Caractérisation des fibres longues de chanvre

Thèse
Pour l’obtention du Grade de Docteur de l’Université de Poitiers.
(Faculté des sciences fondamentales et appliquées)
(Diplôme national – arrêté du 7 août 2006)
École Doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac.
Secteur de Recherche : Biologie des organismes ;
Biotechnologies animales, végétales et microbiennes
Travaux de thèse cofinancés par la Région Poitou-Charentes et l’ADEME
Présentée par Audrey ABOT
Le 19 novembre 2010
Caractérisation des fibres longues de chanvre (Cannabis
sativa) en vue de leurs utilisations dans des matériaux composites
Travaux dirigés par Fabienne Dédaldéchamp (MCF, HDR) et Rémi Lemoine (DR)
Jury d’évaluation des travaux de thèse :
Bernard Kurek (DR) : UMR FARE, Reims, Rapporteur
Claudine Morvan (CR) : Glycomev EA 4558, Rouen, Rapporteur
Alain Boudet (Pr émerite) : UMR 5546, Toulouse, Examinateur
Fabienne Dédaldéchamp (MCF, HDR) : UMR 6305, Poitiers, Examinatrice
Simon Hawkins (Pr) : UMR USTL-INRA 1282, Lille, Examinateur
Lemoine Rémi (DR) : UMR 6305, Poitiers, Examinateur
Grégory Mouille (CR) : IJPB, UMR 1318, INRA Versailles, Examinateur
Hilaire Bewa : Ingénieur Référent ADEME, Angers, Examinateur
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Remerciements
J’adresse mes premiers remerciements à la région Poitou-Charentes et l’ADEME
pour m’accorder la confiance nécessaire en finançant ces travaux.
Je remercie Bernard Kurek et Claudine Morvan pour avoir accepté d’être rapporteurs
de ces travaux de thèse. Je remercie les examinateurs extérieurs : Simon Hawkins et Alain
Boudet pour accepter d’évaluer ces travaux. Je remercie Hilaire Bewa pour le suivi de ces
travaux pour l’ADEME depuis ces trois années de thèse.
J’adresse mes remerciements à Rémi Lemoine pour m’avoir accueilli dans son
laboratoire et m’avoir accordé sa confiance et son soutien dans la direction de mes travaux.
Un grand merci Rémi aussi pour toute la patience que vous avez su m’accorder. Je remercie
Fabienne Dédaldéchamp pour sa participation à la direction de mes travaux, son aide à la
rédaction, à la confection de poster scientifique et le partage des « clés » d’enseignement
qu’elle a su me communiquer. Je suis d’accord, face aux plus jeunes, nous sommes souvent
considérés comme « parole d’évangile » et qu’il faut être d’autant plus prudent quant à ses
propos. On ne se le répétera jamais assez ...
Je remercie Grégory Mouille et Herman Höfte pour m’avoir accueillie dans leurs
locaux. Je remercie tout particulièrement Greg pour m’avoir initiée au vaste domaine de la
FT-IR sous fond de « Rage Against the Machine ». Un grand merci à Arnaud et Aurélia qui
m’ont beaucoup aidée lors de mes déplacements à Versailles. Un grand merci et bravo à
Aurélie Urbain pour ses travaux novateurs ! (Plate-forme de Chimie du Végétal PFCV, INRA
Centre de Versailles/Grignon). Et un grand merci à Diana, Elisabeth, Kian, Michael, Serge,
Madeleine, Virginie, Samantha... et je suis certaine que j’en oublie tant la liste des versaillais
« Inraniens » sympas est longue ! Merci à Sylvie Dinant pour nos conversations histologiques et le prêt précieux du
Esau -. J’espère que tu garderas longtemps les effets « Pop Arts » de la coupe de chanvre
sur ta porte de bureau !
Je remercie David Legland, qui, en plus d’être un super formateur en analyse d’image,
fut aussi un super hôte lors de mes sessions versaillaises (dont on se souviendra ! -) !!!
Je remercie les partenaires de CompoChanvre : Fabienne Touchard, Laurence
Chocinski, Claire Bonnafous (tiens bon c’est bientôt fini !) du LMPM ; mais aussi Cédric
Devers et Frédéric Bataille de Valagro ; Gaëlle Alise, Annette Leroy et Benjamin Masseteau
(courage pour ton éco-avion). Merci à Marie et son époux, de Lin et L’autre, pour la
découverte passionnante de ce métier ancestral de tisserand.
Je remercie tout particulièrement Florence Thibault, qui, bien plus qu’une aide
technique, apporte de nombreuses solutions de « bon sens » pour remédier aux difficultés
rencontrées (Merci aussi pour le PQ : sans toi, je serai au bout du rouleau). Je remercie Magalie
Lallemand (Mag’Hyver ^^) pour son soutien dans les soucis de loupe, pour son enthousiasme à
se former avec moi aux techniques d’analyse d’image et pour sa rigueur « hygiénique et
sécuritaire » non dénuée de sympathie.
Je remercie Pierrette Fleurat-Lessard pour m’avoir communiqué une partie de son
grand savoir en cytologie. C’est une chance de pouvoir travailler avec elle et ses
collaborateurs de Limoges. Merci de m’avoir notamment permis de rencontrer Raphaël avec
qui je partage des échanges fructueux sur les méandres des parois végétales et leurs
valorisations potentielles.
Je remercie Anne Cantereau pour l’aide technique apportée sur les acquisitions en
microscopie confocale ainsi que son aide pour des pistes de réflexion bien utiles en analyses
d’image (Laboratoire Institut de Physiologie et de Biologie Cellulaire, Poitiers).
Je remercie M. Bonnemain pour son aide bibliographique et son aide dans la
caractérisation histologique de la tige de chanvre. Merci aussi pour l’aide précieuse accordée
à la relecture de l’introduction bibliographique de ce manuscrit.
Je remercie Olivier Béhérec de la Fédération Nationale des Producteurs de Chanvre
(FNPC) pour toute l’aide apportée concernant les pistes à approfondir, celles à éviter... et
pour m’avoir intégrée dans la filière chanvre en me conviant aux journées portes ouvertes.
Nos échanges sont toujours très enrichissants.
Je remercie Ecochanvre 86 et tout particulièrement François Michaud pour son aide
admirable à la mise en place des tests en champs et son soutien technique pour le suivi
(merci pour les fourches !).
Je remercie les « récolteurs » : Julien, Manu et Oswaldo sans qui je serais encore à
ramasser les tiges... Je remercie aussi les « fagotteurs » : Cyril, Manu, Jacky, Jenny,
Fabienne, Florence... et j’en oublie ! Sans qui, de la même façon, j’y serais encore à
rassembler les tiges « de manière orientée » dans cette masse de paille...
Je tiens à remercier tout particulièrement Jenny, pour son soutien moral au cours de
ces trois ans de thèse et sa solution « miracle » pour calmer mon exéma ! Sans nul doute, tu
as tout d’une mère ! Je remercie les stagiaires pour leur aide technique et pour l’apprentissage du
« management » qu’ils m’ont poussés à réaliser.
Je remercie tout particulièrement les doctorants du laboratoire, qui ont su agrémenter mon
quotidien de leur sympathie : Doc Pineau (désormais « Jeanne-massien » en mode
Safaroux) ; une exception pour le feu Post-doc Willy (dit L’ourson) merci à toi et à très vite à
Paris ; Fils (Cyril garde confiance, Jean-Philippe saura élever un peu ta conscience... ça
aura été un plaisir, en plus des bonnes tranches de rigolades, de vivre en collocation de
bureau avec toi - Honnêtement, J. R ^^) ; Virginie (merci, merci, merci pour les stat’s et dans la
vie : tu me manques la Ninie !) ; Yves (From the States, qui ne fait pas que des « arc en
ciel » sur les murs ^^), DaB et Anna (Gardez courage ! on aura su en traverser des choses
ensemble ! Merci Dab pour nos fidèles déjeuner et nos récits de la télé ^^) ; enfin, Dany et
Pauline : la relève incontestée et incontestable des doctorants au PhyMoTS.
Je remercie les doctorants de France et de Navarre qui sont passés par chez nous :
Alexandre, Amélie, Hannan et ses collègues Oranaises, Pauline, Olivia, etc...
Je remercie les voisins et voisines : Sandrine et Marie-Anne, nos instants Sushis resteront
mémorables, sans compter les autres ! Et ceux à venir... Je remercie les partenaires de Valagro : Particulièrement Oz et Alex et toute leur
« team » de gens débrouillards sans qui j’aurais eu les mains broyées et je ne saurais
toujours pas utiliser une clé à pipe... Merci Damien pour tes réactions exothermiques qui ont
su dévier l’attention de mes bourdes à répétition...
Je remercie tous les autres collègues qui ont su me soutenir : Thierry F. pour nos
côtés « balances stressées » partagés ; Nathalie, pour tous les bons conseils et l’écoute
prodiguée pendant ces trois années ; Pierre, pour nos partages de jeux de mots grivois
toujours dans la bonne humeur (Pense à t’hydrater avec de l’eau -) ; Les levuristes du 3ème :
Matthieu et Thierry B. avec lesquels la cohabitation de l’étage fut toujours agréable ; Les
« petites mains » de passage Virginie et Titi, pour leur jovialité ; Rossi, pour l’attention que tu
as su me porter concernant notamment ma « frêle petite santé » et nos échanges autour du
« culturel et sa pluridisciplinarité » ; Geneviève et Sylvie pour les « papiers » et les
« papiers » (et encore les « papiers »... procéduriers à souhaits)... et l’agrafeuse récalcitrante, et les
reliures enquiquinantes... Andrée, merci pour tes traductions de l’occitan (bon je n’ai pas réussi à
placer le coup de « la castration des bœufs avec les cordes en chanvre » <<< quoique ^^) ;
Mireille, pour les
livres qu’elle m’a prêtés et pour sa gentillesse couronnée de sourires appropriés ; Cécile, la
sportive, pour son courage et son dynamisme indispensable au laboratoire ; Lucie, alias
MiiiP-MiiiP, pour sa bonne humeur et ses bons goûters ; Maryse, pour les côtés révoltés que
je partage plutôt, pas qu’à moitié ; Sylvain, pour son dynamisme bien approprié ; Laurence,
pour son cynisme à toute épreuve et ses côtés « grande blasée » (ça me manquera « les bébés
congelés »)
; Benoît, le cafetier en chef sans qui ces instants partagés seraient fades car sans
café ; Bruno, Didier, « Touche-touche » (Jim Mitchell : Un petit Riff ?) et Jacky pour votre aide sur
la manutention des chanvres. Encore à tous : Un grand merci de m’avoir accompagnée et
pour avoir réussi à me supporter ! Je remercie l’école doctorale Gay Lussac, qui a su m’encadrer et m’ouvrir de belles
opportunités. Notamment pour la rencontre de Laurent et Laurence et la découverte des
ateliers de l’Ecole de l’ADN, j’ai énormément apprécié travailler avec vous. Mais aussi, pour
la rencontre avec François Baty-Sorel : mon « coach » de vie qui a su m’apprendre le DESC,
et optimiser mes chances de m’insérer dans la vie active avec tous les outils qu’il sait
déployer pour valoriser les compétences bien « nichées ».
Je remercie Fabienne Guillon, Marie-françoise Devaux, Paul Robert et les autres
(INRA de Nantes) pour la formation complète que vous avez su m’apporter lors de mon
master 2. Je remercie Philippe Simier pour ses conseils avisés lors du « gros » de ma
formation avant Poitiers.
Je remercie mes parents pour leur empathie dans les moments difficiles. J’ai une
chance de vous avoir ! Tu vois Papa, ta « Cékotine – Mère Thérésa » aura su faire sa
« Confucius » ^^… Je remercie l’ensemble de ma famille qui ne m’a pas beaucoup vu ces
dernières années…Je remercie tout particulièrement mes sœurs : Cynthia, qui m’a rendue
Tat’audrey en 2007 (Je suis fière de la ‘tite Ambre !), et Anne-sophie qui va me rendre
Tat’audrey bis fin 2010 - de quoi assurer l’entretient de Farfadet ! Merci aussi à mes beauf’s
pour les supporter ! Je remercie la SmalAbot pour ses encouragements depuis tant d’année pour mes
projets toujours barrés... J’accompagnerai volontiers Louise et Gaspard dans leurs différents
trajets, comme les aïeux ont su me le montrer... Vous savez où me trouver, je reste bien
« canichée »-.
Je remercie la patience de ma famille néerlandaise qui va pouvoir bientôt à nouveau
m’accueillir sur les terres bataves. Veel Bedankt voor Alles. Fre en Ju, ik zull snell naar
Utrecht kome !
Durant ces trois années de thèse, en plus de notre chère Ambre, je tiens à souligner
les naissances des petits que j’espère (enfin) bientôt rencontrer : Lou, Lison, Zélie, Blanche,
Clovis, Mado, Sacha, Maewenn... Des kilos de bébés ! Pendant que... moi... à Poitiers...
Un kilo, en trois ans, j’ai rédigé...
J’ai eu toutefois eu la chance d’accueillir et de rencontrer Pauline, née en 2010, et je
félicite ces heureux parents non « chaintrier » ^^. Merci à Mathilde et à Keb’ pour leur
soutien pendant ces trois années. On va bientôt pouvoir se remettre au karaoké et au
loto qu’on va gagner ! Bien évidemment je remercie ceux qui ont su me subir au quotidien, dans les aléas,
où je me traîne pas toujours bien : Matthieu (Merci pour nos bavardages « reboostants »,
pour tes décrochages étonnants ^^, « je te laisse y réfléchir »...), Frank (Merci d’arriver à
me faire rentrer dans mon appartement - et pour les instants « sashimi » et autres
moments anti-souci), Adeline (même si nous ne nous sommes pas vu souvent ces
derniers temps, je ne pourrais oublier ma SulkAde qui me donne tant de temps), Emilie (je
file à La Réunion te rejoindre dès que possible !), Stéphanie (toi qui bat tous les records
de longueur d’études ! Bravo à toi et merci d’être là), Ghislaine (pour nos pause MacDo
bien méritées !), Emilie (Pour les « codes » d’agneau)... Et en vrac : Les lillois, les nantais,
les toulousains, les parisiens... à vous tous je dis à bien vite - je vous l’avais bien dit que
je reviendrai !
Enfin, je remercie mes 177 amis facebook !!! -
„”±˜‹ƒ–‹‘•
Ac : Anticorps
ADEME : Agence de la Défense de l’Environnement et de la Maîtrise de l’énergie
ADF : Acide Detergent Fiber
ADL : Acid Detergent Lignin
ADS : Acid Detergent Solution
AFT : AgroFibre Technologie
AGP : arabinogalactanes protéines
ANOVA : Analyse de variance
ATR : Attenuated Total Reflectance
CCSCP : Coopérative Centrale des Producteurs de Semences de Chanvre
CEAPC : Comité Economique Agricole de la Production de Chanvre
CELC : Confédération Européenne du Lin et du Chanvre
CNRS : Centre National de la Recherche Scientifique
CSTB : Centre Scientifique et Technique du Bâtiment
DM : degré de méthylation
EIHA : Association Européenne du Chanvre Industriel
ENSMA : Ecole Nationale Supérieure de Mécanique et d’Aéronautique
ETR : Ecart-type Résiduel
FNPC : Fédération Nationale des Producteurs de Chanvre
FT-IR : Infra-Rouge à Transformée de Fourrier
G : Gaiacyl
GalA : Acide Galacturonique
GRP : protéines riches en glycines
H : alcool coumarylique
H2O2 : eau oxygénée
ha : hectare
HG : homogalacturonanes
HRGP : hydroxyprolines
INRA : Institut National de la Recherche Agronomique
ITC : Institut Technique du Chanvre
LCDA : La Chanvrière de l’Aube
LMPM : Laboratoire de Mécanique et de Physique des Matériaux
MCBL : Microscopie Confocale à Balayage Laser
MET : Microscopie électronique à transmission
NaOH : soude
NDF Neutral Detergent Fiber,
NDS Neutral Detergent Solution
-1
NO : Nombre d’onde (cm )
OsO4 : acide osmique
PFA : para formaldéhyde
PhyMoTS : Laboratoire de Physiologie du Transport des Sucres chez les végétaux
PME : Pectine Méthyle Estérase
PRP : protéines riches en proline
RGI : rhamnogalacturonanes de type I
RGII : rhamnogalacturonanes de type II
Rha : Rhamnose
S : Syringyl
THC : TetraHydroCannabinol
tMS : tonne de matière sèche
U : Unité d’azote
UMR FARE : Unité Mixte de Recherche en Fractionnement des Agroressources et Environnement
UTC : Union des Transformateurs de Chanvre
WAK : Wall Associated Kinase
Sommaire
Avant propos..................................................................................................... 1
Objectifs du programme CompoChanvre .......................................................... 4
–—†‡„‹„Ž‹‘‰”ƒ’Š‹“—‡ ......................................................................................... 7
1.
Culture du chanvre en France : état des lieux......................................... 7
1.1.
Systématique du chanvre ........................................................................... 7
1.2.
Historique de l’utilisation du chanvre .......................................................... 8
1.3.
Culture du chanvre ....................................................................................12
1.4.
Valorisation actuelle du chanvre ................................................................14
1.4.1. Valorisation de la graine .......................................................................15
1.4.2. Valorisation de la tige ...........................................................................16
2.
Morphologie générale du chanvre..........................................................19
2.1.
La tige .......................................................................................................19
2.2.
La racine ...................................................................................................19
2.3.
Les feuilles ................................................................................................19
2.4.
Les fleurs...................................................................................................20
3.
Morphogénèse et développement des fibres longues ............................20
3.1.
Les différents tissus caulinaires .................................................................20
3.1.1. L’écorce................................................................................................22
3.1.2. Les tissus conducteurs .........................................................................24
3.1.3. La moelle..............................................................................................24
3.2.
Formation des tissus caulinaires................................................................25
3.2.1. Les méristèmes primaires.....................................................................25
3.2.2. Les méristèmes secondaires ................................................................25
4.
Description des fibres : généralités. .......................................................26
4.1.
Origine et localisation des fibres ................................................................28
4.1.1. Fibres xylémiennes...............................................................................28
4.1.2. Fibres extraxylémiennes .......................................................................30
5.
Formation des fibres xylémiennes et phloémiennes ..............................31
5.1.
L’initiation cambiale ...................................................................................32
5.2.
La croissance coordonnée.........................................................................34
5.3.
La croissance intrusive ..............................................................................35
5.4.
La maturation des fibres et la sénescence.................................................38
6.
La paroi végétale : constituants et organisation .....................................40
6.1.
Les polysaccharides : constituants majoritaires pariétaux..........................40
6.1.1. Les pectines .........................................................................................41
6.1.2. Les hémicelluloses ...............................................................................44
6.1.3. La cellulose ..........................................................................................45
6.1.4. Les polyphénols....................................................................................46
6.2.
Les protéines structurales des parois ........................................................47
6.3.
Interactions entre les constituants .............................................................47
6.3.1. Interaction cellulose/hémicelluloses......................................................48
6.3.2. Interactions pectines/pectines et pectines/cellulose .............................48
6.3.3. Interactions polysaccharides/protéines .................................................49
6.3.4. Interactions lignines/cellulose ...............................................................50
6.3.5. Interactions lignines/hémicelluloses......................................................50
7.
Rouissage .............................................................................................51
Objectifs de la thèse.........................................................................................52
ƒ–±”‹‡Ž ............................................................................................................54
1 Matériel végétal .........................................................................................54
1.1
Les semences ...........................................................................................54
1.2
Semis en serre ..........................................................................................55
1.2.1 Application d’un stress hydrique ............................................................56
1.2.2 Test de densité de semis en serre .........................................................56
1.3
Culture en champs ....................................................................................58
1.4
Récoltes ....................................................................................................60
2 Matériel textile commercial ........................................................................61
2.1
Matériel textile pour la conception des éprouvettes de matériaux
composites
61
2.2
Matériel textile ...........................................................................................63
2.3
Matériel issu d’autres chaînes de transformation.......................................64
±–Š‘†‡• ..........................................................................................................66
1 Plan d’échantillonnage ..............................................................................66
2 Rouissage .................................................................................................67
2.1
Mise en place du rouissage .......................................................................67
2.2
Cinétique de rouissage et traitement des fibres rouies ..............................69
3 Préparation des échantillons .....................................................................69
3.1
Préparation des échantillons pour les observations en loupe à fluorescence
et microscopie confocale à balayage laser (MCBL) ..........................................................69
3.2
Préparation des échantillons pour une observation en microscopie
photonique et pour l’étude en microspectrométrie FT-IR. .................................................70
3.2.1 Le prélèvement des échantillons de fibres longues de chanvre .............70
3.3
La préparation des échantillons pour les observations en microscopie
photonique et pour la microspectrométrie FT-IR ...............................................................71
3.4
La préparation des échantillons pour les études biochimiques ..................74
4 Analyse des échantillons ...........................................................................74
4.1
Histologie et cytochimie.............................................................................74
4.1.2 Microscopies .........................................................................................74
4.2
Biochimie : techniques liées à la caractérisation des compositions des
parois par l’étude Infra-Rouge à Transformée de Fourrier (FT-IR) ....................................77
4.2.1 Principe de la méthode ..........................................................................77
4.2.2 Principe de l’appareil d’acquisition .........................................................79
4.2.3 Acquisition des spectres et format de fichier..........................................80
4.3
Biochimie : dosage des composés pariétaux par le fractionnement de la
biomasse.
83
5 Caractérisation des fibres avec les techniques d’imagerie : analyse d’image
………………………………………………………………………………..85
5.1
Principe de l’approche en analyse d’image................................................86
5.1.1 Les capteurs..........................................................................................86
5.1.2 Le traitement d’image ............................................................................86
6 Outils informatiques de traitements de données utilisés ............................89
±•—Ž–ƒ–•‡–‹•…—••‹‘ .......................................................................................91
1 Expérimentations en champ ......................................................................91
1.1
CAMPAGNE 2008 .....................................................................................92
1.1.1 Suivi de la croissance des chanvres en champs....................................92
1.1.2 Récolte et rendements...........................................................................97
1.2
CAMPAGNE 2009 ...................................................................................100
1.3
Impact de l’apport azoté sur la croissance des chanvres .........................101
1.3.1 Etude de la croissance des chanvres, mesure des entre-nœuds.........104
1.4
Campagnes en champs 2008, 2009 : discussion générale ......................109
2 Etudes morphologiques et histocytochimiques ........................................112
2.1
Coloration à l’acridine orange ..................................................................112
2.1.1 Exemple de coupe transversale de chanvre colorée à l’acridine orange...
............................................................................................................114
2.1.2 Mise au point des méthodes en analyse d’image avec Image J...........117
2.2
Répartition et mise en place des fibres longues dans la tige de chanvre .130
2.2.1 Répartition des fibres longues dans la tige de chanvre ........................130
2.2.2 Mise en place des fibres ......................................................................133
2.3
Impact des facteurs agronomiques sur les fibres longues de chanvre .....137
2.3.1 Impact d’un déficit hydrique sur les fibres longues de chanvre ...........137
2.3.2 Impact de l’azote sur les fibres longues de chanvre.............................138
2.3.3 Impact de la densité de semis sur les fibres longues de chanvre.........140
2.3.4 Impact des conditions culturales sur les fibres longues de chanvre .....141
3 Etude de l’impact du rouissage sur les fibres longues de chanvre ...........143
3.1
Observation des fibres longues de chanvre à différents temps de rouissage
................................................................................................................143
3.2
Suivi du rouissage par les méthodes biochimiques .................................145
3.2.1 Fractionnement de la biomasse sur les cinétiques de rouissage .........145
3.2.2 Suivi du rouissage par la méthode d’Attenuated Total Reflectance (ATR).
............................................................................................................147
3.2.3 Suivi du rouissage sur les fibres longues de chanvre avec la
microspectrométrie FT-IR ...........................................................................................150
.......................................................................................................................155
3.2.4 Caractérisation des tensions de surface sur les fibres longues de
chanvre rouies ............................................................................................................156
3.3
Etudes préliminaires sur la caractérisation des textiles avec l’ATR..........158
3.3.1 Caractérisation biochimique des traitements sur les tissus de chanvre158
3.3.2 Exemple de diagnostic de tissus : comparaison lin/chanvre.................161
‘…Ž—•‹‘
±±”ƒŽ‡Ȁ‡”•’‡…–‹˜‡• ....................................................................163
±ˆ±”‡…‡•„‹„Ž‹‘‰”ƒ’Š‹“—‡• .............................................................................172
Sommaire des figures et tableaux
Sommaire des figures
Figure 1. Dessin anatomique du chanvre
6
Figure 2. Le travail du chanvre au XVIIème siècle.
9
Figure 3. Fabrication de cordes en chanvre sur le pont d’un voilier
9
Figure 4. Production de chanvre en France et
principaux partenaires de la
transformation/valorisation du chanvre.
11
Figure 5. Croissance du chanvre, exemple d’un semis réalisé début mai
11
Figure 6. Galle de la tige de chanvre causé par les larves d’agrile (Grapholita delineana)
14
Figure 7. Différentes structures d’organisation de la filière chanvre et leurs interactions.
15
Figure 8. Coupe transversale d’une moitié de tige de chanvre.
16
Figure 9. Schéma résumant l’origine et la complexité cellulaire des tissus conducteurs chez
les Dicotylédones.
21
Figure 10. Formation des fibres par sclérification du collenchyme périphérique dans la racine
de Daucus carotta.
21
Figure 11. Le bois résulte de l’association de cinq types cellulaires comme cela est
représenté dans le schéma central.
23
Figure 12. Différenciation des « trachées ».
28
Figure 13. Sections transversales de différents organes végétaux.
29
Figure 14. Fibres à septa du phloème.
31
Figure 15. Différents concepts de développement des fibres.
33
Figure 16. A gauche croissance diffusive anisotrope et isotrope, à droite croissance apicale
extrusive.
35
Figure 17. Quelques caractéristiques de la croissance intrusive des fibres primaires chez le
lin.
37
Figure 18. Répartition de la cellulose et des lignines en pourcentage de matière sèche dans
la paroi de deux fibres adjacentes.
39
Figure 19. Architecture des parois de cellules fibreuses.
40
Figure 20. Modèle de la paroi primaire d’une cellule de Dicotylédone avec les réseaux
enchevêtrés des composés pariétaux.
41
Figure 21. Composés pectiques.
42
Figure 22. Immunolocalisation des épitopes homogalacturonanes pectiques en relation avec
les fibres longues de chanvre.
43
Figure 23. Les hémicelluloses.
45
Figure 24. La cellulose.
46
Figure 25. Les lignines des Dicotylédones.
47
Figure 26. Réseau cellulose / hémicelluloses des parois primaire.
48
Figure 27. Le réseau pectique contenu entre deux parois primaires et la lamelle moyenne. 49
Figure 28. Présentation des axes de recherche des travaux de thèse.
52
Figure 29. Etapes « clés » du programme CompoChanvre et les différents partenaires.
63
Figure 30. Prototype du système de rouissage.
68
Figure 31. Partie des tiges rouies.
68
Figure 32. Principe de fonctionnement d’un microscope confocal à balayage laser.
76
Figure 33. Représentation schématique d’une molécule diatomique par deux masses m1 et
m2 reliées par un ressort et la représentation graphique de l’énergie n en fonction de la
distance atomique.
78
Figure 34. Passage d’énergie d’une molécule suite à son absorption infrarouge..
78
Figure 35. Principe du fonctionnement d’un spectromètre FT-IR.
80
Figure 36. Fréquences de vibrations des principales fonctions rencontrées dans les
composés organiques.
82
Figure 37. Schéma de principe du dosage des constituants pariétaux des fibres.
85
Figure 38. Principe d’acquisition et de formation de l’image numérique.
87
Figure 39. Les différentes résolutions lors de l’acquisition des images numériques.
88
Figure 40. Exemple de binarisation d’image sur une image de grain de riz.
88
Figure 41. Plan d’expérimentation en champ.
91
Figure 42. Impact de l’apport d’azote (80, 120 et 160 U) sur la croissance des chanvres.
93
Figure 43. Impact de la densité (40, 50 et 60 kg/ha) sur la croissance des chanvres .
95
Figure 44. Impact de la pédologie sur la croissance des chanvres.
96
Figure 45. Schéma d’une faucheuse/conditionneuse.
97
Figure 46. Impact des adventices sur le champ 1 (test d’apport azoté).
99
Figure 47. Observation des chanvres semés dans le champ 2, 3 mois après le semis.
100
Figure 48. Impact de l’azote (0, 80 et 120 U) sur la croissance en taille des chanvres.
101
Figure 49. Impact de l’azote (0, 80 et 120 U) sur la taille et le nombre d’entre-nœud des
chanvres.
103
Figure 50. Impact de l’azote (0, 80 et 120 U) sur la croissance végétative des plantes.
105
Figure 51. Représentation des diamètres des entre-nœuds en fonction de leur position sur la
tige de chanvre.
107
Figure 52. Représentation des entre-nœuds 1 à 8 (longueur et diamètre), en fonction des
conditions azotées testées (0, 80 et 120 U) à 3 mois après le semis (6 juillet).
108
Figure 53. Comparaison des tailles des plantes à la récolte entre les années 2008 et 2009
110
Figure 54. Principe de la coloration à l’acridine orange et de l’attribution des longueurs
d’émissions aux principaux composés pariétaux (cellulose et lignines) des différents types
cellulaires.
114
Figure 55. Coupe transversale de chanvre (C. sativa) colorée à l’acridine orange.
116
Figure 56. Coupe longitudinale de tige de chanvre, Félina 32 cultivée dans le champ lors de
la campagne 2009.
117
Figure 57. Exemple de mesure de proportion surfacique de l’écorce (A), des fibres et du
parenchyme phloémien(B), des fibres primaires (C) et des fibres secondaires (D).
118
Figure 58. Dénombrement des fibres primaires et secondaires par l’outil dédié sous Image J.
119
Figure 59. Représentation de l’inversion des couleurs informatiques attribuées aux longueurs
d’onde d’émission (555 nm < λrouge < 625 nm et 500 nm < λvert < 530 nm) sur une coupe
transversale de chanvre.
123
Figure 60. Exemple de la première étape du traitement d’image par Image J réalisée à partir
de coupes transversales de chanvre (C. sativa) colorée à l’acridine orange et observée au
MCBL.
124
Figure 61. Exemple de la séquence de segmentation des fibres primaires de chanvre via
l’approche « masque » développée sous Image J.
125
Figure 62. Présentation de l’application de la mesure du diamètre de Féret, avec Image J,
sur des sections transversales de matériaux composites chanvre / époxy.
127
Figure 63. Résultats des coupes transversales réalisées sur la plante modèle Félina 32
cultivée en serre et observée à la loupe à fluorescence après coloration à l’acridine orange.
129
Figure 64. Coupe transversale de bas de chanvre colorée à l’acridine orange et observé à la
loupe à fluorescence.
131
Figure 65.Coupes transversales de haut de tige de chanvre observée au MCBL
134
Figure 67. Coupes transversales de tige de chanvre fraîche.
136
Figure 68. Coupe transversale de chanvre (partie apicale) inclus en résine LR White Medium
et colorée au bleu de toluidine.
136
Figure 69. Coupes transversales de bas et haut de tige de chanvre inclus en LR White
Medium.
138
Figure 70. Coupe longitudinale de tige de chanvre, Félina 32 cultivée dans le champ lors de
la campagne 2009.
142
Figure 71. Ecorces de chanvre à différent temps de rouissage.
144
Figure 72. Coupes transversales (semi-fine, 1500 nm) de fibres longues de chanvre inclues
en résine LR White Medium et colorée au bleu de Toluidine.
144
Figure 73. Représentation des fractions issues des différentes étapes du dosage des
constituants pariétaux : NDF, ADF, ADL en fonction du temps de rouissage.
146
Figure 74. Résultats du fractionnement de la biomasse lignocellulosique des fibres de
chanvre : proportions relatives des composés hydrosolubles et cellulosiques en fonction des
temps de rouissage.
147
Figure 75. Représentations graphiques des spectres FT-IR acquis en ATR à partir des
poudres de fibres rouies à 0J et à 30J.
148
Figure 76. Représentation graphique de la comparaison de la moyenne (T-Test) des
spectres acquis sur les poudres des fibres non rouies contre les poudres des fibres rouies à
10, 30 et 45 jours lors du rouissage.
149
Figure 77. Représentation du principe d’acquisition des cartes avec le microspectromètre
FT-IR.
151
Figure 78. Représentation graphique des spectres moyens obtenus en microspectrométrie
FT-IR sur les fibres longues de chanvre à différents temps de rouissage.
152
Figure 79. Résultat de l’ACP (PC1 vs PC2) réalisée avec TmeV sur les fibres primaires
extraites des cartes correspondant aux différents temps de rouissage 0, 5, 10, 30, et 45
jours et acquises au microscope couplé au spectromètre.
153
Figure 80. Représentation graphique du vecteur propre de la composante principale 1 issue
de l’ACP appliquée aux fibres extraites des cartes acquises au microspectromètre FT-IR. 153
Figure 81. Représentation des absorbances relatives des nombres d’ondes 1110 et 1060
cm-1 (respectivement B et C) attribués aux fibres longues de chanvre et des nombres
d’ondes 1153, 1184, 1720 cm-1 (respectivement D, E et F) attribués à la résine.
154
Figure 82. Représentation des absorbances relatives des nombres d’ondes 1110 et 1060
cm-1 (respectivement B et C et E et F) attribués aux fibres longues de chanvre sur des
échantillons de fibres rouies à dix jours de rouissage (A), et à 45 jours de rouissage (D). 155
Figure 83. Représentation graphique de la comparaison entre les moyennes des spectres
acquis sur le tissu de chanvre témoin (Oléron 2) contre les mêmes tissus ayant subi les
températures d’étuvage de 40°C (b), 50 °C (j), 80 ° C (k), 105°C (l) et 120 °C (m).
159
Figure 84. Représentation graphique de la comparaison entre les moyennes des spectres
acquis sur le tissu de chanvre témoin (Oléron 2) contre les mêmes tissus ayant subi des
traitements à la soude (NaOH) (c), à la soude et à l’eau oxygénée (NaOH + H2O2) (d), et
contre le tissus Roumain 1 (e).
160
Figure 85. Représentation graphique de la comparaison de la moyenne (T-Test) des
spectres acquis sur les fibres de chanvre rouies contre la moyenne des spectres acquis sur
les fibres de lin rouies.
161
Sommaire des tableaux
Tableau 1. Avantages techniques, économiques et écologiques des fibres naturelles
comparées aux fibres synthétiques ....................................................................................... 2
Tableau 2. Propriétés mécaniques de fibres d’origines diverses ........................................... 2
Tableau 3. Récapitulatif des données disponibles sur les fibres végétales principalement
utilisées ................................................................................................................................26
Tableau 4. Paramètres de croissance des fibres de lin aux stades de la croissance
coordonnée et intrusive ........................................................................................................33
Tableau 5. Récapitulatif des variétés populations de chanvre utilisées.................................55
Tableau 6. Nombre de graines par pot des tests semis densités..........................................57
Tableau 7. Matières premières employées pour la fabrication des éprouvettes. ...................62
Tableau 8. Récapitulatif des colorations utilisées sur les coupes transversales de chanvre. 76
Tableau 9. Rendement de paille totale obtenue à la récolte des chanvres. ..........................98
Tableau 10. Récapitulatif des proportions de surface de fibres calculées avec Image J. ....120
Tableau 11. Calcul des proportions de surface des fibres en fonction de la hauteur dans la
tige de chanvre Félina 32 modèle cultivée en serre............................................................132
Tableau 12. Récapitulatif des mesures des aires des fibres primaires (FI) et secondaires (FII)
sur les coupes transversales des entre-nœuds 1, 3, 5 et 8 de chanvre Félina 32...............139
Tableau 13. Récapitulatif des tensions de surface et de la polarité obtenues sur les fibres
longues de chanvre à 10 et 30 jours de rouissage confrontées aux valeurs comparables de
la littérature. .......................................................................................................................157
Tableau 14. Récapitulatif non-exhaustif des différentes études des impacts agronomiques
sur la production des fibres longues de chanvre.................................................................165
1.1.1
Avant propos
Le travail effectué durant cette thèse s’inscrit dans le cadre du programme régional
pluridisciplinaire initié en janvier 2007 « Excellence environnementale, développement des
éco-industries ». Ce programme est intitulé « Développement et optimisation de composites
à fibres longues de chanvre et à matrices thermodures utilisées dans les industries
aéronautiques et nautiques, en lien avec les paramètres microstructuraux de la plante » et
porte l’acronyme « CompoChanvre ». Il s’intègre dans le Pôle des Eco-Industries du PoitouCharentes, dans le thème « Substituer le carbone d’origine fossile par du carbone
renouvelable, agromatériaux ».
Cofinancés par l’ADEME (Agence de la Défense de l’Environnement et de la Maîtrise
de l’Energie), ces travaux se rattachent au département « Transports et Mobilité » de
l’ADEME. Les transports sont responsables de 26% des gaz à effet de serre émis (chiffres
2006, ADEME) et sont dépendants à 98% des produits pétroliers. L’action de l’ADEME, outre
la participation à l’élaboration de réglementations, encourage la recherche et le
développement pour la mise en place d’une organisation durable du système des transports
dans le respect de la réduction des émissions des gaz à effet de serre engagée par le
protocole de Kyoto (signé en 1997 et entré en vigueur en 2005).
Les matériaux composites présentent de nombreux avantages par rapport aux
matériaux traditionnels en termes de légèreté, de résistance mécanique et physique et de
liberté de formes. L’emploi croissant de ces matériaux dans de nombreux domaines
(aéronautique, automobile, bâtiment, électricité, équipements industriels,…) justifie l’intérêt
qui leur est porté par la recherche. Généralement, ces matériaux, notamment les plus
robustes, se composent d’une matrice plastique renforcée par des fibres synthétiques
tissées (verre et carbone). Dans une optique de développement durable, le remplacement
des fibres synthétiques de renfort par des fibres végétales est une première étape dans le
respect des enjeux environnementaux (Wambua et al., 2003). En effet, les fibres d’origine
naturelles sont une source renouvelable présentant une faible densité et contribuent à piéger
le carbone tout au long de la vie des matériaux. Les nombreux avantages techniques,
économiques et écologiques des fibres sont reportés dans le Tableau 1.
Dans le programme « CompoChanvre », le choix du renfort s’est porté sur des fibres
de chanvre tissées dans des matrices thermodures ou polyester pour des applications dans
les industries du transport nécessitant des composites de haute technicité (nautisme et
aéronautisme).
1
Tableau 1. Avantages techniques, économiques et écologiques des fibres naturelles comparées aux
fibres synthétiques (d’après J. Bonnaudet, 2007).
Avantages
Avantages
Avantages
économiques
techniques
écologiques
- Faibles coûts
mécaniques
-
Entièrement recyclables
renforts
-
Absence de toxicité du renfort
traditionnels
-
Abaissement du contenu en
- Absence d’abrasion
matériaux d’origine fossile
transformation
- Grande
-
- Densité faible
des pièces produites
- Réduction
- Propriétés
importante
des
temps de cycle de production
- Gains
énergétiques
à
la
identiques
- Bonnes
aux
stabilité
géométrique
propriétés
Absence de résidus après
incinération ultime en fin de vie
d’isolation
-
Neutre pour l’émission de
CO2
phonique et thermique
-
Ressource renouvelable
Tableau 2. Propriétés mécaniques de fibres d’origine diverse (d’après J. Bonnaudet, 2007).
Animale
Végétale
Synthétique
Fibres
Module
d’Young
E (en GPa)
Allongement à
rupture
A (en %)
Contrainte à
rupture
ır (en Mpa)
Densité
72 -73
3
2000 – 2400
2,54
230
1,5
3530
1,8
Verre E
(Filament indus.)
Carbone
(T300)
Aramide
(Kevlar 49)
Lin
Ramie
Chanvre
Jute
Sisal
Noix de coco
Coton
124
2,9
3620
1,44
12 – 85
61 – 128
35
26,5
9 – 21
4–6
5,5 – 12,6
1–4
1,2 – 3,8
1,6
1,5 – 1,8
15 – 40
7–8
18
600 – 2000
400 – 938
389
393 – 773
350 – 700
131 – 175
287 – 597
1,54
1,56
1,07
1,44
1,45
1,15
1,5 – 1,6
Soie
5
15
200
nd
Fil d’araignée
7
30
600
nd
2
Le programme réunit différents partenaires :
9 des laboratoires de recherche : le laboratoire de Mécanique et de Physique des
Matériaux (LMPM) de l’Ecole Nationale Supérieur des Matériaux Aéronautiques,
(ENSMA), Chasseneuil du Poitou (86), et le laboratoire de Physiologie
Moléculaire du Transport des Sucres chez les Végétaux (PhyMoTS, CNRSUniversité de Poitiers (86),
9 un centre technique : le CRITT Matériaux, Rochefort (17),
9 une association de recherche et développement : Valagro, Poitiers (86),
9 des associations avec des partenaires de la filière chanvre : des chanvriculteurs
(Ecochanvre 86) et des tisserands (Lin et L’autre, île d’Oléron (17)).
Dans le cadre de cette étude, deux thèses sont réalisées dans les deux laboratoires
de recherche mentionnés, ce qui confère une originalité pluridisciplinaire à ce programme.
L’ensemble des travaux réalisés durant ces trois années a été valorisé entre autres,
dans le cadre d’un congrès « Le chanvre dans tous ses états» organisé par les différents
partenaires de ce projet, les 18 et 19 mars 2010, à Poitiers.
3
Objectifs du programme CompoChanvre
Conforté par une dynamique régionale s’inscrivant dans la volonté de redévelopper la
culture du chanvre (Cannabis sativa), le choix des fibres longues se justifie par leurs bonnes
propriétés physiques et mécaniques comparativement aux autres fibres naturelles et
synthétiques (Tableau 1 et 2).
Des travaux précédents montrent que le point limitant pour l’emploi des fibres
végétales réside notamment dans l’interface fibre-matrice qui reste à optimiser (Wambua et
al., 2004 ; Baley et al., 2006 ; Abdel-Halim et al., 2008). En effet, les fibres végétales,
contrairement aux fibres synthétiques, présentent des surfaces hétérogènes difficiles à
intégrer aux matrices utilisées pour les matériaux composites. De plus, la composition
hydrophile des fibres végétales ne favorise pas l’adhésion aux matrices hydrophobes. Les
fibres synthétiques générées industriellement sont homogènes et peuvent être traitées
uniformément par des procédés d’ensimage pour optimiser leur adhésion à la matrice
(Tanoglu et al., 2001).
Dans une démarche d’application industrielle, il est donc nécessaire d’optimiser et
d’homogénéiser les lots de fibres longues de chanvre utilisés. La caractérisation de ces
fibres in planta par l’étude de la mise en place des fibres, sur des plantes cultivées en serre
ou en champs, ainsi que le suivi des caractéristiques physico-chimiques au cours des
différentes étapes d’élaboration du matériau (défibrage, filage, tissage et traitement des
tissus au cours de l’élaboration du matériau) s’inscrit dans cette optique.
Les fibres longues de chanvre appartiennent au tissu phloémien et sont caractérisées
par une paroi très épaisse. Les terminologies « fibres longues » et « fibres phloémiennes »
concernent les mêmes fibres et sont employées indifféremment dans ce rapport. La cellulose
est pondéralement et structurellement l’élément principal des parois des fibres. Les
constituants pariétaux non cellulosiques incluent d’autres polysaccharides (hémicelluloses et
pectines), les lignines ainsi que des protéines. Les proportions relatives de ces constituants
confèrent les caractéristiques de résistance et de plasticité aux fibres longues.
Afin de préciser notre démarche, une étude bibliographique est présentée concernant
la culture du chanvre et la mise en place des fibres phloémiennes, en insistant sur les
propriétés physico-chimiques des parois.
4
Figure 1. Dessin anatomique du chanvre
Planche réalisée par Koehler en 1897 et disponible sur http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Koeh026.jpg. Cette illustration de la dioécie du chanvre présente en A : les parties apicales mâles, en B : les
parties apicales femelles, en C : Les anthères sont représentées individuellement et en D : l’inflorescence
mâle, rassemblant les anthères en grappe. F. Les différents stades de maturité de la fleur femelle sont
représentés. Les fleurs s’organisent en grappe sur la tige. E. Les graines de chanvre sont présentées.
6
–—†‡„‹„Ž‹‘‰”ƒ’Š‹“—‡
1. Culture du chanvre en France : état des lieux
1.1. Systématique du chanvre
Le chanvre, décrit par Linné en 1753, est une plante herbacée Dicotylédone,
naturellement dioïque, à feuilles palmées (Figure 1). Une espèce dioïque présente des
plantes à sexe séparé, soit mâle, soit femelle alors qu’une plante monoïque possède les
fleurs des deux sexes sur le même pied.
Le chanvre appartient à la famille des Cannabinacées ou Cannabacées selon les
auteurs. D’après la classification de Cronquist (1981), cette famille appartient à l’ordre des
Urticales et comprend deux genres, Cannabis pour le chanvre et Humulus pour le houblon.
La classification phylogénétique Angiosperm Phylogeny Group II, basée sur la phylogénie
moléculaire des gènes de la RuBisCo (ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygénase,
enzyme clé dans la fixation carbonée)
(Bremer et al., 2003), situe la famille des
Cannabinacées, dans l’ordre des Rosales. Dans cet ordre, l’ortie (Urtica dioica ou urens) et
la ramie (Boehmeria nivea) sont aussi des plantes utilisées pour leur production de fibres
(Bouloc, 2006). L’ordre des Rosales est rassemblé avec 6 autres au sein du clade des
Rosidées I. D’autres plantes riches en fibres phloémiennes, comme le lin (Linum sativum),
sont aussi présentes dans ce groupe.
Au-delà des évolutions de classification des Cannabinacées, il est communément
admis que dans la famille des Cannabinacées, le genre Cannabis est associé à une espèce,
Cannabinus sativa, qui se subdivise en trois groupes ou sous espèces :
9
Cannabis sativa : le chanvre industriel source de fibres phloémiennes,
9
Cannabinus ruderalis : la forme sauvage,
9
Cannabinus indica : la forme psychotrope de la plante.
Cependant, Bouloc (2006) rassemble les deux groupes en Cannabinus sativa se
subdivisant en deux sous espèces, Cannabinus sativa ssp spontanea pour la forme
sauvage et Cannabinus sativa ssp culta pour les formes cultivées.
Au cours du dernier siècle, la sélection du chanvre industriel s’est concentrée sur
l’obtention
de
variétés
non
psychotropes
(C.
sativa)
présentant
un
taux
de
TetraHydroCannabinol inférieur à 0,2% (THC, molécule psychoactive) afin de respecter les
7
règles en vigueur. Les variétés sélectionnées sont des variétés ou populations monoïques
conservant un caractère rustique. Ces populations sont très polymorphes : en effet obtenues
à partir de variétés dioïques à l’origine, les variétés de chanvre industriel ont été
sélectionnées à partir des plants monoïques trouvés naturellement dans ces populations.
Pourtant, l’évolution de la différenciation sexuelle chez les plantes favorise l’apparition de la
dioécie (Khryanin, 2007) pour optimiser les brassages génétiques ce qui offre une meilleure
résistance aux changements de conditions environnementales. Dans le cas du chanvre, la
monoécie résulte d’une sélection inverse présentant une gamme de plantes monoïques avec
un ratio variable de fleurs mâles vs fleurs femelles.
L’origine des chanvres industriels entraîne la diversité de développement et de
morphologie obtenues sur les plants monoïques. En effet, le polymorphisme qui résulte de
ce mode de sélection est très fort au sein d’une variété.
1.2. Historique de l’utilisation du chanvre
Le chanvre est une des plantes les plus anciennes domestiquée par l’Homme. Des
traces datant du néolithique (8000 ans avant J-C) ont été observées en Chine sur des pots
en céramique entourés de fibres spiralées de chanvre.
Dès l’antiquité (3500 avant J-C), le chanvre est utilisé pour ses fibres solides
employées dans la fabrication de vêtements et de cordage pour la marine. Des restes de
tissus de chanvre ont été trouvés en Suisse, Autriche, Irlande, Grèce et Turquie et sont
datés de 2500 avant J-C, mais il fut difficile de discriminer la nature des toiles entre le lin et
le chanvre (Bouloc, 2006).
Le chanvre est largement employé au XVIIème siècle pour les voiles des bateaux
offrant une robustesse supérieure aux voiliers partant au grand large par rapport aux voiles
réalisées en lin des autres bateaux à usages côtiers (Figure 2). En Charentes, sont recensés
pas moins de 80 villages ou lieudits qui mentionnent les noms de chènevaux et chènevières
se rapportant à cette période passée florissante pour le chanvre. La Corderie Royale de
Rochefort, fondée en 1666 par Colbert a été opérationnelle en 1670, et a connu son apogée
pour la fabrication des cordages en chanvre au XVIIIème et XIXème siècle (Figure 3). La
fabrication de l’Hermione (frégate de 1779), sur laquelle a embarqué le marquis de Lafayette
en 1780 pour soutenir la guerre de l’indépendance des américains contre les anglais, est
aussi attribuée à la Corderie Royale de Rochefort. Les voiles et les cordages de l’Hermione
sont constitués de chanvre.
8
Le chanvre utilisé comme matière première était fin, doux, de couleur homogène et
d’odeur forte et devait provenir majoritairement de France grâce aux régions productrices
d’Anjou, de Bretagne, d’Auvergne, de Poitou-Charentes et de Berry (Bouloc, 2006). Pour
l’obtention des fibres, l’étape de rouissage des tiges de chanvre était menée en rouissoirs ce
qui incommodaient beaucoup les riverains par les odeurs pestilentielles qu’ils dégageaient.
Des interdictions préfectorales ont peu à peu entravé cette étape essentielle de
transformation provoquant la chute de l’approvisionnement national (Lavoisier, 1784). Le
chanvre provenant de Hollande ou Russie offrant une meilleure finesse et souplesse et,
présent en abondance, a supplanté peu à peu le chanvre national.
ème
Figure 2. Le travail du chanvre au XVII
siècle.
De gauche à droite, réception des ballots de chanvre, stockage du chanvre et travail des espadeurs
visant à retirer la chènevotte des ballots et des peigneurs pour affiner la filasse, travail du fileur pour
former le fil de cardet, base de la corde (d’après la Corderie royale de Rochefort).
Figure 3. Fabrication de cordes en chanvre sur le pont d’un voilier (Vindheim, 2002).
9
A la fin du XIXème siècle, l’avènement du coton (Gossypium herbaceum) séduit
l’industrie de l’habillement et concurrence fortement les marchés du lin et du chanvre. De
plus, le remplacement de la voilure par les machines à vapeur et, dans le même temps, le
remplacement des cordages traditionnels par les câbles métalliques entraînent le déclin du
chanvre. La chute vertigineuse de plus de 70% des surfaces de chanvre cultivées de 1830 à
1914 en témoigne (Bouloc, 2006).
Dans les années 1930, la concurrence des fibres végétales exotiques (coton, jute
(Corchorus capsularis), sisal (Agave sisalana) et ramie (Bohemeria nivea) et les matières
synthétiques offrent de nouvelles conceptions textiles. L’industrie du pétrole et ses dérivés
avec le polyamide, le polyester et le polypropylène présentent des tissus techniques de
grandes résistances à la rupture. Toutefois, à cette même époque, Henry Ford met au point
une voiture originale comprenant beaucoup de chanvre alors que la plupart des véhicules
sont constitués de tôle en acier, fonte ou aluminium.
En 1937 aux Etats-Unis, le « Marijuana Tax Act » introduit de lourdes taxes sur la
culture du chanvre afin qu’elle ne soit plus rentable car accusée d’être responsable de la
paresse des travailleurs. La pression du lobbying de Dupont de Nemours (découvreur des
fibres synthétiques en nylon, kevlar, etc.) associé aux magnats de l’industrie papetière est
soupçonnée d’être à l’origine de parutions frauduleuses dans la presse de cette époque
visant à diaboliser les consommateurs de Cannabis. La campagne anti-chanvre dans ce
contexte fut écrasante et, de nos jours encore, les Etats-Unis sont toujours défavorables à la
culture du chanvre.
Pourtant, pendant la seconde guerre mondiale, les besoins en toiles et cordage sont
tels que la culture du chanvre est à nouveau promue aux Etats-Unis notamment par la
réalisation
d’un
film
de
propagande
« Hemp
For
Victory »
(http://www.archive.org/details/Hemp_for_victory_1942_FIXED). Mais une fois la guerre
terminée en 1945, la production du nylon étant maitrisée, l’ancienne législation est à
nouveau adoptée et le chanvre est définitivement banni aux Etats-Unis. Seules la Russie et
la France résisteront mais la perte du savoir-faire textile dans ce domaine est facilitée par la
mécanisation maîtrisée du coton (production de machines à égrener le coton dès 1794 et
développement des métiers à tisser mécaniques dès 1785) (Bouloc, 2006).
10
Figure 4. Production de chanvre en France et principaux partenaires de la transformation/valorisation du
chanvre. (Bouloc, 2009, «Le chanvre dans tous ses états », mars 2010, Poitiers).
Figure 5. Croissance du chanvre, exemple d’un semis réalisé début mai (Reis et al., 2006, cité
dans Bouloc, 2006).
11
Seuls restent des marchés de niche concernant les papiers spéciaux pour les fibres
(banques et cigarettes), l’alimentation de l’oisellerie et des appâts de pêche pour les graines
(chènevis). Ces utilisations vont permettre de maintenir une culture du chanvre.
Dans les années 60, l’INRA et la Fédération Nationale des Producteurs de Chanvre
(FNPC) lancent un grand programme de sélection du chanvre pour obtenir des cultivars
monoïques à faible teneur en THC. Ces travaux permettent de réduire le dimorphisme
sexuel chez la plante et de relancer la culture du chanvre agricole sans entraîner les
objections autour de l’usage psychotrope.
Depuis, de récentes législations autour de ces semences de chanvre industriel en
Allemagne, Australie, Canada, Pologne, Tchéquie, Ukraine et Chine augurent de nouvelles
perspectives. Grâce aux multiples usages de son passé et de ses nombreux atouts pour la
préservation de l’environnement, le chanvre suscite un réel intérêt actuel digne d’un « Retour
vers le Futur ».
1.3. Culture du chanvre
La France est le premier producteur de chanvre en Europe avec une superficie de
culture de presque atteignant 12 000 ha (chiffres communiqués par la FNPC, 2008) (Figure
4). En Europe, la superficie totale de chanvre atteint 15 500 ha en 2004 contre 125 000 ha
pour le lin (Karus et Vogt, 2004). Favorisée par un cycle de vie court (4 mois), cette culture
annuelle s’intègre facilement dans les parcours culturaux des agriculteurs (Figure 5). En effet
avec un semis fin avril début mai et une récolte en septembre dans les régions tempérées,
l’itinéraire cultural du chanvre favorise la polyculture et entre parfaitement dans les rotations
de culture (Ranalli, 2004).
Le chanvre est une plante de jours courts, la photopériode conditionne la floraison.
Les plantes fleurissent en fin d’été avec le raccourcissement de l’ensoleillement journalier
(Figure 5). Les meilleurs rendements sont obtenus en Suède car l’été offre des journées très
longues favorables à une forte croissance végétative (O. Béhérec, FNPC, communication
personnelle).
Plusieurs variétés de chanvre textile sont disponibles et caractérisées par des degrés
de précocité différents selon l’impact photopériodique. Sont qualifiées de précoces les
variétés qui fleurissent tôt et de tardives les variétés qui fleurissent tard (variétés fournies par
la FNPC), sachant que la différence entre les deux types les plus employées ne compte que
12
deux semaines maximum d’intervalle (du 1er août (Fédora 17) au 15 août (Futura 75) sous la
latitude du Mans) ce qui souligne la relativité des notions de précocité chez le chanvre.
Les rendements en fibres longues de chanvre sont déterminés par la variété de
chanvre, la nature des sols semés (Katerji et Mastrorilli, 2009), la disponiblité en eau (Di Bari
et al., 2004), les épandements (principalement azotés), la date de récolte (au début ou à la
fin de la floraison) et la densité de semis. Ce dernier facteur serait déterminant avec de
meilleurs rendements pour une densité de semis de 45 à 55 kg de graines par hectare
(Amaducci et al., 2008). Une densité plus importante de semis entraîne un autoéclaircissement des cultures, correspondant à une régulation naturelle provoquant la mort de
certaines plantes pouvant mener à une perte de rendement (Van der Werf et al., 1995a).
Les apports azotés (de 80 à 120 kg/ha) n’affectent que peu les rendements ; en
revanche, une surdose d’azote (200 kg/ha) semble être un facteur limitant pour la
dissociation des fibres (Bouloc, 2006).
L’implantation rapide de la plante et sa levée provoquent un recouvrement du sol
assez précoce limitant ainsi l’émergence d’adventices et donc de traitements par des
herbicides. Ces caractéristiques font du chanvre une plante assez rustique car elle nécessite
peu de travail en amont de sa culture et qu’elle s’adapte à différentes terres. L’analyse du
cycle de vie (AVC) du chanvre (Van der Werf, 2004) donne la culture du chanvre comme
étant une production végétale ne nécessitant que peu d’entrants (épandages azotés et
pesticides) et ne provoquant qu’un faible impact environnemental comparé à d’autres
cultures (betterave notamment). Toutefois l’ACV révèle un impact négatif sur la teneur en
potassium du sol lors des premiers stades de développement du chanvre (Van der Werf,
2004).
Communément le chanvre est décrit comme résistant aux pathogènes du fait de sa
rusticité, mais il semble que ce soit plus son manque d’exposition qui conduit à cette
impression (Bouloc, 2006). En effet, en Champagne-Ardennes où la culture du chanvre
connaît un regain d’intérêt depuis une dizaine d’année, la plante est victime d’infection
fongique par Botrytis cinerea, champignon pathogène de la vigne (Vitis vinifera). De même,
ce type d’infection a été rapporté aux Pays-Bas (Van der Werf et al., 1995a).
Une étude plus ciblée sur les pathogènes du chanvre comme Pseudoperonspora
cannabinna, Septoria neocannabina et Fusarium graminaerum montre que ces derniers
13
seraient en pleine expansion en occident (McPartland, 1997). Des larves d’insecte, comme
l’agrile (Grapholita delineana) du chanvre, provoquent des pertes de rendement en raison
des blessures affaiblissant la tige (Figure 6) (McPartland, 2002).
Figure 6. Galle de la tige de chanvre causé par les larves d’agrile (Grapholita delineana) (McPartland,
2002).
Dans la région Poitou-Charentes, la plante parasite Orobanche (Phelipeae ramosa)
provoque de grandes pertes de rendement sur le colza (Brassica napus) et des travaux ont
rapporté une attaque possible de cette plante parasite sur le chanvre (Simier, communication
personnelle).
Ces points seront à prendre en compte pour un développement de la culture du
chanvre en France.
1.4. Valorisation actuelle du chanvre
La dynamique récente autour du développement durable favorise la renaissance de
la culture du chanvre compte tenu de ses propriétés rustiques et de son historique. Ces
dernières années les acteurs du secteur chanvricole tentent de s’organiser pour apporter des
nouveaux marchés (Garnier, 2006) et la filière se développe autour de grandes organisations
structurantes (Figure 7) comme la FNPC ou encore l’Institut Technique du Chanvre (ITC).
14
1.4.1. Valorisation de la graine
Le chanvre est une culture majoritairement non alimentaire, exception faite du
marché marginal de l’huile de chanvre. Le chènevis est alors pressé pour extraire l’huile qui
représente 30 à 40% du poids de la graine. Cette huile est consommable uniquement à froid
et elle présente de bonnes propriétés siccatives ouvrant une utilisation potentielle pour les
enduits utilisés dans le bâtiment ou la cosmétique. Enfin, les résidus de pressage peuvent
être valorisés en tourteau. Une étude rapporte une augmentation favorable de la teneur en
Oméga 3 dans le beurre issu du lait de vache nourrit pour une part au tourteau de chanvre
(étude non publiée, communiquée par le Lycée de l’Oisellerie, Charente). Ces marchés
restent toutefois tout juste émergents, la récolte de la graine n’étant pas ou que très peu
maîtrisée aujourd’hui, les récoltes en mode battu permettant de valoriser les graines
(chènevis) n’étant pas répandues.
Dans le cadre de ce travail, l’étude est focalisée sur la transformation de la paille de chanvre
pour obtenir des fibres textiles pouvant être filées et tissées.
Figure 7. Différentes structures d’organisation de la filière chanvre et leurs interactions. (Union des
Transformateurs de Chanvre (UTC), Coopérative Centrale des Producteurs de Semences de Chanvre
(CCSCP), Comité Economique Agricole de la Production de Chanvre (CEAPC), Association Européenne
du Chanvre Industriel (EIHA), Confédération Européenne du Lin et du Chanvre (CELC). (Garnier, 2006)
15
Figure 8. Coupe transversale d’une moitié de tige de chanvre.
De la moelle à l’épiderme avec les différents tissus sont utilisés ainsi : le phloème fournit les fibres
longues ou la filasse, le xylème (ou bois) la chènevotte, la paille correspond à l’ensemble de la tige.
1.4.2. Valorisation de la tige
Bien que la culture du chanvre connaisse un net regain d’intérêt cette dernière
décennie, rares sont les infrastructures permettant la transformation des plantes. Cette étape
de transformation est indispensable car, contrairement au blé par exemple, le chanvre ne se
vend pas sur pied. Seuls les co-produits du chanvre après transformation ont une valeur
marchande.
Les estimations de production (étude Agrice, 1998) sont de 6 à 8 t/ha pour les pailles
sèches dont 4,5 à 6 t/ha de rendement pour la chènevotte et 1,5 à 2 t/ha pour les fibres. En
effet, la paille de chanvre après une première transformation comprend deux grandes parties
valorisées (Figure 9) :
9
Le cœur de la tige avec la chènevotte ou bois de chanvre qui représente 50 à
55% du poids sec de la tige,
9
La périphérie de la tige avec les fibres longues et divers tissus périphériques
(épiderme,
collenchyme,
parenchyme
phloémien
et
cambium)
le
tout
représentant 30% à 35 % du poids sec de la tige.
Les 10 à 15% restant correspondent à la poudre engendrée lors des broyages et
peuvent être valorisés en biomasse brute lignocellulosique (biocarburant et renfort
plasturgie).
16
Ces diverses transformations sont assurées soit par des structures spécialisées de
type industriel (La Chanvrière de l’Aube (LCDA), Start Hemp et Agrofibre), soit directement
par les producteurs qui se regroupent alors en SARL pour réaliser les premières
transformations. Actuellement, quelques associations (Chanvre Mellois, Civam Thuré) ont
mis en place des chaînes de production de chanvre allant de la culture à la transformation de
la plante par fractionnement. Les divers co-produits obtenus sont séparés par granulométrie
en chènevotte (fibres du bois, xylème), chènevotte fibrée (fibres du xylème et du phloème) et
filasse (fibres phloémiennes) dans la plupart des cas (Figure 8). D’autres produits peuvent
être plus finement distingués sur les chaînes de fractionnement plus « avancées » (Chanvre
Mellois) où différentes granulométries de chènevottes et chènevottes fibrées sont proposées.
L’ensemble de ces produits est destiné à l’éco-habitat, plus particulièrement pour
l’isolation. La chènevotte s’avère un très bon isolant acoustique et thermique (Kymalainen et
Sjoberg, 2008 ; Pritchett et McCann, 2008), du fait de la structure alvéolaire du bois la
constituant. Ces propriétés remarquables ont donné lieu en juillet 2007 à une certification
CSTB (Centre Scientifique et Technique du Bâtiment) pour le béton de chanvre. Mélangée à
de la chaux, la chènevotte et/ou chènevotte fibrée est commercialisée et connaît un véritable
essor. Cette reconnaissance contribue à l’installation/reconversion de nombreux agriculteurs
vers la culture du chanvre.
Récemment des travaux visant à l’emploi des fibres courtes dans des matériaux
composites ont été présentés (R. Bag, communication orale, journées du Réseau Français
des Parois, Toulouse, 2008). Les fibres courtes correspondent aux fibres de la chènevotte.
D’autres procédés pour valoriser les plastiques renforcés en fibres courtes de chanvre sont
en cours d’élaboration par AFT plasturgie et l’UMR FARE (Fractionnement des
Agroressources et Environnement) de Reims.
Les fibres longues sont peu valorisées seules et, le plus souvent, elles restent
associées à de la chènevotte. Cependant, quelques exploitants récupèrent les fibres longues
sous forme de fillasse. La filasse est compactée en laine non tissée pour l’isolation
thermique en remplacement de la laine de verre. Encore actuellement ces produits
nécessitent un liant polyester (CAVAC, Vendée). Aucune certification n’a encore été obtenue
pour ce produit, mais les consommateurs potentiels sont de plus en plus nombreux.
L’originalité de notre étude a été d’utiliser des fibres longues de chanvre à l’état tissé
dans des matériaux composites.
17
1.4.2.1.
Défibrage
La transformation actuelle de la plante ne permet pas la récupération des fibres
longues de qualité pour le tissage, les étapes de fractionnement mécaniques altérant
considérablement leur intégrité. Dans le cadre de nos travaux, il est nécessaire d’étudier la
filière de transformation du chanvre de la plante au tissu, c’est pourquoi la remise en place
d’un protocole de transformation à l’échelle du laboratoire a du être faite.
Pour une filière textile, l’étape de défibrage doit être calibrée différemment. Comme
pour le lin, la récupération des fibres longues est favorisée après une étape de rouissage au
champ. Cela consiste à une dégradation, par la flore microbienne du sol, des tissus vivants
de la tige de chanvre, seules les fibres et la chènevotte restant intactes. Le rouissage en
champ est encore mené actuellement pour favoriser les étapes de défibrage mécaniques
ultérieures mais les paramètres (durée, température et humidité) ne sont pas contrôlés. Les
produits extraits de nouvelles chaînes de transformation (LCDA, Start hemp et Agrofibre)
n’offrent pas des fibres longues de qualité pour un emploi textile, toutefois la séparation des
fibres longues de la chènevotte est améliorée par cette étape de rouissage (Easson et
Molloy, 1996). Pour l’utilisation de la chènevotte dans l’habitat, un rouissage faible est
préconisé afin de limiter la présence de microorganismes sur le matériau final. Ces
entreprises, visant les marchés de l’éco-habitat et de la plasturgie principalement,
contribuent à la remise en place d’industries autour du chanvre.
1.4.2.2.
Rouissage
Ancestralement, le rouissage se réalisait dans des rouissoirs connectés aux eaux
vives (ruisseau ou rivière), la décomposition durait une trentaine de jours au terme desquels
les faisceaux de fibres détachées du bois étaient retirés et mis à sécher. Pour faciliter le
travail, certains chanvriers laissaient rouir les tiges dans les ruisseaux pendant plus de
3 semaines afin de laisser pourrir l’essentiel de la chènevotte (Bouloc, 2006). De nos jours,
la valorisation des co-produits du chanvre nécessite un rouissage contrôlé permettant
notamment la récupération de la chènevotte. Actuellement, seul le rouissage en champs est
réalisé dans certains cas pour favoriser le défibrage mécanique ultérieur (1.4.2.1), le
rouissage par macération dans l’eau n’étant plus toléré depuis les interdictions citées dans
l’historique (1.2). Pourtant, depuis un siècle, les nombreux travaux sur les traitements des
eaux permettent une réutilisation industrielle possible du rouissage (Bhatnagar et Sillanpaa,
2010).
18
Pour le lin, après rouissage, les tiges sont teillées (les fibres sont déchaussées du
reste de la tige) puis peignées dans toute la longueur de la tige, optimisant la récupération
des fibres longues. Pour le chanvre, ces étapes nécessitent d’être adaptées, les tiges étant
plus robustes et de taille plus importante que celles du lin.
2. Morphologie générale du chanvre
2.1. La tige
Le chanvre est une plante annuelle et monopodiale, c’est-à-dire que sa croissance
est principalement gouvernée par son méristème apical caulinaire ce qui permet la
croissance de la tige en hauteur. Les tiges de chanvre peuvent atteindre 2 à 4 m de haut
avec un diamètre moyen de 1 à 3 cm (Bouloc, 2006), croissant de l’apex vers la base. Les
parties jeunes de la tige (proche de l’apex) montrent une surface cannelée alors que la base
de la tige est lisse. La tige est constituée d’entre-nœuds de longueur variable, résultant d’une
croissance différentielle (car toutes les parties d’une tige ne s’allongent pas de la même
façon). La croissance est qualifiée d’intercalaire (Gorenflot et Foucault, 2005).
La
morphologie de la partie végétative peut varier en fonction des conditions de culture. Par
exemple, une densité de semis faible favorisera la mise en place de ramifications, les
plantes seront moins grandes et présenteront une plus forte croissance en épaisseur. A
l’inverse, une densité de semis élevée limitera la croissance des branches axillaires, les tiges
seront plus fines et plus hautes (Struik et al., 2000 ; Amaducci et al., 2008).
2.2. La racine
La plante possède une racine pivotante avec un système racinaire peu développé par
rapport à sa biomasse aérienne. Le pivot central peut atteindre des profondeurs voisines de
2 m mais les racines secondaires, qui constituent la partie racinaire la plus importante en
masse, s’enfoncent de 10 à 60 cm (Bouloc, 2006). Empiriquement, les agriculteurs
considèrent le chanvre comme un bon précédent au blé grâce aux profondeurs racinaires qui
fournit une terre présentant une excellente structure.
2.3. Les feuilles
Les feuilles sont composées d’un pétiole surmonté de 3 à 7 folioles lancéolées, de
taille inégale, selon le stade de développement de la plante. Généralement, les plus jeunes
feuilles sont composées de 3 folioles (visibles en début de croissance sur les premiers entrenœuds mis en place), puis ultérieurement de 5 à 7 folioles (Figure 1). Les feuilles s’insèrent
de manière opposée dans les 8 à 10 premiers nœuds de la tige (tous les 10 à 30 cm) puis la
19
phyllotaxie (disposition des feuilles sur la tige) passe en mode alterné au début de la
floraison (ITC et Bouloc, 2006).
2.4. Les fleurs
Chez le chanvre, les fleurs sont rassemblées et correspondent alors à des
inflorescences. Les inflorescences se distinguent en mâle et femelle. Sur les plants dioïques,
les inflorescences mâles sont organisées en grappe généralement au sommet de la tige,
formée de panicules plus ou moins lâches sans feuilles (Figure 1).
Les inflorescences femelles forment une cyme à l’apex regroupant plusieurs épis
formés à l’embranchement de nombreuses feuilles (Figure 1). La fleur femelle n’a pas de
pétales ; portée par des bractées sur la tige, elle se compose de deux pistils et contient un
ovaire (Bouloc, 2006). Dans les variétés psychotropes, ce sont les trichomes glandulaires
portés par les bractées qui renferment le THC. Sur les variétés monoïques utilisées, les
plantes présentent des ratios d’inflorescence mâle/femelle allant du « trop mâle »,
correspondant une forme mâle dioïque plus chétive que l’originale, à la « très femelle »,
correspondant à la forme femelle dioïque classiquement décrite (O. Béhérec, FNPC,
communication
personnelle).
Les
monoïques
« vraies »
portent
généralement
les
inflorescences femelles à l’apex et au bout de quelques branches axillaires alors que les
inflorescences mâles se trouvent réparties sur la tige au niveau des nœuds alternes,
marqueurs de l’initiation florale.
3. Morphogénèse et développement des fibres longues
Les tiges du chanvre, comme celles des Dicotylédones, sont constituées de tissus
très polymorphes. La structure primaire de la tige se décline en épiderme, écorce, faisceaux
conducteurs et moelle (Gorenflot et Foucault, 2005). Dans le cadre de ce travail, une
attention particulière est portée sur la description de ces tissus et leur formation pour mieux
comprendre la répartition et la formation des fibres longues.
3.1. Les différents tissus caulinaires
La tige de chanvre est constituée de tissus concentriques avec de l’extérieur au
centre de la tige : l’épiderme, le collenchyme, le tissu phloémien contenant les fibres longues
(primaires et secondaires), le cambium, le xylème et la moelle. Le cambium est l’assise
cellulaire génératrice des tissus conducteurs : du xylème vers le centre de la tige et du
phloème vers l’extérieur (Figure 8 et Figure 9).
20
Figure 9. Schéma résumant l’origine et la complexité cellulaire des tissus conducteurs chez les
Dicotylédones (Catesson, 1980 cité dans Robert et Catesson, 1990).
(S
(S
(S
&R
&R
&R
&R
6F
&V
6F
&V
6F
Figure 10. Formation des fibres par sclérification du collenchyme périphérique dans la racine de Daucus
carotta.
Le collenchyme, tissus de soutien sous épidermique se charge de lignine pour former le sclérenchyme
(Ep : Epiderme, Co : Collenchyme, Sc : Sclérenchyme, Cs ; Canal sécréteur). D’après Duchaigne, 1955.
21
3.1.1. L’écorce
L’épiderme est la première barrière d’échange et de protection de la plante et est
constitué d’une assise cellulaire qui peut être parfois interrompue par des glandes
sécrétrices ou des poils sécréteurs. Les cellules de l’épiderme sont petites, plutôt arrondies
(cellules stomatiques exceptées), leur paroi est de nature cellulosique et elle peut être
subérifiée sur la partie externe.
L’écorce désigne la partie de la tige qui va de l’épiderme au cambium et comprend le
phloème avec ou sans tissus de soutien (collenchyme et sclérenchyme), ceux-ci étant
disposés en anneaux continus ou en îlots séparés.
Le collenchyme assure la souplesse aux jeunes tiges. Chez le chanvre, le
collenchyme est principalement présent dans les parties cannelées de la tige. C’est un tissu
vivant qui se différencie durant la croissance (Gorenflot et Foucault, 2005). Les parois
cellulosiques de ces cellules sont épaisses et sont réparties uniformément. Le tissu rappelle
une structure en « nid d’abeille ».
Le collenchyme peut se sclérifier chez certaines plantes, c’est-à-dire qu’il se charge
notamment de lignine conférant alors une meilleure rigidité au tissu (voir chapitre mise en
place des parois secondaires). La sclérification du collenchyme décrite par Duchaigne (1955)
donne naissance à des fibres de soutien très lignifiées, le tissu formé se nommant
sclérenchyme (Figure 10). Les cellules composant le sclérenchyme ont un cytoplasme qui
dégénère très rapidement. Le sclérenchyme différencié est donc un tissu mort. Les cellules
constitutives du sclérenchyme présentent des formes et des tailles variées allant du polyèdre
aux formes cellulaires plus fuselées.
Deux grands types de fibres sclérenchymateuses sont décrits :
9 les fibres scléreuses sont allongées en fuseau avec une lumière étroite. Leur
section transversale peut être polygonale ou ronde. Elles sont péricycliques sous
épidermiques en anneau continu ou en ilots.
9 Les sclérites ou scléréides sont des cellules courtes de forme variable
groupées en amas ou en assise continue (Evert, 2006).
Les cellules corticales parenchymateuses, impliquée dans la photosynthèse, sont
présentes dans les tissus jeunes mais paraissent peu impliquées dans de grandes fonctions
métaboliques dans les tiges adultes. Chez le chanvre, elles sont visibles dans les parties
22
lisses de la tige entre l’épiderme et les fibres longues. Les cellules parenchymateuses sont
arrondies et ont une fine paroi pectocellulosique.
Figure 11. Le bois résulte de l’association de cinq types cellulaires comme cela est représenté dans le
schéma central.
Sections transversales (A), (B), tangentielle (C) et radial (D) de peuplier (Populus tremula XP. alba, INRA
Clone 717-1B4) colorées par la safranine Astra/bleu. CZ : zone cambiale, DX : xylème en différenciation, f :
fibre, fcc : cellule cambiale fusiforme, p : ponctuations, rcc : cellule cambiale radiale, rp : rayon
interfasciculaire, v : vaisseaux. Les flèches vides (B), indiquent les nouvelles parois tangentielles de la
zone cambiale correspondant aux divisions anticlines (radiales). Les flèches pleines (B) indiquent les
nouvelles parois radiales de la zone cambiale correspondant aux divisions anticlines. Echelle 50 μm
(Dejardin et al., 2010)
23
3.1.2. Les tissus conducteurs
Les tissus conducteurs se distinguent en phloème et xylème. Les tissus conducteurs
se répartissent sur un ou plusieurs cercles concentriques avec le phloème vers l’extérieur et
le xylème vers l’intérieur, proche de la moelle.
Le xylème est composé de protoxylème et de métaxylème (voir § formation des
tissus). Situé dans la partie centrale de la tige proche de la moelle, il correspond à une partie
du bois de la tige ou chènevotte. Le xylème est responsable de la circulation de la sève brute
dans la plante. La sève brute correspond à la sève ascendante puisée des racines pour être
redistribuée aux parties végétatives. Le xylème des Angiospermes est un tissu
principalement mort et fortement lignifié. Il est composé d’éléments conducteurs (les
vaisseaux et les cellules associées aux vaisseaux ou cellules de contact) qui assurent la
circulation de la sève et d’éléments de soutien qui sont des fibres courtes. Parfois, le xylème
peut contenir des trachéides. Les rayons du xylème sont composés par des cellules
parenchymateuses qui assurent les échanges entre xylème et phloème.
Du fait de sa constitution, le bois de chanvre est du type hétéroxylé (Gorenflot et
Foucault, 2005). Le xylème présente une structure alvéolaire en coupe transversale (Figure
11). Il s’agit de plus ou moins gros vaisseaux continus et finis dans la verticalité de la tige.
Le phloème est constitué de protophloème et de métaphloème (voir § formation des
tissus) et est situé dans la partie périphérique des tiges et est responsable du transport de la
sève élaborée. Les fibres longues de chanvre appartiennent au tissu phloémien mais ne sont
pas responsables du transport. Le transport de la sève élaborée est gouverné par les
complexes cellules compagnes / tubes criblés qui représentent un tissu vivant. Les fibres
périphloémiennes, cellules mortes, entourent le phloème et assurent la rigidité des tiges par
leurs localisations périfasciculaires.
3.1.3. La moelle
Dans les parties jeunes de la tige, la moelle est relativement bien développée, avec
de très grandes cellules parenchymateuses non chlorophylliennes mais souvent riches en
amidon. Au cours de l’élongation des entre-nœuds, la moelle peut disparaître et laisser une
lacune médullaire (cœur creux de la tige).
24
3.2. Formation des tissus caulinaires
La formation des tissus caulinaires est initiée par l’activité des cellules
méristèmatiques. Ces cellules présentent des caractères embryonnaires persistants chez la
plante adulte. Elles sont douées de totipotence, c’est-à-dire qu’elles sont initialement
indifférenciées car ce sont des cellules jeunes qui présentent un fort taux de division (Robert
et Catesson, 1990). Les cellules filles produits se différencient pour engendrer les différents
types cellulaires constituants les tissus.
Il existe différents types de méristèmes répartis en méristème primaire et
secondaire.
3.2.1. Les méristèmes primaires
Les méristèmes primaires engendrent les organes primaires comme les tiges ; ils
sont donc à la fois histogènes et organogènes car ils donnent naissance aux tissus et aux
organes chez la jeune plante. Parmi les méristèmes primaires sont distingués :
9 Le méristème apical caulinaire qui gouverne l’élongation des axes. Les
méristèmes caulinaires sont responsables de la croissance des entre-nœuds
chez le chanvre. Le méristème caulinaire est en outre responsable de la
formation d’organes spécialisés comme les feuilles, les branches axillaires et
puis, en réponse à des signaux, à la formation des fleurs. La différenciation
florale implique la fin du méristème. Chez le chanvre, la floraison marque la fin
de la croissance (Mediavilla et al., 1998).
9 Le procambium, dérivant des méristèmes apicaux, qui engendre les tissus
conducteurs primaires dans les premiers stades de croissance de la plante. Le
procambium engendre vers l’intérieur le protoxylème et vers l’extérieur le
protophloème (Robert et Catesson, 1980).
3.2.2.
Les méristèmes secondaires
Les méristèmes secondaires, dont le cambium, gouvernent la croissance en
épaisseur de la tige. Le cambium dérive du procambium et gouverne la production des
tissus conducteurs. Le rôle du cambium est exclusivement histogène et engendre les tissus
secondaires dont le xylème et le phloème. Le cambium peut être aussi nommé zone
génératrice libéro-ligneuse. Le xylème est engendré par la différenciation centripète du
cambium et le phloème par la différenciation centrifuge (Figure 9).
25
Tableau 3. Récapitulatif des données disponibles sur les fibres végétales principalement utilisées
Organe
Espèce
Cellulose
Lignine
d’origine des
Longueur
Diamètre
(mm)
(μm)
Sources
fibres
Lin
75 à 90 %
2à4%
9 à 70
0,9 à 5 %
20 à 50
5 à 15
Morvan et al., 2003
25 à 30
20 à 25
Reis et al., 2006
19,3 ± 5,5
Charlet et al., 2006
11 à 52
5 à 55
15 à 25
Snegireva et al., 2010
Esau, 1969
Tiges, périphloèmeinnes
> 72 %
Chanvre
limbes
tégumetaires
Jute (Corchorus
capsularis)
Graine, poils
75 %
2%
> 100
15 à 25
Crônier et al., 2005
> 67 %
2à5%
5 à 55
15 à 40
Reis et al., 2006
70 à 75 %
3à5%
5 à 40
15 à 30
FNPC,
15 à 35
Ramie
Feuilles,
75 à 90 %
Esau, 1969
Snegireva et al., 2009
55 à 72 %
75 à 90 %
2à5%
5 à 55
50 à 250
10 à 51
Reddy et Yang, 2009
Esau, 1969
> 80 %
nd
30 à 170
20 à 50
Reis et al., 2006
nd
24 %
2à3
16
(Lev-Yadun, 2010)
Reis et al., 2006
15 à 45
20 à 30
Reis et al., 2006
Coton
> 99 %
Kapok
nd
nd
15 à 30
20
Reis et al., 2006
Sisal
50 à 60 %
10 à 14 %
2,5 à 3,5
20
Reis et al., 2006
(Agave sisalana)
Abaca
50 à 60 %
5%
4à6
20
Reis et al., 2006
(Ceiba pentadra)
(Musa textilis)
4. Description des fibres : généralités.
La terminologie « fibres » décrit plusieurs entités botaniques avec des ontogénies et
des rôles différents. Autrement dit, les fibres peuvent correspondre à différents types
cellulaires provenant de différents organes végétaux (Tableau 3).
26
Dans le quotidien, les fibres désignent souvent ce qui a trait à la paroi des cellules
considérée comme une structure fibreuse (§ paroi). Pour exemple, lorsque les diététiciens
conseillent une alimentation riche en fibres, en préconisant la consommation journalière de
cinq fruits et légumes par jour, ils se réfèrent aux parois de tous les types cellulaires
composant les organes végétaux consommés.
Un autre exemple répandu concerne l’évocation des termes « biomasses » et « puits
de carbone » qui correspondent à l’ensemble des parois constitutives de la matière végétale.
En effet, les plantes autotrophes sont capables de fixer le carbone atmosphérique pour le
métaboliser en sucres, éléments principaux des constituants pariétaux. Ce rappel trivial
nécessite d’être souligné car beaucoup de confusions existent encore dans le domaine des
agroressources.
Les classifications des fibres au niveau industriel concernent leurs utilisations. Elles
distinguent :
9 les fibres avec un rôle mécanique qui appartiennent au tissus périphérique de la
tige (sclérenchyme ou non, fibres cellulosiques phloémiennes) et qui sont
utilisées pour des applications textiles ou composites,
9 les fibres utilisées pour la production papetière (les fibres longues phloémiennes
et les fibres courtes xylémiennes),
9 les fibres dérivées d’autres tissus que les tissus caulinaires comme les trichomes
de graine de coton ou de kapok (Ceba pentadra).
Les critères de classification des fibres ne sont pas bien définis, souvent la littérature
classe les fibres en fonction de leur taille (longueur, largeur et rapport de ces mesures), de
leur composition, et de leur comportement mécanique, comme indiqué dans le tableau de
synthèse (Tableaux 2 et 3). Par ailleurs, les méthodes de mesures de tailles utilisées
diffèrent en fonction des sources ce qui complique la classification.
Chez le chanvre, seules les fibres primaires sont considérées comme les fibres
nobles. Pourtant, deux types de fibres longues sont observables : les fibres primaires et les
fibres secondaires. Les fibres secondaires sont plus petites (de 1 à 2 mm de longueur et de
5 à 20 μm de diamètre d’après la FNPC) que les fibres primaires (Tableau 3) et elles ne sont
pas toujours présentes dans la tige en fonction des conditions agronomiques.
27
Figure 12. Différenciation des « trachées ».
Le premier facteur du développement vasculaire primaire est l’identité des cellules procambiales. Ces
cellules se divisent ensuite pour donner tant du protoxylème que du protophloème. Dans la croissance
secondaire, des cellules cambiales se différencient pour engendrer le xylème et le phloème (Turner et al.,
2007)
4.1. Origine et localisation des fibres
Deux grands types de fibres sont distingués : les fibres du bois ou xylémiennes,
fortement sclérifiées et les fibres dites extraxylémiennes localisées à l’extérieur du bois. Les
fibres longues sont parmi les fibres extraxylémiennes (Evert, 2006).
4.1.1. Fibres xylémiennes
Les fibres du bois sont considérées comme des fibres courtes. Le xylème est un tissu
composé de différents types cellulaires. A maturité, les vaisseaux et les fibres composant le
xylème sont morts et fortement lignifiés. Ces cellules sont impliquées respectivement dans la
conduction de la sève et le soutien de la plante. Mais des cellules vivantes composent aussi
le xylème. En effet, des cellules parenchymateuses sont associées aux vaisseaux.
Organisées en rayon, et impliquées dans le transfert radial des assimilats entre le phloème
et le xylème, elles peuvent aussi servir de stockage pour l’amidon et les lipides (Dejardin et
al., 2010). Les cellules les plus étudiées restent les trachéides (Figure 12) (Turner et al.,
2007) car elles ont à la fois un rôle de soutien et un rôle dans la conduction de la sève. Le
bois a une structure hétérogène de part sa constitution mais aussi en fonction de son âge
(Dejardin et al., 2010). De plus, chez les ligneux, la structure du bois peut varier en réponse
28
à des contraintes mécaniques (bois de tension et bois de compression) (Pilate et al., 2004).
Les particularités du bois ne sont que brièvement exposées ici, l’intérêt étant porté sur les
fibres longues. Mais dans une démarche de caractérisation des agroressources, il est
nécessaire de rendre compte de l’hétérogénéité des cellules composant les tissus en vue
d’une optimisation de leurs utilisations.
Figure 13. Sections transversales de différents organes végétaux.
Les schémas montrent la distribution du sclérenchyme, des fibres et des tissus vasculaires. A. tige de
Triticum, B. tige de Sorghum, C. tige de Tillia, D. racine de Phaseolus, E. coupe de feuille d’herbe, F. tige
de Fraxinus, G. tige de Gnetum gnemon, H. tige d’Aristolochia (Evert, 2006).
29
4.1.2. Fibres extraxylémiennes
La terminologie extraxylémienne est peu précise et concerne plusieurs types de
fibres dont le point commun reste leur non-appartenance au xylème. Dans ce paragraphe
l’attention est portée sur les différentes fibres extraxylémiennes décrites afin de comprendre
le type ontogénique des fibres longues de chanvre.
La répartition des fibres le long de la tige de chanvre montre la présence de fibres
longues primaires en périphérie dans les parties hautes de la tige et des fibres primaires et
secondaires dans les parties basses de la tige. Cette répartition résulterait de l’activité
procambiale et cambiale.
Deux autres groupes de fibres extraxylémiennes sont décrits dans les tiges des
Dicotylédones : les fibres corticales et les fibres périfasciculaires qui n’auraient pas pour
origine le phloème (Figure 13, G et H). Ces fibres forment une couronne péricyclique autour
de la tige et dériveraient du cortex et non des tissus vasculaires. Cependant il est fréquent
d’employer la terminologie péricyclique pour désigner les fibres périfasciculaires quelque soit
leur origine ou leur association avec les tissus vasculaires.
Chez le chanvre, le collenchyme est présent dans les parties jeunes de la plante. Les
régions collenchymateuses sont plus importantes dans les cannelures de la tige. Chez
certaines autres espèces végétales, la sclérification des collocytes aboutit à la formation des
fibres dites primaires (Figure 10).
L’ontogénie des fibres de chanvre n’a pas été étudiée et les termes fibres longues,
fibres extraxylémiennes, fibres phloémiennes et sclérenchyme se retrouvent mélangés dans
la littérature (Chernova et Gorshkova, 2007). C’est pourquoi il est important de restituer les
différences de terminologie (§ tissus caulinaires et formation).
30
Figure 14. Fibres à septa du phloème.
A. de vigne (Vitis), B. de cactée (Pereskia) (Evert, 2006)
5. Formation des fibres xylémiennes et phloémiennes
Esau (citée dan Evert, 2006) a suggéré un classement des fibres (xylémiennes et
phloémiennes) d’après leurs mode de formation et elle distingue notamment les fibres à
septa des fibres gélatineuses. Dans le premier cas, les cellules mères phloémiennes et
xylémiennes subissent plusieurs divisions mitotiques régulières et successives avant la mise
en place de la paroi secondaire. Ces cellules se divisent en plusieurs compartiments
pariétaux délimités par les septa (Figure 14). Ces septa ne sont pas tout à fait continus
puisque des plasmodesmes établissent une liaison symplasmique entre les cellules filles.
C’est-à-dire que la structure finale a un cytoplasme continu. Dans certains cas, ces cellules
restent vivantes à maturité et peuvent contenir des amyloplastes ou des cristaux d’oxalate de
calcium, ce qui suppose un rôle de stockage pour ce type de cellule (Esau, 1977). Dans le
cas des fibres gélatineuses, celles-ci sont identifiées par la couche G (pour gélatineuse) qui
correspond à une couche interne dans la paroi secondaire (§ paroi). Ces fibres sont mises
en place lors du développement de la plante en réaction aux contraintes et peuvent être
31
aussi bien xylémiennes que phloémiennes (Esau, 1977). L’auteur n’attribue pas non plus
une ontogénie différente aux fibres xylémiennes et phloémiennes. En effet, les premières
étapes de formation des fibres restent communes à toutes les fibres qu’elles soient
xylémiennes ou phloémiennes (Lev-Yadun, 2010). Les fibres sont issues de la division des
cellules initiales du cambium. Les cellules initiales mesurent quelques 20 μm pour atteindre
jusque 55 cm chez la ramie (Lev-Yadun, 2010) ! Ces cellules sont donc capables de
s’allonger 27 500 fois !
Les fibres se mettent en place en cinq étapes 1. l’initiation, 2. la croissance
coordonnée, 3. la croissance intrusive ou diffusive (élongation), 4. la maturation
(épaississement pariétal avec le dépôt de la paroi secondaire) et 5. la sénescence
(Chemikosova et al., 2006 ; Dejardin et al., 2010).
5.1. L’initiation cambiale
Le cambium est décrit comme un tissu unisérié avec des cellules cambiales initiales
donnant le phloème d’une part et le xylème d’autre part. Ces cellules initiales se divisent
plusieurs fois en cellule mère du phloème et cellule mère de xylème avant leur différenciation.
C’est pourquoi la zone cambiale est multisériée mais seule une assise de cellules
correspond aux cellules intiales, les autres assises correspondant aux dérivés (Lachaud et
al., 1999). Au sein de l’assise cambiale, les divisions anticlines permettent l’élargissement du
cercle cambial en engendrant deux types d’initiales filles à partir de l’initiale mère. Les
cellules initiales peuvent être de deux types :
9 Les initiales fusiformes, qui vont devenir les cellules criblées, les cellules
compagnes, le parenchyme phloémien vertical et les fibres du phloème, mais
aussi les vaisseaux et les cellules associées aux vaisseaux, le parenchyme
ligneux vertical et les fibres du xylème,
9 Les initiales courtes qui deviennent les rayons phloémiens (ou parenchyme
phloémien horizontal) mais aussi les rayons ligneux (ou parenchyme ligneux
horizontal) pour le xylème.
32
Figure 15. Différents concepts de développement des fibres.
(a) Formation des fibres par fusion de cellules parenchymateuses et dissolution des septa entre elles ; (b)
Elongation coordonnée de la partie supérieure de la fibre et croissance continue ; (c) croissance apicale
intrusive, la paroi s’épaissit par la mise en place de la paroi secondaire ; (d) croissance intrusive et
diffusive, épaississement pariétal uniforme après la fin de la croissance (Chernova et Gorshkova, 2007).
Tableau 4. Paramètres de croissance des fibres de lin aux stades de la croissance coordonnée et
intrusive (Ageeva et al., 2005).
Paramètres
Localisation dans la tige
Durée
Forme des cellules
Longueur des cellules
Diamètre des cellules
Division nucléaire
Plasmodesmes
Croissance coordonnée
0,04-0,1 cm de l’apex
Croissance intrusive
0,1 cm à 5 cm de l’apex
(Snap Point)
Plusieurs heures
Plusieurs jours
Longitudinale avec des bouts Longitudinale
avec
des
arrondis
pointes fines
100 à 200 μm
0,2 < 5 cm
4-7 μm
7-20 μm
Synchrone
Asynchrone
Présents
Absent
33
5.2. La croissance coordonnée
L’observation de la croissance cellulaire avant la différenciation des tissus peut
mener à deux interprétations (Chernova et Gorshkova, 2007) :
9
Dans le premier cas, l’expansion cellulaire est synchrone entre deux cellules
voisines et les parois forment un réseau continu et homogène (Figure 15 (a)).
Les cellules se divisent par mitose suivant les cellules voisines, le réseau pariétal
est continu. Les cellules du tissu résultant sont homogènes sur plusieurs assises
cellulaires. Pour former les fibres, des cellules fusionnent et les septa entre les
cellules se dissolvent.
9
Dans le deuxième cas, l’expansion cellulaire est différente entre deux cellules
voisines, les parois ne sont plus contigües sur un plan radial d’une cellule à
l’autre et une des cellules bénéficie d’une plus forte croissance (Figure 15 (b)), La
croissance est alors symplasmique, la cellule subit des divisions du noyau
(caryogénèse) mais pas de division cellulaire (cytokinèse) (Ageeva et al., 2005).
La cellule résultant est de type coenocytique (avec plusieurs noyaux).
Dans les deux cas, les divisions restent coordonnées mais c’est la mise en place de
la paroi qui change. Dans le cas d’une fusion des cellules, la mise en place des fibres est
orientée mais isotrope, c’est-à-dire que les cellules fusionnent sans tenir compte de leur
position dans la tige (basale ou apicale). Alors que dans le second cas, le développement
des fibres est orienté dans l‘axe de la tige mais anisotrope, la croissance cellulaire est
orientée au niveau apical (croissance par l’une des extrémités de la cellule).
Ces deux modèles peuvent coexister pour une compréhension globale du
phénomène. La croissance coordonnée résulte alors de divisions cellulaires non complètes,
la cytokinèse totale ne se faisant pas (Ageeva et al., 2005). Les divisions se réalisent de
manière orientée, vers le haut. Les cellules partagent leur cytoplasme par les plasmodesmes
présents sur les septa. La dissolution des septa se fait ensuite, au deuxième stade de la
formation des fibres appelé croissance intrusive.
34
Figure 16. A gauche croissance diffusive anisotrope et isotrope, à droite croissance apicale extrusive
(Albersheim et al., 2010).
Chez le lin, la croissance coordonnée est décrite comme la première étape de
formation des fibres qui dure quelques heures et ce stade est notamment caractérisé par la
présence de plasmodesmes (Tableau 4) (Ageeva et al., 2005). Ensuite, l’isolement
symplasmique des fibres s’opère pendant la croissance intrusive (Figure 15 (c), (d)). Cette
croissance nécessite un ajustement intercellulaire pour permettre l’élongation cellulaire.
5.3. La croissance intrusive
Deux modes d’expansion cellulaire sont décrits avec la croissance apicale d’une part
et diffusive d’autre part. La croissance apicale ne concerne que peu de types cellulaires
(tubes polliniques et poils absorbants), elle est aussi appelée croissance extrusive ce qui
souligne que, dans ce cas, l’expansion cellulaire saillit à l’extérieur sans s’introduire entre les
types cellulaires voisins. La croissance diffusive peut être isotrope ou anisotrope (Figure 16).
La croissance intrusive est définie comme étant un type d’élongation cellulaire avec
un taux de croissance longitudinale plus élevé que la croissance des cellules environnantes.
Ces cellules doivent donc s’insérer entre les cellules voisines au niveau de la lamelle
moyenne (Chernova et al., 2007 ; Snegireva et al., 2010). La croissance intrusive commence
35
avant la fin de la croissance coordonnée des cellules périphériques (Ageeva et al., 2005) et
peut être de deux types : apical ou diffusif (Figure 15 (c),(d), Figure 16). Quelque soit le
type de croissance intrusive, l’intrusion des pointes cellulaires se fait à travers la lamelle
moyenne. Cette croissance est qualifiée d’intercalaire et explique l’apparition de genoux sur
les fibres (Chernova et al., 2007 ; Snegireva et al., 2010).
Les études menées sur le lin sont plutôt en faveur d’une croissance intrusive diffusive
car les arguments en faveur de croissance intrusive apicale n’ont pas été trouvés. En effet,
les études ultrastructurales ne montrent pas de distribution particulière d’organites aux
pointes des cellules ce qui est un premier critère de la croissance apicale (Chernova et
Gorshkova, 2007). Par ailleurs, le cytosquelette s’agence de façon hélicoïdale puis
transverse à l’extrémité des pointes, ce qui est différent de l’arrangement longitudinal
observable sur les types cellulaires à croissance apicale (Chernova et Gorshkova, 2007). La
prise en compte de ces données étaye donc le modèle (d) de la Figure 15, celui de la
croissance intrusive diffusive.
La durée de cette étape de croissance intrusive n’est pas clairement définie. Il
apparaît toutefois que pour atteindre des longueurs de plusieurs centimètres, la croissance
intrusive doit durer plusieurs semaines (Tableau 4). Un autre point de discussion concerne la
maturation des fibres. Il convient de savoir si l’épaississement pariétal est réalisé
simultanément pendant la croissance intrusive ou si ces deux phénomènes sont séparés
dans le temps. Les travaux antérieurs d’Esau (citée dans Evert, 2006) sont plutôt en faveur
d’une croissance synchronisée avec les dépôts pariétaux (Figure 15, (c)) et cette hypothèse
est très répandue. Néanmoins des travaux récents sur le lin contredisent cette hypothèse
(Chernova et Gorshkova, 2007).
36
Figure 17. Quelques caractéristiques de la croissance intrusive des fibres primaires chez le lin (Snegireva
et al., 2010).
(a) la plante pendant la période de croissance rapide, l’état des fibres aux différentes étapes de
développement est indiqué ; (b) le schéma d’une section longitudinale de la partie apicale de la tige
illustre l’initiation de la croissance intrusive avec l’indication des stades symplasmiques et intrusifs de la
croissance ; (c) schéma de l’augmentation apparente du nombre de fibres sur des sections transversales
de tige et de l’augmentation de la longueur de chaque fibre (le nombre de fibres du segment étant
constant) qui résultent de la croissance intrusive........................................................................................
En effet, chez le lin, un point clé (« snap point ») a été mis en évidence, il
correspond au point de la tige au niveau duquel il n’est plus aisé de rompre la tige
(Gorshkova et al., 2003). Localisé entre 5 et 7 cm à partir de l’apex des tiges de lin, ce point
sépare les fibres situées en dessous, devenues robustes, des fibres situées au dessus,
considérées comme plus fragiles car elles sont plus jeunes (point de rupture) (Figure 17 (a)).
Du haut de la plante jusqu’au « snap point » il y a élongation des fibres, alors que sous ce
point, les fibres ont fini leur élongation et présentent un épaississement de la paroi. En effet,
l’étude du nombre de fibres de lin en section transversale le long de la tige montre que le
nombre de fibres visibles augmente, du fait de l’élongation des fibres, seulement au dessus
37
du point clé et non en dessous, ce qui aurait pu être le cas si la croissance intrusive et
l’épaississement pariétal étaient simultanés (Chernova et Gorshkova, 2007). Les deux
évènements semblent donc séparés dans le temps (Figure 17). Chez le chanvre,
l’épaississement pariétal uniforme a été mis en évidence sur la cellule dans toute sa
longueur, excluant les pointes fines des fibres observables pendant leur élongation
(Snegireva et al., 2010).
5.4. La maturation des fibres et la sénescence
La croissance des cellules végétales est particulière du fait de la contrainte pariétale.
En effet, entourée de paroi primaire, les cellules jeunes subissent des modifications de leur
forme au cours de leur différenciation. La croissance cellulaire est dépendante de la
composition des parois, mais aussi de leur remodelage pour donner la forme définitive aux
cellules. Dans le cas des fibres longues, la différenciation perdure de la maturation à la
sénescence. Les composés pariétaux sont décrits dans le § paroi pour l’aide à la
compréhension.
La maturation des fibres consiste notamment en un épaississement pariétal. Chez le
lin, la maturation des fibres intervient en dessous du « snap point » (Gorshkova et al., 2003).
Des dépôts successifs de microfibrilles de cellulose orientées différemment forment des
strates (S1, S2, S3) (Figure 19). La Figure 20 montre que la cellulose est principalement
présente dans les parois primaire et secondaire. L’orientation des microfibrilles de cellulose
impacte le comportement mécanique des fibres et permet de les séparer en deux grands
groupes (Chernova et Gorshkova, 2007). Le premier groupe inclut les fibres avec des
microfibrilles orientées de manière hélicoïdale, un taux élevé de xylane dans les matrices
non cellulosiques et un fort degré de lignification, c’est typiquement le cas des cellules du
bois. Dans le deuxième groupe sont présentes des cellules dont la paroi cellulaire très
épaisse est constituée par des microfibrilles de cellulose avec une orientation axiale. Les
matrices polysaccharidiques de ce type de fibres contiennent beaucoup de polymères riches
en galactose (Chernova et Gorshkova, 2007). Ce deuxième groupe de fibres correspond aux
fibres gélatineuses (Evert, 2006) ; les fibres de lin et de chanvre sont répertoriées comme
appartenant à ce groupe.
Après la mise en place de la paroi secondaire, les cellules meurent ; c’est le stade
final de la différenciation des fibres. Cela correspond à la sénescence qui s’accompagne
d’une mort cellulaire programmée. Au stade de la maturation des fibres, des cytoségrosomes
ont été observés dans le cytoplasme. Ces cytoségrosomes correspondent à des structures
vacuolaires autolytiques, signe de la fin de vie programmée de ces cellules (Chernova et
38
Gorshkova, 2007). Chez le chanvre, le principal indicateur de la maturation des fibres réside
dans la baisse de la teneur en protéines pariétales (Crônier et al., 2005). Chez le lin, un
complexe pectique soluble riche en galactose au niveau du « snap point » semble lié avec la
synthèse de la couche S1. L’hypothèse est que ce complexe polysaccharidique favoriserait
l’orientation unidirectionnelle des microfibrilles de cellulose (Gorshkova et Morvan, 2006).
Les parois secondaires sont aussi caractérisées par leur composition en lignines
(composant majeur des parois secondaires) (Carpita et Mac Cann, 2000). Mais il est
rapporté que les fibres longues de chanvre, comme les fibres de lin, seraient pauvres en
lignines (environ 4%) et seraient de nature essentiellement cellulosique. La faible teneur en
lignines est détectée dès les stades végétatifs et ne présente pas de variation significative
quantitative au cours du développement. Il semblerait toutefois que des modifications
qualitatives des lignines soient possibles (Crônier et al., 2005).
Figure 18. Répartition de la cellulose et des lignines en pourcentage de matière sèche dans la paroi de
deux fibres adjacentes. (P2 : paroi secondaire, P1 : paroi primaire, lm : lamelle moyenne) (Robert et
Roland, 1998, cités dans Reis et al., 2006).
39
Figure 19. Architecture des parois de cellules fibreuses d’après Brett, C. Waldron K. (1996) cité dans le
chanvre industriel (Bouloc, 2006). La cellule fibreuse mature est une cellule morte avec une paroi
secondaire épaisse qui se décompose en trois couches (S1, S2, S3) avec des orientations différentes de
microfibrilles de cellulose ce qui confère la résistance des fibres.
6. La paroi végétale : constituants et organisation
Les parois sont formées de trois couches concentriques ; la lamelle moyenne, la
paroi primaire et la paroi secondaire. La lamelle moyenne, partie la plus externe de la paroi,
est commune à deux cellules voisines. Elle est particulièrement riche en pectines et plus
particulièrement en homogalacturonanes (Carpita et Mc Cann, 2000). La paroi primaire est
classiquement fine (1 à 3 μm d’épaisseur), souple et fortement hydrophile. Elle caractérise
les cellules jeunes et parenchymateuses et permet l’expansion cellulaire grâce à ses
propriétés de plasticité. La paroi secondaire est synthétisée lorsque les cellules ont achevé
leur croissance et atteint le stade final de différenciation. Elle présente généralement une
résistance mécanique importante (Cosgrove, 2005 ; Gorshkova et al., 2010).
Les
parois
sont
composées
principalement
de
polysaccharides
(cellulose,
hémicelluloses et pectines), de composés phénoliques (lignines) mais aussi de protéines
structurales. Les propriétés fonctionnelles des parois dépendent de la structure des
polymères constitutifs et de leur assemblage (Figure 20).
6.1. Les polysaccharides : constituants majoritaires pariétaux
Ils sont constitués d’enchaînements linéaires ou ramifiés d’hexoses, de pentoses,
d’acides hexuroniques et de désoxyhexoses. Une attention particulière est portée à la
description des pectines pour leurs rôles dans l’adhésion cellulaire et, a fortiori, dans la
cohérence des massifs de fibres longues.
40
Figure 20. Modèle de la paroi primaire d’une cellule de Dicotylédone avec les réseaux enchevêtrés des
composés pariétaux. (Cellulose, hémicelluloses, pectines et protéines structurales) (Mc Cann et Roberts,
1994)
6.1.1. Les pectines
Les pectines sont des polysaccharides complexes présents dans la lamelle moyenne
et la paroi primaire des Dicotylédones. Ce sont des hétéropolysaccharides caractérisés par
la présence d’acide α-D-galacturonique. Les pectines sont composées de zones lisses
composées par les homogalacturonanes (HG) et de zones rugueuses composées de
rhamnogalacturonanes de type I et II (RGI et RGII). Les rhamnogalacturonanes de type I
sont composés d’une chaîne de disaccharides comportant du rhamnose et des acides
galacturoniques, α-D-Rha- (1→4) α-D-GalA. Ces RGI portent des chaînes latérales riches en
unités arabinose et galactose (Figure 21). Les RGII sont des HG complexes qui ont la
particularité de se dimériser grâce aux ions bores par l’intermédiaire des résidus apioses.
41
Figure 21. Composés pectiques.
Les monomères constitutifs sont à gauche séparés en monomères d’oses neutres et d’acides uroniques.
A droite, la diversité des polymères pectiques (Sarkar et al., 2009).
Les HG sont des homopolymères constitués d’un enchaînement linéaire d’acides αD-galacturoniques d’une longueur pouvant atteindre 100 à 200 résidus. Les groupes
carboxyliques sont en partie estérifiés par du méthanol (Figure 22). Le degré de méthylation
des pectines est défini comme étant la proportion d’acides galacturoniques méthyl-estérifiés
pour 100 acides galacturoniques totaux. Les pectines natives sont en général fortement
méthylestérifiées (avec un Degré de Méthylation, DM supérieur à 50) et sont ensuite
déméthylées par des PME (Pectine MéthylEstérases), enzymes pariétales.
Les HG des fibres de chanvre ont été étudiés par immunomarquage avec des
anticorps (Ac) spécifiques de motifs HG partiellement méthylés. En effet, l’Ac Jim7 reconnaît
des pectines HG partiellement méthylestérifiés avec 15<DM<80, Jim5 se fixe sur des HG
partiellement méthylestérifiés avec un DM autour de 40 et PAM1 reconnaît les dimères d’HG
liés entre eux par le calcium (Figure 22, Blake et al., 2008). Il apparaît que JIM7 marque très
faiblement les fibres de chanvre alors que JIM5 marque la paroi primaire des fibres et le tour
intérieur de la paroi secondaire qui délimite le lumen.
42
Figure 22. Immunolocalisation des épitopes homogalacturonanes pectiques en relation avec les fibres
longues de chanvre (Blake et al., 2008). a. Coupe transversale d’une région de jeune tige de chanvre de 60
jours qui montre les massifs collenchymateux (cl), le parenchyme et les cellules associées aux vaisseaux
du xylème qui fixent l’Ac monoclonal JIM 7. Les fibres en développement (flèche) sont faiblement
marquées. b. Coupe transversale équivalente à a. marquée par JIM5. c. Coupe transversale équivalente à
a. marquée par PAM1. d. Coupe transversale de bas de tige de chanvre marquée par JIM7 et colorée avec
du
Calcofluor
(bleu)
qui
montre
la
présence
de
l’épaisse
paroi
secondaire.
Les
cellules
parenchymateuses qui adhèrent aux fibres sont marquées par l’Ac JIM7 (flèches). e. Fibres matures
marquées par JIM7 et colorée au Calcofluor montrant la présence de l’épitope HG entre les fibres
(flèches). f. Coupe transervale équivalente à e. immunomarquée par JIM5. (e : épiderme, cl : collenchyme,
x : xylème, f : fibre, p : cellule parenchymateuse) Echelles 100 μm (a, b, c) et 20 μm (e,
f)..................................................................................
43
6.1.2. Les hémicelluloses
Les hémicelluloses sont des polymères hétérogènes constitués d’oses neutres
(xylose, mannose, galactose, glucose…) et d’acides (acides glucuroniques, acide 4-Ométhyl-glucuronique). Le squelette hémicellulosique peut être constitué d’une unité répétitive
(xylanes,
mannanes,
xyloglucanes)
ou
de
deux
ou
plusieurs
unités
différentes
(galacto/glucomannanes). Les hémicelluloses sont souvent partiellement acétylestérifiées
(Figure 23).
9 Les xyloglucanes, sont constitués d’un squelette de résidus β-D-glucopyranose
liés en (1→ 4) et décorés par des résidus xylose. Le xylose lié en O-6 du
glucose peut porter des résidus galactose, ou de courtes chaînes composées de
galactose et de fucose (fucogalactoxyloglucanes).
9 Les xylanes, nom générique pour une série de polymères ayant en commun un
squelette de résidus β- D-xylose liés en (1→ 4), ont comme constituants latéraux
les
plus
fréquents
de
l’acide
glucuronique
ou
de
l’arabinose
(glucuronoarabinoxylane). De plus, les xylanes peuvent être acétylés. Chez les
Dicotylédones, les xylanes sont principalement associés aux parois secondaires,
mais seraient absents des parois des fibres de lin et de chanvre (Knox et al.,
2008).
9 Les glucomannanes sont des polymères rencontrés dans les parois primaires et
secondaires. Ils consistent en un squelette de β-D-glucose et β-D- mannose liés
en (1→ 4). Des unités galactoses peuvent se brancher aux résidus mannose.
Des travaux récents ont aussi démontré un dépôt accentué de ces
galactoglucomannanes dans les fibres de chanvre déjà épaissies (Crônier et al.,
2005).
44
Figure 23. Les hémicelluloses sont des polymères hétérogènes constitués à partir des monomères d’ose
neutres représentés à gauche sur la figure. Les chaînes principales hémicellulosiques sont les chaînes
de xyloglucanes consistant en un polymère de glucose liés en β 1-4 avec environ 75% des résidus β-D
glucose substitué par des résidus Į-D- xylose (Sarkar et al., 2009).
6.1.3. La cellulose
La cellulose est le polysaccharide le plus abondant chez les végétaux et, à ce titre, le puits
de carbone majeur de la planète. Les rendements du chanvre sont estimés à 1012 t de
cellulose synthétisée par an ! (Struik et al., 2000). La cellulose représente 70 à 80% des
parois des fibres phloémiennes de chanvre (Crônier et al., 2005). C’est un homopolymère
linéaire de β- (1→ 4) D-glucose avec un degré de polymérisation (DP) pouvant atteindre
plusieurs milliers selon les espèces végétales ! (Figure 24) Les parois primaires ont un DP
de cellulose compris entre 250 et 500 jusqu’à 2500-4000 en fonction des variétés alors que
le DP est de 10 000 à 15 000 pour les parois secondaires (Albersheim et al., 2010). Les
groupements hydroxyles libres des chaînes glycosidiques peuvent former des liaisons
hydrogène inter et intra-moléculaires, ce qui favorise l’organisation en structure
microfibrillaire de la cellulose (Figure 24). Les microfibrilles de cellulose peuvent être plus ou
moins compactées grâce aux liaisons hydrogènes pour former la cellulose cristalline ou
amorphe. Les fibres longues de chanvre présentent entre 53% (Bonatti et al., 2004) et 8189% de cristallinité (Reddy et Yang, 2009) ce qui confère des propriétés de résistance
mécanique à la paroi.
45
Figure 24. La cellulose est un homopolymère de glucoses liés en β 1-4, le dimère de base est le
cellobiose.
Les molécules de glucose forment des chaînes pouvant atteindre plusieurs milliers de degrés de
polymérisation. Ces chaînes se lient entre elles par des liaisons hydrogènes pour former les
microfibrilles de cellulose (Sarkar et al., 2009).
6.1.4. Les polyphénols
Les lignines sont classées parmi les polyphénols, le motif de base des lignines étant
de type phényl-propane (C6-C3). Trois dérivés de ce type constituent les monomères des
lignines ou monolignols. Hydroxylés en C4, ils diffèrent par leur degré de méthylation. On
distingue l’alcool coumarylique (H), sans substitution méthyle, l’alcool coniférylique avec une
substitution méthyle sur le carbone 3 (appelé cycle G pour Gaiacyl) et l’alcool sinapylique
comptant deux substitutions méthyle sur les carbones 3 et 5 (appelé cycle S pour Syringyl).
La polymérisation des trois monolignols construit un réseau tridimensionnel amorphe et infini
qui va incruster la matière pariétale. C’est un intraréseau hétérogène présentant des liaisons
covalentes entre les monolignols de type éther et carbone/carbone. Le réseau peut être plus
ou moins condensé en fonction des carbones impliqués dans les liaisons (carbones des
cycles aromatiques ou non).
Les fibres longues de chanvre sont riches en unités gaiacyl et syringuyl et le ratio
S/G reste constant voire décroît au cours de la maturation (Crônier et al., 2005). Des unités
H sont décrites aussi chez le chanvre. Ces unités H sont aussi présentes chez le lin et elles
sont retrouvées fréquemment chez des Dicotylédones annuelles (Crônier et al., 2005). Ces
lignines sont principalement localisées au niveau de la lamelle moyenne chez le chanvre.
....
46
Figure 25. Les lignines des Dicotylédones.
Le motif de base des lignines est de type phénylpropane (C6-C3) avec un noyau aromatique à 6 carbones
et une chaîne propane à 3 carbones. Deux dérivés de ce type constituent les monolignols ou monomères
des lignines chez les dicotylédones : l’alcool coniférylique avec une substitution méthyle sur le carbone 3
(cycle G ou gaiacyl), et l’alcool sinapylique avec deux substitutions méthyles sur les carbones 3 et 5
(cycle S ou syringyl) (à gauche sur la figure (Sarkar et al., 2009).
6.2. Les protéines structurales des parois
Bien que la structure du réseau pariétal soit essentiellement polysaccharidique, des
protéines structurales sont présentes.
Quatre classes de protéines structurales sont distinguées. Les trois premières
classes de protéines sont nommées conformément à leur acide aminé majoritaire : les
glycoprotéines riches en hydroxyprolines (HRGP), parmi lesquelles l’extensine qui est la plus
étudiée, les protéines riches en proline (PRP) et les protéines riches en glycines (GRP).
La quatrième classe majeure des protéines structurales sont les arabinogalactanes
protéines (AGP) nommées protéoglycanes car elles contiennent jusque 95% de
polysaccharides (Carpita et Mc Cann, 2000). Les AGP peuvent être solubles ou liées à la
membrane plasmique grâce à une ancre GPI (Albersheim et al., 2010).
6.3. Interactions entre les constituants
Les interactions entre les polymères polysaccharidiques pariétaux s’établissent par
différents types de liaisons : liaisons covalentes (glycosidiques, esters), liaisons ioniques
(pont calcium) et les liaisons hydrogène (Figures 20 et 25).
47
6.3.1. Interaction cellulose/hémicelluloses
Dans les parois primaires, les xyloglucanes (hémicelluloses) établissent des liaisons
hydrogène avec de nombreuses microfibrilles de cellulose. Les interactions dépendent du
degré de cristallinité des microfibrilles de cellulose, du poids moléculaire des xyloglucanes et
sont favorisées par les chaînes latérales galactanes (Gorshkova et al., 2010). Une chaîne de
xyloglucane est assez longue pour ponter deux microfibrilles (Figure 26).
Un premier domaine s’aligne sur les microfibrilles de cellulose alors qu’un second
domaine contribuerait à maintenir écartées deux microfibrilles, empêchant ainsi leur
association.
Figure 26. Réseau cellulose / hémicelluloses des parois primaires (Albserheim et al., 2010).
Ce schéma d’une section de paroi primaire représente les interactions hydrogènes entre les microfibrilles
de cellulose orientées et les hémicelluloses qui se fixent à leur surface en maintenant écartées deux
microfibrilles.
6.3.2. Interactions pectines/pectines et pectines/cellulose
Parmi les types d’associations décrites entre pectines, ceux impliquant les
homogalacturonanes et les ions calcium sont le plus souvent mentionnés. Des blocs de
résidus d’acide galacturonique non méthylés ont la capacité de former des ponts calciques
conduisant à la dimérisation des homogalacturonanes. La présence de substituants,
48
groupements acétyles ou résidus xyloses sur le squelette homogalacturonane, en raison de
leur encombrement stérique, empêche le rapprochement des homogalacturonanes et leur
dimérisation par le calcium (Figure 27).
Des liaisons hydrogène peuvent s’établir entre une fraction des chaînes latérales
pectiques arabinanes et galactanes et la cellulose (Zykwinska et al., 2005, 2006).
Figure 27. Le réseau pectique contenu entre deux parois primaires et la lamelle moyenne (Albersheim et
al., 2010).
La lamelle moyenne est principalement riche en homogalacturonannes (HG) démethylés et
assemblés en dimère par l’intermédiaire des ions calcium (« egg box ») qui forme un ciment
hydraté adhésif entre deux cellules voisines.
Le réseau pectique au sein des parois est probablement ancré aux membranes plasmiques
par des Wall Associated Kinase (WAK protein). Le réseau pectique est constitué de zones
homogalaturonannes lisses et estérifiées, de zones rhamnogalacturonnanes branchées de
type I et II. Les rhamnogalacturonnanes de type II peuvent se complexer par des liaisons
borates diester.
6.3.3. Interactions polysaccharides/protéines
De nombreux types d’interaction peuvent exister entre protéines et polysaccharides.
Le réseau protéique peut être associé aux polysaccharides par un enchevêtrement physique.
49
Des interactions entre les chaînes homogalacturonanes des pectines et les protéines
majoritaires ont été montrées (Zykwinska et al., 2007). Les pectines joueraient alors un rôle
de « scotch double face » en reliant les protéines d’un côté sur leur zone lisse et la cellulose
grâce aux chaînes latérales arabinanes et galactanes de l’autre côté. Des liaisons ioniques
ont été montrées entre lysine et histidine chargées positivement et pectines chargées
négativement (Fry, 1986). De telles interactions seraient régulées par le pH et la présence
d’ions calcium.
Dans le modèle de paroi primaire proposé par Mc Cann et Roberts en 1997 (Figure
20) où trois réseaux de polymères s’interpénètrent : le réseau cellulose/hémicelluloses
impliqué dans la rigidité des parois est enchâssé dans un réseau pectique constituant une
matrice amorphe. Cette matrice serait impliquée dans le contrôle de la porosité des parois et
des mouvements de fluides et des ions. Le troisième réseau est constitué par les protéines
structurales. Il interviendrait dans le renforcement des propriétés mécaniques de la paroi.
6.3.4. Interactions lignines/cellulose
L’interaction du réseau des lignines avec la matrice polysaccharidique résulte de
liaisons non-covalentes (complexes) mais surtout de liaisons covalentes grâce aux
propriétés réactionnelles des groupements hydroxyles et carbonyles des monomères
polyphénoliques. Le matériau ligno-cellulosique résultant peut être comparable à un béton
armé, la concentration maximale de ce renfort se trouvant dans la lamelle moyenne et la
paroi primaire, zone de cohésion entre deux fibres (Figure 18).
6.3.5. Interactions lignines/hémicelluloses
Des interactions entre les lignines riches en unités syringuyls et des hétéroxylanes
ont été mises en évidence chez le maïs (Lapierre et al., 2001). La gélification de ces
hétéroxylanes nécessiterait, en plus des acides féruliques, la présence de lignines soulignant
la possibilité de liaisons covalentes entre ces composés.
Les relations entre les différents constituants de la paroi sont complexes et sont
variables en fonction des différents types cellulaires. Les différents assemblages des
polymères pariétaux conditionnent le comportement mécanique des cellules mais aussi leur
sensibilité à la dégradation qu’elles soient mécaniques ou chimiques (Booth et al., 2004 ;
McCann et Carpita, 2008)
50
7. Rouissage
Le procédé de rouissage utilisé pour l’extraction des fibres longues résulte de la
séparation des massifs de fibres des autres types cellulaires non fibreux grâce à la digestion
des cellules vivantes par les microorganismes. Le rouissage consiste en une dégradation
des composés hydrosolubles des parois par les enzymes microbiennes et fongiques. Les
pectinases agissent sur les substances pectiques, retrouvées principalement au niveau de la
lamelle moyenne et la paroi primaire. C’est principalement leur action qui lors du rouissage
(Yadav et al., 2009) permet la séparation des fibres longues de la chènevotte et, plus
finement, la séparation des fibres unitaires (Saleem et al., 2008). D’autres méthodes de
séparation mécanique des fibres longues ont été testées (Hobson et al., 2001) et comparées
aux fibres rouies. Ces fibres séparées mécaniquement seraient utilisables pour des
utilisations composites et papetières.
51
Objectifs de la thèse
Pour caractériser les fibres phloémiennes de chanvre, deux axes d’études ont été
choisis. Il s’agit d’une part de réaliser l’étude histologique des fibres de la plante pour
déterminer leur proportion au sein de la tige en fonction du stade de maturité, selon les
variétés et les modes de culture (champs, serre, irrigués ou non) et en fonction du niveau de
prélèvement dans la plante (bas, milieu, haut). D’autre part, il s’agit de caractériser les fibres
biochimiquement, via des études de spectroscopie infrarouge comme l’Attenuated Total
Reflectance (ATR) (Mohebby, 2008), puis par des méthodes classiques de fractionnement
de la biomasse ligno-cellulosique (Van Soest, 1967). L’existence de relations entre ces deux
axes pourra être étudiée en érigeant une cartographie chimique de la distribution des
principaux composés pariétaux sur coupes transversales d’échantillon de fibres de chanvre
par la méthode de microspectrométrie Infra-Rouge à Transformée de Fourrier (FT-IR)
(Figure 28).
Figure 28. Présentation des axes de recherche des travaux de thèse.
Les variétés de plante étudiées sont Félina 32 et Santhica 27 cultivées en serre et en champ. Le plan
d’échantillonnage concerne différents niveaux de la tige (bas et milieu).
52
53
ƒ–±”‹‡Ž
1
1.1
Matériel végétal
Les semences
Les semences de chanvre proviennent de la Coopérative Centrale des Producteurs
de Semences de Chanvre (CCPSC, Le Mans) qui est le multiplicateur exclusif des variétés
disponibles à la FNPC. La sélection a conduit à des variétés de type « populations »,
principalement monoïques (Tableau 5). Une population est un ensemble d’individus de la
même espèce capable de se reproduire entre eux par la voie sexuée. Les variétés
« populations » sont obtenues par la multiplication en masse d’une population artificielle. Ces
populations sont en principe bien adaptées et stables dans leur milieu (FNPC).
Les variétés « populations » de chanvre sont déclinées en fonction de leur précocité
variétale définie par le stade pleine floraison (§ Introduction bibliographique). Ce stade est
une caractéristique de la variété et sa date fixe peut-être déterminée à une latitude donnée
(tardivité ou précocité de la variété).
La croissance végétative se termine à la fin de la floraison, qui a lieu généralement
une semaine après le stade pleine floraison d’après la classification FNPC. Les plantes
fleurissent en jours courts, les chanvres sont parmi les plantes nyctopériodiques. Les
rendements de la plante sont donc déterminés par la latitude de semis. En effet, comme
durant l’été les jours sont plus courts au sud qu’au nord, une variété apparaîtra plus précoce
au sud (Bouloc, 2006, FNPC, Communication orale 2010, Legros, ITC).
Parmi les 8 variétés couramment proposées et employées par la FNPC, le choix
d’étude s’est principalement porté sur une variété du fait de son origine « population ».
Comme mentionné en introduction, la variabilité intra-variété est probablement plus forte que
la variabilité inter-variété du fait du mode de sélection des plantes. Pour l’évaluation de ce
polymorphisme intra-variétal, il est plus judicieux de se focaliser sur une variété. Dans le
cadre des travaux, la Félina 32 a été l’objet principal de la caractérisation, cette variété étant
la seule à avoir été cultivée lors des tests en champs. Cependant, quelques travaux ont été
réalisés sur la variété Santhica 27, cultivée en serre uniquement.
Cultivées sous serres, les deux variétés de chanvre (Cannabis sativa) utilisées sont :
la variété Félina 32 (THC = 0,06 %) et la variété Santhica 27 (THC < 0,001 %)
54
Le tableau 5 rassemble les données de la littérature correspondant aux deux variétés
utilisées.
Tableau 5. Récapitulatif des variétés populations de chanvre utilisées (FNPC, ITC, 2002, 2003)
Variétés
Sexualité
Précocité
Rendement
Taux de fibres (%)
paille (t/ha)
Rendement
graines (qx/ha)
moyenne
Félina 32
monoïque
4 août (semis 15
5,8 à 9,6
30,6 à 51,9
9,2 à 11,6
6,5 à 9,3
34,6 à 52,60
6 à 7,7
avril au Mans)
moyenne
Santhica 27
monoïque
6 août (semis 15
avril au Mans)
La variété Félina 32 a été choisie car elle correspond à la variété la plus employée
parmi les chanvriculteurs de la Vienne. La variété Santhica 27 est la seule variété
pratiquement sans THC, son taux très faible témoigne de la sensibilité des dosages du THC.
Cette variété a été étudiée en serre avec la Félina 32 notamment pour l’évaluation d’un
déficit hydrique sur la croissance des chanvres.
1.2
Semis en serre
Les semis sont effectués en déposant les graines sur le terreau humide. Le semis est
ensuite recouvert de 1 à 2 cm de terreau pour favoriser la germination.
Après germination des graines, les plantes sont rempotées dans des pots de 3 litres
puis un deuxième rempotage s’effectue à deux mois dans des pots de 7 litres. Le terreau
utilisé est classique de marque TREF et est considéré comme suffisant en apport de
nutriments essentiels pour le développement de la plante durant les trois premières
semaines d’utilisation. Ensuite un apport d’engrais exogène est préconisé. L’engrais utilisé
est le PETERS à 1g.l-1 qui contient de l’azote à 20% (N : dont 5,6% d’azote nitrique, 4%
d’azote ammoniacal et 10,4% d’azote uréique), du phosphate à 20% (P sous forme
d’anhydride phosphorique (P2O5) et 20% d’oxide de potassium (K2O). Des oligoéléments
sont aussi apportés par le PETERS dont le Bore (B à 0,01%), le Cuivre (Cu à 0,004%), le
55
Fer (Fe à 0,05%), le Manganèse (Mn à 0,03%), le Molybdène (Mo à 0,001%) et le Zinc (Zn à
0,003%). Les éléments Cu, Fe, Mn, Mo et Zn sont présents dans l’engrais sous forme
chélatée par de l’EDTA. Le terreau est soit employé brut (sans tamisage préalable) ou après
ajout de vermiculite si le terreau initial était tamisé, afin d’offrir un support d’ancrage suffisant
aux systèmes racinaires des plantes.
Les conditions de culture dans la serre ont été maintenues pendant toute la période
de croissance des plantes avec des températures de 24 °C ± 4°C le jour et 18 °C ± 2°C la
nuit, avec une photopériode de 14 h de jour et 10 h de nuit. Ces conditions favorisent la
croissance végétative des plantes mais retardent la floraison.
Différents semis ont été réalisés durant le temps des travaux de thèse. Les premiers
semis ont permis une familiarisation avec la plante mais n’ont pas été exploités. D’autres
semis ont été menés pour évaluer l’impact de l’apport d’eau et de la densité de semis sur la
croissance des fibres longues de chanvre.
1.2.1
Application d’un stress hydrique
Un semis des deux variétés Félina 32 et Santhica 27 a été effectué de façon à
évaluer l’impact d’un déficit hydrique. Le semis a été lancé le 6/12/07. Après germination des
graines, les plantes sont rempotées dans des pots de 5L (17/12/07) puis un deuxième
rempotage s’effectue à deux mois (19 /02/08) dans des pots de 50L.
A partir du 14/01/08, une partie des plants a été placée en déficit hydrique, c’est-àdire que la moitié des pieds ne fut pas ou très peu arrosée. L’apport d’eau était alors défini
quant il était observé un léger flétrissement des feuilles. Les autres pieds ont été alimentés
en eau plus régulièrement avec en moyenne des apports en eau de 1L par semaine.
L’apport d’eau pour les plantes testées en déficit hydrique fut environ deux fois
moindre que pour les témoins irrigués normalement. Ces plantes ont fait l’objet de mesures
et de prélèvements (§ préparation des échantillons en microscopie) pour une collaboration
avec le LMPM afin de jauger l’influence de l’irrigation des plantes sur la morphologie des
fibres et leur comportement mécanique.
1.2.2
Test de densité de semis en serre
Des tests de densité de semis ont été réalisés sur la variété Félina 32 semée aussi
en champ. Le semis densité en serre a été mené en parallèle de la campagne 2009 testant
l’influence de l’azote vs densité sur la culture des plantes en champ (§ culture en champ). Le
56
semis en serre a été décalé, de celui au champ, de dix jours pour mieux permettre le suivi à
la récolte (semis du 20/04/2009 au 20/08/2009).
Les densités semis testées correspondent aux densités testées en champ de 25, 50
et 75 kg/ha. Pour « simplifier » le calcul de la densité de semis, seule l’aire de la surface à
semer est considérée. Le calcul de la surface du pot est réalisé pour obtenir la quantité en
gramme de graines correspondante à chacune des densités de semis envisagée. Il est à
noter que la profondeur des pots n’a pas été prise en compte.
Surface du pot = πr2 = π ∗ 0,2² = 0,125 m²
•
Pour 25 kg / ha : 0,125 * 25 / 10 000 = 0,3125 g
•
Pour 50 kg / ha : 0,125 * 50 / 10 000 = 0,625 g
•
Pour 75 kg / ha : 0,125 * 75 / 10 000 = 0,9375 g
7,5 g § 450 graines
•
Pour 25 kg / ha : 0,3125 * 450 / 7,5 § 19 graines / pot
•
Pour 50 kg / ha : 0,625 * 450 / 7,5 § 38 graines / pot
•
Pour 75 kg / ha : 0,9375 * 450 / 7,5 § 57 graines / pot
Suites aux pesées, deux pots par densité ont été semés (Tableau 6). Il est à noter
que les graines ne sont parfaitement homogènes en poids, ce qui explique les différences
entre les deux pots à chaque densité évaluée. Les 6 pots ont été semés de façon la plus
homogène possible. Les graines ont été posées à la surface du pot et ont été recouvertes
d’une fine couche de terreau pour favoriser leur imbibition et a fortiori leur germination. Les
plantes sont irriguées en mode automatique les premiers temps de la levée. Des petites
buses peuvent être placées en terre sur tout le pot pour favoriser un arrosage homogène
sans risquer de blesser les plantules aux premiers stades du développement. Après la levée,
au bout d’une dizaine de jours, l’apport d’engrais est assuré afin de favoriser l’élongation des
tiges.
Tableau 6. Nombre de graines par pot des tests semis densités. (M. DERET, 2010)
Félina 32 – pot 1
Félina 32 – pot 2
25 kg / ha
0,3140 g = 19 graines
0,3050 g = 20 graines
50 kg / ha
0,6354 g = 39 graines
0,6300 g = 43 graines
75 kg / ha
0,9460 g = 61 graines
0,9430 g = 63 graines
57
1.3
Culture en champs
Les essais de culture en champs ont été menés grâce à la collaboration avec des
chanvriculteurs régionaux (M. Michaud, EcoChanvre 86). Les chanvriculteurs ayant pour
habitude de cultiver la variété Félina 32, c’est cette variété qui a été semée par leur soin
dans les parcelles testées. L’ensemble de l’itinéraire cultural a été conduit par les
collaborateurs agricoles (préparation du sol, épandages et semis).
Des tests de densité de semis et d’apport azoté ont été menés. L’influence de la
densité de semis sur les rendements a été étudiée (Amaducci et al., 2008) avec des
populations de plante de 120, 240 et 360 plantes par m2 mais sur de petites surfaces de
moins de 100 m2 ce qui peut impacter la croissance des plantes par effet de bord. Dans le
cadre de nos travaux, les essais ont été implantés au cœur des champs cultivés afin
d’évaluer l’impact de la densité de semis sans biaiser l’environnement de croissance des
plantes. En effet, Les terrains utilisés ne sont pas homogènes, la réalisation des essais en
plein champ permet de limiter les effets de bord (comme les effluents des épandages
provenant d’un champ voisin par exemple, ou la fourrière souvent plus irriguée que le centre
du champ).
Les besoins du chanvre en azote ont été estimés à 100 / 120 unités (U), compte non
tenu des reliquats présents dans le sol (Bouloc, 2006). Les besoins en azote du chanvre
sont estimés entre 14 et 15 unités par tonne de matière sèche (U/tMS) pour l’obtention de
bons rendements paille à 8t/ha (Bouloc, 2006). Pour les tests concernant l’apport azoté,
l’apport de 80 U correspond à la dose classiquement employée par les chanvriculteurs
d’EcoChanvre 86.
La mise en place du quadrillage des essais a été réalisée en collaboration avec les
chanvriculteurs aux tous premiers stades d’implantation du semis. En effet, les plantes
peuvent croître jusque 4 m de haut en moyenne. Elles ont été semées à haute densité
(environ 200 plantes au m2 pour une densité calculée entre 45 et 55 kg/ha (Bouloc, 2006) et
le découpage des essais a nécessité la mise en place d’un fil d’Ariane aux premiers stades
de croissance des chanvres. En effet, un tel fil conducteur s’avère indispensable pour se
repérer dans le champ quand les plantes commencent à atteindre la hauteur d’homme (ou
de femmes, en l’occurrence, d’environ 1,70 m). L’ensemble du réseau d’essai a été quadrillé
avec ces fils et borné aux extrémités avec des pieux à bout rouge pour favoriser le repérage
en bordure de champs mais aussi à l’intérieur du champ.
58
Au cours de l’été 2008, des essais de densité de semis (40, 50 et 60 kg /ha) et des
essais d’épandages azotés (80, 120 et 160 U) ont été réalisés sur deux parcelles distinctes.
L’azote utilisé par les agriculteurs est de l’ammonitrate achetée en vrac à la coopérative
« centre ouest céréales » (entreprise productrice : YARA). L’ammonitrate contient 16,75%
d’azote ammoniacal NH4+ et 16,75% d’azote nitrique NO3- , soit 33,5% d’azote total.
Le champ sur lequel les tests d’apport azoté ont été menés est appelé champ 1. La
pédologie de ce champ est de type argilo-calcaire. Les concentrations, pour les tests azotes
sur ce champ, ont été choisies par rapport à la valeur de 80 U utilisée par les chanvriculteurs
et majorée ensuite afin de jauger l’impact d’une surdose d’azote sur la croissance des
plantes. La densité employée est de 40 kg/ha sur ce champ avec 80, 120 et 160 U pour les
différents apports azotés.
Le champ sur lequel sont effectués les tests de densité de semis est nommé champ 2.
La pédologie de ce champ est de type calcaire. Pour les densités de semis, la valeur
intermédiaire (50 kg/ha) correspond aux pratiques agronomiques courantes, préconisée par
la FNPC. Les points extrêmes (40 et 60 kg/ha) testent des conditions variables en termes de
densité de semis. La densité de 40 kg/ha correspond à la densité de semis utilisée
classiquement par les chanvriculteurs d’Ecochanvre 86. Le champ 2 sur lequel les tests
« densité » ont été menés, a bénéficié d’un apport de 80 U d’azote.
Les semis ont été effectués le 7 mai 2008 et ont été récoltés le 10 août 2008.
Chacune des parcelles représente au minimum 50 m2, considérant les 6 conditions, ce
premier essai représente 600 m2.
Pour le suivi de ces tests au champ, des prélèvements bimensuels ont été réalisés
pour chacune des conditions au niveau bas, milieu et haut des plantes pour fixation et
inclusion en résine (voir § préparation des échantillons et observation en microscopie).
D’autre part, des mesures en champ (diamètres et hauteur) pour 10 plantes de chaque
condition ont été effectuées à chaque date de prélèvement. La taille totale de la plante a été
évaluée en premier lieu afin de déterminer la prise de diamètre à mi-hauteur de la plante et
le diamètre bas était pris à environ 10 cm de la base de la plante. Les plantes mesurées
n’ont pas été coupées sauf les trois premières pour les prélèvements d’échantillon à fixer en
champ. En effet, pour optimiser la qualité de préparation des échantillons prélevés en champ,
le fixateur a été préparé chaque jour de déplacement avant le départ et les fixations ont eu
lieu au bord du champ dans les tubes à hémolyses, maintenus en glacière et contenant du
fixateur (§ préparation des échantillons pour la composition de la solution fixatrice).
59
Au cours de l’été 2009, les essais de densité de semis et d’épandage azoté ont été
réalisés sur une même parcelle de type argilo calcaire afin d’étudier l’impact croisé de ces
deux facteurs (Struik et al., 2000). Les semis ont été effectués le 10 avril 2009 et récoltés par
nos soins le 11 août 2009. Afin de cerner plus aisément les fortes tendances d’impacts
culturaux de ces facteurs, les valeurs d’épandage azoté et de densité de semis ont été
modifiées par rapport à l’été précédent avec les mêmes valeurs médianes conservées mais
des valeurs plus extrêmes en guise de test de densité minimale et maximale. De manière
identique, l’épandage d’azote a été testé sans apport supplémentaire (le 0 U) ou avec un
apport excessif (le 120 U). La parcelle de test fait environ 300 m2 dans un champ de 1,2 ha.
A compter de l’implantation des chanvres (deux semaines après le semis), des
prélèvements bimensuels ont été réalisés. Sur cette campagne d’études, 30 plantes ont été
prélevées pour chacune des conditions afin d’effectuer les fixations et les mesures au
laboratoire. Les mesures concernent toute la longueur (taille, nombre d’entre-nœud, distance
des entre-nœuds, diamètre de chaque entre-nœud). Trois mètres en papier ont été collés
successivement sur la longueur de la paillasse afin de faciliter les mesures en fixant les
plantes le long de la table. En effet, les mesures à plat sont plus aisées et ne nécessitent pas
le maintien de la plante par un autre manipulateur (la taille des plantes est souvent trop
conséquente (1,70 à 2,50 m pour les plantes cultivées) pour permettre des mesures en pied
seul).
1.4
Récoltes
Dans le cadre de nos travaux de l’été 2008 la récolte a été effectuée par un
entrepreneur financé par les chanvriculteurs d’Ecochanvre 86. Une partie de la récolte a été
fauchée / conditionnée c’est-à-dire qu’une fois fauchées, les tiges passent entre deux
rouleaux ce qui entraîne un premier broyage des tiges. La totalité de la parcelle « azote » a
été récoltée de cette façon. Les fagots correspondant à nos essais ont été ramassés ensuite
à la main. Mais la matière première de tiges s’est avérée ensuite trop altérée pour pouvoir
reconstituer des fagots de tiges orientés (de bas à haut) intéressants pour les actions de
transformation ultérieure. Cette partie de la récolte a été cédée aux espaces verts de
l’Université de Poitiers pour une utilisation en paillage sur les massifs décoratifs floraux du
campus.
Grâce aux problèmes de récolte de la première parcelle par l’entrepreneur qui utilisait
une faucheuse-conditionneuse (bourrage de l’attelage), l’autre partie de la récolte des
chanvres a été fauchée classiquement mécaniquement par un entrepreneur, ce qui a
préservé l’intégrité des tiges. Les tiges ont été ramassées à la main afin de ne pas abîmer la
60
matière première. L’ensemble de la récolte a ensuite été reconditionnée en fagot de tiges
orientées de 80 cm de longueur. Cette portion correspond coupée à 110 cm et retranchée de
30 cm en bas.
La récolte de l’été 2009 a été totalement réalisée par nos soins à l’aide d’un taille
haie thermique pour couper les plantes à la base de la tige.
Le fagotage des plantes pour chacune des conditions azotées testées a été réalisé
en champ directement le jour de la récolte. Les fagots concernent les plantes entières à ce
stade. Ensuite, les plantes ont été mises à sécher (à l’extérieur et en serre), puis fagotées en
lot de 150 tiges tronquées de 30 cm du bas et coupées à 110 cm afin d’obtenir des
morceaux de tige de 80 cm de long : cette partie concerne principalement les entre-nœuds 2
à 5.
2
2.1
Matériel textile commercial
Matériel textile pour la conception des éprouvettes de matériaux composites
Dans le cadre du programme CompoChanvre, l’évaluation de l’emploi de fibres
végétales à l’état tissé a nécessité, dans un premier temps, l’utilisation de tissus de chanvre
commerciaux pour la fabrication des éprouvettes de matériaux composites. En effet, les
transformateurs textiles du chanvre ont disparu depuis les années 60 et l’étude de faisabilité
du projet de la plante aux matériaux composites a requis une recherche fastidieuse pour
trouver la matière première à employer (Figure 29).
Des premières éprouvettes ont été réalisées avec des tissus provenant de Roumanie
présentant des aspects différents dus aux post-traitements de ces tissus. L’un des tissus
testés semble brut et l’autre, paraissant plus blanc, semble « blanchi » certainement avec de
la soude. Très peu de données sont disponibles sur l’origine de ces tissus, toutefois la
matière première étant si rare, ils ont fait l’objet de quelques investigations dans le cadre du
programme CompoChanvre. Ces deux tissus roumains entrent dans la gamme d’échantillon
étudiés (Tableau 7). Dans un second temps, pour évaluer l’influence du tissage sur la qualité
du composite, la recherche de fil et de tisserand a été réalisée. Le fil de chanvre a été fourni
par Safilin (http://www.safilin.com/), rare « filature » persistante en France (seul un service
principalement commercial d’une trentaine de personne assurant la vente de produits lin et
chanvre provenant des filatures délocalisées en Pologne). Ce fil proviendrait d’Italie et est
décrit comme fil de chanvre. Le choix du fil s’est porté sur un fil n° 12 ( cela correspond à la
numérométrie du fil i.e 12 000 m.kg-1, critère textile qui rend compte de la finesse du fil) afin
de réaliser des tissus artisanaux proches des tissus de verre générés industriellement et que
61
cette étude cherche à remplacer. Le choix de la maille à tisser a été réalisé en partenariat
avec des tisserands qui officient sur l’île d’Oléron (Lin et L’autre). Deux types de tissus ont
été produits par cette collaboration, nommé Oléron 1 et Oléron 2 qui diffèrent en fonction de
leur grammage (Tableau 7).
Tableau 7. Matières premières employées pour la fabrication des éprouvettes.
Identification
Origine
Fournisseur
Grammage
2
(g/m )
Tissus Roumain 1
Roumanie
185
Ecolution (ref HF14W)
Tissus Roumain 2
Roumanie (fil)
185
Ecolution (Réf HFC1)
Angleterre (tissus)
(annoncé à
330)
Oléron 1
Italie (Fil)
155
Ile d’Oléron (Tissus)
Oléron 2
Italie (Fil)
Ile d’Oléron (Tissus)
Safilin (Fil)
Lin et L’autre (Tissage)
200
Safilin (Fil)
Lin et L’autre (Tissage)
Afin d’optimiser l’adéquation des tissus utilisés à la matrice époxy des composites,
différents traitements d’ensimage ont été appliqués sur ces tissus. L’ensimage est un
procédé courant dans l’industrie des matériaux composites visant à ajouter des fonctions
chimiques favorisant l’imprégnation des fibres dans la matrice (Baley et al., 2006). Ainsi une
gamme de température d’étuvage (de la température ambiante jusque 160°C) a été réalisée
sur une partie de ces tissus. Des traitements à la soude (NaOH) ou à l’eau oxygénée (H2O2)
ont été aussi effectués et certains autres traitements d’ensimage ont également été
pratiqués mais les détails de ces opérations ne sont pas communiqués.
62
Figure 29. Etapes « clés » du programme CompoChanvre et les différents partenaires. L’objectif du
programme est de remplacer des fibres de verre synthétiques par des fibres longues de chanvre dans
des matériaux composites. La filière textile n’existant plus, la connexion entre la partie végétale et
mécanique n’a pas pu se réaliser directement. C’est pourquoi l’ouverture à d’autres fournisseurs de
matières premières en fils et tissus s’est mise en œuvre au cours du programme.
2.2
Matériel textile
Face à la rareté des échantillons de tissus de chanvre, et afin de mieux caractériser
l’état actuel du marché textile autour de cette ancienne matière, la gamme d’échantillon
textile a été élargie grâce aux échantillons disponibles sur le marché. Parmi ces échantillons,
certains décrits comme étant 100% chanvre ont été ajoutés à la gamme d’étude ainsi trois
tissus de chanvre colorés provenant de Chine ont été fournis par la société Delsol® et un
sac en tissus de chanvre (réalisé à partir de deux tissus de chanvre d’épaisseur de maille
différentes, Ecolution® provenant de Roumanie).
Un autre échantillon de tissus comprenant notamment du chanvre a été intégré à la
gamme d’étude (un t-shirt de deux coloris constitué d’un seul type de tissus composé à 55%
de chanvre et 45% de coton).
63
Un nouveau type de matière première « chanvre » a aussi été pris en compte dans
ces travaux. Il s’agit de filasse de chanvre provenant d’Angleterre et disponible en grandes
quantités. Cette filasse a été achetée par un des partenaires du programme CompoChanvre
à HempTrader® pour d’autres investigations industrielles concernant de nouveaux matériaux
composites pour les bateaux. D’aspect très clair et de toucher très doux, cette filasse rentre
dans la gamme des échantillons prétraités, très certainement à la soude.
Enfin, pour l’évaluation plus complète des produits issus des filières textiles, du coton
(t-shirt 100% coton affiché) et du lin ont été compris dans l’étude. Plusieurs échantillons de
lin ont été fournis par Mme Lépée (Lin et L’autre) correspondant à chaque étape de
transformation textile de la plante : de la tige rouie et séchée jusqu’au fil, en passant par les
intermédiaires correspondant au lin teillé et à la filasse. Ces échantillons sont produits
exclusivement par des méthodes naturelles utilisant le rouissage et le savoir faire ancestral
des liniculteurs.
2.3
Matériel issu d’autres chaînes de transformation
La transformation du chanvre dans la région concerne principalement l’éco-habitat.
Des échantillons provenant de la chaîne de transformation d’Ecochanvre 86 ont ainsi été
recueillis. La transformation des tiges de chanvre se déroule dans un système prototype de
fractionnement composé de deux moissonneuses batteuses successives et quelque peu
modifiées (pour plus de détail se référer à Ecochanvre 86). Les produits de la tige concassés
obtenus se distinguent en chènevotte, chènevotte fibrée et fibres.
La transformation première des chanvres étant encore en développement dans
plusieurs infrastructures, la diversité des échantillons disponibles sur le marché est
importante. En effet, aucune norme actuellement ne régit ces transformations, par
conséquent, chaque transformateur utilise son mode de transformation. Il semble
généralement qu’une étape de prétraitement soit considérée et qui correspond simplement
au temps de rouissage en champ qu’ont subi les tiges de chanvre. Ensuite, les
transformations restent principalement mécaniques afin de provoquer la séparation des
fibres de la chènevotte. Des échantillons provenant de quelques une de ces diverses
chaînes ont pu être récoltés à l’occasion de rencontres avec les différents partenaires
œuvrant pour la relance de la filière chanvre (Echantillon Start Hemp® avec deux temps
différents de rouissage en champ).
64
65
±–Š‘†‡•
1
Plan d’échantillonnage
Le plan d’échantillonnage, appliqué pour la première campagne menée au champ
l’été 2008, a été mise au point sur les plantes issues des premier semis en serre. Des
prélèvements réguliers, mesurant de 0,5 à 1 cm, sont réalisés à différentes hauteurs des
tiges de chanvre (bas, milieu et haut) lors de la croissance des plantes. Le niveau bas de la
plante est considéré à 10 cm au dessus du sol, le milieu est défini après la mesure de la
taille de la plante totale, enfin, le haut correspond à l’apex de la plante.
Les échantillons ont subi une fixation chimique puis une inclusion en résine de façon
à permettre tant leur exploitation en microscopie qu’en microspectrométrie FT-IR. Des
échantillons plus grands de 5 à 10 cm et prélevés aux niveaux du bas, milieu et haut de la
tige ont été simplement fixés en alcool 70% afin de permettre leur exploitation en
macroscopie et en microscopie à fluorescence. Des tiges entières de 1,30 m à 2,50 m ont
été également fixées par de l’alcool 70%. Afin de limiter la consommation de matériel et
optimiser la surface de stockage des échantillons, les tiges ont été débitées en biais en
tronçon de 20 cm et placées dans des tubes de 50 ml. En fonction du diamètre de la tige,
chaque tube peut contenir de 2 à 6 segments de tiges. Les plus grandes plantes (2,50 m)
sont contenues dans 8 tubes de 50 ml. Le fait de couper les segments en biais favorise la
reconstitution de la plante entière ultérieurement.
Pour le suivi en champ des plantes cultivées, des prélèvements bimensuels sont
réalisés à compter d’un mois après le semis et sont conservés en vue des différentes
analyses conformément aux indications ci-dessous.
-
Conservation/ fixation des échantillons de tiges (bas, milieu et haut) dans l’alcool 70
% pour les études morphologiques,
-
Inclusion des échantillons de tiges (bas, milieu et haut) dans de la résine LR White
Medium pour les études morphologiques et biochimiques (FT-IR),
66
2
Rouissage
2.1
Mise en place du rouissage
Un système prototype de rouissage en « simili eaux vives » a été mis en place au
laboratoire. Il consiste en un bac de 200 litres pourvu de bulleur et vidangé chaque jour
ouvré pour se rapprocher au maximum de conditions naturelles (routoirs connectés aux eaux
vives).
Les rouissages sont réalisés sur des lots de 150 tiges de chanvre orientées et de 80
cm de longueur (Figures 30 B, 31). La longueur des tiges est définie par la taille du bac de
rouissage mais aussi par les capacités des filières textiles linières calibrées entre 80 et 100
cm (Figure 30). Cette partie des tiges concerne principalement les entre-nœuds 2 à 5 (les
numéros sont comptés à partir du bas de la tige).
Deux lots de 150 tiges peuvent être rouis simultanément dans un bac. Les rouissages
sont menés sur 40 à 50 jours et des prélèvements réguliers sont réalisés avec un défibrage
manuel afin de séparer totalement les fibres longues de la chènevotte. Après calibration du
système, trois campagnes de rouissage ont été menées. Les deux premières concernent les
plantes issues de la récolte 2008 à partir des plantes cultivées en champ selon les conditions
courantes des agriculteurs régionaux (densité 40 kg/ha et 80 U d’azote) et la troisième la
récolte 2009 avec les mêmes conditions de culture des plantes. Les paramètres de
température ne sont pas pris en compte mais le système est placé dans la serre où les
variations de température sont contrôlées (entre 18 et 25 °C en moyenne sur la journée) . Les
bacs noirs opaques sont couverts afin de ne pas favoriser la croissance d’algues vertes et de
s’affranchir de l’impact de la lumière sur le rouissage.
Les effluents sont traités car de nombreuses incertitudes subsistent sur leur contenu.
Afin d’éviter tout problème, l’ensemble des vidanges sont retraités à la Javel.
67
Figure 30. A : Prototype du système de rouissage (bac de 200 litres pourvu de bulleur et d’un système de
vidange pour changer l’eau chaque jour ouvré), B : produits obtenus par rouissage 1. chènevotte et 2. les
écorces comprenant les fibres longues étalées pour sécher.
Figure 31. Partie des tiges rouies provenant des récoltes de plantes cultivées en densité de 40kg/ha et 80
U d’apport azoté, standard de cultures employé par les chanvriculteurs d’Ecochanvre 86. Les portions de
tige mesurent 80 cm de long et concernent principalement les entre-nœuds 2 à 5.
68
2.2
Cinétique de rouissage et traitement des fibres rouies
Deux campagnes de rouissage ont été réalisées pendant l’hiver 2008-2009 avec des
fagots provenant de la récolte de l’été 2008 et correspondant aux conditions de culture
standard du chanvriculteur collaborateur (Densité 40 kg/ha, Azote 80 U). Une campagne de
rouissage a été réalisée sur la récolte 2009 en considérant à nouveau les plantes issues des
conditions de culture standard du chanvriculteur (Densité 40 kg/ha, Azote 80 U) afin de
considérer cette campagne comme une répétition biologique.
A compter de dix jours de rouissage, des prélèvements réguliers sont effectués sur
une vingtaine de tiges à chaque fois. Lors du prélèvement, l’écorce contenant les fibres
longues est séparée manuellement du bois. Les échantillons sont alors mis à sécher (à l’air
libre dans la serre (B, Figure 30) avant d’être étudiés. Chaque lot de fibres longues est alors
coupé en deux parties de longueurs égales pour permettre l’étude biochimique et
histologique d’une part, et des études mécaniques d’autre part.
3
3.1
Préparation des échantillons
Préparation des échantillons pour les observations en loupe à fluorescence et
microscopie confocale à balayage laser (MCBL)
La réalisation de coupes transversales, à partir d’échantillons frais de tige ou fixés
dans l’alcool 70%, se fait grâce à l’utilisation de couteaux à lame vibrante dans l’eau.
Des petits fragments de tige (1/4 à ½ tige en fonction du diamètre et de 0,5 cm de
hauteur maximum) sont collés sur le support de la machine avec de la Super Glue3® de
Loctite. La préparation est séchée à l’air libre pendant 30 min au moins ou laissée au
frigidaire pendant 1 à 2 h afin de permettre à la colle de bien sécher tout en limitant la
dessiccation de l’échantillon. Ensuite des coupes de 20 à 40 μm d’épaisseur sont réalisées
grâce au couteau à lame vibrante dans l’eau. Deux appareils ont été utilisés durant les
travaux, du fait de l’acquisition d’un nouvel équipement par le laboratoire durant la thèse. Le
premier couteau à lame vibrante utilisé était le VT 1100® de Leica, puis le Vibratome® de
Microm-Microtech HM 650V de chez Thermoscientific® a été acheté par le laboratoire. Les
paramètres de coupe préconisés sont une amplitude de 1,2 mm, une vitesse de 5 mm.s-1 et
une fréquence de 40 Hz. Par contre, les lames de rasoir utilisées classiquement (Gilette®
Bleue) ne conviennent pas pour les coupes sur le chanvre. Il est nécessaire d’utiliser des
lames de plus grande dureté (Gilette® Orange) pour optimiser les coupes engendrées. Il est
à noter que ces lames nécessitent plus de nettoyage que les lames classiquement utilisées.
69
En effet, graissées par sécurité en sortie d’usine, un nettoyage à l’alcool 96% voire à l’alcool
+ acétone est préconisé pour optimiser le tranchant de la lame.
Pour récupérer les coupes engendrées dans l’eau, il est possible d’utiliser un pinceau
ou des pinces fines. Typiquement, si le matériel initial à couper est frais, il sera plus rempli
d’air et flottera donc à la surface de l’eau. Dans ce cas il est plus judicieux d’utiliser un
pinceau car cela garantit une meilleure intégrité de l’échantillon par la douceur de la
manipulation. En revanche, quand le matériel coupé est fixé en alcool 70%, sa
déshydratation a tendance à le faire couler et il reste plus évident de récupérer l’échantillon
avec des pinces fines. Dans ce cas, pour ne pas trop abîmer la coupe, il est préférable de la
saisir sur un coin dur (dans le cas du chanvre, sur un coin de chènevotte).
3.2
Préparation des échantillons pour une observation en microscopie photonique
et pour l’étude en microspectrométrie FT-IR.
Des séries d’inclusions d’échantillons en résine LR White Medium® ont été menées
régulièrement sur les premiers semis effectués en serre. Les paramètres de l’inclusion ont
été définis à partir de ces plantes cultivées en serre, sur différents fragments de tige (avec
des formes et des modes de prélèvement différents). Cela a permis l’optimisation des
fixations d’échantillons de tige prélevés en champ.
D’autres échantillons issues des chaînes de transformation extérieure (§ matériel
textile commercial) ont été inclus en résine.
A partir des inclusions effectuées en résine, il est possible d’engendrer des coupes
semi-fines (800 à 1500 nm) d’épaisseur. Ces coupes sont utiles tant pour les observations
en microscopie photonique que pour les analyses en microspectrométrie FT-IR.
3.2.1
Le prélèvement des échantillons de fibres longues de chanvre
3.2.1.1 Le prélèvement sur les plantes cultivées en serre ou en champs
Conformément au plan d’échantillonnage précédemment décrit, des échantillons sont
prélevés à différents niveaux de la tige (bas, milieu, haut). Les échantillons de fibres (de
maximum 0,5 cm de long) de chaque variété étudiée (Félina 32 ou Santhica 27) sont
récoltés à l’aide de pinces fines en tirant l’épiderme conjointement avec les tissus fibreux
(cela revient à récupérer l’écorce de la tige). De cette manière, seuls les tissus phloémiens et
épidermiques sont prélevés. La partie apicale de la tige est coupée en deux ou en quatre
dans sa longueur de façon à obtenir des quarts de coupe transversale.
70
3.2.1.2 Le prélèvement sur le matériel transformé
Pour les échantillons de fibres rouies il n’est pas possible de déterminer la position
réelle initiale dans la tige. En effet, les écorces retirées du bois ne portent plus les marques
des nœuds. Pour ne pas trop biaiser l’échantillonnage, les échantillons de fibres prélevés ont
été sélectionnés en milieu d’écorce. Des petits morceaux de 0,5 cm de longueur maximum
sont découpés et la « largeur des faisceaux » ne doit pas excéder 1 mm pour favoriser les
étapes ultérieures.
Pour les échantillons provenant des systèmes extérieurs de transformation, les
prélèvements sont aléatoires et gardent en commun avec les autres la petite taille (0,5 cm
maximum de long et 1 mm maximum de large).
3.3
La préparation des échantillons pour les observations en microscopie
photonique et pour la microspectrométrie FT-IR
3.3.1.1 La fixation
La fixation chimique consiste à ponter les protéines afin de créer une réticulation
artificielle pour pouvoir éliminer l’eau tout en conservant la trame structurale d’origine. Les
fixateurs utilisés sont des aldéhydes en mélange avec du para formaldéhyde (PFA) à 4% et
de glutaraldéhyde à 0,5% dans un tampon phosphate 0,2 M à pH 7,2. Le fixateur est
légèrement alcalinisé par de la soude (20 μl de NaOH 1N pour 10 ml de fixateur). Le fixateur
se prépare extemporanément en milieu tamponné. La fixation dure 1h30 minimum mais ne
doit pas dépasser 12h afin de ne pas dégrader le matériel.
Pour les échantillons issus de plantes fraîches, la fixation se réalise au frais ~ 4°C
dans une glacière pour les prélèvements au champ et sur de la glace pilée au laboratoire.
Pour les échantillons issus des différentes voies de transformation (rouissage et
matériel « extérieur »), la fixation chimique n’est pas obligatoire (les tissus étant déshydratés)
toutefois cette étape s’est avérée importante lors de l’amélioration des protocoles.
Pour certains échantillons, une étape de post-fixation à l’acide osmique a été réalisée
(1 % OsO4 dans le tampon phosphate 0,2 M, pH 7,2). Cette post-fixation permet la
réticulation des lipides et notamment des membranes plasmiques des échantillons. Cette
étape sert aussi de contrastant car elle provoque le noircissement des échantillons. L’acide
osmique étant très dangereux et pas nécessaire dans le cas d’échantillon de tiges matures
ou d’échantillons secs, cette étape a été retirée de la plupart des inclusions réalisées.
Toutefois, il est nécessaire de souligner que cette étape demeure indispensable pour les
71
préparations d’échantillon pour l’observation en microscopie électronique à transmission
(MET).
Après la fixation, les échantillons sont rincés dans le tampon phosphate (0,2 M, pH
7,2) au moins trois fois pendant 20 minutes. Afin d’optimiser les lavages, cette étape peut se
passer sous vide. Le tampon phosphate peut-être enrichi en saccharose (7,5% de
saccharose) pour maintenir l’osmolarité des tissus et préserver au maximum leur intégrité.
Le saccharose a été ajouté au tampon phosphate pour les inclusions provenant de tissus
frais uniquement. Les autres échantillons ne nécessitent pas cet apport étant donné que
seules restent les parois des cellules mortes.
Du fait de la difficulté d’inclure les fibres dans les résines, des passages sous vides
ont été ajoutées dès la fixation puis à chaque étape pour favoriser le succès des inclusions.
3.3.1.2 La déshydratation
Le principe est de faire subir à l’échantillon des bains successifs de concentration
croissante en alcool : 20, 50, 70, 95 et 100% de 10 min chacun afin de déshydrater
complètement l’échantillon et favoriser les inclusions en résine. La déshydratation des
échantillons transformés débute à compter de l’alcool 70%.
3.3.1.3 L’imprégnation
L’imprégnation permet une bonne diffusion de la résine dans tout l’échantillon. Cette
étape vise notamment à chasser les gaz encore présents à ce stade. Le choix de la résine
s’est porté sur une résine de type acrylique LR White Medium car elle conserve
l’accessibilité aux composés pariétaux, optimisant les analyses biochimiques ultérieures tout
en assurant des études ultrastructurales. (Les résines epoxy comme l’araldite ou l’epon ne
permettent que des études ultrastructurales).
Pour l’imprégnation en résine, les échantillons déshydratés sont immergés dans des
bains mixtes LR White Medium / alcool éthylique de teneur croissante en résine pendant 8h.
Deux premiers bains successifs sont appliqués (1/3 LR White Medium + 2/3 d’éthanol 100%)
pendant 20 min chacun, puis deux autres bains contenant 2/3 LR White Medium + 1/3
d’éthanol
100%
sont
appliqués
pendant
1h
minimum
chacun.
Pour
les
échantillons transformés le deuxième bain est mené durant une nuit entière après un
passage d’une heure sous vide.
72
Ensuite, le dernier bain est constitué de 100% LR White Medium et est répété au
minimum deux fois avec des temps très long (de 12 à 24h) comprenant systématiquement
une période de vide d’une heure avant de laisser sous une hotte. Il est nécessaire de bien
veiller à laisser les tubes d’imprégnation ouverts sous la hotte (car cela favorise l’évaporation
de l’éthanol 100%) ainsi que dans le frigidaire quand ils sont déposés pour la nuit.
L’inclusion des échantillons se fait dans des capsules de gélatine préalablement
étiquetées au crayon avec des petites bandelettes de papier placée à l’intérieur (le crayon ne
diffuse pas contrairement à l’encre, cette étape reste exclusivement manuscrite). L’étape
d’inclusion est minutieuse car il est important de bien veiller à l’orientation de l’échantillon
dans la gélule pour optimiser les coupes ultérieurement. La polymérisation de la résine
s’effectue dans une étuve (2 jours à 55 °C).
3.3.1.4 Coupe des échantillons
Des coupes semi-fines de 800 à 1500 nm d’épaisseur sont débitées à partir des blocs
échantillons avec un ultramicrotome Leica eMuC6®. Un couteau de verre est employé pour
générer les coupes. Dans le cadre de l’ultramicrotomie, une grande différence avec le
couteau à lame vibrante réside dans le fait que ce soit l’échantillon qui bouge face au
couteau qui est fixe. Le couteau est muni d’un réservoir rempli d’eau osmosée pour favoriser
la propreté et la récupération des coupes.
Les coupes sont ensuite récupérées soit par capillarité avec des anneaux dédiés soit
avec un cil monté sur une tige. Elles sont ensuite évaluées brièvement par une coloration
rapide au bleu de toluidine (1 goutte de bleu de toluidine à 0,1% dans l’eau) afin de veiller à
l’orientation des coupes ou encore à la qualité de l’inclusion. Enfin, les coupes sont
déposées sur des lames à puits traitées au Vectabond® pour favoriser leur adhésion. Les
lames ainsi préparées sont mises à sécher sur plaque chauffante (à 30 °C) quelques
minutes puis elles peuvent être observées en microscopie photonique.
Pour la microspectrométrie FT-IR, les coupes sont déposées sur les lames BaF2 (Le
difluorure de barium étant très perméable aux infra-rouges), taille des lames : 13 mm de
diamètre, 2 mm d’épaisseur) et l’adhésion des coupes se fait par la chaleur. Il est nécessaire
que l’échantillon soit bien sec sur la lame car l’excès d’eau absorbe dans la lumière IR.
Toutefois il faut aussi veiller à ne pas laisser trop longtemps les lames sur plaques
chauffantes car elles sont très fragiles et la chaleur les fragilise d’autant plus. Cette étape de
dépôt de coupes sur les lames Ba F2 requiert donc une forte vigilance.
73
3.4
La préparation des échantillons pour les études biochimiques
Pour les études biochimiques ATR et le fractionnement de la biomasse, les fibres
longues de chanvre sont broyées à l’aide d’un broyeur mécanique (Retsch Mühle SM1
73048®) avec une granulométrie de 0,5 à 1 mm. Cette granulométrie est importante car elle
permet tant l’accessibilité des solvants lors des fractionnements de la biomasse tout en
limitant la perte de matériel, mais en plus, elle garantit une intégrité de la plupart des
composés pariétaux (une granulométrie plus fine risquant de surchauffer et de dénaturer les
composés, une granulométrie plus grossière n’optimisant pas l’accessibilité des solvants aux
composés des parois).
4
4.1
Analyse des échantillons
Histologie et cytochimie
4.1.1.1 Macroscopie : loupe à fluorescence
La macroscopie consiste en l’observation des tissus frais ou fixés en alcool avec un
système de loupe binoculaire. Ce système, relié à une caméra numérique, permet
l’acquisition d’images représentant 1 cm2 de la surface des échantillons, ce qui permet, par
exemple, de recouvrir une section transversale entière de tige de chanvre quelque soit la
hauteur de prélèvement (bas, milieu, haut). Depuis juillet 2008, le laboratoire a fait
l’acquisition d’une loupe à fluorescence Leica® MZ 16 FA comprenant un filtre particulier qui
permet de sélectionner les longueurs d’onde d’intérêts pour notre étude des composés
pariétaux (Filtre GFP 1 et GFP 3 avec respectivement : λexcitation de 450 nm et 500 et
respectivement les λemissions à 480 et 550 nm).
Des manipulations avec ce matériel ont été réalisées sur des coupes de 30 μm de
matériel fixée en alcool 70% réalisées au couteau à lame vibrante. Les coupes ont ensuite
été colorées extemporanément pendant 10 min à l’acridine orange 0,02% dans du tampon
phosphate (0,2 M, pH 7,2) puis observées.
4.1.2
Microscopies
4.1.2.1 Microscopie Confocale à Balayage Laser (MCBL)
La microscopie en fluorescence classique présente une perte de résolution axiale,
conséquence de la superposition des plans focaux adjacents. La microscopie confocale à
balayage laser pallie cet inconvénient grâce à un système de diaphragme variable (« trou
d’aiguille » ou pinhole) permettant de pratiquer des coupes optiques dans l’objet observé. La
microscopie confocale à balayage laser permet des acquisitions de coupe d’échantillon plan
74
par plan (Figure 4), c’est-à-dire que chaque section optique est générée par un déplacement
en hauteur (Z) de l’échantillon. Les images 2D de chacun des plans, acquises par le système
de caméra numérique relié au microscope, peuvent ensuite être compilées en Z pour obtenir
la coupe complète de l’échantillon observé. L’histologie des tiges de chanvre peut être ainsi
caractérisée sur un plan focal image bien défini, favorisant ainsi l’extraction des différents
objets contenus dans l’image (segmentation des cellules) et optimisant leur caractérisation
ultérieure via analyse d’images (Legland et al., 2005). Des manipulations sur matériel frais
ont été réalisées pour calibrer l’étude et jauger les possibilités d’extraction des objets en
analyse d’images ensuite. Les coupes sont préparées et colorées avant observation comme
décrit précédemment (§ 4.1.1). L’observation est réalisée grâce à un microscope confocal
Olympus® FV1000.
L’échantillon est excité par trois rayonnements lasers séquentiels avec une longueur
d’onde de 488 nm, 543 nm et 633 nm. Les émissions correspondantes sont sélectionnées
grâce à un premier filtre By Pass récupérant les longueurs d’onde comprise entre 500 et 530
nm (500 nm < λvert < 530 nm), un second filtre By Pass récupérant les longueurs d’onde
entre 555 et 625 nm (555 nm < λrouge < 625 nm) et un troisième filtre Long Pass récoltant les
rayonnements supérieurs à 650 nm (650 nm < λbleu). Les sections optiques sont de 1,5 à 2
μm à l’objectif X20, et de 1 μm aux objectifs X40 et X60.
Le repérage des échantillons et la mise au point se fait à l’objectif 10X. Les
acquisitions d’images et des séries d’images se réalisent à l’objectif 20X pour les images
illustratives et pour compter le nombre de fibre contenu dans la fenêtre. Les acquisitions
d’image ou de séries d’images réalisées à l’objectif 40X permettent la caractérisation des
fibres phloémiennes primaires. Les images sont enregistrées en format .oib, format d’image
calibrée par le système d’acquisition, et le traitement d’image peut s’effectuer par le logiciel
d’analyse d’image Image J (partie à détailler plus loin dans « outils informatiques »). De la
même manière, les images acquises à l’objectif 60X permettent de caractériser les fibres
phloémiennes secondaires.
75
Figure 32. Principe de fonctionnement d’un microscope confocal à balayage laser.
4.1.2.2 Microscopie photonique
L’utilisation de la microscopie photonique classique permet des études histocytochimiques. Il s’agit de caractériser les échantillons avec des colorations usuelles pour la
cytochimie des parois (Tableau 8). Il est possible d’avoir des informations qualitatives sur les
composés pariétaux présents sur les différents échantillons de fibres longues de chanvre. Le
microscope photonique utilisé durant les travaux de thèse est un Zeiss Axioplan® disponible
dans le service commun de microscopie de l’Université de Poitiers. Le microscope est relié à
une caméra numérique Kappa® qui offre notamment une possibilité de calibration des
images. En revanche, contrairement au MCBL, cette calibration nécessite l’utilisation d’un
logiciel attenant à la caméra et donc représente une étape supplémentaire. Cette étape est
pourtant primordiale pour l’exploitation des images ultérieures (échelle, analyse d’image).
Tableau 8. Récapitulatif des colorations utilisées sur les coupes transversales de chanvre.
Applications
Remarques
Colorants cytologiques classiques pour la microscopie en fond clair
Bleu de Toluidine
Cellulose, Lignines
Carmin aluné – vert d’iode
Cellulose
(rose),
Degré de lignification des parois
Lignines
Eléments lignifiés ou cellulosiques
(vert)
Fluorochrome
Acridine orange
Pectines, cellulose, lignine
Colorant métachromatique
La double coloration au carmin aluné – vert d’iode nécessite une décoloration
préalable des coupes dans de l’eau de javel pure (1h). Plusieurs rinçages à l’eau sont
ensuite nécessaires afin d’éliminer l’eau de javel. Cette étape est importante pour que la
76
double coloration réussisse. Les coupes sont ensuite placées pendant 1 min 30 s dans de
l’acide acétique (CH3COOH) pour le mordançage. Enfin, elles peuvent être rapidement
colorées au carmin aluné – vert d’iode (quelques secondes).
4.2
Biochimie : techniques liées à la caractérisation des compositions des parois
par l’étude Infra-Rouge à Transformée de Fourrier (FT-IR)
La composition des parois cellulaires est habituellement analysée par voie chimique
et enzymatique. Ces analyses nécessitent quelques microgrammes ou milligrammes de
matériel et sont destructives car une étape de broyage du matériel biologique est nécessaire.
Au vue des quantités nécessaires et de la difficulté d’isoler un type de cellule, les résultats
obtenus correspondent à une moyenne. Les méthodes d’immunomarquage ou de
colorations permettent d’obtenir des informations uniquement qualitatives sur la répartition
de certains constituants des parois végétales. La spectrométrie IR permet d’obtenir des
informations tant qualitatives que quantitatives.
4.2.1
Principe de la méthode
Le principe de la spectroscopie infrarouge repose sur (i) la nature quantique de la
lumière, (ii) les vibrations des liaisons chimiques de la matière et (iii) l’absorption du
rayonnement infra-rouge par la molécule. (i) La nature quantique de la lumière implique
l’attribution discrète d’énergie ou quantas aux particules. La vitesse de propagation de la
lumière est une fonction affine qui représente la vitesse de déplacement en fonction de sa
fréquence (υ) et de sa longueur d’onde (λ). La vitesse de la lumière est constante (c = λυ =
300.106 m.s-1) et l’énergie (E) d’un quantum se calcule par la relation E= h. υ avec h =
6,626.10-34 J.s (constante de Planck).
Une molécule diatomique présente des mouvements assimilables à ceux d’un ressort
(Figure 33) c’est le modèle de vibrations harmoniques des liaisons chimiques. Les niveaux
d’énergie d’une molécule diatomique sont repérés par un nombre quantique de vibration n
(Figure 33). Ces notions permettent alors de comprendre comment une molécule va
absorber le rayonnement infrarouge. En effet, lorsque le rayonnement infrarouge arrive sur
l’échantillon, il peut être absorbé, transmis, ou réfléchi. La loi de la conservation d’énergie
implique que l’intensité reçue par l’échantillon (I0) est égale à la somme des intensités
absorbée (Ia), réfléchie (Ie) et transmise (It). Autrement écrit : I0 = Ia + Ir +It .
77
Figure 33. Représentation schématique d’une molécule diatomique par deux masses m1 et m2 reliées par
un ressort et la représentation graphique de l’énergie n en fonction de la distance atomique (Grinchenko,
2007).
Figure 34. Passage d’énergie d’une molécule suite à son absorption infrarouge. L’absorption est
caractéristique des liaisons chimiques de la molécule et pour chaque molécule il peut exister différent
modes vibrationnels qui engendrent différentes bandes d’absorption. Pour exemple ici la molécule d’eau
(Grinchenko, 2007).
La molécule soumise à un rayonnement infrarouge l’absorbe si l’énergie apportée est
suffisante pour passer un niveau d’énergie (de Ei à Ei+1, Figure 34). L’absorption est
caractéristique des liaisons chimiques de la molécule. Le spectre infrarouge est composé
de
bandes
d’absorption. L’intensité des bandes d’absorption est exprimée en
transmittance ou en absorbance (% de transmittance = It/I0 et % d’absorbance = I0/Ir).
Cette intensité dépend du moment dipolaire de la liaison chimique. En effet, les longueurs
d’onde auxquelles l’échantillon absorbe correspondent aux groupements chimiques
caractéristiques des échantillons analysés et l’intensité de l’absorption à une longueur
d’onde appropriée est reliée à la concentration du groupement chimique par la loi de
Beert-Lambert.
78
La position des bandes d’absorption va dépendre de la différence d’électronégativité
des atomes et de leur masse. Par conséquent, un échantillon qui est un ensemble de
composés chimique va présenter un ensemble de bandes d’absorption caractéristiques
permettant d’identifier les constituants.
Les parois végétales absorbent dans la région spectrale de 800 à 1800 cm-1
(Nombres d’ondes ou NO), les polysaccharides présentent des bandes d’absorption
caractéristiques des vibrations d’élongation υ (C-O) et υ (C-C), ainsi que des vibrations de
déformation δ (C-OH). Toutefois, les attributions spectrales des bandes d’absorption ne sont
pas précises, car dans le principe de la méthode il faut comprendre qu’une molécule seule
qui serait utilisée comme un « standard » ne vibrera pas de la même façon si elle est
mélangée dans un ensemble. Les vibrations des molécules dépendent de leur
environnement moléculaire. Par exemple, la signature spectrale de la cellulose seule ne sera
pas identique à la signature d’une paroi cellulaire même si elle est fortement cellulosique.
Toutefois, des nombres d’onde peuvent être retrouvés (Les signatures cellulosique sont
décrites entre 800 et 1200 cm-1).
Pour imager la méthode, il possible de faire une analogie avec un orchestre de
musique où chaque instrument et son musicien serait une molécule (une vibration donnée)
qui resterait très difficile à extraire dans une prestation musicale complexe (comme un
concerto) mais beaucoup moins dans un conte musical enfantin connu comme Pierre et le
Loup.
4.2.2
Principe de l’appareil d’acquisition
Un spectromètre FT-IR acquiert un large spectre de l’IR à l’IR lointain (entre 780 et
100 000 nm ou 0,78 μm et 100 μm). Les instruments de spectrométrie collectent
simultanément tous les NO. Pour son fonctionnement, le faisceau IR de la source A (Figure
35) est dirigé vers l’interféromètre de Michelson qui va moduler chaque NO du faisceau à
une fréquence différente. Dans l’interféromètre, le faisceau IR arrive sur la séparatrice, la
moitié du faisceau est dévié sur le miroir fixe, l’autre sur le miroir mobile. Quand les
faisceaux se recombinent, des interférences destructives ou constructives apparaissent en
fonction de la position du miroir mobile. Le faisceau modulé est alors réfléchi des deux
miroirs vers l’échantillon qui va alors absorber. Le faisceau est ensuite transformé en signal
électrique par le détecteur. Ce signal est un interférogramme qui correspond à une signature
de l’intensité en fonction de la position du miroir. Après une opération mathématique appelée
Transformée de Fourrier, l’interférogramme est converti en spectre IR.
79
Figure 35. Principe du fonctionnement d’un spectromètre FT-IR (Urbain, 2009).......................
4.2.3
Acquisition des spectres et format de fichier
Deux techniques IR ont été utilisées : l’Attenuated Total Reflectance (ATR) et la
microspectrométrie FT-IR. La différence d’appareillage pour le microspectromètre FT-IR
réside dans le nombre de détecteurs de l’appareil : en effet au lieu d’avoir un seul détecteur
qui acquiert point par point les spectres de l’échantillon, l’appareil possède 32 détecteurs
montés en série.
4.2.3.1 Attenuated Total Reflectance
L’acquisition dans ce cas des signatures spectrales consiste en une excitation infrarouge qui ne pénètre que faiblement et de manière standardisée (5 μm de pénétration) dans
l’échantillon ce qui permet de s’affranchir de préparations fastidieuses d’échantillons
nécessaire en transmission pour que le faisceau passe. C’est en réflexion que cette méthode
fonctionne. L’acquisition dans ce cas se réalise spectre par spectre. L’étude du suivi des
fibres au fur et à mesure du rouissage a été réalisée grâce à cette approche à partir des
poudres de fibres rouies.
Le plan d’échantillonnage consiste en une répétition d’acquisition sur des poudre
obtenues aux différents temps de rouissage. Concrètement, la série de mesures est réalisée
sur chacune des poudres successivement puis dix répétitions se succèdent afin que les
facteurs de température et de lumière n’impactent pas les données finales.
80
4.2.3.2
La microspectrométrie FT-IR
L’acquisition avec le microspectromètre FT-IR peut permettre d’acquérir soit un seul
spectre soit une carte de spectres. L’acquisition se fait en transmission. Les cartographies
spectrales ont été réalisées sur l’ensemble des échantillons décrits (§ matériel) issus de la
plante (échantillons inclus en résine) et les échantillons transformés (par le rouissage ou de
provenance extérieure § matériel).
9 acquisition d’un spectre : les spectres peuvent être acquis de manière
individuelle et de façon automatique par le logiciel d’acquisition OMNIC® version
4.4 relié au spectromètre Nicolet Continuμm MCT FT-IR® modèle de
Thermofisher®, accessible sur la plate forme de chimie du végétal à l’INRA de
Versailles.
Avant chaque acquisition d’un spectre il faut faire un « blanc » appelé background.
Cela permet de s’affranchir des teneurs en CO2 et en eau de la pièce. Ensuite, il faut régler
son mode d’acquisition (absorbance ou transmittance, l’une étant l’opposée de l’autre) et les
paramètres d’acquisition (nombre de points à acquérir), nombre de scan, taille de la fenêtre
d’acquisition : possible à compter de 15 μm 2). Ensuite le logiciel lance les acquisitions.
81
Figure 36. Fréquences de vibrations des principales fonctions rencontrées dans les composés
organiques (http://www.biophyresearch.com/pdf/ftir.pdf).
Chaque spectre doit être sauvé en format .JDX dans un fichier numéroté de 1 à N
dans un fichier date. Ensuite un petit logiciel WSF, développé par l’INRA de Versailles,
regroupe tous les N fichiers dans un seul fichier nommé .brut qui est formaté comme suit :
Date de l’acquisition, Nom de l’échantillon, Numéro du spectre, gamme des NO.
Il est nécessaire de nommer l’échantillon en toutes lettres et d’y ajouter
systématiquement un tiret ‘-‘ juste à sa suite pour favoriser les étapes d’analyse de données
ultérieures. En effet, ce fichier .brut est destiné à des analyses statistiques développées par
l’équipe de l’INRA de Versailles (Mouille et al., 2003).
82
9 acquisition d’une carte de spectre : le format de fichier change car le mode
d’acquisition est différent. La version d’OMNIC® 7.3 permet l’acquisition de
cartographies complètes qui sont contenues dans un fichier .MAP. Il est
nécessaire de tronquer les spectres dans la gamme des NO d’intérêt (de 1800 à
800 cm-1) car l’acquisition se fait sur l’ensemble des NO (de 4000 à 800 cm-1)
(Figure 9). Ensuite il est possible d’extraire chacun des spectres de la
cartographie dans un format .spa qui est reconnu par la plupart des logiciels
d’analyse IR. Ces mêmes fichiers peuvent être convertis en .JDX pour les
analyses statistiques développées par Mouille et al., 2003.
4.3
Biochimie : dosage des composés pariétaux par le fractionnement de la
biomasse.
La méthode de fractionnement de la biomasse sèche de Van Soest (1967) permet
l’hydrolyse sélective des constituants des parois des fibres par une succession d’attaques de
détergent d’acidité croissante (Figure 37). La fraction hydrolysée est solubilisée dans le bain
alors que la partie intacte est piégée dans un sachet dédié entourant l’échantillon.
Trois solutions d’attaque acide se succèdent :
9 le détergent neutre (Neutral Detergent Solution : NDS) qui va permettre de
calculer le Neutral Detergent Fiber (NDF), soit la fraction soluble contenue dans
l’échantillon fibreux,
9 l’attaque par le détergent acide (Acid Detergent Solution : ADS) va permettre de
calculer le Acide Detergent Fiber (ADF) qui correspond aux hémicelluloses et à
la cellulose présentes d’ans l’échantillon,
9 l’attaque à l’acide concentré (acide sulfurique à 72%) permet de calculer la
fraction Acid Detergent Lignin (ADL) soit la fraction correspondant aux restes de
l’échantillon (lignines),
9 enfin la calcination permet de calculer la proportion des minéraux contenue dans
l’échantillon.
Par différence de masse, la proportion des composés conservés ou éliminés peut
être calculée et les dosages en proportion des constituants pariétaux et interpariétaux
évalués. Ci-dessous voici comment calculer les proportions des différents composés (Van
Soest, 1967) :
83
Formule générale
[MAH - MIS] - CDR
taux en fibre X =
PIP
x100
Formules pour le calcul du NDF, de l’ADF et de l’ADL
NDF =
[(PAN - MIS) - BLS] - (CDR - CDS)
x 100
PIP
ADF =
[(PAA - MIS) - BLS] - (CDR - CDS)
x 100
PIP
[(PAL - MIS) - BLS] - (CDR - CDS)
PIP
ADL =
Formule de calcul du taux de cendres
CDR = PCI – PCA
x 100
Formule de calcul du blanc
Abréviations utilisées dans les formules
abréviation
signification
MAH
Masse échantillon + sachet Après Hydrolyse
PIP
Poids Initial de Poudre
MIS
Masse Initiale du Sachet vide
PAN
Pesée (sachet+biomasse) Après Détergent Neutre
PAA
Pesée (sachet+biomasse) Après Détergent Acide
PAL
Pesée (sachet+biomasse) Après Hydrolyse Acide (72% H2SO4)
PCI
Pesée du sachet initial (sachet vide)
PCA
Pesée (sachet + biomasse) Après la calcination
CDR
Masse de Cendres de l’échantillon
BLS
Blanc Sachet : MAH - MIS pour le sachet vide témoin
CDS
Masse de Cendres du sachet vide témoin
Ces calculs sont rentrés dans un classeur Excel afin de ne pas répéter les opérations.
84
Figure 37. Schéma de principe du dosage des constituants pariétaux des fibres. Le dosage consiste en
une succession d’attaque de la matière sèche lignocellulosique par des attaques de détergent d’acidité
croissante. Cela correspond au Fractionnement de la biomasse lignocellulosique (Van Soest, 1967).
5
Caractérisation des fibres avec les techniques d’imagerie : analyse d’image
Les systèmes d’observation utilisés durant les travaux (loupe à fluorescence Leica®
MZ 16 FA, microscope confocal Olympus® et microscope photonique Zeiss® Axioplan) sont
tous équipés d’une caméra d’acquisition numérique. C’est-à-dire que les images « réelles »
vont être transformées en image numérique par le système de prise de vue (Figure 38). La
digitalisation de l’image conventionnelle consiste à attribuer à chaque grain constitutif de
l’image un pixel. En effet, les éléments composants l’image numérique sont des pixels (pour
picture element). C’est un peu comme si une grille était superposée sur l’image et que
chacun des carreaux de la grille était analysé pour lui attribuer une teinte (Figure 38).
Classiquement les images « noires et blanches » sont codées en 8 bits ce qui correspond à
une matrice codée de 0 à 255 niveaux de gris. Pour les images couleurs, le spectre lumineux
est séparé en trois gammes d’ondes centrées sur le rouge (R), le vert (V) et le bleu (B) et
chaque composante colorimétrique est codée sur 256 niveaux pour donner une image
couleur en 24 bits (8*3 bits ou 256*256*256 =16,7 millions de couleurs). Dans le cas des
images « couleurs » générées en microscopie confocale, chaque canal (λemission) porte 256
niveaux de gris et il est possible d’attribuer informatiquement de fausses couleurs aux
différents canaux (λemission)
dans une image. A partir des images numériques, des
85
traitements mathématiques peuvent s’appliquer pour extraire les objets contenus dans
l’image et les caractériser (mesures, comptage, etc.) : c’est l’analyse d’image.
Dans le cas des images de coupes transversales de chanvre, l’objectif est de
caractériser la proportion de surface occupée par les fibres (à l’échelle de la loupe), puis
« d’extraire » les fibres et les caractériser plus précisément (à l’échelle du MCBL).
L’optimisation des analyses réside dans la démarche heuristique : de la préparation de
l’échantillon au système d’acquisition choisi en prenant compte des limites associées à
chaque étape. Afin de poser les bases de la méthode, quelques points importants attenants
aux caractéristiques d’acquisition (paramètres des capteurs, différentes résolutions) et aux
traitements d’image sont présentés.
5.1
Principe de l’approche en analyse d’image
5.1.1
Les capteurs
Les capteurs des systèmes numériques d’acquisition dans le visible sont constitués
de photorécepteurs qui produisent une tension électrique proportionnelle au nombre de
photons reçus. La résolution spatiale des images dépend du nombre de photorécepteurs et
de l’optique (taille du pixel) (Figure 39, A). La résolution de luminance (Figure 39, B)
dépend de la résolution du convertisseur analogique-numérique qui donne la dynamique du
pixel (classiquement en 8 bits). Les petites variations de la luminance correspondent au
« bruit » (Figure 39, C) de l’image (plus la résolution de luminance est élevée, plus le
rapport signal/bruit doit être grand pour optimiser la qualité des images).
Les systèmes d’acquisition numérique sont pourvus de capteurs caractérisés par les
paramètres de linéarité et de sensibilité. Il est important de savoir que la linéarité (c) dépend
directement du gain (c = gain.aγ + offset) et la sensibilité est l’inverse du gain (s= 1/gain). Le
gain et le γ sont des paramètres modifiables lors de l’acquisition sur la plupart des systèmes.
Ces paramètres dépendent du système d’acquisition utilisé (le γ est un facteur issu des tubes
cathodiques constitutifs de l’appareillage d’acquisition). Par exemple, afin d’optimiser l’image,
il faut favoriser un gain bas (proche de 1) qui favorisera la linéarité et baissera le rapport
signal sur bruit.
5.1.2
Le traitement d’image
Pour l’exploitation des images numériques, il faut généralement les simplifier. A partir
d’une image codée en 8 bits il est possible de la transformer en une image binaire (avec
seulement deux couleurs : noir et blanc) où les pixels noir (1) correspondent aux objets et
86
les pixels blancs (0) au fond de l’image (l’inverse est possible aussi, c’est à dire attribuer aux
objets la couleur blanche et le noir pour le fond). Cette étape clé du traitement numérique de
l’image est le seuillage, c’est-à-dire le passage de l’image numérique à l’image binaire. Le
principe du seuillage réside dans le fait d’attribuer à un niveau de gris donné une valeur de
seuil afin de partager les pixels arbitrairement en noir et blanc (image binaire) (Figure 40). Il
faut comprendre ici que c’est l’opérateur qui va choisir le seuil à appliquer en fonction des
objets qu’il souhaite extraire pour les caractériser dans l’image. Pour seuiller l’image
(Fonction treshold dans Image J), il est nécessaire que l’image initiale soit suffisamment
contrastée c’est-à-dire que la répartition du nombre de pixel en fonction des niveaux de gris
doit être suffisante (Figure 40).
Lorsque l’image est binarisée, les objets contenus dans l’image peuvent êtres
extraits : c’est la segmentation (Fonction analyse particle dans Image J). La caractérisation des
objets segmentés peut concerner leur comptage, le calcul de paramètres de taille (largeur,
longueur, aire, périmètre), leur paramètre de forme (le rapport de la longueur sur la largeur,
la solidité, etc.) en fonction des questions initiales de l’opérateur.
Figure 38. Principe d’acquisition et de formation de l’image numérique. L’image analogique est convertie
en image numérique composée de pixels (d’après l’ABC de l’Image Numérique, INRA, 2008).
87
Figure 39. Les différentes résolutions lors de l’acquisition des images numériques. A. résolution spatiale,
B. résolution de luminance, C. rapport signal /bruit (d’après l’ABC de l’Image Numérique, INRA, 2008).
Figure 40. Exemple de binarisation d’image sur une image de grain de riz. Au centre, l’histogramme de
répartition des pixels en fonction de leur niveau de gris, une valeur seuil (en orange) est choisie afin
d’attribuer aux pixels inférieurs la valeur noire (1) et aux pixels supérieurs la valeur blanche (0) (d’après
l’ABC de l’Image Numérique, INRA, 2008)...........................................................................................................
88
6
Outils informatiques de traitements de données utilisés
9 Les traitements des données issues des campagnes de mesure sur les plantes
cultivées en champ ont été effectués avec un logiciel statistique dédié à ce type
d’analyse StatBox® (Grimmersoft). La comparaison de deux moyennes est étudiée
avec un T-test de Student (5 < n < 30) ou avec un test non paramétrique (Kruskall et
Wallis) en considérant que les échantillons suivent une loi normale. Si les
échantillons considérés ne suivent pas la loi normale, le test de Mann et Whitney non
paramétrique est appliqué. Le pourcentage de risque est testé entre 5 et 0,5%.
Des tests paramétriques de Fischer sont réalisés pour les échantillons indépendants,
comme pour comparer les données issues de deux champs différents où l’hypothèse
initiale suppose l’égalité des variables théoriques. Sur les gammes d’échantillon avec
n
≥ 30 et avec plus de deux conditions à comparer, des analyses de variance
ANOVA sont réalisées.
Un autre logiciel dédié aux analyses statistiques a été utilisé pour l’ensemble des
données traitées. Plus simple d’utilisation, le logiciel SigmaStat® 3.5 permet des
analyses de variance, des comparaisons de moyenne (T-Test notamment), etc.
9 Les traitements des données FT-IR sont réalisés sous R.2.10.1 avec les scripts écrits
par Aurélie Urbain et l’INRA de Versailles ©. Les étapes de normalisation des
données sont communes aux deux techniques FT-IR employées. Le traitement
statistique emprunte un autre script permettant de réaliser un T-test de Student sur
tous les NO entre différentes gammes de spectre (exemple : les différents temps de
rouissage).
9 Le logiciel TmeV®, initialement dédié aux analyses de microarray, est utilisé pour les
Analyses en Composantes Principales. Ces analyses consistent à regrouper les
données par similitudes, c’est-à-dire que si les groupes de données sont proches, ils
seront cartographiés ensemble alors que si les groupes de données sont distincts, ils
pourront être séparés.
89
90
±•—Ž–ƒ–•‡–‹•…—••‹‘
1
Expérimentations en champ
Afin d’évaluer l’impact des conditions culturales sur les fibres longues de chanvre,
deux campagnes de test en champ ont été menées pendant les années 2008 et 2009 avec
nos partenaires locaux en Poitou-Charentes (regroupés en SARL : Ecochanvre 86). Les
détails de ces expérimentations sont dans le chapitre « Méthodes ».
Les chanvriculteurs locaux utilisent habituellement une densité de semis de 40 kg/ha
pour un apport azoté de 80 U, cette condition a été ajoutée aux plans d’expérimentation
(Figure 41). Cela permet d’envisager des comparaisons entre les champs, et d’une année
sur l’autre.
Figure 41. Plan d’expérimentation en champ. Disposition réelle. A. Plan d’expérimentation des deux
champs de la campagne 2008 : le Champ 1 concerne les tests d’apport azoté, le Champ 2 concerne les
tests de densité de semis. B. Plan d’expérimentation du champ de la campagne 2009 : les densités de
semis ayant été faussées à cause de l’impact des oiseaux sur le semis, il est considéré une moyenne de
densité de 50 kg/ha sur l’ensemble de la parcelle testée. La condition de culture 80 U/40 kg/ha est utilisée
par le chanvriculteur dans tout le reste du champ.
91
1.1
CAMPAGNE 2008
Les premiers tests ont été menés en parallèle sur deux champs différents. Le premier
champ sur lequel ont été testés les impacts de l’apport azoté était de nature argilo calcaire,
le deuxième champ concernant les tests de densité de semis était de nature calcaire.
Pour rappel, les semis ont été effectués le 7 mai 2008 et ont été récoltés le 10 août
2008. A chaque point de prélèvement, 10 plantes par condition sont mesurées dans le
champ.
1.1.1
Suivi de la croissance des chanvres en champs
1.1.1.1 Impact de l’apport d’azote
Les différents apports azotés testés (80, 120 et 160 U avec un engrais azoté
classique ammonitrate dont la composition est spécifiée dans le chapitre « Matériel »)
n’induisent pas de différences significatives sur les tailles des chanvres obtenues (Figure 42).
Les tests statistiques non paramétriques de Kruskal et Wallis, adaptés aux
échantillons indépendants, n’indiquent pas de différence significative au seuil de 1 et 5%, ce
qui conforte ces observations. Toutefois, ils révèlent une hétérogénéité biologique et
environnementale plus forte en début de croissance qu’en fin de croissance. En effet, l’écarttype résiduel (ETR) mesuré par les analyses statistiques varie de 17 à 15% de la première à
la dernière date de prélèvement. Au-delà de 15%, l’ETR est décrit comme fort ce qui
suggère une forte déviation des données brutes, liée à la variabilité biologique des
échantillons. Il est à noter que le nombre d’échantillons pour la campagne 2008 est limité (10
plantes mesurées par date de prélèvement et par condition) ce qui augmente la variabilité
biologique observée.
92
200
Taille des chanvres (cm)
180
160
140
120
80 U
120 U
160 U
100
80
60
40
20
0
23 juin 2008
7 juillet 2008
22 juillet 2008
4 août 2008
Figure 42. Impact de l’apport d’azote (80, 120 et 160 U) sur la croissance des chanvres étudié à 4 dates de
prélèvements (moyenne des 10 plantes mesurées ± l’écart-type sur chacune des conditions).
D’après la FNPC (Bouloc, 2006), l’absorption d’azote s’effectue principalement entre
le stade 3 paires de feuilles (la taille des chanvres est alors d’environ 30 cm), soit 3
semaines après le semis, et la floraison, définie à compter de 3 mois après le semis
(Mediavilla et al., 1998). Les dates de prélèvement choisies lors de cette campagne se
situent toutes dans la zone de forte absorption azotée présumée (à compter de 7 semaines
après le semis jusque 3 mois, au moment de la fauche). Il n’est donc pas évident de rendre
compte de l’impact de l’absorption de l’azote aux premiers stades de développement de la
plante. Pourtant, la fertilisation azotée est réalisée par les agriculteurs avant l’implantation
des chanvres, au moment du semis. Les besoins en azote sont estimés de 14 à 15 U
(Bouloc, 2006) par tonne de matière sèche (t/MS) si les besoins en eau sont couverts
(compte-tenu des rendements potentiels estimés entre 6 et 14,8 t/ha (Mediavilla et al., 2001 ;
Bouloc 2006, ITC), cela explique l’apport azoté préconisé à 120 U pour l’obtention des
meilleurs rendements). Mais, seule la réalisation d’un bilan azoté par l’agriculteur permet
d’ajuster sa fertilisation, en fonction des reliquats azotés présents sur ses parcelles. Dans le
cadre de cette campagne en champ, aucun bilan azoté préalable n’a été réalisé. Il est donc
difficile de savoir quelle est réellement la quantité d’azote présente dans le sol, et en fonction
des apports testés. Il n’est pas évident a fortiori d’évaluer les pertes des apports azotés entre
l’étape de fertilisation et l’absorption efficace par les plantes. Néanmoins, quelle que soit la
93
quantité d’azote initialement présente dans le sol, toutes les parcelles du même champ sont
homogènes. Les comparaisons entre les différents apports azotés testés sont donc justifiées.
Les rendements en paille se stabilisent à partir d’une certaine dose d’azote de 100 à
120 U, compte non tenu des reliquats présents dans le sol (données FNPC, 1986, 1984, et
LCDA, 1982 citées dans Bouloc, 2006). L’apport de 80 U est suffisant pour avoir une forte
croissance dans nos essais, compte tenu des reliquats d’azote présents dans le sol. Les
meilleurs rendements en paille totaux sont rapportés pour des apports azotés compris entre
150 et 240 U (Van der Werf et al., 1995b). Le taux de fibres est peu sensible aux doses
d’azote (Struik et al., 2000) toutefois les meilleurs rendements en fibre sont rapportés entre
50 et 150 U (Van der Werf et al., 1995b).
L’apport d’azote peut modifier la croissance en hauteur des chanvres mais aussi la
croissance radiale (Van der Werf et al., 1995b). Les effets de l’azote sur la morphologie des
plantes ont été étudiés en fonction d’une gamme de densité de semis afin de révéler l’impact
croisé des effets densité et des effets d’apport azoté. L’apport azoté interagit avec la densité
de semis (Van der Werf et al., 1995b) en terme de compétition. A densité équivalente, si les
apports azotés sont élevés (200 U), l’effet de compétition entre les plantes est plus important.
Les rendements augmentent par contre la densité faiblit. La croissance de certaines plantes
est plus robuste que d’autres i.e la dynamique de compétition est amplifiée. Les plantes qui
croissent de façon plus importante optimisent leur accessibilité à la lumière tout en
détériorant l’accès aux autres, la canopée des plantes plus grandes couvrent l’accès à la
lumière des autres et provoquent l’auto-éclaircissement (Van der Werf et al., 1995a et b). )
En effet, à densité équivalente, 5% des plantes meurent avec 80 kg/ha contre 25% des
chanvres à 200 kg/ha d’azote (Van der Werf et al., 1995a) par contre les rendements pailles
à la récolte restent similaires en poids mais pas en nombre de plantes.
1.1.1.2 Impact de la densité
Les différents densités testées (40, 50 et 60 kg/ha) n’impactent pas les tailles des
chanvres mesurées (Figure 43). Les tests statistiques de Kruskal et Wallis n’indiquent pas de
différence significative aux seuils de 1 et 5%. Toutefois ils révèlent à nouveau une forte
hétérogénéité biologique et environnementale, encore relevée avec les ETR au-delà de 15%.
Bien que les différences ne soient pas statistiquement différentes, l’effet densité reste assez
marqué, avec une croissance des tiges plus importante pour la densité 40 kg/ha que pour les
densités 50 et 60 kg/ha et ce quelque soit la date de prélèvement (Figure 43).
94
200
Taille des chanvres (cm)
180
160
140
120
40 kg/ha
50 kg/ha
60 kg/ha
100
80
60
40
20
0
23 juin 2008
7 juillet 2008
22 juillet 2008
4 août 2008
Figure 43. Impact de la densité (40, 50 et 60 kg/ha) sur la croissance des chanvres étudié à 4 dates de
prélèvements (moyenne des 10 plantes mesurées ± l’écart-type sur chacune des conditions).
Les densités de semis ne sont pas équivalentes aux densités de levée des chanvres.
En effet, l’ITC rapporte une perte de 28% à la levée, c’est-à-dire entre le nombre de graines
semées et le nombre de plantes levées. De plus, 15% des plantes meurent en cours de
croissance, c’est-à-dire entre la levée et jusqu’à la fin de la floraison sur le nombre de
plantes récoltés (Communication Legros, ITC, lors du congrès « Le chanvre dans tous ses
états », Poitiers, 2010). D’après la littérature présentée dans l’Introduction bibliographique
(Bouloc, 2006) et d’autres études sur l’impact des densités de semis sur la croissance des
chanvres (Westerhuis et al., 2009), une densité de semis élevée favorise la croissance des
chanvres en taille, toutefois une trop forte densité implique un effet d’auto éclaircissement
des plantes liés à l’effet de la compétition (Van der Werf et al., 1995).
Dans le cadre des investigations menées en champ, les densités de semis n’étaient
pas assez étalées pour rendre compte de l’effet d’auto-éclaircissement des plantes. Des
comptages ont été réalisés sur des petits carrés de 1 m2 aux premiers stades de
développement. Mais les carrés étant définis de manière fixe dès le début de la levée, les
comptages sont biaisés du fait du passage trop fréquent des manipulateurs autour des
carrés de mesure. Pour effectuer un compte-rendu statistique des pertes des plantes entre le
95
semis et la levée, puis entre la levée et la récolte, il serait nécessaire de prélever
aléatoirement dans le champ au moins 3 fois 1m2
dès l’implantation du semis puis
régulièrement en cours de croissance des plantes, jusqu’à la récolte. Les plantes ainsi
prélevées sont plus faciles à dénombrer qu’en champ directement. D’autre part, le fait de
prélever aléatoirement des petites surfaces dans le champ permettrait de s’affranchir du
biais causé par l’impact du passage des manipulateurs dans le cas des carrés fixes. Le
dénombrement et les mesures peuvent être effectués au laboratoire ce qui limite les erreurs
possibles. L’impact de la perte de plantes au cours de la croissance pourrait être ainsi mieux
évalué.
1.1.1.3 Impact des conditions pédologiques sur la croissance des chanvres
Le premier champ, sur lequel les tests d’apport azoté ont été réalisés, a été semé
avec une densité de 40 kg/ha. Le deuxième champ, sur lequel les tests densité de semis ont
été menés, a reçu un apport d’azote de 80 U. Il est alors possible d’évaluer l’impact de la
pédologie des champs sur la croissance des chanvres en comparant la condition de semis à
40 kg/ha et 80 U du champ 1 (Azote, Figure 44) au champ 2 (Densité, Figure 44).
D’après le graphique, il n’apparaît pas de différences significatives entre les
croissances des chanvres issus des deux champs différents. La réalisation du test de
Student, adapté pour la comparaison des moyennes sur ces échantillons indépendants, ne
témoigne pas de différence significative de croissance des chanvres entre les champs 1 et 2
au seuil de 5%. L’impact pédologique sur la croissance des chanvres n’est pas mis en
évidence (Figure 44). Toutefois, les plantes sont plus grandes dans le champ 1.
Taille des chanvres (cm)
200
180
160
140
120
Champ 1. Azote
100
Champ 2. Densité
80
60
40
20
0
23 juin 2008
7 juillet 2008
22 juillet 2008
4 août 2008
Figure 44. Impact de la pédologie sur la croissance des chanvres étudié à 4 dates de prélèvements
(moyenne des 10 plantes mesurées ± l’écart-type sur chacune des conditions). Les deux champs sont
cultivés avec les mêmes conditions 80 U et 40 kg/ha de densité de semis.
96
C’est le champ 1, de nature argilo-calcaire, qui favorise une meilleure croissance des
plantes. L’ancrage racinaire est certainement favorisé par ce type de sol qui semble plus
meuble qu’un terrain argileux. La croissance racinaire peut se réaliser en profondeur et
permettre l’assise d’une meilleure croissance en hauteur. De plus, un terrain argilo-calcaire
retient mieux l’eau, ses capacités hydriques ou hydromorphie, sont meilleures qu’un sol
calcaire. Un terrain argilo-calcaire favorise l’accessibilité à l’eau pour les plantes, élément
indispensable de leur croissance. Les données, issues de la comparaison entre les deux
types de champ, sont donc en accord avec la littérature. Pourtant, il est à savoir qu’un sol
trop hydromorphe, comme un sol alluvionnaire, provoquerait au contraire des pertes de
rendements (Bouloc, 2006).
1.1.2
Récolte et rendements
Cent mètres carrés pour chacune des conditions testées ont été récoltés à la main
après fauchage mécanique. Le fauchage a été réalisé par les chanvriculteurs partenaires. Le
premier champ, sur lequel les tests d’apport azotés ont été effectués, a été fauché à l’aide
d’une faucheuse/conditionneuse. Le deuxième champ, sur lequel les tests de densité de
semis ont été menés, a été fauché à l’aide d’une faucheuse. La faucheuse/conditionneuse
(Figure 45) est pourvue d’un système de rouleaux permettant un premier broyage des tiges
dans leur longueur en vue de faciliter le rouissage en champ ultérieur, pratiqué par les
chanvriculteurs partenaires.
Figure 45. Schéma d’une faucheuse/conditionneuse. Pourvu de ce système de récolte, les tiges de
chanvre après la fauche sont directement guidées dans les rouleaux où elles subissent un premier
broyage facilitant le rouissage au sol ultérieur (www.ikonet.com/.../faucheuse-conditionneuse.php).
97
Le ramassage des 100 m2 pour chacune des conditions a été effectué à la main et
chaque fois, la pesée des chanvres a été effectuée afin de calculer les rendements (Tableau
9). Le rendement en paille correspond au poids de la paille rapportée sur la surface récoltée.
Les rendements sont faibles comparativement aux données de la littérature qui
indiquent un rendement moyen compris entre 60 et 80 kg/100 m2 (Bouloc, 2006). Des
rendements élevés ont été obtenus sur d’autres variétés de chanvre (Futura 75, Tiborszallasi)
avec respectivement 119 et 140 kg/100 m2 (les années 2003 et 2004) et 95 à 115 kg/100 m2
(Amaducci et al., 2008). Les comparaisons des différents rendements obtenus sont
détaillées dans les paragraphes 1.1.2.1 et 1.1.2.2. Toutefois, aux vues de l’hétérogénéité
des plantes et du champ, il semble plus pertinent d’évaluer les rendements calculés par les
agriculteurs sur l’ensemble de leur parcelle (§ discussion).
Tableau 9. Rendement de paille totale obtenue à la récolte des chanvres.
Densité de semis : 40 kg/ha
Conditions testées
80 U
2
Rendements (kg/100m )
37
120 U
20
160 U
65
Apport azoté : 80 U
40 kg /ha
28
50 kg/ha
31
60 kg/ha
45
1.1.2.1 Impact de l’apport azoté sur les rendements en paille de chanvre
Un semis trop tardif peut être à l’origine des faibles rendements obtenus (Tableau 8).
En considérant une valeur référence à 70 kg/100 m2 (la médiane des rendements optimaux
indiqués par Bouloc, 2006), à 80 U le rendement obtenu n’est que de 53% par rapport aux
capacités optimales, de 29% à 120 U, alors qu’à 160 U 93% du rendement optimal est
couvert. Les conditions météorologiques peuvent expliquer en partie ce phénomène. Comme
elles n’étaient initialement pas favorables, le semis a été décalé de deux semaines dans le
temps (semis début mai plutôt que mi-avril dans la région Poitou-Charentes). Le champ des
tests azotés n’a pas été traité aux désherbants préalablement. La levée des chanvres a eu
lieu en même temps que les adventices, qu’ils étouffent classiquement par une levée
massive et précoce. Le chanvre étant une plante rustique, elle reste assez sensible aux
désherbants qui ne sont généralement pas employés. Toutefois, certains herbicides offrent
une sélectivité vis-à-vis du chanvre d’après les études menées depuis 1989 par la FNPC et
la LCDA (Bouloc, 2006). Le champ a été envahi inégalement par les adventices. Pour la
condition d’apport de 120 unités d’azote une forte proportion de Graminées a été retrouvée
(B, Figure 46), ce qui explique le très faible rendement obtenu. Toutefois, si l’on exclut la
98
valeur de rendement obtenue à 120 U, l’apport d’azote a un effet favorable sur la croissance
des chanvres. En effet, à 160 U, le rendement en paille est 1,8 fois plus élevé qu’à 80 U.
Un des problèmes liés à l’excès d’azote concerne notamment les difficultés
provoquées entre la récolte et la transformation (Bouloc, 2006). En effet, les plantes
surfertilisées présentent des tiges plus vertes, moins « sensibles » au rouissage et qui sont
aussi plus difficiles à défibrer mécaniquement (Bouloc, 2006). Mais les chanvres ont été
fauchés à l’aide d’une faucheuse conditionneuse et l’état des tiges ramassées était trop
dégradé pour envisager de les conserver et d’étudier leur comportement au cours des
étapes de rouissage. En effet, la conception de fagot de tiges orientées de 80 cm de long
était impossible et l’ensemble de la récolte obtenue a été cédée aux services des espaces
verts de l’Université de Poitiers.
Figure 46. Impact des adventices sur le champ 1 (test d’apport azoté). A. Chanvre parasité par du liseron
(Convolvulus arvensis) et B. présence de Graminées.
1.1.2.2 Impact de la densité sur les rendements en paille de chanvre
Sur le second champ, un prétraitement anti adventices a été réalisé avant le semis et
le semis a été réalisé un peu plus précocement que dans le champ précédent (semis fin avril
plutôt que début mai). C’est pourquoi le champ semble beaucoup plus « propre » (Figure 47),
c’est-à-dire que seuls les chanvres couvrent le sol et aucune adventice n’est observable.
Toutefois, les rendements obtenus ne sont pas satisfaisants (Tableau 8). En effet,
considérant à nouveau 70 kg/100 m2 comme valeur de rendement de référence, les
99
rendements obtenus sur le semis densité sont 2,5 fois (pour la condition 40 kg/ha) à 1,5 fois
moindre (pour la condition 60 kg/ha). Par contre, les densités de semis concordent avec les
rendements. En effet, les rendements augmentent avec la densité de semis. Si le rendement
maximal est considéré à 60 kg/ha dans ces essais (100%), le rendement baisse de 32% à
50 kg/ha et de 38% à 40 kg/ha.
A ces densités, le phénomène d’auto éclaircissement des chanvres n’est pas
observable. Il serait nécessaire de tester des densités de semis encore plus contrastées
pour pouvoir observer un impact décroissant sur le rendement en paille afin de délimiter la
plus haute densité de semis possible.
Figure 47. Observation des chanvres semés dans le champ 2, 3 mois après le semis. Densité de semis de
chanvre à 40 kg/ha (A), 50 kg/ha (B) et 60 kg/ha (C).
1.2
CAMPAGNE 2009
Afin d’évaluer l’impact croisé des apports azotés vs densité de semis, la campagne
2009 a été quelque peu modifiée par rapport à l’année précédente. Les conditions d’apport
azoté testées sont de 0, 80 et 120 U et les densités de 25, 50 et 75 kg/ha. Ces conditions ont
été croisées sur une même parcelle (Figure 41) située en plein champ. La terre de ce champ
est argilo calcaire. Les semis ont été réalisés le 10 avril 2009 et la récolte a été effectuée le
10 août 2009. Pour rappel, la condition de culture usuelle des chanvriculteurs locaux à 80 U
d’apport azoté et à 40 kg/ha de densité de semis, est ajoutée dans les données.
Afin d’optimiser l’analyse des données, le nombre d’échantillon mesuré a été
augmenté par rapport à la campagne 2008. En effet, lors de la campagne 2009, 30 plantes
ont été mesurées à chaque date de prélèvement et pour chacune des conditions. De plus,
les plantes ont été coupées et mesurées au laboratoire. De ce fait, des mesures
supplémentaires ont pu être réalisées, notamment pour l’étude de la croissance des plantes
en considérant le nombre et la longueur des entre-nœuds.
100
Seul l’impact de l’azote a pu être évalué au cours de cette campagne de tests au
champ. En effet, de nombreux pigeons ont mangé les graines du semis, provoquant la perte
de ces conditions. Comme la parcelle était initialement définie en fonction des trois densités
testées, 12 plantes par « condition de densité » ont été ramassées dans chacune des trois
conditions azotées testée. Ce mode de prélèvement permet de ne pas biaiser l’impact des
différentes densités et la densité de semis de la parcelle peut alors être estimée à 50 kg/ha
en moyenne.
1.3
Impact de l’apport azoté sur la croissance des chanvres
Les figures 48 et 49, indiquent, qu’aux premiers stades de développement des
chanvres, le manque d’azote impacte la croissance des plantes. Les analyses de variance
(Analyses de variances, réalisées avec StatBox®) au seuil de 5% confirment des différences
significatives des tailles de chanvre (sur 30 plantes mesurées à chaque point de prélèvement)
(Figure 48).
14 mai
8 juin
22 juin
6 juillet
22 juillet
10 août
Figure 48. Impact de l’azote (0, 80 et 120 U) sur la croissance en taille des chanvres en fonction des dates
de prélèvements et en fonction des apports azotés (moyenne sur 30 plantes mesurées ± l’écart-type).
L’analyse de variance avec le test ANOVA effectué pour chaque condition sur 30 plantes mesurées pour
chaque point fourni des groupes indiqués par les minuscules a, b, c au dessus des écart-type. Si la lettre
entre deux conditions à une même date de prélèvement est semblable, les différences ne sont pas
significatives, à l’inverse, si la lettre à une même date de prélèvement diffère entre deux conditions
azotées testées, la différence est significative.
Les différences significatives sont relevées entre les tailles des plantes en fonction de
chaque condition azotée testée à compter de la deuxième date de prélèvement (8 juin) : à ce
101
stade, les plantes ont deux mois et sont en pleine croissance végétative. L’azote modifie la
croissance des chanvres avec une meilleure croissance en taille observable à 120 U qu’à 0
U. Jusqu’au 22 juin, la taille des chanvres est d’autant plus importante que la concentration
d’azote apportée est grande (Figure 48 et 49). Néanmoins, le nombre d’entre-nœud ne varie
pas en fonction des conditions azotées dans les trois premiers mois de croissance des
chanvres (tendance observable jusqu’à la mi-juillet) (Figure 49).
En revanche, la croissance des chanvres est modifiée après le 22 juin (2,5 mois
après le semis) où l’analyse de variance distingue la condition azotée 0 U, les 80 et 120 U
sont rassemblées (Figure 48). Ce sont les conditions d’apport azoté extrême, 0 et 120 U qui
provoquent une plus faible croissance visible sur la taille des chanvres par rapport à la
condition intermédiaire 80 U. Au 6 juillet, les deux groupes sont rassemblés par l’analyse de
variance mais diffèrent ensuite jusqu’à la récolte du 10 août. A la fin de la croissance des
plantes, dès le 22 juillet, chacun des groupes est distinct de l’autre. Les plus petits chanvres
sont obtenus sans apport d’azote (0 U) ou avec un apport fort (120 U) et la tendance
s’amplifie à la récolte.
Par comparaison avec les tests d’apport azoté de la campagne 2008, les plantes
croissent de façon identique dans les 2 premiers mois. En effet, il est possible de comparer
les tailles des chanvres de la figure 44 (80 U, 40 kg/ha) avec celles de la figure 48 (80 U, ~
50 kg/ha). Le 23 juin 2008 est comparable au 8 juin 2009 (du fait de la différence de dates de
semis, à ces dates les chanvres sont à 1,5 mois de croissance) et les plantes mesurent
autour de 80 cm. De la même façon, le 22 juin est comparable au 7 juillet (2 mois après la
date de semis) et les plantes mesurent autour de 125 cm quelque soit l’année de test au
champ. A 2,5 mois (22 juillet 2008 et le 6 juillet 2009), les chanvres atteignent 140 cm en
2008 contre 150 cm en 2009. A trois mois (4 août 2008 et 22 juillet 2009), les chanvres des
deux années mesurent 160 cm en moyenne et cela correspond à la taille maximale observée
dans ces études. L’année 2009 les chanvres ont poussé durant 4 mois mais la taille
moyenne à 4 mois n’est pas différente par rapport au mois précédent. Pour la valorisation de
la tige de Félina 32, il ne semble pas nécessaire d’effectuer un semis précoce. Mais il faut
être prudent sur cette comparaison car les densités de semis ne sont pas équivalentes. La
comparaison avec la même densité de semis est possible, mais il faut rappeler que dans le
cadre de ces essais, le terrain sur lequel a été testée la densité 50 kg/ha en 2008 était en
cuvette. Si les chanvres semblent moins croître en 2008, cela est certainement dû au fait
qu’ils étaient dans la mauvaise partie du champ qui présentait un tassement du sol.
102
Les différences observées sur la croissance des chanvres en taille, en fonction de la
quantité d’azoté apportée, peuvent être due à une différence sur le nombre d’entre-nœud
que comportent les tiges. L’observation plus précise des effets des apports azotés sur la
croissance des chanvres a été réalisée en comptant le nombre d’entre-nœud. Pour ces
analyses, les données évaluées ne concernent que les apports azotés définis dans la
parcelle, à savoir 0 U, 80 U et 120 U, en considérant une densité moyenne de 50 kg/ha
(Figure 49). En effet, la comparaison exclut la condition usuelle du chanvriculteur car les
densités de semis utilisées ne sont pas équivalentes.
Figure 49. Impact de l’azote (0, 80 et 120 U) sur la taille et le nombre d’entre-nœud des chanvres (à partir
de 30 plantes mesurées ± l’écart-type). L’analyse de variance réalisée par le test ANOVA montre des
différences significatives sur la taille des chanvres à la deuxième et troisième date de prélèvement. En
revanche, l’analyse de variance ne montre pas de différences significatives sur le nombre d’entre nœud à
ces mêmes dates de prélèvement. A la quatrième et à la cinquième date de prélèvement, l’analyse de
variance distingue les conditions 120 U et 0 U de la condition 80 U.
103
L’analyse de variance ne montre pas de différence significative sur le nombre d’entrenœud au trois premières dates de prélèvement (Figure 49). Pourtant, l’azote a un effet sur la
croissance des chanvres en tailles comme l’indique les groupes a, b, c distingués par
l’ANOVA les 8 et 22 juin. L’azote modifie la croissance des chanvres aux stades de
développement végétatifs de la plante, i.e entre 1 et 2 mois après le semis, mais pas le
nombre d’entre-nœud. Ensuite, à deux mois et demi après le semis (6 juillet), l’analyse de
variance distingue les conditions 0 U et 120 U de la condition intermédiaire 80 U. A ce stade,
l’impact de l’azote sur la croissance des plantes est observable tant sur la taille que sur le
nombre d’entre-nœud. La condition d’apport azoté intermédiaire 80 U est plus favorable à la
croissance des chanvres que ce soit sur la taille ou sur le nombre d’entre-nœud. Le nombre
d’entre-nœud est fortement modifié les 6 et 22 juillet alors que les effets sur la taille ne sont
pas si importants. Toutefois, il faut être vigilant quant au décompte des entre-nœuds lorsque
les entre-nœuds alternent apparaissent, en effet la phyllotaxie des chanvres est très variable
et il n’est pas évident de compter les points d’ancrage des feuilles ou fleurs.
Il est intéressant de remarquer que l’azote ne modifie pas le nombre d’entre-nœud
aux premiers temps de la croissance végétative des plantes. Comme la taille des chanvres
est influencée en fonction de l’azote apporté, la différence de taille peut-être due à une
différence de longueur des entre-nœuds.
1.3.1
Etude de la croissance des chanvres, mesure des entre-nœuds
Pour le suivi de la croissance des plantes à l’échelle de l’entre-nœud, toutes les
mesures sont effectuées sur 30 plantes au laboratoire. Les nœuds sont comptés à partir de
la cicatrice encore visible des cotylédons. Un nœud correspond aux points d’ancrage des
feuilles sur la tige. En moyenne, les 8 à 10 premières feuilles sont bien face à face puis les
positions des feuilles s’alternent (Mediavilla et al., 1998). L’alternance étant très aléatoire en
fonction des plantes, seuls les 8 à 10 premiers nœuds sont considérés. De plus, l’alternance
de la position des feuilles est un marqueur d’initiation de la floraison (Mediavilla et al., 1998),
à un stade où la période de forte croissance végétative est dépassée (à 2 mois voire 2, 5
mois après le semis).
Comme visible sur les figures 48 et 49, à la première date de prélèvement, soit un
mois et demi après le semis, les différents apports azotés (0, 80 et 120 U) ne changent ni la
taille des chanvres, ni le nombre d’entre-nœud. L’observation de la longueur en fonction du
numéro d’entre-nœud ne montre pas non plus de différences (Figure 50, 14 mai). L’entrenœud numéro 2 est le plus grand quelque soit l’apport d’azote testé.
104
Aux deuxième et troisième dates de prélèvement (8 et 22 juin) des différences entre
les tailles des entre-nœuds sont remarquées (Figure 50). Les entre-nœuds 3, 4 et 5 sont les
plus grands, quelque soit l’apport azoté. Les analyses de variance ANOVA distinguent
différents groupes en fonction des différents apports azotés testés. A deux mois (8 juin), les
entre-nœuds 3 et 4 ont des tailles plus importantes en fonction de la concentration d’azote
apportée. La distinction des groupes est moins significative à 2 mois et demi ou pour les
autres entre-nœuds. Toutefois, il est à remarquer que l’absence d’apport azoté (0 U),
provoque un faible développement de la taille des entre-nœuds ce qui implique des entrenœuds de taille 35 à 40% inférieure en moyenne aux entre-nœuds 80 et 120 U le 8 juin.
Cette tendance est moins prononcée le 22 juin avec tailles d’entre-nœuds des 0 U
inférieures de 5 et 25% par rapport aux autres apports azotés de 80 et 120 U. Ces résultats
sont concordants avec les analyses précédentes sur les tailles des chanvres en fonction des
apports azotés.
Figure 50. Impact de l’azote (0, 80 et 120 U) sur la croissance végétative des plantes. Les mesures de ces
graphiques concernent la longueur des entre-nœuds numéro 1 à 8 aux trois premières dates de
prélèvement (moyenne sur 30 plantes ± l’écart-type).
105
Les entre-nœuds 3, 4 et 5 étant les plus sensibles à la concentration d’azote à ces
trois dates de prélèvements, les diamètres correspondants ont été analysés. Il apparaît une
corrélation forte entre la position des nœuds et les diamètres mesurés avec un coefficient de
corrélation R2 calculé entre 0,75 et 0 ,95. Cela signifie que, quelle que soit la condition
d’apport azoté testée, les diamètres varient en fonction de la position dans la tige (Figure 51).
Les diamètres diminuent du bas vers le haut de la tige de chanvre. Cela apparaît logique du
fait de la croissance en hauteur des chanvres gouvernée par le méristème apical.
Néanmoins, la tendance n’est pondérée par les doses d’azote que seulement
pendant les 2 premiers mois de croissance des chanvres. En effet, les chanvres n’ayant pas
reçu d’azote (0 U) sont les plus fins, ceux ayant reçu 80 U sont en position intermédiaire et
enfin les plus grands ont reçu 120 U (A. Figure 51).
106
Figure 51. Représentation des diamètres des entre-nœuds en fonction de leur position sur la tige de
chanvre (moyenne sur 30 plantes). A. Deuxième prélèvement (2 mois après le semis, 8 juin), B. Troisième
prélèvement (2,5 mois après le semis, 22 juin). C. Quatrième prélèvement (3 mois après le semis, 6 juillet).
A deux mois et demi après le semis (22 juin), les chanvres ayant reçu 80 et 120 U ont
une taille et un diamètre équivalent (Figure 48 et B, Figure 51). Enfin, à compter de 3 mois
après le semis les chanvres ayant reçu 80 U sont plus grands que les autres (Figure 48, 49
et C, Figure 51). Pourtant, les longueurs des entre-nœuds 1 à 8 ne diffèrent pas beaucoup
quelle que soit la condition azotée (Figure 52). Par contre, les diamètres des plantes qui ont
reçu 80 U sont plus grands que ceux des deux autres conditions (indices a et b, Figure 52).
Cela signifie que les 80 U bénéficient d’une plus forte croissance en épaisseur, ce qui
contribue à comprendre leur plus forte croissance en hauteur. La tendance se confirme
107
jusqu’à la récolte, les 80 U croissent de manière plus importante en diamètre et en hauteur
par rapport au 0 et aux 120 U.
Figure 52. Représentation des entre-nœuds 1 à 8 (longueur et diamètre), en fonction des conditions
azotées testées (0, 80 et 120 U) à 3 mois après le semis (6 juillet). Les longueurs des entre-nœuds ne
sont pas significativement différentes par contre, les diamètres des entre-nœuds des chanvres ayant
reçu 80 U sont significativement plus grand que les autres, comme l’indique les indices a et b issus
des analyses de variance ANOVA.
Une explication de ces résultats peut provenir de l’hétérogénéité du champ sur lequel
les tests d’apport azoté ont été effectués. En effet, le champ n’était pas plan, et la pente du
champ était orientée dans le sens de nos essais. C’est-à-dire, que la condition 0 U était la
plus basse, la condition 80 U la plus haute. Par conséquent, la pluie a certainement
provoqué le lessivage de la condition 120 U vers les 0 U ce qui peut expliquer les
croissances similaires observées pour ces deux conditions à compter de 2,5 mois jusqu’à la
récolte. Les 80 U, au contraire, auraient bénéficié d’une meilleure exposition, étant plus en
hauteur, ce qui pourrait expliquer pourquoi elles ont eu une plus forte croissance. D’autre
part, les études au niveau des entre-nœuds ne concernent que les 8 premiers entre-nœuds,
108
des modifications de la partie apicale des plantes peuvent expliquer les différences de tailles
observées (Figure 48).
Il est à noter que les écarts-types résiduels calculées pour chacun des ANOVA
restent très élevés. Comme lors de la campagne 2008, ces valeurs témoignent de la forte
variabilité biologique due au polymorphisme des chanvres au sein d’une variété
« population ».
Les investigations au champ, menées sur l’été 2009, sont intéressantes dans
l’approche des mesures réalisées sur chacun des entre-nœuds. En moyenne, l’entre-nœud 8
est le dernier nœud sur la tige où les feuilles sont insérées de manière opposée, et ce pour
chacune des dates de prélèvement (à compter de la mise en place du nœud 8, soit à 1, 5
mois après le semis) et pour chacune des conditions azotées testées. Ces résultats sont
conformes à la littérature (Bouloc, 2006). Cela souligne, que même si le polymorphisme est
très fort au sein de la variété population testée, le développement des plantes au niveau de
l’entre-nœud est plutôt stable. Lors de la croissance végétative, soit dans les deux premiers
mois après le semis, le nombre d’entre-nœud est identique quelle que soit la densité de
semis apportée. A ce stade, tous les entre-nœuds ne sont pas encore mis en place et la
plupart des plantes ne comptent que 8 entre-nœuds. Il est intéressant de noter que, si le
développement de la plante reste similaire en fonction des conditions agronomiques, la
croissance des plantes est différente et le rendement dépend des conditions agronomiques
utilisées.
1.4
Campagnes en champs 2008, 2009 : discussion générale
L’effet population de la variété de chanvre utilisée, Félina 32, est très fort comme en
témoigne l’écart-type résiduel calculé souvent autour de 15% lors des analyses statistiques.
L’augmentation du nombre de plante mesurée entre la campagne 2008 et 2009 n’est pas
suffisante pour contrer la dispersion des données relative au polymorphisme des chanvres
au sein d’une même variété. Il n’est donc pas évident de conclure sur l’impact de l’azote sur
la croissance des chanvres. Toutefois, nos investigations sur le nombre et les mesures de
longueur des entre-nœuds montrent des résultats intéressants. En effet, les différents
apports azotés n’impactent pas le nombre d’entre-nœud mais leur taille. L’azote n’aurait pas
d’effet sur le développement des chanvres mais sur leur croissance. L’apport d’azote 80 U,
qui est la condition usuelle des chanvriculteurs locaux, favorise la meilleure croissance des
plantes en épaisseur et en hauteur.
109
Il est à noter que lors de la campagne 2009, les apports azotés ont été effectués
dans le sens de la pente de la parcelle, ce qui ne permet pas de savoir si l’azote épandu
correspond réellement à l’azote perçu par les plantes. Toutefois, il est notable de voir que
sans apport d’azote (0 U) les plantes sont plus petites. L’apport d’azote est donc
indispensable, ce qui reste une gageure. Il semble que l’apport d’azote à 120 U provoquerait
des effets négatifs aussi sur la croissance des plantes : cela semble contraire aux données
de la littérature qui indiquent les meilleurs rendements à 120 U voire au-delà (entre 150 et
240 U) (Van der Werf et al., 1995b). L’apport azoté interagit avec la densité de semis (Van
der Werf et al., 1995a et b) en terme de compétition. A densité équivalente, si les apports
azotés sont élevés (200 U), l’effet de compétition entre les plantes est plus important. Les
rendements augmentent par contre la densité faiblit. La croissance de certaines plantes est
plus robuste que d’autres i.e la dynamique de compétition est amplifiée. Les plantes qui
croissent de façon plus importante optimisent leur accessibilité à la lumière tout en
détériorant l’accès aux autres, la canopée des plantes plus grandes couvrent l’accès à la
lumière des autres et provoquent l’auto-éclaircissement (Van der Werf et al., 1995a). En effet,
à densité équivalente, 5% des plantes meurent avec 80 kg/ha contre 25% des chanvres à
200 kg/ha d’azote (Van der Werf et al., 1995a) par contre les rendements pailles à la récolte
restent similaires en poids mais pas en nombre de plantes. Les plantes récoltées en 2009
sont plus grandes que les plantes récoltées en 2008 (Analyse de variance au seuil de 5%)
(Figure 53). Les plantes cultivées en 2009 ont été semées un moins plus tôt que celles de
2008 pour une date de récolte équivalente (10 et 4 août respectivement). Le mois de
croissance supplémentaire dont ont bénéficié ces plantes justifie leur plus forte croissance.
Figure 53. Comparaison des tailles des plantes à la récolte entre les années 2008 et 2009 (moyenne de 10
plantes ± l’écart-type pour l’année 2008, et moyenne de 30 plantes ± l’écart-type pour l’année 2009). Les
indices a et b au dessus des barres indiquent les groupes statistiquement différents (au seuil de 5%).
110
La dispersion des rendements obtenus par les agriculteurs d’EcoChanvre 86 est
également très forte avec des rendements de paille totale de 2,1 t/ha à 8,5 t/ha (moyenne
5,7 t/ha) en 2008 et de 4,1 t/ha à 8,4 t/ha (moyenne 5,97 t/ha) en 2009. L’ITC rapporte
également de très fortes dispersions de rendements en t/ha de paille de chanvre de 5,2 t/ha
(sur 20 enquêtes : Euralis, Agrofibre, Région toulousaine) à 8,8 t/ha (sur 109 enquêtes,
LCDA, Aube) en 2009.
Les dispersions des rendements sont notamment imputables au fort effet du
polymorphisme des plantes au sein d’une variété population. De plus, les rendements cités
sont calculés à partir de l’ensemble des rendements obtenus sur les différentes parcelles
cultivées au sein d’EcoChanvre86. Les pédologies de ces parcelles peuvent modifier les
rendements paille obtenus, comme montré lors de la campagne 2008. La pluviométrie était
plutôt semblable en considérant les deux années testées (602 et 597 mm) d’après les
données météorologiques régionales. Toutefois, des écarts de pluviométrie peuvent exister
en fonction des champs et dans la répartition des précipitations, ce qui peut expliquer la
dispersion des rendements.
Parmi les paramètres influençant les rendements du chanvre, la somme des
températures est aussi un facteur déterminant (FNPC et Bouloc, 2006). Les sommes de
température ces années sont respectivement de 1042°C et de 1208°C (d’après le calcul
effectué par http://statmeteo.free.fr/) et sont supérieures de 15 à 30% à la somme de
température de 900 °C nécessaire pour une conduite culturale du chanvre idéale (§ Matériel,
Bouloc, 2006).
Il serait nécessaire de poursuivre les études sur les effets des conditions
agronomiques sur la croissance des chanvres pour enrichir les données. L’étude mérite
d’être continuée en considérant le nombre et les tailles des entre-nœuds. Les entre-nœuds 3,
4 et 5 sont les plus grands. Ces entre-nœuds sont comptés dans les portions de tige
utilisées lors du rouissage.
Ces résultats soulignent la difficulté de passage d’une étude agronomique à l’échelle
du champ, à une étude au niveau des individus. La représentativité de l’échantillonnage est
donc une question primordiale à prendre en compte, surtout sur une espèce à croissance
rapide comme le chanvre. Néanmoins, les résultats obtenus sur la constance du nombre
d’entre nœud dans les portions de tiges qui seront utilisés pour la suite des études.
111
Afin d’évaluer l’impact des apports azotés sur la proportion de fibres, des études
morphologiques ont été mises en place. Dans la partie suivante, la mise au point des
techniques pour la caractérisation des fibres en proportion dans la tige de chanvre et pour la
caractérisation des fibres primaires et secondaires sont présentées. L’effet de l’azote (0, 80
et 120 U) sur la proportion de fibres est évalué grâce à ces méthodes.
2
Etudes morphologiques et histocytochimiques
Les tiges de chanvre adulte sont difficiles à couper. Sur les tiges jeunes, les coupes
transversales à main levée sont plus aisées, et l’observation en fond clair peut-être réalisée.
Pour réaliser les coupes transversales de tige adulte, un couteau à lame vibrante a été utilisé
(§ Méthodes) mais les coupes réalisées restent trop épaisses (40 μm) pour des observations
en microscopie photonique classique. L’utilisation de méthodes d’observation en
fluorescence permet de s’affranchir ou d’amoindrir l’impact des 40 μm d’épaisseur de la
coupe. L’utilisation de la loupe à fluorescence et du microscope confocal à balayage laser
(MCBL) sous UV n’est pas suffisante pour observer tous les types cellulaires constitutifs des
tiges de chanvre. L’utilisation de la méthode de coloration à l’acridine orange permet de
rehausser les contrastes sur l’ensemble des réseaux pariétaux des cellules de la tige. Ce
colorant est dit métachromatique, c'est-à-dire qu’il révèle différentiellement les composés de
la paroi (pectines, lignines, cellulose) en fonction des longueurs d’ondes (λ) d’excitation et
d’émission.
Dans cette partie, le principe de la méthode de coloration à l’acridine orange est
présenté. Un exemple d’application de ce colorant pour faciliter l’observation d’une coupe
transversale de chanvre est détaillé.
2.1
Coloration à l’acridine orange
L’acridine orange est un colorant connu pour discriminer les molécules ARN et ADN
grâce à ses qualités d’intercalant (Mahieu-Williame et al., 2010). L’utilisation de l’acridine
orange comme colorant métachromatique des parois végétales est peu connue. L’emploi
de ce colorant permet de rehausser les contrastes du réseau pariétal et est utilisé pour
faciliter les étapes d’analyse d’images ultérieures (Legland et al., 2010). L’attribution des
longueurs d’onde émises est possible pour différentes classes de composés pariétaux
attenants à des types cellulaires précis. Dans le cas de cette étude, les ondes récupérées se
répartissent dans le vert (500 nm < λvert < 530 nm) (Figure 54, A) et dans le rouge (555 nm
< λrouge < 625 nm) (Figure 54, B). La somme ou le recouvrement de ces deux types d’onde
112
fournissent une couleur jaune (Figure 54, C). Les ondes récupérées dans le bleu,
correspondent à l’amidon contenu dans les amyloplastes (Figure 54, coupes A et B).
En considérant la répartition des composés cellulosiques et lignifiés dans les parois
des cellules fibreuses (§ paroi), il est possible d’attribuer les longueurs d’onde d’émission
(λvert et λrouge). Le vert est attribué à la cellulose et le rouge aux lignines (Figure 54, D et E).
Lorsque ces types de composés sont présents en quantité importante, comme c’est le cas
dans la lamelle moyenne ou dans le bois, les cellules ressortent en jaune (Figure 55). La
coloration à l’acridine orange des fibres longues de chanvre fournit une coloration verte au
centre des fibres, correspondant aux parois primaires et secondaires essentiellement
cellulosiques (Figure 54, A). La lamelle moyenne, contigüe à deux cellules voisines, est
principalement colorée en rouge (Figure 54, B) du fait de sa teneur en lignines (Figure 54, E).
La lamelle moyenne peut aussi présenter une coloration verte plus faible, provenant de la
présence de cellulose. La superposition des deux couleurs forme la couleur jaune
observable sur la lamelle moyenne entre deux fibres voisines (Figure 54, C).
Grâce à la méthode de coloration à l’acridine orange, l’observation des coupes
transversales de chanvre a été facilitée. Il a alors été plus aisé de caractériser les différents
types cellulaires présents sur les coupes transversales de tiges de chanvre à partir des
premières coupes réalisées sur tissus frais (Figure 55) et observées en MCBL.
La vérification de cette méthode de coloration a été faite à partir d’autres coupes
transversales de plantes issues du laboratoire. Par exemple, les fibres périphloémiennes de
vigne comme celle du bois, sont colorées en jaune par cette même méthode et sont
effectivement plus lignifiées (résultats non montrés ou Thèses D. Afoufa-Bastien et A. Medici,
2010).
113
Figure 54. Principe de la coloration à l’acridine orange et de l’attribution des longueurs d’émissions aux
principaux composés pariétaux (cellulose et lignines) des différents types cellulaires. (A) Réception des
composés cellulosiques dans le vert, (B) Réception des composés lignifiés dans le rouge, (C) Cumul de
la réception des longueurs d’onde dans le vert et dans le rouge. Les lamelles moyennes apparaissent en
jaune. Echelle 20 μm. (D) et (E) Rappel de la répartition des composés pariétaux majoritaires de la paroi
des cellules fibreuses et attribution des couleurs........................................................................................
.............
2.1.1
Exemple de coupe transversale de chanvre colorée à l’acridine orange
La coupe transversale de tige de chanvre présentée en exemple a été réalisée sur
tissus frais à partir du milieu d’une tige de Félina 32 adulte cultivée dans la serre (§
Méthodes). La coupe longitudinale (Figure 55) a été réalisée à partir d’une plante Félina 32
cultivée en champ en 2009 et fixée en alcool 70°C. La description ci-dessous concerne
114
l’image de la coupe transversale à l’aide du couteau à lame vibrante dans l’eau (VT 1100®
de Leica®) colorée à l’acridine orange et observée au MCBL (Figures 55 et 56).
L’épiderme est constitué d’une assise cellulaire de petites cellules arrondies qui paraissent
plus épaissies à la face externe. L’épiderme est interrompu par la présence de poils. Le
collenchyme est en partie visible sur cette section transversale. Constitué de petites cellules
arrondies sur plusieurs assises cellulaires, le collenchyme n’est pas continu et est présent
principalement dans les parties cannelées de la plante (§ 2.2 Répartition et mise en place
des fibres longues dans la tige de chanvre). Entre le collenchyme et les fibres primaires, une
assise cellulaire se distingue. Il s’agirait d’une forme d’endoderme. D’autres cellules de taille
et de formes variables sont visibles dans la zone sous épidermique et correspondent au
parenchyme cortical. Les fibres primaires sont organisées en massifs plus ou moins
continus. Sur la coupe transversale, les fibres primaires présentent toutes une paroi
secondaire fortement épaissie et le lumen paraît fermé à cette échelle d’observation. Les
fibres primaires présentent des tailles et des formes différentes en section transversale. Les
fibres primaires sont séparées des fibres secondaires par un parenchyme phloémien. Les
fibres secondaires sont plus petites que les fibres primaires et sont organisées en massifs
autour des éléments conducteurs du phloème (§ description de la répartition des fibres dans
la plante). Le cambium est constitué de cellules rectangulaires qui sont présentes sur
plusieurs assises cellulaires et ce tissu est continu. Le xylème est du type hétéroxylé (i.e
constitué de différents types de cellules, § Introduction bibliographique) car les vaisseaux
sont de diamètre variable avec des vaisseaux à très fort diamètre et d’autres vaisseaux plus
étroits. Ils sont répartis de façon hétérogène dans le bois. Ces vaisseaux sont entourés par
des fibres beaucoup plus petites et aux lumens très étroits. Les rayons parenchymateux sont
fins, unisériés. Ces rayons traversent le bois et se poursuivent dans le phloème. Ils sont
remarquables notamment par la présence d’un contenu cellulaire visible en vert. Enfin, les
complexes fibres / trachéides du xylème sont organisées radialement de manière homogène
dans tout le reste du tissu xylémien.
La coupe longitudinale observée à différents grossissement (Figure 56) ne permet
pas de localiser tous les différents tissus. Toutefois, l’épiderme, les fibres primaires et le
xylème sont indentifiables.
Cette première image, en coupe transversale (Figure 55), permet la localisation sur
coupe transversale des types cellulaires constitutifs des tiges de chanvre. Ces
connaissances facilitent la compréhension de l’arrangement des fibres primaires et
115
secondaires dans la tige de chanvre et une familiarisation avec le matériel. Les étapes de
caractérisation en analyse d’image ont pour objectif de mesurer les fibres en proportion dans
la tige d’une part, et de les caractériser individuellement d’autre part.
Figure 55. Coupe transversale de chanvre (C. sativa) colorée à l’acridine orange. Image acquise au
microscope confocal à balayage laser. Echelle 100 μm. (Ep : épiderme, Co : collenchyme, Fp : fibres
primaires, Ph : phloème, R : rayon parenchymateux, Fs : fibres secondaires, Cb : cambium, Xy : xylème).
116
Figure 56. Coupe longitudinale de tige de chanvre, Félina 32 cultivée dans le champ lors de la campagne
2009. La plante employée a été cultivée avec 80 U d’apport azoté et semée à 40kg/ha. La coupe
longitudinale présentée correspond à une coupe effectuée sur l’entre-nœud 3, à environ 40 cm du bas de
la plante. La coupe est colorée à l’acridine orange et observée au MCBL aux objectifs A. X10 (échelle 100
μm), B.
X20 (échelle 100μm) et C. X60 (échelle 50 μm).
(Ep : épiderme, Fp : fibres primaires, Xy :
xylème)....................................................
2.1.2
Mise au point des méthodes en analyse d’image avec Image J
Le travail sur tissus frais ou tissus fixés en alcool 70% et l’observation en
fluorescence permettent notamment des études structurales assistées par informatique. Des
mises au point en analyse d’image ont été réalisées avec le logiciel Image J dans le but
d’extraire les massifs de fibres phloémiennes et de les caractériser en termes de surface (%
de fibres contenu dans l’écorce), de taille et de nombre. L’approche développée consiste en
une observation à plusieurs échelles (du X 100 avec la loupe au X 600 avec le MCBL) afin
de mesurer respectivement la proportion de fibres puis caractériser les fibres plus
précisément avec des critères de taille et de forme.
Le développement de l’approche en analyse d’image a été réalisé à partir de coupes
transversales de tige de Félina 32 adulte cultivée dans la serre. Ceci permet de se dispenser
des plantes en champ qui ne sont disponibles qu’en fin de saison de culture. La plante
modèle mesure 2,39 m et a été fixée en alcool 70% (§ Méthodes).
2.1.2.1 Caractérisation de la proportion des fibres dans l’écorce des tiges de chanvre
La caractérisation de la surface des fibres contenues dans l’écorce se déroule en
deux étapes. A partir des images acquises à l’objectif X20 au MCBL, une première étape
concerne la mesure de la surface des tissus comprenant les fibres primaires et secondaires.
117
Pour se faire, plusieurs approches sont possibles. La première est axée sur le calcul d’aire,
le détourage de la zone fibre sur la coupe transversale de tige étant réalisé manuellement
avec l’outil dessin d’Image J (la commande sous Image J est dans la barre des tâches sous l’icône courbe
classique).
La mesure de la surface ainsi délimitée se réalise avec le logiciel (la commande sous
Image J est dans Analyze/ Measure).
Sur l’exemple montré Figure 57, l’aire de l’écorce mesurée
est de 295 922 μm2 (Figure 57, A) et l’aire des fibres mesurée est de 132 969 μm2 (Figure
57, B). Ces mesures permettent de calculer rapidement les proportions de fibres primaires et
secondaires dans une image. Mais de rapporter ces aires à la surface totale de la tige
nécessite de connaître l’angle de courbure de la zone considérée ce qui n’est pas forcément
trivial.
Figure 57. Exemple de mesure de proportion surfacique de l’écorce (A), des fibres et du parenchyme
phloémien(B), des fibres primaires (C) et des fibres secondaires (D). Les images de section de coupe
transversale
de
tige
de
chanvre
sont
obtenues
au
MCBL
après
coloration
à
l’acridine
orange.............................
La mesure de segments dans l’image permet de calculer les mesures des cylindres
correspondant aux différentes zones étudiées (Ecorce, Fibres+parenchyme, Fibres primaires,
Fibres secondaire, Figure 57). Connaissant le diamètre de la tige correspondant à la zone
étudiée, il est possible de calculer des proportions. Pour cet exemple, le diamètre de la tige à
cet endroit, mesuré au pied à coulisse, est de 8,65 mm. Considérant une tige cylindrique,
l’aire de la section transversale complète de la tige calculée est de π (8,65/2)2 = 58, 77 mm2.
Grâce aux mesures des différents segments sur l’image, il est possible de calculer les aires
des couronnes correspondantes. Le rapport de ces aires de couronne sur l’aire de la section
transversale fournit la proportion de ces tissus. Pour exemple, le calcul de la proportion de
l’écorce est détaillé. En considérant le premier segment tracé dans l’image A, Figure 57 (502
μm), il est possible de calculer la surface de la couronne en calculant la surface de la section
de la tige ne comprenant pas la couronne π ((8650/2)-502)2 = 459 154 μm2 soit 45,92 mm2,
l’aire de la couronne est donc de 58,77 – 45,92 = 12,85 mm2. Le calcul de la proportion de
118
surface de l’écorce par rapport à la surface de tige entière (58,77/12,85 * 100) donne donc
22%. En considérant le deuxième segment sur l’image (mesuré à 432 μm), le calcul donne
18% de proportion d’écorce dans la tige. Ces données permettent d’avoir une idée de la
proportion d’écorce dans la tige de 20 ± 2% de la surface totale de la tige.
Dans le même principe, les proportions des tissus peuvent être calculées et les
résultats sont répertoriés dans le tableau 10. La technique de mesure employée correspond
au tracé de segments sur les tissus considérés. La somme des deux types de fibres
correspond alors 11,5 ± 1% de la proportion de la surface de la tige soit 57% de moins que
dans la première approche de mesure qui considérait l’écorce entière, soit l’ensemble des
fibres et le parenchyme phloémien. Dans ce dernier cas, seules les fibres sont considérées,
le tissu parenchymateux entre les deux types de fibre est exclu. En effet, comme référencé
dans le tableau 10, en considérant l’écorce entière comme région fibreuse, la perte de
précision est forte, et la proportion de fibres (FI et FII) dans l’écorce est calculée à 56 ± 8,2 %,
et le calcul de la proportion de fibres dans ce cas est surestimé à hauteur de 44% dans ces
mesures.
.....
Figure 58. Dénombrement des fibres primaires et secondaires par l’outil dédié sous Image J. L’image
considérée est la même que celle précédemment (Figure 57).
Afin de déterminer précisément le nombre de fibres contenus dans ces surfaces, il
est possible d’utiliser l’outil de dénombrement d’Image J (la commande sous Image J est dans
Plugins/ Analyze/ Cell Counter)
(Figure 58). Dans cette zone de coupe transversale, 142 fibres
primaires et 64 fibres secondaires sont comptées.
119
La synthèse de ces données est répertoriée dans le tableau 10.
Tableau 10. Récapitulatif des proportions de surface de fibres calculées avec Image J.
2
Aire (mm )
Proportion de
la surface de la
tige (%)
Proportion
de fibres
primaires
(%)
Proportion de
fibres
secondaires (%)
Proportion
de surface
d’écorce
restante (%)
Ecorce (Figure 55, A)
11,16/12,85
20 ± 2
49 ± 8
7 ± 0,2
44 ± 8,2
Fibres + Parenchyme
8,96/7,77
14 ± 1
69,5 ± 1,5
12 ± 1
18,5 ± 2,5
6,32/5,32
9,9 ± 0,9 (142
fibres)
100
0,82/0,88
1,35 ± 0,1 (64
fibres)
7,17/6,2
11,25 ± 1
Zone considérée
(Figure 55, B)
Fibres primaires (FI)
0
(Figure 55, C)
Fibres secondaires (FII)
(Figure 55, D)
Somme FI + FII
87,5 ± 1,5
100
0
12,5 ± 1,5
0
(Figure 55, C et D)
Il est à noter que cette approche est réalisée sur une coupe transversale de tige de
chanvre réalisée à partir d’un quart de tige de bas de la plante Félina 32 utilisée comme
modèle pour le développement des méthodes d’analyse d’image. Les détails de localisation
de la coupe ne sont pas présentés car le but de ce paragraphe est de souligner la faisabilité
de l’approche et la diversité des résultats qu’elle peut engendrer.
Des mesures de proportions de surface à partir des images de coupes transversales
de tige de chanvre observées à la loupe peuvent être réalisées. Cette approche a été utilisée
pour l’étude de la répartition des fibres en fonction de la position dans la tige (§ 2.2
Répartition et mise en place des fibres longues dans la tige de chanvre). En revanche, le
grossissement maximal de la loupe (X115) n’est pas suffisant pour compter les fibres
individuellement.
L’objectif de ce point méthode est de souligner l’immense variabilité qu’il peut y avoir
dans les données en fonction des tissus considérés pour réaliser les mesures. Par exemple,
si le parenchyme phloèmien est inclus, la proportion réelle de fibres est biaisée (Tableau 10).
L’intérêt étant porté sur les fibres, les mesures appliquées dans le reste de ces travaux ne
concernent que les fibres.
Par contre, la démarche heuristique est biaisée du fait de l’absence d’étude sur des
sections transversales entière de tige de chanvre en fonction de leur hauteur de prélèvement.
En effet, les approximations initiales réalisées sur la forme cylindrique et la répartition des
120
différents tissus sur des cercles concentriques supposées de la tige de chanvre ne sont pas
toujours justes. En bas de plante, les tiges sont souvent plus lisses mais les massifs de
fibres primaires et secondaires se répartissent différentiellement (§ 2.2 Répartition et mise en
place des fibres longues dans la tige de chanvre). Il serait nécessaire d’évaluer à l’échelle de
la coupe transversale entière qu’elle est la réelle distribution des fibres. Le plan
d’échantillonnage initial mériterait d’être calibré sur des sections transversales entières de
tige, car l’hypothèse d’une répartition homogène des fibres sur le cylindre de la tige n’est pas
forcément vraie.
Les coupes transversales de chanvre entières sont très difficiles à obtenir avec les
outils à disposition au laboratoire. Toutefois, il est possible de réaliser de belles sections
transversales entières avec un microtome à glissière aidé par un moteur électrique. L’accès
occasionnel de ce type de matériel a permis de tester la faisabilité de cette piste. L’approche
multi-échelle envisagée n’a pas donc pas pu être optimisée car elle nécessite différents
outils. Toutefois, dans l’idée d’une uniformisation de méthodes de mesures dédiées à la
caractérisation des fibres in planta, ce point d’étude mérite d’être souligné.
Cependant, il reste possible de présenter les résultats obtenus sur une portion de
coupe puis en calculant la surface cylindrique de la couronne correspondante aux tissus
d’intérêt, comme présenté précédemment. Cette approche, même si biaisée, apporte des
informations de proportion de tissus qui permettent de comparer ensuite des plantes entre
elles. Cela permet d’étudier l’influence d’un facteur agronomique sur la répartition des fibres
par exemple. Pour l’étude de la répartition des fibres primaires et secondaires en fonction de
la hauteur dans la tige de chanvre, ces méthodes ont été appliquées (§ 2.2.1 Répartition des
fibres longues dans la tige de chanvre).
Une autre étude de proportion des différents tissus constitutifs de la tige de chanvre a
été réalisée en 2006 par Schäfer et al.. Dans leur approche, ils ont aussi considéré une
répartition homogène des différents tissus en cercles concentriques mais n’ont pas calculé
les surfaces correspondantes. En effet, ils ont mesuré les épaisseurs des différents tissus et
les ont comparés sur différentes plantes pour mettre en évidence l’influence de facteurs
agronomiques (densité de semis, apport azoté).
Les proportions de fibres longues de chanvre sont indiquées dans la littérature entre
30 et 35% (Bouloc, 2006), mais les méthodes de mesure sont axées sur les calculs de poids
sec après séparation mécanique de la paille. Une mesure de poids n’est pas évidente à
comparer à des mesures de proportion de surface mais l’idée est de souligner ici
121
l’importance des tissus constitutifs de la tige de chanvre : ils ne sont pas exclusivement
séparés en fibres et bois et cette dimension est à prendre en compte pour une valorisation
pertinente de la plante. Dans ces mesures, basées sur les poids secs, la partie fibreuse est
surestimée aussi car les autres tissus constitutifs de l’écorce sont présents (épiderme,
collenchyme, parenchyme phloémien, cambium). De plus, les proportions de fibres ne
concernent pas uniquement les fibres primaires mais aussi les fibres secondaires. Une étude
de 2005 sur les fibres extraxylémiennes de chanvre (Crônier et al., 2005) rapporte une
proportion de fibres secondaires de 25% en bas des tiges. Ce point d’étude souligne la
vigilance qu’il faut accorder aux critères de caractérisation des fibres de chanvre. Bien que
seules les fibres primaires de chanvre soient considérées comme fibres nobles du chanvre,
et qu’elles sont principalement présentes par rapport aux fibres secondaires, il ne faut pas
attribuer tout le poids sec de la partie fibreuse aux fibres primaires. En effet, la partie fibreuse
correspond à l’écorce séparée du bois au niveau du cambium, et reste constituée de
différents tissus eux même constitués de différents types cellulaires. Pour la valorisation de
cette biomasse, il est important d’en souligner l’hétérogénéité.
2.1.2.2 Caractérisation des fibres de chanvre
Comme vu précédemment pour les acquisitions au MCBL, seules les ondes
récupérés dans le vert (500 nm < λvert < 530 nm) et dans le rouge (555 nm < λrouge < 625 nm)
révèlent la coloration métachromatique pariétale (C, Figure 54). Seules les images acquises
en MCBL ont pu être segmentées, en effet ce mode d’acquisition offre la possibilité de
réaliser de fines sections optiques de l’échantillon (§ Méthodes). La segmentation des fibres
primaires et secondaires a été possible grâce au développement de l’approche « masque »
La séparation des canaux de réception de la lumière (λvert et λrouge) permet d’effectuer la
démarche d’extraction des fibres dans les images, alors que ça n’est pas possible avec les
images acquises avec la loupe à fluorescence ou avec le microscope photonique classique.
Ces dernières sont de vraies images RGB où les canaux ne peuvent être séparés ce qui
n’offre pas les mêmes possibilités d’exploitation en analyse d’image.
Pour extraire les objets présents dans l’image, ici les fibres, il est nécessaire
d’acquérir les images sur les zones les plus planes possibles de la coupe transversale. Cela
permet de limiter le nombre de sections optiques à acquérir et favorise les étapes de
traitements ultérieures. Pour optimiser l’étude, les fibres primaires sont acquises à l’objectif
X40 et les fibres secondaires à l’objectif X60.
122
Après acquisition, les séquences d’images correspondantes en format .oib peuvent
être compilées sous Image J. Pour ce faire, il faut ouvrir le fichier et choisir l’option « merge
RGB » que le logiciel proposera à la lecture du format .oib. Cette étape permet de gérer
ensemble les deux gammes de fichier acquises (le vert et le rouge). A ce stade, la séquence
en z est lisible de manière dynamique. Pour fixer l’image 3D il est nécessaire de la compiler
(la commande utile est dans Image/stacks/Zproject du logiciel Image). L’image correspondante a
des couleurs inversées par rapport au MCBL (Figure 59), mais il est nécessaire de rappeler
que cela reste des couleurs informatiques qui restent attribuées aux longueurs d’onde
d’émission (555 nm < λrouge < 625 nm et 500 nm < λvert < 530 nm).
Il est important de ne pas « calibrer » l’image (i.e de ne pas lui ajouter une échelle), car
l’échelle incrustée dans l’image sera extraite comme un « objet ». Pour rappel, les
fichiers .oib sont automatiquement dimensionnés (pour les X40 l’image est en 800X800
pixels correspondant à 367,60X367,60 μm). Mais il est nécessaire de veiller au format de
l’image si elle est acquise avec un autre système MCBL afin de vérifier si elles sont bien
calibrées pour les étapes de mesures ultérieures. Si l’image acquise n’est pas calibrée, il est
nécessaire de penser soit à prendre une mire pour chacun des objectifs et calibrer ensuite
les images, soit à connaître la résolution du système d’acquisition (combien de microns par
pixel). Cela rajoute une étape de traitement, pourtant essentielle pour les mesures (La
commande sous ImageJ pour la calibration des images correspond à Analyze/set scale ou Analyze/calibrate).
Figure 59. Représentation de l’inversion des couleurs informatiques attribuées aux longueurs d’onde
d’émission (555 nm < λrouge < 625 nm et 500 nm < λvert < 530 nm) sur une coupe transversale de chanvre. A.
l’image acquise au confocal et enregistrée en .jpg et B. l’image acquise au confocal, enregistrée au
format .oib et compilée sous image J. La flèche indique la lamelle moyenne. Echelle 100 μm. (Fp : fibres
primaires).
123
A ce stade, les canaux vert et rouge peuvent être séparés. La commande sous image
J se trouve dans l’onglet Image/color/RGB Split. Il est à noter qu’il est possible aussi d’ouvrir
le fichier .oib en séparant les canaux mais cela oblige l’expérimentateur à compiler les deux
fichiers et cela rajoute donc une étape.
L’approche d’analyse d’image développée (Figure 60) consiste à utiliser les images
acquises dans le rouge (555 nm < λrouge < 625 nm) comme masque. Il s’agit d’utiliser le
signal de la lamelle moyenne pour détourer les fibres. Le signal est perceptible dans le rouge
après coloration à l’acridine orange, ce qui facilite la segmentation des fibres (3, Figure 60). Il
faut que le contraste de cette image soit suffisamment fort pour faciliter le choix du seuil par
l’expérimentateur. Le seuil est propre pour chacune des images, et il doit correspondre au
maximum des pixels représentatifs de la lamelle moyenne. Cette étape est limitante car reste
à la libre appréciation du manipulateur, si le seuil choisi est trop bas, le détourage des fibres
ne sera pas complet et la segmentation des fibres sera plus difficile. A l’inverse, si le
seuillage est trop élevé, le risque est de réduire la taille des fibres extraites ultérieurement et
donc d’introduire un biais dans les mesures.
Figure 60. Exemple de la première étape du traitement d’image par Image J réalisée à partir de coupes
transversales de chanvre (C. sativa) colorée à l’acridine orange et observée au MCBL. 1. Image combinée
« vert et rouge » (les couleurs sont inversées par rapport au MCBL). 2. Canal « rouge » séparé (555 nm <
λvert < 625 nm) correspondant aux composés cellulosiques. 3. Canal « vert » séparé (555 nm < λrouge < 625
nm) correspondant aux composés lignifiés.
Après seuillage de ces images (c’est-à-dire après avoir défini un seuil sur l’histogramme en
niveaux gris) (A, Figure 61), cette image binaire (noir et blanc) est retranchée à l’image
correspondante acquise dans le vert (B, Figure 61). Avant de réaliser la soustraction d’image,
il faut prendre garde aux dimensions des images, en effet les opérations d’addition et de
soustraction matricielles nécessitent des matrices de même taille. Une image binarisée étant
codée en 8 bits, pour calibrer l’image correspondant aux fibres (2, Figure 61) à la bonne taille
124
avant l’opération mathématique il faut la transformer sous Image J (la commande sous Image J est
Image/type/ 8 bits).
Le seuillage de l’image obtenue, correspondant à l’image des fibres moins
celle de la lamelle moyenne (B, Figure 61), est à son tour effectué de manière automatique.
Il est à noter que du fait de l’opération mathématique soustrayant le masque A à l’image 2,
les particules correspondant aux fibres peuvent être alors facilement extraites (la commande
sous Image J est Analyze/Analyze Particle).
La commande d’extraction des particules propose des
bornes de taille. Ces bornes sont calibrées manuellement. En effet, si l’extraction des
particules est effectuée sans bornes, des problèmes de sur-segmentation sont induits, c’està-dire que d’autres objets que les fibres sont extraits des images. La borne minimale d’aire
de 50 μm2 optimise la segmentation des fibres. Toutefois, pour chacune des images
segmentées, il est toujours nécessaire de se référer à l’image source pour vérifier que ce
sont bien des fibres qui ont été extraites.
Les paramètres mesurés varient en fonction du choix du manipulateur. Pour la
caractérisation morphologique des objets fibres, des critères de taille et de forme ont été
testés.
Figure 61. Exemple de la séquence de segmentation des fibres primaires de chanvre via l’approche
« masque » développée sous Image J. L’image A correspond au seuillage de l’image 3 de la Figure 3.
L’image B est le résultat de l’image 2 de la Figure 3 avec la soustraction du masque A. L’image C est le
résultat de la binarisation de l’image B, enfin l’image D correspond à l’extraction des objets fibres sous
Image J......................................................................................................................................................................
Le critère le plus pertinent semble être le diamètre de Féret qui est défini comme
étant la plus grande distance calculée sur une section d’objet. Les aires des fibres sont très
variables pour permettre de discriminer les deux types de fibres. En effet, les aires calculées
pour les fibres primaires sont de 280 ± 170 μm2 contre un diamètre de Féret calculé de 34 ±
11 μm pour ces mêmes fibres primaires (analyse réalisée sur 61 fibres extraites par Image J
à partir de trois images sources acquises au microscope confocal). Dans le cas des fibres
secondaires l’aire calculée est de 95 ± 71 μm2 et le diamètre de Féret est de 13 ± 4μm
(analyse réalisée sur 133 fibres extraites à partir d’une image source acquise au confocal).
Les fibres primaires et secondaires sont significativement différentes d’après le test de
125
comparaison multiple (Test de Tukey) en considérant les aires ou les diamètres de Féret (au
seuil de 1%).
Ces résultats encourageants avec l’approche masque ont motivé l’exploitation de
cette approche. Le diamètre de Féret est retenu comme mesure principale car cette mesure
est plus lisible et que le coefficient de corrélation calculé entre les aires des fibres et le
diamètre de féret est de 0,91.
L’étude préliminaire présentée précédemment a été effectuée à partir de coupes
transversales de tige de chanvre cultivé en serre. L’étude des fibres in planta a été menée
sur des coupes transversales d’une plante provenant du champ (entre-nœuds 2 et 3 à 30 et
40 cm). Sur une série de 10 images, 280 fibres primaires ont été extraites et le diamètre de
Féret mesuré est de 34 ± 14 μm. Il est intéressant de remarquer que les conditions de
culture entre la serre et le champ, n’impactent pas les tailles de fibres mesurées (test de
Tukey au seuil de 1%, test de Mann et Whitney au seuil de 5%). La grande variabilité
pourrait s’expliquer par le fait que les fibres dont le diamètre est le plus petit sont en fait
coupées au niveau des extrémités effilées. Néanmoins, étant donné la grande longueur de
ces fibres, ce point est plutôt secondaire. Une façon de pallier ce problème aurait été de
réaliser des coupes sériées, toutefois l’épaisseur des coupes (40 μm) est largement
inférieure à la longueur des fibres.
Un exemple d’application de cette méthode concerne les mesures des fibres de
chanvre dans les sections transversales de matériaux composites (Figure 62). Les images
des sections de matériaux composites sont obtenues au microscope électronique à balayage
(MEB) et sont réalisées par les partenaires mécaniciens du programme CompoChanvre
(LMPM) (Thèse C. Bonnafous, 2010). La mesure des diamètres de Féret sur ses sections ne
peuvent être que manuelles, les images ne présentant qu’un trop faible contraste comme en
témoigne l’histogramme de l’image (B, Figure 62) et le profil de niveaux de gris obtenu sur
une fibre (C, Figure 62). Sur 40 mesures de fibres effectuées sur cette image, les diamètres
de Féret mesurés sont de 17± 4 μm, ces fibres ont des diamètres significativement différents
de ceux mesurés précédemment sur les FI et FII in planta (au seuil de 1%).
126
Figure 62. Présentation de l’application de la mesure du diamètre de Féret, avec Image J, sur des sections
transversales de matériaux composites chanvre / époxy. A. Section transversale du matériau composite
(Image MEB acquise par les partenaires du LMPM). Le trait rouge traversant une fibre permet de tracer le
profil des niveaux de gris sur ce segment (C). B. Histogramme de la répartition des niveaux de gris
contenu dans l’image A. C. Profil des niveaux de gris le long du segment rouge tracé sur une fibre sur
l’image A......................
D’après la littérature (FNPC, Bouloc 2006), les diamètres des fibres de chanvre sont
de 15 à 30 μm pour les fibres primaires et de 5 à 20 μm pour les fibres secondaires. La façon
de mesurer les diamètres n’est pas précisée. Les fibres ne sont pas des objets ronds,
toutefois, les mesures des cellules sont souvent réalisées en considérant le périmètre puis
en calculant ensuite le diamètre circulaire équivalent. Une étude, par Charlet et al., menée
en 2006 sur les fibres de lin incrustées dans les matériaux composites, a considéré un
facteur de forme de circularité, 4πS/P2 pour corriger cette approximation. Ce facteur est égal
à 1 pour une particule circulaire et tend vers 0 quand la particule s’allonge. Sur les fibres de
lin, la valeur calculée est de 0,905. Leurs calculs leur permettent de déterminer des
diamètres de fibres de lin de 19 ± 5,5 μm dans le composite. Leurs valeurs sont conformes à
la littérature qui indique des diamètres moyens compris entre 10 et 30 μm. Toutefois, les
résultats engendrés avec les approches d’analyse d’image sont certainement plus précis.
La dispersion des résultats des diamètres des fibres de chanvre et de lin dans la
littérature est plus importante que dans le cadre des mesures calibrées avec l’aide de
méthode d’analyse d’image. La mesure du diamètre de Féret est simple manuellement pour
un utilisateur car elle consiste uniquement à tracer le segment le plus long possible dans
l’objet considéré. L’étude de Charlet et al. (2006) est plus précise, leurs résultats se
dispersent de 28% contre 40% pour notre approche. Mais leur étude reste beaucoup plus
fastidieuse à mettre en place car il est nécessaire de passer par une étape de calque des
127
fibres pour pouvoir ensuite les traiter informatiquement. Toutefois, cette étude apporte en
plus la mesure de la porosité des fibres, définie comme étant le rapport entre la surface du
lumen et la surface totale de la cellule. Dans le cas des fibres de chanvre, le lumen observé
est souvent clos, cette porosité éventuelle mériterait d’être évaluée en MEB.
Les diamètres des fibres de chanvre sont 30% à 100% plus importants que les
diamètres des fibres de lin. Il est important de noter que la caractérisation mécanique des
fibres végétales a prouvé que le module d’élasticité des fibres était d’autant plus faible que le
diamètre de la fibre était grand (Baley, 2002, 2003 cité par Charlet et al., 2006). Ces études
réalisées sur le lin suggèrent que c’est la présence du lumen au centre des fibres et
l’épaisseur des parois qui pourraient expliquer cette diminution...La caractérisation des
diamètres des fibres en vue de leurs utilisations dans des matériaux composites est donc
pertinente aux vues de ces données.
Toutefois, rappelons que dans le cas de l’étude CompoChanvre les fibres de chanvre
employée dans les matériaux composites sont utilisées à l’état filées et tissées. Le
comportement mécanique change très certainement du fait de cette des traitements
effectués.
La caractérisation des diamètres des fibres primaires et secondaires in planta
concerne des fibres non transformées. D’autre part, les mesures réalisées ne sont issues
que d’une seule variété de chanvre, la Félina 32. Il est fort possible que les diamètres des
fibres puissent être un critère qui varie en fonction des conditions variétales. En revanche,
comme il a été souligné, les conditions de culture des plantes, entre la serre et le champ,
n’impactent pas les tailles des fibres. C’est certainement leur nombre et leur proportion qui
vont varier en fonction de l’impact des conditions de culture.
Il faut donc être prudent quant à l’exploitation de ces valeurs pour discriminer par
exemple les fibres primaires et secondaires dans un matériau composite. Il serait nécessaire
de pouvoir mesurer les diamètres de Féret sur des gammes de section transversales de
fibres beaucoup plus conséquentes afin d’avoir des critères de discrimination plus robustes.
Il serait intéressant d’appliquer ces méthodes sur l’ensemble des fibres végétales employées
dans les nouveaux matériaux composites. ...
128
........................................................................
Figure 63. Résultats des coupes transversales réalisées sur la plante modèle Félina 32 cultivée en serre
et observée à la loupe à fluorescence après coloration à l’acridine orange. Echelle 100 μm. (Ep :
épiderme, Co : collenchyme, Fp : fibres primaires, Fs : fibres secondaires, Xy : xylème).
129
2.2
Répartition et mise en place des fibres longues dans la tige de chanvre
Les fibres sont localisées en périphérie de la tige de chanvre entre la partie sous
épidermique et le bois. Deux types de fibres longues sont visibles le long de la tige : les
fibres primaires et les fibres secondaires. L’étude présentée dans cette partie cherche à
éclairer la répartition des deux types de fibre dans la tige de chanvre d’une part, d’autre part
de mieux comprendre l’ontogénie des fibres. En effet comme détaillé en chapitre
« Introduction bibliographique », l’origine tissulaire des fibres longues de chanvre n’est pas si
évidente.
2.2.1
Répartition des fibres longues dans la tige de chanvre
L’étude de la répartition des fibres dans la tige de chanvre a été menée du bas au
milieu de la tige (partie exploitée pour les applications textiles). Les premières investigations
ont été réalisées sur une plante adulte Félina 32 cultivée en serre (239 cm de haut).
L’objectif était d’évaluer la répartition des fibres en fonction des entre-nœuds (Figures 63 et
64). Il faut remarquer que les plantes issues de la serre sont très grandes mais gardent la
même phyllotaxie que les plantes cultivées dans le champ (le 8ème nœud est également en
moyenne le nœud à partir duquel la phyllotaxie va s’alterner, par contre le nombre d’entrenœud sur la totalité de la plante est plus important).
Trois coupes sont présentées figure 63 et leur localisation sont spécifiées sur le
schéma de la tige de la Figure. La section transversale agrandie dans la figure 64
correspond à une coupe supplémentaire sur la plante modèle, au 4ème entre-nœud de la
même plante (entre 16,5 et 8,5 cm). Les coupes ont été réalisées au Vibratome® HM 650V
et observées à la loupe à fluorescence.
Le bas de la plante contient de nombreux massifs de fibres secondaires et
relativement moins de fibres primaires (Figures 63 et 64). Les massifs de fibres primaires et
secondaires semblent se séparer radialement suite à l’accroissement en épaisseur dû à la
mise en place des faisceaux libériens (Figure 64, flèches). Au-delà de 30 cm, les massifs de
fibres primaires sont beaucoup plus importants et correspondent à la partie exploitée en
industrie textile. Les fibres primaires sont rassemblées en couronne presque continue, car
les massifs de fibres restent encadrés par les faisceaux libériens. Les proportions de surface
des fibres primaires et secondaires sont reportées dans le tableau 11.
130
Figure 64. Coupe transversale de bas de chanvre colorée à l’acridine orange et observé à la loupe à
fluorescence. Les flèches entre les fibres primaires indiquent les divisions anticlines responsables de
l’accroissement en épaisseur, les flèches entre les fibres secondaires indiquent la dynamique
d’écartement des massifs le long du faisceau libéro-ligneux. Echelle 100 μm..(Ep : épiderme, Co :
collenchyme, Fp : fibres primaires, Fs : fibres secondaires).........
Le mode de mesure choisit correspond au détourage de la surface des fibres
primaires et secondaires. Ce point est détaillé précédemment dans le paragraphe « Mise au
point de l’analyse d’image ». Ces mesures ne prennent donc pas compte les parenchymes.
Pour évaluer les rapports des aires des fibres primaires et secondaires, les massifs qui se
juxtaposent sont considérés. Par exemple, dans l’image de la Figure 64, le massif central
des fibres primaires est détouré puis les deux massifs de fibres secondaires correspondants
en dessous.
La proportion totale de fibres par rapport à la surface totale de la tige augmente du
bas vers le haut de la tige (Tableau 11) avec 20% de plus de fibres totales entre les 3ème et
11ème entre-nœuds. En proportion, le bas de la plante contient beaucoup 2 fois plus de fibres
secondaires que de fibres primaires (Tableau 11, 3ème et 4ème entre-nœud respectivement).
Les proportions de fibres primaires par rapport aux fibres secondaires sont ensuite
équivalentes au 7ème entre-nœud et sont 30% plus importante en proportion qu’au 11ème
131
entre-noeud. Les entre-nœuds 4, 7 et 11 présentent le plus de fibres primaires mais la
proportion totale de fibres varie peu.
Tableau 11. Calcul des proportions de surface des fibres en fonction de la hauteur dans la tige de
chanvre Félina 32 modèle cultivée en serre (mesures réalisées à partir des images présentées Figures 61
et 62). Les informations complémentaires indiquées entre parenthèse sur les lignes des « aires
estimées » correspondent aux segments mesurés dans l’image.
1. 3ème entre-nœud
Position des coupes transversales
Diamètre des entre-nœuds (mm)
12
2
4ème entre-
2. 7ème e-
3. 11ème entre-
nœud
entre-nœud
nœud
11
10,3
9,4
Surface Totale de la section de tige (mm )
113,1
95
83,3
69,4
Surface détourée des fibres primaires (μm2)
19 568
69 666
150 283
133 140
Surface détourée des fibres secondaires
83 260
188 944
185 264
115 950
0,23
0,37
0,81
1,15
(μm2)
Rapport des surfaces FI / FII
2
Aire estimée du cercle des FI (μm )
4,9 (129 μm)
3,7 (110 μm)
5,7 (178 μm)
5,4 (152 μm)
Aire estimée du cercle des FII (μm2)
11,46 (312 μm)
7,85 (233 μm)
5,2 (165 μm)
3,5 (121 μm)
4,33
3,89
6,8
7,8
10,13
8,2
6,2
5
14,46
12,02
13
12,8
Proportion des FI par rapport à la surface
totale de la tige (%)
Proportion des FII par rapport à la surface
totale de la tige (%)
Proportion totale des fibres par rapport à la
surface totale de la tige (%)
Pour rappel cette étude est basée sur une plante provenant d’une culture en serre.
Les conditions de culture sont très différentes de celle du champ. La présence de fibres
secondaires en telle proportion peut-être une résultante de l’acclimatation des plantes en
serre. La plante modèle était isolée en pot et a bénéficié d’une plus forte croissance en
épaisseur car les conditions sont non limitantes en eau et en nutriment. Cet élargissement
radial est typique de certaines plantes Dicotylédones comme le tilleul (Esau, 1969). En plus
de l’activité cambiale qui induit la formation de fibres secondaires, des divisions anticlines
provoquent la séparation des faisceaux. Ce sont les cellules du parenchyme radial qui se
divisent. Toutefois, les plantes qui présentent de tels élargissements, sont le plus souvent
des plantes pérennes. Un « méristème de dilatation » a été décrit pour quelques espèces
(Esau, 1969) mais l’origine des cellules composant ce méristème n’est pas claire. Il pourrait
s’agir de l’expansion des cellules parenchymateuses phloémiennes ou d’une expansion des
cellules radiales (appartenant aux faisceaux libéro-ligneux). Ce sont des pistes de réflexion
pour expliquer le diamètre plus important à la base des tiges de chanvre. Les parties basales
132
de la tige sont effectivement plus anciennes et ont bénéficié d’une plus longue activité
cambiale provoquant l’accroissement en épaisseur.
Cette étude a ensuite été réalisée sur des plantes adultes Félina 32 cultivées dans le
champ lors de la campagne 2009 afin d’évaluer l’impact des apports azotés (0, 80 et 120 U)
sur les proportions de fibres (§ Impact de l’azote sur les fibres longues de chanvre).
2.2.2
Mise en place des fibres
Pour suivre la mise en place des fibres longues de chanvre, le plan d’échantillonnage
consiste à recouvrir la zone apicale, donc les tissus jeunes, par la réalisation de coupes
transversales (Exemple de schéma Figure 65). Plusieurs plantes Félina 32 ont été utilisées
pour cette étude. L’objectif de cette partie est d’apporter des éléments sur l’origine des fibres
longues primaires à partir d’observation de coupes transversales provenant de tissus jeunes.
La première étude d’une plante Félina 32, cultivée en serre, a été menée sur une
plante fraîchement coupée. Cette première plante est jeune (1 mois), possède 7 entrenœuds et mesure 39 cm. C’est à partir de cette jeune plante que les premières coupes
transversales à main levée ont été réalisées puis observée en fluorescence après coloration
à l’acridine orange (Figure 66). Pour compléter cette étude, une deuxième plante Félina 32,
cultivée en serre, a été ajoutée. Cette plante est plus âgée (2 mois, 152 cm de hauteur) mais
l’attention est restée portée sur les parties jeunes de la tige, donc les parties apicales. Les
coupes transversales ont été réalisées à main levée puis observées en microscopie
photonique, avec une double coloration carmin aluné-vert d’iode (Figure 67). Des inclusions
en résine LR White Médium ont été réalisée régulièrement à partir de plantes Félina 32 du
même semis. Un exemple de coupe transversale semi-fine provenant de la partie apicale est
présenté Figure 68.
Le schéma de la Figure 65 correspond à la jeune tige de chanvre utilisée, les traits
horizontaux représentent les points d’insertion des paires de feuille le long de la tige (nœuds).
133
Figure 65.
Plan d’échantillonnage
Figure 66. Coupes transversales réalisées dans les parties jeunes de la plante
conformément au plan d’échantillonnage Figure 10. Observation des coupes
transversales de tige de chanvre au MCBL après coloration à l’acridine
orange. Echelle 100 μm (Ep : Epiderme, Co : Collenchyme, Ph : phloème, Cs :
canal sécréteur, Fp : Fibre primaire, Fs : Fibre secondaire, Cb : Cambium, Xy :
Xylème, Mo : Moelle).
Les quatre images présentées correspondent aux coupes indiquées sur le plan
d’échantillonnage et dont les positions exactes sont précisées sur la Figure 65 au dessus de
chaque image. Les observations des coupes transversales de tige ont été réalisées avec le
MCBL après coloration à l’acridine orange (Figure 66).
Dans la partie apicale de la tige (Figure 66, coupes 1 et 2, et Figure 67) l’épiderme
est interrompu par la présence de poils sécréteurs. Les fibres ne sont pas encore
différenciées alors que le collenchyme est très étendu (Figure 66, coupes 1 et 2, Figures 67
et 68). Le collenchyme est plus abondant dans les parties cannelées de la tige. Le
collenchyme joue un rôle de soutien mécanique dans les parties jeunes de la tige par sa
localisation en périphérie des tissus primaires (Bowes, 1996). Dans cette zone apicale, les
fibres ne sont pas discernables. Le xylème est très jeune et est repérable par ses cellules
aux parois plus épaissies. Il est notable que son développement, entre la coupe 1 et la
coupe 2, se fait vers l’intérieur de la tige, vers la moelle (Figure 66). La moelle dans ces
134
parties est très étendue. La coupe 2 présente de grandes structures cellulaires de part et
d’autre de la zone cambiale, il s’agit certainement de canaux sécréteurs. La zone cambiale
n’est pas indiquée sur l’image car les types cellulaires caractéristiques de ce tissu ne sont
pas discernables. Toutefois, la présence de xylème vers l’intérieur de la tige et du phloème
vers l’extérieur de la tige suggère une activité cambiale.
Dans les parties plus basses de la tige (Figure 65, coupes 3 et 4), les fibres de types
primaires et secondaires sont retrouvées alors que le collenchyme n’est presque plus visible.
La zone cambiale est très importante et les caractéristiques de cette zone multisériée,
constituées de plusieurs assises de petites cellules rectangulaires, sont bien retrouvées (§
Introduction bibliographique). L’activité cambiale est corrélée à la position dans la tige, plus
les coupes sont basses dans la plante, plus les fibres secondaires sont observées.
Effectivement il y a plus de fibres secondaires dans la coupe 4 que dans la coupe 3 (Figure
66). Cette plante a été cultivée en serre ce qui explique certainement sa forte croissance en
épaisseur, comme en témoigne le développement des tissus secondaires comme le xylème
étendu et les fibres secondaires observées.
Cette première étude ne permet pas d’attribuer une origine aux fibres longues. Pour
mieux cibler leur point d’origine, une autre série de coupes transversales ont été réalisées
sur les parties hautes de la deuxième plante Félina 32 décrite précédemment (2 mois, 152
cm). La première coupe provient du haut de la tige de chanvre (Figure 66, coupe A à 144cm,
soit à 8 cm de l’apex), la deuxième coupe est réalisée à 28 cm en dessous de d’apex de la
tige (Figure 67, Coupe B). Ce matériel frais et ensuite coloré au carmin aluné-vert d’iode
(Figure 67). La double coloration au carmin aluné-vert d’iode colore en rose les parois
fortement cellulosiques (comme celles des cellules du collenchyme) et en bleu les parois
lignifiées (comme celles des cellules du xylème) (Figure 67). Les fibres primaires (Figure 67,
B) ne sont que peu lignifiées et ne sont pas colorées.
Une assise endodermique sépare le collenchyme de la partie phloémienne. Les
fibres ne semblent donc pas avoir une origine collenchymateuse. La flèche sur l’image
indique des types cellulaires suspectés d’être les cellules mères des fibres. Ces cellules
sont discernables par leurs formes allongées (Figure 67, A, Flèches). L’observation sur des
coupes transversales de la même plante réalisées un peu plus bas, permet de retrouver ces
types cellulaires qui se distinguent des autres types cellulaires grâce à leur paroi plus
épaissie. Ces cellules sont typiquement les cellules mères des fibres (Esau, 1969,
Bonnemain, Communication personnelle).
135
Figure 67. Coupes transversales de tige de chanvre fraîche. Double coloration carmin aluné-vert d’iode.
La coupe A provient du haut de la tige de chanvre (144 cm, soit à 8 cm de l’apex), la coupe B provient de
28 cm en dessous de d’apex d’une tige de chanvre. La flèche indique une cellule mère des fibres. Échelle
50 μm. (Ep : épiderme, Co : collenchyme, En : endoderme, Fp : fibres primaires, Ph : phloème, Cs : canal
sécréteur, Cb : cambium, Xy : xylème).
Figure 68. Coupe transversale de chanvre (partie apicale) inclus en résine LR White Medium et colorée au
bleu de Toluidine. La flèche indique les types cellulaires qui sont les cellules mères des fibres primaires.
Echelle2252μm. (Ep : épiderme, Co : collenchyme, En : endoderme, Ph : phloème, Cs : canal sécréteur,
Cb : cambium).
136
Sur la coupe semi-fine présentée Figure 68, ces mêmes arguments en faveur d’une
origine phloémienne sont retrouvés. La présence d’un endoderme qui sépare le collenchyme
des cellules mères des fibres réfute l’hypothèse que les fibres résulteraient de la
sclérification du collenchyme (Duchaigne, 1955). Les cellules mères avec la paroi un peu
épaissie, typiques des futurs fibres, sont retrouvées dans l’assise sous endodermique. Les
fibres seraient donc issues de la différenciation du parenchyme phloémien. En effet, sur la
figure 66 le phloème est discernable. Au moment où les fibres commencent à se différencier,
le cambium est actif et le xylème est aussi mis en place.
2.3
Impact des facteurs agronomiques sur les fibres longues de chanvre
2.3.1
Impact d’un déficit hydrique sur les fibres longues de chanvre
L’impact d’un déficit hydrique sur la croissance des chanvres et sur les fibres longues
a été étudié (§ Méthodes). Ces investigations ont été menées en serre sur deux variétés,
Félina 32 et Santhica 27. Les plantes ont été mesurées régulièrement des échantillons en
milieu et haut de tige ont été prélevés pour une fixation et une inclusion en résine. Dans le
cas de ces échantillons, la post-fixation à l’acide osmique a été appliquée. La post-fixation à
l’acide osmique permet de bien conserver l’intégrité de la membrane plasmique, cela permet
de suivre la mise en place de la paroi secondaire jusqu’à la mort de la cellule. Sur la figure
69, le contenu cellulaire est encore distinctement présent dans les fibres issues de plante
peu arrosées (Figure 69, flèche).
Le stress hydrique provoque un retard de croissance visible sur les parties basses de
la plante, compte-tenu du décalage de maturité des fibres. Les mesures de taille révèlent un
décalage de hauteur des plantes au cours de la croissance mais cet écart n’est plus
discernable en fin de croissance.
Des échantillons de fibres de Félina 32 et Santhica 27 rouies et non rouies ont été
fournies aux partenaires du LMPM pour une étude de leur comportement mécanique en
fonction du déficit hydrique. Cette étude à fait l’objet d’un poster présente au congrès « Le
Chanvre dans tous ses états » qui a eu lieu en mars 2010 à Poitiers (Annexe).
137
Figure 69. Coupes transversales de bas et haut de tige de chanvre inclus en LR White Medium. Coloration
au bleu de toluidine. Echelle 10 μm. A. Santhica 27 arrosée bas. B. Santhica 27 non arrosée bas. C.
Santhica 27 arrosée haut. B. Santhica 27 non arrosée haut. (Ep : épiderme, Co : collenchyme, En :
endoderme, Cb : cambium, Xy : xylème).
2.3.2
Impact de l’azote sur les fibres longues de chanvre
L’impact de l’azote a été évalué sur les fibres longues de chanvre. Les plantes
étudiées proviennent de la campagne 2009 où les apports azotés testés étaient de 0, 80 et
120 U. Trois plantes de chacun des lots ont été fixées en alcool 70% à chacune des dates
de prélèvement. L’attention est portée sur la derrière date de prélèvement, correspondant à
la récolte sur une plante de chacune des conditions, et sur les entre-nœuds 1, 3, 5 et 8. Les
diamètres des entre-nœuds considérés sont ceux mesurés sur les plantes à la récolte
(Tableau 12).
138
Tableau 12. Récapitulatif des mesures des aires des fibres primaires (FI) et secondaires (FII) sur les
coupes transversales des entre-nœuds 1, 3, 5 et 8 de chanvre Félina 32, cultivées en champ l’année 2009
avec 0U, 80U et 120U d’apport azoté. Les aires sont mesurées à partir d’images acquise à la loupe à
fluorescence. Les informations complémentaires indiquées entre parenthèse sur les lignes des « aires »
correspondent aux segments mesurés dans l’image. Les proportions indiquées sont calculées par
rapport à la surface totale de la tige.
Entre-nœuds
Aire
(EN) en fonction
couronne
de
la
des conditions
contenant
azotées
FI (mm2)
(mm2)
0U. EN 1
2,72 (151 μm)
2,43 (133 μm)
5,89
27,24
10
0U. EN 5
2,15 (140μm)
0,46 (30 μm)
5,05
20,02
10,7
0U. EN 8
1,78(141 μm)
1,21 (94 μm)
4,19
13,78
12,9
80U. EN 1
4,21 (155 μm)
3,46 (127μm)
8,8
60,82
6,9
80U. EN 3
5,71 (221 μm)
1,35 (51 μm)
8,44
55,95
9,3
2,4
80U. EN 5
6,07 (258 μm)
1,17 (48 μm)
7,75
47,17
12,9
2,5
15,3
5,19
80U. EN 8
3,84 (215 μm)
0,43 (23 μm)
5,91
27,43
14
1,6
15,6
6,99
120U. EN 1
3,42 (146 μm)
2,19 (93 μm)
7,6
45,36
7,5
4,8
12,3
1,56
120U. EN 3
5,45 (151 μm)
2,53 (110 μm)
7,43
43,35
12,6
5,8
18,4
2,15
120U. EN 5
1,79 (100 μm)
1,44 (80 μm)
5,77
26,15
6,8
5,5
12,3
1,24
120U. EN 8
1,61 (115 μm
0,88 (62 μm)
4,57
16,4
9,8
5,4
15,2
1,82
les
Aire
Surface de la
Proportion
Proportion
Proportion de
couronne
de
la
Diamètre
l’entre-nœud
de
section
FI (%)
FII (%)
FI + FII (%)
contenant les FII
(mm)
l’entre-nœud
de
FI/FII
(mm2)
9
19
1,12
2,3
13
4,7
8,8
21,7
1,47
5,7
12,6
1,2
11,7
4,22
Tous les entre-nœuds contiennent plus de fibres primaires que de fibres secondaires
quelle que soit l’apport azoté (0, 80 et 120 U). Les fibres secondaires sont moins présentes
en proportion dans les tiges de plantes cultivées en champ par rapport aux chanvres cultivés
en serre (§ Répartition des fibres longues dans la tige de chanvre). Le pourcentage total de
fibre varie de 11,7 à 21,7% et, quelque soit l’entre-nœud considéré, il y toujours la présence
de fibres secondaires. Ces observations sont contraires à plusieurs observations (Mediavilla
et al., 2001 ; Crônier et al., 2005 ; Bouloc, 2006 ; Schäfer et al., 2006) qui souvent
mentionnent la présence des fibres secondaires exclusivement en bas de tige. Néanmoins,
d’autres travaux mentionnent des fibres secondaires dans les entre-nœuds 1, 3, 5 et 7 avec
une décroissance de l’épaisseur des couches de 2,3 anneaux à 0,3 (Amaducci et al., 2008).
La présence de fibres secondaires est à évaluer car ces fibres seraient plus lignifiées ce qui
réduirait la qualité des fibres totales (Mediavilla et al., 2001).
Les entre-nœuds 3, 5 et 8 de la plante ayant reçu 80 U contiennent le plus de fibres
primaires (Tableau 12). Ces entre-nœuds sont compris dans la portion de tige (entre +30 cm
et 100 cm de la tige) considérée pour les étapes de rouissage. L’apport azoté 80 U est
bénéfique pour une meilleure production de fibres, comme vu dans le chapitre des tests aux
139
champs, cette condition est favorable à la croissance et au développement en épaisseur des
plantes (Tableau 12).
Toutefois ces études méritent d’être complétées par des mesures sur d’autres
coupes provenant d’autres plantes. Le suivi de la croissance des chanvres et de la mise en
place des fibres avec l’approche développée peut être réalisée à partit de la collection
d’échantillons récoltés lors de la campagne au champ en 2009. A chacune des dates de
prélèvement, trois plantes par condition azotée ont été fixées en alcool 70%, il est donc
possible de compléter les données. Le temps imparti dans le cadre de ces travaux n’était
pas suffisant pour réaliser ces études. Mais les échantillons sont bien conservés et
l’approche étant calibrée sur des outils à disposition au laboratoire, il est possible de
poursuivre ces investigations.
2.3.3
Impact de la densité de semis sur les fibres longues de chanvre
L’impact de la densité sur les fibres longues de chanvre n’a pas pu être évalué avec
les plantes issues du champ, comme expliqué dans la partie des « Résultats / Discussion »
concernant les campagnes réalisées dans les champs. Des tests de densité de semis en
serre ont donc été réalisé (Voir § Méthodes) pour compléter ce point d’étude. Toutefois, les
investigations n’ont pas été poursuivies sur ces plantes. En effet, la croissance des chanvres
en serre est très différente que la croissance des plantes cultivées dans les champs. De plus,
seule la surface du pot a été considérée dans les calculs d’équivalence de densité. Or, la
profondeur du pot est un paramètre important pour favoriser l’ancrage racinaire des plantes.
L’évaluation de la densité sur les fibres longues de chanvre mérite d’être étudiée car
de nombreux auteurs témoignent de l’impact favorable de densités élevées (50 kg/ha) sur
l’homogénéisation des diamètres de tige de chanvre (Struik et al., 2000 ; Bennett et al., 2006;
Amaducci et al., 2008). Or, comme il a été souligné lors de nos investigations, le chanvre est
une plante très polymorphe et il est important de souligner les paramètres culturaux
bénéfiques pour une homogénéisation des cultures. De plus, les diamètres des tiges et la
proportion de fibres sont corrélés, la production de fibres longues est bien directement
modifiée par les densités de semis utilisées (Amaducci et al. 2008 ; Bennett et al., 2006).
Plus précisément, la densité de semis aurait un impact sur les diamètres des fibres primaires
et la surface du lumen (Schäfer et al., 2006). Toutefois ces travaux révèlent des résultats
opposés, la difficulté de leur étude réside dans le croisement des effets de densité de semis
et de date de semis. En fonction des essais, ils observent des résultats différents.
Néanmoins ils concluent que la proportion du lumen décroît à une date de semis optimale si
140
la densité de semis est augmentée. A l’inverse, si la date de semis est décalée, la proportion
de la surface du lumen augmente quand la densité de semis est augmentée (Schäfer et al.,
2006). Le rapport de la surface du lumen par rapport à la surface totale de la fibre est décrit
comme critère de maturité (ou indice de maturité) (Amaducci et al., 2008). Ce critère varie en
fonction des stades de récolte : au début, pendant et à la fin de la floraison. Selon leurs
travaux, l’effet des densités de semis ne semble pas modifier l’indice de maturité.
Il est à remarquer qu’en fonction des auteurs et de leur origine disciplinaire, le rapport
de la surface du lumen sur la surface totale de la fibre varie. Dans le cadre des études
d’employabilité des fibres pour les matériaux composites, Charlet et al., 2006 décrit ce
rapport comme la porosité des fibres. Pour les investigations agricoles, comme celle citée
précédemment (Amaducci et al., 2008), c’est un indice de maturité, l’épaississement de la
paroi étant corrélé à la maturation de la fibre.
2.3.4
Impact des conditions culturales sur les fibres longues de chanvre
Les plantes cultivées en serre sont différentes des plantes cultivées dans les champs.
Plusieurs raisons peuvent expliquer ce phénomène. Les plantes cultivées dans les champs
sont soumises notamment aux variations climatiques, alors que dans la serre les paramètres
sont constants et contrôlés. Des phénomènes de thigmomorphogènèse (Coutand, 2010)
peuvent être aussi impliqués dans ces modifications de développement. Les fibres de
chanvre sont soumises à des stress mécanique durant leur croissance ce qui modifie leur
structure longitudinale. C’est-à-dire que des plis se forment le long des faisceaux de fibres
(Figure 70) certainement en réponse à des mouvements de la tige à l’influence du vent.
Ces plis sont à prendre en compte pour l’utilisation des fibres dans les matériaux
composites. Comme observé sur la Figure 60, les plis se propagent dans toute la
transversalité du faisceau de fibres ce qui peut fragiliser la zone et faciliter la rupture. Des
études sur fibres isolées ont souligné ces points de fragilisation, le terme de « genou » est
attribué à ces défauts (Thygesen et Hoffmeyer, 2005).
141
Figure 70. Coupe longitudinale de tige de chanvre, Félina 32 cultivée dans le champ lors de la campagne
2009. La plante employée a été cultivée avec 80 U d’apport azoté et semée à 40kg/ha. La coupe
longitudinale présentée correspond à une coupe effectuée sur l’entre-nœud 3, à environ 40 cm du bas de
la plante. La coupe est colorée à l’acridine orange et observée au MCBL à l’objectif X60 (Echelle 50 μm).
Le rectangle vert entoure les « plis » visibles le long des faisceaux de fibres longues de chanvre. (Fp :
fibres primaires).
142
3
Etude de l’impact du rouissage sur les fibres longues de chanvre
La plupart des méthodes actuelles de transformation du chanvre ne sont plus
adaptées pour une application textile. En effet, comme détaillé dans le chapitre
« Introduction bibliographique », l’utilisation principale des tiges est pour l’éco-habitat, les
fibres longues sont trop altérées par ces méthodes pour envisager leur utilisation textile. La
filière textile du chanvre n’existe quasiment plus (§ Introduction bibliographique). L’évaluation
du rouissage, dans un système prototype mis en place au laboratoire (§ Méthodes), a été
réalisée. Pour rappel, le rouissage favorise la séparation des fibres longues du reste des
tissus de la tige. Les tiges utilisées pour le rouissage proviennent des récoltes des
campagnes menées dans les champs les années 2008 et 2009. Etant donné le nombre de
tiges nécessaire, les plantes choisies sont celles cultivées avec les conditions usuelles des
chanvriculteurs soit une densité de semis à 40 kg/ha et un apport azoté à 80 U.
Le suivi du rouissage a été effectué principalement par des approches de
caractérisation biochimiques. Les méthodes de fractionnement de la biomasse (Van Soest,
1967) et les méthodes de caractérisation Infra Rouge (IR) ont été employées. Avant de
présenter les résultats des caractérisations biochimiques, l’observation des fibres longues à
différents temps de rouissage est décrite.
3.1
Observation des fibres longues de chanvre à différents temps de rouissage
Au fur et à mesure des temps de rouissage, l’aspect des écorces prélevées se
modifie. Comme visible sur les images acquises à la loupe, à 10 jours les écorces sont
colorées, ce qui est dû au fait de la présence de l’épiderme (Figure 71, A). A 30 jours de
rouissage, les fibres paraissent propres (sans présence d’épiderme) et de couleur blanche
relativement homogène (Figure 71, B). A ce stade, les faisceaux de fibres sont visibles car
l’épiderme a totalement disparu (Figure 71, B). A 45 jours, les fibres sont noircies de façon
hétérogène et des tâches de couleur rose sont visibles le long des faisceaux de fibres
(Figure 71, C, flèche).
143
Figure 71. Ecorces de chanvre à différent temps de rouissage. A. 10 jours de rouissage, B. 30 jours de
rouissage, C. 45 jours de rouissage, la flèche indique la tache rose. Echelle 2cm.
Du fait de la nature sèche et déstructurée des fibres à l’issue du rouissage, l’étude
morphologique nécessite une étape de préparation d’échantillon en résine comme décrit
dans le chapitre « Méthodes ». Les échantillons étant très durs à couper, il n’est pas aisé de
réaliser de belles images des coupes semi-fines produites.
La figure 72 présente différentes coupes transversales de fibres rouies à différents
temps de rouissage : 5, 10, 30 et 45 jours. Comparativement à une coupe transversale de
chanvre issu de plante fixée à l’état frais (Figure 68), la perte des tissus environnants les
fibres est visible au fur et à mesure du rouissage.
Figure 72. Coupes transversales (semi-fines, 1500 nm) de fibres longues de chanvre inclues en résine LR
White Medium et colorées au bleu de Toluidine. A. 5 jours de rouissage. B. 10 jours de rouissage. C. 30
jours de rouissage. D. 45 jours de rouissage. (Fp : fibres primaires, Fs : fibres secondaires). Echelle 25
μm.
L’épiderme et le parenchyme phloémien sont les premiers tissus dégradés, en
témoigne la perte de structure des tissus (Figure 72, A). En effet, les cellules épidermiques
ont perdu leur forme cylindrique caractéristique. A 5 et 10 jours de rouissage, le parenchyme
phloémien assure la cohésion des massifs de fibres primaires aux massifs de fibres
secondaires (Figure 72, A et B). A trente jours de rouissage, des résidus de cellules
144
parenchymateuses sont encore visibles sur le pourtour des massifs de fibres primaires
(Figure 72, C). Ce parenchyme n’est plus observable à 45 jours de rouissage (Figure 72, C
et D). Néanmoins, les massifs de fibres ne sont pas dégradés et les fibres restent cohésives
car associées entre elle par la lamelle moyenne. Sur les images présentées, les fibres
secondaires sont moins visibles à 30 et 45 jours de rouissage. Du fait de la déstructuration
du parenchyme phloémien, la séparation des fibres primaires et secondaires est facilitée.
Toutefois, des fibres secondaires ont été observées à ces temps de rouissage sur d’autres
échantillons (Résultats non montrés).
Les lots de tiges utilisés pour le rouissage ont des diamètres différents. La
dégradation des tissus autour des fibres sera d’autant plus longue que le diamètre est grand.
Dans le cas des observations précédentes, chaque temps de rouissage n’est illustré qu’avec
une écorce choisie parmi la vingtaine récupérée à chaque fois. Le suivi du rouissage
nécessite d’autres méthodes complémentaires pour considérer plus d’échantillons à chaque
temps de rouissage afin d’avoir des données plus pertinentes.
3.2
Suivi du rouissage par les méthodes biochimiques
L’évaluation du rouissage a été réalisé avec plusieurs méthodes de biochimie
détaillée dans le § méthodes. Dans cette partie, les méthodes d’analyse de l’impact du
rouissage sur l’écorce de chanvre sont scindées en deux grandes parties : l’une concernant
les analyses réalisées sur les poudres issues des fibres aux différents temps de rouissage
(fractionnement de la biomasse et ATR), l’autre s’appliquant aux échantillons de fibres inclus
en résine (Microspectrométrie FT-IR). Pour rappel les poudres pour chaque temps de
rouissage correspondent aux fibres d’une vingtaine de tiges rouies broyées ensemble dans
un broyeur mécanique (Retsch Mühke SM1 73048®).
3.2.1
Fractionnement de la biomasse sur les cinétiques de rouissage
Les différentes attaques de la paroi par des traitements acides permettent de retirer
successivement les composés pectiques (lamelle moyenne / dissociation des fibres), les
composés de la paroi primaire (hémicelluloses) et les composés de la paroi secondaire
(cellulose) (§ Méthodes, Figure 37). Si on considère que la fibre longue de chanvre est
composée exclusivement de sucres (pectines + hémicelluloses + cellulose ~ 100% des
composés), il est possible d’estimer les différentes fractions NDF, ADF et ADL comme
indiqué sur la Figure 73. Cette approximation permet de faciliter la compréhension du
phénomène de rouissage. Ainsi la partie NDF correspond principalement à l’extraction des
145
composés issus des lamelles moyennes, la partie ADF peut être attribuée à l’extraction des
composés contenus dans les parois primaires et pour finir, la fraction ADL correspond aux
composés extraits des parois secondaires.
Figure 73. Représentation des fractions issues des différentes étapes du dosage des constituants
pariétaux : NDF, ADF, ADL en fonction du temps de rouissage (mesures réalisées sur les rouissages 1 et
2 à partir de un à cinq échantillons pour chacun des temps de rouissage).
Le calcul des proportions des composés pariétaux aux différents temps de rouissage
a été effectué (§ Méthodes). Les fibres sont principalement composées de cellulose (de 70 à
92%) et les principales variations au cours du rouissage concernent les teneurs en
composés hydrosolubles (pectines et protéines structurales) comme souligné dans la Figure
74. Une diminution de la proportion des composés solubles est observée dès 10 jours puis
elle se stabilise à 33 jours. A quarante sept jours de rouissage, il y a une augmentation des
composés hydrosolubles. Il est possible que ces composés soient attribués aux
champignons présents sur les fibres. En effet, un champignon rouge (Phaneochaete
chysosporium) est décrit dans la littérature pour être impliqué dans les phénomènes de
dégradation des matériaux lignocellulosiques comme dans le cas du rouissage (Li et al.,
2009a et b). Ce champignon provoque des tâches rouges-rosées, comme visibles sur la
coupe C, figure 71.
D’après ces analyses, il est impossible de savoir si la perte des composés
hydrosolubles correspond à une perte de pectines, de protéines ou d’hémicelluloses.
146
D’autres approches sont nécessaires pour comprendre ces variations dans les compositions
des fibres au cours du rouissage.
Figure 74. Résultats du fractionnement de la biomasse lignocellulosique des fibres de chanvre :
proportions relatives des composés hydrosolubles et cellulosiques en fonction des temps de rouissage
(mesures réalisées sur les rouissages 1 et 2 à partir de un à cinq échantillons pour chacun des temps de
rouissage, le 45 J est retiré de la synthèse graphique car il n’a été évalué qu’une fois au cours du
rouissage 1, par conséquent le calcul des écarts-types sur ce point n’était pas faisable).
3.2.2
Suivi du rouissage par la méthode d’Attenuated Total Reflectance (ATR).
Les poudres des fibres rouies aux différents temps de rouissage, les mêmes que
celles employées précédemment pour les fractionnements de la biomasse lignocellulosique,
ont été aussi utilisées en ATR. L’objectif est de distinguer les différents types de composés
pariétaux et de suivre leur évolution au cours du rouissage.
L’ATR est une méthode de caractérisation biochimique qui utilise les Infra-Rouges (§
Méthodes). Pour rappel, les parois végétales absorbent dans la région spectrale comprise
entre 800 et 1800 cm-1. Les données issues de l’acquisition sont normalisées sous R
(v.2.10.1) selon la technique de Mouille et al., 2003. Le traitement consiste à réaligner les
spectres sur une ligne de base (une droite) puis à normaliser les données en divisant une
absorbance par la somme des absorbances du spectre. Deux exemples de spectres ATR
normalisés sont montrés Figure 75. Après chaque acquisition, répétée 20 fois, la première
étape consiste à nettoyer les spectres, c’est-à-dire de ne conserver que les spectres aux
147
allures similaires. En moyenne, une dizaine de spectres par temps de rouissage sont gardés
et exploités ensuite pour les comparaisons.
Figure 75. Représentations graphiques des spectres FT-IR acquis en ATR à partir des poudres de fibres
-1
rouies à 0J et à 30J. Les nombres d’ondes représentés (de 830 à 1800 cm ) correspondent à la zone où
absorbent les composés pariétaux (9 spectres pour 0J et 10 spectres pour 30 représentés sur le
graphique).
L’allure des spectres, acquis sur les fibres non rouies et à 30 jours de rouissage,
semble similaire. Il n’est pas évident de comparer les spectres entre eux avec ces
représentations graphiques. C’est pourquoi, l’équipe paroi de l’INRA de Versailles a
développé des méthodes de comparaison entre les spectres, utilisant les T-Tests, et
permettant des représentations graphiques de comparaison entre les spectres. Cette
méthode nécessite l’emploi d’un script développé par Mouille et al. 2003 sous R (v.2.10.1).
La comparaison entre les fibres non rouies et les fibres aux différents temps de
rouissage a été réalisée avec cette méthode (Figure 76).
148
Figure 76. Représentation graphique de la comparaison de la moyenne (T-Test) des spectres acquis sur
les poudres des fibres non rouies contre les poudres des fibres rouies à 10, 30 et 45 jours lors du
rouissage 1. Les valeurs positives correspondent à des absorbances relativement plus élevées pour les
fibres non rouies qu’à 10, 30 et 45 jours de rouissage. Les valeurs négatives correspondent à des
absorbances relativement plus élevées à 10, 30 et 45 jours de rouissage que pour les fibres non rouies.
Les axes horizontaux rouges bordent les seuils de différences significatives. Entre ces deux axes, les
différences ne sont pas significatives. La zone entourée en vert correspond aux liaisons esters attribuées
aux pectines et aux hémicellulose, la zone entourée en bleu correspond aux protéines et celle entourée
en rouge aux polysaccharides pariétaux.
Grâce à ces comparaisons de moyenne de spectres, il est alors possible de
comprendre ce qui se passe lors du rouissage. La baisse des composés hydrosolubles au
cours du rouissage est due à une disparition de pectines/ hémicelluloses (NO autour de
1740 cm-1) (Alix et al., 2009) et de protéines (1650 – 1550 cm-1) (Figure 76). Cette baisse,
résultant de la perte des esters, est visible dès 10 jours de rouissage (Figure 76) et la
tendance s’amplifie à 30 jours, comme en témoigne le doublement de la taille des pics
protéiques à 30 jours (Figure 76). A 45 jours, l’augmentation des composés hydrosolubles
visibles sur la Figure 76 est attribuée aux protéines (1650 – 1550 cm-1). Ces protéines qui
semblent apparaître au cours du rouissage sont certainement des protéines fongiques.
Lors du rouissage, la teneur relative en polysaccharides (de 900 à 1100 cm-1)
augmente sur les fibres rouies par comparaison avec les fibres non rouies. De plus, les pics
inférieurs s’affinent, ce qui reflèterait la pureté des polysaccharides. Cet enrichissement
relatif en polysaccharides s’explique par la disparition successive des autres composés
pariétaux
comme
les
Résultats/Discussion du
pectines,
fractionnement
les
de
protéines
la
et
biomasse).
les
La
hémicelluloses
signature
(§
spectrale
149
polysaccharidique à 45 jours n’est plus observable sur les fibres rouies. Ceci est
probablement du à l’apparition de composés « solubles » tel que ceux observés dans la
figure 74 à 47 jours.
Tous les temps de rouissage ne sont pas représentés afin de faciliter la lecture de la
représentation graphique, de plus les données concernent le rouissage 1. Cette tendance a
aussi été observée sur le rouissage 2 (Résultats non montrés). Lors du rouissage 3, qui
représente la répétition biologique des rouissages 1 et 2 à partir des plantes issues de la
récolte 2009, les données ATR fournissent des résultats peu exploitables. En effet, les
spectres présentent beaucoup de bruit, c’est-à-dire que les spectres « frisent » dans les
zones d’absorption des parois végétales. Une piste possible de ce problème tient de la
granulométrie des poudres engendrées pour chacun des temps sur ce rouissage 3 : il est
possible en effet qu’une erreur de choix de grille lors du broyage mécanique ai engendré un
surchauffage des composés, ce qui est visible sur les modifications des absorbances des
parois végétales (voir également § Caractérisation des traitements biochimiques sur les
tissus de chanvre, sur le point concernant les cinétiques d’étuvage).
Cette perte relative en composés pariétaux à 30 jours de rouissage peut être due à la perte
des cellules environnant les fibres, comme cela a été montré dans le paragraphe
« Observation des fibres à différents temps de rouissage » ou bien à une modification de la
composition des parois. Pour savoir si le rouissage modifie la composition pariétale des
fibres, la technique de microspectrométrie FT-IR a été utilisée sur les échantillons de fibres
rouies inclus en LR White Medium (Figure 69). L’augmentation de la fraction soluble à 45
jours de rouissage provient probablement de la production de polymère par les champignons
présents. Des analyses plus fines des composés présents permettraient d’identifier ces
composés (par chromatographie en phase gazeuse par exemple).
Pour savoir si, par ailleurs, le rouissage modifie la composition pariétale des fibres, la
technique de microspectrométrie FT-IR a été utilisée sur les échantillons de fibres rouies
inclus en LR White Medium (Figure 69).
3.2.3
Suivi du rouissage sur les fibres longues de chanvre avec la
microspectrométrie FT-IR
La microspectrométrie FT-IR permet des acquisitions de spectres sur des coupes
d’échantillons inclus en résine LR White Medium. Les spectres sont acquis avec une fenêtre
couvrant les échantillons (variable en fonction de l’échantillon traité) et un pas de 15 μm
150
dans les deux dimensions de la carte. Une moyenne de 64 spectres est enregistrée pour
chaque point. Un exemple de principe d’acquisition des cartes est montré Figure 77. Sur cet
exemple, l’échantillon correspond à l’écorce provenant du milieu d’une plante Félina 32
cultivée au champ l’année 2008 et récoltée à 3 mois (le 4 août 2008). Cette plante ne
présente pas de fibres secondaires et toutes les fibres primaires ne sont pas matures (le
lumen n’est pas refermé). Pour l’aide au repérage, la coupe A de gauche est observée en
microscopie photonique après coloration au bleu de toluidine. La coupe B de droite provient
du même échantillon observé avec un microscope couplé à un spectromètre FT-IR. Les
points rouges correspondent aux points d’acquisitions tous les 15 μm.
Figure 77. Représentation du principe d’acquisition des cartes avec le microspectromètre FT-IR. A. La
coupe transversale de l’écorce d’une plante Félina 32 cultivée dans le champ l’été 2008. L’échantillon a
été prélevé à la récolte (le 4 août 2008) et provient du milieu d’une plante Félina 32. La coupe semi-fine est
observée au microscope photonique après coloration au bleu de toluidine. (Ep : épiderme, Co :
collenchyme, En : endoderme, Fp : fibres primaires) Echelle 50 μm. B. La même coupe transversale que
dans A. observée avec le microscope couplé à un spectromètre FT-IR. Les points rouges correspondent
aux points d’acquisition de 64 spectres en moyenne tous les 15 μm dans les deux dimensions de la carte.
A partir des cartes acquises en microspectrométrie FT-IR pour chacun des
échantillons d’écorce inclus en LR White Médium aux différents temps de rouissage, les
tissus comprenant les fibres primaires ont été étudiés. C’est-à-dire que les spectres
151
correspondant aux zones de fibres ont été découpés et exploités. L’ensemble des spectres a
été ensuite nettoyé et normalisé comme décrit précédemment via la méthode de Mouille et
al., 2003. Seules les fibres primaires ont été considérées car elles correspondent aux fibres
utilisées dans l’industrie.
Figure 78. Représentation graphique des spectres moyens obtenus en microspectrométrie FT-IR sur les
fibres longues de chanvre à différents temps de rouissage. (Légende : 0 J : témoin des fibres non rouies,
10 J : fibres rouies à 10 jours, 30 J : fibres rouies à 30 jours, 33 J : fibres rouies à 33 jours, 47 J : fibres
rouies à 47 jours).
Les spectres moyens obtenus sur les fibres longues extraites des cartes acquises en
microspectrométrie FT-IR présentent des allures différentes (Figure 78). Les T-Tests
effectués sur ces données avec la méthode de Mouille et al., 2003 regroupent les fibres
rouies à 10 et 30 jours d’une part, et les fibres rouies à 33 et 47 jours d’autre part. Les
variations principales des fibres sont dans la zone polysaccharidique entre 1000 et 11160 cm
-1
. Les fibres non rouies, en jaune sur la Figure 77, sont différentes des autres fibres et
absorbent moins dans la zone des nombres d’onde polysaccharidiques. Au cours du
rouissage, la signature polysaccharidique s’affine sur les fibres.
Afin de souligner les modifications des fibres entraînées au cours du rouissage,
l’ensemble des spectres correspondant aux fibres a été analysé par Analyse en Composante
Principale (ACP) via TmeV (Figure 79). La composante principale 1 (Figure 80, PC1 Fibre)
explique 97% de l’inertie entre les fibres lors du rouissage, le nuage de points est
principalement séparé sur cet axe (Figure 79). Le vecteur propre de la Figure 80 représente
les similarités entre les fibres quelque soit le temps de rouissage testé (0, 5, 10, 30, et 45
jours). Ce vecteur (PC1) peut être tracée afin d’étudier quels sont les nombres d’ondes qui
152
varient le plus. Les valeurs des nombres d’onde correspondants aux pics sont sélectionnées
(Figure 80).
Figure 79. Résultat de l’ACP (PC1 vs PC2) réalisée avec TmeV sur les fibres primaires extraites des cartes
correspondant aux différents temps de rouissage 0, 5, 10, 30, et 45 jours et acquises au microscope
couplé au spectromètre. Le nuage de points représenté se sépare principalement sur l’axe 1 (PC1).
Figure 80. Représentation graphique du vecteur propre de la composante principale 1 issue de l’ACP
appliquée aux fibres extraites des cartes acquises au microspectromètre FT-IR.
153
Les nombres d’ondes 1720, 1184, 1153, 1110 et 1060 cm-1 ont été choisis pour être tracés
sur les cartes acquises au microspectromètre FT-IR. Les nombres d’onde correspondant aux
pics négatifs : 1720, 1184 et 1153 cm-1 sont attribués aux tissus environnants les fibres et à
la résine LR White Medium, comme en témoigne la coloration positive des tissus et de la
résine sur les cartes (Figure 81, D, E et F).
Les nombres d’onde 1060 et 1110 cm-1 sont attribués aux fibres longues de chanvre (Figure
81, B et C). Le nombre d’onde 1060 cm-1 est distinctement attribué aux fibres longues et à
l’épiderme, comme en témoigne la coupe C de la figure 81. Le nombre d’onde 1110 cm-1
réagit aussi avec la résine (Figure 81, B), il est donc moins spécifique des fibres.
Figure 81. Représentation des absorbances relatives des nombres d’ondes 1110 et 1060 cm
-1
(respectivement B et C) attribués aux fibres longues de chanvre et des nombres d’ondes 1153, 1184, 1720
cm
-1
(respectivement D, E et F) attribués à la résine. L’échelle de couleur va du vert pour les valeurs
négatives au rouge pour les valeurs positives.
154
Le nombre d’onde 1720 cm-1 (1775-1720 cm-1, attribué aux liaisons esters), ne
correspond pas aux fibres. Le déclin de l’absorbance de ce nombre d’onde au cours du
rouissage
correspond
à
la
perte
des
tissus
collenchymateux,
épidermiques
et
parenchymateux (Figure 81, D, E et F).
Seuls les nombres d’onde 1110 et 1160 cm-1 peuvent être attribués aux fibres longues. Ces
nombres ont été étudiés sur les échantillons de fibres rouies. Seuls deux temps de rouissage
ont été exploitables et sont présentés sur la Figure 82. Quel que soit le temps de rouissage
considéré, ces nombres d’ondes restent attribués aux fibres longues de chanvre. Ces
nombres d’onde sont des signatures polysaccharidiques (les nombres d’ondes compris entre
1050 et 1250 cm-1).
Figure 82. Représentation des absorbances relatives des nombres d’ondes 1110 et 1060 cm
-1
(respectivement B et C et E et F) attribués aux fibres longues de chanvre sur des échantillons de fibres
rouies à dix jours de rouissage (A), et à 45 jours de rouissage (D). L’échelle de couleur va du vert pour
les valeurs négatives au rouge pour les valeurs positives.
Sur la vingtaine de coupes acquises en microspectrométrie FT-IR, une dizaine de
cartes a été conservée pour les analyses présentées. La plupart des autres cartes acquises
avec le microspectromètre FT-IR n’ont pas pu être exploitée en raison de la présence d’eau
155
sur les acquisitions. Les échantillons étant inclus en résine hydrophobe, il s’agit d’un
problème lié à l’appareillage et non aux préparations d’échantillons.
La résine dans laquelle les échantillons sont inclus peut poser un problème. En effet,
la résine absorbe dans les mêmes zones que les composés de la paroi, soit entre 800 et
1800 cm-1. Le blanc lors de l’acquisition a été acquis sur la résine, a priori elle est donc
retranchée des acquisitions. Toutefois, l’imprégnation de la résine lors de la préparation des
échantillons n’est pas forcément homogène. Il n’est donc pas évident de pouvoir retrancher
le spectre de la résine sur l’ensemble de la carte. Il semble en effet difficile que la résine
pénètre au cœur des fibres, du fait de la cristallinité de la cellulose constitutive des fibres
(Bonatti et al., 2004 ; Reddy et Yang, 2009). Il faut donc être prudent quant à l’interprétation
des nombres d’ondes caractéristiques des différents tissus et des fibres.
Les acquisitions en microspectrométrie FT-IR sont plus efficaces sur des échantillons
qui ont subi moins de préparation, comme dans le cas de cryocoupe. Des études en cours
sur des cryocoupes de miscanthus (Miscanthus sacchariflorus) développées à l’INRA de
Versailles, augurent de meilleurs résultats. Dans le cas du chanvre, ces approches n’ont pas
été testées. Elles ne seraient toutefois possibles que sur des cryocoupes provenant de
section de tige. L’inclusion en résine reste une étape indispensable pour l’étude des fibres au
cours du rouissage. En effet, les fibres ne sont plus liées aux différents tissus et elles ne se
maintiennent pas pour réaliser des coupes transversales. Le problème de la résine reste
donc à résoudre pour le suivi des modifications biochimiques sur les fibres longues de
chanvre au cours du rouissage.
Toutefois, les analyses biochimiques par le fractionnement de la biomasse et par
l’ATR révèlent un enrichissement relatif en polysaccharides. Du fait du dégommage
enzymatique des tissus entourant les fibres (Baracatpereira et al., 1993), la concentration
cellulosique devient relativement plus importante. En effet, plus les fibres sont nettoyées des
tissus environnants, plus la cellulose est détectable et la proportion relative de cellulose
augmente.
3.2.4
Caractérisation des tensions de surface sur les fibres longues de
chanvre rouies
L’enrichissement relatif en cellulose des fibres longues de chanvre au cours du
rouissage modifie leur caractère hydrophile. L’hydrophilie des fibres de chanvre peut modifier
l’imprégnation des fibres dans des matériaux composites. Des analyses complémentaires de
156
tension de surface ont été réalisées par les partenaires du CRITT matériaux de Rochefort.
Ces analyses concernent les fibres rouies à 10 jours et à 30 jours. Ces analyses ont été
réalisées avec la méthode de Washburn, basée sur l’ascension capillaire des liquides
(Aranberri-Askargorta et al., 2003). Cette technique utilise de grandes quantité de fibres ce
qui permet de pallier aux problèmes d’hétérogénéité (pour plus de détail, se référer à G.
Alise au CRITT Matériaux de Rochefort).
Les résultats obtenus sur les fibres de chanvre témoignent d’une augmentation de la
tension de surface au cours du rouissage (Tableau 13). Ces résultats sont cohérents avec
l’enrichissement relatif en polysaccharides cellulosiques notés par le suivi ATR.
Tableau 13. Récapitulatif des tensions de surface et de la polarité obtenues sur les fibres longues de
chanvre à 10 et 30 jours de rouissage confrontées aux valeurs comparables de la littérature.
Matériel
Tension de surface
Polarité
(mN/m)
(mN/m)
36,6
4
CRITT Matériaux de Rochefort
40,7
9,2
CRITT Matériaux de Rochefort
Lin roui
34
nd
(Baltazar-Y-Jimenez et Bismarck, 2007)
Chanvre défibré
31
nd
(Baltazar-Y-Jimenez et Bismarck, 2007)
Fibres de chanvre
Sources
rouies à 10 jours
Fibres de chanvre
rouies à 30 jours
mécaniquement
Cellulose
De 35 à 51
32,3
(Baltazar-Y-Jimenez et Bismarck, 2007),
11
Aranberri-Askargorta et al., 2003
La polarité des fibres augmente avec le temps de rouissage, cette caractéristique est
directement liée à la tension de surface. Ces expériences préliminaires sont en accord avec
les données issues de la littérature. En effet, le chanvre défibré mécaniquement est plus
hydrophobe, i.e que sa tension de surface est plus faible que celles des fibres rouies, ce qui
peut s’expliquer par la présence de résidus cellulaires autour des fibres. En effet, si des
restes d’épiderme sont accrochés aux fibres, cela peut expliquer la plus forte hydrophobicité
observée. Toutefois il faut être prudent quant aux comparaisons de ces données, la variété
de chanvre dans l’étude d’Aranberri-Askargorta et al., (2003) n’étant pas indiquée. La
comparaison avec le standard de cellulose est plus cohérente et les fibres de chanvre rouies
ont une tension de surface caractéristique de la cellulose (Baley et al., 2006 ; Abdel-Halim et
157
al., 2008 ; Alix et al., 2009). Les phénomènes de tension de surface sont directement liés au
comportement mécanique des fibres (Baley et al., 2005).
L’ensemble de ces données issues de l’étude des fibres au cours du rouissage permet
de contribuer à la compréhension de cette première étape du procédé pour l’obtention des
fibres textiles. Le rouissage consiste en la digestion des tissus détourant les fibres pour
faciliter leur séparation du bois. Cette étape permet l’obtention de fibres propres pour leur
emploi ultérieur. Les fibres restent cohésives en massifs au cours du rouissage et ce sont les
tissus environnants qui sont dégradés par les microorganismes présents dans l’eau du
rouissage. Au cours du rouissage, les fibres s’enrichissent en polysaccharides, la disparition
successive des hémicelluloses, des protéines et des pectines, favorisent l’apparition d’un
matériel exclusivement cellulosique (Zhang et al., 2008).
Les fibres longues de chanvre engendrées par le rouissage offrent de bonnes qualités
textiles grâce à leur « nettoyage » naturel et leur composition essentiellement cellulosique.
Toutefois, pour leurs utilisations dans des matériaux composites, la cellulose présente une
hydrophilie peu favorable à leur imprégnation dans les résines époxy. Des traitements
d’ensimage peuvent être appliqués pour favoriser l’adhésion des fibres à la matrice.
3.3
Etudes préliminaires sur la caractérisation des textiles avec l’ATR
La conception des éprouvettes de matériaux composites renforcés par des fibres
longues de chanvre a été réalisée avec des textiles provenant du marché (Tableau 7 du
chapitre « Méthodes »). Les filières textiles étant de plus en en plus rares, les contrôles
qualités dans ces filières ne sont pas très développés. Dans cette partie, l’objectif est de
souligner la possibilité d’établir des critères de distinction entre les différents tissus grâce à la
caractérisation biochimique via l’ATR.
3.3.1
Caractérisation biochimique des traitements sur les tissus de chanvre
Les tissus employés ont subi divers traitements à la chaleur, à la soude, afin de
favoriser leur imprégnation dans la matrice. Quelques études en ATR ont été réalisées sur
ces tissus.
158
Figure 83. Représentation graphique de la comparaison entre les moyennes des spectres acquis sur le
tissu de chanvre témoin (Oléron 2) contre les mêmes tissus ayant subi les températures d’étuvage de
40°C (b), 50 °C (j), 80 °C (k), 105°C (l) et 120 °C
(m). Les axes horizontaux rouges bordent les seuils de
différences significatives. Entre ces deux axes, les différences ne sont pas significatives.
La cinétique d’étuvage réalisée sur les tissus de chanvre (Oléron 2) est visible en
ATR dans la zone d’absorbance des lignines (1515 à 1650 cm-1). En effet, en considérant les
températures d’étuvage de 40 à 120 °C on retrouve l ’ordre des ces températures sur les
absorbances
(Figure
83).
La
plus
forte
température
d’étuvage
(120°C)
réduit
considérablement l’absorbance des tissus de chanvre dans la zone de 1515 à 1650 cm-1. La
chaleur peut modifier la réticulation des composés lignifiés, ce qui peut expliquer en partie
ces résultats. Toutefois, les fibres de chanvre sont rapportées comme étant peu lignifiées (de
2 à 4%, Crônier et al., 2005).
159
Figure 84. Représentation graphique de la comparaison entre les moyennes des spectres acquis sur le
tissu de chanvre témoin (Oléron 2) contre les mêmes tissus ayant subi des traitements à la soude (NaOH)
(c), à la soude et à l’eau oxygénée (NaOH + H2O2) (d), et contre le tissus Roumain 1 (e). Les axes
horizontaux rouges bordent les seuils de différences significatives. Entre ces deux axes, les différences
ne sont pas significatives.
Un autre exemple de modifications biochimiques sur les tissus de chanvre concerne
les traitements alcalins, comme avec la soude (NaOH) et l’eau oxygénée (NaOH + H2O2)
(Figure 84). Les traitements appliqués avant la mise sur le marché des tissus roumains ne
sont pas connus. Les traitements à la soude sur les tissus sont connus depuis deux siècles
et sont couramment appelé mercerisation, inventés par John Mercer en 1844. Ces
traitements favorisaient les teintures des tissus notamment grâce à l’effet de gonflement de
la cellulose constitutive des fibres du coton. Le traitement à l’eau oxygénée est couramment
employé dans l’industrie textile pour blanchir les étoffes.
Néanmoins dans cette étude, la zone polysaccharidique entre 1050 et 1250 cm-1 ne
présente que peu de variations. La comparaison de ces différents tissus montre par contre
des modifications d’absorbance des tissus dans la zone de 1160-1250 cm-1 attribuée aux
esters aromatiques. Cette zone d’absorbance est décrite comme étant notamment
révélatrice des ratios Syringyl/Gaiacyl (S/G = 1330/1270 cm-1) des lignines (Dorado et al.,
2001). En outre, le calcul de ces ratios sur les données n’indique pas de différences, les pics
160
ne sont pas réellement définis et les ratios sont très faibles (de l’ordre de 0,002). Comme
souligné dans le chapitre « Méthodes » il n’est pas évident d’attribuer spécifiquement des
nombres d’ondes à des composés chimiques précis dans une matière hétérogène.
3.3.2
Exemple de diagnostic de tissus : comparaison lin/chanvre
Aucun diagnostic qualité ne semble appliqué aux textiles. Les matières premières à
base de chanvre sont difficiles à trouver et aucune certitude n’existe quant à leur origine. En
effet, la plupart des échantillons initiaux ne sont pas précisément caractérisés. Les méthodes
de contrôle qualité utilisant les techniques Infra-Rouge sont largement employées dans
l’industrie pharmaceutique ou agroalimentaire. Les investigations préliminaires présentées ici
cherchent à tester la faisabilité de ce genre diagnostic sur les textiles. Les fibres de lin ont
été fournies par les collaborateurs tisserands (Lépée) et les fibres de chanvre sont des fibres
rouies à 30 jours.
Figure 85. Représentation graphique de la comparaison de la moyenne (T-Test) des spectres acquis sur
les fibres de chanvre rouies contre la moyenne des spectres acquis sur les fibres de lin rouies. Les
valeurs positives correspondent à des absorbances relativement plus élevées pour les fibres de chanvre
que pour les fibres de lin Les valeurs négatives correspondent à des absorbances relativement plus
élevées pour les fibres de lin que pour les fibres de chanvre. Les axes horizontaux rouges bordent les
seuils de différences significatives. Entre ces deux axes, les différences ne sont pas significatives.
Les techniques IR permettent de discriminer le lin du chanvre (Figure 85) notamment
sur les nombres d’onde polysaccharidiques (NO entre 1050 et 1250 cm-1) et esters (NO
161
autour de 1740 cm-1). Ces techniques semblent adaptées pour la mise en place d’un contrôle
qualité. Toutefois, il est nécessaire de calibrer la méthode, c’est-à-dire de construire une
base de données de références comprenant le maximum de fibres végétales d’origines
connues et à leurs différentes étapes de transformation. En effet, comme montré
précédemment, les différents traitements apportés aux fibres (traitements alcalins, etc.)
induisent des variations qu’il faut être capable de pondérer. De plus, pour une application sur
les diagnostics textiles, il faut être capable d’engendrer des fils mixtes comprenant plusieurs
fibres végétales. Par exemple, pour être capable d’établir dans un tissu la proportion de
chanvre et de lin, il faut avoir une base de données de référence avec ces différentes
proportions qui auront été testées au préalable. Ce travail fastidieux nécessite une mise en
place rigoureuse mais augure de bonnes perspectives d’applications aux vues de la quasi
absence de certification textile actuellement. Les textiles étant de plus en plus employés
dans l’industrie, il serait intéressant de développer des collaborations pour la mise en place
de ce type de diagnostic.
162
‘…Ž—•‹‘
±±”ƒŽ‡Ȁ‡”•’‡…–‹˜‡•
Ces trois années de travaux sur le chanvre ont permis la mise en place de
nouvelles techniques de caractérisation des fibres longues en vue de leurs utilisations (à
l’état tissé) dans des matériaux composites. L’approche globale, de la plante au matériau,
intégrée dans le programme CompoChanvre offre de nouvelles pistes pluridisciplinaires
appliquées pour la substitution du carbone industriel par le carbone d’origine végétale.
Chacune des étapes, de la culture de la plante à l’utilisation des fibres dans des matériaux,
est critique. Parmi la séquence requise pour la transformation des fibres en vue de leur
emploi dans les matériaux composites, plusieurs étapes sont manquantes. En effet, après le
rouissage, il serait nécessaire de teiller, peigner puis de filer les fibres longues obtenues afin
de confectionner le tissu pour la réalisation des matériaux composites. Cependant, la plupart
des professionnels effectuant ces étapes sur les fibres de chanvre n’existent plus en France,
aussi le suivi des fibres longues de la plante jusqu’au matériau composite a été impossible à
réaliser. Ce qui aurait été possible avec le lin ne l’était pas avec le chanvre. Toutefois, les
résultats obtenus au cours de cette thèse ont permis d’avancer sur un certain nombre de
points.
Malgré les difficultés rencontrées, quelques paramètres de culture des chanvres ont
été pris en compte dans nos études. L’effet de l’azote sur la croissance des chanvres de la
variété « population » Félina 32 a été évalué sur les deux années 2008 et 2009. Les
résultats ont montré l’impact bénéfique de l’apport d’azote à 80 U sur la croissance des
plantes en taille et en épaisseur ainsi qu’une plus forte proportion de fibres. Cet apport de
80 U correspond à l’apport d’azote classiquement épandu par les chanvriculteurs régionaux.
Dans cette condition, les 3 paramètres taille/diamètre et pourcentage de fibres sont liés, ce
qui est conforme à la littérature (Amaducci et al., 2008 ; Bennett et al., 2006). L’originalité de
notre étude réside dans le choix des techniques complémentaires en analyses d’image pour
l’évaluation des proportions de fibres in planta.
La variabilité du terrain a été prise en compte et souligne l’importance d’une
homogénéité de terrain requise pour une croissance plus homogène de la culture. En effet,
comme vu en 2008 sur les tests de densité de semis, la forme en « cuvette » du champ n’a
pas favorisé la croissance des plantes se retrouvant dans la partie plus tassée du terrain.
D’autre part, en 2008, la comparaison entre deux types de sols (argilo-calcaire et calcaire) a
pu être prise effectuée mais le nombre d’échantillon (10 plantes cette année là) n’était pas
suffisant pour rendre compte d’un impact significatif de la pédologie du champ sur la
163
croissance des plantes. Les tests en champ méritent d’être poursuivis sur plusieurs types de
terrain choisis préalablement pour qu’ils soient les plus homogènes possible. Ensuite, les
prélèvements à chaque date de suivi de la croissance des plantes doivent être plus
importants.
En effet, le chanvre est une plante très polymorphe car elle se présente sous forme
de variétés « populations ». Comme souligné lors des campagnes en champs, il est
nécessaire de considérer un grand plan d’échantillonnage (au-delà de 30 individus minimum
ou couper à chaque prélèvement plusieurs fois 1 m2) pour estimer statistiquement les effets
des traitements sur la croissance des plantes et a fortiori la production de fibres longues.
Malgré le polymorphisme des chanvres, les paramètres culturaux, notamment la densité de
semis optimise une production plus uniforme de tige (Van der Werf et al., 1995 a, b).
Naturellement, même si les parties florales restent très variables d’une plante à l’autre
(phyllotaxie, ratio fleurs « mâles »/ fleurs « femelles »), elles conservent en moyenne les 8
premiers entre-nœuds avec, à chaque nœud, une phyllotaxie opposée (Mediavilla et al.,
1998). Il est à noter que l’étude de la plante à l’échelle de l’entre-nœud est pertinente compte
tenu du développement de la plante par son méristème apical et du fait que la partie de la
tige utilisée pour la production de fibres correspond souvent aux entre nœuds qui ont été
étudiés ici (les 8 premiers entre-nœuds). Cette précision permet de mieux comprendre les
impacts des différents facteurs agronomiques sur les plantes par opposition aux études
considérant les bas et milieux des plantes comme paramètre morphologique des tiges
(Amaducci et al., 2008). Les comparaisons entre les études sont moins évidentes. D’autres
études considèrent des portions de tige de 50 cm prélevées à différents niveaux de la tige
(Westerhuis et al., 2009), l’avantage de ces approches est de faciliter la manutention au
cours des études, et restent plus favorables pour une application. Il serait nécessaire de
veiller à la stabilité des 8 premiers entre-nœuds sur d’autres variétés de chanvre pour
potentiellement corréler des tailles de portion de tiges correspondant à un certain nombre
d’entre-nœuds.
Plusieurs études sur l’impact des conditions agronomiques sur les rendements en
fibres longues ont été menées sur le chanvre. Les comparaisons restent difficiles car chaque
étude garde ses spécificités en termes de méthodes de caractérisations des rendements en
fibres. Le tableau ci-dessous récapitule les grandes lignes des principales études, en
soulignant les méthodes associées.
164
Tableau 14. Récapitulatif non-exhaustif des différentes études des impacts agronomiques sur la
production des fibres longues de chanvre.
Référence
Variétés de
Mode de culture
chanvre
Méthodes de
Rendements
Rendements
Proportion de
caractérisation
paille (t/ha)
« fibres » (total)
« fibres
n = 25.
10, 4 t/ha à 80 U
3,7 t/ha d’écorce
35,6 % d’écorce
à 80 U
à 80 U
longues »
Van der Werf et
Densité de
al., 1995a et b
plantes à la
récolte 160
Séparation mécanique
plantes /m2
(avec une machine
3,8 t/ha d’écorce
34 % d’écorce à
(1991) et 132
linicole)
à 200 U
200 U
Bas : 1,9 t/ha
Bas : 54 %
Milieu : 1,2 t/ha
Milieu : 34 %
Haut : 0,4
Haut : 12%
plantes /m2
11,3 t/ha à 200
U
(1992)
azote 80 et 200
kg/ha,
Mediavilla et
Kompolti
al., 2000
Densité de semis
170 plantes /m
2
Azote : 60kg/ha.
n = 25, comdition bas,
5,8 à 14,8 t/ha
milieu, haut.
Séparation chimique et
microscopie
11 à 12 % de
fibres primaires
localisées dans
la partie
valorisable de la
tige
Struik et al.,
Futura 77
Trois pays :
Pesée et fractionnement
Seuls les
Considérant les
2000
(seule des
Pays-Bas,
de la biomasse pour
rendements de
dosages de la
variétés
Angleterre, Italie.
calculer le % de cellulose
la Futura 77
cellulose pour
cultivées
sont rapportés.
Futura 77 à la
dans les 3
3 densités : 30,
(moyenne des
récolte, 65% de
90, 270 plantes /
3 densités)
cellulose soit 9
pays), Fédora
19, Félina 34,
m
Kompolti,
Carmagnola
t/ha de cellulose
2
Italie. 12,6 t/ha
3 conditions
(75 plantes/m2)
azotés, 100, 160,
(1996), 11,7 t/ha
220 kg/ha
2
(82 plantes/ m )
(1997).
Pays-bas. 12,5
t/ha (58 plantes/
2
m ) (1996), 13,4
t/ha (78 plantes /
2
m)
Angleterre. 12,5
t/ha (58 plantes/
m2) (1996), 9,9
t/ha (85 plantes/
2
m ) (1997).
165
Bennett et al.,
Chameleon,
Densité de semis
2006
Futura 77,
(en graines/ m2) :
Fedora 19,
150 et 300,
Beniko,
respectivement
Bialobreski
98 et 175
8,7 t/ha (98
Rendements en
Proportion des
plantes / m2) et
fibres totales :
fibres totale :
pesée poids secs à lé
9,8 t/ha (175
4,1 (98 plantes /
47% (98 plantes
récolte et après rouissage
plantes/ m2)
m2), et 5,1 (175
/ m2) et 51,4%
n = 60
2
plantes/ m ).
et teillage
(175 plantes/
plantes/ m2
m2).
Azote : 160
Proportion des
kg/ha
Rendements en
fibres longues :
fibres longues :
13,4% (98
1,2 t/ha (98
plantes / m ) et
2
plantes / m ), et
13,2 % (175
1,3 t/ha (175
plantes/ m ).
2
2
plantes/ m2).
Westerhuis et
Futura 75
al., 2009
Deux pays :
n = 20,
Pays-Bas (NL) et
Italie (I)
3
portions
de
partant du bas
tige
en
(B0-50,
11,7 t/ha aux
Proportion des
Pays-Bas et
fibres à la
10,4 t/ha en
récolte :
Italie.
B50-100 et B25-75 cm), 2
B 0-50 (NL) 2,9
B 0-50 (NL)
portions de tige en partant
t/ha, (I) 2,75 t/ha
25%, (I) 26,5 %
B 25-75 (NL) 3,3
B 25-75 (NL)
t/ha, (I) 3,16 t/ha
28,5%, (I) 29%
Densité de
du haut (H50-100 et H25-
plantes : 120,
75)
240, 360 plantes/
m
2
Rouissage,
broyage,
teillage et nettoyage
B 50 -100 (NL)
B 50 -100 (NL)
à la récolte
3,4 t/ha, (I) 3,2
29%, (I) 30,5%
respectivement
t/ha
103, 183 et 226
H50-100 (NL)
2
plantes/ m > 100
H-50-100 (NL)
cm.
t/ha
Azote 60 kg/ha
H 25-75 (NL) 3,1
kg/ha (Pays-Bas)
Félina 32
Deux champs
t/ha, (I) 2,75 t/ha
2008 n = 10
dans la Vienne
en 2008, un
champ en 2009
H25-75 (NL)
26,5%, (I) 26,5%
(Italie) et 40
PhyMoTS
27,5%, (I) 28,5%
3,2 t/ha, (I) 3
Moyenne 5,7
Rendements
Proportion de
t/ha (2008)
pondérés par les
fibres totales
proportions
(sur 80 U) 14%
2009 n = 30
Moyenne 5,97
2009 : 0,83 t/ha
Proportion des
Azote (2008) 80,
en fibres totales,
FI : 10,8%
120, 160 U
0,64 t/ha en FI
t/ha (2009)
Il est remarquable de rendre compte de la diversité des approches (Tableau 14) et de
noter que les études qui prennent en compte les étapes de transformations du chanvre
(rouissage, teillage, peignage), comme celle de Bennett et al., 2006 sont plus proches de
166
nos résultats en terme de proportion de fibres (de l’ordre de 10 à 14% de fibres). Leurs
études sont axées sur des suivis de masse entre les différentes étapes. De fait, les tiges de
chanvre sont délestées des différents tissus entourant les fibres et des fibres secondaires au
cours des étapes de transformation. Les valeurs autour de 10 à 14% de fibres semblent plus
proches de la réalité en termes de production de fibres longues et de leur proportion réelle
dans la plante par opposition aux 30 à 35% de fibres souvent indiquées qui incluent le
parenchyme phloémien.
Les rendements en paille totaux dépendent de la variété ou du génotype X
environnement (pédologie et climatologie) X impacts culturaux (effets croisés azote et
densité de semis) (Amaducci et al., 2008). Les proportions de fibres seraient principalement
modifiées par le choix de la variété (Westerhuis et al., 2009). Les études méritent donc d’être
poursuivies sur un choix plus large de variétés.
Certaines études récentes proposent de s’axer uniquement sur la croissance
végétative des chanvres pour la production de fibre, c’est-à-dire les deux premiers mois de la
croissance de la plante (Westerhuis et al., 2009). La réalisation de deux semis par été
favoriserait évidemment les rendements, vu que la production serait a priori doublée.
Toutefois, il faut veiller au degré de maturité des fibres dans la tige, car si les fibres ne sont
pas matures, le comportement mécanique est souvent différent du fait de la surface du
lumen au cœur de la fibre (Charlet et al., 2006). Les travaux récents de Gorshkova et al.,
(2010) sur l’étude de la mise en place des fibres de lin et de chanvre apportent des pistes
d’études sur les stades de maturité des fibres, considérant notamment le nombre de noyaux
par cellule. Il serait intéressant d’appliquer leur approche sur les fibres à l’échelle de l’entrenœud et en fonction des stades de croissance pour évaluer les corrélations possible entre
les stades de maturité des fibres et les stades de développement de la plante. Les études
complémentaires, avec les méthodes d’étude de proportion de fibres développées dans le
cadre de ces travaux, pourraient être intégrées dans le suivi de la mise de la mise en place
des fibres.
Le suivi des fibres longues de la plante au matériau est compliqué dû au fait de
l’absence de la filière textile de transformation. Des mesures peuvent être envisagées sur les
fibres inclus dans les matériaux composites mais il reste délicat de comparer les résultats à
ceux obtenus sur des fibres in planta. Pour ce faire, l’évaluation des modifications des fibres
sous l’influence des conditions agronomiques puis au cours de l’ensemble de la chaîne de
transformation doit pouvoir être assurée. Dans nos travaux, l’évolution des fibres de chanvre
aux cours du rouissage est une première étape. En effet, le rouissage correspond à l’étape
167
initiale de la transformation des tiges de chanvre pour une utilisation textile. Ensuite les
étapes de teillage, de filage et de tissage doivent pouvoir être étudiées pour mieux
comprendre les modifications physiques et chimiques des fibres longues pour optimiser leur
emploi dans les matériaux composites.
L’étape de rouissage modifie la composition des parois constitutives des fibres,
comme souligné par le suivi du rouissage en microspectrométrie FT-IR. Lors de nos
investigations, le rouissage fut pratiqué avec un prototype visant à mimer les rouissoirs
existant auparavant. Aucune étude du contenu des bacs de rouissage n’a été réalisée, le
temps imparti pour ses travaux ayant nécessité des choix. Il serait intéressant d’étudier le
contenu en microorganismes présents dans l’eau de rouissage. Des approches de
métagénomique complétées par du séquençage à haut débit permettraient de mieux extraire
les organismes présents. La caractérisation des enzymes principalement impliquées dans le
phénomène de rouissage pourraient être alors réalisées.
En effet, d’autres méthodes de rouissage enzymatiques ont aujourd’hui été
développées (Akin et al., 1999 ; Akin et al., 2000 ; Di Candilo et al., 2000 ; Evans et al.,
2002). L’utilisation d’enzymes ou de cocktail d’enzymes commerciales connaît un véritable
essor avec notamment l’avènement de la chimie verte utilisée dans la conception de
nouveaux biocarburants. Ces enzymes digèrent les différents composés pariétaux. Parmi
ces enzymes, des pectinases (Di Candilo et al., 2000 ; Evans et al., 2002) issues des
microorganismes présents dans l’eau de rouissage. Les microorganismes responsables des
activités pectinolytiques sont principalement des champignons filamenteux et des bactéries
aérobie du genre Bacillus et anaérobie du genre Clostridium (Di Candilo et al., 2000). Les
modifications causées par ces enzymes sur les fibres de chanvre pourraient être étudiées
par les techniques Infra-rouge. En effet, comme vu lors de nos investigations, ces techniques
sont prometteuses et apportent de nombreux renseignements pour le suivi des modifications
biochimiques des fibres. Toutefois, la résolution de ces méthodes (15 μm2) n’est pas
suffisante pour obtenir des informations précises sur les modifications des composés
pariétaux modifiés dans les fibres au cours du rouissage. Les méthodes d’immunocytochimie
complémentaires sur le matériel inclus en résine peuvent compléter ces données (Blake et
al., 2008, Gorshkova et al., 2010). En effet, Knox et al., (2008) ont développé une panoplie
d’anticorps dirigés contre les motifs spécifiques des composés pariétaux. Les épitopes
pectiques (JIM5, JIM7, PAM1), des anticorps reconnaissant les motifs arabinanes et
galactanes (LM5, LM6), et des anticorps reconnaissants des motifs cellulosiques (CCBM).
Des études avec l’ensemble de ces anticorps sur le chanvre ont déjà été réalisées (Blake et
168
al., 2008) sur des coupes transversales de tiges mais ne concernent pas les fibres au cours
de leurs transformations. Lors de nos investigations, une vaste gamme d’échantillons de
chanvre a été préparée en résine LR White Medium offrant la possibilité d’études
immunocytochimiques. En effet, des échantillons issus des campagnes de prélèvement en
champ (2008 à chaque date de prélèvement, échantillons du bas et de milieu de la tige et
2009 à la récolte), des échantillons transformés (les fibres aux différents temps de rouissage
ont été inclus en résine pour les 3 campagnes de rouissage) et des échantillons du marché
(des fils de chanvre, les fibres issues des chaînes de transformation de StartHemp® à deux
temps de rouissage différents et des fibres de Hemptrader®) sont disponibles pour ces
analyses. Tous ces échantillons ont été analysés en microspectrométrie FT-IR mais les
difficultés d’exploitation des cartes liées aux problèmes d’acquisition n’ont pas permis une
valorisation complète de ces échantillons. Toutefois, nos études ont souligné l’impact du
rouissage sur les modifications chimiques au sein des fibres primaires de chanvre. Les NO
autour de 1740 cm-1 déclinent jusqu’à 30 jours de rouissage, à l’inverse les fibres absorbent
plus autour des NO entre 1000-1250 cm-1, attribués aux polysaccharides cellulosiques.
Pourtant, une autre étude sur le rouissage avec de l’eau de mer appliquée aux fibres
longues de chanvre, ne montre pas d’impact sur les composés cellulosiques au cours du
rouissage (Zhang et al., 2008). Leurs analyses n’utilisent pas la microspectrométrie FT-IR
mais des techniques FT-IR classiques. L’originalité de notre étude concerne l’utilisation d’un
microscope couplé à un spectromètre et le développement de la cartographie des NO
d’intérêt par les scripts développés par Urbain et al., sous R v(2.10.1) (Article en cours de
rédaction).
Les techniques IR présentent des difficultés d’interprétation, comme toute technique
nouvelle (du moins dans leurs applications aux fibres végétales) mais des pistes d’utilisation
ont été indiquées. Il s’agit notamment de l’utilisation des méthodes ATR pour la distinction
des fibres de lin et de chanvre ou encore pour le suivi des modifications biochimiques des
méthodes d’ensimage sur les fibres. Ces techniques sont pertinentes pour l’étude des
compositions des parois végétales, comme l’étude de Mouille et al., (2003) a su le montrer
dans la caractérisation de mutants de paroi chez Arabidospis thaliana.
Les méthodes de caractérisation morphologique et cytologiques développées au
cours de ces travaux, en particulier l’utilisation de l’acridine orange comme colorant
métachromatique des parois, sont particulièrement bien adaptées aux autres fibres
végétales. En effet, l’observation en fluorescence est facilitée et cette technique de
coloration utilisée conjointement avec un MCBL à différentes λexcitations et λémissions se prête
169
parfaitement à l’analyse d’image. Il faudrait multiplier les observations pour montrer toute la
puissance de cette technique relativement aisée à mettre en œuvre.
La construction de base de données avec les mêmes méthodes de caractérisation
morphologique et biochimique sur différents végétaux contribuerait à optimiser l’emploi de
ces matières premières biossourcées. Pour le remplacement des fibres synthétiques dans
l’industrie, il est nécessaire d’établir des cahiers des charges sur les fibres végétales
(incluant les paramètres morphologiques, biochimiques et mécaniques de ces matières) afin
de séduire les industriels et motiver le développement de nouveaux matériaux plus
respectueux de l’environnement.
170
171
±ˆ±”‡…‡•„‹„Ž‹‘‰”ƒ’Š‹“—‡•
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Caractérisation des fibres longues de chanvre (Cannabis sativa) en vue de leurs
utilisations dans des matériaux composites.
Les fibres longues de chanvre sont des cellules mortes du tissu phloémien, dont ne subsiste
que la paroi, essentiellement cellulosique. Elles présentent d’excellentes qualités mécaniques, mais
les lots de fibres utilisés sont hétérogènes. Aussi leur caractérisation plus fine est indispensable pour
de nouvelles applications notamment comme renfort dans des matériaux composites (but du
programme « Compochanvre » de la Région Poitou-Charentes dans lequel s’inscrit cette thèse).
L’étude de la répartition des fibres dans la plante en fonction des conditions de culture (serre,
champs, apport d’azote et densité de semis) a été menée. Au champ, des conditions de fertilisation
moyennes (80 unités d’azote/ha) ont des effets favorables sur la croissance en longueur et en
diamètre des tiges et sur le pourcentage de fibres longues. Pour étudier la répartition et le nombre de
fibres, des techniques d’imagerie (microscopies photonique et confocale) et d’analyse d’image (Image
J) ont été développées. Cela a permis de déterminer un diamètre de Féret de 34 ± 11 μm pour les
fibres et de confirmer leur ontologie phloémienne.
L’obtention des fibres longues nécessite une étape de rouissage qui favorise leur séparation
des autres tissus La caractérisation des fibres longues durant le rouissage a été réalisée selon deux
axes principaux : 1 - la caractérisation histologique des fibres, 2 - leur caractérisation biochimique à
l’aide des techniques Infra Rouge (Attenuated Total Reflectance et Microspectrométrie Infra Rouge à
Transformée de Fourrier). Les résultats obtenus démontrent qu’un rouissage optimal permet d’éliminer
les tissus environnants et que les fibres restent groupées en faisceaux et s’enrichissent en cellulose.
Ces techniques innovantes pourront être utilisées pour des applications plus industrielles.
Mots clés : chanvre, fibres, microscopie, techniques infrarouges, rouissage.
Characterization of hemp (Cannabis sativa) long fibers for their use
in composite material
Hemp long fibers are phloem dead cells where only the cellulosic cell wall remains. They
present excellent mechanical properties, but fibers present a huge heterogeneity which represents a
difficulty for their use. Therefore a precise characterization is required for new utilisations such as
reinforcement for composite material (aim of the “CompoChanvre” program funded by the PoitouCharentes Region).
The distribution of fibers in the plant according to different growth conditions (green house,
field with different nitrogen supplies and density) was studied. In field, average fertilization conditions
(80 U / ha of nitrogen) favour the growth (length and thickness) of hemp stem and also the amount of
fibers. To study the fiber distribution and number, confocal and light microscopy associated with image
analysis (Image J software) were developed. Mean hemp fiber diameter of 34 ± 11 μm was
determined and their phloem origin was confirmed.
To obtain hemp long fibers requires a retting step which favours their dissociation from other
tissues. The characterization of hemp long fibers during retting was lead according to two mains axes.
First, an histological characterization was done. Second, a biochemical characterization with infra-red
techniques (Attenuated Total Reflectance and microspectroscopy with Fourrier transformed Infrared)
was realised. Following selected wave numbers during the retting step showed the disappearance of
the tissue around the fibers and their relative cellulose enrichment.
These innovative technical could be used for industrial applications.
Key words : hemp, fibers, image techniques, infrared, retting.
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