatographie de phase
inversée mettent en jeu une phase mobile polaire constituée d’une solution aqueuse acide à
laquelle est ajouté graduellement un solvant organique.
L’étude des biomacromolécules par RP-CLHP s’effectue préférentiellement à des pH
< 3. En effet, l’utilisation de solutions acides se justifie de deux façons : la colonne est bien
plus stable chimiquement à des faibles pH et les groupes silanol résiduels, sous forme
protonée, interviennent peu dans le processus d’interaction chromatographique. Les pics de
protéines obtenus sont alors beaucoup plus fins. La nature de l’acide utilisé influe sur la
sélectivité et la résolution de la colonne. Les phases mobiles les plus couramment utilisées
sont des solutions faiblement concentrées (à 10 mM) d’acide trifluoroacétique (TFA), d’acide
phosphorique, d’acide perchlorique ou d’acide heptafluorobutyrique32. Dans certains cas, des
tensioactifs non chargés peuvent également être utilisés pour l’analyse de protéines très
hydrophobes comme les protéines membranaires33.
Le gradient d’élution appliqué au système, de concentration croissante en solvant
organique, est un procédé nécessaire à la séparation des biomolécules par RP-CLHP. La
nature du solvant organique (acétonitrile, méthanol, éthanol, propanol ou isopropanol) influe
non seulement sur la sélectivité de la colonne mais également sur la conformation des
protéines et peut alors avoir un impact important sur le degré de récupération de l’activité
biologique de l’échantillon34. Les solvants organiques les plus couramment utilisés sont
l’acétonitrile, le méthanol et l’isopropanol. Chacun de ces éluants présente une transparence
optique aux longueurs d’onde d’absorption utilisées pour l’analyse des protéines et
l’acétonitrile est utilisé de façon préférentielle car il présente la plus faible viscosité.
I.3.3 - Prévision de la rétention des protéines en RP-CLHP : modèles
théoriques
180
CHAPITRE III
Le nombre d’applications de la RP-CLHP pour la purification des protéines s’est accru
très rapidement au cours de ces deux dernières décennires. Toutefois, le développement de
modèles
théoriques
complets,
capables
de
décrire
parfaitement
les
processus
thermodynamiques et cinétiques mis en jeu par les interactions entre des protéines et une
phase non polaire, a été limité, du fait de la structure complexe des biomacromolécules. En
l’absence d’approches rigoureuses capables de prédire la rétention des protéines ainsi que le
profil du signal, plusieurs modèles empiriques ont été décrits et appliqués à l’analyse des
protéines35-39.
Selon le modèle du déplacement stoechiométrique développé par Geng et Regnier35 ,
le logarithme décimal du facteur de rétention ( log k' ) d’une protéine lors d’une analyse
isocratique peut être exprimé comme une fonction linéaire du logarithme décimal de la
concentration molaire [ D0 ] en solvant organique dans la phase mobile :
log k' = log I − Z . log[ D0 ]
Equation III-3
où I représente la valeur du facteur de rétention pour une concentration [ D0 ] =1 M et où Z
est la pente de la droite obtenue en traçant l’évolution de log k' en fonction de − log[ D0 ] .
Les paramètres I et Z sont donc déterminés expérimentalement.
Un autre modèle, établi également pour l’analyse des protéines dans des conditions
d’analyse isocratique, exprime le logarithme décimal du facteur de rétention ( log k' ) de la
protéine comme une fonction linéaire de la fraction volumique (ψ ) en solvant organique de la
phase mobile40 :
log k' = log k' 0 − Sψ
Equation III-4
où k' 0 représente la valeur extrapolée du facteur de rétention pour une fraction ψ = 0 et S est
la pente de la droite obtenue en traçant l’évolution de log k' en fonction de − ψ . Ainsi, les
paramètres k' 0 et S sont déterminés expérimentalement. Ces deux grandeurs sont
181
CHAPITRE III
caractéristiques de la protéine et du solvant mis en jeu et sont dépendantes de nombreux
paramètres dont la température et le pH de l’éluant.
Généralement, les courbes représentant l’évolution de la rétention de protéines,
séparées sur des supports de silice-n-alkyle en présence d’une phase mobile constituée d’un
mélange solution aqueuse/solvant organique, sont incurvées plutôt que linéaires (Erreur !
Source du renvoi introuvable.). Ceci suggère l’apparition d’un second processus
chromatographique au delà d’une proportion critique en solvant organique. Les
représentations obtenues présentent tout de même une gamme opérationnelle (aux plus faibles
proportions volumiques en solvant) sur laquelle le logarithme décimal du facteur de rétention
( log k' ) de la protéine décroît linéairement avec l’augmentation de la fraction volumique (ψ )
en solvant organique de phase mobile. Les valeurs de k' 0 et S peuvent alors être déterminées
sur ce domaine.
Par ailleurs, les représentations de log k' en fonction de ψ sont extrêmement sensibles
à la nature du soluté (Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Les courbes (c) et (d)
représentent le comportement type d’une phase inversée sur la rétention de polypeptides et
protéines fortement hydrophobes, tandis que les courbes (a) et (b) mettent en avant l’influence
du paramètre ψ sur la rétention de peptides et petites protéines polaires.
log k’
ψ
182
CHAPITRE III
Figure III-2 : Représentation schématique de l’évolution de la rétention de peptides et protéines sur un
support de RP-CLHP40 en fonction de la fraction volumique en solvant organique : élution de peptides et
petites protéines polaires (a et b) et de polypeptides et protéines fortement hydrophobes (c et d)
Le modèle précédent, défini pour des conditions d’élution isocratique a été étendu à la
rétention des protéines dans des conditions d’élution de gradient linéaire. Dans ce cas, une
relation analogue à l’Erreur ! Source du renvoi introuvable. lie le logarithme décimal du
facteur de rétention médian ( log k' ) de la protéine et la fraction volumique médiane (ψ ) en
solvant organique de la phase mobile35,41 :
log k' = log k' 0 − Sψ
Equation III-5
où ψ représente la valeur de la fraction volumique en solvant organique lorsque la bande de
soluté passe par le centre de la colonne42, k' 0 représente la valeur extrapolée du facteur de
rétention pour une fraction ψ =0 et S est la pente de la droite obtenue en traçant l’évolution
de log k' en fonction de −ψ . Les paramètres S et k' 0 sont à nouveau déterminés
expérimentalement.
En conclusion, la chromatographie de phase inversée permet de séparer des protéines
selon leur caractère hydrophobe. Les phases stationnaires employées en RP-CLHP sont
essentiellement des phases de silice recouvertes par des chaînons n-alkyle. La phase mobile
utilisée est une phase polaire composée d’un mélange d’une solution aqueuse d’acide et de
solvant organique. La sélectivité de la colonne et la résolution d’une séparation peuvent être
facilement contrôlées en changeant la nature des substituants greffés sur le support et la
composition de la phase mobile. Néanmoins, la RP-CLHP peut conduire à la dénaturation de
la protéine. Afin de réduire ce risque, des supports possédant des chaînons relativement courts
tels que le n-butyle doivent être privilégiés.
I.4 – Analyse et purification des protéines par chromatographie
d’interaction hydrophobe à haute performance (HIC)
La chromatographie d’interaction hydrophobe à haute performance (HIC) est un
procédé fréquemment utilisé pour la purification des protéines et présente l’avantage de
préserver l’activité biologique de ces dernières. La HIC a été reportée pour la première fois
183
CHAPITRE III
dans les années 1950 sous le nom de « salting out chromatography »43-45. Cette méthode
consiste à séparer des solutés selon leur caractère hydrophobe. Des supports modifiés
chimiquement par des substituants hydrophobes sont mis en jeu. Grâce à l’utilisation d’un sel
fortement concentré, les protéines sont adsorbées sur la phase stationnaire puis une diminution
de la concentration en sel de l’éluant permet de réduire les interactions protéines/support et
conduit à l’élution sélective des biomolécules.
La comparaison entre la HIC et la RP-CLHP est intéressante car les mécanismes de
rétention impliqués sont basés sur le même principe d’hydrophobie. Il a été constaté que les
deux procédés peuvent mener à des ordres d’élution différents46. Ce résultat peut être expliqué
par une différence de conformation des protéines lors de l’analyse. En effet la HIC s’oppose
par deux faits à la RP-CLHP : (i) la phase de HIC est modifiée par des chaînons alkyle plus
courts et avec une densité faible, (ii) les conditions d’analyse en HIC sont plus douces, avec
l’utilisation d’une phase mobile de pH proche de 7 et contenant rarement un solvant
organique. Par conséquent, les protéines séparées par HIC subissent peu de changements
conformationnels et sont récupérées avec leur activité biologique.
protéines en HIC
Les supports de silice utilisés en chromatographie d’interaction hydrophobe sont
totalement recouverts par une mince couche d’un polymère hydrophile. Des substituants
hydrophobes de type n-alkyle ou aryle sont ensuite liés au polymère avec une faible densité.
La nature du groupement hydrophobe est très importante et peut être variée afin de modifier la
rétention des solutés et la sélectivité de la colonne47. Des greffons hydrophiles comme
l’hydroxypropyle peuvent également être utilisés mais permettent de retenir uniquement les
biomolécules à très fort caractère hydrophobe. A titre de comparaison, des chaînes comme le
pentyle, interagissent fortement avec de nombreuses biomolécules à caractère hydrophobe
plus ou moins marqué et même avec des protéines hydrophiles. Les phases stationnaires
greffées synthétisées sont très stables, permettant alors un grand choix dans les conditions
éluantes et l’application de procédés de rinçage parfois nécessaires à la régénération des
colonnes.
184
CHAPITRE III
I.4.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en HIC
Les phases mobiles utilisées en HIC sont généralement constituées d’un mélange de
sels antichaotropiques, de tampons et d’additifs (ions métalliques, solvants organiques ou
tensioactifs).
Différents critères justifient le choix de la nature du sel. D’une part, le sel doit être de
type antichaotropique afin de limiter la solubilisation de la protéine dans la phase mobile et de
favoriser l’interaction avec le support. Par ailleurs, il doit être hautement soluble pour être
utilisé à de fortes concentrations et être optiquement transparent aux longueurs d’onde de
travail. Le sulfate d’ammonium répondant à l’ensemble de ces critères est couramment utilisé.
Concernant la nature du tampon mis en jeu, un fort pouvoir tampon dans le domaine de
neutralité et une transparence optique sont exigés. Ainsi le phosphate de sodium, le phosphate
de potassium et le tris(hydroxyméthyl)amino-méthane (Tris), de concentrations variables
entre 50 et 100 mM, sont fréquemment utilisés.
L’ajout d’additifs dans la phase mobile peut changer la rétention relative des protéines
et affecter la séparation. De nombreuses études faisant appel à une variété d’additifs, tel que
des ions métalliques48-50 (calcium, magnésium), des solvants organiques49,51 (alcool
polyhydrique, acétonitrile) et des tensioactifs49,51-53 (Tween, Triton X-100 et CHAPS), ont été
menées. Les résultats issus de ces travaux ont montré que la présence d’additifs dans la phase
mobile permet d’élargir le champ des séparations en augmentant le domaine de sélectivité de
la colonne.
I.4.3 - Prévision de la rétention des protéines en HIC : modèle
théorique
Melander et Horvath54,55 ont étendu l’utilisation de la théorie solvophobe56 pour
décrire les effets de sels sur la rétention des protéines en HIC.
Dans des conditions d’élution isocratique et pour des forces ioniques élevées, le
logarithme décimal du facteur de rétention ( log k' ) d’une protéine peut être exprimé comme
une fonction linéaire de la concentration molaire en sel ( CS ) de l’éluant :
log k' = log k 0 ' − HC S
Equation III-6
185
CHAPITRE III
Cette relation est analogue à celle utilisée pour la chromatographie de phase inversée (Cf.
Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Les paramètres H et k' 0 (facteur de rétention du
soluté extrapolé pour une concentration nulle en sel) sont caractéristiques de la protéine et du
sel mis en jeu et sont déterminés expérimentalement, respectivement à partir de la pente et de
l’ordonnée à l’origine de la représentation portant log k' en fonction de − C S .
La terme H peut être défini en fonction de nombreux paramètres d’après la relation
suivante57 :
H = ( Aµ − υ − NBσ )
1
RT
Equation III-7
Les coefficients Aµ et υ sont reliés à la constante diélectrique du milieu, au moment dipolaire
de la molécule et aux interactions de Van der Waals et sont supposés constants pour une
protéine et un système chromatographique donnés. A et B sont des constantes liées
respectivement à la taille et à la charge nette de la protéine, σ représente l’augmentation de la
tension de surface molaire du sel contenu dans l’éluant lors du processus d’interaction
protéine/support, N le nombre d’Avogadro, R la constante des gaz parfaits et T la température
absolue.
De même qu’en chromatographie de phase inversée, les courbes représentant
l’évolution de la rétention des protéines en fonction de la concentration en sel de la phase
mobile sont incurvées plutôt que linéaires57. Les représentations obtenues présentent
également une gamme opérationnelle, sur laquelle le paramètre log k' décroît linéairement
avec la diminution du paramètre C S . Les paramètres H et de k' 0 sont donc déterminées sur
cette gamme.
Pour conclure, le principe de la chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC) est
similaire à celui de la RP-CLHP puisqu’il s’agit de séparer des composés selon leur caractère
hydrophobe. Néanmoins, les supports utilisés en HIC sont moins hydrophobes que ceux mis
en jeu en RP-CLHP (chaînons alkyle plus courts et densité de greffage plus faible). D’autre
part, la phase mobile est généralement constituée d’un mélange de sels et de tampons et
l’utilisation d’un solvant organique est limitée. Les conditions d’analyse en HIC permettent
donc de limiter le risque de dénaturation des protéines par rapport à la RP-CLHP.
186
CHAPITRE III
I.5 – Analyse et purification des protéines par chromatographie d’échange
d’ions à haute performance (IEC)
La chromatographie d’échange d’ions (IEC) a été la technique la plus répandue pour la
séparation et la purification des biomacromolécules depuis l’introduction des échangeurs
d’ions à base de cellulose dans les années 1950. En effet, les protéines sont des molécules
amphotères possédant un pI caractéristique, qui peuvent ainsi être séparées par IEC (Erreur !
Source du renvoi introuvable.).
Charge nette (-)
Charge nette (+)
pI
Rétention
Echange
de cations
Echange
d’anions
pH
Figure III-3 : Relation théorique entre la charge nette d’une protéine et sa rétention en chromatographie
d’échange d’ions58
La chromatographie d’échange d’ions est souvent utilisée comme première étape dans
le schéma d’une purification car sa forte capacité chromatographique permet d’éliminer de
nombreux contaminants de charges différentes de celle de la protéine d’intérêt. Ceci est
particulièrement important dans le cas des fluides biologiques où les protéines à purifier
peuvent être à de très faibles concentrations comparativement à d’autres substances telles que
l’albumine.
C’est au milieu des années 1970 que la purification des protéines a été améliorée
lorsque Regnier et coll.15,59,60 ont développé des phases adsorbantes à base de silice pour
l’IEC permettant des analyses rapides et efficaces.
187
CHAPITRE III
protéines en IEC
Les
propriétés
d’échange
d’ions
(anionique
ou
cationique)
d’une
phase
chromatographique sont déterminées par le type de groupes ioniques liés au support. Ceux-ci
peuvent être introduits sur la silice par greffage ou par dépôt d’un polymère portant des
charges. Les termes d’échangeur « faible » ou « fort » ont été introduits pour définir
respectivement des supports dont la densité de charges est dépendante ou au contraire
indépendante du pH. Ainsi, des supports échangeur d’anions dits « faibles » contiennent
fréquemment des amines primaires, secondaires ou tertiaires et sont obtenus principalement
avec des substituants diéthylaminoéthyle (DEAE) et polyéthylèneimine (PEI). Les échangeurs
d’anions « forts », quant à eux, possèdent des fonctions ammonium quaternaire.
Parallèlement, des supports échangeur de cations « faibles » sont généralement constitués de
fonctions acide carboxylique et leurs semblables dits « forts » contiennent des groupes acide
sulfonique. Des supports aux propriétés mixtes, présentant une affinité pour les anions et pour
les cations, sont également utilisés pour l’IEC des protéines61,62.
Les phases stationnaires greffées obtenues à partir de la silice présentent des propriétés
thermodynamiques et cinétiques conduisant à des efficacités de colonne élevées, à un contrôle
de la sélectivité et une reproductibilité des séparations63,64. Par ailleurs, l’utilisation de la silice
permet des analyses rapides. En effet, le matériau à base de silice est rigide et capable de
résister à des débits élevés à l’inverse des gels à base de carbohydrates qui sont facilement
compressés et dont le volume peut changer suivant la composition de la phase mobile. De
plus, les supports à base de silice peuvent être utilisés avec des phases mobiles
hydroorganiques et même avec des éluants organiques purs. Néanmoins, leur capacité
d’échange est relativement faible comparativement à celles des phases stationnaires issues des
autres types de matériaux.
D’autres supports à base de silice utilisés pour l’analyse des protéines en IEC sont
recouverts par une mince couche d’un polymère contenant des groupements chargés
appropriés15,65-67. La couche macromoléculaire doit être extrêmement fine pour permettre un
transfert de masse rapide ; elle doit également recouvrir totalement la surface de la silice pour
masquer les silanols et ne pas restreindre l’accès aux pores.
188
CHAPITRE III
Les premiers supports de silice modifiée par un polymère adsorbé ont été introduits
par Albert et Regnier65 en 1979. La méthode mise en jeu consiste à adsorber un polymère
cationique de polyéthylèneimine (PEI) sur une surface de silice puis à stabiliser le polymère
en effectuant une réticulation de celui-ci. Les supports échangeurs d’anions ainsi obtenus ont
permis la séparation de protéines avec une haute sélectivité et un bon recouvrement de leurs
propriétés biologiques. Par la suite, un procédé similaire (conduisant également à des
échangeurs d’anions) a été développé par Sébille et coll.68-71 et consiste à adsorber et réticuler
sur de la silice un homo- ou copolymère du polyvinylimidazole (PVI). Les échangeurs de
cations sont un peu plus délicats à obtenir ; ils nécessitent l’adsorption d’un polymère neutre,
tel un copolymère de N-N’ diméthylacrylamide (DMA) et d’acrylate de glycidyle
72
, ou
positif, tel le PEI73, sur la silice, puis sa modification chimique afin de créer des sites
anioniques. Millot et coll.74 ont élaboré des supports échangeurs d’ions aux propriétés
variables (anionique ou cationique) en déposant sur de la silice des couches successives de
polyélectrolytes de charges opposées. Ce procédé qui consiste en un simple processus
d’interactions électrostatiques permet d’obtenir successivement des échangeurs d’anions ou
de cations suivant le nombre de couches de polymères immobilisées.
La plupart des supports élaborés pour la IEC présente un faible caractère hydrophobe
de par la présence de l’agent de réticulation utilisé pour la synthèse de la couche
macromoléculaire. Dans certains cas, des concentrations élevées en sel antichaotropique sont
volontairement utilisées afin d’accentuer le caractère hydrophobe et produire des interactions
multi modes75,76.
I.5.2 - Phases mobiles utilisées pour l’analyse des protéines en IEC
Une des premières considérations pour le choix de la phase mobile est bien sûr la
solubilité et la stabilité de la protéine. Par ailleurs, du fait de la nature amphotère des protéines
et de l’existence de sites multiples d’interaction, des gradients doivent généralement être
utilisés pour conduire à une séparation optimale et reproductible d’un mélange. Plus
précisément, les protéines sont d’abord adsorbées sur la phase stationnaire grâce à l’utilisation
d’un éluant de faible force ionique et de pH adéquat, pour lequel les protéines et le support
sont convenablement ionisés et de charges opposées. Un gradient de force ionique croissante
est ensuite appliqué au système afin de diminuer les interactions protéine/support et d’éluer
189
CHAPITRE III
sélectivement les protéines en fonction de leurs charges. Des gradients de pH peuvent
également être utilisés pour désorber les biomolécules. Avec la plupart des supports de silice
utilisés en IEC des protéines, un gradient de sel atteignant une concentration de 1M est
suffisant pour désorber l’ensemble des protéines et autres molécules ioniques d’un mélange,
et ce, sans altérer la colonne. Les principaux sels utilisés en IEC sont le chlorure de sodium et
l’acétate de sodium, ou parfois, l’acétate d’ammonium (lorsqu’un solvant volatilisable est
nécessaire). La nature du sel utilisé dans le gradient d’élution conditionne la rétention des
protéines et la sélectivité de la colonne 77,78
Généralement, le pH de la phase mobile doit être au moins de 0,5 unité pH au dessus
du pI de la protéine pour la chromatographie d’échange d’anions et l’inverse pour une analyse
par échange de cations. Cette règle possède des exceptions car le pI reflète l’ensemble des
acides aminés constituant la protéine, mais lors d’une séparation dans des conditions non
dénaturantes, seuls les acides aminés de la surface sont impliqués dans le processus
chromatographique d’échange d’ions79,80. Pour les échangeurs d’ions de type « faible », le pH
de la phase mobile détermine également le degré d’ionisation des groupes fonctionnels81
immobilisés sur la phase stationnaire.
Dans certains cas, il peut s’avérer nécessaire d’utiliser des additifs à la phase mobile
pour améliorer la stabilité et la solubilité des protéines et faciliter la récupération de l’activité
biologique. A titre d’exemple, l’utilisation d’un tensioactif neutre tel que le Genapol X-100
augmente la solubilité de certaines protéines membranaires82 et l’addition du βmercaptoéthanol permet de protéger les protéines de l’oxydation. Des solvants organiques
peuvent également être utilisés pour l’élution des biomolécules83, mais des précautions
doivent être prises si ce dernier est combiné avec des sels afin d’éviter un phénomène de
précipitation.
I.5.3 - Prévision de la rétention des protéines en IEC : modèles
théoriques
La rétention d’une protéine en chromatographie d’échange d’ions est fonction de trois
facteurs principaux :
190
CHAPITRE III
- le nombre et la distribution des sites ioniques sur la biomacromolécule, paramètres
gouvernant la topographie de surface et l’aire de contact électrostatique de la protéine vis à vis
de la phase stationnaire,
- la densité de charge de la phase stationnaire,
- la composition de la phase mobile (notamment la nature et la concentration du sel).
La concentration en sel de la phase mobile est le paramètre le plus fréquemment
modifié afin de contrôler le processus chromatographique d’échange d’ions. Boardman et
Partridge84 ont utilisé la loi d’action de masse pour décrire la fixation réversible des protéines,
en présence de sel dans la phase mobile, sur les sites ioniques présents à la surface de la phase
stationnaire. Selon le modèle du déplacement stoechiométrique, l’adsorption d’une protéine
ionisée sur des sites de charge opposée à la surface du support s’accompagne d’une expulsion
simultanée d’un nombre équivalent de contre- ions. Par conséquent, l’équilibre d’associationdissociation en l’absence d’effets de liaisons spécifiques du sel peut-être décrit par la relation
suivante77,85 :
PI N I + N S S
K
⇔
P + NS S + NI I
Equation III-8
avec P représentant la protéine dans la phase mobile, I le co-ion supposé monovalent lié à la
protéine, S le contre-ion présent dans le sel, et N I et N S les nombres respectifs de co-ions et
de contre-ions impliqués dans le processus d’échange. La présence d’une barre au dessus d’un
symbole indique que l’espèce est liée à la phase stationnaire. K représente la constante
d’équilibre caractéristique de l’interaction de la protéine avec le support échangeur d’ion.
Soit Z P la charge caractéristique de la protéine ou encore le nombre de charges
apparentes de la protéine mises en jeu dans le processus d’adsorption-désorption. Lors de
l’utilisation d’un sel contre-ion ( S ) de type monovalent, le paramètre Z P est égal au nombre
de contre- ions ( N S ) monovalents initialement liés à la phase stationnaire et libérés au cours
de l’adsorption d’une molécule de protéine sur le support. Plus généralement, si la valence du
sel contre-ion ( S ) est égale à Z S , le processus d’échange stoechiométrique implique que le
nombre de contre- ions ( N S ) expulsés lors de la fixation d’une molécule de protéine soit égal
191
CHAPITRE III
au rapport
ZP
. D’autre part, le nombre de co-ions ( N I ) monovalents associés à une molécule
ZS
de protéine en solution est égal à Z P .
Par ailleurs, lors d’un processus d’élution isocratique et dans des conditions proches
de l’équilibre d’adsorption-désorption, la rétention d’une protéine peut être reliée à la
concentration molaire en sel ( CS ) de l’éluant selon la série de Taylor suivante58 :

1
log k' = a + b.  log
CS



1
 + c.  log
CS


2


1
 + d .  log
CS


3

 ...

Equation III-9
avec k' le facteur de rétention de la protéine et a , b , c et d des coefficients dépendant du
paramètre de solubilité de la biomolécule, du potentiel ζ de la phase stationnaire et également
de la composition de la phase mobile, de sa polarisabilité et de ses propriétés diélectriques.
Sur une gamme limitée de concentration en sel, le logarithme décimal du facteur de rétention
de la protéine ( log k' ) peut être assimilé à une fonction linéaire du logarithme décimal de la
concentration molaire en sel ( log CS ) de l’éluant77,85 :
log k' = log K 0 − Z .log C S
avec Z = N S =
ZP
ZS
Equation III-10
Le paramètre K 0 est fonction de nombreux facteurs dont la constante d’équilibre ( K )
entre la protéine et le support, le rapport volumique de phase stationnaire/phase mobile et la
concentration en groupements fonctionnels de la phase stationnaire. Le paramètre Z , défini
par le rapport
ZP
, est fonction de la nature et de l’état de surface de la protéine mais aussi du
ZS
support86, de la température85 et de la nature du sel contre-ion. Ainsi, sa détermination
expérimentale est importante puisqu’elle renseigne non seulement sur la topographie de la
biomolécule mais aussi sur les caractéristiques de surface de la phase stationnaire. Les
paramètres K 0 et Z sont déterminés expérimentalement, respectivement à partir de
l’ordonnée à l’origine et de la pente de la représentation portant log k' en fonction de log CS .
Le nombre de charges apparentes de la protéine ( Z P ) mises en jeu dans le processus
192
CHAPITRE III
d’adsorption-désorption est alors déterminé simplement en multipliant la valeur expérimentale
de Z par la valence du contre-ion ( Z S ).
Pour des raisons de clarté, l’Erreur ! Source du renvoi introuvable. est écrite pour
des co-ions de type monovalent ; cependant, le résultat présenté par l’Erreur ! Source du
renvoi introuvable. n’est pas limité à ce type de sel et reste valide quelle que soit la valence
du co-ion considéré.
Melander et coll.87 ont étendu cette théorie dans le cas de phases stationnaires
induisant un processus d’interaction supplémentaire de type hydrophobe. En ajoutant un
terme additionnel rendant compte du phénomène hydrophobe, une égalité possédant trois
paramètres est alors obtenue :
log k' = α − β .log CS + γ .CS
Equation III-11
Les termes β et γ rendent compte respectivement des processus d’interaction ionique et
hydrophobe. Le coefficient α est relié au paramètre K 0 décrit précédemment, le coefficient
β est égal au paramètre ( Z ) décrit précédemment et la variable γ est fonction de la surface
de contact entre la protéine et la phase stationnaire ainsi que de l’augmentation de la tension
de surface molaire de l’éluant lors du processus d’interaction protéine/support.
Les trois paramètres sont déterminés expérimentalement par une régression non
linéaire de la représentation portant log k' en fonction de CS . Le terme β (égal à Z ) peut
également être déterminé aux faibles concentrations en sel (gamme sur laquelle seul le
processus ionique est mis en jeu) à partir de la pente de la représentation portant log k' en
fonction de − log C S .
Le profil caractéristique de l’évolution de la rétention des protéines en fonction de
la concentration en sel de l’éluant sur un support aux propriétés mixtes (ionique et
hydrophobe) est donné en Erreur ! Source du renvoi introuvable..
193
CHAPITRE III
(1)
log k’
(3)
(2)
-log Cs
Figure III-4 : Evolution de la rétention des protéines en IEC en fonction de la concentration en sel de la
phase mobile58. Apparition de trois processus chromatographiques distincts : (1) interaction
électrostatique, (2) exclusion stérique, et (3) interaction hydrophobe
Les différentes zones observées mettent en évidence l’intervention de trois processus
chromatographiques différents dans le contrôle de la rétention des protéines en IEC. Aux
faibles concentration en sel (zone 1), l’évolution linéaire de log k' en fonction de log CS
indique que les interactions protéine/support sont dominées par des forces électrostatiques
(processus ionique). Lorsque la concentration en sel de l’éluant augmente, un point critique
est atteint dans la zone 2 pour lequel l’interaction entre le soluté et le support est minimale, un
phénomène d’exclusion stérique tend alors à dominer le processus de rétention. Pour des
concentrations en sel encore plus élevées (zone 3), un processus de type hydrophobe peut être
impliqué et conduit à l’augmentation de la rétention de la protéine avec l’augmentation de la
proportion en sel de la phase mobile.
En conclusion, la chromatographie d’échange d’ions est une technique qui permet de
séparer des protéines en fonction de leur charge apparente. Les supports à base de silice
utilisés en IEC sont modifiés par un polymère contenant des groupements fonctionnels de
type anionique ou cationique conférant ainsi au support des propriétés d’échangeur de cations
ou d’anions. La phase mobile utilisée est une phase aqueuse généralement constituée d’un
mélange de sels et de tampons.
194
CHAPITRE III
I.6 – Analyse et purification des protéines par chromatographie d’affinité et
d’immunoaffinité à haute performance
I.6.1 - Analyse et purification des protéines par chromatographie
d’affinité à haute performance (CAHP)
La chromatographie d’affinité est basée sur la reconnaissance spécifique entre un
ligand immobilisé sur un support chromatographique et un soluté présent dans la phase
mobile. La chromatographie d’affinité à haute performance (CAHP) trouve de nombreuses
applications dans l’analyse et la purification de protéines.
Les phases stationnaires utilisées en chromatographie d’affinité à haute performance
des protéines doivent répondre à l’ensemble des caractéristiques évoquées précédemment :
stabilité chimique et physique dans les conditions d’élution et de relargage, absence
d’interactions secondaires avec le soluté et hydrophobie nulle ou peu marquée pour éviter la
dénaturation des molécules biologiques. Afin d’obtenir des supports dits d’affinité, les phases
stationnaires doivent également porter à leur surface des groupements chimiques réactifs
susceptibles de lier de façon covalente le ligand. De plus, le nombre de ces groupements par
unité de surface doit être relativement important afin d’obtenir une forte capacité
chromatographique.
Des supports organiques à base de polymères peuvent être utilisés en CAHP des
protéines mais de par les propriétés mécaniques intéressantes de la silice, seul ce type de
support sera évoqué. La modification chimique de la silice pour l’élaboration de phases
stationnaires en CAHP consiste à recouvrir sa surface par une couche moléculaire
intermédiaire permettant le greffage direct (ou après des modifications simples) de substances
d’intérêt biologique88.
La première étape de recouvrement de la silice s’effectue généralement avec des
molécules de silanes (greffage) ou des polymères (greffage ou adsorption). Dans le premier
cas, un grand nombre de silanes peut être utilisé89 mais Chang et coll.59 ainsi que Regnier et
Gooding90 ont montré que le greffage du 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane conduit à une
meilleure passivation du support originel. D’autre part, la fonction époxyde de ce silane
195
CHAPITRE III
permettra le greffage ultérieur d’un ligand. En ce qui concerne l’utilisation d’un polymère,
celui-ci peut être greffé sur le support par liaison covalente avec un silane préalablement
immobilisé ou peut être simplement adsorbé, puis réticulé afin d’éviter son relagarge. Le
polymère ainsi immobilisé présente des fonctions réactives intéressantes (fonctions époxyde,
diol, aldéhyde ou alcool primaire) pour le greffage ultérieur de ligands ou est susceptible
d’être modifié afin de créer les groupements réactifs désirés. A titre d’exemple, Vivarat-Perrin
et coll.91 ont élaboré des supports d’affinité pour l’étude et la purification de sérine-protéases
en immobilisant sur la silice la p-aminobenzamidine (p-ABA) (inhibiteur des sérineprotéases). L’immobilisation du ligand est effectuée par greffage sur un copolymère de Nvinylpyrrolidone (NVP) et de chloroformiate de vinyle (CFV) préalablement adsorbé sur la
silice ou encore préalablement greffé sur une silice silanisée. Une autre voie développée par
Muller et coll.92 consiste à passiver la silice par adsorption et réticulation d’un dextrane
substitué par des groupements de diéthylaminoéthyle (DEAE) puis à y greffer la p-ABA.
Cette dernière voie a été mise à profit pour l’élaboration de nombreux supports d’affinité pour
l’analyse des protéines. En fonction du type de ligand greffé17,93-95, les supports obtenus ont
conduit à des études sur l’ovalbumine, l’héparine, la trombine, de l’anti-thrombine ou des
immunoglobulines humaines de type G (IgG)
I.6.2 – La chromatographie d’immunoaffinité à haute performance
(HICP)
L’immunochromatographie est la partie de la chromatographie d’affinité qui
s’intéresse plus particulièrement aux interactions antigène-anticorps. Ces deux espèces sont
des macromolécules biologiques qui interagissent de façon hautement spécifique96, avec des
constantes de complexation pouvant varier de 105 à 1012 M-1. Cette spécificité de
reconnaissance moléculaire fait de l’immunochromatographie une technique très efficace pour
la séparation et la purification des protéines de type antigène et anticorps97,98. Cet outil permet
également de caractériser l’activité biologique des protéines par des études à l’équilibre99,100
et d’obtenir des informations concernant le mécanisme de la reconnaissance moléculaire par
des études cinétiques de l’association99-104.
En immunochromatographie, de nombreuses séparations sont effectuées sur des
supports macromoléculaires de type Sépharose105. Cependant, de par les propriétés
mécaniques intéressantes de la silice, seul ce type de support sera évoqué par la suite.
196
CHAPITRE III
a) Principe de la chromatographie d’immunoaffinité
L’immunochromatographie nécessite l’immobilisation d’un des deux acteurs du
couple antigène-anticorps sur la phase stationnaire. La purification des protéines par
immunochromatographie consiste en deux étapes. Le mélange à purifier est injecté sur le
support, l’anticorps (ou l’antigène) contenu dans la solution se fixe alors spécifiquement à
l’antigène (ou à l’anticorps) greffé sur la phase stationnaire. Ensuite, un changement de
composition de la phase mobile permet d’éluer la protéine capturée par le support. Des
tampons à base de glycine, de citrate de sodium ou des solutions d’acide acétique, auxquels
du sel est parfois ajouté, peuvent être utilisés comme éluant de désorption. Janis et Regnier106
ont étudié l’influence de la nature du tampon de désorption sur la purification d’anticorps IgG
de lapin analysés sur une colonne de protéine G. Il apparaît que la désorption est dépendante
de la force ionique de l’éluant et que l’utilisation d’une solution de pH = 2,9 à 2% (v/v)
d’acide acétique et contentant 0,1M de glycine conduit à une récupération maximale de
l’activité biologique de l’IgG.
b) Capacité de liaison d’un support d’immunoaffinité et activité spécifique des anticorps
La capacité de liaison d’un support d’immunochromatographie est définie par la
quantité d’anticorps immobilisée par gramme ou par millilitre de support. L’augmentation de
la surface spécifique d’un support, tout en maintenant une densité constante en anticorps
immobilisé, peut conduire à l’augmentation de la capacité de liaison vis-à-vis de l’antigène.
Cependant une augmentation de la surface spécifique s’accompagne toujours d’une
diminution de la taille des pores. Lorsque la taille des pores mis en jeu diminue au deçà d’une
certaine limite, l’accès à la surface active devient difficile pour les molécules de fortes masses
moléculaires. Par conséquent, l’optimisation de la capacité de liaison d’un support
immunologique nécessite de trouver le compromis idéal entre la surface spécifique du support
et le diamètre des pores des particules107,108.
Pour un support d’immunoaffinité de surface spécifique et de diamètre de pores
définis, l’optimisation de la capacité de liaison dépend considérablement de l’accès de
l’antigène aux sites de liaisons présents sur les anticorps immobilisés. L’accès aux sites de
fixation est influencé par divers facteurs109,110 tels que l’orientation moléculaire des anticorps,
leur densité de greffage sur le support et la taille de l’antigène. Il a été montré que l’activité
197
CHAPITRE III
spécifique des anticorps immobilisés, exprimée comme le rapport molaire d’antigène lié au
nombre théorique de sites de liaison de l’anticorps, diminue lorsque la densité de ligand
(anticorps) dépasse une valeur seuil98. Cette valeur critique est d’autant plus faible que la
taille de l’antigène est importante98. Ainsi, la taille de l’antigène doit être considérée pour
déterminer la densité optimale d’anticorps à immobiliser.
c) Modes de fixation d’un anticorps ou d’un antigène sur un support à base de silice pour
l’élaboration de phases stationnaires destinées à la HICP
La fixation d’un anticorps ou d’un antigène sur des particules de silice peut être
effectuée par les méthodes évoquées précédemment pour l’élaboration des supports d’affinité.
En effet, ces deux biomacromolécules possèdent des fonctions amine, acide carboxylique ou
thiol et peuvent réagir sur les fonctions réactives (fonctions époxyde, diol, aldéhyde ou alcool
primaire) portées par un silane ou un polymère préalablement immobilisés sur la silice.
A titre d’exemples, Sportsman et coll.99,101 et Puerta et coll.111 ont greffé des anticorps
anti-insuline99,101, anti IgG101 et anti-β lactoglobuline111 sur une surface de silice
préalablement silanisée et modifiée par des fonctions aldéhyde. Pour ce faire, une simple
réaction chimique entre les groupements amine des protéines et les fonctions aldéhyde du
support est mise en jeu. Une autre méthode utilisée par Renard et coll.100,103,104 consiste à
greffer des anticorps anti-ASH monoclonaux ou polyclonaux sur une surface de silice
préalablement silanisée et activée par le chlorure de trésyle. Plus précisément, la surface
initiale de silice est d’abord convertie en silice diol (par silanisation et hydrolyse acide). Le
support est ensuite modifié afin d’obtenir des fonctions alcool primaire plus réactives que les
fonctions diol α89. Finalement, les fonctions alcool primaire sont activées par le chlorure de
trésyle et l’anticorps est greffé au support par l’intermédiaire de ses groupements amine.
Cependant, les fonctions diol de la silice peuvent également être mises à profit. Ainsi, Hage et
coll.112 ont greffé un anticorps polyclonal anti-ASH, préalablement oxydé, à la surface d’une
silice diol par une méthode d’activation à l’hydrazide. L’introduction de fonctions époxyde à
la surface d’une silice est également chimiquement intéressante. Cette méthode a été utilisée
par Wheatley98 pour fixer de façon covalente de nombreux antigènes tels que l’ASH, l’ α1 glycoprotéine acide, l’IgG ou pour immobiliser les anticorps correspondants. Une autre voie
développée par Muller et coll.17,93 et évoquée précédemment au cours de la présentation des
supports d’affinité (Cf. paragraphe I.6.2 de ce chapitre) consiste à passiver la silice par
198
CHAPITRE III
adsorption et réticulation d’un dextrane substitué par des groupements de diéthylaminoéthyle
(DEAE). Les fonctions alcool du dextrane sont ensuite activées par le 1,1’carbonyldiimidazole (CDI) ou par le 1,4-butanediol diglycidyl éther (BDGE) pour permettre
l’immobilisation par greffage de molécules d’antigène ou d’anticorps.
Par ailleurs, pour les anticorps, d’autres modes de fixation tenant compte de leur
structure biologique particulière (Cf. paragraphe III.1.2.b,c,d) peuvent être utilisés105. Les
molécules d’anticorps présentent deux régions : une région nommée Fab où a lieu la fixation
spécifique de l’antigène et une région nommée Fc qui n’intervient pas dans la reconnaissance
moléculaire. Il est donc préférable que le greffage de l’anticorps se fasse par l’intervention de
groupements de la région Fc afin de laisser la région active Fab accessible à l’antigène et
conduire à des supports d’immunochromatographie ayant une capacité de liaison élevée.
Différentes méthodes peuvent répondre à cette exigence : l’anticorps peut être immobilisé sur
de la protéine A, sur de la protéine G, sur de l’avidine et sur de la streptavidine97,105.
L’ensemble de ces molécules sont fixées préalablement sur le support par les méthodes de
greffage d’un ligand exposées précédemment17,93,97,102,105,113.
Immobilisation d’un anticorps sur la protéine A ou sur la protéine G
L’utilisation de la protéine A ou de la protéine G permet non seulement d’orienter
favorablement les anticorps mais également de créer un éloignement entre les anticorps
immobilisés et la phase stationnaire. L’ensemble de ces phénomènes favorise la
reconnaissance biologique entre l’antigène et son anticorps correspondant.
La protéine A et la protéine G sont extraites respectivement de bactéries de type
staphylocoque et streptocoque. Ces biomolécules présentent la particularité de fixer
sélectivement une importante variété d’immunoglobulines de type G (IgG) par leur région
Fc97,114,115. La constante d’affinité relative à cette fixation est relativement élevée114 et varie
de 107 à 1011 M-1 selon le type de la protéine mise en jeu (A ou G) et selon l’espèce et la sous
classe de l’IgG liée. La protéine A possède cinq sites de fixation pour les molécules d’IgG.
Cependant, lorsque celle-ci est greffée, il semblerait qu’il ne reste que deux sites aptes à fixer
l’anticorps97. La fixation de l’IgG sur la protéine A ou G n’étant pas covalente, une solution
de carbodiimide peut être utilisée pour stabiliser par réticulation les anticorps en place97.
199
CHAPITRE III
Immobilisation d’un anticorps sur l’avidine ou sur la streptravidine
L’avidine et la streptavidine sont des protéines de pI respectif égal à 10-11 et 7. Ces
deux biomacromolécules présentent une affinité très élevée pour la biotine et peuvent former
des complexes extrêmement stables116 avec une constante d’affinité proche de 1015 M-1. Ces
propriétés peuvent être exploitées pour préparer des supports d’immunochromatographie. Le
procédé consiste alors à fixer la biotine sur la partie Fc d’un anticorps117 (liaison covalente)
puis à immobiliser l’anticorps modifié sur un support préalablement greffé par de l’avidine ou
de la streptavidine. Cette méthode conduit également à une bonne orientation moléculaire des
anticorps fixés sur la phase stationnaire. Cependant, ce procédé nécessite une modification
chimique préalable de l’anticorps.
II - Mise en jeu d’un complexe d’inclusion à base de
cyclodextrine et d’adamantane pour l’élaboration de
supports chromatographiques de fonctionnalités variables,
destinés à l’analyse de protéines
L’objectif de cette étude a été de mettre en œuvre des complexes d’inclusion à base de
cyclodextrine afin d’élaborer de façon simple et rapide des supports chromatographiques de
fonctionnalités variables, destinés à l’analyse des protéines. Plus précisément, des phases
stationnaires échangeuses d’ions et des supports d’interaction hydrophobe ont été préparés, à
partir d’un support de départ identique de silice recouverte de molécules de β-cyclodextrine.
Les propriétés des systèmes chromatographiques obtenus ont ensuite été évaluées en
analysant le comportement chromatographique de protéines sur ces matériaux.
200
CHAPITRE III
II.1 – Préparation de supports chromatographiques de fonctionnalités
variables destinés à l’analyse de protéines
L’élaboration de supports chromatographiques de fonctionnalités variables consiste en trois
étapes (Erreur ! Source du renvoi introuvable.) :
(1)
Greffage d’un polymère de β-cyclodextrine sur un support de silice diol (obtention
d’une silice-polyβ-CD) puis remplissage d’une colonne chromatographique avec
la phase obtenue
(2)
Modification chimique de dextranes par des groupements hydrophobes
adamantyle, et un second type de groupements dont la nature est déterminée par le
type de processus chromatographique envisagé
(3)
Préparation des phases stationnaires chromatographiques par adsorption des
dextranes modifiés sur le support de silice-polyβ-CD ; cette étape se déroule in situ
dans la colonne chromatographique
201
CHAPITRE III
Dext
Si
OH OH
Silice diol
2ème étape
1er étape
Modification d'un dextrane (Dext)
par des groupements hydrophobes adamantyle (Ad)
et par des groupements R de nature variable selon le
type de support chromatographique envisagé
Modification de la silice diol
par un polymère de β-cyclodextrine
Dext-Ad-R
Ad
R
Si
R
Ad
R
R
Silice-polyβ
β-CD
3ème étape
Adsorption du dextrane modifié Dext-Ad-R
sur le support de silice- polyβ
β-CD
par formation de complexes d'inclusion
R
Ad
Si
R
Ad
R
Silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-R)
R = COOR = DEAE
Echangeur de cations
Echangeur d'anions
R = C8H17
Support d'interaction
hydrophobe
Figure III-5 : Mise en jeu d’un complexe d’inclusion à base de cyclodextrine et d’adamantane pour
l’élaboration de supports chromatographiques de fonctionnalités variables : présentation des trois étapes
conduisant à l’élaboration des supports
202
CHAPITRE III
1ère étape : Greffage d’un polymère de β-cyclodextrine sur un support de silice diol :
obtention de la silice-polyβ-CD
Le choix des caractéristiques (porosité et surface spécifique) de la silice à modifier
doit prendre en compte deux facteurs principaux : (i) la porosité doit être suffisamment élevée
pour permettre une cinétique de transfert de masse rapide des protéines jusqu’aux sites
d’interaction de la phase stationnaire, (ii) la surface spécifique du support doit être
relativement importante pour conduire à une densité de ligands élevée et conférer au matériau
une capacité chromatographique satisfaisante. Cependant, comme expliqué précédemment
(Cf. paragraphe I.6.2 de ce chapitre), ces deux facteurs sont dépendants l’un de l’autre de telle
sorte que l’augmentation de la porosité de la silice s’accompagne d’une diminution de la
surface spécifique. Des études menées par Vanecek et Regnier118 ont montré qu’un support de
silice de porosité 30 nm offre les meilleures conditions pour l’analyse de protéines de masse
inférieure à 300 000 g/mol. De ce fait, un support de porosité 30 nm, présentant par ailleurs
une surface spécifique de 100 m2/g, a été utilisé dans cette étude.
Le procédé de greffage d’un polymère de β-cyclodextrine sur un support de silice diol
a été décrit précédemment dans le chapitre I (Cf. Chapitre I, paragraphe III.2) et dans l’annexe
3. Les caractéristiques du support de silice-polyβ-CD obtenu sont résumées dans le Erreur !
Source du renvoi introuvable.. Une colonne chromatographique de dimensions 100 mm de
longueur × 4,6 mm de diamètre interne est ensuite remplie avec la phase de silice-polyβ-CD
suivant le protocole décrit en annexe 13 pour être mis en œuvre au cours de la troisième étape.
Silice-diisocyanate
Silice-polyβ
β-CD
Quantité de réactif immobilisée
75 mg
73 mg
(mg/g de silice)
de diisocyanate
de polyβ-CD
Analyse élémentaire
Quantité de cavités de β-CD
immobilisée
(mmol/g de silice)
4,5.10-2
(mmol/m2 de silice)
4,5.10-4
Tableau III-1 : Caractérisation par analyse élémentaire du support de base de silice-polyβ
β-CD utilisé pour
l’élaboration des supports chromatographiques de fonctionnalités variables
203
CHAPITRE III
2ème étape : Modification chimique de dextranes par des groupements hydrophobes
adamantyle (Ad), et un second type de groupements (R) dont la nature est déterminée par le
type de processus chromatographique envisagé
Afin de conférer aux dextranes des propriétés d’adsorption spécifique sur le support de
silice-polyβ-CD, des groupements hydrophobes adamantyle ont été greffés sur les polymères.
D’autre part, dans l’intention de créer des supports chromatographiques de fonctionnalités
variables, différents substituants (notés R) ont également été ajoutés aux dextranes. Ainsi, des
supports échangeurs d’ions ont été élaborés par greffage de fonctions acide carboxylique (R =
COOH) ou de groupements diéthylaminoéthyle (R = DEAE) et des supports d’interaction
hydrophobe ont été obtenus par fixation de chaînons octyle (R = C8H17). La synthèse et la
caractérisation de l’ensemble des polymères de dextranes modifiés, de type Dext-Ad-R, ont
été décrites dans le chapitre I au paragraphe III.3.4.
3ème étape : Préparation in situ des phases stationnaires chromatographiques par
adsorption des dextranes modifiés (Dext-Ad-R) sur le support de silice-polyβ-CD ; cette
dernière étape s’effectue dans la colonne chromatographique
Une colonne chromatographique préalablement remplie par le support de silice-polyβCD est utilisée au cours de cette dernière étape. L’immobilisation d’un dextrane modifié
(Dext-Ad-R) sur la surface de silice-polyβ-CD s’effectue in situ, par simple percolation d’une
solution aqueuse de Dext-Ad-R sur le support jusqu’à atteindre la saturation de ce dernier. Ce
procédé simple et rapide repose dans le cas présent, sur l’adsorption spécifique du dextrane
sur le support par formation de complexes d’inclusion entre les groupes adamantyle du
polymère et les cavités de β-CD greffées sur la silice. L’immobilisation du Dext-Ad-R est
suivie en temps réel à l’aide d’un réfractomètre différentiel branché en sortie de colonne. Le
profil d’un chromatogramme obtenu suivant cette méthode est donné sur la Erreur ! Source
du renvoi introuvable..
204
CHAPITRE III
(3 ) :
Rinçage du support
avec de l’eau
Signal
réfractométrique
Injection d’eau
S0
S1
to
(1) :
support équilibré
dans l’eau
Temps
(2 ) :
Percolation d’une solution aqueuse
de Dext-Ad-R
Figure III-6 : Profil relatif à l’immobilisation d’un Dext-Ad-R sur le support de silice-polyβ
β-CD au cours
d’un procédé chromatographique d’analyse frontale. Ce procédé comporte trois étapes : (1) le support de
silice-polyβ
β-CD est stabilisé dans l’eau ; (2) la percolation d’une solution aqueuse de Dext-Ad-R est
effectuée sur le support jusqu’à l’apparition d’un front de percolation traduisant la saturation du support
en polymère ; (3) un rinçage de la colonne est effectué pour éliminer le Dext-Ad-R interstitiel non adsorbé
sur le support. Conditions chromatographiques : solution de Dext-Ad-R à 1 mg/mL dans l’eau ;
percolation de la phase mobile à 1 mL/min ; détection par réfractométrie différentielle
Le front de percolation relatif au Dext-Ad-R apparaît à un temps de rétention bien
supérieur au temps mort (t0) de la colonne et confirme l’adsorption spécifique du polymère
sur la silice-polyβ-CD. D’autre part, la chute brusque du signal, observée lors du rinçage de la
colonne, suggère que le Dext-Ad-R reste en majorité immobilisé sur le support. La quantité de
polymère immobilisée sur le support, déterminant la capacité chromatographique théorique de
la colonne, peut être déterminée à partir de la différence de surface S0-S1.
Les premiers supports chromatographiques échangeurs de cations et d’interaction
hydrophobe ont été élaborés respectivement à partir d’un Dext40-Ad-COOH, modifié à 62 %
en COOH (Dext-Ad-COOH1, Cf. Chapitre I, paragraphe III.3.4.c), et d’un Dext40-Ad-C8,
modifié à 10,5% en C8 (Dext-Ad-C85, Cf. Chapitre I, paragraphe III.3.4.d). En ce qui
concerne la famille de dextranes Dext40-Ad-C8, le polymère possédant le taux de
modification le plus important en groupements C8 a été choisi afin de conduire à une capacité
205
CHAPITRE III
chromatographique de la colonne la plus élevée possible. Les masses de Dext40-Ad-COOH et
de Dext40-Ad-C8 immobilisées sur la silice-polyβ-CD et les capacités chromatographiques
théoriques résultantes des colonnes sont reportées dans le Erreur ! Source du renvoi
introuvable..
Support
Support d’interaction
échangeur de cations
hydrophobe
Dext40-Ad-COOH1
Dext40-Ad-C85
(modifié à 62% en COOH)
(modifié à 10,5% en C8)
58 000
44 000
7
80
(mmol/g de silice)
1,8.10-2
4,7.10-2
(mmol/m2 de silice)
1,8.10-4
4,7.10-4
Masse moléculaire moyenne du DextAd-R (g/mol)
Quantité de Dext-Ad-R fixée (mg/g de
silice)
Densité de groupements fonctionnels R
(COOH ou C8) fixés
Tableau III-2 : Caractéristiques du support chromatographique échangeur de cations et du support
d’interaction hydrophobe, élaborés respectivement à partir d’un Dext40-Ad-COOH et d’un Dext40-Ad-C8
La quantité de Dext40-Ad-C85 adsorbée sur le support de silice-polyβ-CD est plus de
dix fois supérieure à celle déterminée dans le cas du Dext40-Ad-COOH1. Cette différence
peut s’expliquer par la présence de nombreux groupements ionisables COOH sur la chaîne du
Dext40-Ad-COOH (environ 62 COOH pour 100 unités glucose) qui défavoriseraient
l’inclusion des groupements adamantyle dans les cavités de β-cyclodextrine. Un effet
similaire a été observé dans une étude antérieure lors de la fixation d’un polymère de DextAd-COOH sur une lame d’or recouverte de β-cyclodextrine119. D’autre part, les chaînons
octyle greffés sur le Dext-Ad-C85 pourraient s’inclure dans les cavités de cyclodextrine ou
provoquer une autoassociation120 du polymère par interactions hydrophobes entre ces
greffons. Ces deux phénomènes contribueraient alors au rendement d’immobilisation élevé du
Dext-Ad-C85.
Néanmoins, le taux de modification important du Dext40-Ad-COOH1 en groupements
ionisables COOH conduit à un support échangeur d’ions ayant une densité théorique de
greffons du même ordre de grandeur que celle relative au support d’interaction hydrophobe. Il
est important de noter que la densité théorique de groupements fonctionnels, déterminée à
206
CHAPITRE III
partir de la masse de dextrane immobilisée, et correspondant au nombre total de groupements
fonctionnels par unité de masse ou de surface du support, ne traduit qu’en partie l’état de
surface de la phase stationnaire. En effet, seulement une partie des ligands immobilisés sur de
la silice poreuse est accessible aux solutés analysés si bien que la capacité chromatographique
mesurée expérimentalement d’une colonne est généralement inférieure à la densité théorique
de greffons.
Afin d’augmenter la quantité de Dext40-Ad-COOH1 immobilisée sur le support, les
conditions de percolation ont été modifiées. L’idée étant de favoriser la formation du
complexe d’inclusion entre le Dext40-Ad-COOH1 et la cyclodextrine, une solution de
dextrane préparée dans un milieu fortement salin (NaCl à 1M) est mise à percoler sur le
support. Néanmoins, l’utilisation d’un éluant très concentré en sel sature le réfractomètre
différentiel si bien que la fixation du polymère ne peut être suivie en temps réel et que la
quantité de dextrane immobilisée ne peut être déterminée. Afin de vérifier que la présence de
sel durant la percolation du Dext40-Ad-COOH permet d’augmenter les quantités de polymère
immobilisées, les supports obtenus avec et sans sel ont été comparés quant à leurs capacités à
retenir quelques protéines basiques (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
Protéines
pI
Facteur de rétention (k’)
sur des supports échangeurs de cations obtenus par
percolation d’une solution de Dext-Ad-COOH1
effectuée :
dans l’eau
dans l’eau + NaCl 1 M
9-9,4
4,6
30
α-Chymotrypsine
8,38-
10,7
16
(Eluant à 0,11 M en NaCl)
8,76
α-Chymotrypsinogène A
8,8-
7,7
18,5
9,28,3
30,5
Cytochrome c
9,6
Lysosyme
11
207
CHAPITRE III
Tableau III-3 : Comparaison des facteurs de rétention (k’) de quelques protéines basiques sur des
supports échangeurs de cations, obtenus par percolation d’une solution aqueuse de Dext-Ad-COOH1 à 1
mg/mL dans l’eau ou dans l’eau additionnée de 1 M en NaCl. Conditions chromatographiques : protéines
à 1 mg/mL dans un tampon Tris à 20mM de pH = 7 ; éluant : tampon Tris à 20mM de pH = 7 à différentes
concentrations en NaCl ; débit de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 280 nm
La rétention des protéines est nettement supérieure sur le support cationique obtenu par
percolation d’une solution saline de dextrane. Ce résultat qui suggère que ce support présente
un nombre plus élevé de sites échangeurs d’ions sera confirmé par la mesure des capacités
d’échange (Cf. Paragraphe II.3.1 de ce chapitre). On peut donc en conclure que le support de
base de silice-polyβ-CD est d’avantage recouvert de Dext-Ad-COOH lorsqu’une solution
saline de polymère est utilisée.
Des conditions identiques ont donc été utilisées pour l’élaboration du support
anionique à base d’un dextrane Dext-Ad-DEAE, modifié par des groupements
diéthylalminoéthyle.
Le mode de préparation des supports utilisés ultérieurement pour l’analyse des
protéines est résumé dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable..
Support échangeur
Support échangeur
Support
d’anions
de cations
d’interaction
hydrophobe
Dext-Ad-R
immobilisé sur la
silice-polyβ -CD
Dext40-Ad-DEAE2
Dext40-Ad-COOH1
Dext40-Ad-C85
(modifié à 49% en
(modifié à 62 % en
(modifié à 10,5% en
DEAE
COOH)
C8)
1 mg/mL dans
1 mg/mL dans
1 mg/mL dans
l’eau + NaCl 1 M
l’eau + NaCl 1 M
l’eau
Solution de DextAd-R mise à
percoler sur la
silice-polyβ -CD
Quantité de Dext-
80
Ad-R immobilisée
(mg/g de silice)
208
CHAPITRE III
Tableau III-4 : Résumé des trois types de supports élaborés (échangeur d’anions, échangeur de cations et
support d’interaction hydrophobe) destinés à l’analyse des protéines.
II.2 – Propriétés de surface du support de base de silice-polyβ
β-CD
Avant d’élaborer les trois types de phases chromatographiques destinées à l’analyse
des protéines, les propriétés d’interactions non spécifiques du support de base de silice-polyβCD vis à vis d’un certain nombre de protéines ont été étudiées.
Dans un premier temps, une protéine basique, le cytochrome c (pI = 9-9,4), a été
injectée sur le support de silice-polyβ-CD dans un éluant de pH = 7 et de concentrations
salines variables (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
Facteur de rétention (k’) sur le support de silice-polyβ -CD
pH = 7, milieu salin composé de NaCl
[NaCl] = 0,1 M
[NaCl] = 0,3 M
[NaCl] = 0,5 M
Cytochrome c
0,2
0,2
0,2
Albumine du sérum
0,1
0
0
0,4
0,1
0,1
humain (ASH)
Ovalbumine
Tableau III-5 : Facteur de rétention de quelques protéines sur le support de base de silice-polyβ
β-CD.
Conditions chromatographiques : protéines à 1 mg/mL dans un tampon Tris à 20mM de pH = 7 ; éluant :
tampon Tris à 20mM de pH = 7 à différentes concentrations en NaCl ; débit de la phase mobile : 1
mL/min ; détection UV à 280 nm
Sur la gamme de concentrations étudiées, et notamment aux faibles forces ioniques
(0,1 M), il a été constaté que le cytochrome c, chargé positivement dans les conditions
d’analyse, était élué au voisinage du volume mort. Ce résultat qui montre que la protéine
n’interagit pas avec le support de base suggère que les silanols de la surface sont correctement
masqués par le polymère de polyβ-CD.
Une étude similaire a ensuite été effectuée avec des protéines acides telles que
l’albumine du sérum humain (ASH) (pI = 4,4-4,8) et l’ovalbumine (pI = 4,7) (Erreur !
209
CHAPITRE III
Source du renvoi introuvable.). Ces protéines, chargées négativement au pH de l’étude, ont
été éluées rapidement avec une valeur du facteur de rétention (k’) inférieure à 0,5 même aux
faibles forces ioniques. Ce résultat indique que les interactions non spécifiques entre des
protéines chargées négativement et le support de base sont négligeables.
D’autres
protéines
acides
ou
basiques,
notamment
l’α-lactalbumine,
l’α-
chymotrypsine, l’α-chymotrypsinogène A et le lysozyme ont également été injectés sur le
support suivant des conditions identiques. Contrairement aux cas précédents, ces protéines ont
été retenues par la colonne avec un facteur de rétention pouvant atteindre la valeur de 17 (à
0,5 M en sel) dans le cas du lysozyme. Les résultats précédents suggérant que les interactions
de type ionique avec le support sont négligeables, cette rétention élevée des protéines pourrait
être due à des interactions non spécifiques de type hydrophobe. L’intervention d’un tel
processus a été confirmé par l’augmentation de la rétention des protéines avec la force ionique
du milieu. Les valeurs obtenues dans le cas du lysozyme ont été reportées sur la Erreur !
Source du renvoi introuvable..
Support de silice-polyβ-CD
Support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad)
15
k'
10
5
0
0,0
0,1
0,1
0,2
0,3
0,3
0,4
0,5
0,5
[NaCl] (M)
Figure III-7 : Facteur de rétention du lysozyme sur le support de base de silice-polyβ
β-CD et sur le support
de silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad). Conditions chromatographiques : identiques à celles reportées dans le
Erreur ! Source du renvoi introuvable.
210
CHAPITRE III
Ce processus d’interaction hydrophobe pourrait s’expliquer par la présence sur le
support de l’agent de liaison utilisé dans le procédé de synthèse de la silice-polyβ-CD et dont
le caractère hydrophobe a été mis en évidence au chapitre II, paragraphe II.2.2. En effet, les
motifs alkyle de ce composé pourraient interagir avec les parties apolaires de protéines à
caractère hydrophobe.
Pour évaluer la manifestation des interactions non spécifiques de type hydrophobe
dans les supports finaux de type silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-R) (avec R = DEAE ou COOH),
le support de silice-polyβ-CD a été recouvert d’un polymère de dextrane modifié uniquement
par des groupements adamantyle (Dext-Ad, à 6,2 % en groupement Ad). Le lysozyme a
ensuite été injecté sur la phase stationnaire de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad) obtenue, suivant
des conditions expérimentales identiques à celles de l’étude sur le support initial de silicepolyβ-CD (Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Il a alors été constaté que les
interactions non spécifiques de type hydrophobe diminuaient fortement avec la présence du
polymère sur la surface. D’autre part, même si ces interactions ne sont pas totalement
éliminées, ceci n’est pas un problème pour la suite de l’étude. En effet, les supports
chromatographiques d’échange d’ions qui présenteraient également des propriétés
d’interaction hydrophobe pourraient être appliqués à l’analyse des protéines en utilisant un
modèle théorique rendant compte d’un processus mixte de type ionique et hydrophobe (Cf.
paragraphe I.5.3 de ce chapitre).
II.3 – Analyse des protéines sur les supports échangeurs d’ions
II.3.1 – Détermination de la capacité d’échange ionique des supports
Les supports échangeurs d’ions peuvent être caractérisés par leur capacité d’échange
ionique. Ce paramètre, défini comme étant le nombre de charges du support exprimé en
milliéquivalents par gramme ou par millilitre de matériau, rend compte de l’état de surface de
la phase stationnaire et gouverne en partie la rétention des protéines. Il peut être déterminé par
un procédé chromatographique d’analyse frontale.
Le principe de la méthode consiste à équilibrer la colonne dans une solution
concentrée en sel de façon à saturer les sites ioniques du support par les ions contenus dans
211
CHAPITRE III
l’éluant. Les ions immobilisés sur la phase stationnaire sont ensuite déplacés par un second
type d’ion, choisi en partie pour sa propriété d’absorption en spectroscopie UV de façon à
suivre en temps réel le processus d’échange. Le profil chromatographique obtenu suivant cette
méthode est donné sur la Erreur ! Source du renvoi introuvable..
Dans le cas du support échangeur d’anion de type Dext-Ad-DEAE, la colonne est
équilibrée à l’aide d’une solution de chlorure de sodium de façon à saturer la phase
stationnaire en ions chlorure (Cl-), puis ces derniers sont déplacés par des ions nitrate (NO3-)
au cours de la percolation d’une solution de nitrate de sodium. Pour le support cationique de
type Dext-Ad-COOH, une solution de chlorure de sodium est également utilisée pour
stabiliser la colonne et saturer le support en ions sodium (Na+) avant d’échanger ces derniers
contre des ions benzyltriméthylammonium (C6H5-N+(CH3)3) à l’aide d’une solution de
chlorure de benzyltriméthylammonium.
(3 ) :
Regénération du support
avec une solution de NaCl
Densité optique
Injection d’eau
50%
du front
to
(1) :
support équilibré
avec une solution de NaCl
Temps
t50
(2 ) :
Percolation d’une solution d’ions « déplaçants »
de NaNO3 ou de C6H5 -N(CH3)3Cl
Figure III-8 : Détermination de la capacité d’échange d’un échangeur d’ion par un procédé d’analyse
frontale. Ce procédé comporte trois étapes : (1) le support ionique est stabilisé dans un tampon Tris à 20
mM de pH donné et contenant 0,1 M en NaCl ; (2) une percolation de NaNO3 ou de C6H5-N(CH3)3Cl en
solution dans le tampon Tris à 20 mM de pH donné, est ensuite effectuée afin de déplacer respectivement
les ions chlorure (Cl-) ou sodium (Na+) immobilisés sur la phase stationnaire. L’apparition d’un plateau
indique que la concentration en NaNO3 ou C6H5-N(CH3)3Cl de la solution effluente est égale à la
concentration de la solution initiale et traduit la saturation de la colonne ; (3) le support est ensuite
régénéré avec la solution tampon de la 1ère étape. Conditions chromatographiques : percolation de la
phase mobile à 1 mL/min ; détection UV à 254 nm (NaNO3) ou à 280 nm (C6H5-N(CH3)3Cl)
212
CHAPITRE III
La capacité d’échange ( C E ) ionique du support, exprimée généralement en meq/g de
phase, peut être déterminée à partir du chromatogramme relatif à l’analyse frontale par la
relation suivante :
CE =
( t 50 − t 0 ).D.[ ion " déplaçant" ]
m
Equation III-12
avec t0 (min) le temps de rétention d’un composé non retenu par la colonne, t50 (min) le
temps correspondant à 50% du front de percolation, D (mL/min) le débit de la phase mobile,
m (g)
la masse de support contenue dans la colonne et [ ion " déplaçant" ] (eq/L) la
concentration des ions NO3- ou des ions C6H5-N+(CH3)3 contenus respectivement dans les
solutions de nitrate de sodium ou de chlorure de benzyltriméthyammonium.
Les capacités d’échanges mesurées pour les supports ioniques de cette étude sont
portées dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable..
Capacité d’échange ionique
Support échangeur
Support échangeur de
d’anions
cations
Dext40-Ad-DEAE
Dext40-Ad-COOH
(modifié à 49% en DEAE)
(modifié à 62% en COOH)
pH = 5
pH = 7
pH = 6
pH = 7
(meq/g de silice)
5. 10-2
2,6. 10-2
11,6. 10-2
13,1. 10-2
(meq/m2 de silice)
5. 10-4
2,6. 10-4
11,6. 10-4
13,1. 10-4
de la colonne
Tableau III-6 : Capacité d’échange ionique (CE) des supports anionique et cationique, élaborés
respectivement à partir du Dext-Ad-DEAE et du Dext40-Ad-COOH.
Il apparaît que la capacité d’échange (CE) des phases stationnaires ioniques élaborées
est dépendante du pH de la phase mobile, de telle sorte que la valeur de CE du support
échangeur d’anions diminue lorsque le pH de la phase mobile augmente et que le phénomène
inverse se produit dans le cas du support d’échange de cations. Ce résultat est en accord avec
213
CHAPITRE III
les types de supports ioniques « faibles » élaborés, pour lesquels la densité de charges est
fonction du pH. En effet, le support échangeur d’anions est constitué de fonctions amine
tertiaire de pKa 9,5 et 5,7 si bien que la variation du pH de 5 à 7 diminue la proportion
d’amine de pKa 9,5 sous forme positive et fait passer les fonctions amine de pKa 5,7 de la
forme positive à la forme neutre. Ces deux effets contribuent à diminuer la capacité d’échange
de la colonne. Pour le support échangeur de cations, constitué d’un Dext40-Ad-COOH dont
les fonctions acide carboxylique possèdent un pKa de 3,3-4,5, la variation du pH de 6 à 7
s’accompagne d’une augmentation de la quantité de fonctions acide carboxylique sous forme
négative.
Il est important de noter que les capacités d’échange ionique déterminées par cette
méthode sont des capacités apparentes et traduisent uniquement l’ensemble des charges
accessibles du support. Il serait intéressant de comparer ces valeurs aux capacités d’échange
théoriques attendues, ces dernières étant calculées à partir des masses de polymères adsorbées
sur le support. En effet, la confrontation de ces résultats renseignerait sur la proportion de
groupements fonctionnels de la phase stationnaire non accessible aux solutés. Mais, les deux
supports répertoriés dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable. ayant été élaborés par
percolation d’une solution saline de dextranes modifiés, les quantités de polymères adsorbées
sur le support n’ont pu être déterminées.
Par ailleurs, il apparait que la capacité d’échange mesurée à pH = 7 pour le support
échangeur de cations (Erreur ! Source du renvoi introuvable.) est près de dix fois plus
importante que la densité de groupements COOH caractéristique du support ionique obtenu à
partir d’une solution aqueuse de Dext40-Ad-COOH sans sel (Cf. Erreur ! Source du renvoi
introuvable.). Ce résultat confirme la conclusion du paragraphe II.1 selon laquelle la surface
de silice-polyβ-CD est d’avantage recouverte de dextrane modifié lorsqu’une solution saline
de polymère est utilisée.
II.3.2 – Rétention des protéines sur le support échangeur d’anions de
type silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-DEAE) : application du modèle du
déplacement stoechiométrique
214
CHAPITRE III
Dans un premier temps, une protéine basique, le cytochrome c (pI = 9-9,4), a été
injectée à pH = 7 sur le support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-DEAE) à concentration saline
faible (0,1 M en NaCl). La biomolécule est ressortie de la colonne au voisinage du volume
mort (k’ = 0,2) ce qui indique que le cytochrome c ne présente pas d’affinité pour la phase
stationnaire. Ce résultat était prévisible puisque la protéine et le support sont tous deux
chargés positivement au pH de l’étude.
Le support échangeur d’anions élaboré a ensuite été testé pour l’étude de la rétention
de quelques protéines acides : l’α-lactalbumine, l’albumine du sérum humain (ASH),
l’albumine du sérum bovin (ASB), l’ovalbumine, la β-lactoglobuline A et la β-lactoglobuline
B. Les biomolécules étudiées possédant un point isoélectrique (pI) compris entre 4,2 et 5,3,
une solution éluante dont le pH est suffisamment éloigné du dernier pI (5,3) a été utilisée. Un
pH de 7 a donc été choisi afin que les protéines acides soient de charge nette suffisante pour
entrer dans un processus d’échange d’ions.
L’évolution de la rétention de ces protéines en fonction de la concentration en sel de
l’éluant a ensuite été étudiée (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
α-Lactalbumine
40
Albumine du sérum humain (ASH)
Albumine du sérum bovin (ASB)
Ovalbumine
β-Lactoglobuline A
β-Lactoglobuline B
30
k'
20
10
0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
[NaCl] (M)
Figure III-9 : Evolution du facteur de rétention de quelques protéines acides sur le support de silice-polyβ
βCD-(Dext-Ad-DEAE) échangeur d’anions. Conditions chromatographiques : protéines à 1 mg/mL dans un
tampon Tris à 20mM de pH = 7 ; éluant : tampon Tris à 20mM de pH = 7 à différentes concentrations en
NaCl ; débit de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 280 nm
215
CHAPITRE III
La rétention des protéines diminue quand la concentration en sel de l’éluant augmente
ce qui suggère que les biomolécules entrent bien dans un processus d’échange ionique avec le
support. A concentration en sel relativement élevée (0,5 M en NaCl), la rétention de
l’ensemble des biomolécules devient quasi nulle. Ce résultat indique d’une part, que le
processus d’échange ionique protéine/support est devenu négligeable dans ce domaine et,
d’autre part, que le processus chromatographique non spécifique de type hydrophobe est
inexistant ou négligeable pour le type de protéines étudiées et dans la zone de concentration
en sel utilisée. De ce fait, le modèle du déplacement stoechiométrique tenant compte
uniquement d’un processus de type ionique (décrit au paragraphe I.5.3 de ce chapitre par
l’Erreur ! Source du renvoi introuvable.) a été appliqué dans le domaine des plus faibles
concentrations salines (de 0,03 à 0,2 M en NaCl) (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
α-Lactalbumine
Ovalbumine
β-Lactoglobuline A
β-Lactoglobuline B
2,0
1,5
1,0
log k'
0,5
0,0
-0,5
-1,0
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
- log [NaCl]
Figure III-10 : Application du modèle du déplacement stoechiométrique (Cf. Erreur ! Source du renvoi
introuvable.) à l’étude de la rétention de protéines acides sur le support de silice-polyβ
β-CD-(Dext-AdDEAE) échangeur d’anions. Conditions chromatographiques identiques à celles de la Erreur ! Source du
renvoi introuvable. ; domaine de concentrations salines : 0,03 à 0,2 M en NaCl.
Les courbes présentées en Erreur ! Source du renvoi introuvable. montrent que le
logarithme décimal du facteur de rétention des protéines (log k’) varie linéairement avec le
logarithme décimal de la concentration molaire en sel (-log[NaCl]) de l’éluant. Ce résultat
indique que le modèle du déplacement stoechiométrique est vérifié par l’ensemble des
216
CHAPITRE III
protéines, sur le domaine de concentrations salines étudié. Les paramètres log K0 et Z (définis
au paragraphe I.5.3 de ce chapitre) caractéristiques du système chromatographique mis en jeu
sont donc déterminés expérimentalement, respectivement à partir de l’ordonnée à l’origine et
de la pente des représentations linéaires obtenues. Dans le cas présent, le chlorure de sodium
utilisé
engendre
un contre-ion monovalent ; ainsi,
la
valeur de
Z déterminée
expérimentalement correspond au nombre de charges apparentes de la protéine (ZP) mises en
jeu dans le processus d’adsorption-désorption. Les valeurs des grandeurs log K0 et ZP
déterminées pour l’ensemble des protéines figurent dans le Erreur ! Source du renvoi
introuvable..
Support silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-DEAE)
pH = 7, milieu salin composé de NaCl
pI
log K0
ZP
α-Lactalbumine
4,2-4,5
-1,2 (±0,1)
2,1 (±0,1)
Albumine du sérum
4,4-4,8
-4,4 (±0,4)
3,8 (±0,3)
4,7
-4,7 (±0,3)
4,1 (±0,2)
4,7
-2,4 (±0,4)
2,2 (±0,4)
β-Lactoglobuline A
5,1-5,2
-3,5 (±0,4)
4,3 (±0,4)
β-Lactoglobuline B
5,1-5,3
-3,3 (±0,1)
3,8 (±0,1)
humain (ASH)
Albumine du sérum
bovin (ASB)
Ovalbumine
Tableau III-7 : Valeurs de log K0 et ZP (à pH = 7 et en milieu salin composé de NaCl) de quelques
protéines acides analysées sur le support échangeur d’anions de type silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-DEAE).
Ces valeurs sont déterminées expérimentalement à partir du modèle du déplacement stoechiométrique
défini par l’Erreur ! Source du renvoi introuvable..
Les valeurs de ZP déterminées dans le cas présent ne sont pas en relation stricte avec le
pI des protéines. Si tel était le cas, la valeur de ZP devrait augmenter avec l’écart entre le pH
de la solution éluante (pH = 7) et le pI des biomolécules. Néanmoins, dans le cas présent,
cette comparaison est délicate car les pI des protéines étudiées sont relativement proches. Par
ailleurs, de tels résultats pourraient également s’expliquer par le fait que le paramètre ZP n’est
pas uniquement fonction de la charge nette de la protéine. Il dépend de facteurs plus
complexes comme la distribution et l’accessibilité des sites ioniques sur la biomacromolécule,
217
CHAPITRE III
autrement dit la topographie de surface de la protéine et l’aire de contact électrostatique entre
la protéine et la phase stationnaire.
Les valeurs de ZP de l’étude sont en assez bon accord avec certaines valeurs reportées
dans la littérature (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
ZP
ZP
Support
Valeurs de la littérature
silice-polyβ -CD-
pH = 7, NaCl
pI
(Dext-Ad-DEAE)
pH = 7, NaCl
α-Lactalbumine
Albumine du sérum
2,1
4,2-4,5
4,4-4,8
3,8
4,7
4,1
4,7
2,2
humain (ASH)
Albumine du sérum
bovin (ASB)
Ovalbumine
2,374
Support silice-HB-DS-HB
2,2-2,474
Support silice-PEI
4,2121 (pH = 7,5)
Echangeur d’anion fort
mono-Q HR 5/5
3,5-3,974
5,9121 (pH = 7,5)
Echangeur d’anion fort
mono-Q HR
4,6*,122 Echangeur d’anion
fort mono-Q SAX
β-Lactoglobuline A
β-Lactoglobuline B
4,3
5,1-5,2
3,8
5,1-5,3
218
5,2122* Echangeur d’anion
fort mono-Q SAX
3,4-3,774
3,1-3,3 74
CHAPITRE III
Tableau III-8 : Comparaison des valeurs de ZP de l’étude (obtenues sur le support de silice-polyβ
β-CD(Dext-Ad-DEAE) à pH = 7 et en présence de NaCl) aux valeurs reportées dans la littérature. PEI =
polyéthylèneimine, HB = polybrène ( = polycation), DS = dextrane sulfaté ( = polyanion) ; mono-Q
(Pharmacia) ; (*) La valeur reportée a été corrigée selon la publication de Velayudhan et Horvath85
Cette comparaison reste néanmoins approximative puisque, comme indiqué
précédemment, la valeur de ZP est fonction de nombreux paramètres autres que la charge nette
de la protéine.
II.3.3 – Analyse et séparation des protéines sur le support échangeur
de cations de type silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-COOH)
a) Analyse des protéines sur le support échangeur de cations de type silice-polyβ-CD-(DextAd-COOH) : application du modèle du déplacement stoechiométrique
Dans un premier temps, l’ovalbumine qui est une protéine acide (pI = 4,7) a été
injectée sur le support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-COOH) dans un tampon de pH = 7 et de
force ionique assez faible (NaCl = 0,1 M). L’ovalbumine est alors ressortie de la colonne au
volume mort (k’ = 0). Ce résultat qui suggère que la protéine ne présente pas affinité pour le
support est en bon accord avec le fait que l’ovalbumine et le support sont tous deux chargés
négativement au pH de l’étude.
Le support échangeur de cations élaboré a ensuite été appliqué à l’étude de la rétention
de quelques protéines basiques : l’α-chymotrypsine, l’α-chymotrypsinogène A, le cytochrome
c et le lysozyme. L’évolution de la rétention à pH = 7 de ces biomacromolécules en fonction
de la concentration en sel de l’éluant est reportée sur la Erreur ! Source du renvoi
introuvable..
219
CHAPITRE III
α-Chymotrypsine
100
Cytochrome c
Lysozyme
80
(1)
k'
60
(3)
40
(2)
20
0
0,0
0,5
1,0
1,5
[NaCl] (M)
Figure III-11 : Evolution du facteur de rétention de quelques protéines basiques sur le support de silicepolyβ
β-CD-(Dext-Ad-COOH) échangeur de cations. Conditions chromatographiques : protéines à 1 mg/mL
dans un tampon Tris à 20mM de pH = 7 ; éluant : tampon Tris à 20mM de pH = 7 à différentes
concentrations en NaCl ; débit de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 280 nm
Aux faibles concentrations salines (forces ioniques inférieures à 0,25 M), la rétention
des protéines diminue quand la concentration en sel de l’éluant augmente (zone 1) indiquant
alors que les biomolécules entrent bien dans un processus d’échange ionique avec le support.
A concentration en sel relativement élevée (0,5 M en NaCl), (zone 2), deux
comportements différents sont observés selon les protéines considérées. La rétention du
cytochrome c est quasiment nulle. Un phénomène similaire avait été observé sur le support
échangeur d’anions et comme dans ce cas précédent, ce résultat suggère que le phénomène
d’interaction hydrophobe est inexistant. Par contre, les rétentions de l’α-chymotrypsine, de
l’α-chymotrypsinogène A et surtout du lysozyme sont encore relativement importantes (avec
des valeurs de k’ allant de 5 à 20). Ce dernier résultat suggère qu’un processus hydrophobe
intervient dans le contrôle de la rétention de ces trois protéines qui sont connues pour être
relativement hydrophobes. Afin de confirmer ce second type de processus, des forces ioniques
plus élevées, jusqu’à 1,5 M, ont été étudiées. Les courbes obtenues présentent alors une
troisième zone sur laquelle la rétention de ces trois protéines augmente avec une concentration
croissante en sel de la phase mobile (zone 3). Cette évolution confirme l’intervention
d’interactions hydrophobes entre les parties apolaires de ces biomolécules et le support. Par
contre, la rétention du cytrochrome c reste nulle. Le phénomène d’interaction hydrophobe
observé est probablement dû à l’interaction entre les groupements apolaires des biomolécules
220
CHAPITRE III
et les chaînons alkyle de groupements isocyanate résiduels qui seraient accessibles aux
protéines.
A la vue de ces résultats, le modèle du déplacement stoechiométrique tenant compte
uniquement d’un processus de type ionique (décrit au paragraphe I.5.3 de ce chapitre par
l’Erreur ! Source du renvoi introuvable.) a été appliqué à l’étude du cytochrome c dans le
domaine des faibles concentrations salines et le modèle élargi au processus mixte de type
ionique et hydrophobe (décrit au paragraphe I.5.3 de ce chapitre par l’Erreur ! Source du
renvoi introuvable.) a été utilisé pour l’α-chymotrypsine, l’α-chymotrypsinogène A et le
lysozyme (Erreur ! Source du renvoi introuvable.) sur l’ensemble des concentrations en
sel.
α-Chymotrypsine
Cytochrome c
Lysozyme
2,0
1,5
log k'
1,0
0,5
0,0
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
- log [NaCl]
Figure III-12 : Application du modèle du déplacement stoechiométrique, tenant compte soit d’un
processus unique de type ionique (Cf. Erreur ! Source du renvoi introuvable.), soit d’un processus mixte de
type ionique et hydrophobe (Cf. Erreur ! Source du renvoi introuvable.), à l’étude de la rétention de
protéines basiques sur le support de silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-COOH) échangeur de cations. Conditions
chromatographiques : identiques à celles de la Erreur ! Source du renvoi introuvable.
Le modèle du déplacement stoechiométrique, rendant compte d’un processus ionique
ou d’un processus mixte ionique et hydrophobe, semble vérifié par l’ensemble des protéines.
Sur la Erreur ! Source du renvoi introuvable., il apparaît qu’aux faibles concentrations
salines, le lysozyme est plus retenu que l’α-chymotrypsinogène A qui est elle-même plus
221
CHAPITRE III
retenue que le cytochrome c. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus par Melander et
coll.87 sur un support échangeur de cations faible à base de COOH (Zorbax WCX-300). Aux
fortes concentrations en sel, le même ordre de rétention entre les protéines est observé mais
l’α-chymotrypsinogène A tend à rejoindre le lysozyme. Ce phénomène a également été
observé par Melander et coll.87.
Dans le cas du cytochrome, les paramètres log K0 et Z caractéristiques du système
chromatographique étudié sont obtenus expérimentalement par la détermination respective de
l’ordonnée à l’origine et de la pente de la représentation portant log k’ en fonction de -log
[NaCl]. Pour les autres protéines, les paramètres α, Z ainsi que le paramètre γ (définis au
paragraphe I.5.3 de ce chapitre) rendant compte du processus hydrophobe sont déterminés
expérimentalement par une régression non linéaire de la représentation portant log k’ en
fonction de la concentration saline [NaCl]. D’autre part, l’utilisation du chlorure de sodium
(contre-ion monovalent) implique à nouveau que les valeurs de Z déterminées
expérimentalement correspondent aux nombres de charges apparentes de la protéine (ZP)
mises en jeu dans le processus d’adsorption-désorption. Les valeurs des grandeurs log K0, α, Z
et γ déterminées pour l’ensemble des protéines figurent dans Erreur ! Source du renvoi
introuvable..
Support silice-polyβ
β -CD-(Dext-Ad-COOH)
milieu salin composé de NaCl
pI
log K0 ou α
ZP
γ
ZP / γ
4,4 (±0,2)
6,4 (±0,7)
0,69
5,0 (±0,8)
6,9 (±2,0)
0,72
6,5 (±1,7)
0,69
2,8 (±0,1)
4,6 (±0,4)
0,61
3,1 (±0,1)
4,7 (±0,3)
0,66
7,5 (±0,8)
0,59
pH = 7
α-Chymotrypsine
(b)
α-ChymotrypsinogèneA(b)
Cytochrome c(a)
Lysozyme(b)
8,38-8,76
8,8-9,2-9,6
9-9,4
11
-3,7 (±0,3)
(α)
-4,0 (±1,0)
(α)
-5,1 (±0,3)
(log K0)
-3,0 (±0,8)
(α)
5,0 (±0,3)
4,5 (±0,7)
pH = 6
α-Chymotrypsine(b)
α-ChymotrypsinogèneA(b)
Cytochrome c(a)
Lysozyme(b)
8,38-8,76
8,8-9,2-9,6
9-9,4
11
-2,3 (±0,1)
(α)
-2,4 (±0,1)
(α)
-4,4 (±0,3)
(log K0)
-3,6 (±0,3)
(α)
222
3,8 (±0,2)
4,4 (±0,3)
CHAPITRE III
Tableau III-9 : Valeurs de log K0, α, ZP et γ (à pH = 7 et pH = 6 en milieu salin composé de NaCl) de
quelques protéines basiques analysées sur le support échangeur de cations de type silice-polyβ
β-CD-(DextAd-COOH). Ces valeurs sont déterminées expérimentalement à partir du modèle du déplacement
stoechiométrique considérant un unique processus ionique (Cf. Erreur ! Source du renvoi introuvable.) (a)
ou un processus mixte ionique et hydrophobe (Cf. Erreur ! Source du renvoi introuvable.) (b).
De même que dans le cas du support échangeur d’anions, les valeurs de ZP
déterminées ne sont pas en accord strict avec le pI des protéines. Par exemple, le lysozyme
qui possède le pI le plus éloigné du pH de l’étude présente néanmoins un nombre de charges
apparentes plus faible par rapport à l’α-chymotrypsine ou l’α-chymotrypsinogène A. Ce
résultat indique que la totalité des charges contenues dans les protéines n’est pas accessible au
support. D’autre part, il semblerait que le modèle théorique décrivant un processus mixte de
type ionique et hydrophobe n’ajuste pas parfaitement les données expérimentales. Ceci
pourrait alors entraîner une détermination approchée des paramètres α, ZP et γ.
Par ailleurs, le rapport Z/γ peut également être utilisé pour comparer la rétention d’une
protéine sur des phases stationnaires différentes ou pour comparer diverses protéines sur un
même support. Ce rapport permet d’estimer l’importance relative des processus ionique et
hydrophobe dans le phénomène de rétention de la protéine et traduit en quelque sorte le
nombre moyen de charge par unité de surface hydrophobe de la protéine ; il s’agit donc d’une
densité de charges87. Dans le cas présent, les densités de charges calculées à pH = 7 pour l’αchymotrypsine, l’α-chymotrypsinogène A et le lysozyme sont de l’ordre de 0,7 (Erreur !
Source du renvoi introuvable.). Melander et coll.87 ont mesuré au même pH et sur un
échangeur de cations faible (Zorbax WCX-300) des rapports plus élevés, avec pour
comparaison des valeurs de 1,15 et 1,62 respectivement pour l’α-chymotrypsinogène A et le
lysozyme. Ces résultats indiquent que la contribution des effets hydrophobes du support de
silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-COOH) est plus importante que celle relative à la phase
stationnaire utilisée par les auteurs. Ceci pourrait par ailleurs expliquer le fait que pour le
support de l’étude, les valeurs de Z/γ déterminées pour l’α-chymotrypsine, l’αchymotrypsinogène A et le lysozyme sont similaires.
223
CHAPITRE III
b) Influence du pH sur la rétention des protéines et sur les paramètres caractéristiques des
systèmes protéine-support mis en jeu
Une étude ultérieure a consisté à évaluer l’influence du pH de la phase mobile sur la
rétention des protéines et sur les paramètres caractéristiques ZP et γ des systèmes biomoléculesupport mis en jeu. Les paramètres log K0, α , ZP et γ déterminés à pH = 6, suivant la même
méthode que pour l’étude à pH = 7, sont reportés dans le Erreur ! Source du renvoi
introuvable..
Les valeurs de ZP déterminées à pH = 6 pour l’α-chymotrypsine, l’αchymotrypsinogène A et le cytochrome c sont plus faibles que les valeurs obtenues à pH = 7.
Par contre, la valeur de ZP relative au lysozyme semble ne pas varier dans cette même gamme
de pH. Pour l’α-chymotrypsinogène A et le lysozyme, une évolution similaire a déjà été
observée par Melander et coll.87 sur un support échangeur de cations faible à base de COOH
(Zorbax WCX-300) mais le phénomène inverse à celui de l’étude avait été constaté pour le
cytochrome c.
D’autre part, les valeurs du paramètre hydrophobe γ déterminées à pH = 6 pour l’αchymotrypsine, l’α-chymotrypsinogène A sont plus faibles qu’à pH = 7 alors que l’inverse est
observé pour le lysozyme. Le résultat obtenu pour le lysozyme est identique à celui reporté
par Melander et coll.87 mais les auteurs avaient observé une évolution inverse à celle de
l’étude pour l’α-chymotrypsinogène A.
Lorsque le pH de la phase mobile est diminué de la valeur 7 à 6, plusieurs phénomènes
peuvent se produire simultanément. Tout d’abord, le degré d’ionisation des fonctions acide
carboxylique (pKa = 3,3-4,5123) de la phase stationnaire tend à diminuer comme le prouvent
les valeurs de capacité d’échange mesurées à ces deux pH (11,6. 10-2 meq/g à pH = 6 et
13,1.10-2 meq/g à pH =7). Ce phénomène devrait alors s’accompagner d’une diminution de la
valeur de ZP et le support devenant plus hydrophobe, d’une augmentation de la valeur de γ.
D’autre part, lorsque le pH diminue de 7 à 6, la charge nette des protéines analysées tend à
augmenter, du fait de l’ionisation des groupements histidine dont le groupement imidazole de
la chaîne latérale possède un pI de 5,97. Ce phénomène devrait alors s’accompagner d’une
augmentation de ZP et d’une diminution de γ, l’intensité de ces variations étant fonction de la
teneur en histidine de la protéine. Ainsi, selon la nature de la protéine, ces deux effets
224
CHAPITRE III
antagonistes vont engendrer soit une augmentation, soit une diminution des paramètres ZP et
γ. Par ailleurs, il faut noter que la variation du pH de la phase mobile peut s’accompagner de
phénomènes complexes, tels que des changements conformationnels des biomolécules ou du
support, qui interviennent également dans l’évolution des paramètres ZP et γ.
c) Séparation d’un mélange de protéines
Le support échangeur de cations de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-COOH) a ensuite été
testé pour la séparation d’un mélange de protéines basiques (Erreur ! Source du renvoi
introuvable.). La force ionique maximale du gradient en sel mis en jeu a été choisie à partir
des courbes présentées en Erreur ! Source du renvoi introuvable., de telle façon à ce que
les protéines présentent une affinité minimale pour le support, et ce, afin de réduire au
maximum le temps de l’analyse. Ainsi une concentration finale en sel de 0,3 M a été utilisée.
Densité optique
(unité d'absorbance)
[NaCl] (M)
Cytochrome c
0,5
0,4
0,3
0,2
Lysozyme
α -Chymoptrypsine
0,1
0,0
0
5
10
15
20
25
Temps (min)
Figure III-13 : Séparation d’un mélange de protéines basiques sur le support échangeur de cations de type
silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-COOH). Conditions chromatographiques : protéines à 1 mg/mL dans un
tampon Tris à 20mM de pH = 7 ; éluant : tampon Tris à 20mM de pH = 7 de concentration croissante en
NaCl ; profil du gradient : à t = 0 min, [NaCl] = 0,075 M ; à t = 3 min, [NaCl] = 0,075 M ; à t = 4 min,
[NaCl] = 0,12 M ; à t = 12 min, [NaCl] = 0,12 M ; à t = 13 min, [NaCl] = 0,30 M ; débit de la phase mobile :
1 mL/min ; détection UV à 280 nm
225
CHAPITRE III
Le cytochrome c et l’α-chymotrypsine sont correctement séparés par le support avec
un facteur de résolution (RS) (Cf. Annexe 14) de 1,35, par contre l’α-chymotrypsine reste trop
proche de l’α-chymotrypsinogène A avec une valeur de RS égale à 0,69.
D’un point de vue plus général, la séparation obtenue présente des pics de solutés
assez larges. Il est probable qu’une séparation correcte d’un mélange de protéines sur le
support actuel soit rendue impossible par la présence des interactions de type hydrophobe. En
effet, dans le cas d’une séparation de protéines par chromatographie ionique, une
concentration en sel élevée doit être utilisée pour réduire le temps de l’analyse et améliorer
l’efficacité de la colonne. Or, dans le cas présent, l’utilisation d’une force ionique élevée
s’avère impossible, au risque de faire intervenir le processus hydrophobe qui induirait alors
une forte rétention des protéines sur le support et conduirait ainsi à des effets inverses de ceux
recherchés. Pour la présente étude, le gradient en sel utilisé fait donc appel à une
concentration saline maximale peu importante de 0,3 M. Malgré cela, il semble que des
interactions hydrophobes soient déjà présentes à cette force ionique, notamment pour le
lysozyme (Cf. Erreur ! Source du renvoi introuvable.), et empêche une séparation rapide et
efficace des protéines. Par ailleurs, un second phénomène pourrait expliquer en partie la
largeur importante des pics : il est probable que la couche de dextrane immobilisée sur la
surface de silice-polyβ-CD (porosité 30 nm) réduise la taille apparente des pores et diminue
ainsi la vitesse du transfert de masse des protéines aux groupements fonctionnels du support.
II.4 – Analyse des protéines sur le support d’interaction hydrophobe de
type silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-C8)
II.4.1 – Analyse des protéines sur le support d’interaction
hydrophobe de type silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-C8)
Le support d’interaction hydrophobe de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) élaboré a été
appliqué à l’étude de la rétention de quelques protéines. L’évolution de la rétention d’un
certain nombre de biomacromolécules en fonction de la concentration en sel de l’éluant est
reportée sur la Erreur ! Source du renvoi introuvable..
226
CHAPITRE III
α-Lactalbumine
Ovalbumine
β-Lactoglobuline A
β-Lactoglobuline B
β-Lactoglobuline
α-Chymotrypsine
Cytochrome c
Lysozyme
40
30
k'
20
10
0
0,0
0,5
1,0
1,5
[(NH4)2SO4] (M)
Figure III-14 : Evolution du facteur de rétention de quelques protéines sur le support d’interaction
hydrophobe de silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-C8). Conditions chromatographiques : protéines à 1 mg/mL
dans un tampon Tris à 20mM de pH = 7 ; éluant : tampon Tris à 20mM de pH = 7 à différentes
concentrations en (NH4)2SO4 ; débit de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 280 nm
La rétention des protéines augmente avec la concentration en sel de l’éluant, ce qui
indique que les biomolécules entrent dans un processus d’interaction hydrophobe avec le
support. Ainsi, le modèle de Melander et Horvath (énoncé au paragraphe I.4.3 de ce chapitre
par l’Erreur ! Source du renvoi introuvable.) décrivant l’effet de sels sur la rétention des
protéines en HIC a été appliqué (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
227
CHAPITRE III
α-Lactalbumine
Ovalbumine
α-Chymotrypsine
Lysozyme
1,5
1,0
log k'
0,5
0,0
-0,5
-1,0
0,0
0,5
1,0
1,5
[(NH4)2SO4] (M)
Figure III-15 : Application du modèle de Melander et Horvath (Cf. Erreur ! Source du renvoi introuvable.) à
l’étude de la rétention de protéines sur le support d’interaction hydrophobe de silice-polyβ
β-CD-(Dext-AdC8). Conditions chromatographiques : identiques à celles de la Erreur ! Source du renvoi introuvable.
Les courbes obtenues représentant l’évolution du logarithme décimal du facteur de
rétention (log k’) des protéines en fonction de la concentration en sel de la phase mobile sont,
comme fréquemment noté dans la littérature57, incurvées plutôt que linéaires. Néanmoins, aux
forces ioniques les plus élevées, le logarithme décimal du facteur de rétention des protéines
(log k’) varie linéairement avec la concentration molaire en sel ([(NH4)2SO4]) de l’éluant, ce
qui indique que le modèle de Melander et Horvath est vérifié par l’ensemble des protéines.
Les paramètres log k’0 et H (définis au paragraphe I.4.3 de ce chapitre) caractéristiques
du système chromatographique mis en jeu sont donc déterminés expérimentalement sur cette
zone, respectivement à partir de l’ordonnée à l’origine et de la pente des représentations
portant log k’ en fonction de la concentration en sel [(NH4)2SO4]. Les valeurs obtenues sont
reportées dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable..
Support silice-polyβ -CD-(Dext-Ad-C8)
pH = 7, milieu salin composé de (NH4)2SO4
pI
log k’0
228
H
CHAPITRE III
α-Lactalbumine
4,2-4,5
-1,2 (±0,1)
-2,1 (±0,1)
Albumine du sérum
4,4-4,8
-2,2 (±0,7)
-2,9 (±0,7)
4,7
-2,6 (±0,4)
-3,0 (±0,4)
4,7
-1,8 (±0,2)
-1,6 (±0,1)
8,38-8,76
-1,6 (±0,4)
-2,1 (±0,4)
8,8-9,2-9,6
-1,1 (±0,2)
-2,1 (±0,3)
11
-1,5 (±0,2)
-1,9 (±0,2)
humain (ASH)
Albumine du sérum
bovin (ASB)
Ovalbumine
α-Chymotrypsine
Lysozyme
Tableau III-10 : Valeurs de log k’0 et H (à pH = 7 et en milieu salin composé de (NH4)2SO4) de quelques
protéines hydrophobes analysées sur le support d’interaction hydrophobe de type silice-polyβ
β-CD-(DextAd-C8). Ces valeurs sont déterminées expérimentalement à partir du modèle du de Melander et Horvath
(Cf. Erreur ! Source du renvoi introuvable.)
Au cours des études précédentes concernant la chromatographie d’échange d’ions, il
est apparu que le support de base de silice-polyβ-CD possédait des motifs hydrophobes,
provenant du réactif de couplage (1,4-diisocyanatobutane), susceptibles d’interagir avec les
protéines analysées. Ainsi, dans le cas du support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8), la
rétention de protéines hydrophobes pourrait être gouvernée non seulement pas les chaînons
octyle immobilisés sur le support, mais également par les sites non spécifiques présents sur le
support de base de silice-polyβ-CD. Cependant, la quantité de Dext-Ad-C8 immobilisée à la
surface de la silice étant relativement importante (80 mg/g de support), il est probable que le
support de base soit totalement masqué. Cette hypothèse est d’ailleurs vérifiée par la
comparaison, aux plus faibles forces ioniques, de la rétention de quelques protéines
hydrophobes sur le support de silice-polyβ-CD, avant et après immobilisation du dextrane
modifié Dext-Ad-C8 (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
229
CHAPITRE III
Avant et après immobilisation du Dext-Ad-C8
α-Lactalbumine
α-Chymotrypsine
Lysozyme
30
k'
20
10
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
[(NH4)2SO4] (M)
Figure III-16 : Comparaison du facteur de rétention de quelques protéines hydrophobes sur le support de
base de silice-polyβ
β-CD, avant et après immobilisation du polymère Dext-Ad-C8.
Sur la gamme de concentrations salines étudiées, la rétention négligeable des protéines
hydrophobes sur le support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) comparativement au support de
base de silice-polyβ-CD indique que les sites apolaires diisocyanatobutane sont totalement
écrantés. Ainsi, les paramètres reportés dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable. sont
uniquement caractéristiques d’un processus hydrophobe entre les protéines et les chaînons
octyle de la phase stationnaire.
Les valeurs de H déterminées dans le cas présent sont du même ordre de grandeur que
celles reportées dans la littérature. A titre d’exemple, Fausnaugh et Regnier124 ont déterminé
sur un support de HIC à base de groupements phényle (colonne TSKgel Phenyl-PW) et en
présence de sel (NH4)2SO4 dans la phase mobile, une valeur de H de -2,8 et -1,8
respectivement pour l’ovalbumine et le lysozyme. Cette comparaison reste néanmoins
approchée car le paramètre H est fonction de nombreux facteurs tels que la nature de la
protéine et du sel mais aussi de la nature du support et de la densité et de la distribution des
sites hydrophobes à sa surface.
230
CHAPITRE III
II.4.2 – Séparation d’un mélange de protéines à caractère hydrophobe
sur le support
Le support d’interaction hydrophobe de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) a ensuite été
mis en œuvre pour séparer un mélange de protéines constitutives du blanc d’oeuf (Erreur !
Densité optique
(unité d'absorbance)
[(NH4)2SO4] (M)
Lysozyme
2,0
2,0
1,5
1,5
Ovalbumine
1,0
1,0
Conalbumine
*
0,5
0,5
0,0
0,0
0
5
10
15
Temps (min)
Figure III-17 : Séparation d’un mélange de protéines contenues dans le blanc d’oeuf sur le support
d’interaction hydrophobe de type silice-polyβ
β -CD-(Dext-Ad-C8). Conditions chromatographiques :
protéines à 1 mg/mL dans un tampon Tris à 20mM de pH = 7 ; éluant : tampon Tris à 20mM de pH = 7 de
concentration décroissante en (NH4)2SO4, ; profil du gradient : à t = 0 min, [(NH4)2SO4] = 1,4 M ; à t =
0,01 min, [(NH4)2SO4] = 1,0 M ; à t = 2 min, [(NH4)2SO4] = 1,0 M ; à t = 3,5 min, [(NH4)2SO4] = 0 M ; débit
de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 280 nm ; (*) impureté
Les biomolécules sont séparées avec un facteur de résolution (RS) de 1,35 et 1,00
respectivement entre la conalbumine et l’ovalbumine et entre l’ovalbumine et le lysozyme.
La séparation est plus rapide et les pics de solutés sont plus fins comparativement à la
séparation effectuée sur le support échangeur de cations. En effet, la phase stationnaire
actuelle d’interaction hydrophobe ne présente pas d’interactions non spécifiques de type
ionique. Il est alors possible d’utiliser un gradient de concentration décroissante en sel jusqu’à
la valeur 0 M sans pour autant engendrer de processus ionique supplémentaire, et permettant
alors d’obtenir une séparation plus rapide et de meilleure qualité d’un mélange de protéines.
231
CHAPITRE III
Néanmoins la largeur des pics de solutés reste relativement importante, avec par exemple une
hauteur équivalente d’un plateau théorique (HEPT) (Cf. Annexe 14) égale à 8,5 mm pour le
lysozyme. Ceci suggère que des facteurs autres que la présence d’un processus mixte (ionique
+ hydrophobe) doivent être responsables de la cinétique lente du transfert de masse des
protéines aux groupements fonctionnels du support.
II.5 – Amélioration de l’efficacité des colonnes
Au cours des études précédentes, il est apparu que les supports de fonctionnalités
variables élaborés conduisaient à des pics de solutés assez larges. Plusieurs facteurs pourraient
être responsables de ce résultat. Dans le cas des supports ioniques, les interactions
hydrophobes non spécifiques sont sans doute une des principales causes de la largeur
importante des pics. Dans le cas du support d’interaction hydrophobe qui ne présente pas
d’interactions non spécifiques, il est probable que les biomolécules accèdent difficilement aux
sites actifs du support du fait d’un transfert difficile au travers des pores. Une des raisons à ce
phénomène pourrait être la masse moléculaire relativement importante (de l’ordre de 40 000
g/mol) du dextrane utilisé pour fonctionnaliser le support de base de porosité 30 nm. Afin de
vérifier cette hypothèse, une étude a consisté à élaborer une phase chromatographique à partir
d’un dextrane de masse moléculaire plus faible (M = 10 000 g/mol) et à examiner l’effet de ce
changement sur les propriétés de la colonne.
Afin de n’observer que l’influence de la masse moléculaire du dextrane immobilisé sur
l’efficacité de la colonne, les interactions non spécifiques protéine-support doivent être
éliminées. Précédemment, il a été montré que la quantité importante de Dext40-Ad-C8 fixée
sur la silice-polyβ-CD (80 mg/g de silice) permettait d’écranter totalement les groupements
hydrophobes du support de base et, par conséquent, d’éliminer les interactions hydrophobes
non spécifiques protéine-support (Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Ainsi, une
nouvelle phase stationnaire de type hydrophobe a été préparée en immobilisant comme décrit
précédemment (Cf. Paragraphe II.1 de ce chapitre), un polymère de Dext-Ad-C8 de masse
10 000 g/mol dans une colonne de silice-polyβ-CD jusqu’à saturation de cette dernière.
Cependant, à rétention égale, l’efficacité de la colonne obtenue est très voisine de celle
préparée à partir d’un dextrane de masse moléculaire 40 000 g/mol. En effet, si la grande
quantité de Dext-Ad-C8 immobilisée présente l’intérêt de masquer parfaitement le support de
232
CHAPITRE III
base, il en découle par ailleurs un désavantage. Il est tout à fait possible que le dextrane
immobilisé s’agence en une multicouche qui obstrue les pores et au sein de laquelle le
transfert des protéines est rendu très difficile. Des études complémentaires sur des supports de
porosité plus élevée pourraient alors être envisagées
II.6 – Régénération des colonnes
L’utilisation fréquente d’une phase chromatographique peut altérer les propriétés
d’échange ou d’interaction de cette dernière. Il serait alors intéressant de pouvoir préparer
rapidement un nouveau support sans être obligé de reconduire le protocole expérimental
depuis sa première étape opératoire. Dans le cas présent, la couche de dextrane modifié DextAd-R adsorbée sur le support de silice-polyβ-CD étant responsable des propriétés
chromatographiques de la colonne, il serait avantageux de pouvoir éliminer rapidement cette
couche de polymère et de la remplacer par une nouvelle. C’est en partie pour répondre à cette
demande que le mode de synthèse choisi fait appel à un système fondé sur la formation de
complexes d’inclusion qui se sont révélés être réversibles dans le cas des biocapteurs119.
Par ailleurs, les deux types de supports élaborés (support échangeur d’ions ou support
d’interaction hydrophobe) reposant sur le même principe de préparation, la régénération des
colonnes a été testée uniquement sur un des deux types de phases chromatographiques. Le
support d’interaction hydrophobe de type silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) a semblé être le
meilleur candidat pour cette étude. En effet, d’une part la quantité de Dext-Ad-C8 immobilisée
sur le support est supérieure à celles obtenues avec le Dext-Ad-COOH et le Dext-Ad-DEAE,
d’autre part, du fait de la présence des chaînons octyle sur le polymère, l’affinité du Dext-AdC8 pour la silice-polyβ-CD est probablement supérieure à celles relatives aux dextranes
chargés Dext-Ad-COOH et Dext-Ad-DEAE. Ainsi, si la méthode de régénération testée
s’avère apte à éliminer la totalité du Dext-Ad-C8 immobilisé sur le support, elle devrait
désorber d’autant plus facilement l’ensemble du Dext-Ad-COOH et du Dext-Ad-DEAE
adsorbés sur la silice-polyβ-CD.
La régénération d’un support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) au niveau de la couche
du polymère de β-cyclodextrine a donc été testée, l’objectif étant de dissocier les complexes
233
CHAPITRE III
d’inclusion formés entre les groupements adamantyle portés par le dextrane et les cavités de
cyclodextrine. Pour ce faire, une solution de SDS à 1% en masse dans de l’eau est mise à
percoler sur le support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) (rinçage d’environ 7h30 min à
1mL/min).
Par ailleurs, la qualité de la régénération du support a été vérifiée par injection d’un
méthoxy(polyéthylène glycol) de masse 5000 g/mol modifié à une extrémité par un
groupement hydrophobe naphtyle (MPEG-Nap). En effet, David et coll.125 ont montré
l’existence d’interactions spécifiques entre des MPEG-Nap et une phase stationnaire de silicepolyβ-CD par formation de complexes d’inclusion entre le groupement hydrophobe naphtyle
(Nap) à l’extrémité du MPEG et les cavités de β-CD présentes à la surface du support. Ainsi,
la comparaison de la rétention du MPEG-Nap sur le support initial de silice-polyβ-CD puis
sur la silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) et enfin sur la silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) régénérée
donne une indication sur la quantité de β-CD accessible et permettrait de vérifier si la totalité
des cavités de CD ont été libérées au cours de la régénération de la colonne. L’ensemble des
résultats obtenus au cours de la régénération du support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) est
regroupé dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable..
silice-polyβ -CD
silice-polyβ-CD-
silice-polyβ -CD-
(Dext-Ad-C8)
(Dext-Ad-C8)
régénérée
VR du MPEG-Nap
7,4
0,85
9,6
7,7
0
10,3
(mL)
k’ du MPEG-Nap
Tableau III-11 : Mise en évidence de l’efficacité du procédé de régénération appliqué à un support de
silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-C8)
par
injections
d’un
polymère
de
MPEG-Nap.
Conditions
chromatographiques : MPEG-Nap (M = 5000 g/mol) à 1 mg/mL dans l’eau ; éluant : eau ; débit de la
phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 254 nm
En accord avec les données de la littérature125, le MPEG-Nap est retenu par le support
initial de silice-polyβ-CD avec un facteur de rétention assez élevé de l’ordre de 7,7. Ce
résultat traduit qu’un nombre relativement important de cavités de cyclodextrine interagit
avec le MPEG-Nap. Après immobilisation du Dext-Ad-C8 sur la silice-polyβ-CD, la rétention
234
CHAPITRE III
du MPEG-Nap sur le support devient nulle. Ce dernier point indique qu’aucune cavité de
cyclodextrine n’est restée accessible au polymère et suggère un écrantage total du support de
base de silice-polyβ-CD par la couche de dextrane, phénomène déjà observé au paragraphe
II.4.1 de ce chapitre. Après régénération du support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) par
percolation d’une solution de SDS, la rétention du MPEG-Nap redevient importante (k’ =
10,3) et même plus élevée que sur le support d’origine de silice-polyβ-CD (k’ = 7,7). Ce
résultat suggère que le nombre de cavités de cyclodextrine accessibles au MPEG-Nap est plus
important sur le support régénéré comparativement à celui relatif au support de silice-polyβCD de la première étape. Ainsi, le support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-C8) a sans doute été
régénéré au niveau du polymère de cyclodextrine et il est de plus probable que l’utilisation du
SDS ait conduit à libérer certaines cavités de cyclodextrine initialement occupées par des
produits de synthèse, tels que la pyridine ou la DMAP, utilisés lors l’élaboration de la silicepolyβ-CD (Cf. Chapitre II).
III - Mise en jeu d’un complexe d’inclusion à base de
cyclodextrine
pour
l’élaboration
de
supports
chromatographiques destinés à la purification d’antigènes
L’objectif de ce travail a été de mettre en œuvre des complexes d’inclusion à base de
cyclodextrines afin d’élaborer de façon simple et rapide des supports d’immunoaffinité à
vocation préparative. Une étude de faisabilité a été effectuée en greffant sur un support de
silice, un anticorps polyclonal anti-albumine du sérum humain (anti-ASH). Le support ainsi
obtenu a été testé quant à sa capacité à fixer spécifiquement l’antigène correspondant :
l’albumine du sérum humaine (ASH)
III.1 – Présentation du système antigène-anticorps étudié
235
CHAPITRE III
III.1.1 - Albumine du sérum humain (ASH)
a) Composition de l’albumine du sérum humain (ASH)
L’albumine du sérum humain (ASH) est une protéine de masse moléculaire proche de
69 000 g/mol. Sa séquence primaire a été déterminée simultanément par Behrens et coll.126 et
par Meloun et coll.127 en 1975 : la molécule d’ASH est constituée d’une seule chaîne
polypeptidique contenant 585 résidus d’acides aminés. La molécule d’albumine présente la
particularité de contenir peu de méthionine et un seul tryptophane (en position 214). Par
contre, elle est composée de nombreuses cystéines et acides aminés chargés (99 acides
chargés positivement et 97 chargés négativement) tels que l’acide aspartique, l’acide
glutamique, la lysine et l’arginine. Son point isoélectrique est de 4,8 et sa charge globale à pH
= 7 est de -15 eq/mol. Les principales propriétés physico-chimiques de l’albumine sont
résumées dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable.. Sur l’ensemble de la structure de
la protéine, seul un résidu cystéine (en position 34), protégé de l’oxydation du fait de facteurs
stériques, présente un groupement thiol libre. Les autres résidus cystéine sont reliés par de
nombreux ponts disulfure (au nombre de 17 au total) qui confèrent à la protéine une grande
stabilité ainsi qu’une conformation particulière avec 9 boucles réparties en 3 domaines
homogènes.
Masse molaire (g/mol)
69 000
Masse volumique (g/cm3)
1,35
Forme
Ellipsoïde
3
Taille (nm )
15 × 3,8 × 3,8
Point isoélectrique (unité de pH)
2
4,8
Coefficient de diffusion (cm /s)
0,61.10-6
Viscosité intrinsèque (cm3/g)
0,041
Absorbance (279 nm, 1 mg/mL) (unité de DO)
0,531
Tableau III-12 : Quelques caractéristiques physico-chimiques de l’albumine du sérum humain (ASH),
d’après Peters128
236
CHAPITRE III
b) Conformation de l’albumine
L’albumine est une protéine de forme ellipsoïdale de dimensions 15 × 3,8 × 3,8 nm3.
Des études cristallographiques129 menées à 0,28 nm de résolution ont montré que la molécule
d’albumine possède une structure cristalline en forme de cœur, assimilée à un triangle
équilatéral de 8 nm de côté et de 3 nm d’épaisseur. Chacun des trois domaines homologues est
constitué de 10 hélices et 67 % de la structure de la molécule d’albumine est hélicoïdale.
Les charges positives et négatives distribuées sur la molécule d’albumine lui confèrent
un caractère hydrophile et contribuent à sa grande solubilité en milieu aqueux. D’autre part, la
présence de deux domaines hydrophobes lui confère des propriétés amphiphiles129.
En solution aqueuse, l’albumine peut subir des changements réversibles de sa
conformation moléculaire. Cette propriété confère à la molécule une résistance à des
conditions très dures qui provoqueraient la dénaturation de bien d’autres protéines. Ainsi,
pour des pH proches de 1 à 2, la chaîne macromoléculaire se déploie et s’allonge, mais ce
phénomène est réversible et la molécule peut retrouver sa conformation native. Bien que le
domaine de stabilité de l’albumine soit étendu, une dénaturation irréversible peut se produire
en milieu basique (pH9) par polymérisation de la protéine et perte des structures
hélicoïdales130 ou par oxydation irréversible des ponts disulfure par l’oxygène131,132. En milieu
acide, ces ponts sont peu touchés mais la liaison peptidique peut être hydrolysée.
c) Fonctions de l’albumine
L’albumine est la protéine la plus abondante du plasma sanguin et représente 60% de
la totalité des protéines plasmatiques. Sa concentration physiologique est de 42 ± 3,5 mg/mL
(636 ± 53 µM) ce qui représente environ une masse de 150 g pour une personne de 70kg
possédant un volume plasmatique proche de 3,5 L. L’albumine est détruite par le catabolisme
naturel à raison de 14 g par jour, cette consommation est alors compensée par une synthèse
hépatique de l’ordre de 0,7 mg par gramme de foie et par heure. Le taux d’albumine est
maintenu constant par le contrôle de son gène par des hormones telles que l’insuline ou la
somatotropine. Le temps de demi-vie de l’albumine est de 19 jours.
L’albumine joue de nombreux rôles physiologiques dont la régulation de la pression
osmotique dans l’organisme et la régulation du pH sanguin. Elle est capable de se lier
237
CHAPITRE III
réversiblement à de nombreuses substances telles que des acides gras (linoléate, oléate,
palmitate), des acides aminés (notamment le tryptophane et la cystéine), des hormones
(stéroides, estradiol, progestérone), des ions métalliques (calcium, cuivre, zinc) et de
nombreuses substances à usage thérapeutique133. De ce fait, elle intervient également dans les
processus de régulation, de transport, de distribution et de métabolisation de nombreux
composés endogènes ou exogènes.
III.1.2 – Anticorps anti-albumine du sérum humain
Les études présentées par la suite ont été effectuées avec un anticorps particulier antialbumine du sérum humain mais l’exposé ci-dessous décrit la notion générale d’anticorps134.
a) Introduction à la réponse immunitaire chez les vertébrés : notions d’antigène et
d’anticorps
Les vertébrés ont développé un système immunitaire qui fournit des défenses
spécifiques contre presque n’importe quel microorganisme ou autre substance étrangère
pénétrant le corps. Les substances étrangères qui provoquent une réponse immunitaire sont
appelées des antigènes. Le système immunitaire possède deux types de défenses contre les
antigènes
(microorganismes) :
des
protéines
circulantes,
appelées
anticorps
ou
immunoglobulines (Ig), qui se fixent aux antigènes et les inactivent ou provoquent leur
destruction ; des cellules spécialisées, ayant des récepteurs de surface capables de reconnaître
une attaque spécifique d’antigènes et de les détruire. Le premier type de réponse s’appelle
immunité humorale et le second, immunité à médiation cellulaire.
Les réponses immunitaires sont effectuées par les lymphocytes. Ce sont de petites
cellules rondes qui prennent naissance dans la moelle osseuse d’animaux adultes et qui, après
maturation, circulent dans la lymphe et dans les systèmes circulatoires. Il existe deux classes
principales de lymphocytes : les lymphocytes B, qui synthétisent les anticorps, et les
lymphocytes T, qui effectuent les réponses immunitaires à médiation cellulaire en utilisant des
récepteurs de cellules T ancrés dans la membrane et spécifiques d’antigènes. La capacité
qu’ont les molécules d’anticorps et les récepteurs de cellules T d’interagir spécifiquement
avec les antigènes est une conséquence de leurs séquences particulières d’acides aminés135.
238
CHAPITRE III
Selon la théorie de la sélection clonale136, chaque lymphocyte B synthétise un anticorps
n’ayant qu’une seule spécificité, et chaque cellule T n’a qu’un seul type de récepteur
d’antigène.
Structure des molécules typiques d’anticorpsb)137-139
Les molécules typiques d’anticorps sont des protéines de masse moléculaire proche de
150 000 g/mol et constituées par quatre chaînes polypeptidiques. Plus précisément, il existe
deux chaînes légères identiques, contenant chacune environ 220 acides aminés, et deux
chaînes lourdes identiques, contenant chacune environ 440 acides aminés (Erreur ! Source
du renvoi introuvable.). Chaque chaîne légère est liée à une chaîne lourde par un pont
disulfure et il existe également des ponts disulfure entre les deux chaînes lourdes. De plus,
chacune des quatre chaînes polypeptidiques possède également des ponts disulfure
intrachaînes, régulièrement espacés. Des résidus glucidiques sont attachés aux chaînes
lourdes, faisant ainsi des molécules d’anticorps des glycoprotéines.
Figure III-18 : Modèle de structure d’une molécule typique d’anticorps humain, composé de deux chaînes
polypeptidiques légères et de deux chaînes polypeptidiques lourdes. Le groupement CHO indique la
position approximative de la chaîne glucidique dans la chaîne lourde. Deux sites actifs identiques de
combinaison antigénique sont situés dans les bras de la molécule.
239
CHAPITRE III
Ces quatre chaînes polypeptidiques sont organisées de telle sorte que chaque molécule
d’anticorps contient deux sites identiques de fixation d’antigènes, largement séparés, et dont
chacun peut se combiner à un antigène en utilisant des liaisons secondaires pour maintenir
ensemble leurs surfaces complémentaires. L’examen d’anticorps au microscope électronique
révèle des molécules généralement en forme de Y avec un de ces sites actifs à l’extrémité de
chaque bras. Chaque bras est articulé efficacement autour de l’axe central, la distance entre
les sites actifs augmentant parfois lorsqu’ils sont liés à un antigène.
Une partie des premiers renseignements sur la structure des anticorps et sur la relation
structure-fonction provient d’expériences de dégradation des molécules d’anticorps avec des
enzymes protéolytiques : la papaïne et la pepsine (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
La papaïne produit deux fragments identiques d’attachement à l’antigène, appelés fragments
Fab pour « Fragment Antigen Binding », ayant chacun un seul site de fixation de l’antigène,
et un fragment Fc pour « Fragment cristallisable », dont le nom reflète sa capacité à se
cristalliser aisément. Le traitement par la pepsine donne un fragment F(ab)’2 qui possède deux
sites de liaison antigénique et demeure capable de faire des pontages avec des antigènes.
Figure III-19 : Création des fragments Fab, Fc et F(ab’)2 par digestion protéolytique spécifique de
molécules d’anticorps
240
CHAPITRE III
La région Fc, assure ce que l’on appelle les fonctions effectrices de la molécule. Les
fonctions effectrices sont les diverses activités que doivent assumer les anticorps en plus de la
fixation d’antigènes. Ainsi, par exemple, les complexes antigène-anticorps doivent interagir
avec les phagocytes qui les ingéreront, et cette interaction se produit entre ces cellules et les
régions Fc. Une autre fonction effectrice de ces régions est l’interaction avec une série de
protéines du sang appelées collectivement le système du complément. Lorsque des protéines
du complément s’attachent à un des complexes antigène-anticorps, elles peuvent provoquer la
destruction (lyse) de l’antigène.
c) Les chaînes lourdes et légères possèdent des régions variables pour la reconnaissance
des antigènes et des régions constantes pour leurs fonctions effectrices140-142
Des cartographies de peptides issus de l’action de la trypsine sur différents anticorps
ont mis en évidence la présence de régions variables (V) et de régions constantes (C) sur les
chaînes polypeptidiques constitutives des anticorps (Erreur ! Source du renvoi
introuvable.). Ce sont les régions V des chaînes lourdes et légères qui, ensemble, forment les
sites de combinaison antigéniques. La variabilité de la séquence en acides aminés n’est pas
uniformément distribuée sur les régions variables. Elle est concentrée dans trois segments
appelés régions déterminant la complémentarité avec l’antigène (CDR = complemantarity
determining regions) ou régions hypervariables. Ce sont ces régions hypervariables qui
tapissent les parois des cavités de fixation des antigènes dans les molécules natives
d’anticorps.
d) Interaction antigène-anticorps
Un anticorps donné reconnaît une région bien précise de l’antigène correspondant
appelée épitope. Dans le cas des antigènes protéiques l’épitope est formé par un ensemble de
résidus peptidiques voisins. Il peut s’agir d’acides aminés qui se succèdent dans la structure
primaire de la protéine ou d’acides aminés rapprochés dans l’espace par le reploiement de la
chaîne macromoléculaire. L’épitope est une partie relativement petite de l’antigène et il est
parfois possible de trouver une structure identique ou très voisine sur une autre molécule.
L’anticorps va pouvoir interagir également avec cet autre antigène et on parle alors de
241
CHAPITRE III
réaction croisée143,144. Lorsqu’une telle réaction a lieu, l’affinité de l’anticorps pour le second
site est plus faible que son affinité pour l’épitope.
Le complexe antigène-anticorps est établi uniquement par des liaisons non covalentes
de faible énergie telles que les liaisons hydrogène, les forces de Van der Waals, les
interactions électrostatiques et les interactions hydrophobes. L’affinité d’un anticorps pour
l’antigène correspondant est fortement dépendante de la complémentarité stérique de ces deux
entités. Le complexe obtenu sera d’autant plus stable qu’une complémentarité parfaite
s’établit entre les deux molécules. Des changements mineurs dans la structure de l’antigène145
ou la modification de certaines résidus acides aminés au niveau du site de fixation de
l’anticorps peuvent diminuer considérablement la stabilité du complexe antigène-anticorps.
L’interaction entre un antigène et un anticorps est un phénomène réversible. Une
modification des propriétés physico-chimiques du milieu peut favoriser l’association ou la
dissociation du complexe. Ainsi, en immunochromatographie, il est possible de dissocier le
complexe antigène-anticorps en faisant varier la phase mobile146 (modification du pH, de la
force ionique ou de la composition de l’éluant) ou en jouant sur la température.
e) Présentation des différentes classes d’anticorps139
Pour les chaînes légères, il existe deux types principaux de régions constantes différant
par leur séquence d’acides aminés et définissant deux types de chaînes légères, appelés κ et λ.
Les régions constantes des chaînes légères κ et λ sont homologues à environ 30 à 40%.
Les molécules d’anticorps peuvent être attribuées à différentes classes, selon la
séquence d’acides aminés de la région constante de leurs chaînes lourdes. Le résultat de ces
différences de séquences d’acides aminés est que des molécules d’anticorps appartenant à
certaines classes sont composées de plus d’un tétramère de chaînes légères et lourdes ; des
molécules appartenant à des classes différentes peuvent également différer quant aux
positions des ponts disulfure qui relient leurs deux chaînes lourdes. La conséquence la plus
importante de ces différences de séquences d’acides aminés est que des fonctions biologiques
distinctes sont conférées à des classes différentes d’anticorps. Il existe cinq classes principales
d’anticorps, appelées IgA, IgD, IgE, IgG et IgM, et certaines d’entres elles peuvent être
divisées en sous-classes (par exemple IgG1). Les régions constantes de chaînes lourdes qui
correspondent aux différentes classes d’anticorps sont appelées α,δ,ε,γ et µ. Leurs séquences
242
CHAPITRE III
d’acides aminées sont homologues à environ 40%. La Erreur ! Source du renvoi
introuvable. représente les structures des différentes classes de molécules d’anticorps, et
leurs propriétés sont résumées dans le Erreur ! Source du renvoi introuvable..
Figure III-20 : Structures des sous unités de différentes classes d’immunoglobulines humaines. Les ponts
disulfure sont indiqués par –S-S-. Les IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4 sont des sous-classes d’IgG ; les IgA1 et
IgA2 sont des sous-classes monomériques d’IgA. La chaîne polypetidique J réunit la forme polymérique
d’IgA et peut initier la jonction des cinq sous-unités qui incluent des molécules extracellulaires d’IgM.
243
CHAPITRE III
Classes d’anticorps
Propriété
IgM
IgD
IgG
IgA
IgE
Chaîne lourde
µ
δ
γ
α
ε
Chaîne légère
κ ou λ
κ ou λ
κ ou λ
κ ou λ
κ ou λ
5
1
1
1 ou 2
1
Structure
(µ2 κ2)5
ou
(µ2 λ 2)5
δ2 κ2
ou
δ2 λ 2
γ2 κ2
ou
γ2 λ 2
(α2 κ2)1−2
ou
(α2 λ 2)1-2
ε2 κ2
ou
ε2 λ 2
Masse moléculaire (g/mol)
900 000
185 000
150 000
160 000 ou
200 000
Nombre d’unités Y
320 000
% dans le sérum
6
1
80
13
0,002
Taux de glucides (%)
12
13
3
8
12
+
−
+
−
−
−
−
Fonction biologique :
- Active le complément
- Franchit le placenta
−
−
+
- Premier anticorps qui
+
−
−
−
−
-Sécrétions élevées
−
−
−
+
−
- Réactions allergiques dues à
−
−
−
−
+
apparaît après immunisation
une interaction avec d’autres
types de cellules
Tableau III-13 : Propriétés des principales classes d’anticorps chez l’homme.
(+) indique que l’anticorps possède la propriété alors que (−)
−) indique que l’anticorps ne possède pas la
propriété
Différentes classes d’anticorps ont évolué pour assumer des fonctions spécialisées. Par
exemple, les pentamères IgM apparaissent tôt au cours des réponses immunitaires primaires ;
puis, au cours des réponses secondaires, ils sont largement remplacés par les anticorps IgG
plus courants. Les anticorps IgG sont les seuls qui puissent traverser le placenta pour aller de
la mère au fœtus durant la grossesse. Les molécules IgA sont celles que l’on trouve
habituellement dans les sécrétions (larmes, salive, lait, etc.). Le comportement différent des
244
CHAPITRE III
molécules est dû aux régions constantes de leurs chaînes lourdes. Ainsi, par exemple, des
récepteurs spécifiques sur des cellules du placenta reconnaissent la région constante des
molécules IgG, ce qui provoque leur ingestion par endocytose, leur transfert à travers la
cellule et leur libération dans le sang fœtal de l’autre côté de la cellule. Ces diverses fonctions
que remplissent les anticorps font partie des fonctions effectrices.
III.2 – Préparation du support chromatographique d’immunoaffinité
destiné à la purification de l’albumine du sérum humain (ASH)
La préparation d’un support d’immunoaffinité pour la purification de l’albumine du
sérum humain (ASH) a fait appel à un procédé similaire à celui évoqué précédemment, dans
le cas de l’élaboration des supports chromatographiques de fonctionnalités variables pour
l’analyse des protéines (paragraphe II de ce chapitre). Autrement dit, la formation de
complexes d’inclusion, entre des groupements hydrophobes adamantyle portés par un
dextrane et des cavités de β-cyclodextrine, a été de nouveau mise à profit pour simplifier la
chimie de surface.
III.2.1 – Préparation du support d’immunoaffinité en mode statique
(voie 1)
Une phase de silice, préalablement greffée par un polymère de β-cyclodextrine (Cf.
Chapitre I), a été modifiée par un anticorps anti-albumine humaine (anti-ASH) suivant le
protocole décrit par la Erreur ! Source du renvoi introuvable. et les conditions énoncées
dans l’annexe 15. Les molécules d’anticorps possédant une taille relativement importante
(masse moléculaire de l’ordre de 150 000g/mol), leur immobilisation sur la surface de la
silice, ajoutée à celle de la couche initiale de dextrane, entraîne une diminution de la taille
initiale des pores. De ce fait, afin de favoriser la cinétique du transfert de masse de l’antigène
au travers de la phase stationnaire, un support de porosité élevée de l’ordre de 400 nm a été
utilisé. Les propriétés relatives au support de silice-polyβ-CD utilisé sont reportées en annexe
3.
245
CHAPITRE III
Dext-Ad-COOH
1er étape
COOH
Dext-Ad-COOH
(30 mg/mL dans eau + NaCl 1 M)
TA, 16 h, NaCl (1 M)
Si
Ad
Si
COOH
Ad
3ème étape
COO
Anti albumine humaine
(5,5 mg/mL dans PBS, 10 mM, pH = 7,2)
H2 N
2ème étape
NH2
H2N
EDC/NHS
TA, 1 h, eau
NH2
TA, 3 h
O
O
C O
O
O
N
C O
Ad
N
Ad
O
O
O
Si
C
O
O
Si
C O
NH
N
O
Ad
Ad
O
O
C
C O
NH
O
N
O
COO
4ème étape
TA, 7 h, PBS (10 mM, pH = 8)
Ad
O
Si
C
NH
Ad
O
Silice-(anti-ASH)
C
NH
Réaction III-1 : Elaboration du support chromatographique d’immunoaffinité destiné à la purification de
l’albumine du sérum humain par synthèse en mode statique
246
CHAPITRE III
1ère étape : Adsorption d’un dextrane modifié par des groupes adamantyle et des
fonctions acide carboxylique (Dext-Ad-COOH)
La première étape de l’élaboration du support immunologique consiste à adsorber un
Dext-Ad-COOH sur un support de silice-polyβ-CD. Cette adsorption, résultant de la
formation de complexe d’inclusion entre les groupes adamantyle du polymère et les cavités de
β-cyclodextrine du support, s’effectue au cours d’une simple immersion de la phase dans une
solution concentrée de dextrane modifié en milieu salin, l’ensemble étant maintenu sous
agitation à température ambiante. L’immobilisation du Dext-Ad-COOH sur le support de
silice-polyβ-CD a été vérifiée par analyse élémentaire. A partir du taux de carbone, une
quantité de 21 mg de Dext-Ad-COOH immobilisé par gramme de silice a été déterminée, ce
qui représente une concentration molaire d’environ 5,3.10-2 mmol de fonctions COOH par
gramme de silice et une concentration surfacique de 5,3.10-3 mmol de fonctions COOH par
mètre carré de silice.
2ème étape : Activation des fonctions acide carboxylique du dextrane
Les fonctions acide carboxylique du dextrane sont activées en ester de Nhydroxysuccinimide
(ester
de
NHS)
(diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide
en
présence
(EDC),
d’hydrochlorure
(Erreur !
Source
de
du
1,3renvoi
introuvable.), suivant le mécanisme décrit par la Erreur ! Source du renvoi introuvable..
O
H 3C
HO
N
N
CH2
CH2
CH2
N
C
N
CH2
CH3 , HCl
H 3C
EDC
(M =191,5g/mol)
O
NHS
(M =115,09g/mol)
Figure III-21 : Structure chimique de la N-hydroxysuccinimide (NHS) et de l’hydrochlorure de 1,3(diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC)
247
CHAPITRE III
HN
EDC
+
RCOO
R
[ RCOO--------EDC ]
C
O
C
O
formation d'un complexe
par interactions ioniques
R1
N
R2
composé 1
H2O
hydrolyse
avec R1 = (CH2)3N(CH3)2
NHS
R2= CH2-CH3
O
R1
NH
C
NH
R2
O
+
RCOO
R
C
O
N
O
O
urée
ester de NHS
composés 3
composé 2
Réaction III-2 : Mécanisme d’activation de fonctions carboxylate par le mélange NHS/EDC proposé par
Johnsson et coll.123
De par la réactivité élevée des esters de NHS vis-à-vis des dérivés aminés, ce système
est souvent utilisé pour coupler des protéines à des surfaces123,147-149 et à des matrices telles
que l’agarose150. Johnsson et coll.123 ont optimisé les conditions d’activation par le couple
NHS/EDC et ont montré que l’introduction simultanée des deux composés limite la réaction
secondaire d’hydrolyse du composé intermédiaire (composé 1), et de ce fait, augmente la
formation de l’espèce active ester de NHS (composé 2). De plus, un rapport molaire optimal
du mélange EDC/NHS égal à 0,2M/0,05M permet également de réduire la réaction
d’hydrolyse du composé 1 et conduit en sept minutes à l’activation d’environ 30 à 40% des
fonctions.
3ème étape : Greffage de l’anticorps anti-albumine humaine sur les fonctions
réactives ester de NHS
L’anti-albumine humaine est greffée sur les fonctions réactives du dextrane (ester de
NHS) par l’intermédiaire des fonctions NH2 de l’anticorps et via la formation de liaisons
amide (Erreur ! Source du renvoi introuvable., composé 4). D’une part, cette réaction est
favorisée en milieu basique mais, d’autre part, la stabilité des esters de NHS est d’autant plus
248
CHAPITRE III
faible que le pH est élevé150 de par l’existence d’une hydrolyse spontanée en acide
carboxylique (Erreur ! Source du renvoi introuvable., composé 5). Un pH intermédiaire de
7,2 a donc été utilisé pour cette étape.
R
O
NH
C
R'
O
R'-NH2
composé 4
R
C
O
N
O
O
O
H2O
hydrolyse
RCOO
-
+
HO
N
ester de NHS
composé 5
composé 2
O
Réaction III-3 : Mécanisme du couplage des esters de NHS aux fonctions amine
Le greffage de l’anti-ASH sur le support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-COOH) activé
est vérifié par analyse élémentaire (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
Silice-polyβ-CD-
Silice-(anti-SAH)
(Dext-Ad-COOH)
Analyse élémentaire
%C
2,56
4,14
%N
0,18
0,67
Tableau III-14 : Caractérisation par analyse élémentaire de la silice-polyβ
β-CD-(Dext-Ad-COOH) et de la
silice-(anti-SAH)
L’augmentation du pourcentage de carbone et d’azote observée après percolation de la
solution d’anticorps sur le support de silice-polyβ-CD-(Dext-Ad-COOH) suggère la fixation
d’anti-ASH sur la phase stationnaire. Néanmoins, la solution commerciale d’anticorps étant
constituée d’une importante proportion de protéines autres que l’anticorps spécifique antiSAH, il est tout à fait probable que d’autres types de protéines aient également été greffés sur
la phase stationnaire au cours de cette étape et il est alors impossible de déterminer la quantité
d’anticorps fixée ainsi que la capacité de liaison du support.
249
CHAPITRE III
4ème étape : Désactivation des fonctions réactives ester de NHS résiduelles
Afin d’empêcher toute réaction ultérieure avec les fonctions ester de NHS n’ayant pas
réagi au cours de l’étape de greffage de l’anticorps, une désactivation de celles-ci doit être
effectuée. Pour ce faire, un tampon PBS de pH élevé (pH = 8) a été utilisé pour favoriser
l’hydrolyse spontanée de l’ester de NHS.
III.2.2 – Préparation in situ du support d’immunoaffinité (mode
dynamique, voie 2)
Une deuxième voie pour l’élaboration du support d’immunoaffinité, pouvant être
appliquée à un support de silice-polyβ-CD neuf ou à un support régénéré, a été utilisée. Cette
nouvelle approche a consisté à modifier une phase de silice-polyβ-CD préalablement
introduite dans une colonne chromatographique. Le principe des différentes étapes nécessaires
à la modification chimique du support reste rigoureusement identique à celui décrit par la
Erreur ! Source du renvoi introuvable.. Cependant, la mise en œuvre expérimentale se
différencie par le fait que les diverses solutions de réactifs sont mises à percoler sur le support
contenu dans la colonne (de longueur 3 cm). Les conditions expérimentales relatives à cette
voie de synthèse sont détaillées dans l’annexe 15.
1ère étape : Adsorption du Dext-Ad-COOH
Une solution aqueuse de Dext-Ad-COOH dans du chlorure de sodium est mise à
percoler sur le support de silice-polyβ-CD avec un débit de 1 mL/min. La phase stationnaire
est ensuite rincée avec de l’eau à un débit de 1 mL/min afin d’éliminer le dextrane interstitiel
non adsorbé sur le support.
2ème étape : Activation des fonctions acide carboxylique du dextrane
Afin d’activer les fonctions acide carboxylique du dextrane en ester de NHS, une solution
aqueuse d’un mélange de NHS/EDC est mise à percoler sur le support de silice-polyβ-CD-
250
CHAPITRE III
(Dext-Ad-COOH) avec un débit de 1 mL/min. La colonne est ensuite rincée, avec un débit
identique, avec de l’eau.
3ème étape : Greffage de l’anticorps anti-albumine humaine sur les fonctions
réactives ester de NHS
L’anti-albumine humaine est greffée sur les fonctions ester de NHS du dextrane par
simple percolation d’une solution d’anticorps commercial en solution dans un tampon PBS à
10 mM et de pH = 7,2. Afin d’obtenir un support de capacité chromatographique correcte, un
temps de contact important entre le ligand à greffer et les fonctions réactives du support doit
être établi pour favoriser le greffage de l’anticorps. De ce fait, la percolation de la solution
commerciale en anti-ASH a été effectuée à un faible débit de l’ordre de 0,05 mL/min. Le
support est à nouveau rincé à l’eau avec un débit de 1 mL/min.
L’étape de greffage de l’anticorps a été suivie en temps réel par un détecteur UV
branché en sortie de colonne (longueur d’onde du détecteur réglée à 280 nm). Le
chromatogramme obtenu est constitué de plusieurs épaulements rendant difficile
l’interprétation du signal et donc la détermination de la quantité d’anti-ASH immobilisée. Ce
profil est sans doute la manifestation de phénomènes simultanés au sein de la colonne : (i)
l’équilibrage de la phase stationnaire lors du changement d’éluant imposé par le passage de la
solution d’anticorps (passage de l’eau au PBS), (ii) la fixation de l’anticorps sur les fonctions
ester de NHS impliquant le relargage de molécules de NHS, (iii) la sortie d’impuretés
contenues dans la solution commerciale d’anticorps et ne s’adsorbant pas sur le support.
4ème étape : Désactivation des fonctions réactives ester de NHS résiduelles
Les fonctions ester de NHS n’ayant pas réagi au cours de l’étape de greffage de
l’anticorps sont désactivées par percolation d’un tampon PBS de pH = 8 dans la colonne à un
débit de 1 mL/min.
L’utilisation de cette seconde voie présente certains intérêts comparativement au mode
statique : l’utilisation d’une voie in situ permet de partir d’un support régénéré contenu dans
une colonne sans être obligé de vider cette dernière pour élaborer une nouvelle phase
immunoadsorbante (Cf. paragraphe III.3.6 de ce chapitre) ; de plus en mode dynamique, les
251
CHAPITRE III
réactifs mis en jeu pénètrent mieux dans les pores et les rinçages sont plus faciles à réaliser et
sont plus efficaces.
III.3 – Propriétés des supports d’immunoaffinité obtenus
III.3.1 - Vérification de l’inertie des supports d’immunoaffinité
(élaborés selon les voies 1 et 2) vis à vis des protéines acides
Les propriétés de reconnaissance spécifique des supports d’immunoaffinité obtenus
vis-à-vis de l’ASH (Cf. paragraphe III.3.2 de ce chapitre) ont été étudiées au cours d’analyses
menées dans les conditions physiologiques de pH et de salinité en utilisant pour éluant un
tampon PBS de pH = 7,4 (à 10 mM en phosphate et contenant 2,7 mM de KCl et 0,137 M en
NaCl). Dans ces conditions opératoires, l’ASH qui possède un pI de 4,8 est globalement sous
forme négative. Ainsi, afin de vérifier la reconnaissance spécifique de l’ASH pour le support
modifié anti-ASH, une étape préliminaire a consisté à vérifier l’absence d’interactions non
spécifiques entre la phase immunoadsorbante et des protéines acides (chargées négativement à
pH = 7,4).
L’étude de la rétention de l’α-lactalbumine (pI = 4,2 - 4,5), de l’ovalbumine (pI = 4,7),
et de la β-lactoglobuline (pI = 5,1 - 5,3) a montré que l’ensemble de ces biomolécules est très
faiblement retenu par le support avec un facteur de rétention k’ compris entre 0,1 et 0,5 selon
la protéine étudiée. De plus, la surface des signaux obtenus est similaire à celle observée après
l’injection de ces mêmes protéines sur un support de silice-polyβ-CD. L’ensemble de ces
résultats suggère l’absence d’interactions non spécifiques entre le support d’immunoaffinité et
des protéines acides. Ce point était prévisible car il existe sans doute un phénomène de
répulsion électrostatique entre les charges négatives résiduelles (groupements COO-) du DextAd-COOH adsorbé sur le support et les protéines négatives injectées. Par ailleurs, l’inertie de
la phase immunoadsorbante vis-à-vis des protéines suggère que l’étape de désactivation des
esters de NHS par un tampon PBS de pH = 8 est efficace et permet d’éliminer la totalité de
ces fonctions. En dernier point, l’α-lactalbumine présente une rétention sur le support
d’immunoaffinité (k’=0,5) inférieure à celle obtenue, dans des conditions chromatographiques
similaires, sur le support initial de silice-polyβ-CD (k’=3,6). Ce résultat suggère un bon
écrantage de la surface par la couche de dextrane et les molécules d’anticorps.
252
CHAPITRE III
III.3.2 - Adsorption de l’albumine du sérum humain sur l’anticorps
polyclonal immobilisé selon la voie 1
Afin de contrôler les propriétés immunologiques du support élaboré, la capacité de la
phase stationnaire à fixer de façon spécifique l’antigène ASH doit être vérifiée.
L’analyse frontale est une méthode couramment utilisée pour étudier l’adsorption d’un
soluté sur un ligand immobilisé. Cette méthode consiste à faire circuler une solution de soluté
à travers la colonne jusqu’à atteindre l’équilibre d’association entre le soluté et le ligand
immobilisé. Le support est ensuite rincé afin d’éliminer le soluté interstitiel non adsorbé sur la
phase stationnaire. L’adsorption de l’albumine du sérum humain sur le support
d’immunoaffinité a été effectuée suivant cette méthode. Une solution d’albumine à 0,01
mg/mL a été utilisée et le front de percolation obtenu est reporté sur la Erreur ! Source du
renvoi introuvable.. Ce tracé a été suivi à l’aide d’un enregistreur dont la vitesse de
défilement du papier était de 1 cm/min. La percolation a été poursuivie jusqu’à la stabilisation
apparente du signal. A titre de comparaison, un front d’ovalbumine, effectué dans des
conditions d’élution similaires est également porté sur la Erreur ! Source du renvoi
introuvable..
253
CHAPITRE III
Rinçage du support
avec du PBS
Densité optique
0,012
0,01
unité d’absorbance
0,008
0,004
0,000
0
60
10
0
20
30
Temps (min)
Percolation d’une solution d’ovalbumine
dans du PBS
Rinçage du support
avec du PBS
Densité optique
0,012
0,01
S0
0,008
0,004
S1
0,000
0
0
60
60
120
180
120
180
Temps (min)
Percolation d’une solution d’ASH
dans du PBS
254
CHAPITRE III
Figure III-22 : Courbes d’analyse frontale obtenues lors du passage d’une solution d’ovalbumine et d’une
solution d’ASH à 0,01 mg/mL sur le support de silice modifié anti-ASH élaboré en mode statique (voie 1).
Conditions chromatographiques : ovalbumine et ASH à 0,01 mg/mL dans le PBS, débit de la phase
mobile : 0,5 mL/min ; rinçage au PBS, débit de la phase mobile : 1 mL/min ; longueur de la colonne : 3
cm ; détection UV à 280 nm
Contrairement au signal caractéristique de l’ovalbumine qui apparaît au voisinage du
volume mort de la colonne (V0 = 0,325 mL soit tR = 0,65 min), le front de percolation relatif à
l’albumine apparaît à un volume bien supérieur (VR = 36 mL soit tR = 72 min) et indique
l’adsorption spécifique de la protéine sur l’anticorps. Ce résultat confirme que la méthode
chimique utilisée pour fixer l’anticorps est statistiquement non dénaturante pour l’anticorps.
D’autre part, au cours du rinçage de la colonne, la chute très brusque du signal après un
volume voisin du volume mort suggère que la protéine reste en majorité immobilisée sur le
support. La quantité d’antigène immobilisée sur le support, appelée également capacité
d’adsorption de la colonne à l’équilibre (Qa), peut être déterminée à partir de la différence de
surface S0-S1. Une valeur de 0,45 mg en ASH a été déterminée pour la colonne étudiée, de
dimensions 30 mm de longueur × 4,6 mm de diamètre interne, ce qui correspond à une
capacité de 1,5 mg par gramme de support. La capacité du support en ASH est près de sept
fois supérieure à celle déterminée par Renard et coll.100,151 (dans des conditions opératoires
similaires) alors que la surface spécifique du support est soixante dix fois inférieure.
Cependant cette différence pourrait s’expliquer par la porosité choisie pour le support de base.
En effet, les auteurs ont travaillé avec des billes de silice de faible porosité (6 nm) impliquant
une adsorption de l’ASH principalement sur la surface externe des billes.
Afin de confirmer la fixation de l’ASH sur le support immunoadsorbant, une méthode
a consisté à injecter dans la colonne, supposée sous forme silice-(anti-ASH)-(ASH), une
faible quantité d’anti-ASH (20 µL d’une solution à 0,1 mg/mL) et à vérifier sa capture par le
support (Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Le signal obtenu a été comparé à celui
engendré par une injection identique sur le support initial de silice-(anti-ASH), (Erreur !
255
CHAPITRE III
ASH
anti-ASH
injection d' anti-ASH
Si
Si
Figure III-23 : Vérification de l’immobilisation de l’ASH sur le support d’immunoaffinité par capture de
l’anti-ASH
Injection d’anti-ASH
Vr (mL)
k’
Surface du pic
(unité d’absorbance ×
mL)
Silice-(anti-ASH)
0,5
0,54
167
Silice-(anti-ASH)-
0,5
0,54
97
(ASH)
Tableau III-15 : Comparaison des signaux relatifs à des injections d’anti-ASH sur le support
immunoadsorbant (i) sous forme silice-(anti-ASH) et (ii) sous forme silice-(anti-ASH)-(ASH) (forme
obtenue après percolation de ASH). Conditions chromatographiques : anti-ASH à 0,1 mg/mL dans le PBS,
débit de la phase mobile : 1 mL/min ; détection UV à 280 nm
Le signal obtenu sur le support de silice-(anti-ASH)-ASH étant près de deux fois
moins intense que le signal test effectué sur le support de silice-(anti-ASH) indique une
capture de l’anticorps dans la colonne. Le pic résiduel observé au voisinage du volume mort
correspond sans doute aux diverses protéines (près de deux fois plus concentrées que
l’anticorps spécifique lui même) contenues dans la solution commerciale d’anticorps et non
retenues par le support.
III.3.3 - Régénération du support au niveau anti-ASH/ASH (support
issu de la voie 1)
Renard et coll.151 ont montré qu’après immobilisation spécifique de l’albumine sur un
support d’immunoaffinité, un rinçage d’environ une heure par le tampon d’analyse (PBS)
256
CHAPITRE III
permet de désorber environ 25% de la quantité fixée et que l’autre partie de l’ASH est
irréversiblement adsorbée sur le support. Seul un changement d’éluant peut provoquer un
relargage total de l’albumine ayant interagi avec les anticorps et conduire à la régénération
complète du support. La régénération du système étudié dans ce travail a donc été évaluée en
utilisant comme éluant une solution de tampon glycine à 0,1M et de pH = 2,1 (rinçage
d’environ une heure).
Afin de vérifier si la régénération du support a permis un relargage total de l’albumine,
l’anticorps anti-ASH a été injecté en faible quantité (20 µL d’une solution à 0,1 mg/mL) sur le
support régénéré supposé sous forme silice-(anti-ASH). En effet, s’il reste de l’albumine sur
le support, l’anticorps injecté devrait être capturé par le support. Il a été observé que
l’anticorps est ressorti de la colonne avec un volume de rétention égal à celui obtenu après
une injection identique sur le support initial de silice-(anti-ASH) (Vr = 0,5 mL, Cf. Erreur !
Source du renvoi introuvable.). D’autre part, les aires de ces deux signaux sont également
identiques. Ces résultats indiquent l’absence d’albumine résiduelle sur le support et suggèrent
un relargage complet de la protéine.
Afin d’examiner si les conditions de rinçage ont pu affecter l’activité biologique de
l’anticorps immobilisé. Une nouvelle percolation d’albumine dans des conditions d’élution
similaires à la précédente a été effectuée sur le support supposé régénéré. Le signal obtenu est
comparable à celui de la première immobilisation et la mesure des surfaces S0 et S1 conduit à
une capacité d’adsorption de la colonne à l’équilibre de 0,44 mg. La reproductibilité de
l’analyse frontale suggère une complète régénération du support et également la non
dénaturation des sites de reconnaissance antigénique de l’anti-ASH immobilisée.
III.3.4 - Détermination de la capacité d’adsorption maximale en ASH
du support d’immunoaffinité (support issu de la voie 1)
Au cours d’un processus d’analyse frontale, l’équilibre d’association entre l’antigène
et l’anticorps est gouverné par la loi d’action de masse. Ainsi, la quantité de soluté adsorbée
sur la phase stationnaire dépend de la concentration des espèces chimiques en présence
(antigène et anticorps). L’étude de la variation de la capacité d’adsorption à l’équilibre du
support en fonction de la concentration en soluté de la phase éluante permet d’établir
257
CHAPITRE III
l’isotherme d’adsorption du support. La capacité d’adsorption maximale à l’équilibre de la
phase stationnaire est alors donnée par la valeur de Qa au plateau de l’isotherme.
Dans le cas présent et après une nouvelle régénération du support, une percolation
d’une solution d’albumine de concentration plus élevée (0,05 mg/mL) a été effectuée en
gardant les autres conditions chromatographiques identiques (Erreur ! Source du renvoi
introuvable.). Le front d’albumine apparaît plus tôt lorsque la concentration en soluté de
l’éluant est plus élevée, ce phénomène est expliqué par la loi d’action de masse régissant
l’équilibre antigène-anticorps. D’autre part, une capacité d’adsorption du support à l’équilibre
en albumine de l’ordre de 0,41 mg a été déterminée. Cette valeur étant, au degré d’incertitude
près, égale à la capacité déterminée avec une solution de protéine moins concentrée, indique
que les percolations effectuées correspondent à des points du plateau de l’isotherme
d’adsorption. De ce fait, la capacité d’adsorption maximale à l’équilibre en ASH du support
d’immunoaffinité est d’environ 0,45 mg soit 1,5 mg par gramme de support.
Densité optique
Rinçage du support
avec du PBS
0,05
S0
S1
0
20
40
60
80
Temps (min)
dans du PBS
Figure III-24 : Courbe d’analyse frontale obtenue lors du passage d’une solution d’ASH à 0,05 mg/mL sur
le support de silice modifié anti-ASH élaboré en mode statique (voie 1). Conditions chromatographiques :
258
CHAPITRE III
ASH à 0,05 mg/mL dans le PBS, débit de la phase mobile : 0,5 mL/min ; rinçage au PBS, débit de la phase
mobile : 1 mL/min ; longueur de la colonne : 3 cm ; détection UV à 280 nm
III.3.5 - Régénération du support au niveau du polymère de βcyclodextrine (support issu de la voie 1)
Malgré l’emploi de conditions non dénaturantes, l’utilisation fréquente d’une phase
immunoadsorbante peut conduire à la dénaturation des anticorps immobilisés. Il serait alors
intéressant de pouvoir éliminer la couche d’anticorps altérée et de la remplacer rapidement,
sans être obligé d’élaborer une nouvelle phase depuis la première étape opératoire.
La régénération du support au niveau de la couche du polymère de β-cyclodextrine a
donc été testée, l’objectif étant de dissocier les complexes d’inclusion formés entre les
groupements adamantyle portés par le dextrane et les cavités de cyclodextrine. Les tentatives
de régénération de colonnes sous forme silice-(anti-ASH)-ASH ont été effectuées en utilisant
comme éluant une solution de SDS à 1% en masse dans le tampon glycine à 0,1M et de pH =
2,1 (rinçage d’environ 40 min).
La qualité de la régénération du support a été vérifiée par injection d’albumine (20 µL
d’une solution à 1 mg/mL). En effet, s’il reste de l’anti-ASH dans la colonne, l’albumine
injectée devrait être capturée par l’anticorps. On constate que le pic relatif à cette protéine
apparaît au volume mort de la colonne et possède une surface de 89 unité d’absorbance × mL.
Cette surface est similaire à celle obtenue pour une injection de la même solution d’albumine
sur un support de référence de silice-polyβ-CD non traité (surface de 95 unité d’absorbance ×
mL). Ces résultats indiquent que l’albumine ne présente pas d’affinité pour la phase
stationnaire et suggère la complète régénération du support au niveau de la couche du
polymère de β-cyclodextrine.
III.3.6 - Adsorption de l’albumine du sérum humain sur l’anticorps
polyclonal immobilisé, selon la voie 2, par une méthode d’analyse
frontale
259
CHAPITRE III
La phase précédente ayant été régénérée efficacement au niveau du polymère de βcyclodextrine, a été utilisée comme support de base pour la préparation d’une nouvelle phase
immunoadsorbante suivant la voie in situ (voie 2, Cf. paragraphe III.2.2 de ce chapitre). Il est
important de noter que cette seconde voie offre la possibilité d’élaborer un support
d’immunoaffinité à partir d’une phase régénérée sans être contraint de vider le support de la
colonne.
Afin d’évaluer cette seconde méthode d’immobilisation de l’anticorps, une analyse
frontale de l’albumine humaine a été effectuée sur le support. Le front de percolation obtenu
pour une solution d’albumine à 0,01 mg/mL (conditions chromatographiques identiques à
celles de l’étude de la première voie de fixation) est reporté sur la Erreur ! Source du renvoi
introuvable..
Rinçage du support
avec du PBS
Densité optique
0,01
S0
S1
0
60
120
180
Temps (min)
dans du PBS
Figure III-25 : Courbe d’analyse frontale obtenue lors du passage d’une solution d’ASH à 0,01 mg/mL sur
le support
de silice
modifié anti-ASH élaboré
en mode
dynamique
(voie
2). Conditions
chromatographiques : ASH à 0,01 mg/mL dans le PBS, débit de la pompe 0,5mL/min ; rinçage au PBS,
débit de la pompe 1mL/min ; longueur de la colonne : 3 cm ; détection UV à 280 nm
260
CHAPITRE III
Le front de percolation relatif à l’albumine apparaît à un volume de rétention supérieur
au volume mort de la colonne ce qui indique qu’il y a eu adsorption de l’albumine sur
l’anticorps. Cette fixation est également confirmée par injection de l’anti-ASH (20 µL d’une
solution à 0,1 mg/mL) sur le support de silice-(anti-ASH)-ASH (Cf. paragraphe III.3.2 de ce
chapitre) puisque le signal obtenu est moins intense (diminution de 23 %) que le signal test
effectué sur le support de silice-(anti-ASH). La faisabilité de la seconde méthode
d’immobilisation de l’anticorps, par percolation de solutions réactives sur la colonne, est ainsi
démontrée.
La quantité de protéine immobilisée sur le support (Qa) par cette seconde voie est de
l’ordre de 0,29 mg, ce qui est un peu plus faible que la quantité fixée par la voie statique (0,45
mg). Cependant, le profil de la courbe d’analyse frontale reportée sur la Erreur ! Source du
renvoi introuvable. semble indiquer que la saturation de la colonne n’est pas parfaitement
atteinte. Par ailleurs, les valeurs de Qa obtenues par les deux voies de fixation sont
difficilement comparables car les conditions d’obtention des supports sont différentes. En
effet, les volumes importants requis par la méthode in situ ont conduit à utiliser une solution
de dextrane plus faiblement concentrée (1 mg/mL) comparativement à celle mise en jeu au
cours de la première voie (30 mg/mL). D’autre part, la solution commerciale d’anti-ASH
utilisée pour la seconde voie est moins concentrée en anticorps spécifique (5,5 mg/mL d’antiASH pour 9,5 mg/mL de protéines totales) comparativement à la solution mise en jeu dans la
première voie (4,9 mg/mL d’anti-ASH pour 14 mg/mL de protéines totales). Enfin, le support
de silice-polyβ-CD initial utilisé pour la préparation du support d’immunoaffinité selon la
voie in situ n’est pas un support neuf mais un support régénéré. L’ensemble de ces facteurs
pourrait donc avoir conduit à une densité de greffage de l’ASH sur le support différente de
celle obtenue par la voie statique.
La méthode d’immobilisation en colonne est plus adaptée à la régénération de la
colonne lorsque la couche d’anticorps est altérée. De plus, cette méthode permet des rinçages
plus rapides et plus efficaces comparativement à la voie statique. Par ailleurs, les conditions
opératoires pourraient être redéfinies afin d’augmenter la densité de greffage : en effet, dans
un premier temps, une solution de dextrane plus concentrée pourrait être utilisée puis un plus
grand volume de solution d’anticorps ainsi qu’un débit de la phase éluante plus faible
pourraient être mis en oeuvre.
261
CHAPITRE III
IV – Conclusion
Une méthode faisant appel à la formation de complexes d’inclusion entre des
molécules de β-cyclodextrine et des dextranes modifiés par des groupements adamantyle a été
évaluée pour l’élaboration de supports chromatographiques. L’introduction sur le dextrane de
différents groupements a permis de préparer, à partir d’un même support de base, des phases
chromatographiques de fonctionnalités variables (ioniques et hydrophobes) et une phase
immunoadsorbante.
Chacun de ces supports a été testé pour l’analyse de protéines. L’étude de la rétention
de protéines sur les supports d’échange d’anions et de cations a permis de déterminer le
nombre de charges apparentes des biomolécules mis en jeu lors de leurs interactions avec le
support. De même, l’étude de la rétention de protéines sur le support d’interaction hydrophobe
a permis de déterminer pour chacune d’entre elles un paramètre d’hydrophobie caractéristique
de la surface d’échange hydrophobe entre les protéines et le support. Ces résultats sont en
assez bon accord avec les données de la littérature. Par ailleurs, le support d’échange de
cations et le support d’interaction hydrophobe ont pu être utilisés pour séparer des mélanges
de protéines. Enfin, la dernière phase stationnaire élaborée, de type immunoadsorbante, a
permis la capture spécifique d’un antigène et pourrait donc être utilisée comme support
préparatif pour la purification d’antigènes. D’autre part, ces supports étant basés sur un
complexe d’inclusion réversible, chacun d’entre eux peut être régénéré si nécessaire au niveau
de la couche initiale de cyclodextrine. L’ensemble de ces résultats démontre que le couple
adamantane / β-cyclodextrine peut être utilisé pour élaborer des supports chromatographiques.
La préparation des colonnes est alors simple, rapide et s’effectue dans des conditions douces.
Des études ultérieures pourraient être menées pour augmenter l’efficacité des
colonnes, en utilisant par exemple des supports de porosités plus élevées pour faciliter le
transfert des solutés à l’intérieur des pores, ou en changeant le procédé d’immobilisation de la
cyclodextrine sur la silice afin de limiter le caractère hydrophobe du support de base.
262
CHAPITRE III
263
CHAPITRE III
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES DU CHAPITRE III
264
CHAPITRE III
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
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CHAPITRE III
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(38)
(39)
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CHAPITRE III
(61)
(62)
(63)
(64)
(65)
(66)
(67)
(68)
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(89)
(90)
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(97)
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269
270
271
CHAPITRE IV
CHAPITRE IV :
FONCTIONNALISATION D’UNE SURFACE D’OR
ELABORATION D’UN IMMUNOCAPTEUR
272
CHAPITRE IV
Les immunodiagnostics jouent un rôle fondamental dans le domaine de la santé
publique pour le dépistage d’infections virales, bactériennes, fongiques ou en immunopathologie (auto-immunité et allergie) mais également dans le domaine de l’agro-alimentaire
pour le contrôle qualité. La majorité de ces tests est basée sur le principe de l’ELISA (Enzyme
Linked ImmunoSorbent Assay), technique introduite en 1972 et devenue très populaire dans
les années 80 et 90. Les tests immuno-enzymatiques basés sur cette technique renseignent sur
la spécificité et la quantité d’anticorps produits contre des pathogènes ou des molécules
d’intérêt économique. La technique de l’ELISA présente l’avantage de pouvoir analyser
jusqu’à 96 échantillons simultanément. Néanmoins, ce procédé nécessite l’utilisation
d’anticorps secondaires conjugués à une enzyme réactive afin de révéler la réaction antigèneanticorps. Ceci tend à augmenter le coût du procédé et fait de l’ELISA une méthode de
détection indirecte qui ne permet pas un suivi en temps réel des interactions. De plus, la durée
d’un test est relativement longue (de 3 à 5 heures) et cette technique requiert de grandes
quantités de substrat (50 à 100 µL de fluide biologique, sang, plasma…) pour déterminer une
seule spécificité donnée (un virus, une source d’antigène ou d’allergène,…).
L’objectif à terme de la présente étude est de créer une puce à allergènes capable de
détecter simultanément par une méthode directe (sans marqueurs) une centaine d’anticorps
anti-allergènes, ce qui permettrait un diagnostic de plus de 95 % des allergies actuellement
connues. Pour mener à bien ce projet, il sera nécessaire de déposer sur la surface de multiples
plots microscopiques correspondant à une centaine d’allergènes purifiés qui pourront ensuite,
après contact avec le sérum d’un malade, être reconnus spécifiquement par les anticorps
correspondants présents dans le sérum. L’utilisation d’une méthode optique directe telle que
la résonance des plasmons de surface (SPR) en imagerie devrait permettre d’acquérir, en
parallèle et en temps réel, sur chaque plot, la réponse cinétique des interactions biologiques
mesurées et de doser chacun des anticorps révélés.
L’immobilisation des allergènes sur la puce à protéine est une étape clé dans la
réalisation de ce projet. En effet, la fixation des antigènes sur la surface solide doit respecter
la conformation des allergènes afin de ne pas modifier les propriétés de reconnaissance par les
anticorps correspondants. De plus, la méthode d’immobilisation doit être simple à mettre en
œuvre et compatible avec un système automatique de dépôt de micro-plots. Enfin, la fixation
des allergènes doit être stable dans les conditions d’utilisation de la puce.
273
CHAPITRE IV
L’étude de faisabilité qui sera présentée par la suite s’inscrit dans le cadre d’un
Programme CNRS interdisciplinaire (Protéomique et génie des protéines). Elle a été menée en
collaboration avec le Laboratoire Charles Fabry de Institut d’Optique à Orsay et le
Laboratoire Environnement et Chimie Analytique de l’Ecole Supérieure de Physique et
Chimie Industrielles de la ville de Paris et constitue un premier pas vers la réalisation des
puces à allergènes. Dans ce travail, nous avons choisi d’immobiliser un allergène donné, la βlactoglobuline, sur une surface solide. Les deux procédés utilisés consistent à fixer la protéine
par formation de complexes d’inclusion avec une surface recouverte de molécules de
cyclodextrine. L’immobilisation de la β-lactoglobuline a été effectuée sur l’ensemble de la
surface et a été suivie en temps réel par une méthode optique d’imagerie par RPS afin
d’étudier l’homogénéité de la couche de protéine. Les biocapteurs obtenus après
immobilisation de l’allergène ont été testés quant à leur capacité à fixer spécifiquement un
anticorps anti-β-lactoglobuline contenu dans du sérum de lapin.
Un biocapteur est un dispositif analytique capable de détecter spécifiquement un
analyte donné dans un mélange complexe. Les principaux groupes de biocapteurs sont les
capteurs électrochimiques1, les capteurs optiques2 (cas des capteurs basés sur la RPS), les
capteurs microgravimétriques3 et les capteurs thermométriques4. Quel que soit le type de
biocapteur, celui-ci est composé de trois parties5 : (i) une surface fonctionnalisée par une
biomolécule (enzymes, anticorps, ADN…), appelée biorécepteur, capable de reconnaître
spécifiquement une molécule cible, (ii) un transducteur qui convertit le signal physicochimique engendré par l’interaction biomoléculaire en un signal mesurable et (iii) un système
d’analyse et de traitement des données. Lorsque la surface d’analyse élaborée met en jeu un
anticorps, le système est alors appelé immunocapteur.
I – Introduction à la résonance des plasmons de surface
(RPS)
La RPS est une méthode de détection directe (sans marqueurs) qui permet de suivre en
temps réel des interactions aux interfaces entre un ligand immobilisé sur une surface
métallique et un soluté en solution. En effet, cette technique est sensible aux changements
274
CHAPITRE IV
d’indice de réfraction résultant de modifications interfaciales et peut conduire à la
détermination de l’épaisseur optique de films minces adsorbés sur la surface6-8.
I.1 – Propriétés des ondes plasmons de surface
Le plasmon de surface est une onde électromagnétique qui se propage à l’interface
entre deux milieux de constantes diélectriques de signes opposés, notamment un métal et un
diélectrique. Cette onde électromagnétique possède une polarisation transverse magnétique
(TM) et se propage parallèlement à l’interface métal/milieu diélectrique. D’autre part, elle
présente un caractère d’onde évanescente car son amplitude décroît exponentiellement avec la
distance à l’interface. De par cette propriété d’onde évanescente, la fixation de molécules sur
l’interface va modifier l’information contenue dans l’onde tant au niveau de sa phase que de
son amplitude. Ainsi, le suivi de l’évolution de l’onde évanescente en fonction du temps
permettrait de suivre en temps réel des interactions se produisant à l’interface
métal/diélectrique.
Le caractère évanescent de l’onde plasmon de surface implique que celle-ci se propage
sur une distance limitée suivant l’axe des X et l’axe des Z (Figure IV-1). Elle est alors
caractérisée par sa longueur LX de propagation sur l’interface et par ses profondeurs LZm et
LZd de pénétration de part et d’autre de l’interface. La longueur de propagation ainsi que les
profondeurs de pénétration sont définies comme la distance à laquelle l’intensité de l’onde ne
vaut plus que 1/e de l’intensité maximale. LX représente la dimension minimale nécessaire
pour observer le phénomène de RPS, il s’agit donc de la résolution spatiale de la méthode.
LZm et LZd représentent les distances maximales pour lesquelles le champ évanescent est
sensible à une variation survenant respectivement dans les milieux métalliques et
diélectriques. Au delà de ces valeurs, l’onde devient insensible aux perturbations du milieu.
275
CHAPITRE IV
Lx
Z
LZd
Y
⊗
kSP
LZm
Diélectrique
Couche métallique
X
Figure IV-1 : Profil de l’amplitude de l’onde plasmon se propageant sur l’interface métal/diélectrique.
Les grandeurs caractéristiques LX, LZm et LZd de l’onde plasmon peuvent être calculées
à partir de l’expression de la composante longitudinale (k SP ) X du vecteur d’onde de l’onde
plasmon de surface9,10, celle-ci étant définie par l’égalité suivante :
(k SP )X
 ε . ε
= Re  m d
 ε m + ε d
 ω
.
 c
Equation IV-1
avec ω la fréquence angulaire de l’onde, c la célérité de la lumière dans le vide, ε m (nombre
complexe) et ε d les permittivités respectives du métal et du diélectrique. Maillard10 a montré
que la longueur de pénétration LZd dans le diélectrique (eau) était égale à 102,1 nm pour une
longueur d’onde λ de 660 nm. Ce résultat signifie que la technique utilisée permettra de
détecter tout changement se produisant dans le milieu diélectrique à moins de 100 nm de
l’interface.
I.2 – Excitation des plasmons de surface à l’aide d’un couplage par prisme
Les plasmons de surface peuvent être excités par l’intermédiaire d’un faisceau
lumineux dirigé sur l’interface métal/diélectrique si deux conditions sont respectées (i) l’onde
excitatrice doit être de polarisation TM et (ii) la vitesse de phase de l'onde excitatrice doit être
égale à celle de l'onde de surface, autrement dit, la composante longitudinale ( k X ) du vecteur
276
CHAPITRE IV
d’onde incident doit être égale à la composante longitudinale (k SP ) X du vecteur d’onde de
l’onde de surface.
La composante longitudinale du vecteur d’onde incident ( k X ) est définie par la
relation suivante :
kX =
ω
c
. sin( ϕ )
Equation IV-2
avec ω la fréquence angulaire de l’onde, c la célérité de la lumière dans le vide et ϕ l’angle
d’incidence du faisceau lumineux sur l’interface métal/diélectrique.
Lorsqu’un faisceau lumineux incident est dirigé directement sur une interface
métal/diélectrique, la valeur k X est inférieure à la valeur de (k SP ) X et les plasmons de surface
ne peuvent être excités. Afin de parvenir à la relation d’accord de phase k X = (k SP ) X , il est
alors nécessaire d’augmenter la valeur de k X . Ceci peut être réalisé en faisant passer le
faisceau incident à travers un prisme d’indice de réfraction np supérieur à celui du milieu
diélectrique.
Le couplage d’une onde lumineuse aux ondes électromagnétiques de surface par
l’intermédiaire d’un prisme peut être effectué suivant la configuration d’Otto11 ou de
Kretschmann12. La configuration de Kretschmann est plus simple à mette en œuvre et consiste
à coupler directement le prisme au métal (Figure IV-2). Les études de RPS présentées par la
suite ont été effectuées suivant ce procédé.
277
CHAPITRE IV
kRPS
Diélectrique (εεd)
Couche métallique (εεm)
kX
ϕ
θ
Réflectivité = R =
Prisme
(np)
I
I0
Pour un prisme d’angle au sommet 30° :
θ = 30° + Arc sin( n p . sin( 60° − ϕ ))
Faisceaux incidents
(intensité lumineuse I0)
Faisceaux réfléchis
(intensité lumineuse I)
Polarisation TM
Figure IV-2 : Excitation des plasmons de surface au travers d’un prisme en verre d’indice np recouvert
d’une couche mince métallique de permittivité εm (configuration de Kretschmann).
Dans la configuration de Kretschmann, un faisceau lumineux de polarisation TM est
dirigé, au travers du prisme, vers l’interface métal/diélectrique avec un angle d’incidence
interne ϕ tel que la réflexion du faisceau soit totale. La composante longitudinale initiale du
faisceau lumineux est amplifiée par son parcours dans le prisme et sa nouvelle valeur est
donnée par :
ω
k X = n p . . sin( ϕ )
c
Equation IV-3
avec np l’indice de réfraction du prisme.
Pour un angle d’incidence donné, noté ϕ0, la condition d’accord de phase k X =
(k SP ) X
est vérifiée et peut, à partir des Equations Equation IV-1 et Equation IV-3, être
traduite par l’égalité suivante :
 ε . ε
n p . sin( ϕ0 ) = Re  m d
 ε m + ε d



Equation IV-4
278
CHAPITRE IV
Lorsque la condition d’accord de phase est respectée, l’énergie électromagnétique du faisceau
incident est transmise aux plasmons de surface. On parle de résonance des plasmons de
surface. Ce phénomène s’accompagne d’une extinction du faisceau réfléchi (I=0) ce qui
entraîne l’annulation de la réflectivité ( R =
I
= 0 ). Théoriquement, la résonance des
I0
plasmons de surface peut être mise en évidence par l’établissement de la courbe de réflectivité
(R) en fonction de l’angle d’incidence (ϕ). Cette courbe présente alors un pic d’absorption
pour la valeur de ϕ = ϕ0. Pour des raisons pratiques, l’angle mesuré expérimentalement est
l’angle de rasance externe θ. Les courbes de réflectivité tracées expérimentalement reportent
donc la réflectivité (R) en fonction de l’angle de rasance externe (θ) et ces courbes présentent
un pic d’absorption pour la valeur de θ0 correspondant à l’angle ϕ0.
I.3 – Mesure de l’épaisseur d’une couche mince par RPS
Les courbes de réflectivité (Figure IV-3) présentent un minimum pour la valeur de
l’angle de rasance externe θ0 correspondant à l’angle ϕ0 auquel se produit le phénomène de
résonance des plasmons de surface. D’après l’Equation IV-4, la valeur de ϕ0 est fonction des
permittivités du métal ( ε m ) et du diélectrique ( ε d ) ainsi que de l’indice du prisme (np).
Autrement dit, ϕ0 dépend des indices de réfraction de la couche métallique (nm), du
diélectrique (nd) et du prisme (np).
L’immobilisation de molécules sur la surface métallique entraîne une augmentation de
l’indice de réfraction nd du diélectrique13 et par suite un déplacement de l’angle de plasmons
de surface ϕ0 vers les valeurs plus élevées (Cf. Equation IV-4). D’après l’équation donnée sur
la Figure IV-2, la valeur de θ0 tend alors à diminuer (Figure IV-3a).
279
CHAPITRE IV
Courbe de réflectivité
Cinétique de fixation
(3)
Réflectivité
Réflectivité
Après immobilisation
(instant t+∆
∆t)
0.5
0.22
Avant immobilisation
(instant t)
0.4
0.3
0.20
0.18
0.16
0.2
∆θ0
0.1
∆R
0.12
6
8
10
12
14
Incidence (°)
16
18
∆R
(2)
0.14
20
(1)
0
2
4
Angle de rasance externe θ (°)
6
8
10
12
14
Temps (min)
Avant immobilisation
(instant t)
(a)
Après immobilisation
(instant t+∆
∆t)
(b)
Figure IV-3 : (a) Courbes de réflectivité en fonction de l’angle de rasance externe θ, avant (croix) et après
(rond) immobilisation de molécules sur une surface d’or et (b) cinétique de fixation au cours du temps
obtenue à incidence fixe, (1) : la surface est équilibrée dans une solution donnée (eau, tampon), (2) la
solution de réactifs est mise à circuler sur la surface, (3) : la surface est rincée avec la solution initiale
utilisée dans la première étape (eau, tampon)
D’après la Figure IV-3a, il apparaît que si l’on se place à un angle θ fixe dans le
domaine linéaire de la courbe de réflectivité (partie droite de la courbe), l’immobilisation de
molécules à la surface entraîne une augmentation de la réflectivité. Ainsi, le suivi de la
réflectivité en fonction du temps permet d’observer en temps réel les modifications de l’état
de surface. L’établissement d’une telle courbe, appelée cinétique de fixation, se décompose en
trois étapes (Figure IV-3b). La surface est tout d’abord équilibrée dans une solution donnée
(eau, tampon) (1ère étape), puis la solution de réactifs est mise à circuler sur la surface (2ème
étape), ce qui entraîne une augmentation de la réflectivité. Cette variation de réflectivité est
due d’une part à la fixation du réactif sur la surface et d’autre part à l’indice de réfraction de la
solution introduite dans la cuve. La dernière étape consiste à rincer la surface avec la solution
initiale utilisée dans la première étape (eau, tampon) (3ème étape) afin d’éliminer la variation
de réflectivité liée à l’indice de réfraction de la solution de réactifs présente dans la cuve.
Cette dernière étape se traduit par une diminution de la réflectivité. La variation de réflectivité
∆R obtenue dans ces conditions est uniquement liée à la fixation du réactif sur la surface.
Par ailleurs, des études ont montré que dans le cas de films minces homogènes, le taux
de recouvrement massique Γ massique de la surface peut être déterminé à partir de l’égalité
suivante14,15 :
280
CHAPITRE IV
Γ massique =
( n f − nd ).ep
∂n
∂C
Equation IV-5
n f et ep représentent respectivement l’indice de réfraction et l’épaisseur de la couche
immobilisée sur la surface, nd l’indice de réfraction du milieu diélectrique et
∂n
la variation
∂C
d’indice des molécules fixées en fonction de leur concentration.
A l’aide de l’Equation IV-5, Bassil et coll.{BASSIL #58} ont montré que pour les
protéines, en solution dans du PBS ( nd =1,334) et d’indice de réfraction n f =1,45 et de valeur
∂n
= 0,18 mL/g, une variation de réflectivité de 0,1 % (Cf. Paragraphe I.4 de ce chapitre)
∂C
correspond à une concentration surfacique Γ massique de 0,02 ng/mm2. Dans l’ensemble des
travaux présentés par la suite, les calculs du taux de recouvrement massique en protéine seront
effectués à partir de ce résultat. Le taux de recouvrement molaire Γ molaire en biomolécule
pourra ensuite être déterminé à partir de l’égalité Γ molaire =
Γ massique
M
, avec M la masse
moléculaire de l’espèce considérée. Les valeurs de concentrations molaires reportées dans la
littérature sont généralement de l’ordre de la picomole à la femtomole par millimètre carré17.
I.4 - Imagerie par résonance des plasmons de surface (SPR) et méthodologie
Dans le dispositif utilisé, une lame de verre, recouverte sur une de ses faces par une
fine couche d’or (épaisseur ≈ 45 nm), est accolée par capillarité sur un prisme de verre (np
= 1,777) à l’aide d’une huile de couplage de même indice, afin de se trouver dans la
configuration de Kretschmann (Figure IV-4). Une cellule à circulation (ou cuve) est ensuite
accolée à la surface métallique. Les solutions à tester sont ensuite mises à circuler sur la
surface par l’intermédiaire d’une pompe péristaltique. La cuve utilisée pour les études de RPS
(Cf. Annexe 16) possède un volume de 15 µL.
281
CHAPITRE IV
Cuve
Couche d’or
Lame de verre
ϕ
θ
Prisme de couplage
Faisceaux incidents
Figure IV-4 : Couplage prisme/lame de verre recouverte d’or/cuve mis en jeu lors des analyses par RPS
Lorsqu’une interaction moléculaire se produit à la surface de l’or, celle-ci engendre
une perturbation locale de l’indice du milieu diélectrique ce qui conduit à une modification
des conditions de la résonance. L’utilisation de l’imagerie RPS permet de suivre en parallèle
les perturbations du milieu diélectrique en différents points de la surface. Pour ce faire, la
variation de la réflectivité, due au déplacement du pic d’absorption de la RPS, est suivie sur
les différents points de la surface, l’angle d’incidence et la longueur d’onde étant par ailleurs
maintenus constants. Le paramètre mesuré est donc la variation de réflectivité ∆R. Les valeurs
de la réflectivité R variant entre 0 et 1, une variation de réflectivité ∆R de 0,01 par exemple
est considérée comme une variation de 1 %. Les valeurs de ∆R reportées dans la suite de
l’exposé seront toutes exprimées en % et leurs mesures seront toujours effectuées dans un
solvant de référence.
Le montage optique utilisé pour l’imagerie est donné sur la Figure IV-5.
282
CHAPITRE IV
Entrée, Sortie des solutions
Cuve
Couche d’or
Lame de verre
Prisme
Système afocal conjuguant
la surface métallique
avec la caméra CCD
LED
λ=660 nm
Objectifs
de microscope
Matrice CCD
de la caméra
Polariseur
Miroir
rotatif
Figure IV-5 : Biocapteur basé sur l’imagerie SPR : schéma du montage optique. Les lignes en pointillés
représentent l’origine de l’image recueillie par la caméra CCD
Une diode électroluminescente (LED) de longueur d’onde centrée à λ = 660 nm
(largueur spectrale ∆λ = 20 nm) éclaire la surface d’or fonctionnalisée en contact avec la
cellule d’interaction. Le faisceau incident est de polarisation TM et l’angle d’incidence du
faisceau est contrôlé par un système de miroir rotatif. La lumière réfléchie à la base du prisme
est ensuite dirigée vers une caméra CCD à l’aide d’un système optique, ce qui permet
d’imager la surface métallique fonctionnalisée sur la caméra. Le signal électronique est alors
transmis à l’ordinateur puis analysé par un programme LabVIEW développé au laboratoire
Charles Fabry de l’Institut d’Optique à Orsay.
La position et la dimension des différentes zones étudiées sur la surface d’or, appelées
« plots », sont définies manuellement à l’aide du logiciel LabVIEW. Ce programme enregistre
283
CHAPITRE IV
pour les différents plots mémorisés chacune des images prises par la caméra CCD au cours
d’une analyse et calcule en temps réel, la variation du signal observé. Dans le cas où une
réaction se produit au niveau d’un plot, l’indice du milieu diélectrique et l’angle auquel se
produit la résonance des plasmons de surface sont modifiés. Ainsi, l’intensité lumineuse
réfléchie par ce plot varie et cette variation est enregistrée par l’ordinateur.
Dans la suite de l’étude, l’immobilisation des réactifs sur la lame d’or sera étudiée sur
l’ensemble de la surface en suivant la cinétique de fixation sur une centaine de plots virtuels,
de forme circulaire et de diamètre 250 µm, sélectionnés sur une zone de dimensions 5
x 5 mm2. Chaque plot sera affecté d’un numéro suivant l’ordre défini sur la Figure IV-6.
Plots virtuels
Attribution d’un
numéro de plot
Sens du flux
10
…
…
…
…
…
…
…
…
100
9
…
…
…
…
…
…
…
…
99
8
…
…
…
…
…
…
…
…
98
7
…
…
…
…
…
…
…
…
97
6
…
…
…
…
…
…
…
…
…
5
15
…
…
…
…
…
…
…
…
4
14
…
…
…
…
…
…
…
…
3
13
…
…
…
…
…
…
…
…
2
12
…
…
…
…
…
…
…
…
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
Cuve
Figure IV-6 : Sélection de 100 plots virtuels (de diamètre 250 µm sur une surface de dimensions 5 mm × 5
mm) dispersés sur l’ensemble de la surface d’interaction
II – Méthodes d’immobilisation des protéines sur une
surface d’or : état de l’art
L’élaboration d’un biocapteur implique l’immobilisation préalable des protéines
d’intérêt sur une surface solide. Dans la suite de cet exposé, les modes les plus couramment
utilisés pour la fixation de biomolécules sur une surface d’or seront présentés.
284
CHAPITRE IV
II.1 – Immobilisation des protéines par adsorption passive
Le procédé le plus simple d’immobilisation des protéines sur une surface d’or consiste
en leur adsorption passive (ou physisorption) sur la surface métallique. Ce procédé ne fait
intervenir aucune chimie de surface puisqu’il consiste simplement à mettre en contact une
solution de la protéine d’intérêt avec la surface d’or afin d’engendrer la fixation de la
biomolécule. Les processus d’interactions entraînant l’adsorption des protéines ne sont pas
très bien définis et peuvent varier en fonction de la nature des protéines mises en jeu.
Néanmoins, les interactions de type hydrophobe sont sans doute en majorité responsables de
l’immobilisation des biomolécules18. L’adsorption passive de protéines sur l’or conduit à un
assez bon recouvrement de la surface métallique avec une structure proche de la
monocouche18-21. Par ailleurs, la physisorption des protéines est un processus assez rapide
puisque cinq minutes de contact entre la protéine et le métal peuvent conduire à un
recouvrement d’environ 75 % de la surface19.
Du fait de sa simplicité de mise en oeuvre, de sa rapidité et de son faible coût,
l’adsorption passive a été la première méthode d’immobilisation utilisée pour démontrer
l’utilité de la RPS pour suivre en temps réel des réactions immunologiques19,20. Néanmoins ce
procédé est peu employé aujourd’hui car il présente plusieurs désavantages. En effet,
l’adsorption passive conduit à des fixations non reproductibles très dépendantes de l’état de
surface du métal et les couches moléculaires immobilisées sont instables si bien que des
protéines présentes dans les solutions analysées peuvent remplacer des protéines d’intérêt
initialement fixées sur l’or. De plus, la proximité entre la surface métallique et les protéines
peut altérer les propriétés biologiques des biomolécules. D’autre part, la fixation aléatoire des
protéines sur la surface n’est pas adaptée à la fixation des anticorps puisqu’elle peut entraîner
leur immobilisation par leur fragment inactif Fc mais également par leurs fragments Fab sur
lesquels se situent les sites de reconnaissance immunologique (paratopes). A titre d’exemple,
Kooyman et coll.20 ont montré que l’immobilisation d’anticorps anti-ASH sur l’or conduit à
tout au plus 25 % d’anticorps favorablement orientés pour la fixation de l’antigène
correspondant. Enfin, les biocapteurs élaborés par adsorption passive d’un anticorps sur la
surface métallique peuvent conduire à la fixation non spécifique de certaines protéines
contenues dans un sérum22. Ce phénomène est sans doute la conséquence d’interactions non
spécifiques entre les protéines du sérum et les protéines d’intérêt immobilisées sur la surface
mais aussi avec la surface métallique elle-même.
285
CHAPITRE IV
Du fait des désavantages engendrés par l’adsorption passive des protéines, de
nouveaux procédés d’immobilisation conduisant à une fixation spécifique et stable des
protéines et permettant des analyses reproductibles ont été recherchés.
II.2 – Immobilisation directe de protéines sur une monocouche organique
auto assemblée (SAM)
Pour permette une immobilisation spécifique, stable et reproductible de la protéine sur
l’or, le métal est très fréquemment recouvert d’une monocouche organique auto assemblée
(SAM pour « self-assembled monolayer ») (Figure IV-7). Les deux types de composés
principalement utilisés pour recouvrir l’or sont des alcanes ou des phospholipides. La
formation de la monocouche est induite par une organisation des molécules à l’interface
solide / liquide provoquée d’une part par une forte chimisorption entre la surface d’or et des
groupements réactifs portés par les molécules organiques et, d’autre part, par des interactions
hydrophobes entre les chaînes alkyle. La monocouche ainsi formée est généralement stable,
bien ordonnée et dense.
Protéine
Immobilisation de la
protéine d’intérêt
Fonctions réactives
Chaînons alkyle
ou
Phospholipides
Thiol
Monocouche
auto assemblée
(SAM)
Sulfure
ou disulfure
Surface d’or
Surface d’or
Figure IV-7 : Représentation schématique d’une monocouche auto assemblée (SAM) sur une surface d’or
Comme mentionné précédemment, ces molécules sont modifiées par des fonctions
adéquates pour permettre leur immobilisation sur l’or. Celles-ci sont soit des fonctions thiol
286
CHAPITRE IV
situées en extrémité de chaîne, soit des fonctions sulfure ou disulfure à l’intérieur de la chaîne
(Figure IV-7). Ces composés possèdent également un second type de groupements réactifs à
une de leur extrémité de chaîne pour permettre la fixation ultérieure des protéines. Cette
immobilisation peut alors être effectuée de trois façons différentes : (i) par interactions non
covalentes telles que des interactions électrostatiques, ou par greffage covalent entre la
protéine d’intérêt et les fonctions actives présentes à la surface de la monocouche (paragraphe
II.2.2 de ce chapitre), (ii) par l’intermédiaire d’une interface macromoléculaire (paragraphe
II.3 de ce chapitre) ou (iii) par mise en jeu d’un complexe intermédiaire de haute affinité de
type avidine / biotine (paragraphe II.4 de ce chapitre).
II.2.1 – Propriétés des monocouches de type SAMs
L’utilisation de monocouches SAMs comme interface d’immobilisation des protéines
présente de nombreux avantages.
Tout d’abord, le procédé de formation des monocouches est simple et consomme peu
de produits puisqu’il consiste à immerger la surface métallique dans une solution très diluée
des molécules à fixer. Certaines conditions expérimentales doivent néanmoins être respectées
car l’utilisation de concentrations trop élevées et d’un temps de contact long (6 jours) favorise
la formation de multicouches23. Les monocouches SAMs sont relativement stables
chimiquement et thermiquement24, ce qui est favorable à la fixation ultérieure des protéines
d’intérêt.
Par ailleurs, l’épaisseur, l’ordre et la densité des monocouches peuvent être facilement
contrôlées en fonction (i) de la longueur et de la nature des molécules mises en jeu, (ii) du
type de groupement réactif porté en bout de chaîne par les molécules ou encore (iii) par
l’utilisation d’un mélange de différentes molécules pour la formation de la couche SAM24-28.
En effet l’épaisseur moyenne des monocouches immobilisées peut varier de quelques
nanomètres à plusieurs dizaines de nanomètres selon la nature et la composition de la SAM.
D’autre part, à titre d’exemple, l’utilisation de longues chaînes alkyle thiolées (n > 10) permet
de former une monocouche très dense et très ordonnée (structure cristalline)24. Cette structure
rappelle alors le microenvironnement cellulaire des structures de bicouches lipidiques et
s’avère être une interface adéquate à l’immobilisation des biomolécules (anticorps, enzymes,
acides nucléiques) ou des systèmes biologiques (récepteurs, cellules).
287
CHAPITRE IV
D’autre part, selon les applications envisagées, le caractère hydrophobe ou hydrophile
de la monocouche peut également être facilement contrôlé par les paramètres (i), (ii) et (iii)
définis précédemment24-26. Par exemple, Pale-Grosdemange et coll.25 ont montré qu’une SAM
constituée d’alcanes thiols modifiés par des unités éthylène glycol en extrémité de chaîne
(HS(CH2)n(OCH2CH2)mOH) était moins hydrophile par rapport à une SAM constituée
d’alcanes thiols modifiés en extrémité de chaîne par une fonction OH (HS(CH2)nOH). Ceci
peut s’expliquer qualitativement en terme de désordre au niveau de l’interface SAM / liquide.
En effet, les couches formées par les molécules HS(CH2)nOH sont très organisées et
présentent une interface solide / liquide uniforme constituée de fonctions -CH2OH alors que
les SAMs terminées par des groupes –(OCH2CH2)mOH sont moins ordonnées et présentent à
l’interface un mélange de fonctions -CH2OH et de fonctions moins hydrophiles -OCH2CH2-.
Le contrôle des propriétés de la monocouche (ordre, densité, caractère hydrophobe ou
hydrophile) est une étape importante dans la mise au point d’un biocapteur car il permet de
contrôler la spécificité de la fixation de la protéine d’intérêt ainsi que la quantité de protéine
immobilisée. Quelques exemples illustrant ce point sont donnés dans le paragraphe cidessous.
II.2.2 – Exemples d’immobilisation directe de protéines sur une SAM
Les monocouches SAMs sont souvent constituées de molécules (chaînons alkyle,
phospholipides) portant une fonction carboxylique en extrémité de chaîne. En effet, la fixation
de la protéine d’intérêt sur les fonctions acide carboxylique peut être effectuée facilement soit
par interactions électrostatiques, soit par activation des fonctions COOH en ester de NHS puis
greffage covalent de la protéine sur les fonctions activées grâce à la formation d’une liaison
amide entre les fonctions NH2 de la protéine et les esters de NHS.
A titre d’exemple, Song et coll.29,30 ont utilisé le premier procédé pour fixer du
cyctochrome c par interactions électrostatiques sur une couche SAM composée d’alcanes
thiols de différentes longueurs (n=5, 10 et 15) porteurs de fonctions COOH. Les auteurs ont
montré que l’utilisation d’une couche SAM formée à partir des chaînons alkyle les plus longs
(n=15) permettait d’obtenir une monocouche stable de cytochrome c29.
Choi et coll.31,32 ont appliqué le second procédé pour greffer la protéine G sur les
fonctions ester de NHS d’une monocouche SAM à base d’acide 11-mercaptoundécanoïque
(MUA). Un anticorps anti-Legionella pneumophila a ensuite été immobilisé sur la protéine G
288
CHAPITRE IV
et a permis la détection de la Legionella pneumophila32. Une méthode identique a été utilisée
par Toda et coll.33 pour greffer un anticorps anti-IgG sur une monocouche SAM formée par
des molécules d’acide 4,4-dithiodibutyrique. Suivant le même principe, Herrwerth et coll.34
ont fixé un anticorps sur une monocouche formée par des poly(éthylène glycol)s modifiés par
un chaînon alkyle en C11 à une extrémité de chaîne et par une fonction COOH à la seconde
(HS-(CH2)11-O-(CH2-CH2-O)m-CH2-COOH). Bien que la couche SAM soit constituée par des
macromolécules, celle-ci est assez dense et bien ordonnée (structure cristalline). La présence
du PEG permet de réduire les interactions non spécifiques entre la protéine à immobiliser et la
couche SAM. D’autre part, les poly(éthylène glycol)s modifiés utilisés par les auteurs sont
assez polydispersés. Cette distribution implique alors que la majorité des groupements COOH
est partiellement enfouie dans le film SAM si bien que la présence de ces fonctions n’affecte
pas les propriétés « répulsives » des unités éthylène glycol envers les protéines.
Les monocouches SAM peuvent également comporter d’autres fonctions permettant la
fixation des protéines.
Par exemple, le groupement acide nitrilotriacétique (NTA) peut être utilisé pour fixer,
par l’intermédiaire du Ni(II), des protéines préalablement modifiées par des groupements
histidine. En effet, le Ni (II) se lie au groupement NTA par formation d’un chélate tétravalent,
puis les groupements imidazole des histidines portés par la protéine se lient aux deux sites
vacants du Ni(II). Sigal et coll.35 ont étudié ce procédé par la fixation d’une protéine modèle
modifiée par de l’histidine. Les auteurs ont élaboré une SAM à partir d’un mélange de deux
alcanes thiols modifiés en extrémité de chaîne soit par un tri(éthylène glycol) (HS-(CH2)11(O-CH2-CH2)3-OH), soit par un groupement NTA (HS-(CH2)11-(O-CH2-CH2)3-O-…-NTA).
L’utilisation de la première espèce (HS-(CH2)11-(O-CH2-CH2)3-OH) permet de limiter la
fixation non spécifique de la protéine et de contrôler la densité de sites NTA de la
monocouche SAM. Un procédé identique a été utilisé par Kroger et coll.36 pour immobiliser
un fragment Fab de l’anticorps anti-lysozyme sur une surface SAM.
Les molécules formant la couche de SAM peuvent également être modifiées par une
fonction biotine en extrémité de chaînes. Dans ce cas, un anticorps anti-biotine peut être
directement adsorbé sur la surface37.
289
CHAPITRE IV
II.3– Immobilisation des protéines par l’intermédiaire d’un assemblage
macromoléculaire
La fixation des protéines sur une surface d’or peut également être effectuée par
l’intermédiaire d’un assemblage macromoléculaire. Dans ce cas, le polymère mis en jeu est le
plus souvent immobilisé sur une monocouche SAM ou il peut aussi être adsorbé directement
sur l’or.
II.3.1 – Immobilisation des protéines sur un dextrane carboxyméthylé
Löfås et Johnsson38 ont modifié une surface d’or pour élaborer une matrice flexible
composée de dextrane carboxyméthylé permettant le couplage rapide et efficace de protéines.
Ces surfaces sont commercialisées par Biacore AB sous le nom de Sensor Chip CM 5. Les
surfaces de type Biacore ont été testées pour la fixation d’un grand nombre de protéines13,38,39
et un nombre important de biocapteurs a été élaboré à partir de ce procédé35,40-43. A titre
d’exemple, Knoll et coll.42 ont immobilisé un anticorps anti-PSA (PSA pour « prostatespecific antigen ») permettant la détection rapide de la PSA à la concentration de 3,3-33
pg/mL, concentration largement inférieure à la gamme de concentrations 4-10 ng/mL d’un
diagnostic clinique. Par ailleurs, Pei et coll.43 ont greffé un anticorps anti-C4 (C4 pour
« human complement factor 4 ») ayant conduit à une détection correcte de l’antigène C4 dans
la gamme de concentrations 0,02-20 µg/mL.
Le procédé d’élaboration38 des surfaces de type Biacore consiste à recouvrir la surface
d’or par une monocouche SAM composée de16-mercaptohexadécan-1-ol. Les groupements
hydroxyle en extrémité de chaînes des molécules de la SAM sont choisis pour d’une part
permettre la modification ultérieure de la surface et d’autre part créer une interface hydrophile
neutre. Les fonctions OH sont modifiées en fonctions époxyde par réaction avec
l’épichlorydrine puis, sous des conditions basiques, un dextrane linéaire de masse 500 000
g/mol est lié de façon covalente aux fonctions époxyde. La dernière étape consiste à introduire
des fonctions acide carboxylique sur le dextrane en utilisant l’acide bromoacétique dans des
conditions basiques. Les conditions opératoires sont telles qu’un taux de modification final
d’environ une fonction COOH par unité glucose est obtenu. D’autre part, le taux de
290
CHAPITRE IV
recouvrement moyen en dextrane est de l’ordre de 2 ng/mm2 et chaque chaîne
macromoléculaire est estimée avoir un seul ou peu de points d’ancrage sur la surface SAM44
(Figure IV-8). Les chaînes flexibles de polymère s’étendent alors sur environ 100 nm en
milieu aqueux13,44 et forment ainsi une surface fortement hydrophile qui minimise la fixation
non spécifique des protéines ou autres biomolécules.
Protéine
Greffage covalent de la
protéine d’intérêt
sur les fonctions COOH du
dextrane
Dextrane
carboxyméthylé
Ancrage covalent
Monocouche SAM
Surface d’or
Figure IV-8 : Représentation schématique d’une surface de type Biacore
Les surfaces ainsi élaborées permettent un greffage covalent, rapide et efficace des
protéines. Pour cela, les fonctions COOH du dextrane sont tout d’abord activées en ester de
NHS par l’intermédiaire du couple NHS / EDC puis la protéine d’intérêt est greffée sur la
surface par formation d’une liaison amide entre les fonctions amine de la biomolécule et les
fonctions réactives ester de NHS. Les auteurs ont montré qu’un taux de recouvrement
important en protéine, de l’ordre de 50 ng/mm2, peut être obtenu si cette la protéine est
préalablement concentrée à proximité des sites actifs du dextrane, par interactions
électrostatiques entre les groupements positifs de la protéine et les fonctions COO- du
dextrane13,38,39. Les importantes quantités de protéines immobilisées sont en partie dues à la
291
CHAPITRE IV
grande flexibilité des chaînes de polymères et dans certains cas, plusieurs monocouches de
protéines peuvent être incorporées dans l’hydrogel de dextrane35. D’autre part,
l’immobilisation des protéines par le système Biacore est très reproductible avec par exemple
un coefficient de variation égal à 3,4 % pour la fixation de la protéine A sur 96 surfaces
différentes39.
Cependant le taux de recouvrement en protéines, sous des conditions expérimentales
optimisées, peut être très différent selon la nature de la protéine immobilisée avec par
exemple une valeur de 0,07, de 9,7 et de 18 ng/mm2 respectivement pour la pepsine, l’αchymotrypsinogène A et l’aldolase39. D’autre part, même si dans certains cas la capacité de
fixation du système Biacore est supérieure à celle obtenue par greffage direct sur les
structures de type SAM (fixation d’une monocouche de protéines au maximum), ceci
n’implique pas forcément que la capacité de fixation du biocapteur issu du système Biacore
soit supérieure. En effet, Sigal et coll.35 ont élaboré un biocapteur en immobilisant des
protéines modifiées histidine soit sur des fonctions NTA à la surface d’une SAM (Cf.
Paragraphe II.2.2 de ce chapitre) soit par greffage sur un hydrogel de dextrane
carboxyméthylé. Les auteurs ont constaté que le premier type de biocapteur permettait une
meilleure fixation des anticorps correspondants que le second. Plusieurs hypothèses ont alors
été avancées : (i) l’immobilisation covalente des protéines modifiées histidine sur le dextrane
peut avoir conduit à une modification chimique des épitopes ou à un changement de la
structure tridimensionnelle de la protéine, (ii) la protéine peut être liée au dextrane dans une
orientation telle que les épitopes ne sont pas accessibles ou (iii) la matrice de dextrane peut
empêcher l’accès des anticorps jusqu’aux épitopes ; en effet, il est possible que la flexibilité
de la matrice de dextrane ait conduit à une réticulation des chaînes macromoléculaires lors de
la fixation de la protéine.
II.3.2 – Immobilisation des protéines sur d’autres types de polymères
La fixation de protéines sur une surface d’or peut également s’effectuer par
l’intermédiaire d’autres types de surfaces macromoléculaires que le dextrane carboxyméthylé.
Dans ce cas, la macromolécule peut être déposée directement sur l’or mais elle est le plus
souvent fixée sur une interface de type SAM.
292
CHAPITRE IV
A titre d’exemple pour le premier cas, la surface d’or peut être recouverte par un
polypeptide liant l’or (GBP pour « gold-binding polypeptide »). L’utilisation du polypeptide
GBP permet d’introduire à la surface différents sites réactifs tels que des fonctions amine,
acide carboxylique et hydroxyle permettant le greffage ultérieur de molécules45. De plus, la
présence du polypeptide polaire GBP à la surface de l’or permet de passiver la surface en
empêchant les réactions non spécifiques avec des protéines telles que l’albumine ou des
anticorps45. Ainsi, par exemple, après activation du GPB par le couple NHS / EDC, les
protéines A ou G peuvent être liées au polypeptide45,46. La surface ainsi obtenue permet de
fixer des IgG avec une orientation moléculaire favorable pour l’analyse ultérieure des
antigènes correspondants. Un tel procédé a été utilisé par Soh et coll.46 pour la détection d’un
précurseur de la dioxine, le 2,4-dichlorophénol, avec une faible limite de détection de 20 ppb.
Dans le cas où le polymère est déposé sur une interface de type SAM, la littérature
reporte l’utilisation de plusieurs types de polymères pour la fixation des protéines.
Millot et coll.47 ont par exemple immobilisé un copolymère de N-vinylpyrrolidone
(NVP) et de vinylchloroformiate (VCF) activé par des fonctions carbonate de NHS, avec une
épaisseur proche de 21 nm, sur une SAM constituée de cystéamine. Le copolymère utilisé est
hydrophile et neutre afin de limiter les interactions hydrophobes et/ou électrostatiques avec
les protéines. Des anticorps de type IgG ont ensuite été greffés sur les fonctions carbonate de
NHS résiduelles du copolymère et ont conduit à la formation d’une monocouche d’IgG.
Millot et coll.48 ont également immobilisé des IgG sur un poly(chlorure de méthacryle) dont
les fonctions réactives ont été transformées en ester de NHS. Deux méthodes ont été utilisées
pour la modification de la surface d’or par le polymère. La première a consisté à immobiliser
une monocouche de monomères sur la surface d’une SAM constituée de cystéamine puis à
polymériser in situ les monomères. La seconde a consisté à fixer directement le polymère
préformé sur la surface SAM de cystéamine. Le premier procédé a conduit à une structure
macromoléculaire moins dense et plus flexible permettant un meilleur contact entre le
polymère et les molécules d’IgG. Néanmoins, les quantités d’anticorps greffées sur les deux
types de surface se sont avérées être comparables. Par ailleurs, les auteurs ont montré que
l’introduction d’un bras espaceur sur le polymère avant le greffage de l’anticorps IgG
n’augmentait pas forcément la quantité d’IgG fixée mais améliorait les propriétés de
reconnaissance entre les IgG immobilisés et les anticorps anti-IgG correspondants.
Metallo et coll.49 ont utilisé un polymère bifonctionnel comme interface de fixation
entre une surface SAM et des anticorps. Le polymère élaboré est un poly(acrylamide) modifié
293
CHAPITRE IV
d’une part par des motifs pendants de vancomycine (antibiotique de type glycopeptide)
permettant sa fixation spécifique sur une monocouche SAM comportant des fonctions Dalanine-D-alanine et, d’autre part, par des groupements fluorescéine conduisant à la fixation
spécifique d’anticorps anti-fluorescéine. Un tel système pourrait être développé dans l’objectif
de contrôler la spécificité de reconnaissance des surfaces cellulaires ou d’autres surfaces
biologiques.
Masson et coll.50 ont élaboré un biocapteur à partir d’une variété de polymères et ont
comparé ces systèmes, en terme de sensibilité et d’interactions non spécifiques, à celui obtenu
à partir d’un dextrane carboxyméthylé. Les différents polymères étudiés sont des
polysaccharides tels que le dextrane carboxyméthylé, l’acide hyaluronique carboxyméthylé,
l’acide hyaluronique, l’acide alginique et d’autres types de polymères tels que l’acide
humique,
l’acide
polylactique,
l’acide
polyacrylique
et
un
copolymère
d’acide
poly(méthacrylique) et d’acétate de vinyle. L’ensemble de ces polymères a été immobilisé sur
une surface d’or puis des anticorps anti-myoglobine ont été fixés sur la surface. Les procédés
de fixation des polymères et de l’anticorps sont similaires à ceux utilisés dans le Biacore.
Chacun des biocapteurs ainsi élaborés a permis la détection de la myoglobine à une
concentration de 25 ng/mL inférieure aux concentrations biologiques et les systèmes les plus
performants ont été ceux obtenus à partir de l’acide alginique et du dextrane carboxyméthylé.
Néanmoins, du fait d’interactions non spécifiques, le biocapteur à base de dextrane
carboxyméthylé n’a pas permis la détection de la myoglobine dans un sérum. Des problèmes
similaires ont été constatés avec l’acide alginique mais les interactions non spécifiques ont pu
être diminuées d’environ 60 % avec l’utilisation de l’acide hyaluronique carboxyméthylé et
de l’acide hyaluronique.
II.4– Immobilisation des protéines par l’intermédiaire d’un complexe de
haute affinité de type avidine / biotine
L’avidine est une protéine animale tétramérique de masse moléculaire 67 000 g/mol et
de pI égal à 10-11. L’avidine présente la particularité de se lier de façon non covalente à la
biotine (vitamine H) par quatre sites de fixation identiques disposés sur les deux faces de la
protéine, avec une constante d’affinité très élevée51 de l’ordre de 1015 M-1. Les molécules
dérivées de l’avidine telles que la streptavidine (M = 60 000 g/mol, pI = 7) ou l’extravidine
(M = 73 000 g/mol, pI = 6,5) possèdent la même propriété vis-à-vis de la biotine. La
294
CHAPITRE IV
fonctionnalisation des protéines par de la biotine étant relativement simple, la grande affinité
du complexe avidine (ou dérivés) / biotine a été mise à profit pour fixer de façon spécifique et
stable des protéines sur une surface d’or.
Un procédé fréquemment utilisé consiste à immobiliser l’avidine (ou dérivés) sur la
surface d’or puis à y fixer les protéines d’intérêt préalablement modifiées par de la biotine
(Figure IV-9).
Protéine
Extrémité
biotinylée
(2)
2ème étape :
Immobilisation de la protéine d’intérêt
préalablement biotinylée
Avidine
(ou dérivés)
1ère étape :
Immobilisation de l’avidine (ou dérivés)
sur la surface
(par différents procédés)
(1)
Surface d’or
Figure IV-9 : Principe du procédé fréquemment utilisé pour immobiliser les protéines sur une surface
d’or par l’intermédiaire du couple avidine (ou dérivés) / biotine
Un tel procédé a été utilisé par Kada et coll.52 pour fixer de la HSA et de la ferritine
sur une interface de streptavidine, par Toda et coll.33 pour immobiliser des anticorps anti-IgG
et par Knoll et coll.15 pour fixer des fragments Fab d’anticorps anti-hormone HCG (HCG pour
« hormone human choreonic gonadotropin »), également sur une interface de streptavidine.
Un autre procédé impliquant le couple avidine (ou dérivés) / biotine peut également
être utilisé : l’avidine (ou dérivés) est tout d’abord immobilisée sur la surface puis des
groupements acide nitrilotriacétique (NTA) préalablement biotinylés sont immobilisés de
façon spécifique sur l’avidine. La protéine d’intérêt, préalablement modifiée par de
l’histidine, peut ensuite être fixée sur les fonctions NTA par l’intermédiaire du Ni(II). Un tel
295
CHAPITRE IV
procédé a été utilisé par Kada et coll.53 pour immobiliser une protéine membranaire (protéine
canal KcsA) sur une interface de streptavidine.
L’immobilisation des protéines par le complexe avidine (ou dérivés) / biotine nécessite
la fixation préalable de l’avidine (ou dérivés) sur la surface métallique. L’avidine étant une
protéine, tous les procédés préalablement relatés dans cet exposé peuvent être utilisés.
En particulier, Ebersole et coll.18 ont mis en évidence que l’avidine et la streptavidine
s’adsorbaient spontanément et irréversiblement sur l’or en formant une structure proche de la
monocouche. Les auteurs ont montré que le processus d’adsorption n’était dominé ni par des
interactions métal/thiol (par l’intermédiaire des résidus cystéine de l’avidine) ni par des
interactions électrostatiques mais plutôt par des interactions de type hydrophobe.
On peut également citer les travaux de Toda et coll.33 qui ont utilisé une interface
SAM constituée d’acide 4,4-dithiodibutyrique pour greffer de la streptavidine et immobiliser
un anticorps anti-IgG (anticorps n°1) biotinylé. Les auteurs ont testé en parallèle une voie plus
directe en fixant cet anticorps anti-IgG (anticorps n°1) de façon covalente sur l’interface SAM
constituée de l’acide 4,4-dithiodibutyrique. Les propriétés de reconnaissance de ces deux
types de surfaces vis-à-vis d’un IgG (anticorps n°2) ont été évaluées. Cette comparaison a mis
en évidence que les interactions non spécifiques entre les IgG et la surface d’or étaient
beaucoup plus importantes dans le cas d’une fixation directe sur la SAM. De plus, certaines
molécules d’anti-IgG sont mal orientées et ne peuvent lier l’IgG (Figure IV-10). A l’inverse,
les anticorps n°1 immobilisés par l’intermédiaire du couple avidine / biotine sont placés plus
loin de la surface métallique et l’orientation moléculaire des anticorps est favorable à la
reconnaissance de l’IgG.
296
CHAPITRE IV
Figure IV-10 : Représentation schématique de la fixation d’un anticorps anti-IgG par (a) immobilisation
directe sur l’acide 4,4-dithiodibutyrique (a) ou par mise en jeu du couple streptavidine / biotine (b).
Illustration tirée de la référence 33. S : substrat de verre, G : film d’or, D : acide 4,4-dithiodibutyrique, A :
anticorps anti-IgG (anticorps n°1), I : IgG, AV : streptavidine, B : biotine, LS : bras espaceur
L’avidine (ou dérivés) peut également être immobilisée sur une interface
macromoléculaire. La fixation peut s’effectuer par interactions électrostatiques, par formation
de liaisons covalentes ou encore par formation de liaisons spécifiques de type avidine /
biotine. A titre d’exemple, Frey et coll.54 ont fixé l’avidine sur une monocouche de poly(Llysine) dont certaines fonctions amine ont été préalablement modifiées par des groupements
biotine. Le polymère de poly(L-lysine) est préalablement déposé sur la surface d’or par
interactions électrostatiques avec une monocouche SAM constituée de MUA. Les auteurs ont
montré que l’adsorption de l’avidine sur le polymère s’effectuait de façon spécifique sur les
zones biotinylées de la poly(L-lysine) et que la variation du taux de biotine dans la couche de
poly(L-lysine) permettait de contrôler le taux de recouvrement en avidine. Enfin, la poly(Llysine) étant un polypeptide, son utilisation pour la fixation des protéines permet de limiter le
risque de dénaturation des biomolécules immobilisées.
Il est également possible de fixer directement l’avidine sur une monocouche SAM
constituée de molécules biotinylées en extrémité de chaînes. Ce procédé permet une
immobilisation spécifique et stable de la protéine. Afin d’optimiser les propriétés de surface
de la SAM, de nombreuses études ont été menées sur des monocouches SAMs de composition
variable15,55-58. L’ensemble de ces travaux a montré que le choix d’une molécule biotinylée
appropriée, possédant un bras espaceur de taille adéquate, et dont la concentration dans la
couche de SAM était optimisée, conduisait à une fixation spécifique et maximale de la
297
CHAPITRE IV
protéine. A titre d’exemple, Spinke et coll.55 ont montré que des monocouches biotinylées
composées d’un seul type de molécules engendraient un faible recouvrement en streptavidine
du fait de l’encombrement stérique (Figure IV-11a). Par contre, l’utilisation d’un mélange de
molécules biotinylées et non biotinylées pour constituer la SAM permettait de « diluer » les
extrémités biotine à l’interface solide/liquide et de diminuer l’encombrement stérique autour
de ces fonctions (Figure IV-11b et c). Ainsi, la quantité de protéine immobilisée a pu être
contrôlée par la composition de la SAM. Il a ainsi été montré qu’une SAM constituée d’un
mélange de 10 % de molécules biotinylées (12-mercaptododécanoïque-(8-biotinoylamido-3,6dioxaoctyl) amide) et 90% de chaînons alkyle plus courts portant une fonction OH (11mercaptoundécanol) (Figure IV-11c) conduisait à une fixation spécifique et maximale de la
streptavidine.
Streptavidine
Extrémité biotine
Chaînon alkyle
Extrémité SH
SAM
(a)
Extrémité biotine
Extrémité OH
(b)
(c)
Figure IV-11 : Représentation schématique de la fixation de la streptavidine sur différentes monocouches
de type SAMs55. La gêne stérique rencontrée par la streptavidine lors de son immobilisation diminue de la
figure (a) à (c) et devient nulle dans ce dernier cas.
298
CHAPITRE IV
II.4– Conclusion
En conclusion, de nombreux procédés peuvent être utilisés pour la fixation des
protéines sur une surface d’or. L’adsorption passive de biomolécules sur la surface métallique
conduit à des fixations non reproductibles et instables. De plus, ce procédé peut engendrer la
dénaturation des biomolécules immobilisées. Ainsi, cette méthode d’immobilisation des
protéines ne peut être utilisée pour l’élaboration de systèmes analytiques tels que des
biocapteurs. D’autres modes de fixation sont donc utilisés. Généralement, la surface d’or est
d’abord recouverte d’une couche organique hydrophile afin de diminuer les interactions non
spécifiques entre les protéines et la surface. Ce dernier point permet alors de réduire le risque
de dénaturation des protéines lors de leur immobilisation. La couche organique déposée sur
l’or est généralement une monocouche de chaînons alkyle ou de phospholipides auto
assemblée (SAM) ou une macromolécule telle que le dextrane carboxyméthylé. La protéine
d’intérêt peut ensuite être immobilisée sur cette couche par différents procédés : par
adsorption, par greffage chimique ou encore par mise en jeu de composés intermédiaires tels
que l’avidine et la biotine. L’ensemble de ces procédés peut conduire à une fixation stable et
reproductible ainsi qu’à un taux de recouvrement important en protéine par l’optimisation
préalable des propriétés de l’interface de fixation.
III – Elaboration d’un immunocapteur : présentation des
deux voies utilisées dans ce travail pour immobiliser la βlactoglobuline sur une surface d’or
III.1 – Présentation des deux voies de fixation de la β-lactoglobuline sur une
surface d’or
L’objectif de cette étude est d’élaborer un immunocapteur permettant de révéler la
sensibilité d’un individu à un type d’allergène donné. Dans le cas présent, un biocapteur
299
CHAPITRE IV
particulier capable de déceler l’allergie au lait de vache a été mis au point. Pour ce faire, un
allergène contenu dans le lait, la β-lactoglobuline, a été immobilisé sur une surface d’or.
La β-lactoglobuline est une protéine de masse moléculaire proche de 18 000 g/mol et
de pI égal à 5,1. Elle représente environ 50 à 60 % des protéines du lactosérum. Il existe sept
variants génétiques de cette protéine, les plus communs étant le A et le B. Ces deux variants
de la β-lactoglobuline se trouvent essentiellement sous la forme de monomères ou de dimères.
A pH = 6,8 la protéine est présente sous forme de dimères (M= 36 000 g/mol) qui se
dissocient à un pH supérieur à 8 ou inférieur à 3. La β-lactoglobuline utilisée dans la présente
étude contient un mélange des formes A et B.
Deux méthodes d’immobilisation de la β-lactoglobuline inspirées de procédés mis en
oeuvre par David et coll.59,60 pour la fixation d’anticorps IgG de lapin sur une surface d’or,
ont été envisagées (Figure IV-12) . Ces deux voies d’immobilisation de la protéine font appel
au système adamantyle/β-cyclodextrine :
- méthode A : une β-lactoglobuline préalablement modifiée par des bras porteurs de motifs
adamantyle est adsorbée sur une couche de β-cyclodextrine par formation de complexe
d’inclusion
- méthode B : la β-lactoglobuline est immobilisée par greffage chimique sur un dextrane
porteur de fonctions réactives, le dextrane étant lui-même adsorbé sur une couche de βcyclodextrine par formation de complexes d’inclusion.
300
CHAPITRE IV
Adsorption d'une β-lactoglobuline modifiée
Greffage de la β-lactoglobuline
par des bras de PEG-Ad sur une couche de β-cyclodextrine
sur des fonctions acide carboxylique activées
(Voie A)
(Voie B)
Ad
Ad
HOOC
COOH
COOH
COOH
Ad
surface d'or
Ad
surface d'or
Espèces mises en jeu:
Voie B :
Voie A :
β-cyclodextrine
β-cyclodextrine
HOOC
COOH
β-lactoglobuline modifiée
par des bras de PEG-Adamantyle
COOH
COOH
Ad
Ad
Ad
Dextrane modifié par des groupements adamantyle et
des fonctions acide carboxylique (Dext-Ad-COOH)
Ad
β-lactoglobuline
Figure IV-12 : Présentation des deux voies de fixation de la β-lactoglobuline sur une surface d’or pour la
mise au point d’un immunocapteur permettant de révéler l’allergie au lait de vache
301
CHAPITRE IV
Les deux voies envisagées pour l’élaboration de l’immunocapteur partent d’une interface de
complexation commune : une surface d’or tapissée de molécules de β-cyclodextrine.
L’élaboration de cette interface est décrite dans le paragraphe suivant.
III.2 – Elaboration de l’interface de complexation commune aux deux voies
par immobilisation d’une couche de β-CD sur une surface d’or
La littérature répertorie de nombreux travaux d’immobilisation de cyclodextrines sur
des surfaces d’or. La plupart des méthodes utilisées mettent en jeu des molécules de
cyclodextrine modifiées chimiquement par des fonctions thiol61-67. En effet, ces fonctions
possédant une très grande affinité pour l’or68 sont souvent utilisées comme moyen de
couplage privilégié de molécules ou macromolécules sur des surfaces d’or.
Dans la présente étude, un composé bifonctionnel, l’acide 11-mercaptoundécanoïque
(MUA) a été utilisé comme agent de couplage entre les molécules de β-CD et la surface d’or.
Ce composé a été choisi d’une part pour sa fonction thiol permettant son immobilisation sur
l’or, d’autre part pour sa fonction acide carboxylique permettant le greffage d’une β-CD
aminée et enfin pour son bras espaceur suffisamment long qui devrait conduire à une
monocouche bien organisée69-71.
Le procédé d’immobilisation d’une β-cyclodextrine aminée (β-CD-NH2) (Cf. Synthèse
au chapitre I, paragraphe III.1.2) sur une surface d’or par l’intermédiaire du MUA consiste en
quatre étapes59 (Réaction IV-1). Les conditions expérimentales relatives à chacune de ces
étapes sont reportées dans l’annexe 17.
302
CHAPITRE IV
1ère étape
2ème étape
O
MUA : HS-(CH2)10-COOH
TA, 16 h, EtOH
NHS : HO
N
, EDC
S (CH2)10 COOH
surface
d'or
O
O
O
TA, 30 min
S (CH2)10
O
S (CH2)10 COOH
O
O
O
S (CH2)10
N
O
N
O
Surface Or-MUA
3ème étape
H2N
TA, 30 min
4ème étape
Ethanolamine : H2NCH2CH2OH
TA, 10 min
O
S (CH2)10
NHCH2CH2OH
O
O
S (CH2)10
O
N
O
O
O
S (CH2)10
O
H
N
S (CH2)10
O
H
N
Surface Or-MUA-β
β-CD
Réaction IV-1 : Procédé d’immobilisation de la β -CD-NH2 sur une surface d’or par l’intermédiaire d’un
agent de couplage bifonctionnel, le MUA
De par la grande réactivité des fonctions thiol vis-à-vis de l’or, l’immobilisation de
l’agent de couplage s’effectue simplement, à température ambiante, par immersion de la lame
d’or dans une solution éthanolïque de MUA. La fonction acide carboxylique du MUA est
ensuite activée en ester de NHS en présence d’EDC suivant le mécanisme décrit
précédemment au chapitre III (Cf. Chapitre III, paragraphe III.2.1, Réaction III-2). Puis, la βCD-NH2 est couplée à la fonction réactive du MUA par l’intermédiaire de sa fonction amine
et via la formation d’une liaison amide (Cf. Chapitre III, paragraphe III.2.1, Réaction III-3).
Enfin, afin d’éviter toute réaction ultérieure avec les esters de NHS n’ayant pas réagi au cours
de l’étape de greffage de la β-CD-NH2, les fonctions résiduelles sont désactivées avec une
303
CHAPITRE IV
solution concentrée d’éthanolamine39. Ce rinçage permet en même temps d’éliminer la β-CD
aminée éventuellement liée à la surface par interactions non spécifiques.
L’évolution de la réflectivité en fonction du temps lors du passage d’une solution de βCD-NH2 sur une surface d’or-MUA activée est donnée sur la Figure IV-13.
1 : β-CD-NH2
Réflectivité
2 : Ethanolamine
Rinçage à l'eau
0,48
0,46
0,44
0,42
2
0,40
∆R>0 ⇔ Fixation de la β-CD-NH2
1
0
10
20
30
40
50
60
Temps (min)
Figure IV-13 : Courbe de réflectivité relative à l’immobilisation de la β-CD-NH2 sur une surface d’orMUA activée. Conditions expérimentales : (1) circulation sur la surface d’une solution de β-CD-NH2 à 10
mg/mL dans l’eau pendant 30 min suivie d’un rinçage à l’eau de 10 min, (2) circulation d’une solution
d’éthanolamine à 0,5 M de pH = 7,8 pendant 10 min suivie d’un rinçage à l’eau
La différence de réflectivité engendrée par la circulation d’une solution de β-CD-NH2 sur la
surface d’or-MUA activée suivie d’un rinçage à l’éthanolamine puis à l’eau confirme
l’immobilisation des molécules de cyclodextrine.
La cinétique de fixation de la β-CD-NH2 a été suivie sur une matrice carrée de 100
plots virtuels choisis sur l’ensemble de la surface d’or (Cf. Paragraphe I.4 de ce chapitre). La
variation de réflectivité observée sur l’ensemble de ces plots est reportée sur la Figure IV-14.
304
CHAPITRE IV
Réflectivité différentielle après immobilisation de la β-CD-NH2
suivie d'un rinçage à l'éthanolamine puis à l'eau
1,5
∆R
(%)
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
Numéro du plot
Figure IV-14 : Histogramme rapportant la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots virtuels
de la surface après la circulation d’une solution de β -CD-NH2 sur la surface d’or-MUA activée. Valeurs de
∆R médiane = 1,04 %, moyenne = 0,99 %, minimale = 0,4 %, maximale = 1,8 %
La variation de réflectivité observée sur l’ensemble des plots, après immobilisation de la βCD-NH2 suivie d’un rinçage à l’éthanolamine semble assez dispersée autour d’une valeur
médiane de 1,04 % et d’une valeur moyenne égale à 0,99 %. La fixation plus importante de la
β-CD-NH2 pour les plots de numéros élevés ainsi que la périodicité observée pour les valeurs
de ∆R pourraient être dues à des problèmes de dynamique du flux au sein de la cellule.
Afin de quantifier la dispersion observée sur la Figure IV-14, les valeurs de ∆R
observées pour les 100 plots de la surface ont été reportées dans un histogramme (Cf. Figure
IV-15). Chaque barre de cet histogramme représente le nombre de plots correspondant à une
valeur de ∆R donnée comprise dans une classe de pas égal à 0,1.
305
CHAPITRE IV
Nombre de plots
15
10
5
0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
∆ R (%)
Figure IV-15 : Histogramme rapportant la distribution de la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur
100 plots virtuels de la surface après la circulation d’une solution de β-CD-NH2 sur la surface d’or-MUA
activée.
Bien que cet histogramme fasse apparaître deux populations, celui-ci a été modélisé
par une gaussienne présentant un maximum pour une variation de réflectivité ∆Rcentrale égale à
1,02 % et d’écart type σ égal à 0,45 %. La dispersion des mesures autour de la valeur centrale
est donnée par le rapport σ/∆Rcentrale. Dans le cas présent, un rapport σ/∆Rcentrale de 0,44 a été
déterminé. Ce résultat qui correspond à une hétérogénéité relativement importante de la
surface après immobilisation de la β-CD-NH2 servira de référence ultérieurement. Cette
hétérogénéité peut être due à un effet de surface (hétérogénéité de la sous couche de MUA).
Cependant, comme mentionné précédemment, l’effet du système (Cf. Figure IV-14) doit être
également responsable de l’importante dispersion observée.
306
CHAPITRE IV
IV – Immunocapteur obtenu par immobilisation d’une βlactoglobuline modifiée par des groupements adamantyle :
méthode A
Les différentes étapes nécessaires à l’élaboration de l’immunocapteur, par
immobilisation d’une β-lactoglobuline modifiée par des groupements adamantyle sur la
surface de complexation or-MUA-β-CD, sont résumées par la Réaction IV-2.
Dans un premier temps, la β-lactoglobuline est modifiée chimiquement par des bras de
PEG-Adamantyle (1ère étape) puis la biomolécule obtenue est immobilisée sur une surface
d’or recouverte de β-cyclodextrine (2ème étape). L’immunocapteur ainsi élaboré est ensuite
testé quant à sa capacité à fixer de façon spécifique un anticorps anti-β-lactoglobuline (3ème
étape). Chacune de ces étapes sera détaillée par la suite.
307
CHAPITRE IV
1ère étape :
Modification chimique de la β-lactoglobuline
par des bras de PEG-Ad
Ad
Ad
2ème étape :
Formation de complexes d'inclusion
Ad
Ad
TA, 15 min à 1 h 45 min, PBS/Tween
surface d'or
SURFACE DE COMPLEXATION
OR-MUA-β
β-CD
Ad
Ad
Ad
Ad
IMMUNOCAPTEUR
3ème étape :
Adsorption de l'anticorps
TA, 20 min, PBS/Tween/BSA
Ad
Ad
Ad
Ad
Réaction IV-2 : Elaboration et test de l’immunocapteur par immobilisation d’une β-lactoglobuline
modifiée par des groupements adamantyle sur la surface de complexation or-MUA-β
β-CD
308
CHAPITRE IV
IV.1 – Préparation et caractérisation d’une β-lactoglobuline modifiée par
des groupements adamantyle
IV.1.1 – Modification de la β-lactoglobuline par des groupements
adamantyle
L’élaboration du biocapteur à allergènes selon la voie A nécessite d’introduire des
groupements hydrophobes adamantyle sur la β-lactoglobuline. Cette modification a été
effectuée par couplage de la protéine avec des polymères de PEGs porteurs de ces
groupements adamantyle. La littérature reporte de nombreuses méthodes de couplage des
PEGs aux protéines72-84. Celles-ci font le plus souvent appel à la réactivité des fonctions NH2
des protéines et parfois à la réactivité de leurs fonctions COOH ou SH.
Dans le cas présent, le procédé de couplage utilisé pour la modification de la βlactoglobuline consiste à former un ester de N-hydroxysuccinimide (ester de NHS) à partir
d’un PEG carboxylé puis à faire réagir ces fonctions ester de NHS sur les fonctions NH2 de la
protéine84.
Le but recherché étant de modifier la β-lactoglobuline par des groupements
adamantyle, un PEG carboxylé porteur à l’autre extémité d’un groupement adamantyle doit
être couplé à la protéine. Ainsi, le polymère de type COOH-PEG-AdPh, ayant servi comme
polymère modèle à la détermination des constantes d’affinité (Cf. Chapitre II, paragraphe I.3)
et dont la synthèse a été décrite au chapitre I (paragraphe III.3.3.b), a été utilisé pour la
modification de la β-lactoglobuline. Les conditions expérimentales relatives au couplage du
COOH-PEG-AdPh à la β-lactoglobuline sont résumées par la Réaction IV-3 et dans l’annexe
18.
309
CHAPITRE IV
1ère étape
1) DCC, 0°C, 2 h, CHCl3
O
2) NHS : HO
O
, 0°C, 30 min, CHCl3
O
C
O
N
OH
AdPh-PEG-COOH
O
O
C
O
O
N
AdPh-PEG-COONHS
O
2ème étape
NH2
NH2
NH2
β-lactoglobuline
NH2
NH2
O
0°C, 45 min, Tampon phosphate pH = 7
O
C
NH
NH2
NH2
NH
O
HN
O
C
O
C
O
AdPh-PEG-β
β-lactoglobuline
Réaction IV-3 : Couplage d’un polymère de COOH-PEG-AdPh à la β-lactoglobuline selon le procédé de
Yoshinga et Harris78
310
CHAPITRE IV
1ère étape : Activation de l’extrémité carboxylée du polymère AdPh-PEG-COOH par
formation d’un ester de N-hydroxysuccinimide (NHS) : obtention de l’espèce AdPh-PEGCOONHS
La première étape consiste à activer l’extrémité COOH du polymère AdPh-PEGCOOH en ester de NHS en présence de dicyclohexylcarbodiimide (DCC).
Le polymère AdPh-PEG-COOH utilisé pour cette première étape a été élaboré à partir
d’un lot de AdPh-PEG-OH contenant de faibles proportions des composés suivants (Cf.
Chapitre I, paragraphe III.3.3.b.1) :
- (1) AdPh-PEG-AdPh,
- (2) OH-PEG-OH.
Ainsi, après activation, le polymère recueilli contient majoritairement l’espèce AdPh-PEGCOONHS et une faible proportion des espèces suivantes :
- (1) AdPh-PEG-AdPh,
- (2’) NHSOOC-PEG-COONHS.
L’incidence de ces composés sur la réaction de couplage sera discutée au paragraphe suivant.
2ème étape : Couplage du polymère activé AdPh-PEG-COONHS à la βlactoglobuline : obtention de l’espèce AdPh-PEG- β-lactoglobuline
La β-lactoglobuline est couplée à la fonction réactive du AdPh-PEG-COONHS par
l’intermédiaire de ses fonctions NH2 et via la formation d’une liaison amide. Alors que la
réaction d’amidation est d’autant plus rapide que le pH est élevé, les fonctions ester de NHS
sont quant à elles de plus en plus instables85(réaction d’hydrolyse, Cf. Chapitre III, réaction
III-3). Ainsi, la réaction de couplage du PEG modifié à la protéine a été effectuée dans un
tampon phosphate de pH modéré égal à 7 et un excès de polymère AdPh-PEG-COONHS
(excès molaire AdPh-PEG-COONHS / β-lactoglobuline de l’ordre de 4,7) a été utilisé.
La présence de l’espèce AdPh-PEG-AdPh dans le lot de polymère utilisé pour cette
seconde étape n’a pas d’incidence pour la suite de l’étude. En effet, ce composé est éliminé
par dialyse pendant la purification de la protéine modifiée (Cf. annexe 18). Par ailleurs, la
présence de l’espèce NHSOOC-PEG-COONHS peut conduire à la formation de différentes
entités dont quelques formes possibles sont représentées sur la Figure IV-16. Ces espèces ne
311
CHAPITRE IV
sont pas gênantes car elles contiennent des groupements adamantyle qui permettront leur
immobilisation spécifique (par formation de complexe d’inclusion) sur la couche de β-CD
immobilisée sur la surface d’or.
HOOC
O
Espèce 3
O
C
NH
O
C
HN
NH2
HN
NH2
C
O
O
O
O
Espèce 4
C
O
NH2
NH
NH
NH
O
C
O
HN
O
C
C
O
Espèce 5
O
O
C
NH
NH2
NH2
H
N
O
O
C
NH2
HN
C
C
HN
NH
C
O
NH2
O
O
NH2
NH2
Figure IV-16 : Quelques espèces possibles formées par réaction de la β -lactoglobuline sur un polymère de
type NHSOOC-PEG-COONHS.
312
CHAPITRE IV
IV.1.2 – Caractérisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh par
électrophorèse
La β-lactoglobuline a été caractérisée par trois techniques électrophorétiques :
l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) en présence
de détergent ionique SDS (SDS PAGE), l’isoélectrofocalisation (IEF) et l’électrophorèse
capillaire. Les deux premières caractérisations ont été effectuées au Laboratoire
Environnement et Chimie Analytique de l’Ecole Supérieure de Physique et Chimie
Industrielles de la ville de Paris.
a) Caractérisation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de détergent
SDS (SDS PAGE)
L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de détergent ionique SDS
(SDS PAGE) a été introduite par Shapiro et coll. en 196786. Cette technique consiste à séparer
des protéines en fonction de leur poids moléculaire.
Pour cela, les protéines sont préalablement incubées avec du SDS afin que le
tensioactif se lie aux protéines et masque totalement les charges intrinsèques des
biomolécules. En théorie, les conditions expérimentales sont choisies de telle sorte que
chaque type de protéine fixe en moyenne 1,4 g de SDS par gramme de protéine. Par ce
procédé, les protéines acquièrent donc une densité de charges identique et par conséquent une
mobilité électrophorétique similaire dans un milieu non restrictif. D’autre part, cette étape
d’incubation entraîne une perte des structures tertiaires et secondaires des protéines du fait de
la destruction des liaisons hydrogène et du déploiement de la chaîne macromoléculaire. Dans
un second temps, le mélange protéique est déposé sur un gel de polyacrylamide et une tension
est appliquée aux extrémités du gel afin de provoquer la séparation des protéines. La mobilité
électrophorétique des différentes protéines étant identique, leur vitesse de migration est
uniquement fonction de leur masse moléculaire ; elle est d’autant plus élevée que la taille des
protéines est plus faible. En théorie, dans le cas de gels de polyacrylamide de concentration
fixe, le logarithme décimal de la masse moléculaire d’une espèce ( log M ) est une fonction
linéaire de sa distance relative de migration ( m ) dans le gel :
313
CHAPITRE IV
log M = a − b.m , avec a et b positifs
Equation IV-6
Néanmoins cette relation n’est valable que dans un domaine de masse relativement
étroit. En pratique, une courbe de calibration reportant la distance relative de migration de
composés standards (composés de masse moléculaire connue) en fonction de leur masse est
donc établie. En reportant sur cette courbe la distance de migration des espèces analysées, la
masse moléculaire des différents composés peut être déterminée.
Il est important de noter qu’en réalité la masse moléculaire déterminée par ce procédé
est parfois approximative. En effet, selon le caractère hydrophobe de la protéine, celle-ci peut
être plus ou moins recouverte de SDS. Ainsi, le rapport masse SDS / masse protéine peut, en
réalité, être différent pour chaque type de protéine analysée. Dans ce cas, la migration des
composés devient également fonction de la quantité de SDS fixée. Le SDS PAGE reste
cependant une technique intéressante permettant de comparer des masses moléculaires.
La β-lactoglobuline-PEG-AdPh synthétisée et la β-lactoglobuline native ont été
analysées par SDS PAGE sur un gel de polyacrylamide de concentration croissante de 8 à 18
% (Amersham) (Figure IV-17). Des marqueurs de masse moléculaire comprise entre 94 000
et 14 400 g/mol ont été utilisés (Amersham).
314
CHAPITRE IV
Extrémité positive du gel
Masses moléculaires (g/mol) et
Distances relatives de migration
des marqueurs
94 000
67 000
43 000
30 000
(2’)
(2)
(2)
(1’)
20 100
14 400
Sens de migration
des composés
(1)
(1)
Extrémité négative du gel
β -lactoglobuline β -lactoglobuline-PEG-AdPh
Figure IV-17 : Caractérisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh par SDS PAGE sur gel de
polyacrylamide après coloration au nitrate d’argent
L’électrophérogramme relatif à la β-lactoglobuline native montre la présence de deux
populations majoritaires. En comparant la distance relative de migration de ces deux
populations à celles des marqueurs, on peut supposer que les deux espèces observées
correspondent aux formes monomères (M = 18 000g/mol) et dimères (M = 36 000 g/mol) de
la β-lactoglobuline. La présence de la forme monomère peut s’expliquer du fait des conditions
dénaturantes de la technique utilisée. D’autres bandes de faible intensité correspondant à des
impuretés de la β-lactoglobuline de masse plus élevée sont également observées.
L’électrophérogramme obtenu pour la β-lactoglobuline-PEG-AdPh révèle la présence de
plusieurs populations de masse moléculaire supérieure ou égale à la protéine native, suggérant
alors la modification chimique d’une certaine quantité du lot de protéine. Néanmoins, le
signal obtenu est très diffus et la détermination de la masse moléculaire moyenne de la
315
CHAPITRE IV
protéine modifiée apparaît donc impossible. Par contre, en observant attentivement
l’électrophérogramme obtenu pour la β-lactoglobuline-PEG-AdPh, on peut constater la
présence de 4 bandes majoritaires. La comparaison de cet électrophérogramme avec celui de
la protéine native pourrait laisser supposer que les bandes numérotées 1 et 2 correspondent à
de la protéine, respectivement sous forme monomère et dimère, non modifiée par les bras de
PEG-Ad. Par ailleurs, les deux autres populations observées, numérotées 1’ et 2’, pourraient
correspondre respectivement à la forme monomère et dimère de la protéine modifiée. Bien
que cela soit très approximatif, nous avons tout de même calculé, à partir d’une courbe étalon
établie à l’aide des marqueurs, la masse moléculaire moyenne des espèces 1’ et 2’. Puis, en
supposant comme indiqué précédemment que ces espèces correspondent respectivement à la
forme monomère et dimère de la protéine, il a été calculé un accroissement moyen de la
masse respectivement de 8300 g/mol et 9400 g/mol pour ces deux espèces. Ce résultat
indiquerait alors que les composés 1’ et 2’ contiennent environ 1 à 2 bras de PEG-Ad (M ≈
5000 g/mol). Sachant que l’espèce 1’ provient de la scission du dimère, on en déduit alors que
la β-lactoglobuline-PEG-AdPh porte environ 1 à 4 bras par mole de dimère. Rappelons que ce
résultat est approximatif et ne représente pas forcément le taux moyen de modification de la
β-lactoglobuline par les bras de PEG-Ad.
b) Caractérisation par isoélectrofocalisation (IEF)
L’isoélectrofocalisation est une technique qui permet de mesurer le pI de protéines. Le
procédé utilisé consiste à créer un gradient de pH à l’intérieur d’un gel de poly(acrylamide) ou
d’agarose. Pour cela, le gel est préalablement rempli avec une solution d’ampholytes puis une
tension est appliquée au bornes du capillaire ce qui provoque la mise en mouvement des
ampholites jusqu’à leur immobilisation dans le capillaire au niveau de leur pI. Les ampholites
créent alors un pH local égal à leur pI. Le mélange à analyser est ensuite déposé sur le gel et
les différents constituants du mélange migrent dans le capillaire jusqu’à la bande de pH
correspondant à leur pI. A l’aide d’une courbe de calibration préalablement établie, portant la
distance de migration en fonction du pI des espèces étudiées, le pI des différents composés
analysés peut être déterminé.
La β-lactoglobuline-PEG-AdPh synthétisée et la β-lactoglobuline native ont été
analysées par IEF sur un gel de polyacrylamide (Amersham) de concentration fixe égale à 5
316
CHAPITRE IV
% (Figure IV-18). Une solution d’ampholites permettant de créer un gradient de pH de 3 à 10
et des marqueurs de pI compris entre 4,7 et 10,6 ont été utilisés (BDH).
Extrémité positive du gel
β -lactoglobuline-PEG-AdPh β -lactoglobuline
pI et
Distances relatives de migration
des marqueurs
4,74
4,85
5,65
5,92
Gradient de pH
croissant
6,45
7,3
8,3
10,6
Extrémité négative du gel
Figure IV-18 : Caractérisation de la β -lactoglobuline-PEG-AdPh par IEF sur gel de polyacrylamide après
coloration au bleu de Coomassie
Les électrophérogrammes obtenus pour la β-lactoglobuline et la β-lactoglobulinePEG-AdPh présentent des signaux diffus qui ne permettent pas de déterminer avec précision
le pI des protéines. Néanmoins la comparaison des deux électrophérogrammes révèle un
déplacement de la bande de protéine modifiée vers les pI les plus faibles. Etant donné que la
modification chimique de la β-lactoglobuline par les bras de PEG-AdPh met en jeu des
fonctions NH2 de la protéine (Cf. Réaction IV-3), le déplacement de pI observé semble
confirmer le greffage des bras de PEG-AdPh sur la β-lactoglobuline.
317
CHAPITRE IV
c) Caractérisation par électrophorèse capillaire
La modification de la β-lactoglobuline par des brins de PEG-AdPh a été confirmée par
une dernière technique : l’électrophorèse capillaire.
La β-lactoglobuline-PEG-AdPh ainsi que des composés tests tels que la βlactoglobuline native et le polymère COOH-PEG-AdPh, ont été injectés dans un capillaire de
silice initialement rempli d’un tampon phosphate à 25 mM et de pH = 7 (Figure IV-19). Les
conditions expérimentales correspondant à cette étude sont reportées en annexe 19.
Signal
0.025
0.025
0.020
0.020
0.015
0.015
0.010
β-lactoglobuline-PEG-AdPh
β-lactoglobuline
0.005
0.010
0.005
0.000
0.000
COOH-PEG-AdPh
-0.005
-0.005
DMSO
→ Détermination de la
mobilité électroosmotique
-0.010
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
-0.010
3.0
Temps (minutes)
Figure IV-19 : Caractérisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh par EC sur un capillaire de silice
L’électrophérogramme relatif à la β-lactoglobuline native présente deux signaux bien
distincts. Le premier apparaissant au temps électroosmotique ( t eo = 1,42 min) correspond sans
doute à des impuretés neutres contenues dans le lot de protéine commercial (Cf. SDS PAGE)
et le second apparaissant plus tardivement ( t app = 1,88 min) correspond à la β-lactoglobuline
(pI = 5,2-5,3) chargée négativement au pH de l’étude. Le polymère COOH-PEG-AdPh utilisé
pour le couplage à la protéine présente quant à lui un signal au temps électroosmotique qui
correspond à la forme COO--PEG-AdPh de mobilité électrophorétique quasi nulle (Cf.
318
CHAPITRE IV
Chapitre II, paragraphe I.3). Il faut noter que les impuretés neutres contenues dans le lot de
polymère migrent à la même vitesse que le polymère.
L’injection d’une solution du lot de β-lactoglobuline-PEG-AdPh révèle la présence de
trois signaux. La comparaison de l’électrophérogramme relatif à cette β-lactoglobuline
modifiée avec ceux correspondant à la β-lactoglobuline native et au COOH-PEG-AdPh
permet d’attribuer le premier pic, sortant au temps électroosmotique, à des impuretés neutres
et le troisième signal obtenu vers 1,83-1,89 min à de la protéine non modifiée ou trop
faiblement substituée pour observer une variation significative de mobilité. L’intensité du
second pic obtenu aux alentours de 1,62 min suggère qu’il s’agit de la β-lactoglobuline
modifiée.
Le couplage des chaînes de PEG-AdPh s’accompagnant d’une perte de fonctions NH2
de la protéine et par conséquent d’une diminution de son pI (Cf. résultats de
l’isoélectrofocalisation, paragraphe IV.1.2.b), la β-lactoglobuline modifiée aurait dû sortir
après la β-lactoglobuline native. Or, les mobilités électrophorétiques mesurées pour la βlactoglobuline-PEG-AdPh et la β-lactoglobuline native sont respectivement de -0,84.10-4 et 1,4.10-4 cm2/(V.s) dans les conditions de l’étude. Il est donc probable que l’augmentation de
masse résultant du couplage des chaînes de PEG-AdPh à la protéine s’oppose aux effets de
charge et rend sa migration vers l’anode plus difficile.
IV.1.3 – Conclusion
Afin de pouvoir immobiliser directement la β-lactoglobuline sur une surface d’or
recouverte de molécules de β-CD, la protéine a été préalablement modifiée par des
groupements hydrophobes adamantyle. Pour cela, un PEG modifié à une extrémité de chaîne
par un groupement adamantyle et à la seconde par une fonction COOH, a été utilisé. Après
activation de l’extrémité COOH du polymère en ester de NHS, celui-ci a été greffé sur la
protéine par réaction avec les fonctions NH2 de la protéine.
La protéine modifiée ainsi obtenue a été caractérisée par trois techniques
électrophorétiques classiques : le SDS PAGE, l’IEF et l’électrophorèse capillaire. L’ensemble
de ces méthodes a permis de confirmer de façon qualitative la modification chimique de la
protéine.
319
CHAPITRE IV
IV.2 – Immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface d’or
recouverte de β-cyclodextrine
IV.2.1 – Etude de la spécificité de l’interaction entre la βlactoglobuline et la surface d’or recouverte de β-cyclodextrine
L’adsorption de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la couche de β-CD doit s’effectuer
par formation de complexes d’inclusion entre les groupements phényladamantyle portés par la
protéine et les cavités de cyclodextrine immobilisées sur la surface d’or. Néanmoins, il est
possible que la protéine modifiée interagisse de façon non spécifique avec les molécules de βCD elles-mêmes mais aussi avec des zones de la surface d’or-MUA moins bien recouvertes
par la couche de β-CD. Pour vérifier cette hypothèse, une solution de β-lactoglobuline native,
préparée dans un tampon PBS de pH=7,4 (à 10 mM en phosphate et contenant 2,7 mM de
KCl et 0,137 M en NaCl), est mise en circulation pendant 15 minutes sur une lame d’or-MUA
et sur une lame d’or-MUA-β-CD (Figure IV-20 Aa et Ab).
1 : β-lactoglobuline
Réflectivité
Rinçage :
à l'eau (aA)(bA)
au PBS/Tween (aB)(bB)
0,48
0,448
*
0,46
0,446
0,44
0,42
0,444
(a)
Or-MUA
0,40
0,442
1
0,38
0
10
20
30
40
∆R>0
⇔
0,48
1
0
10
20
30
40
Fixation non spécifique
de la β-lactoglobuline moins
importante qu'en (aA) et (bA)
0,474
Fixation
non spécifique
0,46
0,472
0,44
(b)
Or-MUA-β-CD
0,470
0,42
1
1
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
Temps (min)
(Α) β-Lactoglobuline dans PBS
(Β) β-Lactoglobuline dans PBS + Tween
Figure IV-20 : Comparaison de l’adsorption non spécifique de la β-lactoglobuline en solution dans (A) un
tampon PBS et (B) un tampon PBS/Tween sur la surface (a) d’or-MUA et (b) d’or-MUA-β
β-CD.
320
CHAPITRE IV
Conditions expérimentales : (1) circulation sur la surface pendant 15 min d’une solution de β lactoglobuline à 1 mg/mL dans (A) un tampon PBS (à 10 mM en phosphate, 2,7 mM de KCl et 0,137 M en
NaCl) de pH = 7,4 et (B) un tampon PBS de pH = 7,4 contenant du Tween à 1 ‰ (v/v), suivie d’un rinçage
(A) à l’eau ou (B) au PBS/Tween. (*) Artefact
L’augmentation de réflectivité observée dans les deux cas (Figure IV-20 Aa et Ab) après
rinçage confirme l’immobilisation par interactions non spécifiques de la β-lactoglobuline sur
les différentes surfaces.
Les variations de réflectivité observées sur 100 plots virtuels de la surface sont
reportées dans le Tableau IV-1.
Variations de réflectivité ∆R (%) mesurées
après passage de la β-lactoglobuline en solution dans un tampon
(A) PBS, pH = 7,4
(B) PBS, pH = 7,4 +
Tween à 1 ‰ (v/v)
(a)
Médiane
0,98
0,16
Or-MUA
Moyenne
1,20
0,16
Minimale-Maximale
0,0 - 3,6
0,0 - 0,4
(b)
Médiane
0,29
0,07
Or-MUA-β-CD
Moyenne
0,18
0,07
Minimale-Maximale
0,1 - 0,8
0,0 - 0,2
Tableau IV-1 : Variations de réflectivité ∆R (%) déterminées sur 100 plots virtuels de la surface (a) d’orMUA, et (b) d’or-MUA-β
β-CD après la circulation pendant 15 min d’une solution de β-lactoglobuline à 1
mg/mL (A) dans un tampon PBS de pH = 7,4, et (B) dans un tampon PBS de pH = 7,4 contenant du Tween
à 1 ‰ (v/v), suivie d’un rinçage (A) à l’eau ou (B) au PBS/Tween
La variation de réflectivité observée sur l’ensemble des plots de la surface d’or-MUA est
assez importante avec une valeur moyenne égale à 1,20 % et une valeur maximale de 3,64 %.
Ces valeurs élevées révèlent que la protéine native interagit fortement avec la surface d’orMUA. La β-lactoglobuline (pI = 5,2-5,3) chargée négativement au pH de l’analyse ne devrait
pas interagir avec les fonctions COO- portées par le MUA. Il semblerait donc que la protéine
interagisse de façon non spécifique avec des zones de la surface d’or moins bien recouvertes
par le MUA. Par ailleurs, la variation de réflectivité moyenne de 0,18 % observée sur la
321
CHAPITRE IV
surface d’or-MUA-β-CD est plus de six fois plus faible que la valeur de 1,20 % déterminée
sur la surface d’or-MUA. Ce résultat suggère que le dépôt d’une couche de β-CD permet un
meilleur recouvrement de la surface métallique et tend à diminuer les interactions non
spécifiques entre la β-lactoglobuline et l’or.
Afin d’éliminer les interactions non spécifiques protéine/surface, un tensioactif neutre,
le Tween 20, souvent employé dans les tests immunologiques de type ELISA pour saturer la
surface d’interaction et minimiser les interactions non spécifiques, a été utilisé. Il a été ajouté
à une concentration de 1 ‰ (v/v) au tampon PBS servant à la préparation de la solution de βlactoglobuline. Cette nouvelle solution de protéine a ensuite été mise en circulation pendant
15 minutes sur des surfaces d’or-MUA et d’or-MUA-β-CD (Figure IV-20 Ba et Bb).
Les valeurs de réflectivités différentielles mesurées après passage de la protéine sur
100 plots de la surface sont reportées dans le Tableau IV-1. Il apparaît nettement que pour les
deux types de surfaces étudiées, la présence du Tween 20 permet de diminuer les interactions
non spécifiques entre la β-lactoglobuline et la surface d’or. En effet, sur le support or-MUA,
la valeur moyenne de réflectivité différentielle observée est près de huit fois plus faible en
présence de Tween (valeur de 0,16 %) qu’en son absence (valeur de 1,20 %). D’autre part, les
interactions non spécifiques étant déjà plus faibles sur l’interface de complexation or-MUA-βCD que sur la surface or-MUA, l’utilisation de Tween conduit à des interactions non
spécifiques négligeables avec une valeur moyenne de 0,07 %. Dans la suite de cette étude,
l’immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface d’or-MUA-β-CD sera donc
effectuée en présence de Tween afin de garantir une fixation spécifique.
IV.2.2 - Immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la
surface d’or recouverte de β-cyclodextrine
L’immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la couche de β-CD a été
effectuée avec une solution à 1 mg/mL en protéine modifiée dans un tampon PBS de pH=7,4
contenant 1 ‰ (v/v) de Tween 20 pour garantir une interaction spécifique protéine/surface.
322
CHAPITRE IV
Dans un premier temps, l’évolution de la réflectivité en fonction du temps a été suivie
lors d’un passage de 15 minutes de la solution de β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface
d’or recouverte de β-cyclodextrine (Figure IV-21).
1 : β-CD-NH2
2 : Ethanolamine
3 : PBS/Tween
4 : β-lactoglobuline-PEG-AdPh
Réflectivité
0,7
Rinçage à l'eau
PBS/Tween
0,6
∆R>0
⇔
4
Fixation spécifique de la
0,5
β-lactoglobuline-PEG-AdPh
2
1
0
20
40
3
60
80
100
Temps (min)
Figure IV-21 : Courbe de réflectivité relative à l’immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur une
surface d’or-MUA-β
β-CD. Conditions expérimentales : (1) circulation sur la surface d’une solution de β CD-NH2 à 10 mg/mL dans l’eau pendant 30 min suivie d’un rinçage à l’eau de 10 min, (2) circulation
d’une solution d’éthanolamine à 0,5 M de pH = 7,8 pendant 10 min suivie d’un rinçage à l’eau, (3)
circulation sur la surface d’un tampon PBS/Tween (tampon PBS de pH = 7,4 à 10 mM en phosphate, 2,7
mM de KCl, 0,137 M en NaCl et contenant du Tween à 1 ‰ (v/v)), pendant 10 min, (4) circulation d’une
solution de β -lactoglobuline-PEG-AdPh à 1 mg/mL dans le tampon PBS/Tween pendant 15 min, suivie
d’un rinçage au PBS/Tween pendant 10 min et d’un rinçage à l’eau
L’augmentation de réflectivité observée après circulation de la solution de protéine
modifiée puis rinçage suggère son adsorption sur la couche de β-CD. L’ensemble des
réflectivités différentielles mesurées sur 100 plots virtuels de la surface est reporté sur la
Figure IV-22.
323
CHAPITRE IV
Réflectivité différentielle après immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh
et rinçage au PBS/Tween
3,0
2,5
∆R
(%)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
Numéro du plot
Figure IV-22 : Histogramme rapportant la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots virtuels
après la circulation d’une solution de β -lactoglobuline-PEG-AdPh pendant 15 min sur la surface d’orMUA-β
β-CD suivie d’un rinçage au PBS/Tween. Valeurs de ∆R médiane = 2,56 %, moyenne = 2,57 %,
minimale = 2,0 %, maximale = 3,2 %
Il apparaît que la circulation durant 15 minutes d’une solution de β-lactoglobulinePEG-AdPh sur la surface suivie d’un rinçage au PBS/Tween conduit à une variation de
réflectivité (∆R) comprise entre 2 et 3,2 %. D’autre part, la valeur médiane de ∆R, égale à
2,56 %, est bien supérieure à la valeur de 0,07 % relative à la fixation non spécifique de la
protéine.
Afin de caractériser la dispersion des valeurs de ∆R observées pour les 100 plots de la
surface (Figure IV-22), celles-ci ont été reportées sous forme d’histogramme sur la Figure IV23 puis modélisées par une courbe de Gauss.
324
CHAPITRE IV
Nombre de plots
15
10
5
0
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
∆ R (%)
Figure IV-23 : Histogramme rapportant la distribution de la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur
100 plots virtuels de la surface après la circulation d’une solution de β-lactoglobuline-PEG-AdPh pendant
15 min sur la surface d’or-MUA-β
β-CD suivie d’un rinçage au PBS/Tween
L’histogramme de la Figure IV-23 a été modélisé par une gaussienne de paramètre
∆Rcentrale égale à 2,56 % et d’écart type σ égal à 0,31 % conduisant à un rapport
σ/∆Rcentrale.égal à 0,12. Le rapport σ/∆Rcentrale ainsi déterminé est près de quatre fois plus
faible que celui obtenu après immobilisation de la couche β-CD-NH2 (σ/∆Rcentrale.= 0,44,
paragraphe III.2 de ce chapitre). Ce résultat montre que l’adsorption de la protéine sur la
surface s’effectue de façon relativement homogène malgré la présence d’une sous couche non
uniforme.
La variation de réflectivité observée peut être reliée à la concentration surfacique
(Γmassique) de la protéine{BASSIL #58} (Cf. Paragraphe I.3 de ce chapitre) puis au nombre de
molécules déposées par unité de surface (Γmolaire). En utilisant la valeur médiane de ∆R de
2,56 %, un taux de recouvrement surfacique en β-lactoglobuline-PEG-AdPh de 0,51 ng/mm2
a été déterminé. Le calcul du taux de recouvrement molaire en β-lactoglobuline-PEG-AdPh
nécessite de connaître la masse moléculaire moyenne de la protéine modifiée, or cette masse
n’a pu être déterminée précisément par SDS PAGE (Cf. Paragraphe IV.1.2.a de ce chapitre).
Néanmoins, une approximation avait été posée selon laquelle une partie de la protéine avait
été modifiée par 1 à 4 bras de PEG-AdPh (M ≈ 5000 g/mol) par mole de dimère. Ainsi, un
taux Γmolaire peut être calculé de façon approximative en estimant la masse moléculaire de la
325
CHAPITRE IV
β-lactoglobuline-PEG-AdPh égale à 46 000 g/mol (masse du dimère de la protéine native +
masse de 2 bras de PEG-AdPh). De cette manière, un taux de taux de recouvrement molaire
de 11 fmol/mm2 a été déterminé.
La courbe de cinétique présentée sur la Figure IV-21 montre que la saturation de la
surface en protéine modifiée n’est pas atteinte dans des conditions de 15 minutes de passage.
Afin de déterminer la quantité maximale de protéine pouvant être fixée par cette méthode, une
solution de β-lactoglobuline-PEG-AdPh est mise à circuler sur la surface de β-CD jusqu’à
atteindre le plateau de la courbe de cinétique. Un temps de 1h45min a été nécessaire pour
atteindre l’équilibre dynamique du système. La dispersion de la variation de réflectivité
mesurée au terme de 105 min de circulation de la protéine a été comparée à celle obtenue
précédemment pour 15 min de passage (Figure IV-24). D’autre part, les concentrations
surfaciques et molaires calculées à partir des valeurs médianes de ∆R ont été reportées dans le
tableau de la Figure IV-24.
15 minutes de contact protéine / surface
Nombre de plots
Nombre de plots
15
20
15
10
10
5
5
0
0
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
4,0
4,4
4,8
5,2
5,6
∆ R (%)
∆ R (%)
(a)
(b)
6,0
6,4
6,8
7,2
après passage de la β -lactoglobuline-PEG-AdPh en solution dans un tampon PBS/Tween pendant
(a) 15 min
(b) 105 min
2,56
5,61
Médiane
326
CHAPITRE IV
Moyenne
2,57
5,63
Minimale-Maximale
2 - 3,2
4,7 - 6,4
σ/∆Rcentrale
0,12
0,09
Γmassique (ng/mm2)
0,51
1,12
Γmolaire (fmol/mm2)
11
24
Figure IV-24 : Comparaison de la dispersion de la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots
virtuels de la surface après la circulation d’une solution de β-lactoglobuline-PEG-AdPh pendant 15 min et
105 min sur la surface d’or-MUA-β
β-CD suivie d’un rinçage au PBS/Tween.
La circulation d’une solution de β-lactoglobuline-PEG-AdPh jusqu’à saturation de la
surface d’or-MUA-β-CD et rinçage au PBS/Tween conduit à une variation de réflectivité
(∆R) importante comprise entre 4,7 % et 6,4 %. Néanmoins, il apparaît que la cinétique de
fixation est plus rapide dans les premières minutes puisqu’un passage de 15 min, sept fois
plus court que le temps optimum, permet de fixer la moitié de la quantité de protéine
optimale. D’autre part, la saturation de la couche de β-CD par la β-lactoglobuline-PEG-AdPh
conduit à un rapport σ/∆Rcentrale de 0,09 similaire à celui obtenu au bout de 15 min de
circulation de la protéine. Par ailleurs, en utilisant la valeur médiane de ∆R de 5,61 %, un taux
de recouvrement surfacique à saturation en β-lactoglobuline-PEG-AdPh de 1,12 ng/mm2 a été
déterminé, ce qui correspond à un taux de recouvrement molaire de 24 fmol/mm2 (en
supposant Mβ-lactoglobuline-PEG-AdPh ≈ 46 000 g/mol). Cette concentration molaire en protéine est
du même ordre de grandeur que certaines valeurs de la littérature (Tableau IV-2), ce qui
démontre la faisabilité de la méthode d’immobilisation utilisée.
Protéine immobilisée
Molécules
Procédé
recouvrant la
d’immobilisation
surface d’or
de la protéine sur
Polyéthylènimine
Interactions
Γmassique en protéine
Γmolaire en protéine
(ng/mm2)
(fmol/mm2)
1,64
22
Réf
la surface
Extravidine
Ref
{BA
électrostatiques
SSIL
#58}
Streptavidine
Phospholipides
Adsorption
1,90
31,6
Ref
Adsorption
3,34
49,8
Ref
52
biotinylés
Avidine
Poly(L-lysine)
biotinylée
327
54
CHAPITRE IV
Ferritine biotinylée
Spreptavidine
Adsorption
4,08
8,6
Ref
ASB
or
Adsorption passive
0,2
3,0
Ref
Ig monoclonal HT13
or
Adsorption passive
1,6
10,6
Ref
Dextrane-COOH
Liaison covalente
0,24 à 0,35
1,6 à 2,3
Ref
Protéines (autres
Hydrogel de
Liaison covalente
De 0,07
De 2
Ref
qu’anticorps)
Dextrane-COOH
(pepsine)
(pepsine)
Lysozyme
(Biacore)
53
17
17
(anti-hormone hCG)
IgG de lapin
Chymotrypsinogène A
à 9,7
à 377
(ChymotrypsinogèneA)
(Chymotrypsinogène A)
16,1
107,3
10,0
66,6
16,7
111,3
59
39
Ribonucléase
Protéine A
Ovalbumine
Pepsine …
IgG1 (anti-α-
Hydrogel de
fetoprotéine)
Dextrane-COOH
IgG (anti-β2µ-
(Biacore)
Liaison covalente
Ref
39
globuline)
IgG (anti-C4)
Tableau IV-2 : Quelques valeurs de concentrations massiques et molaires reportées dans la littérature et
relatives à l’immobilisation de protéines sur des surfaces d’or. hCG : hormone chorionique humaine ; C4
pour « human complement factor 4 »
Néanmoins, la quantité de protéine immobilisée reste inférieure à certaines valeurs obtenues
sur le système Biacore. Ceci est sans doute dû à la structure des surfaces d’hydrogel de
dextrane qui offre plus de fonctionnalité que les molécules de cyclodextrine utilisées dans
cette étude qui conduisent dans le meilleur des cas à une monocouche de protéine.
IV.3 – Reconnaissance de la β-lactoglobuline immobilisée (méthode A) par
l’anti-β
β-lactoglobuline
Afin de contrôler les propriétés immunologiques du biocapteur élaboré, la capacité de
ce dernier à fixer de façon spécifique un anticorps anti-β-lactoglobuline a été étudiée. Un
sérum de lapin contenant de l’anti-β-lactoglobuline à la concentration de 0,2 mg/mL
(déterminée par test ELISA) a été utilisé pour cette étude. Par ailleurs, ce sérum est composé
d’environ 70 mg/mL de protéines totales (4,5 < pI < 9,5) dont 50 mg/mL d’albumine, 10 à 12
328
CHAPITRE IV
mg/mL d’immunoglobulines de différents types et d’α- et de β-globuline à des concentrations
inconnues.
Afin d’assurer une reconnaissance spécifique du biocapteur vis-à-vis de l’anti-βlactoglobuline contenue dans le sérum, les interactions non spécifiques susceptibles
d’intervenir entre la surface du biocapteur et les différentes protéines du sérum doivent être
éliminées. Pour ce faire, le sérum utilisé pour l’étude est dilué dans un tampon PBS de
pH=7,4 (à 10 mM en phosphate, 2,7 mM de KCl et 0,137 M en NaCl) auquel est ajouté du
Tween à 1‰ (v/v) et de l’ASB à 1 % (m/m) (tampon PBS/Tween/ASB).
L’évolution de la réflectivité en fonction du temps a été suivie lors d’un passage de 20
minutes du sérum de lapin dilué au centième (dans un tampon PBS/Tween/ASB) (soit 2
µg/mL d’anticorps spécifique anti-β-lactoglobuline) sur le biocapteur saturé en βlactoglobuline-PEG-AdPh (Figure IV-25).
1 : sérum
Réflectivité
Rinçage au PBS/Tween/ASB
0,64
0,62
∆R > 0
⇔
Adsorption du sérum
0,60
1
0,58
0
10
20
30
40
50
Temps (min)
Figure IV-25 : Courbe de réflectivité relative à l’adsorption de l’anticorps anti-β
β-lactoglobuline contenu
dans le sérum sur la surface de l’immunocapteur saturé en β-lactoglobuline-PEG-AdPh préalablement
équilibrée dans un tampon PBS/Tween/ASB. Conditions expérimentales : (1) circulation pendant 20 min
d’un sérum de lapin dilué au centième (soit 2 µg/mL d’anticorps spécifique anti-β
β-lactoglobuline) dans un
tampon PBS/Tween/ASB (tampon PBS de pH = 7,4 à 10 mM en phosphate, 2,7 mM de KCl, 0,137 M en
NaCl et contenant du Tween à 1 ‰ (v/v) et de l’ASB à 1 % (m/m)), suivie d’un rinçage au tampon
PBS/Tween/ASB pendant 15 min.
329
CHAPITRE IV
L’augmentation de réflectivité observée après la circulation du sérum suivie d’un rinçage au
PBS/Tween/ASB indique la fixation de l’anticorps anti-β-lactoglobuline du sérum sur la
surface de l’immunocapteur. Les paramètres caractéristiques de la dispersion de la variation
de réflectivité mesurée sur l’ensemble de la surface du biocapteur sont reportés sur la Figure
IV-26.
Réflectivité différentielle après adsorption du sérum
et rinçage au PBS/Tween/ASB
Nombre de plots
7
25
6
∆R
(%)
5
20
4
15
3
10
2
5
1
0
0
0
20
40
60
80
100
4,4
4,8
5,2
5,6
Numéro du plot
6,0
6,4
∆ R (%)
après passage de l’anti-β-lactoglobuline sur la surface du biocapteur
Médiane
5,75
Moyenne
5,73
Minimale-Maximale
5,0 – 6,7
σ/∆Rcentrale
0,05
Figure IV-26 : Dispersion de la variation de la réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots virtuels de la
surface après la circulation d’un sérum contenant de l’anti-β
β -lactoglobuline pendant 20 min sur la surface
de l’immunocapteur saturé en β-lactoglobuline, suivie d’un rinçage au PBS/Tween/ASB.
Il apparaît que le passage du sérum (composé de 2 µg/mL d’anti-β-lactoglobuline)
pendant 20 minutes sur la surface du biocapteur suivi d’un rinçage au PBS/Tween/ASB
conduit à une variation de réflectivité (∆R) relativement élevée comprise entre 5,0 % et 6,7 %.
La valeur médiane de ∆R, égale à 5,75 %, peut être utilisée pour calculer le taux de
recouvrement en anticorps. Une concentration massique de 1,15 ng/mm2 est ainsi calculée, ce
qui correspond à un taux de recouvrement molaire de l’ordre de 8 fmol/mm2. D’autre part, la
330
6,8
7,2
CHAPITRE IV
valeur assez faible du rapport σ/∆Rcentrale montre que la quantité d’anticorps immobilisée sur
la surface du biocapteur est relativement homogène.
IV.4 – Etude de faisabilité d’une puce à allergènes
La mise au point d’un immunocapteur à base de β-lactoglobuline est une première
étape nécessaire à la mise au point de systèmes plus complexes tels que des puces à
allergènes. Dans de tels systèmes, différents allergènes doivent être déposés sur une interface
d’interaction afin de pouvoir détecter, au travers d’une unique analyse, la présence de
multiples anticorps dans un sérum de malade.
Dans le cas présent, une étude a été menée afin de vérifier si la chimie de surface
basée sur des complexes d’inclusion utilisée pour l’élaboration du biocapteur, serait adaptée à
la mise au point d’une puce à allergènes.
Pour ce faire, une surface de complexation or-MUA-β-CD a d’abord été élaborée
suivant le procédé décrit au paragraphe III-2 de ce chapitre. Puis, la lame d’or a été retirée du
système optique de RPS et sept plots de β-lactoglobuline-PEG-AdPh ont été déposés
manuellement sur la surface. Une solution de protéine à 1 mg/mL dans un tampon
PBS/Tween, identique à celle utilisée pour l’élaboration du biocapteur, est utilisée pour cette
étape. Après dépôt de l’ensemble des plots sur la surface, la lame d’or est maintenue à l’air
ambiant pendant 30 minutes avant d’être replacée dans le système de RPS. Après un rinçage
rapide de la surface à l’eau, le sérum est mis à circuler dans la cuve du système optique
suivant des conditions opératoires identiques à celles utilisées pour l’étude du biocapteur.
L’évolution de la réflectivité lors de la circulation du sérum a été suivie simultanément
sur les zones d’or où ont été déposés les plots de β-lactoglobuline-PEG-AdPh et sur des zones
non traitées par la protéine (Figure IV-27).
331
CHAPITRE IV
Réflectivité
1 : sérum
0,52
0,50
0,48
∆R>0
0,46
⇔
1
(a)
0
10
20
30
40
Réflectivité
0,48
0,46
0,44
∆R=0
0,42
Pas d'adsorption du sérum
⇔
1
(b)
0
10
20
30
40
Temps (min)
Figure IV-27 : Courbe de réflectivité relative à la circulation de l’anti-β
β-lactoglobuline sur la surface d’orMUA-β
β-CD recouverte de 7 plots de β-lactoglobuline-PEG-AdPh. La figure (a) représente le signal obtenu
sur un plot de protéine et la figure (b) le signal relatif à une zone non traitée. Conditions expérimentales :
identiques à celles de la Figure IV-25.
La prise d’anticorps observée après rinçage sur les plots de β-lactoglobuline-PEGAdPh (Figure IV-27a) indique que le procédé statique de dépôt de plots de protéine sur la
surface d’or conduit à une concentration surfacique suffisante à la détection de l’anticorps.
Par ailleurs, le suivi de la réflectivité sur un plot virtuel de zone non traitée par la protéine
(Figure IV-27b) indique que le sérum n’interagit pas avec la surface de base or-MUA-β-CD et
confirme que l’adsorption de l’anticorps observée est spécifique à la présence de la protéine.
Les valeurs de réflectivités différentielles mesurées sur les sept plots de βlactoglobuline-PEG-AdPh après circulation du sérum suivie d’un rinçage au PBS/Tween/ASB
sont reportées sur la Figure IV-28.
332
CHAPITRE IV
Réflectivité différentielle après circulation du sérum et rinçage au PBS/Tween/ASB
(b) sur des plots virtuels
de zones non traitées
(a) sur les plots de protéine
5
4
∆R
(%)
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Numéro du plot
Figure IV-28 : Histogramme rapportant la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur (a) les plots de β lactoglobuline-PEG-AdPh et (b) des plots virtuels de zones non traitées par la protéine après circulation
de l’anti-β
β -lactoglobuline pendant 20 min sur la surface suivie d’un rinçage au PBS/Tween/ASB
La variation de réflectivité (∆R) observée après circulation de l’anti-β-lactoglobuline
sur les plots de protéine varie entre 3,6 % et 5,0 % et est quasiment nulle sur les plots virtuels
de zones non traitées par la protéine. Ces valeurs confirment la spécificité de reconnaissance
anticorps / allergène mentionnée précédemment, et ce, sur l’ensemble de la surface du
biocapteur. Par ailleurs, bien qu’un faible nombre de plots ait été étudié, il semblerait que la
fixation de l’anticorps soit assez homogène. Ce résultat est un critère de sélection important
démontrant la faisabilité de puces à protéines par le procédé de chimie de surface particulier
appliqué. D’autre part, bien qu’il soit difficile de comparer la présente étude à celle effectuée
en mode dynamique, les résultats issus de ces deux travaux semblent cohérents. En effet, la
variation de réflectivité observée dans le cas présent sur les plots de protéine est inférieure à
celle obtenue en mode dynamique (gamme minimum-maximum de ∆R = 5,0 % - 6,7 %, Cf.
Figure IV-26). Ce résultat suggère que la quantité d’allergène immobilisée par dépôt de plots
est inférieure à celle fixée précédemment en mode dynamique, ce qui est en bon accord avec
les durées de contact protéine/ surface mises en jeu, respectivement égales à 30 et 105
minutes dans les deux cas.
La présente étude a démontré la faisabilité de l’utilisation d’une chimie de surface
basée sur la formation de complexes d’inclusion pour l’élaboration de puces à protéines. Ceci
étant, les conditions de dépôt des plots de β-lactoglobuline restent à optimiser (concentration,
pH et force ionique de la solution de protéine, temps de contact protéine / surface …).
333
CHAPITRE IV
V – Immunocapteur obtenu par immobilisation de la βlactoglobuline sur un dextrane carboxyméthylé modifié
par des groupements adamantyle : méthode B
Les différentes étapes nécessaires à l’élaboration de l’immunocapteur, par greffage
chimique de la β-lactoglobuline sur un dextrane intermédiaire préalablement immobilisé sur
la surface de complexation or-MUA-β-CD, sont résumées par la Réaction IV-4.
Dans un premier temps, un dextrane carboxylé modifié par des groupements
adamantyle est immobilisé sur une surface d’or recouverte de β-cyclodextrine (1ère étape) puis
la β-lactoglobuline est greffée sur les fonctions acide carboxylique activées du dextrane (2ème,
3ème et 4ème étape). L’immunocapteur ainsi préparé est ensuite testé quant à sa capacité à fixer
de façon spécifique de l’anti-β-lactoglobuline (5ème étape). Chacune de ces étapes sera
détaillée par la suite.
334
CHAPITRE IV
1ère étape :
Immobilisation d'un Dext-Ad-COOH
par formation de complexes d'inclusion
HOOC
COOH
COOH
TA, 20 min
COOH
Ad
Ad
surface d'or
SURFACE DE COMPLEXATION
OR-MUA-β
β-CD
2ème étape
O
NHS : HO
NH2
3ème
, EDC
N
O
TA, 20 min
étape : Greffage de la β-lactoglobuline
TA, 15 min à 2 h, Tampon acétate pH = 4,5
4ème
étape : TA, 30 min, PBS pH = 8
O
NH
NH
O
N
O
O
O
Ad
COO
-
COO
-
O
O
O
N
N
O
O
O
O
Ad
Ad
O
O
COOH
Ad
IMMUNOCAPTEUR
5ème étape :
Adsorption de l'anticorps
NH
NH
O
O
COO
-
COO
-
TA, 20 min, PBS/Tween/BSA
Ad
Ad
Réaction IV-4 : Elaboration et test de l’immunocapteur par greffage de la β -lactoglobuline sur un
dextrane intermédiaire préalablement immobilisé sur la surface de complexation or-MUA-β
β-CD
335
CHAPITRE IV
V.1 – Immobilisation d’un dextrane modifié par des groupements
adamantyle et des fonctions COOH (Dext-Ad-COOH) sur la surface d’or
recouverte de β-cyclodextrine
L’adsorption d’un Dext-Ad-COOH (Cf. Synthèse chapitre I, paragraphe III.3.4.c) sur
la couche de β-CD met en jeu la formation de complexes d’inclusion entre les groupements
adamantyle portés par le dextrane et les cavités de cyclodextrine immobilisées sur la surface
d’or. Le dextrane utilisé pour cette étude possède une masse moléculaire de 40 000 g/mol et
est modifié à 6,2 % en groupement adamantyle et à 62 % en fonctions COOH. L’évolution de
la réflectivité en fonction du temps lors du passage d’une solution de Dext-Ad-COOH sur la
surface d’or-MUA-β-CD est donnée sur la Figure IV-29.
1 : β-CD-NH2
Réflectivité
2 : Ethanolamine
3 : Dext-Ad-COOH
0,70
Rinçage à l'eau
0,65
0,60
0,55
0,50
∆R>0
⇔
0,45
2
0,40
0
20
40
Fixation du Dext-Ad-COOH
3
1
60
80
100
Temps (min)
Figure IV-29 : Courbe de réflectivité relative à l’immobilisation du Dext-Ad-COOH sur une surface d’orMUA-β
β-CD. Conditions expérimentales : (1) circulation sur la surface d’une solution de β -CD-NH2 à 10
mg/mL dans l’eau pendant 30 min suivie d’un rinçage à l’eau de 10 min, (2) circulation d’une solution
d’éthanolamine à 0,5 M de pH = 7,8 pendant 10 min suivie d’un rinçage à l’eau, (3) circulation d’une
solution de Dext-Ad-COOH à 1 mg/mL dans l’eau pendant 20 min suivie d’un rinçage à l’eau de 20 min
L’augmentation de réflectivité observée après la circulation de la solution de Dext-AdCOOH sur la surface d’or-MUA-β-CD suivie d’un rinçage à l’eau confirme la complexation
du polymère avec les cavités de β-CD immobilisées. La variation de réflectivité observée sur
336
CHAPITRE IV
100 plots virtuels de la surface après l’immobilisation du dextrane modifié est donnée sur la
Figure IV-30.
Nombre de plots
25
20
15
10
5
0
3,4
3,6
3,8
4,0
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
∆ R (%)
Variations de réflectivité ∆R (%) mesurées après passage du Dext-Ad-COOH
Médiane
4,16
Moyenne
4,15
Minimale-Maximale
3,8 - 4,8
σ/∆Rcentrale
0,04
Figure IV-30 : Histogramme rapportant la dispersion de la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur
100 plots virtuels de la surface après la circulation d’une solution de Dext-Ad-COOH sur la surface d’orMUA-β
β-CD suivie d’un rinçage à l’eau.
Le passage sur la surface d’or-MUA-β-CD d’une solution de Dext-Ad-COOH pendant
20 minutes suivi d’un rinçage à l’eau conduit à une variation de réflectivité (∆R) comprise
entre 3,8 % et 4,8 %. D’autre part, la faible valeur du rapport de dispersion σ/∆Rcentral obtenu
révèle que la quantité de polymère immobilisée sur la lame d’or-MUA-β-CD est relativement
uniforme sur l’ensemble de la surface. Il semblerait donc que le recouvrement d’une surface
d’or-MUA-β-CD hétérogène (σ/∆Rcentrale de 0,44, paragraphe III.2 de ce chapitre) par un
polymère de dextrane conduit à une homogénéisation de l’état de surface. Ce résultat est sans
doute la conséquence de la masse moléculaire assez élevée du dextrane utilisé (M = 40 000
g/mol). En effet, même si les complexes d’inclusion formés entre les groupements adamantyle
337
CHAPITRE IV
du polymère et les cavités de β-CD ne sont pas répartis régulièrement sur la surface, il est
probable que les longues chaînes linéaires des molécules de dextrane immobilisées tendent à
recouvrir de façon homogène l’ensemble de la surface.
V.2 - Immobilisation à pH = 7,4 de la β-lactoglobuline sur la surface d’or
recouverte de Dext-Ad-COOH
Une précédente étude (paragraphe IV.2.1 de ce chapitre) a montré que les interactions
non spécifiques entre la β-lactoglobuline et la surface d’or-MUA et d’or-MUA-β-CD
pouvaient être diminuées voir éliminées en utilisant un tampon PBS de pH = 7,4 additionné
de Tween à 1 ‰ (v/v). Or dans cette seconde voie d’élaboration d’un immunocapteur,
l’immobilisation de la β-lactoglobuline s’effectue sur une couche intermédiaire de Dext-AdCOOH (Cf. Réaction IV-4 : ). Ainsi, les interactions non spécifiques entre la β-lactoglobuline
et la couche de polymère ont dû être étudiées. Pour ce faire une solution de β-lactoglobuline à
1 mg/mL dans un tampon PBS de pH=7,4 sans tween, a été mise en circulation pendant 15
minutes sur une lame d’or-MUA-β-CD-(Dext-Ad-COOH) puis un rinçage à l’eau de la
surface pendant 10 minutes a été effectué. Sur une centaine de plots virtuels étudiés, aucune
augmentation du niveau de la réflectivité n’a été observée après circulation de la solution de
protéine et rinçage à l’eau. Ce résultat indique que, dans les conditions opératoires de l’étude,
les interactions non spécifiques protéine/surface sont totalement éliminées lorsque la surface
est recouverte d’un Dext-Ad-COOH. Ce phénomène était prévisible puisque d’une part, la
couche homogène de polymère adsorbée sur la lame doit recouvrir correctement la surface
d’or responsable en grande partie des interactions non spécifiques et, d’autre part, le Dext-AdCOOH et la β-lactoglobuline sont tous deux chargés négativement dans les conditions de
l’étude. Le greffage de la β-lactoglobuline sur le dextrane modifié peut donc être effectué
dans un tampon PBS de pH = 7,4 sans risque d’interactions non spécifiques.
Dans cette seconde voie d’élaboration d’un immunocapteur, l’immobilisation de la βlactoglobuline sur la couche de dextrane modifié doit s’effectuer par formation de liaisons
covalentes entre les fonctions NH2 de la protéine et les fonctions COOH activées du Dext-AdCOOH (Cf. Réaction IV-4 : ). Le procédé suivi fait de nouveau appel au couple EDC/NHS
338
CHAPITRE IV
déjà utilisé au Chapitre III pour l’élaboration du support d’immunoaffinité et au Chapitre IV
pour l’immobilisation de la β-CD-NH2 sur la surface d’or-MUA.
Les trois étapes nécessaires à l’utilisation de ce procédé ont été suivies par RPS. La
surface d’or-MUA-β-CD-(Dext-Ad-COOH) a tout d’abord été activée pendant 20 minutes par
une solution d’EDC/NHS à 0,2 M / 0,05 M dans l’eau afin de convertir les fonctions acide
carboxylique du Dext-Ad-COOH en ester de NHS. Après un rinçage à l’eau, une solution de
β-lactoglobuline à 1 mg/mL dans le tampon PBS de pH=7,4 est mise à circuler pendant 15
minutes sur la surface activée et un nouveau rinçage à l’eau est effectué. Enfin, afin d’éviter
toute réaction ultérieure avec les fonctions ester de NHS résiduelles n’ayant pas réagi, cellesci sont désactivées par hydrolyse à l’aide d’un tampon PBS de pH = 8.
La variation de réflectivité (∆R) observée suivant ces conditions, après immobilisation
de la protéine et rinçage, est assez faible avec une valeur moyenne de 1,5%. Ce pourcentage
traduit une concentration surfacique de la protéine de 0,3 ng/mm2 et une concentration
molaire de 8 fmol/mm2. La quantité de protéine fixée dans ces conditions est inférieure à la
celle obtenue avec la méthode A pour laquelle une concentration massique de 0,51 ng/mm2 et
molaire de 11 fmol/mm2 ont été déterminées dans des conditions similaires.
Bien que le pH élevé de l’étude soit favorable à une cinétique rapide de la réaction de
greffage de la protéine, il semblerait que les conditions opératoires choisies ne permettent pas
une fixation importante de la β-lactoglobuline. Ce résultat a donc conduit à tester de nouvelles
conditions opératoires pour favoriser la réaction de greffage et augmenter de fait la quantité
de protéine immobilisée.
V.3 - Immobilisation à pH = 4,5 de la β-lactoglobuline sur la surface d’or
recouverte de Dext-Ad-COOH
Johnsson et coll.39 ont étudié l’immobilisation d’une protéine acide, la protéine A (pI =
5,1) sur une surface d’hydrogel de dextrane carboxyméthylé (Biacore). Les auteurs ont mis en
évidence que la quantité de protéine greffée sur la surface pouvait être largement augmentée
si la biomolécule était préalablement concentrée à proximité des sites actifs du dextrane, par
interactions électrostatiques entre les charges positives de la protéine et les groupements
COO- du polymère. Pour favoriser ce phénomène d’interactions électrostatiques, les auteurs
339
CHAPITRE IV
ont montré que la protéine devrait être dissoute dans un tampon de force ionique très faible
(10 mM) et dont le pH est inférieur au point isoélectrique de la biomolécule.
Ainsi, dans la présente étude, l’étape de greffage de la β-lactoglobuline (pI = 5,2-5,3)
sur le Dext-Ad-COOH sera testée dans un tampon acétate à 10 mM de pH = 4,5 de telle sorte
que la protéine chargée positivement dans ces conditions puisse se concentrer à proximité des
fonctions COO- (pKa = 3,3-4,5) portées par le dextrane.
a) Phénomène d’accumulation de la β-lactoglobuline à proximité du Dext-Ad-COOH par
mise en jeu d’interactions électrostatiques
Afin de donner un ordre de grandeur des interactions électrostatiques mises en jeu, une
solution de protéine à 1 mg/mL dans le tampon acétate de pH = 4,5 a été mise en circulation
pendant 15 minutes sur la surface d’or-MUA-β-CD-(Dext-Ad-COOH) puis un rinçage à l’eau
de 35 minutes a été effectué (Figure IV-31).
1 : β-CD-NH2
Réflectivité
2 : Ethanolamine
3 : Dext-Ad-COOH
0,7
Rinçage à l'eau
0,6
∆R>0
⇔
Fixation de la β-lactoglobuline
0,5
par interactions électrostatiques
4
1
0,4
0
2
50
3
100
150
Temps (min)
Figure IV-31 : Courbe de réflectivité relative à l’immobilisation de la β-lactoglobuline par interactions
électrostatiques sur la surface d’or-MUA-β
β-CD-(Dext-Ad-COOH). Conditions expérimentales : (1), (2) et
(3) Cf. Figure IV-29, (4) circulation d’une solution de β-lactoglobuline à 1 mg/mL dans un tampon acétate
à 10 mM de pH = 4,5 suivie d’un rinçage à l’eau de 35 min
340
CHAPITRE IV
L’augmentation de réflectivité observée après la circulation de la solution de la βlactoglobuline (à pH = 4,5) sur la surface d’or-MUA-β-CD-(Dext-Ad-COOH) suivie d’un
rinçage à l’eau confirme la présence des interactions ioniques attendues entre la protéine
chargée positivement et les fonctions COO- du polymère. La dispersion de la variation de
réflectivité (∆R) mesurées sur 100 plots virtuels de la surface après circulation de la protéine
et rinçage à l’eau est reportée sur la Figure IV-32.
Nombre de plots
15
10
5
0
7,6
8,0
8,4
8,8
9,2
9,6
10,0
10,4
10,8
∆ R (%)
Variations de réflectivité ∆R (%) mesurées après
passage de la β-lactoglobuline en solution dans un tampon acétate 10 mM de pH = 4,5
Médiane
9,15
Moyenne
9,07
Minimale-Maximale
7,3 – 10,5
σ/∆Rcentrale
0,07
Figure IV-32 : Dispersion de la variation de la réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots virtuels de la
surface après la circulation de la β -lactoglobuline pendant 15 min sur la surface d’or-MUA-β
β-CD-(DextAd-COOH) suivie d’un rinçage à l’eau.
La Figure IV-32 révèle que les interactions ioniques protéine/dextrane modifié sont
relativement importantes. En effet, après un rinçage de 35 min à l’eau, une variation de
réflectivité élevée pouvant atteindre 10,5 % est encore observée. Par ailleurs, le facteur de
dispersion donné par le rapport σ/∆Rcentrale étant assez faible, avec une valeur de 0,07, indique
341
CHAPITRE IV
que l’interaction électrostatique mise en jeu conduit à un recouvrement assez homogène du
polymère Dext-Ad-COOH par la protéine. Par la suite, ce phénomène devrait être favorable à
un greffage homogène de la protéine sur la surface.
En dernier lieu, une solution de rinçage permettant d’éliminer la protéine adsorbée sur
la surface par interactions ioniques a été recherchée. En effet, dans la suite de l’étude, une fois
l’étape de greffage terminée, la protéine fixée de façon non covalente à la surface devra être
éliminée. Deux solutions de rinçage ont été testées : une solution saline de NaCl à 1 M dans
l’eau (Figure IV-33) et un tampon PBS (à 10 mM en phosphate,2,7 mM de KCl et 0,137 M en
NaCl) de pH = 8.
1 : β-CD-NH2
Réflectivité
2 : Ethanolamine
3 : Dext-Ad-COOH
5 : NaCl
0,7
Rinçage à l'eau
0,6
5
0,5
∆R>0
⇔
Fixation de la β-lactoglobuline
par interactions électrostatiques
4
1
0,4
0
2
50
Elimination complète
de la β-lactoglobuline
3
100
150
Temps (min)
Figure IV-33 : Courbe de réflectivité relative à l’élimination de la β -lactoglobuline immobilisée sur la
surface d’or-MUA-β
β-CD-(Dext-Ad-COOH) par interactions électrostatiques. Conditions expérimentales :
(1), (2), (3) et (4) Cf. Figure IV-31, (5) circulation d’une solution de NaCl à 1 M dans l’eau suivie d’un
rinçage à l’eau
La réflectivité mesurée après le passage de la solution de NaCl et rinçage à l’eau étant
identique à celle observée avant la fixation de la β-lactoglobuline indique que la protéine
adsorbée sur le support a été totalement éliminée. Un résultat similaire a été obtenu avec une
solution de PBS à pH = 8. Ainsi, ces deux solutions pourront être utilisées par la suite, pour
éliminer la β-lactoglobuline immobilisée sur la surface de façon non spécifique.
342
CHAPITRE IV
b) Greffage à pH = 4,5 de la β-lactoglobuline sur la surface d’or recouverte de Dext-AdCOOH
Les trois étapes nécessaires au greffage de la protéine sur les fonctions COOH activées
du Dext-Ad-COOH ont été suivies par RPS (Figure IV-34). Tout d’abord, les fonctions
COOH du dextrane ont été activées en ester de NHS par une solution aqueuse d’un mélange
d’EDC/NHS. Puis, la β-lactoglobuline, en solution à 1 mg/mL dans un tampon acétate à 10
mM de pH = 4,5, est mise à circuler sur la surface pendant 15 minutes. Enfin, les fonctions
ester de NHS résiduelles n’ayant pas réagi sont désactivées par hydrolyse à l’aide d’un
tampon PBS de pH = 8. Cette dernière étape permet en même temps d’éliminer la βlactoglobuline adsorbée par liaisons ioniques à la surface.
1 : β-CD-NH2
Réflectivité
2 : Ethanolamine
3 : Dext-Ad-COOH
4 : NHS/EDC
6 : PBS, pH = 8
0,70
0,65
Rinçage à l'eau
0,60
6
0,55
∆R>0 ⇔ Fixation covalente + ionique
∆R>0 ⇔ Fixation covalente
0,50
0,45
4
1
0,40
0
2
50
5
3
100
150
200
Temps (min)
Figure IV-34 : Courbe de réflectivité relative à l’immobilisation de la β -lactoglobuline sur la surface d’orMUA-β
β-CD-(Dext-Ad-COOH) activée. Conditions expérimentales : (1), (2) et (3) Cf. Figure IV-29, (4)
circulation d’une solution d’EDC/NHS à 0,2 M / 0,05 M pendant 20 min suivie d’un rinçage à l’eau de 10
min, (5) circulation d’une solution de β-lactoglobuline à 1 mg/mL dans un tampon acétate à 10 mM de pH
= 4,5 pendant 15 min suivie d’un rinçage à l’eau de 10 min, (6) circulation d’un tampon PBS (à 10 mM en
phosphate, 2,7 mM de KCl et 0,137 M en NaCl) de pH = 8 pendant 30 min suivie d’un rinçage à l’eau
L’augmentation de réflectivité observée après circulation de la solution de βlactoglobuline sur la surface d’or-MUA-β-CD-(Dext-Ad-COOH) activée et rinçage à l’eau
343
CHAPITRE IV
reflète l’adsorption de la protéine sur la surface par interactions électrostatiques avec les
groupements COO- non modifiés du Dext-Ad-COOH et par formation de liaisons covalentes.
Le rinçage de la surface par le tampon PBS permet ensuite d’accéder à la variation de
réflectivité traduisant uniquement la fixation covalente de la β-lactoglobuline.
Le profil de la courbe de cinétique relative à la fixation de la β-lactoglobuline (Figure
IV-34) suggère que la quantité de protéine immobilisée au bout de 15 minutes de passage
pourrait être augmentée. Une nouvelle étude a donc été effectuée avec un temps de contact
protéine/surface de 2 heures. Par ailleurs, un temps de circulation beaucoup moins élevé, égal
à 5 minutes, a également été testé. Les quantités de β-lactoglobuline immobilisées sur la
surface en fonction du temps de circulation de la solution de protéine sont reportées sur la
Figure IV-35.
Réflectivités différentielles mesurées après immobilisation de la β-lacotglobuline
par
liaisons covalentes + interactions électrostatiques
liaisons covalentes
12
10
∆R
8
(%)
6
4
2
Pas de fixation
covalente
0
5 min
15 min
120 min
Durée de circulation de la β-lacotglobuline sur la surface (min)
Figure IV-35 : Evolution de la variation de réflectivité (∆R) (valeur médiane d’une série statistique de 100
plots) relative à la fixation de la β-lactoglobuline sur la surface d’or-MUA-β
β-CD-(Dext-Ad-COOH) activée
en fonction du temps de passage de la protéine sur la surface
Il apparaît qu’un temps de contact de 5 minutes entre la protéine et la surface n’est pas
suffisant pour établir une fixation stable par liaisons covalentes. Au bout de 15 minutes de
circulation de la β-lactoglobuline sur la surface, une variation de réflectivité médiane voisine
de 4,33 %, traduisant la fixation covalente de la protéine, est obtenue. Au bout de 120 minutes
de passage, la quantité de protéine greffée est augmentée avec une valeur médiane de ∆R
344
CHAPITRE IV
égale à 8,11 %. Ces pourcentages conduisent à une concentration surfacique de 0,87 et 1,62
ng/mm2 et à une concentration molaire de 24 et 45 fmol/mmol respectivement pour 15 min et
120 min de passage de la protéine.
L’absence de greffage de la β-lactoglobuline observée après 5 minutes de contact
protéine/surface peut s’expliquer par le fait que l’étude est effectuée dans un milieu
relativement acide (pH = 4,5) pour lequel la vitesse de couplage de la protéine est faible.
Néanmoins les variations de réflectivité observées à partir de 15 minutes de contact indiquent
que la réaction de greffage s’effectue quand même. En effet, la concentration locale élevée de
la protéine à proximité des sites actifs du dextrane ainsi que la durée de vie plus importante
des fonctions esters de NHS en milieu acide85 qu’à pH = 7,4 favorisent le couplage de la
protéine. D’autre part, la cinétique de fixation de la β-lactoglobuline apparaît plus rapide dans
les premières minutes de contact. En effet au bout de 15 minutes de circulation de la protéine,
la quantité de β-lactoglobuline immobilisée sur la surface est égale à la moitié de celle
obtenue après un temps huit fois plus important de 120 minutes. Ce phénomène a déjà été
observé pour la méthode A lors de l’immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la
couche de β-cyclodextrine. Le processus de fixation de la protéine est différent pour les deux
méthodes : la voie A est basée sur la formation de complexes d’inclusion alors que la voie B
met en jeu une réaction chimique. Néanmoins dans les deux cas, la surface se sature
progressivement en protéine et l’encombrement stérique qui en résulte entraîne alors un
ralentissement de la cinétique de fixation.
Les variations de réflectivité (∆R) mesurées sur 100 plots virtuels de la surface après
circulation de la protéine pendant 15 et 120 minutes puis rinçage au PBS de pH = 8, sont
reportées sur la Figure IV-36. Par ailleurs, les concentrations surfaciques et molaires calculées
à partir des valeurs médianes de ∆R ont été reportées dans le tableau de la Figure IV-36.
345
CHAPITRE IV
Nombre de plots
Nombre de plots
15
25
20
10
15
10
5
5
0
0
3,2
3,4
3,6
3,8
4,0
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
6,4
∆ R (%)
6,8
7,2
7,6
8,0
8,4
8,8
9,2
9,6
∆ R (%)
(a)
(b)
Variations de réflectivité ∆R (%) mesurées après
passage de la β -lactoglobuline en solution dans un tampon acétate 10 mM de pH = 4,5 pendant
(a) 15 min
(b) 120 min
Médiane
4,33
8,11
Moyenne
4,34
8,14
Minimale-Maximale
3,5 – 5,0
7,1 - 9,3
σ/∆Rcentrale
0,03
0,07
Γmassique (ng/mm2)
0,87
1,62
Γmolaire (fmol/mm2)
24
45
Figure IV-36 : Comparaison de la dispersion de la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots
virtuels (dispersés sur l’ensemble de la surface) après la circulation d’une solution de β-lactoglobuline
pendant 15 min et 120 min sur la surface d’or-MUA-β
β-CD-(Dext-Ad-COOH) activée suivie d’un rinçage
de la surface par du PBS pH = 8 pendant 30 min
Le rapport de disperion σ/∆Rcentrale relatif à la fixation covalente de la β-lactoglobuline
sur la surface d’or-MUA-β-CD-(Dext-Ad-COOH) activée, après 15 minutes de contact
protéine/surface, est très faible avec une valeur de 0,03. Ce résultat indique que la protéine se
fixe de façon uniforme à la surface. D’autre part, ce facteur de dispersion est inférieur aux
valeurs 0,09-0,12 obtenues après adsorption de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface
346
CHAPITRE IV
d’or-MUA-β-CD (Cf. Figure IV-24, paragraphe IV.2.2 de ce chapitre). Ce résultat pourrait
s’expliquer par le fait que la couche de Dext-Ad-COOH sur laquelle s’effectue le greffage de
la β-lactoglobuline est bien plus homogène que la couche de β-CD impliquée lors de
l’immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh. Par ailleurs, la comparaison des facteurs
de dispersion obtenus après 15 minutes et 120 minutes de contact protéine/support suggère
que la fixation d’une quantité plus importante de β-lactoglobuline sur la surface ne conduit
pas à une meilleure homogénéité de celle-ci. Enfin, les concentrations molaires de protéine
immobilisée suivant la méthode B apparaissent plus élevées par rapport à celles obtenues avec
la méthode A (Cf. Figure IV-24). Cette différence provient sans doute du fait que le dextrane
immobilisé dans la voie B présente plus de sites fonctionnels que les molécules de
cyclodextrine utilisées dans la voie A.
V.4 - Reconnaissance de la β-lactoglobuline immobilisée (méthode B) par
l’anti-β
β-lactoglobuline
La capacité de l’immunocapteur à fixer spécifiquement l’anti-β-lactoglobuline a été
étudiée. La solution de sérum utilisée pour cette étude ainsi que les conditions expérimentales
d’analyse sont identiques à celles de la première étude du biocapteur élaboré selon la voie A
(Cf. Paragraphe IV.3 de ce chapitre).
L’évolution de la réflectivité en fonction du temps a été suivie lors d’un passage de 20
minutes du sérum de lapin sur le biocapteur obtenu après deux heures de contact
protéine/surface (Figure IV-37).
347
CHAPITRE IV
1 : sérum
Réflectivité
0,48
0,47
∆R > 0
0,46
⇔
0,45
1
0
10
20
30
40
50
Temps (min)
Figure IV-37 : Courbe de réflectivité relative à l’adsorption de l’anticorps anti-β
β-lactoglobuline contenu
dans le sérum sur la surface de l’immunocapteur obtenu après deux heures de contact protéine/surface.
Le biocapteur est préalablement équilibré dans un tampon PBS/Tween/ASB. Conditions expérimentales :
(1) circulation pendant 20 min d’un sérum de lapin dilué au centième (soit 2 µg/mL d’anticorps spécifique
anti-β
β-lactoglobuline) dans un tampon PBS/Tween/ASB (tampon PBS de pH = 7,4 à 10 mM en phosphate,
2,7 mM de KCl, 0,137 M en NaCl et contenant du Tween à 1 ‰ (v/v) et de l’ASB à 1 % (m/m)), suivie d’un
rinçage au tampon PBS/Tween/ASB pendant 15 min.
L’augmentation du niveau de réflectivité après la circulation du sérum sur la surface
du biocapteur et rinçage au PBS/Tween/ASB (Figure IV-37) indique la fixation de l’anticorps
anti-β-lactoglobuline sur la surface. Par ailleurs, une étude identique a été effectuée sur une
surface d’or-MUA-β-CD-(Dext-Ad-COOH) activée qui avait été mise au contact de la βlactoglobuline pendant 5 min mais qui n’avait pas fixé de protéine du fait du temps de contact
trop court (Cf. Figure IV-35). Dans ce cas, aucune variation de réflectivité n’a été observée
après passage du sérum et rinçage de la surface. Ce résultat indique que l’adsorption de
l’anticorps observée sur la surface du biocapteur (Figure IV-37) est bien spécifique à la
présence de la β-lactoglobuline.
Les valeurs de réflectivités différentielles obtenues sur 100 plots virtuels de la surface
du biocapteur sont reportées sur la Figure IV-38.
348
CHAPITRE IV
Réflectivité différentielle après adsorption du sérum
et rinçage au PBS/Tween/ASB
Nombre de plots
2,5
2,0
20
(%) 1,5
15
1,0
10
0,5
5
∆R
0,0
0
0
20
40
60
80
100
1,2
1,4
1,6
Numéro du plot
1,8
2,0
2,2
∆ R (%)
1,92
Médiane
Moyenne
1,94
Minimale-Maximale
1,5 – 2,4
σ/∆Rcentrale
0,10
Figure IV-38 : Dispersion de la variation de la réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots virtuels
(dispersés sur l’ensemble de la surface) après la circulation d’un sérum contenant de l’anti-β
βlactoglobuline pendant 20 min sur la surface de l’immunocapteur obtenu après deux heures de contact
protéine/surface, suivie d’un rinçage au PBS/Tween/ASB
Le passage du sérum (composé de 2 µg/mL d’anti-β-lactoglobuline) pendant 20
minutes sur la surface du biocapteur suivi d’un rinçage au PBS/Tween/ASB conduit à une
variation de réflectivité (∆R) comprise entre 1,5 % et 2,4 %. Par ailleurs, la valeur assez faible
du rapport σ/∆Rcentrale montre que la quantité d’anticorps immobilisée sur la surface du
biocapteur est relativement homogène. Néanmoins, le facteur de dispersion mesuré dans le
cas présent est deux fois plus important par rapport à la valeur de 0,05 obtenue après passage
du sérum sur le premier type de biocapteur (voie A, Cf. Figure IV-26). Cette différence
pourrait s’expliquer par un problème de dynamique de flux à l’intérieur de la cuve du système
de RPS. En effet, un examen plus attentif de l’histogramme permet de révéler une périodicité
349
2,4
2,6
CHAPITRE IV
du signal, de 10 plots. Globalement, il semblerait que les plots n° (11, 12, 13), (21, 22, 23),…,
plots situés à proximité de l’entrée de la solution dans la cuve (Cf. Paragraphe I.4 de ce
chapitre), sont beaucoup plus sensibles au sérum que les plots numérotés 10, 20… situés à
l’opposé de cette entrée. Si l’on observe de près l’histogramme de la Figure IV-26 (Cf.
Paragraphe IV.3 de ce chapitre) relatif à la voie A, une périodicité du signal apparaît
également mais celle-ci est moins marquée que dans le cas présent. Ainsi, il existe sans doute
un effet du système sur la dispersion des mesures et celui ci semble plus important dans le cas
présent que lors de la première étude (voie A).
La valeur médiane de ∆R, égale à 1,92 %, conduit à un taux de recouvrement en anticorps de
0,38 ng/mm2, ce qui correspond à une concentration molaire de 2,5 fmol/mm2. La prise
d’anticorps observée sur le biocapteur saturé en β-lactoglobuline est donc relativement faible
par rapport à celle obtenue avec l’immunocapteur issu de la voie A (8 fmol/mm2, Cf.
Paragraphe IV.3 de ce chapitre), ce qui semble contradictoire avec l’importante quantité
d’allergène fixée sur la surface (Γmolaire = 45 fmol/mm2). Plus précisément, le rapport Γmolaire
allergène
/ Γmolaire
anticorps
pour la méthode B est égal à 18, ce qui indique qu’une molécule
d’allergène sur 18 lie l’anticorps. Il est alors possible que le greffage chimique de la protéine
sur le dextrane ait conduit à une perte de son activité fonctionnelle. Ce phénomène parait
néanmoins surprenant dans la mesure où la PEGylation de la β-lactoglobuline (voie A) ne
semble pas avoir affecté les propriétés de reconnaissance de l’allergène. Une autre hypothèse
pourrait expliquer la faible immobilisation de l’anticorps. En effet, l’encombrement stérique à
proximité de la surface augmente avec la quantité de β-lactoglobuline fixée sur le dextrane.
De ce fait, il est possible que l’importante quantité d’allergène immobilisée dans le cas
présent conduit à une proximité trop importante des molécules si bien que les épitopes
présents sur la protéine deviennent difficilement accessibles aux anticorps.
Afin de vérifier la vraisemblance de cette dernière hypothèse, la fixation de l’anticorps
sur la surface d’un biocapteur recouvert d’une quantité d’allergène moins importante (Γmolaire
= 24 fmol/mm2) a été étudiée suivant des conditions expérimentales identiques à celles
précédemment citées (Cf. Figure IV-37). Les paramètres caractéristiques de la variation de
réflectivité mesurée sur 100 plots de la surface sont reportés dans le Tableau IV-3.
350
CHAPITRE IV
Médiane
7,01
Moyenne
7,00
Minimale-Maximale
5,4 – 7,7
σ/∆Rcentrale
0,06
Tableau IV-3: Dispersion de la variation de la réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots virtuels
(dispersés sur l’ensemble de la surface) après la circulation d’un sérum contenant de l’anti-β
βlactoglobuline pendant 20 min sur la surface d’un immunocapteur de concentration molaire en allergène
(Γ
Γmolaire) égale à = 24 fmol/mm2, suivie d’un rinçage au PBS/Tween/ASB
La fixation d’anticorps sur la surface du biocapteur recouvert de 24 fmol/mm2 de
protéine se traduit par une variation de réflectivité médiane de 7,01 %, ce pourcentage
correspond à une concentration molaire en anti-β-lactoglobuline de 9,3 fmol/mm2. Cette
valeur est plus importante que celle déterminée précédemment pour le biocapteur constitué de
45 fmol/mm2 d’allergène (Cf. Figure IV-38). Le nouveau rapport Γmolaire allergène / Γmolaire anticorps
est égal à 2,58, ce qui indique qu’une molécule d’allergène sur 2 à 3 lie l’anticorps. Ce
résultat est donc en bon accord avec l’hypothèse posée précédemment qui suggère un
problème d’accessibilité des anticorps aux épitopes des molécules d’allergènes. Un
phénomène similaire a déjà été observé lors de l’interaction entre des monobrins d’ADN
puisque le rendement d’hybridation diminue quand la concentration surfacique d’ADN sonde
devient élevée87. Néanmoins, la confirmation de cette hypothèse nécessiterait de plus amples
études.
VI – Régénération de l’immunocapteur
VI.1 – Régénération de l’immunocapteur au niveau de la couche de βcyclodextrine
L’utilisation répétée de l’immunocapteur pourrait conduire à la perte de l’intégrité
fonctionnelle de l’allergène immobilisé. Il serait donc intéressant de pouvoir éliminer la
351
CHAPITRE IV
couche de β-lactoglobuline altérée et de la remplacer rapidement, sans être obligé de
reconduire l’élaboration de l’immunocapteur depuis la première étape.
Parmi les deux méthodes utilisées jusqu’à présent, la voie A permet de préparer un
immunocapteur en une seule étape à partir de la surface d’or-MUA-β-CD, par une circulation
de 15 minutes d’une solution de β-lactoglobuline sur la surface. L’élaboration d’un
immunocapteur à partir de la voie B nécessite un nombre d’étapes plus important : une couche
de Dext-Ad-COOH doit d’abord être immobilisée sur la surface d’or-MUA-β-CD, puis le
polymère doit être activé afin de pouvoir greffer la β-lactoglobuline et enfin, les fonctions
réactives résiduelles de la surface doivent être désactivées. Il apparaît clairement que la
méthode A est plus intéressante d’un point de vue temps. Ainsi, l’étude de la régénération de
l’immunocapteur au niveau de la couche de β-cyclodextrine a été effectuée uniquement pour
cette voie.
Des études antérieures menées par David59,88,89 ont montré qu’il était possible de
dissocier les complexes d’inclusion adamantyle / β-CD en utilisant une solution de SDS.
L’objectif de l’étude étant de dissocier les complexes d’inclusion formés entre les
groupements adamantyle portés par la β-lactoglobuline-PEG-AdPh et les cavités de
cyclodextrine immobilisées sur l’interface or-MUA-β-CD, une solution de SDS à 1 % en
masse dans l’eau a donc été utilisée pour rompre ces complexes et éliminer la protéine. Le
rinçage de la surface a été effectué pendant 15 minutes (Figure IV-39, partie gauche de la
courbe).
La réflectivité mesurée après le passage de la solution de régénération est légèrement
inférieure à celle observée avant la fixation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh. Ceci suggère la
complète élimination de la couche d’allergène et peut-être même la désorption d’impuretés
présentes sur la surface.
Afin de contrôler la qualité de la régénération de la surface du biocapteur, une
nouvelle circulation de protéine a été effectuée sur la surface or-MUA-β-CD supposée
régénérée (Figure IV-39, partie droite de la courbe).
352
CHAPITRE IV
∆R > 0
⇔
Réflectivité
1 : PBS/Tween
2 : β-lactoglobuline-PEG-AdPh
3 : PBS/Tween
4 : eau
5 : SDS
6 : eau
Adsorption de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh
3
3
0,56
4
4
0,54
0,52
2
2
0,50
6
6
0,48
0,46
5
5
Régénération complète
de l'interace de complexation
0,44
1
1
0,42
0
20
40
60
80
100
120
140
Temps (min)
Figure IV-39 : Courbe de réflectivité relative à la régénération de la surface d’or-MUA-β
β-CD après
immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh suivie d’un nouveau cycle d’adsorption de la protéine
modifiée. Conditions expérimentales : (1) circulation sur la surface d’un tampon PBS/Tween (tampon PBS
de pH = 7,4 à 10 mM en phosphate, 2,7 mM de KCl, 0,137 M en NaCl et contenant du Tween à 1 ‰ (v/v)),
pendant 10 min, (2) circulation d’une solution de β -lactoglobuline-PEG-AdPh à 1 mg/mL dans le tampon
PBS/Tween pendant 15 min, (3) rinçage au PBS/Tween pendant 10 min, (4) rinçage à l’eau pendant 10
min, (5) régénération de la surface par rinçage avec une solution de SDS à 1 % en masse dans l’eau
pendant 15 min, (6) rinçage à l’eau pendant 10 min
Les courbes de réflectivité relatives aux deux cycles successifs d’immobilisation de la
β-lactoglobuline-PEG-AdPh sont légèrement différentes : il semblerait que la quantité
d’allergène adsorbée sur le support régénéré soit plus importante par rapport à celle obtenue
lors du premier passage de la protéine. Les valeurs de réflectivités différentielles déterminées
pour les 100 plots virtuels de la surface au cours de cette étude ont été comparées dans le
Tableau IV-4 aux valeurs obtenues lors du premier cycle d’adsorption de la protéine.
353
CHAPITRE IV
Variations de réflectivité ∆R (%) mesurées après deux passages successifs
de β -lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface or-MUA-β-CD
1er passage
2ème passage
Médiane
2,56
3,57
Moyenne
2,57
3,57
Minimale-Maximale
2,0 - 3,2
3,0 - 4
σ/∆Rcentrale
0,12
0,06
Tableau IV-4 : Variations de réflectivité ∆R (%) déterminées sur 100 plots virtuels de la surface après
deux cycles d’immobilisation de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh sur la surface d’or-MUA-β
β-CD.
Conditions expérimentales : identiques à celles de la Figure IV-39
Il apparaît que la fixation de la protéine sur le support or-MUA-β-CD régénéré est plus
importante comparativement à celle de la première immobilisation. Ce résultat suggère que le
nombre de cavités de β-CD accessibles sur le support or-MUA-β-CD régénéré est plus
important que celui relatif au support initial. En effet, il est possible que l’utilisation du SDS
ait conduit à libérer des cavités de cyclodextrine initialement occupées par des produits de
synthèse utilisés lors de la réaction d’amination de la β-CD. Un tel phénomène avait d’ailleurs
été constaté lors de la régénération du support chromatographique de type hydrophobe (Cf.
Chapitre III, paragraphe II.6). Cette hypothèse pourrait par ailleurs expliquer la meilleure
homogénéité de surface observée lors du deuxième cycle de fixation de la β-lactoglobulinePEG-AdPh. Une seconde hypothèse pourrait également expliquer l’adsorption plus
importante de l’allergène sur la surface régénérée. Il est possible que le rinçage à l’eau de 10
minutes après la régénération de la surface par le SDS (étape 6 sur la Figure IV-39) ne soit
pas suffisamment long pour permettre un relargage complet des molécules de tensioactif.
Ainsi, lors du second cycle d’adsorption de la β-lactoglobuline-PEG-AdPh, celle-ci pourrait
interagir de façon non spécifique avec les molécules de SDS encore présentes à la surface, ce
qui provoquerait une augmentation de la quantité de protéine adsorbée.
Pour vérifier cette dernière hypothèse, la fixation non spécifique de la β-lactoglobuline
native sur une surface d’or-MUA-β-CD préalablement traitée au SDS et rincée à l’eau a été
mesurée. Pour ce faire, une solution de β-lactoglobuline (à 1 mg/mL dans le tampon
PBS/Tween) a été mise en circulation pendant 15 minutes sur une surface d’or-MUA-β-CD
préalablement rincée pendant 15 minutes avec une solution de SDS (à 1 % en masse dans
354
CHAPITRE IV
l’eau) puis 10 minutes à l’eau. Les valeurs de ∆R mesurées dans ces conditions, sur 100 plots
de la surface après rinçage à l’eau, varient entre 0 et 0,2 %. Les valeurs observées sont
identiques à celles obtenues sur une surface d’or-MUA-β-CD non traitée au SDS (Cf. Tableau
IV-1). Ce résultat indique qu’il n’existe pas d’interaction non spécifique protéine/SDS et
confirme qu’un rinçage de 10 min à l’eau est suffisant pour éliminer totalement les molécules
de tensioactif.
VI.2 – Régénération de l’immunocapteur au niveau de l’antigène βlactoglobuline
La régénération de l’immunocapteur au niveau de l’antigène β-lactoglobuline a été
étudiée sur les deux systèmes analytiques, élaborés selon les procédés A et B. Dans la suite de
ce travail, les résultats obtenus pour les deux types de biocapteurs seront présentés en
parallèle.
Une solution de tampon glycine à 0,1 M et de pH = 2,1 utilisée pour la régénération du
support chromatographique d’immunoaffinité (Cf. Chapitre III, paragraphe III.3.3) a de
nouveau été choisie pour rompre les liaisons de forte affinité antigène-anticorps. Le traitement
de la surface a été effectué pendant 15 minutes sur les deux types de biocapteur (Figure IV40, partie gauche de la courbe, étape 5).
355
CHAPITRE IV
∆R > 0
⇔
Réflectivité
0,65
1 : PBS/Tween/ASB
2 : sérum
3 : PBS/Tween/ASB
4 : eau
5 : glycine
6 : eau
3
3
4
4
0,60
2
2
0,55
5
5
6
0,50
0,45
6
du biocapteur
1
1
0
50
100
Immunocapteur
Méthode A
150
200
Temps (min)
∆R > 0
⇔
Réflectivité
3
1 : PBS/Tween/ASB
2 : sérum
3 : PBS/Tween/ASB
4 : eau
5 : glycine
6 : eau
3
0,48
4
4
0,46
2
2
0,44
0,42
0,40
6
6
0,38
5
0,36
5
1
0,34
du biocapteur
1
0,32
0
Immunocapteur
Méthode B
50
100
150
200
Temps (min)
Figure IV-40 : Courbe de réflectivité relative à la régénération de la surface de l’immunocapteur après
adsorption de l’anti-β
β-lactoglobuline suivie d’un nouveau cycle d’adsorption de l’anticorps. Conditions
expérimentales : (1) circulation d’un tampon PBS/Tween/ASB (tampon PBS de pH = 7,4 à 10 mM en
phosphate, 2,7 mM de KCl, 0,137 M en NaCl et contenant du Tween à 1 ‰ (v/v) et de l’ASB à 1 % (m/m)),
pendant 15 min, (2) circulation d’un sérum de lapin dilué au centième dans le tampon PBS/Tween/ASB
356
CHAPITRE IV
pendant 20 min, (3) rinçage au PBS/Tween/ASB pendant 15 min, (4) rinçage à l’eau pendant 15 min, (5)
régénération de la surface par rinçage avec un tampon glycine 0,1 M de pH = 2,1 pendant 15 min, (6)
rinçage à l’eau pendant 15 min,
La réflectivité mesurée sur les deux types d’immunocapteurs après le passage du
tampon de régénération étant identique à celle observée avant la fixation de l’anti-βlactoglobuline suggère le relargage complet de l’anticorps.
La qualité de cette régénération a été étudiée en faisant circuler sur la surface supposée
régénérée des biocapteurs une nouvelle solution de sérum (Figure IV-40, partie droite de la
courbe), dans des conditions expérimentales identiques à la première étude d’adsorption du
sérum.
Sur les deux types d’immunocapteurs, les courbes de réflectivité relatives aux deux
cycles successifs de sérum semblent parfaitement reproductibles. Afin de quantifier ce résultat
sur l’ensemble de la surface, les valeurs de réflectivités différentielles obtenues sur les 100
plots virtuels de la surface ont été comparées sur la Figure IV-41 aux valeurs observées après
la première étude d’adsorption du sérum.
Réflectivité différentielle après adsorption du sérum et rinçage au PBS/Tween/ASB
Immunocapteur
Méthode A
er
1 passage
ème
2 passage
6
∆R
5
(%)
4
3
Immunocapteur
Méthode B
2
1 passage
ème
2 passage
er
1
0
20
40
60
Numéro du plot
357
80
100
CHAPITRE IV
Variations de réflectivité ∆R (%) mesurées après deux passages successifs
d’anti-β -lactoglobuline sur la surface du biocapteur
Immunocapteur Méthode A
1er passage
2ème passage
Médiane
5,75
5,72
Moyenne
5,73
5,73
Minimale-Maximale
5,0 – 6,7
5,0 – 6,8
σ/∆Rcentrale
0,05
0,06
Immunocapteur Méthode B
1er passage
2ème passage
Médiane
1,92
1,93
Moyenne
1,94
1,95
Minimale-Maximale
1,5 – 2,4
1,6 – 2,4
σ/∆Rcentrale
0,10
0,11
Figure IV-41 : Comparaison de la variation de réflectivité ∆R (%) observée sur 100 plots virtuels de la
surface après deux passages successifs d’un sérum contenant l’anticorps anti-β
β-lactoglobuline sur la
surface de l’immunocapteur saturé en β-lactoglobuline (méthode A) et obtenu après deux heures de
contact protéine/surface (méthode B)
Les variations de réflectivité ∆R (%) mesurées sur les deux types de biocapteurs après les
deux passages successifs d’anti-β-lactoglobuline sont très proches et indiquent que les prises
d’anticorps sont reproductibles sur l’ensemble de la surface. L’écart relatif sur la valeur de ∆R
entre le premier et le deuxième passage de sérum a été calculé pour les 100 plots. Un écart
médian de 0,96 % ainsi qu’un écart moyen de 1,38% ont été déterminés pour
l’immunocapteur préparé selon la méthode A et un écart médian de 2,02 % ainsi qu’un écart
moyen de 2,34 % pour l’immunocapteur issu de la voie B. Ces faibles différences conduisent
à plusieurs conclusions : (i) le tampon glycine permet la régénération complète de la surface
du biocapteur, (ii) l’acidité du tampon de régénération n’a pas affecté l’intégrité fonctionnelle
de la β-lactoglobuline et (iii) la surface élaborée est chimiquement stable dans les conditions
expérimentales mises en jeu, ce qui permet une bonne reproductibilité des prises d’anticorps.
358
CHAPITRE IV
VII – Comparaison des deux voies d’élaboration de
l’immunocapteur
Les principaux résultats obtenus lors de l’élaboration et de l’évaluation de l’activité
biologique de l’immunocapteur selon les deux voies de préparation envisagées sont reportés
dans le Tableau IV-5. Ce tableau résume les temps de contact utilisés pour immobiliser les
différents composés mis en jeu et donne les prises de réflectivités (∆R) médianes observées
après leur fixation sur la surface ; les paramètres de dispersion sur les mesures de ∆R y sont
également reportées ainsi que les taux de recouvrement molaire en protéine.
Méthode A
Méthode B
β-CD-NH2
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
1,04 %
0,44
30 min
Dext-Ad-COOH
20 min
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
4,16 %
0,04
β-lactoglobuline-PEG-AdPh (pH = 7,4)
β-lactoglobuline (pH = 4,5)
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
2,56 %
0,12
4,33 %
0,03
15 min
105 min
15 min
Γmolaire
Γmolaire
11 fmol/mm2
24 fmol/mm2
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
5,61 %
0,09
120 min
Γmolaire
24 fmol/mm
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
8,11 %
0,07
Γmolaire
2
45 fmol/mm2
(valeur approximative)
359
CHAPITRE IV
Anti-β -lactoglobuline
Utilisation de l’immunocapteur constitué de
24 fmol/mm2 de β-lactoglobuline
24 fmol/mm2 de β-lactoglobuline
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
∆R médiane
σ/∆Rcentrale
5,75 %
0,05
7,01 %
0,06
20 min
20 min
Γmolaire
Γmolaire
2
8 fmol/mm
9,3 fmol/mm2
Γmolaire allergène / Γmolaire anticorps
Γmolaire allergène / Γmolaire anticorps
3,00
2,58
Tableau IV-5 : Comparaison des deux voies d’élaboration du biocapteur
Les deux voies d’élaboration du biocapteur partent d’une surface commune d’or
recouverte de β-cyclodextrine qui apparaît assez hétérogène. Si l’on compare l’élaboration de
l’immunocapteur à partir de cette surface, le procédé A semble plus rapide et plus simple que
le procédé B puisqu’il permet l’immobilisation d’allergènes préalablement modifiés en une
seule étape contre quatre étapes pour la voie B (immobilisation du dextrane – activation –
immobilisation de la protéine - désactivation).
Cependant, l’utilisation du procédé B met en jeu un polymère de dextrane qui recouvre
de façon homogène la surface et qui conduit à un greffage ultérieur de la protéine plus
homogène que celui obtenu par la voie A. D’autre part, la capacité de fixation en allergènes
de la surface recouverte de dextrane (voie B) est plus importante que celle offerte par la
surface recouverte de β-cyclodextrine (voie A). Cette différence s’explique sans doute par
l’utilisation d’un dextrane qui par sa haute fonctionnalité (environ 60 % de fonctions actives)
et la flexibilité de ses chaînes offre un accès privilégié à la protéine comparativement à la
surface « plus rigide » de β-cyclodextrine. Néanmoins, comme expliqué au paragraphe V.4 de
ce chapitre, la saturation de la surface en allergènes ne se traduit pas obligatoirement par une
capture maximale de l’anticorps correspondant.
Les biocapteurs issus des deux voies A et B et constitués d’une quantité d’allergène
similaire ont permis une détection comparable de l’anticorps, avec un rapport Γmolaire allergène /
Γmolaire anticorps proche dans les deux cas.
Enfin, contrairement à la voie B, la voie A est difficilement compatible avec
l’élaboration d’une puce à protéines contenant une centaine d’allergènes différents car elle
360
CHAPITRE IV
implique de modifier préalablement chacun de ces allergènes avant leur immobilisation. C’est
essentiellement pour cette raison que la voie B doit être privilégiée dans la suite du projet
d’élaboration des puces à allergènes.
VII – Conclusion
Un immunocapteur a pu être élaboré par une chimie de surface impliquant la
formation de complexes d’inclusion entre des cavités de β-cyclodextrine et des molécules
modifiées par des groupements hydrophobes. Deux voies de préparation ont été utilisées. La
première (voie A) a consisté à immobiliser un allergène, préalablement modifié par des
groupements hydrophobes, sur une surface recouverte de β-cyclodextrine grâce à la formation
de complexes d’inclusion. Dans la seconde (voie B), un dextrane fonctionnalisé a été
immobilisé sur une surface recouverte de β-cyclodextrine par formation de complexes
d’inclusion, puis l’allergène a été greffé sur les fonctions réactives du dextrane.
L’homogénéité des surfaces a été étudiée pour les deux voies de préparation après chaque
étape du procédé d’élaboration de l’immunocapteur. Bien que la surface de départ (or-MUA-
β-CD) soit hétérogène, les deux méthodes permettent d’obtenir des dépôts de protéine
relativement homogènes. D’autre part, les conditions opératoires permettant une fixation
spécifique et optimale de la β-lactoglobuline ont été déterminées. En particulier, il a été
montré que l’immobilisation de l’allergène selon la voie A devait être réalisée en présence de
Tween 20 (pH = 7,4) afin d’éliminer la fixation non spécifique de la protéine. Par ailleurs, la
fixation de la β-lactoglobuline suivant la voie B nécessite de préconcentrer la protéine à
proximité du dextrane fonctionnalisé, par interactions électrostatiques, afin de favoriser la
réaction de greffage de l’allergène sur les fonctions activées du dextrane. Pour cela, le
couplage a été effectué à un pH de 4,5 inférieur au pI de la protéine et dans un tampon de
faible force ionique. Pour les deux procédés étudiés, l’immobilisation de la protéine semble
assez rapide puisqu’un temps de contact de 15 minutes permet de fixer près de la moitié de la
quantité maximale. Par ailleurs, il n’est pas nécessaire de saturer la surface en βlactoglobuline car cela peut entraîner des problèmes d’accessibilité des anticorps aux épitopes
des molécules d’allergènes.
361
CHAPITRE IV
Les immunocapteurs élaborés selon ces deux voies ont permis la capture spécifique
d’anticorps présents dans un sérum de lapin démontrant ainsi que la β-lactoglobuline
immobilisée selon chacune des deux voies pouvait être reconnue par les anticorps
correspondants. Des études complémentaires pourraient être menées pour améliorer la
quantité d’anticorps immobilisée. Notamment, l’évolution de la quantité d’anticorps capturée
en fonction de la quantité d’allergène fixée sur la surface de l’immunocapteur pourrait être
étudiée.
En conclusion, les deux méthodes décrites dans ce travail semblent répondre aux
contraintes relatives à l’élaboration d’un immunocapteur : elles sont relativement simples à
mettre en œuvre, peu coûteuses, conduisent à des surfaces stables dans les conditions
d’utilisation du biocapteur et permettent une interaction spécifique entre la β-lactoglobuline et
l’anticorps contenu dans un sérum. Cependant, la voie impliquant un polymère de dextrane
parait mieux adaptée à l’élaboration de systèmes analytiques plus élaborés de type puces à
allergènes puisqu’elle ne nécessite pas de modifier les protéines. La prochaine étape
consistera à optimiser les conditions de dépôt de β-lactoglobuline sur la surface et à élargir la
méthode à d’autres allergènes. Par la suite, il sera intéressant de mener des études de cinétique
afin de déterminer l’affinité des allergènes pour les anticorps correspondants.
362
CHAPITRE IV
363
CHAPITRE IV
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES DU CHAPITRE IV
364
CHAPITRE IV
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
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(34)
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(36)
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(38)
(39)
(40)
(41)
(42)
(43)
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(51)
(52)
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(63)
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(65)
(66)
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367
368
369
CONCLUSION GENERALE
CONCLUSION GENERALE
370
CONCLUSION GENERALE
Les propriétés d’inclusion des cyclodextrines vis-à-vis des composés hydrophobes
sont connues de longue date et ont donné lieu à divers types d’applications en solution
(vectorisation et contrôle de la libération de principes actifs, augmentation de la solubilité, de
la stabilité et de la biocompatibilité de médicaments). Mise à part l’utilisation de supports
chromatographiques chiraux et de « tissus intelligents » modifiés par la cyclodextrine, la
formation de complexes d’inclusion aux interfaces a été peu exploitée à ce jour. L’objectif de
ce travail a été de montrer qu’après traitement par de la β-cyclodextrine, les propriétés d’une
surface (silice, or) pouvaient être modifiées par simple contact avec une solution de polymère
ou de protéine portant des groupements adamantyle.
Pour effectuer cette étude, différents types de molécules invitées ont été synthétisées :
(i) des dextranes possédant des groupements adamantyle et diverses fonctionnalités telles que
des fonctions DEAE, des fonctions COOH, des chaînons alkyle en C8 ou encore des
molécules d’intérêt biologique telles que des anticorps et (ii) un allergène, la β-lactoglobuline,
modifiée par des groupes adamantyle.
Le système associatif adamantane/β-cyclodextrine a été sélectionné du fait de la forte
affinité de l’adamantante pour les cavités de β-cyclodextrine. En particulier, des études
antérieures menées par CLHP avaient montré qu’un polymère modèle de poly(éthylène
glycol) modifié par un groupement adamantyle en extrémité de chaîne (MPEG-AdPh) ne
pouvait être élué hors d’une colonne de silice greffée par un polymère de β-cyclodextrine
(silice-polyβ-CD) qu’après addition dans la phase mobile d’un agent compétiteur (HP-β-CD).
Des études théoriques plus poussées ont été menées afin de déterminer l’affinité de ces
polymères modèles (MPEG-AdPh) vis-à-vis de la β-cyclodextrine. Pour cela, des méthodes
d’électrophorèse capillaire d’affinité (ACE) et de chromatographie liquide à haute
performance (CLHP), généralement appliquées à l’analyse de petites molécules ou de
macromolécules biologiques, ont été mises en œuvre. Ces deux techniques ont permis
d’accéder aux constantes en solution avec un bon accord entre les valeurs déterminées.
D’autre part, l’utilisation pour l’étude CLHP d’un support de silice-polyβ-CD a permis de
déterminer l’affinité des complexes à l’interface solide / liquide et a mis en évidence une
interaction relativement élevée dans ces conditions.
371
CONCLUSION GENERALE
La faisabilité d’un procédé d’immobilisation basé sur la formation de complexes
d’inclusion pour la modification des propriétés de surface a été étudiée par une méthode
chromatographique. Pour cela, différents polymères ont été immobilisés sur un support de
silice-polyβ-CD de porosité 30 et 400 nm. Les polymères utilisés pour cette étude sont des
dextranes modifiés d’une part par des groupements adamantyle afin de permettre leur fixation
sur le support de β-cyclodextrine et d’autre part, par diverses fonctionnalités telles que des
sites ioniques ou hydrophobes ou encore par des molécules biologiques telles que des
anticorps. Nous avons montré que le procédé d’immobilisation des polymères était rapide et
pouvait être réalisé dans des conditions douces (température ambiante, solution aqueuse). La
fixation des différents dextranes a été vérifiée par l’analyse des propriétés de surface des
supports obtenus. Pour cela, des protéines de différentes natures (acides, basiques, à caractère
hydrophobe ou des antigènes) ont été injectées sur les phases stationnaires ainsi obtenues.
L’étude de l’évolution de leur rétention en fonction de la composition de la phase mobile (cas
des protéines acides, basiques et hydrophobes) ou l’étude de leur capture par le support (cas
des antigènes) a permis de révéler des propriétés de surface de type ionique, hydrophobe ou
encore immunoadsorbante. Ces travaux ont donc permis de confirmer la présence des
différents dextranes sur le support et ont démontré la faisabilité d’une chimie de surface basée
sur la formation de complexes d’inclusion aux interfaces pour la fonctionnalisation de
supports. Par ailleurs, ces études ont montré la stabilité en milieux aqueux des matériaux
obtenus ainsi que la possible réversibilité des complexes formés.
Parallèlement, les surfaces élaborées ont pu être utilisées pour l’application de
modèles chromatographiques théoriques décrivant la rétention des protéines en fonction de la
composition de la phase mobile. Ainsi, l’application de ces modèles aux supports d’échange
d’ions a permis de déterminer le nombre de charges de la protéine mises en jeu dans le
processus d’adsorption-désorption avec la phase stationnaire et a conduit à des résultats en
bon accord avec ceux de la littérature. Sur le support d’interaction hydrophobe, ces modèles
ont permis d’accéder à l’aire de contact hydrophobe entre des protéines injectées et la phase
stationnaire. Bien que la chimie de surface n’ait pas été optimisée, les supports élaborés
peuvent être utilisés sous leur forme actuelle comme phase stationnaire en CLHP. En
particulier, l’échangeur de cations et le support hydrophobe ont permis la séparation de
mélanges de protéines. Néanmoins, les pics de solutés obtenus sont relativement larges du fait
de problèmes de diffusion des protéines dans les pores de 30 nm et du fait de la présence de
sites d’interactions non spécifiques sur le support. Ces sites secondaires sont dus
essentiellement à la présence de l’agent de couplage utilisé lors de la synthèse de la silice372
CONCLUSION GENERALE
polyβ-CD. Il serait donc intéressant de tester des supports de porosité plus élevée et de
développer un nouveau procédé de greffage du polymère de β-CD sur la silice pour améliorer
l’efficacité des colonnes de CLHP classique. Il faut souligner que du fait de sa facilité de mise
en œuvre, le procédé de fonctionnalisation des surfaces par mise en jeu de complexes
d’inclusion pourrait par la suite être appliqué à l’élaboration de microsystèmes analytiques.
Dans la dernière partie de ce travail, le procédé particulier d’immobilisation basé sur
les complexes d’inclusion a été mis en œuvre sur une surface plane recouverte d’or pour
élaborer un immunocapteur permettant la détection d’anticorps anti-allergène. Pour ces
travaux préliminaires effectués dans le cadre d’un Programme CNRS interdisciplinaire
(Protéomique et génie des protéines), la β-lactoglobuline a été choisie comme allergène
modèle. Les différentes étapes de l’élaboration de cet immunocapteur ainsi que les tests de
reconnaissance biologique ont été suivis en temps réel par une méthode optique de résonance
des plasmons de surface (RPS).
Deux procédés d’immobilisation de la β-lactoglobuline sur une surface d’or recouverte
de β-cyclodextrine ont été utilisés. Les résultats obtenus semblent montrer que les deux
méthodes sont équivalentes en termes d’homogénéité de surface, de reconnaissance des
anticorps anti-β-lactoglobuline contenus dans un sérum de lapin et de spécificité de
l’interaction anticorps / antigène. Cependant, la première méthode qui nécessite de modifier
l’allergène par des bras de PEG possédant une extrémité adamantyle semble peu adaptée à
une configuration de type « puces à allergènes ». La modification d’un nombre élevé
d’allergènes est en effet une contrainte que la deuxième méthode permet d’éviter. Par ailleurs,
bien que ce problème n’ait pas été rencontré dans le cas de la β-lactoglobuline, il est possible
que certains allergènes perdent leurs propriétés de reconnaissance après modification. Pour la
suite du projet, il sera donc préférable de privilégier la seconde voie qui consiste à recouvrir la
surface d’or par une couche de dextrane carboxyméthylé. Les conditions permettant un dépôt
optimal de microplots d’allergènes devront être déterminées. En particulier, le pH et la
concentration du tampon servant à préparer les solutions d’allergène, la concentration de
l’allergène et le temps de réaction seront des paramètres à étudier.
En conclusion, ce travail de thèse a permis de démontrer que le système adamantane /
β-cyclodextrine pouvait être utilisé pour fonctionnaliser des surfaces du fait de sa rapidité de
mise en œuvre et de la stabilité des dépôts obtenus. Il présente les mêmes avantages que le
373
CONCLUSION GENERALE
couple avidine / biotine et permet de plus une régénération des surfaces après utilisation. Il
semble être un candidat intéressant pour le développement de microsystèmes analytiques.
374
375
ANNEXES EXPERIMENTALES
376
ANNEXE 1
SYNTHESE DU POLYMERE DE β-CYCLODEXTRINE
Réactifs nécessaires
•
β-cyclodextrine (Roquette)
•
Solution de soude à 33% en masse (Aldrich)
•
Epichlorhydrine (Aldrich)
•
Solution d’acide chlorhydrique 6N
•
Acétone (SDS)
•
Eau
Principe de la synthèse
La synthèse du polymère de β-cyclodextrine (polyβ-CD) consiste en une
polycondensation entre le « monomère » de β-cyclodextrine et le monomère d'épichlorhydrine
en milieu alcalin. Le schéma réactionnel suivant met en évidence l’ensemble des réactions
secondaires pouvant intervenir lors de cette copolymérisation.
377
Cl +
O
(4)
HO
H2C
O
HO
HO
H2 C
(1)
O
O
HO
OH
OH
-
O
O
HO
O
O
CH2 CH CH2 Cl
OH
CH2 CH CH2
O
H2O
(4)
H2 O
HO
H 2C
HO CH2 CH CH2 OH
HO
H2 C
OH
(3)
O
OH
O
Cl
CH2 CH CH2 OH
OH
O
suivi de H2O
Cl
(5)
O
suivi de H2O
HO CH2 CH CH2 O CH2 CH CH2 OH
OH
O
HO
O
O
HO
(5)
HO
H2C
(2)
O
OH
HO
H2C
O
HO
O
HO
H2C
O
CH2
HO
H2 C
O
HO
O
CH CH2 O
OH
O
OH
O
O
CH2 CH CH2 O CH2 CH CH2 OH
OH
OH
La réaction s’effectuant dans un milieu fortement alcalin, les fonctions alcools de la
cyclodextrine sont sous forme déprotonée et conduisent à une attaque nucléophile et à une
ouverture du cycle époxyde (les OH portés par le C2 étant plus acides que les autres doivent
réagir en priorité) (réaction 1). La chlorhydrine ainsi formée se trouvant dans un milieu alcalin
se réarrange immédiatement pour reformer un cycle époxyde (réaction 2). Cet époxyde peut
alors réagir avec une deuxième molécule de cyclodextrine (réaction 3) ou s’hydrolyser en
présence d’eau (réaction 4). Dans ce dernier cas, les fonctions alcool résultantes peuvent
réagir avec de nouveaux cycles époxydes (réaction 5) et conduire à la formation de séquences
plus ou moins longues de poly(2-hydroxypropyl)éther libres à une extrémité, ou bien jouant le
rôle de pontages entre plusieurs CDs.
La polymérisation étant relativement lente, un bon contrôle de l’avancement de la
réaction est possible mais ce contrôle reste délicat car les paramètres expérimentaux
(dimension du réacteur, vitesse d'agitation, concentration de la soude) influent sur la
prédominance des différents types de réactions. D’autre part, au delà d’un certain degré de
polymérisation, la polyfonctionnalité des β-cyclodextrines entraîne une réticulation
378
conduisant à des gels insolubles. De ce fait, un arrêt de la polycondensation doit être effectué
avant la gélification du système.
Mode opératoire
200g (0,176mol) de β-cyclodextrine sont introduits dans un réacteur préalablement
thermostaté à 33°C. Une agitation mécanique de 300 tours/min est alors déclenchée avant
d’ajouter 320mL d’une solution de soude à 33% minimum en masse. Le milieu réactionnel est
conservé dans les mêmes conditions (agitation de 300 tours/min à 33°C) toute une nuit. Le
lendemain, 97mL (1,237 mol) d’épichlorhydrine (EP) sont ajoutés au mélange avant de porter
la vitesse de rotation du réacteur à son maximum (680 tours/min). La polycondensation est
stoppée avant la gélification du mélange au bout d’1h45min par l’ajout de 320mL d’acétone
au mélange suivi d’une agitation de 5min (toujours à 680 tours/min). Le mélange réactionnel
est ensuite transvasé dans un bécher et 400mL d’eau distillée y sont ajoutés avant de
neutraliser la solution en deux temps. Tout d’abord, le pH de la solution est ajusté aux
alentours de 10,4 (à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique 6N) et le mélange est
maintenu sous agitation pendant 24h dans un bain thermostaté à 50°C afin de stabiliser la
solution (le pH de la solution s’équilibre à une valeur proche de 9,4). Dans un second temps,
la solution est neutralisée en ajustant le pH à 7. Le mélange est ensuite purifié par
ultrafiltration tangentielle sur système Pellicon avec une membrane en cellulose régénérée
(Pellicon 2) de seuil de coupure 10000. Le copolymère est finalement récupéré par
lyophilisation.
Caractérisation par RMN du proton
Le spectre de RMN du proton relatif au copolymère β-CD/EP en solution dans de
l’eau deutérée (D2O) ainsi que les attributions des différents signaux et leurs déplacements
chimiques sont donnés sur la figure ci-dessous :
379
autres protons
1
H anomériques H(1)
1
2
N° pic
Déplacement (ppm)
Multiplicité
Attribution
1
5,05
Singulet large
H anomérique
2
3,7
Multiplet
Autres protons de la β-CD
et protons de l'EP
Le spectre de RMN renseigne sur la composition du copolymère : en effet, la
comparaison des signaux permet d’accéder au nombre moyen de cavités de β-CD par chaîne
de copolymère et au nombre moyen de greffons EP par cavité de β-CD. Soit x et y les
proportions molaires respectives de la β-CD et de l’EP dans le copolymère, les intégrations I1
et I2 respectives des pics 1 et 2 sont alors définies par :
I1 = 7x
I2 = 7*6x + 5y
Le pourcentage massique de β-CD dans le copolymère est alors donné par la relation
suivante :
% massique β − CD =
m βCD
m βCD + m EP
× 100 =
x M β −CD
x M β −CD + y M EP
× 100
avec M β-CD = 1135g.mol-1 et M EP = 58g.mol-1 (masse du motif EP).
380
Le nombre moyen de cavités de β-CD par chaîne de polymère peut ensuite être déterminé par
l’égalité suivante :
Nb cavité de β − CD / chaîne de polymère = M n *
381
% massique β − CD
M β −CD
ANNEXE 2
SYNTHESE DE LA β-CD AMINEE
•
β-cyclodextrine (Roquette)
•
Chlorure de tosyle (Aldrich)
•
Azoture de sodium (Aldrich)
•
Iodure de potassium (Aldrich)
•
Nickel de Raney (Aldrich)
•
Borohydrure de sodium (Aldrich)
•
Pyridine (SDS)
•
Ethanol (SDS)
•
N,N-diméthylformamide ou DMF (SDS)
•
Résine Amberlite TMD-8 (Aldrich)
Mode opératoire
1) 1er étape : Synthèse de l'intermédiaire β-cyclodextrine tosylée
22g (19,4 mmol) de β-cyclodextrine, séchée une nuit à 110°C, sont dissous dans
500mL de pyridine avant d’être mis à refroidir à 8°C. Une fois la CD dissoute (solution
jaune), 1,8g (9,4mmol) de chlorure de tosyle sont ajoutés. Le mélange est maintenu 24 heures
sous agitation et la réaction est stoppée par ajout de 100mL d’eau. Après évaporation de la
pyridine (chassée par l’eau), la solution aqueuse de β-cyclodextrine tosylée est filtrée et lavée
à l’éthanol afin d’éliminer le chlorure de tosyle n’ayant pas réagi. Le produit obtenu (blanc)
est ensuite recristallisé dans l’eau et le précipité est filtré et séché sous vide. Le rendement de
382
cette étape est d’environ 25%. L’homogénéité du produit est vérifiée par chromatographie de
phase inverse sur colonne C18 dans un mélange méthanol/eau à 50/50.
2) 2ème étape : Synthèse de l'intermédiaire β-cyclodextrine azidée
3,4g (2,6mmol) de β-cyclodextrine tosylée sont dissous dans 10mL de DMF distillé
sur CaH2 avant d’ajouter 1,75g (26,4mmol) d’azoture de sodium et 0,224g (1,3mmol)
d’iodure de potassium. Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation 24h à 70°C sous
atmosphère d’azote. Le DMF est chassé sous pression réduite et le produit est repris avec
100mL d’eau. La solution obtenue est dessalée en ajoutant dans un bécher une résine
Amberlite TMD-8. Le pH et la conductivité de la solution sont mesurés en l’absence de
résine. Une fois que la conductivité de la solution est suffisamment proche (facteur 10 environ
par rapport à l’eau) de celle de l’eau distillée, la résine est éliminée par filtration sur filtre
plissé puis le filtrat est lyophilisé. Le rendement massique de cette seconde étape est proche
de 90%.
3) 3ème étape : Synthèse de la β-cyclodextrine aminée
0,8g (0,7mmol) de β-cyclodextrine azidée sont dissous dans 40mL d’eau contenant
2mL de Nickel de Raney en suspension, puis 0,4g (10mmol) de borohydrure de sodium sont
ajoutés. La suspension est maintenue sous agitation 24h à 70°C. Le mélange réactionnel est
ensuite filtré sur membrane de cellulose 0,45µm. Le filtrat est dialysé sur une membrane à
seuil de coupure 1000 pendant 9 heures puis lyophilisé. Le rendement massique de cette
dernière étape est proche de 50%.
383
Caractérisation par IR et par RMN du proton
1) 1er étape : Caractérisation de l'intermédiaire β-cyclodextrine tosylée
L’analyse IR est effectuée par ATR. Le spectre IR de la β-cyclodextrine tosylée est
donné sur la figure ci-dessous. La tosylation de la β-CD est confirmée par l’apparition d’une
bande à 1385 cm-1 caractéristique de la liaison R1-OSO2-R2
ν = 1385 cm-1
Le spectre de RMN du proton caractéristique de la β-cyclodextrine tosylée en solution
dans le DMSO deutéré est présenté au chapitre I, figure I.10. Un taux de substitution moyen
en fonctions tosyle par cavité de CD peut être déterminé à partir de la relation suivante :
I H aromatique
taux de mod ification en tosyle (%) =
4
× 100
I OH sec ondaire
14
2)2ème étape : Caractérisation de l'intermédiaire β-cyclodextrine azidée
Le spectre IR de la β-cyclodextrine azidée obtenu par ATR est donné sur la figure cidessous. La réaction d’azidation est vérifiée par la disparition de la bande à 1385 cm-1 au
profit d’une autre à 2105 cm-1 caractéristique des fonctions N3 (ν-N=N+=N-).
384
ν = 2105 cm-1
L’analyse par RMN du proton est effectuée en solution dans le DMSO deutéré.
L’azidation de la CD est confirmée par RMN par la disparition des signaux caractéristiques
du groupement tosyle à 7,75-7,4 ppm et 2,42 ppm.
3) 3ème étape : Caractérisation de la β-cyclodextrine aminée
Le spectre IR de la β-cyclodextrine aminée obtenu par ATR est donné sur la figure cidessous. La réaction d’amination est vérifiée par la disparition de la bande à 2105 cm-1
caractéristique des fonctions N3.
ν = 2105 cm-1
385
ANNEXE 3
SYNTHESE DES SUPPORTS DE SILICE-POLYβ -CD
•
Pour la synthèse de la silice-polyβ-CD utilisée comme support d’affinité (Cf.
Chapitre II)
Silice LiChrosorb DIOL, diamètre de particule = 5 µm, porosité = 10 nm, Sp = 300
m2/g, 4,2 µmol/m2 de fonction OH, taux de carbone = 6,45% (Merck, Darmstadt,
Allemagne)
•
Pour la synthèse de la silice-polyβ-CD utilisée comme support de base pour
l’élaboration des phases chromatographiques de fonctionnalités variables (Cf.
Chapitre III)
Silice Nucléosil DIOL (Nucléosil 300-7OH), diamètre de particule = 7 µm, porosité =
30 nm, Sp = 100 m2/g, 3 - 3,5 µmol/m2 de fonction OH, taux de carbone = 1,81%
(Macherey-Nagel, Düren, Allemagne)
•
Pour la synthèse de la silice-polyβ-CD utilisée comme support de base pour
l’élaboration de la phase chromatographique d’immunoaffinité (Cf. Chapitre
III)
Silice Nucléosil DIOL (Nucléosil 4000-7OH), diamètre de particule = 7 µm, porosité
= 400 nm, Sp = 10 m2/g, 3 - 3,5 µmol/m2 de fonction OH, taux de carbone = 0,54%
(Macherey-Nagel, Düren, Allemagne)
•
Triéthylamine (Aldrich)
•
Dilaurate de dibutylétain ou DBLT (Merck)
•
1,4-diisocyanatobutane (Aldrich)
•
4-diméthylaminopyridine ou DMAP (Aldrich)
•
Polyβ-CD (Cf. synthèse au chapitre I, paragraphe III.1.1, et annexe 1)
•
1,2-dichloroéthane (SDS)
•
Pyridine (Aldrich)
•
Ethanol (Aldrich)
386
Mode opératoire
Selon les applications envisagées, des supports de silice diol de porosité variable (10 à
400 nm) ont été utilisés. La surface spécifique associée à ces supports étant différente, le
nombre de fonctions hydroxyle à modifier l’est également. Les proportions de réactifs ont
alors été modifiées pour chaque type de support. Ces proportions sont résumées dans le
tableau ci-dessous.
Réactifs
Silice
Silice de porosité 10 nm
Masse
Volume
Quantité
Masse
Volume
Quantité
Masse
Volume
Quantité
(g)
(mL)
(mmol)
(g)
(mL)
(mmol)
(g)
(mL)
(mmol)
1,26
1
3.10-1-
1
1
3.10-2-
-1
3,5.10-2
fonctions
3,5.10
OH
fonctions
fonctions
OH
OH
10
10
10
Triéthylamine
25 µL
25 µL
25 µL
DBLT
25 µL
25 µL
25 µL
1,2-dichloroéthane
1,77
1,4-
1,6
12,6
0,88
0,8
6,3
0,40
0,36
2,8
diisocyanatobutane
Silice-isocyanate
1
DMAP
0,21
Polyβ-CD
2,5
Pyridine
1
1,7
0,21
1,7
1,25
77
0,21
1,7
0,5
77
77
1) 1ère étape : Greffage de l’intermédiaire difonctionnel 1,4-diisocyanatobutane sur la silice
diol : obtention de la silice-isocyanate
La silice diol, préalablement séchée une nuit sous vide à 70°C, est mise en suspension
dans le 1,2-dichloroéthane anhydre. L’ensemble est placé sous atmosphère inerte d’azote puis
mis aux ultrasons environ 5 min afin de faire pénétrer le solvant à l’intérieur des pores de la
silice. La suspension est ensuite chauffée à 65°C, toujours sous atmosphère d'azote, avant
d'ajouter la triéthylamine (capteur d'HCl), le DBLT (catalyseur) et le 1,4-diisocyanatobutane.
L’ensemble est maintenu pendant 6 heures à 65°C sous agitation douce. Au cours de ces 6h,
le mélange est placé plusieurs fois aux ultrasons afin de favoriser la pénétration des réactifs
dans les pores. Après retour à la température ambiante, le milieu réactionnel est filtré sous
387
azote sur membrane de cellulose régénérée 0,45 µm et la silice recueillie est lavée plusieurs
fois avec du dichloroéthane. La silice-isocyanate obtenue est mise à sécher sous vide et les
fonctions isocyanate étant instables à l’air ambiant, cette silice intermédiaire est conservée
sous vide avant d’être utilisée rapidement pour la seconde étape.
2) 2ème étape : Greffage du poly-β-CD sur la silice-isocyanate : obtention de la silice-polyβCD
Le polyβ-CD, préalablement séché une nuit sous vide à 70°C, est mis en solution sous
atmosphère d’azote dans la pyridine anhydre conservée sur pastilles de NaOH. Après
dissolution du polymère, la DMAP et la silice-isocyanate sont ajoutés à la solution et après
leur dissolution, le mélange réactionnel est placé aux ultrasons environ 5 min. L’ensemble est
maintenu pendant 48 heures à température ambiante sous agitation douce et sous atmosphère
d’azote. Au cours de ce temps réactionnel, le mélange est à nouveau mis plusieurs fois aux
ultrasons. Le milieu réactionnel est filtré sous azote sur membrane de cellulose régénérée 0,45
µm et la silice recueillie est lavée plusieurs fois avec de la pyridine puis de l’éthanol. La
silice-polyβ-CD obtenue est mise à sécher sous vide.
Caractérisation par analyse élémentaire
Les supports de silice-polyβ-CD élaborés ont été caractérisés par analyse élémentaire.
Les résultats obtenus pour l’ensemble des supports sont résumés dans les tableaux suivants.
Silice-polyβ-CD (porosité 10 nm) utilisée comme support d’affinité (Cf. Chapitre II)
Silice-isocyanate
Silice-polyβ
β -CD(*)
66 mg
7 mg
(mg/g de silice)
de diisocyanate
de polyβ -CD
Quantité de cavités de β -CD immobilisée
(mmol/g de silice)
2,8.10-3
(mmol/m2 de silice)
9,3.10-6
( )
* avec un lot de polyβ-CD de caractéristiques chimiques Mn = 30 000 g/mol, Mp = 68 000
g/mol, Ip = 2,26, % massique de β-CD = 45, nombre de β-CD par chaîne = 12
388
Silice-polyβ-CD (porosité 30 nm) utilisée comme support de base pour l’élaboration des
phases chromatographiques de fonctionnalités variables (Cf. Chapitre III)
Silice-isocyanate
Silice-polyβ
β -CD(*)
75 mg
63 mg
(mg/g de silice)
de diisocyanate
de polyβ -CD
(mmol/g de silice)
3,9.10-2
(mmol/m2 de silice)
3,9.10-4
( )
Silice-polyβ-CD (porosité 40 nm) utilisée comme support de base pour l’élaboration de la
phase chromatographique d’immunoaffinité (Cf. Chapitre III)
Silice-isocyanate
Silice-polyβ
β -CD(*)
4 mg
15 mg
(mg/g de silice)
de diisocyanate
de polyβ -CD
(mmol/g de silice)
6.10-3
(mmol/m2 de silice)
6.10-4
( )
389
ANNEXE 4
CARACTERISATION DES POLYMERES HYDROPHILES INITIAUX
1) Chromatographie d'exclusion stérique (SEC)
Les masses molaires moyennes des polymères et les indices de polymolécularité ont
été déterminés par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant une double détection : la
réfractométrie différentielle (RI) et la diffusion de la lumière. L’ensemble des analyses a été
effectué en milieu aqueux sur deux colonnes PL aquagel-OH 40 et 30 montées en série
(Polymer Laboratories, Shropshire, UK) après un étalonnage avec des PEGs standards (dans
le cas d’une détermination par RI uniquement).
2) RMN du proton
Deux spectromètres Bruker, AC 200 et AVANCE 300, ont été utilisés en fonction de
la sensibilité désirée. Les composés sont mis en solution dans du diméthylsulfoxyde deutéré
(dérivés de PEG) ou dans de l’eau deutérée (dérivés du dextrane) à une concentration de 20 à
25g/L.
2) IR
Les analyses ont été réalisées sur un spectrophotomètre de type Perkin-Elmer 1760 et un
spectrophotomètre moyen infrarouge à transformée de Fourier TENSOR 27.
390
Caractérisation des PEGs initiaux par RMN du proton
Spectres de RMN du proton :
Les spectres de RMN du proton des PEGs initiaux ont été effectués en solution dans le
diméthylsulfoxyde (DMSO) deutéré. Ce solvant aprotique permet d'observer les protons des
fonctions hydroxyle terminales par un triplet à 4,58 ppm bien séparé du pic des protons du
squelette (CH2-CH2-O ; 3-4 ppm centré sur 3,5 ppm). Les spectres obtenus pour le MPEG
5000 et le PEG 4600 sont donnés sur la figure ci-dessous.
J = 140 Hz
J = 140 Hz
MPEG 5000
N° pic
Déplacement
PEG 4600
Multiplicité
(ppm)
Nb de H
Attribution
par chaîne de
polymère
1
4,58
Triplet
1 (MPEG)
H de la fonction OH
2 (PEG)
2
3,51
Singulet large
3
3,2
Singulet fin
3 (MPEG)
CH3-O-
0 (PEG)
Remarque : la présence d’atomes
13
C (isotopes du
12
C à raison de 1% environ) dans la
structure des PEGs conduit à un couplage supplémentaire 1J1H-13C entre les H du squelette et
391
les 13C. Ce dernier se traduit par l’apparition de deux triplets, appelés satellites du 13C, séparés
de 140 Hz et centrés de part et d'autre du pic des protons du squelette du PEG.
Estimation des masses molaires moyennes en nombre (Mn) des PEGs initiaux :
Soit n le nombre de monomères formant les PEGs considérés, les masses molaires Mn
sont alors définies par :
Mn = M des 2 extrémités + M unité de répétition*n
avec pour le PEG : Mn = M(OH) + M(H) + M(CH2-CH2-O)*n = 18 + 44*n
et pour le MPEG : Mn = M(CH3O) + M(H) + M(CH2-CH2-O)*n = 32 + 44*n
La détermination du nombre d’unités monomères (n) permet de calculer les masses molaires
moyennes en nombre (Mn) des PEGs initiaux. Le nombre n peut être déterminé à partir des
spectres de RMN par les relations suivantes :
I CH 2 −CH 2 −O
n=
4
I OH
2
I CH 2 −CH 2 −O
pour le PEG
et
n=
4
I OH
pour le MPEG
Caractérisation des dextranes initiaux par RMN du proton
Les spectres de RMN du proton des dextranes initiaux ont été effectués en solution
dans de l’eau deutérée (D2O) (Cf. figure ci-dessous). Le carbone 1 de l’unité glucose étant lié
à une fonction époxyde, le proton anomérique (proton porté par le carbone 1) possède un
environnement électronique différent des autres protons du glucose et apparaît sous la forme
d’un doublet à 4,8 ppm.
392
D2O
2
1
N° pic
Déplacement
Multiplicité
(ppm)
Nb de H
Attribution
par unité glucose
1
4,8
Doublet
1
H anomérique
2
3,9 à 3,3
Multiplet
6
393
ANNEXE 5
SYNTHESE DES MPEGs MODIFIES PHENYLADAMANTYLE : MPEG-AdPh
•
Méthoxypoly(éthylène glycol), noté MPEG, de masses molaires 5000 et
2000g/mol (Aldrich)
•
Chlorure de 4-toluènesulfonyle ou chlorure de tosyle (Fluka)
•
4-(1-adamantyl)phénol (Aldrich)
•
Hydrure de sodium (Aldrich)
•
Triéthylamine, NEt3 (Aldrich)
•
Dichlorométhane (SDS)
•
Ether diéthylique (SDS)
•
Ethanol (SDS)
Mode opératoire
1) 1er étape : Synthèse de l'intermédiaire MPEG tosylé (MPEG-Ts)
1 mmol de MPEG, préalablement séché une nuit sous vide à 40°C, est dissous dans 15
mL de dichlorométhane. Le mélange réactionnel est refroidi à 0°C à l'aide d'un bain de glace
et mis sous atmosphère d'azote. Puis, 1g de chlorure de 4-toluènesulfonyle (5,2 mmol) est
ajouté. Le milieu est maintenu à 0°C pendant 2 heures puis à température ambiante toute la
nuit. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique anhydre suivi d'une
filtration et d'un séchage sous vide. Afin d'éliminer les sels de triéthylammonium, le polymère
est ensuite recristallisé dans l'éthanol anhydre et la solution est filtrée à froid (4°C). Le
rendement massique de la tosylation est proche de 90%. Le MPEG-Ts obtenu est conservé
sous vide (afin de limiter la dégradation des fonctions tosyle) avant d’être rapidement utilisé
pour la deuxième étape.
394
2) 2ème étape : Synthèse du MPEG modifié phényladamantyle (MPEG-AdPh)
0,9 g (4 mmol) de 4-(1-adamantyl)phénol sont dissous sous atmosphère d’azote dans
70 mL de 1,2-dichlorométhane anhydre avant d’y ajouter goutte à goutte 0,24 g (10mmol)
d'hydrure de sodium mis en suspension dans 30 mL de dichlorométhane. Le mélange est agité
2 heures à température ambiante puis une solution contenant 0,8 mmol de MPEG-Ts dans 50
mL de dichlorométhane est ajoutée goutte à goutte au mélange. Le milieu réactionnel est porté
au reflux à 40°C pendant 48h. La solution est précipitée dans de l’éther diéthylique puis
filtrée, le solide recueilli est ensuite séché sous vide. Le composé obtenu est recristallisé dans
l'éthanol et la solution est filtrée à froid (4°C). Le MPEG-AdPh synthétisé est conservé à 4°C.
Caractérisation par IR, UV et RMN du proton
1) 1er étape : Caractérisation de l'intermédiaire MPEG tosylé (MPEG-Ts)
Le polymère tosylé est caractérisé par (1) IR, (2) UV et (3) RMN du proton.
(1) Le spectre IR des PEGs modifiés présente deux bandes d’adsorption
caractéristiques du groupement tosyle : une bande d'absorption à 1175 cm-1 caractéristique des
fonctions sulfonyle (νSO2) et une autre à 1646 cm-1 de par la présence du cycle benzénique
(νC=C).
(2) La modification du MPEG par le tosyle peut également être confirmée par un
spectre UV du fait que la fixation du tosyle au MPEG confère au polymère des propriétés
chromophores avec un maximum d’adsorption vers 270nm.
(3) Le spectre de RMN du proton relatif au MPEG-Ts est effectué dans le DMSO
deutéré. L’attribution et les déplacements chimiques des différents signaux obtenus sont
regroupés dans le tableau suivant :
395
N°
Déplacement
pic
(ppm)
Multiplicité
Nb de H
Attribution
par chaîne de
MPEG-Ts
4
7,8 et 7,5
doublet de doublet A2B2
4
H aromatique
2
-CH2OTs
(J=8,0 Hz)
5
4,11
triplet (J = 6 Hz)
2
3,51
singulet large
H motif
répétition
3
3,2
singulet fin
3
CH3-O-
6
2,42
singulet fin
3
CH3 du Ts
Si l’on considère le cas où le MPEG initial n’est pas totalement modifié par le tosyle,
des fonctions OH résiduelles sont présentes sur le polymère. Dans ce cas, le pourcentage de
substitution des fonctions OH par le tosyle peut être déterminé à partir de l’intégration des
signaux relatifs à la présence du tosyle et de l’intégration du signal relatif aux fonctions OH
(signal à 4,58 ppm d’intensité IOH, Cf. Annexe 4). Plusieurs formules peuvent être utilisées :
=
I H aromatique
4.I OH + I H aromatique
× 100 =
I CH 2 − OTs
2.I OH + I CH 2 − OTs
× 100 =
I CH 3 du Ts
3.I OH + I CH 3 du Ts
× 100
Le taux de modification en groupement tosyle peut également être déterminé en
rapportant les intégrations des signaux caractéristiques de la présence du tosyle sur celles
issues du MPEG de base :
I CH 2 − OTs
I H aromatique
4
I CH 3 − O
3
Ou bien
396
× 100 =
I CH 3 du Ts
3
2
× 100 =
× 100
I CH 3 − O
I CH 3 − O
3
3
I H aromatique
I CH 2 − OTs
I CH 3 du Ts
3
4
2
× 100 =
× 100 =
× 100
I CH 2 − CH 2 − O
I CH 2 − CH 2 − O
I CH 2 − CH 2 − O
4* n
4* n
4* n
avec n le nombre de monomères formant le MPEG
2) 2ème étape : Caractérisation du MPEG modifié phényladamantyle (MPEG-AdPh)
L’espèce finale est également caractérisée par (1) IR, (2) UV et (3) RMN du proton.
(1) Le spectre IR permet de confirmer la réaction de l’adamanylphénol sur
l’intermédiaire tosyle par la disparition des bandes du tosyle à 1175 et 1646 cm-1.
(2) Un déplacement du maximum d’adsorption dans l’UV de 270 à 276nm est observé
lors de la fixation de l’adamanylphénol au MPEG-Ts.
(3) Le spectre de RMN du proton du MPEG-AdPh en solution dans le DMSO deutéré
est donné sur la figure ci-dessous :
397
2
DMSO
3
1
1
4
4
1
5
N°
Déplacement
pic
(ppm)
Multiplicité
Nb de H
Attribution
par chaîne de
MPEG-AdPh
4
7,3 et 6,9
2 Doublets A2B2
4
H aromatique
2
-CH2OAdPh
(J=8,1 Hz)
5
4,05
Triplet (J = 6 Hz)
2
3,51
Singulet large
H motif
répétition
3
3,2
singulet fin
3
CH3-O-
6
2,0 - 1,8 - 1,7
Singulets larges
15
H adamantyle
De même que pour le MPEG-Ts, de nombreuses relations permettent la détermination
du taux de conversion des fonctions tosyle en phényladamantyle :
taux de mod ification en phényladamantyle (%) =
=
I H aromatique
× 100 =
I CH 2 − OAdPh
2.I OH + I CH 2 − OAdPh
Ou
398
× 100 =
I H de l' adamantyle
15.I OH + I H de l' adamantyle
× 100
=
I H aromatique
I CH 2 −OAdPh
4
2
I CH 3 −O
3
× 100 =
I CH 3 −O
IH
× 100 =
3
de l ' adamantyle
15
I CH 3 −O
× 100
3
Ou encore
I H aromatique
=
I CH 2 − OAdPh
15
4
2
× 100 =
× 100 =
× 100
I CH 2 − CH 2 − O
I CH 2 − CH 2 − O
I CH 2 − CH 2 − O
4* n
4* n
avec n le nombre de monomères formant le MPEG
399
4* n
ANNEXE 6
SYNTHESE DES PEGs MODIFIES PHENYLADAMANTYLE ET COOH:
COOH-PEG-AdPh
•
Poly(éthylène glycol), noté PEG, de masse molaire 4600g/mol (Aldrich)
•
Chlorure de 4-toluènesulfonyle ou chlorure de tosyle (Fluka)
•
4-(1-adamantyl)phénol (Aldrich)
•
Hydrure de sodium (Aldrich)
•
Triéthylamine, NEt3(Aldrich)
•
4-Diméthylaminopyridine, DMAP (Aldrich)
•
Anhydride succinique (Aldrich)
•
Dichlorométhane (SDS)
•
•
Ethanol (SDS)
•
Tétrahydrofurane ou THF (SDS)
•
Tétrachlorure de carbone (SDS)
Mode opératoire
1) 1er étape : Synthèse de l'intermédiaire PEG phényladamantyle (OH-PEG-AdPh)
Synthèse de l'intermédiaire tosylé à une extrémité de chaîne : OH-PEG-Ts
La synthèse du OH-PEG-Ts s’effectue selon les conditions expérimentales décrites en
annexe 5 (dans le cas d’un MPEG comme polymère initial). Cependant, afin de modifier le
PEG initial par un unique groupement tosyle par chaîne, un excès molaire de chlorure de
400
tosyle par rapport aux fonctions hydroxyle initiales du PEG de l’ordre de 1,1 (et non de 5) a
été utilisé.
Synthèse du PEG modifié par le phényladamantyle(AdPh) à une extrémité de chaîne : OHPEG-AdPh
0,077 mg (3,2 mmole) de NaH sont mis en suspension, sous atmosphère d’azote, dans
50 mL de THF puis 0,9g (4 mmol) de 4-(1-adamantyl)phénol sont ajoutés au milieu
(dégagement gazeux). Le mélange est ensuite agité une heure à température ambiante.
Parallèlement, 4g (0,8 mmol) de OH-PEG-Ts (modifié à 50%) sont dissous dans 50 mL de
THF (on chauffe légèrement au pistolet pour solubiliser le polymère) puis transférés, à l’aide
d’une canule, dans la solution d’alcoolate. Le milieu réactionnel est porté à reflux à 40°C
pendant 48 heures. La solution est d’abord filtrée sous azote (membrane d’acétate de cellulose
régénérée 0,45 µm) avant d’être précipitée dans de l’éther diéthylique puis filtrée à nouveau
sous azote (membrane d’acétate de cellulose régénérée 0,45 µm). Le solide recueilli est
ensuite séché sous vide avant d’être recristallisé dans l'éthanol. Le polymère est récupéré
après une nouvelle filtration sous azote, à froid (à 4°C sur membrane d’acétate de cellulose
0,45 µm). Le rendement massique de cette étape est proche de 75%.
1) 1er étape : Caractérisation de l'intermédiaire PEG phényladamantyle (OH-PEG-AdPh)
Caractérisation de l'intermédiaire tosylé à une extrémité de chaîne : OH-PEG-Ts
Le spectre de RMN du proton caractéristique d’un OH-PEG-Ts (modifié à 58% en
tosyle) en solution dans le DMSO deutéré est donné ci-dessous.
401
H2O
2
6
DMSO
4
4
5
1
N° pic
Déplacement
Multiplicité
Nb de H
(ppm)
Attribution
par chaîne de
OH-PEG-Ts
4
7,8 et 7,5
Doublet de doublet A2B2
4
H aromatique
(J=8,0 Hz)
1
4,58
Triplet
1
H fonction OH
5
4,11
Triplet (J = 6 Hz)
2
-CH2OTs
2
3,51
Singulet large
6
2,42
Singulet fin
3
CH3 du Ts
De même que pour le MPEG-Ts (annexe 5), le taux de modification en groupement
tosyle peut être déterminé par de nombreuses relations :
=
I H aromatique
× 100 =
I CH 2 −OTs
2.I OH + I CH 2 − OTs
Ou
402
× 100 =
I CH 3 du Ts
3.I OH + I CH 3
× 100
du Ts
I CH 2 −OTs
I H aromatique
I CH 3 du Ts
1
1
1
3
4
2
= *
× 100 = *
× 100 = *
× 100
I
I
I
2
2
2
CH 2 −CH 2 −O
CH 2 −CH 2 −O
CH 2 − CH 2 −O
4* n
4* n
4* n
avec n le nombre de monomères formant le PEG
Le taux « 100% de modification » est défini par la substitution de l’ensemble des
fonctions hydroxyle du polymère initial. Ainsi dans le cas d’un PEG, ce taux correspond à la
modification des deux extrémités de chaîne du polymère et non plus à la modification d’une
seule extrémité comme dans le cas du MPEG. De ce fait, dans la seconde ligne d’équations
permettant le calcul du taux de substitution des PEGs, un facteur ½ doit être introduit.
Caractérisation du PEG modifié par le phényladamantyle (AdPh) à une extrémité de chaîne :
OH-PEG-AdPh
Le spectre de RMN du proton caractéristique du OH-PEG-AdPh en solution dans le
DMSO deutéré est présenté sur la Figure I-15. De même que pour le MPEG-AdPh (annexe 5),
le taux de modification en groupements phényladamantyle peut être déterminé par de
nombreuses relations :
I CH 2 − OAdPh
I H aromatique
=
× 100 =
× 100 =
× 100
2.I OH + I CH 2 − OAdPh
15.I OH + I H de l' adamantyle
Ou
I CH 2 −OAdPh
I H aromatique
1
1
1
15
4
2
= *
× 100 = *
× 100 = *
× 100
I CH 2 −CH 2 −O
2 I CH 2 −CH 2 −O
2 I CH 2 −CH 2 −O
2
4* n
4* n
4* n
403
2) 2ème étape : Caractérisation du MPEG modifié phényladamantyle et COOH (COOHPEG-AdPh)
Le spectre de RMN du proton caractéristique du COOH-PEG-AdPh en solution dans
le DMSO deutéré est présenté sur la Figure I-17. La détermination du taux de modification
des fonctions OH résiduelles du PEG-AdPh intermédiaire en fonctions acide carboxylique
peut être effectuée à partir de la relation suivante :
1
taux de modification en COOH (%) = *
2
I CH 2 ( α 2 ) de l' extrémité COOH
2
I CH 2 −CH 2 −O
4* n
404
× 100
ANNEXE 7
ANALYSE PAR CLHP DES LOTS DE POLYMERE OH-PEG-AdPh SYNTHETISES
Conditions expérimentales
•
Support : silice greffée par un polymère de β-cyclodextrine (Cf. synthèse du
support au Chapitre I), colonne 10 cm
•
Détection par réfractométrie (PEG) et par UV à 276nm (lots de OH-PEG-AdPh)
•
Eluant : eau et solution d’hydroxypropylβ-cyclodextrine (Aldrich) à 7mM dans
l’eau
Mode opératoire et caractérisation
1er étape : détermination de la quantité de PEG non modifié contenue dans les lots de OHPEG-AdPh synthéthisés
Le PEG ne possédant pas de propriétés d’absorption en UV, une détection par
réfractométrie différentielle a été utilisée. Dans un premier temps, une solution de PEG
commercial (à 1g/L dans l’eau) a été injectée sur le support chromatographique en présence
d’eau comme éluant. Le PEG, ne présentant aucune affinité pour le support de silice greffée
par un polymère β-cyclodextrine, est ressorti au volume mort (VO = 1mL). La seconde étape a
consisté à injecter sur le support une solution des lots de OH-PEG-AdPh synthétisés. Les
mêmes conditions expérimentales ont été respectées : solution à 1g/L dans l’eau et de l’eau
choisie pour éluant. La présence de l’espèce PEG non modifié dans les lots de polymère
synthétisés a été révélée par la sortie d’un pic au volume mort. La proportion relative de PEG
non modifié dans les lots de polymère peut être déterminée par le rapport des aires des pics
obtenus :
Qté relative de l' espèce PEG non modifié dans les lots de polymère (%) =
Asignal PEG non mod ifié dans les lots OH − PEG − AdPh
× 100
Asignal PEG commercial
405
2ème étape : détermination des quantités de PEG mono et disubstitué phényladamantyle
(OH-PEG-AdPh et AdPh-PEG-AdPh) contenues dans les lots de OH-PEG-AdPh
synthéthisés
La présence du groupement phényladamantyle sur le PEG a permis une détection en UV à
276nm, détection qui s’avère être plus sensible que la réfractométrie. Des études antérieures
ont montré que le PEG modifié phényladamantyle, retenu par le support lorsque de l’eau est
utilisée comme éluant, voit sa rétention fortement diminuée en présence de compétiteur dans
la phase mobile. De ce fait, un éluant constitué à 7mM d’hydroxypropylβ-cyclodextrine a été
utilisé pour permettre une sortie rapide des PEGs modifiés. Les solutions des lots de OHPEG-AdPh (1g/L dans l’eau) sont alors injectées sur le support et deux signaux (à des
volumes de rétention de l’ordre de 2 et 8,2 mL) sont observés. La présence soupçonnée des
espèces mono et disubstituées est alors confirmée. Les quantités relatives de PEG mono et
disubstitués sont ensuite estimées par la comparaison des aires des différents signaux :
Qté relative de l' espèce OH − PEG − AdPh par rapport à l' espèce AdPh − PEG − AdPh (%) =
Asignal OH − PEG − AdPh
× 100
Asignal AdPh− PEG − AdPh
Asignal OH − PEG − AdPh +
2
et
Qté relative de l' espèce AdPh − PEG − AdPh par rapport à l' espèce OH − PEG − AdPh (%) =
100 − Qté relative de l' espèce OH − PEG − AdPh (%)
Dans la relation précédente, l’aire relative au signal du composé disubstitué doit être divisée
par deux. En effet, l’espèce Adph-PEG-AdPh possèdant deux groupements chromophores,
provoque un signal deux fois plus intense que celui relatif à une même quantité de OH-PEGAdPh.
406
ANNEXE 8
SYNTHESE DES DEXTRANES MODIFIES ADAMANTYLE : Dext-Ad
•
Dextrane de masse 40000 et 10000g/mol (Pharmacia)
•
Chlorure de lithium ou LiCl (Aldrich)
•
Chlorure de 1-adamantoyle (Aldrich)
•
•
Pyridine (Aldrich)
•
•
2-propanol (SDS)
Mode opératoire
1g de dextrane de masse 40000 ou 10000g/mol (soit 6,2 mmol d’unités glucose) et
0,27g (6,2 mmol) de chlorure de lithium (accélère la dissolution du polymère) sont
préalablement séchés une nuit sous vide à 100°C. L’ensemble est ensuite dissous à 80°C sous
atmosphère d'azote dans 25 mL de DMF anhydre conservé sous capsule. La dissolution du
dextrane est lente (jusqu’à 2h30) et peut être accélérée par une augmentation momentanée de
la température à 100°C (dissolution de 30 à 45min). Après dissolution totale du dextrane,
0,23g (1,2 mmol) de chlorure de 1-adamantoyle, 0,14g (1,2 mmol) de DMAP et 100 µL (1,2
mmol) de pyridine sont ajoutés au mélange. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation
pendant 3 heures à 80°C avant d'être précipité dans le 2-propanol. La solution est filtrée sur
fritté de porosité 4 et le solide blanc recueilli est séché sous vide quelques heures. Le composé
est ensuite dissous dans un minimum d'eau afin d’effectuer une dialyse contre de l'eau sur
membranes Spectra/Por de seuil de coupure 6000-8000 ; les petites molécules telles que le
DMAP, le chlorure de lithium et les sels de pyridinium sont alors éliminées. Enfin le
polymère est récupéré par lyophilisation. Le rendement massique varie de 90 à 97%.
407
Le spectre de RMN du proton caractéristique du Dext-Ad en solution dans le D20 est
donné sur la figure ci-dessous.
D2O
2
1
3
3
3
1
N° pic
Déplacement (ppm)
Multiplicité
Attribution
1
4,95 - 4,8
Singulet
H anomériques
et
Doublet
et non modifiées
2
3,9 à 3,3
Multiplet
3
1,9 - 1,75 - 1,55
Singulets larges
H adamantyle
Le taux de modification du dextrane en adamantyle peut être déterminé à partir des
spectres de RMN du proton par l’intégration des signaux de l’adamantyle rapportée à celles
relatives aux protons du dextrane :
408
I H adamantyle
taux de modification en adamantyle (%) =
15
I H anomériques
I H adamantyle
=
15
I autres H du dextrane
6
Le nombre moyen de groupements adamantyle par chaîne de dextrane peut ensuite
être déterminée par la relation suivante :
nombre moyen d' adamantyle par chaîne =
M dextrane
taux de modification en adamantyle (%)
=
×
M unité monomère de glu cos e
100
avec M unité monomère de glu cos e = 162 g.mol-1
409
ANNEXE 9
SYNTHESE DES DEXTRANES MODIFIES ADAMANTYLE ET
DIETHYLAMINOETHYLE :
Dext-Ad-DEAE
•
Dextrane de masse 40000g/mol (Pharmacia)
•
Hydroxyde de sodium (Aldrich)
•
2-chloro-N,N-diéthyléthylamine ou DEAE (Aldrich)
•
Chlorure de lithium ou LiCl (Aldrich)
•
Chlorure de 1-adamantyle (Aldrich)
•
•
Pyridine (Aldrich)
•
Eau ultra pure (doublement distillée)
•
•
2-propanol (SDS)
Mode opératoire
1) 1er étape : Synthèse du dextrane modifié diéthylaminoéthyle (Dext-DEAE)
Une solution constituée par 2g (50 mmol) d’hydroxyde de sodium dans 4 mL d’eau
ultra pure est ajoutée goutte à goutte à 1g (6,2 mmol d’unités glucose) de dextrane également
dissous dans 4 mL d’eau ultrapure. L’addition de la solution de soude se fait à froid vers 4°C
(un bain de glace est utilisé pour refroidir le mélange). Le mélange est maintenu sous
agitation à 4°C pendant 30min avant d’y ajouter progressivement 2,1 g (12 mmol) ou 4,2 g
(24 mmol) de DEAE. Le mélange réactionnel est maintenu à 4°C pendant 10min puis chauffé
à 60°C de 1h à 4h selon le taux de greffage envisagé. Après avoir refroidi le mélange avec un
410
bain de glace, le pH de la solution (initialement compris entre 12 et 13) est amené à 9 à l’aide
d’une solution d’acide chlorhydrique. Enfin, le mélange est dialysé contre de l'eau sur
membranes Spectra/Por de seuil de coupure 6000-8000 avant d’être lyophilisé. Le polymère
est alors recueilli avec un rendement massique de 60 à 90%.
2) 2e étape : Synthèse du dextrane modifié adamantyle et diéthylaminoéthyle (Dext-AdDEAE)
La deuxième étape consiste à modifier le Dext-DEAE intermédiaire par des
groupements adamantyle. Le mode opératoire suivi est décrit en annexe 8 mais les
proportions de réactifs doivent être modifiées. En effet, une quantité plus importante de
chlorure de lithium (rapport molaire de LiCl/unités glucose de l’ordre de 3) est utilisée pour
favoriser la solubilisation du Dext-DEAE (modifié par de nombreux groupements ioniques)
dans le DMF. De plus, un rapport molaire de (chlorure d’adamantyle/unités glucose) plus
élevé, de l’ordre de 0,4, a été utilisé pour favoriser la réaction avec les hydroxyles restants du
Dext-DEAE.
1) 1er étape : Caractérisation du dextrane modifié diéthylaminoéthyle (Dext-DEAE)
Le spectre de RMN du proton caractéristique du Dext-DEAE en solution dans le D2O
est donné sur la Figure I-19. Le taux de modification en « chaînes A » et « chaînes B » ainsi
que le taux global moyen de modification du dextrane en DEAE peuvent être déterminés à
partir de l’analyse de RMN par le rapport de l’intégration des signaux des CH3 des différents
motifs DEAE à celle relative à l’ensemble des H anomériques.
411
taux de chaînes ( A + B ) (%) = taux total de modification en amine tertiaire de pKa 9 ,5 et de pKa 5,7 (%)
I CH 3
=
a min e tertiaire
6
I H anomériques
× 100
taux de chaînes B (%) = taux de modification en ammonium quaternaire (%)
= taux de modification en amine tertiaire de pKa 5,7 (%)
I CH 3 ammonium
=
quaternaire
6
I H anomériques
× 100
taux de chaînes A (%) = taux de modification en amine tertiaire de pKa 9 ,5 (%)
= taux de chaînes ( A + B ) (%) − taux de chaînes B (%)
taux global moyen de modificati on en DEAE (%) = taux de chaînes A (%) + 2 × taux de chaînes B (%)
Le nombre moyen de chaînes (A + B) par chaîne de dextrane peut ensuite être
déterminé par la relation suivante :
nombre moyen de chaînes ( A + B ) par chaîne de dextrane
M dextrane
taux de chaînes ( A + B ) (%)
=
×
100
412
2) 2e étape : Caractérisation du dextrane modifié adamantyle et diéthylaminoéthyle (DextAd-DEAE)
La méthode de calcul du taux de modification en adamantyle est donnée dans l’annexe 8.
413
ANNEXE 10
SYNTHESE DES DEXTRANES MODIFIES ADAMANTYLE ET COOH :
Dext-Ad-COOH
•
•
Chlorure de lithium ou LiCl(Aldrich)
•
•
•
Pyridine (Aldrich)
•
Anhydride succinique (Aldrich)
•
Triéthylamine
•
•
2-propanol (SDS)
Mode opératoire
1) 1er étape : Synthèse du dextrane modifié adamantyle (Dext-Ad)
La synthèse est décrite en annexe 8.
2) 2e étape : Synthèse du dextrane modifié adamantyle et acide carboxylique (Dext-AdCOOH)
Les proportions en réactifs indiquées ci-dessous correspondent à un rapport molaire
d’anhydride succinique par rapport au nombre d’unités glucose égal à 0,62.
414
1g de Dext-Ad substitué à 6,2 ou 7,3% en adamantyle (soit respectivement 5,8 ou 5,75
mmol d’unité glucose) est dissous à 70°C sous atmosphère d’azote dans 25 mL de DMF. A la
dissolution du polymère, 0,36g (3,6 mmol) d’anhydride succinique, 0,04g (0,33mmol) de
DMAP et 40 µL de triéthylamine sont ajoutés à la solution. Le mélange réactionnel est
maintenu sous agitation pendant environ 16 heures à 80°C. Le DMF est ensuite chassé sous
pression réduite et le produit est repris par 60mL d’eau. La solution est mise à dialyser contre
de d’eau sur membrane Spectra/Por de seuil de coupure 6000-8000 puis lyophilisée.
1) 1er étape : Caractérisation du dextrane modifié adamantyle (Dext-Ad)
La caractérisation du polymère est décrite en annexe 8.
2) 2e étape : Caractérisation du dextrane modifié adamantyle et acide carboxylique (DextAd-COOH)
Le spectre de RMN du proton caractéristique du Dext-Ad-COOH en solution dans le
D2O est donné sur la figure ci-dessous.
415
D2O
4
2
1
3
1
3
3
N° pic
Déplacement (ppm)
Multiplicité
Attribution
1
5,0 - 4,8
Singulet
H anomériques
et
Doublet
et non modifiées
2
3,9 à 3,3
Multiplet
4
2,55
Singulet large
HOOC-CH2-CH2-COO-Dext
3
1,8 - 1,7 - 1,5
Singulets larges
H adamantyle
Le taux de modification en fonctions acide carboxylique peut être déterminé à partir
des spectres de RMN du proton par la comparaison des signaux relatifs aux groupements
succinique et de ceux caractéristiques du dextrane :
I ROOC −CH 2 −CH 2 −COOH
taux de modification en COOH (%) =
4
I H anomériques
I ROOC −CH 2 −CH 2 −COOH
× 100 =
4
6
416
× 100
Le nombre moyen de fonctions acide carboxylique par chaîne de dextrane peut ensuite
être déterminé par l’égalité suivante :
nombre moyen de COOH par chaîne =
M dextrane
×
taux de modification en COOH (%)
100
417
ANNEXE 11
SYNTHESE DES DEXTRANES MODIFIES ADAMANTYLE ET OCTYLE :
Dext-Ad-C8
•
•
Chlorure de lithium ou LiCl(Aldrich)
•
•
•
Pyridine (Aldrich)
•
Chlorure de nanoyle (Aldrich)
•
•
2-propanol (SDS)
Mode opératoire
1) 1er étape : Synthèse du dextrane modifié adamantyle (Dext-Ad)
La synthèse est décrite en annexe 8.
2) 2e étape : Synthèse du dextrane modifié adamantyle et nonyle (Dext-Ad-C8)
Les proportions en réactifs indiquées ci-dessous correspondent à la synthèse du
Dext40-Ad-C82 utilisant un rapport molaire de chlorure de nanoyle par rapport au nombre
d’unités glucose égal à 0,21.
0,25 g (5,7 mmol) de chlorure de lithium (accélère la dissolution du polymère),
préalablement séchés une nuit sous vide à 100°C, sont dissous rapidement à 80°C sous
418
atmosphère d'azote dans 25 à 30 mL de DMF anhydre conservé sous capsule. 1g de Dext-Ad
substitué à 6,2 % en adamantyle (soit 5,8 mmol d’unité glucose) est ensuite ajouté à la
solution. Après dissolution totale du dextrane (environ 10min), 214 µL (1,2 mmol) de
chlorure de nanoyle, 0,125g (1 mmol) de DMAP et 7,75 µL (0,1 mmol) de pyridine sont
ajoutés au mélange. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation pendant 3 heures à
80°C puis toute la nuit à température ambiante avant d'être précipité dans le 2-propanol. La
solution est filtrée sur fritté de porosité 4 et le solide recueilli est séché sous vide quelques
heures. Le composé est ensuite dissous dans un minimum d'eau afin d’effectuer une dialyse
contre de l'eau sur membranes Spectra/Por de seuil de coupure 6000-8000 ; les petites
molécules telles que le DMAP, le chlorure de lithium et les sels de pyridinium sont alors
éliminées.
Les conditions expérimentales des deux réactions étant identiques (à l’exception près
que le Dext-Ad n’est pas séché avant sa modification), une synthèse plus rapide en une seule
étape a été testée. Voici pour exemple les proportions en réactifs utilisées pour la synthèse du
Dext40-Ad-C84 utilisant un rapport molaire de chlorure de nanoyle et de chlorure
d’adamantyle par rapport au nombre d’unités glucose de 0,19 :
1 g de dextrane de masse 40000 (soit 6,2 mmol d’unités glucose) (séché une nuit sous
vide à 100°C)
0,25 g (5,7 mmol) de chlorure de lithium,
0,23 g (1,2 mmol) de chlorure de 1-adamantoyle,
207 µL (1,2 mmol) de chlorure de nanoyle
0,77 g (6,3 mmol) de DMAP
et 140 µL (1,7 mmol) de pyridine.
Caractérisation
1) 1er étape : Caractérisation du dextrane modifié adamantyle (Dext-Ad)
La caractérisation du polymère est décrite en annexe 8.
419
2) 2e étape : Caractérisation du dextrane modifié adamantyle et nonyle (Dext-Ad-C8)
Le spectre de RMN du proton caractéristique du Dext-Ad-C8 en solution dans le D2O
est donné sur la figure I-20. Le taux de modification en chaînons alkyle peut être déterminé à
partir des spectres de RMN du proton par la comparaison des signaux relatifs du groupement
alkyle et de ceux caractéristiques du dextrane. Dans la majorité des cas, seul le signal relatif
au -CH3 du C8 est bien résolu des signaux de l’adamantyle, ainsi le taux de substitution en
chaînons alkyle est principalement déterminé par les relations suivantes :
I −CH 3 du C8
taux de modification en C 8 (%) =
I −CH 3 du C8
3
3
× 100 =
× 100
I H anomériques
6
Le nombre moyen de chaînons alkyle par chaîne de dextrane peut ensuite être déterminé par
la relation suivante :
nombre moyen de C8 par chaîne =
M dextrane
×
taux de modification en C8 (%)
100
420
ANNEXE 12
CONDITIONS EXPERIMENTALES RELATIVES A LA DETERMINATION DES
CONSTANTES D’AFFINITE EN ACE
Appareillage
Les analyses ont été effectuées sur un appareil automatisé Beckam P/ACE MDQ
(Beckman Coulters, Fullerton, CA, USA) équipé d’un système de refroidissement permettant
un contrôle efficace de la température du capillaire. Un capillaire de silice vierge (50 µm de
diamètre interne × 75 µm de diamètre externe), (Beckman Instruments), de longueur effective
l = 21 cm et de longueur totale L = 31 cm a été utilisé. Les données ont été collectées avec un
système Gold software (Beckman).
Solutés :
•
MPEG-AdPh de masse moléculaire 2000 et 5000 g/mol (Cf. synthèse au chapitre I,
paragraphe III.3.3.a, et annexe 5)
•
COOH-PEG-AdPh de masse moléculaire 5000 g/mol (Cf. synthèse au chapitre I,
paragraphe III.3.3.b, et annexe 6)
Ligands solubles :
•
β-CD sulfatée (β-CD-Sulf), taux de substitution moyen en sulfate = 7 à 11
mol/mol de β-CD (Sigma)
Divers :
•
Thiourée (Aldrich) pour la mesure de la mobilité électroosmotique
•
Tampon phosphate de sodium à 25 mM de pH = 7
•
Méthanol (Aldrich)
•
Solution aqueuse de NaOH à 0,1 et 1M (Interchrom)
•
Eau ultra pure
421
Tous les produits chimiques et solvants utilisés sont de pureté analytique ou de qualité
CLHP. L’ensemble des tampons et échantillons injectés est préparé avec de l’eau ultra-pure
obtenue avec un système Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) et filtré sur des membranes
de Nylon (0,2 µm) (Millipore)
Méthodes
Détermination des constantes d’affinité MPEG-AdPh / β-CD
1) Conditions de l’ACE
Une solution de thiourée à 0,01 % en masse dans de l’eau est utilisée comme
indicateur du flux électroosmotique. Les nouveaux capillaires sont conditionnés en utilisant le
procédé de rinçage suivant : 5 min de rinçage au méthanol, suivi de 5 min d’eau ultra-pure, 10
min d’une solution aqueuse de NaOH à 1 M, 5 min d’eau ultra pure et enfin 20 min avec le
tampon de séparation. L’ensemble de ces rinçages est effectué avec l’application d’une
pression de 20 psi (1 psi = 6894,76 Pa) à l’entrée du capillaire.
Avant chaque injection, le capillaire est rincé pendant 5 min avec une solution de
NaOH à 0,1 M, 5 min avec de l’eau et équilibré 5 min avec le tampon de séparation. Les
échantillons sont introduits dans le capillaire en utilisant un mode hydrodynamique avec
l’application d’une pression de 0,8 psi pendant 5 s. Sachant qu’un effet Joule excessif à
l’intérieur du capillaire peut affecter l’équilibre d’association, les séparations sont effectuées à
une faible tension, égale à 4 kV, afin d’être dans le domaine de linéarité de la loi d’Ohm et
d’éviter tout effet Joule. Le capillaire est maintenu à une température constante de 25°C
pendant l’analyse. La détection du MPEG-AdPh en solution dans le tampon phosphate
s’effectue à 214 nm.
2) Etude de l’adsorption du soluté et du ligand à la surface du capillaire
L’évolution possible du flux électroosmotique résultant de l’adsorption (i) du MPEGAdPh ou (ii) de la β-CD-Sulf à la surface du capillaire a été vérifiée en utilisant les procédés
suivants. (i) Le MPEG-AdPh de masse 5000 g/mol a été injecté plusieurs fois en utilisant pour
tampon d’analyse un tampon phosphate de sodium. Après chaque injection de polymère, le
422
flux électroosmotique a été mesuré avec de la thiourée. (ii) Afin de contrôler l’adsorption de
la β-CD-Sulf, le capillaire est rincé plusieurs fois avec un tampon phosphate à 17 mM en βCD-Sulf, avant de mesurer la mobilité électroosmotique. Les conditions d’injection et de
rinçage sont les mêmes que celles reportées pour l’étude d’ACE
3) Mesures de viscosité
Pour étudier l’effet de l’addition de la β-CD-Sulf sur la viscosité du tampon, tous les tampons
contenant la cyclodextrine à différentes concentrations sont injectés dans le capillaire de façon
hydrodynamique à 0,8 psi pendant 5 s. Les échantillons injectés sont ensuite poussés dans le
capillaire sous une pression constante de 1 psi par le même tampon que celui injecté. Les
temps (t) nécessaires aux échantillons de tampons injectés pour atteindre le détecteur ont été
déterminés. Le facteur de correction ν (Cf. Equation II-37) pour chaque tampon a ensuite été
estimé à l’aide de la relation ν =
t
, avec t 0 le temps mis par un échantillon de tampon sans
0
t
β-CD-Sulf pour parcourir la longueur effective du capillaire sous une pression constante de 1
psi. La détection du front relatif aux différents tampons a été effectuée à 214 nm.
4) Détermination des constantes d’interaction
Le MPEG-AdPh (de masse moléculaire 2000 et 5000 g/mol) est dissous à 0,2 mM
dans de l’eau et analysé trois fois en utilisant des concentrations croissantes en β-CD-Sulf
dans le tampon d’analyse. Le tampon de séparation est un tampon phosphate de sodium à 25
mM et de pH = 7,0, contenant de 0 à 17 mM en β-CD-Sulf. La détermination des constantes
d’interaction est effectuée en calculant la mobilité électrophorétique µ i du MPEG-AdPh.
Cette mobilité électrophorétique est déterminée en soustrayant la mobilité électroosmotique
µ eo de la mobilité apparente µ app mesurée expérimentalement.
Afin de déterminer les constantes d’affinités K AL et les mobilités électrophorétiques
µ c des complexes, des méthodes de régression non linéaires et linéaires sont appliquées aux
données expérimentales. Toutes ces régressions sont effectuées en utilisant le logiciel Origin
5.0 Software (Microcal Sofawtare, Northampton, MA, USA)
423
Injection du COO--PEG-AdPh
Quelques essais ont été effectués avec le COO--PEG-AdPh (de masse moléculaire
5000 g/mol) dissous à 0,2 mM dans de l’eau. Le tampon de séparation est un tampon
phosphate à 25 mM et de pH = 7,0 sans cyclodextrine.
La détection de la mobilité électroosmotique et la détermination des mobilités
électrophorétiques µ i du COO--PEG-AdPh ont été effectuées suivant des conditions
identiques à celle décrites ci-dessus pour l’étude du MPEG-AdPh. De même, les procédés de
rinçage du capillaire, d’injection de l’échantillon, de séparation et de détection sont similaires
à l’étude ci-dessus.
424
ANNEXE 13
APPAREILLAGE CHROMATOGRAPHIQUE
ET REMPLISSAGE DES COLONNES
Appareillage chromatographique
Le système CLHP utilisé est constitué de deux pompes Shimadzu LC9A (Kyoto,
Japon) et d’un injecteur d’échantillon avec une boucle d’injection de 20 µL (Modéle 7125,
Rheodyne, Berkley, CA, USA). La détection des solutés est effectuée à l’aide d’un détecteur
UV Spectra 100 de longueur d’onde variable (Thermo-Finnigan, San Jose, CA, USA) ou d’un
réfractomètre différentiel Waters R 401 (St Quentin en Yvelines, France). Les expériences
d’analyse frontale sont effectuées avec une vanne à six voies placée avant l’injecteur
d’échantillon pour permette le passage instantané d’un éluant à un autre.
Remplissage des colonnes chromatographiques par le support de silice-polyβ-CD
Deux types de colonnes ont été utilisés :
(1) des colonnes en acier inox de dimensions 100 mm de longueur × 4,6 mm de
diamètre interne pour le support d’affinité (Cf. Chapitre II) et les phases chromatographiques
de fonctionnalités variables (Cf. Chapitre III)
(2) des colonnes en poly(éther éther cétone) (PEEK) de dimensions 30 mm de
longueur × 4,6 mm de diamètre interne pour le support d’immunoaffinité (Cf. Chapitre III)
Les colonnes ont été remplies par voie humide :
(1) colonnes en acier inox :
1 g de silice-polyβ-CD est mis en suspension dans 6 mL de tétrachlorure de carbone
(CCl4) puis la suspension est dégazée pendant 5 minutes aux ultrasons. La solution est ensuite
comprimée dans la colonne par un flux de dichlorométhane sous pression élevée (400 bars,
pompe Haskel, Touzart et Matignon). La colonne est ensuite placée sur l’appareillage
chromatographique et rincée au méthanol pendant 30 min à 1 mL/min et à l’eau pendant 1 h à
1 mL/min avant d’être testée.
(2) colonnes en PEEK :
425
0,3 g de silice-polyβ-CD est mis en suspension dans 1,5 mL d’eau ultra pure. La
solution est ensuite introduite dans la colonne par une aspiration sous vide par l’intermédiaire
d’une trompe à eau. La colonne est ensuite placée sur l’appareillage chromatographique et
rincée à l’eau pendant 1 h à 1 mL/min avant d’être testée.
426
ANNEXE 14
QUELQUES GRANDEURS CHROMATOGRAPHIQUES
Les grandeurs chromatographiques caractéristiques permettant d’estimer la rétention
d’un soluté dans une colonne et la qualité d’une séparation sont les suivantes :
-
Facteur de capacité ou facteur de rétention (k’) :
Le facteur de capacité ou facteur de rétention (k’) d’un soluté caractérise son affinité
pour la phase stationnaire et peut être exprimé à partir de son temps de rétention ( t R ) par la
relation :
k' =
( t R − t0 )
t0
avec t 0 le temps de rétention d’un composé non retenu par la phase stationnaire.
Cette grandeur est indépendante de la géométrie de la colonne.
-
Facteur de sélectivité (α):
Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics consécutifs 1 et 2, un
paramètre appelé facteur de sélectivité (ou rétention relative) (α) est utilisé :
α=
t R 2 − t0
t R 1 − t0
=
k' 2
k'1
Les indices 2 et 1 correspondent respectivement aux composés le plus retenu et le moins
retenu. Le facteur de sélectivité est ainsi toujours supérieur à 1.
-
Efficacité d’une colonne et nombre de plateaux théoriques
L’efficacité d’une colonne chromatographique, dont dépend l’étalement des pics, est
mesurée, pour chaque composé, par le nombre de plateaux théoriques N contenus dans la
colonne selon la relation :
427
2
t 
t 
N = 16  R  = 5,54  R 
ω 
δ 
2
avec ω la largeur du pic à la base et δ la largeur du pic à mi-hauteur.
Pour pouvoir comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs, un paramètre appelé
hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT ou H) a été défini :
HEPT = H =
L
N
avec L la longueur de la colonne
-
Facteur de résolution (RS)
Le facteur de résolution (RS) caractérise la qualité d’une séparation et prend en compte
l’écartement entre deux pics et leur largeur à la base du pic (ω) :
RS = 2
tR 2 − tR 1
ω 2 + ω1
La séparation entre deux pics est d’autant meilleure que le facteur de résolution (RS) est plus
élevé. Pour des pics gaussiens, la séparation peut être considérée correcte pour une valeur de
RS=1,5
428
ANNEXE 15
PREPARATION DU SUPPORT D’IMMUNOAFFINITE
•
Phase de silice-poyβ-cyclodextrine (de porosité 400 nm) synthétisée selon le
protocole décrit en annexe 3
•
Dextrane modifié de type Dext-Ad-COOH
•
Chlorure de sodium (Aldrich)
•
N-hydroxysuccinimide ou NHS (Aldrich)
•
Hydrochlorure
de
1-3(diméthylaminopropyl)-3éthylcarbodiimide
ou
EDC
(Aldrich)
•
Solution commerciale d’anti-albumine du sérum humain (Sigma, Ref A0433)
•
Eau ultra pure
•
Tampon PBS (tampon de pH = 8 à 10mM en phosphate et contenant 2,7mM de
KCl et 0,137M en NaCl)
Mode opératoire
1) Préparation du support d’immunoaffinité en mode statique (voie 1)
75 mg d’un dextrane de type Dext-Ad-COOH (dans le cas présent, utilisation du
Dext10-Ad-COOH, M = 10000g/mol, modifié à 7,3 % en groupes adamantyle et à 62 % en
fonctions COOH) sont mis en solution dans 2,5mL d’une solution de chlorure de sodium à
1M dans de l’eau ultra-pure. La solution est versée sur 470mg d’une phase de silice-poyβcyclodextrine de porosité 400 nm. L’ensemble est placé 2 à 3min aux ultrasons puis maintenu
sous agitation à température ambiante environ 16 heures. La solution est filtrée sous azote (sur
membrane d’acétate de cellulose 0,45 µm) et la phase est rincée avec 300mL d’eau ultra pure.
La silice ainsi recueillie est mise en suspension dans 10mL d’une solution aqueuse contenant
58mg (0,05M) de NHS et 383mg (0,2M) d’EDC. L’ensemble est maintenu sous agitation à
429
température ambiante pendant 1 heure puis filtré sous azote (sur membrane d’acétate de
cellulose 0,45 µm) et la phase est rincée avec 400mL d’eau ultra pure. La fixation de
l’anticorps sur la silice est effectuée par mise en suspension de cette dernière dans 2mL d’une
solution commerciale d’anti-ASH (à 9,5 mg/mL en protéines dont 5,5 mg/mL d’anticorps
spécifique en solution dans du tampon PBS à 10mM de pH = 7,2 et contenant 15 mM
d’azoture de sodium). L’ensemble est maintenu sous agitation à température ambiante
pendant 3 heures puis filtré sous azote (sur membrane d’acétate de cellulose 0,45 µm) et la
phase est rincée avec 600mL d’eau.
Une colonne en PEEK de 3cm de longueur est ensuite remplie avec la phase de silice
modifiée par les anticorps anti-ASH (Cf. Remplissage en annexe 13). Le support est rincé à
un débit de 1mL/min avec de l’eau (1h30) puis avec un tampon PBS (tampon de pH = 8 à
10mM en phosphate et contenant 2,7mM de KCl et 0,137M en NaCl) pendant 7 heures afin
de désactiver les fonctions d’ester de NHS n’ayant pas réagi.
2) Préparation in situ du support d’immunoaffinité (mode dynamique, voie 2)
Les conditions opératoires relatives à la synthèse du support d’immunoaffinité en
mode dynamique sont résumées dans le tableau ci dessous.
Réactifs
Concentration
Temps de
de la solution éluante
passage (h)
Débit de
la solution
éluante
(mL/min)
1
ère
étape
2ème
étape
Dext-Ad-COOH
1 mg/mL dans NaCl 1M
1,5
1
NHS/EDC
0,2M/0,05M dans l’eau
2
1
0,6
0,05
4
1
4,9 mg/mL en anticorps et
ème
3
Anti-ASH
14 mg/mL en protéines totales
dans du PBS 10mM, pH = 7,2
étape
(Vsolution=1,8mL)
4ème
étape
PBS pH = 8
10mM
430
La percolation des différentes solutions de réactifs s’effectue à un débit de 1mL/min (excepté
pour l’anticorps). Une solution de Dext-Ad-COOH (Dext10-Ad-COOH1), à 1 mg/mL dans du
chlorure de sodium à 1M, est éluée sur le support pendant 1h30 puis la phase est rincée à l’eau
pendant 1 heure. Un mélange de NHS/EDC à 0,05M/0,2M dans l’eau ultrapure est ensuite mis
à percoler pendant 2 heures et la phase est à nouveau rincée avec de l’eau, une quinzaine de
minutes au minimum. Le faible volume des solutions commerciales d’anticorps (en moyenne
2mL) ne permet pas d’effectuer une percolation à proprement dit, à moins de diluer
énormément le mélange. Afin de conserver la concentration élevée en anticorps de la solution
commerciale (14 mg/mL en protéines dont 4,9 mg/mL d’anticorps spécifique en solution dans
du tampon PBS à 10mM de pH = 7,2 et contenant 15 mM d’azoture de sodium), celle-ci est
utilisée en l’état et les 1,8mL disponibles sont injectés dans la colonne par l’intermédiaire
d’une boucle d’injection de 2mL. Simultanément, le débit de la pompe est réduit à
0,05mL/min pour permettre une durée de contact relativement élevée (0,6 h) de l’anticorps
avec le support et favoriser la réaction de greffage. La colonne est ensuite rincée à l’eau
quelques minutes et une solution tampon PBS (tampon de pH = 8 à 10 mM en phosphate et
contenant 2,7 mM de KCl et 0,137 M en NaCl) est élué sur le support pendant 4 heures pour
éliminer les fonctions résiduelles ester de NHS.
431
ANNEXE 16
CARACTERISTIQUES DE LA CELLULE D’INTERACTIONS
DU SYSTEME OPTIQUE DE RPS
La cuve utilisée pour mener les expériences de RPS est taillée dans un bloc de
10 x 15 x 25 mm3 de téflon (Cf. Figure ci-dessous). Ce matériau présente l’avantage d’être
biocompatible avec les réactifs de l’étude et d’être suffisamment souple pour permettre aux
parois de la cuve d’épouser la forme du prisme et d’assurer une bonne étanchéité. La cuve
utilisée est de forme cylindrique afin de conduire à une circulation homogène des réactifs et
ses dimensions de 8 mm de diamètre interne x 300 µm de hauteur engendrent un volume
raisonnable de 15 µL. L’entrée et la sortie des réactifs dans la cuve sont assurées par deux
ouvertures de diamètre 400 µm dans le bloc de téflon respectivement positionnées en bas et
en haut de la cellule.
Sortie des solutions
Cuve
Entrée des solutions
Sens du flux
à l’intérieur de la cuve
Bloc de téflon
Cellule d’interactions mise en jeu dans les études menées par RPS
432
ANNEXE 17
IMMOBILISATION DE LA β -CYCLODEXTRINE AMINEE (β -CD-NH2)
SUR UNE SURFACE D’OR
•
Acide 11-mercaptoundécanoïque ou MUA (Aldrich)
•
β-CD-NH2 (Cf. Synthèse au chapitre I, paragraphe III.1.2 et annexe 2)
•
Hydrochlorure
de
1,3-(diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide
ou
EDC
(Aldrich)
•
•
Ethanolamine (Aldrich)
•
Ethanol (SDS)
•
Eau ultra pure
L’ensemble des tampons et échantillons injectés est préparé avec de l’eau ultra-pure obtenue
avec un système Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) et filtré sur des membranes
d’acétate de cellulose (0,45 µm) (Millipore)
Mode opératoire
1) 1ère étape : Dépôt de l’agent de couplage, le MUA, sur la lame d’or
La circulation de solvants organiques dans la cellule du dispositif optique n’est pas
compatible avec les matériaux utilisés. Ainsi, l’utilisation de l’éthanol lors de cette étape ne
permet pas de suivre par RPS la fixation en temps réel du MUA sur la surface, la réaction doit
donc être effectuée en mode statique.
Pour ce faire, 11 mg de MUA sont dissous dans 50 mL d’éthanol (soit une solution à 1
mM) puis la solution est filtrée sous azote (sur membrane d’acétate de cellulose 0,45 µm). La
solution est versée dans une boite de pétri puis la lame d’or y est immergée. La boite de pétri
433
est ensuite placée sur un banc d’agitation mécanique durant 16 heures. La surface de l’or est
ensuite lavée par immersion de la lame dans un bain d’éthanol (trois lavages) afin d’éliminer
le MUA non greffé à la surface, puis dans un bain d’eau (trois lavages).
2) 2ème étape : Activation de la fonction acide carboxylique du MUA en ester de Nhydroxysuccinimide (ester de NHS)
Cette étape s’effectuant en milieu aqueux peut être effectuée en mode statique ou dans
la cellule du dispositif optique de RPS.
Mode statique :
383 mg d’EDC et 58 mg de NHS sont dissous dans 10 mL d’eau ultra pure (soit un
rapport molaire d’EDC/NHS = 0,2 M/0,05 M) puis la solution obtenue est filtrée sous azote
(sur membrane d’acétate de cellulose 0,45 µm). La lame d’or-MUA est ensuite immergée
dans cette solution et l’ensemble est placé sur le banc d’agitation mécanique pendant 30 min.
La lame est ensuite rincée trois fois à l’eau avant d’être placée sur le dispositif optique de
RPS.
Mode dynamique :
La lame d’or-MUA est placée sur le dispositif optique de RPS et la surface est rincée
avec de l’eau jusqu’à stabilisation de la réflectivité. Une solution d’EDC/NHS de rapport
molaire identique à celui utilisé en mode statique est ensuite mise à circuler pendant 15 à 20
minutes sur la surface puis cette dernière est rincée au moins 10 minutes avec de l’eau.
3) 3ème étape : Couplage de la β-CD-NH2 au MUA activé
Cette étape s’effectuant dans de l’eau, le greffage de la cyclodextrine peut être suivi en
temps réel par RPS. Une solution aqueuse de 10 mg/mL de β-CD-NH2 est mise à circuler
pendant 30 minutes sur la surface puis cette dernière est rincée au moins 10 minutes avec de
l’eau jusqu’à stabilisation de la réflectivité.
4) 4ème étape : Désactivation des fonctions ester de NHS résiduelles
434
Une solution d’éthanolamine à 0,5 M et de pH = 7,8 est mise à circuler pendant 10 minutes
sur la surface afin de convertir les fonctions ester de NHS résiduelles en 2hydroxyéthylamide. La surface est ensuite rincée 10 minutes avec de l’eau.
435
ANNEXE 18
SYNTHESE DE LA β -LACTOGLOBULINE MODIFIEE
PAR DES GREFFONS DE PEG-AdPh :
β-LACTOGLOBULINE-PEG-AdPh
•
Polymère de type HOOC-PEG-AdPh (Cf. Synthèse au Chapitre I, paragraphe
III.2.3.b, et annexe 5)
•
Dicyclohexylcarbodiimide ou DCC (Aldrich)
•
•
β-lactoglobuline (M = 36 000 g/mol) de pureté minimum = 80 % (Sigma)
•
Chloroforme (SDS)
•
•
Tampon phosphate 30 mM à pH = 7
Mode opératoire
1) 1ère étape : Activation de l’extrémité carboxylée du polymère AdPh-PEG-COOH par
formation d’un ester de N-hydroxysuccinimide (NHS) : obtention de l’espèce AdPh-PEGCOONHS
La verrerie est séchée une nuit à l’étuve avant de procéder à la synthèse.
3 mL de chloroforme sont amenés à 0°C à l’aide d’un bain de glace. Puis 200 mg (4.10-2
mmol) de HOOC-PEG-AdPh (M = 4926 g/mol) et 37 mg (0,18 mmol) de DCC sont ajoutés
au solvant. Le milieu réactionnel est maintenu pendant 2 heures à 0°C sous agitation douce.
37 mg (0,32 mmol) de NHS sont ensuite ajoutés au mélange et celui-ci est maintenu sous
agitation pendant 30 minutes à 0°C. La solution est filtrée à l’aide d’un système swinex sur
une membrane acétate de cellulose régénérée 0,45 µm et le filtrat recueilli est précipité dans
436
40 mL d’éther. La solution est ensuite filtrée sous azote sur une membrane d’acétate de
cellulose régénérée 0.45 µm et le solide ainsi recueilli est séché sous vide.
2) 2ème étape : Couplage du polymère activé AdPh-PEG-COONHS à la β-lactoglobuline :
obtention de l’espèce AdPh-PEG- β-lactoglobuline
3 mL de tampon phosphate 30 mM à pH = 7 sont amenés à 0°C à l’aide d’un bain de glace.
100 mg (2,8 10-3 mmol) de β-lactoglobuline sont ajoutés au tampon et la solution est
maintenue 5 minutes à 0°C sous agitation. Après addition de 66 mg (1,3 10-2 mmol) de
polymère AdPh-PEG-COONHS (M = 5023 g/mol) à la solution, cette dernière est maintenue
sous agitation pendant 45 minutes à 0°C. 10 mL d’eau distillée sont ajoutés au milieu
réactionnel. Le mélange est mis à dialyser contre de l’eau pendant 72 heures sur membrane
Spectra/Por de seuil de coupure 15 000 puis la solution est lyophilisée. La protéine modifiée
ainsi recueillie est conservée à -20°C.
437
ANNEXE 19
ANALYSE DE LA β -LACTOGLOBULINE-PEG-AdPh PAR EC
Appareillage
Cf. Annexe 12
Solutés :
•
β-lactoglobuline-PEG-AdPh (Cf. synthèse au chapitre IV, paragraphe IV.1, et
annexe 18)
•
β-lactoglobuline (M = 36 000 g/mol) de pureté minimum = 80 % (Aldrich)
•
COOH-PEG-AdPh de masse moléculaire 5000 g/mol (Cf. synthèse au chapitre I,
paragraphe III.3.3.b, et annexe 6)
Divers :
•
DMSO (SDS) pour la mesure de la mobilité du flux électroosmotique
•
Tampon phosphate à 25 mM de pH = 7
•
Solution aqueuse de NaOH à 0,1 M (Interchrom)
•
Eau ultra pure
Méthodes
Chaque soluté est dissous à 1 mg/mL dans l’eau ce qui correspond à une concentration
d’environ 0,2 mM pour le COOH-PEG-AdPh, 0,03 mM pour la β-lactoglobuline et une
concentration inférieure à 0,03 mM pour la β-lactoglobuline-PEG-AdPh (M > 36 000 g/mol).
Le tampon d’analyse est un tampon phosphate à 25 mM et de pH = 7,0. La mobilité
électrophorétique est déterminée en soustrayant la mobilité électroosmotique µ eo de la
mobilité apparente µ app mesurée expérimentalement. Une solution de DMSO à 0,01 % en
438
masse dans de l’eau est utilisée comme indicateur du flux électroosmotique (détection à 280
nm). Les analyses sont répétées au moins deux fois.
Avant chaque injection, le capillaire est rincé pendant 5 min avec une solution de
NaOH à 0,1 M, 5 min avec de l’eau et équilibré 5 min avec le tampon d’analyse. L’ensemble
de ce rinçage est effectué avec l’application d’une pression de 20 psi (1 psi = 6894,76 Pa) à
l’entrée du capillaire.
Les échantillons sont introduits dans le capillaire en utilisant un mode hydrodynamique avec
l’application d’une pression de 0,8 psi pendant 5 s. Les séparations sont effectuées à 15 kV.
Le capillaire est maintenu à une température constante de 25°C pendant l’analyse. La
détection des espèces en solution dans le tampon phosphate s’effectue à 214 nm.
439
RESUME
Résumé en français :
Le phénomène d’association aux interfaces par formation de complexes d’inclusion entre des molécules de βcyclodextrine (β-CD) et des polymères amphiphiles modifiés par des groupements adamantyle a été mis en jeu pour la
fonctionnalisation de surfaces. Ce procédé a ensuite été appliqué à l’élaboration d’un immunocapteur.
Dans la première partie de ce travail, des études théoriques menées par électrophorèse capillaire d’affinité (ACE) et par
chromatographie liquide à haute performance (CLHP) ont permis de déterminer les constantes d’affinité en solution entre des
molécules de β -CD et des polymères modèles de poly(éthylène glycol)s modifiés par des groupements hydrophobes
adamantyle. D’autre part, l’utilisation d’un support chromatographique à base de β -CD a permis d’accéder aux constantes
aux interfaces.
Dans une seconde partie, la faisabilité d’un procédé de fonctionnalisation d’une surface par l’intermédiaire de
complexes d’inclusion a été démontrée par CLHP par l’élaboration de supports chromatographiques de fonctionnalités
variables. Pour cela, un polymère de β-CD a été greffé sur de la silice diol puis la fixation sur le support de dextranes
modifiés par des groupements adamantyle et des groupements de fonctionnalités diverses (ioniques, hydrophobes ou
molécules biologiques) a été étudiée. Les propriétés de surface des supports ainsi obtenus ont été révélées par l’étude de la
rétention de protéines en fonction de la composition de la phase mobile ou par la capture d’un antigène dans le cas particulier
de la phase stationnaire modifiée par des anticorps.
Enfin, la formation de complexes d’inclusion aux interfaces a été mise à profit pour la réalisation
d’immunocapteurs. L’élaboration de ces systèmes analytiques a été suivie en temps réel par résonance des plasmons de
surface (RPS). Deux procédés d’élaboration ont été envisagés. Ces deux voies ont nécessité de déposer préalablement une
couche de β-CD sur une surface d’or. Puis, la première méthode a consisté à immobiliser sur la surface la protéine d’intérêt
préalablement modifiée par des groupements adamantyle. La seconde méthode a impliqué l’immobilisation sur la surface de
β-CD d’une couche intermédiaire de dextrane porteur de groupements adamantyle et de groupements fonctionnels permettant
le greffage ultérieur de la protéine d’intérêt. Les biocapteurs issus de ces deux voies ont conduit à une reconnaissance
spécifique et reproductible des anticorps correspondants.
Mots-clés : β-cyclodextrine ; adamantane ; constantes d’interaction ; électrophorèse capillaire ; supports de CLHP ;
immunocapteur ; β-lactoglobuline
Titre en anglais :
FUNCTIONALIZATION OF SURFACES BY THE INTERMEDIATE OF THE ADAMANTANE / β-CYCLODEXTRIN
SYSTEM; APPLICATION OF THE METHOD FOR THE ELABORATION OF AN IMMUNOSENSOR
Résumé en anglais :
The association between molecules of β-cyclodextrin (β -CD) and amphiphilic adamantyl-modified polymers by
formation of inclusion complexes at solid/liquid interfaces was used for the functionalization of surfaces and the elaboration
of an immunosensor. At first, theoretical studies led to the determination of affinity constants in solution and at interfaces
between molecules of β-CD and model polymers bearing adamantyl groups. Then, the method used for the functionalization
of surfaces by formation of inclusion complexes was validated by the modification of surface properties of silica particles and
by the elaboration of chromatographic supports of various functionalities. At least, the formation of inclusion complexes at
interfaces was used for the elaboration of β-lactoglobulin-coated immunosensors. The sensors prepared following this
procedure permitted the specific and reproducible detection of the corresponding antibodies.
Key-words : β -cyclodextrin ; adamantane ; binding constants ; capillary electrophoresis ; HPLC supports ; immunosensor ;
β-lactoglobulin

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