Catherine Vénien-Bryan - ESI

Cours Franco-­‐Québécois d’Enzymologie Avancée Enzymologie Moléculaire & Mécanis4que UE 5V107 (UPMC) & BMC 6225 (Université de Montréal) Le kinome Les protéines kinases comme cibles thérapeu4ques Catherine Vénien-Bryan!
IMPMC UMR7590!
Equipe Structure et Dynamique des Protéines!
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Vendredi 18 Septembre 2015 o  EvaluaDon des kinases comme cible thérapeuDque, “druggable target” o  Domaine catalyDque partagé •  (ConformaDons acDves, inacDves ou conDnuum) o Mécanisme catalyDque, résidus clés o  Les inhibiteurs actuels des kinases §  Cibler Le site de fixaDon de l’ATP §  Cibler la conformaDon acDve ou inacDve •  (cancer) § Fasudil et Rho kinase § Inhibiteurs d’ABL imaDnib (Glivec) niloDnib (Tasigna) et dasaDnib (Sprycel) § Inhibiteurs des EGFR kinases gefiDnib (Iressa) erloDnib (Taceva) et lapaDnib (Tykerb) § Inhibiteurs de B-­‐Raf et VEGFR sorafenib(nexavar) et suriDnib (Sutent) § InhibiDon de mTOR (Temsirolimus (Torisel CCI-­‐779) § Inhibiteurs de CDK en phase II •  Le monde pharmaceu4que au tournant de son histoire Durant les 30 dernières années, les blockbusters ($$$) ont été mis sur le marché, anDcancéreux, agents respiratoires, régulateurs de lipide, anDdiabéDques et anDpsychoDques ($307 milliards aux EU) MAIS … –  Les brevets arrivent a échéance (fermeture du site de Pfizer a Sandwich UK) –  Les couts et les risques associés au développement de nouveaux médicaments ne cessent d’augmenter –  Food and Drug Administra0on a durci les règles pour l’autorisaDon sur les marchés Mullard 2011 Développement d’un médicament Kola et Landis, 2004 Arrowsmith, 2011 Les différents acteurs de la recherche et la “druggabilite”, Vistoli et al., 2008 La familles des protéines kinases humaines Rôle physiologique Carbohydrates et lipides TranscripDon et réplicaDon de l’ADN Biosynthèse des neurotransmegeurs ContracDon des muscles lisses Unregulated protein kinases cause diseases such as cancers, inflammatory disease, diabetes and neurodegenera4ve diseases La familles des protéines kinases humaines Rôle enzyma4que •  Catalysent la phosphorylaDon (modificaDon post-­‐traducDonnelle) de protéines cibles: transfert du γ-­‐phosphate d’un ATP vers le groupe hydroxyle d’un résidu serine, thréonine ou tyrosine Protein-­‐OH + ATP4− .Mg2+ → Protein-­‐O-­‐PO32− + ADP3−.Mg2+ + H+ •  La réacDon inverse, la déphosphorylaDon, est catalysée par les phosphatases •  les processus biologiques sont ainsi switch ON and OFF en foncDon de la demande de la cellule • 
L'efficacité catalyDque est augmentée de 1014 fois avec une enzyme L'efficacité cataly4que est augmentée de 1014 fois Ac4on PhK sur la Meme réac4on sans Glycogene interven4on Phosphorylase d’enzyme: methanolyse de l'ATP en methyl phosphate kcat=28sec-­‐1 KM(ATP)=70 uM Efficacité catalyDque kcat/KM=4x105s-­‐1M-­‐1 kcat/KM=3.8x10-­‐9s-­‐1M-­‐1 La phosphoryla4on •  La phosphorylaDon induit des modificaDons structurales donc foncDonnelles très importantes de la protéine cible qui ont pour conséquences entre autres… une augmentaDon ou une inhibiDon de son acDvité enzymaDque un changement de sa localisaDon cellulaire dans certains cas (i.e. facteurs de transcripDon) L’associaDon avec protéines créer des états transitoires entre un état ordonné vers un état désordonné ou inversement désordonné vers ordonné créaDon de sites de reconnaissance pour le recrutement d'autres protéines How can covalent a[achment of a phosphate group promote different responses? •The phosphate group has a double negaDve charge •This property cannot be mimicked by the naturally occurring amino acids • A phosphate group can act as an organising centre through hydrogen bonds • A phosphate group has steric bulk and can act as a blocker or through electrostaDc repulsion Phospho-­‐group as an organizing centre making bidendate bonds to arginine residues Phospho-­‐Tyrosine Phospho-­‐sérine Phospho-­‐thréonine Glycogen phosphorylase is ac4vated by phosphorylase kinase, the first protein kinase to be discovered-­‐1955 J. Biol Chem. 1955; 216, 121-­‐132 Three noble prizes around kinase 1992 : Edwin Krebs & Edmond Fischer « Reversible protein phosphoryla0on as a biological regulatory mechanism » 2000 : Arvid Carlsson, Paul Greengard & Eric Kandel « Signal transduc0on in the nervous system » 2001 : Leland Hartwell, Tim Hunt & Sir Paul Nurse « key regulators of the cell cycle » Kinome humain et Phylogénie 518 protéines kinases 478 kinases typiques (ePKs) 388 ser/thr kinases 90 tyrosines kinases 40 aPKs (atypical protein kinase) Arbre phylogénique des 478 protéines kinases humaines typiques (ePKS eucaryoDc protein kinase) soit 491 domaines catalyDques disDncts reparDs en 9 groupes Id: pourcentages d’idenDté de séquence au sein de chaque groupe Le pourcentage d’idenDté sur la totalité des séquences étant de 22.6% Manning et al., 2002, Science 298: 1912 Kinome humain et Phylogénie Groupe Nombre de domaines cataly4ques Informa4ons succinctes Quelques exemples de kinases ACG
63
CAMK
82
CMGC
61
cAPK
RSK1..4
PHK, TTN
RSK1..4 (second domaine, pseudokinase)
CDK1..11
ERK1..7, MK10, MK14
CK1
12
Phosphoryle préférentiellement les résidus Ser et Thr proches
d’acides aminés basiques tels que la Lys ou l’Arg
Très proche du groupe AGC. Phosphoryle également des substrats
contenant des résidus basiques
Large groupe présent chez tous les eucaryotes. Rôles importants
dans le cycle cellulaire, la transduction du signal (en bas de la
cascade des MAP kinases) etc..
Petit groupe présent chez tous les eucaryotes
STE
48
MAP2K1..7
MAP3K1..8
TK
94
Rôles importants dans la transduction du signal (en haut de la
cascade des MAP kinases). Certaines sont duales, capables de
transférer le phosphate aussi bien sur Ser, Thr ou Tyr.
Phosphoryle spécifiquement les Tyr. Rôles importants dans la
transduction du signal intra et intercellulaire. La moitié de ces
kinases ont un domaine récepteur transmembranaire avant le
domaine catalytique, et sont appelées Récepteurs à activités
Tyrosine Kinase (RTKs)
TKL
43
RGC
5
Autres
83
Atypiques
40
CK1
Non RTKs :
ABL, SRC, BMX, BTK, TEC, CSK,
LCK, FAK, HCK JAK1..3 (un domaine
catalytique et un domaine pseudokinase)
RTKs :
EPHA1..10, EPHB1..6, EGFR/Her1..4,
KDR, KIT, PDGFR, FMS, INSR,
FGFR1..4
ILK (pseukinase) TAK1
Présente une similarité proche des TKs, mais ne phosphoryle que
les résidus Ser et Thr
Très petit groupe, présentant une similarité de séquence proche des ANP (pseudokinase)
TKs, mais ne phosphoryle que les résidus Ser et Thr
STK6, WNK1..4, CK2, PLK1,
Faible similarité de séquence avec les 8 autres groupes
Absence de similarité de séquence bien que capable de
phosphoryler des protéines. Pour celles dont la structure 3D est
connue, le repliement est globalement conservé avec les ePK
NEK2
mTOR
InformaDons relaDves aux neuf groupes de kinases humaines de type ePK ainsi qu’aux Atypiques (aPKs) Dré de la thèse d’Emeline Leproult 2011 Protein kinase distribu4on in different organism ePKs: eukaryoDc protein kinases aPKs: aDpycal protein kinases TKs: Tyrosin Kinase TKLs: Tyrosine kinase-­‐like Protein kinase architecture Kinase Fold (ac4ve form) Lobe N-­‐terminal Hinge Susan Taylor, Science 1991 • 
P-­‐loop C-­‐helix • 
• 
• 
CatalyDc loop • 
• 
• 
Substrat • 
Lobe C-­‐terminal • 
Two subdomaines (lobes) •  Small lobe/N-­‐lobe 5stranded anD parallel β-­‐sheet, α-­‐C helix conserved) •  Large lobe/C lobe enDrely α-­‐helical Small and large lobe are flexibly connected (hinge) ATP + 2 Mg2+ bind at the interface between the 2 lobes Ac4va4on loop (from DFG to APE moDf, is phosphorylated on pT197) CatalyDc loop (D166) C-­‐helix Glycine rich loop (GXXGXG moDf) posiDons β-γ
phosphate group ideally for catalysis between β2 and β3) PepDde to be phosphorylated binds on top of acDvaDon loop OH-­‐group of SER, Thr or Tyr to be phosphorylated is opDmally posiDoned close to γ-­‐phosphate group From Endicog et al., Annu. Rev. Biochem. 2012 81:587-­‐613 Protein kinases have a conserved fold •  Crystals structures of kinase domains of four Tyr-­‐kinases ( EGFR, Jak2, Abl, Lck) And two Ser/Thr-­‐kinases (PDK1,Chk2) •  The kinase domain is about 350 aminoacids long and highly conserced in sequence and structure Therefore: Kinases were considered un-­‐druggable un4l the end of the 1990s ATP binding and loca4on of the substrat (Ser-­‐Substrat) -­‐rôles supposés des quatre résidus catalyDques Lys (brin β3 P-­‐loop) Glu (C-­‐Helix), Asp-­‐DFG (AcDvaDon segment) Asp-­‐HRD (CatalyDc loop). Les liaisons hydrogènes sont représentées en poinDllées jaunes Les résidus du lobe C-­‐terminal stabilisant le ribose ne sont pas représentés. From Adams JA Chem. Rev. 2001, 101, 2271-­‐2290 -­‐ From LN Johnson et al., Cell, 1996 Substrate recogni4on Protein-­‐OH + ATP4− .Mg2+ → Protein-­‐O-­‐PO32− + ADP3−.Mg2+ + H+ . Remote docking sites exist also Protein kinase pep4de substrates Comparison of recogni4on sites for serine/theonine or tyrosine kinases
Structures de complexes kinases/pepDdes Protein kinase cataly4c mechanism Le groupe OH du substrat protéique est orienté de telle sorte que le doublet libre d'électron de l'oxygène est aligné le long de l'atome γ-­‐
phosphate parDcipaDon de Asp catalyDque acide/base la liaison nucléophile vers le phosphore commence a s'établir l'acidité du groupe hydroxyle du substrat augmente, et son pKa devient inférieur au pKa de Asp catalyDque a proximité Transfert d'un proton d'un groupe
hydroxyle (normal pKa ~ 12) vers Asp (normal pKa ~ 4,5). Conforma4on ac4ve versus conforma4on inac4ve All ac0ve kinases are alike but an inac0ve kinase is inac0ve aGer its own fashion -­‐Cataly0c residues are misaligned -­‐Binding sites for ATP and/or pep0de are sterically blocker -­‐Ac0va0on loop misaligned (substrate binding site not formed Une orientaDon différente des 2 lobes reflèt
flexibilité autour de la charnière Des orientaDon différentes de l'hélice C qui dans beaucoup d'états inacDfs est tournée vers l'exterieur déplacement du segment d'ac4va4on qui dans de nombreuses kinases inacDves est désordonné une conformaDon différente du mo4f DFG au début du segment d'acDvaDon Conforma4on inac4ve C-­‐helix out Conforma4on inac4ve C-­‐helix out (kinase CDK2) La même kinase dans la conformaDon acDve est représentée en transparent Déplacement de la C-­‐hélice (flèche orange, le résidu catalyDque Glu C-­‐hélice situé sur la C-­‐hélice est entouré en orange) Notez aussi le déplacement du segment d’acDvaDon Conforma4on inac4ve DFG out Conforma4on inac4ve DFG out de la kinase ABL. -­‐La même kinase dans la conformaDon acDve est représentée en transparent -­‐déplacement du moDf DFG sur le segment d’acDvaDon (flèche orange, le résidu PheDFG est entouré en orange) Conforma4on ac4ve versus conforma4on inac4ve Les 2 formes acDves et inacDves sont uDlisées comme cible pour produire des médicaments La conformaDon de la forme inacDve est souvent unique donc cibler cege forme inacDve peut donner une spécificité plus élevée e.g. imaDnib (Glivec) cible la forme inacDve de Abl tyrosine kinase avec une très forte spécificité. Seules les kinases Abl, ARG, Kit and PDGFR sont les cibles de imaDnib. L’affinité pour l’ATP est moins bonne dans les formes inacDves – favorable pour la fixaDon des inhibiteurs Cibler la forme acDve est avantageuse lorsqu’il y a perte de régulaDon conduisant à une forme acDve non régulée Cependant cibler la forme acDve résulte dans des inhibiteurs moins spécifiques Fasudil, dasaDnib, gefiDnib et erloDnib Efficacité du médicament in vivo dépend de son pouvoir a être un bon compéDteur en présence de concentraDons cellulaires d'ATP. (environ 1 a 10mM). Pour la plupart des kinases, le Km pour l'ATP est de l'ordre de 10uM. Mécanismes d’ac4va4on des protéines kinases PhosphorylaDon sur le segment d'acDvaDon, ou sur d'autres sites EliminaDon de sous-­‐unités ou de séquences inhibitrices, et/
ou l'associaDon avec d'autres domaines ou sous-­‐
unités. (Cdk2, cell cycle kinase, dont l’acDvaDon dépend de l’associaDon avec la SU cyclin) La fixaDon de la cycline dans la région de l'hélice C induit rotaDon de l'hélice et l’ acDvaDon DimerisaDon récepteurs à tyrosine kinase checkpoint kinase2 AssociaDon via des proteines scaffolding Des kinases peuvent aussi s'assembler pour assurer une spécificité et augmenter l'acDvité. En conclusion: 1-­‐ Les Protéines kinases eucaryotes ont un moDf commun catalyDque dans lequel l'hélice C et le segment d'acDvaDon sont essenDels pour posiDonner correctement, les résidus catalyDques. La catalyse est favorisée par -­‐alignement précis de l'ATP et du groupe OH du substrat -­‐parDcipaDon d'un résidu aspartate agissant comme acide/base, -­‐parDcipaDon d’un résidu basique pour stabiliser l'état de transiDon. 2-­‐ La reconnaissance du substrat au niveau du site catalyDque implique des résidus spécifiques dans la région près du site de phosphorylaDon. L'associaDon entre une kinase et son substrat est souvent de faible affinité une plus grande stabilité est obtenue par le docking sur des sites éloignés du site catalyDque. 3-­‐ Les protéines kinases sont flexibles et différentes kinases peuvent adopter des conformaDons disDnctes dans leur état inacDf. 4-­‐ Les mécanismes qui abouDssent a l'acDvaDon des kinases varient et incluent la phosphorylaDon sur le segment d'acDvaDon, la phosphorylaDon sur d'autres sites, le retrait de sous-­‐unités ou de séquences inhibitrices, et/ou l'associaDon avec d'autres domaines ou sous-­‐
unités. La dimérisaDon peut aussi réguler l’acDvaDon 5. Les protéines Scaffolding pourraient jouer un rôle dynamique et catalyDque dans l'acDvaDon des kinases et la sélecDon du substrat. Le rôle des pseudokinases (ou aPKs, 48 dans le kinome) commence à émerger: certaines parDcipent à la formaDon des protéines scaffolding, d’autres sont impliquées dans les voies de signalisaDon. 6. ConformaDon inacDve: conDnuum DFG out.. Helice C out…. Les kinases dérégula4ons •  La dérégulaDon de l’acDvité kinase: peut par exemple devenir consDtuDvement acDve –  AcDvaDon par mutaDon vers une forme consDtuDvement acDve –  Perte de régulateurs négaDfs –  Réarrangements chromosomiques qui conduisent à la formaDon de protéines de fusion acDves i.e. acDvaDon par mutaDon •  Plus du quart des cibles thérapeuDques sont des kinases (mais seulement 10 inhibiteurs ont été approuvés pour uDlisaDon clinique….) •  De nouvelles approches, plus efficaces pour la découverte de nouveaux inhibiteurs des kinases, sont en développement (inhibiDon covalente, miRNA) Les inhibiteurs des kinases cible des traitements contre le cancer -­‐UnDl the late 1990s, anD-­‐cancer drugs were directed towards -­‐metabolic enzymes (e.g. methotrexate) -­‐DNA (cisplaDn, gemcitabine, cyclophosphamide) -­‐DNA topoisomerases (doxorubicin, etoposide, irinotecan, topotecan)
-­‐hormonal signalling pathways via the nuclear hormone receptors for breast (e.g. tamoxifen) and prostate cancer (e.g.flutamide) -­‐microtubule stabilisaDon (e.g. paclitaxel,taxodere ) -­‐ Paclitaxel is used to treat paDents with lung, ovarian, breast, head and neck cancer, and advanced forms of Kaposi's sarcoma. Caractéris4ques des inhibiteurs de kinases (cancer) Découvertes importantes sur les protéines kinases et le développement d’inhibiteurs Nom générique Nom commercial Site ciblé Type d’inhibiteur Conforma4on Année approba4on (USA) Cibles kinases principales Indica4on Fasudil Fadudil (Asahi Kasei) ATP I AcDve 1999 ROCK Vasospasm cerebral ImaDnib Gleevec (NovarDs) ATP II InacDve 2001 ABL, ARG, PDGFR, KIT Leucémie (CML), Tumeurs du tube digesDf (GIST) NiloDnib Tasigna (NovarDs) ATP II InacDve DFG OUT 2007 ABL, ARG, KIT, PDGFR Leucémie (CML) avec résistance ou intolérance à imaDnib DasaDnib Sprycel (BMS) ATP I1/2 acDve 2007 ABL, ARG, KIT, PDGFR SRC etc. Leucémie (CML) ) avec résistance ou intolérance à imaDnib GefiDnib Iressa (Astra Zeneca) ATP acDve 2004 EGFR cancer du poumon , (NSCL) ErloDnib Tarceva (OSI PharmaceuDcal
s, Genentech et Roche) ATP I 1/2 acDve 2004 EGFR Carcinomes du poumon (NSCL) et pancreaDques (avec gemcitabine) LapaDnib Tykerb (GSK) ATP I 1/2 InacDve C helix OUT 2007 EGFR (ErbB1, ErbB2) Cancer du sein– Her2 posiDf Sorafenib Nexavar (Bayer) ATP II InacDve DFG OUT 2006 B-­‐Raf, VEGFR, PDGFR, FLT3, c-­‐KIT Carcinome des cellules rénales SuniDnib Sutent (Pfizer) ATP I AcDve 2006 VEGFR, PDGFR, FLT3, c-­‐Kit Renal cell carcinoma, gastrointesDnal stromal tumours Rapamycine Temsirolimus (analogue Rapamune (Wyeth) Torisel (Wyeth) N.D. III N.D. 2007 mTor via la FK-­‐
Binding Proteine Carcinome des cellules rénales, transplantaDon d’organes (immunosuppresseur) I 1/2 DFG OUT Inhibiteurs des protéines kinase autorisés cible: site de fixa4on de l’ATP •  Tous les inhibiteurs de kinase qui sont uDlisés cliniquement se lient au site de l'ATP avec l'excepDon de temsirolimus (cible mTOR) •  Le site de l’ATP est commun à toutes les kinases. Il est remarquable qu’en ciblant ce site on ait pu cependant créer des drogues spécifiques à quelques kinases •  La sélecDvité est créée en ciblant des poches adjacentes au site de l'ATP avec des groupes qui ont une diversité chimique, 5 poches ont été exploitées La poche ‘p38 ’ (reconnue dans p38a/BIRB-­‐796 complexe et ABL/imaDnib complexe) protégée par un résidu appelé « gate keeper » la poche entre l'helice C et le segment d’acDvaDon qui interagit avec de larges inhibiteurs de type II ciblant la conformaDon inacDve La poche qui stabilise le groupe adénine la poche sous l'adenine (lys89 chez CK2) La poche qui stabilise le ribose (plusieurs groupes polaires) Details of ROCK kinase in complex with hydroxyfasudil (fasudil) and with H1152P H1152P Ki Hydroxyfasudil Ki ROCK 0.15 uM ROCK 6 nM PKA PKA 0.34 uM 2.2 uM ABL inhibitors: ima4nib (Glivec). ABL conforma4on Ki ima4nib ABL inacDve 37 nM ABL acDve 7 uM Added to improve solubility and oral bioavailability Target the adenine ATP site ABL inhibitors: nilo4nib (Tasigna) and dasa4nib (Sprycel). F382 points toward the ATP-­‐binding site Dasa4nib se lie sur la conforma4on ac4ve de ABL F382 is buried in an hydrophobic pocket Aminothiazole occupe le site normalement lié à l’adénine de l’ATP Efficace dans le cas de mutaDons sur la boucle riche en G et le segment acDvateur (F317L, M351T) mais inefficace dans le cas de T315I EGFR kinase inhibitors: gefi4nib (Iressa), erlo4nib (Tarceva) lapa4nib (Tykerb) and HKI272. Improve pharmacokineDc properDes AcDve conformaDon EGFR kinase inhibitors: gefi4nib (Iressa), erlo4nib (Tarceva) lapa4nib (Tykerb) and HKI272. AcDve conformaDon InacDve conformaDon Large groupe ne peut s’accomoder que de la conformaDon inacDve EGFR kinase inhibitors: gefi4nib (Iressa), erlo4nib (Tarceva) lapa4nib (Tykerb) Ac4va4ng muta4ons, resistance EGRF EGRF EGRF EGRF ErbB2 wild T790M L858R T790M/
L858R Km ATP 10 uM 5.9uM 148 uM 8.4uM Kd 0.4 nM erloDnib Kd 0.7 nM gefiDnib 0.8uM 4.6nM 2.4 nM 10.9nM Kd 3nM lapaDnib Kd/Km 1.7uM 13nM 1.6x10-­‐5 78x10-­‐5 Inhibiteur de EGFR, gefiDnib, a montré que c'est la balance entre l'affinité pour l'ATP et celle pour la drogue qui détermine l'efficacité de la drogue. EGFR kinase inhibitors: and HKI272. HK1272 binds covalently to a cysteine residue Wissnet & Mansour, 2008) B-­‐RAF and VEGFR inhibitors. (a) Sorafenib in complex with B-­‐RAF B-­‐Raf conformaDon inacDve Rapamycin in the complex of FKBP12/rapamycin/FRB domain of mTOR Rapamycin is sandwiched between the two components Protein Kinases are also targets for treatment of -­‐ inflammatory disease, -­‐ Diabetes -­‐ neurodegeneraDve disease But as yet NO drugs in clinical use, due to the complexity of the signalling pathways that involves much cross-­‐talks between pathways Rheumatoid arthriDs ParasiDc deseases Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum is known CharacterisDc sequences of kinases specific to the parasite different from the human host could be targeted BirB-­‐796 targets inacDve conformaDon of p38 kinase Limita4ons rencontrées dans le développement des inhibiteurs Affinité pour l’ATP, efficacité des inhibiteurs IC50 = concentraDon d’inhibiteur nécessaire pour inhiber 50% de l’acDvité d’une kinase. Kd = constante de dissociaDon, permet d’évaluer l’affinité de l’inhibiteur pour sa cible. KM, ATP = affinité de l’ATP pour sa cible Sélec4vité Profil de sélec4vité de 38 inhibiteurs de kinases se trouvant de la phase clinique 1 au marché. Les sphères rouges indiquent les kinases humaines inhibées dans l’arbre phylogénéDque, avec un Kd allant de 10μM à 1nM selon le diamètre croissant de la sphère. Les arbres encadrés en bleu et rouge correspondent respecDvement à de bons et mauvais profils de sélecDvité de plusieurs inhibiteurs. Par exemple, la staurosporine a un très mauvais profil de sélecDvité tandis que l’imaDnib et le lapaDnib sont hautement sélecDfs, limitant les problèmes de toxicité. (Karaman et al., 2008) Inhibiteurs ATP-­‐compé44fs Type I Type I 1/2 Type I 1/2 Type II Inhibiteurs non ATP compé44fs Type III Inhibiteurs covalents ReprésentaDon du mode de liaison covalent d’un analogue de l’inhibiteur afaDnib via la cystéine 797 , située à la fin de la région charnière dans le site catalyDque de la kinase EGFR, en conformaDon acDve Nouvelles stratégies et direc4ons futures Quinazoline Quinoline Fedorov et al., Nature Chemical Biology vol.6 march 2010