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THESE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté de Médecine et Pharmacie)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : BioSanté N°524
Champs disciplinaires : Biologie, Médecine, Santé
Secteur de Recherche : Recherche clinique, innovation thérapeutique, santé publique
Présentée par :
Yoann Sottejeau
************************
DEVENIR DE LA NA+, K+-ATPASE DANS L'ISCHEMIE REPERFUSION CARDIAQUE
(De sa régulation aux compléments alimentaires)
************************
Directeur de Thèse :
Jean Michel Maixent
Codirecteur de Thèse:
Sandrine Pierre
Ghislaine Gerber
************************
Soutenue le 12 Décembre 2011
Devant la Commission d’Examen
************************
JURY
Jean-François Faivre
Monique Bernard
Thomas A. Pressley
Zijian Xie
Université de Poitiers
CRMBM / CNRS UMR 6612
University of Texas Tech
University of Toledo
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Remerciements
Remerciements
Je
tiens
à
remercier
chaleureusement
mes
co-directeurs
de
thèse
:
- le Pr Jean-Michel Maixent qui m'a soutenu, conseillé durant ces quatre ans de thèse
et qui en 2003 m'a fait traverser l'Atlantique direction Toledo.
- le Dr Sandrine Pierre qui m'a accueilli, encadré et m'a fait évoluer dans mon
approche scientifique.
- Mme Ghislaine Gerber pour m'avoir permis de continuer cette aventure américaine,
pour la confiance qu'elle m'a accordée pour mener à bien le projet scientifique
d'Holistica et de m'avoir fait découvrir la recherche en entreprise.
Je souhaite adresser mes plus vifs remerciements au Pr Amir Askari, chairman du
département de "Physiology, Pharmacology, Metabolism, and Cardiovascular
Sciences" de l'University of Toledo (USA) pour m'avoir accueilli au sein de son
département au début de ma thèse et à son remplaçant le Pr Nader Abraham; au Pr
Gérard Mauco, directeur de l'unité INSERM U927 pour m'avoir accueilli au sein du
laboratoire à Poitiers.
J'adresse de profonds remerciements au Pr Zijian Xie pour son soutien, ses
explications, ses conseils éclairés ainsi que pour ses questions pertinentes au
labmeeting.
Je tiens tout particulièrement à remercier le Dr Thomas Pressley (University de Texas
Tech) et le Dr Gustavo Blanco (University of Kansas) et le Dr Peter Lauf (Wright
State University) avec qui j'ai pu collaborer durant ce stage, le Dr David Giovannucci,
le Dr Andrea Kalinoski pour leurs aides précieuses et conseils sur l'utilisation du
microscope confocale, le Pr Andrew Beavis pour m'avoir intégré aux activités de
l'école doctorale de l'University of Toledo et encouragé à présenter chaque année au
Pharmacology Research Colloquium, le Dr Guillermo Vasquez pour m'avoir permis
d'utiliser son laboratoire pour la culture cellulaire et le Dr Daniel Marc pour m'avoir
fait prendre goût à la recherche scientifique.
Devenir de la Na+, K+-ATPase dans l'ischémie reperfusion cardiaque
Yoann Sottejeau
2
Remerciements
Je voudrais remercier également mes partenaires institutionnels publiques : l'école
doctorale Biosanté de l'Université de Poitiers, le Ministère de l'Education Nationale de
l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, l' ANRT ainsi que l'entreprise Holistica
pour leur participation dans mon financement CIFRE.
Je remercie les membres du laboratoire du Dr Pierre, ceux du Pr Xie et Pr Askari pour
leur soutien permanent et leurs nombreux conseils plus particulièrement Qiming
Duan, Jiang Tian, Luis Quintas, Eric Morgan, Liu Lijun, Margie et Mano.
Je remercie mes collègues du laboratoire du Pr Maixent, Mathieu Chaillou, Phillipe
Rigouard, Mourad Fares, Céline François, Emmanuelle Jolivet, Stéphane Sardrin pour
les conversations constructives que j'ai eu avec eux lors de mes venues à Poitiers, ainsi
que les salariés d'Holistica avec qui j'ai pu échanger.
Je voudrais exprimer ma profonde reconnaissance à Martha Heck, Karen Edwards,
Marianne Miller Jasper, Debra Lebarr, Anita Easterly et Elizabeth Akeman du
secrétariat du département de "Physiology, Pharmacology, Metabolism, and
Cardiovascular Sciences" de l'University of Toledo pour l'aide apportée pendant ses
quatre années sans qui rien n'aurait été possible.
Je remercie Amit Patel, Susan Salari, Karen Judd, Paula Kinoshita et Bernard Wang
pour leur patience, leur écoute lorsque je les ai formé au laboratoire et pour les travaux
que nous avons réalisés ensemble.
Un grand merci et une pensée pour mes amis de l'University of Toledo : Lucas, JeanYves, Angela, Danny, MJ, Brian, Bernard, Joae, Nitin, Kathy, Jihad, Lisa, Rudel,
Maria qui ont facilité mon intégration et permis de passer dans la joie et la bonne
humeur les rudes hivers de l'Ohio ainsi qu'au Dr Manning et à toute l'équipe de
football de l'Université de Toledo pour ses parties endiablées.
Yoann Sottejeau
3
Remerciements
Je remercie du fond du cœur :
Aude, ma compagne, ma collègue : Merci pour ces formidables années américaines
passées au laboratoire et dans la vie de tous les jours ainsi que pour nos futurs
projets.
Jan et Erika Rizzo, ma famille américaine : Merci pour les cours d'anglais, les
leçons de golf, les théories de Lost et vos invitations de Thanksgiving et 4th of July.
A ma famille, mes parents et mon frère : Merci de votre soutien, de votre écoute, de
votre réconfort indispensables à la réalisation de mes projets même les plus fous.
Yoann Sottejeau
4
Publications et Communications
5
Articles publiés :
Chaillou M, Rigoard P, Fares M, François C, Sottejeau Y, Maixent JM., Relation
between Į-isoform and phosphatase activity of Na+,K+-ATPase in rat skeletal muscle
fiber types., Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2011 Jul 25;57 Suppl:OL1520-7.
(Annexe)
Pierre SV, Belliard A, Sottejeau Y., ."Modulation of Na+, K+-ATPase cell surface
abundance through structural determinants on the {alpha}1-subunit", Am J Physiol
Cell Physiol. 2011 Jan;300(1):C42-8. (Résultats)
Sottejeau Y, Patel AM, Gerber G, Pierre SV, Maixent JM., Effect of a novel
Omegacoeur®/Doluperine® nutritional combination on human embryonic kidney cell
viability., Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2010 Oct 5;56 Suppl:OL1400-9.
(Résultats)
Sottejeau Y, Belliard A, Duran MJ, Pressley TA, Pierre SV., Critical role of the
isoform-specific region in alpha1-Na,K-ATPase trafficking and protein Kinase Cdependent regulation., Biochemistry. 2010 May 4;49(17):3602-10. (Résultats)
Rigoard P, Chaillou M, Fares M, Sottejeau Y, Giot JP, Honfo-Ga C, Rohan J,
Lapierre
F,
Maixent
JM.,
[Energetic
applications:
Na+/K+-ATPase
and
neuromuscular transmission], Neurochirurgie. 2009 Mar;55 Suppl 1:S92-103.
(Annexe)
Pierre SV, Sottejeau Y, Gourbeau JM, Sánchez G, Shidyak A, Blanco G., Isoform
specificity of Na-K-ATPase-mediated ouabain signaling., Am J Physiol Renal Physiol.
2008 Apr;294(4). (Résultats)
Yoann Sottejeau
6
Communication affichées :
Sottejeau Y, Belliard A, Pierre SV, Modulation of Na/K-ATPase surface abundance
during ischemia/reperfusion injury in rat cardiac myocytes Présenté durant les
événements suivants :
- Experimemtal Biology 2011, Washington D.C., USA. 9-13 Avril 2011
- Printemps de la cardiologie 2011, Lyon, France, 12-14 mai 2011
Sottejeau Y, Patel AM, Gerber G, Pierre SV, Maixent JM., Effect of a novel
Omegacoeur®/Doluperine® nutritional combination on human embryonic kidney cell
viability. Présenté à l' Experimemtal Biology 2011, Washington D.C., USA. 9-13
Avril 2011
Sottejeau
Y,
Belliard
A,
Pierre
SV.,
Na+,
K+-ATPase
alteration
by
ischemia/reperfusion Injury. Présenté durant les événements suivants :
- Inaugural Student Research Forum, Toledo, Ohio, USA. 17 Juin 2010
- 37th Pharmacology Research Colloquium, Lansing, Michigan, USA. 25 Juin 2010
- Ohio Physiology Society meeting, Cleveland, Ohio, USA. 14-15 Octobre 2010
Sottejeau Y, Belliard A, Patel AM., Morgan EE., Pierre SV. Ouabain protects
cardiac Na+, K+-ATPase during Ischemia/Reperfusion Injury. Présenté à l’University
of Toledo Medical Center Graduate Forum 2010, Toledo, Ohio, USA. 30-31 Mars
2010
Sottejeau Y, Morgan EE., Belliard A, Stebal C, Pierre SV. Ouabain Pre and Postconditioning
protects
cardiac
function
and
Na,K
ATPase
against
Ischemia/Reperfusion injury. Présenté au 36th Pharmacology Research Colloquium,
Detroit, Michigan, USA. 19 Juin 2009
Yoann Sottejeau
7
Sottejeau Y, Pierre SV, Duran MJ, Carr DL, Pressley TA, , The last residue of the
Na,K-ATPase catalytic subunit isoform specific region (ISR) plays a critical role in
Na,K-ATPase membrane trafficking. Présenté durant les événements suivants :
- University of Toledo Medical Center Graduate Forum 2008, Toledo, Ohio, USA. 2-3
Avril 2008
- Experimemtal Biology 2008, San Diego, California, USA. 5-9 Avril 2008 (non
présent, présenté par Dr Pierre)
- 35th Pharmacology Research Colloquium, Ann Arbor, Michigan, USA. 27 Juin 2008
Yoann Sottejeau
8
Table des matières
9
Table des matières
Remerciements ....................................................................................................................... 2
Publications et Communications................................................................................................ 5
Articles publiés : .................................................................................................................... 6
Communication affichées :..................................................................................................... 7
Table des matières...................................................................................................................... 9
Table des illustrations .......................................................................................................... 14
Liste des figures ............................................................................................................... 14
Liste des tableaux ............................................................................................................. 15
Abréviations ............................................................................................................................. 16
Introduction .............................................................................................................................. 20
I
Physiologie et Pathophysiologie cardiaque, traitement et prévention ......................... 21
1
Physiologie du cœur ................................................................................................. 21
2
Maladies cardiovasculaires ...................................................................................... 24
a
L'infarctus du myocarde ....................................................................................... 25
i
Définition ......................................................................................................... 25
ii Symptômes et dépistage ................................................................................... 27
iii Facteurs de risques ........................................................................................... 30
b
L'insuffisance cardiaque....................................................................................... 33
i
Définition ......................................................................................................... 33
ii Symptômes et dépistage ................................................................................... 33
3
Traitements cliniques ............................................................................................... 35
a
L'infarctus du myocarde ....................................................................................... 35
b
L'insuffisance cardiaque....................................................................................... 37
c
Approche du complément alimentaire ................................................................. 38
4
Phénomène de l’ischémie/reperfusion ..................................................................... 38
a
D’un niveau organique ......................................................................................... 38
b
Du niveau de la cellule ......................................................................................... 39
5
Recherche préclinique sur ischémie/reperfusion ..................................................... 41
a
Modèle utilisé....................................................................................................... 41
i
in vitro .............................................................................................................. 42
ii ex vivo .............................................................................................................. 44
iii in vivo............................................................................................................... 45
b
Protection ............................................................................................................. 46
i
Preconditioning ................................................................................................ 46
ii Perconditioning ................................................................................................ 49
iii Postconditioning............................................................................................... 49
II Na+, K+-ATPase ........................................................................................................... 51
1
Famille et Structure .................................................................................................. 51
a
Sous-unités et Isoformes ...................................................................................... 52
i
Sous-unité Į...................................................................................................... 52
ii Sous-unité ȕ...................................................................................................... 53
iii Sous-unité Ȗ ...................................................................................................... 55
2
Fonction / Régulation ............................................................................................... 55
a
Echangeur d’ions.................................................................................................. 56
i
Participation au maintien du potentiel de membrane et de l'excitabilité des
cellules nerveuses et musculaires............................................................................. 56
ii Régulation de la balance osmotique et du volume cellulaire........................... 56
iii Fonctionnement des co-transports liés à l'ion sodium...................................... 57
iv Mécanisme réactionnel de la Na+,K+-ATPase................................................ 57
Yoann Sottejeau
10
III
1
2
3
4
5
6
7
Table des matières
b
Fonction de signalisation...................................................................................... 58
i
Mécanisme réactionnel..................................................................................... 58
ii Régulation des fonctions cellulaires................................................................. 60
iii Interaction Na+, K+-ATPase et Src................................................................... 60
iv "Pumping pool" et "Non-pumping pool" de la Na+, K+-ATPase ..................... 61
v
Spécificité liée aux isoformes .......................................................................... 62
c
Ligand spécifique de la Na+, K+-ATPase, les stéroïdes cardiotoniques............... 62
d
Régulation de la Na+, K+-ATPase par les PKC.................................................... 63
i
Rôle des PKC ................................................................................................... 63
ii La famille des PKC et leurs structures ............................................................. 64
iii Action du diacylglycérol et des phorbol ester sur les PKC.............................. 64
iv Régulation des isoformes Į de la Na+, K+-ATPase par les PKC...................... 65
v
Rôle de la partie N terminale de l' Į1 dans la régulation de la Na+, K+-ATPase
par les PKC............................................................................................................... 65
vi Rôle de la diversité de l'ISR dans la régulation de la Na+, K+-ATPase par les
PKC 66
e
Muscle cardiaque et Na+, K+-ATPase .................................................................. 66
i
Muscle cardiaque ............................................................................................. 66
ii Durant ischémie/reperfusion cardiaque............................................................ 67
iii Durant la protection (ouabaïne preconditioning) ............................................. 67
Application en Nutrition .............................................................................................. 69
Le complément alimentaire et la réglementation européenne.................................. 69
a
Allégation santé.................................................................................................... 70
i
dans le domaine cardiovasculaire..................................................................... 71
Régime méditerranéen.............................................................................................. 71
Omégacoeur® .......................................................................................................... 72
a
ȍ 3........................................................................................................................ 73
b
ȍ 6........................................................................................................................ 75
c
ȍ 9........................................................................................................................ 76
d
Basilic................................................................................................................... 77
e
Ail......................................................................................................................... 77
Régime ayuvédique .................................................................................................. 77
Dolupérine®............................................................................................................. 77
a
Curcuma ............................................................................................................... 78
b
Poivre ................................................................................................................... 78
c
Gingembre............................................................................................................ 78
Incidence de ces régimes sur les maladies cardiovasculaires .................................. 79
a
Régime méditerranéen.......................................................................................... 79
i
ȍ 3.................................................................................................................... 79
ii ȍ 6.................................................................................................................... 81
iii ȍ 9.................................................................................................................... 81
iv Basilic............................................................................................................... 81
v
Ail..................................................................................................................... 81
b
Régime ayuverdique............................................................................................. 82
i
Curcuma ........................................................................................................... 82
ii Poivre ............................................................................................................... 82
iii Gingembre........................................................................................................ 82
Incidence de ces régimes sur la Na+, K+-ATPase .................................................... 82
a
Régime méditerranéen.......................................................................................... 83
b
Ayuverdique ......................................................................................................... 83
Yoann Sottejeau
11
Table des matières
Problématiques et Objectifs ..................................................................................................... 85
I
Différence des isoformes Į de la Na+, K+-ATPase ...................................................... 86
II Caractérisation de la Na+, K+-ATPase durant ischémie/reperfusion cardiaque ........... 86
III Effets cardiovasculaires de l'association des composés Omégacoeur® et Dolupérine®
87
Matériels et Méthodes .............................................................................................................. 88
I
Culture Cellulaire ......................................................................................................... 89
1
Lignée de rein d’opossum : OK ............................................................................... 89
2
Lignée de rein de porc : LLC-PK1 et ses lignées modifiées PY17 et AAC19 ........ 89
3
Lignée embryonnaire de rein humain : HEK 293 .................................................... 89
4
Conditions de culture des lignées cellulaires ........................................................... 90
5
Cellules primaires de myocytes cardiaques néonataux de rats sains ....................... 90
II La transfection.............................................................................................................. 91
1
Création de lignées stables ....................................................................................... 91
2
Transfection transitoire par lipofection.................................................................... 92
III Induction de l’ischémie/reperfusion............................................................................. 92
1
Technique ................................................................................................................. 92
2
Protocole................................................................................................................... 93
IV
Mesure du transport ionique et de l’activité enzymatique de la Na K ATPase ....... 94
1
Mesure du transport ionique : assimilation du Rubidium ........................................ 94
2
Mesure de l’activité enzymatique totale .................................................................. 95
V L’immunodétection ...................................................................................................... 96
1
Extraction des protéines totales................................................................................ 96
2
Western-Blot ............................................................................................................ 96
3
Immunofluorescence indirecte ................................................................................. 97
VI
Technique de biotynilation....................................................................................... 98
1
Mesure des protéines membranaires ........................................................................ 98
2
Mesure des protéines endocytées ............................................................................. 98
VII
Mesure de viabilité cellulaire ................................................................................... 99
1
Test de viabilité : coloration au bleu de trypan ........................................................ 99
a
Principe................................................................................................................. 99
b
Technique ............................................................................................................. 99
2
Test de cytotoxicité cellulaire : mesure du relâchement de LDH .......................... 100
a
Principe............................................................................................................... 100
b
Technique ........................................................................................................... 100
3
Mesure de la mort cellulaire : marquage Annexin V / Propidium Iodide .............. 101
a
Principe............................................................................................................... 101
b
Technique ........................................................................................................... 101
VIII La microscopie à lumière transmise....................................................................... 102
IX
La microscopie confocale....................................................................................... 102
X Association des solutions Omégacoeur® et Dolupérine®......................................... 102
1
Choix des doses...................................................................................................... 102
2
Préparation des solutions Omégacoeur® et Dolupérine® ..................................... 103
XI
Analyse statistiques des données ........................................................................... 103
Résultats ................................................................................................................................. 104
I
Etude de la fonction de signalisation des isoformes de la Na+, K+-ATPase .............. 105
1
Article : Pierre SV, Sottejeau Y, Gourbeau JM, Sánchez G, Shidyak A, Blanco G.,
Isoform specificity of Na-K-ATPase-mediated ouabain signaling., Am J Physiol Renal
Physiol. 2008 Apr;294(4):F859-66.. .............................................................................. 105
2
Données supplémentaires....................................................................................... 115
Yoann Sottejeau
12
Table des matières
II Etude de la Na , K -ATPase dans des cellules rénales .............................................. 115
1
rôle de la Na+, K+-ATPase "Isoform Specific Region".......................................... 115
a
Article : Sottejeau Y, Belliard A, Duran MJ, Pressley TA, Pierre SV., Critical
role of the isoform-specific region in alpha1-Na,K-ATPase trafficking and protein
Kinase C-dependent regulation., Biochemistry. 2010 May 4;49(17):3602-10.......... 115
2
lors de l’ischémie reperfusion ................................................................................ 126
a
Article : Pierre SV, Belliard A, Sottejeau Y., Modulation of Na(+)-K(+)-ATPase
cell surface abundance through structural determinants on the Į1-subunit., Am J
Physiol Cell Physiol. 2011 Jan;300(1):C42-8............................................................ 126
III Etude de la Na+, K+-ATPase lors de ischémie reperfusion dans les cellules cardiaques
135
1
Données supplémentaires....................................................................................... 135
IV
Etude de la toxicité de l'association des composés Omégacoeur® et Dolupérine®
dans des cellules humaines................................................................................................. 160
V Protocole d'essai clinique de l'association composés Omégacoeur® et Dolupérine®
dans une protection cardiovasculaire ................................................................................. 171
Discussion et Perspectives ..................................................................................................... 177
I
Na+, K+-ATPase, signalisation et IR .......................................................................... 178
II Na+, K+-ATPase, endocytose et IR ............................................................................ 181
III Effets cardiovasculaires de l'association des composés Omégacoeur® et Dolupérine®
185
Conclusion.............................................................................................................................. 188
Références Bibliographiques ................................................................................................. 191
Annexes.................................................................................................................................. 220
Publication non présenté : Rigoard P, Chaillou M, Fares M, Sottejeau Y, Giot JP, HonfoGa C, Rohan J, Lapierre F, Maixent JM., [Energetic applications: Na+/K+-ATPase and
neuromuscular transmission], Neurochirurgie. 2009 Mar;55 Suppl 1:S92-103. ............... 221
Publication non présenté : Chaillou M, Rigoard P, Fares M, Francois C, Sottejeau Y,
Maixent JM., Relation between Į-isoform and phosphatase activity of Na+,K+-ATPase in
rat skeletal muscle fiber types., Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2011 Jul 25;57
Suppl:OL1520-7................................................................................................................. 234
Résumé ................................................................................................................................... 243
+
+
Yoann Sottejeau
13
Table des matières
Table des illustrations
Liste des figures
Figure 1 Représentation schématique de l’anatomie du cœur ................................................. 22
Figure 2 Représentation schématique du tissu nodal ............................................................... 23
Figure 3 Représentation schématique de la paroi cardiaque.................................................... 23
Figure 4 Représentation schématique de l'infarctus du myocarde ........................................... 26
Figure 5 Représentation d'une onde d'ECG normal ................................................................. 28
Figure 6 Détection des principaux biomarqueurs de l’IDM adapté de [14] ............................ 30
Figure 7 Hospitalisations en soins de courte durée pour cardiopathie ischémique selon l’âge
en 2006 d'après [17] ......................................................................................................... 31
Figure 8 Mise en place d'un stent............................................................................................. 36
Figure 9 Induction de la mort cellulaire par l'ischémie/reperfusion adaptée de [52]............... 41
Figure 10 Reproduction des zones ischémiques par la technique de "Coverslip Hypoxia" .... 43
Figure 11 Représentation schématique d'un système de cœur isolé perfusé............................ 45
Figure 12 Mécanisme de protection du Preconditioning ......................................................... 48
Figure 13 Mécanisme de protection du Postconditioning........................................................ 50
Figure 14 Structure primaire de la sous-unité Į de la Na+, K+-ATPase................................... 52
Figure 15 Structure primaire de la sous-unité ȕ de la Na+, K+-ATPase................................... 54
Figure 16 Structure primaire de la sous-unité Ȗ de la Na+, K+-ATPase ................................... 55
Figure 17 Fonction d'échangeur d’ions de Na+, K+-ATPase.................................................... 56
Figure 18 Cycle réactionnel de la Na+, K+-ATPase dit cycle de Post-Albers.......................... 58
Figure 19 Fonction de signalisation de la Na+, K+-ATPase..................................................... 59
Figure 20 Représentation schématique des six de domaines de Src ........................................ 61
Figure 21 Structure chimique des molécules d'ouabaïne, digoxine et marinobufagénine ....... 63
Figure 22 Structure des différentes PKC adaptée de [153]...................................................... 64
Figure 23 Différence de séquences de l' ISR des isoformes Į de la Na+, K+-ATPase ............. 66
Figure 24 Base du régime méditerranéen adapté de [180]....................................................... 72
Figure 25 Formule chimique des principaux acides gras du groupe Ȧ-3................................. 74
Figure 26 Synthèse des acides gras du groupe Ȧ-3.................................................................. 74
Figure 27 Synthèse des acides gras du groupe Ȧ-6.................................................................. 76
Figure 28 Représentation schématique du positionnement des lamelles de verres pour la
technique de "Substrate and Coverslip hypoxia" ............................................................. 92
Figure 29 Protocole d'ischémie/reperfusion............................................................................. 94
Figure 30 Réaction chimique intervenant lors du dosage de la lactate déshydrogénase (LDH)
........................................................................................................................................ 100
Figure 31 Détection par Western Blot des sous-unités Į1 et Į2 de la Na+, K+-ATPase sur
différentes lignées cellulaires. Résultat représentatif de 3 expériences indépendantes sur
3 lignées cellulaires PY-17, AAC 19 et PY17- Į2 pour la détection des isorformes Į1 et
Į2 de la Na+, K+-ATPase .............................................................................................. 115
Figure 32 Localisation cellulaire de la Na+, K+-ATPase Į1 durant la reperfusion ................ 159
Figure 33 Théorie du signalosome adaptée de [293] ............................................................. 180
Figure 34 Régulation de la Na+, K+-ATPase par le mécanisme PURED adapté de [290] .... 184
Yoann Sottejeau
14
Table des matières
Liste des tableaux
Tableau 1 Classification fonctionnelle de l'insuffisance cardiaque basée sur l'activité physique
et les symptômes selon les recommandations du NYHA d'après [23]............................. 34
Tableau 2 Evaluation des concentrations intracellulaire de différents paramètres cellulaires
pendant l'ischémie reperfusion d'après [48] ..................................................................... 40
Tableau 3 Techniques d'étude spécifique en fonction du modèle d'ischémie reperfusion....... 42
Tableau 4 Recommandation de différentes organisations pour la prévention de risques
cardiovasculaire d'après [191, 207, 260].......................................................................... 80
Tableau 5 Spécificités et caractéristiques des anticorps utilisés lors des Western Blot .......... 97
Yoann Sottejeau
15
Abréviations
16
Abréviations
AA : acide arachidonique
AGPI : acide gras polyinsaturés
AJR : apport journalier recommandé
ALA : acide Į-linolénique
AVC : accident vasculaire cérébral
BNP : Brain natriuretic peptide
BSA : Bovine Serum Albumin, sérum d'albumine bovine
DAG : diacylglycérol
Cl- : chlorides
CMN : cardiomyocytes néonataux
COX 2 : cyclooxygénase 2
CPK : Créatine PhosphoKinase
CRP : C-reactive protein
DHA : acide docosahexaénoïque
DMEM : Dulbecco's modified Eagle medium
ECG : électrocardiogramme
EFSA : European Food Safety Authority, l’Autorité européenne de sécurité des
aliments
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
EPA : acide eicosapentaénoïque
ERK ½ : Extracellular-signal-regulated kinase ½
GPCR : récepteurs couplés à la protéine G
Yoann Sottejeau
17
Abréviations
Grb2 : Growth factor receptor-bound protein 2
HEK293 : Human Embryonic Kidney cells
IC : insuffisance cardiaque
IDM : infarctus du myocarde
ISR : "Isoform Specific Region"
IR : ischémie/reperfusion
JAK : Janus Kinase
KATP : canaux potassiques dépendants de l'ATP
KH : Krebs-Henseleit
LA : acide linoléique
LDH : lactate déshydrogénase
LDL : Lipoprotéine de basse densité (Low Density Lipoprotein)
LLC-PK1: cellules de rein de porc
LVDP : pression développée du ventricule gauche
MAPK : mitogen-activated protein kinase
MP : matrice métalloprotéinase
MPTP : pore de transition de perméabilité mitochondriale
NCX : échangeur sodium/calcium
NHE : échangeur sodium/proton
NT-proBNP : N-terminal pro–brain natriuretic peptide
OK : cellules de rein d'opossum
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
Yoann Sottejeau
18
Abréviations
OPC : Ouabaïne Preconditioning
PDK1 : phosphoinositidedependent kinase-1
PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase
PKA : protéine Kinase A
PKC : protéine Kinase C
PLC : phospholipase C
PMA : phorbol ester, phorbol 12- myristate 13 acétate
RISK : Reperfusion Injury Salvage Kinase
ROS :Reactive oxygen species
SAFE : Survivor Activating Factor Enhancement
SERCA : reticulum sarcoplasmique
SHC : src homology collagen like
SOS : son of sevenless
STAT-3 : signal transducer and activator of transcription 3
SVF : sérum de veau fœtal
TCEP : tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride
TNF Į : Tumor necrosis factor Į
:
Yoann Sottejeau
19
Introduction
20
Introduction: Physiologie et Pathologie cardiaque, traitement et prévention
I
Physiologie et Pathophysiologie cardiaque, traitement et prévention
1
Physiologie du cœur
Le cœur est un organe musculeux creux. Il est situé dans la partie médiane
gauche du thorax. Il assure la circulation sanguine dans le corps grâce à ses
contractions régulées par le système nerveux autonome. Cette fonction permet de
maintenir en adéquation l'apport et les besoins en oxygène de l'organisme. Il est
composé de quatre cavités soit deux oreillettes et deux ventricules respectivement
droits et gauches. Les oreillettes sont séparées par le septum inter-auriculaire et les
ventricules par le septum interventriculaire.
D'un point de vue physiologique, le sang appauvri en oxygène après son
passage dans l'organisme arrive dans l'oreillette droite par les veines caves inférieure
et supérieure. Le sang est alors reversé via la valvule tricuspide dans le ventricule
droit. Celui-ci propulse le sang désoxygéné via la valvule pulmonaire par l'artère
pulmonaire jusqu'au poumon (petite circulation). Après enrichissement en oxygène
dans les poumons, le sang retourne au cœur par les veines pulmonaires dans l'oreillette
gauche. Le sang est alors reversé via la valvule mitrale dans le ventricule gauche.
Celui-ci propulse le sang oxygéné via la valvule aortique par l'aorte et ses branches,
dans tout l'organisme (grande circulation). (Figure 1)
Yoann Sottejeau
21
Figure 1 Représentation schématique de l’anatomie du cœur
Les contractions du cœur sont engendrées et se propagent grâce au tissu nodal.
Celui-ci comprend le nœud sinusal situé dans la l'oreillette droite qui commande la
fréquence cardiaque, et le nœud auriculo-ventriculaire, placé à la jonction des
oreillettes et des ventricules et prolongé vers les deux ventricules par le faisceau de
His et ses ramifications, qui permettent le passage de l'influx vers les ventricules. Le
fonctionnement du tissu nodal est influencé par le système nerveux végétatif et par les
catécholamines. Les différentes phases de la contraction cardiaque sont nommées
systoles auriculaire et ventriculaire, correspondant respectivement à la contraction des
oreillettes et des ventricules. Chaque phase de contraction est suivie d’une phase de
relaxation cardiaque appelée diastole. (Figure 2)
Yoann Sottejeau
22
Figure 2 Représentation schématique du tissu nodal
D'un point de vue musculaire, la paroi cardiaque, ou muscle cardiaque est
composée de trois épaisseurs : l'endocarde, le myocarde et le péricarde. Chaque
épaisseur a une fonction propre. (Figure 3)
Figure 3 Représentation schématique de la paroi cardiaque
Yoann Sottejeau
23
L'endocarde est composé essentiellement de cellules endothéliales qui tapissent
la paroi interne du cœur. Cette membrane interne se trouve directement au contact de
l'intima de l'aorte et des veines caves supérieure et inférieure. Elle participe à la
régulation de la contraction cardiaque via l'activation hormonale endocrine des
cardiomyocytes [1].
Le myocarde est le muscle cardiaque en lui-même. C'est un muscle strié
capable d'une contraction régulière autonome. Il est sensible aux stimulations
hormonales et neuronales [1]. D'un point de vue cellulaire, il est composé de
cardiomyocytes (30 à 40% représentant 75% du volume du myocarde), de cellules
endothéliales, de cellules musculaires lisses et de fibroblastes [1].
Le péricarde est l'enveloppe du cœur. Ce tissu fibreux est composé de deux
couches : une couche fibreuse externe reliant le cœur aux organes environnants tels
que les poumons et une couche séreuse interne maintenant la structure du cœur et des
vaisseaux avoisinant tels que l'aorte et les veines caves. Le péricarde interne est
constitué de deux feuillets (le péricarde viscéral ou épicarde qui adhère directement ou
myocarde et le péricarde pariétal) qui sont séparés par l'espace inter-péricardique. Ce
dernier est une cavité virtuelle contenant physiologiquement 50 à 70 millimètres de
liquide péricardique lui permettant d'assurer une meilleure fluidité des mouvements
cardiaques.
2
Maladies cardiovasculaires
Selon
l'Organisation
Mondiale
de
la
Santé
(OMS),
les
maladies
cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Les statistiques
en 2009 estiment que les maladies cardiovasculaires occupent 29% de la mortalité
mondiale totale. D'après les projections, ces maladies devraient rester les premières
causes de décès en 2020 [2].
Les maladies cardiovasculaires se définissent par l'ensemble des troubles
affectant le cœur et les vaisseaux sanguins comprenant :
Yoann Sottejeau
24
- les cardiopathies coronariennes (touchant les vaisseaux sanguins qui
alimentent le muscle cardiaque) comprenant l'angor (ou angine de poitrine) et
infarctus du myocarde
- les maladies cérébro-vasculaires (touchant les vaisseaux sanguins qui
alimentent le cerveau) comprenant les accidents vasculaires cérébraux (AVC)
- les cardiopathies rhumatismales, affectant le muscle et les valves cardiaques
et résultant d’un rhumatisme articulaire aigu, causé par une bactérie streptocoque
- les malformations cardiaques congénitales (malformations de la structure du
cœur déjà présentes à la naissance)
- les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires (obstruction
des veines des jambes par un caillot sanguin, susceptible de se libérer et de migrer
vers le cœur ou les poumons).
- les maladies du muscle cardiaque comprenant les cardiomyopathies et les
insuffisances cardiaques
- les maladies des valves cardiaques comprenant les endocardites et les
valvulopathies cardiaques
a
L'infarctus du myocarde
i
Définition
L'infarctus du myocarde (IDM) se définit par une nécrose d'une partie plus ou
moins importante du myocarde consécutive à une obstruction brutale d'une artère
coronaire [3]. Lors d'un infarctus du myocarde, l'irrigation d'une partie du cœur ne se
fait plus. Durant cette ischémie prolongée, les cellules du myocarde privées de sang et
d'oxygène meurent, libérant leurs enzymes qui détruisent le tissu environnant. Le plus
souvent, l'infarctus du myocarde est une complication aiguë de l'athérosclérose
coronaire par la rupture d'une plaque d'athérome sur l'artère causant son occlusion.
Cette plaque athéromateuse correspond à une accumulation de lipides, de glucides, de
Yoann Sottejeau
25
sang, de produits sanguins, de tissu fibreux et de dépôts calcaires. Elle forme un amas
lipidique dans la paroi artérielle. Les lipoprotéines de basse densité (LDL), composés
plasmatiques transportant le cholestérol, pénètrent et s'accumulent dans l'intima des
artères. Après leur pénétration, les LDL s'oxydent et ne peuvent plus être dégradées.
Les macrophages accumulent les oxy-LDL et se transforment en cellules spumeuses
ce qui induit une réaction inflammatoire chronique. Enfin, les cellules musculaires
lisses migrent dans l’intima des artères et constituent la chape fibreuse dont
l’épaisseur est déterminante dans le phénomène de rupture de la plaque d’athérome à
l’origine de l'infarctus du myocarde.
La rupture de la plaque d'athérome permet le contact du sang circulant avec le
sous-endothélium pro-thrombogène ce qui aboutit à la constitution d'un thrombus
occlusif. En effet le sous-endothélium est composé principalement de macromolécules
synthétisées par les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses de
l'endothélium vasculaire tel le collagène, des microfibrilles, de la fibronectine, de la
thrombospondine, du facteur de Von Willebrand et des glycosaminoglycanes qui
favorisent la coagulation sanguine. Le thrombus occlusif est accompagné d'une
réponse inflammatoire et provoque l'ischémie myocardique et la nécrose des
cardiomyocytes. (Figure 4).
Figure 4 Représentation schématique de l'infarctus du myocarde
Yoann Sottejeau
26
ii Symptômes et dépistage
En 2000, la Société Européenne de Cardiologie et du Collège Américain de
Cardiologie établissent les nouveaux critères de diagnostics [4]. Le diagnostic définitif
de l'infarctus du myocarde est posé lorsque le patient présente une augmentation de
biomarqueurs plasmatiques de la nécrose myocardique tels que la troponine T ou I et
la fraction myocardique de la Créatine Kinase et au moins un de ses critères :
- des symptômes d'ischémie tels que des douleurs thoraciques angineuses
rétrosternales en barres oppressantes irradiant dans le bras gauche et la mâchoire
accompagnées de sueurs [5]. Ces symptômes typiques doivent être observés au repos,
de manière prolongée et être résistants à la trinitrine qui est un puissant vasodilatateur.
-
un
développement
pathologique
de
l'onde
Q
décelé
lors
de
l'électrocardiogramme. (ECG)
- des troubles de l'ECG indicatifs d'ischémie par élévation ou dépression du
segment ST.
- intervention sur les artères coronaires
Il faut noter que les parmi les biomarqueurs plasmatiques de la nécrose
myocardique, la troponine T ou I sont les plus spécifiques et ont une meilleure
sensibilité que les autres biomarqueurs [6]. L'évolution de l'infarctus du myocarde
dépend de l'étendue de la nécrose cellulaire et de sa localisation. Elle dépend très
largement de l'étendue de l'infarctus ; une mort subite peut survenir surtout pendant les
premières heures qui suivent la crise, ce qui justifie une hospitalisation aussi rapide
que possible. Des complications peuvent apparaître tel l'insuffisance cardiaque, des
troubles du rythme cardiaque, une rupture d'un des deux piliers de la valvule mitrale
ou, beaucoup plus rarement, la perforation de la paroi cardiaque nécrosée. Cependant,
le cœur n’est pas le seul organe atteint lors d’un infarctus du myocarde important,
puisque la diminution du débit cardiaque induit par cette pathologie peut avoir des
conséquences néfastes sur les poumons en entraînant une congestion pulmonaire, sur
les reins en induisant une insuffisance rénale ou sur le pancréas en inhibant la
sécrétion d’insuline.
Yoann Sottejeau
27
Pour la moitié des infarctus, il existe une période plus ou moins longue où le
sujet souffre d'angine de poitrine (angor). Cela se définit par des crises douloureuses
survenant soit à la marche, en particulier au froid et au vent, soit au repos (de
préférence de nuit). Ces douleurs, qui sont des sensations de serrement, de brûlures
voire de broiement sont ressenties derrière le sternum et peuvent irradier dans le bras
gauche, vers la mâchoire voire dans le dos et disparaissent en deux ou trois minutes.
Dans l'autre moitié des cas, l'infarctus est inaugural. Il peut se manifester par de
violentes douleurs similaires à celle de l'angor de façon plus violente et plus longue.
Certains infarctus ne se manifestent par aucun signe clinique, ils sont dits "méconnus"
ou "ambulatoires" et sont détectés accidentellement à l'occasion d'un ECG. L'ECG est
l'examen complémentaire réalisé dès l'apparition de ces symptômes (3). Celui-ci
permet de poser un diagnostic préliminaire et ainsi de débuter la prise en charge
thérapeutique précoce du patient [7]. Cet examen permet de mettre en évidence soit un
développement pathologique de l'onde Q, soit une élévation ou dépression du segment
ST. (Figure 5)
Figure 5 Représentation d'une onde d'ECG normal
Cet examen seul, est insuffisant puisque de nombreuses pathologies
cardiovasculaires telles que les péricardites ou myocardites démontrent elle aussi une
modification du segment ST (7). Afin d'établir un diagnostic final, la mesure des
Yoann Sottejeau
28
biomarqueurs disponibles est indispensable (3). Ces biomarqueurs sont des marqueurs
sériques de la nécrose myocardique comprenant la troponine I ou T, la sous-fraction
MB des Créatine PhosphoKinases (CPK) et la myoglobine. Les troponines sont des
filaments protéiques régulateurs de la contraction musculaire et, durant la nécrose, la
majeure partie des troponines cardiaques est relâchée [8]. Ce biomarqueur est
détectable dans le sérum à partir de la 4ème ou 12ème heures après infarctus (en fonction
de la durée de l'ischémie) avec un taux maximal entre la 12ème et la 48ème heure [9].
Depuis la définition des nouveaux critères, le dosage de la troponine est le marqueur
de référence [4, 10]. La troponine a été définie comme étant le plus sensible et le plus
spécifique des biomarqueurs plasmatiques grâce à la très bonne sensibilité des dosages
[9]. La quantité de troponines libérées dans le plasma semblant proportionnelle à la
taille de la zone infarcie, le dosage permet d'estimer la taille de l'infarctus [11]. Bien
que se soit le marqueur de référence, le taux n'est pas détectable de manière précoce
[9] et son élévation peut être associée à de nombreuses conditions sans thrombose
cardiaque [10]. C'est pour ces raisons et de la possibilité de faux positif, qu'il est
conseillé de doser les CPK-MB l'ancien biomarqueur de référence. La sous-fraction
MB des CPK augmente à partir des 4-6
ème
heures après le début de la douleur et est
présente pendant 24-48h [9]. Comme les troponines, ce marqueur n'est pas un
marqueur précoce. La sensibilité des dosages est satisfaisante, seulement la spécificité
du biomarqueur est remise en question car elle peut être détectée lors de toute
souffrance musculaire [9]. Le biomarqueur de la myoglobine est utilisé comme
marqueur précoce [12]. La myoglobine s'élève dès la 2ème heure et atteint son pic à la
4ème heure [9]. Ce marqueur dosé seul offre peu de spécificité pour les infarctus du
myocarde notamment chez les patients souffrant de traumatisme ou d'insuffisance
rénale [9].
L'intérêt de ce dosage, combiné à un marqueur plus spécifique (troponine ou
CKMB), peut être utile dans un diagnostic plus précoce de l'infarctus du myocarde
[13]. Le dosage de ces trois marqueurs est complémentaire et permet de détecter
l'infarctus du myocarde à tout moment [14] (Figure 6).
Yoann Sottejeau
29
Figure 6 Détection des principaux biomarqueurs de l’IDM adapté de [14]
L'échocardiographie Doppler est la méthode non invasive de choix pour mettre
en évidence l’évaluation initiale de la taille de l’IDM en milieu hospitalier (3). Elle
permet de déterminer la localisation et l'importance des troubles de la cinétique
segmentaire, d'évaluer la fonction ventriculaire gauche globale, de détecter un
éventuel thrombus intraventiculaire gauche, de dépister des complications mécaniques
de l'infarctus du myocarde notamment une dysfonction valvulaire (insuffisance
mitrale), une communication interventriculaire, une rupture myocardique ou un
épanchement péricardique [15]. En revanche, l’échographie cardiaque ne permet pas
d’affirmer le caractère récent ou ancien des anomalies de la cinétique segmentaire
révélées.
iii Facteurs de risques
L’infarctus du myocarde comme de nombreuses pathologies cardiovasculaires,
est une pathologie multifactorielle pour laquelle il existe de nombreux facteurs de
risque tant génétiques qu’environnementaux agissant le plus souvent en synergie. Ces
facteurs de risque sont majoritairement liés à l’athérosclérose qui comme exposé
précédemment est un précurseur principal de l'infarctus du myocarde, ou pour certains
liés à des maladies génétiques.
Yoann Sottejeau
30
Environ 300 facteurs de risques cardiovasculaires ont été répertoriés ayant des
impacts plus ou moins importants sur la physiopathologie [16]. Parmi ces facteurs, on
distingue des facteurs irréversibles, principalement génétiques et des facteurs
réversibles basés sur des modes de vie ou des maladies non cardiovasculaires. Ces
facteurs réversibles englobent 80% des risques de développer une pathologie
cardiovasculaire. De nombreuses campagnes de prévention visent à réduire leurs
impacts [16]. Si l'on s'attarde sur les chiffres en France en 2006 (Figure 7) [17], on
s'aperçoit que les hommes ont plus de risques que les femmes. L'âge joue aussi un
rôle, on note une augmentation du risque à partir de 50 ans et un risque maximum à 65
120000
Hommes
Femmes
90000
60000
30000
an
s
84
an
s
+
de
84
65
à
64
45
à
44
à
25
-2
5
an
s
an
s
0
an
s
Nombres d'hospitalisations
pour cardiopathie ischémique
ans.
Figure 7 Hospitalisations en soins de courte durée pour cardiopathie ischémique selon l’âge en 2006
d'après [17]
A ces deux facteurs irréversibles s'ajoutent également les antécédents familiaux
d’infarctus du myocarde ce qui augmentent le risque dans la descendance, et qui peut
être en partie imputable aux nombreux facteurs génétiques de l’infarctus du myocarde.
Ceux-ci ont cependant un impact relativement restreint [16]. Parmi les facteurs de
Yoann Sottejeau
31
risques réversibles, le tabagisme, la dyslipidémie, l'hypertension artérielle, le diabète
de type 2 et l'obésité sont les plus importants.
Le tabagisme qu'il soit actif ou passif augmente le risque cardiovasculaire. Il
entraîne une augmentation du taux de LDL et une dysfonction endothéliale qui
augmente le risque de rupture de la plaque d'athérome [18].
La dyslipidémie se définit par une élévation des concentrations de cholestérol
et /ou des triglycérides dans le sang. Cette augmentation de cholestérol est notamment
due à une augmentation de LDL-cholestérol. L’effet néfaste d’un taux élevé de LDLcholestérol peut s’expliquer par l’augmentation du risque de formation d’une plaque
d’athérome, à l’inverse d’un taux élevé de HDL-cholestérol [19].
L’hypertension artérielle correspond à une élévation de la pression du sang
dans les artères, par rapport à une valeur dite “normale”. L'augmentation de la
pression artérielle favorise le dépôt de graisses sur et dans la paroi des artères. Elle
cause aussi un remodelage vasculaire conduisant à une perte des capacités
vasodilatatrices des vaisseaux et à une dysfonction endothéliale. Cet hypertension est
fortement corrélée au diabète de type 2 [20].
Le diabète de type 2 se manifestant chez les personnes atteignant la
cinquantaine résulte d'une mauvaise réponse des cellules musculaires ou adipeuses à
la sécrétion d'insuline. Les patients diabétiques présentent des altérations de la
microcirculation conduisant à une dysfonction endothéliale [20]. Le diabète de type 2
est souvent lié à un problème d'obésité.
L’obésité se définit par un excès de graisses dans l’organisme se traduisant par
un indice de masse corporelle (kg/m²) supérieur ou égal à 30. L'obésité favorise les
risques d'hypertension et de diabète de type 2.
Outre ces facteurs de risque cardiovasculaire majeurs, de nombreuses études
mettent en évidence des facteurs de risque secondaires comme les effets néfastes de la
pollution atmosphérique ou la consommation excessive d’alcool.
Yoann Sottejeau
32
b
L'insuffisance cardiaque
i
Définition
L'insuffisance cardiaque se définit par l'incapacité du cœur à assumer un débit
sanguin adapté aux besoins métaboliques et fonctionnels de l’organisme [21]. Ce
dysfonctionnement entre la fonction de pompe cardiaque et les besoins de l'organisme
se retranscrit par une augmentation des pressions ventriculaires et/ou une diminution
du débit cardiaque. L'insuffisance cardiaque est avant tout une conséquence de
nombreuses maladies cardiovasculaires (hypertension artérielle, atteinte valvulaire,
maladie cardiaque congénitale, cardiopathie ischémique, myocardiopathie…) et
touche les ventricules gauche et droit. L'insuffisance cardiaque gauche, conséquence
notamment d'un infarctus du myocarde, entraîne un œdème pulmonaire responsable
d'une gêne respiratoire parfois intense à l'effort puis au repos. L'insuffisance cardiaque
droite est le plus souvent consécutive à une hypertension artérielle pulmonaire, ellemême causée par une affection pulmonaire. Une insuffisance ventriculaire gauche
peut se compliquer d'une insuffisance ventriculaire droite et ainsi créer une
insuffisance cardiaque globale.
ii Symptômes et dépistage
Lorsque l'insuffisance cardiaque s'installe, l'organisme va mettre en œuvre une
série de mécanismes pour tenter de compenser la défaillance du muscle cardiaque. Les
mécanismes d'adaptation sont une dilatation des cavités gauches (essentiellement le
ventricule) et/ou un épaississement de leurs parois musculaires ou une accélération du
rythme cardiaque. Cette insuffisance cardiaque dite compensée est asymptomatique.
Une fois, les mécanismes compensateurs dépassés, l'insuffisance cardiaque
décompensée s'installe et les premiers symptômes apparaissent. Les symptômes sont
des essoufflements au repos ou pendant un exercice, une fatigue, un gonflement des
chevilles [22]. Selon les symptômes, l'insuffisance cardiaque peut être classée selon
les critères de la New York Heart Association (NYHA) [23] (Tableau 1).
Yoann Sottejeau
33
Tableau 1 Classification fonctionnelle de l'insuffisance cardiaque basée sur l'activité physique et les
symptômes selon les recommandations du NYHA d'après [23]
Aucune limitation de l'activité physique.
Classe I
Une activité physique ordinaire provoque une fatigue, des
palpitations ou une dyspnée.
Légère limitation de l'activité physique.
Classe II
Confort au repos mais une activité physique ordinaire
provoque une fatigue, des palpitations ou une dyspnée.
Limitation marquée de l'activité physique.
Classe III
Confort au repos, mais celui-ci est réduit lors d'une activité
physique ordinaire provoquant une fatigue, des palpitations
ou une dyspnée.
Impossibilité de supporter une activité physique sans
inconfort.
Classe IV
Les symptômes sont présents au repos et augmentent lors
d'une activité physique.
Des signes cliniques typiques d'une insuffisance cardiaque sont de la
tachycardie, des râles pulmonaires, des effusions pleurales, des œdèmes périphériques.
Il peut être mis en évidence au repos, une cardiomégalie, des murmures cardiaques,
des anomalies décelées sur les échocardiogrammes (22). Les biomarqueurs sériques de
l'insuffisance cardiaque sont très nombreux notamment l'albumine, la CRP (C-reactive
protein), le TNF Į (Tumor necrosis factor Į), les procollagènes de type III,
Provasopressine, troponines cardiaques, BNP (Brain natriuretic peptide) et NTproBNP (N-terminal pro–brain natriuretic peptide) [24]. Tous ces biomarqueurs ne
sont pas exclusifs à l'insuffisance cardiaque. Cependant les marqueurs BNP et NTproBNP sont les marqueurs alliant la meilleure spécificité/sensibilité [25].
Yoann Sottejeau
34
3
Traitements cliniques
a
L'infarctus du myocarde
La stratégie employée lors d'un infarctus du myocarde est la reperfusion rapide
de l'artère afin de diminuer la mortalité et les risques de complications comme
l'insuffisance cardiaque. La reperfusion artérielle est réalisée soit par thrombolyse
veineuse ou soit par angioplastie coronaire. Dans les douze premières heures, le
traitement thrombolytique est possible. Ce traitement peut être débuté en phase préhospitalière par le SAMU. La dissolution du caillot intra vasculaire est réalisée par
l'activation du système fibrinolytique. En effet le traitement va transformer le
plasminogène inactif en plasmine active. L’action protéolytique de la plasmine va
s’exercer sur la fibrine du caillot pour le dissoudre et sur le fibrinogène circulant.
L’efficacité est d’autant plus grande que le caillot est récent. Les molécules sont
injectées en intraveineuse en une ou plusieurs fois selon le produit injecté. Les
molécules les plus utilisées sont Altéplase (activateur tissulaire du plasminogène : tPA), Rétéplase (analogue simplifié du t-PA humain obtenu par génie génétique),
Ténectéplase (une protéine recombinante différente du t-PA endogène), Streptokinase
(protéine produite par le streptocoque ß-hémolytique se combinant au plasminogène)
et Urokinase (protéase activant la transformation du plasminogène circulant et lié à la
fibrine en plasmine). L’efficacité est d’autant plus grande que le caillot est récent [26,
27]. Le risque majeur des traitements thrombolytiques est l'hémorragie, en particulier
les hémorragies cérébrales et la dissolution partielle du caillot qui peut permettre une
ischémie récidivante. Cependant ce traitement n'est pas le traitement de choix et ne
s'applique que si l'angioplastie n'est pas possible [28].
L'angioplastie coronaire est pour la majorité des cardiologues la meilleure
stratégie de reperfusion pour la plupart des patients avec un infarctus du myocarde.
Cette technique est l'introduction, par une artère périphérique, d'une sonde munie à
son extrémité d'un ballonnet gonflable. Les coronaires sont visualisées après injection
d'un produit de contraste radiologique pour localiser le lieu de l'intervention. Lorsque
que la sonde atteint la zone d'intervention, un fil très fin est utilisé pour franchir
l'occlusion afin de servir de guide et de positionner de manière stable la sonde
Yoann Sottejeau
35
d'angioplastie. La sonde placée, le ballonnet est alors gonflé. Le ballonnet va écraser
la plaque d'athérome contre la paroi et réattribuer au coronaire un diamètre normal.
Dans la plupart des interventions, cette technique est couplée à la mise en place d'un
stent. Le stent est un petit ressort métallique positionné sur le ballon d'angioplastie
dégonflé. Après gonflage du ballonnet, le stent se détend et maintient la paroi de
l'artère. Le stent permet d'éliminer la possibilité d'un nouveau rétrécissement de
l'artère [29] (Figure 8). Le stent étant un corps étranger, il peut permettre la formation
d'un caillot. C’est pour cela, que chaque pose est accompagnée d'un traitement
d'antiagrégants plaquettaires. Le stent posé est dit actif si celui-ci délivre des
molécules diminuant le risque de resténose.
Figure 8 Mise en place d'un stent
Cette intervention est accompagnée par des traitements adjuvants. Ce
traitement comprend des anticoagulants (héparine et acide acétylsalicylique), des
antiplaquettaires (thienopyridine) et des inhibiteurs des récepteurs des glycoprotéines
IIb et IIIa [30].
Lorsque l'angioplastie est inefficace ou si plusieurs artères sont occluses, la
chirurgie cardiaque est utilisée. La technique utilisée est celle du pontage coronarien.
Elle consiste à contourner une artère coronaire rétrécie ou obstruée en implantant un
autre vaisseau en aval de cette dernière pour rétablir la circulation sanguine [31].
Après l'intervention, un traitement médical est administré. Celui-ci vise la
diminution de la mortalité cardiovasculaire en diminuant le risque de récidive et en
Yoann Sottejeau
36
stabilisant la plaque d'athérome. Ce traitement est une association de béta-bloquants,
d’acide acétylsalicylique, de statine, d’inhibiteurs de l’enzyme de conversion de
l’angiotensine. La prise en charge des facteurs de risque par des mesures hygiénodiététiques tels que la reprise d’une activité physique, l’arrêt de la consommation de
tabac et un changement dans les habitudes alimentaires afin de favoriser une
alimentation pauvre en lipides saturés et en glucides, fait aussi partie du traitement
[32].
b
L'insuffisance cardiaque
Lors de l'insuffisance cardiaque (IC) dès les premiers signes cliniques, une
prise en charge thérapeutique doit être effectuée pour traiter les symptômes ainsi que
la cause.
Le traitement médical associe diurétique, inhibiteur de l’enzyme de
conversion et anti-arythmique.
Les diurétiques sont recommandés en cas de signes de congestion (insuffisance
cardiaque congestive). Ils permettent à l'organisme de soulager l’excès de rétention
d'eau et de sel (sodium) diminuant ainsi le volume de sang circulant et la charge pour
la contraction cardiaque. L'association d'inhibiteur de l’enzyme de conversion
(inhibiteur de l’enzyme de conversion d'angiotensine) et anti-arythmique (ȕ-bloquant)
ont pour but d'améliorer les fonctions ventriculaires. En cas de contre-indication ou
d'intolérance à l'un de ses deux produits, ils peuvent être remplacés par des
antagonistes de l'adostérone, des bloqueurs du récepteurs à l'angiotensine. La
Digoxine, un glycoside cardiaque inhibiteur de la Na/K ATPase, est prescrit pour
contrôler les fréquences cardiaques, les ralentir, souvent en association avec des ȕbloquants (22). Son intérêt est aussi important lorsque l’IC est associée à une
fibrillation auriculaire [33]. De part sa toxicité, l'utilisation des digitaliques est réduite.
Elle est pourtant conseillée en cas d'insuffisance cardiaque clinique et de dysfonction
systolique du ventricule gauche [34].
Lorsque les traitements ne sont pas suffisants, la mise en place d'un pacemaker
peut diminuer les symptômes d’insuffisance en améliorant la synchronisation de la
contraction des ventricules. En dernier recours, en cas d'échec de toutes les
Yoann Sottejeau
37
thérapeutiques, une greffe cardiaque peut être effectuée pour les patients de moins de
65 ans.
c
Approche du complément alimentaire
Selon la directive européenne 2002/46/CE, un complément alimentaire est une
denrée alimentaire dont le but est de compléter le régime alimentaire normal en
constituant une source concentrée de nutriments ou d'autres substances ayant un effet
nutritionnel ou physiologique. La nutrition et le traitement de l'infarctus ou de
l'insuffisance cardiaque sont étroitement liés. En effet, après un accident
cardiovasculaire, un changement de comportement alimentaire est exigé. D'ailleurs les
agences de sécurité sanitaire préconisent certains nutriments en prévention ou en
protection du système cardiovasculaire. Cette partie sera détaillée plus spécifiquement
dans le chapitre "Application en Nutrition". La restriction sodique est l’intervention
diététique la plus facilement réalisée (pain sans sel). Malheureusement le sel (NaCl)
reste très utilisé comme additif dans l’industrie alimentaire, son remplacement par le
KCl reste préconisé. Sodium et potassium diminue la tension artérielle et permettent
une élimination rénale de la surcharge sodée de l’IC.
Les Ȧ 3 constituent la seconde voie avec le remplacement de lipides saturés par
des insaturés et aussi par une action protectrice cardiaque qui reste à déterminer [35].
De nombreuses pistes anti-aggrégant plaquettaire, anti-inflammatoire (résolution de
l’inflammation), anti-arythmique, effets conjugués sur le métabolisme énergétique
[36], effet de préconditionement [37]. Ces deux derniers mécanismes ont été
seulement été démontrés in vitro.
4
Phénomène de l’ischémie/reperfusion
a
D’un niveau organique
Lors de l'ischémie cardiaque, il y aune chute brutale de l'activité contractile
jusqu'à devenir nulle. Lors des premières minutes de l'ischémie, les dommages
occasionnés sont réversibles [38], mais la nécrose des tissus durant l'ischémie est
Yoann Sottejeau
38
irréversible. Celle-ci s'étend de l'endocarde vers l'épicarde, c'est le "wavefront
phenomenom". [39, 40]. Ce phénomène dynamique de nécrose du myocarde dépend
principalement de trois facteurs: la taille de la zone ischémique (zone à risque), la
durée et l'intensité de l'ischémie (degré de réduction du débit sanguin myocardique).
Cette nécrose s'accompagne d'une réaction inflammatoire [41]. A cause du "wavefront
phenomenom", il existe une période critique pour le sauvetage du myocarde infarci
qui diffère selon les espèces [38]. La seule méthode reconnue réduisant la taille de
l'infarctus est la reperfusion coronaire. De façon contradictoire, la reperfusion a aussi
des effets néfastes comme le montre les travaux de Jennings (38, 39) et d'Hearse [42].
La
réoxygénation
du
myocarde
ischémique
s'accompagne
de
dommages
ultrastructuraux beaucoup plus importants que si l'ischémie avait été maintenue, c'est
le "paradoxe de l'oxygène". Ces lésions de reperfusion correspondent à un événement
associé à la reperfusion (nouveau ou pouvant être atténué par l'intervention
thérapeutique commencée seulement à la reperfusion). Cinq formes de lésions de
reperfusion sont possibles : les arythmies de reperfusion, la sidération myocardique
(myocardial stunning), les dommages vasculaires, le phénomène de "no-reflow" et la
nécrose de reperfusion. Cette reperfusion active et amplifie aussi la réaction
inflammatoire [43].
b
Du niveau de la cellule
Lors de la séquence ischémie/reperfusion, les variations intracellulaires
majeures sont celle des ions et de l'ATP. Celles-ci mèneront à la mort cellulaire. Lors
de l'ischémie, il n’y a plus de transport d’oxygène ce qui entraîne une chute brutale de
l'ATP intracellulaire [44] et une dépolarisation de la mitochondrie. De plus une
augmentation de la concentration de sodium intracellulaire, par l'intermédiaire de
l'échangeur sodium/proton (NHE) se produit [45] ce qui entraîne une augmentation de
la concentration du Calcium intracellulaire par la mise en mode inverse de l'échangeur
sodium/calcium (NCX) [46]. Le pH intracellulaire s'acidifie par la glycolyse
anaérobique et l'hydrolyse de l'ATP [47]. A la reperfusion, il y a un large nombre de
réactions radicalaires impliquant toutes les espèces de ROS. La restauration de
l’homéostasie cellulaire est différente selon les ions, l’ATP et le pH. Les
Yoann Sottejeau
39
concentrations ioniques intracellulaires se normalisent dans les 30 premières minutes
de la reperfusion [48] (Tableau 2).
Tableau 2 Evaluation des concentrations intracellulaire de différents paramètres cellulaires pendant
l'ischémie reperfusion d'après [48]
Condition
normoxique
30 min
0 min de
d'ischémie reperfusion
5 min de
reperfusion
30 min de
reperfusion
Na+
10 mM
ύ
40 mM
15 mM
10 mM
Ca2+
0.1 – 1 μM
ύ
3 μM
1.8 μM
0.7 μM
Mg2+
0.8 mM
ύ
2.5mM
0.8 mM
0.8 mM
ATP
10 mM
ώ
2 mM
5mM
5mM
PH
7.1
ώ
6.0
7.1
7.1
Le stock d'ATP est revenu à la normale après 24h. Le pH intracellulaire
revient à l'homéostasie au bout de 5 minutes. La normalisation du pH désinhibe
l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (MPTP). Ce dernier
est activé par l'activation des calpaïnes et l'accumulation de calcium mitochondriale.
Son activation mène à la rupture de la membrane sarcolemale et donc à la mort
cellulaire [49, 50]. A cela, s'ajoute dans les premières minutes de la reperfusion, une
hypercontracture provoquée par le taux élevé de calcium intracellulaire et la
dysfonction mitochondriale [51]. Cette hypercontracture mène elle aussi à la mort
cellulaire (altération du sarcolemme) [52] (Figure 9).
Yoann Sottejeau
40
Figure 9 Induction de la mort cellulaire par l'ischémie/reperfusion adaptée de [52]
5
Recherche préclinique sur ischémie/reperfusion
a
En
Modèle utilisé
recherche
préclinique,
différents
modèles
sont
utilisés
pour
étudier
l'ischémie/reperfusion et permettre des avancées dans de nouvelles thérapies. Chaque
modèle a ses avantages et ses inconvénients mais permet l'étude précise de certaines
caractéristiques des voies d’altération de la séquence d’IR comme le démontre le
Tableau 3.
Yoann Sottejeau
41
Tableau 3 Techniques d'étude spécifique en fonction du modèle d'ischémie reperfusion.
Techniques
Etude in vitro
Mesure des doses réponses, Etudes biochimique
Etude ex-vivo
Mesure des paramètres cardiaques fonctionnels, Mesure de
la taille de l'infarctus, Etude des mécanismes de l'arythmie
Etude in vivo
Echographie, Mesure de la taille de l'infarctus, Mesure de la
densité des artères et capillaires
i
in vitro
Les modèles in vitro sont utilisés pour les études biochimiques, la mesure des doses
réponses des différentes molécules et l'étude des phénomènes cellulaires lors de
l'ischémie/reperfusion. L'ischémie/reperfusion myocardique se réalise sur des cellules
isolées de cardiomyocytes. Le travail sur cellule permet une manipulation plus aisée
des gènes (surexpression ou sous-expression), le travail avec une grande variété de
techniques d'imagerie grâce à la visualisation des cellules; une utilisation facile des
techniques d'immunodétection ainsi que l'étude de l'internalisation des protéines.
L'étude sur myocytes isolés permet d'étudier spécifiquement ce type cellulaire en
évitant l'influence des cellules environnantes telles que les cellules endothéliales et les
fibroblastes. En revanche, la culture cellulaire rend l'étude de la contractilité
imparfaite en enlevant une partie des phénomènes dus à l'aspect pathophysiologique
de l'ischémie/reperfusion myocardique que l'on retrouve sur le cœur entier.
Les techniques les plus utilisées pour induire l'ischémie in vitro sont les
suivantes :
L'ischémie chimique est l'empoisonnement métabolique de la cellule par la
reproduction de la perte d'ATP et de l'acidose cellulaire produite lors de l'ischémie à
l'aide d'agent chimique (2-deoxyglucose et de cyanure de sodium –NaCN-) [53, 54].
Yoann Sottejeau
42
L'"ischemic pelleting" ou culotage ischémique ischémie/reperfusion cellulaire
est réalisé par la centrifugation des cardiomyocytes fraîchement isolés avec un
surnageant couvert d'huile [55]
La sévère hypoxie cellulaire, avec ou sans privation de substrats (absence de
glucose), est réalisée à l'aide de chambre hypoxique utilisant une atmosphère en
nitrogène entre 95 et 100% [56, 57]. Le "Coverslip hypoxia" est la reproduction d'une
hypoxie sévère sur une portion du tapis cellulaire en le recouvrant d'une lamelle de
verre formant une barrière de diffusion qui le prive d'oxygène et restreint la présence
au milieu de culture [58]. A l'inverse des autres techniques énumérées qui réalisent des
ischémies totales des cellules, cette technique réalise une ischémie régionalisée qui
reflète plus précisément les événements ischémiques in vivo en recréant les zones : la
zone ischémique, la zone non ischémique et la zone de bordure à l’interface de ces 2
zones comme lors d’un infarctus du myocarde (Figure 10). De plus la reperfusion est
possible et est simulée par une simple réoxygénation du milieu avec une composition
ionique normale.
Figure 10 Reproduction des zones ischémiques par la technique de "Coverslip Hypoxia"
Yoann Sottejeau
43
ii ex vivo
Le modèle ex vivo est utilisé pour l'étude de la fonction contractile, la
fréquence cardiaque, la mesure de la taille de l'infarctus, l'étude des mécanismes de
l'arythmie, la mesure des effets de différentes doses de molécules. L'utilisation du
cœur isolé perfusé permet d'examiner spécifiquement l'étude des fonctions contractiles
telles que les effets inotropiques, chronotropiques et vasculaires sans les
complications neuronales et hormonales obtenues sur un model in vivo. En revanche,
le cœur isolé demande une expertise technique accrue afin d'éviter la formation de
contusions,
la
possibilité
de
réaliser
par
inadvertance
une
protection
à
l'ischémie/reperfusion et la perfusion ne peut durer que quelques heures.
De plus l'ischémie/reperfusion produite est réalisée sur le cœur en entier alors
qu'in vivo celle-ci est régionalisée.
Le concept de cœur isolé perfusé fut introduit et établi par Oska Langendorff
en 1898 [59]. Cette technique est devenue maintenant une technique prédominante en
recherche pharmacologique et physiologique.
Brièvement celle-ci consiste à isoler le cœur de l'animal et canuler l'aorte. Le
cœur est alors perfusé dans une solution oxygénée comprenant des nutriments. La
solution de Krebs–Henseleit est la solution de référence pour la perfusion de tissu de
mammifères composée notamment de sodium, potassium, calcium, chloride, glucose,
phosphate, sulfate de magnésium et du bicarbonate afin de mimer le contenu ionique
du plasma. [60]. Afin de mesurer les paramètres cardiaques et notamment la pression
développée du ventricule gauche (LVDP, la différence entre la systole et la diastole du
ventricule gauche), un ballon de latex connecté à un capteur de pression est introduit
dans le ventricule gauche (Figure 11). L'ischémie et la reperfusion sont réalisées
respectivement par l’interruption de la perfusion puis par sa restauration.
Yoann Sottejeau
44
Figure 11 Représentation schématique d'un système de cœur isolé perfusé
iii in vivo
Les modèles in vivo sont utilisés pour la mesure de la taille de l'infarctus, des
mesures échographiques, l'étude des molécules avant des tests cliniques, l’étude des
effets à long terme de l'ischémie/reperfusion et de sa protection. Ces techniques sont
les plus proches de la clinique et mime la situation d'ischémie/reperfusion pendant un
traitement chirurgical après ischémie myocardique. En revanche, ces modèles
demandent une grosse logistique et une expertise technique. Sur les modèles
d'animaux anesthésiés, il est possible de produire un effet de preconditioning avec des
agents anesthétiques volatiles [61]. Sur les modèles d'animaux conscients, la
vérification du succès de la reperfusion est difficile [62, 63].
Les techniques in vivo sont réalisées soit sur des animaux conscients, soit sur
des animaux anesthésiés.
Sur des animaux conscients, les animaux sont préalablement opérés et un
système hydraulique d'occlusion est posé sur l'artère interventriculaire antérieure.
L'ischémie est réalisée ultérieurement à l'acte chirurgical par fermeture du système
hydraulique [64].
Yoann Sottejeau
45
Sur des animaux anesthésiés, l'ischémie est réalisée pendant l'opération par
clampage de l'artère interventriculaire antérieure [65-67] .
b
Protection
En recherche préclinique, l'étude et la recherche de la protection
cardiovasculaire sont basées sur le phénomène de "conditioning" (conditionnement)
qu'il soit mécanique ou pharmacologique. Celui-ci peut avoir lieu avant l'ischémie
(preconditioning), à distance (perconditioning) et après l'ischémie (postconditioning).
i
Preconditioning
Le premier phénomène de conditionnement à été découvert chez le chien par
Murry en 1986 [68]. Ce "preconditioning" consiste à réaliser de brefs épisodes
d'ischémie cardiaque non létale afin de protéger le cœur en le rendant plus résistant
pour l'ischémie suivante. La protection de cette ischémie de "preconditioning" persiste
après l'acte protecteur et démontre l'existence d'une "mémoire" cardiaque. En effet le
cœur "se rappelle" d'avoir été exposé à des stimuli de "preconditioning" et maintient la
protection même quand les stimuli sont arrêtés. Ce phénomène décrit par Murry a été
reproduit chez d'autres espèces incluant le rat [69], le lapin [70], le cochon [71] ainsi
que chez l'homme [72, 73]. Le precondioning peut aussi être réalisé notamment par
des agents pharmacologiques bradykinine, ouabaïne et des opioïdes. Le mécanisme
précis de cette protection cardiovasculaire est encore peu connu. Lors du
preconditioning, cela va entraîner l'activation de la voie du phosphatidylinositol 3kinase (PI3K) qui entraînera l'activation successive de Akt, eNOS, Guanylate cyclase
(via la libération de NO). Ce qui amènera à la translocation de la PKCİ et l'ouverture
des canaux potassiques dépendants de l'ATP (KATP) des mitochondries [74].
L'activation de cette voie avant l'ischémie va permettre l'activation d'une voie de
signalisation cardioprotectrice similaire à la reperfusion qui est la Reperfusion Injury
Salvage Kinase (RISK). Le preconditioning ischémique provoque à la reperfusion le
relâchement d'agoniste tel que l'adénosine, la bradykinine et des opioïdes qui
s'attachent à des récepteurs couplés à la protéine G (GPCR). L'activation des GPCR
Yoann Sottejeau
46
mène à l'activation d'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) via la matrice
métalloprotéinase (MP). EGFR va activer la kinase Src qui mène à l'activation de la
voie du PI3K [75]. Cette voie résulte en l'activation successive de Akt, eNOS,
Guanylate cyclase. Ce qui amènera à la translocation de la PKCİ et l'ouverture des
KATP des mitochondries [76] qui libèrent une faible quantité de ROS mitochondriale
pour activer des PKC et Erk ½ et qui inhibent l'ouverture du MPTP (Figure 12) .Outre
cette cascade d'activation, la voie PI3K/Akt inhibe des agents pro-apoptotiques tel que
BAD [77], BAX [78]ainsi que l'inhibition de la cytochrome C mitochondriale [79].
Parallèlement à la voie PI3K/Akt, les GPCR activent aussi Erk ½. qui vont
phosphoryler des protéines tel que BAD [80], BAX [81]. Une autre voie de
signalisation indépendante de RISK a été décrite avec la voie SAFE (Survivor
Activating Factor Enhancement). Cette voie est initiée par le TNFĮ et implique les
Janus Kinase (JAK) et STAT-3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3)
[82].
Yoann Sottejeau
47
Figure 12 Mécanisme de protection du Preconditioning
Yoann Sottejeau
48
ii Perconditioning
Le "perconditioning" ischémique consiste à protéger le cœur pendant une
ischémie prolongée par plusieurs brefs épisodes ischémiques sur du tissu périphérique
au cœur. Cette protection a été mise en évidence chez le rat [83] et chez l'homme [84]
par réalisation d'ischémie au niveau de la jambe par arrêt du flux sanguin. Le
mécanisme de cette protection est très peu décrit mais passerait par l'ouverture des
KATP des mitochondries [83].
iii Postconditioning
Le "postconditioning" ischémique consiste à protéger le cœur après une
ischémie prolongée par plusieurs brefs épisodes d'ischémie cardiaque non létale [85].
Ce postconditioning est réalisable de manière clinique, comme lors de la reperfusion
par angioplastie réalisée durant la phase aiguë de l'infarctus du myocarde [86]. Celuici doit être effectué dans les dix premières minutes de la reperfusion [87] et n'est
efficace seulement si l'occlusion coronaire est inférieure à 45 minutes [88]. L'effet
obtenu par postconditioning ne peut s'ajouter à l'effet obtenu par preconditioning [89].
Le mécanisme amenant à la protection cardiaque est similaire à celui du
preconditioning par l'activation des mêmes voies de signalisation et kinase [90]
(Figure 13).
Yoann Sottejeau
49
Figure 13 Mécanisme de protection du Postconditioning
Cette protection par le phénomène de "conditioning" qu'il soit avant ou après
l'ischémie déclenche les mêmes voies de signalisation. Une meilleure compréhension
de ces voies de signalisation permettrait la mise en place de nouveaux traitements
cardioprotecteurs.
Yoann Sottejeau
50
Introduction: Na+, K+-ATPase
II Na+, K+-ATPase
La Na+, K+-ATPase a été découverte en 1957 par Jens Skou. L'isolement de
cette enzyme de la membrane cellulaire de cellules de nerf a apporté une contribution
majeure et innovante dans le domaine des transports ioniques. La contribution de Jens
Skou par cette découverte et les caractérisations de Na+, K+-ATPase qu'il a effectué
par la suite lui a valu le 10 décembre 1997 le prix Nobel de Chimie.
1
Famille et Structure
La Na+, K+-ATPase fait partie de la super famille des P type ATPase. Cette
famille comporte toutes les enzymes membranaires hydrolysant un ATP pour
transporter des ions contre leurs gradients de diffusion. Ces ATPases sont présentes
chez les eucaryotes et les procaryotes. Cette large famille comporte notamment les
pompes ioniques les plus étudiées la Na+, K+-ATPase, la H,K ATPase gastrique ainsi
que le Ca- ATPase du reticulum sarcoplasmique (SERCA). En fonction de leurs
structures et de leurs fonctions les ATPase de type P sont divisées en cinq sous-types.
Le type I comprend les ATPases transportant les métaux lourds. Le type II comprend
la Na+, K+-ATPase, la H,K ATPase et SERCA. Le type III contient l'ATPase à protons
des plantes. Le type IV comprend les ATPases ayant le rôle de flipases par le transport
de phospholipides [91]. Le type V comprend un large groupe d'ATPases retrouvé
seulement chez les eucaryotes. Le Type II contient quatre sous groupes. La Na+, K+ATPase est dans le type IIC caractérisée par l'association d'une glycoprotéine souvent
appelée la sous unité ȕ.
La structure conservée des ATPases de type P est définie par six domaines
transmembranaires et deux boucles cytoplasmiques [92]. Le type I a une structure
comprenant deux domaines transmembranaires supplémentaires. Le type II comprend
lui quatre domaines transmembranaires supplémentaires [93]. Comme toute ATPase
de type P IIC, la Na+, K+-ATPase est composée d'un complexe fonctionnel minimal de
deux sous-unités Į et ȕ. Une autre sous-unité Ȗ, non essentielle au fonctionnement de
l'enzyme, a été isolée en 1980 [94].
Yoann Sottejeau
51
a
Sous-unités et Isoformes
i
Sous-unité Į
La sous-unité Į comme décrite par la famille de P type ATPase a dix domaines
transmembranaires, quatre boucles cytoplasmiques, 5 boucles extracellulaires et les
extrémités N et C terminales intracellulaires. Cette protéine a pour taille 110 000
Daltons. Elle assume les fonctions catalytiques de la Na+, K+-ATPase et comporte les
sites de fixation du Na+, du K+, de l'ATP et des glycosides cardiaques [95]. En 1979, il
a été démontré que la sous-unité Į existait sous plusieurs isoformes (Į et Į+) [96]. Ces
deux formes ont été décrites plus tard dans le cœur de chien. Depuis il a été décrit
quatre isoformes différentes (Į1, Į2, Į3 et Į4) [97, 98].Ces quatre isoformes ont une
structure identique et une similarité dans leurs séquences d'acide aminé. Leurs
homologies sont de 75% entre elles et de 93% entre Į1, Į2 et Į3. Deux régions offrent
une grande variabilité entre les isoformes, la partie N-terminale (position 1-30) et
l'"Isoform Specific Region" (ISR) (position 489-499) (Figure 14). L'ISR est située
dans la boucle cytoplasmique principale de l'enzyme, proche du site de fixation de
l'ATP. Ces deux régions confèreraient une ou plusieurs fonctions spécifiques pour
chaque isoforme [99].
Figure 14 Structure primaire de la sous-unité Į de la Na+, K+-ATPase
Yoann Sottejeau
52
Du fait du fort pourcentage d'homologie, les quatre isoformes de la Na+, K+ATPase ont une fonction de transport ionique et des caractéristiques enzymatiques
comparables chez l'homme. Cependant leurs expressions tissulaires varient.
L'isoforme Į1 est ubiquitaire. On la retrouve dans tous les tissus, contrairement aux
autres. Les isoformes Į2 et Į3 sont majoritairement exprimées dans le cerveau
(cellules neuronales pour Į 3 et les cellules gliales pour Į 2) ainsi que dans le cœur et
les muscles squelettiques. L'isoforme Į 4 est exprimée seulement dans les testicules.
Chez le rat, il est noté que l'isoforme Į 3 n'est exprimée que dans le cœur à l'état fœtal
et néonataux (trois premiers jours) et l'isoforme Į2 dans le cœur à l'état adulte [100,
101]. Chez les rongeurs (rat, souris), d'autres différences existent. En effet, l'affinité
pour certains inhibiteurs spécifiques de la Na+, K+-ATPase, comme les glycosides
cardiaques telle l'ouabaïne, varient selon les isoformes. Į2 et Į3 ont une affinité pour
l'ouabaïne de l'ordre de 1000 fois supérieure à celle de l' Į1 (de l’ordre de 10 μM), qui
présente une relative "insensibilité" caractéristique de ces espèces [102]. De telles
différences d'affinités aux digitaliques ne se retrouvent pas chez l'homme, ou toutes les
isoformes sont dites "sensibles"[103].
ii Sous-unité ȕ
La sous-unité ȕ est une glycoprotéine de type II ayant un domaine
transmembranaire, une courte extrémité N-terminal cytosolyque et un large domaine
extracellulaire (Figure 15). Cette protéine a une taille comprise en 40 000 et 60 000
Daltons suivant son nombre de glycosylation [104].
Yoann Sottejeau
53
Figure 15 Structure primaire de la sous-unité ȕ de la Na+, K+-ATPase
Par son interaction avec la sous-unité Į, elle assume l'adressage de la sousunité Į lors de sa maturation et permet la stabilité du complexe Į-ȕ au niveau de la
membrane plasmique [105]. Comme la sous-unité catalytique, la sous unité ȕ se
retrouve sous 3 isoformes (ȕ1, ȕ2 et ȕ3). Ces isoformes ont une homologie environ de
60% entre elles. Le domaine transmembranaire est la région la plus conservée parmi
les isoformes et les espèces ainsi que les six cystéines extracellulaires qui participent à
la formation de pont disulfure essentiel à l'activité catalytique de la sous-unité Į. Les
différences structurelles entre les isoformes sont le nombre de sites de glycosylation.
En effet ȕ1 compte trois glycosylations tandis que ȕ2 deux et ȕ3 huit [104]. Outre ces
différences structurelles, les isoformes ont une expression tissulaire variée. Il est rare
qu'une seule isoforme soit retrouvée dans un tissu pourtant chez le rat seul ȕ1 est
exprimée dans le rein. Les isofomes peuvent être exprimées toutes les trois dans le
même tissu comme le cerveau et l'endothélium des muscles lisses. Dans le cœur, seul
ȕ1 et ȕ2 sont exprimés. Les sous-unités ȕ influencent les propriétés de transport de la
Na+, K+-ATPase. En effet, une sous-unité Į associée à différentes sous-unités ȕ
acquiert des affinités différentes pour le potassium et le sodium [100, 105]. Une
quatrième isoforme existe ȕm (ȕ4). On la retrouve notamment dans les muscles
squelettiques et sa structure est différente des trois autres sous-unités [106, 107].
Yoann Sottejeau
54
iii Sous-unité Ȗ
La sous-unité Ȗ est un polypeptide hydrophobique, d'une taille d'environ 7 000
Daltons (Figure 16). Cette sous-unité a été identifiée dans le rein [108].
Figure 16 Structure primaire de la sous-unité Ȗ de la Na+, K+-ATPase
D'autres polypeptides hydrophobiques ont été découverts avec une séquence
peptidique similaire "FXYD" à la sous-unité Ȗ (FXYD2) [109]. Ces motifs peptidiques
permettent de classer les FXYD qui comportent notamment le phospholemman
(FXYD1). Ce motif est présent dans le cœur, mais absent au stade fœtal dans le cœur
de rat. Ce polypeptide n'est pas essentiel au bon fonctionnement de la Na+, K+ATPase. Cependant, certains FXYD influencent le transport et la cinétique de la Na+,
K+-ATPase. La distribution spécifique des protéines FXYD permettrait l'adaptation de
l'activité de la Na+, K+-ATPase spécifique aux besoins de chaque tissu [110]. Cette
modulation peut être régulée par les protéines Kinase C (PKC) et les protéines Kinase
A (PKA) comme c'est le cas dans le cœur pour le phospholemman [111].
2
Fonction / Régulation
Yoann Sottejeau
55
a
Echangeur d’ions
La fonction cationique de la Na+, K+-ATPase est le maintien des gradients
sodique et potassique indispensables à la survie de toute cellule animale. En effet, elle
échange 3 ions sodium (Na+) du cytoplasme vers l'espace extracellulaire et de 2 ions
potassium (K+) dans la direction opposée de leurs gradients respectifs naturels, en
dépensant une molécule d'ATP. (Figure 17)
Figure 17 Fonction d'échangeur d’ions de Na+, K+-ATPase
i
Participation au maintien du potentiel de membrane et de l'excitabilité
des cellules nerveuses et musculaires.
Le potentiel de membrane est le résultat de mouvements ioniques
transmembranaires. Dans un état "repos" c'est le mouvement de K+ au travers de la
membrane qui prédomine. Ce potentiel est proche de -70 mV chez l'homme.
Dans les cellules excitables, un signal provoque l'ouverture transitoire des
canaux sodium responsables d'un potentiel d'action nerveux ou musculaire. Après
cette dépolarisation, le retour à l'état de repos est assuré par les transports sodiques et
potassiques de la Na+, K+-ATPase (potentiel de repos) [112].
ii Régulation de la balance osmotique et du volume cellulaire
Yoann Sottejeau
56
Pour survivre, la cellule doit réguler son volume cellulaire afin d'éviter des
modifications de volumes excessives. En effet, l'accumulation dans la cellule de
protéines et de substances engendre une osmolarité plus élevée qui entraînerait le
gonflement de la cellule, sa lyse et mort cellulaire. Ce changement d’osmolarité doit
être contrebalancée en réduisant la concentration d'ions cytosoliques notamment l'ion
chlorides (Cl-) par les canaux chlore. De par sa fonction de transporteur d'ions, la Na+,
K+-ATPase génère un potentiel de membrane positif à l'extérieur de la cellule
conduisant les Cl- à l'extérieur de celle-ci. La balance osmotique est alors maintenue
[113-115].
iii Fonctionnement des co-transports liés à l'ion sodium
Le gradient sodique de la cellule, étant de l'extérieur vers l'intérieur de la
cellule, est utilisé par un grand nombre de co-transporteur (Na+/glucose, Na+/acide
aminé et Na+/Cl) ou échangeur (Na+/Ca2+ et Na+/H+). Ce phémonène permet l'entrée
dans la cellule de diverses molécules et ions nécessaires à son fonctionnement. La
sortie du sodium hors de la cellule, contre son gradient, est assurée seulement par la
pompe Na+, K+-ATPase et permet le maintien du gradient sodique. Cela permet au
Na+ d'avoir une grande importance biologique. De par le maintien du gradient sodique,
la Na+, K+-ATPase régule la régulation du pH et le signal calcique intracellulaire. Ce
dernier est responsable notamment de la libération de neurotransmetteurs, de la
sécrétion des glandes endocrines et exocrines, de la contraction cardiaque et du tonus
vasculaire.
iv Mécanisme réactionnel de la Na+,K+-ATPase
Comme les autres P-types ATPase majeures, la fonction de pompe de la Na+,
K+-ATPase est décrite par le schéma d'Albers-Post [116, 117] (Figure 18). La Na+,
K+-ATPase va séquestrer (occlusion) et transporter les ions en passant sous différentes
conformations (E1, E1P, E2) (phosphorylé en présence de Na+ et déphosphorylé en
présence de K+). La Figure 18 reprend en détail les étapes de la réaction. En
conformation E1, l'enzyme est liée à l'ATP en présence de Mg2+ du coté cytosolique.
A cette forme E1-ATP, trois Na+ cytosoliques vont se lier (E1-ATP-3Na+). L'ATP est
Yoann Sottejeau
57
hydrolysé pour phosphoryler E1 et libérer de l'ADP (E1-P-3Na+). Les ions Na+ sont
alors libérés du coté extracellulaire, l'enzyme passe alors sous sa forme E2-P. La
liaison des deux ions K+ sur l'enzyme va entraîner sa déphosphorylation (E2-2K+).
Une molécule d'ATP vient alors se fixer formant le complexe E2-ATP-2K+. Les ions
K+ sont alors libérés dans le cytoplasme et l'enzyme revient sous sa forme E1-ATP.
Figure 18 Cycle réactionnel de la Na+, K+-ATPase dit cycle de Post-Albers
b
Fonction de signalisation
La Na+, K+-ATPase est connue depuis les années 60 pour sa fonction
enzymatique dite de "pumping pump". Cependant depuis 1998, les découvertes du
laboratoire du Dr Xie rapportent que cette enzyme a une deuxième fonction, une
fonction de transduction du signal [118, 119] .
i
Mécanisme réactionnel
Yoann Sottejeau
58
Dans la plupart des types cellulaires, l'interaction ouabaïne- Na+, K+-ATPase
provoque une cascade d'événements. (Figure 19).
Figure 19 Fonction de signalisation de la Na+, K+-ATPase
L'enzyme sur la membrane plasmique interagit avec les protéines voisines et
active la tyrosine kinase Src. Cette activation va provoquer le recrutement de la PI3K
et l'activation du récepteur de l'EGFR qui active respectivement les voies PI3K/Akt et
MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase). La PI3K activée va enclencher la
phosphorylation en série de PDK1, (Phosphoinositide Dependent Kinase-1) et Akt
[120]. L'EGFR phosphorylé va activer parallèlement PLC (Phospholipase C) et SHC
Yoann Sottejeau
59
(Src Homology Collagen like). La PLC active la PKC qui active la kinase ERK ½
(Extracellular-signal-Regulated Kinase 1/2). De son coté SHC permet l'activation en
cascade de Grb2 (Growth factor Receptor-Bound protein 2), SOS (Son Of Sevenless),
Ras, Raf, MEK et ERK ½. Lors de l'activation de la voie MAPK, il y a production de
ROS (Reactive Oxygen Species) [121]. Toutes ces cascades de signalisation sont
initiées dans la cavéole [122]. La cavéoline-1 ainsi que le cholestérol sont essentiels à
la formation de la cavéole et le recrutement de la Na+, K+-ATPase dans celle-ci [123].
ii Régulation des fonctions cellulaires
L'activation de ces cascades permet la régulation de plusieurs fonctions
cellulaires en fonction du type cellulaire. Le processus final de cette transduction est la
régulation de plusieurs fonctions cellulaires (l'apoptose / la différenciation
cellulaire /la prolifération / l'hypertrophie cellulaire) en fonction du type cellulaire par
l'augmentation de transcription d'une série de gènes. Sur des neuroblastomes humains,
il a été démontré que la transduction du signal via l'ouabaïne active des voies
apoptotiques notamment par l'activation des protéines p53, Bad et caspase 3 [124]. A
l'inverse, dans les cellules endothéliales, c'est un effet anti-apoptotique qui est observé
par l'inhibition des caspases 3 [125]. Un effet prolifératif a été démontré notamment
dans les cellules des muscles lisses vasculaires et des cellules rénales du tube proximal
[126, 127]. Dans les myocytes cardiaques, l'ouabaïne engendre par la voie des
PI3K/Akt une hypertrophie cellulaire ainsi que des changements dans la régulation
transcriptionnelle et module sa contractilité [122, 128].
iii Interaction Na+, K+-ATPase et Src
¾ Src
Src est une protéine de la famille des non-récepteurs tyrosine-kinases ou
appelée kinases de la famille Src. Elle a pour taille 52 000 à 62 000 Daltons et
participe à de nombreuses phosphorylations des tyrosines [129, 130]. Elle est
Yoann Sottejeau
60
notamment constituée de 6 domaines, Sh4, Unique, Sh3, Sh2, Kinase et C-terminal
(Figure 20).
Figure 20 Représentation schématique des six de domaines de Src
Le domaine Sh4 permet l'adressage de la protéine et sa localisation à la
membrane [131, 132]. Le domaine Sh3 permet les interactions avec les motifs prolines
[133, 134]. Le domaine Sh2 interagit lui avec les résidus "tyrosines phosphorylés "
[135, 136]. Le domaine kinase réagit avec des nucléotides et phosphoryle le substrat.
Il contient la Tyr-418 [137, 138]. Le domaine C-terminal est composé de 15 à 17
résidus et comporte la Tyr 527 [139]. Lorsque que Src est inactivée, la tyrosine 527 est
phosphorylée et les sites Sh2 et Sh3 sont inaccessibles, c'est la forme "fermée". Elle
est dite active lorsque la Tyr416 est phosphorylée, les sites Sh2 et Sh3 sont alors
accessibles, c'est la forme ouverte [140].
¾ Interaction Na+, K+-ATPase et Src
L'activation de Src est directe. En effet il a été démontré que la Na+, K+ATPase interagit directement à la protéine Src. Cette interaction est même double car
il a été démontré que les domaines cellulaires de la Na+, K+-ATPase CD2 et CD3
interagissent respectivement au domaine kinase et Sh2 [141]. Ces travaux ont aussi
permis de comprendre la fonction de récepteur de la Na+, K+-ATPase. En effet, il a été
démontré que lorsque l'ouabaïne interagit avec la Na+, K+-ATPase, le changement de
conformation de la Na+, K+-ATPase permet la libération d’un domaine kinase de Src
et donc la phosphorylation de la Tyr 416 [141, 142]. La Na+, K+-ATPase n'interagit
pas seulement avec Src, elle forme un complexe Na+, K+-ATPase /Src.
iv "Pumping pool" et "Non-pumping pool" de la Na+, K+-ATPase
Yoann Sottejeau
61
La découverte de la fonction de signalisation de la Na+, K+-ATPase ainsi que la
réalisation d'une lignée cellulaire LLCPK1 PY17comportant seulement 8% de Na+,
K+-ATPase Į1 [143] ont permis de démontrer l'existence de deux pools de Na+, K+ATPase. En effet, il a été démontré que 8% de Na+, K+-ATPase Į1 (PY17) permet la
même absorption de K+ que 46% de Na+, K+-ATPase Į1 (A4-11). De plus la
destruction des cavéoles par le mȕCD, démontre l'augmentation de l'absorption de K+
pour les cellules A4-11 mais pas chez les PY17 [144]. Il existe donc bien, pour la Na+,
K+-ATPase, un pool de "pumping pump" dédié à l'échange d'ions et un autre pool
"non-pumping pool" dédié notamment à la fonction de signalisation mais
probablement pas uniquement à cette fonction.
v
Spécificité liée aux isoformes
L'étude de la signalisation fût d'abord réalisée dans des cellules cardiaques
comportant différentes isoformes [118, 119]. Afin d'étudier plus précisément cette
fonction, l'étude a été réalisée dans des cellules rénales comportant seulement les
sous-unités Į1 et ȕ1 [123, 145]. Ainsi l'étude de cette fonction de signalisation a
seulement été caractérisée sur l'isoforme Į1.
c
Ligand spécifique de la Na+, K+-ATPase, les stéroïdes cardiotoniques
La Na+, K+-ATPase a pour ligand spécifique les stéroïdes cardiotoniques. Ce
groupe de molécules comprend notamment l'ouabaïne et la digoxine d'origine
végétale, et la marinobufagénine d'origine animale (Figure 21).
Yoann Sottejeau
62
Figure 21 Structure chimique des molécules d'ouabaïne, digoxine et marinobufagénine
Les stéroïdes cardiotoniques ont un double effet (activateur/inhibiteur) sur la
+
+
Na , K -ATPase. Ces effets ont été notamment démontrés avec l'ouabaïne, molécule
de référence pour investir le mode d'action des stéroïdes cardiotoniques. A forte dose,
l'ouabaïne inhibe la fonction d'échange d'ions de la Na+, K+-ATPase en se fixant
préférentiellement sur la forme E2-P. L'ouabaïne bloque la réaction de
déphophorylation, entraînant un arrêt du processus de transfert ionique [146]. A faible
dose, l'ouabaïne est l'initiateur de la fonction de signalisation de la Na+, K+-ATPase
[119]. Depuis leur découverte, les stéroïdes cardiotoniques étaient considérés comme
des molécules pharmaceutiques, cependant depuis les années 90, il a été démontré que
certains composés tels l'ouabaïne et la marinobufagénine peuvent être des composés
endogènes produits à faible dose par le corps humain [147-149]. Leur production et
leur sécrétion sont régulées par de nombreux stimuli pathologiques ou physiologiques
[150, 151].
d
Régulation de la Na+, K+-ATPase par les PKC
i
Rôle des PKC
La PKC fait partie de la famille des sérine/thréonine kinase. Elle joue un rôle
essentiel dans la transduction du signal. Elle est impliquée dans différentes fonctions
physiologiques de la cellule et notamment dans la modulation de l'activité des canaux
ioniques [152].
Yoann Sottejeau
63
ii La famille des PKC et leurs structures
La famille des protéines kinases C est hétérogène. Elle comporte 10 isotypes
provenant de 9 gènes différents ayant tous un domaine sérine/thréonine kinase. Ces
isotypes sont classés en 3 catégories. Les PKC classiques ou conventionnelles (cPKC),
les nouvelles PKC (nPKC) et les PKC atypiques (aPKC) [153]. Les cPKC
comprennent les PKC Į, ȕI, ȕII et Ȗ. Elles sont constituées de deux domaines C1 (site
de fixation des phosphatidylsérines) et C2. Ces deux domaines permettent la fixation
des activateurs des PKC. Les nPKC comprennent les PKC į, İ, Ș, et ș. Elles sont aussi
constituées de deux domaines C1 et C2, seulement C2 diffère dans la constitution de
sa séquence. Les aPKC comprennent les PKC ȗ et Ȝ/Ț. Elles sont constituées d'un
domaine C1 ainsi que d'un domaine OPR (site de fixation de PAR6 et ZIP/p62)
(Figure 22).
Figure 22 Structure des différentes PKC adaptée de [153]
iii Action du diacylglycérol et des phorbol ester sur les PKC
Depuis les années 80, le diacylglycérol (DAG), métabolite de la membrane de
phospholipides est connu comme étant le second messager de l'activation des PKC
[154]. Le phorbol ester, phorbol 12- myristate 13 acétate (PMA) peut substituer
l'action du DAG et activer lui aussi les PKC [155]. Dans les années 90, il a été
démontré que la PKC ȗ ne répondait à la stimulation du DAG et du PMA [156]. Il est
maintenant établi que les cPKC sont activées par le DAG et les phorbol ester en
présence d'ions calciques (Ca+). Les nPKC ont les mêmes propriétés d'activation mais
Yoann Sottejeau
64
la présence de Ca+ n'est pas requise. Ceci est dû à la différence de séquences du
domaine C2. La PKC ȗ et probablement toutes les aPKC ne sont pas activables par le
DAG et le PMA, du fait d'un manque de répétition de cystéine dans le domaine. Cette
séquence riche en cystéine permet la fixation de ces deux métabolites [157].
iv Régulation des isoformes Į de la Na+, K+-ATPase par les PKC
En 1992, une étude montre des effets de régulation par les PKC de la Na+, K+ATPase [158]. Depuis cette étude, différents laboratoires ont démontré le rôle de
régulation des PKC sur la Na+, K+-ATPase et les différences de régulation sur les
différentes isoformes. Les bases moléculaires de cette diversité sont loin d’être
élucidées, mais le modèle admis repose sur la contribution de 2 zones d’hétérogénéités
structurales parmi les isoformes : la région N-terminale et une région de 10 acides
amines dans la principale boucle cytoplasmique. La première région porte les sites de
phosphorylation par les PKCs, l’autre un site d’interaction avec les vésicules de
clathrine via ces adaptateurs. Ensemble, ces régions expliqueraient que, suivant
l’activation des PKCs, certaines isoformes se retrouvent en plus grand nombre à la
surface de la cellule, alors que d’autres ne répondent pas ou se retrouvent
internalisées.
v
Rôle de la partie N terminale de l' Į1 dans la régulation de la Na+, K+ATPase par les PKC
Lorsque les PKCs sont activées par le PMA, l'activité de l'isoforme Į1 de la
Na+, K+-ATPase augmente dans les cellules de rein d'Opossum. Cette régulation est
due aux 31 premiers résidus d'acides aminés de la partie N-terminal de la Na+, K+ATPase [159]. En fait, les Serines 11 et 18 de l'Į1 sont phosphorylées simultanément
après l'activation des PKC. Cette augmentation de l'activité de la Na+, K+-ATPase
serait expliquée par une augmentation du nombre de Na+, K+-ATPases sur la
membrane plasmique des cellules [160]. Ces découvertes démontrent que les
isoformes sont régulées différemment, puisque seule l'Į1 comporte des sérines en
position 11 et 18 dans sa partie N-terminale.
Yoann Sottejeau
65
vi Rôle de la diversité de l'ISR dans la régulation de la Na+, K+-ATPase
par les PKC
Afin d'étudier la diversité de l'ISR de la Na+, K+-ATPase, le laboratoire du Dr
Pressley (Texas Tech University, Lubbock, Texas, USA) a réalisé différentes chimères
dans lesquelles l'ISR d'une isoforme est remplacée par celle d'une autre isoforme. Par
exemple, la chimère Į1Į2Į1 est l'isoforme Į 1 dont l'ISR a été changée par celle de l'
Į 2. Ces chimères ont été étudiées lors de la régulation de la Na+, K+-ATPase par PKC
[161]. L'activité de la pompe est augmentée dans les cellules de 15% après activation
des PKC pour les isoformes Į1 et Į2. Si l'ISR de Į2 remplace celle de l'Į1 (Į1Į2Į1),
l'augmentation est alors de 30%. Cependant pour la chimère Į2Į1Į2, il n'y a plus
d'augmentation. Lorsque les ISR des 4 isoformes (Figure 23) sont alignées, on
s'aperçoit que le dernier résidu d'acide aminé est une leucine pour les isoformes Į1, Į3
et Į4. Cette leucine forme un motif dileucine avec l'acide aminé suivant. L’isoforme
Į2 ne possède pas ce motif. De plus, il a été démontré que le motif dileucine s'associe
in vitro avec les adaptateurs à la clathrine AP-1 et AP-2 [162]. In vivo, ce motif
s'associe à AP-1 et facilite l'internalisation du récepteur [163].
Isoform Specific Region
Į1
Į2
Į3
Į4
... S
|
... S
|
... S
|
... S
I
|
I
|
I
|
I
H
|
H
|
H
|
H
K N P N A S
E
P K H L L V M K ...
|
| |
|
|
E R E D S P Q S - H V L V M K ...
|
| |
| |
|
|
E T E D P N D N R Y L L V M K ...
| |
| |
|
|
L L E D N S E A H V L L - M K ...
Figure 23 Différence de séquences de l' ISR des isoformes Į de la Na+, K+-ATPase
e
Muscle cardiaque et Na+, K+-ATPase
i
Muscle cardiaque
Dans le myocarde, la Na+, K+-ATPase régule la contractilité. En effet, le nœud
sinusal en produisant un potentiel d'action va dépolariser les myocytes. Cette
dépolarisation s'effectue dans un premier temps le long de la membrane plasmique par
l'ouverture des canaux sodiques puis dans un deuxième temps à travers les tubes
transverses (t-tubule) par l'ouverture des canaux calciques. L'augmentation de la
Yoann Sottejeau
66
concentration de calcium dans le cytoplasme va permettre à cet ion de se lier à la
troponine C. Cette interaction va permettre l'interaction des filaments d'actine et de
myosine et déclencher la contraction. La relaxation s'effectue par une dissociation du
calcium sur les myofilaments lors de la baisse de la concentration de calcium
intracellulaire. Cette dernière s'effectue par la réabsorption du calcium par les
protéines membranaires comme les SERCA, les NCX, Ca2+ ATPase sarcolemmal et
l'uniport calcique mitochondrial. Cette réabsorption calcique engendre une
augmentation de Na+ intracellulaire par l'activité NCX. Cet excès est régulé par la
Na+, K+-ATPase [164].
L'inhibition partielle de la Na+, K+-ATPase par les glycosides cardiaques
engendre une augmentation du Na+ intracellulaire. L'activité de l'échangeur Na/Ca
sarcolemal est alors affecté. Le Ca intracellulaire est augmenté ce qui entraîne une
augmentation de la force de contraction [165]. Il a aussi été démontré que l'ouabaïne
engendre par l'activation de la fonction de signalisation de la Na+, K+-ATPase une
hypertrophie des myocytes cardiaques [120].
ii Durant ischémie/reperfusion cardiaque
Les dommages occasionnés par l'ischémie/reperfusion cardiaque affectent aussi
la Na+, K+-ATPase. En effet, son activité est diminuée durant la reperfusion
[166],l'expression de ses gènes est altérée [167] ainsi que l'expression protéique de ses
isoformes [168]. Les mécanismes conduisant à ces altérations sont toujours inconnus.
iii Durant la protection (ouabaïne preconditioning)
Bien que les mécanismes conduisant à la baisse d'activité de la Na+, K+ATPase pendant la reperfusion restent ignorés, la préservation de cette fonction est
possible par un préconditionement ou " preconditioning " ischémique [169]. Ce
"preconditioning" ischémique protège aussi de l'altération de l'expression des gènes de
la Na+, K+-ATPase et de l'expression protéique de ses isoformes [168]. Il a aussi été
montré que la Na+, K+-ATPase de part sa fonction de signalisation peut protéger les
fonctions cardiaques et la mort cellulaire due à l'ischémie/reperfusion par
Yoann Sottejeau
67
administration d'ouabaïne ou de digoxine avant l'ischémie [170-173] Cette protection
appelée "ouabaïne preconditioning" active par le complexe Na+, K+-ATPase /Src la
PLC-Ȗ1 et PKCİ et permet l'ouverture des canaux potassiques ATP dépendant de la
mitochondrie ainsi que la production de ROS.
Yoann Sottejeau
68
Introduction: Application en Nutrition
III Application en Nutrition
La nutrition est la science qui analyse les rapports entre la nourriture et un état
de santé. A partir des nombreuses observations cliniques, la nutrition peut jouer un
rôle dans les maladies tels les problèmes cardiovasculaires, l'ostéoporose,
l'hypertension artérielle, le diabète de type 2 et l'obésité. Elle peut être un facteur
essentiel dans le maintien d’une bonne santé et permet de réduire les facteurs de
risques sur le plan physiologique. Le mode d'alimentation moderne peut induire
certains déficits alimentaires. C'est pour combler à ces déficits nutritionnels mais aussi
pour leur intérêt physiologique, que les compléments alimentaires trouvent leur utilité.
Le marché des compléments alimentaires est en pleine expansion dans les pays
industrialisés. En 2008, il a été estimé à 1 milliard d'euros selon les chiffres du
Syndicat de la Diététique et des Compléments Alimentaires (SYNADIET). Afin
d'encadrer cette expansion en Europe, d'éviter les risques sanitaires à la prise de ces
compléments alimentaires et aussi pour comprendre et démontrer leur efficacité,
plusieurs directives européennes ont été établies.
1
Le complément alimentaire et la réglementation européenne
Les compléments alimentaires sont définis par la directive européenne
2002/46/CE [174], repris par la législation française par le décret de 2006-352 du 20
mars 2006 [175] : "Compléments alimentaires : les denrées alimentaires dont le but
est de compléter le régime alimentaire normal et qui constituent une source
concentrée de nutriments ou d’autres substances ayant un effet nutritionnel ou
physiologique seuls ou combinés, commercialisés sous forme de doses, à savoir les
formes de présentation telles que les gélules, les pastilles, les comprimés, les pilules et
autres formes similaires, ainsi que les sachets de poudre, les ampoules de liquide, les
flacons munis d’un compte-gouttes et les autres formes analogues de préparations
liquides ou en poudre destinées à être prises en unités mesurées de faible quantité.".
Avant cette réglementation aucune définition précise du complément alimentaire
n’était établie. Cette définition établit pour le complément alimentaire une
composition (dose et forme de présentation) qui est associée à des effets nutritionnels
et physiologiques. Cette définition permet de faire la différence d’une part, entre le
Yoann Sottejeau
69
complément alimentaire et d’autre part avec les médicaments dont le rôle défini par
leur réglementation spécifique s’intéressant aux effets pharmacologiques avec la
prévention et le traitement thérapeutique des maladies humaines. Le complément
alimentaire ne peut être présenté comme ayant un usage thérapeutique comme l'est le
médicament. Outre la définition juridique des compléments alimentaires, la directive
européenne 2002/46/CE a permis la mise en place d'une réglementation pour ces
produits. Elle détermine une liste de vitamines et minéraux autorisés, définit les
limites maximales du dosage qui ne doivent pas dépasser des doses comprises dans la
limite de l'apport journalier recommandé (AJR) ainsi que la réglementation de
l'étiquetage. De plus, cette directive permet la protection du consommateur et une lutte
efficace contre toute forme de concurrence déloyale bien que toutes les substances
entrant dans les compléments alimentaires n’aient pu encore être harmonisées à ce
jour. Cette directive européenne a été transposée en droit français par le décret de
2006-352 du 20 mars 2006 [175],. Afin de compléter sa directive, le parlement
européen a édité le Règlement (CE) N°1925/2006 [176]. Ce règlement permet de
définir le cadre législatif concernant l'adjonction de vitamines, de minéraux et de
certaines autres substances aux denrées alimentaires. Il précise aussi les possibilités
d'allégations nutritionnelles, physiologiques et de santé des produits alimentaires.
a
Allégation santé
Pour obtenir une allégation santé, plusieurs conditions sont à remplir pour le
complément alimentaire. Le nutriment ou la substance faisant l'objet de l'allégation
doivent par la quantité présente dans le complément alimentaire avoir un effet
nutritionnel ou physiologique bénéfique et scientifiquement prouvé. Il doit être sous
une forme consommable. Pour autoriser une nouvelle allégation, le fabricant introduit
sa demande auprès de l’État membre concerné qui la transmet à l’Autorité européenne
de sécurité des aliments (EFSA, European Food Safety Authority) comme il est décrit
dans les règlements CE/353/2008 et CE/1169/2009 [177, 178]. Sur la base de l’avis
scientifique émis par l’EFSA, une décision (avis motivé positif ou négatif) relative à
l’utilisation est prise par la Commission. Ces allégations sont aussi soumises à des
exigences spécifiques en matière d'étiquetage et de publicité. Il doit être mentionné
l'importance d'une alimentation variée et équilibrée et d'un mode de vie sain, la
Yoann Sottejeau
70
quantité de la denrée alimentaire et le mode de consommation assurant le bénéfice
allégué, un avertissement sur les personnes qui doivent éviter cette substance
(allergies, intolérance) ainsi qu'un avertissement sur les risques pour la santé en cas de
consommation excessive.
Une petite proportion des avis sur les allégations ont été rendus depuis 2009
par l'EFSA et leur soumission auprès de la Commission Européenne en cours fera
l’objet d’un vote groupé pour toutes les allégations étudiées au cours de ces dernières
années.
i
dans le domaine cardiovasculaire
En 2011, l'EFSA a prodigué des conseils concernant les allégations santé dans
le domaine cardiovasculaire [179]. Ils résultent de l’expérience accumulée par les
expertises de nombreuses allégations génériques rendues nécessaire par ces textes. Les
bénéfices recevables pour une allégation santé sont notamment la réduction ou le
maintien de la pression artérielle après au moins deux mois de consommation du
produit, l'action sur les lipides sanguins telle la diminution du cholestérol- LDL ou des
triglycérides, l’augmentation du cholestérol HDL mis en évidence dans des études
cliniques. La réduction de l'agrégation plaquettaire fait exception en incluant des
sujets ayant une activation plaquettaire constitutive, la durée de la complémentation ne
dure qu’un mois.
2
Régime méditerranéen
Le régime alimentaire méditerranéen est caractérisé par une consommation de
fruits, légumes, pain, céréales, noix, graines, de poissons et d'huile d'olive ainsi qu'une
faible consommation de viande rouge [180]. (Figure 24).
Yoann Sottejeau
71
Figure 24 Base du régime méditerranéen adapté de [180]
Depuis les années 90, ce régime suscite un grand intérêt de la santé publique.
Cette diététique, par l'apport d'antioxydants et d'acides gras mono et polyinsaturés,
apporte des bénéfices dans de nombreux domaines de la santé. En effet, il a été
démontré que le régime méditerranéen a un effet sur la longévité, sur les maladies
chroniques, sur l'obésité, sur les maladies cardiovasculaires, sur le cancer et sur la
mortalité [180-190].
3
Omégacoeur®
Yoann Sottejeau
72
C'est en se basant sur ce régime méditerranéen et sa capacité à contribuer à la
protection cardiovasculaire que les laboratoires Holistica® ont développé le
complément alimentaire Omégacoeur®.
Ce complément est composé d'huile de poissons sauvages, d'un nuxoléat
méditerranéen (consistant en un macérat d’ail, de basilic, d'huile d’olive et d'huile de
noix) et d'huile de germe de blé. Le tout est conditionné dans une capsule en gélatine
de poissons sauvages.
L'huile de poisson sélectionné pour Omégacoeur® est naturellement riche en
acide gras polyinsaturés (AGPI) de la série Ȧ 3, plus particulièrement en EPA (acide
eicosapentaénoïque) et en DHA (acide docosahexaénoïque) sous leur forme native
triglycérides, non estérifiés. L'huile d'olive apporte de très grandes quantités d'acide
oléique (de la série des Ȧ 9) tandis que l'huile de noix et l'huile de germe de blé
fournissent les AGPI de la série Ȧ 6 et notamment l'acide linoléique et une petite
contribution en autres AGPI. Une prise de quatre capsules par jour pour un apport
nutritionnel ou physiologique permet l'apport de 676 mg d'ȍ 3 AGPI comprenant 572
mg d'EPA et de DHA soit 229% AJPR et 188% d'AJPR pour le DHA selon les
recommandations de l'EFSA [191]. Deux capsules par jour couvrent 100 % des AJPR
en EPA et DHA (114 %). Pour un usage visant à la réduction des risques
cardiovasculaires, une prise de six capsules par jour apporte 1014 mg d'Ȧ 3 AGPI
incluant 858mg d'EPA et de DHA soit 343% d'AJPR selon les recommandations de
l'EFSA [191].
a
ȍ3
Le groupe d'acides gras Ȧ-3, notés également Ȧ3 (ou encore n-3), un groupe
d'acides gras polyinsaturés à longue chaîne. Les principaux acides gras du groupe Ȧ-3
sont l'acide Į-linolénique (ALA), l'acide éicosapentaénoïque (EPA) et l'acide
docosahexaénoïque (DHA) (Figure 25).
Yoann Sottejeau
73
ȍ3
Formule
Acide Į-linolénique
(ALA) (C18:3n-3)
Acide éicosapentaénoïque
(EPA) (C20:5n-3)
Acide docosahexaénoïque
(DHA) (C22:6n-3)
Figure 25 Formule chimique des principaux acides gras du groupe Ȧ-3
L'acide Į-linolénique est qualifié d'acide gras essentiel car l'organisme ne peut
les synthétiser [192, 193]. Il est donc indispensable de les apporter dans l'alimentation.
. Il est particulièrement présent dans l’huile, les graines de lin et de chanvre, ainsi que
dans l'huile de noix et de canola (colza). L'ALA est le précurseur du DHA et de l'EPA
[194] (Figure 26).
.
Figure 26 Synthèse des acides gras du groupe Ȧ-3
Yoann Sottejeau
74
L'acide eicosapentaénoïque peut être synthétisé à partir de l'acide alphalinolénique. Il est important de consommer des aliments riches en EPA, notamment
certains poissons gras (le saumon, le flétan, le hareng, le maquereau, les anchois, le
thon, les rougets et les sardines). L'EPA est l'un des précurseurs avec l'acide di-homo
gamma linolénique et l'acide arachidonique des éïcosanoïdes. Par la voie des cyclooxygénases et par la voie des lipoxygénases, ces trois acides gras sont transformés en
en prostaglandines, prostacyclines, thromboxanes, et leucotriènes [195]. Ces différents
dérivés vont jouer un rôle dans les voies de l'inflammation, de l'agrégation plaquettaire
et de l'hémodynamique [196].
L'acide docosahexaénoïque peut en théorie être synthétisé à partir de l'ALA.
Cependant un apport augmenté d'ALA n'entraine pas de grandes variations de DHA
[197]. La consommation d'aliments riches en DHA est donc recommandée. Le DHA
est présent notamment dans certains poissons gras. Le DHA, tout comme l'acide
arachidonique (AA), est incorporé dans les phospholipides membranaires. Leurs
chaînes carbonées de par leurs nombreuses doubles liaisons (6 pour DHA et 4 pour
AA) leur confèrent une grande flexibilité. Cette flexibilité va permettre d'augmenter la
fluidité de la membrane et ainsi modifier les propriétés physico-chimiques de celle-ci.
La modification de la fluidité de la membrane plasmique va modifier l'activité des
protéines transmembranaires comme les récepteurs ou les canaux ioniques [198-200].
Du fait de toutes ces actions, les Ȧ 3 ont des effets en cancérologie, en
neurologie et dans le domaine cardiovasculaire [201-210].
b
ȍ6
Le groupe d'acides gras Ȧ-6, noté également Ȧ6 (ou encore n-6), sont des acides gras
polyinsaturés. Les principaux acides gras du groupe Ȧ-6 sont l'acide linoléique (LA),
l'acide gamma-linolénique, l'acide dihomo-gamma-linolénique et l'acide arachidonique
(AA). L'acide linoléique est qualifié d'acide gras essentiel. Il est donc indispensable de
Yoann Sottejeau
75
l'apporter dans l'alimentation. Il est particulièrement présent sous forme végétale dans
les huiles de pépins de raisin, de tournesol, de germe de blé, de maïs, de noix et de
soja. L’acide linoléique est un précurseur de l'acide arachidonique, il est donc lié à la
production et à l’équilibre d'eicosanoïdes, intervenant dans la régulation de
l’inflammation, du métabolisme cellulaire et de l’agrégation plaquettaire [196]
(Figure 27).
Figure 27 Synthèse des acides gras du groupe Ȧ-6
Du fait de toutes ces actions, les Ȧ 6 ont des effets anti cancer, anti inflammatoire et
dans le domaine cardiovasculaire [211-214].
c
ȍ9
Le groupe d'acides gras Ȧ9, noté également Ȧ9 (ou encore n-9), sont des acides gras
mono-insaturés. Les principaux acides gras du groupe Ȧ-9 sont l’acide oléique, l’acide
gadoléique, l’acide érucique et l’acide nervonique. Ils ne sont pas essentiels, le corps
humain peut les fabriquer à partir d'acides gras insaturés. Dans l'alimentation, on les
Yoann Sottejeau
76
retrouve principalement dans l'huile d'olive qui est riche en acide oléique. Les
composés de l'huile d'olive ont démontré des effets sur le cancer, les maladies
cardiovasculaires, l'arthrite et l'hypertension [215-217].
d
Basilic
Le basilic, Ocimum basilicum, est une plante de la famille des Labiacées. Sa culture
nécessite un climat chaud et ensoleillé comme le climat méditerranéen. Dans le régime
méditerranéen, il est utilisé comme condiment ou comme plante aromatique. Le
basilic a démontré des propriétés antimicrobiennes, des effets sur le diabète et des
effets dans le domaine cardiovasculaire. [218-220].
e
Ail
L'ail, Allium sativum, est une plante de la famille des Amaryllidaceae. Dans le régime
méditerranéen, il est utilisé comme condiment. L'ail a démontré des propriétés
antimicrobiennes, des effets en cancérologie et des effets en cardiovasculaire [221224].
4
Régime ayuvédique
L'Ayurvéda ou encore médecine ayurvédique est une médecine traditionnelle
originaire de l’Inde, également pratiquée dans d'autres parties du monde. Cette
médecine antique a une approche holistique en intégrant des recommandations
nutritionnelles. Ce régime est basé essentiellement sur l'utilisation des légumes et
d'épices. Ce régime a démontré des effets anti-inflammatoires [225, 226]. Aucun effet
cardiovasculaire n'a été démontré par ce régime, cependant certaines épices et herbes
composant le régime ont démontré des effets cardiovasculaires [227].
5
Dolupérine®
Yoann Sottejeau
77
C'est en se basant sur ces traditions ayuvédiques et son action anti-inflammatoire sur
l'arthrite que les laboratoires Holistica® ont développé le complément alimentaire
Dolupérine®. Ce complément est composé d'extrait de curcuma concentré en
curcumine (95%), d'extrait de gingembre titré en gingerol (5%) et d'extraits de poivre
(95% de piperine). Holistica® recommande 2 gélules de Dolupérine par jour ce qui
apporte 600 mg de curcumine potentialisés pour sa biodisponibilité par 7,5 mg de
pipérine et 15 mg de gingérol pour un apport nutritionnel ou physiologique.
a
Curcuma
Le curcuma (Curcuma longa) dont le principal principe actif est la curcumine ou
diféruloyméthane. La curcumine est le principal pigment du curcuma qui donne une
couleur jaune. Ce composé est l'un des piliers de la diététique "Ayurvéda" est
composant essentiel des currys indiens. Il amène une majeure partie des effets
biologiques du curcuma notamment les effets sur l'inflammation. Il a été démontré que
la curcumine inhibe les enzymes clés de l'inflammation la cyclooxygénase 2 (COX 2)
et la lipooxygénase [228, 229]. La curcumine a donc des effets sur l'inflammation
ainsi que sur le cancer, l'ischémie cérébrale ainsi que dans le domaine cardiovasculaire
[230-237].
b
Poivre
Le poivre est une épice obtenue à partir des baies de différentes espèces de poivriers
(Piper nigrum, Piper cubeba et Piper longum). Le poivre a la propriété d'augmenter la
biodisponibilité de la curcumine qui est peu assimilée seule par l'organisme [238,
239]. Outre cette propriété, le poivre a démontré des effets en neurologie, en
cardiovasculaire, en gastrologie et en cancerologie [240-243].
c
Gingembre
Yoann Sottejeau
78
Le gingembre, Zingiber officinale, est une plante dont le rhizome est utilisé comme
épice notamment dans le régime ayuvédique. Le gingembre et son principe actif le
gingérol ont démontré des effets sur la digestion, le cancer, dans le domaine
cardiovasculaire ainsi que des effets antimicrobiens et anti-inflammatoires [244-250].
6
Incidence de ces régimes sur les maladies cardiovasculaires
a
En 1966, une étude épidémiologique a démontré que la mort suite à une cause
cardiovasculaire est moins présente chez les populations issus du bassin méditerranéen
et au Japon où le régime alimentaire est basés sur la consommation de poisson cru
riche en Ȧ 3, que dans les autres pays industrialisés tel la Finlande et les Etats-Unis
[251]. Cette étude épidémiologique a été poursuivie pendant 15 ans dans 7 pays et les
résultats confirment les premières impressions de l'étude de 1966 [252, 253].
Depuis d'autres études ont démontré cette corrélation entre le régime méditerranéen et
la diminution de la mortalité suite à une cause cardiovasculaire [186]. Outre cette
prévention, ce régime permet une prévention primaire en réduisant les facteurs de
risques cardiovasculaires du myocarde [254, 255] et une prévention secondaire par la
diminution de la survenue d'une récidive d’infarctus après un premier événement
cardiovasculaire.
[256].
Bien
que
de
nombreuses
preuves
de
prévention
cardiovasculaire existent pour ce régime, il n'est pas encore recommandé par les
organisations de la santé publique. Ces organisations préfèrent recommander
seulement certains composés de ce régime comme les Ȧ-3.
i
ȍ3
A l'instar du régime méditerranéen, les Ȧ 3 qui le composent sont aussi associés à une
protection cardiovasculaire. De nombreuses d'études cliniques d'intervention
rapportent l'effet protecteur des huiles de poisson et autres ingrédients contenant des Ȧ
3 dans la prévention et le traitement des maladies cardiovasculaires [257-259]. Les
apports en Ȧ 3 sont recommandés par différentes organisations pour la prévention de
Yoann Sottejeau
79
risques cardiovasculaire notamment l'American Heart Association en Amérique du
Nord et l'EFSA pour l'Europe [191, 207] ainsi que l'Agence Française de sécurité
sanitaire (AFSSA) [260] (Tableau 4).
Tableau 4 Recommandation de différentes organisations pour la prévention de risques cardiovasculaire
d'après [191, 207, 260]
Institution
Population ciblée
Tous adultes sans
maladie cardiaque
chronique
American Heart
Association
(USA)
European Food
Safety Agency
(Europe)
Patients avec une
maladie cardiaque
chronique
Consommation approximative d' 1g/jour
d'EPA+DHA provenant préférablement d'huile
de poissons
Patients avec un taux
élevé de triglycérides
2-4 g/jours d'EPA+DHA
Population adulte
250mg EPA+DHA par jour
Femmes enceintes ou
allaitantes
Enfants de 7-24 mois
100-200mg DHA par jour en ajout des apports
journaliers recommandés pour un adulte
Enfants de 2-18 ans
Population adulte
Agence française
de sécurité
sanitaire des
aliments (France)
Recommandation
Manger du poisson (particulièrement des
poissons gras) au moins deux fois par semaines
comprenant les huiles et les produits riches en
ALA
Femmes enceintes ou
allaitantes
Enfants de 6 mois-3
ans
Enfants de 3-9 ans
Enfants de 9-18 ans
100mg DHA par jour
250mg DHA par jour
250mg EPA par jour
250mg DHA par jour
70mg DHA par jour
125mg DHA par jour
250mg DHA par jour
Les Ȧ 3 ont un effet anti-arythmique [209, 261], un effet anti-thrombotique par
inhibition de l'agrégation plaquettaire [262], anti-inflammatoire par diminution de la
CRP [263]. Ils améliorent les fonctions endothéliales en diminuant l'adhésion à
l'endothélium (diminution de VCAM) et en ayant un effet direct vasomoteur sur les
Yoann Sottejeau
80
effets endothéliales [264, 265] ainsi que les paramètres lipidiques sanguins en
diminuant le cholestérol et les triglycérides plasmatiques [206, 266].
ii ȍ 6
Le rôle des Ȧ 6 en cardiovasculaire a été plus controversé du au fait d'un effet pro
inflammatoire possible lié à la production de certains éïcosanoïdes (Prostaglandine E2,
Thromboxane A2, Leukotriène B4). Cependant un effet anti-inflammatoire est décelé
chez l'homme [267]. Les Ȧ 6 améliorent aussi le profil lipidique et notamment la
baisse du cholestérol (total et LDL) et l'augmentation des HDL [268]. L'AHA
préconise la prise d'Ȧ 6 équivalent à au moins 5 à 10% des besoins énergétiques par
jour pour diminuer les risques cardiovasculaires [213].
iii ȍ 9
L'effet cardiovasculaire de l'huile d'olive est démontré chez l'homme par l'étude
Eurolive ("The effect of olive oil consumption on oxidative damage in European
populations"). Les Ȧ 9 et les composés phénoliques de l'huile d'olive agissent sur
l'augmentation des HDL, la diminution de l'oxydation des lipides (LDL oxydés) [269].
iv Basilic
Le potentiel effet cardiovasculaire du basilic n'a été démontré qu'in vitro et sur
l'animal. En effet, le basilic a des effets vasorelaxants et diminue l'agrégation
plaquettaire. Il permet aussi la diminution du cholestérol total dans le plasma ainsi que
le niveau du LDL cholestérol et des triglycérides [220, 270].
v
Ail
Yoann Sottejeau
81
Les bienfaits cardiovasculaires de l'ail viennent de ses effets anti-athéroslérotiques
contribuant à limiter l'augmentation de la plaque d'athérome [221].
b
Régime ayuverdique
Aucune
étude
épidémiologique
ou
essai clinique n'ont démontré d'effets
cardiovasculaires cependant plusieurs composés de ce régime présentent des effets
potentiels notamment par leur rôle dans la modulation de l’inflammation.
i
Curcuma
Le curcuma et son composé actif la curcumine ont un fort potentiel pour la prévention
cardiovasculaire. Il a été démontré lors d'expériences d'ischémie/reperfusion
cardiaque, que chez les rats ayant eu un régime contenant de la curcumine pendant un
mois, l'infarctus myocardique est diminué et permet un meilleur rétablissement des
fonctions cardiaques [271, 272]
ii Poivre
Outre ses effets catalyseurs pour l'assimilation de la curcumine dans l'organisme [238,
239], le poivre a la propriété d’un hypotenseur chez le lapin [241].
iii Gingembre
dans des études précliniques, il a été démontré pour le gingembre de nombreux effets
cardiovasculaires. En effet, le gingembre et son composé actif le gingérol a des effets
anti inflammatoires, antioxydant, anti plaquettaires, hypotenseur et hypolipidémique.
[246, 247].
7
Incidence de ces régimes sur la Na+, K+-ATPase
Yoann Sottejeau
82
a
Quelques études ont mis en évidence plusieurs effets des constituants du régime
méditerranéen sur la Na+, K+-ATPase. Sur les cellules cardiaques de rat, il a été
démontré que les Ȧ 3 diminuaient l'effet toxique de l'ouabaïne sur les cellules en
réduisant l'augmentation de contractilité et de la concentration du calcium
intracellulaire. Sur le cœur isolé les Ȧ 3 n’interfèrent pas avec la contractilité mais
diminuent les effets toxiques d’une intoxication à l’ouabaïne liés à une surcharge
calcique délétère [36]. Les huiles de poissons modifient l'affinité de l'ouabaïne pour
l'isoforme Į1 [273] chez le rat dans plusieurs tissus (rein, cœur, cerveau, nerf
sciatiques).Ces huiles de poissons limitent la baisse d'activité de la Na+, K+-ATPase
lors de la cardiomyopathie induite par le diabète. [274]. Des études sur la Na+, K+ATPase purifiée de rein porc ont démontré que l'acide linoléique diminue l'activité de
la Na+, K+-ATPase et augmente l'affinité à l'ouabaïne. Dans ce type d’étude, il ne reste
que la protéine entourée d’un manchon lipidique indispensable à l’activité
enzymatique de la Na+, K+-ATPase purifiée. L’acide linoléique perturbe cette
interaction entre l’acide gras et la protéine [275]. Sur les membranes de cellules
endothéliales isolées et semi purifiées, il a été démontré que les Ȧ 3 diminuent
l'activité de la Na+, K+-ATPase par un mécanisme similaire à celui présenté
précédemment [276]. A l'inverse, Omégacoeur® induit une augmentation de l'activité
de la Na+, K+-ATPase [277]. Ces différences peuvent s'expliquer par la différence des
méthodes d'incorporation des acides gras dans les cellules et aussi par la composition
des traitements (Ȧ 3 et Ȧ 3/6/9, ail et basilic).
b
Ayuverdique
Quelques études ont mis en évidence, plusieurs effets de la curcumine, constituant du
régime ayuverdique, sur la Na+, K+-ATPase. Sur la Na+, K+-ATPase purifiée, il a été
démontré que la curcumine diminuait l'activité de la Na+, K+-ATPase [278]. Cette
action inhibitrice pourrait s’expliquer par une modification de l'interface
lipide/protéine [279]. Sur les cardiomyocytes de rat adulte, cette baisse d'activité de la
Na+, K+-ATPase liée à l'action de la curcumine est retrouvée. Outre cet effet
Yoann Sottejeau
83
inhibiteur, la curcumine protège en partie de la diminution de l'activité de la Na+, K+ATPase lié à l'action du TNFĮ. [280].
Yoann Sottejeau
84
Problématiques et Objectifs
85
Plusieurs problématiques et objectifs ont été déterminés durant cette thèse :
I Différence des isoformes Į de la Na+, K+-ATPase
De part leurs différences d'expression tissulaire, les différentes isoformes Į de la Na+,
K+-ATPase ont probablement des rôles ou des régulations différentes dans les cellules
notamment pour ajuster des réponses aux seconds messagers intracellulaires au niveau
tissulaire. Leur fonction enzymatique étant similaire, ces différences pourraient
provenir de leur fonction de signalisation ainsi que de leur régulation par d'autres
protéines. Pour caractériser ces différences, nous avons d'abord étudié la fonction de
signalisation des quatre isoformes Į de la Na+, K+-ATPase, puis le rôle d'un motif
dileucine [DE]XXXL[LI] contenu dans l'ISR de l' Į 1 de la Na+, K+-ATPase, qui peut
être reconnu par les adaptateurs à la clathrine AP-1 et AP-2, et sa régulation par les
PKC par la création du mutant Į1-L499V. Les résultats obtenus ont mis en évidence
des caractéristiques spécifiques du mutant Į1-L499V et une plus grande présence à la
membrane cellulaire de la Na+, K+-ATPase. Ces caractéristiques ont été étudiées dans
les contextes de l'ischémie/reperfusion rénale et cardiaque afin de vérifier si
l'augmentation de la Na+, K+-ATPase à la surface membranaire peut être salutaire
lorsque la cellule a une concentration intracellulaire de Na+ élevé. Cette augmentation
de Na+ a été reportée lors de l'ischémie/reperfusion [48, 281].
II Caractérisation de la Na+, K+-ATPase durant ischémie/reperfusion
cardiaque
La Na+, K+-ATPase subit les dommages occasionnés de l'ischémie/reperfusion
cardiaque. Lors de la reperfusion, l'activité de la Na+, K+-ATPase est diminuée ce qui
accélère le processus de mort cellulaire. Les processus amenant à la défaillance de la
Na+, K+-ATPase sont encore inconnus. Nous avons essayé de caractériser la Na+, K+ATPase lors des trente premières minutes de la reperfusion après ischémie sur un
modèle cellulaire. Afin de valider le modèle cellulaire d'ischémie/reperfusion par
"Substrate and Coverslip hypoxia", nous avons dans un premier temps confirmé les
effets protecteurs de l'Ouabaïne preconditioning reportées par le laboratoire du Dr
Yoann Sottejeau
86
Pierre [171] puis, dans un deuxième temps nous avons caractérisé cette protection sur
la Na+, K+-ATPase.
III Effets cardiovasculaires de l'association des composés Omégacoeur®
et Dolupérine®
Les ingrédients des composés Omégacoeur® et Dolupérine® ont tous des propriétés
cardiovasculaires. Différentes études ont démontré des effets synergétiques des
composants majeurs d' Omégacoeur® (Ȧ 3) et Dolupérine® (curcumine) sur
l'inflammation [282, 283]. Afin de démontrer des effets cardiovasculaires de
l'association des composés Omégacoeur® et Dolupérine®, nous avons tout d'abord
réalisé des études toxicologiques sur des cellules humaines de cette association, puis
étudié les effets de l'association après l'ischémie/reperfusion sur des cellules
humaines. Pour des raisons de confidentialité dus à la mise en place d'un brevet, seuls
les premiers résultats de l'étude toxicologique seront présentés dans la partie résultat.
Afin de permettre d'obtenir une allégation santé cardiovasculaire à cette association
Omégacoeur® et Dolupérine®, un protocole d'essai clinique est en cours d'écriture.
Mon travail de thèse a donc consisté à étudier la Na+, K+-ATPase cardiaque lors des
dégâts occasionnés par la reperfusion après ischémie/reperfusion, la protection
occasionnée de l'Ouabaïne Precondioning sur la Na+, K+-ATPase, la compréhension
de l'hétérogénéité des isoformes de la Na+, K+-ATPase dans la fonction de
signalisation et le rôle de l'ISR dans la régulation des PKC, ainsi que les possibles
effets cardiovasculaires de l'association des composés Omégacoeur® et Dolupérine®
sur l'ischémie/reperfusion.
La présentation des résultats obtenus au cours de mes quatre années de thèse se fera
sous forme d'articles scientifiques associés à certains résultats supplémentaires.
Yoann Sottejeau
87
Matériels et Méthodes
88
Pendant ces quatre années de formation, j'ai acquis différentes compétences
notamment la culture cellulaire, des techniques biochimiques, des techniques de
transfection cellulaire ainsi que l'imagerie confocale. Je me limiterai dans ce chapitre,
à la présentation des techniques utilisées en routine.
I Culture Cellulaire
1
Lignée de rein d’opossum : OK
Les cellules cultivées sont des cellules de rein d'opossum (OK, American Type
Culture Collection, ATCC number CRL-1840). C'est une lignée de cellules
épithéliales d'opossum adhérentes provenant des cellules de tubules proximaux de
rein.
2
Lignée de rein de porc : LLC-PK1 et ses lignées modifiées PY17 et AAC19
Les cellules cultivées sont des cellules de rein de porc (LLC-PK1, American
Type Culture Collection, ATCC number CL-101). C'est une lignée de cellules
épithéliales de porc adhérentes provenant des cellules de tubules proximaux de rein.
Pour mener à bien ce travail, j'ai eu recours à deux lignées modifiées issue de
LLC-PK1, PY17 et ACC19 [143] fournies par le Prof. Zijian Xie de l'Université de
Toledo. La lignée PY17 est une lignée où l'isoforme Į endogène de la Na+, K+-ATPase
est sous exprimé (10% de son expression habituelle). La lignée ACC19 est une lignée
issue de PY17 où l'expression de l'isoforme Į de la Na+, K+-ATPase est restauré par la
transfection d’une isoforme Į provenant du rat résistante à l'ouabaïne.
3
Lignée embryonnaire de rein humain : HEK 293
La lignée HEK293 (Human Embryonic Kidney, American Type Culture
Collection, ATCC number CRL-1573) est une lignée de cellules épithéliales humaines
adhérentes provenant de cellules embryonnaires de rein. C'est une lignée dont
89
l'utilisation est très répandue dans le monde scientifique car ces cellules présentent une
croissance rapide et une facilité à être transfectées avec divers agents.
4
Conditions de culture des lignées cellulaires
Les lignées de OK, HEK293 et LLCPK1 sont entretenues dans du milieu
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) complété avec les antibiotiques
pénicillines et streptomycine pour des concentrations finales respectives de 100 U/mL
et 100 μg/mL et par du sérum de veau fœtal (SVF) utilisé à 10%. Pour les cellules
transfectées avec une isoforme Į de la Na+, K+-ATPase de rat, 3 μM d'ouabaïne sont
ajoutés dans le milieu standard de culture pour maintenir la lignée.
Les cellules sont placées dans un incubateur à 37°C dont l'atmosphère est
humidifiée et enrichie à 5% (HEK293 et LLCPK1) et 10% (OK) de CO2. Lorsque les
cellules sont confluentes, à environ 80%, elles sont décollées par une brève
trypsinisation (trypsine-EDTA, SIGMA). L'effet de la trypsine est ensuite inhibé par
dilution avec l’ajout du milieu de culture complet. Les cellules sont alors centrifugées
à 1000 g 5 minutes puis remises en suspension 0.8 105 cellules/cm2. Le milieu est
renouvelé tous les 2 jours. Enfin, pour éviter une dérive génétique, nous effectuons au
plus une vingtaine de passages successifs avant de décongeler une nouvelle fiole de
cellules.
5
Cellules primaires de myocytes cardiaques néonataux de rats sains
Les cultures primaires de myocytes cardiaques néonataux sont obtenues à
partir de rat Sprague Dawley âgé de 1 à 2 jours. Les cardiomyocytes sont isolés par
digestion répétée des ventricules dans une solution enzymatique composée de
collagènase et de pancréatinase puis par une dissociation des fibroblastes et des
cardiomyocytes par incubation des cellules 1h30 dans un incubateur à 37°C et 5% de
CO2. Une fois les fibroblastes attachés à la boîte de culture, la solution contenant les
cardiomyocytes est répartie dans les boîtes de culture tapissées de collagène à une
densité de 1 105 cellules/cm2. Les cellules sont cultivées dans un milieu comprenant 4
Unités de DMEM et 1 Unité de Medium 199 (M199) complété avec les antibiotiques
pénicilline et streptomycine pour des concentrations finales respectives de 100 U/mL
90
et 100 μg/mL et par du sérum de veau fœtal (SVF) utilisé à 10% dans un incubateur à
37°C et 5% de CO2. Après 24 h, le milieu est changé dans le milieu DMEM/M199
privé de SVF. Toutes les expériences, utilisant des cardiomyocytes néonataux (CMN),
ont été utilisés 48 h après la privation du milieu en sérum.
II La transfection
La transfection est le processus de transfert d'ADN ou d'ARN exogène dans
des cellules eucaryotes. Il existe différentes méthodes pour introduire ces éléments
exogènes dans une cellule. La plus classique et la moins onéreuse mais par contre la
moins fiable, est la transfection par des précipités de phosphate de calcium.
Récemment, des techniques de transfection par des liposomes appelées lipofections
(micelles lipidiques possédant des propriétés structurales analogues à celle des
membranes cellulaires) se sont multipliées. Il existe encore d'autres moyens pour
transfecter les cellules notamment des transfections par éléctroporation (choc
électrique) ou par choc thermique. Ces 2 dernières techniques ont pour finalité la
création d'ouvertures transitoires dans la membrane plasmique permettant l'entrée de
molécules extracellulaires, comme un plasmide d'ADN ou un ARN silencieux
(siARN).
1
Création de lignées stables
Différents clones stables ont été obtenus par transfection des PY17 avec un
vecteur encodant la protéine Į2 de la pompe Na+, K+-ATPase par la technique de
transfection. Lors de cette transfection, le plasmide pRC/CMV- Į 2 AACS (don du Dr
Thomas Pressley, Université de Texas Tech) exprimant l'isoforme Į 2 de rat modifié
pour résister à l'ouabaïne est introduite dans les cellules avec la lipofectamine 2000
(Invitrogen©). Les cellules transfectées et devenues résistantes à l’ouabaïne sont
sélectionnées par l’ajout dans le milieu de culture de 3 μM d'ouabaïne, 24 h après la
transfection. Après une semaine, les cellules isolées exprimant l'isoforme Į 2 de la
pompe Na+, K+-ATPase sont cultivées pour obtenir une lignée cellulaire stable.
L'expression des isoformes Į 1 et Į 2 de la lignée cellulaire est alors quantifiée par
Western Blot pour leurs protéines.
91
2
Transfection transitoire par lipofection
24 heures après ensemencement, les CMN sont transfectées par les plasmides
de l'isoforme Į 1 de rat de la pompe Na+, K+-ATPase (Į 1-YFP ou Į 1 L499V-YFP) à
l'aide de lipofectamine 2000 (Invitrogen©) selon les recommandations des
fournisseurs. Pour optimiser le rendement de la transfection des CMN, celle-ci est
réalisée dans du milieu sans sérum (optiMEM , Invitrogen). 8 heures après, le milieu
sans sérum est ensuite renouvelé. Les expériences d'ischémie/reperfusion sont
réalisées 48 heures après la transfection des cellules.
III Induction de l’ischémie/reperfusion
1
Technique
L'ischémie est reproduite par la technique de "Substrate and Coverslip
hypoxia". La privation de l'oxygène lors de l'ischémie est reproduite par la technique
de "Coverslip Hypoxia" décrite par [58]. En effet, plusieurs lamelles de verres (deux
22 X 44 mm LifterSlips et un 22 X 63 mm LifterSlip (Thermo scientific)) sont placées
sur les CMN et recouvrent 57% de la boîte de culture (Figure 28). La privation de
nutriment est réalisée par le changement du milieu par du PBS. La reperfusion
s'effectue par l'enlèvement délicat des lamelles de verre et le changement de milieu du
PBS par la solution de Krebs-Henseleit.
Figure 28 Représentation schématique du positionnement des lamelles de verres pour la technique de
"Substrate and Coverslip hypoxia"
92
Pour les études de microscopie confocale, les cellules sont cultivées sur des
lamelles de verre (22X22, Fisher) en plaque six puits et l'I/R est induite comme décrit
précédemment par une lamelle de glace ronde de 18 mm de diamètre (Fisher).
2
Protocole
Pour étudier l'ischémie/reperfusion, 2 groupes ont été composés (Figure 29).
Les temps de perfusion, d'ischémie et de reperfusion ont été définis en fonction des
résultats préalablement obtenus par le laboratoire du Dr Pierre sur cœur isolé perfusé
[171]. Chaque expérience a été réalisée avec des cellules confluentes à 70-80%.
Le groupe Contrôle (C) est constitué de cellules perfusées 80 minutes en
Krebs-Henseleit (KH) contenant (en mmol/L) 118.0 NaCl, 4.0 KCl, 1.8 CaCl2, 1.3
KH2PO4, 1.2 MgSO4, 0.3 EGTA, 25 NaHCO3, and 37 D-glucose à 37°C.
Pour le groupe ischémie/reperfusion (IR), les cellules sont rincées puis
perfusées dans une solution de KH pendant 20 minutes à 37°C. L'ischémie réalisée par
la technique de "Substrate and Coverslip hypoxia" pendant 30 minutes à 37°C. La
reperfusion est initiée pour 0,5 et 30 minutes.
Pour étudier la protection par un preconditioning à l’ouabaïne, 3 groupes ont
été composés (Figure 29). Un groupe " Ouabaïne Preconditioning" (OPC), le
"preconditioning" est réalisé par l'incubation de 10 μM d'ouabaïne pendant 4 minutes,
puis rinçage et 8 minutes de perfusion en KH ; l'ischémie/reperfusion est réalisée
comme dans le groupe IR avant l'ischémie/reperfusion. Pour étudier les voies de
signalisation de l' "Ouabaïne Preconditioning", deux autres groupes utilisant un
inhibiteur de PKCİ translocation peptide ont été ajoutés. Ces deux groupes
ischémie/reperfusion + inhibiteur de PKCİ translocation peptide (IR+TIP) et ouabaïne
preconditioning + inhibiteur de PKCİ translocation peptide (OPC+TIP) suivent les
mêmes protocoles respectivement décrits par IR et OPC, la différence étant un ajout
avant l'induction de l'ischémie/reperfusion de 5 nM d'inhibiteur de PKCİ translocation
peptide.
93
Figure 29 Protocole d'ischémie/reperfusion
IV Mesure du transport ionique et de l’activité enzymatique de la Na K
ATPase
1
Mesure du transport ionique : assimilation du Rubidium
Cette technique [284] permet d’estimer le transport actif d’ions rubidium par la
pompe à sodium. Elle est basée sur la capacité de l'ion Rb+ à se fixer sur les sites
extracellulaires de transport de l'ion K+ puis à être incorporé dans la cellule, Le K+
extracellulaire n’est pas présent en raison de sa compétition pour le site K. L'inhibition
spécifique de l'activité de la pompe Na+, K+-ATPase est obtenue par addition
d’ouabaïne. L'activité de la pompe Na+, K+-ATPase est mesurée par la différence
d'accumulation dans les cellules de radioisotopes après 8 minutes à 37°C d'incubation
d'une solution de DMEM contenant du
86Rb
+
avec ou sans ouabaïne (1mM
concentration finale).
94
Pour mesurer l'activité Na , K -ATPasique maximale dans toutes les conditions
+
+
expérimentales, la monensine est ajoutée à la solution radioactive. En effet, il était
important de limiter l’influence d’un changement possible de la concentration
intracellulaire de Na+ suivant une modification de l’activité Na+, K+-ATPasique dans
nos conditions. L’absence de gradient de sodium empêche à la concentration
intracellulaire sodique de réguler l’activité Na+, K+-ATPasique [285].
Pour déterminer l'effet des PKC sur l'activation, les cellules en monocouches
(70% de confluence) sont préalablement incubées en présence d'un agoniste de
phorbol ester, phorbol 12- myristate 13 acétate (PMA), (10 μM concentration finale)
dilué dans du DMSO, ou d'une solution véhicule, le DMSO.
2
Mesure de l’activité enzymatique totale
La mesure de l'activité de la Na+, K+-ATPase se fait par la méthode colorimétrique
adaptée de [286] qui permet de doser le phosphate inorganique en solution.
Parallèlement sur des cellules entières, il est mesuré l'activité ATPasique totale et
l'activité ouabaïne insensitive en présence d’une solution de 0,8 mM d'ouabaïne.
L'activité de la Na+, K+-ATPase est la différence entre ces 2 activités (ATPasique
totale – activité ouabaïne insensitive) [287, 288]. 10 μg de cellules sont reprises en
tampon Tris contenant des ions Na, K et Mg et 0.5mg/mg par protéine d'alaméthicine
pendant 10 minutes à température ambiante. Cet ionophore est utilisé pour assurer
l'accès aux substrats et aux inhibiteurs à chaque site des vésicules membranaires
présentant une orientation normale ou inversée. Après 10 minutes à 37°C, la réaction
enzymatique est amorcée par l'ajout d'une solution d'ATP-Mg pendant 10 minutes à
37°C. La réaction est stoppée par l'addition de 8% d'acide trichloracétique (TCA) froid
puis une mise en incubation des échantillons durant 10 minutes dans la glace. La
mesure du phosphate inorganique des échantillons s'effectue par l'ajout d'une solution
d'ammonium molybdate et le vert de malachite (BIOMOL GREEN™ (Biomol
International) qui se complexe avec le phosphate inorganique et permet sa coloration à
620nm. En parallèle, une gamme d'étalonnage est réalisée à l'aide d'une solution
standard de phosphate inorganique (BIOMOL GREEN™ (Biomol International).
Après 20 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière, l’absorbance à 620 nm
des échantillons et de la courbe d'étalonnage est mesurée.
95
V L’immunodétection
1
Extraction des protéines totales
Le milieu de culture est enlevé et les boîtes de culture lavées avec du tampon
"Phosphate buffered saline" (PBS). Les cellules sont mises en solution par
détachement (grattage) des cellules sur lit de glace dans une solution de RIPA (1%
Igelpal CA630, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM
Tris HCl,1 mM orthovanadate de sodium, 1 mM NaF et 2 mM d'inhibiteur de
protéinase). Le lysat cellulaire est placé dans la glace pendant 15 minutes et centrifugé
10 minutes à 16000 g. Le surnageant comprenant les protéines est conservé pour les
western-blots.
2
Western-Blot
Les échantillons sont incubés 30 minutes à température ambiante dans du tampon de
charge dénaturant à raison d'un volume de protéines pour 1,5 volumes de tampon. Les
protéines sont ainsi linéarisées par le SDS et le ȕ-mercaptoéthanol qui réduit les ponts
disulfures. Le mélange tampon de charge/protéines est ensuite déposé sur un gel de
polyacrylamide à raison de 15 à 100 μg de protéines par puits suivant les expériences.
Ce gel de polyacrylamide est composé de deux parties : un gel de concentration à 4%
d'acrylamide et d’un gel de séparation à 10% d'acrylamide. L’électrophorèse dure 1 h
30 à 0,03A (pour 1 gel). Les protéines migrent alors selon leur poids moléculaires.
Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose par
électrotransfert. Le transfert dure 4 heures à 90 V dans la glace. La membrane de
nitrocellulose est ensuite saturée dans du TBS-Tween contenant 5% de lait durant 1
heure à température ambiante afin d'éviter toute fixation non spécifique des anticorps.
La membrane est ensuite immergée dans une solution de TBS-T contenant 5% de lait
et l'anticorps primaire (Tableau 5). L’incubation dure une nuit à 4°C (sous agitation
douce). Après une série de lavage (3 x 5 minutes) dans du TBS-Tween, la
nitrocellulose est incubée avec une solution de TBS-Tween contenant 5% de lait et
l'anticorps secondaire anti-espèce conjugué à l’HRP (HorseRadish Peroxidase)
(Tableau 5) pendant 1 heure à température ambiante. L'anticorps secondaire fixe
l'anticorps primaire et permet la révélation des protéines par chimioluminescence. Les
96
deux réactifs SuperSignal® (Pierce©) sont mélangés. 3 mL du mélange sont déposés
sur la membrane. Ces substrats sont consommés par la peroxydase dans une réaction
luminescente, laquelle est détectée par impression d'un film autoradiographique.
Tableau 5 Spécificités et caractéristiques des anticorps utilisés lors des Western Blot
Anticorps
anti 6F
anti
HERED
anti GFP
anti NASE
anti actine
(C11)
anti ERK1
(K23)
P ERK
3
Protéine
reconnue
Į 1 de la pompe
Na+, K+-ATPase
(opossum et rat)
Į 2 de la pompe
Na+, K+-ATPase
GFP, YFP,
CFP…
Į1 de la pompe
Na+, K+-ATPase
(rat)
Actine
ERK 1
ERK phosporylé
Caractéristique
s
Fabricant
Anticorps
secondaire
monoclonal
de souris
Upstate©
anti souris
polyclonal
de lapin
monoclonal
de souris
Dr Pressley,
Université de Texas Tech
anti lapin
Abcam©
anti souris
polyclonal
de lapin
Dr Pressley,
Université de Texas Tech
anti lapin
Santa Cruz Biotechnology ®
anti chèvre
anti lapin
anti souris
polyclonal
de chèvre
polyclonal
de lapin
monoclonal
de souris
Immunofluorescence indirecte
L'immunofluorescence indirecte est une technique de marquage permettant de mettre
en évidence une ou plusieurs protéines (par simple ou double marquage) par
l'utilisation d'un fluorophore couplé à un anticorps secondaire. Les cellules sont
cultivées sur des lamelles de verre (22X22, Fisher). Après lavage au PBS, les cellules
sont fixées pendant 20 minutes à 4°C dans du méthanol froid (stocké à -20°C) puis
lavées au PBS et saturées pendant 30 minutes à température ambiante avec Image-IT
FX signal enhancer (Invitrogen). Ensuite les cellules sont incubées pendant 2 heures à
température ambiante avec l'anticorps primaire (Fisher) (dilué dans une solution de
PBS/BSA 1%/1%) puis lavées 3 fois au PBS avant d'être incubées pendant 2 heures à
37°C, avec l'anticorps secondaire (dilué dans une solution de PBS/BSA 1%/1%)
couplé à un fluorophore (Invitrogen). Après 3 lavages au PBS, les lamelles sont
montées avec du ProLong Gold antifade reagent with 4,6-diamidino-2-phenylindole
97
(DAPI – Invitrogen-). Enfin, les lamelles sont observées en microsopie confocale
(Leica TCS SP5).
VI Technique de biotynilation
1
Mesure des protéines membranaires
Cette technique est basée sur l'association biotine/streptavidine. Les cellules en
monocouches (70% de confluence) sont mises en présence d'une solution contenant
1,5mg/mL de Sulfo-NHS-SS-Biotine® (Pierce©) pendant 25 minutes à 4°C.
L'ensemble des protéines localisées à la surface cellulaire est alors marqué par la
biotine. Les esters NHS couplés à la biotine reconnaissent les Į- amines des protéines.
Après inactivation du groupe NHS couplé à la biotine et plusieurs lavages au PBS, les
protéines totales sont extraites dans un tampon de lyse. Une partie du lysat cellulaire
est incubé pendant une nuit à 4°C sous agitation en présence de streptavidine couplée
à des billes d’agarose. L’association biotine/streptavidine permet aux protéines
biotinylées d'être ensuite immuno-précipitées par plusieurs cycles de centrifugation et
de lavage. Les protéines biotinylées sont ensuite analysées par Western Blot.
2
Mesure des protéines endocytées
L'évaluation des protéines endocytées a été réalisée par une stratégie de "pulse-chase".
Les protéines localisées à la surface cellulaire sont marquées par la biotine comme
décrit précédemment. Après l'inactivation du groupe Sulfo-NHS couplé à la biotine et
plusieurs lavages au PBS, les cellules sont remises en culture pour 0 ou 4 heures. La
biotine subsistant à la surface membranaire est détachée par un l'agent réducteur tris
(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) (100mM dans 50mM Tris, Ph 7,4)
pendant 30 minutes à 4°C. Les protéines totales sont ensuite extraites dans un tampon
de lyse. Une partie du lysat cellulaire est incubée pendant une nuit à 4°C sous
agitation en présence de streptavidine couplée à des billes d’agarose. L’association
biotine/streptavidine permet aux protéines biotinylées d'être ensuite immunoprécipitées par plusieurs cycles de centrifugation et de lavage. Les protéines
biotinylées sont ensuite analysées par Western Blot.
98
VII
1
Mesure de viabilité cellulaire
Test de viabilité : coloration au bleu de trypan
a
Principe
Le bleu de trypan est un colorant présentant la propriété de pénétrer dans les cellules.
Ces dernières sont capables, grâce à un mécanisme nécessitant une source énergétique
(ATP), d'éjecter ce colorant vers le milieu extracellulaire. De ce fait, seules les cellules
vivantes pourront expulser cette molécule et rester incolores au microscope, au
contraire les cellules mortes n'auront pas les moyens de la rejeter (ne produisant plus
d'ATP) et resteront bleues. Cependant, cette molécule étant toxique, elle finit par tuer
les cellules qui deviennent alors toutes bleues.
b
Technique
Les cellules sont tout d'abord suspendues par trypsinisation (trypsine-EDTA,
SIGMA). L'effet de la trypsine est ensuite inhibé par rajout du milieu de culture
complet. Dans un tube, 100μL de suspension cellulaire sont mélangés à 500 μL de
bleu de trypan (0.4%) et 400μL de milieu de culture. Après 3 minutes à température
ambiante, 10 μL de cette suspension sont déposés sur cellule de Mallassez. Les
cellules vivantes et mortes sont ensuite comptabilisées.
99
2
Test de cytotoxicité cellulaire : mesure du relâchement de LDH
a Principe
La Lactate DésHydrogénase (LDH) est une enzyme exclusivement cytoplasmique et
relativement stable. L'augmentation de l'activité de cette enzyme dans le surnageant
des cellules permet de détecter une altération de la perméabilité membranaire.
Le dosage est fondé sur la production de NADH+, H+ par la lactate déshydrogénase en
transformant le lactate en pyruvate. Et l'utilisation de ce coenzyme par le catalyseur
(diaphorase) pour transformer le sel de tetrazolium (jaune) en sel de formazan (rouge)
(Figure 30). La quantité de sel de formazan produite lors de la réaction est mesurée
par spectrophotométrie à 490 nm. .
Figure 30 Réaction chimique intervenant lors du dosage de la lactate déshydrogénase (LDH)
b
Technique
La détermination de la présence de LDH dans le milieu collecté après
ischémie/reperfusion est réalisée par l'utilisation du kit (Cytotoxicity Detection Kit,
Roche Applied Science). Dans une plaque 96 puits, 100μL d'échantillon ou de la
gamme d'étalonnage sont mélangés à 100μL d'un mélange réactionnel comprenant le
catalyseur et le sel de tetrazolium. Après 20 minutes à température ambiante à l'abri de
la lumière, l’absorbance à 490 nm des échantillons et de la courbe d'étalonnage est
mesurée.
100
3
Mesure de la mort cellulaire : marquage Annexin V / Propidium Iodide
a
Principe
La mort cellulaire est caractérisée par deux processus la nécrose et l'apoptose. La
nécrose résultant d’un processus dégénératif est caractérisée notamment au niveau
cellulaire par une fragmentation de la chromatine nucléaire et un éclatement cellulaire.
L'apoptose ou mort cellulaire programmée est caractérisée par une cellule qui se
rétracte avec un retournement de la membrane cellulaire et l’exposition vers
l’extérieur de phosphatidylsérines intracellulaires (changement de polarité des
phospholipides membranaires, la condensation de la chromatine puis la fragmentation
du noyau et de la cellule aboutit à la formation de corps apoptotiques.
L’annexine V couplée à une sonde fluorescente, en présence de Ca2+, reconnaît
et fixe spécifiquement les phosphatidylsérines. L'iodure de propidium pénètre les
cellules perméables et se lie à l'ADN présent dans le noyau. Les cellules marquées
annexine V négatives - PI négatives sont considérées comme vivantes, celles annexine
V positives – PI négatives sont considérées comme étant en phase précoce d'apoptose,
celles annexine V négatives - PI positives en nécrose et celles annexine V positives PI positives sont considérées en apoptose tardive ou des cellules en "apoptose nécrose " et que le type de mort est impossible à distinguer.
b
Technique
Les cellules sont cultivées sur des lamelles de verre (22X22, Fisher). Après lavage au
PBS, les cellules sont fixées pendant 10 minutes à température ambiante dans du
paraformaldehyde 2%. Après lavage successif en PBS 1X et dans la solution de
fixation d'annexine (Invitrogen), 100μL de solution de fixation d'annexine contenant
5μL d'annexine V –fluorophore et 2μL d'iodure de propidium (100μg/mL) pendant 15
minutes à température ambiante. Après lavage en solution de fixation d'annexine, les
lamelles sont montées avec du ProLong Gold antifade reagent with 4,6-diamidino-2phenylindole (DAPI – Invitrogen-). Enfin, les lamelles sont observées en microsopie
confocale (Leica TCS SP5).
101
VIII
La microscopie à lumière transmise
Les images réalisées en lumière transmise ont été prises par un appareil
photographique numérique monté sur microscope inversé doté d'objectifs de 10, 20 et
40X.
IX La microscopie confocale
Grâce au microscope confocal, il est possible de réaliser des séries d'images de
très faible profondeur de champ (environ 400 nm) appelées "sections optiques". La
reconstitution, par des logiciels d'imagerie, de ces images permet une visualisation
tridimensionnelle de l'objet observé. Quand la source lumineuse est un laser, on parle
de microscopie confocale à balayage laser (CLSM pour Confocal Laser Scanning
Microscope). A la différence de la microscopie à fluorescence conventionnelle, la
microscopie confocale présente une très haute résolution spatiotemporelle. Cette
propriété est due à l'utilisation de filtres spatiaux appelés "pinholes" qui sont capables
d'éliminer les rayons lumineux émis en dehors du plan focal.
Pour cette étude, un microscope confocal inversé Leica TCS SP5 a été utilisé.
Ce dernier est doté d'un objectif à immersion 63X associé à une unité contrôlant les
lasers. Les fluorochromes verts sont excités par un laser argon (488 nm) alors que les
fluorochromes rouges le sont par un laser hélium-néon (546 nm) dont la lumière est
transmise à l'échantillon via une fibre optique et un miroir dichroïque. La fluorescence
émise est ensuite reçue au niveau du photodétecteur et les signaux sont traités par un
logiciel spécifique.
X Association des solutions Omégacoeur® et Dolupérine®
1
Choix des doses
Le DHA et la curcumine sont les principaux principes actifs respectivement des
composés Omégacoeur® et Dolupérine®. Les formules des composés étant
102
constantes, la détermination des doses pour l'association des deux produits est réalisée
en prenant comme référence les concentrations de DHA (Omégacoeur®) et de
curcumine (Dolupérine®). En se basant sur les publications concernant les principaux
composés et des précédents rapports d'efficacité sur l'association DHA/curcumine,
quatre doses croissantes de l'association ont été choisies pour cette étude
respectivement de 2,5 à 2500 μM de DHA dans Omégacoeur® associé à la Dolupérine
dans un respect d'un ratio DHA/curcumine de 2,5/1.
2
Préparation des solutions Omégacoeur® et Dolupérine®
Les acides gras provenant d'Omégacoeur® sont précomplexés en présence de sérum
d'albumine bovine ( BSA,fatty-acid free Bovine Serum Albumin, Fisher) pour un ratio
d'1mg d'acide gras libre pour 2,6 mg de BSA dans du DMEM pendant 18 h sous
agitation à température ambiante comme décrit par Pardridge [289]. La Dolupérine®
est préparée via une solution stock (100 mM de curcumine) dans 0,5M d'hydroxyde de
sodium. La plus forte titration de l'association DHA/curcumine (2,5/1 mM) est
préparée en mixant les deux solutions et contient 21 mg/mL de BSA ainsi qu'une trace
résiduelle d'hydroxyde de sodium (1%) qui n'induit aucun changement du pH dans le
milieu de culture. Les trois autres doses sont préparées par des dilutions successives
au 1/10 à partir de la solution 2,5mM DHA/1mM curcumine pour obtenir les solutions
2,5/1, 25/10 et 250/100 μM ratio de DHA/curcumine. Pour contrôler le potentiel effet
de la BSA, un contrôle sans Omégacoeur® et Dolupérine® a été préparé dans les
mêmes conditions.
XI Analyse statistiques des données
Les analyses statistiques ont été réalisées par le test t de Student bilatéral ou par le test
d'analyse de variances "two-way" ANOVA. Les valeurs exprimées représentent la
moyenne +/- SEM (écart standard à la moyenne). Toutes les données ont été analysées
à l'aide de l'outil statistique d'Excel®.
103
Résultats
104
Résultats
I Etude de la fonction de signalisation des isoformes de la Na+, K+ATPase
1
Article : Pierre SV, Sottejeau Y, Gourbeau JM, Sánchez G, Shidyak A,
Blanco G., Isoform specificity of Na-K-ATPase-mediated ouabain signaling.,
Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Apr;294(4):F859-66..
Cette étude a pour but de définir la fonction de signalisation de chaque
isoforme. Pour cela, les cellules d'insectes Sf9 qui contiennent une quantité
négligeable de Na+, K+-ATPase endogène ont été transfectées avec les couples
d’isoformes Į1/ȕ1, Į2/ȕ1, Į3/ȕ1, Į4/ȕ1 de rat. La fonction de signalisation a été
étudiée par détection de la phosphorylation de ERK1/2 après stimulation par
différentes doses d'ouabaïne.
Les résultats démontrent que les couples Į1/ȕ1, Į3/ȕ1, Į4/ȕ1 ont une fonction
de signalisation. Celle-ci est dépendante à la sensibilité des isoformes Į de rat pour
l'ouabaïne. L'isoforme Į2 ne présente aucune fonction de signalisation passant par
ERK1/2.
Cette étude démontre les régulations sélectives par la signalisation cellulaire
des différentes isoformes Į de la Na+, K+-ATPase. Comme cette étude a été réalisée
sur des cellules d'insectes, il est important de reproduire cette même étude sur des
cellules de mammifères pour être sûr que le fonctionnement soit le même. De même, il
serait intéressant de caractériser la signalisation des isoformes par Src qui est le
premier effecteur de la signalisation.
Yoann Sottejeau
105
Sandrine V. Pierre, Yoann Sottejeau, Jean-Michel Gourbeau, Gladis Sánchez,
Amjad Shidyak and Gustavo Blanco
Am J Physiol Renal Physiol 294:859-866, 2008. First published Dec 19, 2007;
doi:10.1152/ajprenal.00089.2007
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Endolymphatic Sodium Homeostasis by Extramacular Epithelium of the Saccule
S. H. Kim and D. C. Marcus
J. Neurosci., December 16, 2009; 29 (50): 15851-15858.
[Abstract] [Full Text] [PDF]
Glutamate Transporter Coupling to Na,K-ATPase
E. M. Rose, J. C. P. Koo, J. E. Antflick, S. M. Ahmed, S. Angers and D. R. Hampson
J. Neurosci., June 24, 2009; 29 (25): 8143-8155.
Regulation of ERK1/2 by ouabain and Na-K-ATPase-dependent energy utilization and
AMPK activation in parotid acinar cells
S. P. Soltoff and L. Hedden
Am J Physiol Cell Physiol, September 1, 2008; 295 (3): C590-C599.
Updated information and services including high-resolution figures, can be found at:
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Additional material and information about AJP - Renal Physiology can be found at:
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This information is current as of August 11, 2010 .
AJP - Renal Physiology publishes original manuscripts on a broad range of subjects relating to the kidney, urinary tract, and their
respective cells and vasculature, as well as to the control of body fluid volume and composition. It is published 12 times a year
(monthly) by the American Physiological Society, 9650 Rockville Pike, Bethesda MD 20814-3991. Copyright © 2008 by the
American Physiological Society. ISSN: 0363-6127, ESSN: 1522-1466. Visit our website at http://www.the-aps.org/.
Downloaded from ajprenal.physiology.org on August 11, 2010
Endogenous Cardiotonic Steroids: Physiology, Pharmacology, and Novel Therapeutic
Targets
A. Y. Bagrov, J. I. Shapiro and O. V. Fedorova
Pharmacol. Rev., March 1, 2009; 61 (1): 9-38.
Am J Physiol Renal Physiol 294: F859–F866, 2008.
First published December 19, 2007; doi:10.1152/ajprenal.00089.2007.
Isoform specificity of Na-K-ATPase-mediated ouabain signaling
Sandrine V. Pierre,1 Yoann Sottejeau,1 Jean-Michel Gourbeau,1 Gladis Sánchez,2 Amjad Shidyak,1
and Gustavo Blanco2
1
Department of Physiology and Pharmacology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio; and 2Department
of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas
Submitted 20 February 2007; accepted in final form 12 December 2007
␣-isoforms; Sf-9; genistein; ERK
THE ENERGY-TRANSDUCING ION
pump Na-K-ATPase is an enzyme
classically known for its critical role in maintaining the Na⫹
and K⫹ gradients across the plasma membrane of most eukaryotic cells (27). The Na-K-ATPase is the receptor for cardiotonic steroids, a group of compounds that includes the
glycoside ouabain (26). Ouabain binding to the Na-K-ATPase
inhibits the catalytic and transport activity of the enzyme (14).
In most cell types, ouabain-Na-K-ATPase binding also elicits a
cascade of cellular events that include the interaction of the
enzyme at the plasma membrane with neighboring proteins and
the activation of the tyrosine kinase Src. This initial response
subsequently causes the recruitment and phosphorylation of a
series of proteins such as the extracellular regulated kinase
ERK (22, 30). The process ultimately stimulates transcription
and translation of a series of genes that are involved in
regulation of cell proliferation and promotes changes in cell
migration and metabolism (1, 11, 30).
Address for reprint requests and other correspondence: S. V. Pierre,
Dept. of Physiology and Pharmacology, Univ. of Toledo College of Medicine, 3035 Arlington Ave., Toledo, OH 43614-5804 (e-mail: sandrine.pierre
@utoledo.edu).
http://www.ajprenal.org
Structurally, the Na-K-ATPase consists of two major polypeptides, the ␣- and ␤-subunits (14). The ␣-polypeptide is the
catalytic subunit that contains the binding sites for Na⫹, K⫹,
ATP, and cardiotonic steroids (14). Different ␣-subunits (␣1,
␣2, ␣3, and ␣4) have been identified in mammalian cells (3,
19). The ␣1-isoform is expressed in almost every cell, while
the other ␣-polypeptides exhibit a tissue-specific pattern of
expression (3). In addition, Na-K-ATPase isozymes composed
of different ␣-isoforms have unique kinetic properties and a
distinctive response to second messengers (3, 9, 23). The
characteristic expression, activity, and regulation of the Na-KATPase isoforms suggest that the molecular heterogeneity of
the Na-K-ATPase catalytic subunit is of physiological relevance. Importantly, evidence for the biological role of the
␣-isoforms is supported by studies in transgenic animals and
through the identification of mutations of the transporter in
humans (12, 17, 21, 28, 29, 32, 33).
One of the most conspicuous functional differences among
␣-isoforms of the Na-K-ATPase in the rat is their reactivity to
ouabain, with ␣1 having a much lower ouabain sensitivity than
␣2, ␣3, and ␣4 (3). This particular functional property appears
to be physiologically important in regulating Na-K-ATPase
activity in an isoform-specific manner (3, 12). In support of the
biological importance of a modulatory action for ouabain, the
cardiotonic steroid has been found to exist as an endogenous
substance that circulates in plasma of humans and other mammals (10, 25). In addition to regulating enzymatic and transport
activities, the differences in affinity of Na-K-ATPase isoforms
for ouabain may translate into differences in the ability of each
␣-polypeptide to relay ouabain-binding signals into the cell. At
present, there is experimental evidence that the signaling function of the Na-K-ATPase is mediated by the ␣1 polypeptide
(22, 30). However, the role of other ␣-isoforms as transducers
of the ouabain message is unknown. Studying the effect of
ouabain on the Na-K-ATPase isoforms is a difficult task. A
major obstacle is that the various ␣-polypeptides are coexpressed in cells in different combinations, and with the ubiquitous ␣1-polypeptide (3, 19). This problem can be circumvented by using heterologous expression systems. In the past,
we have successfully used the baculovirus expression system
to study different aspects of the enzymatic and regulatory
properties of the Na-K-ATPase isoforms in insect cells (4).
Sf-9 insect cells provide several advantages for the study of the
Na-K-ATPase, including the production of high amounts of the
␣- and ␤-subunits and the proper delivery of catalytically
competent Na-K-ATPase isozymes to the plasma membrane
(4). Importantly, Sf-9 cells contain negligible levels of endogThe costs of publication of this article were defrayed in part by the payment
of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement”
in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
0363-6127/08 $8.00 Copyright © 2008 the American Physiological Society
F859
Pierre SV, Sottejeau Y, Gourbeau J-M, Sánchez G, Shidyak A,
Blanco G. Isoform specificity of Na-K-ATPase-mediated ouabain
signaling. Am J Physiol Renal Physiol 294: F859–F866, 2008. First
published December 19, 2007; doi:10.1152/ajprenal.00089.2007.—
The ion transporter Na-K-ATPase functions as a cell signal transducer
that mediates ouabain-induced activation of protein kinases, such as
ERK. While Na-K-ATPase composed of the ␣1-polypeptide is involved in cell signaling, the role of other ␣-isoforms (␣2, ␣3, and ␣4)
in transmitting ouabain effects is unknown. We have explored this
using baculovirus-directed expression of Na-K-ATPase polypeptides
in insect cells and ERK phosphorylation as an indicator of ouabaininduced signaling. Ouabain addition to Sf-9 cells coexpressing Na-KATPase ␣1- and ␤1-isoforms stimulated ERK phosphorylation. In
contrast, expression of the ␣1- and ␤1-polypeptides alone resulted in
no effect, indicating that the ␣␤-complex is necessary for Na-KATPase signaling. Moreover, the ouabain effect was sensitive to
genistein, suggesting that Na-K-ATPase-mediated tyrosine kinase
activation is a critical event in the intracellular cascade leading to
ERK phosphorylation. In addition, the Na-K-ATPases ␣3␤1- and
␣4␤1-isozymes, but not ␣2␤1, responded to ouabain treatment. In
agreement with the differences in ouabain affinity of the ␣-polypeptides, ␣1␤1 required 100- to 1,000-fold more ouabain to signal than
did ␣4␤1 and ␣3␤1, respectively. These results confirm the role of the
Na-K-ATPase in ouabain signal transduction, show that there are
important isoform-specific differences in Na-K-ATPase signaling, and
demonstrate the suitability of the baculovirus expression system for
studying Na-K-ATPase-mediated ouabain effects.
F860
Na-K-ATPase ISOFORMS AND OUABAIN SIGNALING
enous Na-K-ATPase, which permits analysis of the baculovirus-produced isoforms in the absence of high background
levels of the transporter (4). Finally, and most significantly, the
baculovirus expression system preserves the natural intrinsic
ouabain binding capabilities of the different ␣-polypeptides
expressed (4). In this work, we have used the baculovirus
expression system to explore the ouabain-dependent signaling
function of Na-K-ATPase isozymes composed of the different
␣-isoforms. We show that 1) Na-K-ATPase-mediated ouabain
signaling takes place through a tyrosine kinase-dependent pathway that leads to the activation of ERK in Sf-9 cells; 2) both
the ␣- and ␤-subunits of the Na-K-ATPase are required for
ouabain signaling by the transporter; 3) the ␣1, ␣3, and ␣4
isoforms, but not ␣2 can transmit ouabain-induced phosphorylation of ERK in the cells; and 4) Na-K-ATPase isoformmediated signaling is a ouabain dose-dependent process determined by the particular affinity of each ␣-polypeptide for the
cardiotonic steroid.
Cell maintenance, baculovirus construction. and viral infections.
Sf-9 cells were grown at 27°C in Grace’s medium (JRH Biosciences,
Lenexa, KS) with 3.3 g/l lactalbumin hydrolysate, 3.3 g/l yeastolate,
and supplemented with 10% (vol/vol) fetal bovine serum, 100 U/ml
penicillin, 100 ␮g/ml streptomycin, and 0.25 ␮g/ml fungizone (complete medium), as described elsewhere (8). Baculovirus preparation
and selection were performed according to the procedures recommended by the supplier (Invitrogen, Carlsbad, CA), as described
previously (8). Viral infections were performed in 60-mm petri dishes
using a multiplicity of infection of ⬃5.
Ouabain treatment and processing of cells. Following infection,
cells were incubated for 48 h at 27°C, after which complete culture
media was changed to serum-free media. After an additional 24-h
incubation period, cells were treated with or without different concentrations of ouabain and/or genistein for 15 min unless otherwise
stated. Cell treatment was finished by rapidly aspirating the medium
and washing the cells once with 5 ml ice-cold PBS. Then, cells were
lysed in 1 ml of ice-cold lysis buffer, containing 1% Nonidet P-40,
0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 ␮g/ml aprotinin, 10 ␮g/ml leupeptin, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM NaF, and 50 mM Tris 䡠 HCl
(pH 7.4). Cell lysates were placed on ice for 15 min and centrifuged
at 16,000 g for 10 min. The pellets were discarded, and the cleared
supernatants were used for immunoblot analysis.
PAGE and immunoblot analysis. Expression of the ␣- and ␤-isoforms of the Na-K-ATPase was analyzed by SDS-PAGE (7.5% gel)
and immunoblotting. Protein concentration of the cell supernatant was
determined using the dye-binding assay based on the method of
Bradford from Bio-Rad (Hercules, CA). Samples containing 20 ␮g of
total protein/lane were then separated by SDS-PAGE, transferred onto
nitrocellulose membranes (Nitrobind, Osmonics, Minnetonka, MN),
and immunoblotted, as described previously (7). Primary antibodies
specific for each of the rat Na-K-ATPase isoforms were used to
identify the corresponding polypeptides. For ␣1, a 1:100 dilution of
anti-␣1-synthetic peptide was used (8). The ␣2-isoform was identified
with MCB2 at a 1:300 dilution (2). For ␣3, anti-␣3-synthetic peptide
at 1:200 was used (8). The ␣4-polypeptide was detected with 1:100 of
the anti-␣4-polyclonal antisera (7). The ␤1-polypeptide was identified
with poly-␣A-antiserum at 1:100 (8). Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse (1:2,000) and goat anti-rabbit (1:500) secondary antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz. CA) and
chemiluminescence were used for detection.
Immunoblotting was also used to determine activation of ERK. For
this, 60 ␮g total protein/lane was separated by SDS-PAGE and
AJP-Renal Physiol • VOL
RESULTS
ERK is expressed and phosphorylated in Sf-9 cells. Despite
their extensive use as an expression system, the cell biology of
Sf-9 cells is still not completely understood. Therefore, initially, we had to establish whether Na-K-ATPase-ouabain
signaling could be reconstituted in the cells. ERK is a key
kinase in the ouabain-dependent signaling cascade, and its
activation is commonly used as an indicator of the intracellular
effect of the cardiotonic steroid in mammalian cells (22, 31).
Accordingly, to validate the baculovirus expression system as
a tool to study Na-K-ATPase isoform signaling, our first goal
was to determine the endogenous levels and phosphorylation
status of ERK in Sf-9 insect cells. The total and phosphorylated
forms of ERK were explored in uninfected Sf-9 cells grown
under standard culture conditions by immunoblotting, using
antibodies that specifically recognize the nonphosphorylated or
the activated forms of the protein. As a control, we used rat
neonatal cardiomyocyte lysates, where ERK has been extensively characterized (15, 20). As shown in Fig. 1A, ERK is
expressed and undergoes phosphorylation in Sf-9 cells. However, the pattern of ERK expression differs between insect cells
and rat neonatal cardiomyocytes. While the cardiac cells show
the typical bands of ERK, at 42 and 44 kDa, corresponding to
ERK1 and ERK2, respectively, Sf-9 cells exhibited a single
band, consistent with the total and phosphorylated form of
ERK that migrates at 42 kDa. These results suggest that only
ERK1 is present in Sf-9 cells. However, the identity of the
form of ERK found in the insect cells cannot be unequivocally
concluded from the electrophoretic mobility pattern of the
proteins. Electrophoretic migration is influenced by protein
posttranscriptional modifications, and it is possible that posttranslational changes in ERK may differ in insect and mammalian cells, thus affecting the mobility, and precluding identification of the particular ERK isoforms. In any case, these
results clearly show that ERK is present in insect cells and that
the kinase exists in a phosphorylated state under basal tissue
culture conditions of the cells.
294 • APRIL 2008 •
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MATERIALS AND METHODS
transferred to nitrocellulose. The monoclonal anti-phospho-ERK (1:
500) and polyclonal anti-ERK (1:2,000) antibodies were used to
identify the phosphorylated and total forms of ERK, respectively.
Immunoblots were first probed with anti-phospho-ERK, then stripped
and reprobed with anti-total ERK to control for equal protein loading
in the gels, as we have previously reported (13). Horseradish peroxidase and chemiluminescence were used for detection. The intensity
of ERK signals was determined using an Imaging Densitometer
(GS-670, Bio-Rad). The levels of phosphorylated ERK (p-ERK) were
expressed as the ratio between the phosphorylated and nonphosphorylated forms of the protein and were normalized against the corresponding controls. Also, immunoblots were used to explore the
presence of the phosphorylated and total forms of c-Src and caveolin-1. Anti-c-Src and anti-caveolin-1 antibodies were purchased from
Santa Cruz Biotechnology, anti phospho c-Src was obtained from
Invitrogen, and anti-phospho caveolin-1 was acquired from BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA).
Statistical analysis. Statistical significance of the differences in of
ERK phosphorylation between ouabain-treated and untreated groups
was performed using one-way ANOVA, followed by Dunnett’s multiple comparison post hoc test. Statistical significance was defined as
P ⬍ 0.05.
F861
Tyrosine kinase activation is critical for ouabain-induced
ERK phosphorylation in Sf-9 cells. We next investigated
whether ouabain, acting through the Na-K-ATPase, could induce ERK phosphorylation in insect cells. For this, Sf-9 cells
expressing the rat Na-K-ATPase ␣1- and ␤1-isoforms were
exposed to ouabain and the relative levels of ERK1 phosphorylation were determined by immunoblotting. As a first approach, we used a relatively high concentration of ouabain (1
mM) and an incubation time with the cardiotonic steroid of 15
min, which are parameters known to produce maximal ERK
phosphorylation in mammalian cells (15). As shown in Fig. 1B,
compared with the untreated controls, ouabain caused an ⬃2.5fold increase in ERK1 phosphorylation. This suggests that
ouabain signaling via the Na-K-ATPase can be obtained in
Sf-9 cells.
Other proteins that become phosphorylated on ouabain stimulation in myocardial cells are Src and caveolin 1. To determine whether these polypeptides are also involved in Na-KATPase signaling in Sf-9 cells, we studied the expression of
the total and phosphorylated forms of Src and caveolin 1 in the
cells. While we could identify expression of the nonphosphorylated forms of these polypeptides, we were unable to detect
the activated Src and caveolin 1 neither in the untreated cells
nor in the cells incubated with ouabain (data not shown). This
indicated that, in the insect cells, and with the antibodies
available, Src and caveolin 1 could not be used as indicators of
ouabain-induced Na-K-ATPase-mediated signaling.
In mammalian cells, the Na-K-ATPase-ouabain effect requires the activity of tyrosine kinases (30). Because genistein
has been previously used to efficiently inhibit tyrosine kinase
activity in insect cells (24), we used the inhibitor to test
whether these kinases are involved in the ouabain-induced
phosphorylation of ERK1 mediated by the Na-K-ATPase
␣1␤1-isozyme. Figure 1B shows that, as has been observed in
mammalian cells (13, 16), addition of 100 ␮M genistein 30
min before treatment with ouabain completely abolished ouabaininduced ERK1 phosphorylation. Altogether, these results suggest
that ouabain-Na-K-ATPase signaling can be reconstituted in
Sf-9 cells and that the process involves intracellular messengers, such as tyrosine kinases and ERK, which are components
of the ouabain-Na-K-ATPase signaling pathway in mammalian
cells.
Time course of ouabain-induced ERK phosphorylation in
Sf-9 cells. The ouabain-mediated and Na-K-ATPase-dependent
increase in ERK phosphorylation in Sf-9 cells occurred relatively quickly and could be observed after 15 min of treatment
of the cells with ouabain. However, the time-dependent kinetics of ouabain-induced p-ERK formation in Sf-9 cells was
unknown. To determine this, we treated insect cells expressing
the Na-K-ATPase ␣1␤1-isozyme with two different concentrations of ouabain, 10 ␮M or 1 mM, and measured the relative
amounts of ERK1 phosphorylation by immunoblotting at various time points after exposure to the cardiotonic steroid. As
shown in Fig. 1C, ouabain induced p-ERK formation in the
cells in a time-dependent manner, with the kinase achieving
maximal phosphorylated values 15 min after treatment with
ouabain. Although both concentrations of ouabain produced
similar temporal patterns of ERK activation, the values of
p-ERK obtained with 1 mM ouabain were higher, suggesting
that signaling of the Na-K-ATPase ␣1␤1-isozyme is also de-
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Fig. 1. ERK phosphorylation in insect cells. A: characterization of ERK in Sf-9 cells. Proteins from uninfected Sf-9 cells were separated by SDS-PAGE,
immunoblotted, and probed with a monoclonal antibody specific for the phosphorylated forms of ERK1 and -2 (top). After stripping, blots were reprobed with
a polyclonal antibody specific for total ERK1 and -2. Horseradish peroxidase and chemiluminescence were used for detection. Rat neonatal cardiac myocytes
(NCM) were included as a control. B: ouabain-induced and Na-K-ATPase-mediated ERK phosphorylation in Sf-9 cells involves tyrosine kinases. Sf-9 cells
expressing rat Na-K-ATPase-␣1␤1 were treated in the absence (C) and presence of 1 mM ouabain (OUA) for 15 min, with or without pretreatment for 30 min
with 100 ␮M genistein, a protein tyrosine kinase inhibitor. Phospho- ERK/total ERK ratios were normalized against the corresponding nontreated controls. A
representative blot is shown, while bars are means ⫾ SE of 3 independent experiments. C: time course of ouabain-induced ERK phosphorylation in insect cells.
Sf-9 cells expressing rat Na-K-ATPase ␣1␤1 were treated with either 10 ␮M or 1 mM ouabain for the indicated times and assayed for ERK phosphorylation as
described above. Phospho-ERK/total ERK ratios for each time point were normalized against the corresponding value at time 0. Values are means ⫾ SE of 3
independent experiments.
F862
experiments confirm that the baculovirus expression system
represents a useful tool for studying Na-K-ATPase signaling,
and, most importantly, they show that expression of the NaK-ATPase ␣␤-holoenzyme is an absolute requirement for
ouabain-induced ERK phosphorylation. This confirms that the
Na-K-ATPase is the signal transducer that mediates ouabain
effects in the cell.
Ouabain-induced ERK phosphorylation specificity of the
Na-K-ATPase ␣-isoforms. To determine whether Na-K-ATPases
containing isoforms different from ␣1 could also signal, we
explored the effect of increasing concentrations of ouabain on
ERK phosphorylation in Sf-9 cells expressing the Na-K-ATPase ␣2-, ␣3- or ␣4-isoforms in combination with the ␤1subunit. The results are shown in Figs. 3, 4, and 5. While Figs.
3A, 4A, and 5A show expression of the corresponding Na-KATPase isoforms, Figs. 3B, 4B, and 5B present the amounts of
total and phosphorylated forms of ERK. The first striking
observation was that the ␣2-isoform was not able to elicit the
ouabain-dependent activation of ERK in the cells regardless of
the amount of ouabain added to the media (Fig. 3B). In this
manner, cells expressing ␣2␤1 showed comparable levels of
p-ERK at all concentrations of ouabain (Fig. 3B). The absence
of signaling by the ␣2-isoform was not dependent on the
inability of the cells to produce functionally competent molecules of Na-K-ATPase-␣2␤1. We measured the ouabain-sensitive hydrolysis of ATP in the cells and determined that the
expressed ␣2␤1-enzyme complex had an average maximal
activity (Vmax) of 0.9 ⫾ 0.07 ␮mol Pi 䡠 mg⫺1 䡠 h⫺1, a value that
is similar to that previously reported for the baculovirusgenerated isozyme (6). Therefore, it appears that, although in
the insect cells the Na-K-ATPase ␣2-isoform is enzymatically
active, it does not function as a signal transduction molecule. In
contrast to ␣2, when Na-K-ATPase composed of the ␣3- and
␣4-isoforms were expressed at constant levels (Figs. 4A and
5A), ouabain-induced ERK phosphorylation was observed in
the cells. Signaling by these Na-K-ATPases was dose depen-
Fig. 2. Expression of a Na-K-ATPase ␣1␤1 complex is required for ouabain-induced ERK phosphorylation. Sf-9 cells expressing the ␣1 (A)- and the ␤1
(B)-subunits of the Na-K-ATPase alone, or the ␣1- and ␤1 polypeptides together (C) were treated with the indicated concentrations of ouabain for 15 min, and
ERK phosphorylation levels were determined. Representative blots are shown for expression of the corresponding Na-K-ATPase subunits and total and
phospho-ERK. The bar graph summarizes data from 3–7 determinations depending on ouabain doses, with bars representing means ⫾ SE. *Statistically different
values compared with the control at zero ouabain (P ⬍ 0.05).
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pendent on the ouabain dose. These results demonstrated the
time-dependence of ouabain-Na-K-ATPase signaling in Sf-9
cells and established 15 min as the optimal time to assess
ouabain signaling in the cells for all subsequent experiments.
Na-K-ATPase expression is required for ouabain signaling
effect. Different experimental approaches have shown that the
Na-K-ATPase is the receptor that binds and mediates the
effects of cardiotonic steroids in the cell (1, 22, 30). Most
recent studies, involving transgenic mice in which ouabain
affinity of Na-K-ATPase isoforms was modified, support the
physiological relevance of the ouabain binding site in the enzyme and the importance of interaction of ouabain with the
transporter (12). Here, we have used the baculovirus expression system to confirm whether the Na-K-ATPase is the receptor and signal transducer for ouabain and to determine which
subunits of the transporter are required for mediating signal
transduction events. Because Sf-9 cells practically lack endogenous Na-K-ATPase, we were able to directly evaluate this
issue in the insect cells. Thus we compared the effect of
ouabain on ERK phosphorylation in Sf-9 cells expressing the
whole Na-K-ATPase ␣␤-complex or the individual ␣- and
␤-subunits of the enzyme. For this, Sf-9 cells were infected
with viruses directing expression of the Na-K-ATPase ␣1- and
␤1-subunits, together or separately. Cells were then treated with
increasing concentrations of ouabain, and ERK phosphorylation was measured. As shown in Fig. 2A, cells expressing the
Na-K-ATPase ␣1-subunit alone exhibited the normal basal
levels of ERK phosphorylation, which were not affected by
addition of ouabain. Similarly, the Na-K-ATPase ␤-polypeptide was unable to transmit ouabain effects in the insect cells
(Fig. 2B). In contrast, coexpression of the ␣1- and ␤1-polypeptides in Sf-9 cells showed the expected ouabain-dependent
phosphorylation of ERK (Fig. 2C). p-ERK levels in cells
expressing the ␣1␤1-isozyme varied depending on the ouabain
dose, with the highest response obtained with ouabain concentrations of 100 and 1,000 ␮M (Fig. 2C). Altogether, these
F863
DISCUSSION
Fig. 3. Na-K-ATPase ␣2␤1 complex is not able to signal ouabain effect in
insect cells. A: expression of the ␣2- and ␤1-subunits was confirmed in the
insect cells by immunoblotting using antibodies specific to the corresponding
Na-K-ATPase polypeptides. B: levels of total and phosphorylated (p) ERK
were determined in cells expressing ␣2␤1 as explained in MATERIALS AND
METHODS after treatment without and with the indicated concentrations of
ouabain for 15 min. A representative blot for total and p-ERK is shown, while
the bar graph represents data from 3–7 determinations depending on ouabain
doses, with bars representing means ⫾ SE.
dent, and the peak of ouabain effect was detected at 0.1 ␮M for
␣3 and 0.1–1 ␮M for ␣4 (Figs. 4B and 5B, respectively).
Although low concentrations of ouabain are able to trigger
signaling through both the ␣3- and ␣4-isoforms, comparison of
the dose-response curves for ERK activation suggests that
those isoforms respond to the cardiotonic steroid with different
kinetics. Thus, while signaling through ␣4 remains relatively
high on addition of increasing doses of ouabain (Fig. 5B),
signaling via ␣3 is reduced at higher concentrations of the
cardiotonic steroid (Fig. 4B). In fact, as shown in Fig. 4B, in
the cells expressing ␣3 and treated with 100 and 1,000 ␮M
ouabain, the levels of p-ERK are not significantly different
from those of untreated cells.
To better compare the signaling ability of Na-K-ATPases
composed of different ␣-isoforms, the ouabain-dependent ERK
phosphorylation values for ␣1␤1, ␣2␤1, ␣3␤1, and ␣4␤1, obtained from Figs. 2B, 3B, 4B, and 5B were compiled and
plotted. As shown in Fig. 6, Na-K-ATPase signaling exhibits a
distinct profile depending on the ␣-isoform considered. Altogether, these results indicate that the ␣2-isoform is the only
catalytic subunit of the Na-K-ATPase that is not capable of
transducing the ouabain effect in the Sf-9 model. In addition,
and in agreement with the differences in affinity of the isoforms for ouabain, ␣1 requires significantly higher concentrations of the cardiotonic steroid than ␣3 and ␣4.
Fig. 4. Expression of ␣3␤1 in Sf9 cells mediates ouabain-induced ERK
phosphorylation. A: expression of the ␣3- and ␤1-subunits in the insect cells as
confirmed by immunoblot using antibodies specific to the corresponding
Na-K-ATPase polypeptides. B: levels of total and p-ERK were determined in
cells expressing ␣3␤1 as explained in MATERIALS AND METHODS after treatment
without and with the indicated concentrations of ouabain for 15 min. A
representative gel is shown, and the bars represent means ⫾ SE of 3–5
determinations depending on ouabain doses. Asterisks indicate statistically
different values compared with the control at zero ouabain (P ⬍ 0.05).
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Molecular heterogeneity of the Na-K-ATPase is important in
adjusting the Na⫹ and K⫹ gradients to the specific needs of
each cell (3). In the present work, we have explored whether
Na-K-ATPase ␣-isoform diversity also plays a role in the
ability of the enzyme to relay ouabain-induced signaling in the
cell. Using heterologous expression in insect cells and ERK
phosphorylation as an indicator of ouabain-activated signaling,
we confirmed that the Na-K-ATPase is the receptor that mediates ouabain-triggered signaling cascades in the cells. Importantly, the Na-K-ATPase holoenzyme complex is necessary for
signaling, and the ␣- or ␤-subunits alone cannot mediate
ouabain effects in the cells. The inability of the ␤-subunit to
signal agrees with the notion that the ␤-polypeptide is not
directly involved in ouabain binding (14). The lack of reactivity of the ␣-subunit to ouabain stimulation when it is expressed
alone may also depend on the incapacity of the polypeptide to
bind ouabain. It is known that to acquire its normal protein
conformation, the ␣-subunit requires the presence of the ␤-subunit (5, 18). Moreover, in the absence of the ␤-subunit, the
␣-polypeptide exhibits properties that are different from those
of the Na-K-ATPase catalytic subunit; most noticeably, the
isolated ␣-polypeptide shows insensitivity to ouabain (5). Thus
F864
it appears that the stabilization of the ␣-protein conformation
by the ␤-polypeptide is necessary for the ouabain-signaling
function of the Na-K-ATPase. This requirement of the Na-KATPase holoenzyme for signaling confirms previous observations and agrees with the notion that the transporter is the
natural receptor for the cardiotonic steroids (10, 26, 30).
Our results also demonstrate that the baculovirus-directed
expression of Na-K-ATPase in insect cells is a useful system
for studying the signaling function of the enzyme. We have
found that ouabain signaling in Sf-9 cells takes place via
activation of tyrosine kinases and the phosphorylation of ERK,
a key component of the Na-K-ATPase-ouabain cascade in
mammalian cells (30). In contrast, we were unable to identify
activation of some other messengers described in the ouabainsignaling pathway in mammalian cells, such as the phosphorylated forms of Src and caveolin 1. This observation could be
attributed to a lack of cross-reactivity of the anti-phospho Src
and caveolin 1 antibodies for mammalian and insect cells, or it
may just reflect the absence of ouabain-induced Src and caveolin 1 phosphorylation in the Sf-9 cells. Clearly, a complete
understanding of the intracellular pathways responsible for
ouabain-mediated ERK activation in insect cells will require
further studies. Importantly, our findings of a ouabain-depenAJP-Renal Physiol • VOL
Fig. 6. Summary of ouabain-dependent ERK phosphorylation mediated by
different Na-K-ATPase ␣-isoforms in Sf9 cells. Relative values of ouabaindependent p-ERK levels in insect cells expressing the various Na-K-ATPase
␣-isoforms obtained from the data in Figs. 2–5 were plotted for comparison of
the signaling properties of Na-K-ATPases composed of different ␣-isoforms.
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Fig. 5. Expression of ␣4␤1 in Sf9 cells mediates ouabain-induced ERK
phosphorylation. A: expression of the ␣4- and ␤1-subunits in the insect cells as
confirmed by immunoblot using antibodies specific to the corresponding
Na-K-ATPase polypeptides. B: levels of total and p-ERK were determined in
cells expressing ␣4␤1 as explained in MATERIALS AND METHODS after treatment
without and with the indicated concentrations of ouabain for 15 min. A
representative gel is shown, and the bars represent means ⫾ SE of 4 – 6
determinations depending on ouabain doses. *Significantly different from
untreated controls (P ⬍ 0.05).
dent and genistein-sensitive phosphorylation of ERK in Sf-9
cells expressing Na-K-ATPase molecules suggest that the baculovirus expression system represents a valuable system for
studying not only the enzymatic properties (4), but also the
signaling role of the various isoforms of the transporter.
Interestingly, not all Na-K-ATPase ␣-isoforms are able to
signal, and ␣2 is the only catalytic subunit of the enzyme that
does not support ouabain-induced ERK activation in the insect
cells. Our results show that the ␣2-isoform expressed in Sf-9
cells is catalytically competent and has the ability to hydrolyze
ATP in a ouabain-sensitive manner. This suggests that the lack
of signaling by ␣2 is not due to gross alterations in the structure
of the expressed isoform but rather to the intrinsic differences
in the ability of the ␣2-polypeptide to function as a signal
transduction molecule. Therefore, expression of a high-affinity
receptor for ouabain, such as the ␣2-isoform, is not an exclusive factor for ouabain signaling in the cell, and other structural
determinants within the ␣-polypeptide may be important for
the signal transduction function of the Na-K-ATPase. However, there are alternative explanations for the inability of ␣2 to
signal. Thus the ␤-subunit may influence the signaling ability
of the Na-K-ATPase complex, and while ␣2 is unable to
transmit the ouabain effect when coexpressed with ␤1, it may
acquire this ability when associated with one of the other
␤-isoforms. Also, it is conceivable that ␣2 may signal through
a different intracellular pathway that does not involve activation of ERK. It is possible that signaling by ␣2 may require
second messengers that are present in mammalian cells but not
in Sf-9 cells. Further investigation will be needed in this area
to better understand the molecular basis of the peculiar behavior of ␣2 in ouabain signaling. In any case, it is clear that
among other characteristics, the Na-K-ATPase isoforms can be
distinguished by their different ouabain-dependent signaling
properties.
For those Na-K-ATPase ␣-isoforms that do signal a ouabain
effect in Sf-9 cells, a dose-dependent response to ouabain was
found. According to the intrinsic ability of the isoforms to bind
ouabain, the ␣1- polypeptide required 100- to 1,000-fold more
ouabain to signal than did ␣4 and ␣3. Therefore, the affinity of
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Kathleen Sweadner for providing the anti-␣2-Na-K-ATPase
antibody, Dr. Zi-Jian Xie for helpful discussion and input throughout the study,
and Dr. Eric E. Morgan for kind help with the manuscript.
GRANTS
This work was supported by National Institutes of Health Grants HL-36573,
HD-043044, HD-055763, and RR-19799. Y. Sottejeau and J.-M. Gourbeau
were fellows from the Institut Universitaire Professionnel (IUP) “Genie Physiologique et Informatique,” Poitiers, France.
REFERENCES
1. Aperia A. New roles for an old enzyme: Na,K-ATPase emerges as an
interesting drug target. J Intern Med 261: 44 –52, 2007.
2. Arystarkhova E, Sweadner KJ. Isoform-specific monoclonal antibodies
to Na,K-ATPase alpha subunits. Evidence for a tissue-specific posttranslational modification of the alpha subunit. J Biol Chem 271: 23407–
23417, 1996.
3. Blanco G. Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for
tissue-specific ion regulation. Semin Nephrol 25: 292–303, 2005.
4. Blanco G. The NA/K-ATPase and its isozymes: what we have learned
using the baculovirus expression system. Front Biosci 10: 2397–2411,
2005.
5. Blanco G, DeTomaso AW, Koster J, Xie ZJ, Mercer RW. The alphasubunit of the Na,K-ATPase has catalytic activity independent of the
beta-subunit. J Biol Chem 269: 23420 –23425, 1994.
6. Blanco G, Koster JC, Sanchez G, Mercer RW. Kinetic properties of the
alpha 2 beta 1 and alpha 2 beta 2 isozymes of the Na,K-ATPase.
Biochemistry 34: 319 –325, 1995.
7. Blanco G, Melton RJ, Sanchez G, Mercer RW. Functional characterization of a testes-specific alpha-subunit isoform of the sodium/potassium
adenosinetriphosphatase. Biochemistry 38: 13661–13669, 1999.
8. Blanco G, Sanchez G, Mercer RW. Comparison of the enzymatic
properties of the Na,K-ATPase alpha 3 beta 1 and alpha 3 beta 2 isozymes.
Biochemistry 34: 9897–9903, 1995.
9. Blanco G, Sanchez G, Mercer RW. Differential regulation of Na,KATPase isozymes by protein kinases and arachidonic acid. Arch Biochem
Biophys 359: 139 –150, 1998.
10. Blaustein MP. Endogenous ouabain: physiological activity and pathophysiological implications. Clin Investig 72: 706 –707, 1994.
11. Contreras RG, Flores-Beni Tez D, Flores-Maldonado C, Larre I,
Shoshani L, Cereijido M. Na⫹,K⫹-ATPase and hormone ouabain: new
roles for an old enzyme and an old inhibitor. Cell Mol Biol (Noisy-legrand) 52: 31– 40, 2006.
12. Dostanic I, Paul RJ, Lorenz JN, Theriault S, Van Huysse JW, Lingrel
JB. The ␣2-isoform of Na-K-ATPase mediates ouabain-induced hypertension in mice and increased vascular contractility in vitro. Am J Physiol
Heart Circ Physiol 288: H477–H485, 2005.
13. Haas M, Askari A, Xie Z. Involvement of Src and epidermal growth
factor receptor in the signal-transducing function of Na⫹/K⫹-ATPase.
J Biol Chem 275: 27832–27837, 2000.
14. Kaplan JH. Biochemistry of Na,K-ATPase. Annu Rev Biochem 71:
511–535, 2002.
15. Kometiani P, Li J, Gnudi L, Kahn BB, Askari A, Xie Z. Multiple signal
transduction pathways link Na⫹/K⫹-ATPase to growth-related genes in
cardiac myocytes. The roles of Ras and mitogen-activated protein kinases.
J Biol Chem 273: 15249 –15256, 1998.
16. Liu J, Tian J, Haas M, Shapiro JI, Askari A, Xie Z. Ouabain interaction
with cardiac Na⫹/K⫹-ATPase initiates signal cascades independent of
changes in intracellular Na⫹ and Ca2⫹ concentrations. J Biol Chem 275:
27838 –27844, 2000.
17. Looney MR, Sartori C, Chakraborty S, James PF, Lingrel JB, Matthay MA. Decreased expression of both the ␣1- and ␣2-subunits of the
Na-K-ATPase reduces maximal alveolar epithelial fluid clearance. Am J
Physiol Lung Cell Mol Physiol 289: L104 –L110, 2005.
18. McDonough AA, Geering K, Farley RA. The sodium pump needs its
beta subunit. FASEB J 4: 1598 –1605, 1990.
19. Mobasheri A, Avila J, Cozar-Castellano I, Brownleader MD, Trevan
M, Francis MJ, Lamb JF, Martin-Vasallo P. Na⫹, K⫹-ATPase isozyme
diversity; comparative biochemistry and physiological implications of
novel functional interactions. Biosci Rep 20: 51–91, 2000.
20. Mohammadi K, Kometiani P, Xie Z, Askari A. Role of protein kinase
C in the signal pathways that link Na⫹/K⫹-ATPase to ERK1/2. J Biol
Chem 276: 42050 – 42056, 2001.
21. Moseley AE, Huddleson JP, Bohanan CS, James PF, Lorenz JN,
Aronow BJ, Lingrel JB. Genetic profiling reveals global changes in
multiple biological pathways in the hearts of Na, K-ATPase alpha 1
isoform haploinsufficient mice. Cell Physiol Biochem 15: 145–158,
2005.
22. Pierre SV, Xie Z. The Na,K-ATPase receptor complex: its organization
and membership. Cell Biochem Biophys 46: 303–316, 2006.
23. Pressley TA, Duran MJ, Pierre SV. Regions conferring isoform-specific
function in the catalytic subunit of the Na,K-pump. Front Biosci 10:
2018 –2026, 2005.
24. Reyes-Cruz G, Vazquez-Prado J, Muller-Esterl W, Vaca L. Regulation
of the human bradykinin B2 receptor expressed in sf21 insect cells: a
possible role for tyrosine kinases. J Cell Biochem 76: 658 – 673, 2000.
25. Schoner W, Bauer N, Muller-Ehmsen J, Kramer U, Hambarchian N,
Schwinger R, Moeller H, Kost H, Weitkamp C, Schweitzer T, Kirch
U, Neu H, Grunbaum EG. Ouabain as a mammalian hormone. Anne NY
Acad Sci 986: 678 – 684, 2003.
26. Schoner W, Scheiner-Bobis G. Endogenous and exogenous cardiac
glycosides and their mechanisms of action. Am J Cardiovasc Drugs 7:
173–189, 2007.
27. Skou JC, Esmann M. The Na,K-ATPase. J Bioenerg Biomembr 24:
249 –261, 1992.
28. Vanmolkot KR, Kors EE, Hottenga JJ, Terwindt GM, Haan J,
Hoefnagels WA, Black DF, Sandkuijl LA, Frants RR, Ferrari MD,
van den Maagdenberg AM. Novel mutations in the Na⫹, K⫹-ATPase
pump gene ATP1A2 associated with familial hemiplegic migraine
and benign familial infantile convulsions. Ann Neurol 54: 360 –366,
2003.
29. Wessman M, Kaunisto MA, Kallela M, Palotie A. The molecular
genetics of migraine. Ann Med 36: 462– 473, 2004.
30. Xie Z. Membrane transporters and signal transduction. Cell Mol Biol
(Noisy-le-grand) 52: 1–2, 2006.
31. Xie Z, Cai T. Na⫹-K⫹-ATPase-mediated signal transduction: from protein interaction to cellular function. Mol Interv 3: 157–168, 2003.
294 • APRIL 2008 •
www.ajprenal.org
these ␣-isoforms for ouabain is an important property that
influences the signaling ability of the Na-K-ATPase. In addition, the ouabain-dependent kinetics of ERK phosphorylation
appears to be different between the ouabain-sensitive ␣3- and
␣4-isoforms. Thus, while both polypeptides start signaling at
low ouabain concentrations, ␣3 exhibits a narrower ouabain
range for optimal signal transduction. Although an explanation
for this isoform-specific response is unavailable for the moment, the differences in signal transduction kinetics we observed are suggestive of differences in isoform-specific receptor inactivation rates due, for example, to putative dissimilarities in the rate of internalization of each isoform after ouabain
binding. Additional experiments are required to further investigate this particular aspect of Na-K-ATPase isoform signaling.
Importantly, the different reactivity of the ␣-isoforms to cardiotonic steroids may not only be relevant for ouabain-controlled ion transport activity of the Na-K-ATPase but may also
represent a mechanism to regulate the ouabain-dependent signaling of the enzyme. This is of physiological relevance, since
controlling the expression of the different Na-K-ATPase ␣-isoforms would confer cells with a distinct susceptibility to the
circulating levels of ouabain. In this manner, the response to
ouabain can be adapted to the particular needs of each cell
type.
In conclusion, we have used the baculovirus expression
system to successfully demonstrate Na-K-ATPase-ouabain signaling in insect cells, confirmed the absolute requirement of
both subunits of the enzyme in the process, and uncovered
important isoform-specific differences in the Na-K-ATPasemediated cellular response to ouabain.
F865
F866
32. Yamamoto T, Su Z, Moseley AE, Kadono T, Zhang J, Cougnon M,
Li F, Lingrel JB, Barry WH. Relative abundance of alpha2 Na⫹
pump isoform influences Na⫹-Ca2⫹ exchanger currents and Ca2⫹
transients in mouse ventricular myocytes. J Mol Cell Cardiol 39:
113–120, 2005.
33. Zhang J, Lee MY, Cavalli M, Chen L, Berra-Romani R, Balke CW,
Bianchi G, Ferrari P, Hamlyn JM, Iwamoto T, Lingrel JB, Matteson DR, Wier WG, Blaustein MP. Sodium pump alpha2 subunits
control myogenic tone and blood pressure in mice. J Physiol 569:
243–256, 2005.
294 • APRIL 2008 •
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Résultats
2
Données supplémentaires
Afin de confirmer les résultats obtenus sur les cellules d'insectes, nous avons
décidé de réaliser une lignée cellulaire stable de rein de porc contenant seulement
l'isoforme Į2 de la Na+, K+-ATPase. Cette lignée a été réalisée par la transfection de
l'isoforme Į2 dans des cellules PY-17 contenant seulement 10% de l'isoforme Į1.
Après génération de la lignée stable (PY17- Į2), il a été vérifié que celle-ci contenait
bien seulement l'isoforme Į2 uniquement (Figure 31).
Figure 31 Détection par Western Blot des sous-unités Į1 et Į2 de la Na+, K+-ATPase sur différentes
lignées cellulaires. Résultat représentatif de 3 expériences indépendantes sur 3 lignées cellulaires PY-17, AAC
19 et PY17- Į2 pour la détection des isorformes Į1 et Į2 de la Na+, K+-ATPase
La lignée étant générée, elle pourra être utilisée pour étudier la fonction de
signalisation de l'isoforme Į2.
II Etude de la Na+, K+-ATPase dans des cellules rénales
1
rôle de la Na+, K+-ATPase "Isoform Specific Region"
a
Article : Sottejeau Y, Belliard A, Duran MJ, Pressley TA, Pierre SV., Critical
role of the isoform-specific region in alpha1-Na,K-ATPase trafficking and
protein Kinase C-dependent regulation., Biochemistry. 2010 May
4;49(17):3602-10.
Suite aux résultats obtenus par le laboratoire du Dr Pressley [161], le but de
cette étude était de démontrer que les observations faites sur la chimère Į1Į2Į1
(augmentation de l'activité de la Na+, K+-ATPase de 30% au lieu de 15% pour l' Į1)
sont dues à l'absence du motif dileucine [DE]XXXL[LI] qui peut être reconnu par les
Yoann Sottejeau
115
Résultats
adaptateurs à la clathrine AP-1 et AP-2 [162]. Pour réaliser cela, la mutation de l' Į1
de rat a été réalisée en position 499 en remplaçant une Leucine par une Valine puis a
été exprimée dans des cellules de rein d'opossum. En présence de PMA (activateur des
PKC), l' Į1-L499V se comporte comme la chimère Į1Į2Į1 en augmentant de 30%
l'activité de la Na+, K+-ATPase. En voulant regarder l'effet du PMA sur l'expression de
surface de la Na+, K+-ATPase, nous avons remarqué que dans des conditions basales,
le mutant Į1-L499V était plus exprimé à la surface membranaire que l' Į1. Cette
différence à l'état basal n'engendre pas de changement d'activité de la Na+, K+ATPase. De plus, l'endocytose du mutant Į1-L499V est ralenti par rapport à celle de l'
Į1. Afin de vérifier si les résultats obtenus sont dus au motif reconnu [DE]XXXL[LI]
par les adaptateurs à la clathrine ou seulement au motif dileucine, un deuxième mutant
a été réalisé en position 495 en remplaçant l'acide glutamique par une sérine. Ce
mutant Į1-E495S se comporte exactement comme l' Į1-L499V sur l'augmentation de
l'activité de la Na+, K+-ATPase par le PMA, ainsi que la distribution de la Na+, K+ATPase à la surface membranaire à l'état basal. Cette étude démontre l'importance de
la région isoforme spécifique (ISR) de l' Į1 et du motif [DE]XXXL[LI] présent dans
celui-ci dans la réponse aux PKC ainsi qu'à l'expression membranaire à l'état basal.
Elle permet aussi l'évocation des différences de régulation de l'ISR pour chaque
isoforme Į, ainsi que la présence d'un pool d’ATPase inactive pour le transport
ionique "non pumping pump" à la surface membranaire puisqu'en comparaison à l' Į1,
le mutant Į1-L499V a plus de Na+, K+-ATPase à la surface membranaire mais à la
même capacité d'échange d'ions.
Yoann Sottejeau
116
Biochemistry XXXX, XXX, 000–000 A
DOI: 10.1021/bi9021999
)
Critical Role of the Isoform-Specific Region in R1-Na,K-ATPase Trafficking
and Protein Kinase C-Dependent Regulation†
Yoann Sottejeau,‡ Aude Belliard,‡ Marie-Josee Duran,§, Thomas A. Pressley,§ and Sandrine V. Pierre*,‡
)
‡
Department of Physiology and Pharmacology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio 43614, and §Center for
Membrane Protein Research, Department of Cell Physiology and Molecular Biophysics, Texas Tech University Health Sciences
Center, Lubbock, Texas 79430 Current address: ELA Research Foundation, 26, rue de Londres, F-75009 Paris, France
Received December 23, 2009; Revised Manuscript Received March 12, 2010
ABSTRACT: The isoform-specific region (ISR) is a region of structural heterogeneity among the four isoforms
of the catalytic R-subunit of the Na,K-ATPase and an important structural determinant for isoform-specific
functions. In the present study, we examined the role of a potential dileucine clathrin adaptor recognition
motif [DE]XXXL[LI] embedded within the R1-ISR. To this end, a rat R1 construct where leucine 499 was
replaced by a valine (as found in the R2 isoform sequence) was compared to wild-type rat R1 after stable
expression in opossum kidney cells. Total Na,K-ATPase expression, activity, or in situ 86Rbþ transport was
not affected by the L499V mutation. However, surface Na,K-ATPase expression was nearly doubled. This
increase was associated with a reduced rate of internalization from the cell surface of about 50% after a 4 h
chase and became undetectable if clathrin-coated pit-mediated trafficking was blocked with chlorpromazine.
Further, PKC-induced stimulation of Na,K-ATPase-mediated 86Rbþ uptake was doubled in mutantexpressing cells, comparable to the chimera containing the intact R2-ISR. Similar results were observed
when the potential motif was disrupted by means of an E495S mutation. These findings suggest that a
dileucine motif embedded within the Na,K-ATPase R1-ISR plays a critical role in the surface expression of
Na,K-ATPase R1 polypeptides at steady state and in the response to PKC activation.
The Na,K-ATPase is critical for maintaining the ionic gradients across the plasma membranes of animal cells. The primary
contributor to overall catalysis, the R subunit, exists as four
distinct isoforms (1). There are observed kinetic differences
among these isoforms, but the subtlety of these distinctions
makes them an unlikely basis for physiological significance,
especially in humans (2, 3). Instead, it has been suggested that
the major functional distinction among the isoforms involves two
issues: their regulation by intracellular effectors such as protein
kinase C (PKC)1 (4, 5) and their localization in highly differentiated cells (6).
It could almost go without saying that the molecular basis
underlying the differential response to regulation and targeting
must reside within regions of structural divergence among the
isoforms. Current research has focused on the role of two major
regions of marked structural diversity: the amino-terminal
domain and a 10-residue region near the center of the molecule,
the isoform-specific region (ISR) (Figure 6A, K489-L499 on the R1
polypeptide) (7, 8). Earlier work with chimeras in which the
central ISR of the rat R1- and R2-isoforms were exchanged
suggests that this region plays a key role in the isoform-specific
†
This work has been supported by grants from the American
Heart Association Texas Affiliate (98G-385), the National Center for
Research Resources (RR-19799), and the National Heart, Lung, and
Blood Institute, NIH (HL 36573).
*Corresponding author. Phone: 419-383-4182/4150. Fax: 419-3832871.
E-mail: [email protected].
1
Abbreviations: CPZ, chlorpromazine; ISR, isoform-specific region;
OK cells, opossum kidney cells; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate;
PKC, protein kinase C; TCEP, tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride; YFP, yellow fluorescent protein.
r XXXX American Chemical Society
PKC regulation of pump activity (9). This prompted us to
examine further the ISR sequence in R1 and R2. Alignment of
the sequences revealed that the ISR of R1 contains a potential
dileucine motif [DE]XXXL[LI] (10). Indeed, the pair of leucines
is conserved among all of the known mammalian R1 sequences,
although the presence of an equally conserved proline within the
“polar” central portion of the region deviates somewhat from the
consensus structure. Nevertheless, this motif could serve as a
target for adaptor proteins that mediate membrane translocation, such as AP-2. The dileucines are disrupted in the ISR of
R2 by substitution with a conserved valine, and we hypothesized
that this motif in R1 could encourage translocation of pump
complexes from the plasmalemma to intracellular vesicles,
presumably via clathrin-coated vesicles and clathrin adaptor
proteins (11, 12). To test this hypothesis, two ISR mutants of
the rat R1 sequence were characterized after heterologous
expression in opossum kidney (OK) cells. The results presented
here show that steady-state Na,K-ATPase cell surface expression
was altered in both mutants, consistent with altered trafficking of
the R1 protein from the cell membrane. Further, the observed
PKC responses in these mutations were doubled relative to rat
R1, further suggesting a role of the dileucine ISR in PKC-induced
activation.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Expression Vectors, Site-Directed Mutagenesis, and
Heterologous Expression. cDNAs encoding wild-type (WT)
or modified ouabain-resistant rat R1 sequences were prepared as
described (9) in the eukaryotic expression vector pRc/CMV
pubs.acs.org/Biochemistry
B
Sottejeau et al.
Biochemistry, Vol. XXX, No. XX, XXXX
(Invitrogen, San Diego, CA). All mutants were created by sitedirected mutagenesis of WT or yellow fluorescent protein- (YFP-)
tagged rat R1 constructs (QuickChange mutagenesis kit; Stratagene, La Jolla, CA), and the structures of the resulting mutant
cDNAs were confirmed by direct sequencing of the altered
regions. Stable heterologous expression was achieved by transfection of OK cells (CRL-1840; American Type Culture Collection)
and subsequent selection of recipients with 3 μM ouabain, as we
and others have described previously (9, 13, 14). This strategy
takes advantage of the well-known reduced ouabain sensitivity of
rodent Na,K-ATPase R1 polypeptide compared to other species.
Indeed, a concentration of 3 μM ouabain is sufficient to kill
nontransfected OK cells but not cells that express the introduced
rat R1-derived forms. Expression of the expected exogenous
sequences was confirmed by reverse transcription and polymerase
chain reaction (PCR) as described (9, 15).
Active Transport. Na,K-pump-mediated transport was assessed by measuring the ouabain-sensitive uptake of the Kþ
congener, 86Rbþ, as previously described (9). Briefly, the difference in accumulation of radioisotope over 5 min at 37 °C was
determined in cells exposed to standard culture medium with
3 μM or 1 mM ouabain. The effect of PKC activation was
determined by treating confluent monolayers for 5 min with
DMSO vehicle or the phorbol ester agonist, phorbol 12-myristate
13-acetate (PMA), prior to the addition of radiolabeled Rbþ.
With the exception of one set of experiments (presented in Table 1
and explicitly labeled as such) the intracellular Naþ concentration in the OK cells was increased with the ionophore monensin
at a concentration of 20 μM.
Enzymatic Activity. The specific activity of Na,K-ATPase in
whole cell lysates was determined from the hydrolysis of radiolabeled ATP as previously described (16). The difference in
inorganic phosphate release from [γ-32P]ATP (100 μCi/mmol) in
the absence and presence of 3 mM ouabain was determined after
a 30 min incubation at 37 °C in buffer containing 130 mM NaCl,
20 mM KCl, 3 mM MgCl2, 3 mM ATP Na+ salt, 25 mM
histidine, 0.20 mM EGTA, and 3 mM NaN3 (pH 7.5 at 25 °C).
Hydrolysis rates were standardized against the amount of protein.
Fluorescence Imaging. Cells were grown on glass coverslips
for 24 h followed by a 24 h period of exposure to cycloheximide
(5 nM) prior to visualization using an inverted confocal argon
and helium/neon laser scanning microscope (DM IRE2; Leica)
equipped with a 63/1.3 oil objective.
Biotinylation and Western Blotting. Total and surface
protein abundances of the introduced R1 constructs were determined by electrophoresis and immunoblotting as described
previously (8). Rat-derived R1 was detected with anti-NASE, a
site-directed rabbit polyclonal antibody directed against the
R1-ISR. Although some preparations of this antibody crossreact with the endogenous opossum subunit, we selected a
preparation in which this cross-reactivity was minimal. In some
experiments, immunoblotting results were confirmed by the use
of 6F, a monoclonal antibody directed against chicken R subunit (7). Equal loading of the samples among the lanes of the gel
was confirmed by probing with a commercial antibody against
actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
The amount of introduced R1 expressed at the cell surface was
detected by biotinylation following the recommended procedures
of Gottardi et al. (17). Seventy percent confluent cells grown on
100 mm culture dishes were placed on ice, rinsed twice with
ice-cold saline, and exposed twice to 1.5 mg/mL N-hydroxysulfosuccinimidobiotin in biotinylation buffer (10 mM triethanolamine,
2 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 250 mM sucrose, pH 9.0) for
25 min at 4 °C. Unreacted biotin was scavenged by a 20 min
exposure to 100 mM glycine buffer at 4 °C, followed by two
additional washes with saline. Cells were then solubilized in lysis
buffer (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM
Tris, pH 7.5) for 60 min on ice, and the resulting lysates were
cleared by centrifugation at 14,000g for 10 min at 4 °C. Lysates
were incubated overnight at 4 °C with streptavidin-agarose
beads (Pierce) with end-over-end rotation. The beads were then
washed twice with lysis buffer, twice with high-salt buffer (0.1%
Triton X-100, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH
7.5), and twice with no-salt wash buffer (10 mM Tris, pH 7.5).
Bound proteins were eluted with sodium dodecyl sulfatecontaining sample buffer for analysis by electrophoresis and
immunoblotting as described above. To test whether any
changes in surface expression of the introduced mutants were
related to clathrin-mediated membrane recycling of the Na,KATPase, we studied the effect of chlorpromazine (CPZ)
(Vetranal; Sigma), a cationic amphiphilic drug that inhibits
clathrin-mediated membrane recycling by encouraging the
removal of coated pits from the cell surface (18). Based on
previous studies (19, 20), we opted for a treatment that consisted
of a 24-h pretreatment with 5 nM cycloheximide before
exposure to 10 μM CPZ for 30 min followed by 4 h incubation
in culture media. Evaluation of endocytosis of Na,K-ATPase
was accomplished with a pulse-chase strategy. Cells were
serum-starved and treated with 5 nM cycloheximide 24 h prior
to the beginning of the experiment. First, proteins expressed at
the cell surface were biotinylated as described above, quenched
with PBS-glycine buffer, and brought back to normal culture
conditions for 0 or 4 h. The remaining surface-bound biotin was
then cleaved by treatment with tris(2-carboxyethyl)phosphine
hydrochloride (TCEP) reducing agent (100 mM into 50 mM
Tris, pH 7.4) for 30 min at 4 °C as described previously (21).
Na,K-ATPase Structure. The high-resolution structure of
the pig Na,K-ATPase published by Morth et al. (22) was
obtained using the Cn3D software from NCBI’s Entrez retrieval
service. The localization of the ISR on the pig structure was
determined following alignment of the rat (NM012504) and pig
(PDB ID 3138E) R1 isoform amino acid sequences obtained from
the NCBI database. For the studies illustrated in Figure 6C,D, a
probable structure was generated using the SWISS-MODEL best
fit tool and refined using the built-in energy minimization tool.
Gaps and breaks introduced into the sequences were repaired
manually, and the structure was again refined using the energy
minimization tool. The resulting structural models were visualized using PyMOL. Protein surfaces were also generated using
the PyMOL software.
RESULTS
Characterization of R1-L499V. Our initial experiments
focused on an R1 construct in which the first leucine of the
putative dileucine motif (495EPKHLLV501) was replaced with a
valine, as present in the sequence of R2 (492PQSHVLV498)
(Figure 6A). Transfection of the R1-L499V construct into OK
cells and selection as detailed in Experimental Procedures
produced ouabain-resistant colonies, indicating that the mutant
was capable of producing functional Na,K-ATPase. Qualitatively, confocal fluorescence microscopy studies of YFP-tagged
WT and the L499V mutant did not show intracellular sites of
accumulation of fluorescence, suggesting that the mutation did
Article
C
FIGURE 1: Fluorescence imaging of YFP-tagged WT (A, B) and L499V (C, D) rat Na,K-ATPase R1 transfected OK cells visualized by confocal
microscopy as described in Experimental Procedures. (A, C) YFP fluorescence. (B, D) Merged picture of transmission microscopy and YFP
fluorescence.
not result in a major change in the cellular processing and
maturation of the R1 polypeptide (Figure 1). Consistent with
this inference, introduction of the L499V mutation did not
appear to affect quantitatively the total level of R1 subunit
expression, as shown, from immunoblotting of cell lysates
(Figure 2A). Moreover, in situ 86Rbþ uptake (in the presence
or absence of the Naþ ionophore monensin) and ouabainsensitive Na,K-ATPase activity in OK cells expressing the R1L499V mutant were not significantly different from that in cells
expressing the wild-type rat R1 (Table 1).
Cell Surface Expression of R1-L499V. To test whether
disruption of the potential ISR dileucine motif in the mutant
could affect steady-state surface expression of the Rl polypeptide,
we conducted a series of experiments using cell surface biotinylation as detailed in Experimental Procedures. As shown in
Figure 2B, immunodetection of the introduced wild-type R1 or
the L499V mutant suggested a roughly 75% elevation in surface
abundance in the mutant transfected cells (P < 0.05 vs R1). These
results suggest that although the mutation had no effect on
overall Na,K-ATPase expression, it did favor the expression of
enzyme complexes at the plasmalemma. Shifts between the
surface and intracellular sites could be mediated by a clathrindependent mechanism. To determine if the effect of the disruption of the R1-ISR putative dileucine on basal Na,K-ATPase
surface expression involved coated pits, we compared the effect of
chlorpromazine (CPZ) treatment on surface expression of R1 and
R1-L499V. As shown in Figure 3A, the surface expression levels
of R1 and R1-L499V were undistinguishable 4 h post-CPZ
treatment. In addition, we verified that total expression
levels of R1 and R1-L499V were still comparable following the
treatment as shown in Figure 3B. Taken together, these results
suggest that the difference we observed in Figure 2B involved
recycling of clathrin-coated pits. To test whether the disruption of
the dileucine motif may have decreased basal internalization of
the L499V mutant compared to wild-type R1, we compared the
time course of Na,K-ATPase removal from the cell surface using
a combination of cell surface biotinylation and TCEP protection
assay. As shown in Figure 4, the amount of Na,K-ATPases
internalized in 4 h was significantly decreased by 2.6-fold in the
mutant when compared to wild type (P < 0.05).
PKC Regulation of 86Rbþ Uptake in Cells Expressing
R1-L499V. We next determined what effects the changes in the
dileucine motif would have on the response to PKC activation.
As shown in Figure 5, a significant increase of 16 ( 1% in
ouabain-sensitive 86Rbþ uptake was observed following 5 min of
PMA treatment in R1 transfected cells (P < 0.01 vs untreated R1,
paired t-test). After exchange of the original R1-ISR for the R2
sequence, the PMA-induced activation reached 26 ( 4% (P <
0.001 vs untreated R1R2R1, paired t-test) and was significantly
higher than the increase observed for the full-length R1 (P <
0.05), in agreement with our previous report (9). In R1-L499V
transfected cells, the response to PMA treatment reached 26 (
2% (P < 0.001 vs untreated R1-L499V, paired t-test), indistinguishable from the response of OK cells expressing the
R1R2R1 chimera. It therefore appears that replacing L499 by a
V is sufficient to mimic the effect of exchanging the entire ISR
sequence.
ISR and L499V Location on the Na,K-ATPase Structure. If the central ISR of the R subunit plays a role in
AP/clathrin-mediated shuttling of the Na,K-ATPase complex
D
Sottejeau et al.
Table 1: Effect of R1-L499V Mutation on Rbþ Transport and OuabainSensitive ATPase Activitya
Rbþ transport
without monensin
Rbþ transport
with monensin
ouabain-sensitive
ATPase activity
OK R1
OK R1-L499V
7.47 ( 0.38, n = 11
7.52 ( 1.11, n = 14
9.25 ( 1.14, n = 6
9.15 ( 0.46, n = 7
0.42 ( 0.14, n = 5
0.52 ( 0.07, n = 5
a
Na,K-ATPase-mediated transport was assayed in the absence or
presence of 20 μM monensin. Uptakes are expressed as nmol of Kþ (mg
of protein)-1 min-1 and are quoted as means ( SEM with the indicated
number of experiments. Ouabain-sensitive ATPase activities are expressed
as μmol of Pi h-1 (mg of protein)-1 and are quoted as means ( SEM with
the indicated number of experiments. Values obtained for R1 and R1-L499V
were compared using bilateral Student’s t-test and were not found to differ
significantly from one another.
FIGURE 2: (A) Total abundance of rat R1 and R1-L499V in transfected OK cells. The upper panel depicts typical immunoblots of cell
lysates probed with antibodies specific for R1 and actin. The lower
panel depicts the pooled data relative to R1, represented as means (
SEM (n = 4). Values were compared using bilateral Student’s t-test,
and no significant difference was observed. (B) Surface expression of
rat R1 and R1-L499V in transfected OK cells. The upper panel
depicts a typical immunoblot of biotinylated membrane proteins
recovered by affinity purification with streptavidin. The lower panel
depicts the pooled data relative to R1, represented as means ( SEM
(n = 3). Values were compared using bilateral Student’s t-test. *, P <
0.05 vs R1.
between the plasmalemma and intracellular compartments, it
must be accessible for interaction with other proteins. We
examined the likely position of the ISR, taking advantage of
the recent high-resolution structure obtained for the Na,
K-ATPase complex from pig kidney (22). Homology modeling
of the rat sequence against this structure suggests that the ISR of
R protrudes into the cytoplasm from the N or “nucleotidebinding” domain, consistent with earlier models based on the
sarcoplasmic reticulum Ca2þ-ATPase (15) (Figure 6B). At least
theoretically, this places the ISR in an accessible position for
interaction with intracellular partners such as clathrin APs.
Closer inspection of the likely surface of the molecule, however, suggested a more complex situation (Figure 6C). Leu-499 of
rat R1 appears to be barely exposed to the solvent (panel A of
Figure 6D). The homologous residue of rat R2 (Val-496) is
similarly hidden. If anything, the position of Val-496 is within a
pocket that may be even less accessible than the corresponding
region of R1 (panel B of Figure 6D). The structural model for the
L499V mutant suggests an intermediate condition. Although the
pocket in which the valine is located appears more like that of R1,
its accessibility may be compromised because the smaller side
chain does not penetrate as readily to the surface, leaving a deeper
hole than the wild-type subunit in the same region (panel C of
Figure 6D). Taken together, the results from these structural
analyses suggested that L499 is likely to be buried in the R1
structure (at least in the E2 3 P state of the pump cycle). It follows
that the probable location of L499 does not suggest a direct role
in protein-protein interaction such as those controlling membrane trafficking. Its position is not incompatible, however, with
a key role for L499 as part of the overall dileucine motif
[DE]XXXL[LI] in R1-ISR, which remains well exposed (loop
in Figure 6B). To test further the role of the potential motif, we
mutated the glutamate in position 495 (in green on Figure 6B) to
a serine, altering the charge along the surface of this region.
Cell Surface Expression and PKC Response of R1E495S. Transfection of the R1-E495S construct into OK cells
produced ouabain-resistant colonies, indicating that the mutant
was functional. The E495S mutation did not affect the total level
of R1-subunit, as shown by immunodetection in cell lysates
(Figure 7A). However, cell surface expression of R1-E495S was
more than twice that observed for the wild-type R1 (P < 0.05),
comparable to the increase observed for the R1-L499V mutant
(Figure 7B). Finally, as shown in Figure 7C, Na,K-ATPasemediated 86Rbþ uptake increased by 29 ( 3% in response to
PMA in R1-E495S transfected cells. Again, this increase was
significantly higher than the increase observed for wild-type R1
(P < 0.05) and indistinguishable from the response observed for
R1-L499V or the chimera R1R2R1.
DISCUSSION
The present study provides new supportive evidence for a
regulatory role of one of the two major regions of marked
structural diversity among the four isoforms of the Na,K-ATPase
Article
E
FIGURE 4: Na,K-ATPase endocytosis of wild-type R1 and L499V in
transfected OK cells. The upper panel depicts a typical immunoblot
of biotinylated endocytosed membrane proteins after 0 and 4 h at
37 °C recovered by affinity purification with streptavidin. The lower
panel depicts the pooled data relative to wild-type R1, represented as
means ( SEM (n = 3). Values were compared using bilateral
Student’s t-test. *, P < 0.05 vs the corresponding wild-type R1.
FIGURE 3: Effect of chlorpromazine treatment on surface (A) and
total (B) expression of rat R1 and R1-L499V in transfected OK cells.
Cells were treated with 10 μM chlorpromazine for 30 min, and surface
or total protein lysates were prepared after 4 h of incubation at 37 °C.
(A) The upper panel depicts a representative immunoblot of biotinylated surface membrane proteins recovered by affinity purification
with streptavidin. The lower panel depicts the pooled data relative to
R1, represented as means ( SEM (n = 7). (B) The upper panel shows
representative immunoblots of cell lysates probed with antibodies
specific for R1 and actin. The lower panel depicts the pooled data
relative to R1, represented as means ( SEM (n = 7). Values were
compared using bilateral Student’s t-test, and no significant difference was observed.
catalytic subunit: the isoform-specific region (ISR) (Figure 6A,
K489-L499 on the R1 polypeptide). On the basis of the functional
characterization of two mutants where the potential dileucine
recognition motif [DE]XXX[LI] in R1-ISR was disrupted, we
propose that the ISR is involved in (1) trafficking of the R1
protein from the cell membrane under basal conditions and (2)
the change in ion-pumping rate in response to PKC stimulation.
Effect of the Mutations at Steady State. The biotinylation
experiments revealed an increased abundance of about 80% for
both mutants in the plasma membrane, relative to the wild-type
FIGURE 5: Effect of L499V mutation on PMA-dependent activation
of R1 Na,K-ATPase-mediated Rbþ transport. Na,K-ATPasemediated transport was assayed in attached cells by measuring the
ouabain-sensitive uptake of the Kþ congener, 86Rbþ. PKC activation
was induced by a 5 min exposure of the cells to 10 μM PMA prior to
the addition of Rbþ and compared to paired control plates of cells
exposed for 5 min to the same amount of vehicle alone (DMSO).
Values are means ( SEM (n = 8-11) of uptake induced by PMA
exposure, expressed in percent of their paired controls (same transfection group, same passage, same day). Values were compared using
one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison tests.
NS, nonsignificant. *, P < 0.05 vs wild-type R1.
rat R1 subunit (Figures 2B and 7B). Despite this increase, we
could not detect differences in total exogenous subunit nor Na,
K-ATPase specific activity in cell lysates. It follows that the
proportion of R1 subunit allocated to the surface must have been
F
Sottejeau et al.
FIGURE 6: (A) Position and sequence comparison of the central isoform-specific regions (ISR) in the wild-type R1 and R2 catalytic subunits of the
Na,K-ATPase from rat. The open box represents the location of the ISR. Mutated residues in the constructs used in the present study are shown in
red. The sequence numbers of the boundary amino acids of the R1- and R2-ISR are indicated. (B) Likely position of the central ISR in the structure
of the R1 subunit from the high-resolution structure of pig Na,K-ATPase (22) as deduced from homology modeling against the R1 subunit from
rat. In the structure, the P-domain is depicted in green, the A-domain in blue, and the N-domain in gray. In the gray domain, the residues forming
the ISR are depicted in yellow, E495 is in green, L499 is in blue, and L500 is in red. (C) Putative location of the dileucine motif in the structure of the
R1, R2, and R1-L499V variant of the subunits from rat. (D) Leu-499 is identified by blue in the model for R1 (panel A). Val-496 is identified by blue
in the model for R2 (panel B). The substitutent Val-499 is identified by blue in the model for R1-L499V (panel C).
larger in cells expressing the L499V mutant, and total exogenous
expression was comparable for both wild-type and mutant forms.
It is probably not surprising that a mutation that alters trafficking in response to kinase activation would also influence basal
Article
G
FIGURE 7: Effect of the E495S mutation on surface expression and PMA-dependent activation of R1 Na,K-ATPase-mediated Rbþ transport. (A)
Total abundance of rat R1 and R1-E495S in transfected OK cells. The upper panel depicts typical immunoblots of cell lysates probed with
antibodies specific for R1 and actin. The lower panel depicts the pooled data relative to R1, represented as means ( SEM (n = 3). Values were
compared using bilateral Student’s t-test, and no significant difference was observed. (B) Surface expression of rat R1 and R1-E495S in transfected
OK cells. The upper panel depicts a typical immunoblot of biotinylated membrane proteins recovered by affinity purification with streptavidin.
The lower panel depicts the pooled data relative to R1, represented as means ( SEM (n = 3). Values were compared using bilateral Student’s
t-test. *, P < 0.05 vs R1. (C) Na,K-ATPase-mediated transport was assayed in attached cells by measuring the ouabain-sensitive uptake of the Kþ
congener, 86Rbþ. PKC activation was induced by a 5 min exposure of the cells to 10 μM PMA prior to the addition of Rbþ and compared to paired
control plates of cells exposed for 5 min to the same amount of vehicle alone (DMSO). Values are means ( SEM (n = 5) of uptake induced by
PMA exposure, expressed in percent of their paired controls (same transfection group, same passage, same day). Values were compared using
bilateral Student’s t-test. *, P < 0.05 vs the corresponding wild-type R1.
distribution of the enzyme complex, and the data presented in
Figure 4 indeed suggest that the L499V mutation decreased the
rate of Na,K-ATPase removal from the cell surface. Furthermore, the difference in basal cell surface expression between R1
and the mutant was no longer observed after CPZ treatment
(Figure 3A), suggesting that the underlying mechanism involved
the clathrin-coated pit recycling pathway. Additional unanticipated effects of the mutation may be evident when comparing the
observed rates of transport and apparent surface abundance.
Despite the elevated surface expression seen in R1-L499V
transfected cells, their Na,K-ATPase-mediated uptake of
86
Rbþ was indistinguishable from that of cells expressing en-
dogenous wild-type subunit (Table 1). Such a discrepancy
suggests that the steady-state catalytic turnover of the L499Vcontaining enzyme complexes may have been lower than those
containing wild-type proteins. This could simply reflect a somewhat lower intracellular Naþ concentration (or more rigorously,
its thermodynamic activity) in the mutant-expressing cells. That
this was not the case is demonstrated by the effects on transport
elicited by monensin. Both wild-type- and L499V-expressing cells
increased their Na,K-ATPase-mediated transport by about 23%
in the presence of the ionophore, which presumably increased
intracellular Naþ to near saturating concentrations. The similarity in response to monensin implies that the pumps in both cell
H
Sottejeau et al.
types were operating at comparable points on the concentration-activity curves for intracellular Naþ. Moreover,
the relatively modest increases in transport seen with the
addition of monensin suggest that the concentration of Naþ
inside both cell types was mildly elevated relative to nontransfected cells. Many cells in culture will respond with an
approximate doubling of Na,K-ATPase-mediated transport
in the presence of monensin, reflecting an intracellular Naþ
concentration near the enzyme’s K1/2. Given that the transfected OK cells used in this study were maintained in a low
dose of ouabain sufficient to inhibit endogenous enzyme,
an elevation in intracellular Naþ would therefore not be
unexpected.
Effect of the Mutations on PKC-Induced Stimulation of
86
Rbþ Uptake. Both mutations produced an increase in pumpmediated transport when OK cells were exposed acutely to
phorbol esters that was roughly twice that seen with the wildtype subunit (Figures 5 and 7C). This suggests that Leu-499 and
Glu-495 of the R1-ISR contribute to the regulation of the Na,KATPase-mediated ion transport by PKC attributed to this region
in earlier work (9).
Data accumulated by several laboratories indicate that PKC
regulates the cycling of pumps to and from the plasma membrane. For instance, activation of PKC produces clear shifts in
the distribution of the pump that are mediated (at least in part) by
modulation of clathrin-dependent endocytosis (23-25). Further
studies are warranted to determine whether the mutations
characterized here indeed interfere with this process. In favor
of a physiological role of isoform-specific mechanisms in agonistmediated regulation, Teixeira et al. (26) found that treatment of
neostriatal neurons with dopamine decreases the amount of R2 in
the membrane, without altering R1 abundance. Work by
others argues that the second leucine of the dileucine motif is
less critical. Done et al. (27), for example, found that mutations in
Leu-500 in rat R1 were not sufficient to alter PMA-induced
activation. Similarly, studies with other proteins have suggested
that the second leucine is less important in adaptor protein
binding (28). Of course, the current work cannot exclude the
contributions of other regions of the R subunit to membrane
translocation nor does it identify the proteins responsible for
targeting R.
Some proteins that are sorted via dileucine-based motifs are
regulated by direct phosphorylation of a serine within the
motif (29). Indeed, the ISR of rat contains a serine (Ser-494) in
the same position as a serine within the dileucine motif of the
T cell receptor that is targeted by PKC (30). This mechanism
seems unlikely as an explanation for the Na,K-ATPase
because the serine residues of R1 targeted by PKC are located
in the amino terminus. Although this region was not resolved
in the structure proposed by Morth et al. (22), its likely
position within the high-resolution model is well away from
the ISR, minimizing the likelihood of direct interactions
between the two regions.
Taken together, these data suggest that a dileucine motif of the
type [DE]XXXL[LI] in the Na,K-ATPase R1-ISR plays a role
in surface expression of the polypeptide and in the enzyme
response to PKC stimulation. Additional mutations and further
structural modeling may shed some light on the precise underlying mechanism, and one can also expect that increased efforts
will be directed toward direct identification of the various
adaptor proteins responsible for the sorting of this important
enzyme complex.
ACKNOWLEDGMENT
The authors appreciate the assistance of Deborah Carr,
Ryan M. Downey, and Dr. Raymond E. Willis and are grateful
to Dr. Ting Cai and Dr. Zi-Jian Xie for suggestions and
discussions.
REFERENCES
1. Blanco, G., and Mercer, R. W. (1998) Isozymes of the Na-K-ATPase:
heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275,
F633–650.
2. Crambert, G., Hasler, U., Beggah, A. T., Yu, C., Modyanov, N. N.,
Horisberger, J. D., Lelievre, L., and Geering, K. (2000) Transport and
pharmacological properties of nine different human Na, K-ATPase
isozymes. J. Biol. Chem. 275, 1976–1986.
3. Wang, J., Velotta, J. B., McDonough, A. A., and Farley, R. A. (2001)
All human Na(þ)-K(þ)-ATPase alpha-subunit isoforms have a
similar affinity for cardiac glycosides. Am. J. Physiol. Cell Physiol.
281, C1336–1343.
4. Blanco, G., Sanchez, G., and Mercer, R. W. (1998) Differential
regulation of Na,K-ATPase isozymes by protein kinases and arachidonic acid. Arch. Biochem. Biophys. 359, 139–150.
5. Nishi, A., Fisone, G., Snyder, G. L., Dulubova, I., Aperia, A., Nairn,
A. C., and Greengard, P. (1999) Regulation of Naþ, Kþ-ATPase
isoforms in rat neostriatum by dopamine and protein kinase C.
J. Neurochem. 73, 1492–1501.
6. Song, H., Lee, M. Y., Kinsey, S. P., Weber, D. J., and Blaustein, M. P.
(2006) An N-terminal sequence targets and tethers Naþ pump alpha2
subunits to specialized plasma membrane microdomains. J. Biol.
Chem. 281, 12929–12940.
7. Takeyasu, K., Lemas, V., and Fambrough, D. M. (1990) Stability of
Na(þ)-K(þ)-ATPase alpha-subunit isoforms in evolution. Am. J.
Physiol. 259, C619–630.
8. Pressley, T. A. (1992) Phylogenetic conservation of isoform-specific
regions within alpha-subunit of Na(þ)-K(þ)-ATPase. Am. J. Physiol.
262, C743–751.
9. Pierre, S. V., Duran, M. J., Carr, D. L., and Pressley, T. A. (2002)
Structure/function analysis of Na(þ)-K(þ)-ATPase central isoformspecific region: involvement in PKC regulation. Am. J. Physiol. Renal
Physiol. 283, F1066–1074.
10. Kirchhausen, T. (1999) Adaptors for clathrin-mediated traffic. Annu.
Rev. Cell Dev. Biol. 15, 705–732.
11. Simmen, T., Honing, S., Icking, A., Tikkanen, R., and Hunziker, W.
(2002) AP-4 binds basolateral signals and participates in basolateral
sorting in epithelial MDCK cells. Nat. Cell Biol. 4, 154–159.
12. Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., and Wakeham,
D. E. (2001) Biological basket weaving: formation and function of
clathrin-coated vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 517–568.
13. Jewell, E. A., and Lingrel, J. B. (1991) Comparison of the substrate
dependence properties of the rat Na,K-ATPase alpha 1, alpha 2, and alpha
3 isoforms expressed in HeLa cells. J. Biol. Chem. 266, 16925–16930.
14. Vilsen, B. (1997) Leucine 332 at the boundary between the fourth
transmembrane segment and the cytoplasmic domain of Naþ,KþATPase plays a pivotal role in the ion translocating conformational
changes. Biochemistry 36, 13312–13324.
15. Duran, M. J., Pierre, S. V., Carr, D. L., and Pressley, T. A. (2004)
The isoform-specific region of the Na,K-ATPase catalytic subunit:
role in enzyme kinetics and regulation by protein kinase C. Biochemistry 43, 16174–16183.
16. Pressley, T. A., Haber, R. S., Loeb, J. N., Edelman, I. S., and IsmailBeigi, F. (1986) Stimulation of Na,K-activated adenosine triphosphatase and active transport by low external Kþ in a rat liver cell
line. J. Gen. Physiol. 87, 591–606.
17. Gottardi, C. J., Dunbar, L. A., and Caplan, M. J. (1995) Biotinylation
and assessment of membrane polarity: caveats and methodological
concerns. Am. J. Physiol. 268, F285–295.
18. Wang, L. H., Rothberg, K. G., and Anderson, R. G. (1993)
Mis-assembly of clathrin lattices on endosomes reveals a regulatory
switch for coated pit formation. J. Cell Biol. 123, 1107–1117.
19. Guevara, E. A., de Lourdes Barriviera, M., Hasson-Voloch, A., and
Louro, S. R. (2007) Chlorpromazine binding to Naþ, Kþ-ATPase and
photolabeling: involvement of the ouabain site monitored by fluorescence. Photochem. Photobiol. 83, 914–919.
20. Liu, J., Kesiry, R., Periyasamy, S. M., Malhotra, D., Xie, Z., and
Shapiro, J. I. (2004) Ouabain induces endocytosis of plasmalemmal
Na/K-ATPase in LLC-PK1 cells by a clathrin-dependent mechanism.
Kidney Int. 66, 227–241.
Article
21. Klisic, J., Zhang, J., Nief, V., Reyes, L., Moe, O. W., and Ambuhl,
P. M. (2003) Albumin regulates the Naþ/Hþ exchanger 3 in OKP cells.
J. Am. Soc. Nephrol. 14, 3008–3016.
22. Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L.,
Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., and Nissen, P. (2007) Crystal
structure of the sodium-potassium pump. Nature 450, 1043–1049.
23. Efendiev, R., Bertorello, A. M., Pressley, T. A., Rousselot, M.,
Feraille, E., and Pedemonte, C. H. (2000) Simultaneous phosphorylation of Ser11 and Ser18 in the alpha-subunit promotes the recruitment
of Na(þ),K(þ)-ATPase molecules to the plasma membrane.
Biochemistry 39, 9884–9892.
24. Bertorello, A. M., Komarova, Y., Smith, K., Leibiger, I. B., Efendiev,
R., Pedemonte, C. H., Borisy, G., and Sznajder, J. I. (2003) Analysis
of Naþ,Kþ-ATPase motion and incorporation into the plasma membrane in response to G protein-coupled receptor signals in living cells.
Mol. Biol. Cell 14, 1149–1157.
25. Khundmiri, S. J., Bertorello, A. M., Delamere, N. A., and Lederer,
E. D. (2004) Clathrin-mediated endocytosis of Naþ,Kþ-ATPase in
response to parathyroid hormone requires ERK-dependent phosphorylation of Ser-11 within the alpha1-subunit. J. Biol. Chem. 279,
17418–17427.
I
26. Teixeira, V. L., Katz, A. I., Pedemonte, C. H., and Bertorello, A. M.
(2003) Isoform-specific regulation of Naþ,Kþ-ATPase endocytosis
and recruitment to the plasma membrane. Ann. N.Y. Acad. Sci. 986,
587–594.
27. Done, S. C., Leibiger, I. B., Efendiev, R., Katz, A. I., Leibiger, B.,
Berggren, P. O., Pedemonte, C. H., and Bertorello, A. M. (2002)
Tyrosine 537 within the Naþ,Kþ-ATPase alpha-subunit is essential
for AP-2 binding and clathrin-dependent endocytosis. J. Biol. Chem.
277, 17108–17111.
28. Dietrich, J., Kastrup, J., Nielsen, B. L., Odum, N., and Geisler, C.
(1997) Regulation and function of the CD3gamma DxxxLL motif: a
binding site for adaptor protein-1 and adaptor protein-2 in vitro.
J. Cell Biol. 138, 271–281.
29. Geisler, C., Dietrich, J., Nielsen, B. L., Kastrup, J., Lauritsen, J. P.,
Odum, N., and Christensen, M. D. (1998) Leucine-based receptor
sorting motifs are dependent on the spacing relative to the plasma
membrane. J. Biol. Chem. 273, 21316–21323.
30. Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Pedersen, L. O., Odum, N., and
Geisler, C. (1996) Molecular characterization of the di-leucinebased internalization motif of the T cell receptor. J. Biol. Chem.
271, 11441–11448.
Résultats
2
lors de l’ischémie reperfusion
a
Article : Pierre SV, Belliard A, Sottejeau Y., Modulation of Na(+)-K(+)ATPase cell surface abundance through structural determinants on the Į1subunit., Am J Physiol Cell Physiol. 2011 Jan;300(1):C42-8..
Cette étude est le prolongement continuation de la caractérisation du mutant
Į1-L499V dans des conditions d'ischémie/reperfusion. En effet, nous avons émis
l'hypothèse que l'augmentation de la Na+, K+-ATPase à la surface membranaire peut
être salutaire lorsque la cellule a une concentration intracellulaire de Na+ élevée. Cette
augmentation de Na+ a été reportée lors de l'ischémie/reperfusion [48, 281]. Pour cela,
la technique de "Substrate and Coverslip hypoxia" a été utilisée pour mimer l'ischémie
puis des indicateurs de mort cellulaire ont été mesurés (LDH, Annexin V/PI) ainsi que
la présence à la membrane de la Na+, K+-ATPase. En comparaison à l' Į1, le mutant
Į1-L499V réduit la libération de LDH ainsi que la diminution de la mort cellulaire par
les processus de nécrose et d'apoptose. L’expression membranaire du mutant Į1L499V après ischémie/reperfusion est toujours supérieure à celle de l' Į1. Cependant
les résultats de biotinylation suggèrent que l'Ischémie/Reperfusion induit une
internalisation de la Na+, K+-ATPase. Afin de vérifier cette suggestion,
l'internalisation de l' Į1 a été confirmée par "pulse chase" et marquage
immunofluorescent. Cette étude démontre que l'ischémie/reperfusion induit une
endocytose de l' Į1 Na+, K+-ATPase. L'augmentation de l' Į1 Na+, K+-ATPase à la
surface membranaire par le mutant Į1-L499V permet une amélioration de la survie
cellulaire dont le mécanisme devra être caractérisé lors de prochaines études. Cette
augmentation permet aussi l'évocation d'un mécanisme similaire par PURED
(Phosphorylation-Ubiquitination-Recognition-Endocytosis-Degradation) d'endocytose
de la Na+, K+-ATPase retrouvé dans l'hypoxie pulmonaire [290] qui devra être précisé
par d'autres études.
Yoann Sottejeau
126
Modulation of Na+-K+-ATPase cell surface abundance
through structural determinants on the α1-subunit
Sandrine V. Pierre, Aude Belliard and Yoann Sottejeau
Am J Physiol Cell Physiol 300:C42-C48, 2011. First published 3 November 2010;
doi:10.1152/ajpcell.00386.2010
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This article cites 45 articles, 26 of which can be accessed free at:
http://ajpcell.physiology.org/content/300/1/C42.full.html#ref-list-1
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AJP - Cell Physiology is dedicated to innovative approaches to the study of cell and molecular physiology. It is published 12 times
a year (monthly) by the American Physiological Society, 9650 Rockville Pike, Bethesda MD 20814-3991. Copyright © 2011 by the
American Physiological Society. ISSN: 0363-6143, ESSN: 1522-1563. Visit our website at http://www.the-aps.org/.
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This infomation is current as of January 20, 2011.
Am J Physiol Cell Physiol 300: C42–C48, 2011.
First published November 3, 2010; doi:10.1152/ajpcell.00386.2010.
Perspectives
Modulation of Na⫹-K⫹-ATPase cell surface abundance through structural
determinants on the ␣1-subunit
Sandrine V. Pierre,* Aude Belliard, and Yoann Sottejeau
Department of Physiology and Pharmacology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio
Submitted 16 September 2010; accepted in final form 2 November 2010
K⫹-ATPase and regulates its transport properties, have been
identified (21). In addition, several members of the FXYD
family of accessory proteins have been shown to bind to and
regulate Na⫹-K⫹-ATPase function in a tissue-specific manner
(19, 20).
The Na⫹-K⫹-ATPase is also the pharmacological target of
endogenous and exogenous cardiotonic steroids (CTS). CTS
have long been known as potent inhibitors of Na⫹-K⫹-ATPase
ion-pumping function, which is critical to their effect on
Na⫹-coupled influx of ions, amino acids, or glucose. This
inhibitory action on Na⫹-K⫹-ATPase ion-pumping function
and subsequent modulation of the Na⫹/Ca2⫹ exchange has
been extensively studied in the cardiac positive inotropic action
of CTS. In addition, CTS such as ouabain, digoxin, or marinobufogenin, initiate intracellular signaling cascades via stimulation of the Na⫹-K⫹-ATPase receptor function (30, 36, 47,
48). The role of this more recently discovered property in the
hormone-like function of endogenous CTS and in the therapeutic effect of exogenous CTS in health and diseases is being
increasingly recognized. Progress in the understanding of CTS
action in the cardiovascular and nervous systems, metabolism,
or cell growth and differentiation has been emphasized in
recent reviews (1, 2, 40, 42).
dileucine motif; ischemia-reperfusion injury; oppossum kidney cells;
cardiotonic steroids
Localization of Na⫹-K⫹-ATPase at the cell surface is important to both ion-pumping and receptor functions, and modulation of cellular Na⫹-K⫹-ATPase activity through changes
in cell surface expression has been reported in response to
major physiological or pathophysiological stimuli. Such stimuli include CTS themselves (32, 45), the parathyroid hormone
(24), dopamine (4), insulin (3, 12, 18), hypoxia (14), and
hypercapnia (46). Over the past 15 years, investigations using
heterologous expression systems have focused on the identification of key structural determinants along the Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 polypeptide that influence its expression at the cell
surface under basal conditions or in response to specific stimuli. Data from such studies are compiled in Table 1. We have
recently examined one of these molecular determinants, a
dileucine-based motif for recognition by clathrin-coated vesicle (CCV) adaptor proteins of the structure n(p)2– 4LL, where n
is a negatively charged residue and p is a polar residue (26).
The sequence is well conserved among all the known mammalian ␣1 sequences (Table 2), and our studies revealed that
mutations targeting this motif such as L499V or E495S resulted in an increased abundance of Na⫹-K⫹-ATPase ␣1-units
at the cell surface (44).
-K⫹-ATPASE is the membrane-spanning enzyme that
both establishes and maintains the electrochemical gradient
across the plasma membrane of animal cells by coupling the
hydrolysis of ATP to the transport of Na⫹ and K⫹ (23, 43).
The Na⫹-K⫹-ATPase complex consists of two dissimilar ␣and ␤-subunits, which exist as multiple isoforms. The ␣-subunit is the primary contributor to overall catalysis and contains
the binding sites for the substrates required by the enzyme.
Expression of the ␣1-isoform is apparently ubiquitous, while
the three others (␣2– 4) have increasingly restricted expression
patterns (5, 6). Three distinct isoforms of the ␤-subunit, which
is critical to the structural and functional maturation of Na⫹THE NA
⫹
* This article is an invited submission based on S. V. Pierre’s having
received the 2010 New Investigator Award by the American Physiological
Society-Cell and Molecular Physiology Section.
Address for reprint requests and other correspondence: S. V. Pierre, Dept. of
Physiology and Pharmacology, Univ. of Toledo College of Medicine, Health
Science Campus, 3000 Arlington Av., Toledo, OH 43614-2598 (e-mail:
[email protected]).
C42
Regulation of Na⫹-K⫹-ATPase Cell Surface Abundance and
Known Structural Determinants on the Na⫹-K⫹-ATPase ␣1
Polypeptide
0363-6143/11 Copyright © 2011 the American Physiological Society
http://www.ajpcell.org
Pierre SV, Belliard A, Sottejeau Y. Modulation of Na⫹-K⫹ATPase cell surface abundance through structural determinants on the
␣1-subunit. Am J Physiol Cell Physiol 300: C42–C48, 2011. First
published November 3, 2010; doi:10.1152/ajpcell.00386.2010.—
Through their ion-pumping and non-ion-pumping functions, Na⫹K⫹-ATPase protein complexes at the plasma membrane are critical to
intracellular homeostasis and to the physiological and pharmacological actions of cardiotonic steroids. Alteration of the abundance of
Na⫹-K⫹-ATPase units at the cell surface is one of the mechanisms for
Na⫹-K⫹-ATPase regulation in health and diseases that has been
closely examined over the past few decades. We here summarize these
findings, with emphasis on studies that explicitly tested the involvement of defined regions or residues on the Na⫹-K⫹-ATPase ␣1
polypeptide. We also report new findings on the effect of manipulating Na⫹-K⫹-ATPase membrane abundance by targeting one of these
defined regions: a dileucine motif of the form [D/E]XXXL[L/I]. In
this study, opossum kidney cells stably expressing rat ␣1 Na⫹-K⫹ATPase or a mutant where the motif was disrupted (␣1-L499V) were
exposed to 30 min of substrate/coverslip-induced-ischemia followed
by reperfusion (I-R). Biotinylation studies suggested that I-R itself
acted as an inducer of Na⫹-K⫹-ATPase internalization and that
surface expression of the mutant was higher than the native Na⫹-K⫹ATPase before and after ischemia. Annexin V/propidium iodide
staining and lactate dehydrogenase release suggested that I-R injury
was reduced in ␣1-L499V-expressing cells compared with ␣1-expressing cells. Hence, modulation of Na⫹-K⫹-ATPase cell surface
abundance through structural determinants on the ␣-subunit is an
important mechanism of regulation of cellular Na⫹-K⫹-ATPase in
various physiological and pathophysiological conditions, with a significant impact on cell survival in face of an ischemic stress.
Perspectives
MOLECULAR DETERMINANTS OF NA⫹-K⫹-ATPASE CELL SURFACE ABUNDANCE
C43
Table 1. Summary of domains and sites of posttranslational modifications involved in the regulation of rat Na⫹-K⫹-ATPase
␣1 surface expression
Structural Determinant
␣1 Surface Expression
Ref. No
Up
17
Dopamine/DR1/AP2
Hypoxia
None
Down
9, 13
Up
44
Dopamine
Hypoxia/PKC
PTH/PKC/ERK/CCV
Hypoxia/ubiquitination
Dopamine
Down
Down
Down
Down
Down
10
14
24
15
49
Trigger/Signal Cascade
Tyrosine-based domain for AP-binding
IVVY-255
Tyrosine-based domain for AP-binding
537-YLEL
Dileucine-based motif for AP-binding
EPKHL-499L
Phosphorylation /S-18
Ubiquitination/K-16/K-17/K-19/K-20
Proline-rich domain TPPPTTP-87
ANG II/AT1/AP1
ANG II, angiotensin II; AT1, Type 1 angiotensin II receptor; AP1 and AP2, clathrin adaptor protein 1 and 2; DR1, dopamine receptor 1; PKC, protein kinase
C; PTH, parathyroid hormone; ERK, extracellular signal-regulated kinase; CCV, clathrin-coated vesicle.
We reckoned that an increased abundance of Na⫹-K⫹ATPase pump units at the cell surface could be salutary to cells
with critically high levels of intracellular Na⫹ such as those
reported during ischemia-reperfusion (I-R) injury and may
result in protection against I-R-induced cell death (34, 35).
This hypothesis was tested in opossum kidney (OK) cells stably
expressing native or L499V-mutated forms of Na⫹-K⫹-ATPase
␣1 polypeptide exposed to substrate/coverslip-induced I-R.
METHODS
Cell Lines
OK cells stably expressing native and L499V-mutated forms of
Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 were used. Details on the experimental procedures related to expression vectors and site-directed mutagenesis,
heterologous expression, and initial characterization of Na⫹-K⫹ATPase enzyme properties in these cells can be found in Sottejeau et
al. (44).
Substrate and Coverslip-Induced Ischemia-Reperfusion
Ischemia was induced by removal of the substrate and placement of
a glass coverslip over a portion of the OK cell monolayers, as
described previously (38). Briefly, 70% confluent OK cells grown in
100-mm dishes were rinsed once with PBS and incubated in KrebsHenseleit (KH) buffer containing (in mmol/l) 118.0 NaCl, 4.0 KCl,
1.8 CaCl2, 1.3 KH2PO4, 1.2 MgSO4, 0.3 EGTA, 25 NaHCO3, and 37
D-glucose for 20 min at 37°C. Ischemia was then simulated by
replacing the KH buffer by PBS and placing two 22 ⫻ 44 mm
LifterSlips and one 22 ⫻ 63 mm LifterSlip (Thermo scientific) over
the cell monolayers for 30 min at 37°C. Reperfusion was initiated by
gentle removal of the LifterSlips and returned to KH buffer at 37°C.
For confocal imaging studies, OK cells were grown on square coverslip 22 ⫻ 22 mm (Fisher) in six-well plates, and I-R was induced as
described above using 18-mm diameter round glass coverslips
(Fisher).
Annexin V/Propidium Iodide Staining
At the end of the experimental protocol, OK cells were fixed in 2%
paraformaldehyde for 10 min at room temperature after a wash in PBS
1⫻. Cells were then incubated with Alexa Fluor 488 annexin V and
red fluorescent propidium iodide (PI) (Vybrant Apoptosis Assay Kit
no. 2, Invitrogen) according to the manufacturer’s recommendations.
The coverslips were mounted with ProLong Gold antifade reagent
with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen). Confocal images were captured by sequential scanning with no overlap using a
Leica TCS SP5 broadband confocal microscope system coupled to a
DMI 6000CS inverted microscope equipped with multiple continuous
wave lasers and a ⫻63/1.3 oil objective.
Measurement of Lactate Dehydrogenase Activity
At the end of a 60-min long reperfusion period, the cell incubation
buffer was collected and lactate dehydrogenase (LDH) activity was
determined colorimetrically using a standard assay (Cytotoxicity Detection Kit, Roche Applied Science), according to the manufacturer
recommendations.
Assessment of Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 Total Protein Abundance and
Surface Expression
Total abundance of the introduced rat ␣1 constructs was determined by electrophoresis and immunoblotting of proteins from cell
lysates using anti-NASE antibody as described (44). For total expression, equal loading of the samples among the lanes of the gel was
Table 2. Conserved dileucine motif of the form [D/E]XXXL[L/I] motif in Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 sequences in various species
Species
NCBI Access No.
[D/E]XXXL[L/I] Motif
Rattus norvegicus (rat)
Homo sapiens (human)
Dario rerio (zebrafish)
Ovis aries (sheep)
Mus musculus (mouse)
Sus scrofa (pig)
Bos taurus (cattle)
Canis familiaris (dog)
Gallus gallus (chicken)
NM_012504
NM_000701
NM_131686
NM_001009360
NM_144900
NM_214249
BC123864
NM_001003306
NM_205521
SIHK489NPNASEPKHL499LVMK
SIHQ492NPNSNNTESKHL504LVMK
SIHK487NANAGEPRHL497LVMK
SIHK487NPNTAEPRHL497LVMK
SIHK487NANAGEPRHL497LVMK
SIHK487NPNTSEPRHL497LVMK
SIHK487NANAGESRHL497LVMK
The conserved sequence of amino acid residues that form the dileucine motif appears in boldface.
AJP-Cell Physiol • VOL
300 • JANUARY 2011 •
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Using a Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 Structural Determinant of
Surface Abundance as a Target for Protection Against
Ischemia-Reperfusion Injury
Perspectives
C44
confirmed by probing with a commercial antibody against actin (Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Introduced ␣1 expressed at the
cell surface was detected by biotinylation following the recommended
procedures of Gottardi et al. (22), as we have recently reported in
detail (44). I-R-induced endocytosis of Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 units was
tested with a pulse– chase strategy as slightly modified from previous
studies (27, 44). Briefly, proteins expressed at the cell surface were
first biotinylated as described above, quenched with PBS– glycine
buffer, and rinsed twice with saline solution. The cells were then
incubated in DMEM medium for 20 min at 37°C in 10% CO2
followed by 30 min of ischemia and 30 min of reperfusion. The
remaining surface-bound biotin was then cleaved by treatment with 50
mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) reducing
agent for 15 min at 4°C.
Immunocytochemistry and Fluorescence Imaging
Fig. 1. Lactate dehydrogenase (LDH) released by ␣1- and ␣1-L499V-expressing opossum kidney (OK) cells exposed to ischemia followed by reperfusion.
LDH release was measured as an index of cell injury in the media of ␣1- and
␣1-L499V-expressing cells after 110 min Krebs-Henseleit (KH) buffer (C,
control, n ⫽ 6) or after 20 min KH/30 min substrate/coverslip-induced
ischemia/60 min KH (IR60: ischemia-reperfusion 60, n ⫽ 6). Values are
expressed as means ⫾ SE. ***P ⬍ 0.001 and **P ⬍ 0.01 vs. respective
controls; and #P ⬍ 0.05 vs. IR60 ␣1.
Statistical Analysis
RESULTS
with DAPI fluorescence, which excludes potential “false-positive” with cytoplasmic PI signal only (41)] were detected after
I-R. Specifically, 4 PI⫹ cells per 100 cells were detected in the
␣1-group after I-R, and 1 PI⫹ cell per 100 cells was detected
in the ␣1-L499V-expressing group.
Decreased Post-I-R Cell Death in Cells Expressing the Na⫹K⫹-ATPase ␣1-L499V Mutant
Increased Post-I-R Surface Abundance in Cells Expressing
the Na⫹-K⫹-ATPase ␣1L499V Mutant
Statistical analysis was conducted using one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison post hoc test. P ⬍ 0.05 was
considered statistically significant.
In vitro I-R was induced in OK cells by removing the
metabolic substrates from the culture medium and by placing
coverslips over the monolayer, according to the protocol of
Pitts and Tombs (38). Whereas all cells were exposed to
substrate depletion for 30 min, it is important to note that the
three LifterSlips represented about 57% of the surface of the
100-mm diameter dishes and hence did not cover the entire
monolayer. As shown in Fig. 1, this resulted in a significant
increase in LDH release in the media over the course of 60 min
of reperfusion (IR60), indicative of cell injury. The LDH
release by ␣1-expressing cells was comparable to that observed
in nontransfected OK cells (not shown) but was significantly
higher than the release measured in ␣1-L499V-expressing cells
exposed to the same I-R protocol. To further assess the I-Rinduced decreased cell viability and the comparatively lower
injury observed in the ␣1-L499V-expressing group, cells
grown on coverslips were exposed to control and I-R conditions as detailed in METHODS and stained with Alexa Fluor 488
annexin V to label apoptotic cells and red-fluorescent PI to
label late apoptotic/necrotic cells. The representative pictures
shown in Fig. 2 present qualitative evidence that 30 min of
substrate/coverslip-induced ischemia followed by 60 min of
reperfusion resulted in an increase in the annexin V⫹ population in ␣1-expressing cells that was more pronounced than the
increase produced in ␣1-L499V-expressing cells. A few PI⫹
cells defined as cells with nuclear PI signal [i.e., overlapping
With the use of biotinylation techniques, Na⫹-K⫹-ATPase
surface expression was compared in OK cells stably expressing
native and L499V Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 with or without exposure to 30 min ischemia and 5 min reperfusion (IR5). The data
presented in Fig. 3 confirmed our previously reported finding
that basal surface expression of Na⫹-K⫹-ATPase ␣1-units is
significantly higher in the mutant group without change in total
expression (44). After 5 min of reperfusion, total expression of
Na⫹-K⫹-ATPase ␣1-was unchanged (3B), but its surface expression was significantly decreased in both ␣1- and ␣1L499V Na⫹-K⫹-ATPase-expressing cells compared with their
respective controls. The I-R-induced decrease was about 25–
30% for both groups. As a result, the post-I-R surface expression in the ␣1-L499V-expressing cells was comparable to the
pre-I-R level in the ␣1-expressing group.
I-R Induces Internalization of Na⫹-K⫹-ATPase Units
The data collected from the biotinylation studies presented
in Fig. 3 suggested that I-R results in decreased abundance of
Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 units at the cell surface. To test whether
this was due to an increased internalization of Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 units during I-R, we compared Na⫹-K⫹-ATPase
removal from the cell surface using a cell surface biotinylation
and TCEP treatment (see METHODS) in ␣1-expressing cells in
control conditions (80 min pulse-chase aerobic buffer) or
exposed to the IR30 protocol (20 min aerobic buffer, 30 min
300 • JANUARY 2011 •
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At the end of the experimental protocol, cells were fixed by 20 min
incubation with ice-cold methanol, washed with PBS, and blocked
with Signal Enhancer (Invitrogen). The cells were then incubated with
a mouse anti-Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 monoclonal antibody (clone
C464.6, Upstate) in PBS containing 1% bovine serum albumin for 2
h at room temperature. After three washes with PBS, cells were
exposed to AlexaFluor 488-conjugated anti-mouse secondary antibody for 2 h at room temperature, washed, and mounted onto slides.
Image visualization was performed using a Leica TCS SP5 broadband
confocal microscope system coupled to a DMI 6000CS inverted
microscope.
Perspectives
C45
substrate/coverslip ischemia, 30 min aerobic buffer). As shown
in Fig. 4A, the amount of Na⫹-K⫹-ATPase internalized in 80
min was significantly increased in the IR30 group compared
with the control (P ⬍ 0.01). Immunofluorescent labeling of
Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 units before and after I-R was consistent
with increased intracellular signal after 30 min of reperfusion
(Fig. 4B).
DISCUSSION
In this article, we review the growing list of physiological
and pathological regulators of Na⫹-K⫹-ATPase surface abundance with emphasis on studies that explicitly tested the
involvement of defined regions or residues on the Na⫹-K⫹ATPase ␣1 polypeptide. We also report new findings on the
potential protective effect of manipulating Na⫹-K⫹-ATPase
surface abundance during I-R injury by targeting one of these
defined regions.
Regulation of Na⫹-K⫹-ATPase Cell Surface Abundance and
Structural Determinants on the ␣1-Subunit
The concept that membrane trafficking is an important
regulator of Na⫹-K⫹-ATPase is not a new one. In fact, early
studies like those of Lamb and Ogden in HeLa cells pointed
to CTS-induced changes in surface expression more than 30
years ago (28). Over the past two decades, this phenomenon
has been observed in many other models, and a considerable
amount of knowledge has been accumulated on the multiple
physiological and pathological regulators of Na ⫹-K ⫹ATPase surface abundance. Based on the results of our in
vitro study in OK cells presented in Figs. 3 and 4, we
propose that I-R be added to the growing list of those
regulators. Studies that identified regulators also provided
insights into the cellular pathways and compartments involved, but we are just beginning to understand the role of
structural determinants on Na⫹-K⫹-ATPase enzyme complex in the integrated response to a given stimulus. As
shown in Table 1, most of the determinants identified on the
␣1 polypeptide are located within the amino terminal part or
the large cytoplasmic loop of the molecule. Additional
determinants and mechanisms of regulation of surface abundance remain to be identified, and studies like those by
Kimura et al. on the regulation of Na⫹-K⫹-ATPase trafficking by arrestins and spinophilin (25) point to additional roles
for the large intracellular loop in particular.
I-R-Induced Decrease of Na⫹-K⫹-ATPase Cell Surface
Abundance
The results from this study are consistent with an I-Rinduced internalization of Na⫹-K⫹-ATPase units in OK cells.
As shown in Fig. 3, the extent of I-R-induced internalization is
300 • JANUARY 2011 •
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Fig. 2. Annexin V/propidium iodide (IP)
staining in Na⫹-K⫹-ATPase ␣1- and ␣1L499V-expressing OK cells exposed to ischemia followed by reperfusion. After treatment, fluorescent staining of Annexin V
(green), PI (red), and DAPI (blue) was performed as described in METHODS, and cells
were examined by fluorescence confocal microscopy. C, control (110 min KH); IR60, 20
min KH/30 min substrate/coverslip-induced
ischemia/60 min KH. Pictures are representative of at least 10 fields observed in 3 different
preparations for each condition in Na⫹-K⫹ATPase ␣1- and ␣1-L499V-expressing OK
cells. Scale bar ⫽ 25 ␮m.
Perspectives
C46
Mechanism of Protection Against I-R-Induced Injury
Fig. 3. Surface and total expression of Na⫹-K⫹-ATPase units in ␣1- and
␣1-L499V-expressing OK cells exposed to 30 min of substrate/coverslipinduced ischemia followed by 5 min of reperfusion. A: surface expression. Top,
typical immunoblot of biotinylated membrane proteins recovered by affinity
purification with streptavidin. Bottom, pooled data relative to basal expression
of wild-type ␣1 represented as means ⫾ SE (n ⫽ 8 –10). *P ⬍ 0.05 and
***P ⬍ 0.001 vs. control ␣1; ##P ⬍ 0.01 vs. C ␣1-L499V, and $$P ⬍ 0.01
vs. IR5 ␣1. B: total expression. Top, typical immunoblots of cell lysates probed
with antibodies specific for rat ␣1 and actin. Bottom, pooled data relative to
basal expression of wild-type ␣1, represented as means ⫾ SE (n ⫽ 8 –10). No
significant difference was found. IR5, exposed to 30 min coverslip-induced
ischemia followed by 5 min of reperfusion.
comparable in ␣1- and ␣1-L499V-expressing cells, suggesting
that the particular dileucine motif that we chose to mutate to
increase surface expression is not involved in I-R-induced
internalization itself, at least in this model. Although beyond
the scope of this study, an investigation of the role of intracellular mediators such as ROS and PKCs, as well as the clathrincoated pits network and the ubiquitin system in I-R-induced
internalization of Na⫹-K⫹-ATPases may reveal a great deal
about the underlying mechanism. Indeed, several of these
machineries and mediators have been shown to regulate hypoxia-induced Na⫹-K⫹-ATPase internalization as part of a
“phosphorylation-ubiquitination-recognition-endocytosis-degradation” (PURED) pathway (14, 15, 29) and are also important components of the cellular response during exposure to
I-R, especially in the heart (11, 16, 33, 39). In addition, studies
in cells expressing Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 mutated on Ser-18 or
one of the surrounding Lys (involved in hypoxia-induced
internalization as shown in Table 1) may prove useful in future
attempts to characterize the mechanism of I-R-induced internalization. Structural determinants may hence be instrumental
to future studies on the mechanism underlying I-R-induced
Na⫹-K⫹-ATPase internalization and its importance in I-Rinduced cell death.
Fig. 4. Internalization of Na⫹-K⫹-ATPase units in cells exposed to 30 min of
substrate/coverslip-induced ischemia followed by 30 min of reperfusion. After
treatment, assessment of the amount of endocytosed Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 units
and immunofluorescent staining of Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 were performed as
described in METHODS. A: endocytosed Na⫹-K⫹-ATPase. Inset, typical immunoblot of biotinylated endocytosed Na⫹-K⫹-ATPase ␣1 recovered by affinity
purification with streptavidin. Graph depicts the pooled data relative to control
represented as means ⫾ SE (n ⫽ 4). **P ⬍ 0.01 vs. control. B: pictures are
representative of 6 independent experiments for each condition. C, control (60
min without ischemia); IR30, 30 min substrate/coverslip-induced ischemia
followed by 30 min of reperfusion. Scale bar ⫽ 10 ␮M.
300 • JANUARY 2011 •
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According to the data presented in Figs. 1 and 2, an increased number of Na⫹-K⫹-ATPase units at the cell surface
correlates with an increased tolerance to I-R in ␣1-L499Vexpressing cells. However, these studies do not reveal the
underlying mechanism of protection. Additional Na⫹-K⫹-ATPase ion-pumping capacity at the cell surface may help preserve intracellular ion homeostasis during I-R, but studies like
our initial characterization of the ␣1-L499V mutant itself (44)
or the graded knockdown of ␣1 subunit (31) have shown that
surface expression does not necessarily correlate with increased ion-pumping function. In fact, other non-ion-pumping
functions of Na⫹-K⫹-ATPase may be involved, such as survival signaling or preservation of the integrity of intracellular
structures (7, 8, 45). Clearly, further investigation in cells
exposed to I-R is needed to clarify the relative contribution of
Na⫹-K⫹-ATPase ion-pumping and non-ion-pumping functions
in the protection afforded by increased cell surface expression.
In conclusion, a substantial number of studies have underscored the importance of surface abundance modulation in the
Perspectives
regulation of Na⫹-K⫹-ATPase function. In addition, a number
of structural determinants have been identified on the ␣-polypeptide, with variable degree of divergence among various ␣-isoforms and between different species. The exact role of these
variations in tissue- and species-specific response to various
stimuli and diseases remains to be established. The data presented here suggest that modulation of Na⫹-K⫹-ATPase cell
surface abundance by targeting structural determinants on the
␣-subunit has a significant impact on I-R-induced cell injury.
ACKNOWLEDGMENTS
The NASE antibody and plasmids used in this study are a gift from Dr.
Pressley (Texas Tech University, Lubbock, TX). We thank Drs. T. A. Pressley
and Z. J. Xie (University of Toledo College of Medicine, Toledo, OH) for
helpful discussion and input on the content of the paper.
GRANTS
DISCLOSURES
No conflicts of interest, financial or otherwise, are declared by the author(s).
REFERENCES
1. Aperia A. New roles for an old enzyme: Na,K-ATPase emerges as an
interesting drug target. J Intern Med 261: 44 –52, 2007.
2. Bagrov AY, Shapiro JI, Fedorova OV. Endogenous cardiotonic steroids:
physiology, pharmacology, and novel therapeutic targets. Pharmacol Rev
61: 9 –38, 2009.
3. Benziane B, Chibalin AV. Frontiers: skeletal muscle sodium pump
regulation: a translocation paradigm. Am J Physiol Endocrinol Metab 295:
E553–E558, 2008.
4. Bertorello AM, Sznajder JI. The dopamine paradox in lung and kidney
epithelia: sharing the same target but operating different signaling networks. Am J Respir Cell Mol Biol 33: 432–437, 2005.
5. Blanco G. Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for
tissue-specific ion regulation. Semin Nephrol 25: 292–303, 2005.
6. Blanco G, Mercer RW. Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in
structure, diversity in function. Am J Physiol Renal Physiol 275: F633–
F650, 1998.
7. Cai T, Wang H, Chen Y, Liu L, Gunning WT, Quintas LE, Xie ZJ.
Regulation of caveolin-1 membrane trafficking by the Na/K-ATPase. J
Cell Biol 182: 1153–1169, 2008.
8. Chen Y, Cai T, Wang H, Li Z, Loreaux E, Lingrel JB, Xie Z.
Regulation of intracellular cholesterol distribution by Na/K-ATPase. J
Biol Chem 284: 14881–14890, 2009.
9. Chen Z, Krmar RT, Dada L, Efendiev R, Leibiger IB, Pedemonte CH,
Katz AI, Sznajder JI, Bertorello AM. Phosphorylation of adaptor
protein-2 mu2 is essential for Na⫹,K⫹-ATPase endocytosis in response
to either G protein-coupled receptor or reactive oxygen species. Am J
Respir Cell Mol Biol 35: 127–132, 2006.
10. Chibalin AV, Ogimoto G, Pedemonte CH, Pressley TA, Katz AI,
Feraille E, Berggren PO, Bertorello AM. Dopamine-induced endocytosis of Na⫹,K⫹-ATPase is initiated by phosphorylation of Ser-18 in the rat
alpha subunit and Is responsible for the decreased activity in epithelial
cells. J Biol Chem 274: 1920 –1927, 1999.
11. Churchill EN, and Mochly-Rosen D. The roles of PKCdelta and epsilon
isoenzymes in the regulation of myocardial ischaemia/reperfusion injury.
Biochem Soc Trans 35: 1040 –1042, 2007.
12. Comellas AP, Kelly AM, Trejo HE, Briva A, Lee J, Sznajder JI, Dada
LA. Insulin regulates alveolar epithelial function by inducing Na⫹/K⫹ATPase translocation to the plasma membrane in a process mediated by
the action of Akt. J Cell Sci 123: 1343–1351, 2010.
13. Cotta-Done S, Leibiger IB, Efendiev R, Katz AI, Leibiger B, Berggren
PO, Pedemonte CH, Bertorello AM. Tyrosine 537 within the Na⫹,K⫹ATPase alpha-subunit is essential for AP-2 binding and clathrin-dependent
endocytosis. J Biol Chem 277: 17108 –17111, 2002.
14. Dada LA, Chandel NS, Ridge KM, Pedemonte C, Bertorello AM,
Sznajder JI. Hypoxia-induced endocytosis of Na,K-ATPase in alveolar
epithelial cells is mediated by mitochondrial reactive oxygen species and
PKC-zeta. J Clin Invest 111: 1057–1064, 2003.
15. Dada LA, Welch LC, Zhou G, Ben-Saadon R, Ciechanover A,
Sznajder JI. Phosphorylation and ubiquitination are necessary for
Na,K-ATPase endocytosis during hypoxia. Cell Signal 19: 1893–1898,
2007.
16. Downey JM. Free radicals and their involvement during long-term
myocardial ischemia and reperfusion. Annu Rev Physiol 52: 487–504,
1990.
17. Efendiev R, Budu CE, Bertorello AM, Pedemonte CH. G-proteincoupled receptor-mediated traffic of Na,K-ATPase to the plasma membrane requires the binding of adaptor protein 1 to a Tyr-255-based
sequence in the alpha-subunit. J Biol Chem 283: 17561–17567, 2008.
18. Ewart HS, Klip A. Hormonal regulation of the Na⫹-K⫹-ATPase: mechanisms underlying rapid and sustained changes in pump activity. Am J
Physiol Cell Physiol 269: C295–C311, 1995.
19. Garty H, Karlish SJ. Role of FXYD proteins in ion transport. Annu Rev
Physiol 68: 431–459, 2006.
20. Geering K. Function of FXYD proteins, regulators of Na, K-ATPase. J
Bioenerg Biomembr 37: 387–392, 2005.
21. Geering K. Functional roles of Na,K-ATPase subunits. Curr Opin Nephrol Hypertens 17: 526 –532, 2008.
22. Gottardi CJ, Dunbar LA, Caplan MJ. Biotinylation and assessment of
membrane polarity: caveats and methodological concerns. Am J Physiol
Renal Fluid Electrolyte Physiol 268: F285–F295, 1995.
23. Kaplan JH. Biochemistry of Na,K-ATPase. Annu Rev Biochem 71:
511–535, 2002.
24. Khundmiri SJ, Bertorello AM, Delamere NA, Lederer ED. Clathrinmediated endocytosis of Na⫹,K⫹-ATPase in response to parathyroid
hormone requires ERK-dependent phosphorylation of Ser-11 within the
alpha1-subunit. J Biol Chem 279: 17418 –17427, 2004.
25. Kimura T, Allen PB, Nairn AC, Caplan MJ. Arrestins and spinophilin
competitively regulate Na⫹,K⫹-ATPase trafficking through association
with a large cytoplasmic loop of the Na⫹,K⫹-ATPase. Mol Biol Cell 18:
4508 –4518, 2007.
26. Kirchhausen T. Adaptors for clathrin-mediated traffic. Annu Rev Cell
Dev Biol 15: 705–732, 1999.
27. Klisic J, Zhang J, Nief V, Reyes L, Moe OW, Ambuhl PM. Albumin
regulates the Na⫹/H⫹ exchanger 3 in OKP cells. J Am Soc Nephrol 14:
3008 –3016, 2003.
28. Lamb JF, Ogden P. Internalization of ouabain and replacement of sodium
pumps in the plasma membranes of HeLa cells following block with
cardiac glycosides. Q J Exp Physiol 67: 105–119, 1982.
29. Lecuona E, Trejo HE, Sznajder JI. Regulation of Na,K-ATPase during
acute lung injury. J Bioenerg Biomembr 39: 391–395, 2007.
30. Li Z, Xie Z. The Na/K-ATPase/Src complex and cardiotonic steroidactivated protein kinase cascades. Pflügers Arch 457: 635–644, 2009.
31. Liang M, Tian J, Liu L, Pierre S, Liu J, Shapiro J, Xie ZJ. Identification of a pool of non-pumping Na/K-ATPase. J Biol Chem 282:
10585–10593, 2007.
32. Liu J, Shapiro JI. Regulation of sodium pump endocytosis by cardiotonic
steroids: molecular mechanisms and physiological implications. Pathophysiology 14: 171–181, 2007.
33. Misra MK, Sarwat M, Bhakuni P, Tuteja R, Tuteja N. Oxidative stress
and ischemic myocardial syndromes. Med Sci Monit 15: RA209 –RA219,
2009.
34. Murphy E, Eisner DA. Regulation of intracellular and mitochondrial
sodium in health and disease. Circ Res 104: 292–303, 2009.
35. Murphy E, Steenbergen C. Ion transport and energetics during cell death
and protection. Physiology (Bethesda) 23: 115–123, 2008.
36. Pierre SV, Xie Z. The Na,K-ATPase receptor complex: its organization
and membership. Cell Biochem Biophys 46: 303–316, 2006.
37. Pierre SV, Yang C, Yuan Z, Seminerio J, Mouas C, Garlid KD,
Dos-Santos P, Xie Z. Ouabain triggers preconditioning through activation
of the Na⫹,K⫹-ATPase signaling cascade in rat hearts. Cardiovasc Res
73: 488 –496, 2007.
38. Pitts KR, Toombs CF. Coverslip hypoxia: a novel method for studying
cardiac myocyte hypoxia and ischemia in vitro. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 287: H1801–H1812, 2004.
39. Powell SR, Divald A. The ubiquitin-proteasome system in myocardial
ischaemia and preconditioning. Cardiovasc Res 85: 303–311.
300 • JANUARY 2011 •
www.ajpcell.org
This work was supported by National Heart Lung Blood Institute Grant
HL-36573. Y. Sottejeau is a Conventions Industrielles de Formation par la
REcherche (CIFRE) fellow of the French National Agency for Technological
Research (ANRT).
C47
Perspectives
C48
40. Prassas I, Diamandis EP. Novel therapeutic applications of cardiac
glycosides. Nat Rev Drug Discov 7: 926 –935, 2008.
41. Rieger AM, Hall BE, Luong le T, Schang LM, Barreda DR. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant
number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J
Immunol Methods 358: 81–92.
42. Schoner W, and Scheiner-Bobis G. Endogenous and exogenous cardiac
glycosides: their roles in hypertension, salt metabolism, and cell growth.
Am J Physiol Cell Physiol 293: C509 –C536, 2007.
43. Skou JC. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim Biophys Acta 23: 394 –
401, 1957.
44. Sottejeau Y, Belliard A, Duran MJ, Pressley TA, Pierre SV. Critical
role of the isoform-specific region in alpha1-Na,K-ATPase trafficking and
protein Kinase C-dependent regulation. Biochemistry 49: 3602–3610.
45. Tian J, Li X, Liang M, Liu L, Xie JX, Ye Q, Kometiani P,
Tillekeratne M, Jin R, Xie Z. Changes in sodium pump expression
dictate the effects of ouabain on cell growth. J Biol Chem 284:
14921–14929, 2009.
46. Welch LC, Lecuona E, Briva A, Trejo HE, Dada LA, Sznajder JI.
Extracellular signal-regulated kinase (ERK) participates in the hypercapnia-induced Na,K-ATPase downregulation. FEBS Lett.
47. Xie Z, Cai T. Na⫹-K⫹–ATPase-mediated signal transduction: from
protein interaction to cellular function. Mol Interv 3: 157–168, 2003.
48. Xie Z, Xie J. The Na/K-ATPase-mediated signal transduction as a target
for new drug development. Front Biosci 10: 3100 –3109, 2005.
49. Yudowski GA, Efendiev R, Pedemonte CH, Katz AI, Berggren PO,
Bertorello AM. Phosphoinositide-3 kinase binds to a proline-rich motif in
the Na⫹,K⫹-ATPase alpha subunit and regulates its trafficking. Proc Natl
Acad Sci USA 97: 6556 –6561, 2000.
300 • JANUARY 2011 •
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Résultats
III Etude de la Na+, K+-ATPase lors de ischémie reperfusion dans les
cellules cardiaques
1
Données supplémentaires
Cette étude a pour but de reproduire dans un modèle cellulaire d'ischémie/reperfusion
la protection d’un processus de préconditionement par l’ouabaïne (ouabaïne
preconditioning OPC) obtenue sur cœur isolé perfusé [171]. Nous avons étudié la Na+,
K+-ATPase durant cette protection après trente minutes de reperfusion. Pour cela, la
technique mixte d’absence de substrat couplée à une hypoxie ("Substrate and
Coverslip hypoxia") a été utilisée pour mimer l'ischémie. Des indicateurs de mort
cellulaire ont été mesurés (LDH, Annexin V/PI) sur les cellules primaires de
cardiomyocytes de rats néonataux. Afin d'étudier la Na+, K+-ATPase pendant
l'ischémie/reperfusion avec un préconditionement à l’ouabaïne, nous avons quantifié
la présence de la Na+, K+-ATPase membranaire, ainsi que son activité enzymatique
membranaire et totale.
Les résultats obtenus pour les LDH et les marquages Annexin V/PI démontrent une
protection par le processus OPC sur la mort cellulaire. Cette protection est dépendante
de l’activité PKCİ puisque que l'utilisation d'un inhibiteur de cette PKC abolit la
protection OPC durant l'ischémie/reperfusion. Les effets sur l'activité totale de la Na+,
K+-ATPase démontrent que l'ischémie/reperfusion induit une diminution de l'activité
de l'enzyme et que celle-ci est abolie par le processus de l’OPC. Cet effet est obtenu
sans changement à la surface membranaire de l’activité de transport mesurée par le
flux de rubidium entre les groupes contrôle, Ischémie/reperfusion et OPC. En étudiant,
où se situe la Na+, K+-ATPase après 30 minutes d'ischémie et 30 minutes de
reperfusion par immunoflurescence et biotinylation, on s'aperçoit que la protéine Na+,
K+-ATPase est moins présente à la surface de la membrane que le groupe contrôle qui
n'a pas subit d'ischémie alors que pour le groupe OPC, cette quantification est
identique au groupe contrôle. Ces données confirment les résultats obtenus dans des
cellules
rénales
démontrant
l'endocytose
de
la
Na+,
K+-ATPase
par
l'ischémie/reperfusion [291]. Afin de confirmer la corrélation entre la protection de la
Yoann Sottejeau
135
Résultats
présence de la Na , K -ATPase à la surface et la protection des effets de
+
+
l'ischémie/reperfusion sur la mort cellulaire, le mutant Į1-L499V a été transfecté
transitoirement sur les cellules primaires de cardiomyocytes de rats néonataux. En
comparaison à l' Į1 transfecté, le mutant Į1-L499V réduit la libération de LDH. Cette
étude démontre l'importance de conserver la Na+, K+-ATPase à la surface
membranaire pendant la reperfusion et caractérise l'action du processus OPC et de
l'ischémie/reperfusion sur la Na+, K+-ATPase.
Ces données sont en cours de soumission à Journal of Molecular and Cellular
Cardiology. Elles sont présentées sous la forme du manuscript refusé à Circulation
Research.
Yoann Sottejeau
136
Page 1
Modulation of cardiac Na+,K+-ATPase surface expression and cell viability by
Ischemia/Reperfusion Injury and Ouabain Preconditioning
Aude Belliard*, Yoann Sottejeau*, Qiming Duan, and Sandrine V. Pierre
Department of Physiology and Pharmacology, College of Medicine, University of Toledo, 3035 Arlington
Avenue, Toledo, OH 43614-5804, USA.
*These authors contributed equally to the work.
Corresponding author: Dr. Sandrine V. Pierre, Department of Physiology and Pharmacology, University
of Toledo College of Medicine, Health Science Campus, 3000 Arlington Avenue, Toledo, OH 436142598
Phone number: 419 383 4182/4150
Fax number: 419 383 2871
e-mail: [email protected]
Running Title: Ouabain Preconditioning and cardiac Na+,K+-ATPase
word count: 6400.
subject codes: [4]
Page 2
ABSTRACT
Rationale: A recent report shows that cell surface abundance of the Na+,K+-ATPase Į1 polypeptide
influences epithelial cell survival in response to ischemia-reperfusion (IR) injury. The importance of this
phenomenon has not been investigated in cardiac IR injury.
Objective: The impact of cardiac Na+,K+-ATPase surface expression in cell survival after ischemia was
investigated in a cellular model of IR and ouabain-induced preconditioning (OPC).
Methods and Results: Rat neonatal cardiac myocytes (NCM) were subjected to 30 minutes of
substrate/coverslip ischemia followed by 30 min of reperfusion. This significantly compromised cell
viability as documented by LDH release and Annexin V/PI staining. Total Na+,K+-ATPase Į-polypeptide
expression remained unchanged, but cell surface biotinylation and immunostaining studies revealed that
Na+,K+-ATPase cell surface abundance was significantly decreased. Na+,K+-ATPase-activity and in situ
86
Rb+ transport were both significantly altered by about 30%. Exposure to ouabain preconditioning
increased cell viability by about 40% in a PKCH-dependent manner, comparable to the protective effect
previously reported in intact heart preparations. OPC completely prevented IR-induced modulation of
Na+,K+-ATPase activity and surface expression. However, OPC failed to prevent the IR-induced decrease
of in situ 86Rb+ transport, suggesting that the increased viability was not conferred by an increased
Na+,K+-ATPase-mediated ion transport capacity at the cell membrane. Consistent with this observation,
transient expression of a mutant form of Na+,K+-ATPase Į1 that was previously shown to have increased
surface abundance without increased ion transport activity successfully reduced IR-induced cell death.
Conclusions: These results suggest that maintenance of Na+,K+-ATPase cell surface abundance is critical
to myocyte survival after an ischemic attack and plays a role in OPC-induced protection. They further
suggest that the protection conferred by increased surface expression is independent of ion transport.
Keywords: Heart, Rubidium uptake, surface expression, alpha isoform,
Page 3
INTRODUCTION
Na+,K+-ATPase is a membrane-spanning enzyme complex that both establishes and maintains the
electrochemical gradient across the plasma membrane of animal cells by coupling the hydrolysis of ATP
to the transport of Na+ and K+ ions1, 2. The Na+,K+-$73DVHFRQVLVWVRIGLVVLPLODUĮDQGȕVXEXQLWVZKLFK
exist as multiple isoforms and are expressed in a tissue-specific manner. Alpha1 is the predominant
LVRIRUPDERXWRIWKHFDWDO\WLFĮ-subunit expressed in cardiac tissue3. The Na+,K+-ATPase protein
complex is the pharmacological target of the digitalis drugs used in the treatment of heart failure and
atrial arrhythmia4. Digitalis and its variants are believed to act through their inhibition of Na+,K+-ATPase
ion-pumping function, with a subsequent decrease in Na+/Ca2+ exchange and an increase in contractility.
However, digitalis drugs like digoxin or ouabain also initiate intracellular signaling cascades via
stimulation of the Na+,K+-ATPase receptor function. Activation of these cascades are the consequence of
digitalis-induced interactions of Na+,K+-ATPase with neighboring membrane proteins such as Src,
epidermal growth factor receptor (EGFR), and caveolin5-7. These interactions result in the activation of
key downstream players such as Akt, PKCH or ERK1/2 that are critical to additional cardiac effects of
digitalis, such as preconditioning, physiological hypertrophy, and regulation of gene transcription8-12.
Na+,K+-ATPase integrity at the cell surface of the cardiac myocyte is therefore critical for the
maintenance of ion homeostasis, requiring about 40% of the resting ATP consumption13. Na+,K+-ATPase
is also key to effective transmission of the digitalis signal and subsequent functional effects. It follows
that the localization of Na+,K+-ATPase at the cell surface is important to both ion-pumping and signaling
functions, and we have recently reviewed examples of modulation of cellular Na+,K+-ATPase activity
through changes in cell surface expression in response to major physiological or pathophysiological
stimuli14. Among them, we found that ischemia/reperfusion (IR) induces Na+,K+-ATPase internalization
in epithelial cells. Furthermore, increasing Na+,K+-ATPase membrane abundance by expressing a mutated
IRUPRILWVFDWDO\WLFĮ-subunit resulted in a significant decrease in IR-induced cell death14.
In the heart, IR-induced alteration of the Na+,K+-ATPase enzyme is well documented15-21, and elucidation
of the underlying mechanism involved is considered key to the development of novel approaches for
therapeutic intervention22, 23. Surprisingly, however, the precise sequence of events remains incompletely
understood, and the role played by surface abundance of the enzyme complex is not known. Contributing
to our relative lack of understanding may be the technical limitations of intact heart preparations. It is
challenging, for example, to measure Na+,K+-ATPase ion-transporting expression and function in situ,
particularly at the level of the individual cell. To address specifically the role of Na+,K+-ATPase surface
abundance in IR injury and in cardiac protection, the present study uses a cell culture model, which
provides complementary approaches to our previous studies in Langendorff- perfused hearts. Using
primary cultures of rat neonatal cardiac myocytes, we developed a model of IR injury and protection by
ouabain preconditioning (OPC) with characteristics comparable to what we have previously reported in
the whole heart11, 12, 24. In this model, we present evidence that Na+, K+-ATPase cell surface abundance is
modulated by IR and OPC, and can be targeted to increase myocyte survival in the face of an ischemic
attack. Because the protection occurs even in the absence of restoration of Na+,K+-ATPase -mediated
ion-transport capacity in situ, we propose that this mechanism of protection is mediated through the
maintenance/restoration of one or several of the non-ion pumping functions of Na+, K+-ATPase at the cell
surface.
Page 4
MATERIAL AND METHODS
Neonatal Cardiac Myocytes (NCM) isolation
Primary cultures of neonatal contractile cardiac myocytes were isolated from the ventricles of 1-or 2days-old rats, as described previously25, 26 and were incubated in serum-free medium 48 hours prior to
experimentation. Transient transfections of native and mutated Na+, K+-ATPase Į SRO\SHSWLGHV were
performed after one day of culture using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 2 μg of plasmid / 2ml
media / 35 mm well, according to the manufacturer's recommendations.
Coverslip-induced Ischemia/Reperfusion in NCM
Ischemia was induced in NCM by placement of a glass LifterSlip over the cell monolayers and removal
of substrate, as slightly modified from previously described procedures14, 27, 28. Briefly, a 22x63 and two
22x44 LifterSlips (Thermo scientific, USA) were delicately placed over the NCM monolayer in a 100mm diameter dish, resulting in coverage of about 57% of the monolayer. In addition, changes in substrate
were performed to mimic those that occur during ischemia and reperfusion, using Krebs-Henseleit buffer
and phosphate buffered saline (PBS) PBS as detailed in the next sub-section (under “Protocols”). For
confocal imaging studies, NCM were grown on square coverslips (22x22 mm, Fisher) in 6-well plates,
and I/R was induced as described above using 18-mm diameter round glass coverslips (Fisher). For 86Rb+
uptake studies, NCM were cultured in collagen-coated 6-well plates, and round coverslips (25 mm Fisher)
were used to induce I/R.
Protocols
All treatments were performed at 37°C under a 5% CO2 atmosphere. Six groups were studied as depicted
in figure 1. The control group (C) was incubated 80 minutes in Krebs-Henseleit (KH) solution containing
(in mmol/L) NaHCO3 (25), KCl (4.0), MgSO4 (1.2), D-glucose(11), NaCl (118.0), KH2PO4 (1.3),
Ethylene glycolbis (2-aminoethylether)-N, N, Nƍ 1ƍ -tetraacetic acid (0.3), CaCl2 (1.8)12 at 37°C. The
ischemia-reperfusion group (IR) was incubated 20 minutes in KH, subjected to coverslip ischemia in PBS
for 30 min, and then “reperfused” upon gentle removal of the LifterSlips and a change of media back to
fresh oxygenated KH buffer for 30 min. The ouabain-preconditioned group (OPC) was incubated 8
minutes with KH buffer followed by 4 minutes of incubation with ouabain (10 μmol/L) and 8 minutes of
KH before inducing 30 minutes of coverslip ischemia in PBS and reperfusion for 30 min. In some
experiments, the PKCİ translocation inhibitor (TIP, 5μmol/L) was added during the first 20 minutes of
the protocol (Figure 1).
Measurement of Lactate Dehydrogenase (LDH) activity
The amount of LDH released in the culture media after 30 minutes of reperfusion was used as an indicator
of loss of cellular integrity and measured according to a procedure slightly modified from Pierre et al
(2011)14. Briefly, following the 30 minute-long reperfusion period, NCM incubation buffer (KH) was
collected and LDH activity was determined colorimetrically using a standard assay (Cytotoxicity
Detection Kit, Roche Applied Science), according to the manufacturer’s recommendation. To evaluate the
extent of the injury as a percent of the total cell population, LDH was also measured in a subset of
experiments in lysates obtained by treatment of the monolayer with 0.1% Triton X-100 at 4°C for 30
minutes at the end of the various protocols. Total LDH was obtained as the sum of LDH released in the
media and LDH in the cell lysates.
Annexin V/PI Staining
At the end of the experimental protocol, NCM were fixed in 2% paraformaldehyde for 10 minutes at
room temperature after a wash in PBS. Cells were then incubated with Alexa Fluor 488 annexin V and
red fluorescent propidium iodide (PI) (Vybrant Apoptosis Assay Kit no. 2, Invitrogen) according to the
manufacturer's recommendations. The coverslips were mounted with ProLong Gold antifade reagent with
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen). Confocal images were captured by sequential scanning
Page 5
with no overlap using a Leica TCS SP5 broadband confocal microscope system coupled to a DMI
6000CS inverted microscope equipped with multiple continuous wave lasers and a ×63/1.3 oil objective.
Assessment of Na+,K+-ATPase Į7RWDO3URWHLQ$EXQGDQFHDQG6XUIDFH([SUHVVLRQ
Total abundance of Na+,K+-ATPase ĮSURWHLQZDVGHWHUPLQHGE\HOHFWURSKRUHVLVDQGLPPXQREORWWLQJ of
cell lysates using anti-NASE antibody as described 29 . Na+,K+-ATPase ĮH[SUHVVHGDWWKHFHOOVXUIDFH
was detected by biotinylation following the recommended procedures of Gottardi et al. 30.
Immunocytochemistry and Fluorescence Imaging.
At the end of the experimental protocol, cells were fixed by 20 minutes incubation with ice-cold
methanol, washed with PBS, and blocked with Signal Enhancer (Invitrogen). The cells were then
incubated with a mouse anti-Na+,K+-$73DVH Į PRQRFORQDO DQWLERG\ FORQH & 8SVWDWH LQ 3%6
containing 1% bovine serum albumin for 2 hours at room temperature. After three PBS washes, cells were
exposed to AlexaFluor 488-conjugated anti-mouse secondary antibody for 2 hours at room temperature,
washed, and mounted onto glass slides. Image visualization was performed using a Leica TCS SP5
broadband confocal microscope system coupled to a DMI 6000CS inverted microscope14.
Active transport. At the end of the 80 minutes incubation according to the protocols described in Figure
1, Na+,K+-ATPase-mediated transport was assessed by measuring the ouabain-sensitive uptake of the K+
congener, 86Rb+, as described31 with minor modifications.
Na+, K+-ATPase activity
NCM homogenates were prepared and exposed to alamethicin (0.5mg/mg protein) for 10 minutes prior to
ATPase measurement as previously described 32. The ionophore, alamethicin, was used to insure access of
substrates and inhibitor to both the ATP- and ouabain-binding sites in the closed membrane vesicles that
form in crude homogenates, as published previously 32.
Fluorescence microscopy
After 24 h, the number of NCM successfully expressing the YFP-WDJJHGĮDQGĮ/9SRO\SHSWLGHV
was evaluated using inverted fluorescence microscopy (Olympus IX51, Japan).
Statistical analysis between control and treated groups were conducted using a one-way ANOVA
followed by Tukey’s multiple comparison post hoc test. P<0.05 was considered statistically significant.
Page 6
RESULTS
Effect of Ischemia/Reperfusion and ouabain preconditioning on myocyte viability
In vitro IR was induced in NCM by removing the metabolic substrates from the culture medium and by
placing coverslips over the monolayer, according to a protocol modified from Pitts and Toombs28 that we
have recently used on epithelial cells14 . Myocytes were exposed to control (C), IR, or OPC protocols as
described in Figure 1, and cell viability was assessed quantitatively (LDH release) and qualitatively
(AnnexinV/PI labeling).
To evaluate the extent of injury produced by this model, we first assessed the “released LDH/ total LDH”
ratio, where released LDH represents the population of cells with a loss of membrane integrity and total
LDH represents the total cell population. As shown in figure 2A, IR resulted in a consistent and
significant increase of the ratio, indicative of a loss of viability of the IR-exposed cells. Since the bulk of
this release most likely originated from the 57% of cells under the lifterslip, we estimated that the area
covered by cells with compromised viability represented about 25-30% of the area at risk. OPC
significantly reduced the “released LDH/total LDH” ratio, by about 24% (P<0.01).
We have reported previously that OPC-induced protection against IR injury in the whole heart requires
PKCH translocation12. To test whether this occurred in the cardiac myocytes, we used a PKCH
translocation inhibitory peptide (TIP). Since intragroup variation in the “released LDH/total LDH” ratio
was found to be minimal in all conditions (Figure 2A), released LDH only was examined in these series
of experiments. As shown in figure 2B, treatment with 20 minutes of TIP did not affect LDH release in
control or IR-exposed groups, but completely abolished the OPC-induced protection.
Cell injury and protection was further assessed in NCM that were grown on coverslips and stained with
Alexa Fluor 488 annexin V to label apoptotic cells and red-fluorescent propidium iodide (PI) to label late
apoptotic/necrotic cells following exposure to the different protocols. Pictures representative of the
observations made at the center of the area covered by the coverslip (core) are shown in Figure 2C and
present qualitative evidence that IR resulted in a marked increase in the annexin V+/PI+ population. OPC
completely prevented IR effects in a PKCH-dependent manner, as suggested by the TIP-induced abolition
of OPC protection (Figures 2B and 2C). Taken together, these data suggest that our previous findings of
IR-induced injury and protection by OPC in the Langendorff-perfused rat heart could be recapitulated in
this in vitro model. Accordingly, the IR-induced injury model in NCM was used in the following studies
of Na+,K+-ATPase function and expression.
Effect of Ischemia/Reperfusion and ouabain preconditioning on Na+,K+-ATPase function and
expression
Cell Surface Abundance. To test whether IR affected the surface expression of the Na+,K+-ATPase ĮO
polypeptide in myocytes (as found recently in epithelial cells14), we conducted a series of experiments
using cell-surface biotinylation as detailed in Methods $V VKRZQ LQ ILJXUH $ LPPXQRGHWHFWLRQ RI ĮO
revealed that surface abundance in the IR-exposed cells was decreased by about 30% compared to control
(P<0.05), and this decrease was completely prevented by OPC. Immunofluorescent labeling of Na+,K+ATPase Į1 in NCM exposed to control or IR protocols was also consistent with an increased intracellular
signal after 30 minutes of reperfusion (Figure 3C) that was prevented by OPC treatment. As shown in
figure 3B, IR and OPC did not induce any detectable change in total Na+,K+-ATPase Įexpression. In
DGGLWLRQ WR Į Į EXW QRWĮ Zas detected in control NCM (not shown), in agreement with a previous
report (33). ,5RU23&GLGQRWLQGXFHDQ\GHWHFWDEOHFKDQJHLQĮWRWDOSURWHLQOHYHOV (not shown). Taken
together, these results suggest that although IR had no effect on overall Na+,K+-ATPase Į-subunit
expression, it resulted in a decreased number of enzyme complexes at the plasmalemma. The results also
suggest that OPC prevented IR-induced modulation.
In situ Na+,K+-ATPase-mediated 86Rb+ uptake. To assess functionally the impact of IR- and OPCinduced modulations of surface abundance on cellular Na+,K+-ATPase-mediated ion transport capacity, in
situ 86Rb+ uptake was evaluated in the presence of the ionophore monensin, conditions that minimize the
possible effect of variations in intracellular sodium. The results presented in figure 4 indicated that IR
Page 7
significantly reduced the uptake (27±3%, P<0.001) compared to control. Somewhat surprisingly,
although OPC prevented the IR-induced decrease in cell surface abundance, it did not prevent the
decrease in Na+,K+-ATPase-mediated 86Rb+ uptake.
Na+,K+-ATPase activity. The results above suggest that some of the Na+,K+-ATPase units at the cell
surface were not transporting ions in the OPC group. A possible explanation for this was that OPC
prevented IR-induced internalization but not IR-induced inactivation of the enzyme function. To explore
this possibility, we measured maximal ouabain-sensitive Na+,K+-ATPase activity in the presence of
saturating concentrations of substrates and inhibitor. Alamethicin pre-treatment was performed to insure
access of substrates and inhibitor to their respective binding sites on the enzyme despite potentially-closed
membrane vesicles, as reported previously32. The results shown in figure 5 suggest that IR decreased
Na+,K+-ATPase activity by about 28% (P<0.001), and that this decrease was completely prevented by
OPC (P<0.01), in a PKCH-dependent manner.
Effect of increased Na+,K+-ATPase surface expression on cardiomyocyte viability during IschemiaReperfusion
The above-mentioned results suggest that preservation of Na+,K+-ATPase cell surface abundance, rather
than ion transport, correlated with protection against IR-induced cell death by OPC. This is consistent
with our previous observation that expression of a L499V mutant of the Na+,K+-$73DVHĮSRO\SHSWLGH
in epithelial cells resulted in increased surface expression without change in 86Rb+ uptake29 and conferred
resistance to IR injury14. Hence, to directly evaluate the impact of cell surface expression on cardiac
myocyte viability during IR, we transiently transfected NCM with the native ĮSRO\SHSWLGH or the L499V
mutant%RWKĮDQGĮ/9ZHUHYFP- tagged at the C-terminus. The tag did not induce any detectable
change in enzymatic activity (not shown), and allowed us to immunologically discriminate the exogenous
ĮFRQVWUXFWVIURPWKHHQGRJHQRXVĮFull length expression of both constructs was verified by western
blotting using an anti-GFP antibody (not shown) and transfection efficiency was estimated by
visualization under a fluorescent microscope prior to exposure to IR. As shown in figure 6A, a similar
efficiency of about 40% was observed IRU ERWK Į-YFP and Į/9-YFP constructs. However, IRinduced LDH release was significantly decreased in NCM transiently expressing the Na+,K+-ATPase
Į/9- <)3PXWDQWFRPSDUHGWR1&0H[SUHVVLQJĮ-YFP, by about 45% (P<0.01, figure 6B).
Page 8
DISCUSSION
Using a modification of a recently described model of in vitro Ischemia/Reperfusion (IR) injury14, 27 in rat
neonatal cardiac myocytes, we obtained evidence that Na+, K+-ATPase cell surface abundance is
modulated by IR and ouabain preconditioning (OPC) and that OPC can be used to increase myocyte
survival following an ischemic attack. Because the protection occurred even in the absence of restoration
of Na+,K+-ATPase-mediated ion-transport in situ, we propose that this mechanism of protection is
mediated through the maintenance of one or more of the non-ion pumping functions of Na+, K+-ATPase
at the cell surface.
Characterization of the in vitro Model
In 2004, Pitts and Toombs first proposed a novel method for creating regional ischemic conditions in
primary cultures of neonatal rat cardiac myocytes (NCM)28. The unique aspect of the method, which was
applied in the present study, consisted of creating a localized diffusion barrier by placing a glass coverslip
over a portion of the monolayer. In our modified version of this protocol, the coverslip was carefully
removed after 30 minutes and fresh media was added back to the monolayer for an additional 30 minutes,
to simulate reperfusion. As shown in figure 1, these interventions were designed to mimic the
combination of metabolic disturbances and hypoxic conditions of our previous studies of IR and OPC in
Langendorff-perfused rat hearts12. The results presented in figure 1 indicate that the extent of the injury
produced was indeed comparable (40% of the area at risk after 2h of reperfusion in the whole heart model
vs 30% of the myocytes under the coverslip in the present study). Another indication that this in-vitro
model was well suited for the present study was the protection provided by OPC (figures 2A-C). This is a
critical result for two reasons. First, it confirms microscopic observations and total LDH release
measurements (not shown) indicating that the injury observed in the IR group was not the result of a
mechanical insult induced by manipulation of the coverslip. Second, it shows for the first time that OPC
signaling occurs in and directly protects the cardiac myocyte. Indeed, because of the ubiquitous
expression of the Na+,K+-ATPase receptor complex, ouabain signaling may occur in any cardiac cell and
contribute to the protection observed in the whole heart in earlier studies. Without excluding other effects
of fibroblastic or vascular origin for example, the results of the present study clearly show that OPC
occurs in cardiac myocytes independently of the presence of any other cell type. This is hardly a unique
case among preconditioning mechanisms, and in fact many forms of protection have been shown in IR
models in cardiac myocyte monolayers. Such examples include ischemic-, hypoxic-, and opioid-induced
preconditionings34-36. The results presented in figures 2B and 2C also show that OPC-induced protection
in cardiac mycocytes requires PKCH activation, consistent with our previous finding in whole hearts11, 12,
and as previously demonstrated for hypoxic preconditioning in neonatal cardiac myocytes 36.
IR-induced alteration of Na+,K+-ATPase and OPC-induced protection
Since Beller et al. first correlated post-ischemic alterations in cardiac glycoside binding to decreased
Na+,K+-ATPase activity in dog myocardium in 197615, numerous studies have examined the mechanisms
leading to cardiac Na+,K+-ATPase alteration during IR 15-21. Indeed, alteration of Na+,K+-ATPase during
myocardial infarction may render the myocardial tissue more sensitive to the arrhythmogenic effect of
digitalis, and uncertainties surrounding their safety in heart failure patients with an ischemic origin have
contributed to the decrease in digitalis use despite their unique hemodynamic and neurohumoral benefits4.
However, although the elucidation of the mechanism underlying IR-induced alteration of Na+,K+-ATPase
is still considered key to the development of novel approaches for therapeutic intervention22, 23, the precise
sequence of events remains unclear.
The use of a cellular model allowed us to observe two previously unknown characteristics. The first is
that the decrease in Na+,K+-$73DVHĮcell surface abundance induced by IR in cardiac myocytes is not
accompanied by a decrease in total Įexpression, suggestive of an increased internalization or decreased
delivery to the surface without changes of synthesis or degradation of the polypeptide in this model.
Based on our recent data in epithelial cells14, we propose that the mechanism is likely to involve, at least
Page 9
in part, IR-induced internalization. In agreement with previous reports, we also found an alteration of
Na+,K+-ATPase-mediated ion transport, and an alteration of the enzyme catalytic properties. At least
theoretically, these suggest that IR-induces Na+,K+-ATPase internalization, resulting in altered
intracellular ion homeostasis and inactivation of the enzyme properties according to a mechanism that
could be comparable to the one occurring during lung hypoxia37. However, a closer examination of the
results obtained in the OPC group suggests that failure to maintain adequate ion homeostasis alone may
not be responsible for IR-induced myocyte cell death or OPC-induced protection. This unforeseen finding
is the second key characteristic that this in vitro model revealed. Indeed, figure 3 clearly shows that OPC
prevented IR-induced decreased in cell surface abundance, and figure 5 indicates that the catalytic
properties of the enzyme were preserved as well. However, an increase in surface abundance of protein
capable of pumping ions did not result in an increased cellular Na+,K+-ATPase-mediated ion transport
capacity, as shown in figure 3. Combined with the results shown in figure 6 and discussed in next
paragraph, these results suggest for the first time a correlation between Na+,K+-ATPase surface
abundance and cell survival in face of an ischemic attack. These results also show that, like ischemic
preconditioning (IPC), OPC occurs in cardiac myocytes and protects cardiac Na+,K+-ATPase itself against
IR injury 35, 38, 39. These add to the list of shared properties between the two forms of preconditioning,
which includes the production of reactive oxygen species, activation of Src and PKCH, and mitoK-ATP
channel opening11, 12, 36, 40-42.
Increased Na+,K+-ATPase cell surface abundance and protection against IR
The results presented in figures 1-3 show that an increased number of Na+,K+-ATPase units at the cell
surface correlates with an increased tolerance to IR in the OPC group. To test whether there was more
than a correlative association to this observation, we assessed the effect of a transient and specific
increase of Na+,K+-ATPase cell surface abundance on cardiac myocyte survival after ischemic attack. To
this end, we use a minimally-modified Na+,K+-$73DVH Į-polypeptide Į-L499V, with increased cell
surface abundance compared to the native form29. The results presented in figure 6 show that Į-L499Vexpressing neonatal cardiac myocytes have increased viability compared WR Į–expressing ones,
consistent with our previous findings in epithelial cells14. Mechanistically, a relatively straightforward
explanation for the increased viability would be that additional Na+,K+-ATPase ion-pumping capacity at
the cell surface in the mutant group helped preserve intracellular ion homeostasis during IR. However,
studLHVOLNHRXULQLWLDOFKDUDFWHUL]DWLRQRIWKHĮ-L499V mutant itself29 or our graded knock-GRZQRIĮ
subunit43 have shown that surface expression does not necessarily correlate with ion-pumping function.
The results on IR and OPC shown in figures 2-5 of the present study and discussed in the previous
paragraph add to the list. Hence, we propose that one or several non ion-pumping functions served by the
Na+,K+-ATPase complex at the plasma membrane may be involved in the modulation of myocyte survival
during IR observed in this study. Future studies may reveal whether one such function lies in survival
signaling or preservation of the integrity of intracellular structures.
Page 10
ACKOWLEDGEMENTS
The TED antibody and plasmids used in this study are a gift from Dr. Thomas A. Pressley (Texas Tech
University, Lubbock, Texas). We would like to acknowledge the technical assistance of Dr. Andrea
Kalinoski of the University of Toledo Advanced Microscopy & Imaging Center and helpful discussion
with Dr. D. Giovanucci (University of Toledo College of Medicine).
Sources of Funding: This work is supported by National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL36573 and by the French National Agency for Technological Research (ANRT) CIFRE N° 924/2008.
Disclosures: None.
Non-standard Abbreviations and Acronyms:
OPC
ouabain preconditioning,
IR
ischemia/reperfusion,
LDH
lactate dehydrogenase,
NCM neonatal cardiac myocytes
Page 11
REFERENCES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Kaplan JH. Biochemistry of na,k-atpase. Annu Rev Biochem. 2002;71:511-535
Skou JC. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral
nerves. Biochim Biophys Acta. 1957;23:394-401
Lucchesi PA, Sweadner KJ. Postnatal changes in na,k-atpase isoform expression in rat
cardiac ventricle. Conservation of biphasic ouabain affinity. J Biol Chem.
1991;266:9327-9331
Gheorghiade M, van Veldhuisen DJ, Colucci WS. Contemporary use of digoxin in the
management of cardiovascular disorders. Circulation. 2006;113:2556-2564
Liu L, Mohammadi K, Aynafshar B, Wang H, Li D, Liu J, Ivanov AV, Xie Z, Askari A.
Role of caveolae in signal-transducing function of cardiac na+/k+-atpase. Am J Physiol
Cell Physiol. 2003;284:C1550-1560
Pierre SV, Xie Z. The na,k-atpase receptor complex: Its organization and membership.
Cell Biochem Biophys. 2006;46:303-316
Xie Z, Cai T. Na+-k+--atpase-mediated signal transduction: From protein interaction to
cellular function. Mol Interv. 2003;3:157-168
D'Urso G, Frascarelli S, Zucchi R, Biver T, Montali U. Cardioprotection by ouabain and
digoxin in perfused rat hearts. J Cardiovasc Pharmacol. 2008;52:333-337
Inserte J. Triggering of cardiac preconditioning through na+/k+-atpase. Cardiovasc Res.
2007;73:446-447
Liu L, Zhao X, Pierre SV, Askari A. Association of pi3k-akt signaling pathway with
digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am J Physiol Cell Physiol.
2007;293:C1489-1497
Pasdois P, Quinlan CL, Rissa A, Tariosse L, Vinassa B, Costa AD, Pierre SV, Dos Santos
P, Garlid KD. Ouabain protects rat hearts against ischemia-reperfusion injury via
pathway involving src kinase, mitokatp, and ros. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
2007;292:H1470-1478
Pierre SV, Yang C, Yuan Z, Seminerio J, Mouas C, Garlid KD, Dos-Santos P, Xie Z.
Ouabain triggers preconditioning through activation of the na+,k+-atpase signaling
cascade in rat hearts. Cardiovasc Res. 2007;73:488-496
Ismail-Beigi F, Edelman IS. The mechanism of the calorigenic action of thyroid
hormone. Stimulation of na plus + k plus-activated adenosinetriphosphatase activity. J
Gen Physiol. 1971;57:710-722
Pierre SV, Belliard A, Sottejeau Y. Modulation of na(+)-k(+)-atpase cell surface
abundance through structural determinants on the alpha1-subunit. Am J Physiol Cell
Physiol. 2011;300:C42-48
Beller GA, Conroy J, Smith TW. Ischemia-induced alterations in myocardial (na+ + k+)atpase and cardiac glycoside binding. J Clin Invest. 1976;57:341-350
Bersohn MM. Sodium pump inhibition in sarcolemma from ischemic hearts. J Mol Cell
Cardiol. 1995;27:1483-1489
Kim DH, Akera T, Kennedy RH. Ischemia-induced enhancement of digitalis sensitivity
in isolated guinea-pig heart. J Pharmacol Exp Ther. 1983;226:335-342
Inserte J, Garcia-Dorado D, Hernando V, Soler-Soler J. Calpain-mediated impairment of
na+/k+-atpase activity during early reperfusion contributes to cell death after myocardial
ischemia. Circ Res. 2005;97:465-473
Page 12
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
Lundmark JL, Ramasamy R, Vulliet PR, Schaefer S. Chelerythrine increases na-k-atpase
activity and limits ischemic injury in isolated rat hearts. Am J Physiol. 1999;277:H999H1006
Ostadal P, Elmoselhi AB, Zdobnicka I, Lukas A, Elimban V, Dhalla NS. Role of
oxidative stress in ischemia-reperfusion-induced changes in na+,k(+)-atpase isoform
expression in rat heart. Antioxid Redox Signal. 2004;6:914-923
Zhang XQ, Moorman JR, Ahlers BA, Carl LL, Lake DE, Song J, Mounsey JP, Tucker
AL, Chan YM, Rothblum LI, Stahl RC, Carey DJ, Cheung JY. Phospholemman
overexpression inhibits na+-k+-atpase in adult rat cardiac myocytes: Relevance to
decreased na+ pump activity in postinfarction myocytes. J Appl Physiol. 2006;100:212220
Murphy E, Eisner DA. Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health
and disease. Circ Res. 2009;104:292-303
Murphy E, Steenbergen C. Ion transport and energetics during cell death and protection.
Physiology (Bethesda). 2008;23:115-123
Morgan EE, Li Z, Stebal C, Belliard A, Tennyson G, Salari B, Garlid KD, Pierre SV.
Preconditioning by subinotropic doses of ouabain in the langendorff perfused rabbit
heart. J Cardiovasc Pharmacol. 2010;55:234-239
Kometiani P, Li J, Gnudi L, Kahn BB, Askari A, Xie Z. Multiple signal transduction
pathways link na+/k+-atpase to growth-related genes in cardiac myocytes. The roles of
ras and mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem. 1998;273:15249-15256
Mohammadi K, Kometiani P, Xie Z, Askari A. Role of protein kinase c in the signal
pathways that link na+/k+-atpase to erk1/2. J Biol Chem. 2001;276:42050-42056
Pitts KR, Toombs CF. Studying ischemia and reperfusion in isolated neonatal rat
ventricular myocytes using coverslip hypoxia. Methods Mol Med. 2007;139:271-281
Pitts KR, Toombs CF. Coverslip hypoxia: A novel method for studying cardiac myocyte
hypoxia and ischemia in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;287:H1801-1812
Sottejeau Y, Belliard A, Duran MJ, Pressley TA, Pierre SV. Critical role of the isoformspecific region in alpha1-na,k-atpase trafficking and protein kinase c-dependent
regulation. Biochemistry. 2010;49:3602-3610
Gottardi CJ, Dunbar LA, Caplan MJ. Biotinylation and assessment of membrane polarity:
Caveats and methodological concerns. Am J Physiol. 1995;268:F285-295
Peng M, Huang L, Xie Z, Huang WH, Askari A. Partial inhibition of na+/k+-atpase by
ouabain induces the ca2+-dependent expressions of early-response genes in cardiac
myocytes. J Biol Chem. 1996;271:10372-10378
Xie ZJ, Wang YH, Ganjeizadeh M, McGee R, Jr., Askari A. Determination of total (na+
+ k+)-atpase activity of isolated or cultured cells. Anal Biochem. 1989;183:215-219
Zahler R, Sun W, Ardito T, Kashgarian M. Na-k-atpase alpha-isoform expression in heart
and vascular endothelia: Cellular and developmental regulation. Am J Physiol.
1996;270:C361-371
Patel HH, Head BP, Petersen HN, Niesman IR, Huang D, Gross GJ, Insel PA, Roth DM.
Protection of adult rat cardiac myocytes from ischemic cell death: Role of caveolar
microdomains and delta-opioid receptors. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
2006;291:H344-350
Diaz RJ, Wilson GJ. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte
models. Cardiovasc Res. 2006;70:286-296
Page 13
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
Gray MO, Karliner JS, Mochly-Rosen D. A selective epsilon-protein kinase c antagonist
inhibits protection of cardiac myocytes from hypoxia-induced cell death. J Biol Chem.
1997;272:30945-30951
Helenius IT, Dada LA, Sznajder JI. Role of ubiquitination in na,k-atpase regulation
during lung injury. Proc Am Thorac Soc. 2010;7:65-70
Elmoselhi AB, Lukas A, Ostadal P, Dhalla NS. Preconditioning attenuates ischemiareperfusion-induced remodeling of na+-k+-atpase in hearts. Am J Physiol Heart Circ
Physiol. 2003;285:H1055-1063
Inserte J, Garcia-Dorado D, Hernando V, Barba I, Soler-Soler J. Ischemic
preconditioning prevents calpain-mediated impairment of na+/k+-atpase activity during
early reperfusion. Cardiovasc Res. 2006;70:364-373
Baines CP, Goto M, Downey JM. Oxygen radicals released during ischemic
preconditioning contribute to cardioprotection in the rabbit myocardium. J. Mol. Cell.
Cardiol. 1997;29:207-216
Gross GJ, Auchampach JA. Blockade of atp-sensitive potassium channels prevents
myocardial preconditioning in dogs. Circ Res. 1992;70:223-233
Garlid KD, Paucek P, Yarov-Yarovoy V, Murray HN, Darbenzio RB, D'Alonzo AJ,
Lodge NJ, Smith MA, Grover GJ. Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction
with mitochondrial atp-sensitive k+ channels. Possible mechanism of cardioprotection.
Circ Res. 1997;81:1072-1082
Liang M, Tian J, Liu LJ, Pierre S, Liu J, Shapiro J, Xie ZJ. Identification of a pool of
non-pumping na/k-atpase. Journal of Biological Chemistry. 2007;282:10585-10593
Page 14
Control (C)
20
0
50
80 min
50
80 min
50
80 min
Ischemia-Reperfusion (IR)
Ischemia
20
0
Ouabain PreConditionning (OPC)
Ouabain
0
8
12
Ischemia
20
Krebs-Henseleit buffer (KH)
PBS + coverslip-induced ischemia
TIP in KH
Ouabain in KH
Figure 1. Experimental protocols. Timing of interventions is shown in relation to the 30minutes period of substrate and coverslip-induced ischemia. Ouabain was added at 10 μmol/L.
The PKCH translocation inhibitor peptide (TIP, 5μmol/L) was given before, during and after
ouabain.
Page 15
A
B
Page 16
C
Figure 2. Effect of ischemia/reperfusion and ouabain preconditioning on cell viability.
LDH release and Annexin V/PI staining were used to evaluate cell injury in NCM after 80
minutes of incubation in Krebs-Henseleit (KH) buffer (C: control), 80 minutes incubation
according to the ischemia/reperfusion protocol shown in Figure 1 (IR), or 80 minutes incubation
according to the ouabain preconditioning protocol shown in Figure 1 (OPC). Where indicated,
the PKCH translocation inhibitory peptide (TIP) was added as described in Figure 1. A)
Characterization of the proportion of cell death. Released LDH/total LDH ratios were
measured as described in Materials and Methods. Values are mean ± SEM (n=6). *** P<0.001
vs OPC. B) Effect of PKCH Inhibition. LDH release in cell culture media was measured as
described in Materials and Methods. Values are mean ± SEM (n=5). *** P<0.001 vs IR, #
P<0.05 vs OPC C) Annexin V/Propidium Iodide (PI) staining of NCM exposed to IR. After
treatment, fluorescent staining of Annexin V (green), PI (red), and DAPI (blue) was performed
as described in Materials and Methods, and cells were examined by fluorescence confocal
microscopy. Pictures are representative of at least 6 fields observed in 3 different preparations
for each condition (Core of the ischemic zone created by the coverslip). Scale bar = 25 μm.
Page 17
A
B
Page 18
C
Figure 3. Effect of ischemia/reperfusion and ouabain preconditioning on Na+,K+-ATPase
cell surface expression. Monolayers of neonatal cardiac myocytes were exposed to C
(control), IR (Ischemia/Reperfusion), and OPC (ouabain Preconditioning) protocols as described
in Figure 1. A) The upper panel depicts a representative Na,K-ATPase Į immunoblot of
biotinylated plasma membrane surface proteins recovered by affinity purification with
streptavidin. The lower panel depicts the band density quantification data relative to control,
represented as means ± SEM (n =6). * P<0.05 vs. control. B) The upper panel representative
depicts a representative immunoblot of 3 independent experiments for the detection of total
Na+,K+-$73DVHĮDQGDFWLQLQFHOOKRPRJHQDWHVLower panels: Na+,K+-$73DVHĮDFWLQUDWLRV
expressed as mean ± SEM (n=3). C) Na+,K+-ATPase Į JUHHQ DQG '$3, EOXH
immunofluorescence. After treatment, fluorescent staining was performed as described in
Materials and Methods, and cells were examined by fluorescence confocal microscopy. Pictures
are representative of at least 6 fields observed in the center of the area under the coverslip in 3
different preparations for each condition. Scale bar = 25 μm.
Page 19
Figure 4. Effect of ischemia/reperfusion and ouabain preconditioning on Na+,K+-ATPasemediated 86Rb+ transport. Monolayers of neonatal cardiac myocytes were exposed to C
(control), IR (Ischemia/Reperfusion), and OPC (ouabain Preconditioning) protocols as described
in Figure 1. At the end of the protocols, Na+,K+-ATPase-mediated transport was assayed in
attached cells by measuring the ouabain-sensitive uptake of the K+ congener 86Rb+ as described
in Materials and Methods. Values are means ± SEM (n=6). *** P<0.001 vs C. No significance
was
detected
between
IR
and
OPC.
Page 20
Figure 5: Effect of ischemia/reperfusion and ouabain preconditioning on Na+,K+-ATPase
activity. Monolayers of neonatal cardiac myocytes were exposed to C (control), IR
(Ischemia/Reperfusion), and OPC (ouabain Preconditioning) protocols as described in Figure 1.
Where indicated, the PKCH translocation inhibitory peptide (TIP) was added. At the end of the
protocols, ouabain-sensitive ATPase activities were measured using phosphate inorganic
detection in alamethicin-pretreated suspensions of rat neonatal cardiomyocytes, as described in
Material and Methods. Values are expressed as mean ± SEM (n=5). ** P<0.01 vs C. # P<0.05
vs OPC.
Page 21
A
Control
Į YFP L499V Į-YFP
Fluorescence
Phase Contrast
B
Figure 6. Effect of Ischemia/Reperfusion on LDH released by Na+,K+-ATPase Į- DQGĮL499V-transfected rat neonatal cardiac myocytes . A) Microscopic observation (X10) of
transfected rat neonatal cardiac myocytes after 24h. Upper panel: fluorescence microscopy.
Lower panel: contrast microscopy. Pictures are representative of at least 4 fields observed in 3
different preparations for each group. B) LDH release was measured as an index of cell injury in
WKH PHGLD RI Į- DQG Į-L499V-transfected neonatal cardiac myocytes exposed to IR
(Ischemia/Reperfusion) as described in Figure 1. Cells exposed to the lipofectamin treatment
only were used as control. Shown are mean ± SEM from 6 separate experiments. ** P<0.01 vs
Į IR.
Page 22
Novelty and Significance
What Is Known?
x
The elucidation of the mechanism underlying ischemia-reperfusion injury -induced alteration of
Na+,K+-ATPase is key to the development of novel approaches for therapeutic intervention.
x
Ouabain preconditioning protects the heart against ischemia reperfusion injury through Na+,K+ATPase signaling.
What New Information Does This Article Contribute?
x
Maintenance of Na+, K+-ATPase cell surface abundance is critical to myocyte survival in face of
an ischemic attack and plays a role in ouabain preconditioning-induced protection.
x
Protection afforded by increased Na+, K+-ATPase cell surface expression may be independent of
increased cellular ion pumping capacity.
x
Like ischemic preconditioning, ouabain preconditioning occurs in the cardiac myocyte in a
PKCH-dependant manner and protects Na+, K+-ATPase itself against IR injury.
Na+,K+-ATPase integrity at the cell surface of the cardiac myocyte is not only critical for the maintenance
of ion homeostasis, it is also key to adequate initiation and transduction of digitalis signaling and
subsequent pharmacological effects. The elucidation of the mechanism underlying ischemia/reperfusion
(IR)-induced alteration of Na+,K+-ATPase is considered key to the development of novel approaches for
therapeutic intervention in myocardial infarction. The use of a cellular model allowed us to uncover two
novel characteristics of ischemia-reperfusion-induced alteration of the cardiac Na+,K+-ATPase and
protection by ouabain-preconditioning. First, we found that Na+,K+-$73DVH Į cell surface abundance
modulates IR-induced cell death of cardiac myocytes. Second, we obtained evidence that failure to
maintain adequate ion homeostasis may not be the sole mechanism by which reduced Na+,K+-$73DVHĮ
cell surface abundance modulates myocyte survival during IR. Future studies may reveal whether one
such function lies in survival signaling or preservation of the integrity of intracellular structures.
Résultats
Afin d'identifier à quel moment l'endocytose de la Na , K -ATPase avait lieu
pendant l'ischémie/reperfusion, l’immunoflurescence de la Na+, K+-ATPase a été
réalisée après l'ischémie et après l'ischémie/reperfusion. Ces données démontrent que
l'endocytose s'effectuerait pendant la reperfusion et sont confirmées par le marquage
avec la biotinylation. (Figure 32)
+
+
Figure 32 Localisation cellulaire de la Na+, K+-ATPase Į1 durant la reperfusion
A) Image de microscopie confocale représentative d'au moins 3 expériences indépendantes,
marquage de la Na+, K+-ATPase Į1 (vert) et du noyau par DAPI (bleu). B) Western Blot
représentatif de l'expression membranaire de la Na+, K+-ATPase. Moyenne ± SEM, analyse
ANOVA des données, * p<0,05. C : Contrôle, IRt0 : Ischémie 30 min et Reperfusion 0 min,
IRt5 : Ischémie 30 min et Reperfusion 5 min, IRt30 : Ischémie 30 min et Reperfusion 30 min
Yoann Sottejeau
159
Résultats
IV Etude de la toxicité de l'association des composés Omégacoeur® et
Dolupérine® dans des cellules humaines
Cette étude a pour but de démontrer l’absence de toxicité de l'association de
l’Omégacoeur® et de la Dolupérine® dans des cellules humaines. En effet, de
nombreux bénéfices de cette association sont possibles de par les effets anti cancéreux
et cardiovasculaires notamment qui ont été reportés pour les ingrédients des deux
composés. Afin de mesurer la toxicité sur des cellules humaines HEK293, un test au
bleu trypan ainsi qu'une observation microscopique des cellules ont été réalisés après
une incubation de 24h avec différentes doses du complexe Omégacoeur® et
Dolupérine®. Les résultats ne démontrent aucun effet toxique aux doses
thérapeutiques supposées (2,5 μM de DHA contenu dans Omégacoeur®) /1 μM de
curcumine contenu dans Dolupérine®. et 25/10 μM) [282, 283]. Une toxicité a été
détectée lorsque la dose était 100 à 1000 fois supérieure à la dose thérapeutique (2,5/1
mM). Cette toxicité est liée à la Dolupérine® seule (1 mM de curcumine contenu dans
Dolupérine®) alors qu'aucune toxicité n'a été décelée pour Omégacoeur® à la dose la
plus forte testée (soit 2,5 mM de DHA contenu dans Omégacoeur®). Cette étude
démontre l'innocuité à dose thérapeutique de l'association Omégacoeur® et
Dolupérine® sur des cellules humaines.
Yoann Sottejeau
160
Cellular and Molecular Biology TM 56, OL1400-OL1409
DOI 10.1170/159
ISSN 1165-158X
2010 Cell. Mol. Biol.TM
EFFECT OF A NOVEL OMEGACOEUR®/DOLUPERINE®
NUTRITIONAL COMBINATION ON HUMAN EMBRYONIC
KIDNEY CELL VIABILITY
Y. SOTTEJEAU 1,2,3, A. M. PATEL 1, G. GERBER 2, S. V. PIERRE 1, *, AND J. M. MAIXENT 3,4, * "
1 Department of Physiology and Pharmacology, College of Medicine, University of Toledo, 3035 Arlington Avenue, Toledo,
Ohio, USA.
2 Laboratoire Holistica International, 465 Parc d’Activité des Jalassieres, Eguilles, France.
3 INSERM U927, CHU - 350 avenue Jacques Coeur - BP 577, 86021 Poitiers cedex, France
4 Université de Poitiers, IUP Génie Physiologique-Informatique, Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées, Bât.
Mécanique, 40 Av. du recteur Pineau 86022 Poitiers Cedex France.
*
These authors have contributed equally to the work.
"
Pr. Jean-Michel Maixent, Email : [email protected]
Received May 20th, 2010; Accepted September 9th, 2010; Published October 5th, 2010
Abstract – Holistica Laboratories (Eguilles, France) developed the nutritional supplements Omegacoeur® and Doluperine®
based on two of the most ancient and unique dietary health traditions. Omegacoeur® is formulated to supply key active
components of Mediterranean diet (omega 3,6,9 fatty acids, garlic, and basil) and the formulation of Doluperine® was based
on the Ayurvedic tradition (curcuma, pepper, ginger extracts). Interestingly, recent studies suggest that an combination of the
ingredients supplied by these two supplements could provide additional and previously unanticipated benefit through
synergistic actions of some of their key components. However, the effect of such combination on human cell viability has
not been investigated. In this present article, a review of the various effects of the individual compounds of the new
combination and the reported active doses, and the result of a study of an combination of Omegacoeur® / Dolupérine® on
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells. Incremental doses of 4 Omegacoeur® / Dolupérine® combinations prepared so
that the molar ratio DHA (Docosahexaenoic acid) in Omegacoeur® / curcumin in Dolupérine® was kept constant, at 2.5
DHA / 1 curcumin, were added to the culture media. After 24h of incubation, cell viability was assessed by the trypan blue
exclusion method. The data suggest that the combination of Omegacoeur® with Dolupérine® does not affect HEK 293 cells
viability in the range of doses that have demonstrated beneficial effects in earlier studies.
Key words: Nutritional complements; Mediterranean diet; omega3- omega6- omega9-fatty-acids; garlic, piperin; ginger;
curcumin; HEK 293, synergistic.
INTRODUCTION
Holistica Laboratories (Eguilles, France)
develop and optimize formulas for health food
supplements that are exclusively based on plants
and constituents of natural origin. The fast
growing body of literature available on
epidemiological
studies
and
molecular
mechanism of actions of nutraceuticals support
the hypothesis of a potential added benefit of a
Abbreviations: ȍcoeur, Omegacoeur; BSA, Bovine serum
albumin;
COX
2,
cyclooxygenase
2;
DHA,
Docosahexaenoic acid; DMEM, Dulbecco's Modified Eagle
Medium; Dlp, Doluperine; EFSA, European Food Safety
Authority; EPA, Eicosapentaenoic acid; HEK, Human
Embryonic Kidney; PUFA, Polyunsaturated fatty acid.
combination of two of the leading nutritional
supplements developed by this company,
Omegacoeur® and Doluperine®.
Omegacoeur® and the Mediterranean diet
The Mediterranean diet has been suggested
to play a beneficial role for health and longevity,
and recent studies further supported previous
reports that consumption of a Mediterranean diet
lowers the risk of death from heart disease and
cancer in both men and women (21-25,45,47).
The dietary tradition of the Mediterranean region
is characteristically based on a predominant
consumption of fruits, vegetables, breads and
cereals, nuts and seeds. Fish is also consumed on
a regular basis, mostly oily fishes high in omega3 fatty acids and widely used condiments include
1400
Copyright © 2010 C.M.B. Edition
SOTTEJEAU Y. et al.
garlic, onions, basil and other herbs.
(6,12,14,51). Omegacoeur® is prepared with sea
fish oil, Mediterranean nuxoleat (garlic/basil
olive- and walnut oil maceration), and wheat
germ oil. At the dosage of 4 capsules per day (for
recommended nutritional or physiological
support as a food supplement), Omegacoeur®
supplementation provides 676 mg of omega 3
PUFA (Polyunsaturated fatty acid). This
represents 572 mg of EPA (Eicosapentaenoic
acid) + DHA (Docosahexaenoic acid)
which is 229 % of European Food Safety
Authority (EFSA) daily value recommendations
(1). Most notably, this also provides 188 % of
recommended daily intake for the key component
of Omégacoeur®, docosahexaenoic acid (DHA).
At an upper dosage of 6 capsules per day
(recommended for health risk prevention),
Omegacoeur® supplementation provides 1014
mg of omega 3 PUFA ( including 858 mg of
EPA + DHA : 343 % of EFSA daily value EFSA
recommendations.
Doluperine® and the Ayurvedic Diet
Often referred-to as the most ancient and the
foundation of major Traditional Medicines, the
Indian Ayurveda (“Science of Life”) relies
heavily on the healthy effects of plants and spices
and their daily used in the diet. Curcumin, one of
the main pillars of Ayurveda, is thought to be
responsible for most of the biological effects of
turmeric, a key component of Indian curries. In
support of such action, epidemiological studies
have shown a lower prevalence of inflammatory
diseases in the Indian population (16,43), and
curcumin was shown to inhibit the key
inflammatory enzymes cyclooxygenase 2 (COX
2) and lipooxygenase (8,35). It is important to
note that, because of curcumin's rapid plasma
clearance and conjugation, its physiological
usefulness would be somewhat limited unless
complexed with piperine to increase its systemic
bioavailability (61) (27). Ginger is also part of
the Ayurvedic health tradition. Its main uses
include antimicrobial, antithrombotic, antiinflammatory, and anticancer properties (2,70).
The formula of Dolupérine® includes a turmeric
extract highly concentrated in Curcumin (95%), a
ginger extract titrated in gingerol (5%), and a
pepper extract (95% Piperin). Two capsules of
Doluperine, the recommended daily dose,
provide 600 mg of curcumin in combination with
7.5 mg Piperine and 15 mg of gingerol.
The potential added benefice of an
Omegacoeur® / Dolupérine® combination.
Omegacoeur® and Dolupérine® were
developed based on various beneficial health
effects of two clearly different sets of
complementary active ingredients that have been
independently incorporated into the traditional
Mediterranean and Ayurvedic-based diets,
respectively. With the fast-paced growth of the
nutritional supplement market, a considerable
effort has been put forth toward the
understanding of the underlying mechanisms of
action of some of the key components present in
the two formulas ((26,32,42,54,59), and other
refs in tables 1 and 2). Taken together, these
studies revealed that distinct signalling pathways
were targeted by some of the components,
suggesting that key compounds of Omegacoeur®
and Doluperine® could demonstrate synergistic
effects. That this may indeed be the case is
supported by recent in vitro studies and in vivo
studies in rodents (57,69).
Clearly, the positive outcome of the abovementioned studies warrants further investigation
in humans, but the effect of the combination has
not been investigated on human cell viability.
Accordingly, the present study was designed to
begin the assessment of the effect of the
combination of Omegacoeur® and Dolupérine®,
at doses chosen within the combination predicted
nutritional, physiological or therapeutic range on
human cell viability. The data obtained in a
model of human embryonic kidney (HEK) cells
suggest that the combination of Omegacoeur®
with Dolupérine® did not affect HEK cell
viability in a range of doses that have
demonstrated beneficial effects in earlier animal
studies (69).
Doses of Omegacoeur® and Dolupérine®
DHA and curcumin are key active principles in
Omegacoeur® and Dolupérine®, respectively. Accordingly,
Holistica Laboratories manufacture the formulas so that the
contents in DHA (in Omegacoeur®) and curcumin (in
Dolupérine®) are kept constant. Hence, to determine the
doses of the new Omegacoeur®/Dolupérine® combination
to be tested, we choose to use the amounts of DHA present
in Omegacoeur® and the amount of curcumin in
Doluperine® as references. Based on dose-effects reported
in the literature for the main components of both formulas
(see tables 1 and 2) and previous reports of efficacy of
DHA/curcumin combination (69) (57) , 4 incremental doses
of the mixture were chosen for this study. They ranged from
2.5 to 2500 μM DHA in Omegacoeur® in combination with
the amount of Doluperine® necessary to obtain a molar
ratio of DHA / curcumin of 2.5/1.
1401
Omegacoeur®/Doluperine® combination safety on human embryonic kidney cells
Table 1. Selected studies of the health benefice and mechanism of action of the individual
components of Omegacoeur® in major health risks.
mg per pill of
Omegacoeur ®
Cancer
Risks
Neurological
Risks
Cardiovascular
Risks
Others
Omega 3
169 *
(17,41)
(66,68)
(29,33,40,46,58)
(11)
Omega 6
56
(10)
(34,55)
(76)
Omega 9
97
(44)
(18)
(75)
Garlic
Macerate
29
(39)
(63,72)
Basil
Macerate
29
(19,60)
(3)
* Includes EPA: 86 mg of eicosapentaenoic acid (EPA) and 57 mg of docosahexaenoic acid (DHA).
Table 2. Selected studies of the health benefice and mechanism of action of the individual
components of Doluperine® in major health risks.
Curcuma
Extract
(95%
curcumin)
Pepper
Extract
(95%
piperin)
Ginger
Extract
(5%
gingerol)
a
mg per capsule of
Doluperine®
Cancer
Risks
Neurological
Risks
Cardiovascular
Risks
Others
316 a
(7,53)
(4,37)
(48,49,65)
(28,30,56)
(15)
(71)
(64,74)
(31,50)
(5,9,67)
4b
150 c
(36)
Includes 300 mg of curcumin, b includes 3.75 mg of piperine, and c includes 7.5 mg of gingerol.
1402
SOTTEJEAU Y. et al.
Preparation of Omegacoeur® and Dolupérine® solutions
Fatty acids from Omegacoeur® were pre-complexed
with bovine serum albumin (fatty-acid free BSA, Fisher) at
the ratio of 1 mg free fatty acid / 2.6 mg Bovine serum
albumin (BSA), in Dulbecco's Modified Eagle Medium
(DMEM) for 18 hours at room temperature as previously
described (52). Dolupérine® was prepared as a stock
solution (100mM of curcumin) in 0.5M sodium hydroxide.
The highest DHA/curcumin titration (2.5/1 mM) was
prepared by mixing the two solutions, and contained 21
mg/ml BSA and a negligible amount of residual sodium
hydroxide (1%), which did not induce any detectable change
in pH of the culture media (data not shown). Three other
doses were prepared by serial 1/10 dilutions from the 2.5
mM DHA/1.0 mM curcumin solution, namely 2.5/1, 25/10,
and 250/100 μM DHA/curcumin ratios. To control for the
potential effects of BSA, vehicle controls where
Omegacoeur® and Dolupérine® were omitted were
prepared in the same conditions.
Cell Culture and incubation
Human embryonic kidney 293 cells (HEK293) were
obtained from American Type Culture Collection
(Rockville, MD). Cells were maintained in Dulbecco’s
modified Eagle’s medium (DMEM, Sigma) supplemented
with 10% fetal bovine serum (Gibco), streptomycin at 100
ȝJP/SHQLFLOOLQDW8P/DW&LQDKXPLGLILHG
CO2-containing atmosphere. HEK 293 cells were seeded
(10 000-14 000 cells/cm2) and cultured overnight in
standard culture medium before addition of to the indicated
Omegacoeur® and/or Dolupérine® or the corresponding
vehicle control for 24h.
Morphological observation
HEK 293 cell monolayers were examined for
morphological changes by inverted microscopy (Olympus
IX51). Images were captured using a CCD camera
connected to the microscope and computerized using the
software program SPOT (Diagnostic instrument).
Cell viability
Cell viability was determined using a standard Trypan
blue dye exclusion test (62). At the end of the 24hr
incubation period (see above), the cells were detached by
trypsin treatment and re-suspended in DMEM. Loss of cell
membrane integrity was detected by classical Trypan Blue
staining and viable cells (capable of excluding the dye) were
counted using a haemocytometer. Data were expressed in
percentage of viable cells counted after 24h of incubation in
media alone.
Data are expressed as means ± standard error of the
mean (SEM) of 4-6 independent experiments per
experimental group. Treated groups were compared to the
control group (media only) using paired student’s t-test. P
values < 0.05 were considered significant.
RESULTS
The Aim of the present study was to
determine
whether
a
combination
of
Omegacoeur® and Dolupérine® could result in a
somewhat unexpected but nonetheless possible
toxicity in human cells in the therapeutic range.
To this end, HEK cell monolayers were exposed
for 24h to a mixture of Omegacoeur® and
Dolupérine®, and cell viability was assessed by
the trypan blue exclusion method. To determine
the doses, the amounts of DHA present in
Omegacoeur® and the amount of curcumin in
Doluperine® were used as references.
Incremental doses for the mixture were then
prepared so that the molar ratio of DHA in
Omegacoeur® / curcumin in Dolupérine® was
kept constant, at 2.5 DHA / 1 curcumin.
Dose effect of Omegacoeur® and Dolupérine®
combination on HEK 293 viability
The effect of 24h of incubation in the
presence of 4 increasing doses of the mixture and
their respective vehicle controls (corresponding
amount of BSA alone, as detailed in Methods)
were tested. As shown in Figure 1A, the
microscopic observation did not reveal any effect
of the vehicle alone at any of the concentrations
used. Using the trypan blue exclusion method,
we confirmed quantitatively that the highest dose
of BSA alone (21 mg/ml) did not have any effect
on HEK cell morphology or viability (not
shown). Hence, the vehicle was omitted in the
subsequent studies and a control with standard
culture media only was used for the quantitative
analyses presented in Figures 1B and 2. At
concentrations ranging from 2.5 to 250 μM DHA
in Omegacoeur®, none of the Omegacoeur® /
Dolupérine® combinations had a significant
effect on HEK cell morphology (Fig 1A).
Quantitative analysis using the trypan blue
exclusion test revealed that cell viability was
118%±31, 146%±30 and
69%±20 after
incubation with the 2.5/1 μM, 25/10 μM, and
250/100 μM DHA in Omegacoeur® / curcumin
in Dolupérine® mixtures, respectively. None of
these conditions we found significantly different
from the control (100%, Fig 1B). In contrast, the
higher concentration tested (2.5/1 mM DHA in
Omegacoeur® / curcumin in Dolupérine®)
induced a clear change in cell morphology after
24h (Fig 1A), followed by detachment and death,
as revealed by the quantitative analysis by trypan
blue exclusion (Fig 1B, p<0.05).
Effect of high concentrations of Omegacoeur®
and/or Dolupérine® on HEK 293 viability
To clarify the origin of the negative effect of
24h of incubation with the Omegacoeur® /
Dolupérine® mixture at the highest concentration
on HEK cell viability, we next examined the
individual effects of Omegacoeur® and
1403
Figure 1. Dose effect of Omegacoeur®/Dolupérine® combination on HEK 293 viability. A) Microscopic observations
(X200) of HEK 293 cells following 24 hours of incubation in the presence of the indicated concentrations of DHA (in
Omegacoeur®)/curcumin (in Dolupérine®) combination, or in the presence of the corresponding vehicle control prepared as
detailed in the “Material and Methods” section. A representative picture is shown for each dose of the combination (+)
underneath a representative picture of the corresponding vehicle control (-). Control: standard culture medium. ȦFRHXU'OS
2.5/1 μM: 2.5 μM DHA in omegacoeur /1 μM curcumin in Doluperine. ȦFRHXU'OS0 25 μM DHA in omegacoeur
/10 μM curcumin in Doluperine. ȦFRHXU'OS0250 μM DHA in omegacoeur /100 μM curcumin in Doluperine.
ȦFRHXU'OSP02.5 mM DHA in omegacoeur /1 mM curcumin in Doluperine. B) Quantitative analysis of HEK 293
cell viability following 24 hours of incubation in the presence of incremental concentrations of DHA (in
Omegacoeur®)/curcumin (in Dolupérine®) combination prepared as indicated in the “Material and Methods” section. Data
are means ± SEM of 6 independent experiments. *p<0.05 vs. Control (standard culture media).
1404
SOTTEJEAU Y. et al.
Dolupérine® when given separately at those
concentrations. HEK cell monolayers were
exposed to 2.5mM of DHA in Omegacoeur®, 1
mM of curcumin in Dolupérine®, or a mixture of
the two, and cell viability was determined using
the trypan blue exclusion test after 24h.
Microscopic observation revealed that HEK cell
morphology was unchanged after 24h of
incubation with 2.5 mM of DHA in
Omegacoeur®, undistinguishable from control
(Fig 2A). Consistently, cell viability was not
significantly different from that of the control
(81% ± 32, NS). On the other hand, 1 mM
curcumin in Doluperine alone or in combination
with 2.5 mM of DHA in Omegacoeur® induced
a significant toxicity on HEK cells. Taken
together, these results suggested that 1 mM
curcumin in Doluperine at very high
concentration accounted for the cytotoxicity
observed in the mixture at high concentration
(100-1000 times the health risk prevention
dosages).
Figure 2. Effects of high concentrations of Omegacoeur®, Dolupérine®, and a 2.5/1 ratio combination on HEK 293
viability. A) Microscopic observations (X200) of HEK 293 cells following 24 hours of incubation with or without 2.5 mM
of DHA in Omegacoeur® and/or 1 mM of curcumin in Dolupérine®. B) Quantitative analysis of HEK 293 viability
following 24 hours of incubation with the concentration of 2.5 mM of DHA in Omegacoeur® and the concentration 1 mM
of curcumin in Dolupérine® individually or in combination. Shown are means ± SEM of 6 independent experiments *p<0.05
vs. Control (standard culture media).
1405
DISCUSSION
A mixture of the two nutritional
supplements Omegacoeur® and Dolupérine®
could provide additional benefits through
synergistic actions of some of their key
components, but the safety of such combination
have not been examined in human cells. This
study provides the first set of evidences in
support of the innocuousness of the combination
of Omegacoeur® and Dolupérine® in human
embryonic kidney cells at active relevant doses.
The
25/10
Omegacoeur®
/Dolupérine®
combination is safe and well within the expected
active range
The data presented in Figure 1 indicated that
the 2.5/1, 25/10, and 250/100 ratios of μM DHA
in Omegacoeur® / μM curcumin in Dolupérine®
did not induce significant cell death in human
embryonic kidney cells. Based on current
literature, the 25/10 Omegacoeur® /Dolupérine®
combination seems the most promising of all
doses studied. It is important to keep in mind
that, in addition to 25 μM DHA and 10 μM
curcumin, the 25/10 mixture also contains 6.7
μM gingerol, 0.18 μM piperine, as well as
Omega-6 and Omega 9 PUFA at about 8.4 μg/ml
and 1.4 μg/ml, respectively. These concentrations
are within the range of EC50s of welldocumented beneficial effects of these
components. Interistingly, DHA has been shown
to reduce endothelial expression of vascular cell
adhesion molecule 1 (VCAM-1), E-selectin,
intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1),
interleukin 6 (IL-6), and IL-8 in response to IL-1,
IL-4, tumor necrosis factor, or bacterial
endotoxin at concentrations ranging 1-25 μM
(20). Similarly, the amount of curcumin in the
mixture appears suitable for anti-inflammatory
action since the reported EC50 of curcumin for
inhibition of epidermal lipoxygenase and
cyclooxygenase activities is 5-10 μM (35). In
addition to these anti-inflammatory effects, the
combination of 25μM DHA and 10 μM of
curcumin has been shown to suppress cell growth
and stimulate apoptosis in human pancreatic
cancer cell lines (69). Finally, gingerol has
shown inhibitory effect on COX 2 and NFkappaB at 5–30 μM (38). Taken together, these
suggest that the 25/10 μM combination contains
suitable amounts of the various compounds.
Highly relevant to potential therapeutic use,
those concentrations are also within achievable
plasma concentrations (61). Finally, the
DHA/curcumin ratio itself has been recently
shown to promote synergism between DHA and
curcumin in animal cells, raising the interesting
possibility of achieving biological activity
without toxicity at an even lower range. Indeed,
Saw et al. have recently shown that an
combination 0.78 μM DHA or EPA / 2.5μM
curcumin has synergistic anti-inflammatory
effects on murine leukemic monocytic
macrophage cells (57). Clearly, further studies
are warrant to further optimize the dosage of the
Omegacoeur®/Dolupérine® mixture in human,
but based on this brief review of the literature
and the results of the present study, biological
effects have been reported for doses that are at
least 100 times lower than the toxic dose of the
combination of Omegacoeur® and Dolupérine®
(2.5/1 mM) that we observed in HEK cells.
Effect at high concentration
Because 1 mM Dolupérine® alone produced
a toxicity undistinguishable from the toxicity of
the combination of 2.5 mM Omegacoeur®/ 1
mM Dolupérine® (Figure 2), it is likely that one
of the main components of Dolupérine® was
responsible for the effect. Even though this dose
of Dolupérine® includes 0.19 mg/ml ginger
(0.67mM gingerol) and 0.005 mg/ml pepper
(0.018 mM piperine) in addition to the 1mM
curcumin and other natural curcuminoids, the
toxic effect is consistent with previous reports of
the effect of high doses of curcuma. Indeed,
EC50 for toxicity of natural curcuminoids on
HEK 293 cells was shown to be 37-200 μM after
16h (13). Since the high dose of Dolupérine®
contained approximately 5 times this amount of
natural curcuminoids, it is reasonable to conclude
that the 1 mM curcumin along with the other
natural curcuminoids in Dolupérine® were
responsible for the toxic effect we observed.
Finally, in favour of an absence of further toxic
effect of ginger and pepper, Unnikrishnan et al.
have shown an absence of toxic effect on human
lymphocytes at higher doses than the ones used
in the present study (ginger 0.25 mg/ml and
pepper 0.1 mg/ml) (73).
In summary, this study shows, for the first
time, that the combination of two nutritional
supplements based on the Mediteranean diet
(Omegacoeur® naturally rich in omega3,6,9
PUFA) and the Ayurvedic diet (Doluperine®
enriched in curcuma, pepper, and ginger extracts)
did not induce cell death in for human embryonic
1406
SOTTEJEAU Y. et al.
kidney cells at active-relevant doses. Future
preclinical studies and clinical trials shall
determine whether the potential beneficial
effects of this combination indeed translates into
nutritional, physiological or therapeutic effects at
different dosages in the prevention of health risks
or as a complementary physiological support in
combination with the treatments of a variety of
disease processes including cancer, neurological
and cardiovascular disorders.
Acknowledgements - Yoann Sottejeau is a CIFRE fellow of
the French National Agency for Technological Research
(ANRT). The authors wish to thank Ajay Rajagopalan for
his valuable assistance with data collection and analysis.
REFERENCES
1.
Scientific Opinion of the Panel on Dietetic products,
Nutrition and Allergies on a request from European
Commission related to labelling reference intake values for
n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. The EFSA Journal
2009;1176: 1-11.
2.
Afzal, M., Al-Hadidi D., Menon M., Pesek J., Dhami
M. S. Ginger: an ethnomedical, chemical and
pharmacological review. Drug Metabol Drug Interact
2001;18: 159-190.
3.
Agrawal, P., Rai V., Singh R. B. Randomized
placebo-controlled, single blind trial of holy basil leaves in
patients with noninsulin-dependent diabetes mellitus. Int J
Clin Pharmacol Ther 1996;34: 406-409.
4.
Agrawal, R., Mishra B., Tyagi E., Nath C., Shukla R.
Effect of curcumin on brain insulin receptors and memory
functions in STZ (ICV) induced dementia model of rat.
Pharmacol Res 2009;21: 21.
5.
Altman, R. D., Marcussen K. C. Effects of a ginger
extract on knee pain in patients with osteoarthritis. Arthritis
Rheum 2001;44: 2531-2538.
6.
Aronis, P., Antonopoulou S., Karantonis H. C.,
Phenekos C., Tsoukatos D. C. Effect of fast-food
Mediterranean-type diet on human plasma oxidation. J Med
Food 2007;10: 511-520.
7.
Bar-Sela, G., Epelbaum R., Schaffer M. Curcumin as
an Anti-Cancer Agent: Review of the Gap between Basic
and Clinical Applications. Curr Med Chem 2009;24: 24.
8.
Bengmark, S. Curcumin, an atoxic antioxidant and
natural NFkappaB, cyclooxygenase-2, lipooxygenase, and
inducible nitric oxide synthase inhibitor: a shield against
acute and chronic diseases. JPEN J Parenter Enteral Nutr
2006;30: 45-51.
9.
Bliddal, H., Rosetzsky A., Schlichting P., Weidner M.
S., Andersen L. A., Ibfelt H. H., Christensen K., Jensen O.
N., Barslev J. A randomized, placebo-controlled, cross-over
study of ginger extracts and ibuprofen in osteoarthritis.
Osteoarthritis Cartilage 2000;8: 9-12.
10. Brown, M. D., Hart C., Gazi E., Gardner P., Lockyer
N., Clarke N. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid
and bone marrow adipocytes on metastatic spread from
prostate cancer. Br J Cancer 2009;8: 8.
11. Caughey, G. E., Mantzioris E., Gibson R. A., Cleland
L. G., James M. J. The effect on human tumor necrosis
factor alpha and interleukin 1 beta production of diets
enriched in n-3 fatty acids from vegetable oil or fish oil. Am
J Clin Nutr 1996;63: 116-122.
12. Champagne, C. M. The usefulness of a
Mediterranean-based diet in individuals with type 2
diabetes. Curr Diab Rep 2009;9: 389-395.
13. Changtam, C., de Koning H. P., Ibrahim H., Sajid M.
S., Gould M. K., Suksamrarn A. Curcuminoid analogs with
potent activity against Trypanosoma and Leishmania
species. Eur J Med Chem 2009.
14. Chatzi, L., Torrent M., Romieu I., Garcia-Esteban R.,
Ferrer C., Vioque J., Kogevinas M., Sunyer J.
Mediterranean diet in pregnancy is protective for wheeze
and atopy in childhood. Thorax 2008;63: 507-513.
15. Chonpathompikunlert,
P.,
Wattanathorn
J.,
Muchimapura S. Piperine, the main alkaloid of Thai black
pepper, protects against neurodegeneration and cognitive
impairment in animal model of cognitive deficit like
condition of Alzheimer's disease. Food Chem Toxicol
2009;23: 23.
16. Chopra, A., Saluja M., Patil J., Tandale H. S. Pain and
disability, perceptions and beliefs of a rural Indian
population: A WHO-ILAR COPCORD study. WHOInternational League of Associations for Rheumatology.
Community Oriented Program for Control of Rheumatic
Diseases. J Rheumatol 2002;29: 614-621.
17. Cohen, L. A. Lipids in cancer: an introduction. Lipids
1992;27: 791-792.
18. Covas, M. I. Bioactive effects of olive oil phenolic
compounds in humans: reduction of heart disease factors
and oxidative damage. Inflammopharmacology 2008;16:
216-218.
19. Danesi, F., Elementi S., Neri R., Maranesi M.,
D'Antuono L. F., Bordoni A. Effect of cultivar on the
protection of cardiomyocytes from oxidative stress by
essential oils and aqueous extracts of basil (Ocimum
basilicum L.). J Agric Food Chem 2008;56: 9911-9917.
20. De Caterina, R., Liao J. K., Libby P. Fatty acid
modulation of endothelial activation. Am J Clin Nutr
2000;71: 213S-223S.
21. de Lorgeril, M., Salen P. The Mediterranean diet:
rationale and evidence for its benefit. Curr Atheroscler Rep
2008;10: 518-522.
22. de Lorgeril, M., Salen P. Modified Cretan
Mediterranean diet in the prevention of coronary heart
disease and cancer. World Rev Nutr Diet 2000;87: 1-23.
23. de Lorgeril, M., Salen P. Modified cretan
Mediterranean diet in the prevention of coronary heart
disease and cancer: An update. World Rev Nutr Diet
2007;97: 1-32.
24. de Lorgeril, M., Salen P., Martin J. L., Monjaud I.,
Boucher P., Mamelle N. Mediterranean dietary pattern in a
randomized trial: prolonged survival and possible reduced
cancer rate. Arch Intern Med 1998;158: 1181-1187.
25. de Lorgeril, M., Salen P., Martin J. L., Monjaud I.,
Delaye J., Mamelle N. Mediterranean diet, traditional risk
factors, and the rate of cardiovascular complications after
myocardial infarction: final report of the Lyon Diet Heart
Study. Circulation 1999;99: 779-785.
26. Duran, M. J., Sabatier F., Pieroni G., Gerber G.,
Sampol J., Maixent J. M. Omegacoeur, a Mediterranean
nutritional complement, stimulates Na,K-ATPase activity in
human endothelial cells. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand)
2001;47: 313-318.
27. Durgaprasad, S., Pai C. G., Vasanthkumar, Alvres J.
F., Namitha S. A pilot study of the antioxidant effect of
curcumin in tropical pancreatitis. Indian J Med Res
2005;122: 315-318.
28. Egan, M. E., Pearson M., Weiner S. A., Rajendran V.,
Rubin D., Glockner-Pagel J., Canny S., Du K., Lukacs G.
1407
L., Caplan M. J. Curcumin, a major constituent of turmeric,
inhibiting ERK and NF-kappaB transcriptional activity.
corrects cystic fibrosis defects. Science 2004;304: 600-602.
Food Chem Toxicol 2009.
29. Erkkila, A. T., Matthan N. R., Herrington D. M.,
43. Malaviya, A. N., Kapoor S. K., Singh R. R., Kumar
Lichtenstein A. H. Higher plasma docosahexaenoic acid is
A., Pande I. Prevalence of rheumatoid arthritis in the adult
associated with reduced progression of coronary
Indian population. Rheumatol Int 1993;13: 131-134.
atherosclerosis in women with CAD. J Lipid Res 2006;47:
44. Menendez, J. A., Lupu R. Mediterranean dietary
2814-2819.
traditions for the molecular treatment of human cancer: anti30. Funk, J. L., Frye J. B., Oyarzo J. N., Kuscuoglu N.,
oncogenic actions of the main olive oil's monounsaturated
Wilson J., McCaffrey G., Stafford G., Chen G., Lantz R. C.,
fatty acid oleic acid (18:1n-9). Curr Pharm Biotechnol
Jolad S. D., Solyom A. M., Kiela P. R., Timmermann B. N.
2006;7: 495-502.
Efficacy and mechanism of action of turmeric supplements
45. Mente, A., de Koning L., Shannon H. S., Anand S. S.
in the treatment of experimental arthritis. Arthritis Rheum
A systematic review of the evidence supporting a causal link
2006;54: 3452-3464.
between dietary factors and coronary heart disease. Arch
31. Ghayur, M. N., Gilani A. H., Afridi M. B., Houghton
Intern Med 2009;169: 659-669.
P. J. Cardiovascular effects of ginger aqueous extract and its
46. Metcalf, R. G., Sanders P., James M. J., Cleland L. G.,
phenolic constituents are mediated through multiple
Young G. D. Effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty
pathways. Vascul Pharmacol 2005;43: 234-241.
acids on the inducibility of ventricular tachycardia in
32. Goua, M., Mulgrew S., Frank J., Rees D., Sneddon A.
patients with ischemic cardiomyopathy. Am J Cardiol
A., Wahle K. W. Regulation of adhesion molecule
2008;101: 758-761.
expression in human endothelial and smooth muscle cells by
47. Mitrou, P. N., Kipnis V., Thiebaut A. C., Reedy J.,
omega-3 fatty acids and conjugated linoleic acids:
Subar A. F., Wirfalt E., Flood A., Mouw T., Hollenbeck A.
involvement of the transcription factor NF-kappaB?
R., Leitzmann M. F., Schatzkin A. Mediterranean dietary
Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2008;78: 33-43.
pattern and prediction of all-cause mortality in a US
33. Grimsgaard, S., Bonaa K. H., Hansen J. B., Myhre E.
population: results from the NIH-AARP Diet and Health
S. Effects of highly purified eicosapentaenoic acid and
Study. Arch Intern Med 2007;167: 2461-2468.
docosahexaenoic acid on hemodynamics in humans. Am J
48. Mohanty, I., Arya D. S., Gupta S. K. Effect of
Clin Nutr 1998;68: 52-59.
Curcuma longa and Ocimum sanctum on myocardial
34. Harris, W. S., Mozaffarian D., Rimm E., Krisapoptosis in experimentally induced myocardial ischemicEtherton P., Rudel L. L., Appel L. J., Engler M. M., Engler
reperfusion injury. BMC Complement Altern Med 2006;6: 3.
49. Mohanty, I., Singh Arya D., Dinda A., Joshi S.,
M. B., Sacks F. Omega-6 fatty acids and risk for
Talwar K. K., Gupta S. K. Protective effects of Curcuma
cardiovascular disease: a science advisory from the
longa on ischemia-reperfusion induced myocardial injuries
American Heart Association Nutrition Subcommittee of the
and their mechanisms. Life Sci 2004;75: 1701-1711.
Council on Nutrition, Physical Activity, and Metabolism;
50. Nicoll, R., Henein M. Y. Ginger (Zingiber officinale
Council on Cardiovascular Nursing; and Council on
Roscoe): a hot remedy for cardiovascular disease? Int J
Epidemiology and Prevention. Circulation 2009;119: 902Cardiol 2009;131: 408-409.
907.
51. Panagiotakos, D. B., Dimakopoulou K., Katsouyanni
35. Huang, M. T., Lysz T., Ferraro T., Abidi T. F., Laskin
K., Bellander T., Grau M., Koenig W., Lanki T., Pistelli R.,
J. D., Conney A. H. Inhibitory effects of curcumin on in
Schneider A., Peters A. Mediterranean diet and
vitro lipoxygenase and cyclooxygenase activities in mouse
inflammatory response in myocardial infarction survivors.
epidermis. Cancer Res 1991;51: 813-819.
Int J Epidemiol 2009;38: 856-866.
36. Jeong, C. H., Bode A. M., Pugliese A., Cho Y. Y.,
52. Pardridge, W. M. Transport of protein-bound
Kim H. G., Shim J. H., Jeon Y. J., Li H., Jiang H., Dong Z.
hormones into tissues in vivo. Endocr Rev 1981;2: 103-123.
[6]-Gingerol suppresses colon cancer growth by targeting
53. Prasad, C. P., Rath G., Mathur S., Bhatnagar D.,
leukotriene A4 hydrolase. Cancer Res 2009;69: 5584-5591.
Ralhan R. Expression analysis of maspin in invasive ductal
37. Jiang, J., Wang W., Sun Y. J., Hu M., Li F., Zhu D. Y.
carcinoma of breast and modulation of its expression by
Neuroprotective effect of curcumin on focal cerebral
curcumin in breast cancer cell lines. Chem Biol Interact
ischemic rats by preventing blood-brain barrier damage. Eur
2009;26: 26.
J Pharmacol 2007;561: 54-62.
54. Rathore, P., Dohare P., Varma S., Ray A., Sharma U.,
38. Kim, S. O., Kundu J. K., Shin Y. K., Park J. H., Cho
Jagannathan N. R., Ray M. Curcuma oil: reduces early
M. H., Kim T. Y., Surh Y. J. [6]-Gingerol inhibits COX-2
accumulation of oxidative product and is anti-apoptogenic
expression by blocking the activation of p38 MAP kinase
in transient focal ischemia in rat brain. Neurochem Res
and NF-kappaB in phorbol ester-stimulated mouse skin.
2008;33: 1672-1682.
Oncogene 2005;24: 2558-2567.
55. Russo, G. L. Dietary n-6 and n-3 polyunsaturated fatty
39. Koscielny, J., Klussendorf D., Latza R., Schmitt R.,
acids: from biochemistry to clinical implications in
Radtke H., Siegel G., Kiesewetter H. The antiatherosclerotic
cardiovascular prevention. Biochem Pharmacol 2009;77:
effect of Allium sativum. Atherosclerosis 1999;144: 237937-946.
249.
56. Satoskar, R. R., Shah S. J., Shenoy S. G. Evaluation of
40. Kris-Etherton, P. M., Harris W. S., Appel L. J. Fish
anti-inflammatory property of curcumin (diferuloyl
consumption, fish oil, omega-3 fatty acids, and
methane) in patients with postoperative inflammation. Int J
cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol
Clin Pharmacol Ther Toxicol 1986;24: 651-654.
2003;23: e20-30.
57. Saw, C. L., Huang Y., Kong A. N. Synergistic anti41. Liang, B., Wang S., Ye Y. J., Yang X. D., Wang Y.
inflammatory effects of low doses of curcumin in
L., Qu J., Xie Q. W., Yin M. J. Impact of postoperative
combination
with
polyunsaturated
fatty
acids:
omega-3 fatty acid-supplemented parenteral nutrition on
docosahexaenoic acid or eicosapentaenoic acid. Biochem
clinical outcomes and immunomodulations in colorectal
Pharmacol;79: 421-430.
cancer patients. World J Gastroenterol 2008;14: 2434-2439.
58. Schwellenbach, L. J., Olson K. L., McConnell K. J.,
42. Lim, J. H., Kwon T. K. Curcumin inhibits phorbol
Stolcpart R. S., Nash J. D., Merenich J. A. The triglyceridemyristate acetate (PMA)-induced MCP-1 expression by
1408
SOTTEJEAU Y. et al.
lowering effects of a modest dose of docosahexaenoic acid
alone versus in combination with low dose eicosapentaenoic
acid in patients with coronary artery disease and elevated
triglycerides. J Am Coll Nutr 2006;25: 480-485.
59. Seki, H., Tani Y., Arita M. Omega-3 PUFA derived
anti-inflammatory
lipid
mediator
resolvin
E1.
Prostaglandins Other Lipid Mediat 2009;89: 126-130.
60. Sharma, M., Kishore K., Gupta S. K., Joshi S., Arya
D. S. Cardioprotective potential of ocimum sanctum in
isoproterenol induced myocardial infarction in rats. Mol Cell
Biochem 2001;225: 75-83.
61. Shoba, G., Joy D., Joseph T., Majeed M., Rajendran
R., Srinivas P. S. Influence of piperine on the
pharmacokinetics of curcumin in animals and human
volunteers. Planta Med 1998;64: 353-356.
62. Siddiqui, M. A., Singh G., Kashyap M. P., Khanna V.
K., Yadav S., Chandra D., Pant A. B. Influence of cytotoxic
doses of 4-hydroxynonenal on selected neurotransmitter
receptors in PC-12 cells. Toxicol In Vitro 2008;22: 16811688.
63. Sivam, G. P. Protection against Helicobacter pylori
and other bacterial infections by garlic. J Nutr 2001;131:
1106S-1108S.
64. Srinivasan, K. Black pepper and its pungent principlepiperine: a review of diverse physiological effects. Crit Rev
Food Sci Nutr 2007;47: 735-748.
65. Srivastava, G., Mehta J. L. Currying the heart:
curcumin and cardioprotection. J Cardiovasc Pharmacol
Ther 2009;14: 22-27.
66. Stevens, L., Zhang W., Peck L., Kuczek T., Grevstad
N., Mahon A., Zentall S. S., Arnold L. E., Burgess J. R.
EFA supplementation in children with inattention,
hyperactivity, and other disruptive behaviors. Lipids
2003;38: 1007-1021.
67. Stewart, J. J., Wood M. J., Wood C. D., Mims M. E.
Effects of ginger on motion sickness susceptibility and
gastric function. Pharmacology 1991;42: 111-120.
68. Su, K. P., Huang S. Y., Chiu C. C., Shen W. W.
Omega-3 fatty acids in major depressive disorder. A
preliminary double-blind, placebo-controlled trial. Eur
Neuropsychopharmacol 2003;13: 267-271.
69. Swamy, M. V., Citineni B., Patlolla J. M., Mohammed
A., Zhang Y., Rao C. V. Prevention and treatment of
pancreatic cancer by curcumin in combination with omega-3
fatty acids. Nutr Cancer 2008;60 Suppl 1: 81-89.
70. Tapsell, L. C., Hemphill I., Cobiac L., Patch C. S.,
Sullivan D. R., Fenech M., Roodenrys S., Keogh J. B.,
Clifton P. M., Williams P. G., Fazio V. A., Inge K. E.
Health benefits of herbs and spices: the past, the present, the
future. Med J Aust 2006;185: S4-24.
71. Taqvi, S. I., Shah A. J., Gilani A. H. Blood pressure
lowering and vasomodulator effects of piperine. J
Cardiovasc Pharmacol 2008;52: 452-458.
72. Tattelman, E. Health effects of garlic. Am Fam
Physician 2005;72: 103-106.
73. Unnikrishnan, M. C., Kuttan R. Cytotoxicity of
extracts of spices to cultured cells. Nutr Cancer 1988;11:
251-257.
74. Vijayakumar, R. S., Surya D., Nalini N. Antioxidant
efficacy of black pepper (Piper nigrum L.) and piperine in
rats with high fat diet induced oxidative stress. Redox Rep
2004;9: 105-110.
75. Waterman, E., Lockwood B. Active components and
clinical applications of olive oil. Altern Med Rev 2007;12:
331-342.
76. Zulet, M. A., Marti A., Parra M. D., Martinez J. A.
Inflammation and conjugated linoleic acid: mechanisms of
action and implications for human health. J Physiol
Biochem 2005;61: 483-494.
1409
Résultats
V Protocole d'essai clinique de l'association composés Omégacoeur® et
Dolupérine® dans une protection cardiovasculaire
Ce protocole d'essai clinique a pour but d'évaluer la protection cardiovasculaire
de l'association d'Omégacoeur® et Dolupérine® et d'obtenir une allégation santé pour
cette association. Afin de pouvoir réaliser cette évaluation, nous avons décidé de
l'évaluer dans une prévention secondaire (personne ayant déjà eu un accident
cardiovasculaire). Les paramètres évalués seront les triglycérides, les LDL cholestérol,
des HDL cholestérol, des non HDL cholestérol (le cholestérol sans les HDL
cholestérol), les risques cardiovasculaires absolus déterminés par la méthode de
Framingham, les marqueurs de l'inflammation, les marqueurs de la coagulation, les
marqueurs du dysfonctionnement endothéliale, la pression artérielle et la tolérance
générale aux produits.
Ce protocole clinique n'est qu'une ébauche et n'est pas définitif. Il devra être
révisé après concertation avec le médecin investigateur.
Yoann Sottejeau
171
Résultats
Synopsis étude Omégacoeur®/Dolupérine®
Date : XXX
N° de l’essai: XXX
Nom du Promoteur : Holistica
Produit : Omégacoeur® et Dolupérine®
Substances actives :
Omégacoeur®
Dolupérine®
Titre : Evaluation de l'efficacité et de l'acceptabilité de l'association des compléments
alimentaires Omégacoeur® et Dolupérine® destiné à améliorer le profil lipidique des
patients venant d'avoir un accident cardiovasculaire chez les hommes ou les femmes de X à
X ans ayant une dyslipidémie: étude randomisée, en double aveugle contrôlée par placebo.
Investigateur - Coordonnateur : XXX
Centre Coordonnateur : XXX
Rationnel :
La mortalité d'origine cardiovasculaire dans le monde s'élève selon l'OMS à 17
millions d'individus par an ce qui équivaut à 30% de la mortalité mondiale. La première
cause de décès chez les personnes atteintes de maladies cardiovasculaires est l'infarctus du
myocarde (7,2 millions par an dans le monde) (Weir RA, McMurray JJ. Epidemiology of
heart failure and left ventricular dysfunction after acute myocardial infarction. Curr Heart
Fail Rep. 2006 Dec;3(4):175-80. Review; et Weir RA, McMurray JJ, Velazquez EJ.
Epidemiology of heart failure and left ventricular systolic dysfunction after acute myocardial
infarction: prevalence, clinical characteristics, and prognostic importance. Am J Cardiol.
2006 May 22;97(10A):13F-25F. Epub 2006 Apr 21. Review.).
Lors d'un infarctus du myocarde, l'irrigation d'une partie du cœur est interrompue.
Lors de cette ischémie prolongée, les cellules du myocarde privées de sang et d'oxygène
meurent, libérant leurs enzymes qui détruisent le tissu environnant. Le plus souvent,
l'infarctus du myocarde est une complication aiguë de l'athérosclérose coronaire par la
rupture d'une plaque d'athérome sur l'artère causant son occlusion. Cette plaque
athéromateuse correspond à une accumulation de lipides, de glucides, de sang, de produits
sanguins, de tissu fibreux et de dépôts calcaires. Les LDL, composés plasmatiques
transportant le cholestérol, pénètrent et s'accumulent dans l'intima des artères. Après leur
pénétration, les LDL s'oxydent et ne peuvent plus être dégradés. Les macrophages
accumulent les oxy-LDL et se transforment en cellules spumeuses ce qui induit une réaction
inflammatoire chronique. Enfin, les cellules musculaires lisses migrent dans l’intima des
artères et constituent la chape fibreuse dont l’épaisseur est déterminante dans le phénomène
de rupture de la plaque d’athérome à l’origine de l'infarctus du myocarde.
La rupture de la plaque d'athérome permet le contact du sang circulant avec le sousendothélium pro-thrombogène et aboutit à la constitution d'un thrombus occlusif. En effet le
sous-endothélium est composé principalement de macromolécules synthétisées par les
cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses de l'endothélium vasculaire comme le
collagène, des microfibrilles, de la fibronectine, de la thrombospondine, du facteur de Von
Willebrand et des glycosaminoglycanes qui favorisent la coagulation sanguine. Le thrombus
occlusif est accompagné d'une réponse inflammatoire et provoque l'ischémie myocardique
Yoann Sottejeau
172
Résultats
ainsi que la nécrose des cardiomyocytes.
La stratégie employée lors d'un infarctus du myocarde est la reperfusion rapide de
l'artère afin de diminuer la mortalité et les risques de complication liés à l'insuffisance
cardiaque aigüe. La restauration de l'artère ouverte est réalisée soit par thrombolyse veineuse
ou soit par angioplastie coronarienne.
Après l'intervention, un traitement médical est administré. Celui-ci vise la diminution
de la mortalité cardiovasculaire en diminuant le risque de récidive et en stabilisant la plaque
d'athérome. Ce traitement est une association de béta-bloquants, d’acide acétylsalicylique, de
statine, d’inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine et de la prise en charge des
facteurs de risques. par des mesures hygiéno-diététiques. (Gajos G., Optimal treatment for
patients after myocardial infarction: some current concepts and controversies., Pol Arch Med
Wewn. 2008 Jan-Feb;118(1-2):43-51.)
Ces facteurs de risques de l'infarctus du myocarde sont majoritairement liés à
l’athérosclérose. Certains facteurs de risques sont réversibles comme le tabagisme, la
dyslipidémie, l'hypertension artérielle, le diabète de type 2 et l'obésité.
Afin de lutter contre la dyslipidémie (taux élevés de LDL-cholestérol et/ou de triglycérides et
des taux bas de HDL-cholestérol) un traitement à base de statines est prescrit. Seulement
bien que diminuant le profil lipidique, ce traitement n'est pas efficace dans tous les cas
(Davidson MH, Maki KC, Pearson TA, Pasternak RC, Deedwania PC, McKenney JM,
Fonarow GC, Maron DJ, Ansell BJ, Clark LT, Ballantyne CM., Results of the National
Cholesterol Education (NCEP) Program Evaluation ProjecT Utilizing Novel E-Technology
(NEPTUNE) II survey and implications for treatment under the recent NCEP Writing Group
recommendations., Am J Cardiol. 2005 Aug 15;96(4):556-63.). Une association avec une
autre formulation permettrait de couvrir la diminution du profil lipidique de tous les patients.
L'association des produits testés Omégacoeur® et Dolupérine®, sont des compléments
alimentaires commercialisés en XXXX pour participer à l'entretien de la circulation
(Omégacoeur®) et en XXXX pour les gênes liées à l’inflammation (Dolupérine®).
Omégacoeur® est composé d'huile de poissons sauvages, d'un nuxoléat méditerranéen
(macérat d’ail, de basilic, d'huile d’olive et d'huile de noix) et d'huile de germe de blé. Le
tout est enrobé dans une capsule en gélatine de poissons sauvages. Ce complément
alimentaire fournit les acides gras polyinsaturés 3,6,9. Dolupérine®, est composé de curcuma
concentré en curcumine, d'extrait de gingembre titré en gingerol et d'extrait de poivre. Les
composés majoritaires de ces deux compléments alimentaires Ȧ 3 (Omégacoeur®) et
curcumine (Dolupérine®) ont des propriétés notamment agissant sur le profil lipidique et sur
l'inflammation. Cette étude a été envisagée dans le but d’évaluer l’efficacité et la tolérance de
l'association des compléments alimentaires dans la diminution du profil lipidique en
association de statines lors d'une dyslipidémie survenant après un infarctus du myocarde.
Phase clinique
Période d'étude
Soumission CPP
Début d’essai
Dernier sujet recruté
Dernière visite / dernier sujet
date
date
date
date
Résultats d’analyse interim
Gel de base
Analyse statistique
Rapport Clinique (résumé)
date
date
date
date
Phase IV
Complément
alimentaire
Objectifs
_ Etude visant à démontrer l’efficacité de l'association des compléments alimentaires
Omégacoeur® et Dolupérine®, pour améliorer le profil lipidique suite à un infarctus du
myocarde.
Yoann Sottejeau
173
Résultats
Les sujets sélectionnés devront présenter une dyslipidémie post-infarctus.
Objectif principal :
_ Mise en évidence d’une diminution de la tryglycéridémie chez des patients ayant eu un
infarctus du myocarde et présentant une dyslipidémie par comparaison avec le Placebo après
8 semaines de prise des produits
Objectifs secondaires :
- Diminution ou non augmentation des LDL cholestérol
- Augmentation ou non diminution des HDL cholestérol
- Diminution ou non augmentation des non HDL cholestérol
- Evaluation de l’effet du produit test versus placebo sur les risques cardiovasculaires absolus
par la méthode de Framingham
- Evaluation de l'effet du produit testé versus placebo sur l'inflammation
- Evaluation de l'effet du produit testé versus placebo sur la coagulation
- Evaluation de l'effet du produit testé versus placebo sur le dysfonctionnement endothéliale
- Evaluation de l'effet du produit testé versus placebo sur la pression artérielle
_ Tolérance générale au produit.
Méthodologie :
Étude multicentrique, en double aveugle, randomisée, contrôlée par placebo.
Nombre de sujets nécessaires :
Population de l’essai :
Critères d’inclusion
Pourra être inclus tout sujet présentant tous les critères suivants :
_ Sujet de sexe masculin ou féminin âgé de XX ans à XX ans,
_ Sujet hospitalisé pour un infarctus du myocarde
_ Sujet étant sous un traitement à base de statines
_ Présentant un taux sanguin de triglycérides entre 2 et 5 g/L
_ Sujet qui ne change ni ses habitudes de vie ni son régime alimentaire,
_ Sujet facilement joignable et suffisamment coopérant pour se conformer aux impératifs de
l'étude,
_ Ayant donné son consentement écrit (sujet sachant lire et écrire) préalablement à toute
procédure liée à l’essai,
_ Sujet affilié à un régime de sécurité sociale.
Critères d’exclusion
Ne pourra pas être inclus, un sujet présentant au moins l’un des critères suivants :
- Problèmes médicaux significatifs pour les affections suivantes :
_ Diabètes
_ Pancréatite
_ Hypothyroïdie
_ Toute anomalie clinique identifiée au cours de la visite de sélection qui, de l'avis de
l'investigateur, serait de nature à compromettre la réalisation en toute sécurité de l'étude.
Yoann Sottejeau
174
Résultats
- un critère lié aux traitements antérieurs ou associés :
_ Traitement altérant les lipides autres que les statines
_ Prise de compléments alimentaires à base d’Ȧ 3, de curcumine ou d'autres composés
ayant des propriétés d'action sur les lipides
_ Sujet ayant une allergie connue au produit à l’essai ou à l’un de ses constituants.
- Un critère lié aux habitudes de vie :
_ Consommation excessive d'alcool,
_ Consommation régulière de stupéfiants.
- un critère lié au sujet :
_ Sujet susceptible selon l'investigateur, de ne pas se conformer aux instructions du
protocole et / ou d’être non observant à la complémentation,
_ Sujet ayant participé dans le mois précédent à un essai clinique ou y participant au
moment de sa sélection,
_ Sujet dans l'incapacité linguistique ou psychique de comprendre et de signer le
consentement éclairé,
_ Personne étant privée de liberté par décision administrative ou judiciaire, ou étant sous
tutelle,
_ Pour les femmes non ménopausées :
- pas de contraception efficace (contraceptif oral, dispositif intra-utérin, ligature des
trompes, chirurgie),
- femme enceinte ou allaitante
Produits à l’essai :
· Le produit test Omégacoeur® est composé d' Ȧ 3 (35 %), particulièrement en E.P.A. (17 %)
et en D.H.A. (12 %), en Ȧ 6 (11%) dont 9 % d'acide linoléique et d'Ȧ 9 (15%). Il se présente
sous forme de capsules en gélatine de poissons sauvages de couleur XXX et de taille XXX.
· Le produit test Dolupérine® composé de curcuma concentré en curcumine (95%), d'extrait
de gingembre titré en gingerol (5%) et d'extrait de poivre (95% de piperine). Il se présente
sous forme de gélules opaques d’origine végétale, de couleur XXX et de taille XX.
· Le placebo sera présenté sous la même forme, non distinguable des produits à l’essai.
· Les produits seront assignés en double aveugle selon une liste de randomisation définissant
pour chaque numéro de produit la séquence de supplémentation (groupe A : placebo et
groupe B : produit test).
· Les produits sont conditionnés sous blisters de XX gélules avec X blisters par étui soit XX
gélules par étui. X étuis seront remis à chaque patient pour assurer 8 semaines de
supplémentation.
Dose et administration
Chaque patient prendra quotidiennement X gélules et X capsules du produit attribué, en trois
prises avant chaque repas avec un verre d’eau, et cela durant les 8 semaines consécutives de
supplémentation.
Déroulement de l'essai
Après signature du consentement, les patients identifiés suivront une visite de sélection
(critères d’inclusion et non inclusion, examen clinique complet).
A la visite V2 (Inclusion), si tous les critères d’inclusion sont conformes au protocole, les
compléments alimentaires ou le placebo seront remis en double aveugle aux patients selon la
liste de randomisation. Chaque patient prendra quotidiennement pendant une durée de 8
semaines X gélules et X capsules des produits ou X gélules et X capsules de placebo.
Yoann Sottejeau
175
Résultats
A la visite V3 (à 8 semaines), les patients restitueront les lots de traitement. Cette visite
comprendra la mesure de compliance, le bilan clinique et le remplissage du cahier
d’observation.
Critères d'évaluation :
Critères d’efficacité
Recherche de l’efficacité des produits à l’essai vis-à-vis du profil lipidique en fin de
complémentation par rapport au groupe placebo
_ Evolution de la tryglycéridémie sous Omégacoeur® et Dolupérine®, et comparaison des
résultats avec les placebos.
Critères secondaires
_ Evolution des LDL cholestérol : analyse intergroupe
_ Evolution des HDL cholestérol : analyse intergroupe
_ Evolution des non HDL cholestérol: analyse intergroupe
- Evolution de l’effet du produit test versus placebo sur les risques cardiovasculaires absolus
par la méthode de Framingham : analyse intergroupe
- Evolution de l'effet du produit test versus placebo sur l'inflammation : analyse intergroupe
- Evolution de l'effet du produit test versus placebo sur la coagulation : analyse intergroupe
- Evolution de l'effet du produit test versus placebo sur le dysfonctionnement endothéliale :
analyse intergroupe
- Evolution de l'effet du produit test versus placebo sur la pression artérielle : analyse
intergroupe
Critères d'acceptabilité
_ Recueil des données de sécurité standard (examen physique et poids corporel) à la
sélection, et à la visite de fin d'étude (V3), comme décrit dans le protocole.
_ Recueil et suivi des événements indésirables survenus pendant l’étude. Les éventuels effets
indésirables graves seront notifiés et rapportés au promoteur dans les 24 h.
Méthodes statistiques
L’analyse des données recueillies est de type descriptive. L’analyse statistique des données
sera réalisée à l’aide du logiciel SAS. Une valeur de p<0.05 sera considérée comme
statistiquement significative.
Analyse de l’acceptabilité
La fréquence des événements indésirables rapportés en cours d’étude sera fournie par groupe
de sujets selon la classification MedDRA.
Analyse statistique intermédiaire
Non applicable.
Yoann Sottejeau
176
Discussion et Perspectives
177
Ce travail de thèse a consisté à étudier les fonctions et le rôle de la Na+, K+ATPase durant l'ischémie/reperfusion cardiaque notamment les altérations causés par
la reperfusion, la protection que procure l'Ouabaïne Precondioning, la compréhension
de la diversité des isoformes de la Na+, K+-ATPase sur sa fonction de signalisation et
le rôle de l'ISR dans la régulation des PKC, ainsi que les possibles effets
cardioprotecteurs de l'association des composés Omégacoeur® et Dolupérine® sur
l'ischémie/reperfusion.
I Na+, K+-ATPase, signalisation et IR
Les résultats obtenus démontrent clairement que les isoformes Į1, Į3 et Į4 de
+
la Na , K+-ATPase en présence ont une fonction de signalisation initiée par l'ouabaïne
et passant par ERK1/2 dans les cellules d'insectes Sf9. La réponse aux différentes
doses d'ouabaïne testées est en corrélation avec la sensitivité de chaque isoforme chez
le rat. En effet, la phosphorylation d'ERK1/2 pour l' Į1 est maximale à 1 mM, Į3 à 0,1
μm et Į4 à 1 μm. Alors qu'au contraire, l'isoforme Į2 n'a révélé aucune fonction de
signalisation relayée par l'activation d'ERK1/2. L'association de l'isoforme Į2 avec la
sous unité ȕ1 est une possible explication de cette non-signalisation. En effet, la sous
unité ȕ1 pourrait influencer la capacité de l'isoforme Į2 à signaler. Il est possible que
la fonction de signalisation de l'isoforme Į2 s'effectue avec une autre isoforme de la
sous unité ȕ. Il se peut aussi que la fonction de signalisation n'emprunte pas la voie
passant par ERK1/2. Une autre possibilité serait que l'isoforme Į2 aurait besoin d'une
autre isoforme Į pour transduire un signal. En effet, dans la cavéole de cardiomyocyte
de rat adulte, l'isoforme Į2 est retrouvée en présence des isoformes Į1 et Į3. De plus
l'ouabaïne induit le recrutement dans la cavéole de l'isoforme Į2 et de Src [122]. La
relation entre l' Į2 et Src a démontré que l'ouabaïne induisait une plus grande
association entre Į2 et Src dans les cellules humaines de muscles squelettiques [292].
Du fait qu'il ait été impossible de détecter la phosphorylation de Src dans les cellules
d'insecte, il est important de confirmer ces résultats dans des cellules de mammifère.
La génération d'une lignée stable exprimant seulement l'isoforme Į2 de la Na+, K+ATPase dans des cellules rénales LLCPK1 modifiées va permettre l'étude de la
signalisation de cette isoforme et son action sur ERK ½. Les résultats préliminaires sur
Yoann Sottejeau
178
la signalisation relayée par ERK1/2 de l'isoforme Į2, non présenté ici, confirment les
résultats obtenus dans les cellules d'insectes. L'étude de Src qui est le premier
effecteur de la signalisation de la Na+, K+-ATPase parait actuellement primordial pour
définir la capacité de signalisation de l'isoforme Į2 seule.
Cette signalisation de la Na+, K+-ATPase induite par l'ouabaïne a déjà
démontré une protection cardiovasculaire lors de l'ischémie reperfusion [171]. Les
résultats d'ischémie/reperfusion sur les cardiomyocytes suggèrent que la protection
obtenue par Ouabaïne preconditioning est similaire aux résultats obtenus sur cœur
isolé perfusé. [171]. En effet l'ouabaïne preconditioning permet de diminuer la mort
cellulaire (suggéré par les résultats de LDH dans le milieu dans le milieu de culture et
les marquages Annexin V/PI), et cette protection est réalisée en activant la PKCİ. Il
est intéressant de noter que cette protection peut s'effectuer sur des cardiomyocytes
seuls sans l'influence des cellules environnantes telles que les cellules endothéliales et
les fibroblastes.
Les résultats obtenus sur la Na+, K+-ATPase lors de l'ischémie/reperfusion
ainsi que sa préservation lors de l'ouabaïne preconditioning montrent l'importance de
la
Na+,
K+-ATPase
dans
l'ischémie/reperfusion.
Or
les
études
de
l'ischémie/reperfusion ont mis en avant le rôle des récepteurs couplés à la protéine G
(GPCR) qui sont eux aussi endocytés pendant l'ischémie/reperfusion et qui joue un
rôle très important dans le preconditioning [74]. La théorie du signalosome démontre
que les différents conditioning (Bradykinine, et ouabaïne) permettent la formation
d'une vésicule cavéolaire recrutant le récepteur membranaire impliqué et les protéines
de signalisation nécessaires à la protection cardiovasculaire (Figure 33).
Yoann Sottejeau
179
Figure 33 Théorie du signalosome adaptée de [293]
Ce signalosome va alors activer la PKCİ par translocation à la mitochondrie et
permettre l'ouverture du canal MitoKATP ce qui inhibera le pore de transition de
perméabilité mitochondriale [293]. Il est donc possible que lors d'un conditioning, le
récepteur membranaire impliqué n'est pas le seul récepteur recruté dans la cavéole. Il
serait intéressant d'étudier si le signalosome de la Na+, K+-ATPase incorpore GPCR et
inversement si lors d'un conditioning impliquant un GPCR, son signalosome contient
la Na+, K+-ATPase. En cas de différence, cela pourrait mettre en évidence quels
récepteurs sont les plus importants pour le signalosome ainsi que pour la protection
cardiovasculaire.
Yoann Sottejeau
180
Ce modèle in vitro permet de détailler les mécanismes cellulaires de
l'ischémie/reperfusion ainsi que ceux de l'ouabaïne preconditioning et vient compléter
les données ex-vivo obtenus sur le rat [171] et le lapin [172]. La suite de l'étude de la
protection de l'ischémie/reperfusion par l'ouabaïne preconditioning devrait se
poursuive sur un modèle animal in vivo voir si c'est concluant par un essai clinique en
utilisant de faible concentration de digoxine chez l'homme. Afin de faciliter
l'utilisation potentielle clinique d'un conditioning aux digitaliques, les recherches
devraient explorer la possibilité d'un traitement à l'ouabaïne postconditioning.
II Na+, K+-ATPase, endocytose et IR
Les résultats obtenus suggèrent que le motif dileucine [DE]XXXL[LI] présent
dans ISR de l'isoforme Į1 de la Na+, K+-ATPase joue un rôle important dans la
régulation de cette isoforme. En effet, la disparition de ce motif engendre après
activation des PKC par le PMA, une augmentation de l'activité membranaire de la
Na+, K+-ATPase équivalente à celle observée sur la chimère Į1Į2Į1 dont on a
remplacé l'ISR de l' Į1 contenant le motif dileucine par celui de l' Į2 qui ne le contient
pas. En voulant étudier l'effet des PKC sur l'expression de surface de la Na+, K+ATPase, nous avons observé qu'en condition basale, le mutant Į1-L499V était plus
exprimé à la surface membranaire que l' Į1. Cette différence a l'état basal n'engendre
pourtant pas de changement d'activité de la Na+, K+-ATPase. Ces résultats confirment
la présence de Na+, K+-ATPase à la surface membranaire qui n'utilise pas leur fonction
enzymatique et confortent l'idée de différents pool de la Na+, K+-ATPase à la
membrane cellulaire "pumping pool" et "non pumping pool" [144]. Il serait d'ailleurs
intéressant d'effectuer une autre étude pour d'écrire précisément, ce "non pumping
pool" et de caractériser les fonctions de signalisation de ce mutant Į1-L499V.
L'évaluation des pools de la Na+, K+-ATPase pourrait se faire par la mesure de
l'activité par flux de rubidium en présence de Methyl-beta-Cyclodextrin (MȕCD). Le
MȕCD va chélater le cholestérol et rompre les cavéoles formées à la membrane ce qui
entraînera la transformation du pool de "non pumping" qui réside dans les cavéoles en
pool de "pumping pump".
La différence d'expression à la surface membranaire de la Na+, K+-ATPase est
probablement le fait que le motif [DE]XXXL[LI] peut être reconnu par les adaptateurs
Yoann Sottejeau
181
à la clathrine AP-1 et AP-2 [162]. Les techniques de biotynylation utilisées décrivent
un ralentissement de l'endocytose de la Na+, K+-ATPase par le mutant Į1-L499V par
rapport à l' Į1. Les résultats obtenus avec la chlorpromazine suggèrent que le
mécanisme impliqué dans ce ralentissement serait dû au recyclage membranaire par
les vésicules de clathrine. La caractérisation du mutant Į1-E495S sur l'action du PMA
sur l'activité de la Na+, K+-ATPase ainsi que la distribution de la Na+, K+-ATPase à la
surface membranaire à l'état basal démontre l'importance du motif [DE]XXXL[LI] de
l'ISR dans la régulation de l'isoforme Į1 de la Na+, K+-ATPase. Cette disparition du
motif dans l'ISR, qui rend l'ISR Į1 similaire à celui de l'Į2, démontre l'hétérogénéité
dans la régulation par les PKC ainsi que la distribution des différentes isoformes Į de
la Na+, K+-ATPase. En fonction de l'état physiologique de la cellule, ces différences
de régulations permettent probablement un ajustement des différentes expressions des
isoformes Į de la Na+, K+-ATPase afin d'assurer différentes réponses de la fonction
enzymatique et d'engendrer des différences de transduction du signal en présence de
digitaliques endogènes.
Les résultats obtenus démontrent que la modulation de l’expression
membranaire de la Na+, K+-ATPase par la mutation L499V sur le polypeptide Į1
permet de diminuer la mort cellulaire causée par l'ischémie/reperfusion. Cette
réduction est due à une plus grande présence du mutant Į1-L499V que de Į1 à la
surface membranaire pendant l'ischémie/reperfusion. Cependant le mutant Į1-L499V
n'empêche pas une diminution de la Na+, K+-ATPase à la surface membranaire durant
l'ischémie/reperfusion. Cette augmentation de la Na+, K+-ATPase à la surface
membranaire permet probablement lors de la reperfusion quand la concentration
intracellulaire de Na+ élevée de revenir plus rapidement à une concentration
physiologique et de limiter les lésions délétères que peuvent apporter cette
augmentation [48, 281]. D'après les caractéristiques du mutant Į1-L499V,
l'augmentation de l'activité enzymatique lors de cette excès de Na+ intracellulaire
s'effectuerait probablement par une augmentation du "pumping pool" au détriment du
"non pumping pool". Seulement, l'étude de l'activité membranaire du mutant dans des
conditions d'ischémie/reperfusion n'a pas encore été évaluée. Les résultats suggèrent
aussi que l'Ischémie/Reperfusion induit une internalisation de la Na+, K+-ATPase.
Yoann Sottejeau
182
Cette internalisation de la Na , K -ATPase lors de l'ischémie/reperfusion dans
+
+
les cellules rénales est confirmée par les résultats obtenus dans les cellules cardiaques.
Cette internalisation est inhibée par l'ouabaïne précondioning. La corrélation entre la
présence de la Na+, K+-ATPase à la surface membranaire et la protection des effets de
l'ischémie/reperfusion sur la mort cellulaire est confirmée par les résultats obtenus sur
les cardiomyocytes de rats néonataux transfectés transitoirement avec le mutant Į1L499V. L'ischémie/reperfusion induit aussi une diminution de l'activité totale de la
Na+, K+-ATPase. Cette diminution est protégée par l'OPC. Cependant l'activité de la
Na+, K+-ATPase à la surface membranaire ne démontre aucun changement entre les
groupes IR et OPC. Ce résultat couplé aux données sur l'endocytose de la Na+, K+ATPase durant l'ischémie/reperfusion est étonnant. En effet, on aurait pu s'attendre
plutôt à une diminution de la Na+, K+-ATPase à la surface membranaire accompagné
d'une diminution de la l'activité membranaire de la Na+, K+-ATPase pendant
l'ischémie/reperfusion. Tandis que l'OPC par le maintien de la Na+, K+-ATPase à la
surface membranaire maintiendrait l'activité membranaire et permettrait de revenir
plus rapidement à une concentration physiologique intracellulaire de Na+ et de limiter
les dégâts délétères que cela entraîne [48]. Ces résultats suggèrent que l'ouabaïne
préconditioning protège des dommages causés par l'ischémie/reperfusion en
préservant le pool de "non pumping" puisque l'échange d'ions à la membrane reste
identique. Cette protection du pool de "non pumping" passe probablement la
protection de la fonction de signalisation de la Na+, K+-ATPase. Ceci reste à
démontrer en étudiant cette fonction après ischémie/reperfusion. Cependant une autre
étude a démontré que lors de l'ischémie/reperfusion, il y a destruction de la cavéole ce
qui empêcherait d'induire la fonction de signalisation de la Na+, K+-ATPase [294]. Il
se peut aussi que l'activité à la membrane après I/R ne soit pas différente de celle de
l'OPC par une compensation de la diminution de l'activité de l' Į1 par l'isoforme Į3.
Pour vérifier cette hypothèse, il serait intéressant d'observer où se situe cette isoforme
dans la cellule pendant l'ischémie/reperfusion et de mesurer son activité membranaire.
L'Ischémie/Reperfusion induirait donc une internalisation de la Na+, K+ATPase qui pourrait être similaire au mécanisme au mécanisme PURED
(Phosphorylation-Ubiquitination-Recognition-Endocytosis-Degradation)
décrivant
l'endocytose de la Na+, K+-ATPase pendant l'hypoxie pulmonaire. Ce phénomène
PURED, en absence d'oxygène, implique pour les cellules pulmonaires, la
Yoann Sottejeau
183
phosphorylation par la PKCȗ de la Na , K -ATPase sur la Serine 18, puis son
+
+
ubiquitinilation, son endocytose et sa dégradation (Figure 34). Si ce phénomène se
reproduit lors de l'ischémie/reperfusion, il est probable qu' il ait été amorcé pendant
l'ischémie par la privation d'oxygène qui est similaire à l'hypoxie.
Figure 34 Régulation de la Na+, K+-ATPase par le mécanisme PURED adapté de [290]
Selon nos résultats, ce phénomène parait moins probable. D''après notre étude,
cette internalisation interviendrait pendant la reperfusion en présence d'oxygène. Deux
hypothèses pourraient expliquer cette endocytose durant la reperfusion. La première
est qu'à la reperfusion, la faible quantité d'ATP disponible forcerait la cellule à
s'adapter et à réduire le nombre d'ATPase à la surface cellulaire puisque par le passé il
a été démontré que la déplétion de l'ATP provoque une réduction de la Na+, K+ATPase à la surface membranaire [295]. La deuxième est que la Na+, K+-ATPase est
son propre capteur. L'augmentation ou diminution de la concentration de certains
électrolytes (Na+ et K+) de la cellule permet à la Na+, K+-ATPase de passer à la
configuration E2 où elle active Src en l'absence d'ouabaïne [296] et d'induire sa propre
endocytose. En effet, la signalisation par l'ouabaïne peut induire l'endocytose de la
Na+, K+-ATPase et celle-ci est dépendante de l'activation de Src [297]. Or les travaux
de Takeishi démontrent, que pendant l'ischémie/reperfusion, l'activation de Src a lieu
Yoann Sottejeau
184
pendant l'ischémie et celle de ERK ½ pendant la reperfusion [298]. Lorsqu'on
compare les signaux de l'ischémie/reperfusion et ceux du préconditioning par
l’ischémie, les activations de ERK ½ sont similaires alors que celle de Src sont
différentes pendant la phase d'ischémie. En effet, Src est activé en début d'ischémie
(dans les 10 premières minutes) pour le groupe préconditioning alors qu'il est activé
en fin d'ischémie et au moment de la reperfusion pour le groupe ischémie/reperfusion
[299]. L'activation de Src en début de reperfusion pourrait engendrer l'endocytose de
la Na+, K+-ATPase. Cette activation pourrait être induit par la Na+, K+-ATPase ellemême. En effet, il a été démontré que la transition du passage de la conformation E1
vers E2 de l'enzyme permet l'activation Src et que ce changement de conformation
peut être régulé par le Na+ ou le K+ [296]. Ce changement de conformation de E1 à E2
en fonction des concentrations de Na+ et K+ pendant l'ischémie/reperfusion et
l'activation de Src sont en adéquation.
Afin de confirmer ces possibles hypothèses, il serait intéressant d'inhiber Src
pendant l'ischémie par un inhibiteur PP2 ou un inhibiteur spécifique du complexe Na+,
K+-ATPase /Src, le Na,Ktide [300] et d'évaluer l'impact de cette inhibition sur la
surface membranaire après 30 minutes de reperfusion. Il serait aussi intéressant
d'utiliser un inhibiteur de PKCȗ pendant l'ischémie/reperfusion pour vérifier si le
mécanisme PURED intervient dans cette internalisation.
La poursuite de l'étude sur la protection de l'ischémie/reperfusion cardiaque par
modulation de la Na+, K+-ATPase devrait se poursuivre sur un modèle animale. Ce
dernier devra exprimer, spécifiquement dans le cœur, le mutant de la Na+, K+-ATPase
Į1-L499V. L'expression de ce mutant sera exprimée par adénovirus ou lentivirus chez
le rat. L'ischémie/reperfusion sera simulé ex-vivo sur cœur isolé perfusé, voire in vivo.
III Effets cardiovasculaires de l'association des composés Omégacoeur®
et Dolupérine®
Les résultats obtenus démontrent la non toxicité de l'association des composés
Omégacoeur® et Dolupérine® dans des cellules humaines à des doses à potentiel
thérapeutique (2,5 μM de DHA contenu dans Omégacoeur®) /1 μM de curcumine
contenu dans Dolupérine®. et 25/10 μM) [282, 283] Une toxicité a été détectée
Yoann Sottejeau
185
lorsque la dose était 100 à 1000 fois supérieure que la dose thérapeutique (2,5/1 mM).
Cette toxicité est apportée par la Dolupérine® puisque celle-ci seul est aussi toxique à
cette dose (1 mM de curcumine contenu dans Dolupérine®) alors qu'aucune toxicité
n'a été décelée pour Omégacoeur® à la même dose (2,5 mM de DHA contenu dans
Omégacoeur®). La toxicité de la Dolupérine® est probablement due à la curcumine
puisqu'il a été démontré que l'EC50 de la toxicité des curcuminoïdes naturelles sur des
cellules HEK293 se trouve entre 37-200 μM après 16 heures d'activation [301]. En
plus de l'utilisation de cinq fois l'EC50 des curcuminoïdes naturelles, la dose utilisée
de curcumine est aussi environ 70 fois l'EC50 de la curcumine sur l'inhibition de
l'activité de la Na+, K+-ATPase (K0.5 §14.6 μM) [278]. Il est donc fort probable que la
toxicité de la Dolupérine® à la plus forte dose est due à la dose de curcumine
contenue dans le composé. Cette étude démontre l'innocuité à dose thérapeutique de
l'association Omégacoeur® et Dolupérine® sur des cellules humaines.
La suite de l'étude sur les cellules, non présentée ici pour cause de mise en
place d'un brevet, a mis en évidence des effets protecteurs vis à vis de
l'ischémie/reperfusion induite par l'association d'Omégacoeur® et Dolupérine®. Ces
résultats in vitro permettent actuellement la mise en place d'un protocole d'essai
clinique pour obtenir une allégation santé cardiovasculaire de cette association.
L'action des compléments alimentaires dans la santé ne pourra suppléer l'action des
médicaments mais peut les renforcer lors d'une prévention secondaire ou réduire leur
utilisation dans une prévention primaire. Dans ce protocole, nous avons du faire
plusieurs choix afin de pouvoir démontrer l'action bénéfique de l'association dans le
domaine cardiovasculaire chez l'homme. Le type de population, ici pour l'étude, sont
des sujets présentant une dyslipidémie post-infarctus. Le choix des sujets hospitalisés
souffrant de pathologies a été réalisé pour la plus grande facilité de suivre le patient
pendant l'étude clinique, d'éviter les pertes de sujets durant l'étude ainsi que la mise en
évidence d'un effet. Sur un sujet sain, il est plus difficile de mettre en évidence une
baisse de niveau des profils lipidiques si ceux-ci sont déjà normaux soit un faible taux
de triglycéride. L'inconvénient de patients pathologiques est qu'ils sont traités pour
soigner sa pathologie. De part la partielle efficacité du traitement statines dans le cas
d'une dyslipidémie (taux élevés de LDL-cholestérol et/ou de triglycérides et des taux
bas de HDL-cholestérol) [302] et de l'éventuel action sur de l'association
d'Omégacoeur® et Dolupérine® sur le profil lipidique offrent un bon angle d'étude.
Yoann Sottejeau
186
La définition d'un objectif primaire lors du protocole de l'essai clinique est nécessaire
pour estimer l'efficacité du produit en fonction des résultats obtenus par d'autres essais
cliniques sur le même sujet et ainsi de pouvoir calculer le nombre de sujets nécessaires
à l'étude. Aucun essai clinique n'a été réalisé en associant les Ȧ 3 et la curcumine.
Cependant l'association Ȧ 3 et statines a déjà démontré son action sur le profil
lipidique [303-305] ainsi que la curcumine seule [306]. L'objectif primaire choisi est la
diminution des triglycérides puisque les statines seules ne permettent pas un retour à
la normal de ce facteur [302]. L'association d'Omégacoeur® et Dolupérine® n'a
probablement pas uniquement d'action sur le profil lipidique comme décrit dans
l'Introduction les constituants de ces deux composés ont des actions sur les risques
cardiovasculaires, l'inflammation, la coagulation, la pression artérielle ainsi que sur la
dysfonction endothéliale. Ces actions potentielles de l'association seront évaluées dans
les objectifs secondaires. En plus des choix qui ont permis de définir le protocole
d'essai clinique, il a fallu vérifier que ce protocole répondait aux conseils prodigués
par l'EFSA concernant les allégations santé dans le domaine cardiovasculaire [179].
Les objectifs de l'étude sont dans les bénéfices recevables pour une allégation santé (la
réduction ou le maintien de la pression artérielle, l'action sur les lipides sanguins telle
que la diminution du cholestérol- LDL ou des triglycérides, l’augmentation du
cholestérol HDL, la réduction de l'agrégation plaquettaire). La finalisation de ce
protocole d'essai clinique ainsi que de sa mise en place vise à mettre en évidence les
bénéfices de l'association d'Omégacoeur® et Dolupérine® sur les risques
cadiovascualaires et permettre l'obtention d'une allégation santé en cardiovasculaire
pour cette association. Cette allégation santé va pouvoir valoriser les bienfaits des
produits associés et les placera comme des compléments alimentaires de choix dans le
domaine cardiovasculaire.
Yoann Sottejeau
187
Conclusion
188
Conclusion
Cette thèse, sous contrat CIFRE dont les travaux ont été réalisés à l'Université
de Toledo dans le laboratoire du Dr Pierre, m'a permis de mener à bien simultanément
différents projets. Ces projets bien qu'éloignés se sont, au cours du temps, tous se
rejoints dans une même thématique celle de l'ischémie reperfusion cardiaque. De part
l'évolution des projets, certains se sont même entrecroisés.
Ces quatre années de travail ont notamment permis de démontrer les
différences de signalisation entre les isoformes surtout lorsqu'on compare l'isoforme
Į1 à Į2. Outre ces différences de signalisation, ces deux isoformes démontrent des
différences de régulation par les PKC. Cette différence provient de la différence des
séquences d'acides aminés dans l'"Isoform Specific Region" et la présence (Į1) ou
l'absence (Į2) du motif dileucine [DE]XXXL[LI]. Lors de la mise en évidence de cette
différence, la création d'un mutant Į1-L499V a démontré des caractéristiques
spécifiques et notamment une plus grande présence à la membrane cellulaire de la
Na+, K+-ATPase. Cette modulation de la surface membranaire de la Na+, K+-ATPase a
démontré qu'elle protège de la mort cellulaire induite par l'ischémie/reperfusion
rénale. Cette ischémie/reperfusion rénale induit une endocytose de la Na+, K+-ATPase.
Le passage à l'étude de l'ischémie/reperfusion cardiaque a d'abord permis de confirmer
que le modèle utilisé "Substrate and Coverslip hypoxia" reproduisait et confirmait les
effets protecteurs de l'Ouabaïne préconditioning reportées sur cœur isolé perfusé. La
caractérisation de la protection de l'Ouabaïne préconditioning sur la Na+, K+-ATPase
pendant l'ischémie/reperfusion démontre que cette protection protège de l'endocytose
de la Na+, K+-ATPase Į1 qui a lieu pendant la reperfusion, et de la diminution de
l'activité de la Na+, K+-ATPase totale. Les résultats obtenus après transfection du
mutant Į1-L499V dans les cardiomyocytes néonataux confirment que la protection de
l'endocytose de la Na+, K+-ATPase est une protection prioritaire pour réduire la mort
cellulaire induite par l'ischémie/reperfusion.
Ces données montrent toute l'importance de la Na+, K+-ATPase dans
l'ischémie/reperfusion et que sa protection est essentielle pour la survie de la cellule.
Yoann Sottejeau
189
Conclusion
Outre cette recherche fondamentale, les travaux effectués pour les laboratoires
Holistica ont permis d'étudier les effets cardiovasculaires de l'association des
composés Omégacoeur® et Dolupérine®. Les résultats évoqués ici démontrent une
innocuité dans les cellules humaines de cette association à des doses thérapeutiques.
Pour des raisons de confidentialité pour la mise en place d'un brevet, seul les premiers
résultats de l'étude ont pu être présentés. Cependant, les résultats non présentés étant
concluant, un protocole d'essai clinique est en cours de réalisation afin de permettre
l'obtention d'une allégation santé cardiovasculaire à cette association Omégacoeur® et
Dolupérine®.
Yoann Sottejeau
190
Références Bibliographiques
191
1.
Brutsaert, D.L., The indispensable role of cardiac endothelium in the structure and
function of the heart. Verh K Acad Geneeskd Belg, 2003. 65(2): p. 75-116.
2.
Murray, C.J. and A.D. Lopez, Alternative projections of mortality and disability by
cause 1990-2020: Global Burden of Disease Study. Lancet, 1997. 349(9064): p. 1498504.
3.
Thygesen, K., J.S. Alpert, H.D. White, E.S.C.A.A.H.A.W.H.F.T.F.f.t.R.o.M.I. Joint,
A.S. Jaffe, F.S. Apple, M. Galvani, H.A. Katus, L.K. Newby, J. Ravkilde, B.
Chaitman, P.M. Clemmensen, M. Dellborg, H. Hod, P. Porela, R. Underwood, J.J.
Bax, G.A. Beller, R. Bonow, E.E. Van der Wall, J.P. Bassand, W. Wijns, T.B.
Ferguson, P.G. Steg, B.F. Uretsky, D.O. Williams, P.W. Armstrong, E.M. Antman,
K.A. Fox, C.W. Hamm, E.M. Ohman, M.L. Simoons, P.A. Poole-Wilson, E.P.
Gurfinkel, J.L. Lopez-Sendon, P. Pais, S. Mendis, J.R. Zhu, L.C. Wallentin, F.
Fernandez-Aviles, K.M. Fox, A.N. Parkhomenko, S.G. Priori, M. Tendera, L.M.
Voipio-Pulkki, A. Vahanian, A.J. Camm, R. De Caterina, V. Dean, K. Dickstein, G.
Filippatos, C. Funck-Brentano, I. Hellemans, S.D. Kristensen, K. McGregor, U.
Sechtem, S. Silber, P. Widimsky, J.L. Zamorano, J. Morais, S. Brener, R. Harrington,
D. Morrow, M. Lim, M.A. Martinez-Rios, S. Steinhubl, G.N. Levine, W.B. Gibler, D.
Goff, M. Tubaro, D. Dudek, and N. Al-Attar, Universal definition of myocardial
infarction. Circulation, 2007. 116(22): p. 2634-53.
4.
Alpert, J.S., K. Thygesen, E. Antman, and J.P. Bassand, Myocardial infarction
redefined--a consensus document of The Joint European Society of
Cardiology/American College of Cardiology Committee for the redefinition of
myocardial infarction. J Am Coll Cardiol, 2000. 36(3): p. 959-69.
5.
Achar, S.A., S. Kundu, and W.A. Norcross, Diagnosis of acute coronary syndrome.
Am Fam Physician, 2005. 72(1): p. 119-26.
6.
Arruda-Olson, A.M., P.A. Pellikka, F. Bursi, A.S. Jaffe, P.J. Santrach, J.A. Kors, J.M.
Killian, S.A. Weston, and V.L. Roger, Left ventricular function and heart failure in
myocardial infarction: impact of the new definition in the community. Am Heart J,
2008. 156(5): p. 810-5.
Yoann Sottejeau
192
7.
Reichlin, T., W. Hochholzer, S. Bassetti, S. Steuer, C. Stelzig, S. Hartwiger, S.
Biedert, N. Schaub, C. Buerge, M. Potocki, M. Noveanu, T. Breidthardt, R.
Twerenbold, K. Winkler, R. Bingisser, and C. Mueller, Early diagnosis of myocardial
infarction with sensitive cardiac troponin assays. N Engl J Med, 2009. 361(9): p. 85867.
8.
Labugger, R., L. Organ, C. Collier, D. Atar, and J.E. Van Eyk, Extensive troponin I
and T modification detected in serum from patients with acute myocardial infarction.
Circulation, 2000. 102(11): p. 1221-6.
9.
Moe, K.T. and P. Wong, Current trends in diagnostic biomarkers of acute coronary
syndrome. Ann Acad Med Singapore, 2010. 39(3): p. 210-5.
10.
Inbar, R. and Y. Shoenfeld, Elevated cardiac troponins: the ultimate marker for
myocardial necrosis, but not without a differential diagnosis. Isr Med Assoc J, 2009.
11(1): p. 50-3.
11.
Pruvot, S., G. Galidie, J.F. Bergmann, and I. Mahe, [Troponin and other markers of
myocardial ischemia injury, what is the relevance in internal medicine?]. Rev Med
Interne, 2006. 27(3): p. 215-26.
12.
Apple, F.S., M. Murakami, M. Panteghini, R.H. Christenson, F. Dati, J. Mair, A.H.
Wu, and I.C.o.S.o.M.o.C. Damage, International survey on the use of cardiac
markers. Clin Chem, 2001. 47(3): p. 587-8.
13.
Ohman, E.M., C. Casey, J.R. Bengtson, D. Pryor, W. Tormey, and J.H. Horgan, Early
detection of acute myocardial infarction: additional diagnostic information from
serum concentrations of myoglobin in patients without ST elevation. Br Heart J, 1990.
63(6): p. 335-8.
14.
Boersma, E., N. Mercado, D. Poldermans, M. Gardien, J. Vos, and M.L. Simoons,
Acute myocardial infarction. Lancet, 2003. 361(9360): p. 847-58.
15.
Rasoul, S., J.H. Dambrink, A. Breeman, A. Elvan, and A.W. van 't Hof, The relation
between myocardial blush grade and myocardial contrast echocardiography: which
one is a better predictor of myocardial damage? Neth Heart J, 2010. 18(1): p. 25-30.
16.
Poulter, N., Global risk of cardiovascular disease. Heart, 2003. 89 Suppl 2: p. ii2-5;
discussion ii35-7.
17.
Direction de la recherche, d.é., de l’évaluation et des statistiques (DREES), Rapport
2009-2010: 69 Maladies cardiovasculaires : cardiopathies ischémiques et thromboses
veineuses profondes, L’état de santé de la population en France - Suivi des objectifs
annexés à la loi de santé publique 2010.
Yoann Sottejeau
193
18.
Ambrose, J.A. and R.S. Barua, The pathophysiology of cigarette smoking and
cardiovascular disease: an update. J Am Coll Cardiol, 2004. 43(10): p. 1731-7.
19.
Schlitt, A., S. Blankenberg, C. Bickel, J. Meyer, G. Hafner, X.C. Jiang, and H.J.
Rupprecht, Prognostic value of lipoproteins and their relation to inflammatory
markers among patients with coronary artery disease. Int J Cardiol, 2005. 102(3): p.
477-85.
20.
Franjic, B. and T.H. Marwick, The diabetic, hypertensive heart: epidemiology and
mechanisms of a very high-risk situation. J Hum Hypertens, 2009. 23(11): p. 709-17.
21.
Mudd, J.O. and D.A. Kass, Tackling heart failure in the twenty-first century. Nature,
2008. 451(7181): p. 919-28.
22.
Dickstein, K., A. Cohen-Solal, G. Filippatos, J.J. McMurray, P. Ponikowski, P.A.
Poole-Wilson, A. Stromberg, D.J. van Veldhuisen, D. Atar, A.W. Hoes, A. Keren, A.
Mebazaa, M. Nieminen, S.G. Priori, K. Swedberg, and E.S.C.C.f.P. Guidelines, ESC
guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2008:
the Task Force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure
2008 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the
Heart Failure Association of the ESC (HFA) and endorsed by the European Society of
Intensive Care Medicine (ESICM). Eur J Heart Fail, 2008. 10(10): p. 933-89.
23.
,
.
(
Association, T.C.C.o.t.N.Y.H. Nomenclature and Criteria for Diagnosis of Diseases of the Heart and Great Vessels 1994 9th ed. Little Brown
& Co
): p. 253-256.
24.
Braunwald, E., Biomarkers in heart failure. N Engl J Med, 2008. 358(20): p. 2148-59.
25.
Maisel, A., C. Mueller, K. Adams, Jr., S.D. Anker, N. Aspromonte, J.G. Cleland, A.
Cohen-Solal, U. Dahlstrom, A. DeMaria, S. Di Somma, G.S. Filippatos, G.C.
Fonarow, P. Jourdain, M. Komajda, P.P. Liu, T. McDonagh, K. McDonald, A.
Mebazaa, M.S. Nieminen, W.F. Peacock, M. Tubaro, R. Valle, M. Vanderhyden,
C.W. Yancy, F. Zannad, and E. Braunwald, State of the art: using natriuretic peptide
levels in clinical practice. Eur J Heart Fail, 2008. 10(9): p. 824-39.
26.
Boersma, E., A.C. Maas, J.W. Deckers, and M.L. Simoons, Early thrombolytic
treatment in acute myocardial infarction: reappraisal of the golden hour. Lancet,
1996. 348(9030): p. 771-5.
27.
Newby, L.K., W.R. Rutsch, R.M. Califf, M.L. Simoons, P.E. Aylward, P.W.
Armstrong, L.H. Woodlief, K.L. Lee, E.J. Topol, and F. Van de Werf, Time from
symptom onset to treatment and outcomes after thrombolytic therapy. GUSTO-1
Investigators. J Am Coll Cardiol, 1996. 27(7): p. 1646-55.
Yoann Sottejeau
194
28.
Antman, E.M., M. Hand, P.W. Armstrong, E.R. Bates, L.A. Green, L.K. Halasyamani,
J.S. Hochman, H.M. Krumholz, G.A. Lamas, C.J. Mullany, D.L. Pearle, M.A. Sloan,
S.C. Smith, Jr., M. Writing Committee, D.T. Anbe, F.G. Kushner, J.P. Ornato, A.K.
Jacobs, C.D. Adams, J.L. Anderson, C.E. Buller, M.A. Creager, S.M. Ettinger, J.L.
Halperin, S.A. Hunt, B.W. Lytle, R. Nishimura, R.L. Page, B. Riegel, L.G.
Tarkington, and C.W. Yancy, 2007 Focused Update of the ACC/AHA 2004 Guidelines
for the Management of Patients With ST-Elevation Myocardial Infarction: a report of
the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on
Practice Guidelines: developed in collaboration With the Canadian Cardiovascular
Society endorsed by the American Academy of Family Physicians: 2007 Writing
Group to Review New Evidence and Update the ACC/AHA 2004 Guidelines for the
Management of Patients With ST-Elevation Myocardial Infarction, Writing on Behalf
of the 2004 Writing Committee. Circulation, 2008. 117(2): p. 296-329.
29.
Keeley, E.C. and L.D. Hillis, Primary PCI for myocardial infarction with ST-segment
elevation. N Engl J Med, 2007. 356(1): p. 47-54.
30.
Lazzeri, C., R. Tarquini, S. Valente, R. Abbate, and G.F. Gensini, Emerging drugs for
acute myocardial infarction. Expert Opin Emerg Drugs, 2010. 15(1): p. 87-105.
31.
Noon, G.P., Evolution of surgical treatment of coronary artery occlusive disease.
JAMA, 2009. 301(9): p. 970-1.
32.
Gajos, G., Optimal treatment for patients after myocardial infarction: some current
concepts and controversies. Pol Arch Med Wewn, 2008. 118(1-2): p. 43-51.
33.
Maixent, J.M., O. Barbey, S. Pierre, M.J. Duran, S. Sennoune, M. Bourdeaux, P.
Ricard, and S. Levy, Inhibition of Na,K-ATPase by external electrical cardioversion
in a sheep model of atrial fibrillation. J Cardiovasc Electrophysiol, 2000. 11(4): p.
439-45.
34.
Rahimtoola, S.H., Digitalis therapy for patients in clinical heart failure. Circulation,
2004. 109(24): p. 2942-6.
35.
Leaf, A., J.X. Kang, and Y.F. Xiao, Fish oil fatty acids as cardiovascular drugs. Curr
Vasc Pharmacol, 2008. 6(1): p. 1-12.
36.
Maixent, J.M., A. Gerbi, O. Barbey, C. Lan, I. Jamme, H. Burnet, A. Nouvelot, S.
Levy, P.J. Cozzone, and M. Bernard, Dietary fish oil promotes positive inotropy of
ouabain in the rat heart. Am J Physiol, 1999. 277(6 Pt 2): p. H2290-7.
37.
Abdukeyum, G.G., A.J. Owen, and P.L. McLennan, Dietary (n-3) long-chain
polyunsaturated fatty acids inhibit ischemia and reperfusion arrhythmias and
Yoann Sottejeau
195
infarction in rat heart not enhanced by ischemic preconditioning. J Nutr, 2008.
138(10): p. 1902-9.
38.
Jennings, R.B. and K.A. Reimer, Factors involved in salvaging ischemic myocardium:
effect of reperfusion of arterial blood. Circulation, 1983. 68(2 Pt 2): p. I25-36.
39.
Jennings, R.B., H.M. Sommers, G.A. Smyth, H.A. Flack, and H. Linn, Myocardial
necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog. Arch Pathol,
1960. 70: p. 68-78.
40.
Reimer, K.A. and R.B. Jennings, The "wavefront phenomenon" of myocardial
ischemic cell death. II. Transmural progression of necrosis within the framework of
ischemic bed size (myocardium at risk) and collateral flow. Lab Invest, 1979. 40(6): p.
633-44.
41.
White, P.D., G.K. Mallory, and J. Salcedo-Salgar, The Speed of Healing of
Myocardial Infarcts. Trans Am Clin Climatol Assoc, 1936. 52: p. 97-104 1.
42.
Hearse, D.J., Reperfusion of the ischemic myocardium. J Mol Cell Cardiol, 1977. 9(8):
p. 605-16.
43.
Entman, M.L. and C.W. Smith, Postreperfusion inflammation: a model for reaction to
injury in cardiovascular disease. Cardiovasc Res, 1994. 28(9): p. 1301-11.
44.
Steenbergen, C., M.E. Perlman, R.E. London, and E. Murphy, Mechanism of
preconditioning. Ionic alterations. Circ Res, 1993. 72(1): p. 112-25.
45.
Murphy, E., M. Perlman, R.E. London, and C. Steenbergen, Amiloride delays the
ischemia-induced rise in cytosolic free calcium. Circ Res, 1991. 68(5): p. 1250-8.
46.
Noble, D., Simulation of Na/Ca exchange activity during ischemia. Ann N Y Acad
Sci, 2002. 976: p. 431-7.
47.
Smith, G.L., P. Donoso, C.J. Bauer, and D.A. Eisner, Relationship between
intracellular pH and metabolite concentrations during metabolic inhibition in isolated
ferret heart. J Physiol, 1993. 472: p. 11-22.
48.
Murphy, E. and C. Steenbergen, Ion transport and energetics during cell death and
protection. Physiology (Bethesda), 2008. 23: p. 115-23.
49.
Steenbergen, C., E. Murphy, J.A. Watts, and R.E. London, Correlation between
cytosolic free calcium, contracture, ATP, and irreversible ischemic injury in perfused
rat heart. Circ Res, 1990. 66(1): p. 135-46.
50.
Murphy, E. and C. Steenbergen, Preconditioning: the mitochondrial connection. Annu
Rev Physiol, 2007. 69: p. 51-67.
Yoann Sottejeau
196
51.
Piper, H.M., Y. Abdallah, and C. Schafer, The first minutes of reperfusion: a window
of opportunity for cardioprotection. Cardiovasc Res, 2004. 61(3): p. 365-71.
52.
Garcia-Dorado, D., A. Rodriguez-Sinovas, M. Ruiz-Meana, J. Inserte, L. Agullo, and
A. Cabestrero, The end-effectors of preconditioning protection against myocardial
cell death secondary to ischemia-reperfusion. Cardiovasc Res, 2006. 70(2): p. 274-85.
53.
Bond, J.M., E. Chacon, B. Herman, and J.J. Lemasters, Intracellular pH and Ca2+
homeostasis in the pH paradox of reperfusion injury to neonatal rat cardiac myocytes.
Am J Physiol, 1993. 265(1 Pt 1): p. C129-37.
54.
Wang, J., L. Drake, F. Sajjadi, G.S. Firestein, K.M. Mullane, and D.A. Bullough, Dual
activation of adenosine A1 and A3 receptors mediates preconditioning of isolated
cardiac myocytes. Eur J Pharmacol, 1997. 320(2-3): p. 241-8.
55.
Vander Heide, R.S., D. Rim, C.M. Hohl, and C.E. Ganote, An in vitro model of
myocardial ischemia utilizing isolated adult rat myocytes. J Mol Cell Cardiol, 1990.
22(2): p. 165-81.
56.
Gray, M.O., J.S. Karliner, and D. Mochly-Rosen, A selective epsilon-protein kinase C
antagonist inhibits protection of cardiac myocytes from hypoxia-induced cell death. J
Biol Chem, 1997. 272(49): p. 30945-51.
57.
Vanden Hoek, T.L., Z. Shao, C. Li, R. Zak, P.T. Schumacker, and L.B. Becker,
Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia. Am J Physiol, 1996.
270(4 Pt 2): p. H1334-41.
58.
Pitts, K.R. and C.F. Toombs, Coverslip hypoxia: a novel method for studying cardiac
myocyte hypoxia and ischemia in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004.
287(4): p. H1801-12.
59.
Langendorff, O., Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen.
. Pflügers Archiv, 1898. 61: p. 291−332.
60.
Taegtmeyer, H., One hundred years ago: Oscar Langendorff and the birth of cardiac
metabolism. Can J Cardiol, 1995. 11(11): p. 1030-5.
61.
De Hert, S.G., Volatile anesthetics and cardiac function. Semin Cardiothorac Vasc
Anesth, 2006. 10(1): p. 33-42.
62.
Ytrehus, K., The ischemic heart--experimental models. Pharmacol Res, 2000. 42(3): p.
193-203.
63.
Tang, X.L., Y. Qiu, S.W. Park, J.Z. Sun, A. Kalya, and R. Bolli, Time course of late
preconditioning against myocardial stunning in conscious pigs. Circ Res, 1996. 79(3):
p. 424-34.
Yoann Sottejeau
197
64.
Himori, N. and A. Matsuura, A simple technique for occlusion and reperfusion of
coronary artery in conscious rats. Am J Physiol, 1989. 256(6 Pt 2): p. H1719-25.
65.
Chimenti, S., E. Carlo, S. Masson, A. Bai, and R. Latini, Myocardial infarction:
animal models. Methods Mol Med, 2004. 98: p. 217-26.
66.
Maulik, N., S. Fukuda, and H. Sasaki, A survival model for the study of myocardial
angiogenesis. Methods Enzymol, 2002. 352: p. 391-407.
67.
Wayman, N.S., M.C. McDonald, P.K. Chatterjee, and C. Thiemermann, Models of
coronary artery occlusion and reperfusion for the discovery of novel antiischemic and
antiinflammatory drugs for the heart. Methods Mol Biol, 2003. 225: p. 199-208.
68.
Murry, C.E., R.B. Jennings, and K.A. Reimer, Preconditioning with ischemia: a delay
of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation, 1986. 74(5): p. 1124-36.
69.
Liu, Y. and J.M. Downey, Ischemic preconditioning protects against infarction in rat
heart. Am J Physiol, 1992. 263(4 Pt 2): p. H1107-12.
70.
Liu, G.S., J. Thornton, D.M. Van Winkle, A.W. Stanley, R.A. Olsson, and J.M.
Downey, Protection against infarction afforded by preconditioning is mediated by A1
adenosine receptors in rabbit heart. Circulation, 1991. 84(1): p. 350-6.
71.
Schott, R.J., S. Rohmann, E.R. Braun, and W. Schaper, Ischemic preconditioning
reduces infarct size in swine myocardium. Circ Res, 1990. 66(4): p. 1133-42.
72.
Deutsch, E., M. Berger, W.G. Kussmaul, J.W. Hirshfeld, Jr., H.C. Herrmann, and
W.K. Laskey, Adaptation to ischemia during percutaneous transluminal coronary
angioplasty. Clinical, hemodynamic, and metabolic features. Circulation, 1990. 82(6):
p. 2044-51.
73.
Yellon, D.M., A.M. Alkhulaifi, and W.B. Pugsley, Preconditioning the human
myocardium. Lancet, 1993. 342(8866): p. 276-7.
74.
Murphy, E. and C. Steenbergen, Mechanisms underlying acute protection from
cardiac ischemia-reperfusion injury. Physiol Rev, 2008. 88(2): p. 581-609.
75.
Krieg, T., Q. Qin, E.C. McIntosh, M.V. Cohen, and J.M. Downey, ACh and adenosine
activate PI3-kinase in rabbit hearts through transactivation of receptor tyrosine
kinases. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002. 283(6): p. H2322-30.
76.
Costa, A.D., K.D. Garlid, I.C. West, T.M. Lincoln, J.M. Downey, M.V. Cohen, and
S.D. Critz, Protein kinase G transmits the cardioprotective signal from cytosol to
mitochondria. Circ Res, 2005. 97(4): p. 329-36.
Yoann Sottejeau
198
77.
Datta, S.R., H. Dudek, X. Tao, S. Masters, H. Fu, Y. Gotoh, and M.E. Greenberg, Akt
phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery.
Cell, 1997. 91(2): p. 231-41.
78.
Tsuruta, F., N. Masuyama, and Y. Gotoh, The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)Akt pathway suppresses Bax translocation to mitochondria. J Biol Chem, 2002.
277(16): p. 14040-7.
79.
Kennedy, S.G., E.S. Kandel, T.K. Cross, and N. Hay, Akt/Protein kinase B inhibits
cell death by preventing the release of cytochrome c from mitochondria. Mol Cell
Biol, 1999. 19(8): p. 5800-10.
80.
Hausenloy, D.J. and D.M. Yellon, New directions for protecting the heart against
ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase
(RISK)-pathway. Cardiovasc Res, 2004. 61(3): p. 448-60.
81.
Weston, C.R., K. Balmanno, C. Chalmers, K. Hadfield, S.A. Molton, R. Ley, E.F.
Wagner, and S.J. Cook, Activation of ERK1/2 by deltaRaf-1:ER* represses Bim
expression independently of the JNK or PI3K pathways. Oncogene, 2003. 22(9): p.
1281-93.
82.
Lecour, S., Multiple protective pathways against reperfusion injury: a SAFE path
without Aktion? J Mol Cell Cardiol, 2009. 46(5): p. 607-9.
83.
Schmidt, M.R., M. Smerup, I.E. Konstantinov, M. Shimizu, J. Li, M. Cheung, P.A.
White, S.B. Kristiansen, K. Sorensen, V. Dzavik, A.N. Redington, and R.K.
Kharbanda, Intermittent peripheral tissue ischemia during coronary ischemia reduces
myocardial infarction through a KATP-dependent mechanism: first demonstration of
remote ischemic perconditioning. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007. 292(4): p.
H1883-90.
84.
Li, L., W. Luo, L. Huang, W. Zhang, Y. Gao, H. Jiang, C. Zhang, L. Long, and S.
Chen, Remote perconditioning reduces myocardial injury in adult valve replacement:
a randomized controlled trial. J Surg Res, 2010. 164(1): p. e21-6.
85.
Zhao, Z.Q., J.S. Corvera, M.E. Halkos, F. Kerendi, N.P. Wang, R.A. Guyton, and J.
Vinten-Johansen, Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during
reperfusion: comparison with ischemic preconditioning. Am J Physiol Heart Circ
Physiol, 2003. 285(2): p. H579-88.
86.
Staat, P., G. Rioufol, C. Piot, Y. Cottin, T.T. Cung, I. L'Huillier, J.F. Aupetit, E.
Bonnefoy, G. Finet, X. Andre-Fouet, and M. Ovize, Postconditioning the human
heart. Circulation, 2005. 112(14): p. 2143-8.
Yoann Sottejeau
199
87.
Yang, X.M., J.B. Proctor, L. Cui, T. Krieg, J.M. Downey, and M.V. Cohen, Multiple,
brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting
cell signaling pathways. J Am Coll Cardiol, 2004. 44(5): p. 1103-10.
88.
Tang, X.L., H. Sato, S. Tiwari, B. Dawn, Q. Bi, Q. Li, G. Shirk, and R. Bolli,
Cardioprotection by postconditioning in conscious rats is limited to coronary
occlusions <45 min. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006. 291(5): p. H2308-17.
89.
Tsang, A., D.J. Hausenloy, M.M. Mocanu, and D.M. Yellon, Postconditioning: a form
of "modified reperfusion" protects the myocardium by activating the
phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway. Circ Res, 2004. 95(3): p. 230-2.
90.
Hausenloy, D.J., A. Tsang, and D.M. Yellon, The reperfusion injury salvage kinase
pathway: a common target for both ischemic preconditioning and postconditioning.
Trends Cardiovasc Med, 2005. 15(2): p. 69-75.
91.
Lenoir, G., P. Williamson, and J.C. Holthuis, On the origin of lipid asymmetry: the
flip side of ion transport. Curr Opin Chem Biol, 2007. 11(6): p. 654-61.
92.
Moller, J.V., B. Juul, and M. le Maire, Structural organization, ion transport, and
energy transduction of P-type ATPases. Biochim Biophys Acta, 1996. 1286(1): p. 151.
93.
Kubala, M., ATP-binding to P-type ATPases as revealed by biochemical,
spectroscopic, and crystallographic experiments. Proteins, 2006. 64(1): p. 1-12.
94.
Reeves, A.S., J.H. Collins, and A. Schwartz, Isolation and characterization of (Na,K)ATPase proteolipid. Biochem Biophys Res Commun, 1980. 95(4): p. 1591-8.
95.
Kaplan, J.H., Biochemistry of Na,K-ATPase. Annu Rev Biochem, 2002. 71: p. 511-35.
96.
Sweadner, K.J., Two molecular forms of (Na+ + K+)-stimulated ATPase in brain.
Separation, and difference in affinity for strophanthidin. J Biol Chem, 1979. 254(13):
p. 6060-7.
97.
Shull, G.E., J. Greeb, and J.B. Lingrel, Molecular cloning of three distinct forms of the
Na+,K+-ATPase alpha-subunit from rat brain. Biochemistry, 1986. 25(25): p. 812532.
98.
Shamraj, O.I. and J.B. Lingrel, A putative fourth Na+,K(+)-ATPase alpha-subunit
gene is expressed in testis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(26): p. 12952-6.
99.
Pressley, T.A., M.J. Duran, and S.V. Pierre, Regions conferring isoform-specific
function in the catalytic subunit of the Na,K-pump. Front Biosci, 2005. 10: p. 2018-26.
100.
Blanco, G., Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion
regulation. Semin Nephrol, 2005. 25(5): p. 292-303.
Yoann Sottejeau
200
101.
Charlemagne, D., J.M. Maixent, M. Preteseille, and L.G. Lelievre, Ouabain binding
sites and (Na+,K+)-ATPase activity in rat cardiac hypertrophy. Expression of the
neonatal forms. J Biol Chem, 1986. 261(1): p. 185-9.
102.
Sweadner, K.J., Enzymatic properties of separated isozymes of the Na,K-ATPase.
Substrate affinities, kinetic cooperativity, and ion transport stoichiometry. J Biol
Chem, 1985. 260(21): p. 11508-13.
103.
Wang, J., J.B. Velotta, A.A. McDonough, and R.A. Farley, All human Na(+)-K(+)ATPase alpha-subunit isoforms have a similar affinity for cardiac glycosides. Am J
Physiol Cell Physiol, 2001. 281(4): p. C1336-43.
104.
Blanco, G. and R.W. Mercer, Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in
structure, diversity in function. Am J Physiol, 1998. 275(5 Pt 2): p. F633-50.
105.
Geering, K., The functional role of beta subunits in oligomeric P-type ATPases. J
Bioenerg Biomembr, 2001. 33(5): p. 425-38.
106.
Pestov, N.B., G. Adams, M.I. Shakhparonov, and N.N. Modyanov, Identification of a
novel gene of the X,K-ATPase beta-subunit family that is predominantly expressed in
skeletal and heart muscles. FEBS Lett, 1999. 456(2): p. 243-8.
107.
Zhao, H., N.B. Pestov, T.V. Korneenko, M.I. Shakhparonov, and N.N. Modyanov,
Accumulation of beta (m), a structural member of X,K-ATPase beta-subunit family, in
nuclear envelopes of perinatal myocytes. Am J Physiol Cell Physiol, 2004. 286(4): p.
C757-67.
108.
Forbush, B., 3rd, J.H. Kaplan, and J.F. Hoffman, Characterization of a new
photoaffinity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a
proteolipid component of the Na, K-ATPase. Biochemistry, 1978. 17(17): p. 3667-76.
109.
Sweadner, K.J. and E. Rael, The FXYD gene family of small ion transport regulators
or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics,
2000. 68(1): p. 41-56.
110.
Geering, K., Functional roles of Na,K-ATPase subunits. Curr Opin Nephrol
Hypertens, 2008. 17(5): p. 526-32.
111.
Bibert, S., S. Roy, D. Schaer, J.D. Horisberger, and K. Geering, Phosphorylation of
phospholemman (FXYD1) by protein kinases A and C modulates distinct Na,KATPase isozymes. J Biol Chem, 2008. 283(1): p. 476-86.
112.
Nielsen, O.B. and A.P. Harrison, The regulation of the Na+,K+ pump in contracting
skeletal muscle. Acta Physiol Scand, 1998. 162(3): p. 191-200.
Yoann Sottejeau
201
113.
Macknight, A.D. and A. Leaf, Regulation of cellular volume. Physiol Rev, 1977.
57(3): p. 510-73.
114.
Lang, F., G.L. Busch, M. Ritter, H. Volkl, S. Waldegger, E. Gulbins, and D.
Haussinger, Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol
Rev, 1998. 78(1): p. 247-306.
115.
Stein, W.D., Cell volume homeostasis: ionic and nonionic mechanisms. The sodium
pump in the emergence of animal cells. Int Rev Cytol, 2002. 215: p. 231-58.
116.
Post, R.L., S. Kume, T. Tobin, B. Orcutt, and A.K. Sen, Flexibility of an active center
in sodium-plus-potassium adenosine triphosphatase. J Gen Physiol, 1969. 54(1): p.
306-26.
117.
Albers, R.W., Biochemical aspects of active transport. Annu Rev Biochem, 1967. 36:
p. 727-56.
118.
Kometiani, P., J. Li, L. Gnudi, B.B. Kahn, A. Askari, and Z. Xie, Multiple signal
transduction pathways link Na+/K+-ATPase to growth-related genes in cardiac
myocytes. The roles of Ras and mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem, 1998.
273(24): p. 15249-56.
119.
Xie, Z., Ouabain interaction with cardiac Na/K-ATPase reveals that the enzyme can
act as a pump and as a signal transducer. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2001.
47(2): p. 383-90.
120.
Liu, L., X. Zhao, S.V. Pierre, and A. Askari, Association of PI3K-Akt signaling
pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am J Physiol Cell
Physiol, 2007. 293(5): p. C1489-97.
121.
Xie, Z. and T. Cai, Na+-K+--ATPase-mediated signal transduction: from protein
interaction to cellular function. Mol Interv, 2003. 3(3): p. 157-68.
122.
Liu, L., K. Mohammadi, B. Aynafshar, H. Wang, D. Li, J. Liu, A.V. Ivanov, Z. Xie,
and A. Askari, Role of caveolae in signal-transducing function of cardiac Na+/K+ATPase. Am J Physiol Cell Physiol, 2003. 284(6): p. C1550-60.
123.
Wang, H., M. Haas, M. Liang, T. Cai, J. Tian, S. Li, and Z. Xie, Ouabain assembles
signaling cascades through the caveolar Na+/K+-ATPase. J Biol Chem, 2004.
279(17): p. 17250-9.
124.
Kulikov, A., A. Eva, U. Kirch, A. Boldyrev, and G. Scheiner-Bobis, Ouabain
activates signaling pathways associated with cell death in human neuroblastoma.
Biochim Biophys Acta, 2007. 1768(7): p. 1691-702.
Yoann Sottejeau
202
125.
Trevisi, L., B. Visentin, F. Cusinato, I. Pighin, and S. Luciani, Antiapoptotic effect of
ouabain on human umbilical vein endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun,
2004. 321(3): p. 716-21.
126.
Aydemir-Koksoy, A., J. Abramowitz, and J.C. Allen, Ouabain-induced signaling and
vascular smooth muscle cell proliferation. J Biol Chem, 2001. 276(49): p. 46605-11.
127.
Khundmiri, S.J., M.A. Metzler, M. Ameen, V. Amin, M.J. Rane, and N.A. Delamere,
Ouabain induces cell proliferation through calcium-dependent phosphorylation of Akt
(protein kinase B) in opossum kidney proximal tubule cells. Am J Physiol Cell
Physiol, 2006. 291(6): p. C1247-57.
128.
Huang, L., H. Li, and Z. Xie, Ouabain-induced hypertrophy in cultured cardiac
myocytes is accompanied by changes in expression of several late response genes. J
Mol Cell Cardiol, 1997. 29(2): p. 429-37.
129.
Eckhart, W., M.A. Hutchinson, and T. Hunter, An activity phosphorylating tyrosine in
polyoma T antigen immunoprecipitates. Cell, 1979. 18(4): p. 925-33.
130.
Courtneidge, S.A. and A.E. Smith, Polyoma virus transforming protein associates
with the product of the c-src cellular gene. Nature, 1983. 303(5916): p. 435-9.
131.
Resh, M.D., Myristylation and palmitylation of Src family members: the fats of the
matter. Cell, 1994. 76(3): p. 411-3.
132.
Sato, I., Y. Obata, K. Kasahara, Y. Nakayama, Y. Fukumoto, T. Yamasaki, K.K.
Yokoyama, T. Saito, and N. Yamaguchi, Differential trafficking of Src, Lyn, Yes and
Fyn is specified by the state of palmitoylation in the SH4 domain. J Cell Sci, 2009.
122(Pt 7): p. 965-75.
133.
Yu, H., J.K. Chen, S. Feng, D.C. Dalgarno, A.W. Brauer, and S.L. Schreiber,
Structural basis for the binding of proline-rich peptides to SH3 domains. Cell, 1994.
76(5): p. 933-45.
134.
Mayer, B.J. and M.J. Eck, SH3 domains. Minding your p's and q's. Curr Biol, 1995.
5(4): p. 364-7.
135.
Anderson, D., C.A. Koch, L. Grey, C. Ellis, M.F. Moran, and T. Pawson, Binding of
SH2 domains of phospholipase C gamma 1, GAP, and Src to activated growth factor
receptors. Science, 1990. 250(4983): p. 979-82.
136.
Moran, M.F., C.A. Koch, D. Anderson, C. Ellis, L. England, G.S. Martin, and T.
Pawson, Src homology region 2 domains direct protein-protein interactions in signal
transduction. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990. 87(21): p. 8622-6.
Yoann Sottejeau
203
137.
Ma, Y.C., J. Huang, S. Ali, W. Lowry, and X.Y. Huang, Src tyrosine kinase is a novel
direct effector of G proteins. Cell, 2000. 102(5): p. 635-46.
138.
Schulte, R.J. and B.M. Sefton, Inhibition of the activity of SRC and Abl tyrosine
protein kinases by the binding of the Wiskott-Aldrich syndrome protein. Biochemistry,
2003. 42(31): p. 9424-30.
139.
MacAuley, A. and J.A. Cooper, Structural differences between repressed and
derepressed forms of p60c-src. Mol Cell Biol, 1989. 9(6): p. 2648-56.
140.
Brown, M.T. and J.A. Cooper, Regulation, substrates and functions of src. Biochim
Biophys Acta, 1996. 1287(2-3): p. 121-49.
141.
Tian, J., T. Cai, Z. Yuan, H. Wang, L. Liu, M. Haas, E. Maksimova, X.Y. Huang, and
Z.J. Xie, Binding of Src to Na+/K+-ATPase forms a functional signaling complex.
Mol Biol Cell, 2006. 17(1): p. 317-26.
142.
Li, Z. and Z. Xie, The Na/K-ATPase/Src complex and cardiotonic steroid-activated
protein kinase cascades. Pflugers Arch, 2009. 457(3): p. 635-44.
143.
Liang, M., T. Cai, J. Tian, W. Qu, and Z.J. Xie, Functional characterization of Srcinteracting Na/K-ATPase using RNA interference assay. J Biol Chem, 2006. 281(28):
p. 19709-19.
144.
Liang, M., J. Tian, L. Liu, S. Pierre, J. Liu, J. Shapiro, and Z.J. Xie, Identification of a
pool of non-pumping Na/K-ATPase. J Biol Chem, 2007. 282(14): p. 10585-93.
145.
Haas, M., H. Wang, J. Tian, and Z. Xie, Src-mediated inter-receptor cross-talk
between the Na+/K+-ATPase and the epidermal growth factor receptor relays the
signal from ouabain to mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem, 2002.
277(21): p. 18694-702.
146.
Marks, M.J. and N.W. Seeds, A heterogeneous ouabain-ATPase interaction in mouse
brain. Life Sci, 1978. 23(27-28): p. 2735-44.
147.
Hamlyn, J.M., M.P. Blaustein, S. Bova, D.W. DuCharme, D.W. Harris, F. Mandel,
W.R. Mathews, and J.H. Ludens, Identification and characterization of a ouabain-like
compound from human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(14): p. 6259-63.
148.
Schoner, W., Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur J
Biochem, 2002. 269(10): p. 2440-8.
149.
Fedorova, O.V., P.A. Doris, and A.Y. Bagrov, Endogenous marinobufagenin-like
factor in acute plasma volume expansion. Clin Exp Hypertens, 1998. 20(5-6): p. 58191.
Yoann Sottejeau
204
150.
Bagrov, A.Y., J.I. Shapiro, and O.V. Fedorova, Endogenous cardiotonic steroids:
physiology, pharmacology, and novel therapeutic targets. Pharmacol Rev, 2009.
61(1): p. 9-38.
151.
Dmitrieva, R.I., A.Y. Bagrov, E. Lalli, P. Sassone-Corsi, D.M. Stocco, and P.A. Doris,
Mammalian bufadienolide is synthesized from cholesterol in the adrenal cortex by a
pathway that Is independent of cholesterol side-chain cleavage. Hypertension, 2000.
36(3): p. 442-8.
152.
Toker, A., Signaling through protein kinase C. Front Biosci, 1998. 3: p. D1134-47.
153.
Ohno, S. and Y. Nishizuka, Protein kinase C isotypes and their specific functions:
prologue. J Biochem, 2002. 132(4): p. 509-11.
154.
Takai, Y., A. Kishimoto, U. Kikkawa, T. Mori, and Y. Nishizuka, Unsaturated
diacylglycerol as a possible messenger for the activation of calcium-activated,
phospholipid-dependent protein kinase system. Biochem Biophys Res Commun, 1979.
91(4): p. 1218-24.
155.
Castagna, M., Y. Takai, K. Kaibuchi, K. Sano, U. Kikkawa, and Y. Nishizuka, Direct
activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumorpromoting phorbol esters. J Biol Chem, 1982. 257(13): p. 7847-51.
156.
Ono, Y., T. Fujii, K. Ogita, U. Kikkawa, K. Igarashi, and Y. Nishizuka, Protein kinase
C zeta subspecies from rat brain: its structure, expression, and properties. Proc Natl
Acad Sci U S A, 1989. 86(9): p. 3099-103.
157.
Nishizuka, Y., Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses.
FASEB J, 1995. 9(7): p. 484-96.
158.
Bertorello, A.M., Diacylglycerol activation of protein kinase C results in a dual effect
on Na+,K(+)-ATPase activity from intact renal proximal tubule cells. J Cell Sci,
1992. 101 ( Pt 2): p. 343-7.
159.
Pedemonte, C.H., T.A. Pressley, M.F. Lokhandwala, and A.R. Cinelli, Regulation of
Na,K-ATPase transport activity by protein kinase C. J Membr Biol, 1997. 155(3): p.
219-27.
160.
Efendiev, R., A.M. Bertorello, T.A. Pressley, M. Rousselot, E. Feraille, and C.H.
Pedemonte, Simultaneous phosphorylation of Ser11 and Ser18 in the alpha-subunit
promotes the recruitment of Na(+),K(+)-ATPase molecules to the plasma membrane.
Biochemistry, 2000. 39(32): p. 9884-92.
Yoann Sottejeau
205
161.
Pierre, S.V., M.J. Duran, D.L. Carr, and T.A. Pressley, Structure/function analysis of
Na(+)-K(+)-ATPase central isoform-specific region: involvement in PKC regulation.
Am J Physiol Renal Physiol, 2002. 283(5): p. F1066-74.
162.
Heilker, R., U. Manning-Krieg, J.F. Zuber, and M. Spiess, In vitro binding of clathrin
adaptors to sorting signals correlates with endocytosis and basolateral sorting.
EMBO J, 1996. 15(11): p. 2893-9.
163.
Rapoport, I., Y.C. Chen, P. Cupers, S.E. Shoelson, and T. Kirchhausen, Dileucinebased sorting signals bind to the beta chain of AP-1 at a site distinct and regulated
differently from the tyrosine-based motif-binding site. EMBO J, 1998. 17(8): p. 214855.
164.
Bers, D.M. and S. Despa, Cardiac myocytes Ca2+ and Na+ regulation in normal and
failing hearts. J Pharmacol Sci, 2006. 100(5): p. 315-22.
165.
Schwinger, R.H., H. Bundgaard, J. Muller-Ehmsen, and K. Kjeldsen, The Na, KATPase in the failing human heart. Cardiovasc Res, 2003. 57(4): p. 913-20.
166.
Kim, M.S. and T. Akera, O2 free radicals: cause of ischemia-reperfusion injury to
cardiac Na+-K+-ATPase. Am J Physiol, 1987. 252(2 Pt 2): p. H252-7.
167.
Ostadal, P., A.B. Elmoselhi, I. Zdobnicka, A. Lukas, D. Chapman, and N.S. Dhalla,
Ischemia-reperfusion alters gene expression of Na+-K+ ATPase isoforms in rat heart.
Biochem Biophys Res Commun, 2003. 306(2): p. 457-62.
168.
Elmoselhi, A.B., A. Lukas, P. Ostadal, and N.S. Dhalla, Preconditioning attenuates
ischemia-reperfusion-induced remodeling of Na+-K+-ATPase in hearts. Am J Physiol
Heart Circ Physiol, 2003. 285(3): p. H1055-63.
169.
Inserte, J., D. Garcia-Dorado, V. Hernando, I. Barba, and J. Soler-Soler, Ischemic
preconditioning prevents calpain-mediated impairment of Na+/K+-ATPase activity
during early reperfusion. Cardiovasc Res, 2006. 70(2): p. 364-73.
170.
Pasdois, P., C.L. Quinlan, A. Rissa, L. Tariosse, B. Vinassa, A.D. Costa, S.V. Pierre,
P. Dos Santos, and K.D. Garlid, Ouabain protects rat hearts against ischemiareperfusion injury via pathway involving src kinase, mitoKATP, and ROS. Am J
Physiol Heart Circ Physiol, 2007. 292(3): p. H1470-8.
171.
Pierre, S.V., C. Yang, Z. Yuan, J. Seminerio, C. Mouas, K.D. Garlid, P. Dos-Santos,
and Z. Xie, Ouabain triggers preconditioning through activation of the Na+,K+ATPase signaling cascade in rat hearts. Cardiovasc Res, 2007. 73(3): p. 488-96.
Yoann Sottejeau
206
172.
Morgan, E.E., Z. Li, C. Stebal, A. Belliard, G. Tennyson, B. Salari, K.D. Garlid, and
S.V. Pierre, Preconditioning by subinotropic doses of ouabain in the Langendorff
perfused rabbit heart. J Cardiovasc Pharmacol, 2010. 55(3): p. 234-9.
173.
D'Urso, G., S. Frascarelli, R. Zucchi, T. Biver, and U. Montali, Cardioprotection by
ouabain and digoxin in perfused rat hearts. J Cardiovasc Pharmacol, 2008. 52(4): p.
333-7.
174.
Directive, du Parlement européen et du conseil. 2002/46/CE: p. 2002.
175.
Décret, du 20 mars 2006, 2006-352: p. Journal Officiel.
176.
Réglement, du Parlement européen et du conseil. 2006, 1925/2006/CE.
177.
Réglement, du Parlement européen et du conseil. 2008, CE/353/2008
178.
Réglement, du Parlement européen et du conseil. 2009, CE/1169/2009
179.
EFSA, Public consultation on a draft guidance on the scientific requirements for
health claims related to antioxidants, oxidative damage and cardiovascular health
2011.
180.
Trichopoulou, A., Traditional Mediterranean diet and longevity in the elderly: a
review. Public Health Nutr, 2004. 7(7): p. 943-7.
181.
Trichopoulou, A. and E. Vasilopoulou, Mediterranean diet and longevity. Br J Nutr,
2000. 84 Suppl 2: p. S205-9.
182.
Willett, W.C., The Mediterranean diet: science and practice. Public Health Nutr,
2006. 9(1A): p. 105-10.
183.
Martinez-Gonzalez, M.A., M. Bes-Rastrollo, L. Serra-Majem, D. Lairon, R. Estruch,
and A. Trichopoulou, Mediterranean food pattern and the primary prevention of
chronic disease: recent developments. Nutr Rev, 2009. 67 Suppl 1: p. S111-6.
184.
Lairon, D., Intervention studies on Mediterranean diet and cardiovascular risk. Mol
Nutr Food Res, 2007. 51(10): p. 1209-14.
185.
Mente, A., L. de Koning, H.S. Shannon, and S.S. Anand, A systematic review of the
evidence supporting a causal link between dietary factors and coronary heart disease.
Arch Intern Med, 2009. 169(7): p. 659-69.
186.
Mitrou, P.N., V. Kipnis, A.C. Thiebaut, J. Reedy, A.F. Subar, E. Wirfalt, A. Flood, T.
Mouw, A.R. Hollenbeck, M.F. Leitzmann, and A. Schatzkin, Mediterranean dietary
pattern and prediction of all-cause mortality in a US population: results from the
NIH-AARP Diet and Health Study. Arch Intern Med, 2007. 167(22): p. 2461-8.
187.
Itsiopoulos, C., A. Hodge, and M. Kaimakamis, Can the Mediterranean diet prevent
prostate cancer? Mol Nutr Food Res, 2009. 53(2): p. 227-39.
Yoann Sottejeau
207
188.
Verberne, L., A. Bach-Faig, G. Buckland, and L. Serra-Majem, Association between
the Mediterranean diet and cancer risk: a review of observational studies. Nutr
Cancer, 2010. 62(7): p. 860-70.
189.
Perez-Martinez, P., A. Garcia-Rios, J. Delgado-Lista, F. Perez-Jimenez, and J. LopezMiranda, Mediterranean diet rich in olive oil and obesity, metabolic syndrome and
diabetes mellitus. Curr Pharm Des, 2011. 17(8): p. 769-77.
190.
Paletas, K., E. Athanasiadou, M. Sarigianni, P. Paschos, A. Kalogirou, M.
Hassapidou, and A. Tsapas, The protective role of the Mediterranean diet on the
prevalence of metabolic syndrome in a population of Greek obese subjects. J Am Coll
Nutr, 2010. 29(1): p. 41-5.
191.
EFSA, Scientific Opinion of the Panel on Dietetic products, Nutrition and Allergies on
a request from European Commission related to labelling reference intake values for
n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. The EFSA Journal, 2009. 1176: p. 1-11.
192.
Bjerve, K.S., S. Fischer, and K. Alme, Alpha-linolenic acid deficiency in man: effect
of ethyl linolenate on plasma and erythrocyte fatty acid composition and biosynthesis
of prostanoids. Am J Clin Nutr, 1987. 46(4): p. 570-6.
193.
Holman, R.T., S.B. Johnson, O. Mercuri, H.J. Itarte, M.A. Rodrigo, and M.E. De
Tomas, Essential fatty acid deficiency in malnourished children. Am J Clin Nutr,
1981. 34(8): p. 1534-9.
194.
DeFilippis, A.P. and L.S. Sperling, Understanding omega-3's. Am Heart J, 2006.
151(3): p. 564-70.
195.
Smith, W.L., L.J. Marnett, and D.L. DeWitt, Prostaglandin and thromboxane
biosynthesis. Pharmacol Ther, 1991. 49(3): p. 153-79.
196.
Lagarde, M., D. Lemaitre, C. Calzada, and E. Vericel, Involvement of lipid
peroxidation in platelet signalling. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 1997.
57(4-5): p. 489-91.
197.
Burdge, G., Alpha-linolenic acid metabolism in men and women: nutritional and
biological implications. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2004. 7(2): p. 137-44.
198.
Djemli-Shipkolye, A., D. Raccah, G. Pieroni, P. Vague, T.C. Coste, and A. Gerbi,
Differential effect of omega3 PUFA supplementations on Na,K-ATPase and MgATPase activities: possible role of the membrane omega6/omega3 ratio. J Membr
Biol, 2003. 191(1): p. 37-47.
199.
Duran, M.J., S.V. Pierre, P. Lesnik, G. Pieroni, M. Bourdeaux, F. Dignat-Georges, J.
Sampol, and J.M. Maixent, 7-ketocholesterol inhibits Na,K-ATPase activity by
Yoann Sottejeau
208
decreasing expression of its alpha1-subunit and membrane fluidity in human
endothelial cells. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2010. 56 Suppl: p. OL1434-41.
200.
Sennoune, S., A. Gerbi, M.J. Duran, J.P. Grillasca, E. Compe, S. Pierre, R. Planells,
M. Bourdeaux, P. Vague, G. Pieroni, and J.M. Maixent, Effect of streptozotocininduced diabetes on rat liver Na+/K+-ATPase. Eur J Biochem, 2000. 267(7): p. 20718.
201.
Cohen, L.A., Lipids in cancer: an introduction. Lipids, 1992. 27(10): p. 791-2.
202.
Liang, B., S. Wang, Y.J. Ye, X.D. Yang, Y.L. Wang, J. Qu, Q.W. Xie, and M.J. Yin,
Impact of postoperative omega-3 fatty acid-supplemented parenteral nutrition on
clinical outcomes and immunomodulations in colorectal cancer patients. World J
Gastroenterol, 2008. 14(15): p. 2434-9.
203.
Stevens, L., W. Zhang, L. Peck, T. Kuczek, N. Grevstad, A. Mahon, S.S. Zentall, L.E.
Arnold, and J.R. Burgess, EFA supplementation in children with inattention,
hyperactivity, and other disruptive behaviors. Lipids, 2003. 38(10): p. 1007-21.
204.
Su, K.P., S.Y. Huang, C.C. Chiu, and W.W. Shen, Omega-3 fatty acids in major
depressive disorder. A preliminary double-blind, placebo-controlled trial. Eur
Neuropsychopharmacol, 2003. 13(4): p. 267-71.
205.
Grimsgaard, S., K.H. Bonaa, J.B. Hansen, and E.S. Myhre, Effects of highly purified
eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid on hemodynamics in humans. Am J
Clin Nutr, 1998. 68(1): p. 52-9.
206.
Schwellenbach, L.J., K.L. Olson, K.J. McConnell, R.S. Stolcpart, J.D. Nash, J.A.
Merenich, and G. Clinical Pharmacy Cardiac Risk Service Study, The triglyceridelowering effects of a modest dose of docosahexaenoic acid alone versus in
combination with low dose eicosapentaenoic acid in patients with coronary artery
disease and elevated triglycerides. J Am Coll Nutr, 2006. 25(6): p. 480-5.
207.
Kris-Etherton, P.M., W.S. Harris, L.J. Appel, and C. Nutrition, Fish consumption, fish
oil, omega-3 fatty acids, and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol,
2003. 23(2): p. e20-30.
208.
Erkkila, A.T., N.R. Matthan, D.M. Herrington, and A.H. Lichtenstein, Higher plasma
docosahexaenoic acid is associated with reduced progression of coronary
atherosclerosis in women with CAD. J Lipid Res, 2006. 47(12): p. 2814-9.
209.
Metcalf, R.G., P. Sanders, M.J. James, L.G. Cleland, and G.D. Young, Effect of
dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on the inducibility of ventricular tachycardia
in patients with ischemic cardiomyopathy. Am J Cardiol, 2008. 101(6): p. 758-61.
Yoann Sottejeau
209
210.
Caughey, G.E., E. Mantzioris, R.A. Gibson, L.G. Cleland, and M.J. James, The effect
on human tumor necrosis factor alpha and interleukin 1 beta production of diets
enriched in n-3 fatty acids from vegetable oil or fish oil. Am J Clin Nutr, 1996. 63(1):
p. 116-22.
211.
Brown, M.D., C. Hart, E. Gazi, P. Gardner, N. Lockyer, and N. Clarke, Influence of
omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread
from prostate cancer. Br J Cancer, 2010. 102(2): p. 403-13.
212.
Russo, G.L., Dietary n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids: from biochemistry to
clinical implications in cardiovascular prevention. Biochem Pharmacol, 2009. 77(6):
p. 937-46.
213.
Harris, W.S., D. Mozaffarian, E. Rimm, P. Kris-Etherton, L.L. Rudel, L.J. Appel,
M.M. Engler, M.B. Engler, and F. Sacks, Omega-6 fatty acids and risk for
cardiovascular disease: a science advisory from the American Heart Association
Nutrition Subcommittee of the Council on Nutrition, Physical Activity, and
Metabolism; Council on Cardiovascular Nursing; and Council on Epidemiology and
Prevention. Circulation, 2009. 119(6): p. 902-7.
214.
Zulet, M.A., A. Marti, M.D. Parra, and J.A. Martinez, Inflammation and conjugated
linoleic acid: mechanisms of action and implications for human health. J Physiol
Biochem, 2005. 61(3): p. 483-94.
215.
Menendez, J.A. and R. Lupu, Mediterranean dietary traditions for the molecular
treatment of human cancer: anti-oncogenic actions of the main olive oil's
monounsaturated fatty acid oleic acid (18:1n-9). Curr Pharm Biotechnol, 2006. 7(6):
p. 495-502.
216.
Covas, M.I., Bioactive effects of olive oil phenolic compounds in humans: reduction of
heart disease factors and oxidative damage. Inflammopharmacology, 2008. 16(5): p.
216-8.
217.
Waterman, E. and B. Lockwood, Active components and clinical applications of olive
oil. Altern Med Rev, 2007. 12(4): p. 331-42.
218.
Rattanachaikunsopon, P. and P. Phumkhachorn, Antimicrobial activity of basil
(Ocimum basilicum) oil against Salmonella enteritidis in vitro and in food. Biosci
Biotechnol Biochem, 2010. 74(6): p. 1200-4.
219.
Agrawal, P., V. Rai, and R.B. Singh, Randomized placebo-controlled, single blind
trial of holy basil leaves in patients with noninsulin-dependent diabetes mellitus. Int J
Clin Pharmacol Ther, 1996. 34(9): p. 406-9.
Yoann Sottejeau
210
220.
Amrani, S., H. Harnafi, D. Gadi, H. Mekhfi, A. Legssyer, M. Aziz, F. Martin-Nizard,
and L. Bosca, Vasorelaxant and anti-platelet aggregation effects of aqueous Ocimum
basilicum extract. J Ethnopharmacol, 2009. 125(1): p. 157-62.
221.
Koscielny, J., D. Klussendorf, R. Latza, R. Schmitt, H. Radtke, G. Siegel, and H.
Kiesewetter, The antiatherosclerotic effect of Allium sativum. Atherosclerosis, 1999.
144(1): p. 237-49.
222.
Sivam, G.P., Protection against Helicobacter pylori and other bacterial infections by
garlic. J Nutr, 2001. 131(3s): p. 1106S-8S.
223.
Tattelman, E., Health effects of garlic. Am Fam Physician, 2005. 72(1): p. 103-6.
224.
Fleischauer, A.T. and L. Arab, Garlic and cancer: a critical review of the
epidemiologic literature. J Nutr, 2001. 131(3s): p. 1032S-40S.
225.
Chopra, A., M. Saluja, J. Patil, and H.S. Tandale, Pain and disability, perceptions and
beliefs of a rural Indian population: A WHO-ILAR COPCORD study. WHOInternational League of Associations for Rheumatology. Community Oriented
Program for Control of Rheumatic Diseases. J Rheumatol, 2002. 29(3): p. 614-21.
226.
Malaviya, A.N., S.K. Kapoor, R.R. Singh, A. Kumar, and I. Pande, Prevalence of
rheumatoid arthritis in the adult Indian population. Rheumatol Int, 1993. 13(4): p.
131-4.
227.
Mamtani, R., Ayurveda and yoga in cardiovascular diseases. Cardiol Rev, 2005.
13(3): p. 155-62.
228.
Bengmark, S., Curcumin, an atoxic antioxidant and natural NFkappaB,
cyclooxygenase-2, lipooxygenase, and inducible nitric oxide synthase inhibitor: a
shield against acute and chronic diseases. JPEN J Parenter Enteral Nutr, 2006. 30(1):
p. 45-51.
229.
Huang, M.T., T. Lysz, T. Ferraro, T.F. Abidi, J.D. Laskin, and A.H. Conney,
Inhibitory effects of curcumin on in vitro lipoxygenase and cyclooxygenase activities
in mouse epidermis. Cancer Res, 1991. 51(3): p. 813-9.
230.
Prasad, C.P., G. Rath, S. Mathur, D. Bhatnagar, and R. Ralhan, Expression analysis of
maspin in invasive ductal carcinoma of breast and modulation of its expression by
curcumin in breast cancer cell lines. Chem Biol Interact, 2009. 26: p. 26.
231.
Bar-Sela, G., R. Epelbaum, and M. Schaffer, Curcumin as an Anti-Cancer Agent:
Review of the Gap between Basic and Clinical Applications. Curr Med Chem, 2009.
24: p. 24.
Yoann Sottejeau
211
232.
Jiang, J., W. Wang, Y.J. Sun, M. Hu, F. Li, and D.Y. Zhu, Neuroprotective effect of
curcumin on focal cerebral ischemic rats by preventing blood-brain barrier damage.
Eur J Pharmacol, 2007. 561(1-3): p. 54-62.
233.
Agrawal, R., B. Mishra, E. Tyagi, C. Nath, and R. Shukla, Effect of curcumin on brain
insulin receptors and memory functions in STZ (ICV) induced dementia model of rat.
Pharmacol Res, 2010. 61(3): p. 247-52.
234.
Srivastava, G. and J.L. Mehta, Currying the heart: curcumin and cardioprotection. J
Cardiovasc Pharmacol Ther, 2009. 14(1): p. 22-7.
235.
Egan, M.E., M. Pearson, S.A. Weiner, V. Rajendran, D. Rubin, J. Glockner-Pagel, S.
Canny, K. Du, G.L. Lukacs, and M.J. Caplan, Curcumin, a major constituent of
turmeric, corrects cystic fibrosis defects. Science, 2004. 304(5670): p. 600-2.
236.
Satoskar, R.R., S.J. Shah, and S.G. Shenoy, Evaluation of anti-inflammatory property
of curcumin (diferuloyl methane) in patients with postoperative inflammation. Int J
Clin Pharmacol Ther Toxicol, 1986. 24(12): p. 651-4.
237.
Funk, J.L., J.B. Frye, J.N. Oyarzo, N. Kuscuoglu, J. Wilson, G. McCaffrey, G.
Stafford, G. Chen, R.C. Lantz, S.D. Jolad, A.M. Solyom, P.R. Kiela, and B.N.
Timmermann, Efficacy and mechanism of action of turmeric supplements in the
treatment of experimental arthritis. Arthritis Rheum, 2006. 54(11): p. 3452-64.
238.
Shoba, G., D. Joy, T. Joseph, M. Majeed, R. Rajendran, and P.S. Srinivas, Influence of
piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers.
Planta Med, 1998. 64(4): p. 353-6.
239.
Durgaprasad, S., C.G. Pai, Vasanthkumar, J.F. Alvres, and S. Namitha, A pilot study
of the antioxidant effect of curcumin in tropical pancreatitis. Indian J Med Res, 2005.
122(4): p. 315-8.
240.
Chonpathompikunlert, P., J. Wattanathorn, and S. Muchimapura, Piperine, the main
alkaloid of Thai black pepper, protects against neurodegeneration and cognitive
impairment in animal model of cognitive deficit like condition of Alzheimer's disease.
Food Chem Toxicol, 2010. 48(3): p. 798-802.
241.
Taqvi, S.I., A.J. Shah, and A.H. Gilani, Blood pressure lowering and vasomodulator
effects of piperine. J Cardiovasc Pharmacol, 2008. 52(5): p. 452-8.
242.
Vijayakumar, R.S., D. Surya, and N. Nalini, Antioxidant efficacy of black pepper
(Piper nigrum L.) and piperine in rats with high fat diet induced oxidative stress.
Redox Rep, 2004. 9(2): p. 105-10.
Yoann Sottejeau
212
243.
Srinivasan, K., Black pepper and its pungent principle-piperine: a review of diverse
physiological effects. Crit Rev Food Sci Nutr, 2007. 47(8): p. 735-48.
244.
Afzal, M., D. Al-Hadidi, M. Menon, J. Pesek, and M.S. Dhami, Ginger: an
ethnomedical, chemical and pharmacological review. Drug Metabol Drug Interact,
2001. 18(3-4): p. 159-90.
245.
Tapsell, L.C., I. Hemphill, L. Cobiac, C.S. Patch, D.R. Sullivan, M. Fenech, S.
Roodenrys, J.B. Keogh, P.M. Clifton, P.G. Williams, V.A. Fazio, and K.E. Inge,
Health benefits of herbs and spices: the past, the present, the future. Med J Aust,
2006. 185(4 Suppl): p. S4-24.
246.
Ghayur, M.N., A.H. Gilani, M.B. Afridi, and P.J. Houghton, Cardiovascular effects of
ginger aqueous extract and its phenolic constituents are mediated through multiple
pathways. Vascul Pharmacol, 2005. 43(4): p. 234-41.
247.
Nicoll, R. and M.Y. Henein, Ginger (Zingiber officinale Roscoe): a hot remedy for
cardiovascular disease? Int J Cardiol, 2009. 131(3): p. 408-9.
248.
Stewart, J.J., M.J. Wood, C.D. Wood, and M.E. Mims, Effects of ginger on motion
sickness susceptibility and gastric function. Pharmacology, 1991. 42(2): p. 111-20.
249.
Altman, R.D. and K.C. Marcussen, Effects of a ginger extract on knee pain in patients
with osteoarthritis. Arthritis Rheum, 2001. 44(11): p. 2531-8.
250.
Bliddal, H., A. Rosetzsky, P. Schlichting, M.S. Weidner, L.A. Andersen, H.H. Ibfelt,
K. Christensen, O.N. Jensen, and J. Barslev, A randomized, placebo-controlled, crossover study of ginger extracts and ibuprofen in osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage,
2000. 8(1): p. 9-12.
251.
Keys, A., C. Aravanis, H.W. Blackburn, F.S. Van Buchem, R. Buzina, B.D.
Djordjevic, A.S. Dontas, F. Fidanza, M.J. Karvonen, N. Kimura, D. Lekos, M. Monti,
V. Puddu, and H.L. Taylor, Epidemiological studies related to coronary heart
disease: characteristics of men aged 40-59 in seven countries. Acta Med Scand Suppl,
1966. 460: p. 1-392.
252.
Keys, A., A. Menotti, C. Aravanis, H. Blackburn, B.S. Djordevic, R. Buzina, A.S.
Dontas, F. Fidanza, M.J. Karvonen, N. Kimura, and et al., The seven countries study:
2,289 deaths in 15 years. Prev Med, 1984. 13(2): p. 141-54.
253.
Keys, A., A. Menotti, M.J. Karvonen, C. Aravanis, H. Blackburn, R. Buzina, B.S.
Djordjevic, A.S. Dontas, F. Fidanza, M.H. Keys, and et al., The diet and 15-year death
rate in the seven countries study. Am J Epidemiol, 1986. 124(6): p. 903-15.
Yoann Sottejeau
213
254.
Estruch, R., M.A. Martinez-Gonzalez, D. Corella, J. Salas-Salvado, V. Ruiz-Gutierrez,
M.I. Covas, M. Fiol, E. Gomez-Gracia, M.C. Lopez-Sabater, E. Vinyoles, F. Aros, M.
Conde, C. Lahoz, J. Lapetra, G. Saez, E. Ros, and P.S. Investigators, Effects of a
Mediterranean-style diet on cardiovascular risk factors: a randomized trial. Ann
Intern Med, 2006. 145(1): p. 1-11.
255.
Vincent-Baudry, S., C. Defoort, M. Gerber, M.C. Bernard, P. Verger, O. Helal, H.
Portugal, R. Planells, P. Grolier, M.J. Amiot-Carlin, P. Vague, and D. Lairon, The
Medi-RIVAGE study: reduction of cardiovascular disease risk factors after a 3-mo
intervention with a Mediterranean-type diet or a low-fat diet. Am J Clin Nutr, 2005.
82(5): p. 964-71.
256.
de Lorgeril, M., P. Salen, J.L. Martin, I. Monjaud, J. Delaye, and N. Mamelle,
Mediterranean diet, traditional risk factors, and the rate of cardiovascular
complications after myocardial infarction: final report of the Lyon Diet Heart Study.
Circulation, 1999. 99(6): p. 779-85.
257.
Paganelli, F., J.M. Maixent, M.J. Duran, R. Parhizgar, G. Pieroni, and S. Sennoune,
Altered erythrocyte n-3 fatty acids in Mediterranean patients with coronary artery
disease. Int J Cardiol, 2001. 78(1): p. 27-32.
258.
GISSI-Prevenzione, Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and
vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-Prevenzione trial. Gruppo
Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico. Lancet, 1999.
354(9177): p. 447-55.
259.
Burr, M.L., A.M. Fehily, J.F. Gilbert, S. Rogers, R.M. Holliday, P.M. Sweetnam, P.C.
Elwood, and N.M. Deadman, Effects of changes in fat, fish, and fibre intakes on death
and myocardial reinfarction: diet and reinfarction trial (DART). Lancet, 1989.
2(8666): p. 757-61.
260.
AFFSA, Avis de l'Agence française de sécurité sanitaire des aliments relatif à
l'actualisation des apports nutritionnels conseillés pour les acides gras. 2010.
261.
Reiffel, J.A. and A. McDonald, Antiarrhythmic effects of omega-3 fatty acids. Am J
Cardiol, 2006. 98(4A): p. 50i-60i.
262.
Mori, T.A., L.J. Beilin, V. Burke, J. Morris, and J. Ritchie, Interactions between
dietary fat, fish, and fish oils and their effects on platelet function in men at risk of
cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997. 17(2): p. 279-86.
Yoann Sottejeau
214
263.
Zhao, G., T.D. Etherton, K.R. Martin, S.G. West, P.J. Gillies, and P.M. Kris-Etherton,
Dietary alpha-linolenic acid reduces inflammatory and lipid cardiovascular risk
factors in hypercholesterolemic men and women. J Nutr, 2004. 134(11): p. 2991-7.
264.
Fleischhauer, F.J., W.D. Yan, and T.A. Fischell, Fish oil improves endotheliumdependent coronary vasodilation in heart transplant recipients. J Am Coll Cardiol,
1993. 21(4): p. 982-9.
265.
Egert, S. and P. Stehle, Impact of n-3 fatty acids on endothelial function: results from
human interventions studies. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2011. 14(2): p. 121-31.
266.
Harris, W.S., Fish oils and plasma lipid and lipoprotein metabolism in humans: a
critical review. J Lipid Res, 1989. 30(6): p. 785-807.
267.
Ferrucci, L., A. Cherubini, S. Bandinelli, B. Bartali, A. Corsi, F. Lauretani, A. Martin,
C. Andres-Lacueva, U. Senin, and J.M. Guralnik, Relationship of plasma
polyunsaturated fatty acids to circulating inflammatory markers. J Clin Endocrinol
Metab, 2006. 91(2): p. 439-46.
268.
Hu, F.B., J.E. Manson, and W.C. Willett, Types of dietary fat and risk of coronary
heart disease: a critical review. J Am Coll Nutr, 2001. 20(1): p. 5-19.
269.
Covas, M.I., K. Nyyssonen, H.E. Poulsen, J. Kaikkonen, H.J. Zunft, H. Kiesewetter,
A. Gaddi, R. de la Torre, J. Mursu, H. Baumler, S. Nascetti, J.T. Salonen, M. Fito, J.
Virtanen, J. Marrugat, and E.S. Group, The effect of polyphenols in olive oil on heart
disease risk factors: a randomized trial. Ann Intern Med, 2006. 145(5): p. 333-41.
270.
Amrani, S., H. Harnafi, H. Bouanani Nel, M. Aziz, H.S. Caid, S. Manfredini, E.
Besco, M. Napolitano, and E. Bravo, Hypolipidaemic activity of aqueous Ocimum
basilicum extract in acute hyperlipidaemia induced by triton WR-1339 in rats and its
antioxidant property. Phytother Res, 2006. 20(12): p. 1040-5.
271.
Mohanty, I., D. Singh Arya, A. Dinda, S. Joshi, K.K. Talwar, and S.K. Gupta,
Protective effects of Curcuma longa on ischemia-reperfusion induced myocardial
injuries and their mechanisms. Life Sci, 2004. 75(14): p. 1701-11.
272.
Mohanty, I., D.S. Arya, and S.K. Gupta, Effect of Curcuma longa and Ocimum
sanctum on myocardial apoptosis in experimentally induced myocardial ischemicreperfusion injury. BMC Complement Altern Med, 2006. 6(3): p. 3.
273.
Gerbi, A. and J.M. Maixent, Fatty acid-induced modulation of ouabain responsiveness
of rat Na, K-ATPase isoforms. J Membr Biol, 1999. 168(1): p. 19-27.
274.
Gerbi, A., O. Barbey, D. Raccah, T. Coste, I. Jamme, A. Nouvelot, L. Ouafik, S. Levy,
P. Vague, and J.M. Maixent, Alteration of Na,K-ATPase isoenzymes in diabetic
Yoann Sottejeau
215
cardiomyopathy: effect of dietary supplementation with fish oil (n-3 fatty acids) in
rats. Diabetologia, 1997. 40(5): p. 496-505.
275.
Mahmmoud, Y.A. and S.B. Christensen, Oleic and linoleic acids are active principles
in Nigella sativa and stabilize an E(2)P conformation of the Na,K-ATPase. Fatty acids
differentially regulate cardiac glycoside interaction with the pump. Biochim Biophys
Acta, 2011. 1808(10): p. 2413-20.
276.
Mayol, V., M.J. Duran, A. Gerbi, F. Dignat-George, S. Levy, J. Sampol, and J.M.
Maixent, Cholesterol and omega-3 fatty acids inhibit Na, K-ATPase activity in human
endothelial cells. Atherosclerosis, 1999. 142(2): p. 327-33.
277.
Duran, M.J., F. Sabatier, G. Pieroni, G. Gerber, J. Sampol, and J.M. Maixent,
Omegacoeur, a Mediterranean nutritional complement, stimulates Na,K-ATPase
activity in human endothelial cells. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2001. 47(2): p.
313-8.
278.
Mahmmoud, Y.A., Curcumin modulation of Na,K-ATPase: phosphoenzyme
accumulation, decreased K+ occlusion, and inhibition of hydrolytic activity. Br J
Pharmacol, 2005. 145(2): p. 236-45.
279.
Mahmmoud, Y.A., Curcumin is a lipid dependent inhibitor of the Na,K-ATPase that
likely interacts at the protein-lipid interface. Biochim Biophys Acta, 2011. 1808(1): p.
466-73.
280.
Skayian, Y. and S.I. Kreydiyyeh, Tumor necrosis factor alpha alters Na+-K+ ATPase
activity in rat cardiac myocytes: involvement of NF-kappaB, AP-1 and PGE2. Life
Sci, 2006. 80(2): p. 173-80.
281.
Murphy, E. and D.A. Eisner, Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in
health and disease. Circ Res, 2009. 104(3): p. 292-303.
282.
Saw, C.L., Y. Huang, and A.N. Kong, Synergistic anti-inflammatory effects of low
doses of curcumin in combination with polyunsaturated fatty acids: docosahexaenoic
acid or eicosapentaenoic acid. Biochem Pharmacol, 2010. 79(3): p. 421-30.
283.
Swamy, M.V., B. Citineni, J.M. Patlolla, A. Mohammed, Y. Zhang, and C.V. Rao,
Prevention and treatment of pancreatic cancer by curcumin in combination with
omega-3 fatty acids. Nutr Cancer, 2008. 60 Suppl 1: p. 81-9.
284.
Pressley, T.A., R.S. Haber, J.N. Loeb, I.S. Edelman, and F. Ismail-Beigi, Stimulation
of Na,K-activated adenosine triphosphatase and active transport by low external K+
in a rat liver cell line. J Gen Physiol, 1986. 87(4): p. 591-606.
Yoann Sottejeau
216
285.
Haber, R.S., T.A. Pressley, J.N. Loeb, and F. Ismail-Beigi, Ionic dependence of active
Na-K transport: "clamping" of cellular Na+ with monensin. Am J Physiol, 1987.
253(1 Pt 2): p. F26-33.
286.
Harder, K.W., P. Owen, L.K. Wong, R. Aebersold, I. Clark-Lewis, and F.R. Jirik,
Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein
tyrosine phosphatase beta (HPTP beta) using synthetic phosphopeptides. Biochem J,
1994. 298 ( Pt 2): p. 395-401.
287.
Huang, L., P. Kometiani, and Z. Xie, Differential regulation of Na/K-ATPase alphasubunit isoform gene expressions in cardiac myocytes by ouabain and other
hypertrophic stimuli. J Mol Cell Cardiol, 1997. 29(11): p. 3157-67.
288.
Xie, Z.J., Y.H. Wang, M. Ganjeizadeh, R. McGee, Jr., and A. Askari, Determination
of total (Na+ + K+)-ATPase activity of isolated or cultured cells. Anal Biochem,
1989. 183(2): p. 215-9.
289.
Pardridge, W.M., Transport of protein-bound hormones into tissues in vivo. Endocr
Rev, 1981. 2(1): p. 103-23.
290.
Lecuona, E., H.E. Trejo, and J.I. Sznajder, Regulation of Na,K-ATPase during acute
lung injury. J Bioenerg Biomembr, 2007. 39(5-6): p. 391-5.
291.
Pierre, S.V., A. Belliard, and Y. Sottejeau, Modulation of Na(+)-K(+)-ATPase cell
surface abundance through structural determinants on the alpha1-subunit. Am J
Physiol Cell Physiol, 2011. 300(1): p. C42-8.
292.
Kotova, O., L. Al-Khalili, S. Talia, C. Hooke, O.V. Fedorova, A.Y. Bagrov, and A.V.
Chibalin, Cardiotonic steroids stimulate glycogen synthesis in human skeletal muscle
cells via a Src- and ERK1/2-dependent mechanism. J Biol Chem, 2006. 281(29): p.
20085-94.
293.
Garlid, K.D., A.D. Costa, C.L. Quinlan, S.V. Pierre, and P. Dos Santos,
Cardioprotective signaling to mitochondria. J Mol Cell Cardiol, 2009. 46(6): p. 85866.
294.
Chaudhary, K.R., W.J. Cho, E.E. Daniel, and J.M. Seubert, Role of caveolins in
epoxyeicosatrienoic acid-mediated protective effects against ischemia reperfusion
injury. Experimental Biology 2011, 2011. April 9-13: p. Washington D.C (USA).
295.
Ikenouchi, H., L. Zhao, M. McMillan, E.M. Hammond, and W.H. Barry, ATP
depletion causes a reversible decrease in Na+ pump density in cultured ventricular
myocytes. Am J Physiol, 1993. 264(4 Pt 2): p. H1208-14.
Yoann Sottejeau
217
296.
Ye, Q., Z. Li, J. Tian, J.X. Xie, L. Liu, and Z. Xie, Identification of a potential
receptor that couples ion transport to protein kinase activity. J Biol Chem, 2011.
286(8): p. 6225-32.
297.
Liu, J., R. Kesiry, S.M. Periyasamy, D. Malhotra, Z. Xie, and J.I. Shapiro, Ouabain
induces endocytosis of plasmalemmal Na/K-ATPase in LLC-PK1 cells by a clathrindependent mechanism. Kidney Int, 2004. 66(1): p. 227-41.
298.
Takeishi, Y., J. Abe, J.D. Lee, H. Kawakatsu, R.A. Walsh, and B.C. Berk, Differential
regulation of p90 ribosomal S6 kinase and big mitogen-activated protein kinase 1 by
ischemia/reperfusion and oxidative stress in perfused guinea pig hearts. Circ Res,
1999. 85(12): p. 1164-72.
299.
Takeishi, Y., Q. Huang, T. Wang, M. Glassman, M. Yoshizumi, C.P. Baines, J.D. Lee,
H. Kawakatsu, W. Che, N. Lerner-Marmarosh, C. Zhang, C. Yan, S. Ohta, R.A.
Walsh, B.C. Berk, and J. Abe, Src family kinase and adenosine differentially regulate
multiple MAP kinases in ischemic myocardium: modulation of MAP kinases activation
by ischemic preconditioning. J Mol Cell Cardiol, 2001. 33(11): p. 1989-2005.
300.
Li, Z., T. Cai, J. Tian, J.X. Xie, X. Zhao, L. Liu, J.I. Shapiro, and Z. Xie, NaKtide, a
Na/K-ATPase-derived peptide Src inhibitor, antagonizes ouabain-activated signal
transduction in cultured cells. J Biol Chem, 2009. 284(31): p. 21066-76.
301.
Changtam, C., H.P. de Koning, H. Ibrahim, M.S. Sajid, M.K. Gould, and A.
Suksamrarn, Curcuminoid analogs with potent activity against Trypanosoma and
Leishmania species. Eur J Med Chem, 2010. 45(3): p. 941-56.
302.
Davidson, M.H., K.C. Maki, T.A. Pearson, R.C. Pasternak, P.C. Deedwania, J.M.
McKenney, G.C. Fonarow, D.J. Maron, B.J. Ansell, L.T. Clark, and C.M. Ballantyne,
Results of the National Cholesterol Education (NCEP) Program Evaluation ProjecT
Utilizing Novel E-Technology (NEPTUNE) II survey and implications for treatment
under the recent NCEP Writing Group recommendations. Am J Cardiol, 2005. 96(4):
p. 556-63.
303.
Bays, H.E., J. McKenney, K.C. Maki, R.T. Doyle, R.N. Carter, and E. Stein, Effects of
prescription omega-3-acid ethyl esters on non--high-density lipoprotein cholesterol
when coadministered with escalating doses of atorvastatin. Mayo Clin Proc, 2010.
85(2): p. 122-8.
304.
Kim, S.H., M.K. Kim, H.Y. Lee, H.J. Kang, Y.J. Kim, and H.S. Kim, Prospective
randomized comparison between omega-3 fatty acid supplements plus simvastatin
Yoann Sottejeau
218
versus simvastatin alone in Korean patients with mixed dyslipidemia: lipoprotein
profiles and heart rate variability. Eur J Clin Nutr, 2011. 65(1): p. 110-6.
305.
Maki, K.C., M.R. Dicklin, M.H. Davidson, R.T. Doyle, C.M. Ballantyne, and
C.O.o.p.O.-w.S. Investigators, Baseline lipoprotein lipids and low-density lipoprotein
cholesterol response to prescription omega-3 acid ethyl ester added to Simvastatin
therapy. Am J Cardiol, 2010. 105(10): p. 1409-12.
306.
Alwi, I., T. Santoso, S. Suyono, B. Sutrisna, F.D. Suyatna, S.B. Kresno, and S. Ernie,
The effect of curcumin on lipid level in patients with acute coronary syndrome. Acta
Med Indones, 2008. 40(4): p. 201-10.
Yoann Sottejeau
219
Annexes
220
Annexes
Publication non présenté : Rigoard P, Chaillou M, Fares M, Sottejeau Y,
Giot JP, Honfo-Ga C, Rohan J, Lapierre F, Maixent JM., [Energetic
applications: Na+/K+-ATPase and neuromuscular transmission],
Neurochirurgie. 2009 Mar;55 Suppl 1:S92-103.
221
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Annexes
Publication non présenté : Chaillou M, Rigoard P, Fares M, Francois C,
Sottejeau Y, Maixent JM., Relation between Į-isoform and phosphatase
activity of Na+,K+-ATPase in rat skeletal muscle fiber types., Cell Mol Biol
(Noisy-le-grand). 2011 Jul 25;57 Suppl:OL1520-7.
234
Cell. Mol. Biol. 57 (supp): OL1520-OL1527
Published on July 25, 2011; DOI 10.1170/175
RELATION BETWEEN Į-ISOFORM AND PHOSPHATASE
ACTIVITY OF Na+,K+-ATPase IN RAT SKELETAL MUSCLE
FIBER TYPES
M. CHAILLOU1,2, P. RIGOARD*1, M. FARES1, C. FRANCOIS1, Y. SOTTEJEAU1 3 AND
J.M. MAIXENT1,4"
1 Inserm U 927, School of Medecine, CHU, University Hospital, University of Poitiers, 86000 Poitiers, France
2 Fleurance Nature, 75010 Paris, France
3 Department of Physiology and Pharmacology, College of Medicine, University of Toledo, 3035 Arlington
Avenue, Toledo, Ohio, USA.
4 Pôle de Formation Professionnelle Biologie-Santé Université de Poitiers, Poitiers, France
Abstract
In skeletal muscle the relationship between Na+,K+-ATPase activity and isoform content remains controversial
(9,6). It could be due to the fiber-type content, membrane isolation and analytical methods. We investigated the
GLVWULEXWLRQRIVXEXQLWĮDQGĮ1D+,K+-ATPase catalytic isoforms and the Na+,K+-ATPase activity in isolated
membranes from white ( type I and glycolitic fibers) and red (type II and oxidative fibers) skeletal muscles. Red
Gastrocnemius and White Gastrocnemius muscles were sampled from 8 week-old female Wistar rats and crude
membranes were performed. The Na+,K+-ATPase activity and membrane distribution of Na+,K+-$73DVHĮDQG
Į LVRforms were assessed by ouabain sensitive K-phosphatase (Kpase) measurements and Western Blot
respectively. The Na+,K+-ATPase activity was 6 fold lower in White Gastrocnemius membranes than in Red
*DVWURFQHPLXV PHPEUDQHV7KHĮDQGĮ-isoform levels are higher in RG than in White Gastrocnemius. The
Į DQG Į-subunit Red Gastrocnemius content was significantly higher than in WG. The correlation between
FUXGHPHPEUDQH.SDVHDFWLYLW\DQGERWKFDWDO\WLFĮ-subunit of the Na+,K+-ATPase exist.These data suggest that
the Na+,K+-$73DVH SKRVSKDWDVH DFWLYLW\ FRUUHODWHV ZLWK WKH Į DQG Į LVRIRUPV OHYHOV LQ 5HG *DVWURFQHPLXV
and White Gastrocnemius and confirms the fiber-specific Na+,K+-$73DVHFDWDO\WLFĮ-VXEXQLWVDQGĮ-isoform
as the major catalytic isoform in rat skeletal muscle.
Key words: Kpase, turnover, Na+,K+-ATPase, ouabain.
Article information’s
INTRODUCTION
Received on February 2, 2011
Accepted on June 24, 2011
Corresponding author
J.M. Maixent, Pôle de Formation Professionnelle BiologieSanté, Bât. Delta B2, Rue Charles Claude Chenou, Faculté
des Sciences Fondamentales et Appliquées, 40 Av. du
recteur Pineau 86022 Poitiers Cedex France
Fax : +33 5 49 45 36 32
E-mail烉[email protected]
* The two authors contribute equally
Abbreviations: RG : red gastrocnemius muscle; WG :
white gastrocnemius muscle; Kpase : ouabain sensitive
potassium phosphatase; SR : sarcoplasmic reticulum ;
pNPP: paranitrophenyl phosphatase; pNP: paranitrophenyl ;
LDL : low density lipoprotein: 3-OMFP : 3-Omethylfluorescein phosphate hydrolysis by the Na+,K+)ATPase.
Skeletal muscles are composed of different
types of fiber types. These fibers are classified by
their properties : 1/ phenotypes (red vs white), 2/
Contractility (fast twich (type II) vs slow twich
(type I)) and 3/ metabolism (oxidative vs
glycolytic). Their physiological roles are for red
muscle the gravity, bearing weight and sustained
movements and for white the concentrated bursts
of power (18). Two examples of skeletal muscles
have been used for their phenotypes : soleus
with 87 % fast oxidative red fibers (red
gastrocnemmius are also used) and the white
gastrocnemius with 84 % slow glycolytic white
fibers (1). Furthermore, type II fibers possess a
specific profile of myosin heavy chains and an
extensive sarcoplasmic reticulum (SR) with T
tubules which permits the rapid regulation of the
cytosolic free Ca2+ -transient and rapid activation
Copyright © 2011 Cellular & Molecular Biology
http://www.cellmolbiol.com
1520
M. CHAILLOU et al. / Sodium pump in skeletal muscle
of the myofibrillar proteins. This confers to such
fiber higher frequency of sarcolemmal action
potential (24). As a consequence, these fibers in
the rat skeletal muscles are characterized by a
high level of P-type ATPases especially the Ca2+ATPase. Na+,K+-ATPase Į DQG Į DUH PDMRU
isofoms in adult skeletal muscles whereas the Į
DQG Į DUH QRW H[SUHVVHG 18). However it was
difficult in many studies (1-6) to assess the
Na+,K+-ATPase activity and the Į DQG Į
Na+/K+-ATPase isoform content in crude
homogenates. This discrepancy may be attributed
to the different methods used to homogenize and
purify membrane from skeletal muscle. However,
the yield in enzyme activity was less than 10 %
of the whole enzyme with 0.08 % in recovery as
outlined by Clausen (6). On the other hand,
homogenates seem less appropriated to
characterize the protein content with accuracy
although Thompson and McDonough (29)
illustrate very accurate detection of Na+,K+ATPase in skeletal muscle homogenates in a fiber
specific manner. However Fowles et al. (9)
recently addressed this issue with extending
characterization of Na+,K+-ATPase in many
conditions and failed to indicate a clear
relationship between activity and total pump
content and isoform content of Na+,K+-ATPase.
In the past, there was a consensus that
measurements of K+-activated phosphatase are
more accurate for purified plasma membranes
from skeletal muscles (7). However these
previous measurements are limited in use within
the rat since the resistant rat Į1 isoform of
Na+,K+-ATPase is partially inhibited by ouabain,
the Na+,K+-ATPase specific inhibitor , and do not
allow the measure of the whole enzyme activity
with accuracy.
Therefore, our goal in this study is to
understand the relation between enzyme activity
and isoform content in type I and type II skeletal
muscles. To address this, we determined the K+dependent phosphatase activity of the Na+,K+ATPase (K-pNPPase activity as sensitive to Na+)
and the immunological characterization of
catDO\WLF Į-subunit from rat red and white
gastrocnemius skeletal muscles crude membrane
fractions in term of acceptable enzyme recovery
(50 % of the whole Na+,K+-ATPase activity) (2).
Animals
8 weeks female wistar rats were purchased from R.
Janvier (Le Genest-St-Isle, France). All experiments were
performed according to Institutional Animal Care and Use
Committee guidelines (Ministère de l’Agriculture, Article
R214-87 and R215-10 from « code rural »). Animals were
anesthetized with a mix of Ketamine (3mg/kg ; Jansen
Pharmaceutics, Paris, France) and chlorpromazine (1.5ml/kg
; Roche Pharmaceutioicals, Paris, France). Muscles were
removed, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 °C.
Muscle Plasma Membrane Isolation
Samples of frozen skeletal muscle (2-12 mg) were
homogenized directly in ice-cold buffer containing 250 mM
sucrose, 0.1 mM phenylmethane sulfonyl fluoride, 1 mM
EDTA, and 20 mM imidazol-HCl, pH 7.4, with a polytron
PT 10 (5 sec, setting 3) as previously described in cardiac
tissues (2). The homogenate was subfractionated by two
sequential differential centrifugations at 12,000 x g for 5 min
and 540,000 x g for 5 min, using a TLA100.3 rotor in the
Beckman TL 100 centrifuge (Beckman Instruments; Gagny,
France). The final pellet was resuspended in 250 mM
sucrose and 16 mM HEPES-HCl, pH 7.4 and stored at -80C
until use. These preparations consisted of a membrane
fraction highly enriched in Na+,K+-ATPase.
Since Zhang and Ng showed that the Na+,K+-ATPase
Į-1 isoforms undergo dephosphorylation in rat skeletal
muscle cryosections, we have chosen to store muscle
membrane preparations in liquid nitrogen after preparation
to avoid dephosphorylation (30).
The protein yields for the crude membrane
preparations calculated as the amount of sarcolemmal
protein available at the end of isolation relative to the known
amount of wet weight tissue at the beginning of the isolation
(mg protein/g wet wt) were the same as muscle membrane
preparations previously used – state the recovery since this
was criticized in the introduction (7).
K+ -stimulated paranitrophenyl phosphatase activity
Na+,K+-ATPase activity was measured as K+stimulated paranitrophenyl phosphatase (pNPPase) activity
using a modified method from Maixent et al.(15). The
activity was assessed in 96-wells plates using a reaction
mixture with KCl or KCl-ouabain-NaCl during 2 h at 37°C.
Each well contained (final volume 300 μl) 6 mM MgCl2, 30
mM Imidazole, 250 mM sucrose, 8 mM pNPP (Sigma) with
20 mM KCl or 20 m KCl and 10-3 M ouabain. The complete
(almost)
ouabain
inhibition
of
K+ -stimulated
paranitrophenyl phosphatase (pNPPase) activity was tested
after 30 min, 60 min, 90 min and 120 min. This last time of
incubation was used to calculate the enzyme activity and
ouabain inhibition. The enzymatic reaction was initiated by
the addition of protein (5 μg). As similar inhibition of the
enzyme activity was obtained between Na+ (20-100 mM)
and ouabain, we did not choose to preequilibrate the
membranes and ouabain before addition of K+. Optical
density was measured at 405 nm using the Wallac 1420
VICTOR3™ a multilabel, multitask plate reader. K+stimulated paranitrophenyl phosphatase (pNPPase) activity
was calculated as the difference in paranitrophenyl (pNP)
production with KCl or KCl-ouabain-NaCl. Enzyme
activities are expressed as optical density/hr/mg of protein.
Protein content was determined by the method of Lowry et
al. (13), using bovine serum albumin (Sigma) as a standard.
Antibodies
The monoclonal antibody 6F specific for the Na+,K+ATPase Į1 isoform was obtained from the Developmental
Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa (Iowa
City, IA). The polyclonal antibody HERED specific for Į2
isoform was obtained from Thomas A.Pressley (Department
of Cell Physiology & Molecular Biophysic, Texas Tech
1521
University Health
(26)(Tab. 1).
Sciences
Center,Lubbock,
Texas)
SDS/PAGE and Western Blots
([SUHVVLRQ RI WKH Į DQG Į LVRIRUPV RI WKH 1D+,K+ATPase was analysed by SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE, 10% gel) and immunoblotting.
In a preliminary experiment, we obtained linear calibration
curves with the antibodies used in this study between 5 and
20 μg of skeletal membrane proteins loaded on the same gel.
A total protein of 10 μg/lane was separated by SDS-PAGE
and was transferred onto nitrocellulose membrane (Hybond
C+, Amersham Corp.). Nitrocellulose blots were blocked in
5% BSA in TBS-T for 1 h at room temperature. Primary
antibody in 5% BSA TBS-T was incubated overnight at 4°C.
Secondary antibody was incubated for 1 hr at room
temperature. Table 1 indicates the concentration for each
primary antibody and corresponding secondary antibody
Detection
was
performed
with
the
enhanced
chemiluminescence (ECL). Multiple exposures were
analyzed to assure that the signals were within the linear
range of the film. The amount of protein bands was
quantitated using imageJ (NIH). All summarized results
consist of data from at least four Western blots representing
six different membranes preparations of each muscle types.
Table 1. Primary and secondary antibodies used in this study
(1)
From Developmental Studies Hybridoma Bank of Iowa University (Iowa City, IA).
Generously provided by Dr. Thomas A. Pressley (Department of Cell Physiology & Molecular Biophysics, Texas Tech
University Health Sciences Center,Lubbock, Texas)
(2)
Statistical analysis
Results are expressed as means ± SEM of six
experiments. Statistical analysis was done using analysis of
variance (ANOVA) followed with the Tukey’s post-test
(GraphPad Prism®, GraphPad Software, San Diego, CA).
Values of p<0.05 were considered statistically significant.
RESULTS
Na+,K+-ATPase activity in crude membrane from
frozen skeletal RG and WG
The Na+,K+-ATPase activity was determined
using Kpase assays in RG and WG muscles crude
membrane preparations . The Kpase activity was
6 fold higher (p<0.01) in RG than in WG (Fig.
1).
Isoform distribution
The Na+,K+-ATPase catalytic subunit
isoforms were measured in the same crude
membrane preparations. The relative distribution
of Į DQG Į LVRIRUPV LV VKRZQ LQ )LJ Relative density of each isoform was calculated
relative to the known standard of rat brain lysate.
Rat kidney lysate was used to corrobarate the
VSHFLILFLW\ RI Į 7KH Į- DQG Į-isoforms
distribution is higher in RG WKDQLQ:*7KHĮ
DQG Į-isoforms content was approximately 1.5fold and 3 fold greater in RG than in WG
respectively (p<0.05). In conclusion the
GLVWULEXWLRQ IRU Į-subunit exhibited a dramatic
GLIIHUHQFHLQĮLVRIRUPH[SUHVVLRQ
Relationship between Na+,K+-ATPase activity
and isoforms content
Interrelationships
determined
from
regression correlation between activity and
isoform abundance in crude membrane
preparations are shown in Fig 2. A trend for a
correlation could be seen between crude
membrane Kpase activity and both catalytic
subunit of the Na+,K+-ATPase from both muscle
type (Fig. 2 A&B). The correlation was similar
IRU WKH Į-VXEXQLWV Į U 16 DQG Į U
=0.5, NS).
The flat correlation between crude
PHPEUDQH .SDVH DFWLYLW\ DQG ERWK FDWDO\WLF Įsubunit of the Na+,K+-ATPase could be due to the
important difference in Kpase activity between
the two muscles (Fig. 2 A&B).
DISCUSSION
It has been known for long time that red and
white skeletal muscles differs by their
metabolism
(oxidative
vs.
glycolytic),
contractility (fast twitch vs. slow twitch) and
their functionality. The activity and content of the
Na+,K+-ATPase is regulated by various factors in
order to satisfy the demand of Na+,K+-ATPase
1522
Figure 1. Na+,K+-ATPase enzyme activity and D-2 isoform expression are higher in rat red skeletal muscles. RG: Red
Gastrocnemius, WG: White Gastrocnemius, relative abundance (in %) was adjusted to 100% for rat brain tissue in Į1 and Į2
respectively, n=6,* P < 0.05. This graph summarize 4 Western blots representing six different membranes preparations of
each muscle types
A
B
200
Enzyme Activity
Enzyme Activity
200
150
100
50
150
100
50
0
0
0
50
100
150
0
200
50
100
150
200
250
D 2 Expression
D 1 Expression
Figure 2. Regression correlation between activity and isoform abundance in crude membrane preparations of red and
white skeletal muscles. /LQHDUUHJUHVVLRQ5 IRUĮDQG5 IRUĮ(Q]\PHDFWLYLW\.+ pNPPase Activity OD x
10-4 KPJSURWHLQĮDQGĮH[SUHVVLRQUHODWLYHDEXQGDQFHWRUDWEUDLQKRPRJHQDWH
1523
(phosphorylation, signal transduction, etc.) in the
skeletal muscle (6,18,21). It has been assumed
that the changes in K+ transport in muscle are
dependent of Na+,K+-ATPase activity and
abundance, especially the Į-isoform which is
the predominant isoform in skeletal muscle (19).
However, the mechanisms underlying these
regulations are still not well understood (6). In
skeletal muscle the relationship between Na+,K+ATPase activity and isoform content remains
controversial9. It could be due to the fiber-type
content, membrane isolation and analytical
methods. We investigated the distribution of
Na+/K+ ATPase Į DQG Į LVRIRUPV DQG LWV
activity in isolated membranes from white ( type
I and glycolytic fibers) and red (type II and
oxidative fibers) skeletal muscles. To avoid the
dilemma to use homogenate or purified
membrane preparation, in this study we isolated a
simple crude membrane preparation and revealed
that an apparent fiber type of Na+,K+-$73DVHĮDQG Į-subunit abundances in RG and WG
respectively.
We found a trend for a regulation between
crude membrane Kpase activity and both
catalytic subunit of the Na+,K+-ATPase from both
muscle type (Fig. 2 A&B). The correlation was
VLPLODU IRU WKH Į-subunits (r=0.5). Previous
studies showed discrepancies between Na+,K+$73DVH DFWLYLW\ DQG Į-subunit content in the
skeletal muscle (9,20,21). Fowles et al.(9)
investigated the hypothesis that muscle Na+,K+ATPase activity was directly related to Na+,K+$73DVH DQG WR Į-catalytic isoform contents
from different fiber-type composition. However
Fowles et al. found disparate correlation between
content and activity of Na+,K+-ATPase in the
skeletal muscle among and the methods to
measure the enzyme activity ie. Na+,K+-ATPase,
3-O-MFP and 3H ouabain binding (9) and
conclude that the best measure of Na+,K+-ATPase
activity was the ATPase reaction in crude
membrane fractions.
Using western blot analysis, Kritensen and
Juel (12) LQYHVWLJDWHG WKH UHODWLYH Į-isoform
distribution in rat skeletal muscle membranes.
Interestingly the distribution of RG and WG
Na+,K+-ATPase in the purified membranes
(sarcolemma giant vesicles) was found to be
very similar to our results with a crude membrane
preparation. However they found an inverse ratio
in contrast to our results with a very crude
membrane preparation. In this outer membrane
IUDFWLRQ WKH Į DQG Į ZHUH WKH PDMRU SURWHLQ
found in WG. In contrast, Fowles et al. (9) found
the same distribution with the homogenate and
FUXGH PHPEUDQHV SUHVHQWHG KRPRJHQDWHV Į
5* !!:* Į 5* !:* DQG FUXGH
PHPEUDQHV Į 5* !:* DQG Į 5*!:*2XU
UHVXOWVFRQILUPWKHFRQVWDQW5*!:*IRUĮDQG
Į ZKDWHYHU WKH IUDFWLRQ Komogenate or crude
membranes). The relative isoform distribution in
our membrane preparation confirms two facts as
previously evidenced in a more complete analysis
of muscle types by Thompson and MCDonough
(29) : the fiber-specific Na+,K+-$73DVH Įsubunits GLVWULEXWLRQ DQG WKH Į-isoform as the
major catalytic isoform in rat skeletal muscle
(29). All our results are integrated with the
existing literature and are schematically represent
in Fig. 3 & in Fig. 4 for red skeletal muscle and
white skeletal muscle respectively (These figures
are adapted from Mcdonough et al., 2002 (18)).
It remains to assess the subcellular distribution of
Į-isoforms in terms of enzyme activity and
protein expression in endosomal membranes,
caveolae and t-tubules.
Skeletal muscle crude homogenates contain
very high concentrations of SR and mitochondrial
ATPases, and only a minor fraction can be
identified as specifically activated by Na+, K+,
and Mg2+ or suppressed by cardiac glycosides. It
is difficult, therefore, to obtain accurate values
for the total content of Na+-K+-ATPase activity as
well as the Na+-K+-ATPase protein distribution
(6,18). Moreover, Zhang et al. (30) recently
VKRZHGDGLIIHUHQWLDOSKRVSKRU\ODWLRQRIWKHĮsubunit in the RG. Using an elegant experimental
design, and two well characterized specific
antibodies for the Na+,K+-$73DVH Į-subunit
0F.DQGĮ)WKHVHDXWKRUVGHPRQVWUDWHGWKDW
in RG skeletal muscle, only a small number of
the fibers were stained and that the type IIA, IID
and IIB were minimally stained due to a
phosphorylation on the Ser 18. This amino acid is
VSHFLILF IRU WKH Į RQ WKH UDW DQG FDQ EH
phosphorylated (5,8). The phosphatase activity
during the cryosection and immunostaining could
have dephosphorylated the phosphorylation sites
in the Na+,K+-ATPase and render more
homogeneous (in the way of irrespective of the
phosphorylation status) the RG and WG crude
membrane preparations for western blot and
enzyme. Since we used a phosphatase in our
assay, this heterogenous phosphorylation could
be less present.
Since the challenge is to access Na+,K+ATPase in skeletal muscles, our enzymological
procedure coupled to our membrane fractionation
appears a good compromise. To understand better
the distribution of Na+,K+-ATPase coupled to
enzyme activity in the high and low-oxidative
1524
Figure 3. Schematic representation of the Na+,K+-ATPase in red skeletal muscle. IC : Intracellular, EC : Extracellular,
ST : Signal Transduction, ER : Endoplasmic Reticulum, SR : Sarcoplasmic Reticulum. Adapted from Mcdonough et al., 2002
(18).
Figure 4. Schematic representation of the Na+,K+-ATPase in white skeletal muscle. IC : Intracellular, EC : Extracellular,
ST : Signal Transduction, ER : Endoplasmic Reticulum, SR : Sarcoplasmic Reticulum. Adapted from Mcdonough et al., 2002
(18).
1525
muscles (4,16), it will be interesting to study it
during physiological and pathophysiologicals
conditions such as exercise, muscle fatigue (with
a pronounced loss of K+ from contracting
muscles (22), age (23), lipidic modulation by
cholesterol, oxidized LDL and fatty acids
especially the polyunsaturated fatty acids like the
omega-3 (3,17,25)), as well as obesity, diabetes,
cardiac hypertrophy, heart failure, peripherical
nerve dysfunctions (10,14,27,28 ).
The role of the Na+,K+-$73DVHȕVXEXQLWDV
well as the Phospholemman (FXYD1) protein
DVVRFLDWHG ZLWK LWV Įȕ KHWHURGLPHUV ZLWKLQ WKLV
membrane preparation remains to be elucidated
DOWKRXJK Įȕ KHWHURGLPHUV LV WKH SUHGRPLQDQW
heterodimer
in
fast
glycolytic
muscle
(9,11,12,29,30). The extrapolation of the rat to
human (7,22) and the control of the
dephosphorylation status of Na+,K+-ATPase as
previously shown by Zhang et al. (30) in plasma
membranes should be addressed.
The main finding of the present study is that
membrane enzyme activity using the phosphatase
activity of the Na+,K+-ATPase from crude RG
DQG :* PHPEUDQH SUHSDUDWLRQV UHIOHFWV WKH Į
DQG Į 1D+,K+-ATPase isoform distribution in
RG and WG rat skeletal muscles and confirms
the fiber-specific Na+,K+-$73DVH FDWDO\WLF ĮVXEXQLWV DQG Į-isoform as the major catalytic
isoform in rat skeletal muscle. This procedure
could be extended to other characterizations of
the Na+,K+-ATPase in skeletal muscles.
Acknowledgements - This work was supported, in part, by
a grant from the PHRC. We also like to thank S. Sennoune
(Texas tech University, Lubbock, USA) for their kindly help
in revising the manuscript and Torben Clausen (Aarhus
University) for helpful discussions.
REFERENCES
1. Armstrong. R.B., and Phelps. R.O., Muscle fiber type
composition of the rat hindlimb. Am. J. Anat. 1984, 171:
259-272.
2. Barbey. O., Gerbi. A., Paganelli. F., Robert. K., Lévy. S.
and Maixen.t J.M. Canine cardiac digitalis receptors are
preserved in congestive heart failure induced by rapid
ventricular pacing. J. Recept. Signal Transduct. Res. 1997,
17: 447-458.
3. Barbey. O., Gerbi. A., Robert. K., Mayol. V., Pierre. S.,
Paganelli. F. and Maixent. J.M. Immunological
identification of Na+,K+-ATPase isoforms in nonfailing and
failing myocardium. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997, 834: 656657.
4. Berrebi-Bertrand. I. and Maixent. J.M. Immunodetection
and enzymatic characterization of the alpha 3-isoform of
Na+,K+-ATPase in dog heart. FEBS Lett. 1994, 348: 55-60.
5. Blanco. G. and Mercer. R.W. Isozymes of the Na+,K+ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function.
Am. J. Physiol. 1998, 275: F633-50.
6. Clausen. T. Na+,K+-ATPase regulation and skeletal
muscle contractility. Physiol. Rev. 2003, 83: 1269-1324.
7. Clausen. T. Hormonal and pharmacological modification
of plasma potassium homeostasis. Fundam Clin Pharmacol
2010, 24: 595-605.
8. Feschenko. M.S. and Sweadner. K.J. Phosphorylation of
Na+,K+-ATPase by protein kinase c at ser18 occurs in intact
cells but does not result in direct inhibition of ATP
hydrolysis. J. Biol. Chem. 1997, 272: 17726-17733.
9. Fowles. J.R., Green. H.J. and Ouyang. J. Na+,K+-ATPase
in rat skeletal muscle: content, isoform, and activity
characteristics. J. Appl. Physiol. 2004, 96: 316-326.
10. Galuska. D., Kotova. O., Barrès. R., Chibalina. D.,
Benziane. B. and Chibalin. A.V. Altered expression and
insulin-induced trafficking of Na+,K+-ATPase in rat
skeletal muscle: effects of high-fat diet and exercise. Am. J.
Physiol. Endocrinol. Metab. 2009, 297: E38-49.
11. Hundal. H.S., Marette. A., Ramlal. T., Liu. Z. and Klip.
A. Expression of beta subunit isoforms of the Na+,K+ATPase is muscle type-specific. FEBS Lett. 1993, 328: 253258.
12. Kristensen. M. and Juel. C. Na+,K+-ATPase Na+
affinity in rat skeletal muscle fiber types. J. Membr. Biol.
2010, 234: 35-45.
13. Lowry. O.H., Rosebrough. N.J., Farr. A.L. and Randall.
R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J.
Biol. Chem. 1951, 193: 265-275.
14. Lelievre. L.G., Maixent. J.M., Lorente. P., Mouas. C.,
Charlemagne. D. and Swynghedauw. B. Prolonged
responsiveness to ouabain in hypertrophied rat heart:
physiological and biochemical evidence. Am. J. Physiol.
1986, 250: H923-31.
15. Maixent. J.M., Gerbi. A., Berrebi-Bertrand. I., Correa.
P.E., Genain. G. and Baggioni. A. Cordil reversibly inhibits
the Na+,K+-ATPase from outside of the cell membrane. role
of K+-dependent dephosphorylation. J. Recept. Res. 1993,
13: 1083-1092.
16. Maixent. J.M. and Berrebi-Bertrand. I. Turnover rates of
the canine cardiac Na+,K+-ATPase. FEBS Lett. 1993, 330:
297-301.
17. Mayol. V., Duran. M.J., Gerbi. A., Dignat-George. F.,
Lévy. S., Sampol. J. and Maixen. J.M. Cholesterol and
omega-3 fatty acids inhibit Na+,K+-ATPase activity in
human endothelial cells. Atherosclerosis 1999, 142: 327333.
18. McDonough. A.A., Thompson. C.B. and Youn. J.H.
Skeletal muscle regulates extracellular potassium. Am. J.
Physiol. Renal Physiol. 2002, 282: F967-74.
19. McDonough. A.A. and Youn. J.H. Role of muscle in
regulating extracellular [K+]. Semin. Nephrol. 2005, 25:
335-342.
20. Murphy. K.T., Macdonald. W.A., McKenna. M.J. and
Clausen. T. Ionic mechanisms of excitation-induced
regulation of Na+,K+-ATPase mRNA expression in isolated
rat edl muscle. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.
2006, 290: R1397-406.
21. Murphy. K.T., Nielsen. O.B. and Clausen. T. Analysis of
exercise-induced Na+,K+exchange in rat skeletal muscle in
vivo. Exp. Physiol. 2008, 93: 1249-1262.
22. Murphy. K.T., Petersen. A.C., Goodman. C., Gong. X.,
Leppik. J.A., Garnham. A.P., Cameron-Smith. D., Snow.
R.J. and McKenna. M.J. Prolonged submaximal exercise
induces isoform-specific Na+,K+-ATPase mRNA and
1526
protein responses in human skeletal muscle. Am. J. Physiol.
Regul. Integr. Comp. Physiol. 2006, 290: R414-24.
23. Ng. Y., Nagarajan. M., Jew. K.N., Mace. L.C. and
Moore. R.L. Exercise training differentially modifies ageassociated alteration in expression of Na+,K+-ATPase
subunit isoforms in rat skeletal muscles. Am. J. Physiol.
Regul. Integr. Comp. Physiol. 2003, 285: R733-40.
24. Pette. D. and Staron. R.S. Mammalian skeletal muscle
fiber type transitions. Int. Rev. Cytol. 1997, 170: 143-223.
25. Pierre. S.V., Lesnik. P., Moreau. M., Bonello. L., DroyLefaix. M., Sennoune. S., Duran. M., Pressley. T.A.,
Sampol. J., Chapman. J. and Maixent. J.M. The standardized
ginkgo biloba extract egb-761 protects vascular endothelium
exposed to oxidized low density lipoproteins. Cell. Mol.
Biol. (Noisy-le-grand) 2008, 54 Suppl: OL1032-42.
26. Pressley. T.A. Phylogenetic conservation of isoformspecific regions within alpha-subunit of Na(+)-K(+)-atpase.
Am. J. Physiol. 1992, 262: C743-51.
27. Rigoard. P., Chaillou. M., Fares. M., Sottejeau. Y., Giot.
J., Honfo-Ga. C., Rohan. J., Lapierre. F. and Maixent. J.M.
[energetic applications: Na+,K+-ATPase and neuromuscular
transmission]. Neurochirurgie 2009, 55 Suppl 1: S92-103.
28. Rigoard. P., Tartarin. F., Buffenoir. K., Chaillou. M.,
Fares. M., D'Houtaud. S., Wager. M., Giot. J.P., Quellard.
N., Fernandez. B., Lapierre. F. and Maixent. J.M. The
Na+,K+-ATPase alpha3-isoform specifically localizes in the
schmidt-lanterman incisures of human nerve. Cell. Mol.
Biol. (Noisy-le-grand). 2007, 53 Suppl: OL1003-9.
29. Thompson. C.B. and McDonough. A.A. Skeletal muscle
Na+,K+-ATPase alpha and beta subunit protein levels
respond to hypokalemic challenge with isoform and muscle
type specificity. J. Biol. Chem. 1996, 271: 32653-32658.
30. Zhang. L. and Ng. Y. Fiber specific differential
phosphorylation of the alpha1-subunit of the Na(+),K (+)atpase in rat skeletal muscle: the effect of aging. Mol. Cell.
Biochem. 2007, 303: 231-237.
1527
Résumé
According to WHO, cardiovascular diseases are the first cause of mortality around the world.
They define all causes affecting the heart and blood vessels. The most famous pathology is the
myocardium infarction. During an infarct, a part of the blood supply for the heart are stopped. When
ischemia are prolonged, myocardium cell deprived blood and oxygen die and release enzymes which
destroy the surrounding tissue. Current medical strategy is a quick reperfusion in order to decrease
mortality and complication as heart failure. To improve this strategy and permit to develop new
therapies, preclinical research studies ischemia/reperfusion injury and its protection based on the
conditioning phenomenon (pharmacological or mechanical).
Na+, K+-ATPase, by its ion exchange function, maintain the homeostasis gradient of potassium
and sodium needed for mammalian cell survival and, by its signaling function, regulate some cellular
funtions (apoptosis, cell differentiation, cell proliferation, cell hypertrophy). This signaling fonction
has been shown to be implicated by ouabain preconditioning to the protection of cardiac functions and
cell death due to ischemie/reperfusion injury. However Na+, K+-ATPase itself are damaged by cardiac
ischemia/reperfusion injury. During the reperfusion, Na+, K+-ATPase activities are decreased and
accelerated the cell death mechanism. However, mechanisms which lead to Na+, K+-ATPase failure
are still unknown.
A part of the study presented here characterised the Na+, K+-ATPase alteration during the first
thirty minutes of reperfusion after ischemia on cellular model. To validate the ischemic cellular model
by Substrate and Coverslip hypoxia used, we confirmed the effects of ouabain preconditioning
reported in isolated rat heart. This protection during ischemia/reperfusion avoid endocytosis of Į1 Na+,
K+-ATPase during reperfusion and the decrease of Na+, K+-ATPase activity. All these results shown
all the importance of Na+, K+-ATPase Na+, K+-ATPase. Its protection and its upholding at the
membrane surface are essential for cell survival.
Another part of the study is interested on the Na+, K+-ATPase Į isoform differences in
signaling function and Protein Kinase C regulation. Some differences in signaling function occurs
between the isoform, mainly when we compare Į1 isoform which have a signaling function and Į2
which have not. In addition to these differences, these two isoforms demonstrate some differences
during the regulation by PKC, which come from the presence (Į1) or not (Į2) of the dileucine motif
[DE]XXXL[LI] in the Isoform Specific Region. During the demonstration of these differences, the
creation of Į1-L499V mutant shown specific characteristic whose a higher Na+, K+-ATPase cell
surface presence. Modulation of Na+, K+-ATPase cell surface has demonstrated protection of cell
death induced by ischemia/reperfusion in kidney and cardiac cells.
Last part of the study are the toxicological study of combination of Omégacoeur® and
Dolupérine® in human cells and the setup of clinical trial protocol. Results demonstrate harmlessness
in human cells at therapeutic doses. For confidentiality reason due to pattern preparation, only first
results of the study are presented. However the hidden results were interesting enough to continue on
clinical trial protocol in order to obtain a health allegation in cardiovascular for the combination of
Omégacoeur® and Dolupérine®.
Keywords : Na+, K+-ATPase, cardiac ischemia/reperfusion, ouabain preconditioning, cell surface
modulation, Na+, K+-ATPase signaling, Na+, K+-ATPase alpha isoform diversity, nutritional
complements;, omega 3, curcumin
Yoann Sottejeau
244
Résumé
Selon l'OMS, les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le
monde. Elles définissent l'ensemble des troubles affectant le cœur et les vaisseaux sanguins dont la
pathologie la plus connue est l'infarctus du myocarde. Lors d'un infarctus du myocarde, l'irrigation
d'une partie du cœur ne se fait plus. Lors de cette ischémie prolongée, les cellules du myocarde privées
de sang et d'oxygène meurent, libérant leurs enzymes qui détruisent le tissu environnant. La stratégie
médicale employée est la reperfusion rapide de l'artère afin de diminuer la mortalité et les risques de
complications telle que l'insuffisance cardiaque. Afin d'améliorer cette stratégie et permettre des
avancées par de nouvelles thérapies, la recherche préclinique étudie l'ischémie/reperfusion ainsi que la
protection cardiovasculaire basée sur le phénomène de "conditioning" qu'il soit mécanique ou
pharmacologique.
La Na+, K+-ATPase permet le maintien des gradients sodique et potassique indispensables à la
survie de toute cellule animale de par sa fonction d'échangeur d'ions et régule plusieurs fonctions
cellulaires (l'apoptose/ la différenciation cellulaire la prolifération / l'hypertrophie cellulaire) de par sa
fonction de transduction du signal. Cette fonction de signalisation a démontré une implication dans la
protection des fonctions cardiaques et la mort cellulaire due à l'ischémie/reperfusion par Ouabaïne
préconditioning. Or la Na+, K+-ATPase subit les dommages occasionnés de l'ischémie/reperfusion
cardiaque. Lors de la reperfusion, l'activité de la Na+, K+-ATPase est diminuée ce qui accélère le
processus de mort cellulaire. Les processus amenant à la défaillance de la Na+, K+-ATPase sont encore
inconnus.
Une partie des travaux présentés est consacrée à la caractérisation de la Na+, K+-ATPase lors
des trente premières minutes de la reperfusion après ischémie sur un modèle cellulaire. Afin de valider
le modèle cellulaire d'ischémie/reperfusion par "Substrate and Coverslip hypoxia" utilisé, nous avons
confirmé les effets protecteurs de l'Ouabaïne préconditioning reportés dans le cœur isolé perfusé. La
protection de l'Ouabaïne préconditioning sur la Na+, K+-ATPase pendant l'ischémie/reperfusion
démontre une protection sur l'endocytose de la Na+, K+-ATPase Į1 ayant lieu pendant la reperfusion
ainsi que sur la diminution de l'activité de la Na+, K+-ATPase totale. Les résultats obtenus démontrent
toute l'importance de la Na+, K+-ATPase dans l'ischémie/reperfusion, sa protection et son maintien à la
surface membranaire sont essentiels pour la survie de la cellule.
Une autre partie des travaux s'est intéressée à la différence entre les isoformes Į de la Na+, K+ATPase dans leur fonction de signalisation ainsi que de leur régulation par les Protéines Kinase C. Il a
été notamment mis en évidence des différences de signalisation entre les isoformes surtout lorsqu'on
compare l'isoforme Į1qui signale à Į2 qui ne signalerait pas. Outre ces différences de signalisation,
ces deux isoformes démontrent des différences de régulation par les PKC. Cette diversité provient de
la différence des séquences d'acides aminés dans l'"Isoform Specific Region" et la présence (Į1) ou
l'absence (Į2) du motif dileucine [DE]XXXL[LI]. Lors de la mise en évidence de cette différence, la
création d'un mutant Į1-L499V a démontré des caractéristiques spécifiques dont une plus grande
présence à la membrane cellulaire de la Na+, K+-ATPase. Cette modulation de la surface membranaire
de la Na+, K+-ATPase a montré qu'elle protège de la mort cellulaire induite par l'ischémie/reperfusion
rénale et cardiaque.
Une dernière partie est consacrée à l'étude toxicologique de l'association des composés
Omégacoeur® et Dolupérine® sur des cellules humaines et la mise en place d'un protocole d'essai
clinique. Les résultats obtenus évoquent une innocuité dans les cellules humaines de cette association à
des doses thérapeutiques. Pour des raisons de confidentialité due à la mise en place d'un brevet, seul
les premiers résultats de l'étude ont pu être présentés. Cependant les résultats non présentés étant
concluant, un protocole d'essai clinique est en cours de réalisation afin de permettre l'obtention d'une
allégation santé cardiovasculaire à cette association Omégacoeur® et Dolupérine®.
Mots clés : Na+, K+-ATPase, ischémie/reperfusion cardiaque, ouabaïne préconditioning, modulation
de la membrane plasmique, signalisation de la Na+, K+-ATPase, diversité des isoformes alpha de la
Na+, K+-ATPase, compléments alimentaires, oméga 3, curcumine
Yoann Sottejeau
245
Lors d'un infarctus du myocarde, la stratégie employée est la reperfusion afin de diminuer la
mortalité et les complications. Son amélioration s'effectue par l'étude l'ischémie/reperfusion et de la
protection cardiovasculaire par "conditioning".
La Na+, K+-ATPase maintient le gradient ionique par sa fonction d'échangeur d'ions et régule
des fonctions cellulaires de par sa fonction de transduction du signal. L'ouabaïne préconditioning
implique cette fonction de signalisation dans la protection cardiaque. Or la Na+, K+-ATPase subit les
dommages lors de l'ischémie/reperfusion cardiaque et les processus amenant à cette défaillance sont
encore inconnus.
Une partie est consacrée à la validation du modèle cellulaire "Substrate and Coverslip
hypoxia" en confirmant les effets de l'ouabaïne préconditioning reportés sur cœur isolé. Cette
protection empêche l'endocytose de la Na+, K+-ATPase Į1 ainsi que la diminution de son activité
totale durant la reperfusion. Le maintien de la Na+, K+-ATPase à la membrane est essentiel pour la
survie de la cellule.
Une autre partie étudie aux différences de signalisation entre l'isoforme Į1qui signale à Į2 qui
ne signalerait pas. Ces deux isoformes démontrent des différences de régulation par les PKC
provenant de la présence du motif dileucine dans l'"Isoform Specific Region". La création d'un mutant
Į1-L499V qui module la surface membranaire de la Na+, K+-ATPase a démontré une protection de la
mort cellulaire induite par l'ischémie/reperfusion rénale et cardiaque.
Une dernière partie étudie l'innocuité de l'association des composés Omégacoeur® et
Dolupérine® sur des cellules humaines et la mise en place d'un protocole d'essai clinique.
Mots clés : Na+, K+-ATPase, ischémie/reperfusion cardiaque, ouabaïne préconditioning, modulation
de la membrane plasmique, signalisation de la Na+, K+-ATPase, diversité des isoformes alpha de la
Na+, K+-ATPase, compléments alimentaires, oméga 3, curcumine
Profile of Na+, K+-ATPase during cardiac ischemia/reprefusion
During a myocardium infarction, current medical strategy is a quick reperfusion of damage
tissues in order to decrease mortality and complication as heart failure. To improve it, preclinical
research studies ischemia/reperfusion injury and its protection based on the conditioning phenomenon.
Na+, K+-ATPase, by its ion exchange function, maintains the homeostasis gradient and, by its
signaling function, regulates some cellular functions. Ouabain preconditionung implicated this
signaling function in cardiac protection. However Na+, K+-ATPase itself are damaged by cardiac
ischemia/reperfusion injury and mechanisms which lead to this failure are still unknown.
A part of the study validated Substrate and Coverslip hypoxia model on cardiac cells by
confirmation the effects of ouabain preconditioning reported in isolated rat heart. This protection avoid
endocytosis of Į1 Na+, K+-ATPase and the decrease of Na+, K+-ATPase activity during reperfusion.
Na+, K+-ATPase protection and its upholding at the membrane surface are essential for cell survival.
Another part investigated Na+, K+-ATPase Į isoform. Differences in signaling function occurs
mainly between Į1 isoform which have a signaling function and Į2 which have not. These two
isoforms demonstrate some differences during the regulation by PKC, due to the dileucine motif in the
Isoform Specific Region. Creation of Į1-L499V mutant which modulate Na+, K+-ATPase cell surface,
has demonstrated protection of cell death induced by ischemia/reperfusion in kidney and cardiac cells.
Last part studied the toxicological study of combination of Omégacoeur® and Dolupérine® in
human cells and the setup of clinical trial protocol.
Keywords : Na+, K+-ATPase, cardiac ischemia/reperfusion, ouabain preconditioning, cell surface
modulation, Na+, K+-ATPase signaling, Na+, K+-ATPase alpha isoform diversity, nutritional
complements;, omega 3, curcumin

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