(n=19) Non manipulées

Rationnel
!   Les objectifs de la greffe
•  Réduire le délai des cytopénies
•  Assurer une hématopoïèse à long terme
•  Assurer la reconstitution immunitaire (si allogreffe)
Rationnel
!   Le compartiment des cellules souches hématopoïétiques
•  Hétérogène, selon le degré de maturité des CSH
 
 
 
cellules très immatures : SRC (self renewal cell),
capables d’assurer une hématopoïèse à long terme
cellules immatures : pré-CFC (colony-forming cell), LTC-IC (long
term culture initiating cell)
capables d’assurer une hématopoïèse à court terme
Progéniteurs : capables de réduire la durée de la neutropénie
•  Principales problématiques de la culture des cellules souches ex
vivo
 
 
Permettre l’expansion des cellules souches en évitant leur
épuisement
Permettre l’expansion massive des progéniteurs
Quel milieu de culture ?
!   Très nombreuses études selon
• 
• 
• 
• 
Le milieu de culture
Les cytokines : associations, concentrations
La présence ou non d’un support stromal
Le mode de culture (statique, bioréacteur)
Peled T. et al., Exp Hematol 2005 Ivanovic Z. et al., Transfusion 2006 Levak et al., Hematologica 2005 Möhle R. and Kanz L., Semin Hematol 2007 Mc Niece I. et al., Cytotherapy 2004 Andrade-­‐Zaldivar H. et al., Cytotechnology 2008 Douay L., J Hematother Stem Cell Res 2001 Quel milieu de culture ?
!   2 études sont citées ici •  Boiron et al., Transfusion 2006; 46:1934-­‐42 « Large-­‐scale expansion and transplantaVon of CD34 + hematopoieVc cells: in vitro and in vivo confirmaVon of neutropenia abrogaVon related to the expansion process without impairment of the long-­‐term engra]ment capacity » •  PHRC (CHU Bordeaux) « Ex-­‐vivo expanded peripheral blood stem cells compared with unmanipulated peripheral blood stem cells autologous transplantaVon for mulVple myeloma » Milieu de culture : Boiron et al., Transfusion 2006
!   Étude sur l’expansion ex vivo de cellules souches CD34+ :
diminution de la durée de la neutropénie et persistance d’une
hématopoïèse efficace à long terme
!   Schéma de l’étude
•  Mobilisation des cellules souches
 
Chimiothérapie + Filgrastim
•  Collection des cellules souches
 
 
1er bras : prélèvement non manipulé, cryopréservation du
prélèvement total (=prélèvement non manipulé)
2ème bras : expansion des CD34+
–  tri des CD34+
–  mise en culture des CD34+ 10j (milieu contenant 25 à 30.106 cellules/
sac, SCF 100ng/ml, GCSF 100 ng/ml, TPO 10 ng/ml; température
maintenue à 37°C, 5% CO2, 95% H2O)
•  Ré-injection
Milieu de culture : Boiron et al., Transfusion 2006
!   Résultats
Expansion des différentes lignées cellulaires
Milieu de culture : Boiron et al., Transfusion 2006
Comparaison taux de GB selon
expansion ex vivo ou non
GB 0.5x109 /l: 2j
GB 0.1x109 /l: 1j
8pts/27 : GB jamais <0.5
Comparaison taux de Plaquettes
selon expansion ex vivo ou non
Indépendance en transfusion plaquettaire
Médiane 10j
Aucun besoin transfusionnel chez 4 patients
Milieu de culture : Boiron et al., Transfusion 2006
!   Expansion ex vivo de cellules souches CD34+ •  DiminuVon de la durée de la neutropénie •  Persistance d’une hématopoïèse efficace à long terme Expansion CSP ex vivo vs CSP non manipulées dans autogreffe de
CSP chez les patients atteints de MM (PHRC Bordeaux)
!   Schéma de l’étude
• 
• 
• 
• 
• 
Patients de 18 à 65 ans, étude prospective avec appariement
MM symptomatique en 1ère ligne thérapeutique
Collection d’au minimum 10.106 CD34/kg
Intensification par Melphalan 200mg/m2
Protocole d’expansion et de préparation des cellules identique à
l’étude de Boiron (cf diapos précédentes)
!   Résultats (1)
•  Nombre de CD34 injectées
Nombre médian de CD34 (106 /kg) Avec expansion (n=19) Non manipulées (n=38) p 14 (5,3 – 48) 2,6 (1,2 – 32,5) < 0,0001 Expansion CSP ex vivo vs CSP non manipulées dans autogreffe de
CSP chez les patients atteints de MM (PHRC Bordeaux)
!   Prise de greffe
Avec expansion Non manipulées p <0,0001 PNN < 500/mm3 ( j) 2 (0-­‐5) 7 (3-­‐17) Délai pour PNN >500/mm3 7 (0-­‐9) 12 (11-­‐20) < 0,0001 Plaquemes <20000/mm3 ( j) 0 (0-­‐3) 2,5 (0-­‐12) < 0,0001 Délai pour Plaq >20000/mm3 0 (0-­‐13) 12 (0-­‐23) < 0,0001 Expansion CSP ex vivo vs CSP non manipulées dans autogreffe de
CSP chez les patients atteints de MM (PHRC Bordeaux)
!   Résultats (2)
•  OS (médiane Follow-up : 26 mois (3-127 mois)
Survie (mois) OS à 5 ans Avec expansion (n=19) Non manipulées (n=38) p 25 (21-­‐19) NR NS 51% (42-­‐60) 51% (43-­‐59) NS •  PFS
Avec expansion Non manipulées p PFS (mois) 18,3 (15,6-­‐21) 25 (23-­‐27) NS PFS à 5 ans 13,3% (12-­‐15) 24% (21-­‐27) NS 14,13 (5-­‐25) 15 (2-­‐75) NS Délai jusqu’à progression/
décès (mois) Expansion de cellules issues d’unités de sang placentaire
pour allogreffe de cellules de cordons chez le sujet adulte
!   But : augmenter les chances de succès de l’allogreffe de sang
de cordon chez l’adulte
!   Les différentes méthodes :
•  Co-transplantation de plusieurs unités de sang placentaire
•  Transfusion simultanée de l’unité de sang placentaire, et de
• 
• 
cellules souches haplo-identiques hautement purifiées
Allogreffe de sang placentaire intra-osseuse
Réalisation d’une expansion ex-vivo de cellules progénitrices
CD34+
Verneris et al., Blood 2005 Magro et al., Haematologica 2006 Le Blanc et al., Leukemia 2007 Frassoni et al., Lancet Oncology 2008 De Lima et al., Bone Marrow Transplant 2008 Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor
cells capable of rapid myeloid reconstitution
!   Colleen Delaney, Shelly Heimfeld, Carolyn Brashem-Stein, Howard
Voorhies, Ronald L Manger et Irwin D Bernstein
!   Nature Medicine, volume 16, numéro 2, février 2010
unité avec expansion
+ unité non manipulée
2 unités non
manipulées
Délai de sortie d’aplasie (GB >500/mm3)
Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor
cells capable of rapid myeloid reconstitution
!   Colleen Delaney, Shelly Heimfeld, Carolyn Brashem-Stein, Howard
Voorhies, Ronald L Manger et Irwin D Bernstein
!   Nature Medicine, volume 16, numéro 2, février 2010
Prise de greffe myéloïde en
fonction du temps et de l’unité de
sang placentaire prédominante
Influence de la concentration en oxygène du
milieu de culture
!   Niches hématopoïétiques
•  Faible vascularisation, et milieu hypoxique
•  Résistance à l’hypoxie du fait de leur quiescence et faible
• 
métabolisme
Hyperoxygénation délétère : création de radicaux libres toxiques,
dénaturation des cytokines
!   Concentration optimale du milieu de culture en O2 : 3%
•  Permet la préservation des cellules souches
•  Permet l’expansion massive des progéniteurs
Ingrid G. Winkler et al., Blood 2010
Conclusion
!   L’expansion des cellules souches ex vivo est source de
multiples études et d’essais thérapeutiques prospectifs
randomisés
!   Intérêt de la recherche sur l’expansion des cellules
immunocompétentes, ayant des propriétés antivirales et
anticancéreuses
!   Une collaboration internationale est essentielle pour avancer
dans ce domaine de recherche