these de doctorat

Transcription

these de doctorat

UNIVERSITÉ MOHAMMED V – AGDAL
FACULTÉ DES SCIENCES
Rabat
THESE DE DOCTORAT
N° d’ordre : 2561
Discipline: Biologie
Spécialité : Biochimie-Immunologie
Présentée par
Nawal MERGHOUB ep. GHOMARI
Titre
Recherche de substances naturelles issues de plantes
médicinales Marocaines capables d’inhiber la
prolifération des cellules cancéreuses du col de l’utérus et
étude de leurs mécanismes d’action
Soutenue le 26 Décembre 2011
Devant le jury :
Pr. Abdelaziz BENJOUAD
Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR/CNRST)
Pr. Katim ALAOUI
Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5s/FMP)
Pr. Saaid AMZAZI
Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR)
Pr. Youssef BAKRI
Pr. Mohammed EL HASSOUNI
Professeur de l’enseignement supérieur (FSDM/ Fès)
Dr. Mohammed EL MZIBRI
Directeur de l’Unité Biologie et Sciences Médicale (CNESTEN)
Pr. Abdelkader IL IDRISSI
Dr. Hamid MORJANI
Maître de conférences (UFR Pharmacie-CNRS/URCA)
Président
Examinateurs
Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat – Maroc
Tel +212 (0) 37 77 18 34/35/38, Fax : +212 (0) 37 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma
Dédicaces
A la mémoire de mon père,
A ma mère pour sa tendresse,
A mes beaux parents pour leurs encouragements,
A mon époux pour son soutien,
A mes frères, mes beaux frères et mes belles sœurs,
A mes grands parents, oncles et tantes,
A mes enfants Meryem et Abdelhadi,
A mes amies.
Avant Propos
Cette thèse a été réalisée dans le cadre d’une collaboration entre le Laboratoire de Biochimie Immunologie de la Faculté des Sciences de Rabat- Agdal- (Université Mohammed V), l’Unité de Biologie et
Recherche Médicale du CNESTEN et le Laboratoire MEDyC - Unité CNRS UMR6237 IFR53-UFR
Pharmacie (Université de Reims Champagne-Ardenne). Ce travail a été agréablement réalisé sous
l’encadrement scientifique conjoint du Pr. Saaid Amzazi, Dr. Hamid Morjani, Dr. Mohammed EL Mzibri, et
Dr. Laila Benbacer.
Ce projet de recherche a été soutenu par le “ Comité Mixte Inter-Universitaire Franco-Marocain”
dans le cadre d’une action intégrée Volubilis (AI n° MA/07/178 - Egide n° 13466WE; 2007-2010), dont je
tiens à exprimer mes plus vifs remerciements.
Je tiens tout d’abord à exprimer ma profonde reconnaissance et ma gratitude à Monsieur le Pr.
Saaid AMZAZI, Doyen de la Faculté des Sciences Rabat-Agdal (UM5a), responsable de l’UFR "BiochimieImmunologie" et directeur de thèse, de m’avoir accueilli au sein du Laboratoire, de m’avoir permis
d’effectuer ce travail, pour son encadrement, ses conseils constructifs, ses encouragements continus et pour
la confiance qu’il m’a accordé.
J’exprime mes sincères remerciements à Monsieur le Directeur Générale du CNESTEN Khalid EL
MEDIOURI de m’avoir accueilli au sein de son institution pour la réalisation de ce travail. Mes plus
sincères remerciements se dirigent vers Dr. Mohammed EL MZIBRI, Directeur de l’Unité Biologie et
Recherche Médicale (UBRM), pour m’avoir confié la réalisation de ce projet, pour son encadrement ainsi
que ses conseils et remarques pour l’amélioration de ce manuscrit. Je remercie également Dr. Laila
BENBACER, Responsable du Laboratoire Pharmaco-Toxicologie de l’UBRM/CNESTEN,
pour ses
conseils, ses encouragements, son encadrement, et son aide apportée lors de la réalisation de ce travail.
J’exprime ma profonde reconnaissance et mes sincères remerciements au Pr. Hamid MORJANI,
du Laboratoire MEDyC - Unité CNRS UMR6237 IFR53-UFR Pharmacie (Université de Reims
Champagne-Ardenne), pour son encadrement, sa disponibilité permanente, pour tout les moyens qu’il a mis
à ma disposition lors de la réalisation de ce travail de recherche, pour m’avoir guidé pendant tous mes
stages avec rigueur, ainsi que pour les efforts qu’il a consentis pour la correction des publications ainsi que
le manuscrit de thèse.
J’exprime toute ma gratitude au Pr. Abdelaziz BENJOUAD, pour m’avoir fait l’honneur de
présider le jury malgré tous ses engagements, ainsi que pour ses conseils et ses recommandations
constructives.
Je remercie vivement le Pr. Katim ALAOUI d’avoir aimablement accepté d’examiner mon travail
de thèse et aussi de faire partie du jury malgré tout ses engagements.
Je remercie également Pr. Youssef BAKRI de m’avoir fait l’honneur de lire mon manuscrit
et d’être rapporteur de ma thèse ainsi que pour ses conseils constructifs.
J’exprime tous mes remerciements au Pr. Mohammed EL HASSOUNI, pour avoir accepté d’être
rapporteur de cette thèse et aussi de se déplacer pour juger ce travail.
Mes remerciements vont aussi au Pr. Abdelkader IL IDRISSI, d’avoir bien voulu examiner mon
travail et de faire partie de ce jury ainsi que pour ses remarques constructives.
Mes plus vifs remerciements sont adressés à l’égard du Pr. Chantal TRENTESSAUX pour avoir
contribuée de près à la réalisation de cette étude, pour ses conseils avisés, sa gentillesse et son aide
précieuse.
J’adresse mes sincères remerciements au Pr Hassane EL BTAOURI pour l’intérêt qu’il a porté
lors de la réalisation de ce travail, pour ses conseils ainsi que pour sa précieuse contribution.
Qu’il me soit permis
d’adresser mes remerciements à toutes les personnes
ayant
manifestées de l’intérêt et contribuées de près à la réalisation de ces travaux de recherche, tout
particulièrement : Dr. Christine TERRYN, Dr. Richard LENAOUR, Dr. Bertrand BRASSARD
et Dr. Hassane Ait BENHASSOU.
J’exprime mes sincères remerciements à Dr. Saïd GAMOUH pour son aide précieuse apportée au
cours de ce travail et son importante contribution lors de la purification des principes actifs.
Mes remerciements vont également au Pr. Mohammed FANNANE pour ses conseils, ainsi que son
aide précieuse concernant la localisation et l’identification des plantes étudiées. Je remercie le Pr. Khalid
BOUGRIN pour son aide et ses précieux conseils.
Je remercie également les membres de l’UBRM/CNESTEN pour leurs soutiens, leurs gentillesses et
leurs amitiés, Mme Imane CHAOUI, M. Hassan JADDI, M. Mohammed ATTALEB, Melle Asmae EL
HAMDOUCHI, M. Rabii AMEZIANE, M. Aziz SMOUNI, Mme Naima SAIED, M. Lahssan MERZOUG
et M. Khalid El KARI.
Sans oublier de remercier également mes amies Mouna FAHR, Naima AZOUZI,
Naima ELTALHI, Noema BERRADA, Zineb QUMICHOU, Siham BENBETKA et Lamia AIT
SAID, pour leur soutien, leur gentillesse et leur sympathie en leur souhaitant bon courage et
bonne continuation.
Je tiens aussi à remercier vivement les membres de ma famille qui m’ont toujours
soutenue et encouragée et pour leurs aides précieuses durant toutes ces années.
Production scientifique
Ce projet de recherche a été soutenu par le “ Comité Mixte Inter-Universitaire FrancoMarocain” dans le cadre d’une action intégrée Volubilis (AI n° MA/07/178 - Egide n° 13466WE;
2007-2010). Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont fait l’objet des
publications et
communications orales et affichées présentées ci-dessous.
Publications:
Merghoub N., Benbacer L., El Btaouri H., Ait Benhassou H., Terryn C., Attaleb M., Madoulet C.,
Benjouad A., El Mzibri M., Morjani H.and Amzazi S. In vitro antiproliferative effect and
induction of apoptosis by Retama monosperma L. extract in human cervical cancer cells.
Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-grand), 2011; Suppl 57:1581-91, Oct 15.
Merghoub N., Benbacer L., Amzazi S., Morjani H. and El Mzibri M.. Cytotoxic effect of some
Moroccan medicinal plant extracts on human cervical cell lines. Journal of Medicinal Plants
Research, 2009; Vol. 3(12), pp. 1045-1050.
Merghoub N., Benbacer L., Attaleb M., Amzazi S., Benjouad A., Terryn C., EL Btaouri H.,
Morjani H. and EL Mzibri M. Recherche de molécules naturelles capables d’inhiber la
croissance et la télomèrase des cellules du cancer du col de l’utérus porteuses de HPV.
Proceeding of Third International SMBBM Congress of Biochemistry and Molecular Biology
– IUBMB Special Meeting of Plant Stresses. 6TH Congress of FASBM. Marrakech 20-25
April 2009.
Merghoub N., EL Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., Trentesaux C., Brassart B., Terryn C.,
Attaleb M., Benjouad A., Amzazi S., Morjani H. and EL Mzibri M.. Inula Viscosa L. extracts
inhibit telomerase activity and induce caspase-dependent apoptosis in cervical cancer cells.
Soumis au journal “ PLOSone”.
Communications orales et affichées:
Merghoub N., El Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., C. Trentesaux, Terryn C., El Mzibri M.,
Amzazi S. and Morjani H.; Tomentosin from Inula viscosa L. induces telomere shortering and
caspase-dependant apoptosis in cervical cancer cells. Communication orale - 5ème Forum du
Cancéropôle Grand Est, Strasbourg, France; 2-3 novembre 2011.
Merghoub N., El Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., Trentesaux C., Brassart B., Terryn C.,
Attaleb M., Benjouad A., Amzazi S., Morjani H. and El Mzibri M. Induction of telomere
shortening and caspase-dependent apoptosis in cervical cancer cell lines by tomentosin
isolated from Inula viscosa L. Communication orale, 4ème Symposium International sur les
plantes aromatiques et médicinales - De la plante à la pratique thérapeutique. SIPAM4 Mohammedia – Maroc. Mai 12-13, 2011.
Merghoub N., El Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., Trentesaux C., Brassart B., Terryn C.,
Attaleb M., Benjouad A., Amzazi S., Morjani H. and El Mzibri M. Inula Viscosa L. extracts
inhibit telomerase activity and induce caspase-dependent apoptosis in cervical cancer cells.
Communication affichée, 4ème Symposium International sur les plantes aromatiques et
médicinales - De la plante à la pratique thérapeutique. SIPAM4 - Mohammedia – Maroc. Mai
12-13, 2011.
Merghoub N., H. El Btaouri, L. Benbacer, Attaleb M., Benjouad A., Terryn C., Martiny L., El
Mzibri M., Amzazi S. and Morjani H. Induction of telomerase inhibition and caspasedependent apoptosis in cervical cancer Hela and Siha cell lines by the hexane extract and
dichloromethane fractions of Inula viscosa L. International Symposium of the Federative
Research Institute N° 53 (IFR53). Cell-Microenvironment Interactions; Reims, France, June
7th to 9th, 2010.
Merghoub N., Benbacer L., Attaleb M., Amzazi S., Benjouad A., Terryn C., EL-btaouri H.,
Morjani H. et EL Mzibri M.. Recherche de molécules naturelles capables d’inhiber la
croissance et la télomèrase des cellules du cancer du col de l’utérus porteuses de HPV.
Communication orale aux Troisièmes Congrès International de Biochimie. Marrakech 20-25
Avril 2009.
Merghoub N., Amzazi S., EL Mzibri M. et Benbacer L. Evaluation de l’activité cytotoxique de
plantes médicinales sur des lignées Cancéreuses du col de l’utérus. Communication affichée
au 3ème Symposium International sur les Plantes Aromatiques et Médicinales (SIPAM III) et
au 1 er Congrès International sur les Molécules Bioactives (CIMB1). Oujda; 29 -30 Mai 2008
- Maroc.
Prix:
Prix de la meilleure Communication orale aux Troisièmes Congrès International de
Biochimie. Marrakech 20-25 Avril 2009. 6ème édition du Concours National de l’Innovation :
Catégorie Jeunes chercheurs scientifiques.
Résumé
A travers le monde, la recherche de nouvelles molécules anticancéreuses demeure une des
principales préoccupations des chercheurs en oncologie. Aussi, les plantes ont été à l’origine de nombreuses
molécules actives ayant montré leur efficacité dans le traitement de différents cancers. Au Maroc, la
médecine traditionnelle, riche et diversifiée, constitue une source importante pour le criblage de nouvelles
molécules potentiellement bioactives à visée thérapeutique.
Dans ce cadre, et afin de valoriser les plantes médicinales Marocaines, l’objectif de cette étude est la
recherche de nouvelles substances naturelles issues de plantes utilisées en médecine traditionnelle Marocaine
capables d’inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du col de l’utérus.
Sept plantes médicinales ont été sélectionnées, sur la base d’une étude ethnobotanique et en fonction
de leurs utilisations en médecine traditionnelle, et évaluées pour leurs effets cytotoxiques vis-à-vis de deux
modèles cellulaires en culture SiHa et HeLa. Parmi ces plantes, Inula viscosa L. et Retama monosperma L.
se sont révélées particulièrement actives. L’extrait hexanique (IV-HE) et la fraction dichlorométhane (IVDF) issus d’Inula viscosa ainsi que la fraction dichlorométhane de Retama monosperma (Rm-DF) induisent
une activité cytotoxique significative vis-à-vis des deux lignées cellulaires après 72h de traitement, avec des
valeurs d’IC50 comprises entre 6 et 22µg/ml.
Par la suite, nous nous sommes intéressés à l’étude des mécanismes d’action de ces extraits. Les
extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF induisent une mort cellulaire par apoptose, mise en évidence par le clivage
de la procaspase-3, l’activité de la caspase-3 et le clivage de PARP. De plus, ces extraits induisent une chute
du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) et une production des espèces réactives de l’oxygène (ROS),
accompagnées d’une diminution de l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 suggérant que
l’apoptose induite par ces extraits, nécessite des événements mitochondriaux.
Aussi, nous avons montré, en utilisant le test TRAP, que les extraits IV-HE et IV-DF sont capables
d’inhiber significativement l’activité télomérase des cellules SiHa et HeLa après 48h de traitement. Ceci a
été confirmé par l’hybridation du simple brin télomérique (TTAGGG).
Par ailleurs, l’étude du statut MDR des extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF a été réalisée en utilisant
différentes lignées cellulaires exprimant les gènes MDR. Les indices de résistance des extraits IV-HE, IVDF et Rm-DF sont ˂ 2, suggérant que les molécules contenues dans ces extraits ne sont pas des substrats
MDR.
Le fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa (IV-HE), a permit la purification
d’un sesquiterpène lactone, la tomentosine. Cette molécule a montré un effet inhibiteur significatif de la
prolifération des cellules SiHa and HeLa d’une manière dose et temps-dépendants (IC50 de 7.10 ± 0.78 µM et
5.87 ± 0.36 µM, respectivement après 96h de traitement). L’analyse du simple brin télomérique (TTAGGG),
a permis de montrer que la tomentosine était capable d’induire un raccourcissement de celui-ci d’une
manière significative dans les cellules SiHa et HeLa. Cette étude met en évidence pour la première fois que
la tomentosine cible le télomère et induit une apoptose Caspases-dépendante dans les cellules cancéreuses du
col de l’utérus. La tomentosine induit également un arrêt du cycle cellulaire des cellules HeLa et SiHa en
phase G2/M. Toutes ces données suggèrent que Inula viscosa L. et Retama monosperma L. présentent un fort
potentiel pour le développement de nouveaux agents anticancéreux.
Mots clés : Plantes médicinales, Inula viscosa L., Retama monosperma L., tomentosine, cytotoxicité in
vitro, apoptose, télomères, télomérase, cancer du col utérin.
Abstract
Worldwide, the discovery of new anticancer drugs remains the main concerns in oncology.
Plants are an important source of active molecules having shown their efficacy in the treatment of
various cancers. In Morocco, traditional medicine, rich and diverse, constitutes an important source
for screening of new potentially bioactive molecules with therapeutic potential. In this context, and
in order to promote Moroccan medicinal plants, the aims of this study are the search for new natural
substances from plants used in traditional medicine, able to inhibit the proliferation of cervical
cancer cells.
Seven medicinal plants were selected, on the basis of an ethnobotanical study and according
to their use in traditional medicine, and evaluated for their cytotoxic effects against two cervical cell
lines HeLa and SiHa. Among these plants, Inula viscosa L. and Retama monosperma L. have
attracted our particular interest. The hexanic extract (IV-HE) and dichloromethane fraction (IV-DF)
from Inula viscosa L. and dichloromethane fraction from Retama monosperma L. (Rm-DF) were
able to induce a significant cytotoxic effects against the two cell lines after 72h treatment, with IC50
values ranging from 6 to 22 µg/ml.
Subsequently, we investigated the mechanisms of action of these extracts. IV-HE, IV-DF
and Rm-DF were able to induce cells apoptosis, as evidenced by pro-caspase 3 cleavage, caspase 3
activity and PARP cleavage. Moreover, these extracts induced a decrease in mitochondrial
membrane potential (ΔΨm) and increase of reactive oxygen species (ROS), accompanied by a
decrease in anti-apoptotic protein Bcl-2 expression, suggesting that apoptosis induced by these
extracts requires mitochondrial events.
We show also that IV-HE and IV-DF extracts were able to significantly inhibit telomerase
activity after 48 hours treatment, by using the Telomerase amplification protocol (TRAP) analysis.
These data were confirmed by TAGGG telomere length assay.
Moreover, the study of the multidrug-resistance (MDR) status of IV-HE, IV-DF and Rm-DF
extracts was performed using different cell lines expressing MDR genes. The resistance index of
IV-HE and IV-DF extracts was less than 2-fold, suggesting that the molecules contained in these
extracts are not MDR substrates.
The bio-guided fractionation of hexanic Inula viscosa extracts (IV-HE), has allowed the
purification of a sesquiterpene lactone, tomentosin. This molecule was found to inhibit significantly
the cell growth of SiHa and HeLa cervical cancer cells in dose and time-dependent manner
(IC50 values of 7.10 ± 0.78 µM and 5.87 ± 0.36 µM, respectively after 96h of treatment). TTAGGG
telomere length assay showed that tomentosin was able to induce a significant telomeric Goverhang shortening in SiHa and HeLa cells.
This study provides the first evidence that tomentosin targets telomere machinery and induces
apoptosis in cervical cancer cells. The molecular mechanism underlying tomentosin-induced apoptosis may
involve a mitochondria-mediated signaling pathway. Tomentosin induces also a cell cycle arrest of SiHa and
HeLa cells in G2/M phase. All these data suggest that Inula viscosa L. and Retama monosperma L. have a
high potential for the development of news anticancer agents.
Key Words : medicinals Plants, Inula viscosa L., Retama monosperma L., tomentosin, in vitro cytotoxicity,
apoptosis, telomeres, telomerase, cervical cancer .
Sommaire
LISTE DES FIGURES .................................................................................................................. 1
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................. 3
LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................................... 4
GLOSSAIRE.................................................................................................................................. 5
INTRODUCTION ......................................................................................................................... 6
DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 9
I.
RECHERCHE DE SUBSTANCES NATURELLES POUR LE TRAITEMENT DU CANCER ............... 9
1.
Importance thérapeutique des molécules d'origine naturelle .................................................... 9
2.
Progrès dans la recherche de nouvelles substances anticancéreuses : .................................... 10
3.
Place des plantes médicinales dans la médecine traditionnelle Marocaine ............................ 12
4.
Description et propriétés pharmacologiques des plantes sélectionnées ................................. 13
4.1.
Inula viscosa L. (Ait)...................................................................................................... 13
4.2.
Retama monosperma L. (Boiss.) .................................................................................... 14
4.3.
Berberis hispanica Boiss. ............................................................................................... 14
4.4.
Ormenis eriolepis Maire. ................................................................................................ 15
4.5.
Ormenis mixta L. ............................................................................................................ 15
4.6.
Rhamnus lycioides ssp. Oleoides .................................................................................... 15
4.7.
Urginea maritima L. Baker. ........................................................................................... 16
II. GENERALITES SUR LE CANCER DU COL DE L’UTERUS ....................................................... 16
1.
Epidémiologie du cancer du col de l’utérus ........................................................................... 16
2.
Histoire naturelle du cancer du col de l’utérus ....................................................................... 16
2.1.
L’infection à papillomavirus humain (HPV) .................................................................. 16
2.2.
Lésions histologiques cervicales .................................................................................... 18
3.
Le dépistage du cancer du col de l’utérus............................................................................... 19
4.
Prévention et vaccination ....................................................................................................... 20
5.
Les papillomavirus humains (HPV) et cancer ........................................................................ 21
6.
5.1.
Classification des Papillomavirus................................................................................... 21
5.2.
Structure et organisation génomique .............................................................................. 22
5.3.
Cycle viral ...................................................................................................................... 23
Implication des protéines E7 et E6 dans le processus tumoral : ............................................. 25
6.1.
Rôle de l’oncoprotéine E6 .............................................................................................. 26
6.2.
Rôle de l’oncoprotéines E7 : .......................................................................................... 28
III. TELOMERES ET TELOMERASE : NOUVELLES CIBLES POUR LA CHIMIOTHERAPIE
ANTICANCEREUSE...................................................................................................................... 29
1.
2.
3.
Les télomères .......................................................................................................................... 29
1.1.
Structure et description ................................................................................................... 29
1.2.
Les protéines associées aux télomères humains : complexe Shelterin ........................... 30
1.3.
Conformation tridimensionnelle des télomères .............................................................. 31
1.4.
Les télomères et l’horloge mitotique .............................................................................. 32
1.5.
Mécanismes permettent la réplication des télomères ..................................................... 33
1.6.
Techniques de mesure de la longueur des télomères ...................................................... 34
La télomérase. ........................................................................................................................ 35
2.1.
Structure de la télomérase .............................................................................................. 35
2.2.
Mécanisme de réplication des télomères par la télomérase ............................................ 37
2.3.
Mécanisme de régulation de la télomérase ..................................................................... 38
2.4.
Rôle des protéines E6 et E7 dans la régulation de l’activité télomérase ........................ 41
2.5.
Techniques de mesure de l’activité télomérase : ............................................................ 41
Stratégies thérapeutiques ciblant les télomères et la télomérase ............................................ 42
3.1.
Stratégies ciblant la télomérase ...................................................................................... 43
3.2.
Stratégies ciblant le télomère.......................................................................................... 45
IV. INDUCTION DE L’APOPTOSE A VISEE THERAPEUTIQUE ..................................................... 47
1.
2.
Concept de l’apoptose ............................................................................................................ 48
1.1.
Caractéristiques morphologiques de l’apoptose ............................................................. 49
1.2.
Caractéristiques biochimiques de l’apoptose ................................................................. 50
Les principaux effecteurs de l’apoptose ................................................................................. 51
2.1.
Les Caspases................................................................................................................... 51
2.2.
Protéines de la famille Bcl2 ............................................................................................ 52
2.3.
Les récepteurs membranaires de la famille du TNF-α ................................................... 53
2.4.
Les céramides ................................................................................................................. 54
3.
Rôle de la mitochondrie dans le processus apoptotique ......................................................... 54
4.
Les principales voies de signalisation de l’apoptose .............................................................. 55
4.1.
Voie intrinsèque : ........................................................................................................... 55
4.2.
Voie extrinsèque: ............................................................................................................ 56
V. MECANISMES DE RESISTANCE AUX MEDICAMENTS ANTICANCEREUX ............................. 58
1.
Résistance MDR ou MultiDrug Resistance :.......................................................................... 58
2.
Transporteurs ABC humains impliqués dans le Phénotype MDR ......................................... 59
2.1.
La glycoprotéine P (P-gp) .............................................................................................. 60
2.2.
MRP (Multidrug resistance associated protein) ou ABCC : .......................................... 61
VI. OBJECTIFS DE LA THESE .................................................................................................... 63
MATERIEL ET METHODES ................................................................................................... 64
1.
Préparation des extraits de plantes : ....................................................................................... 64
1.1.
Extraction par macération : ............................................................................................ 64
1.2.
Extraction par soxhlet :................................................................................................... 64
2.
Effecteurs pharmacologiques : ............................................................................................... 67
3.
Culture cellulaire : .................................................................................................................. 68
3.1.
Lignées cellulaires et conditions de culture:................................................................... 68
3.2.
Entretien des cellules et conditions de culture................................................................ 69
3.3.
Viabilité cellulaire : ........................................................................................................ 70
3.4.
Conservation des cellules : ............................................................................................. 70
4.
Evaluation de la cytotoxicité in vitro des extraits : .............................................................. 70
5.
Statut Multidrug-Resistance : ................................................................................................. 72
6.
Etude du mécanisme d’action des extraits et des molécules purifiées ................................... 73
7.
6.1.
Détermination de l’activité télomérase par test TRAP: .................................................. 73
6.2.
Expérience d’hybridation du simple brin télomérique ................................................... 75
Etude de l’apoptose : .............................................................................................................. 76
7.1.
Mise en évidence de l’apoptose par coloration au Hoechst. ........................................... 77
7.2.
Double marquage à l’Annexine V/Iodure de Propidium: ............................................... 78
7.3.
Production d’espèces actives de l’oxygène (ROS) par spectrofluorométrie. ................. 78
7.4.
Etude du potentiel membranaire mitochondrial par spectrofluorométrie. ...................... 79
7.5.
Analyse de l’expression des proteines par western blot ................................................. 80
7.6.
Mesure de l’activité Caspase-3 ....................................................................................... 82
7.7.
Etude du cycle Cellulaire : ............................................................................................. 83
8. Fractionnement et isolement des composés contenus dans l’extrait hexanique d’Inula
viscosa : .......................................................................................................................................... 84
8.1.
Fractionnement de l’extrait hexanique: .......................................................................... 84
8.2.
Fractionnement de la fraction F3 .................................................................................... 84
8.3.
Fractionnement de la fraction F6 .................................................................................... 84
8.4.
Méthodes d’analyse ........................................................................................................ 84
RESULTATS ............................................................................................................................... 86
PARTIE 1 : ................................................................................................................................... 86
RECHERCHE ET IDENTIFICATION PLANTES UTILISEES EN MEDECINE
TRADITIONNELLE MAROCAINE, CAPABLE D’INHIBER LA CROISSANCE DES
CELLULES DU CANCER DU COL DE L’UTERUS................................................................ 86
I.
EVALUATION DE LA CYTOTOXICITE DES EXTRAITS METHANOLIQUES DE PLANTES
SELECTIONNEES ........................................................................................................................ 88
PARTIE 2: .................................................................................................................................... 91
RECHERCHE DE SUBSTANCES NATURELLES CAPABLES D’INHIBER LA
PROLIFERATION ET L’ACTIVITE TELOMERASE ET D’INDUIRE L’APOPTOSE DES
CELLULES CANCEREUSES DU COL DE L’UTERUS .......................................................... 91
A. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et induction de l’apoptose par
les extraits d’ Inula viscosa L. ............................................................................................... 93
1.
Evaluation de l’activité cytotoxique: ...................................................................................... 93
2.
Mesure de l’activité télomérase : ............................................................................................ 94
3.
Effet des extraits sur le télomère simple brin ......................................................................... 95
4.
Effet des extraits d’Inula viscosa sur les cellules de phénotype ALT .................................... 97
5.
Etude de l’apoptose : .............................................................................................................. 97
5.1.
Altérations morphologiques liées de l’apoptose:........................................................... 97
5.2.
Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux : ......................................... 98
5.3.
Expression des protéines Pro-Caspase3, Bcl2 et clivage de PARP : ............................ 101
5.4.
Activation de la Caspase 3 : ......................................................................................... 102
5.5.
Production de ROS induite par les extraits d’Inula viscosa L. ..................................... 103
5.6.
Chute du potentiel membranaire mitochondrial induite par les extraits d’Inula viscosa L.
104
5.7.
Identification de la composition des extraits d’Inula viscosa L. .................................. 105
B. Activité antiproliférative et induction de l’apoptose par les extraits de Retama
monosperma L. ..................................................................................................................... 107
1.
Evaluation de l’activité cytotoxique: .................................................................................... 107
2.
Etude de l’apoptose : ............................................................................................................ 108
2.1.
Altérations morphologiques liées de l’apoptose induite par Rm-DF: ......................... 108
2.2.
Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux : ....................................... 109
2.3.
Production de ROS induite par l’extrait de Retama monosperma L. ........................... 109
2.4.
Effet de Rm-DF sur le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) :........................ 112
2.5.
Expression des protéines Pro-Caspase3, Bcl2 et clivage de PARP : ............................ 112
2.6.
L.
Identification de la composition de la fraction dichlorométhane de Retama monosperma
...................................................................................................................................... 113
C. Statut MDR des extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF: ...................................................... 115
PARTIE 3 : ................................................................................................................................. 117
PURIFICATION DE LA TOMENTOSINE ET MISE EN EVIDENCE DE SON
MECANISME D’ACTION ........................................................................................................ 117
A. Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L. : isolement des
composés majoritaires ......................................................................................................... 119
1.
Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa : ..................................... 119
2.
Analyse structurale des composés isolés .............................................................................. 122
2.1.
Détermination de la structure chimique du composé F3-1 ........................................... 122
2.2.
Détermination de la structure chimique du composé F6-3 ........................................... 124
2.3. Evaluation de l’activité cytotoxique des fractions obtenues à partir de l’extrait hexanique
d’Inula viscosa L. ..................................................................................................................... 125
B. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et induction de l’apoptose par
la tomentosine. ..................................................................................................................... 126
1.
Evaluation de l’activité cytotoxique des produits purifiés ................................................... 126
2.
Activité antiproliférative de la tomentosine en fonction du temps ....................................... 126
3.
Effet de la tomentosine sur le télomère simple brin ............................................................. 128
4.
Effet de la tomentosine sur des cellules cancéreuses de phénotype ALT ............................ 130
5.
Etude de l’apoptose induite par la tomentosine .................................................................... 130
5.1.
Mise en évidence des altérations morphologiques liées à l’apoptose ........................... 131
5.2.
Production d’espèces actives de l’oxygène (ROS) : ..................................................... 134
5.3.
Effet de tomentosine sur le potentiel membranaire mitochondrial .............................. 135
5.4.
Mise en évidence de l’expression de protéines impliquées dans l’apoptose ................ 135
5.5.
Mesure de l’activité Caspase 3 ..................................................................................... 137
5.6.
Analyse du cycle cellulaire :......................................................................................... 138
C. Statut MDR de tomentosine: ........................................................................................ 142
DISCUSSION ............................................................................................................................ 143
A. Recherche de substances naturelles capable d’inhiber la prolifération et l’activité
télomérase et d’induire l’apoptose des cellules cancéreuses du col de l’utérus ................. 146
B. Purification de la tomentosine et mise en évidence de son mécanisme d’action ......... 149
CONCLUSION GENERALE & PERSPECTIVES ............................................................... 153
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................ 155
ANNEXES ...................................................................................................................................... I
LISTE DES FIGURES
Figure 1:Nouveaux médicaments anticancéreux mis sur le marché durant la période 1981-2006. .......... 10
Figure 2: Développement des cancers du col utérin liés une infection par un HPV à haut risque ............ 19
Figure 3: Représentation schématique de la structure de l’HPV ............................................................... 22
Figure 4: Organisation du génome d’HPV (génotype 16)......................................................................... 23
Figure 5: Cycle viral de l’HPV.................................................................................................................. 24
Figure 6: E6 cible la dégradation de p53 via la voie ubiquitine/proteasome. .......................................... 26
Figure 7: Les voies d’apoptose intrinsèque et extrinsèque. ....................................................................... 27
Figure 8: L’oncoprotéine E7 et cycle cellulaire. ....................................................................................... 29
Figure 9: Représentation schématique de la séquence d’ADN télomèrique humaine. .............................. 30
Figure 10: Représentation schématique de la T-loop en présence des protéines télomériques. ................ 32
Figure 11: Représentation schématique de l’horloge mitotique des télomères. ........................................ 33
Figure 12: Représentation schématique de la télomérase humaine. .......................................................... 36
Figure 13: Représentation schématique du mécanisme de l’élongation du télomère par la télomèrase. .. 37
Figure 14: Mécanisme de régulation de la télomérase. ............................................................................. 40
Figure 15: Représentation schématique des stratégies d’inhibition de la télomérase. .............................. 42
Figure 16: Mécanisme de l’inhibition de la télomérase par stabilisation de Gquadruplexe par des ligands
spécifiques .................................................................................................................................................. 46
Figure 17: Principales étapes d’altérations morphologiques de l’apoptose. ............................................. 49
Figure 18: Les protéines de la famille Bcl-2. ............................................................................................ 53
Figure 19: Voie intrinsèque de l’apoptose.. .............................................................................................. 56
Figure 20: Voie extrinsèque de l’apoptose (voie des récepteurs de mort). ............................................... 57
Figure 21: Structure des protéines ABC.................................................................................................... 60
Figure 22: Protocole d’extraction par soxhlet des plantes......................................................................... 65
Figure 23 : Schéma des produits de PCR issus d’une analyse TRAP. ...................................................... 73
Figure 24: Effet cytotoxique des extraits de plantes vis-à-vis des cellules SiHa et HeLa......................... 89
Figure 25: Altération morphologiques des cellules SiHa, induites par l’extrait méthanoliques d’Inula
viscosa L ..................................................................................................................................................... 90
Figure 26: Effet des extraits d’Inula viscosa sur la prolifération des cellules SiHa et HeLa. ................... 94
Figure 27: Activité télomérase dans les cellules SiHa et HeLa................................................................. 95
Figure 28: Effet des extraits d’Inula viscosa sur le simple brin télomérique. .......................................... 96
Figure 29: Histogrammes représentant la quantification du signal du simple brin télomérique, des lignées
cellulaires SiHa et HeLa après traitement. ................................................................................................. 96
Figure 30: Effet des extraits IV-HE et IV-DF sur la croissance des lignées cellulaires MRC5 et
MRC5/V1. .................................................................................................................................................. 97
Figure 31: Modifications morphologiques caractéristiques de l’apoptose induite par les extraits d’Inula
viscosa L. .................................................................................................................................................... 99
Figure 32: Modifications morphologiques caractéristiques de l’apoptose induite par les extraits d’Inula
viscosa L. .................................................................................................................................................. 100
Figure 33 : Détection des cellules apotoptiques par cytomètrie de flux.................................................. 101
Figure 34: Effet des extraits d’Inula viscosa sur l’expression de la pro-Caspase 3, de Bcl2 et le clivage de
PARP. ....................................................................................................................................................... 102
Figure 35: Activation de la Caspase 3 induite par les extraits d’Inula viscosa. ...................................... 103
Figure 36: Production de ROS dans les cellules traitées par les extraits d’Inula viscosa L. .................. 104
Figure 37: Effet des extraits d’Inula viscosa L. sur le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm). ... 105
1
Figure 38: Effet des extraits de Retama monosperma sur la croissance des cellules SiHa et HeLa. ...... 108
Figure 39: Modifications morphologiques liées à l’apoptose induite par Rm-DF. ................................. 110
Figure 40: Détection des cellules apototiques par cytomètrie de flux..................................................... 111
Figure 41: Effet de l’extrait Rm-DF sur la production des ROS. ............................................................ 111
Figure 42: Effet de l’extrait Rm-DF sur le potentiel membranaire mitochondrial. ................................. 112
Figure 43: Effet des extraits de Retama monosperma sur l’expression de la pro-Caspase 3, le clivage de
PARP et Bcl2............................................................................................................................................ 113
Figure 44: Fractionnement de l’extrait hexanique................................................................................... 119
Figure 45: Chromatogramme d’analyse de la fraction F3 par CPG ........................................................ 120
Figure 46: Chromatogramme d’analyse du composé majoritaire contenu dans la fraction F3 par SM .. 120
Figure 47: Chromatogramme d’analyse de la fraction F6 par CPG ........................................................ 121
Figure 48: Chromatogramme d’analyse du composé majoritaire contenu dans la fraction F6 par SM. . 121
Figure 49: Purification de la fraction F3. ............................................................................................... 122
Figure 50: Fractionnement de la fraction F6. .......................................................................................... 122
Figure 51: Structure chimique de l’acide isocostique. ............................................................................ 123
Figure 52: Structure chimique de la tomentosine. ................................................................................... 124
Figure 53: Effet de tomentosine et l’acide isocostique sur la prolifération des cellules SiHa et HeLa. .. 127
Figure 54: Activité antiproliférative de tomentosine en fonction du temps. ........................................... 128
Figure 55: Effet de la tomentosine sur le simple brin télomérique. ........................................................ 129
Figure 56: Effet de la tomentosine sur la croissance des lignées cellulaires MRC5 et MRC5/V1. ........ 130
Figure 57: Altérations morphologiques induites par tomentosine. ......................................................... 132
Figure 58: Altérations morphologiques induites par tomentosine. ......................................................... 133
Figure 59: Effet de tomentosine sur la production des ROS dans les cellules SiHa et HeLa. ................ 134
Figure 60: Effet de tomentosine sur les variations du potentiel membranaire mitochondrial des cellules
SiHa et HeLa. ........................................................................................................................................... 135
Figure 61: Effet de la tomentosine sur l’expression de la pro-Caspase 3, Bcl2et le clivage de PARP ,
analysé par western blot. .......................................................................................................................... 137
Figure 62: Activation de la Caspase 3 en fonction du temps après traitement des cellules par la
tomentosine. ............................................................................................................................................. 139
Figure 63: Effet de la tomentosine sur le cycle cellulaire des cellules HeLa. ......................................... 140
Figure 64: Effet de la tomentosine sur le cycle cellulaire des cellules SiHa. .......................................... 141
Figure 65: Mécanismes d’action proposé de la tomentosine: ................................................................. 152
2
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Classification des HPVs cervicaux en fonction de leur oncogénicité. .................................... 18
Tableau 2: Données ethnobotaniques et pharmacologiques des plantes récoltées. ................................... 66
Tableau 3: Liste et caractéristiques des anticorps primaires et secondaires employés. ............................ 82
Tableau 4: Valeurs des IC50 (µg/ml) des différents extraits de plantes vis-à-vis des lignées SiHa et HeLa,
après 48h d’exposition................................................................................................................................ 90
Tableau 5: Valeurs des IC50 (µg/ml) des extraits d’Inula viscosa L. ........................................................ 93
Tableau 6: Composés présent dans les extraits d’Inula viscosa L. identifiés by CG/MS. ..................... 106
Tableau 7: Valeurs des IC50 des extraits et des fractions de Retama monosperma L. ............................ 107
Tableau 8: Composés contenus dans la fraction dichlorométhane de Retama monosperma, identifiés par
CG/MS. .................................................................................................................................................... 114
Tableau 9: Statut MDR des extraits IV-HE et IV-DF vis-à-vis de lignée cellulaire du carcinome
mammaire (MCF7) sélectionnées en présence de doxorubicine (MCF7/DOX) et l’étoposide (MCF7/VP).
.................................................................................................................................................................. 116
Tableau 10: Statut MDR des extraits IV-HE et IV-DF vis-à-vis des lignées cellulaires résistantes à la
chimiotérapie, transfectées par un des gènes de résistance (ABCB1/Pgp, ABCC1/MRP1, ABCC3/MRP3
et ABCG2/BCRP). .................................................................................................................................. 116
Tableau 11: Donnés spectrales RMN 13C de l’acide isocostique (fraction F3-a).................................... 123
Tableau 12: Donnés spectrales RMN 13C de la tomentosine (fraction F6-3). ......................................... 125
Tableau 13: Evaluation de la cytotoxicité des fractions et sous-fractions issues de l’extrait hexanique d’
Inula viscosa vis-à-vis des lignées SiHa et HeLa. ................................................................................... 126
Tableau 14: Valeurs des IC50 (µg/ml) de la tomentosine vis-à-vis de cellules SiHa et HeLa. ................ 128
Tableau 15: Statut MDR de la tomentosine ........................................................................................... 142
3
LISTE DES ABREVIATIONS
ALT : Alternative Lengthening of Telomeres
Bcl-2 : B-cell lymphoma 2
Caspase : Cystéinyl ASPartic acid-ProteASE
CG/MS : chromatographie phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse
CHAPS : 3-[3-(Cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate
CI50 : Concentration Inhibitrice de 50% de l'activité
D-loop : Displacement loop
DMSO : DiMéthylSulfOxyde
FACS : Fluorescence Activated Cell Sorter
IV-HE: Inula viscosa Hexanic extract
IV-DF: Inula viscosa Dichloromethane Fraction
IV-ME: Inula viscosa Methanolic Extract
IV-AF: Inula viscosa Ethyl acetate Fraction
NF-κB : Nuclear Factor κB NF-Y : Facteur Nucléaire Y
PARP : Poly (ADP-Ribose) Polymérase
PBS : Phosphate Buffered Saline
PS : PhosphatidylSérine
Rb : Protéine du Rétinoblastome
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
Rm-HE: Retama monosperma Hexanic Extract
Rm-ME: Retama monosperma Methanolic Extract
Rm-DF: Retama monosperma Dichloromethane Fraction
Rm-AF: Retama monosperma Ethyl Acetate Fraction
ROS: Reactive Oxygen Species
SV40 : Simian Virus 40
t-loop : Telomeric loop
TRAP : Telomeric Repeat Amplification Protocol
hTERT : Human Telomerase Reverse Transcriptase
hTR : Human Telomerase RNA
4
GLOSSAIRE
Alcaloïdes : composés azotés basiques, représentent un groupe très vaste de métabolites
secondaires avec structure, distribution et activités biologiques diverses. Les plus importants
sont : les isoquinoléiques, les quinoléiques, les péridiques, les pipéridiques et les stéroïdes.
Flavonoïdes : composés dont la structure chimique est basée principalement sur un squelette de
15 carbones, constitué de deux unités aromatiques, deux cycles en C6 reliés par une chaine en
C3. Il y a six classes de flavonoïdes qui différent par leur structure chimique: flavones, flavanols,
flavonols, flavanones, isoflavones, flavanones et anthocyanidines.
Terpènes : sont des molécules à nombre de carbones multiple de 5, avec une formule de base
(C5H8)n et dont le précurseur est l’isopentényl diphosphate. En fonction du nombre n d’unités, il
existe différents composés : les pentacarbonés (C5) ramifiées, les monoterpènes (C10), les
sesquiterpènes (C15), les diterpènes (C20) …
Sesquiterpènes lactones : ont comme base un squelette de 15 atomes de carbone qui contient
généralement au moins le groupe γ-lactonique, sa formation vient de trois unités isopronèques
qui sont liées ensemble sous forme" tête-queue" en formant le composé 2,6,10triméthyldodécane. Les sesquiterpènes lactones constituent un grand et divers groupe de
métabolites secondaires, qui se distinguent dans leurs propriétés et leurs structures : les
germacranolides, les élémanolides, les eudesmanolides, les guaianolides et les héliangolides.
5
Introduction
Introduction
A travers le monde, le cancer du col utérin représente un problème majeur de santé
publique. C’est le deuxième cancer féminin dans le monde avec environ 200 000 décès annuel et
500 000 nouveaux cas chaque année, avec 85% de survenue chez les femmes des pays en voie de
développement (Pointreau Y. et al., 2010). Au Maroc, et en l'absence d'un registre national de
cancer, les données sont limitées aux cas enregistrés dans certains établissements de santé, et qui
concordent pour qualifier le cancer du col en tant que problème majeur de santé publique.
Le cancer du col, considéré comme maladie sexuellement transmissible, est étroitement lié
à l’infection par certains virus appelés papillomavirus humains (HPV). Ces virus oncogènes
contribuent à l’immortalisation des cellules infectées. Le pouvoir transformant de ces HPV a été
attribué aux protéines virales E6 et E7 (Munger K. et al., 2004). Ces protéines interfèrent avec de
nombreuses protéines cellulaires impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, le contrôle de
l’apoptose, la réparation de l’ADN, la formation du fuseau mitotique, l’adhérence intercellulaire
et à la matrice extracellulaire, la motilité cellulaire et les voies de transduction des signaux
mitogènes (Mougin C. et al., 2008). Par ailleurs, l’oncoprotéine E6 est capable d’activer la sousunité catalytique de la télomérase (hTERT) (Klingelhutz A.J. et al., 1996). Le maintien de la
longueur des télomères est réalisé en coopération avec E7 qui participe elle aussi à la prévention
de leur érosion (Liu X. et al., 2008).
La prise en charge du cancer du col repose sur un trépied fondamental composé d’une
prévention contre les infections à HPV, rendue possible grâce à la mise en place de deux vaccins
contre les types oncogènes, le diagnostic précoce basé principalement sur les technique cytohistologiques mais qui peut également faire appel aux techniques moléculaires, et la thérapie
basée sur des traitements physiques destructeurs, tel le traitement au laser ou l’exérèse, et
radiologiques. Les traitements chimiothérapeutiques sont très limités et sont confrontées souvent
au problème de chimiorésistance. De ce fait, la recherche de nouvelles molécules cytotoxique
reste une des principales préoccupations des chercheurs en oncologie.
Durant les dernières décennies, nous avons assisté à une croissance considérable dans le
développement de nouvelles thérapies antivirales avec la découverte d'agents ayant des activités
contre des virus tels que, le virus de l’immunodéficience humaine (HIV), le cytomégalovirus
influenza humaine (HCMV) et le virus de l’hépatite B (HBV). Cependant, peu de composés
avaient une activité contre les HPV.
6
Introduction
Par ailleurs, de nombreux médicaments doivent leur existence à la biodiversité du milieu
naturel, les plantes, les organismes marins et les micro-organismes qui constituent une source
importante de substances actives ayant un rôle essentiel en médecine. De nombreux
médicaments anticancéreux d’origine naturelle ou dérivés de composés naturels, sont
actuellement utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. L’exploitation des pharmacopées
traditionnelles, notamment l’utilisation des plantes connues souvent depuis des siècles pour leur
valeur médicinale ; a permis la mise en place d'un très grand nombre de médicaments
anticancéreux d'une très grande efficacité.
La médecine traditionnelle Marocaine se révèle donc riche et diversifiée, ce qui constitue
un important atout et une source inépuisable dans le criblage de nouvelles molécules à visée
thérapeutique. Le Maroc constitue une unité géographique dont les caractéristiques offre une
gamme variée de bioclimats permettant l’installation d’une flore riche à endémisme marqué. A
côté de ce contexte naturel particulièrement favorable et prometteur, ce pays dispose d’un savoir
faire ancestral, qui a été préservé au cours des siècles : la médication par les plantes, leur
utilisation pour l’aromatisation et la conservation des aliments, ainsi que pour l’extraction des
principes aromatiques destinés à l’usage familial ou commercial.
Le travail présenté dans cette thèse s’inscrit dans le cadre de la stratégie nationale visant à
valoriser les plantes médicinales marocaines. Aussi, notre étude a porté sur l’évaluation de
l’activité antiproliférative, voir anticancéreuse, d’extraits provenant de plantes médicinales
marocaines sur des lignées cancéreuses du col de l’utérus.
Aussi, et après une étude bibliographique qui fait état des dernières connaissances sur les
plantes médicinales, leur utilisation comme source d’agents anticancéreux, nous avons introduit
le cancer du col de l’utérus comme modèle cancéreux pour l’évaluation de l’activité des plantes
médicinales sélectionnées. Par ailleurs, l’accent a été mis sur les stratégies anticancéreuses
ciblant les télomères et la télomérase, ainsi que le mécanisme d’induction de l’apoptose à visée
thérapeutique.
Notre approche expérimentale a été axée dans un premier temps sur l’étude la cytotoxicité,
in vitro, des extraits méthanoliques de sept plantes médicinales, connues pour leur utilisation en
médecine traditionnelle marocaine à savoir : Inula viscosa L. ; Retama monosperma, Ormenis
mixta L., Ormenis eriolepis Coss., Rhamnus lycioides L., Berberis hispanica Boiss. et Urginea
7
Introduction
maritima L. L‘effet cytotoxique est étudié sur des lignées cellulaires provenant d’un cancer du
col de l’utérus (SiHa et HeLa).
La deuxième partie de ce travail concerne l’étude du mécanisme d’action des extraits des
deux plantes (Retama monosperma L. Boiss. et Inula viscosa L. Ait.), ayant montré des activités
cytotoxiques importantes. Ainsi, nous avons étudié leurs effets sur l’activité télomèrase grâce au
test TRAP (Telomere Repeat Amplification Protocol). Nous avons également étudié l’induction
de l’apoptose par ces extraits grâce au marquage avec le Hoechst 33342 et la microscopie de
fluorescence ; au suivi d’événements mitochondriaux tels que la modification du potentiel
membranaire mitochondrial (ΔΨ) et la production d’espèces actives de l’oxygène (ROS).
La dernière partie de cette thèse à été consacrée au fractionnement bio-guidé de l’extrait
héxanique d’Inula viscosa, à l’évaluation de l’effet cytotoxique des différentes fractions, suivie
de l’étude du mécanisme d’action du produit purifié le plus actif.
8
Données
bibliographiques
Données bibliographiques
I.
Recherche de substances naturelles pour le traitement du cancer
1. Importance thérapeutique des molécules d'origine naturelle
Les médicaments à base de produits naturels, éléments essentiels des soins de santé partout
dans le monde, sont encore largement utilisés et ont une importance considérable. Selon
l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 80% de la population du globe a recours aux
médecines traditionnelles pour satisfaire des besoins en soins de santé primaires. La majeure
partie du traitement traditionnel consiste à utiliser des extraits de plantes ou leurs constituants
actifs. Toutefois, les 20% de la population restante incorpore des produits naturels dans leurs
traitements médicaux, notamment dans les pays développés (OMS, 2002).
La nature reste l’une des sources principales d’obtention de nouveaux agents
thérapeutiques, qui peut encore être exploitée efficacement pour combattre les maladies. Les
produits naturels s’avèrent d’une très grande richesse sur le plan de leurs diversités et bioactivités. Le criblage à haut débit de nouveaux principes actifs d’origine naturelle, la maîtrise des
tests biochimiques appropriés et le développement de méthodes de synthèse efficaces, ont permet
le développement de substances d'intérêt médical dans de nombreux domaines thérapeutiques :
traitements des cancers et des pathologies cardiovasculaires, anti-inflammatoires...
Depuis plus de 40 ans, de nombreux médicaments provenant de milieu naturel sont
actuellement utilisés en chimiothérapie anticancéreuse (Kinghorn A.D. et al., 2009). Une récente
étude, a montré que parmi les produits pharmaceutiques mis sur le marché durant la période
1981-2006, 52% des médicaments actuels sont constitués ou dérivés de produits naturels et
seulement 30% des médicaments sont totalement synthétiques (Newman D.J. and Cragg G.M.,
2007). Les différentes catégories d’origine naturelle peuvent être soit ; des produits directement
isolés de sources naturelles, mais aussi des analogues de produits naturels obtenus par
hémisynthèse ou par modification chimique de ces derniers, des produits synthétiques dont la
structure a été copiée sur un modèle naturel (inspirés d’un pharmacophore naturel). Dans le
domaine des anticancéreux, parmi les médicaments chimiothérapeutiques mis sur le marché de
1940 à 2006 uniquement 28% des médicaments sont purement synthétiques et
64% sont
d'origine naturelle (Figure 1).
9
Figure 1:Nouveaux médicaments anticancéreux mis sur le marché durant la période 1981-2006 (N
=175).S: médicaments totalement synthétiques; S*: médicaments synthétiques inspirés d'un
pharmacophore naturel; V: vaccins; B: médicaments d'origine biologique (peptides, protéines); N:
produits d'origine naturelle; ND: dérivés de produits naturels (hémi-synthétiques); NM: produits naturels
mimés. D’après (Newman D.J. and Cragg G.M., 2007).
2. Progrès dans la
anticancéreuses :
recherche
de
nouvelles
substances
De nombreux médicaments anticancéreux, provenant du milieu naturel, ont montré leur
efficacité dans le traitement de différents types de cancers. L’utilisation des substances naturelles
en tant qu'agents anticancéreux a commencé par l'isolement de la podophyllotoxine à partir d'une
plante de la famille des Berbéridées (Podophyllum peltatum). La podophyllotoxine étant trop
toxique, a fait l’objet de modifications structurales pour donner naissance à deux composés
antitumoraux (le teniposide et l'étoposide) inhibiteurs de la topo-isomérase II. Pour revue voir
(Lv M. and Xu H., 2011). Parmi les médicaments anticancéreux provenant des vegétaux, il
existe également les vinca-alcaloïdes telsque la vinblastine et la vincristine, inhibiteurs de
l'assemblage de la tubuline, isolées de la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus et ses
analogues
hémisynthétiques,
vinorelbine
et
vindésine.
Les
taxoïdes,
inhibiteurs
du
désassemblage des microtubules, telque le paclitaxel isolé de l'if du pacifique Taxus brevifolia et
le docetaxel, préparé par hémisynthèse à partir d'un diterpène isolé de l'if européen Taxus
baccata. Les dérivés de la camptothécine comme le topotecan et l’irinotecan, inhibiteurs de la
topo-isomérase I et provenant de l'étude chimique d'un arbre ornemental chinois Camptotheca
acuminat.
10
Certains produits naturels isolés de plantes, qui ont montré un effet anticancéreux
intéressant in vivo, sont actuellement en phase clinique I et II, parmi lesquels :
Homoharringtonine, alcaloïdes isolé à partir d’un arbre chinois Cephalotaxus harringtonia (Zhou
D.C. et al., 1995) ; β-lapachone, une quinoneisolée à partir de Tabebuia avellanedae ;
Combretastatin A4, isolée à partir de Combretum caffreum ; ce qui permettra l’enrichissement
de l'arsenal thérapeutique existant. D’autres substances naturelles, possédant des propriétés
antimitotique potentiels in vitro, mais qui n’ont pas encore fait l’objet d’étude clinique, parmi
lesquelles: Helanalin, Resveratrol, Curcumin, Genistein et Epigallocatechin-3-gallate (Li Y. et
al., 2011; Nobili S. et al., 2009).
Les végétaux ont été et sont encore largement exploités, mais il existe d'autres
sources biologiques fournissant des principes actifs originaux et qui sont les micro-organismes
et le milieu marin. Les micro-organismes ont à leurs tours conduits à de nombreux produits
antitumoraux. Plusieurs antibiotiques produits par différentes souches de streptomyces et trop
toxiques pour être utilisés comme antibactériens, sont doués de propriétés anti-tumorales. Les
plus importants appartiennent au groupe des anthracyclines (doxorubicine, daunomycin, etc.).
ces derniers s'intercalent entre deux paires de bases azotées de l'adn, empêchant sa réplication et
sa transcription , de plus ils inhibent une enzyme qui contrôle la structure dans l'espace de l'adn,
la topo-isomérase ii (Binaschi M. et al., 2001; Hortobagyi G.N. and 1997). les bléomycines,
comportant 13 peptides différents extraits de streptomyces verticillus, s'intercalent dans l'adn,
puis entraînent des cassures de l'adn après liaison avec un ion métallique et production de
radicaux libres oxygénés (Colombo P. et al., 2001). la mitomycine c se lie étroitement à certaines
bases de l'adn et se comporte comme un agent alkylant après avoir subi une modification dans la
cellule (Tomasz M. et al., 1987). Pour revue voir (Kinghorn A.D. et al., 2009; Nobili S. et al.,
2009).
Le milieu marin offre également de nombreuses substances antitumorales aux structures
d'une diversité variée et qui sont employées avec succès pour le traitement de certaines formes.
Plusieurs composés antitumoraux d'origine marine ont été répertoriés parmi lesquelles, la
cytarabine (Aracytine, Cytarbel ou Ara-C), substance anticancéreuse extraite d'une éponge des
Caraïbes, est considéré comme un antimétabolite spécifique de la phase S du cycle cellulaire et
utilisé pour le traitement de certaines formes de leucémies. Il existe également les dolastatines,
groupe d'oligopeptides initialement isolés d'un mollusque marin de l'océan Indien, Dolabella
auricularia, sont des poisons du fuseau mitotique. L'ecteinascidine 743 (ET743) isolé d'un
11
Tunicier, Ecteinascidia turbinata, est un agent alkylant sélectif des résidus guanine de l'ADN du
petit sillon, utilisé pour le traitement des sarcomes mous. La bryostatine, l'aplidine sont d'autres
exemples de substances provenant également de sources marines sont actuellement en essais
cliniques. Pour revue voir (von Schwarzenberg K. and Vollmar A.M., 2010).
Par ailleurs, à côté des anticancéreux d’origine naturelle comme le taxol ou la
daunorubicine (première génération) et de ceux dérivés de produits naturels, dits de deuxième
génération (taxotère et navelbine), une troisième génération de produits naturels est en
émergence. Elle repose sur l’utilisation de microorganismes génétiquement modifiés pour
produire des collections d’analogues, difficile à préparer par la chimie organique classique
(Monneret C., 2010).
3. Place des plantes médicinales dans la médecine traditionnelle
Marocaine
Au Maroc, les plantes occupent une place importante et jouent un rôle très important dans
la médecine traditionnelle, qui elle même est largement employée dans divers problèmes de
santé. Certaines remèdes sont spécifiques d’une seule affection par contre d’autres peuvent
traiter plusieurs maladies tels que le diabète, les rhumatismes, les cancers, ...etc. Les enquêtes
ethnopharmacologiques menées dans les différentes régions marocaines ont permis d’inventorier
plusieurs recettes utilisées pour soigner différentes pathologies (Hseini S. et al., 2007; Jouad H.
et al., 2001; Salhi S. et al., 2010) .
Le continent africain regorge de plantes médicinales très diversifiées. En effet, sur les
300.000 espèces végétales recensées sur la planète plus de 200.000 espèces vivent dans les pays
tropicaux d’Afrique et ont des vertus médicinales (Sofowora A., 1993). La position
géographique du Maroc à l’extrême nord-ouest de l’Afrique et la grande diversité de son climat
et son écologie ; notamment des montagnes, littoral, et des zones désertiques, ont favorisé le
développement d’une flore très riche qui est estimée à 4200 plantes et 1500 espèces introduites
(Hmamouchi M., 2001).
Le Maroc occupe une place non négligeable sur le marché international des productions de
plantes médicinales et aromatiques. Cette production repose principalement sur une biomasse
spontanée constituée d’une flore riche et variée à endémisme très marqué et l’existence
d’écosystèmes qui offrent des conditions écologiques favorables (Bellakhdar J., 1997).
12
L’importance du secteur des plantes médicinales et aromatique et leurs produits dérivés ne
cesse d’augmenter en relation, d’une part, de l’augmentation accrue de la demande mondiale
enregistrée ces dernières années, d’autre part, le nombre croissant d’utilisateurs et la diversité des
domaines d’application. Cet intérêt a suscité la mise en œuvre d’un plan d’action nationale et
d’une stratégie de développement du secteur des plantes aromatiques et médicinales (USAID.,
2008), par la valorisation des plantes médicinales et développement du savoir ancestrales et des
connaissances spécifiques des espèces végétales. D’autre part, de nombreux laboratoires et
centres de recherches au Maroc ont commencé à s’intéresser aux plantes médicinales et
aromatique et ont pu rassembler d’importantes données scientifiques et techniques sur les
ressources naturelles dans ce domaine.
4. Description et
sélectionnées
propriétés
pharmacologiques
des
plantes
Sur la base d’une recherche bibliographique et d’une enquête au près de quelques
herboristes au Maroc, nous avons sélectionné sept plantes utilisées en médecine traditionnelle :
Inula viscosa L. ; Retama monosperma, Ormenis mixta L., Ormenis eriolepis Coss., Rhamnus
lycioides L., Berberis hispanica Boiss. et Urginea maritima L..
4.1. Inula viscosa L. (Ait).
Inula viscosa (L.) Ait. = (syn. Dittrichia viscosa L. W. Greuter ou Cupularia viscosa G.)
est une plante pérenne appartenant à la famille des Astéracées, connu sous le nom d’Aunée
visqueuse, et a pour nom vernaculaire Magramane- Terhala. Cette espèce méditerranéenne, est
commune au Maroc.
Au Maroc,
les feuilles sont utilisées en cataplasme
pour traiter les abcès, la gale,
dermatoses, impétigo, furoncles, des ulcères, des gerçures et comme cicatrisant des plaies
cutanées (Hmamouchi M., 2001). La racine crue écrasée est ingérée dans le traitement de
l’hypertension, de la tuberculose, des affections poitrinaires, des infections respiratoires et
bronchiques (Bellakhdar J., 1997).
La partie aérienne de cette plante est aussi utilisée en
décoction pour le traitement de la pression artérielle et diabète et des pathologies rénales
(Eddouks et al., 2002). Dans les autres pays méditerranéens, cette plante est utilisée pour ces
effets anti-inflammatoire (Al-Dissi N.M. et al., 2001; Barbetti P. et al., 1985) comme
antipyretiques et antiseptiques (Lauro L. and Rolih C., 1990)
et pour le traitement des
pathologies gastroduodénales (Lastra C. et al., 1993).
13
Inula viscosa L. a fait l’objet de plusieurs études démontrant les multiples activités
biologiques et pharmacologiques de cette plante ; telle que l’activité anti-inflammatoire
(Hernandez V. et al., 2007; Manez S. et al., 2007; Manez S. et al., 1999), l’activié
antimicrobienne (Ali-Shtayeh M.S. et al., 1998; Bssaibis F. et al., 2009; Maoz M. and Neeman I.,
1998), antifungique (Cafarchia C. et al., 2002; Maoz M. and Neeman I., 2000; Qasem J.R. et al.,
1995), hypoglycémiante et hypolipidemiante (Zeggwagh et al., 2006), antiulcérogenique
(Alkofahi A. and Atta A.H., 1999 ), antioxydante (Schinella G.R. et al., 2002) antivirale (Sassi
A.B. et al., 2008) et l’activité antitumoral (Rozenblat S. et al., 2008).
4.2. Retama monosperma L. (Boiss.)
Retama monosperma L. Boiss. (synonyme : Genista monosperma est également connu
sous le nom de genêt blanc, nom vernaculaire : R’tam) est une plante appartenant à la famille des
Fabacées. Cette espèce originaire de la flore de l’Afrique du nord et de l’Espagne. Au Maroc,
les plantes du genre Retama sont répondues dans les régions désertiques et le Moyen atlas
(Maghrani M. et al., 2005a). La décoction des feuilles s’emploie, en friction, dans le prurit et la
gale humaine et animale, comme purgatif et vermifuge (Bellakhdar J., 1997), et comme abortif
(Benrahmoune I.Z., 2003).
Les plantes du genre Retama ont fait l’objet de plusieurs études démontrant les multiples
activités biologiques et pharmacologiques de cette plante ; telle que l’activité antihypertensive
and diuretique (Eddouks et al., 2007; Maghrani M. et al., 2005b), l’activité antimicrobienne
(Awen B.Z. et al., 2011; Edziri H. et al., 2007), cytotoxique (Conforti F. et al., 2004; Edziri H. et
al., 2007), hypoglycémiante (Algandaby et al., 2010; Maghrani M. et al., 2005a), antioxydante
et antivirale (Edziri H. et al., 2010).
4.3. Berberis hispanica Boiss.
Berberis hispanica Boiss. et Reut., est une plante
appartenant à la famille des
Berbéridacées, connu sous le nom d’épine vinette, et a pour nom vernaculaire « argis, bu-sman,
barbaris ». Cette espèce est commune du Maroc, d’Algérie et d’Espagne se rencontre en
montagne, dans le Moyen Atlas, le Haut Atlas et le Rif. Au Maroc, l’écorce de racine est
utilisée dans le traitement des affections occulaires. L’infusion de ces écorces est utilisée en
collyre ou pour traiter des atonies gastro-intestinales et des désordres hépathiques. Cette plante
est utilisé aussi comme fébrifuge (Bellakhdar J., 1997).
14
Les plantes du genre Berberis ont fait l’objet de plusieurs études démontrant les multiples
activités biologiques et pharmacologiques de cette plante, parmi lesquelles : l’activité
antitumorale (Fukuda K. et al., 1999; Khan M. et al., 2010; Meenakshi S. and Srivastava S.,
2007), hypoglycémiante (Singh J. and Kakkar P., 2009) , activité antimicrobienne (Ai-Rong L. et
al., 2007; Meenakshi S. and Srivastava S., 2007), activité anti-inflammatoire (Fukuda K. et al.,
1999), activité antioxydante (Zovko Koncic M. et al., 2010).
4.4. Ormenis eriolepis Maire.
Ormenis eriolepis Maire., également connu sous le nom vernaculaire (gartofa ou jartofa),
est une plante appartenant à la famille des Astéracées. Cette plante est employée comme tonique
gastro-intestinal, sudorifique et antidiabétique. Utilisée en décoction comme stomachique,
emménagogue et vermifuge. Cette espèce a fait l’objet de plusieurs études démontrant ces
activités tels que l’activité antibactérienne (El Hanbali F. et al., 2004), activité antileishmania (El
Hanbali F. et al., 2005) et activité antifungique (Amani H. et al., 2008).
4.5. Ormenis mixta L.
Ormenis mixta L.
(Dumpt.) = Chamaemelum mixtum L. est une plante bisannuelle
appartenant à la famille des Astéracées, connu sous le nom de camomille du Gharb ou hellala.
Cette plante est une endémique du Maroc, elle se rencontre dans deux zones disjointes, la
première entre Tanger, Ouezzane, Souk Larbaa, Moulay Bousselham et Azilah, et la seconde
entre Kénitra, Sidi Slimane, Khémisset et Rabat (Aafi A. et al., 2005). Cette plante est utilisée
pour assécher les boutons et comme cicatrisant des blessures (Haddad P.S. et al., 2003). Peu
d’étude ethnoparmacologique ont été consacrée à cette espéce. Une récente étude a rapportée
son activité microbienne (Satrani B. et al., 2007).
4.6. Rhamnus lycioides ssp. Oleoides
Rhamnus lycioides ssp. Oleoides est une éspèce d’Europe et d’Afrique du Nord. Au Maroc
cette plante est utilisée comme laxatif (Bellakhdar J., 1997), et contre les affections hépatiques
(Hmamouchi
M., 2001). Les plantes du genre Rhamnus sont connue pour leurs activités
pharmacologiques, parmi lesquelles l’activité hypotensive (Terencio M.C. et al., 1990), activité
antiproliférative et antioxydante (Ammar R.B. et al., 2008).
15
4.7. Urginea maritima L. Baker.
Urginea maritima L., connue sous le nom Scille ou Urginée et dont le nom vernaculaire
(ansal, bsel al-far, téilum), est une espèce répandue dans tout le bassin méditerranéen. Elle est
utilisée par voie orale ou en fumigation comme abortif (Hmamouchi M., 2001). Elle est utilisée
comme réchauffante contre refroidissements, la toux et la bronchite, en traitements de la
jaunisse, comme diurétique et contre les tumeurs internes (Bellakhdar J., 1997). Cette espèce a
été étudié pour son activité cytotoxique et antimalaria (Sathiyamoorthy P. et al., 1999).
II.
Généralités sur le cancer du col de l’utérus
1. Epidémiologie du cancer du col de l’utérus
Le cancer du col de l’utérus est une pathologie d’origine infectieuse. Il est la 1ére cause de
mortalité par cancer chez la femme dans de nombreux pays du tiers monde et représente 20 à
30% des cancers de la femme dans ces pays contre 4 à 6% des cancers féminins en Amérique du
nord et Europe. Il représente la seconde cause des cancers féminins dans le monde avec près de
500 000 nouveaux cas annuels (Agosti J. M. and Goldie S. J. , 2007). Près de 83 % des cas et
trois quarts des décès sont concentrés dans les pays en développement.
Le cancer invasif du col de l'utérus est une maladie d’origine infectieuse à évolution lente
qui met plus de dix ans à se développer, depuis la primo-infection par un papillomavirus humain
oncogène à tropisme génital jusqu’aux différentes lésions histologiques précancéreuses
accompagnant la persistance de l’infection (Baseman J.G. and Koutsky L.A., 2005). C’est en
1972, que les premières expériences couronnée par le prix Nobel de médecine et de physiologie
2008, le Pr. zur Hausen, ont permis d’établir une relation directe entre le cancer du col de
l’utérus et l’infection par les HPV. Ce lien fut finalement reconnu en 1996 par l’organisation
mondiale de la santé (OMS) et le NIH (National Institutes of Health) (Cohen J. and Enserink M.,
2008).
2. Histoire naturelle du cancer du col de l’utérus
2.1. L’infection à papillomavirus humain (HPV)
Il est maintenant clairement établi que les papillomavirus humains (Human
Papillomaviruses–HPVs)
sont
les
facteurs
étiologiques
majeurs
incriminés
dans
le
développement des lésions prénéoplasiques et néoplasiques du col utérin, qu’elles soient
16
d’origine malpighienne ou glandulaire (Munoz N. et al., 2006). Approximativement 4% de tout
les cancers humains sont associé à l’infection par le virus HPV (Stanley M., 2010).
Les Papillomavirus infectent spécifiquement les épithéliums pluristratifiés comme la peau
et les muqueuses génitale ou buccale. Leur cycle multiplicatif est étroitement lié à la
différenciation des kératinocytes. Le site primaire d'infection correspond aux cellules basales de
l'épithélium, au niveau de brèches ou de traumatismes. Le virus persiste dans ces cellules à l’état
d’épisome (50 à 200 copies par cellule) et maintient un faible niveau transcriptionnel et réplicatif
(Ozbun M.A. and Meyers C., 1998). La phase transcriptionnelle précoce débute dans les cellules
suprabasales. Il y a ensuite la réplication végétative du génome viral (de 1000 à 10 000 copies
par cellule), puis la phase transcription elle tardive, dans les couches épineuses et granuleuses.
La dissémination du virus a lieu lors de la desquamation naturelle des cellules cornées.
Toutes les études épidémiologiques ont confirmé que le facteur le plus associé au
développement de ce cancer est l'infection par une sous-classe de virus du papillome humain
(HPVs) dits de "haut risque", notamment les types 16 et 18 (Tableau 1). Cette association est très
forte car 99,7% des cas du cancer du col de l'utérus squameux sont liés à l'infection par HPV
(Walboomers J.M. et al., 1999). Les génotypes d’HPV sont classés en fonction des différences
observées dans la séquence d’ADN qui code la protéine de capside L1. Il existe plus de 50
génotypes d'HPV pouvant infecter la sphère ano-génitale sur plus de 120 existants; seuls 18 sont
considérés à fort potentiel oncogène pour le col utérin dont 12 de façon bien établie. Parmi ceuxci, 8 génotypes (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 et 58) sont impliqués dans 95 % des cancers du col
utérin (Munoz N. et al., 2003; Munoz N. et al., 2006). Les génotypes 16 et 18 sont responsables
dans les pays occidentaux d’un peu plus de 70 % des cancers du col utérin (Clifford G. et al.,
2006; Munoz N. et al., 2004), ce qui explique qu'ils aient été choisis comme cible pour les
vaccins anti-HPV. Au Maroc, des études ont montré que 91% des femmes marocaines ayant un
cancer du col de l’utérus présentaient des infections à HPV dont 50.5% de type 16 et 15.4% de
type 18 (Amrani M. et al., 2003 ; Amrani M. et al., 2002).
L’infection par les HPV de haut risque s’avère nécessaire mais non suffisante au
développement du phénotype malin. Des cofacteurs répartis selon trois catégories vont
également jouer un rôle important : (i) les facteurs environnementaux ou exogènes regroupant les
contraceptifs oraux, le nombre de grossesses, la fumée de cigarette, la nutrition, la co‐infection
avec d’autres agents sexuellement transmissibles (exemples : virus de l’immunodéficience
17
humaine (VIH), virus de l’herpès), (ii) les facteurs endogènes regroupant des facteurs génétiques
et (iii) les facteurs relatifs à la réponse immunitaire (Franco E.L. et al., 2005).
Tableau 1: Classification des HPVs cervicaux en fonction de leur oncogénicité.
Potentiel oncogénique
Haut risque
Types d’HPVs
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 68, 73, 82
Haut risque probable
26, 53, 66
Bas risque
6, 11, 40, 42, 43, 44,
54, 61, 70, 72, 81
Risque indéterminé
34, 57, 83
2.2. Lésions histologiques cervicales
Les lésions induites par les HPVs sont le plus souvent bénignes : elles correspondent
à une hyperplasie localisée des cellules basales de l'épithélium, communément appelée verrue
(HPVs cutanés), ou condylome (HPVs génitaux). Ces hyperplasies n'entraînent pas ou peu de
modifications de la différenciation cellulaire. Par contre, certains types d'HPVs à haut risque ont
été détectés dans des dysplasies et des cancers épidermoïdes invasifs totalement dédifférenciés.
L'histoire naturelle du cancer du col de l’utérus comporte plusieurs lésions
histologiques précancéreuses (les néoplasies cervicales intra-épithéliales ou CIN), faisant suite à
la persistance de l’infection génitale par un HPV à haut risque oncogène, dont certaines sont des
stades facultatifs et d'autres des étapes nécessaires à l’apparition d’un cancer invasif (Hantz S. et
al., 2006 ) (Figure 2). Ces CIN sont classées en trois groupes selon la hauteur de l’épithélium
impliqué dans ces changements néoplasiques: les CIN1 concernent les épithéliums dont seul le
tiers inférieur est modifié, les CIN2 correspondent à des épithéliums dont les deux tiers sont
modifiés et enfin les CIN3 sont rencontrés lorsque toute la hauteur de l’épithélium est impliquée
dans ces néoplasies (Richart R.M., 1987).
Pour chaque lésion cervicale précancéreuse, il existe une probabilité de régression vers un
épithélium normal, accompagnant la clairance virale et une probabilité de persistance ou de
progression vers un stade plus avancé, y compris pour les carcinomes in situ assimilés aux CIN 3
(Ostor A.G., 1993). Les HPV sont largement répandus dans la population normale et on estime
qu’au minimum 10 % des femmes sont infectées de manière latente. Seulement une très petite
proportion des femmes infectées par ces virus développe une lésion précancéreuse (Bergeron C.,
18
2008). Ces virus infectent le revêtement épithélial de la peau et de certaines muqueuses. Ce
tropisme tissulaire se traduit par des interactions spécifiques entre le virus et sa cellule hôte, le
kératinocyte.
Le suivi à long terme des lésions du col montre que la plupart des lésions régressent alors
que certaines persistent et peuvent évoluer vers un grade plus élevé. Le taux de régression
spontanée diminue avec le grade de la lésion. Environ la moitié des lésions de bas grade vont
régresser spontanément, un tiers de ces lésions persistent avec le même grade et 20 %
progressent vers une lésion plus sévère (Melnikow J. et al., 1998).
Figure 2: Développement des cancers du col utérin liés une infection par un HPV à haut risque
CIN : néoplasie cervicale intra-épithéliale.
3. Le dépistage du cancer du col de l’utérus
La prévention du cancer du col utérin est basée sur le dépistage des lésions précancéreuses.
Le test de dépistage de référence des lésions cancéreuses et précancéreuses du col utérin repose
sur un examen cytologique : le FCU. Le frottis cervical est un test de dépistage simple et
relativement économique qui détecte la présence de cellules anormales et correspond à une
prévention secondaire. Il permet de dépister des anomalies par l’examen au microscope des
cellules prélevées par une spatule et/ou une brosse, étalées sur lame et colorées par la méthode de
19
Papanicolaou (Papanicolaou G.N. and Traut H.F., 1943) . L'interprétation du FCU se base
actuellement sur le système de Bethesda 2001 (Solomon D. et al., 2002).
Il existe de nombreuses techniques de détection des HPV. Différentes techniques de
génotypage par PCR ont été décrites. Une fois la PCR réalisée, le génotypage peut être réalisé
par diverses méthodes : séquençage direct, analyse du polymorphisme des fragments de
restriction ou hybridation par des sondes spécifiques (Carcopino X. et al., 2011). Tous les tests
HPV disponibles sur le marché détectent les génotypes de haut grade, Certains tests détectent par
ailleurs des génotypes de bas grade. Les lésions de bas grade confirmées histologiquement
justifient une surveillance en raison de la probabilité élevée de régression. Les lésions de hautgrade,
après confirmation histologique, doivent toujours être traitées, le plus souvent par
résection (conisation). Cinq modalités thérapeutiques (cryothérapie, vaporisation laser,
conisation au bistouri à froid ou au laser, résection à l’anse diathermique) peuvent être utilisées
comme traitement (Heard I., 2005).
4. Prévention et vaccination
L’étiologie du cancer du col de l’utérus étant étroitement liée à une infection par les HPV.
Deux stratégies sont actuellement développées, l'une préventive et l'autre thérapeutique, visant à
faire régresser les infections persistantes et leur évolution en cancer invasif. Le développement
des vaccins à visée prophylactique est basé sur l'induction d'une immunité humorale avec
production d'anticorps neutralisants efficaces sur l’infection persistante à HPV16 et 18 et sur
l’apparition de lésions précancéreuses (Future L.L., 2007; Paavonen J. et al., 2007). Tandis que
les vaccins thérapeutiques, utilisant comme antigènes ces protéines précoces E6 et E7, ont été
développés et en cours d’essais cliniques. Ils repose sur l'induction d'une immunité cellulaire
dirigée contre les cellules tumorales infectées exprimant les oncoprotéines virales en particulier
(Pretet J.L. et al., 2006). Il existe deux de types vaccins prophylactiques en cours de
commercialisation: un bivalent contre les HPV 16 et 18, le Cervarix, et un tétravalent contre les
HPV 6, 11, 16 et 18, le Gardasil. L’efficacité vaccinale est de plus de 90% contre l’infection à
HPV 16 et 18 et proche de 100% contre l’apparition de lésions précancéreuses chez les sujets
non-infectés avant vaccination (Mougin C. et al., 2009).
La vaccination va permettre d’administrer une molécule capable de déclencher une réponse
immunitaire. La mémorisation de cette réponse par le système immunitaire permet alors lors
d’une infection ultérieure une mobilisation plus rapide des acteurs du système immunitaire
20
tumoral. Les anticorps produit les lymphocytes vont dont transsuder via la membrane basale
dans le mucus. Ainsi, il a été montré que des anticorps spécifiques de la capside virale L1 ou L2
sont capables de prévenir une nouvelle infection par HPV (Bousarghin L. et al., 2009).
5. Les papillomavirus humains (HPV) et cancer
5.1. Classification des Papillomavirus
Le terme papillomavirus, (papilloma dérivé de papula et signifiant bouton et du suffixe
grec –ome qui désigne son caractère tumoral), appartiennent à la famille des papillomaviridae.
Cette famille, dont la classification repose sur des identités de séquences nucléotidiques codant
la protéine de capside L1, est composée de 16 genres qui partage un minimum de 60 %
d’identité, désignés par une lettre grecque (alpha à pi); ces genres sont subdivisés en espèces
partageant 60 à 70 % d’identité et numérotées avec un chiffre arabe ; ces espèces comprennent
différents types partageant 71 à 89 % d’identité et qui eux mêmes peuvent être subdivisés en
sous-types avec une différence de 2 à 10 % par rapport au type et en variants avec une
différence inférieure à 1 à 2 %) (De Villiers E.M. et al., 2004).
Il existe environ 200 génotypes différents qui se distinguent en fonction de leur tropisme
(cutané ou muqueux), de leur propriété biologique et de leur potentiel oncogénique (bas risque
ou haut risque). Ils infectent les cellules germinales de la couche basale des épithéliums
malpighiens (Monsonego J. et al., 2006; Munoz N. et al., 2006).
Les HPV sont classés en cinq groupes. Cette classification est basée sur les séquences de la
protéine majeure de capside L1. Les HPV qui peuvent infecter le col de l’utérus appartient au
groupe alpha qui comprend 60 membres. Les HPV de type béta, gamma, Mu et Nu sont
retrouvés principalement dans les infections cutanées (Alain S. et al., 2010). Les HPV alpha sont
les plus répandus et regroupent les virus cutanés et génitaux‐muqueux. Ceux du genre bêta
infectent préférentiellement la peau. Certains sont responsables de lésions bénignes comme
l’HPV49 alors que d’autres génotypes (HPV5 et 8) sont constamment trouvés dans les cancers
non mélaniques de la peau, chez des patients atteints d’une épidermodysplasie verruciforme. Des
types des genres alpha (HPV2), gamma (HPV4) et mu (HPV1) sont aussi impliqués dans le
développement de verrues cutanées (Mougin C. et al., 2008 ).
21
5.2. Structure et organisation génomique
Les papillomavirus humain (HPV), de la famille des papillomaviridae, sont des virus non
enveloppés de petite taille. Leur capside à symétrie icosaédrique d’un diamètre d’environ 55 nm
est composée de 72 capsomères (Figure 3). Chaque capsomère est en fait un pentamère de la
protéine majeure de capside L1. Cette capside renferme une molécule d’ADN circulaire
bicaténaire composée d’environ 7,9 Kpb. Malgré les différences de séquences pouvant exister
entre chacun des types d’HPV, l’organisation du génome leur est commune.
Figure 3: Représentation schématique de la structure de l’HPV
(A). Photographie au microscope électronique d’un papillomavirus. (B). Diagramme schématique de la
structure de la capside formée de l’assemblage de 72 capsomères disposés de façon pentavalente ou
hexavalente : Mode d’assemblage des protéines de la capside, d’après (Pereira R. and Hitzeroth ll, 2009).
Le génome est constitué d’ADN double brin de 7900 paires de bases environ, avec un seul
brin codant et trois régions génomiques (Figure 4).

La région L (pour Late) est une région de transcription tardive de 3Kb, exprimés
tardivement au cours du cycle viral, les protéines codées sont impliquées dans la capside
virale (L1 et L2).
22

La région E (pour Early) est une région de transcription précoce d’environ 4Kb avec 7 à 8
ORF (Open Reading Frame) exprimés précocement au cours du cycle viral; les protéines,
non structurales, sont impliquées dans la réplication épisomale du génome viral E1 et E2, la
régulation de la transcription (E2), la maturation et le relarguage des protéines virales (E4),
et l'immortalisation et transformation de la cellule-hôte (E5, E6 et E7).

La région URR pour Upstream Regulatory Region, ou LCR pour long Control Region, est
une région non codante, de 400 à 1 000 nucléotides, très variable, contient les promoteurs
des gènes précoces et des séquences de régulation de la réplication et de la transcription et
qui a un rôle de régulation et de contrôle des gènes E et L.
Figure 4: Organisation du génome d’HPV (génotype 16).
Les phases ouvertes de lecture (POL) ou séquences codantes, sont situées sur un seul des brins de
l’ADN viral et sont groupées en 2 régions distinctes : la région précoce E (Early) et la région tardive L
(Late). Une troisième région non codante est appelée LCR (Long Control Region) ou URR (Upstream
Regulatory Region). Ces trois régions sont séparées par deux sites de polyadénylation : un site précoce
(PAE : PolyAdenylation Early) et tardif (PAL : PolyAdenylation Late) ; D’après (Doorbar J., 2006).
5.3. Cycle viral
Les papillomavirus utilisent pour la réplication de leur génome les ADN polymérases
cellulaires, leur génome ne codant pas pour cette enzyme. Plusieurs types de réplication de
l'ADN se succèdent au cours de leur cycle infectieux, en fonction de l’état de différenciation des
cellules épidermiques. Le cycle viral est identique quelque soit le type d’HPV infectant. Les
23
principales étapes de leur cycle de réplication sont présentées chronologiquement. Au niveau des
cellules basales, seuls les gènes précoces sont exprimés. Lors de l’ascension des cellules vers la
couche superficielle de l’épithélium, la réplication virale s’intensifie. Les protéines de capside
L1 et L2 qui sont exprimées tardivement permettent l’encapsidation du génome et la production
de virions, lesquels n’étant pas lytiques sont éliminés par les cellules en voie de desquamation. Il
est important de souligner que les gènes E6-E7 ne sont plus exprimés dans les cellules
différenciées, car ils sont contrôlés négativement par la protéine E2 (Figure 5).
Figure 5: Cycle viral de l’HPV: Expression des protéines virales dans les différentes couches de
l’épithélium.
Les cellules présentant des noyaux rouges sont les cellules infectées au sein desquelles les
protéines virales sont exprimées. La morphologie des cellules dépend de l’expression des
protéines virales en particulier d’E6 et E7 dont l’expression est nécessaire à la réplication du
génome. Les protéines de capside L1 et L2 vont être exprimées au sein des cellules contenant
l’ADN amplifié au niveau des couches supérieures. D’après (Doorbar J., 2006).
Lors d’une infection naturelle, les HPV pénètrent dans l’épithélium spécifiquement au
niveau des cellules basales à la suite d’un microtraumatisme ou d’une lésion tissulaire (Sapp M.
and Day P.M., 2009). L’internalisation du virus au sein de la cellule se fait par un mécanisme
d’endocytose via des vésicules de clathrine ou un système dépendant des cavéoles (Bousarghin
L. et al., 2009).
Suite à l’endocytose des particules virales au sein des épithélia, le génome viral est
maintenu sous forme épisomique dans les cellules basales (de 10 à 200 copies
24
extrachromosomiques). Dans la phase de maintien, le cycle viral est non productif, deux
protéines virales précoces E1 et E2 jouent un rôle clé dans ce processus. Ce qui va permettre le
maintien de l’ADN viral sous forme épisomale et va faciliter sa ségrégation au moment de la
division cellulaire par l’intermédiaire de Brd4 (Wilson V.G. et al., 2002). Cependant, une phase
proliférative va suivre au cours de laquelle le nombre de cellules basales portant le virus
augmente.
L’entrée du papillomavirus dans la cellule hôte est suivie d’une période d’hyperprolifération des cellules de l’épithélium supra‐basal. Dans les épithélia sains, les cellules de la
couche basale migrent vers les couches supra‐basales. Elles quittent alors le cycle cellulaire et
débutent un processus de différenciation terminal afin de produire une barrière de protection. Au
sein des kératinocytes infectés par HPV, ce processus de différenciation n’a pas lieu et le cycle
cellulaire est maintenu (Sherman M. E. et al., 1997). Le mécanisme par lequel les papillomavirus
stimulent la progression du cycle cellulaire implique les deux oncoprotéines E6 et E7.
Au niveau de la couche basale de l'épithélium et après l’entrée du génome viral dans le
noyau de la cellule hôte, celui-ci subit une phase d’amplification, sous le contrôle des protéines
précoces E1 et E2, jusqu’à atteindre un nombre de 50 à 100 copies par cellule, ceci constitue la
phase d'établissement. Cette étape du cycle de multiplication est dite non productive car il n'y a
pas de production de virions, seuls les gènes précoces sont transcrits.
La dernière phase du cycle virale va consister en l’assemblage de particules virales et à
leur libération à la surface de l’épithélium. L’assemblage de ces nouveaux virions se déroule
dans le noyau, c’est pourquoi la protéine L1 synthétisée dans le cytoplasme s’assemble en
capsomères et est transloquée dans le noyau (Florin L. et al., 2006). L’intégration est considérée
plutôt comme un évènement précoce de la cancérogenèse cervicale. Dans les cellules infectées,
le génome viral peut être retrouvé soit sous forme épisomique, soit sous forme intégrée, plus
stable ou un mélange des deux (Doorbar J., 2006)..
6. Implication des protéines E7 et E6 dans le processus tumoral :
Les sérotypes HPV16 et 18 possèdent des propriétés d’immortalisation et de
transformation cellulaire contrôlées par les oncoprotéines virales E6 et E7 qui interfèrent avec les
protéines cellulaires p53 et pRb impliquées dans la régulation de la prolifération, de la
différenciation, de l’apoptose et de la réponse immunitaire. La persistance des HPV à haut
25
risque, s’accompagne d’une expression des protéines E6 et E7 qui est corrélée avec la sévérité de
la maladie et le grade de la lésion (Doorbar J. and 2005). Il a été montré également que la survie
des patients ayant un cancer stade Ib et IIa était associée à l’expression des ARNm E6 et E7
d’HPV16 ou 18 (de Boer M. A. et al., 2007). Les autres oncoprotéines, E1, E2, E4 et E5 sont
supposées être également exprimées avant le début de la phase d’amplification génomique et
participent au maintien du virus sous forme épisomale (Middleton K. et al., 2003).
6.1. Rôle de l’oncoprotéine E6
La protéine E6 des HPV à haut risque lie avec une très forte affinité la protéine p53 et
favorise sa dégradation dans le protéasome après association avec une ubiquitine ligase cellulaire
dénommée E6-AP (E6-associated protein) (Scheffner M. et al., 1990). Cette dégradation de p53
entraîne une perte de contrôle du cycle cellulaire et de l’apoptose. L’interaction d’E6 avec p53
empêche la liaison de p53 au niveau de séquences spécifiques de l’ADN. Cette interaction induit
un changement conformationnel de p53 ce qui conduit à une inhibition de sa liaison à l’ADN ou
à une dissociation des complexes ADN‐p53 déjà formés (Figure 6).
Figure 6: E6 cible la dégradation de p53 via la voie ubiquitine/proteasome. D’après (Ghittoni R. et
al., 2010). E6 induit la dégradation de p53 en formant un complexe avec une autre ubiquitine ligase,
E6AP.
E6 inhibe également la voie de signalisation dépendante de p53 est sa séquestration au sein
du cytoplasme (Shamanin V.A. et al., 2008). La dégradation de p53 par E6 a pour conséquence
l’inhibition de l’apoptose.
La dégradation de p53 va maintenir la division cellulaire car
l’expression des protéines cibles de p53, impliquées dans l’arrêt en G1 ou induisant l’apoptose,
est réprimée ce qui va empêcher d’éliminer les cellules infectées. E6 agit sur de nombreux
26
médiateurs de la mort cellulaire de la voie mitochondriale et des voies des récepteurs aux
signaux de mort (Figure 7). La voie intrinsèque de l’apoptose implique un signal cellulaire tel
qu’un dommage à l’ADN ou un stress oxydatif. Ces stress de manière général activent un certain
nombre de voies de signalisation qui convergent vers la mitochondrie. L’apoptose extrinsèque
est induite par des signaux extérieurs qui vont conduire à l’activation des récepteurs de mort au
niveau de la surface cellulaire.
Figure 7: Les voies d’apoptose intrinsèque et extrinsèque.
La voie d’apoptose extrinsèque est activée par trimérisation des récepteurs de mort cellulaire, suivie de
l’activation des molécules adaptatrices et la pro‐Caspase 8 ce qui permet à la formation du complexe
DISC. Le clivage des Caspases exécutrices suivantes, 3 et 7, est alors possible et la mort cellulaire est
induite. (1) E6 peut bloquer l’association de récepteur de mort avec des molécules adaptarice comme
FADD (Fas associated death domain), TRADD (TNFR‐associated death domain) (2) induisant la
dégradation de la Caspase 8. L’activation de la voie intrinsèque repose quant à elle sur un stress
intracellulaire qui conduit à la formation de pores au niveau de la membrane mitochondriale et à une
libération de cytochrome‐c dans le cytoplasme : l’apoptosome est alors formé. E6 dégrade la protéine Bak
(3). E6 peut également inhiber IAPs bloquant ainsi le clivage des Caspases excécutrices (4). D’après
(Howie H.L. et al., 2009).
Une autre fonction est attribuée à la protéine E6 des HPV à haut risque, qui est capable
d’activer la transcription du gène hTERT (human telomerase reverse transcriptase) codant une
sous-unité catalytique de la télomérase (Klingelhutz A.J. et al., 1996; Munger K. et al., 2004).
(voir III-2.4).
27
6.2. Rôle de l’oncoprotéines E7 :
L’oncoprotéine E7 est une protéine de 98 acides aminés, constituée de trois isoformes :
E7a1 , E7a et E7b, et contient trois régions conservées CR1, CR2 et CR3 (Valdovinos-Torres H.
et al., 2008). Les activités de transformation de l’oncoprotéine E7 ne s’exercent pas seulement au
travers de la dégradation de pRb mais également par ses nombreuses actions de transactivation
sur divers facteurs de transcription et la régulation de leurs gènes cibles.
La protéine E7 des HPV à haut risque posséde une forte affinité pour la protéine
suppresseur de tumeur du rétinoblasme pRb induisant ainsi sa dégradation. Il s’ensuit une
libération et une activation des facteurs de transcription E2F qui permettent l’expression de
protéines nécessaires à la réplication de l’ADN (Munger K. et al., 2004). E7 jouerait un rôle
important dans l’altération des voies métaboliques fondamentales.
Au sein des cellules saines, la progression du cycle cellulaire est régulée par la protéine
pRb sous sa forme hypophosphorylée qui est capable d’interagir avec le facteur de transcription
E2F. Lors de la phase G1, la protéine Rb est progressivement phosphorylée par les kinases
dépendantes des cyclines (CDK). Une fois hyperphosphorylée, pRB ne peut plus lier E2F. Le
facteur de transcription ainsi libéré va activer la transcription des gènes impliqués dans la
poursuite du cycle cellulaire. Au sein des cellules infectées par HPV, E7 interagit avec pRb sous
forme hypophosphorylée et empêche la liaison à E2F. La phosphorylation de E7 conditionne ses
actions sur la régulation du cycle cellulaire. E2F est active de manière constitutive et le cycle
cellulaire n’est plus soumis à un contrôle (Figure 8). La protection contre l’arrêt en phase G1
malgré la stabilisation de p53 par E7 est une conséquence des effets de E7 sur pRb et sur p21
(Gottlieb E. and Oren M., 1998).
28
Figure 8: L’oncoprotéine E7 et cycle cellulaire.
E7 est capable d’activer les complexes cyclines E/CDK2 (impliqués dans le passage du point de
restriction R du cycle cellulaire et la phase G1 tardive) et les complexes cyclines A/CDK2
(impliqués dans la transition G1/S et la progression dans S). D’après (Ghittoni R. et al., 2010).
III.
Télomères et télomérase : nouvelles cibles pour la chimiothérapie
anticancéreuse.
1. Les télomères
Le télomère est un terme qui vient du grec telos (fin) et mere (segment). Le concept de
télomères est apparut suite aux travaux de H.J. Muller sur les chromosomes de la Drosophile en
1938 et qui a montré que les extrémités des chromosomes interagissent rarement avec les
extrémités issues de cassures de l’ADN radio-induites. Il a été proposé ainsi que les
chromosomes possèdent une structure particulière.
1.1. Structure et description
Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées qui coiffent et protègent
l’extrémité des chromosomes. L’ADN télomérique consiste en une région double-brin dont la
taille moyenne varie de 12 à 15 kb dans les cellules somatiques humaines, contenant de
nombreuses répétitions en tandem de séquences hexa-nucléotidiques de séquence 5‘-TTAGGG3’ (Blackburn E.H., 2001). L’extrémité terminale du télomère est composée d’une extension 3’
simple-brin d’environ 250 à 300 bases (brin G) (Figure 9). Les télomères ont au moins deux
fonctions : protéger les extrémités chromosomiques d’une dégradation de l’ADN par les
exonucléases et prévenir les fusions de deux extrémités de chromosome capables d’entraîner des
29
cassures et des recombinaisons chromosomiques (Hahn W.C., 2003). En plus de leur rôle dans le
maintien de la stabilité du chromosome, les télomères sont impliqués dans l’organisation spatiale
du noyau et dans la séparation des chromosomes pendant la division cellulaire (Kirk K.E. et al.,
1997). Les télomères joueraient aussi un rôle sur la régulation transcriptionnelle de gènes
localisés près des extrémités chromosomiques (Shore D., 1995).
Du fait de l’incapacité de la ADN polymérase à répliquer complètement les extrémités
terminales d’une molécule d’ADN linéaire, le télomère se raccourcit à chaque division cellulaire,
ce qui aboutit à un arrêt de la prolifération des cellules somatiques en phase G0 (sénescence
réplicative) lorsque le télomère atteint une taille critique (McEachern M.J. et al., 2000). Les
télomères représentent un mécanisme de contrôle de la durée de vie des cellules normales et leur
altération permet l’immortalisation indispensable à la prolifération des cellules cancéreuses
(Harley C.B. et al., 1990).
Figure 9: Représentation schématique de la séquence d’ADN télomèrique humaine. L’extrémité
télomérique contient des répétitions d’ADN double brin de 5 à 15 kb et d’une extension simplebrin en 3’ de 200 à 300 b (McEachern M.J. et al., 2000).
1.2. Les protéines associées aux télomères humains : complexe Shelterin
Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques spécialisés constitués de protéines
spécifiques associées aux séquences TTAGGG des extrémités chromosomiques. Ce complexe
appelé « télosome » ou « capuchon télomérique » ou « shelterin » permet à la cellule de
distinguer entre des cassures double brin de l’ADN et les extrémités naturelles des chromosomes
(De Lange T., 2005). Ces complexes protéiques permettent ainsi la protection des extrémités
chromosomiques vis-à-vis de l’activation des voies de reconnaissance de dommages à l’ADN et
de l’action d’exonucléases impliquées dans les voies de réparation. Il est également impliqué
dans la régulation de la longueur des télomères en interagissant avec la télomérase ou en
remodelant la chromatine.
30
Le shelterin est composé de six protéines, il reconnaît spécifiquement les répétitions
télomériques TTAGGG grâce à trois protéines de ses composants : Telomeric Repeat binding
Factor 1 et 2 (TRF1 et TRF2) qui se fixent les répétitions télomériques par un domaine Cterminal Myb et diffèrent par leur partie N-terminale (acide pour TRF1 et basique pour TRF2).
Tandis que la protéine Protection Of Telomeres 1 (POT1) peut lier les répétitions TTAGGG
simple-brin de l’extrémité 3’. Trois autres protéines ; TRF2- and TRF1-Interacting Nuclear
protein 2 (TIN2), Rap1 (Repressor Activator Protein 1), et TPP1 (appelé aussi TINT1, PTOP, ou
PIP1) servent d’adaptateurs entre TRF1, TRF2 et POT1 (De Lange T., 2005).
En plus des protéines du complexe shelterin, les télomères humains interagissent avec de
nombreuses protéines qui contribuent au maintien et à la protection des extrémités
chromosomiques. Ces facteurs « accessoires » sont associés aux télomères de façon transitoire au
cours du cycle cellulaire contrairement aux protéines du complexe shelterin. La plupart des
protéines accessoires ont une fonction connue autre que leur fonction télomérique, qui pour la
majorité est impliquée dans les mécanismes de réparation de l’ADN (Palm W. et al., 2008).
Ainsi, les protéines impliquées dans les mécanismes de réparation de l’ADN telles que
KU70/KU80 (Hsu H.L. et al., 2000), Apollo (Beneke S. et al., 2008), PARP1 et PARP2
(Beneke S. et al., 2008; Gomez M. et al., 2006 ).
1.3. Conformation tridimensionnelle des télomères
L’extrémité 3’ simple brin du télomère joue un rôle important dans la structure et la
régulation de la longueur des télomères. Chez l’homme, il a été montré que l’extrémité simple
brin pouvait s’hybrider au sein de la séquence double brin afin de former une grande boucle
appelée « T-loop » (Telomeric Loop) (Griffith J.D. et al., 1999). De nombreuses protéines sont
associées aux télomères dans cette boucle permettant la formation d’un complexe télomérique
servant de « coiffe » pour le télomère, possédant un rôle actif dans la protection et la régulation
de la longueur des télomères (Smogorzewska A. et al., 2004). La T-loop correspondrait à une
invasion du duplexe télomérique par le brin G télomérique. Suite à cette invasion, une partie de
l’ADN double brin devient simple brin, formant une D-loop (Displacement loop) (Figure 10). La
séquestration du simple-brin dans cette conformation (environs 100 nucléotides) permettrait
d’éviter la dégradation du télomère par les nucléases et les fusions télomériques (Griffith J.D. et
al., 1999). La protéine TRF2 favorise la formation de la T-loop et l’altération des fonctions de
TRF2 induit la dégradation du simple brin télomérique (Stansel R.M. et al., 2001).
31
1.4. Les télomères et l’horloge mitotique
L’absence de télomérase dans les cellules somatiques provoque un raccourcissement
progressif des télomères à chaque mitose. Ce raccourcissement des télomères jouerait le rôle
d’une « horloge mitotique » qui contrôlerait ainsi l’activité de prolifération des cellules
normales. Lorsque les télomères ont atteint une taille critique (limite de Hayflick), les cellules
rentrent en sénescence et arrêtent de se diviser (Hayflick L., 1998 ). L’inactivation de p53 ou de
Rb permet d’échapper à la sénescence réplicative. L’érosion télomérique se poursuit au fur et à
mesure des divisions jusqu’à la crise où la majorité des cellules meurent. L’émergence de
cellules immortelles s’effectue si un mécanisme de maintien des télomères est activé (Figure 11).
Les cellules sénescentes acquièrent des caractéristiques morphologiques différentes des cellules
normales telles que le noyau et le cytoplasme qui sont plus volumineux, la forme applatie, la
richesse en lysosomes, en mitochondrie et les modifications des enzymes de la matrice telle que
la diminution des inhibiteurs de la matrice métalloprotéinase (Cristofalo V.J. et al., 2004). La
sénescence peut être alors induite par le raccourcissement des télomères lié à des modifications
de la structure de la chromatine télomérique. Les cellules présentent également une augmentation
de l’expression de l’anti-oncogène P53 qui déclencherait la désorganisation de la t-loop et les
fusions chromosomiques (Griffith J.D. et al., 1999).
Figure 10: Représentation schématique de la T-loop en présence des protéines télomériques. Les
protéines TRF1 et TRF2 sont associés à la T-loop (D’après Blackburn and Neidel., 2006.
32
Figure 11: Représentation schématique de l’horloge mitotique des télomères.
Dans les cellules germinales, la télomérase est active et la taille des télomères est maintenue à
chaque division. L’absence de télomérase active dans les cellules somatiques occasionne un
raccourcissement progressif des télomères à chaque mitose cellulaire. Lorsque les télomères ont
atteint une taille critique (limite de Hayflick), il se produit un arrêt du cycle cellulaire (sénescence
réplicative) ; d’après (Trentesaux C. et al., 2010).
1.5. Mécanismes permettent la réplication des télomères
Les travaux sur la réplication des télomères ont permis de mettre en évidence le rôle de la
télomérase dans le maintien de l’immortalité cellulaire. L’expression de la télomérase dans des
cellules normales permet de contrecarrer l’induction de la sénescence en maintenant la longueur
des télomères. L’émergence de cellules immortelles s’effectue si un mécanisme de maintien des
télomères est activé. Le mécanisme de réplication des télomères par la télomérase sera
explicitement détaillé ci-dessous (partie II.2.2.).
Dans certaines tumeurs humaines d’origine mésenchymateuses ainsi que dans des lignées
immortalisées par l’antigène T de SV40, l’activité télomérase est absente et le maintien de la
longueur des télomères est assuré par un mécanisme alternatif, ALT (Alternative Lengthening of
telomeres), basé sur des recombinaisons entre les télomères. Le mécanisme ALT pourrait
expliquer les 10-15 % de cellules cancéreuses n’ayant pas réactiver la télomérase (Bryan T.M. et
al., 1997). Parmi les cancers exprimant le phénotype ALT : les ostéosarcomes, sarcome des
tissus mous, glioblastomes, carcinomes de cellules rénales, carcinomes adrenocorticaux,
carcinomes à larges cellules de poumon et des carcinomes ovariens. La longueur des télomères
est variable et très hétérogène dans les tumeurs humaines, les cellules ALT possèdent des
télomères longs (>20 kb) et hétérogènes tandis que les tumeurs télomérase positives possèdent
des télomères plus courts (entre 4 et 7 kb) (Riou J.F. et al., 2006). Le mécanisme ALT peut
33
s’appuyer sur différents types d’échanges de séquences télomériques, soit par des échanges de
chromatides sœurs résultant de la réparation des cassures synthétisées pendant la réplication, par
échanges de brins entre les chromatides sœurs (Sonoda E. et al., 1999), soit par un processus de
recombinaison inter-télomérique (Murnane J.P. et al., 1994). Contrairement à la télomérase
exprimée de façon transitoire ou à un niveau basal dans certains types cellulaires, le mécanisme
ALT est totalement absent dans les cellules normales. Des résultats tendent à indiquer qu’il
existerait des éléments capables de réprimer ce mécanisme dans les cellules normales.
1.6. Techniques de mesure de la longueur des télomères
Plusieurs techniques sont actuellement utilisées pour évaluer la moyenne la longueur des
télomères dans les cellules.
- La technique d’hybridation en solution permet de mesurer la taille du simple-brin télomérique
(Gomez et al, 2003), elle est basée sur la quantité d’hybridation du brin C radiomarqué avec le
simple-brin télomérique. Le pourcentage d’hybridation du brin C radiomarqué sur la partie
simple-brin télomérique détermine les variations de la longueur du télomère (principe détaillé
dans Matériels et Méthodes).
- La technique TRF (Telomere Restriction Fragments) permet la mesure de la taille moyenne des
télomères d’une population donnée par Southern blot (Vaziri H. et al., 1993). Le télomère est
séparé du reste de l’ADN génomique par digestion enzymatique par Hinf I et Rsa I. Après
digestion de l’ADN génomique, les fragments sont séparés sur gel d’agarose, puis révélés par
autoradiographie ou écran Phosphoimager (Kimura M. et al., 2010). Les fragments télomériques
apparaissent sous forme de « smear » et leur longueur moyenne est calculée en comparant au
marqueur de taille de l’ADN déposé sur le gel.
- Une autre méthode histochimique, appelé Q-FISH (Quantitative-Fluorescence in situ
hybridation), basée sur l’utilisation de sondes d’acides nucléiques peptidiques (PNA Peptide
Nucleic Acid) de séquences (CCCTAA)3 marquées par un fluorochrome. Les sondes vont
reconnaître les extrémités télomériques et s’hybrider. La lecture grâce à un microscope à
fluorescence des cellules en métaphase va permettre de mesurer l’intensité de fluorescence au
niveau de chaque télomère, puis en comparant avec la fluorescence de plasmides calibrateurs, de
calculer précisément la longueur des télomères (Poon S.S. et al., 1999).
34
- Le Flow-FISH, est une technique qui a le même principe que celui de Q-FISH mais basée sur
l’utilisation de la cytomètrie de flux. Les sondes de PNA sont hybridées sur les cellules en
suspension, et la lecture au cytomètre en flux permet d’obtenir une mesure de la moyenne de
fluorescence dans l’échantillon de cellules (Rufer N. et al., 1998).
2. La télomérase.
L'identification de la
télomérase et la réplication des télomères a été faite
en 1985 par Elizabeth Blackburn, Jack Szostak et Carol Greider, ce qui leurs a valu le Prix Nobel
de Médecine et physiologie en 2009. Ainsi, Greider et Blackburn avaient découvert la
télomérase, qu’ils avaient préalablement décider d’appeler «telomere terminal transferase»,
permettant d’ajouter des séquences TTGGGG in vitro sur une amorce simple brin synthétique est
identifiée chez Tetrahymena thermophila (Greider C.W. and Blackburn E.H., 1985). L’activité
télomérase a ensuite été mise en évidence dans de nombreux autres organismes à savoir, chez
Oxytrichia (Zahler A.M. and Prescott D.M., 1988), les Euplotes (Shippen-Lentz D. and
Blackburn E.H., 1989) et chez la levure (Kramer K. M. and Haber J. E., 1993). Chez l’Homme,
l’activité enzymatique a été mise en évidence d’abord dans les cellules tumorales HeLa (Morin
G.B., 1989). Ensuite , il a été montré que la télomérase est réactivée dans plus de 90% des
cancers, toutes origines confondues (Kim N. W. et al., 1994).
2.1. Structure de la télomérase
La télomérase est un complexe ribonucléoprotéique (127 Kda) dont l’holoenzyme
comporte deux sous-unités (Figure 12), une sous-unité catalytique à activité transcriptase
inverse, hTERT (human TElomerase Reverse Transcriptase), et d’une sous-unité ribonucléique
composée d’une matrice d’ARN, hTR (ou hTER pour human Telomerase RNA) ou hTERC
(human telomerase RNA component), permettant l’addition de séquences TTAGGG à
l’extrémité 3’ du télomère (Greider C.W. and Blackburn E.H., 1989). La télomérase est active
dans les cellules germinales et embryonnaires indifférenciées, mais très faiblement exprimée
dans les cellules somatiques. Une très forte activité télomérase a été détectée dans les cellules à
prolifération rapide, hématopoïétiques et interstitielles (Broccoli D. et al., 1995). Les cellules
souches et les cellules germinales possèdent également une activité télomérase qui permet
d’assurer leurs fonctions respectives dans le renouvellement de tissus et dans la reproduction.
35
Figure 12: Représentation schématique de la télomérase humaine. La télomérase Enzyme constituée
par une partie ARN codée par hTERC et une sous-unité protéique codée par hTERT. Le complexe
télomérase regroupe d’autres protéines telles que Est1 et la dyskérine (Smogorzewska A. et al., 2004).
La sous-unité hTERT est une ADN polymérase, assurant l’activité catalytique de
l’enzyme. Sur son extrémité N-terminale, TERT possède une large extension de 400 acides
aminés nommée NTE (acid N-terminal extension) et une courte extension en C-terminal
d’environ 150-200 acides aminés nommée CTE (C-terminal extension). Les domaines Nterminaux et NLS sont impliqués dans la localisation nucléolaire de la télomérase (Yang Y. et
al., 2002), alors que le domaine C-terminal est essentiel pour le fonctionnement de hTERT, et
semble jouer un rôle dans l’activité processive de la télomérase (Huard S. et al., 2003). La région
N-terminale de TERT contribue aux propriétés uniques de la télomérase telles que son
association à la matrice ARN, la fixation d’autres composants protéiques et la modulation de sa
processivité (Autexier C. and Lue N.F., 2006).
La sous-unité ribonucléique hTR (human Telomerase RNA) est constitué d’un ARN
intégral de 451 nucléotides dont 11 constituent la matrice pour la synthèse des répétitions
télomériques (Chen Q.M. et al., 2000 ). La sous unité d’ARN hTR est exprimé avec un taux 5
fois supérieur dans les cellules cancéreuses humaines que dans les cellules normales (Yi X. et
al., 1999). En plus de ces deux sous-unités, d’autres composants du complexe de la télomérase
interviennent dans l’assemblage, la conformation et la localisation nucléaire de la télomérase.
Parmi, ces protéines : TEP1, P23/ p90 et 14-3-3 se lient à la sous-unité hTERT. Cependant, les
protéines REP1, hGAR1, Dyskérine, hNOP10, hNHP2, C1/C1, A1/UP1, L22 et hStau se lient à
la sous-unité hTR (Cong Y.S. et al., 2002).
36
2.2. Mécanisme de réplication des télomères par la télomérase
La télomérase est une transcriptase réverse spécialisée qui assure la réplication des
extrémités télomériques des chromosomes. La télomérase étant exprimée dans la plupart des
cancers humains, mais elle est inactive dans la majorité des cellules normales, à l’exception de
celles de la lignée germinale, les cellules souches embryonnaires (Wright W.E. et al., 1996), les
lymphocytes activés (Weng N.P. et al., 1997), le tissu de l’endomètre durant le cycle menstruel
et les cellules de la couche basale épidermique (Yasumoto S. et al., 1996). L’activité catalytique
de la télomérase induit le rallongement de l’extrémité 3’simple brin des télomères par un
mécanisme processif. L’allongement des télomères se fait en trois étapes (Figure 13).
Figure 13: Représentation schématique du mécanisme de l’élongation du télomère par la
télomèrase. D’après (Mason M. et al., 2011). Les étapes d’extension processive de l’ADN télomérique par
la télomérase: (a) La reconnaissance du substrat par la télomérase (en bleu) et l’hybridation de la matrice
ARN au substrat (en violet). (b) L’addition de nucléotides à l’extrémité 3’ télomérique par hTERT (en jaune),
la matrice ARN sert d’amorce. (c) Une translocation de la télomérase et le repositionnement de la matrice
ARN de la télomérase. (d) Initiation d’un second cycle d’élongation d’une nouvelle séquence télomèrique (en
vert).
37
2.3. Mécanisme de régulation de la télomérase
Dans les cellules normales, télomérase négatives, un raccourcissement progressif des
télomères a lieu à chaque division cellulaire conduisant à la sénescence. L’activité télomérase
est surexprimée dans une grande majorité des tumeurs humaines mais aussi dans des tissus
normaux à renouvellement rapide (cellules souches, intestinales, épithéliums,..) par contre elle
est surexprimée dans la plus de 85% des cancers humains. L’expression de l’activité télomérase
est régulée à différents niveaux, notamment la transcription, l’épissage alternatif de l’ARNm, la
maturation de hTERT et hTR. Chez l’homme, la sous-unité ribonucléique de la télomérase est
exprimée de façon ubiquitaire dans la quasi-totalité des cellules, et il existe donc peu de
mécanismes conduisant à sa régulation. La sous-unité catalytique hTERT est, dans la plupart des
cellules somatiques le facteur limitant de l’activité télomérase.
2.3.1. Régulation de la télomérase via l’expression de hTERT.
a. Régulation transcriptionnelle :
Dans les cellules humaines le premier niveau de régulation de la télomérase se fait par
régulation transcriptionnelle de la sous–unité catalytique de la télomérase par activation de son
promoteur (Figure 14). Plusieurs facteurs de transcription et de répressions sont responsables de
la régulation du gène de hTERT, parmi lesquels on retrouve principalement c-Myc/Mad, Sp1, le
récepteur aux estrogènes, Ets, NF-KB, E2F-1, MZF-2 et WT. Le promoteur du gène de hTERT
est une séquence d’environ 1100 paires de bases en amont du site d’initiation de la transcription
(Wick M. et al., 1999) et contient deux sites de fixation de c-Myc, des E box avec de une
séquence conservée (CACGTG), l’un juste en amont du site d’initiation de la transcription,
l’autre à environ 200 paires de bases (Greenberg R. A. et al., 1999). En association avec la
protéine Max, l’oncogène c-Myc se fixe sur une séquence consensus du promoteur de gène de
hTERT et exerce un effet d’activateur de la transcription du gène (Wu K.J. and Grandori C.,
1999). Cependant, la fixation de Mad1 à la place de c-Myc inhibe la transcription de gène (Xu D.
et al., 2001). Dans les cellules où la télomérase est très faiblement exprimée comme les cellules
somatiques normales, on retrouve une faible expression de c-Myc et une forte expression de
Mad1 (Gunes C. et al., 2000).
b. L’épissage alternatif de hTERT :
L’expression de la télomérase peut être régulée par un épissage alternatif de son ARN
messager (Ulaner G.A. et al., 1998). Il existe plusieurs variantes d’épissage possibles, quatre
38
insertions de séquences introniques et de deux délétions (α et β) (Figure 16). L’insertion 1 (38pb)
et la délétion β (182pb) induisent un arrêt prématuré de la traduction en amont du domaine
transcriptase inverse donnant une protéine tronquée non fonctionnelle. La délétion α (36pb) a
lieu au niveau du motif A du domaine transcriptase inverse aboutissant à une protéine non
tronquée mais non fonctionnelle agissant comme dominant négatif de la télomérase active
(Colgin L.M. et al., 2000). Un changement au niveau du profil d’épissage a été montré, donnant
lieu à une différence d’expression de la télomérase, entre les cellules normales et tumorales
(Saeboe-Larssen S. et al., 2006).
c. Régulation post traductionnelle :
Pour être active, la protéine hTERT obtenue après traduction du transcrit actif doit subir
plusieurs étapes de modifications post-traductionnelles pour être activée : l’assemblage des
différentes sous-unités, la translocation au noyau où s’exerce son activité catalytique, et une
phosphorylation qui va permettre d’augmenter son activité. Plusieurs études ont montré que dans
certaines cellules, malgré la présence de l’ARN messager codant pour la forme active de
hTERT, l’activité de la télomérase été indétectable (Liu K. et al., 2001; Rohde V. et al., 2000).
Après sa synthèse, hTERT doit être transloquée au noyau afin de permettre son assemblage avec
la sous-unité ribonucléique, puis d’accéder aux télomères. Ensuite, une étape d’oligomérisation
de hTERT est indispensable pour l’activer. L’oligomérisation est contrôlée dans le noyau par
des protéines chaperonnes Hsp70 qui jouent un rôle dans le repliement de hTERT, Hsp90 et p23
qui sont impliquées dans l’assemblage de hTERT et hTR (Forsythe H.L. et al., 2001). hTERT
peut être phosphorylée ou déphosphorylée par certaines kinases et phosphatases permettant la
modulation de son activité (Li H. et al., 1998). .
2.3.2. Régulation de la sous-unité ribonucléique hTR.
La sous-unité ribonucléique hTR est exprimée de façon ubiquitaire dans toutes les cellules,
mais n’est pas un facteur limitant de l’activité télomérase. Le gène humain hTR, présent en une
seule copie, est localisé sur le chromosome 3 à la position 3q26.3 (Soder A.I. et al., 1997). Cette
région est souvent amplifiée dans certains types de tumeurs solides humaines, telles que les
cancers du col de l'utérus, des poumons et de certains carcinomes épidermoïdes. Le promoteur de
hTR contient une boîte CCAAT à proximité du site d’initiation de la transcription et une boîte
TATA, compatible avec la transcription de ce gène par l'ARN polymérase II. La mutation ou la
délétion de la boite CCAAT inhibe l’expression du promoteur de hTR, ce qui montre
l’importance de cette séquence pour la transcription de hTR (Zhao J.Q. et al., 2000).
39
Plusieurs protéines, en s’associant à hTR permettent sa stabilisation. C’est le cas de
protéines telles que la dyskérine, Nhp2p, Nop10p et Gar1p, qui jouent un rôle dans la
stabilisation de hTR, sa localisation cellulaire ou l’assemblage de la télomérase. Le
raccourcissement progressif des télomères induit des changements épigénétiques des régions
télomériques et subtélomériques (Benetti R. et al., 2007).
Figure 14: Mécanisme de régulation de la télomérase. La régulation de l’expression de la télomérase
et de son activité est contrôlée aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. En vert, sont
représentés des facteurs favorisant la transcription et, en rouge, ceux qui inhibent la transcription. D’après
(Olaussen K.A. et al., 2006).
40
2.4. Rôle des protéines E6 et E7 dans la régulation de l’activité télomérase
Une autre fonction est attribuée à la protéine E6 des HPV à haut risque, qui est capable
d’activer la transcription du gène hTERT (human telomerase reverse transcriptase) codant une
sous-unité catalytique de la télomérase (Klingelhutz A.J. et al., 1996; Munger K. et al., 2004).
L’effet E6 sur la télomérase est principalement réalisé par l’activation de son promoteur mais il a
également été mis en évidence une interaction physique fonctionnelle de E6 directement sur le
complexe télomérase (Liu X. et al., 2009). L’immortalisation et la transformation des cellules
épithéliales induite par l’oncoprotéine E6 est réalisée en synergie avec l’oncoprotéine E7 (Liu X.
et al., 2008; Munger K. et al., 1989). L’activation transcriptionnelle de la télomérase par E6 se
fait par le biais d’interaction entre E6, E6AP (ubiquitine ligase), le facteur de transcription c‐myc
et son cofacteur Max (Veldman T. et al., 2003)..
E7 est capable d’immortaliser des cellules épithéliales humaines de kératinocytes en
coopération avec E6 (Hawley-Nelson P. et al., 1989). E7 est en fait capable d’immortaliser des
cellules simplement en combinaison avec une expression de hTERT (Kiyono T. et al., 1998). Par
ailleurs, sa capacité à augmenter c-myc active le promoteur de hTERT (Liu X. et al., 2008).
Ainsi il a été montré que la dégradation de pRb par E7 protège également les cellules de la
sénescence (Psyrri A. and DiMaio D., 2008), l’inhibition de E7 dans des lignées cervicales
entraîne une cascade dépendante de pRb qui aboutit à la sénescence cellulaire (Johung K. et al.,
2007).
2.5. Techniques de mesure de l’activité télomérase :
La détection in vitro de l’activité télomérasique dans des échantillons biologiques peut être
effectuée grâce à la méthode TRAP (Telomere Repeat Amplification Protocol). Cette technique
est composée de deux phases, la première permet l’élongation in vitro d’un fragment télomérique
synthétique par la télomérase contenue dans l’extrait cellulaire, la deuxième permet la détection
de ces produits d’élongation par amplification par PCR (Kim N. W. et al., 1994).
Plusieurs techniques permettent par la suite de détecter les produits d’amplification de la
PCR, qui vont permettre une mesure semi-quantitative ou quantitative de l’activité télomérase
(Hou M. et al., 2001). Une mesure semi-quantitative de l’activité télomérase peut être obtenue
soit grace à la méthode de transfert d’énergie en fluorescence (FRET) en utilisant une amorcesonde d’hybridation marquée par un fluorochrome (TRAPEZEXL, Chemicon International)
(Uehara H. et al., 1999), soit à l’aide d’un test ELISA, en marquant l’amorce TS avec la biotine
41
(TeloTAGGG Telomerase PCR-ELISA kit, Roche) (Wu Y.Y. et al., 2000). Une quantification
précise de l’activité télomérase peut etre réalisé grace à l’utilisation de la PCR quantitative en
temps réel (Hou M. et al., 2001).
3. Stratégies thérapeutiques ciblant les télomères et la télomérase
L’activité télomérase procure à la cellule un potentiel réplicatif illimité et est considérée
comme une des six altérations essentielles nécessaires à la croissance tumorale (Hanahan D. et
al., 2000 ). La télomérase étant surexprimée dans la plus de 85% des cancers humains (Kim
N.W., 1997; Shay J.W. and Bacchetti S., 1997). Cette spécificité met en évidence une cible
attrayante pour la conception des inhibiteurs en vue du traitement de cancers, tout en minimisant
les effets secondaires toxiques dans les cellules normales qui n’expriment pas la télomérase. Ces
stratégies ont pour but d’induire un raccourcissement prématuré des télomères et un arrêt de la
prolifération anarchique des cellules. De plus les inhibiteurs de la télomérase peut aussi posséder
une grande spécificité, faible toxicité et réduction des autres effets indésirables (Gellert G.C. et
al., 2005). Le ciblage des télomères et la modulation de l’activité télomérasique dans les cellules
cancéreuses peut être assurée par différents types d’inhibiteurs (Figure 15).
Figure 15: Représentation schématique des stratégies d’inhibition de la télomérase. D’après
(Zimmermann S. et al., 2007).
42
3.1. Stratégies ciblant la télomérase
L’inhibition de la télomérase a pour but d’inhiber l’élongation des télomères, aboutissant
au raccourcissement de la taille de l’extrémité chromosomique, à l’arrêt de la prolifération
cellulaire et l’entrée des cellules cancéreuses en sénescence et/ou en apoptose. Il existe plusieurs
stratégies d’inhibtion de la télomérase, soit par inhibition de la sous-unité ribosomale hTR,
l’inhibition de la sous-unité catalytique hTERT ou inhibition de l’association du complexe
hTERT / hTR.
3.1.1. Cibler hTERT
Plusieurs stratégies ciblant hTERT ont été mis en évidence, à savoir expression d’un
dominant-négatif, inhibition de la transcription, de l’ARNm, inhibition des modifications posttraductionnelles, inhibition de la translocation nucléaire et inhibition de son activité catalytique.
L’induction de changements spécifiques d’acides aminés entraîne l’émergence de certaines
protéines mutantes de la sous-unité catalytique hTERT dites DN-hTERT catalytiquement
inactives. hTERT est le facteur limitant de l’activité télomérase dans la plupart des cellules
somatiques. L’activité télomérase peut être inhibée par l’utilisation de dominants négatifs de
hTERT. Cette stratégie permet d’inhiber la croissance cellulaire, d’induire un raccourcissement
télomérique et l’induction de la sénescence et/ou de l’apoptose (Seimiya H. et al., 2005).
Récemment, il a été montré que les DN-hTERT sensibilisent les cellules tumorales aux agents
antinéoplasiques, telles
que le
cisplatine,
la
vincristine, le
docétaxel,
l’étoposide,
l’ecteinascidine-743, le témozolomide et l’imatinib (Tauchi T. et al., 2007).
Le premier niveau de régulation est régi par des facteurs de transcription. On y trouve,
parmi plusieurs, ceux favorisant la transcription en se liant à de nombreux sites au niveau du
promoteur du gène de hTERT, tels que SP1, Myc, le récepteur d’estrogène ER et ceux inhibant
la transcription tels que MZF2, WT1, Mad. Ces stratégies ne ciblent donc pas spécifiquement la
télomérase. Certains composés d’origine naturelle tels que l’acide gambogique et la génistéine,
sont capables de réprimer c-Myc et donc, de réduire l’activité télomérase dans des cellules
cancéreuses (Guo Q.L. et al., 2006). Il a été également montré que les acides rétinoïques et leurs
analogues présentaient la capacité d’inhiber la transcription de hTERT, induisant une diminution
de l’activité télomérase et de la croissance des cellules tumorales (De Cian A. et al., 2008).
43
Il est possible de cibler directement l’ARNm de hTERT grâce à des techniques des RNAi
(interfering RNA). Il a été démontré que cette stratégie induisait une diminution de la production
d’hTERT, de l’activité télomérase (de Souza Nascimento P. et al., 2006). Dans les cancers
cervicaux, cette stratégie facilite l’induction de l’apoptose par des agents chimiothérapeutiques
via l’activation de la protéine proapototique BAX (Massard C. et al., 2006; Peralta-Zaragoza O.
et al., 2010). Une autre approche basée sur le principe du siRNA consiste à utiliser des
oligomères phosphorotioate anti-hTERT qui induisent une diminution rapide de la viabilité des
cellules tumorales et l’apoptose indépendamment de l’activité enzymatique de la télomérase
(Kraemer K. et al., 2003; Wang Y.F. et al., 2006).
Les analogues nucléosidiques sont capables de bloquer l’incorporation des nucléotides
dans l’ADN néo-synthétisé lors de l’activité transcriptase inverse. Des dérivés de l’AZT (3’azido-3’- désoxythymidine), comme l’AZGTP (7-déaza-2’-désoxyguanosine 5’- triphosphate),
(Fletcher T.M. et al., 2001), et les dérivés triphosphates tels que l’arabinofuranosyl-guanosine
(Ara-G), le dideoxyinosine (ddI) et dideoxyguanosine (ddGTP) (Strahl C. et al., 1996) inhibent
la télomérase et induisent le raccourcissement des télomères . Plusieurs autres études ont montrés
que analogues nucléosidiques induisent une réduction de l’activité télomérase et un
raccourcissement de la longueur des télomères d’une manière dose- et chrono-dépendante
(Murakami J. et al., 1999; Rankin A.M. et al., 2008b).
La classe des inhibiteurs non nucléosidiques renferme des composés qui inhibent la
télomérase en se liant au site actif de l’enzyme transcriptase réverse. Il a été montré que certaine
molécules de petite tailles telles que le dérivé d’isothiazolone appelé TMPI (Hayakawa N. et
al., 1999), la rhodacyanine FJ5002 (Naasani I. et al., 1999) et le BIBR1532 (Damm K. et al.,
2001), induisent efficacemnet un raccourcissement progressif des télomères. Le BIBR1532 (2(E)-3-naphtalen-2-yl-but-2-enolylamino)-benzoique acide) possède une haute spécificité
d’inhibition non compétitive de la télomérase. Cet inhibiteur semble capable, dans plusieurs
types de cancer, de raccourcir les télomères in vivo et de provoquer la sénescence des cellules
tumorales (Damm K. et al., 2001).
L’activité télomérase peut aussi être régulée par la translocation de hTERT du cytoplasme
au noyau. Le TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha) module l’activité télomérase en induisant la
translocation de hTERT du cytoplasme vers le noyau par une interaction directe NK-kappaB
p65. Cette translocation peut ainsi être bloquée par des inhibiteurs spécifiques de la voie de
signalisation NK-kappaB (Liao C.H. et al., 2007).
44
3.1.2. Cibler hTR
Le ciblage de l’ARN de hTR est une stratégie qui vise à bloquer l’accès de la télomérase à
son ARN matrice, résultant en une inhibition de son activité. Des oligonucléotides antisens
peuvent être utilisés pour cibler la matrice ARN de hTR ou une de ses régions afin d’induire une
dégradation ou une altération de la conformation de hTR en empêchant la formation du
complexe télomérase inhibant ainsi l’activité enzymatique de la télomérase. De nombreux
oligonucléotides antisens ont montré leurs effets inhibiteurs de l’activité télomèrase provoquant
la sénescence et l’apoptose après raccourcissement progressif des télomères dans plusieurs
lignées de cellules cancéreuses (Folini M. et al., 2009; Rankin A.M. et al., 2008a). Une de ces
molécules le GRN163L, antagoniste potentiel de hTR (Roth A. et al., 2010). Cette molécule a
été autorisée à entrer en phase clinique I/II dans le cas des traitements des leucémies
lymphocytaires chroniques (Gryaznov S.M., 2010).
3.1.3. Le complexe hTR – hTERT
Il existe une autre stratégie d’inhibition de la télomérase en bloquant l’association entre la
sous-unité
catalytique
hTERT
et
la
sous-unité
ribosomale
hTR.
Des
séquences
oligonucléotidiques hTRas009 et hTRas010 sont capables d’induire une diminution de l’activité
télomérase (Keppler B.R. and Jarstfer M.B., 2004).
3.2. Stratégies ciblant le télomère.
Cette stratégie consiste à inhiber la reconnaissance de la télomérase de son substrat, le
télomère, qui constituent une des cibles d’intêret considérable pour la fixation de ligands
spécifiques. Les télomères sont capables d’adopter une structure en G-quadruplexe, et la
stabilisation de ces structures par des ligands spécifiques permettrait d’inhiber la reconnaissance
de la télomérase et d’empêcher l’élongation des télomères.
3.2.1. Par les ligands des G-quadruplexes
L’extrémité 3’ simple brin du télomère contient plusieurs guanines consécutives qui
peuvent s’assembler pour former un repliement intramoléculaire comportant trois plateaux de
guanines (G-quartets) stabilisés par des liaisons hydrogènes entre les N7 des guanines et un
cation central, K+ ou Na+. Les G-quadruplexes (G4) correspondent à un empilement
hydrophobe de plusieurs G-quartets et il y a autant de G-quartet que de guanines adjacentes
répétées selon un multiple de 4 (Riou J.F. et al., 2003). Les G4 peut également se former in vitro
45
à partir d’oligonucléotides d’ADN ou d’ARN mimant les séquences télomériques, de promoteurs
de gènes, de sites de recombinaison, de sites d’empaquetage et de domaines de dimérisation des
ARN (Davis, 2004).
La recherche de petites molécules stabilisant le G-quadruplexe (ligands G4) et inhibant
l’activité de la télomérase est apparue au cours de ces dernières années comme une stratégie pour
bloquer la télomérase et induire la mort des cellules cancéreuses. Cette stratégie consiste à
inhiber la reconnaissance de la télomérase de son substrat, le télomère (Figure 16). Le principe
d’action des ligands de G-quadruplex est dû à leur intercalation au sein de ces structures,
entraînant leur stabilisation et donc le blocage de la télomérase au cours de l’étape d’élongation.
Un grand nombre de ligands de l’ADN G-quadruplexe ont été développés capables d’inhiber
potentiellement l’accessibilité de la télomérase au télomère. La stabilisation de ces structures par
des ligands permettrait d’inhiber la reconnaissance de la télomérase et d’empêcher l’élongation
des télomères (Mergny J. L., et al., 1998). Ces agents stabilisateurs de G-quadruplexes incluent
des acridines trisubstituées (BRACO19) (Gowan S.M. et al., 2002), des porphyrines cationiques
(TMPyP4) (Grand C.L. et al., 2002), les acridines pentacycliques (RHSPS4), des produits
naturels tels la télomestatine (Gomez D. et al., 2004b; Kim M.Y. et al., 2003), des dérivés
d’éthidium, des dérivés de pérylène (PIPER), des dibenzophenanthrolines et des dévivés triazine
(12459) (Gomez D. et al., 2004a; Riou J.F. et al., 2002).
Figure 16: Mécanisme de l’inhibition de la télomérase par stabilisation de Gquadruplexe par des
ligands spécifiques. D’après (Trentesaux C. et al., 2010).
46
3.2.2. Par les protéines associées au télomère.
Les protéines associées au télomère représentent également des cibles pour inhiber la
télomérase. Des études ont montré que des cibles pharmacologiques de la tankyrase1 induisent le
raccourcissement du télomère par inhibition de la télomérase et l’entrée rapide des cellules
cancéreuses en crise (Seimiya H. et al., 2005). D’autre part, une inhibition de la protéine
protectrice TRF2 dans des lignées cellulaires conduit à un raccourcissement des télomères et à
une apoptose rapide p53- dépendante (Karlseder J. et al., 1999). De plus, certaines molécules
peuvent induire par compétition avec les protéines télomériques, une déprotection du télomère,
conduisant à l’induction de la réponse « dommages à l’ADN » au niveau du télomère et
provoque l’entrée en sénescence des cellules (O'Sullivan R.J. and Karlseder J., 2010).
IV.
Induction de l’apoptose à visée thérapeutique
Les médicaments anticancéreux ont pour objectifs d’induire la mort des cellules tumorales
en évitant de cibler les cellules normales. La mort cellulaire se déroule selon une variété de
mécanismes. En réponse à une agression très violente, les cellules meurent par un processus de
lyse appelé nécrose. Dans d’autres situations, la mort cellulaire peut ȇtre génétiquement
programmée et met en jeu des voies de signalisation complexes telle que l’apoptose. L’apoptose,
mort programmée de la cellule, est réalisée par des protéases appelées Caspases (cysteinyl
aspartate-specific proteases), dont l’activité est révélée à la suite de messages moléculaires en
provenance de la mitochondrie (cytochrome c) ou d’origine extracellulaire, par activation de
récepteurs de mort membranaires. Les agents anticnacéreux, quelles que soient leurs cibles
cellulaires, peuvent induire la mort par apoptose de certaines lignées cellulaires tumorales en
culture (Solary E., 2006).
D’autres morts cellulaires existent incluant une apoptose indépendante des Caspases, une
apoptose abortive se terminant en nécrose et une mort cellulaire induite par les enzymes
lysosomiales. L’autophagie est un autre processus génétiquement contrôlé qui contribue à la
mort cellulaire au cours du développement ou en réponse à certaines agressions. L’autophagie
est indépendante des Caspases au cours de laquelle la cellule dégrade à l’intérieur d’elle-même
des protéines et organelles entières. Les agents anticancèreux peuvent aussi avoir pour effet
d’arrêter la prolifération des cellules tumorales, notamment en induisant un processus appelé
sénescence, ou de restaurer leur capacité de différenciation (Jaattela M. and 2002).
47
1. Concept de l’apoptose
L’apoptose est un processus actif et physiologique de mort cellulaire, utilisée pour éliminer
les cellules en excès, endommagées ou infectées, potentiellement dangereuses pour l’organisme.
L’apoptose joue un rôle essentiel dans le développement normal de l’organisme et dans le
maintien de l’homéostasie cellulaire chez l’adulte, qui résulte d’un équilibre entre la prolifération
et la mort cellulaire. En 1972, Kerr et al. ont décrit une mort cellulaire du même type dans divers
tissus et types cellulaires: ces cellules présentaient des caractéristiques morphologiques
communes, mais cependant distinctes de celles observées dans les cellules en nécrose tant d'un
point de vue morphologique que biochimique. La nécrose est un phénomène passif faisant suite à
une agression extérieure. Alors que l’apoptose est un processus organisé temporellement, au
cours duquel la cellule exprime un ensemble de gênes entraînant des modifications
morphologiques, biochimiques et structurales aboutissant à sa destruction "sans traces" et
complète (Kerr J.F. et al., 1972).
Une dérégulation de la mort cellulaire programmée peut-être à l'origine de nombreux
aspects de pathologies humaines. D’une part, une inactivation de l’apoptose peut aboutir à une
augmentation du nombre de cellules et, en conséquence, à une prolifération incontrôlée. Il est
très vraisemblable que certaines tumeurs malignes soient, en fait, la conséquence de facteurs qui
suppriment l’apoptose. D’autre part, diverses affections sont la conséquence d’une stimulation
anormale de l’apoptose ; c’est le cas, notamment, dans la maladie d’Alzeimer, la maladie de
Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, l’infarctus du myocarde et le syndrome
d’immunodéficience acquise (Thompson C.B., 1995).
L’apoptose peut être activée par des signaux physiologiques normaux, intra- ou
extracellulaires, mais aussi par des stimuli pathologiques. En effet, elle est responsable de
l’élimination des cellules endommagées par un stress oxydatif, par des altérations génétiques, par
la maladie, par un choc thermique ou par l’exposition à des agents génotoxiques (chimiothérapie
et radiothérapie). Elle permet le bon fonctionnement du système immunitaire, les cellules
infectées par des virus ainsi que les cellules tumorales étant détruites par apoptose, par les
lymphocytes T cytotoxiques.
48
1.1. Caractéristiques morphologiques de l’apoptose
Une cellule en apoptose active une série d’évènements moléculaires et biochimiques
conduisant à des altérations morphologiques. Ces changements sont spécifiques à l’apoptose et
permettent d’identifier ce type de mort cellulaire. Les premiers évènements morphologiques
observables sont la réduction du volume cellulaire, la ségrégation de la chromatine à la
périphérie de l’enveloppe nucléaire, condensation de la chromatine, la condensation du
cytoplasme et la formation d’invaginations des membranes plasmiques et nucléaires, donnant un
aspect de bourgeon à la surface membranaire périphérique. La cellule perd le contact avec ses
voisines. L’évolution des invaginations membranaires aboutit à la fragmentation de la cellule en
corps apoptotiques, vésicules membranaires contenant le cytoplasme et les organites dégradés
(Figure 17). La phagocytose rapide des corps apoptotiques empêche la libération du cytoplasme
de la cellule apoptotique dans le milieu environnant et évite ainsi toute réaction inflammatoire.
Contrairement à l’apoptose, la nécrose, considérée comme une mort cellulaire non coordonnée,
est caractérisée par une modification de la perméabilité membranaire entraînant une dilatation du
cytoplasme et des organites ; la cellule se gorge d’eau. Dans le cas d’une nécrose, la chromatine
nucléaire flocule et la synthèse protéique diminue. La rupture des membranes conduit à la
libération dans le milieu environnant du contenu cytoplasmique, déclenchant une réaction
inflammatoire (Allen R.T. et al., 1997).
Figure 17: Principales étapes d’altérations morphologiques de l’apoptose.
49
1.2. Caractéristiques biochimiques de l’apoptose
De nombreux changements biochimiques sont observés dans les cellules apoptotiques :
- Une fragmentation de l’ADN se produit suite à un clivage inter-nucléosomal de l’ADN en
fragments résultant de l’activation d’une endonucléase CAD/DFF40 qui coupe l’ADN entre les
nucléosomes en fragments dont la taille est de 180-200 paires de bases donnant ainsi un aspect
caractéristique en échelle sur gel d’agarose (Enari M. et al., 1998).
- Une Modification des flux calciques responsables de l’activation de nombreuses enzymes, dont
les nucléases qui induisent la fragmentation de l’ADN (Petit P.X. et al., 1997).
- Une activation des trans-glutaminases impliquées dans la réorganisation des éléments du
cytosquelette menant aux invaginations membranaires et à la formation des corps apoptotiques
(Gentile V. et al., 1992).
- Activation des Caspases (Cysteinyl aspartate specific protease): l’apoptose est irréversiblement
déclenchée par l’activation des Caspases.
- Accumulation des céramides : Les céramides peuvent réguler l’apoptose selon deux grands
mécanismes indépendants, l’un impliquant les domaines de mort et l’activation transcriptionnelle
de la voie JNK, l’autre mettant en jeu l’altération des fonctions mitochondriales.
- Génération de radicaux libres et ROS (reactive oxygen species): Plusieurs travaux ont montré
que les ROS intracellulaires interviennent aussi comme seconds messagers dans la transduction
de signaux. Certaines données suggèrent qu'elles pourraient participer à l'induction de l'apoptose.
- Une modification de la perméabilité membranaire mitochondriale, liée à une dissipation du
potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm), et la libération dans le cytoplasme de protéines
apoptogènes comme le cytochrome c.
- Perte de l’asymétrie de la membrane plasmique et externalisation de la phosphatidylsérine (PS)
depuis le feuillet interne vers le feuillet externe de la membrane. Ce phénomène d’externalisation
de la PS vers dans le feuillet externe de la membrane cellulaire apparaît tôt dans l’apoptose et
semble indépendant du type cellulaire. Un changement dans la composition et l’expression des
oligosaccharides de surface est également observé à la surface des cellules apoptotiques. Les PS
et les oligosaccharides sont reconnus par les récepteurs de la vitronectine et de la fibronectine
des macrophages lors de la phagocytose (Fadok V.A. et al., 2000).
50
2. Les principaux effecteurs de l’apoptose
2.1. Les Caspases
Les caractéristiques biochimiques et morphologiques de l’apoptose résultent de l’activation
de protéases intracellulaires spécifiques, les Caspases "Cysteinyl aspartate specific protease".
Les Caspases sont une famille de protéines effectrices de l’apoptose dont l’activation représente
un marqueur de l’apoptose. Ce sont des molécules de signalisation hautement régulées contrôlant
des processus biologiques critiques pour la cellule par le biais de protéolyses limitées et
spécifiques. Ces protéases présentent une spécificité stricte de clivage de leurs substrats après un
résidu aspartique. Toutes les Caspases ont une structure conservée et sont synthétisées sous
forme de précurseurs inactifs ou zymogènes. Les Caspases sont constituées d’un pro-domaine Nterminal de longueur variable allant de 23 à 219 acides aminés, suivi d’un domaine de 17 à 21
kDa (P20) qui deviendra après clivage la grande sous-unité et enfin d’un domaine C-terminal de
10 à 14 kDa (P10) qui constituera la petite sous-unité. La maturation protéolytique des Caspases
implique le clivage entre les deux sous unités ainsi que l’élimination du prodomaine. Petite et
grande sous unité s’assemblent pour former un hétérodimère et il faut que deux hétérodimères
s’associent pour former la Caspase active. Le rôle des Caspases est d’inactiver les voies
protectrices et d’activer les molécules qui vont participer à la destruction cellulaire (Taylor R.C.
et al., 2008). Toutes les Caspases présentent des similarités de séquence, de structure et de
substrat, aussi c’est leurs positions dans le déroulement du processus apoptotique. Les Caspases
peuvent être réparties en 3 groupes en fonction de leur structure et de leur réactivité : les
Caspases initiatrices, effectrices et activatrices de cytokines.
2.1.1. Les Caspases initiatrices :
Les Caspases -2, -8, -9, et -10 sont des Caspases initiatrices. Elles possèdent dans leur
prodomaine des séquences de recrutement spécifiques : DED (Death Effector Domain) pour les
Caspases-8 et -10 ou CARD (Caspase Recruitment Domain) pour les Caspases-9 et -2 (Hofmann
K. et al., 1997). Ces domaines permettent l’interaction avec des complexes multiprotéiques, le
DISC (Death Inducing Signaling Complex) et l’apoptosome respectivement, résultant ainsi en
l’activation de ces Caspases. Une fois activées, les Caspases initiatrices vont à leur tour activer
les Caspases dites effectrices.
51
2.1.2. Les Caspases effectrices :
Les Caspases effectrices -3, -6 et-7 se caractérisent par une région N-terminale plus courte
et sont dépourvues de domaine de recrutement. Ce sont les exécuteurs de l’apoptose. Elles
agissent en cascade et sont même capable de retro-activer des Caspases situées plus en amont
pour amplifier le processus. La Caspase-3, très majoritaire, se trouve à la tête de cette cascade
(Orth K. et al., 1996) et son activation constitue le point de non retour dans l’apoptose.
2.2. Protéines de la famille Bcl2
Le gène Bcl-2 (B cell lymphoma 2) est le prototype d’une famille de gènes qui contrôle la
mort cellulaire. L’alignement des sèquences protéiques des membres de la famille Bcl-2 a permis
d’identifier quatres régions, hautement conservées chez les mammifères, appelées domaines BH
(Bcl-2 homolgy) : BH1 à BH4. Les membres de la famille Bcl-2 sont classées en trois groupes
(Figure 18) (Tsujimoto Y. and Shimizu S., 2000) :
-
Le premier groupe rassemble les membres antiapoptotiques en particulier, Bcl-2, Bcl-xL,
Bcl-w. Ils contiennent les domaines BH1, -2, -3 et -4. Ces protéines sont présentes dans
la membrane mitochondriale externe et exercent un effet inhibiteur sur la
perméabilisation de la membrane.
-
Le deuxième groupe rassemble une partie des membres pro-apoptotiques caractérisés par
l’absence du domaine BH4 dans la séquence des protéines, en particulier Bax, Bak et
Book. Elles sont présentes dans le cytosol. En réponse à un signal apoptotique elles
s’insèrent dans la membrane mitochondriale externe en formant des oligomères et
inactivent les protéines anti-apoptotiques.
-
Un troisième groupe rassemble des membres pro-apoptotiques possédant uniquement le
domaine BH3 et présents dans le cytosol, telque : Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa et Puma. Ces
protéines agissent sur Bcl2 pour lancer l'apoptose.
52
Figure 18: Les protéines de la famille Bcl-2.
Les protéines anti-apoptotiques telleque Bcl-2 sont capables de bloquer la production des
ROS (Kane et al., 1993), de stabiliser le potentiel transmembranaire en régulant le flux de
protons (Vander Heiden et al., 1999), ou encore de moduler l’homéostasie du calcium
mitochondrial (Zhu et al., 1999). Bcl-2 préviendrait la fuite du cytochrome c en compensant le
déséquilibre ionique, probablement à l’origine de la baisse de ΔΨm, de l’ouverture des
mégapores et de la rupture de la membrane externe mitochondriale. Pour revue voir (Krishna S.
et al., 2011).
Au contraire, les protéines pro-apoptotiques telles que Bid, Bim, Bad et Bax, qui sont
présentes dans le cytoplasme, peuvent après stimulation se relocaliser majoritairement au niveau
de la membrane mitochondriale externe et provoquer directement ou indirectement la libération
du cytochrome c selon des mécanismes variés. A la suite de différents stimuli apoptotiques, Bax
subit un changement conformationnel libérant son domaine d’ancrage membranaire et se
relocalise au niveau de la membrane mitochondriale externe (Hsu et al., 1997 ; Wolter et al.,
1997 ; Suzuki et al., 2000 ; Danial et Korsmeyer, 2004 ; Kuwana et al., 2005).
2.3. Les récepteurs membranaires de la famille du TNF-α
Les cytokines membres de la famille du TNF-α ainsi que leurs récepteurs jouent un rôle
important dans l’apoptose. Seize ligands membres de la famille du TNF ont été identifiés: TNFa, FasL, les ligands similaires au TNF-a induisant l'apoptose (TRAIL), lymphotoxine a,
lymphotoxine b, CD27L, CD30L, CD40L, CD137L, OX40L. La plupart de ces ligands sont
53
synthétisés sous forme de précurseurs trans-membranaires avant que leurs domaines
extracellulaires soient clivés par des métalloprotéases. Certains de ces ligands ont un rôle
différent sur l’apoptose en fonction du type cellulaire. L’apoptose initiée par ces ligands requiert
la trimérisation des récepteurs conduisant
à l’activation des Caspases cytoplasmiques
(Longthorne V.L. and Williams G.T., 1997).
2.4. Les céramides
Les céramides sont des lipides complexes appartenant à la famille des sphingolipides. Ils
occupent une position centrale car ils sont les précurseurs d'autres sphingolipides essentiels tels
que les cérébrosides, les gangliosides et la sphingomyéline. Leurs propriétés sont nombreuses,
cependant ils ont un rôle biologique essentiel au sein de l'épiderme dans les mécanismes de
perméabilité de la peau et de cohésion cellulaire. Les céramides sont impliquées dans la
régulation de diverses réponses cellulaires, comme la prolifération, la différenciation et
l’apoptose (Perry D.K. and Hannun Y.A., 1998). Au cours du processus apoptotique, une
production de céramides intracellulaires précéde l’apparition des modifications biochimiques et
morphologiques de l’apoptose, suggérant que les céramides peuvent être impliquées dans la
transduction du signal menant à la mort cellulaire. Pour revue voir (Ponnusamy S. et al., 2010).
3. Rôle de la mitochondrie dans le processus apoptotique
La mitochondrie, organite producteur d’energie (ATP), occupe une place centrale dans le
mécanisme de l’apoptose. Son implication au cours du processus apoptotique est associée à une
transition de la perméabilité membranaire (MTP; Membrane transition permeability) et
l'effondrement du potentiel trans-membranaire mitochondrial (ΔΨm), résultant de l’ouverture de
mégapores mitochondriaux. Du fait de sa haute concentration en solutés, un gonflement
osmotique progressif de la matrice est parfois observé, dont l’aboutissement est la rupture de la
membrane externe. L’ouverture des pores est considérée comme l’étape d’intégration du signal
apoptotique et de non-retour de la cellule vers l’apoptose. La MPT peut en effet être induite
directement par de nombreux facteurs apoptotiques tels que le calcium, les ROS, un changement
de pH et Bax, une protéine pro-apoptotique de la famille des Bcl (B cell lymphoma)-2, mais
également de façon indirecte par des Caspases, des céramides et la protéine p53, capables de
moduler l’activité de protéines de la famille des Bcl-2.
Deux mécanismes pouvent expliqué la perméabilisation de la MME lors de l’apoptose. Le
premier, implique un phénomène appelé transition de perméabilité (TP) et s’accompagne
54
d’anomalies fonctionnelles mitochondriales telles qu’une réduction du potentiel de membrane
mitochondrial, un découplage de la chaîne respiratoire et la production d’anions superoxydes. Il
s’agit de l’ouverture d’un mégacanal mitochondrial ou pore de TP situé aux points de contacts
entre les membranes mitochondriales externes et internes (Green D.R. et al., 2004). L’ouverture
du pore de TP est régulée par la famille de Bcl-2. Ainsi, la protéine proapoptotique Bax est
capable de favoriser la TP (Brenner C. et al., 2000) tandis que Bcl-2 prévient l’ouverture du
pore. Le second mécanisme, qui peut expliquer la perméabilisation de la MME, implique
directement les membres de la famille de Bcl-2. Lors d’un stimulus apoptotique, les protéines
proapoptotiques telles que Bax et/ou Bak sont relocalisées au niveau de la MME pour former un
canal capable de libérer le cytochrome c. Ce processus est régulé par les autres membres de la
famille de Bcl-2. D’une part, la séquestration des protéines pro-apoptotiques par les protéines
antiapoptotiques empêche celles-ci de perméabiliser la mitochondrie (Cheng E.H. et al., 2001).
Parmi les conséquences de l’ouverture des pores mitochondriaux, la rupture du
métabolisme énergétique, la formation de radicaux libres lors du découplage de la chaîne
respiratoire, la libération de facteurs apoptotiques séquestrés dans la matrice, comme le
cytochrome c, des pro-Caspases et AIF (Apoptosis inducing factor), augmentation de la
concentration de Ca++ intracellulaire. Pour revue voir (Indran I.R. et al., 2011).
4. Les principales voies de signalisation de l’apoptose
La phase d’initiation de l’apoptose peut être déclenchée par des stimuli aussi variés que des
radiations ionisantes, une carence en facteurs de croissance, des drogues cytotoxiques, du
glucose, des acides gras, des céramides ou des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Il existe
deux grandes voies de signalisation aboutissant à la mort cellulaire par apoptose. Une voie
intrinsèque impliquant la mitochondrie et une deuxième voie extrinsèque ou voie des récepteurs
de mort mettant en jeu les récepteurs membranaires.
4.1. Voie intrinsèque :
L’apoptose peut survenir soit par une voie mitochondriale Caspase-dépendante à la suite
d’une activation directe des Caspases, soit à une voie mitochondriale Caspase-indépendante.
4.1.1. Voie mitochondriale Caspases-dépendante :
La d’apoptose dépendante des Caspases fait intervenir le cytochrome c et la protéine
Smac/DIABLO. Le cytochrome c a un rôle dans l’exécution de la mort cellulaire programmée en
55
plus de son rôle associé à la phosphorylation oxydatice comme transporteur d’électrons. Le
cytochrome c participe également à l’assemblage de l’apoptosome (Slee E.A. et al., 1999). Une
fois libéré dans le cytosol, le cytochrome c interagit avec la protéine Apaf-1 et la pro-Caspase 9
via les domaines CARD, induisant ainsi l’activation de le la Caspase-9, qui a son tour va activer
les Caspases exécutrices telle que les Caspases 3 et 7 (Figure 19). La protéine SMAC/DIABLO
participe également aux mécanismes aboutissant à l’activation en cascade des Caspases. Cette
protéine mitochondriale est libérée en réponse à un stimulus apoptotique.
4.1.2. Voie mitochondriale Caspases-indépendante
Cette voie fait intervenir une flavoprotéine l’AIF (Apoptoisis Inducing Factor) qui posséde
une double fonction de NADPH oxydase et monodéhydroascorbate réductase mitochondriale et
de facteur apoptogène. Après un stimulus apoptotique, l’AIF est libéré par la mitochondrie,
transloqué dans le noyau des cellules en apoptose et induit en coopération avec l’endonucléase
G, le clivage de l’ADN en fragments de 50 Kpb (Susin S.A. et al., 1999).
Figure 19: Voie intrinsèque de l’apoptose. D’après (Pereira W.O. et al., 2011).
4.2. Voie extrinsèque:
Une deuxième voie apoptotique induite par les récepteurs membranaires DR (death
receptors) appartenant à la superfamille des TNF-R (tumor necrosis factor receptor). Les voies
de signalisation apoptotique des récepteurs de mort conduisent à l’activation des Caspases et en
sont directement dépendantes. Les récepteurs de mort sont activés par fixation de leur ligand et
vont recruter les Caspases initiatrices (Caspases 8 et 10) et induire activation par auto-clivage. La
56
transmission du signal apoptotique de Fas passe par la formation d’un complexe multiprotéique
formé par l’agrégation des récepteurs Fas, la protéine FADD (Fas- associated death domain) et la
pro-Caspase-8 (Kischkel F.C. et al., 1995). Ce complexe est nomé DISC (Death Inducing
Signaling Complex). Suite à son auto-activation, la Caspase-8 va alors activer la Caspase-3 par
clivage, déclenchant une cascade de Caspases effectrices qui vont conduire à la mort apoptotique
de la cellule. Il existe deux types de cellules selon l’utilisation de ou non de la phase
mitochondriale en aval de Fas (Scaffidi C. et al., 1998).
Les cellules de type I seraient
indépendantes d’une activité apoptotique des mitochondries et utiliseraient uniquement une
activité directe des Caspases. Les cellules de type II seraient dépendantes de l’activation de la
voie apoptotique mitochondriale. La différence moléculaire entre les cellules de type I et II est
liée à la quantité de Pro-Caspase-8 clivée au niveau de DISC (plus importante dans les cellules
type I par rapport aux cellules type II). La protéine Bid, membre de la famille Bcl-2, constitue un
des liens entre la voie du récepteur Fas et la voie mitochondriale. Un fragment de la protéine Bid,
issu du clivage par la Caspase-8, est transféré du cytoplasme à la mitochondrie. Bid tronqué
(tBid) se lie à Bax (protéine pro-apoptotique de la famille Bcl-2) et induit son oligomérisation et
son intégration dans la membrane externe mitochondriale entrainant l’ouverture de mégapores
mitochondriaux à l’origine de la chute du potentiel trandsmembranaire mitochondriale et la
libération du cytochrme c (Figure 20). Pour revue voir (Indran I.R. et al., 2011; Pereira W.O.
and Amarante-Mendes G.P., 2011).
Figure 20: Voie extrinsèque de l’apoptose (voie des récepteurs de mort). D’après (Pereira W.O. et
al., 2011).
57
V.
Mécanismes de résistance aux médicaments anticancéreux
L’efficacité de la chimiothérapie est limitée par les phénomènes de résistance. Tous les
cancers ne sont pas également sensibles aux médicaments anticancéreux. Les cellules
cancéreuses possédent ou acquiérent la possibilité de contourner les mécanismes d’actions de
chimiothérapie. Certains types de cancers sont naturellement résistants à tous les médicaments.
D’autres sont d’abord sensibles mais développent des capacités de résistance en cours de
traitements qui deviennent moins efficaces pendant tout le long du traitement. Les différents
mécanismes impliqués dans la résistance des cellules cancéreuses soit par :
- Une diminution de pénétration dans la cellule ou influx des médicaments, il s’agit d’un
mécanisme très fréquent de résistance, en rapport avec des défauts des systèmes de transport.
- Une augmentation de la sortie de la cellule ou efflux des médicaments, due à l’expression de
transporteurs spécifiques, tels que la P-glycoprotéine et la MRP, peut provoquer aussi une
diminution du taux intracellulaire de médicaments.
- Une diminution du métabolisme activateur.
- Une augmentation du métabolisme inactivateur.
- Une augmentation de la quantité de cible intracellulaire.
- Une modification de la cible des médicaments anticancéreux, certains anti-mitotiques agissent
sur les enzymes intracellulaires de la mitose.
- Une augmentation de la réparation de l’ADN.
- Un autre mécanisme important est l’inhibition de l’apoptose chimio-induite, par modification
de la p53 et/ou des protéines de la famille Bcl2.
L'inefficacité d'un traitement peut se manifester d'emblée, traduisant une résistance
primaire, intrinsèque, de la tumeur au médicament ; elle peut survenir plus tard, au cours du
traitement, on parle de résistance secondaire ou acquise. Une résistance croisée peut être présente
vis-à-vis de molécules de modes d'action diffèrent, c'est la résistance pléiotropique = Multi Drug
Résistance = MDRI ; qui peut exister d'emblée dans les cellules néoplasiques ou résulter de la
pression exercée sur la tumeur par l'exposition antérieure aux agents anticancéreux.
1. Résistance MDR ou MultiDrug Resistance :
La résistance multiple aux agents anticancéreux (Multidrug Resistance) ou phénotype
"MDR" ou résistance pléiotropique est la faculté que possèdent certaines cellules à présenter une
résistance croisée à des agents cytotoxiques de structures différentes. Cette résistance peut
également survenir vis-à-vis de nombreuses drogues différentes auxquelles les cellules n’ont
58
jamais été exposées auparavant (Gottesman M.M. and Pastan I., 1993) et qui peuvent posséder
différents mécanismes d'action (Goldstein L.J. et al., 1989). Cette résistance s’observe
essentiellement vis-à-vis des agents anticancéreux d’origine naturelle parmi lesquels les
anthracyclines (adriamycine, daunorubicine), des alcaloïdes ou poison du fuseau mitotique
(vinblastine, vincristine), des taxanes, des épipodophyllotoxines (téniposide, étoposide) et de
l’actinomycine D. Cependant, le phénotype MDR peut être contourné in vitro grâce à
l’application d’agents modulateurs (exemple: vérapamil, la nifédipine, la quinine, le
dexvérapamil) qui bloquent l’action d’efflux des pompes membranaires en permettant ainsi
d’augmenter la concentration cellulaire de l’agent anti-cancéreux. Les applications cliniques de
la réversion de MDR restent encore expérimentales.
Les cellules résistantes "multidrogue" présentent un certain nombre de caractéristiques
bien spécifiques liées à des changements structuraux et fonctionnels au niveau de leur membrane
plasmique, du cytoplasme, des compartiments cellulaires ou du noyau. Ces caractéristiques
peuvent être dues soit à une diminution de l’accumulation intracellulaire des drogues
cytotoxiques, à des modifications de l’activité ou de l’expression de certaines protéines ou à des
modifications physiologiques de la cellule.
2. Transporteurs ABC humains impliqués dans le Phénotype MDR
La famille des transporteurs ABC est l’une des familles les plus importantes qui confère le
phénotype MDR. Plusieurs molécules de la famille des transporteurs ABC (ABC pour ATPbinding cassette), la glycoprotéine P (P pour permeability), les MRP (multi-drug resistance
associated protein) et la BCRP (breast cancer resistance protein) sont à l’origine de cet efflux.
Ces protéines présentent une remarquable conservation dans leur séquence et dans leur
organisation structurale, caractérisée par une structure en quatre domaines : deux domaines
hydrophobes, formant le site de reconnaissance du substrat, et deux domaines hydrophiles
conservés, impliqués dans l’hydrolyse de l’ATP, source d’énergie du transport.
Ces « multidrug transporters » sont surexprimées dans de nombreuses cellules tumorales et
sont responsable de l’efflux des drogues hors de ces cellules, provoquant une diminution de la
quantité
intracellulaire de drogues. Ainsi, la concentration intracellulaire des agents
anticancéreux est maintenue en deçà des seuils de cytotoxicité (Baggetto L.G., 1997; Dalton
W.S. et al., 1989). Ces protéines sont également impliquées dans le transport d’un grand nombre
de substances biologiques parmi lesquelles, les peptides, les sucres, les hormones, mais
59
également de substances toxiques comme les médicaments. Ces protéines membranaires
s’expriment dans les tissus sains et sont surexprimés dans les tissus malins.
Les données actuelles indiquent que 48 gènes codant pour des transporteurs ABC ont été
identifiés et divisés en 7 sous-familles de transporteurs ABC (ABCA à ABCG) en fonction des
homologies de séquence et de l’organisation des différents domaines (Dean M. et al., 2001). La
structure minimale d’une protéine ABC est composée d’un site de liaison de l’ATP (ATPbinding cassette) de 200 à 250 acides aminés, et de six domaines hydrophobes
transmembranaires (comme la BCRP). La structure habituellement rencontrée est un
redoublement de cette structure minimale (deux sites ATP et 12 sites transmembranaires :
comme la P-gp), et quelques membres de cette famille possèdent, en plus, cinq domaines
transmembranaires et une terminaison azotée externe (comme MRP1) (Figure 21).
Figure 21: Structure des protéines ABC. D’après (Marie J.P. et al., 2004 ). BCRP : breast cancer
resistance protein ; MRP: multidrug resistance associated protein.
2.1. La glycoprotéine P (P-gp)
Parmi les transporteurs ABC impliqués dans la MDR, la P-glycoprotéine est le premier
transporteur responsable de l’efflux de drogues identifié dans des cellules tumorales résistantes.
Elle est définie comme étant le principal élément responsable de l’induction d’une résistance
pléïotropique aux agents anticancéreux (Ambudkar S.V. et al., 2003). La P-gp humaine, d’un
poids moléculaire de 170 KDa, est une protéine transmembranaire glycosylée de 1280 acides
aminés (Juliano R.L. and Ling V., 1976). Sa structure est caractérisée par la répétition de deux
moitiés homologues unies par une région « linker ». Chaque moitié comprend une région
hydrophobe réalisant 6 passages transmembranaires successifs et un vaste domaine
cytoplasmique hydrophile qui contient le site actif de liaison à l’ATP (Walker J.E. et al., 1982).
60
La famille des gènes MDR ou (ABCB1) codant pour les Pgps, appartient à trois classes
différentes. Les classes 1 et 2 se composent de Pgps impliquées dans le transport des
cytostatiques telles que le gène MDR1 humain (Chen C.J. et al., 1986). La classe 3 inclut les
gènes, non impliquées dans le transport des cytostatiques tels que MDR2 humain (Buschman E.
et al., 1992). La surexpression des P-gp des classes I et II est capable de conférer le phénotype
MDR. Contrairement à la surexpression des gènes de classe III ne confèrent pas de résistance
aux agents anticancéreux (Choi K. et al., 1991).
Certaines tumeurs présentent des taux naturellement élevés de glycoprotéine P:
côlon, pancréas, sein, hépatocarcinomes. D'autres expriment des taux initialement faibles
qui augmentent en cours des traitements: estomac, sein, ovaire, poumon, sarcomes,
lymphomes. L’une des caractéristiques de la Pgp est sa grande variété de substrats. Elle est
capable de transporter des drogues ayant des structures très diverses tant du point de vue
structure chimique et masse moléculaire, et mécanisme d’action. Parmi substrats transportés par
la P-gp : Vinca-alcaloïdes (Vinblastine, Vincristine) ; Anthracyclines (Doxorubicine,
Daunorubicine, Epirubicine) ; Epipodophyllotoxines (Etoposide, Teniposide) ; Paclitaxel ;
Actinomycine D ; Topotécan ; Mitomycine C, Mitoxantrone ; Colchicine ; Bromure d’éthidium ;
Puromycine.
2.2. MRP (Multidrug resistance associated protein) ou ABCC :
Un second type de protéine capable de transporter des drogues a été découvert, les MRP
qui appartiennent à la superfamille des transporteurs ABC (Cole S.P.C. et al., 1992). Il existe 13
membres de la famille MRP ou ABCC, dont 4 codes pour des protéines inactives, ont une faible
homologie avec la P-gp. Les MRP se situe au niveau du réticulum endoplasmique et de
l’appareil de Golgi avec une faible localisation au niveau de la membrane plasmique et sont
capables d’effluer les cytostatiques de la cellule en présence de glutathion (Flens M.J. et al.,
1994). La MRP1, de masse moléculaire 190 kDa, appartient à la superfamille des transporteurs
membranaires ABC (ABCC1), ayant une structure similaire à celle de la P-gp (Zaman G.J. et al.,
1994). Le spectre de chimiorésistance dû aux protéines P-gp et MRP1 est remarquablement
similaire (Cole S.P.C. et al., 1992). La MRP1 est capable d’induire une chimiorésistance aux
anthracyclines (doxorubicine et daunorubicine), aux alcaloïdes (vincristine et vinblastine) (Paul
S. et al., 1996) et aux épipodophyllotoxines (étoposide et téniposide) (Kuwano M. et al., 1999) et
au méthotrexate (Borst P. et al., 2000). La MRP3 est aussi un transporteur membranaire
61
impliqué dans la résistance notamment à l’étoposide, la vincristine et le méthotrexate (Kool M.
et al., 1999). BCRP (Breast Cancer resistance Protein) ou ABCG2
Le gène BCRP (ABCG2) qui code pour une protéine de 72,1KDa, est distribuée d’une
façon discontinue et prédominante au niveau de la membrane plasmique, ce qui renforce son
action comme pompe membranaire responsable de l’efflux des agents anticancéreux (Rocch E. et
al., 2000). Isolée comme une protéine ABC spécifique du placenta (ABC « P »), elle a aussi été
retrouvée dans une lignée de tumeur mammaire (MCF7) multirésistante n’exprimant pas de P-gp
et MRP1, et dans des lignées de cancer du côlon résistante à la mitoxantrone (Abbott B.L. and
2003). La BCRP peut transporter plusieurs substrats. Elle efflue préférentiellement la
mitoxantrone, mais aussi les anthracyclines, le bisanthrène et le topotécan. Elle est exprimée
dans les cancers du sein, du colon et de l’estomac (Ross D.D. et al., 1999).
62
VI.
Objectifs de la thèse
Actuellement, les différentes formes de cancer représentent un fléau majeur. La lutte
contre les différentes formes de cancer porte sur la recherche d’agents anticancéreux plus
efficaces et plus spécifiques potentiels, en provenance de toutes les sources aussi bien naturelles
que synthétiques; et
sur une meilleure conception du traitement. Ce qui fait l’objet d’un
gigantesque effort de recherche à l’échelle mondiale.
Le travail présenté dans cette thèse s’inscrit dans le cadre de la valorisation des plantes
médicinales Marocaines et la recherche de nouvelles molécules anticancéreuses. L’objectif de ce
travail a été la recherche et identification de molécules issues de plantes utilisées en médecine
traditionnelle, capable d’inhiber la croissance des cellules du cancer du col de l’utérus. Aussi,
l’étude du mécanisme d’action de ces molécules par évaluation de l’effet inhibiteur de l’activité
télomérase et induction de l’apoptose.
Nous avons donc étudié l'activité cytotoxique in vitro, des extraits méthanoliques de sept
plantes, connues pour leur utilisation en médecine traditionnelle à savoir : Inula viscosa L. ;
Retama monosperma L., Ormenis mixta L., Ormenis eriolepis Coss., Rhamnus lycioides L.,
Berberis hispanica Boiss. et Urginea maritima L.
Le mécanisme d’action des extraits des deux plantes (Retama monosperma L. et Inula
viscosa L.), ayant montré des activités cytotoxiques importantes, a été exploré. Ainsi, nous avons
étudié leurs effets sur l’activité télomèrase grâce au test TRAP (Telomere Repeat Amplification
Protocol). L’apoptose induite par ces extraits a été évaluée grâce au marquage avec le Hoechst
33342 et la microscopie de fluorescence ; au suivi d’événements mitochondriaux tels que la
modification du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨ) et la production d’espèces actives de
l’oxygène (ROS).
Parralémement, nous nous somme intéressés à l’étude de statut MDR des extraits les plus
actifs, en évaluant leurs effets cytotoxiques vis-à-vis de lignées cellulaires résistantes à la
chimiothérapie anticancéreuse.
La dernière partie à été axée sur fractionnement bio-guidé de l’extrait héxanique d’Inula
viscosa, ainsi que l’évaluation de l’effet cytotoxique des différentes fractions, suivie de l’étude
du mécanisme d’action du produit purifié le plus actif.
63
Matériel
& méthodes
Matériel & Méthodes
1. Préparation des extraits de plantes :
1.1. Extraction par macération :
Les plantes sélectionnées pour cette étude ont été collectées dans leur habitat naturel à
différents endroits pendant la période de Mars-Avril (voir Tableau 2). La détermination
botanique des espèces a été réalisée par le Pr. M. FENNANE de l’Institut Scientifique de Rabat.
Les parties récoltées ont ensuite été séchées à l’abri de la lumière du soleil. Les poudres des
différentes plantes ont été soumise à l’extraction par macération dans du méthanol. Les extraits
récupérés sont évaporés à sec sous pression réduite, obtenant ainsi des résidus sirupeux.
1.2. Extraction par soxhlet :
-
Préparation des extraits d’Inula viscosa L.
La poudre sèche d’Inula viscosa L. (180 g) a été extraite au soxhlet en utilisant des
solvants de polarité croissante, successivement au n-hexane (1,3 L) et au méthanol (1,3 L). Les
extraits obtenus sont évaporés à sec sous pression réduite à l’aide d’un rotavapeur. L’extrait
méthanolique (IV-ME, 23.2g) a été soumis ensuite à des partitions liquide-liquide successives en
présence de dichloromethane et d’acétate d’éthyle (Figure 22). Après séchage sous pression
réduite, l’extrait hexanique (IV-HE, 22g), dichloromethane (IV-DF, 10,7g) et l’extrait acétate
d’éthyle (IV-AF, 8,3g) sont obtenus et conservés à – 20°C jusqu’à leurs utilisation.
-
Préparation des extraits de Retama monosperma L .
La poudre sèche de Retama monosperma L. (200 g) a été extraite au soxhlet, en utilisant
des solvants à différentes de polarité, successivement au n-hexane (1,3 L) et au méthanol (1,3
L). Les extraits obtenus sont évaporés à sec sous pression réduite à l’aide d’un rotavapeur.
L’extrait méthanolique Rm-ME (14,3g) a été soumis ensuite à des partitions liquide-liquide
successives en présence de dichloromethane et d’acétate d’éthyle (Figure 22). Après séchage
sous pression réduite, les extraits hexanique (Rm-HE, 5g), dichloromethane (Rm-DF, 6,6g ) et
l’extrait acétate d’éthyle (Rm-AF, 2,6g ) sont obtenus et conservés à – 20°C jusqu’à leurs
utilisation.
64
Poudre de plantes
Inula viscosa L. / Retama monosperma. L.
Hexane (1,3L)
Extraction au Soxhlet
Extrait Hexanique
Résidu de plante
Méthanol
(1,3L)
Extraction au Soxhlet
Extrait methanolique
Résidu
Départition
H2O
Dichloromethane x3
(CH2Cl2)
Extrait Dichlorométhane
Phase polaire
Ethyl acetate x 3
(EtOAc)
Extrait Acétate Ethyle
Phase polaire
Figure 22: Protocole d’extraction par soxhlet des plantes: Inula viscosa L. (Ait.) et Retama
monosperma L. Boiss.
65
Tableau 2: Données ethnobotaniques et pharmacologiques des plantes récoltées.
Noms des plantes (famille)
Inula viscosa Ait.
= Dittrichia viscosa L.
(Astéracées)
Retama monosperma L.
= Genista monosperma
(Fabacées)
Berberis hispanica Bois. et
Reut.
Nom
vernaculaire
Lieu de récolte
MagramaneTerhala
Ain atik Région
de Temara
R’tm
Sidi – boughaba
Mahdia -
Argis –
Azargnat
Partie
récoltée
Usage traditionnel
Activités pharmacologiques rapportées
Partie
aérienne
Utilisée en cataplasme pour traiter les abcès, la gale, dermatoses,
impétigo, furoncles, des ulcères et comme cicatrisant des plaies
cutanées (Hmamouchi M., 2001).
Traitement des infections respiratoires, bronchiques, tuberculose,
anémie, de la pression artérielle et diabète (Bellakhdar J., 1997).
activité anti-inflammatoire (Hernandez V. et al., 2007;
Manez S. et al., 2007).
activité antimicrobienne (Maoz M. and Neeman I., 1998).
activité antifungique (Cafarchia C. et al., 2002).
activité antitumorale (Rozenblat S. et al., 2008).
Feuilles
activité antimicrobienne (Ai-Rong L. et al., 2007;
Meenakshi S. and Srivastava S., 2007).
activité anti-inflammatoire (Fukuda K. et al., 1999).
activité antitumorale (Fukuda K. et al., 1999; Meenakshi
S. and Srivastava S., 2007).
Ecorces
de racines
Hellala
Ouarzazat
Partie
aérienne
Utilisée en décoction comme stomachique, emménagogue et
vermifuge.
Employés comme tonique gastro-intestinal, sudorifique et
antidiabétique.
Hellala
Sidi – boughaba
Mahdia -
Partie
aérienne
Assèche les boutons et comme cicatrisant des blessures
(Haddad P.S. et al., 2003).
activité antimicrobienne (Satrani B. et al., 2007).
Sidi – boughaba
Mahdia -
Feuilles
Utilisée comme laxatif, et contre les affections hépatiques
(Hmamouchi M., 2001).
activité hypotensive (Terencio M.C. et al., 1990).
El- harsa
Ansal – Baslet
el dib
Sidi – boughaba
Mahdia -
utilisée par voie orale ou en fumigation comme abortif
(Hmamouchi M., 2001) utilisée contre la toux et la
bronchite, en traitements de la jaunisse et comme
diurétique (Bellakhdar J., 1997).
activité cytotoxique et antimalaria (Sathiyamoorthy
P. et al., 1999).
Ormenis eriolepis Maire.
(Astéracées)
Ormenis mixta L.
(Astéracées)
Rhamnus lycioides ssp. Oleoides
(Rhamnacées)
(Lemnacées)
Traitements des affections oculaires, des atonies gastrointestinales et des désordres hépatiques (Bellakhdar J., 1997)
Les plantes du genre berberis sont utilisées pour leur activité
antitumorale par certains herboristes.
ND
Tamahdit- prés de
la région d’Azrou
(Berbéridacées)
Urginea maritima L.
Employée en friction dans le prurit , la gale humaine et
animale, et comme purgatif et vermifuge (Bellakhdar J., 1997).
utilisée comme abortif (Benrahmoune I.Z., 2003).
Bulbes
activité antibactrial (El Hanbali F. et al., 2004).
activité antileishmania (El Hanbali F. et al., 2005).
activité antifungique (Amani H. et al., 2008.).
66
2. Effecteurs pharmacologiques :
-
Vinblastine :
La vinblastine est un agent antimitotique de la classe des vinca-alcaloïdes, extraite de la
pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus). C'est un poison du fuseau mitotique qui inhibe
la polymérisation de la tubuline en microtubules, ce qui bloque la division cellulaire et provoque
donc la mort de la cellule (Gigant et al., 2005).
-
Doxorubicine :
La doxorubicine ou adriamycine est un antibiotique de la famille des anthracyclines. Elle
est obtenue par fermentation chez différents micro-organismes appartenant au genre
Streptomyces (Arcamone F. et al., 1997). Elle exerce l’essentiel de son action en s’intercalant
entre deux bases (G-C) d’ADN, ce qui provoque une distorsion de l’hélice (Koehn H. et al.,
2007), et en interagissant avec la topoisomérase II entraînant ainsi une inhibition de la synthèse
d’ADN (Anderson D. et al., 1997).
-
Etoposide ou VP-16:
L’étoposide est un dérivé hémisynthétique de la podophyllotoxine, molécule naturelle
extraite de la racine de mangadore (podophyllum peltatum). Possédant de forte propriétés
anticancéreuses, l’étoposide se lie à la topoisomerase II inhibant ainsi sa fonction dans la ligature
des molécules d’ADN clivé, inhibe le réplication de l’ADN et la transcription, provoque une
mort cellulaire par apoptose, et agit principalement dans les phases G2 et S du cycle cellulaire
(Baldwin E.L. et al., 2005).
-
Mitoxantrone :
La mitoxantrone (Sigma) est un inhibiteur de la topoisomerase II (Crespi M.D. et al.,
1986) qui appartient à la famille des anthracenediones. La solution mère est préparée à une
concentration de 5 10-2 M et stockée à –20°C. La préparation des différentes concentrations
utilisées sur les cultures cellulaires est obtenue par des dilutions extemporanées de cette solution
mère dans du milieu de culture.
67
-
12459 :
Le 12459 (dérivé du 2,4,6-triamino-1,3,5 triazine) a été synthétisé par Aventis- Pharma
S.A.. Le 12459 est un inhibiteur efficace de l’activité télomérase in vitro. Ce dérivé induit à
faible concentration et à long terme la sénescence associée à une dégradation du télomère, et une
apoptose à forte concentration et à court terme (Riou et al., 2002).
3. Culture cellulaire :
3.1. Lignées cellulaires et conditions de culture:
- Cellules HeLa :
HeLa (ATCC N°CCL-2.2), sont des cellules de type épithélial porteuses du virus HPV de
sous type 18, avec une expression faible de p53 et niveau d’expression normal de pRB. Cette
lignée cellulaire a été fournie par le Dr. P. Coursaget, INSERM U618, University François
Rabelais, Tours, France.
-
Cellules SiHa :
SiHa (ATCC N° HTB-35), cellules épithéliales adhérentes, porteuses du virus HPV 16 (1
à 2 copies par cellule) et sont p53 et pRB positive. Cette lignée cellulaire a été fournie par le Dr.
P. Coursaget, INSERM U618, University François Rabelais, Tours, France.
-
Cellules MCF-7 :
La lignée MCF-7 a été établie à partir d’un adénocarcinome mammaire métastatique. Les
lignées résistantes MCF-7/DOX et MCF-7/VP résistantes à la doxorubicine (DOX) et à
l’étoposide (VP16) respectivement, ont été établies à partir de la lignée parentale MCF7, par
exposition continue des cellules à des concentrations croissantes de Doxorubicine et de
Etoposide (VP16), respectivement (Fairchild C. R. et al., 1987; Schneider et al., 1994). Les
deux lignées résistantes ont été fournies par le Professeur J. Robert (Université de Bordeaux).
-
Cellules 2008 :
La lignée cellulaire 2008 provient d’un carcinome ovarien humain. La lignée 2008/MRP1
et 2008/ MRP3 sont des cellules résistantes établie par transfection par des séquences codantes
pour la MRP1(Naredi P. et al., 1994) et MRP3 (Scheffer G. L. et al., 2000), respectivement. La
68
lignée cellulaire 2008/MRP1 a été fournie par le Prof. P. Borst (Netherlands Cancer Institute,
Amsterdam, The Netherlands).
-
Lignées HEK293 :
La lignée HEK293 provient de cellules embryonnaires de rein humain. La lignée HEK293
surexprimant la BCRP a été établies par une transfection avec un vecteur pcDNA3 contenant
l’ADNc de la BCRP (Robey R.W. et al., 2003). Ces lignées ont été fournies par le Dr. Robey
RW (National Institutes of Health, Bethesda).
-
Cellules LR73 :
La lignée cellulaire LR73 provient d’un cancer ovarien d’hamster chinois. La résistance de
la lignée LR73/Pgp a été induite par transfection des cellules parentales sensibles par l’ADN
complémentaire (ADNc) du gène mdr1 (Gros P. et al., 1989; Schurr E. et al., 1989). Ces lignées
ont été fournies par le Dr. Gros P. (Faculty of Medicine, McGill University, Montreal, Canada).
-
Cellules MRC5:
MRC5 (ATCC CCL-171) est une lignée cellulaire adhérente fibroblastique normale de
poumon. La lignée cellulaire MRC5/V1 de phénotype ALT dérive de la lignée de fibroblastes
pulmonaires normaux MRC5 qui ont été immortalisés par l’antigène T de SV40 (Taylor L.M. et
al., 2004; Temime-Smaali N. et al., 2008). Ces deux lignées ont été fournies par Pr. JeanFrançois Riou et Pr. Chantal Trentesaux (MNHN, INSERM U565, CNRS UMR 7196, 75005
Paris, France).
3.2. Entretien des cellules et conditions de culture
Les cellules sont cultivées dans un milieu de culture approprié à chaque lignée. Toutes
les manipulations sont effectuées stérilement sous une hotte à flux laminaire vertical. Les lignées
cellulaires SiHa, HeLa, 2008, 2008/MRP1, 2008/MRP3, sont cultivées dans du milieu MEM
(GIBCO). Les autres lignées cellulaires à savoir MCF7, MCF7/DOX, MCF7/VP sont cultivées
en présence de RPMI et les cellules HEK293 et HEK293/BCRP sont cultivées en présence de
DMEM (GIBCO). Chaque milieu est complémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF)
(GIBCO), préalablement décomplémenté (30 min à 56°C) et un mélange d’antibiotiques
Pénicilline/Streptomycine /Neomycine (GIBCO). Les lignées cellulaires sont maintenues à 37°C
dans une atmosphère saturée en humidité et contenant 5% de CO2.
69
Les cellules sont cultivées en monocouches, au bout de trois jours les cellules sont
observées au microscope inversé à contraste de phase. Lorsque les cellules atteignent un état de
croissance subconfluent, le milieu de culture est aspiré puis les cellules sont lavées avec deux
fois avec du PBS. Les cellules sont ensuite détachées à l’aide de 500 μL de trypsine /EDTA
(Invitrogen) pendant 5 minutes à 37°C et reprises dans 10mL de milieu de culture neuf. Les
cellules sont ensuite énumérées à l’aide d’un hématimètre de Malassez ou cellules de Kova
(Kova® Glasstic® slide, Hycor Biomedical Inc.). Leur viabilité est évaluée par la méthode
d’exclusion au bleu trypan.
3.3. Viabilité cellulaire :
Afin d’estimer la viabilité cellulaire, nous avons effectué un test d’exclusion au bleu
trypan. Ce test est basé sur la capacité des cellules vivantes à exclure les colorants de haut poids
moléculaire. Le bleu trypan (0,4% en PBS) (Sigma-Aldrich) est ajouté à la suspension cellulaire.
La numération est effectuée sur des lames de comptage : lame de Mallassez ou bien lame de
Kova. Le bleu Trypan est activement exclu des cellules vivantes alors qu’il pénètre dans le
cytoplasme des cellules mortes. En microscopie optique, les cellules mortes sont colorées en bleu
alors que les cellules vivantes restent incolores (Bhuyan B. K. et al., 1976).
3.4. Conservation des cellules :
Les cellules en phase exponentielle de croissance sont détachées par de la trypsine –EDTA,
lavées au PBS et centrifugées à 1500 rpm pendant 15 min à 4°C. Le culot cellulaire obtenu est
remis en suspension dans du milieu froid contenant : MEM additionné de 20% de SVF et 10% de
DMSO stérile, à raison de 1.106 cellules/mL. Les cellules sont réparties dans des cryotubes de
1mL. Ces derniers sont mis dans la boite de congélation progressive afin de permettre un
refroidissement progressif, et mis dans le -80°C. Après 24 h, ces tubes sont stockés soit
directement à -80°C, soit dans l’azote liquide.
4. Evaluation de la cytotoxicité in vitro des extraits :
Les extraits obtenus sont solubilisés dans le diméthyl sulfonide (DMSO) avant d'être
incorporés dans le milieu complet. La concentration finale du DMSO dans les différentes
solutions est inférieure à 0.01%. Une série de dilutions des extraits est effectuée avec le milieu
de culture,
afin d'évaluer les différents extraits
à des concentrations croissantes. Pour
l’évaluation des extraits bruts obtenus par macération dans du méthanol. Les extraits sont testés à
70
des concentrations variant de 500 à 12,5µg/ml, et pour les extraits obtenus à l’aide du Soxhlet,
les concentrations testées varient de 80 à 5 µg/ml.

Test MTT :
Les méthodes les plus largement utilisées et les plus adaptées pour la mesure de la
prolifération et de la viabilité cellulaire, dans le cadre d'un criblage anti-tumoral de nouvelles
drogues, sont celles qui utilisent les sels de tétrazolium. Pour cette étude nous avons utilisé la
technique du MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide), méthode
colorimétrique appliquée pour la quantification de la prolifération cellulaire (Carmichael J. et al.,
1987; Mosmann T., 1983). Ce test repose sur la biotransformation du MTT en cristaux de
formazan par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes. L’absorbance de la
solution sera alors quantifiée au spectrophotomètre à 550 nm. Les valeurs de densité optique
(DO) sont directement corrélées aux concentrations de MTT intracellulaire métabolisé et sont
donc proportionnelles au nombre de cellules vivantes.
-
Protocole :
Les cellules sont ensemencées dans des plaques de 96 puits selon la densité appropriée à
chaque lignée et cultivées pendant 24 h à 37°C. Après incubation, les extraits à tester sont
déposés à différentes concentrations en duplicate dans les puits. Les plaques sont ensuite mises
pour incubation pendant 48 ou 72h à 37°C. 4 heures avant la fin de l’incubation, 10 µl d’une
solution de MTT (5 mg/ml) sont ajoutés dans les puits. Les plaques sont mises à incuber pendant
4 heures à 37°C, 5% de CO2. La formation des cristaux bleus de formazan est visualisée au
microscope optique. Le milieu de culture est éliminé et un même volume de DMSO (Sigma) est
ajouté dans chaque puits. La plaque est alors soumise à une agitation douce permettant la
dissolution des cristaux de formazan. L'absorbance est déterminée à 570nm dans un lecteur de
microplaques et les résultats sont exprimés en pourcentage de viabilité des cellules traitées par
rapport à celles non traitées. Les cellules non traitées sont considérées comme témoin avec un
pourcentage de viabilité de 100%. L'indice de cytotoxicité est calculé à l'aide de la formule
suivante:
%IC = (1- (T/C)) x 100.
T et C : moyenne des densités optiques des fractions testées et
des contrôle.
71
5. Statut Multidrug-Resistance :
Pour l’étude du statut Multidrug-Resistance des extraits les plus actifs, nous avons utilisé
les lignées cellulaires sensibles et résistantes à un anticancéreux tel que la doxorubicine et
l’étopiside.

La Lignée cellulaire de carcinome mammaire humain MCF7 ainsi que leurs homologues
résistantes à la chimiothérapie: MCF7/DOX exprimant la protéine Pgp (P-glycoprotéine)
et résistantes à la doxoribicine et MCF7/VP16 exprimant la protéine MRP1 (MultidrugResistance associated Protein) et résistantes à l’étoposide.

La lignée cellulaire 2008 provenant d’un carcinome ovarien humain et leurs homologues
résistantes 2008/MRP1 et
2008/MRP3, exprimant les protéines MRP1 et MRP3
respectivement.

La lignée HEK293 provenant de cellules embryonnaires de rein humain, ainsi que son
homologue HEK293/BCRP, transfectée par le gène exprimant la BCRP.

La Lignée LR73 provenant d’un cancer ovarien d’hamster chinois et son homologue
résistante à la Doxorubicine par transfection (LR73/Pgp).
La résistance des cellules vis-à-vis d’un agent cytotoxique est évaluée par un index de
résistance (IR), c’est le rapport de IC50 de la lignée résistante / IC50 lignées sensible. L’IC50 est
la concentration de l’agent pharmacologique induisant une inhibition de croissance de 50%.
-
Protocole :
Les cellules des différentes lignées, en phase exponentielle de croissance sont ensemencées
dans des microplaques de 96 puits à une densité de 5000 cellules par puit dans un volume de 100
μL. Après 24 heures d’adhérence, les cellules sont exposées à différentes concentrations des
produits à tester dilués dans le milieu de culture. Les plaques sont ensuite remises en culture à
37°C pendant 72h. Un test MTT est ensuite réalisé afin de déterminer la cytotoxicité des agents
pharmacologiques et des extraits de plantes. Des courbes d’inhibition de croissance sont tracées
(% de viabilité cellulaire en fonction des concentrations des produits). Ainsi la concentration qui
induit 50% d’inhibition de croissance (IC50) peut être déterminée par extrapolation.
72
6. Etude du mécanisme d’action des extraits et des molécules
purifiées
6.1. Détermination de l’activité télomérase par test TRAP:
-
Principe:
Le test TRAP est utilisé dans le but de déterminer in vitro l’activité de la télomérase dans
des tissus ou dans des extraits cellulaires (Cathers B.E. et al., 1999). Il comporte deux réactions
successives, une extension d’un oligonucléotide TS par la télomérase, puis une amplification
PCR des séquences télomériques produites par PCR à l’aide des amorces CX externe et TS,
servant respectivement d’amorce antisens et d’amorce sens. L’ajout d’extrait protéique contenant
la télomérase va permettre à cette enzyme d’allonger l’oligonucléotide TS, en ajoutant à chaque
cycle de PCR une séquence TTAGGG. Après migration en gel d’acrylamide, on obtient une
échelle d’ADN, chaque bande étant caractérisée par l’ajout d’une séquence répétée de TTAGGG.
Le milieu réactionnel contient également un autre couple d’oligonucléotides TS et NT capable
d’amplifier une 3ème amorce TSNT. L’amplification du TSNT correspond au contrôle interne de
PCR (ITAS) (Krupp G. et al., 1997), qui lorsqu’il est inhibé, correspond à une inhibition de la
Taq polymérase et non pas de la télomérase (Figure 23).
Figure 23 : Schéma des produits de PCR issus d’une analyse TRAP.
La télomérase ajoute des répétitions d’hexamères télomériques sur l’amorce TS. Les produits
issus de l’activité de la télomérase sont amplifiés par PCR à l’aide d’une seconde amorce
(CXext). Cependant, au niveau de la réaction de PCR, peuvent être obtenus des fragments
d’élongation non désirés ainsi que la dimérisation des amorces TS+CXext.
73

Préparation des extraits cellulaires
Les cellules HeLa et SiHa (1 x 106 cellules) sont traitées par les extraits, ayant présentées
un effet cytotoxique important à savoir l’extrait dichloromethane de Retama monosperma L. et
les extraits hexane et dichloromethane de Inula viscosa L., pendant 48h de traitement. Les
cellules sont scrapées et lavées avec du PBS, puis centrifugées pendant 10 minutes à 1500 rpm.
Le culot cellulaire est remis en suspension dans 200µl du tampon de lyse CHAPS (CHAPS 0,5
%, MgCl2 1 mM, EDTA 1 mM, Benzamidine 0,1 mM, β-mercaptoéthanol 5 mM, glycérol 10 %,
Tris-HCl pH 7.5 10 mM) pendant 30 minutes dans la glace. Le lysat cellulaire est ensuite soumis
à une centrifugation pendant 20 minutes à 4°C et à 14000 g. Le surnageant constitue l’extrait
cellulaire. La concentration protéique est déterminée sur un aliquot par la méthode de Bradford.
Les extraits sont conservés à -20°C.

Dosage des extraits protéiques
La concentration protéique des échantillons est déterminée par dosage colorimétrique
selon la méthode de Bradford qui est basée sur le changement de longueur d’onde d’absorbance,
se manifestant par le changement de la couleur d’un colorant, le bleu de Coomassie, après liaison
avec l’arginine et les résidus hydrophobes des acides aminés présent dans la ou les protéines. Le
changement d’absorbance est proportionnel à la quantité de colorant lié, indiquant donc la
concentration en protéines de l’échantillon. La concentration de protéines des échantillons est
calculée par rapport à une droite d'étalonnage réalisée à partir d'une solution de sérum albumine
bovine (SAB) dont la concentration est connue.
Brièvement, 800 μl de solution protéique diluée environ 1000 fois sont ajoutés à 200 μl de
réactif de Bradford (Biorad Protein Assay, BIO-RAD). L’absorbance de la solution est mesurée à
595 nm. On détermine alors la quantité de protéines contenue dans 1 ml de lysat en se référant à
la courbe de calibration réalisée à partir d’une solution étalon (1 à 10 μg / mL) de Sérum
Albumine Bovine (Sigma).

Test TRAP
Les réactions sont réalisées dans un milieu réactionnel de 50 μL composé de: Tris- HCl pH
8.0 20 mM, dNTP 50 μM, MgCl2 15 mM, KCl 63 mM, EGTA 1 mM, Tween 20 0,05 %, BSA
20 μg/mL, primers TS et CX ext 150ng, primer NT 50 ng, TSNT 10-18M, Taq polymérase 2,5
unités et des quantités variables en protéines totales. L’incubation est réalisée dans un appareil
74
Eppendorf Mastercycler selon les cycles suivants : 15 minutes à 30°C, 1 minute à 90°C, puis 30
cycles de 30 secondes à 92°C, 30 secondes à 50°C et 30 secondes à 72°C, suivis d’un cycle
terminal de 1 minute 30 secondes à 72°C et d’une incubation finale à 4°C. Les produits de la
PCR sont soumis à une électrophorèse verticale sur d’acrylamide/bisacrylamide (19 :1) à 12 % .
Un tampon de charge (sucrose 20 %, TBE 6X, bleu de bromophénol 0,2 %, xylène cyanole) est
ajouté aux échantillons. Des aliquots de 15 μL sont déposé et soumis à migration à 200 V
pendant 45 minutes. Ensuite le gel est coloré dans une solution de TBE 1X (50 mL) additionné
de 5μL de SYBR Green I (Invitrogene). Le gel est ensuite scané par le Typhoon (Amersham
Biosciences, Orsay, Ulis).
Les séquences nucléotidiques des amorces utilisées dans le test TRAP :
Amorces
TS
CX ext
NT
TSNT
Séquences
5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’
5’-GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3’
5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’
5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’
6.2. Expérience d’hybridation du simple brin télomérique
-
Principe :
Ce test d’hybridation en solution non dénaturante est utilisé dans le but de mesurer la taille
du simple brin (Gomez D. et al., 2003). Cette technique est basée sur l’hybridation d’une sonde
brin C (5’-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA-3’) radiomarquée sur la partie simple
brin télomérique. La taille du télomère peut être évaluée après migration dans un gel d’agarose
0,8% en présence d’un marqueur de poids moléculaire. Plus le simple brin est long, plus le
nombre de brin C peut s’hybrider et plus fort serra le marquage. Si le simple brin est raccourci
suite à l’inhibition de la télomérase par les extraits de plantes, la quantité de sonde fixée sera
diminuée.
-
Protocole :

Préparation de la sonde brin C radiomarquée :
La sonde radiomarquée est préparée en incubant, pendant 1 heure à 37°C, 20 pmol
d’oligonucléotides brin C ; 80μCi de γ[32P] ATP ; et 1μl de T4 PNK (polynucleotide kinase). La
75
réaction est réalisée dans un volume final de 30μl de T4 PNK 1X (70 mM Tris-HCl ; 10 mM
MgCl2 ; 5 mM dithiothreitol ; pH 7.6 à 25°C). Les amorces radiomarquées sont ensuite purifiées
sur colonnes Quiagen (nucleotide removal kit).

Préparation des ADN
5.106 cellules SiHa et HeLa sont trypsinées, lavées deux fois au PBS et sédimentées par
centrifugation à 1000xg pendant 5 min. Les ADN sont extraits à partir de colonnes Qiagen
(DNA extraction kit), puis quantifiés par spectrophotométrie. Les concentrations sont ensuite
évaluées par migration de 5μl de suspension d’ADN dans un gel d’agarose 0,8%. Le gel est
scanné au Typhoon et les ADN sont quantifiés, ce qui permet un réajustement des volumes
d’échantillons pour travailler à concentrations constantes.

Hybridation :
L’hybridation est réalisée dans un volume final de 30μl de tampon 2 NEB 1X (50 mM
NaCl ; 10 mM Tris-HCl ; 10 mM MgCl2 ; 1 mM dithiothreitol ; pH 7.9 à 25°C) ou de tampon
d’hybridation (50mM NaCl, 10mM tris HCl pH 8 ; 1mM EDTA). 3μg d’ADN précédemment
extrait sont incubés à 50°C pendant 12 heures en présence de 0,5 pmol de sonde brin C.
radiomarquée. Les échantillons sont séparés par migration sur un gel d’agarose 0,8% dans du
TBE 1X contenant 0,01% de bromure d’éthidium, pendant 1h30 à 80V. Le gel est séché sur du
papier filtre Whatman pendant 30 min à 42°C, puis le signal de fluorescence du bromure
d’éthidium est révélé et quantifié par le phosphoimager (Typhoon 9210, Amersham) afin de
déterminer la quantité d’ADN génomique. Le gel est ensuite mis en contact avec un écran
radiosensible dans une cassette pendant au moins 24 heures et la radioactivité est quantifiée. Le
pourcentage d’hybridation est calculé en faisant le rapport : quantité de sonde P32 hybridée /
quantité totale ADN génomique. Le résultat est exprimé en % de signal radioactif par rapport à la
quantité totale d’ADN analysée.
7. Etude de l’apoptose :
L'inhibition de la prolifération cellulaire peut s'expliquer par la mise en œuvre de deux
phénomènes qui sont, soit un ralentissement ou un arrêt du cycle cellulaire, soit le
déclenchement du processus de mort cellulaire programmée. Pour ce faire, une panoplie de
techniques a été réalisée afin de déterminer le mécanisme d’action des extraits de plantes
sélectionnés.
76
7.1. Mise en évidence de l’apoptose par coloration au Hoechst.
La mise en évidence des altérations morphologiques liées à
l’apoptose se fait par
marquage de l’ADN nucléaire à l’aide d’une sonde fluorescente intercalante, le réactif de
Hoechst 33342.
Le Hoechst est un dérivé de benzimidazole (Harapanhalli R.S. et al., 1994). Il est utilisé
comme marqueur fluorescent vital, capable de franchir la membrane cytoplasmique pour se fixer
de façon stœchiométrique sur les bases A-T de l’ADN. Son maximum d’absorption se situe à
340 nm et il émet une fluorescence bleue vers 470 nm. Les cellules sont considérées comme
apoptotiques si elles fluorescent uniquement dans le bleu et si elles présentent les caractéristiques
morphologiques définies par Kerr (Kerr J.F. et al., 1994) chronologiquement un contour
irrégulier, une condensation nucléaire, une condensation du cytoplasme, et éventuellement la
présence de corps apoptotiques.
-
Protocole :
Les cellules HeLa et SiHa sont mises en culture sur des lames de verres à 2-4 chambres
appelées Lab-Tek (Nalge Nunc International Corp., Naperville) à une densité de 20000-30000
cellules/ml. Les traitements des cellules se font à l’identique du test de viabilité cellulaire, et sont
réalisé après une période minimale d’adhésion des cellules de 24h. Après traitements des cellules
par les différents extraits de plantes. Le milieu est ensuite retiré et les cellules sont lavées 3 fois
avec du PBS,
avant d’être fixées 5 min par addition de 500 μl du mélange fixateur
(Paraformaldehyde 4% + 0,1% Triton X 100). Les lames sont ensuite rincées par 3 lavages
successifs de PBS. Pour la coloration, le Hoescht 33342 (Sigma) est ajouté à la concentration
finale de (10 μg/mL de PBS) pendant 30 minutes. L'excès de colorant est éliminé par 3 lavages
au PBS avant de monter les lames avec une goutte de cytifluor (antifading) et de souder le
pourtour de la lamelle avec un verni. Les lames sont ensuite observées au microscope à
fluorescence (excitation : 351-364 nm, émission : 390-480 nm). Les sondes fluorescentes sont
très photosensibles, il convient donc d’éviter toute exposition prolongée à la lumière ambiante
durant les procédures de marquage. Pour l'expression des résultats on définit des champs
aléatoires et on dénombre environ 200 cellules par champ. Les résultats sont exprimés en % de
cellules apoptotiques par rapport à la population totale dénombrée. Les cellules marquées sont
observées à l’aide d’un microscope à fluorescence après excitation dans l'UV (330-385nm). Les
cellules sont observées à l’aide d’un videomicroscope Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Oberkochen,
77
Germany). La capture des images est obtenue grâce à une caméra Coolsnap HQ pilotée par le
logiciel Metamorph software (Roper Scientific, Duluth, GA, USA).
7.2. Double marquage à l’Annexine V/Iodure de Propidium:
Dans une cellule non-apoptotique les phosphatidylsérines membranaires ne sont situées
que sur la face interne de la membrane. En phase précoce de l’apoptose, on observe la
translocation de la phosphatidyl-sérine à l’extérieur de la membrane plasmique. Or les annexines
sont une famille de molécules impliquée dans la signalisation cellulaire et ayant la capacité de se
fixer spécifiquement à ces phosphatidylsérines.
La fixation de l'annexine V couplée à un
fluorophore va donc mettre en évidence les cellules apoptotique après analyse par cytométrie en
flux. L'iodure de propidium (IP) est un agent d’intercalation comme marqueur des acides
nucléiques. En cytométrie en flux, l'IP permet de distinguer facilement les cellules vivantes des
cellules mortes. Pour cela, un double marquage est réalisé afin de distinguer dans les populations
de cellules mortes, les sous-populations de cellules nécrotiques (marquées avec l'annexine et
marquées avec l'IP) et de cellules apoptiques (marquées seulement à l'annexine V) (Moore A. et
al., 1998).
-
Protocole :
La détection des cellules apoptotiques est réalisée à l’aide ApoTarget Annexin-V-FITC
Apoptosis Kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, France). Les cellules sont ensemencées pendant 24 h
dans des plaques 6 puits à une densité de 2x105 cellules/puits, puis traitées par 20µg/ml
d’extraits pendant 48h. A la fin du temps d’incubation, les cellules sont récupérées et lavées deux
avec du PBS. Après une centrifugation de 5 min à 1500 rpm, les cellules sont resuspendue dans
100µl de tampon Annexin binding. 5µL d’Annexin-V-FITC et 10µL d’Iodure de propidium sont
ensuite ajoutés. La suspension cellulaire est ensuite incubée à température ambiante à l’obscurité
pendant 15 minutes et analysée aussitôt à l’aide du cytomètre de flux FACScalibur (BD
Biosciences).
7.3. Production d’espèces actives de l’oxygène (ROS) par spectrofluorométrie.
La production intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) ou "reactive
oxygen species" après traitement des cellules par les extraits de plantes est mesurée à l’aide
d’une
sonde
fluorescente,
la
6-carboxy-2’,7’-
dichlorodihydro-fluorescéine
diacétate,
diacetoxyméthylester (C-2938, Molecular Probes). Cette sonde n’émet pas de fluorescence en
solution. L’estérification des fonctions carboxylique par des groupements acétoxyméthyl rend la
78
molécule neutre et lipophile, ce qui favorise sa pénétration au travers de la membrane plasmique.
Par contre, dans la cellule, des estérases endogènes coupent les fonctions esters des
biomolécules, ceci favorise l’oxydation du C-2938 en un dérivé de structure proche de celle de la
fluorescéine qu’il est possible de quantifier en fluorescence. Excitée à 488 nm, la forme oxydée
émet une fluorescence verte dont le maximum d’intensité se situe vers 518 nm.
-
Protocole :
Les cellules sont traitées avec différents extraits de plantes pendant 24h, après quoi le
milieu est aspiré, les cellules sont lavées avec du PBS et incubées 30 min à 37°C en présence du
reactif C-2938 à 10 µM. Les cellules sont à nouveau rincées au PBS avant d'être analysées par
spectrofluorimétrie Shimadzu RF5000 (Shimadzu, Japon) dans du PBS froid. Au contact
d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), le C-2938 est oxydé et qui fluoresce dans le vert (λem:
488 nm). Le ratio (518/488 nm des intensités de fluorescence mesurées nous permet d'évaluer la
quantité de ROS produite. Comme précédemment les résultats sont exprimés en pourcentage de
variation par rapport aux cellules contrôles.
7.4. Etude du potentiel membranaire mitochondrial par spectrofluorométrie.
Pour mesurer le potentiel membranaire mitochondrial (Ψm), on utilise une sonde
cationique JC-1 (5,50,6,60-tetrachloro-1,10,3,30- tetraethyl- benzamidazolocarbocyanin iodide
(JC-1) (Sigma, MO, USA), fortement lipophile, de la famille des carbocyanines. La solution
stock à 1.3 x 10- 3 M est préparée dans le DMSO et conservée à – 20°C. Cette sonde s’accumule
préférentiellement au niveau des mitochondries et permet ainsi une mesure du potentiel
mitochondrial membranaire (ΔΨm) (Reers M. et al., 1991). La sonde JC-1 intracellulaire est
excitée à 488 nm et donne naissance à deux émissions de fluorescence (Smiley S.T. et al.,
1991) :
- Une fluorescence verte (525-530 nm) qui correspond au JC-1 sous forme monomérique
caractéristique d’un faible ΔΨm.
- Une fluorescence rouge- orange (585-595 nm) correspondant au JC-1 sous forme agrégée
caractéristique d’un fort (ΔΨm).
La force protomotrice (Δp) qui résulte de l’éjection des protons par la chaîne respiratoire
mitochondriale et de leur distribution asymétrique de part et d’autre de la membrane interne
mitochondriale comprend un gradient chimique (Δ pH) et un gradient électrique élevé (ΔΨm)
79
essentiel pour la production d’ATP par les mitochondries. Lors de l’induction de l’apoptose,
l’effondrement du Δφm entraîne une forte charge négative intra mitochondriale réduisant ainsi
l’accumulation du JC-1.
-
Protocole :
Les cellules HeLa et SiHa (25 x 103 cellules) sont ensemencées dans plaques à 6 puits et
traitées par les extraits, ayant présentées un effet cytotoxique important à savoir l’extrait
dichloromethane de R. monosperma et les extraits hexane et dichloromethane d’ I. viscosa ,
pendant 24 et 48h de traitement.
Pour la mesure du ΔΨm, les cellules sont traitées par 2.5x10-6 M de sonde JC-1 et
incubées 30 min à 37°C. Les résultats sont exprimés sous forme de rapport des intensités de
fluorescence (I590nm)/(I590nm)+(I530nm) de la sonde JC-1. Ce rapport est pris comme base
100 dans les cellules témoins et les valeurs des cellules traitées sont exprimées en % de
diminution par rapport aux cellules contrôles.
7.5. Analyse de l’expression des proteines par western blot
-
Extraction des protéines cellulaires:
Après les différents temps d’incubations, les cellules SiHa et HeLa (3 x 106 cellules)
traitées sont scrapées et récupérées dans du PBS 1X et centrifugées 5 min à 1500 rpm. Le culot
est lavé une fois dans du PBS puis repris dans 500μL de tampon de lyse contenant des
inhibiteurs de protéases (Tampon A pH 7,8 [HEPES 10Mm ; KCl 10mM ; MgCl2 2mM;
EDTA 0,1mM; NaF 0,2mM] ; PMSF 0,4mM ; leupeptine 1µg ; Orthovanadate 0,2 mM). Les
cellules sont lysées pendant une 15 min à 4°C. Après une centrifugation de 30 secondes à 14000
rpm à 4°C, les débris cellulaires sont sédimentés. Le surnageant contenant les protéines est
ensuite récupéré et les protéines sont ensuite dosées par la méthode de Bradford. Les échantillons
protéiques sont aliquotés et conservés à -20°C.
-
Migration et électrotransfert:
Une quantité égale de protéines (25 μg) est mélangée avec du tampon d’échantillons
(Bleu de charge 5x (Tris/HCl (pH 6,8) 0,25 M ; Bleu de bromophenol
0,1 % ; SDS 2% ;
Saccharose 4% ; β-mercaptoéthanol 7,5%). Les échantillons sont dénaturés pendant 2 min à
90°C. Ces derniers ainsi que des marqueurs de poids moléculaires sont déposés sur un gel
préalablement coulé de polyacrylamide/SDS sur un gradient 5-10%. Ce gel est composé d’un gel
80
de concentration à 5% (Acrylamide 40% (mono/bis 29 :1) 5% ; Tampon de concentration
(pH6,8) 125mM [Tris/HCl 0,5 M ; SDS 0,4%] ; 7,5µl Persulfate d’ammonium 10% ; 3 μl
TEMED) et un gel de séparation à 10 % (10% Acrylamide 30% (mono/bis 29 :1) ; Tampon de
séparation (pH 8,8) 375mM : [Tris /HCl 1,5M ; SDS 0,4%] ; 34,5 μL Persulfate d’ammonium
10% ; 3,5 μL TEMED). La migration s’effectue sous tension de 100 V pendant 1heure à +4°C
dans un tampon de migration (Tris 25mM (pH 8,3) ; Glycine 192mM ; SDS 0,1%). Les
marqueurs de poids moléculaire (Novex Sharp Protein standard) utilisés correspondent à 260,
160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 et 3.5 kDa.
Après migration, les protéines sont électro-transférées sur membrane nitrocellulose
(hybondTM ECLTM Amersham pharmacia biotech). Le transfert est effectuée à 4°C pendant
1heure sous 30 V dans du tampon de transfert (Tris base 20 mM ; Glycine 150 mM ; Méthanol
20%).
A la fin du transfert, pour vérifier si les protéines ont bien été transférées, la membrane est
plongée dans la solution de rouge Ponceau sigma (Ponceau S 0.1 % dans une solution de l’acide
acétique à 5 % (v/v)) et rincée avec de l’eau distillée pour éliminer l’excès de coloration. Ceci
permet de visualiser les bandes qui correspondent aux protéines présentes dans les échantillons et
de les identifier par le marqueur de poids moléculaire. La membrane servira ensuite de support
après lavage pour mettre en évidence la protéine recherchée par une technique immunoenzymologique.
-
Hybridation et immunodétection :
Avant de réaliser l'hybridation de la membrane avec les anticorps spécifiques, il est
important d’éviter toute possibilité de fixation non spécifique. La membrane est donc saturée par
incubation pendant une heure dans du tampon TBS-T (TBS [TRIS/HCl pH 7.5 20 mM ; NaCl
500 mM]; 0,05 % de Tween 20) et contenant 5 % de lait écrémé en poudre. Après saturation, la
membrane est alors incubée pendant une nuit à + 4°C, en présence d’un anticorps spécifique de
la protéine recherchée dans du TBS-T contenant 5 % de lait écrémé, à une dilution appropriée.
Après trois lavages dans du TBS-T, la membrane est incubée pendant 1h 30 à température
ambiante sous agitation en présence de l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (dilué dans
du TBS-T contenant 1 % de lait écrémé). Les différents anticorps, leur spécificité, leur
concentration et le temps d’incubation sont présentées dans le Tableau 3. Le complexe [protéineanticorps Iaire-anticorps IIaire] est révélé par le kit ECL (ECL Western blotting detection
81
reagents. Amersham biosciences). Ce réactif, contenant du luminol, est hydrolysé par la
peroxydase couplée à l'anticorps IIaire. Cette réaction s'accompagne d'une émission photonique
qui va impressionner le film photographique (Amersham hyperfilmTM ECL).
Tableau 3: Liste et caractéristiques des anticorps primaires et secondaires employés.
Anticorps
Anti β-Actine
Espèces
Dilution
Monoclonal
1/5000
Monoclonal
1/700
Monoclonal
1/1000
Monoclonal
1/700
Beckamn coulter
IgG Anti-souris
conjugué à la peroxydase
Polyclonal
1/5000
Cell signaling
technology
IgG Anti-lapin
Conjugué à la peroxydase
Polyclonal
1/5000
Cell signaling
technology
Anti- Caspase 3
Anti- Parp
Anti- Bcl2
Références
Santa Cruz
Biotechnology
Santa Cruz
Biotechnology
Cell signaling
technology
7.6. Mesure de l’activité Caspase-3
Afin de s’assurer que l’apoptose induite par les extraits testés est Caspase-dépendante,
nous avons effectué des mesures de l’activité Caspase 3 après traitements des cellules SiHa et
HeLa. Le dosage de l’activité Caspase-3 a été réalisé à l’aide d’un kit Caspase-3 Activity Assay
(Calbiochem). La Caspase-3 clive spécifiquement son substrat à droite d’une séquence DEVD
(Asp-Glu-Val-Asp) et la méthode consiste à utiliser un substrat colorimétrique (Ac-DEVD-AFC)
lié à un fluorophore 7-amino-4-trifluoromethyl coumarin (AFC). L’AFC libéré émet une
fluorescence, mesurable par spectrofluorimétrie, qui est proportionnelle à l’activité DEVDase
présente dans l’échantillon.
Les cellules HeLa et SiHa sont incubées en présence de différents extraits pendant 6 et 24
h. Après incubation, les cellules sont lavées avec du PBS froid puis grattées dans un volume de
tampon de lyse fournie par le kit. La lyse s'effectue par 3 cycles successifs de
congélation/décongélations suivis de 15 min d'incubation dans la glace. Les lysats cellulaires
sont ensuite centrifugés 20 min à 14000 g à 4°C. Un dosage de protéine est réalisé dans les
fractions de surnageants collectées. La mesure de l’activité Caspase-3 est effectuée dans une
plaque de 96 puits sur 50 μg de protéines après 1h d’incubation à 37°C en présence du substrat
82
(0.2 mM). La lecture spectrophotométrique se fait à 405 nm dans un lecteur de plaque
multicanaux (Metertech. inc. Σ 960). Les résultats sont exprimés en picomoles de pNA libéré par
heure et par μg de protéine.
7.7. Etude du cycle Cellulaire :
La mesure du cycle cellulaire par cytométrie en flux divise le cycle en trois phases : G0/G1
(phase d’activation des cellules), S (phase de synthèse de l’ADN) et G2/M (phase de mitose).
Ces trois phases sont différentes par leur quantité d’ADN. Les cellules en G0/G1 contiennent 2n
chromosomes, les cellules en G2/M contiennent 4n chromosomes et les cellules en phase de
synthèse possèdent une quantité d’ADN intermédiaire. La cytométrie en flux permet de suivre la
distribution des cellules dans les différentes phases du cycle en fonction du traitement appliqué.
Elle nécessite l’emploi de fluorochromes spécifiques de l’ADN possédant deux qualités
essentielles : combinaison stoechiométrique avec l’ADN et bonne émission de fluorescence
après liaison à l’ADN. Les fluorochromes utilisés sont regroupés en deux catégories principales :
les agents intercalants comme l’iodure de propidium, bromure d'éthidium et les colorants
spécifiques de paires de bases tel que le Hoechst 33342/33258 (A-T) et mithramycine (G-C).
-
Protocole :
Les cellules SiHa et HeLa ont été incubées en présence de 10, 20, 40μM de tomentosin
pendant 24, 48 et 72h de traitement avec un contrôle sans traitement pour temps d’’incubation.
Après récupération par trypsination, 1.106 cellules sont rincées dans du PBS puis centrifugées à
1500 rpm pendant 5 minutes. Le culot est ensuite récupéré et vortexé pendant qu’on y rajoute
goutte à goutte 1mL d’éthanol à 70% froid afin de permettre la fixation des cellules. Le mélange
peut alors être gardé 30 min dans la glace ou conservée à 4°C si la manipulation doit être
interrompue. Après une centrifugation de 5 min à 1500 rpm, le culot est vortexé, rincé dans 1 ml
de PBS et la suspension cellulaire est ensuite centrifugée 5 min à 1500 rpm. Le culot est ensuite
remis en suspension dans 1 mL d’une solution de PBS comprenant 40 μg/mL d’iodure de
propidium et 100 μg/mL de RNase. La suspension cellulaire est ensuite incubée à température
ambiante à l’obscurité pendant 20 minutes et analysée aussitôt au cytomètre en flux FACS
calibur (BD Biosciences, Pont de Claix, France).
83
8. Fractionnement et isolement des composés contenus dans l’extrait
hexanique d’Inula viscosa :
8.1. Fractionnement de l’extrait hexanique:
L’extrait hexanique (20g) est dissous dans de l’acétonitrile donnant ainsi l’extrait
acétonitrile Fa (15g) et un résidu insoluble Fn (4,2g). L’extrait acétonitrile évaporé subit dans un
premier temps un fractionnement sur colonne de gel de silice 60 (Scharlau, SOLVACHIM). La
masse de silice correspond approximativement à 30 fois plus du poids de l’extrait à fractionner.
La séparation se fait par élution en utilisant une phase mobile apolaire CH 2CL2/Hexane avec un
gradient de (70 :30, 80 :20, 90 :10, 95 :5). Les différentes fractions éluées de 100ml sont
collectées. Les fractions éluées obtenues ont été analysées par chromatographie sur couche
mince (CCM) dans le but de réunir les fractions qui présentent le même profil, et déterminer un
nouveau système de solvant susceptible de mieux séparer les composés.
8.2. Fractionnement de la fraction F3
Dans un deuxième temps, la fraction F3 a subit un sous fractionnement par
chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant comme phase mobile Hexane/Acétate
d’éthyle (75 : 25), obtenant ainsi deux sous fractions à partir de la fraction F3. L'analyse
structurale des produits isolés est ensuite réalisée.
8.3. Fractionnement de la fraction F6
La fraction F6 a subit un sous fractionnement par chromatographie sur colonne de gel de
silice en utilisant comme phase mobile Hexane/Acétate d’éthyle (75 : 25).
8.4. Méthodes d’analyse
L'analyse de la composition des fractions obtenues par chromatographie ainsi que la
pureté des molécules isolées sont évaluées par chromatographie phase gazeuse couplée à la
spectroscopie de masse (CG/MS). L'identification structurale et la caractérisation des métabolites
secondaires isolés s’appuient essentiellement sur la technique de spectroscopie par résonance
magnétique nucléaire (RMN) : C13 et H1 et en se basant sur les données de la littérature.
84
8.4.1. Chromatographie sur couche mince
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique analytique rapide et
simple , utilisée au cours de la séparation et de l’identification des composés. Elle repose
principalement sur le phénomène d’adsorption. Cette technique permet d’avoir une idée globale
des composés présents dans un extrait ou une fraction, elle permet également un contrôle aisé et
rapide de la pureté d’un composé. Lors de nos travaux nous avons utilisés pour la CCM
analytique des plaques de silice sur support de verre.
8.4.2. Chromatographie phase gazeuse couplé à la spectroscopie de masse
(GC/MS):
-
Principe :
La spectrométrie de masse désigne une méthode d’analyse qui repose sur la détermination
des masses des espèces atomiques ou moléculaires individuelles de l’analyte, ce qui permet de
recueillir des informations sur sa nature, sa composition et sur sa structure. Le spectromètre de
masse est constitué de trois parties ; la source d’ionisation, l’analyseur et le détecteur. L’appareil
est constitué de plusieurs pompes à vide permettant de travailler à basse pression.
-
Protocole :
L’analyse GC-MS des extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF a été realisé à l’aide de l’appareil
TRACE GC ULTRA équipé
d’une colonne capillaire VB5 (5% phenyl; 95%
methylpolisyloxane) (30 m x 0.25 mm x 0.25 mm film thickness), directement couplé au
spectromètre de masse (Polaris Q) (EI 70 eV). L’helium est utilisé comme gaz vecteur, avec un
débit de 1ml/min. Le volume d’injection est de 1µl en splitless. La temperature de l’injecteur et
du détecteur sont à 250°C
et 300°C, respectivement. La température du four réglant la
température de la colonne a été programmér comme suit : de 60°C jusqu’à 200°C à raison de
2°C/min, ensuite de 200°C jusqu’à 300°C à raison de 20°C/min. Les composés contenus dans
les extraits ont été identifié par comparaison de leurs spéctres de masse avec ceux des bases de
données : NIST et Wiley7.
8.4.3. Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)
L’ensemble des spectres RMN monodimensionnelle (1H, 13C) ont été réalisé à l’aide d’un
appareil Bruker DPX Avance 400 MHz à l’UATRS au CNRST. L’analyse d’un mélange est
menée sur échantillon de 10mg dilué dans 0,5ml de CDCL3.
85
RESULTATS
Résultats
Partie 1 :
Recherche et identification plantes utilisées en
médecine traditionnelle Marocaine, capable
d’inhiber la croissance des cellules du cancer du col
de l’utérus
86
Résultats
Les principes actifs issus des plantes jouent toujours un rôle primordial dans les progrès de
la médecine moderne. L’exploitation des pharmacopées traditionnelles, notamment l’utilisation
des plantes connues souvent depuis des siècles pour leur valeur médicinale ; a permis la mise en
place d'un très grand nombre de médicaments anticancéreux d'une très grande efficacité. Les
cytotoxiques demeurent la base irremplaçable du traitement chimiothérapeutique des cancers.
Malheureusement; malgré l'avènement récent de différents types d'agents anticancéreux,
certaines tumeurs solides restent incurables et sont globalement résistantes à la plupart des
médicaments actuels. De plus, les agents cytotoxiques manque de spécificité vis-à vis des
cellules saines de l’organisme et peuvent engendrer de sévères effets secondaires. D'où l'intérêt
de rechercher de nouvelles molécules cytotoxiques, surtout lorsqu'il s'agit d'un mécanisme
différent de celui des composés déjà introduits en thérapeutique.
Afin de contribuer à l’identification de nouvelles molécules anticancéreuses, nous avons
étudié la cytotoxicité, in vitro, des extraits méthanoliques de sept plantes médicinales, connues
pour leur utilisation en médecine traditionnelle marocaine : Inula viscosa L., Retama
monosperma L., Ormenis mixta L., Ormenis eriolepis Coss., Rhamnus lycioides L., Berberis
hispanica Boiss. et Urginea maritima L.. L’effet cytotoxique est étudié sur des lignées
cellulaires provenant d’un cancer du col de l’utérus (HeLa et SiHa). Le choix des plantes
étudiées a été basée sur l’usage traditionnel ou des activités précédemment rapportées dans la
littérature.
87
Résultats
I.
Evaluation de la cytotoxicité des extraits méthanoliques de plantes
sélectionnées
L’évaluation de la cytotoxicité des plantes sélectionnées in vitro, vis-à-vis des lignées
SiHa et HeLa, a été réalisé par mesure de la viabilité cellulaire utilisant le test MTT. Un extrait
de chaque plante a été préparé par macération au méthanol. Les cellules ont été traitées par les
extraits méthanoliques à des concentrations croissantes pendant 48h. Des courbes représentant
les pourcentages de viabilité en fonction des concentrations des différents extraits de plantes sont
présentées (Figure 24). Les concentrations inhibitrices à 50% (IC50) ont été calculées par
extrapolation et les résultats sont exprimés par la moyenne ± SD. Les courbes montrent qu’il
existe une bonne corrélation dose-effet des extraits pour l’intervalle de concentrations testées et
l’activité cytotoxique est proportionnelle à la concentration des extraits de plantes étudiées.
Ces résultats ont révélé que parmi les 7 plantes étudiées, 3 d’entre elles à savoir : Inula
viscosa L., Retama monosperma L., Ormenis eriolepis Coss., ayant présenté des IC50 les plus
faibles, montrent une inhibition significative de la croissance des cellules SiHa d’une manière
dose-dépendante, comparée aux autres extraits (Tableau 4) Un effet inhibiteur similaire est
observé pour lignée cellulaire HeLa. Les photos présentées dans la (Figure 25) démontrent les
modifications morphologiques et l’inhibition de la croissance des cellules SiHa induites par
l’extrait méthanolique d’Inula viscosa après 48h de traitement. Les extraits méthanoliques des
plantes Berberis hispanica Boiss. et Ormenis mixta L ont présenté un effet cytotoxique plus
faible avec une IC50› 100 µg/ml. En revanche les extraits méthanoliques des plantes Rhamnus
lycioides L. et Urginea maritima L. ne présentent pas d’activité cytotoxique notable vis-à-vis les
deux lignées cellulaires SiHa et HeLa pour l’intervalle des concentrations testées, avec des IC 50
› 500 µg/ml.
88
Résultats
Viabilité cellulaire (%)
SiHa
100
Inula viscosa
Ormenis eriolepis
Ormenis mixta
Berberis hispanica
50
Retama monosperma
Rhamnus lycioides
Urginea maritima
0
0
15,62 31,25
62,5
125
250
500
Concentration (µg/ml)
HeLa
100
Inula viscosa
Ormenis eriolepis
Ormenis mixta
Berberis hispanica
50
Retama monosperma
Rhamnus lycioides
Urginea maritima
0
0
15,62 31,25
62,5
125
250
500
Figure 24: Effet cytotoxique des extraits de plantes vis-à-vis des cellules SiHa et HeLa.
Les cellules sont incubées avec des concentrations croissantes (0-500µg/ml) d’extraits
pendant 48h. La viabilité cellulaire est évaluée grâce au test au MTT (n=4).
89
Résultats
Tableau 4: Valeurs des IC50 (µg/ml) des différents extraits de plantes vis-à-vis des lignées SiHa et
HeLa, après 48h d’exposition.
Extraits de plantes
IC50 (µg/ml)
Lignée SiHa
Lignée HeLa
Inula viscosa
53.79 ± 11.84
59.87 ± 8.15
Ormenis eriolepis
94.37 ± 4.38
111.66 ± 4.27
Ormenis mixta
382.51 ± 26.04
311.44 ± 14.31
Berberis hispanica
178.21 ± 5.16
223.56 ± 9.99
Retama monosperma
99.42 ± 1.47
96.41 ± 4.08
Urginea maritima
› 500
› 500
Rhamnus lycioides
› 500
› 500
Mytomycine
6.10 + 1.44
1.22 + 0.30
Les résultats présentés sont des moyennes±SD d’expériences représentative réalisées en triplicate.
0 µg/ml
6,12 µg/ml
31,25 µg/ml
500µg/ml
250µg/ml
62,5 µg/ml
125µg/ml
Figure 25: Altération morphologiques des cellules SiHa, induites par l’extrait méthanoliques
d’Inula viscosa L. Photos des cellules après 48h de traitement par des concentrations croissantes d’extrait
méthanolique, observées par microscope inversé (grossissement x10).
90
Résultats
Partie 2:
Recherche de substances naturelles capables d’inhiber
la prolifération et l’activité télomérase et d’induire
l’apoptose des cellules cancéreuses du col de l’utérus
A. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et
induction de l’apoptose par les extraits d’Inula viscosa L.
1.
2.
3.
4.
5.
Evaluation de l’activité cytotoxique:
Mesure de l’activité télomérase :
Effet des extraits sur le télomère simple brin
Effet des extraits sur les cellules de phénotype ALT
Etude de l’apoptose
B. Activité antiproliférative et induction de l’apoptose par les
extraits de Retama monosperma L.
1. Evaluation de l’activité cytotoxique
2. Etude de l’apoptose
C. Statut MDR des extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF
91
Résultats
Les télomères sont des séquences jouent un rôle important dans l’intégrité des
chromosomes en empêchant les phénomènes de fusions chromosomiques et recombinaisons. La
perte progressive de ces séquences télomèriques est associée à la sénescence des cellules. Le
maintien des télomères est assuré par une enzyme ribonucléoprotéique, la télomérase,
responsable de la synthèse de ces séquences répétitives. L’activité de cette enzyme est absente
dans la majorité des cellules somatiques normales, alors qu’elle est présente dans plus de 90%
des cancers (Kim N. W. et al., 1994). De ce fait, l’inhibition de l’activité télomérase offre une
nouvelle stratégie thérapeutique particulièrement attractive pour la recherche de nouveaux agents
antitumoraux, notamment dans le cancer du col utérin. Cette stratégie a pour but d’induire un
raccourcissement prématuré des télomères et un arrêt de la prolifération anarchique des cellules
cancéreuses, permettant ainsi de diminuer l’aspect cytotoxique des médicaments anticancéreux,
de réduire leurs effets secondaires et d’augmenter l’efficacité des traitements.
La deuxième partie de cette thèse a été consacrée à la recherche de molécules issues de
plantes médicinales capables d’inhiber la croissance des cellules et susceptibles de réguler
l'activité de la télomérase et d’induire l’apoptose des cellules du cancer du col de l’utérus. Dans
un premier temps, des extraits des deux plantes à savoir : Retama monosperma L. Boiss. et Inula
viscosa L. Ait. ont été obtenus grâce à différents solvants (méthanol, dichlorométhane, acétate
d’éthyle et hexane) et ont été étudiés pour leurs propriétés cytotoxiques vis-à-vis des lignées
SiHa et HeLa.
Dans un second temps, nous avons étudié le mécanisme d’action de ces extraits les plus
actifs par évaluation de l’effet inhibiteur de l’activité télomérase et induction de l’apoptose. Afin
d’identifier les voies par lesquelles ces extraits induisent leur effets cytotoxiques, nous avons
étudié leurs effets sur l’activité télomérase grâce au test TRAP (Telomere Repeat Amplification
Protocol), ainsi que leurs effets sur la longueur des télomères grâce au test d’Hybridation en
solution. Nous avons également étudié l’induction de l’apoptose par ces extraits grâce au
marquage avec le Hoechst 33342, au double marquage à l’Annexine V et l’Iodure de Propidium ;
au suivi d’événements mitochondriaux tels que la modification du potentiel membranaire
mitochondrial (ΔΨm) et la
production d’espèces actives de l’oxygène (ROS).
Des tests
complémentaires on été réalisé pour rechercher l’expression des protéines impliquées dans la
régulation de l’apoptose et la mesure de l’activité Caspase 3.
L'apparition de cellules tumorales résistantes aux agents anticancéreux demeure l'un des
obstacles majeurs aux traitements chimiothérapeutiques des cancers. Parallèlement, nous avons
92
Résultats
étudié le statut MDR des extraits d’Inula viscosa ainsi que la fraction dichlorométhane de
Retama monosperma, en évaluant la cytotoxicité de ces extraits vis-à-vis de modèles cellulaires
résistantes à la chimiothérapie anticancéreuse exprimant des protéines de transport ABC.
A. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et induction
de l’apoptose par les extraits d’ Inula viscosa L.
1. Evaluation de l’activité cytotoxique:
Les extraits de plantes obtenus (hexanique, méthanoliques, dichlorométhane et acétate
d’éthyle) ont été étudiés pour leurs propriétés cytotoxiques. Les deux lignées cellulaires sont
incubées en présence de concentrations croissantes de chaque extrait pendant 72h puis la
viabilité cellulaire est estimée grâce au test MTT. Les données obtenues montrent que l’extrait
hexanique (IV-HE) et l’extrait dichlorométhane (IV-DF) d’Inula viscosa possèdent des activités
antiprolifératives les plus importantes. Ces extraits induisent une inhibition de la croissance des
cellules significative dans les cellules HeLa et SiHa d’une manière dose-dépendante (Figure 26).
Les valeurs d’IC50 sont comprises entre 6 et 22 µg/ml. En revanche, l’extrait méthanolique (IVME) et l’extrait acetate d’éthyle (IV-AF) ne présentent pas d’activité cytotoxique notable vis-àvis des cellules SiHa et HeLa. En effet, les IC50 sont supérieures à 50 μg/ml pouvant aller
jusqu’à plus de 80μg/ml (Tableau 5). D’une manière générale, les extraits IV-HE et IV-DF
semblent agir sur la viabilité cellulaire avec une efficacité relativement plus importante sur la
lignée cellulaire SiHa que sur la lignée HeLa.
Tableau 5: Valeurs des IC50 (µg/ml) des extraits d’Inula viscosa L.
Extraits Inula viscosa L.
IC50 (µg/ml)
SiHa
HeLa
Extrait hexanique (IV-HE)
9.56 ± 1.68
13.17±0.79
Extrait methanolique (IV-ME)
52.83±3.28
› 80
Fraction dichlorométhane (IV-DF)
6.54±1.46
22.04±3.31
Fraction acétate d’éthyle (IV-AF)
63.62±10.55
› 80
Vinblastine
10.88±0.78
6.28±0,35
La vinblastine est utilisée comme contrôle positif. Les données représentent la moyenne±SD de
trois expériences différentes réalisées en triplicate.
93
Prolifération cellulaire (%)
Résultats
extrait methanol
fraction dichloromethane
fraction acetate ethyle
extrait hexane
100
50
HeLa
0
0
5
10
20
40
60
80
concentration (µg/ml)
Proliferation cellulaire (%)
extrait methanol
fraction acetate ethyle
fraction dichloromethane
extrait hexane
100
50
SiHa
0
0
5
10
20
40
60
80
Figure 26: Effet des extraits d’Inula viscosa sur la prolifération des cellules SiHa et HeLa. Les
cellules sont traitées à des doses croissantes d’extraits et fractions pendant 72h. La viabilité cellulaire est
déterminée à l’aide du test MTT. Les données représentent la moyenne±SD de trois expériences
différentes réalisées en triplicate.
2. Mesure de l’activité télomérase :
Nous avons étudié l’effet des extraits d’Inula viscosa L. sur l’activité télomérase grâce au
test TRAP. Les cellules ont été traitées avec les extraits IV-HE et IV-DF (20µg/ml) pendant
48h. Les cellules non traitées sont considérées comme témoin. L’activité télomérase a été
mesurée à différentes quantités d’extraits protéiques (0.3, 1, 3 et 10 ng). Après électrophorèse
des produits d’amplification, une différence significative de l’intensité des bandes caractérisant
l’activité télomérase est observée dans les cellules traitées par IV-HE et IV-DF à la quantité de
0.3ng, par rapport aux cellules témoins (Figure 27). En effet, à la quantité de 0.3ng seules les
94
Résultats
cellules témoins présentent une activité télomérase détectable. Au vue de ces résultats, il apparait
clairement que les extraits IV-HE et IV-DF inhibent l’élongation des télomères in vitro des
cellules SiHa et HeLa.
Figure 27: Activité télomérase dans les cellules SiHa et HeLa.
Les cellules ont été traitées avec les extraits IV-HE et IV-DF (20µg/ml) pendant 48h. Après extraction et
dosages de protéines, l’activité télomérase de plusieurs concentrations protéiques (de 1 à 10 ng) est
mesurée par le test TRAP. L’aspect en barreaux d’échelle (bandes successives séparées de 6 nucléotides)
correspondant aux produits de PCR formés après l’ajout d’un nombre distinct de répétitions télomériques
à l’amorce TS. ITAS est un contrôle interne de PCR (36 pb).
3. Effet des extraits sur le télomère simple brin
Afin de mettre en évidence l’effet potentiel des extraits d’Inula viscosa L. sur le simple
brin télomèrique en inhibant l’activité catalytique de la télomérase, nous avons étudié l’effet des
extraits sur la longueur du brin G télomèrique grâce à la technique d’hybridation en condition
non dénaturante avec une sonde 21C, radiomarquée au 32P. Le signal d’hybridation de la sonde
oligonucléotidique complémentaire au brin G mesuré à l’aide d’un phosphoimager permet en
effet d’estimer la longueur du brin G. Pour ce faire, les cellules SiHa et HeLa ont été incubées
95
Résultats
pendant 72h en absence ou en présence de 20µg/ml d’IV-HE et IV-DF. Le signal d’hybridation a
été mesuré et les résultats sont présentés dans la Figure 28.
Figure 28: Effet des extraits d’Inula viscosa sur le simple brin télomérique. Analyse de l’hybridation
en solution non dénaturante du simple brin télomérique provenant d’ADN génomique purifié des cellules
SiHa et HeLa traitées par 20µg/ml d’extraits pendant 72h.
Le signal du brin G est quantifié et rapporté à la quantité d’ADN totale obtenu grâce au
bromure d’Ethidium (EtBr). Les résultats sont présentés sous forme d’histogrammes représentant
la moyenne de trois expériences différentes (Figure 29).
100
Signal d'hybridation brin-G
(%)
SiHa
90
80
**
**
70
60
50
Témoin
IV-HE
IV-DF
Figure 29: Histogrammes représentant la quantification du signal du simple brin télomérique, des
lignées cellulaires SiHa et HeLa après traitement par les extraits d’Inula viscosa (20µg/ml) durant
72h. Les résultats sont normalisés et la taille des simples brins est exprimée en % par rapport aux cellules
non traitées considérées comme témoin (100%). Les résultats présentés sont des moyennes±SD
d’expériences représentatives réalisées en triplicate. * : p<0,05 ; ** : p<0,01.
Les données obtenues montrent qu’après traitement avec IV-HE et IV-DF pendant 72h de
traitement, une diminution significative du signal d’hybridation est observée, atteignant (IV-HE,
72.5%) et (IV-DF, 78%), par rapport aux cellules témoin non traitées pour les cellules SiHa ;
(IV-HE, 55%) et (IV-DF, 64.5%) pour les cellules HeLa. Ces données montrent clairement que
les extraits d’Inula viscosa induisent un raccourcissement de la taille du simple brin télomérique
significativement dans les cellules SiHa et HeLa.
96
Résultats
4. Effet des extraits d’Inula viscosa sur les cellules de phénotype ALT
Afin d’étudier l’effet des extraits d’Inula viscosa L. sur les cellules cancéreuses de
phénotype ALT, nous avons évalué l’effet des extraits IV-HE et IV-DF sur la croissance des
cellules MRC5/V1, fibroblastes transféctées par l’antigène T de SV40. Les cellules MRC5/V1 et
MRC5 ont été traitées à différentes concentrations d’extraits pendant 72h. Comme le montre la
figure 30, les extraits IV-HE et IV-DF inhibent significativement la prolifération des cellules
MRC5/V1, avec un IC50 de
10.55±2.46µg/ml and
26.21±2,53µg/ml, respectivement. En
revanche, ces mêmes extraits inhibent faiblement la croissance des cellules de la lignée parentale
MRC5, avec un IC50 de 60.35±2.71µg/ml et 62.92±1.34µg/ml. Les cellules MRC5/V1
transfectées sont 5.72 et 2.4-fois plus sensibles aus extraits IV-HE et IV-DF, respectivement par
rapport aux
cellules MRC5. Ce résultat montre bien que les extraits d’Inula viscosa sont
capables d’inhiber la croissance aussi bien des cellules cancéreuses exprimant la télomérase que
les cellules cancéreuses de phénotype ALT, n’exprimant pas de télomérase.
MRC5 cells
MRC5/V1 cells
50
0
0
20
40
60
80
100
MRC5 cells
100
100
MRC5/V1 cells
50
0
0
20
IV-HE (µg/ml)
40
60
80
100
IV-DF (µg/ml)
Figure 30: Effet des extraits IV-HE et IV-DF sur la croissance des lignées cellulaires MRC5 et
MRC5/V1. Les cellules sont traitées à différentes concentrations d’extraits pendant 72h de traitement. La
viabilité cellulaire est déterminée par le test MTT. Les données représentent la moyenne ± SD de trois
expériences différentes.
5.1. Altérations morphologiques liées de l’apoptose:
La condensation chromatinienne et la présence de corps apoptotiques définissent
principalement les critères morphologiques de l’apoptose. Nous avons étudié l’induction de
l’apoptose par les extraits ayant présentés un effet cytotoxique plus importants, grâce au
marquage avec le Hoechst 33342. Les cellules sont incubées en présence ou en absence des
97
Résultats
extraits IV-HE et IV-DF à la dose de 20µg/ml pendant 24, 48 et 72h. Après marquage des
cellules et leurs observations au microscope à fluorescence, les cellules non traitées considérées
comme témoin présentent un noyau avec une répartition homogène de la chromatine. En revanche,
les cellules traitées avec les extraits
IV-HE et IV-DF présentent des noyaux ayant une
condensation de la chromatine, une fragmentation nucléaire et la présence de corps apoptotiques
dans les cellules SiHa (Figure 31) et HeLa (Figure 32). Une augmentation du nombre de cellules
apoptotiques est observée dès 24h de traitement par rapport aux cellules non traitées. Les extraits
IV-HE et IV-DF induisent l’apoptose des cellules SiHa et HeLa de manière temps-dépendant.
5.2. Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux :
Afin de confirmer que la mort cellulaire induites par les extraits d’Inula viscosa L. est de
nature apoptotique, nous avons réalisé un double marquage par l’Annexine-Iodure de Propidium
des cellules traitées Les cellules sont traitées durant 24, 48, et 72h avec les extraits IV-DF et IVHE (20μg/ml). Un double marquage Annexine-Iodure de Propidium (IP) a été effectué, suivi
d’une analyse en cytométrie de flux. Le marquage à l’Annexine V permet de marquer les cellules
apoptotiques et le marquage à l’Iodure de Propidium permet, quant à lui, d’identifier les cellules
en nécrose. Par ce double marquage, nous pouvons ainsi identifier quatre populations de cellules
: les cellules normales, les cellules en apoptose précoce (Annexine positif), les cellules en
apoptose tardive (Annexine positif et IP positif) et les cellules nécrotiques (Annexine négatif et
IP positif) (Figure 33). Après traitement des cellules par IV-HE et IV-DF, le pourcentage de
cellules apoptotiques marquées à l’Annexine V augmente significativement dans les cellules
SiHa et HeLa après 48h de traitement.
98
Cellules apoptotiques (%)
Résultats
50
24h
48h
72h
SiHa
40
30
20
10
0
Témoin
IV-HE
IV-DF
Figure 31: Modifications morphologiques caractéristiques de l’apoptose induite par les extraits
d’Inula viscosa L. Les cellules SiHa sont incubées en présence de extraits IV-HE et IV-DF pendant 24,
48, et 72h puis marqués au réactif de Hoechst et observées au microscope à fluorescence (grossissement
x40).
99
Résultats
24h
50
48h
72h
HeLa
40
30
20
10
0
Témoin
IV-HE
IV-DF
Figure 32: Modifications morphologiques caractéristiques de l’apoptose induite par les extraits
d’Inula viscosa L. Les cellules HeLa sont incubées en présence de extraits IV-HE et IV-DF pendant 24,
48, et 72h puis marqués au réactif de Hoechst et observées au microscope à fluorescence (grossissement
x40).
100
Résultats
Figure 33 : Détection des cellules apototiques par cytomètrie de flux. Après 48h de traitement, les
cellules traitées avec IV-HE et IV-DF sont doublement marquées avec de l’annexine et l’iodure de
propidium puis analysées par cytométrie en flux (Facscalibur).
5.3. Expression des protéines Pro-Caspase3, Bcl2 et clivage de PARP :
Afin de déterminer le mécanisme responsable de la mort cellulaire induite par les extraits
d’Inula viscosa vis-à-vis des lignées cellulaires SiHa et HeLa, l’expression des protéines
impliquées dans la régulation de l’apoptose ont été recherchés. Les cellules sont incubées en
présence ou en absence des extraits IV-HE et IV-DF à la dose de 20µg/ml pendant 24 et 48h.
L’expression des protéines est analysée par Western blot. Les données obtenues (Figures 34),
montrent qu’après traitement des cellules, les deux extraits induisent une diminution progressive
de la Pro-Caspase 3 (forme inactive de la Caspase 3) au cours du temps dans les deux lignées
SiHa et HeLa.
PARP, enzyme nucléaire, est substrat endogène des Caspases effectrices qui constitue un
marqueur de l’apoptose. En absence de l’activité caspasique, la proteine fonctionnelle est
localisée autours de 116KDa par western blot, en revanche lorsque les Caspases sont activées le
PARP est clivée en un fragmant de 89KDa. Une apparition progressive du fragment de 89kDa
101
Résultats
correspondant au PARP clivé a également été observée au cours du temps dans les deux lignées
après 24h de traitement avec les deux extraits.
Figure 34: Effet des extraits d’Inula viscosa sur l’expression de la pro-Caspase 3, de Bcl2 et le
clivage de PARP. Les cellules SiHa et HeLa sont incubées en absence ou en présence de 20µg/ml de
IV-HE et IV-DF. A la fin de différents temps d’incubation (24 et 48h), les cellules sont lysées et 30µg
d’extrait protéique sont analysées par western blot. La β-actine est utilisées comme contrôle de
dépôt.
En parallèle à l’activation de la Caspase 3 et le clivage de PARP, l’expression de Bcl-2 est
fortement réduite en fonction du temps, dés 24h de traitement par les deux extraits dans les
lignées SiHa et HeLa. L’ensemble de ces résultats montrent que les extraits d’Inula viscosa
exercent leur effet cytotoxique en induisant l’apoptose Caspases-dépendante et faisant intervenir
la voie mitochondriale.
5.4. Activation de la Caspase 3 :
Afin de confirmer que l’apoptose induite par les extraits d’Inula viscosa est dépendante de
l’activation des Caspases, des mesures de l’activité Caspase-3 après traitements des cellules SiHa
et HeLa ont été réalisées, par mesure du clivage d’un substrat fluorimètrique Ac-DEVD-pNA.
Les cellules sont incubées en présence ou en absence des extraits IV-HE et IV-DF à la dose de
20µg/ml pendant 6 et 24h. Après chaque temps d’incubation, les cellules sont lysées et l’activité
de la Caspase 3 est mesurée par spectrofluorimètre. Les résultats obtenus sont présentés dans la
figure 35.
102
Résultats
Figure 35: Activation de la Caspase 3 induite par les extraits d’Inula viscosa. Les cellules SiHa et
HeLa sont incubées en absence ou en présence de IV-HE et IV-DF (20µg/ml) durant 6 et 24h. Les
résultats présentés sont des moyennes±SD d’expériences représentative réalisées en triplicate. *, p<0,05 ;
** , p<0,01 , *** , p<0,001.
Les cellules SiHa et HeLa ont été incubées pendant (6 et 24h) en absence ou en présence
de différentes concentrations de IV-HE et IV-DF (20µg/ml). IV-HE induit une activation de la
Caspase 3 des cellules SiHa de manière modérée à partir de 6 heures. En revanche, une
activation significative et plus importante est observée au niveau des cellules SiHa et HeLa après
24 heures d’incubation, suggérant que les extraits d’Inula viscosa induisent une mort cellulaire
Caspases-dépendante.
5.5. Production de ROS induite par les extraits d’Inula viscosa L.
Afin de s’assurer que la mort cellulaire provoquée par les extraits d’Inula viscosa est de
nature apoptotique, nous avons effectué des mesures complémentaires telles que la quantification
de ROS (espèces réactives de l’oxygène) libérées puisque leur rôle dans l’apoptose est connu.
Les cellules sont incubées en présence ou en absence des extraits IV-HE et IV-DF à la dose de
20µg/ml pendant 24h. Les données obtenues par spectrofluorimètrie sont normalisées par rapport
aux contrôles et exprimées en pourcentage par rapport à la quantité de ROS présente au départ.
103
Résultats
Les résultats montrent qu’en présence des extraits IV-HE et IV-DF, la production des ROS
augmente significativement après 24h de traitement dans les cellules SiHa et HeLa (Figure 36).
Figure 36: Production de ROS dans les cellules traitées par les extraits d’Inula viscosa L. Les
cellules SiHa et HeLa sont traitées avec 20µg/ml des extraits IV-HE et IV-DF pendant 24h.Les
résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SD de trois expériences indépendantes ; *, p<0,05 ; ** ,
p<0,01.
5.6. Chute du potentiel membranaire mitochondrial induite par les extraits
d’Inula viscosa L.
Nous avons également évalué l’effet des extraits d’Inula viscosa sur le potentiel
membranaire mitochondrial des cellules traitées. Les cellules ont été incubées en présence ou en
absence des extraits IV-HE et IV-DF (20µg/ml) pendant 24h. Les données obtenues par
spectrofluorimètrie sont normalisées par rapport aux cellules non traitées considérées comme
contrôle. Les résultats montrent qu’en présence des extraits IV-HE et IV-DF, une chute
significative du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) est observée après 24h de
traitement dans les cellules SiHa et HeLa (Figure 37).
104
Résultats
Figure 37: Effet des extraits d’Inula viscosa L. sur le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm).
Les cellules SiHa et HeLa sont traitées avec 20µg/ml des extraits IV-HE et IV-DF pendant 24h. Les
résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SD de trois expériences indépendantes ; *,
p<0,05.
5.7. Identification de la composition des extraits d’Inula viscosa L.
Afin de déterminer les molécules contenus dans les extraits d’Inula viscosa et qui sont
responsables de l’activité cytotoxique, la composition des extraits IV-HE et IV-DF a été
déterminée par CG/MS. Les chromatogrammes obtenus sont présentés dans les figures 66 et 67
(voir Annexes). L’analyse des données obtenues (Tableau 6), a révélé la présence d’un acide
sesquiterpènique : l’acide isocostique (46.05%) et de deux sesquiterpène lactones : tomentosine
(33.27%) et inuviscolide (13.04%) comme composés majoritaires.
105
Résultats
Tableau 6: Composés présent dans les extraits d’Inula viscosa L. identifiés by CG/MS.
Extraits
IV-HE
Composés
RT
Rendement
(%)
1-Amino-1-ortho-chlorophenyl-2-(2-quinoxalinyl)ethene
12.79
0.21
3-(4'-Methoxyphenyl)-1-acetyl-2-phenylindolizine
24.99
1.68
Acide isocostique
40.56
46.05
Isoaromadendrene epoxide
41.38
1.44
Phenanthrene, 7-ethenyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,8,10,10a- dodecahydro4α,7-dimethyl-1-methylene-, [4αS-(4αα’,4βα’,7α’,10αα’)]
42.74
0.69
Iso-velleral
46.26
1.87
6,9,12,15-Docosatetraenoic acid, methyl ester
46.82
0.37
Quercetine 7,3',4'-trimethoxy
46.93
0.22
Tomentosine
47.27
33.27
Inuviscolide
47.39
13.04
Tetracosane
54.32
0.77
6-Imino-8-(3',5'-dichlorolphenyl)-3,4-dihydro-2H, 6H-pyrimido
57.78
0.39
Acide Benzeneacetique, α’,4-bis[(trimethylsilyl)oxy]-, trimethylsilyl
ester
18 .91
10.44
9H-pyrrolo[3',4':3,4]pyrrolo[2,1-α]phthalazine-9,11(10H)-dione,10ethyl-8-phenyl
24.99
47.85
Acide isocostique
40.56
2.29
1 ,2-longidione
44.54
5.03
10 hydroxy-1 ,4,5,8-Tetramethyl anthrone
44.84
2.54
Chiapin B
46.27
1.55
2,4,7 Trimethyl-5 ,6-diphenyl-1H-isoindol-1 ,3(2H)-dione
47.01
9.12
Tomentosine
47.26
13.93
Methyl 2,3-Dideoxy-4-O-propargyl-6-O-(tert-butyldimethylsilyl)-αD-erythro-hex-2-enopyranoside
55.92
7.24
[2,1-b][1,3]thiazine-7-carbonitrile
IV-DF
RT : temps de rétention (min).
106
Résultats
B. Activité antiproliférative et induction de l’apoptose par les extraits
de Retama monosperma L.
1. Evaluation de l’activité cytotoxique:
Les différents extraits de Retama monosperma L. obtenus ont été évalués pour leurs effets
cytotoxiques. Les deux lignées cellulaires sont incubées en présence de concentrations
croissantes de chaque extrait pendant 72h. La viabilité cellulaire est déterminée à l’aide du test
MTT. Les données obtenues montrent que seul l’extrait dichlorométhane (Rm-DF), ayant
présenté les valeurs d’IC50 les plus faibles, possède un effet cytotoxique important vis-à-vis des
cellules SiHa et HeLa. Cet extrait induit une inhibition de la croissance des cellules significative
dans les cellules HeLa et SiHa d’une manière dose-dépendante (Figure 38). Les IC50 sont
comprises entre 14 et 21 µg/ml. En revanche, l’extrait méthanolique (Rm-ME) et l’extrait
hexanique (Rm-HE) ne présentent pas d’activité cytotoxique avec des IC50 > 80μg/ml (Tableau
6). Par ailleurs, l’extrait acétate d’éthyle (Rm-AF) présente un effet cytotoxique relativement
modéré vis-à-vis des cellules SiHa et HeLa.
Tableau 7: Valeurs des IC50 des extraits et des fractions de Retama monosperma L.
Extraits Retama monosperma L.
IC50 (µg/ml)
SiHa
HeLa
Extrait hexanique (Rm-HE)
› 80
› 80
Extrait méthanolique (Rm-ME)
› 80
› 80
Fraction dichlorométhane (Rm-DF)
14.57±4.15
21.33±7.88
Fraction acétate éthyle (Rm-AF)
27.54±5.64
77.47±2.25
10.88±0.78
6.28±0,35
Vinblastine
107
Résultats
Fraction dichloromethane
Fraction acétate éthyle
Extrait hexanique
100
50
SiHa
0
0
5
10
20
40
60
80
Fraction acétate éthyle
Fraction dichloromethane
Extrait hexanique
100
50
HeLa
0
0
5
10
20
40
60
80
Figure 38: Effet des extraits de Retama monosperma sur la croissance des cellules SiHa et HeLa.
Les cellules sont traitées à des doses croissantes d’extraits et fractions pendant 72h. Les données
représentent la moyenne±SD de trois expériences différentes réalisées en triplicate.
2.1. Altérations morphologiques liées de l’apoptose induite par Rm-DF:
Afin de déterminer si la mort cellulaire induite par la fraction dichlorométhane de Retama
monosperma, l’extrait ayant présentés un effet cytotoxique plus important, nous avons recherché
les altérations morphologiques liée à l’apoptose des cellules traitées, grâce au marquage au
Hoechst 33342. Les cellules sont incubées en présence ou en absence de Rm-DF (20µg/ml)
pendant 24, 48 et 72h. Après observation des cellules marquées au microscope à fluorescence,
les cellules traitées avec l’extrait Rm -DF présentent des noyaux ayant une condensation de la
108
Résultats
chromatine, une fragmentation nucléaire et la présence de corps apoptotiques dans les cellules
SiHa et HeLa (Figure 39). Une augmentation du nombre de cellules apoptotiques est observée
dès 24h de traitement par rapport aux cellules non traitées. En revanche, les cellules non traitées
considérées comme témoin présentent un noyau avec une répartition homogène de la chromatine.
L’extrait Rm-DF induisent l’apoptose des cellules SiHa et HeLa de manière temps-dépendante.
2.2. Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux :
Afin de confirmer que la mort cellulaire induites par l’extrait de Retama monosperma L.
est de nature apoptotique, nous avons réalisé un double marquage par l’annexine-iodure de
propidium des cellules traitées Les cellules sont traitées avec Rm-DF (20μg/ml) pendant 48h. Un
double marquage annexine-iodure de propidium a été éffectué, suivi d’une analyse en cytométrie
de flux. Les données obtenues montrent une augmentation du nombre de cellules apoptotiques
marquées à l’Annexine V, après 48h de traitement des cellules SiHa et HeLa avec Rm-DF
(Figure 40).
2.3. Production de ROS induite par l’extrait de Retama monosperma L.
Afin d’évaluer l’effet de l’extrait Rm-DF sur la production des ROS (espèces réactives de
l’oxygène), nous avons mesuré des ROS libérées après traitement des cellules à la concentration
de 40µg/ml pendant 24h. Les données obtenues sont normalisées par rapport aux cellules non
traitées considérées comme contrôle. Les résultats montrent qu’en présence de Rm-DF, la
production des ROS augmente significativement après 24h de traitement dans les cellules SiHa
et HeLa (Figure 41).
109
50
SiHa
24h
48h
40
30
20
10
0
72h
Résultats
50
40
24h
48h
72h
HeLa
30
20
10
0
Témoin
Rm-DF
Témoin
Rm-DF
Figure 39: Modifications morphologiques liées à l’apoptose induite par Rm-DF. Les cellules SiHa et
HeLa sont incubées en présence de l’extrait pendant 24, 48, et 72h. Les cellules marquées au Hoechst
33342 ont été observées au microscope à fluorescence (grossissement x40).
110
Résultats
Figure 40: Détection des cellules apototiques par cytomètrie de flux. Après 48h de traitement, les
cellules traitées avec Rm-DF sont doublement marquées avec de l’Annexine V et l’Iodure de Propidium
puis analysées par cytométrie en flux (Facscalibur).
Figure 41: Effet de l’extrait Rm-DF sur la production des ROS. Les cellules SiHa et HeLa sont
traitées avec Rm-DF (40µg/ml) pendant 24h. Les résultats présentés sont des moyennes±SD de
trois expériences indépendantes réalisées en triplicate ; *, p<0,05 ; ** , p<0,01.
111
Résultats
2.4. Effet de Rm-DF sur le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) :
Nous avons évalué l’effet de l’extrait Rm-DF sur le potentiel membranaire mitochondrial
après traitement des cellules à la dose de 20 et 40µg/ml pendant 24h. Les données obtenues ont
été normalisées par rapport aux cellules non traitées considérées comme contrôle. Les résultats
montrent qu’en présence de Rm-DF, une chute significative du potentiel membranaire
mitochondrial (ΔΨm) est observée après 24h de traitement dans les cellules SiHa et HeLa
(Figure 42). Cette chute est plus importante à la concentration de 40µg/ml.
Figure 42: Effet de l’extrait Rm-DF sur le potentiel membranaire mitochondrial. Les cellules SiHa et
HeLa sont traitées avec Rm-DF (20 et 40µg/ml) pendant 24h. Les résultats présentés sont des
moyennes±SD de trois expériences indépendantes réalisées en triplicate ; *, p<0,05 ; ** , p<0,01.
2.5. Expression des protéines Pro-Caspase3, Bcl2 et clivage de PARP :
Afin de d’éplorer l’expression des protéines impliquées dans la signalisation de l’apoptose
des cellules traitées par l’extrait Rm-DF. Les cellules sont incubées en présence ou en absence de
Rm-DF (20µg/ml) pendant 24, 48h ou 72h. L’expression des protéines est analysée par Western
blot. Les données obtenues (Figures 43), montrent que le traitement des cellules avec Rm-DF,
induit une diminution progressive de la forme inactive de la Caspase 3 au cours du temps dans
les deux lignées SiHa et HeLa.
Une apparition progressive du PARP clivé (fragment de 89kDa) a également été observée
au cours du temps dans les deux lignées après 24h de traitement. En parallèle à l’activation de la
Caspase 3 et le clivage de PARP, l’expression de Bcl-2 est fortement réduite en fonction du
temps, dés 24h de traitement par l’extrait Rm-DF dans les lignées SiHa et HeLa. L’ensemble de
ces résultats montrent que Rm-DF exerce son effet cytotoxique en induisant l’apoptose
Caspases-dépendante et faisant intervenir la voie mitochondriale.
112
Résultats
Figure 43: Effet des extraits de Retama monosperma sur l’expression de la pro-Caspase 3, le clivage
de PARP et Bcl2. Les cellules SiHa et HeLa sont incubées avec Rm-DF (20µg/ml) pendant 24, 48 et 72h.
Les cellules sont ensuite lysées et 30µg d’extrait protéique sont analysées par western blot. La β-actine est
utilisées comme contrôle de dépôt.
2.6. Identification de la composition de la fraction dichlorométhane de Retama
monosperma L.
La détermination des molécules responsables de l’activité cytotoxique de la fraction
dichlorométhane de Retama monosperma, a été réalisée par CG/MS. Les chromatogrammes
d’analyse de l’extraits Rm-DF par CG/MS obtenus est présenté dans la figure 68 (voir Annexes).
L’analyse des données obtenues (Tableau 8), a révélé la présence de 5 alkaloides quinolizidines :
sparteine (10.97%), L-methyl-cytisine (9.11%), 17- oxosparteine (3.49%), lupanine (0.93%) et
anagyrine (39.63%), comme composés majoritaires.
113
Résultats
Tableau 8: Composés contenus dans la fraction dichlorométhane de Retama monosperma,
identifiés par CG/MS.
RT
composés
CAS
Rendement (%)
9,89
α-Pinene
7785-70-8
2.73
13,79
1,8-Cineole
470-82-6
8.03
18.91
Benzeneacetic acid, α,4-bis[(trimethylsilyl)oxy]-,
trimethylsilyl ester
56114-69-3
4.71
95647-39-5
19.05
24.99
9H-pyrrolo[3',4':3,4]pyrrolo[2,1-a]phthalazine-9,
11(10H)-dione,10-ethyl-8-phenyl
38,98
Sparteine
90-39-1
10.97
42,71
Hexadecanoic acid
57-10-3
0.86
44,23
L methyl cytisine
486-86-2
9.11
46,67
17- oxosparteine
489-79-5
3.49
47.78
4-(N-(3-trifluoromethylphenyl)-amino)-5,6-dimethyl7H-pyrro[2.3-d]pyrimidine
100633-91-8
0.50
48,78
Lupanine
550-90-3
0.93
53 ,73
Anagyrine
486-89-5
39.63
114
Résultats
C. Statut MDR des extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF:
Dans le but d’évaluer le statut MDR des extraits d’Inula viscosa (IV-HE et IV-DF) et
l’extrait de Retama monosperma (Rm-DF), nous avons évalué leur cytotoxicité vis-à-vis de
différentes lignées cellulaires résistantes à la chimiothérapie anticancéreuse (obtenues soit par
sélection ou par transfection). Pour cela les cellules sont incubées avec des concentrations
croissantes en extraits de plantes ou du médicament anticancéreux (Doxorubicine, Etoposide,
mitoxantrone et méthotrexate) pendant 72 h. La viabilité cellulaire est évaluée par le test MTT.
Nous pouvons ainsi déterminer la concentration du médicament ou des extraits qui induisent
50% d’inhibition de croissance cellulaire (CI50) dans les différentes lignées cellulaires. Nous
avons également calculé l’indice de résistance (IR) des lignées résistantes par rapport aux lignées
parentales.
Dans un premier temps nous avons évaluer le statut MDR des extraits en utilisant des
lignées résistantes aux médicaments anticancéreux par sélection à savoir : la lignées MCF7/DOX
exprimant la protéine Pgp et résistante à la doxorubicine et la lignées MCF7/VP exprimant la
protéine MRP1 et résistante à l’étoposide (Tableau 9). Les données obtenues montrent que les
lignées testées ne présentent pas de résistance significative vis-à-vis des extraits d’Inula viscosa
(IV-HE et IV-DF) et de l’extrait de Retama monosperma (Rm-DF). Seules les cellules
MCF7/DOX présentent des index de résistance relativement modérés et qui varient entre 1,70 et
1,90 pour les extraits IV-HE et IV-DF par comparaison à la doxorubicine et à l’étoposide. En
effet, une résistance des cellules MCF7/DOX à la doxorubicine par rapport à la lignée parentale
MCF7 avec un indice de résistance de 130 et une résistance significative des cellules MCF7/VP
avec un indice de résistance de l’étoposide de l’ordre de 18,5, ont été observé.
Nous avons également évalué le statut MDR des extraits en utilisant des lignées cellulaires
résistantes à la chimiothérapie, transféctées par les gènes de résistance ABCB1/Pgp,
ABCC1/MRP1, ABCC3/MRP3 et ABCG2/BCRP. Le methotrexate et la mitoxantrone ont été
utilisé comme contrôle positif pour les protéines de transport MRP3 et BCRP respectivement.
Cependant la doxorubicine est utilisée comme contrôle positif de la Pgp et MRP1. Les données
obtenues (Tableau 10) montrent que les extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF n’induisent pas de
résistance vis-à-vis des lignées testées.
L’ensemble de ces résultats montre que les extraits d’Inula viscosa et la fraction
dichlorométhane de Retama monosperma ne sont pas substrat MDR.
115
Résultats
Tableau 9: Statut MDR des extraits IV-HE et IV-DF vis-à-vis de lignée cellulaire du carcinome
mammaire (MCF7) sélectionnées en présence de doxorubicine (MCF7/DOX) et l’étoposide
(MCF7/VP).
Extraits
MCF7/S
IC50%
14,68 ± 1,7
MCF7/DOX
MCF7/VP
26,42 ± 2,54
11,91 ± 0,89
1.79
0.81
42,44 ± 3,25
12,74 ± 2,65
1.89
0.57
37,42 ± 6,37
23,25 ± 2,63
1,65
1,12
19,6 ± 0,85
ND
130
ND
ND
54,98±3,23
ND
18.51
IV-HE (µg/ml)
IR
IC50%
22,41 ± 3,76
IV-DF (µg/ml)
IR
IC50%
20,66 ± 2,5
Rm-DF(µg/ml)
IR
IC50%
0,15 ± 0,02
Doxorubicin (µM)
IR
IC50%
2,97±0,80
Etoposide (µM)
IR
ND: Non déterminé ; IR: Indice de Résistance
Tableau 10: Statut MDR des extraits IV-HE et IV-DF vis-à-vis des lignées cellulaires résistantes à la
chimiotérapie, transfectées par un des gènes de résistance (ABCB1/Pgp, ABCC1/MRP1,
ABCC3/MRP3 et ABCG2/BCRP).
Extraits
IV-HE
(µg/ml)
IC50%
LR73
LR73/Pgp
HEK
HEK/BCRP
2008
2008/MRP1
2008/MRP3
14,96±0,27
14,12±0,35
7,27±0,66
7,45±0,6
7,88±0,31
12,61±0,36
6,19±0,41
1,60
0,78
20,64±1,48
21,75±1,78
1,06
1,11
>80
73,48±7,69
≥2,26
2,08
1,12±0,035
-
12,44
ND
-
-
ND
ND
12.5±1,4
175±3.76
-
14
IR
IV-DF
(µg/ml)
IC50%
0,94
42,73±3,13
IR
Rm-DF
(µg/ml)
Doxorubicine
(µM)
IC50%
43,44±3,44
IC50%
0,048±0,001
IC50%
IR
38,30±0,57
4,51±0,1
-
-
-
ND
19,1±0,86
35,29±1,82
-
0,09±0,004
ND
0,036±0,002
ND
-
19,44±1,55
0,50
93,95
IR
Methotrexate
(µM)
38,05±1,61
15,56±0,81
0,60
0,87
IR
Mitoxantrone
(µM)
26,39±2,47
0,62
IR
IC50%
26,54±2,11
1,02
1,17±0,44
-
32,5
-
ND
-
116
Résultats
Partie 3 :
Purification de la tomentosine et Mise en évidence de
son mécanisme d’action
A. Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L. :
isolement des composés majoritaires
1. Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L.
2. Analyse structurale des composés isolés
B. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et induction de
l’apoptose par la tomentosine.
Evaluation de l’activité cytotoxique des produits purifiés
Activité antiproliférative de la tomentosine en fonction du temps
Effet de la tomentosine sur le télomère simple brin
Effet de la tomentosine sur des cellules cancéreuses de phénotype
ALT
5. Etude de l’apoptose induite par la tomentosine
1.
2.
3.
4.
C . Statut MDR de tomentosine
117
Résultats
Nous avons montré lors de cette partie que l’extrait hexanique ainsi que la fraction
dichlorométhane issus d’Inula viscosa L. induisent une inhibition de la prolifération d’une
manière significative des lignées cellulaires provenant du cancer du col de l’utérus. Nous avons
également mis en évidence les voies par lesquelles ces extraits induisent leurs effets cytotoxiques
vis-à-vis des cellules SiHa et HeLa. Les extraits IV-HE et IV-DF induisent une inhibition de
l’activité télomérase ainsi que l’induction de l’apoptose Caspase-dépendante. Ceci nous a donné
une motivation sans égale pour la suite de ce travail de manière à déterminer les molécules
responsables de l’effet antiprolifératif de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L (IV-HE).
Dans un premier temps, nous avons procédé au fractionnement bio-guidé et une
purification des métabolites secondaires majoritairement contenus dans l’extrait (IV-HE). Afin
d’identifier et de caractériser la composition chimique des fractions obtenues, nous avons réalisé
par les techniques d’analyses à savoir la chromatographie phase gazeuse couplée à la
spectroscopie de masse (CG/MS) pour les fractions et une analyse en RMN pour les produits
purs. Ces analyses ont été réalisées à la plate forme (UTARS) du Centre National de Recherche
Scientifique et Technique (CNRST). Deux molécules majoritairement contenus dans l’extrait
hexanique ont été purifiées.
Dans un deuxième temps, nous avons tout d’abord étudié l’effet des molécules purifiées
sur la croissance et la prolifération des cellules du cancer du col de l’utérus (SiHa et HeLa). La
molécule ayant présentée un effet inhibiteur le plus important à savoir la tomentosin, a été
évaluée pour son effet inhibiteur de la télomérase en étudiant son effet sur la longueur du simple
brin télomérique. Afin d’identifier les voies de signalisation impliquées dans l’apoptose induite
par la tomentosin, nous avons étudié les modifications morphologiques des cellules traitées par
la tomentosin grâce au marquage avec le Hoechst 33342 et la microscopie de fluorescence, au
suivi des événements mitochondriaux tels que la modification du potentiel membranaire
mitochondrial (ΔΨ) et la production d’espèces actives de l’oxygéne (ROS). Nous avons
également étudié l’effet de la tomentosin sur le cycle cellulaire des cellules traitées, sur
l’expression des protéines impliquées dans le processus apoptotiques et sur l’activité de la
Caspase 3.
118
Résultats
A. Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L.
: isolement des composés majoritaires
1. Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa :
L’extrait hexanique (20g) est dissous dans de l’acétonitrile donnant ainsi l’extrait
acétonitrile Fa (15g) et un résidu insoluble Fn (4,2g). L’extrait acétonitrile évaporé subit dans un
premier temps un fractionnement sur colonne de gel de silice, en utilisant un gradient de solvant
CH2CL2/Hexane. Les fractions éluées obtenues ont été analysées par chromatographie sur
couche mince (CCM) dans le but de réunir les fractions qui présentent le même profil. Le
fractionnement de l’extrait acétonitrile conduit à sept fractions après rassemblement, Parmi les
fractions obtenues, celles qui présentent un produit majoritaire sont retenues pour une
purification plus poussée à savoir les fractions F3 et F6 (Figure 44).
Les fractions obtenues ont été analysé par chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectroscopie de masse (CG/MS), afin de vérifier leurs puretés. Une analyse par RMN 1H et 13C
a été réalisé ensuite pour déterminer la structure chimique des sous-fractions pures obtenues. La
fraction F3 a été analysée par CG/MS indiquant une composition simple pour laquelle l’acide
isocostique constitue le composé majeur (84,86%) (figures 45 et 46). L’analyse phytochimiques
de la fraction F6 effectuée par CG/MS montre que cette fraction est constituée majoritairement
de tomentosine (75,28%) (figures 47 et 48).
Figure 44: Fractionnement de l’extrait hexanique
119
Résultats
RT: 4.00 - 60.02 SM: 15G
NL:
1.76E7
TIC F: MS
F58_C_GC
01
RT: 40.12
100
90
80
70
60
50
40
RT: 43.86
30
20
RT: 45.35
10
RT: 12.07
0
18.16 RT: 24.21
10
20
RT: 53.21
RT: 33.89
30
Time (min)
40
50
60
Figure 45: Spectre d’analyse de la fraction F3 par CPG
F58_C_GC01 #5910 RT: 40.12 AV: 1 NL: 1.32E6
T: + c Full ms [ 50.00-300.00]
219.12
Relative Abundance
100
80
173.10
60
91.11
145.12
79.17
40
119.15
201.14
161.07
67.17
20
234.10
183.17
262.76 282.08
0
50
100
150
200
250
300
m/z
Figure 46: Spectre d’analyse du composé majoritaire contenu dans la fraction F3 par SM
120
Résultats
RT: 4.00 - 60.02 SM: 15G
NL:
2.74E7
TIC F: MS
F58_C_GC
03
RT: 46.56
100
90
80
Relative Abundance
70
60
50
40
RT: 42.70
30
20
RT: 42.01
10
RT: 12.09
0
10
RT: 39.75
18.17 RT: 24.21
20
33.10
30
Time (min)
RT: 50.32
RT: 54.27
40
50
60
Figure 47: Spectre d’analyse de la fraction F6 par CPG
Relative Abundance
F58_C_GC03 #6734 RT: 46.56 AV: 1 NL: 1.78E6
T: + c Full ms [ 50.00-300.00]
145.09
100
80
91.16
60
131.16
117.10
159.09
40
67.14
190.01
20
215.12
231.11
281.03
0
50
100
150
200
250
300
m/z
Figure 48: Spectre d’analyse du composé majoritaire contenu dans la fraction F6 par SM.
Les fractions F3 (2,2g) et F6 (1,8g) ont subit un sous-fractionnement par chromatographie
sur colonne de gel de silice en utilisant comme phase mobile Hexane/Acétate d’éthyle, obtenant
ainsi deux sous fractions à partir de la fraction 3 (Figure 49) et le fractionnement de la fraction
F6 a donné 4 sous fractions (Figure 50).
Le fractionnement des fractions F3 et F6 a conduit à l’obtention des deux molécules pures
à savoir tomentosine et l’acide isocostique acide. Ce résultat est conforté par la poursuite de
121
Résultats
l'analyse des spectres de RMN qui permettent clairement de confirmer la structure et la pureté
des produits.
Figure 49: Purification de la fraction F3.
Figure 50: Fractionnement de la fraction F6.
2. Analyse structurale des composés isolés
2.1. Détermination de la structure chimique du composé F3-1
L’analyse des spectres RMN de la fraction F3-a obtenus, montre qu’il s’agit d’un composé
pur de structure connue à savoir : un sesquiterpene acide, l’acide isocostique (figure 51). de
122
Résultats
formule brute : C15H22O2
et de
poids moléculaire de 234g/mol. Les caratéristiques
spectrales ont été déterminé à partir du spectre RMN 1H, et du spectre RMN 13C.
Le dépouillement du spectre RMN1H de l’acide isocostique (figure 69, voir Annexes),
nous a permis d’identifier sa structure. En particulier, nous avons relevé un triplet centré en
5,32ppm correspondant au proton de la double liaison cyclique H7. Ensuite, deux doublets à
6,32ppm et 5,68 ppm indiquant la présence de deux protons vinyliques H12a et H12a’, et un
singulet à 1,6 ppm intégrant les trois protons du groupe méthyle (CH3) de la double liaison
cyclique et un autre vers 1,27ppm intégrant trois protons H10 du goupe méthyle (CH3) de la
jonction cyclique. Des multiplets sortant entre 0,82 à 2,51ppm intégrant les 12 protons cycliques
(H1 à H6 et H8a). Sur le spectre RMN 13C (figure 70, voir Annexes), nous avons relevé des pics
confirmant les carbones de l’acide isocostique présentés dans le tableau 11.
Figure 51: Structure chimique de l’acide isocostique.
Tableau 11: Donnés spectrales RMN 13C de l’acide isocostique (fraction F3-a).
Acide isocostique
C1
C2
C3
C4
C4a
C5
C6
C7
C8
C8a
C9
C10
C11
C12
C13
29,36
40,12
27,42
37,81
32,26
37,81
21,12
121,06
134,77
46,85
15,65
22,95
145,31
125,05
172,67
123
Résultats
2.2. Détermination de la structure chimique du composé F6-3
L’analyse des spectres RMN de la fraction F6-3 obtenus, montre qu’il s’agit d’un composé
pur de structure connue à savoir : un sesquiterpene lactone, tomentosine (figure 52), de formule
brute : C15H20O3 et de poids moléculaire de 248g/mol . Les caratéristiques spectrales ont été
déterminé à partir du spectre RMN 1H, et du spectre RMN 13C.
Figure 52: Structure chimique de la tomentosine.
L’interprétation du spectre RMN 1H (figure 71, voir Annexes), montre la présence de deux
signaux sous forme d’un doublet dédoublé vers 6,185 ppm et 5,475ppm attribuant aux deux
protons vinyliques H12a et H12a’. Un quadruplet apparaît vers 5,384ppm correspondant au proton
H2, un septuplet vers 4,592ppm intégrant le proton H5a de la jonction cyclique et un multiplet
centré à 3,27ppm correspondant à l’autre proton de la jonction H3a. Ensuite, on a pu identifier la
présence d’un singulet intense vers 2,1ppm intégrant trois protons H11 du groupe méthyle de la
fonction cétonique et un doublet intense vers 1,075ppm intégrant trois protons H13 du groupe
méthyle du cycloheptènique. Finalement, nous avons relevé des multiplets situés entre 2,50 à
1,78ppm intégrant 9 protons (5 protons du cycle, H3, H6 et H7 et 4 protons de la chaîne
aliphatique H8 et H9). L’analyse du spectre RMN 13C (figure 72, voir Annexes), nous a permis de
relever les pics correspondant aux atomes de carbone de la molécule du tomentosine, indiqués
dans le tableau 12.
124
Résultats
Tableau 12: Donnés spectrales RMN 13C de la tomentosine (fraction F6-3).
Tomentosine
C1
C2
C3
C3a
C4
C5
C5a
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
C13
144,41
120,08
30,40
42,58
138,98
170,19
79,25
36,63
29,87
26,53
42,08
208,13
35,39
122,08
20,91
2.3. Evaluation de l’activité cytotoxique des fractions obtenues à partir de l’extrait
hexanique d’Inula viscosa L.
Un screening bio-guidé a été effectué afin de déterminer et d’isoler les molécules
responsables de l’activité antiproliférative de l’extrait hexanique d’Inula viscosa. Une évaluation
de l’effet cytotoxique des différentes fractions vis-à-vis des deux lignée cellulaires SiHa et HeLa.
Les cellules ont été incubé en présence ou absence des fractions obtenues à différentes
concentrations pendant 72h La viabilité des cellules a été déterminé à l’aide du test MTT. Les
résultats obtenues ont montré que la fraction acétonitrile (Fs) présente un effet inhibiteur de la
croissance des cellules SiHa et HeLa d’une manière significative. Par contre les fractions Fn, F1,
F2, F3, F4, F5 et F7, ne présentent aucun effet cytotoxique pour l’intervalle des concentrations
testées (IC50>50µg/ml) (tableau 13). Les fractions des composés pures à savoir tomentosine et
l’acide isocostique présentant les valeurs d’IC50 les plus faibles, exercent un effet antiprolifératif
significatif et important vis-à-vis des deux lignées SiHa et HeLa. Ces résultats montrent que
tomentosine est le principe actif de l’effet antiprolifératif de l’extrait hexanique d’Inula viscosa
vis-à-vis des cellules SiHa et HeLa.
125
Résultats
Tableau 13: Evaluation de la cytotoxicité des fractions et sous-fractions issues de l’extrait
hexanique d’ Inula viscosa vis-à-vis des lignées SiHa et HeLa.
IC50 (µg/ml)
Fractions et produits
purs
SiHa
HeLa
Fa
27,33±1,88
20,35±1,25
Fn
>100
>100
F1
>50
>50
F2
>50
>50
F4
>50
>50
F5
>50
>50
31,2±1,1
16,42±0,6
3±0,46
2,67±0,1
F3-a
acide Isocostique
F6-3
Tomentosine
Les valeurs
des IC50 (µg/ml) présentés sont des moyennes±SD d’expériences
représentatives réalisées en triplicate.
B. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et
induction de l’apoptose par la tomentosine.
1. Evaluation de l’activité cytotoxique des produits purifiés
Les effets cytotoxiques de la tomentosine et de l’acide isocostique ont été étudiés sur les
deux lignées SiHa et HeLa. Ces cellules ont été incubées en absence ou en présence de diverses
concentrations des composés purs (2, 5, 10, 20, 40, 80 et 200 µM) durant 72h. La doxorubicine
est utilisé comme contrôle positif. Les résultats obtenus montrent que tomentosine présente un
effet inhibiteur significatif et important de la croissance des deux lignées cellulaires testées,
d’une manière dose-dépendante (Figure 53). Après 72h de traitement, les IC50 de tomentosine
sont 12,12±1,87 µM et 10,77±0,4 µM pour les cellules SiHa et HeLa, respectivement (Tableau
12). En revanche, l’acide isocostique présente un effet inhibiteur relativement modéré avec des
IC50 de 133,31±4,68µM et 70,55±3,08µM pour les cellules SiHa et HeLa, respectivement.
2. Activité antiproliférative de la tomentosine en fonction du temps
Nous avons également étudié l’effet antiprolifératif de tomentosine en fonction du temps,
en mesurant la viabilité des cellules traitées par tomentosine à différents d’incubation (24, 48, 72
et 96h). Les résultats obtenus montrent que tomentosine induit un effet inhibiteur de la
126
Résultats
prolifération des lignées SiHa et HeLa d’une manière dose et temps-dépendant. Les données
obtenues sont présentées sous formes d’histogrammes représentant les variations des IC50 en
fonction du temps (Figure 54). A 24h de traitement, la tomentosine présente des IC50 pour les
lignées SiHa et HeLa de 25,68±1,86µM et 23,69±0,79µM, respectivement. Nous observons une
diminution des valeurs des IC50 après 48h et 72h de traitement pour les deux lignées cellulaires
pour atteindre (SiHa IC50 7,10±0,78µM et HeLa: 5,87±0,36µM) après 96h de traitement.
HeLa
100
SiHa
50
0
0
2
5
20
40
80
200
Acide isocostique (µM)
SiHa
HeLa
100
50
0
0
2
4
8
20
40
80
Tomentosine (µM)
Figure 53: Effet de tomentosine et l’acide isocostique sur la prolifération des cellules SiHa et HeLa.
Les cellules sont traitées avec des doses croissantes de produits pendant 72h. La viabilité cellulaire est
déterminée à l’aide du test MTT. Les données représentent la moyenne±SD de trois expériences
différentes réalisées en triplicate.
127
Résultats
Tableau 14: Valeurs des IC50 (µg/ml) de la tomentosine vis-à-vis de cellules SiHa et HeLa.
IC50 (µM)
Produits purifiés
Acide isocostique
SiHa
133,31±4,68
HeLa
70,55±3,08
Tomentosine
12,12±1,87
10,77±0,4
Doxoribicine
0,3±0,026
0,26±0,06
La doxorubicine est utilisée comme contrôle posistif. Les données représentent la
moyenne±SD de trois expériences différentes réalisées en triplicate.
30
24h
48h
72h
96h
IC50% (µM)
25
20
15
10
5
0
SiHa
HeLa
Figure 54: Activité antiproliférative de tomentosine en fonction du temps. Les cellules SiHa et HeLa
sont traitées par des concentrations croissantes de tomentosin durant 24, 48, 72 et 96h. Les données
représentent la moyenne±SD de trois expériences différentes réalisées en triplicate.
3. Effet de la tomentosine sur le télomère simple brin
Afin de mettre en évidence l’effet potentiel de la tomentosine sur le simple brin
télomérique en inhibant l’activité catalytique de la télomérase, nous avons étudié l’effet de la
tomentosine sur la longueur du brin G télomérique grâce à la technique d’hybridation en
condition non dénaturante avec une sonde 21C, radiomarquée au 32P. Le signal d’hybridation de
la sonde oligonucléotidique complémentaire au brin G mesuré à l’aide d’un phosphoimager
permet en effet d’estimer la longueur du brin G. Pour ce faire, les cellules SiHa et HeLa ont été
incubées pendant 72h en absence ou en présence de 10 et 20µM de tomentosine. Le simple brin
télomérique a été mesuré par l’hybridation avec une sonde 21C . Le signal du brin G est
quantifié et rapporté à la quantité d’ADN totale obtenu grâce au bromure d’Ethidium (EtBr). Les
résultats sont présentés sous forme d’histogrammes représentant la moyenne de trois expériences
différentes (figure 55).
128
Résultats
Figure 55: Effet de la tomentosine sur le simple brin télomérique.
Les histogrammes représentent la quantification du signal du simple brin télomérique, des lignées
cellulaires SiHa et HeLa après traitement par la tomentosine (10 et 20µM) durant 72h. Les résultats
sont normalisés et la taille des simples brins est exprimé en % par rapport aux cellules non traitées
considérées comme témoins (100%). Les résultats présentés sont des moyennes±SD d’expériences
représentative réalisées en triplicate. * , p<0,05 ; ** , p<0,01.
Les signaux d’hybridation obtenus montrent qu’après traitement par 10μM de tomentosine,
une diminution significative du signal d’hybridation est observée, atteignant 76,86±9,77 % par
rapport aux cellules témoin non traitées après 72 h d’incubation pour les cellules SiHa, et
85,29±1,52 % pour les cellules HeLa. Cette diminution du signal est plus importante après
traitement par 20µM de tomentosine, atteignant 63,32±10,09 %
pour les cellules SiHa et
74,11±2,77 % pour les cellules HeLa. Ces données montrent clairement que tomentosine induit
un raccourcissement de la taille du simple brin télomérique significativement dans les cellules
SiHa et HeLa d’une manière dose-dépendante.
129
Résultats
4. Effet de la tomentosine sur des cellules cancéreuses de phénotype
ALT
Dans le but d’évaluer l’effet de tomentosine sur les cellules cancéreuses télomérase
négative et de phénotype ALT, nous avons testé lors de cette expérience, la capacité de la
tomentosine à inhiber la croissance des cellules MRC5/V1, fibroblastes transféctées par
l’antigène T de SV40. Les cellules MRC5/V1 et MRC5 ont été traitées à différentes
concentrations pendant 72h d’incubation. Comme le montre la figure 56, la tomentosine inhibe
significativement la prolifération des cellules MRC5/V1, avec une IC50 de 7,10±0,22 µM. En
revanche, la tomentosine inhibe faiblement la croissance des cellules de la lignée parentale
MRC5, avec une IC50 de 33,46±0,88µM. Les cellules MRC5/V1 transfectées sont 4,7 fois plus
sensible à la tomentosine que les cellules MRC5. Ce résultat obtenu confirme bien, que le
sesquiterpène lactone, tomentosine est capable d’inhiber aussi la croissance de cellules
cancéreuses télomérase positive que les cellules cancéreuses de phénotype ALT.
MRC5
100
MRC5/V1
50
0
0
1
5
10
20
50
100
Tomentosine (µM)
Figure 56: Effet de la tomentosine sur la croissance des lignées cellulaires MRC5 et MRC5/V1. Les
cellules sont traitées à différentes concentrations de tomentosine pendant 72h de traitement. La viabilité
cellulaire est déterminée par le test MTT. Les données représentent la moyenne±SD de trois expériences
indépendantes.
5. Etude de l’apoptose induite par la tomentosine
Nous nous sommes intéressé également à l’étude des voies de signalisation impliquées
dans l’apoptose induite par la tomentosine, nous avons étudié les modifications morphologiques
des cellules traitées par la tomentosine grâce au marquage avec le Hoechst 33342 et la
microscopie de fluorescence, au suivi des événements mitochondriaux tels que la modification
130
Résultats
du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) et la production d’espèces actives de l’oxygéne
(ROS). Nous avons également étudié l’effet de la tomentosine sur le cycle cellulaire des cellules
traitées, sur l’expression des protéines impliquées dans le processus apoptotiques et sur l’activité
de la Caspase 3.
5.1. Mise en évidence des altérations morphologiques liées à l’apoptose
Afin de mettre en évidence les modifications morphologiques nucléaires qui apparaissent
au cours de l'apoptose induite par tomentosine, un marquage au Hoechst a été réalisé. Ce
marquage permet de visualiser les noyaux cellulaires de toutes les cellules et de détecter
d’éventuelles fragmentations nucléaires, condensation nucléaires, et présence de corps
apoptotiques, caractéristiques de l’apoptose. Les lignées cellulaires SiHa et HeLa sont incubées
durant 24h, 48h et 72h avec des concentrations croissantes de tomentosine (10, 20 et 40 μM). Un
marquage au Hoechst des cellules traitées par tomentosine a été réalisé, suivi d’une observation
au microscope à fluorescence. Les données obtenues sont présentées dans les figures 57 et 58.
Après traitement des cellules SiHa et HeLa, le pourcentage de cellules apoptotiques
augmente significativement dés 24h de traitement en fonction de la concentration en tomentosine
et de la durée de traitement. Le pourcentage des cellules apoptotiques le plus élevé atteint 57 ±
7,07 % et 44 ± 5,66 % pour les cellules SiHa et HeLa respectivement, après un traitement de
20µM de tomentosine pendant 72h. Ces résultats sont en corrélation avec les tests de cytotoxicité
qui montrent que la lignée SiHa semble être plus sensible à la tomentosine par rapport à la lignée
HeLa.
131
Résultats
70
**
60
24h
48h
50
**
**
72h
40
*
30
*
20
*
10
0
Témoin
10µM
20µM
Tomentosine
Figure 57: Altérations morphologiques induites par tomentosine. Les cellules SiHa sont traitées à
des concentrations (10 et 20µM) de tomentosine pendant 24, 48 et 72h. Les résultats présentés
sont des moyennes±SD d’expériences représentative réalisées en triplicate. *: p<0,05 ; ** : p<0,01.
132
Résultats
Figure 58: Altérations morphologiques induites par tomentosine. Les cellules HeLa sont traitées à
des concentrations (10 et 20µM) de tomentosine pendant 24, 48 et 72h. Les résultats présentés
sont des moyennes±SD d’expériences représentative réalisées en triplicate. * : p<0,05 ; ** : p<0,01.
133
Résultats
5.2. Production d’espèces actives de l’oxygène (ROS) :
Afin de s’assurer que la mort cellulaire provoquée par tomentosine est de nature
apoptotique médiée par la voie mitochondriale, nous avons mesuré la production intracellulaire
des ROS après 24h de traitement des cellules SiHa et HeLa, à l’aide de la sonde fluorescente
C2938. Les cellules traitées et marquées ont été analysées par spectrophotométrie. Les résultats
ont été normalisés par rapport aux cellules témoin non traitées (Figure 59).
Après 24h de traitement par la tomentosine, la production des ROS augmente
significativement à la concentration de 20µM dans les deux lignées cellulaires. Cette
augmentation est plus importante à la concentration de 40µM. Tomentosine induit une
production des ROS de manière dose-dépendante.
Figure 59: Effet de tomentosine sur la production des ROS dans les cellules SiHa et HeLa. Les
cellules sont traitées à des concentrations croissantes de tomentosine (10, 20 et 40 µM) pendant 24h. Les
résultats présentés sont des moyennes±SD d’expériences représentative réalisées en triplicate. * : p<0,05 ;
** : p<0,01.
134
Résultats
5.3. Effet de tomentosine sur le potentiel membranaire mitochondrial
Afin de confirmer que l’apoptose des SiHa et HeLa par tomentosine est médiée par la voie
mitochondriale, nous avons mesuré les variations du potentiel membranaire mitochondrial après
24h de traitement à l’aide de la sonde fluorescente JC-1. Les cellules traitées et marquées ont été
analysées par spectrophotométrie. Les variations du potentiel membranaire mitochondrial sont
présentées dans la figure 60. Les données obtenues montrent une chute significative du potentiel
membranaire mitochondriale après traitement des SiHa et HeLa par 20µM. Cette augmentation
et plus importante après traitement par 40µM. Tomentosine induit une chute du potentiel
membranaire mitochondrial d’une manière dose-dépendante. Ce résultat confirme bien que
tomentosine induit l’apoptose des cellules SiHa et HeLa via des événements mitochondriaux.
Figure 60: Effet de tomentosine sur les variations du potentiel membranaire mitochondrial des
cellules SiHa et HeLa. Les cellules sont traitées à des concentrations croissantes de tomentosine
(10, 20 et 40 µM) pendant 24h. Les résultats présentés sont des moyennes±SD d’expériences
représentative réalisées en triplicate. * , p<0,05 ; ** , p<0,01.
5.4. Mise en évidence de l’expression de protéines impliquées dans l’apoptose
La détermination l’expression des protéines impliquées dans la régulation de l’apoptose
des cellules traitées par tomentosine a été réalisée par Western blot. Les cellules ont été traitées
par 10, 20 et 40µM de tomentosine durant 24, 48 et 72h d’incubation (Figure 61). L’actine est
utilisée comme contrôle pour s’assurer qu’une quantité identique de protéines est déposée pour
chaque échantillon. Les données obtenues montrent une diminution de l’expression de la
proCaspase-3 (du clivage protéolytique de celle-ci en Caspase-3 active) à partir de 24 h de
traitement par tomentosine, avec une disparition totale de cette protéine à 72h ; suggérant que la
forme inactive a été clivée en sa forme active.
135
Résultats
Dés 24h de traitement des cellules HeLa par la tomentosine, un fragment correspondant au
PARP clivé (89KDa), qui constitue un marqueur de l’apoptose, est détectable au cours du temps
dans les deux lignées après 24h de traitement. En parallèle à l’activation de la Caspase 3 et le
clivage de PARP, l’expression de Bcl-2 est fortement réduite en fonction du temps, dés 24h de
traitement par tomentosine dans les lignées SiHa et HeLa.
L’ensemble de ces résultats montrent que la tomentosine induit dans les cellules SiHa et
HeLa une apoptose qui passe par la voie mitochondriale. En effet, le traitement des cellules par
différentes concentrations de tomentosine induit une diminution de l’expression de la protéine
anti-apoptotique Bcl-2 dés 24h de traitement d’une manière dose et temps-dépendants. Ceci se
traduit par une diminution jusqu’à disparition du signal de la bande correspondante à la protéine
Bcl-2 au bout de 72h de traitement. Néanmoins ce résultat a été confirmé par l’analyse de la
production des espèces réactives de l'oxygène (ROS) du potentiel membranaire mitochondrial.
Pour compléter les résultats obtenus par western blot et étudier plus en détails l’implication
des Caspases dans l’apoptose induite par la tomentosine, nous avons ensuite mesuré l’activité
Caspase 3 des cellules traitées.
136
Résultats
Figure 61: Effet de la tomentosine sur l’expression de la pro-Caspase 3, Bcl2et le clivage de PARP ,
analysé par western blot. Les cellules SiHa et HeLa sont incubées en absence ou en présence de 10 et 20
et 40µM de tomentosine. A la fin de différents temps d’incubation (24, 48 et 72h), les cellules sont lysées
et l’extrait protéique est analysé par western blot. La β-actine est utilisée comme contrôle de dépôt. La
figure présentée est représentative de deux expériences indépendantes.
5.5. Mesure de l’activité Caspase 3
Afin de s’assurer que la mort cellulaire provoquée par la tomentosine est de nature
apoptotique, nous avons mesuré l’activation d’une Caspase effectrice, la Caspase 3, par un test
fluorimétrique. Le substrat utilisé, Ac-DEVD-pNA est un peptide contenant la séquence du site
de clivage du PARP, substrat endogène de la Caspase 3. Ainsi le clivage de ce substrat
synthétique permet d’évaluer l’activité de la Caspase 3. Les cellules SiHa et HeLa ont été
137
Résultats
incubées pendant (6, 12, 24h) en absence ou en présence de différentes concentration de
tomentosine (10, 20 et 40µM). La tomentosine augmente l’activation de la Caspase 3 de manière
régulière à partir de 6 heures, atteignant jusqu’à 6 fois la valeur initiale après 24 heures
d’incubation (Figure 62), suggérant que tomentosine induit l’activation de la Caspase 3 d’une
manière dose- et chrono-dépendante. Au vu de ces résultats et de ceux obtenus précédemment
par analyse par western blot analysant l’expression de la pro-Caspase 3 et le clivage de PARP,
nous pouvons donc affirmer que la tomentosine induisent l’apoptose Caspase-dépendante dans
les cellules SiHa et HeLa.
5.6. Analyse du cycle cellulaire :
L’inhibition de la prolifération cellulaire peut s’expliquer par la mise en œuvre de deux
phénomènes possible, soit un ralentissement ou un arrêt du cycle cellulaire, soit le
déclenchement du processus de mort cellulaire programmée. Pour compléter notre étude, nous
avons analysé la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. Pour ce
faire, des cellules SiHa et HeLa ont été traitées avec 10 et 20µM de tomentosine pendant 24h et
48h, suivi d’un marquage à l’iodure de propidium et une analyse par cytomètrie de flux. Les
données obtenues sont présentés sous forme d’histogrammes représentant distribution des
cellules SiHa et HeLa dans le cycle cellulaire (Figure 63 et 64).
Concernant les cellules HeLa et SiHa, après 24h de traitement par 10 et 20µM de
tomentosine, une accumulation du nombre de cellules en phase G0 /G1 est observée.
Simultanément, une diminution du nombre de cellules en phase S apparait. Cependant, à la
concentration de 40µM de tomentosine, une diminution du nombre de cellules en phase G0 /G1 et
S, ainsi qu’une apparition d’une population de cellules en G2/M est observée. Au bout de 48h de
traitement par la tomentosine à la concentration de 10µM, une diminution du nombre de cellules
SiHa et HeLa en phase S et une augmentation du nombre des cellules en phase G 0/G1 est
observé. Toutefois, une accumulation du nombre de cellules en phase G2/M aux concentrations
de 20 et 40 µM de tomentosine est observée. Simultanément, une diminution du nombre de
cellules en phase G0/G1 apparait, suggérant ainsi un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M.
138
Résultats
Figure 62: Activation de la Caspase 3 en fonction du temps après traitement des cellules par la
tomentosine. Les cellules SiHa et HeLa sont incubées en absence ou en présence de concentrations
croissantes de tomentosine (10, 20 et 40µM) durant 6, 12 et 24h. Les résultats présentés sont des
moyennes±SD d’expériences représentatives réalisées en triplicate. * , p<0,05 ; ** , p<0,01 , *** ,
p<0,001 .
139
Résultats
G2/M
S
HeLa- 48h
G0/G1
Nombre de cellules (%)
HeLa -24h
100
80
60
40
20
G2/M
S
G0/G1
100
80
60
40
20
0
0
Control
10µM
20µM
40µM
Tomentosine
Control
10µM
20µM
40µM
Tomentosine
Figure 63: Effet de la tomentosine sur le cycle cellulaire des cellules HeLa.
Distribution des cellules dans le cycle cellulaire, M1 (G0 /G1) et M2 (S) et M3 (G2/M).
Les
histogrammes représentent le pourcentage de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire en
fonction des concentrations de tomentosine (10, 20 et 40µM) et en fonction du temps de traitement (24 et
48h).
140
Résultats
G2/M
S
100
SiHa-48h
G0/G1
Nombre de cellulles (%)
SiHa- 24h
G2/M
S
G0/G1
100
80
60
40
20
0
Control
10µM
20µM
40µM
Tomentosine
80
60
40
20
0
Control
10µM
20µM
40µM
Tomentosine
Figure 64: Effet de la tomentosine sur le cycle cellulaire des cellules SiHa.
Distribution des cellules dans le cycle cellulaire, M1 (G0/G1) et M2 (S) et M3 (G2/M). Les
histogrammes représentent le pourcentage de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire en
fonction des concentrations de tomentosine (10, 20 et 40µM) et en fonction du temps de traitement (24 et
48h).
141
Résultats
C. Statut MDR de tomentosine:
Nous avons également évalué le statut MDR de tomentosine en utilisant des lignées
MCF7/DOX exprimant la protéine Pgp (résistante à la doxorubicine) et la lignées MCF7/VP
exprimant la protéine MRP1 (résistante à l’étoposide), ainsi que les lignées transféctées par les
gènes de résistance ABCB1/Pgp,
ABCC1/MRP1,
ABCC3/MRP3. Les données obtenues
montrent que les lignées testées ne présentent pas de résistance significative à la tomentosine
(Tableau 15). En revanche, les cellule LR73/Pgp présentent une forte résistance à la
doxorubicine par rapport aux cellules parentales. Le facteur de résistance de tomentosine est de
l’ordre de 0,57 ; 1,42 ; 1,17 pour les cellules MCF7/VP,
LR73/Pgp et 2008/MRP3
respectivement.
Tableau 15: Statut MDR de la tomentosine
Produits
Tomentosine
(µM)
Doxorubicine
(nM)
MCF7
MCF7/VP
LR73
LR73/Pgp
2008
2008/MRP1
2008/MRP3
IC50%
13,39
7,70
8,65
12,32
8,82
32,19
10,37
IR
-
0,57
-
1,42
-
3,64
1,17
IC50%
400,11
567,26
33,10
1602
93,3
175,19
162,27
IR
-
1,41
-
48,4
-
1,87
1,73
142
DISCUSSION
Discussion
Le cancer est une cause importante de morbidité et de mortalité partout dans le monde. Le
cancer du col de l’utérus, bien qu’en nette régression dans la majorité des pays développés ces
dernières années, reste la deuxième cause de mortalité des femmes dans les pays en voie de
développement (Pointreau Y. et al., 2010). Depuis l’introduction du test de dépistage
cytologique ainsi que la mise en place de programmes de dépistage des lésions précancéreuses
de plus en plus précoce, l’incidence et la mortalité due au cancer du col utérin a
significativement diminué dans les pays industrialisés. Cependant, dans la plupart des pays en
voie de développement, l’absence de plan national de prévention de ce cancer, le manque de
moyens et l’absence de couverture médicale d’une grande partie de la population, fait de ce
cancer un véritable problème de santé publique.
La chimiothérapie anticancéreuse constitue désormais, avec la chirurgie et la radiothérapie,
un élément essentiel de 1'arsenal thérapeutique anticancéreux d'aujourd'hui (Brady L.W. et al.,
1993). Dans le cas cancer du col utérin, l’association de chimiothérapie et de radiothérapie en
reste le traitement de base (Magné N. et al., 2008). En dépit des progrès accomplis sur le plan
thérapeutique et au niveau des techniques de dépistage, les effets secondaires des médicaments
antitumoraux, les problèmes de résistance et l’échappement tumoral demeurent les principales
causes d’échec dans le traitement des cancers.
Ces dernières années, les laboratoires pharmaceutiques en quête de nouvelles molécules à
visé thérapeutiques, ont beaucoup investi dans la recherche de substances d’origine naturelles
(Kinghorn A.D. et al., 2009), pour contrecarrer la résistance de certaines tumeurs vis-à-vis de
nombreux agents anticancéreux d’une part, et pour développer des thérapies anticancéreuses de
plus en plus ciblées permettant d’augmenter la spécificité et l’efficacité des médicaments
chimiothérapeutiques.
Depuis l’antiquité et grâce à leurs propriétés thérapeutiques, les plantes ont joué un rôle
capital dans l’art de guérir. Aujourd’hui, elles offrent, dans le domaine des médicaments, une
alternative intéressante pour le criblage de substances potentiellement bioactives. Dans le
domaine des anticancéreux, nombreuses sont les molécules cytotoxiques d’origine végétale, qui
sont utilisées en chimiothérapie anticancéreuse (Newman D.J. and Cragg G.M., 2007; Nobili S.
et al., 2009).
143
Discussion
Le criblage de nouvelles molécules anticancéreuses est en un premier lieu basé sur
l’évaluation de leurs effets antiprolifératifs sur des lignées cancéreuses en culture. Les techniques
d'évaluation de l'activité antiproliférative ou cytotoxique in vitro, par leur simplicité de mise en
œuvre, leur spécificité, leur sensibilité ; sont privilégiées par rapport aux techniques utilisant des
modèles in vivo (Eisenbrand G. et al., 2002). Cependant, les substances actives in vitro de façon
spécifique sur certains types de tumeurs humaines présentent une faible toxicité potentielle et
sont supposées être actives in vivo. C'est dans cette optique, que le NCI (National Cancer
Institute) teste chaque produit sur 60 lignées appartenant à 7 catégories tissulaires: leucémie,
mélanome, poumon, colon, rein, cerveau et ovaire (Boyd M.R., 1989). Les méthodes les plus
largement utilisées et les plus adaptées pour la mesure de la prolifération et la viabilité cellulaire,
dans le cadre d'un criblage anti-tumoral de nouvelles drogues, sont celles qui utilisent les sels de
tétrazolium. Pour cette étude nous avons utilisé la technique du MTT, qui est la première
méthode colorimétrique appliquée pour la quantification de la prolifération cellulaire (Denizot F.
and Lang R., 1986; Carmichael J. et al., 1987) pour sa fiabilité, sa sensibilité et ses nombreux
avantages.
Dans un première temps, nous avons évalué la cytotoxicité des extraits méthanoliques des
7 plantes vis-à-vis des cellules du cancer du col de l’utérus, les lignées SiHa et HeLa. A notre
connaissance aucune étude n’a été répertoriée concernant l’activité cytotoxique des plantes que
nous avons sélectionné. A l’issue de cette étude, il ressort que les extraits méthanoliques des
plantes Inula viscosa L. et Retama monosperma L., ont montré une activité cytotoxique
intéressante comparée aux autres extraits. Ces deux plantes constituent une source importante en
composés
biologiquement actifs. Du fait de la richesse d’Insula viscosa, en flavonoïdes
(Hernandez V. et al., 2007) et
en terpénoïdes
(Fontana G. et al., 2007) et la présence
d’alcaloïdes (Touati D. et al., 1996b) dans Retama monosperma .
Inula viscosa est largement utilisé pour le traitement des abcès, de la gale, les dermatoses, les
furoncles, des ulcères, des gerçures et comme cicatrisant des plaies cutanées (Hmamouchi M.,
2001). Egalement dans le traitement de la tuberculose, des affections poitrinaires, des infections
respiratoires et bronchiques (Bellakhdar J., 1997), ou pour le traitement de la pression artérielle
et diabète et des pathologies rénales (Eddouks et al., 2002). Dans d’autres pays méditerranéens,
cette plante est utilisée pour ces effets anti-inflammatoire (Al-Dissi N.M. et al., 2001; Barbetti P.
et al., 1985) et pour le traitement des pathologies gastroduodénales (Lastra C. et al., 1993).
144
Discussion
Cette plante a suscité l’intérêt de plusieurs chercheurs scientifiques pour ses multiples
activités biologiques et pharmacologiques; telle que l’activité anti-inflammatoire (Hernandez V.
et al., 2007; Manez S. et al., 2007; Manez S. et al., 1999), l’activité antimicrobienne (AliShtayeh M.S. et al., 1998; Maoz M. and Neeman I., 1998), antifungique (Cafarchia C. et al.,
2002; Maoz M. and Neeman I., 2000; Qasem J.R. et al., 1995), hypoglycémiante et
hypolipidemiante (Zeggwagh et al., 2006), antioxydante (Schinella G.R. et al., 2002) antivirale
(Sassi A.B. et al., 2008).
Retama monosperma L. est une plante utilisé dans le traitement des prurits et la gale
humaine et animale, comme purgatif et vermifuge (Bellakhdar J., 1997), et comme abortif
(Benrahmoune I.Z., 2003). Les espèces appartenant au genre Retama sont caractérisés par leurs
vertus thérapeutiques et ont fait l’objet de plusieurs études démontrant les multiples activités
pharmacologiques ; telles l’activité antihypertensive and diurétique (Eddouks et al., 2007;
Maghrani M. et al., 2005b), l’activité antimicrobienne (Awen B.Z. et al., 2011; Edziri H. et al.,
2007), cytotoxique (Conforti F. et al., 2004; Edziri H. et al., 2007),
hypoglycémiante
(Algandaby et al., 2010; Maghrani M. et al., 2005a), antioxydante et antivirale (Edziri H. et al.,
2010). Ces données suggèrent que Inula viscosa L. et Retama monosperma L. présentent un fort
potentiel pour le développement d’agents anticancéreux contre le cancer du col de l’utérus.
145
Discussion
A. Recherche de substances naturelles capable d’inhiber la
prolifération et l’activité télomérase et d’induire l’apoptose des
cellules cancéreuses du col de l’utérus
Par la suite, une étude le mécanisme d’action des extraits d’Inula viscosa L. et Retama
monosperma L., a été réalisée ainsi que la caractérisation chimique des extraits les plus actifs.
Une extraction a été réalisée à l’aide de solvants organiques de polarité différentes a permis
d’obtenir 4 extraits dont la cytotoxicité a été évaluée vis-à-vis des deux lignées cellulaires SiHa
et HeLa. Malgré l’existence de plusieurs publications rapportant les multiples propriétés
pharmacologiques d’Inula viscosa et de Retama monosperma, leurs propriétés anticancéreuses
n’ont jamais été étudiées.
Les résultats obtenues lors de nos expériences, ont révélé que l’extrait hexanique et la
fraction dichlorométhane d’Inula viscosa ainsi que la fraction dichlorométhane de Retama
monosperma ont montré un effet cytotoxique important et dose-dépendant vis-à-vis des cellules
SiHa et HeLa. Les IC50 sont comprises entre 6 et 22µg/ml. Selon le NCI (National Cancer
Institute), le critère de sélection de l’activité cytotoxique des extraits bruts, IC50 <30µg/ml
(Suffness M. and Pezzuto J.M., 1990), suggérant que les extraits d’Inula viscosa et de Retama
monosperma peuvent effectivement être considérés comme agents cytotoxiques.
L’inhibition de la prolifération des cellules SiHa et HeLa par les extraits d’Inula viscosa
corrobore les effets cytotoxiques in vitro des extraits de plantes du genre Inula précédemment
rapportés vis-à-vis différentes lignées cellulaires tumorales (Dorn D.C. et al., 2006; Khan A.L. et
al., 2010; Konishi T. et al., 2002; Pal H.C. et al., 2010; Talib W.H. and Mahasneh A.M., 2010).
Dans un premier temps, une évaluation de l’effet des extraits d’Inula viscosa sur l’activité
télomérase a été réalisé.
Nos résultats indiquent que IV-HE et IV-DF possèdent un effet
inhibiteur de l’élongation des télomères in vitro des cellules du cancer du col de l’utérus. Ce
résultat a été confirmé par l’analyse d’hybridation du brin G télomérique, indiquant le
raccourcissement de la taille du simple brin télomérique dans les cellules SiHa et HeLa traitées
par ces extraits d’une manière dose-dépendante. Nous avons pu démontrer pour la première fois,
que les extraits d’Inula viscosa ciblent spécifiquement la machinerie télomère/télomérase.
La surexpression d’hTERT constitue une étape critique de la transformation néoplasique.
L’activation du mécanisme de maintenance des télomères est ainsi indispensable à
l’immortalisation des cellules humaines. L’inhibition de la télomérase provoque l’entrée en
146
Discussion
apoptose ou en sénescence dans la plupart des lignées cellulaires de cancer (Hahn W.C. et al.,
1999). De ce fait, les télomères et la télomérase ont sont proposés comme des cibles intéressantes
dans le développement de stratégies thérapeutiques anticancéreuses nouvelles (Riou J.F. et al.,
2006 ).
Dans un second temps, nous avons recherché si l’apoptose est le mécanisme par lequel ces
extraits exercent leurs effets antiprolifératifs. L’apoptose, est un processus physiologique impliqué
dans l’homéostasie cellulaire ou en réponse à un traitement anticancéreux, au cours duquel se
manifestent des événements morphologiques telles la condensation de la chromatine,
fragmentation nucléaires et formation de corps apoptotiques ; et biochimiques telles l’activation
des trans-glutaminases, des Caspases, externalisation des phosphatidylsérines membranaire,
diminution
du
potentiel
membranaire
mitochondrial,
Production
de
ROS,
clivage
internucléosomal de l’ADN, clivage de l’enzyme de réparation PARP (Allen R.T. et al., 1997).
Les extraits d’Inula viscosa induisent une mort cellulaire par apoptose, démontrée par le
clivage de proCaspase-3, activation de la Caspase-3 et le clivage de PARP (poly (ADP-ribose)
polymerase). De plus, les extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF induisent précocement une chute du
potentiel membranaire mitochondriale (ΔΨm) et une production des espèces réactives de
l’oxygéne species (ROS), accompagné du clivage de la protéine anti-apoptotique Bcl-2
suggérant que l’apoptose des cellules HeLa and SiHa induite par ces extraits, est Caspase
dépendante et médiée via des événements mitochondriaux.
Nous avons par la suite mis en évidence le mécanisme impliqué dans le déclenchement du
processus apoptotique des lignées SiHa et HeLa induit par la fraction dichlorométhane de
Retama monosperma. Les donnés obtenues ont révélé que l’effet cytotoxique induit par la
tomentosin est due à l’induction de l’apoptose. L’apoptose induite par Rm-DF est médiée par la
voie mitochondriale, s’accompagne précocement d’un effondrement du potentiel membranaire
mitochondriale, d’une libération des espèces réactives de l’oxygène, et du clivage de la proCaspase 3 et de PARP.
La détermination de la composition chimique des extraits les plus actifs par CG/MS, a
révélé la présence d’un sesquiterpène acide, l’acide isocostique et deux sesquiterpènes lactones,
tomentosin et l’inuviscolide comme composés majoritaires dans l’extrait hexanique d’Inula
viscosa L., suggérant que l’effet antiprolifératif de l’extrait IV-HE pourrait probablement être
attribué aux sesquiterpènes lactones, classes de métabolites secondaires connus pour leur effet
147
Discussion
anti-inflammatoire et anticancéreux (Ghantous A. et al., 2010; Li X.W. et al., 2011;
Modzelewska A. et al., 2005). Ceci est en accord avec les résultats d’autres études montrant que
de nombreux sesquiterpènes lactones tels que helenaline (Huang P.R. et al., 2005), costunolide
(Choi S.H. et al., 2005; Kanno S. et al., 2008) sont capables d’inhiber l’activité de la télomérase
in vitro des différentes lignées cellulaire. De plus, Rozenblat S. et al. ont rapporté que les deux
sesquiterpènes, tomentosin et inuviscolide sont capables d’inhiber la croissance et d’induire
l’apoptose de lignées cellulaires de mélanome (Rozenblat S. et al., 2008). En revanche, la
caractérisation de la fraction dichlorométhane d’Inula viscosa a révélé la présence de tomentosin,
inuviscolide et l’acide isocostique en très faible quantité. Cependant, nous n’avons pas noté la
présence de flavonoïdes comme stipulé dans la littérature (Hernandez V. et al., 2007), mais ceci
n’exclue pas leur présence, puisque les flavonoïdes sont des composés non détectables par
CG/MS.
La caractérisation chimique de la fraction dichlorométhane de Retama monosperma (RmDF) a révélé la présence de plusieurs alcaloïdes pyrolizidines à savoir spartéine, L-methylcytisine, 17- oxo-spartéine, lupanine et anagyrine. Ces données corroborent avec celles d’une
étude phytochimique antérieure qui a montré la présence d’alcaloïdes pyrolizidines dans Retama
monosperma (El-Shazly A. et al., 1996; Touati D. et al., 1996a). Les alcaloïdes quinolizidines
ont suscité intérêt particulier pour leurs diverses activités biologiques telles, l’activité antivirale
(Ding P.L. et al., 2006), antihypoglycémiante et antitumorale (Zhang Y. et al., 2010). L’activité
antiproliférative marquée de la fraction dichlorométhane de Retama monosperma pourrait être
attribuée aux alcaloïdes quinolizidines, composés majoritaires contenus dans cette fraction. Une
récente étude a rapporté l’activité antiproliférative de l’oxymatrine, alcaloïde quinolizidine, ainsi
que sa capacité à induire l’apoptose des cellules de carcinome hépatique (Song G. et al., 2006).
Lin Z. et al. ont mis en évidence l’effet cytotoxique in vitro de six alcaloïdes quinolizidine,
isolés à partir de Sophora Flavescens Ait. La sophoridine, aloperine, sophocarpine, matrine,
oxymatrine et la cytisine, aloperine, vis-à-vis de différentes lignées cellulaires (Lin Z. et al.,
2011).
Parrallélement, nous avons étudié le statut MDR des extraits d’Inula viscosa et Retama
monosperma par évaluation de leurs effets cytotoxique sur les différentes lignées cellulaires
résistantes aux médicaments anticancéreux. Malgré d’importants progrès dans le traitement
chimiothérapeutique anticancéreux, l’apparition de chimiorésistance rend difficile toute
tentatives de traitement des cancers résistans. Cette chimiorésistance est principalement due au
148
Discussion
phénotype de multichimiorésistance typique MDR. Les protéines ABC sont impliquées dans des
mécanismes qui permettent à la cellule tumorale d’échapper tant aux effets toxiques des
médicaments qu’à la mort cellulaire par apoptose induits par de nombreux agents anticancéreux.
Notre étude a démontré que IV-HE, IV-DF, Rm-DF et tomentosin sont capables d’inhiber la
prolifération des lignées cellulaires sensibles et résistantes, avec des indices de résistance ˂ 2,
suggérant que ces extraits ne sont pas des substrats MDR.
Pour la suite de notre étude, nous avons retenu l’extrait hexanique d’Inula viscosa, dont
l’activité biologique est la plus marquée par rapport aux autres extraits, pour faire l’objet d’un
fractionnement bio-guidé.
B. Purification de la tomentosine et mise en évidence de son
mécanisme d’action
Dans le but de rechercher les principes actifs responsables de l’effet anticancéreux des
extraits d’Inula viscosa L, un fractionnement bio-guidé et une purification des composés
majoritaire contenus dans l’extrait hexanique a été réalisé. Deux composés de structures connues
ont été purifiés à savoir un sesquiterpène acide, l’isocostique acide et un sesquiterpène lactone,
tomentosin. Ces données corroborent avec plusieurs travaux phytochimiques antérieurs stipulant
la présence d’un grand nombre de métabolites secondaires à partir des extraits de la plante Inula
viscosa L. essentiellement les composés sesquiterpèniques (Fontana G. et al., 2007) (Zarga M.H.
et al., 2003) (Hernandez V. et al., 2001). Une étude menée sur l’extrait hexanique d’Inula
viscosa L., rapportée la présence de deux sesquiterpènes lactones : tomentosine et inuviscolide ,
ainsi que trois sesquiterpènes acides à savoir : acide costique, acide isocostique, acide ilicique
(Mamoci E. et al., 2011). Une autre étude chimique effectuée sur l’extrait acétonique de Inula
viscosa L., a mis en évidence la présence de deux composés sesquiterpèniques à savoir le acide
2,5-dihydroxyisocostic, l’acide 2,3-dihydroxycostic, l’acide Isocostic, Carabrone et Tomentosin
(Fontana G. et al., 2007).
Les sesquiterpènes lactones sont des principes actifs d’un grand nombre de plantes
médicinales de la famille des Astéracées, possédant un effet cytotoxique et antitumoral
considérable (Picman A.K., 1986; Rodriguez E. et al., 1976). Les sesquiterpènes tels que,
helenalin (Dirsch V.M. et al., 2001), costunolide (Park H.J. et al., 2001), isocostunolide (Chen
C.N. et al., 2007) et alantolactone (Lawrence N. J. et al., 2001) , possèdent une activité
antiproliférative vis-à-vis plusieurs lignées cellulaires cancéreuses.
149
Discussion
La particularité structurale des sesquiterpènes lactones leur confère des possibilités de
réactivité biologique incontestables compte tenu de l'enchaînement α-méthylène γ-lactone et des
fonctions époxydes fréquentes dans les majeures parties de ces molécules. Ces fonctions
constituent des sites réactifs vis-à-vis des nucléophiles biologiques principalement le groupe
thiol des amines de diverses enzymes (glycogène synthase, ADN polymérase, thymidylate
synthase), donnant ainsi des alkylations irréversibles d’où une gamme très importante d'activité
biologique (Bruneton J., 1993; Fernandes M.B. et al., 2008).
Nous avons tout d’abord étudié l’inhibition de la croissance cellulaire de tomentosin sur les
cellules cancéreuses du col de l’utérus. Notre étude a démontré que le tomentosin est capable
d’inhiber la prolifération de chacune des deux lignées cellulaires SiHa et HeLa de manière dose
et chrono-dépendant. L’effet inhibiteur de la prolifération cellulaire corrobore les effets
antiprolifératifs de tomentosin récemment rapportés vis-à-vis d’autres lignées tumorales de
mélanome (SK-28, 624 mel et 1363 mel) (Rozenblat S. et al., 2008). Cependant, nos résultats ont
montré que la tomentosine a un effet cytotoxique plus important sur les lignées cellulaires du
cancer du col de l’utérus que les lignées de mélanome. Après 24h de traitement, la tomentosine
présente des IC50 pour les lignées SiHa et HeLa de 25,68±1,86µM et 23,69±0,79µM,
respectivement. Contrairement aux lignées de mélanome dont les IC50 sont de (SK-28) :
33.6±1.8µM ; (624 mel): 31.6±1.2µM ; (1363 mel): 35.3±1.4µM.
D’autre part, l’acide isocostique purifié, composé majoritaire contenu dans l’extrait
hexanique d’Inula viscosa (IV-HE), a présenté un effet inhibiteur de la croissance relativement
faible des cellules SiHa et HeLa par comparaison à celui de tomentosin. Ceci suggérerait que
l’activité anticancéreuse de l’extrait hexanique d’Inula viscosa pourrait être attribuée entre
autres au sesquiterpène lactone, tomentosine.
Dans le but d’appréhender l’effet inhibiteur de tomentosin vis-à-vis des cellules
cancéreuses du col de l’utérus, nous avons dans un premier temps évalué l’effet potentiel de la
tomentosin sur le simple brin télomérique en inhibant l’activité catalytique de la télomérase des
cellules SiHa et HeLa. Nous avons montré que tomentosin induit un raccourcissement de la taille
du simple brin télomérique dans les lignées SiHa et HeLa d’une manière dose dépendante. Notre
étude a permis de mettre en évidence pour la première fois l’effet inhibiteur de l’élongation des
télomères induit par la tomentosine. Il existe plusieurs publications rapportant la capacité de
certains sesquiterpènes lactones, isolés à partir des plantes du genres Inula, à inhiber l’activité
télomérase (Choi S.H. et al., 2005; Huang P.R. et al., 2005; Kanno S. et al., 2008).
150
Discussion
D’autre part, nous avons également démontré que la tomentosine induisait un effet
inhibiteur sélectif envers la croissance des cellules de la lignée MRC5/V1, fibroblastes de
phénotype ALT. Dans les cellules déficientes en télomérase, le maintien de la longueur des
télomères est assuré par le mécanisme ALT qui fait intervenir des recombinaisons entre les
télomères (Cesare A.J. and Reddel R.R., 2008). Les cellules de phénotype ALT sont dépourvues
d’activité télomérase et possèdent des télomères longs et une hétérogénéité de la taille des
télomères (Henson J.D. et al., 2002). Les cellules MRC5/V1 sont 5 fois plus sensibles à la
tomentosine que les cellules MRC5, suggérant que la tomentosine est capable d’inhiber la
croissance aussi bien des cellules cancéreuses télomérase positives que les cellules de phénotype
ALT.
Parallèlement, nous avons identifié les mécanismes impliqués dans le déclenchement du
processus apoptotique des lignées SiHa et HeLa induit par la tomentosine. Les résultats obtenus
ont révélé que l’effet cytotoxique induit par la tomentosin est due à l’induction de l’apoptose et
arrêt du cycle cellulaire des cellules HeLa and SiHa en phase G2/M. Ceci a été confirmé par le
clivage de proCaspase-3, activation de la Caspase-3 et le clivage de PARP (poly (ADP-ribose)
polymerase). D’autre part, la tomentosin induit une chute du potentiel membranaire
mitochondriale (ΔΨm) et la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS), accompagné
de l’inhibition de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 indiquant que l’apoptose induite par la
tomentosin dans les cellules HeLa and SiHa, est médiée via des événements mitochondriaux.
Nos résultats sont fortement corrélés avec ceux d’une récente étude qui a mis en évidence
l’activité anticancéreuse des deux sesquiterpènes lactones, Tomentosin et Inuviscolide sur des
lignées cellulaire cancéreuses humaine de mélanome, par induction de l’apoptose et arrêt du
cycle cellulaire en phase G2/M (Rozenblat S. et al., 2008).
151
Discussion
Cette étude met en évidence pour la première fois que tomentosin cible spécifiquement la
machinerie télomère-télomérase, induit l’apoptose Caspases-dépendante des cellules cancéreuses
du col de l’utérus et l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M (Figure 65).
Figure 65: Mécanismes d’action proposé de la tomentosine:
Voies de signalisations impliquées dans l’apoptose des cellules SiHa et HeLa induite par la
tomentosine.
152
Conclusion générale
& Perspectives
Conclusion générales & Perspectives
Dans le cadre de la mise en évidence de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter
contre le cancer, nous nous sommes intéressés à la recherche de substances naturelles issues de
plantes médicinales utilisées en médecine traditionnelle Marocaine capables d’inhiber la
croissance des cellules cancéreuses du col de l’utérus.
Aussi, nous avons montré que, parmi différentes plantes testées, l’extrait hexanique (IVHE) et la fraction dichlorométhane (IV-DF) issus d’Inula viscosa ainsi que la fraction
dichlorométhane de Retama monosperma (Rm-DF) induisaient une activité cytotoxique
significative vis-à-vis des deux lignées cellulaires du col de l’utérus porteuses de papillomavirus
humains, SiHa et HeLa.
L’analyse moléculaire a montré que les trois extraits, IV-HE, IV-DF et Rm-DF, induisent
une mort cellulaire par apoptose, mise en évidence par le clivage de la pro-Caspase-3,
l’activation de la Caspase-3 et le clivage de PARP (poly (ADP-ribose) polymerase). En outre,
ces extraits induisent précocement une chute du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) et
une production des espèces réactives de l’oxygène (ROS), accompagnées du clivage de la
protéine anti-apoptotique Bcl-2 suggérant que l’apoptose des cellules SiHa et HeLa induite par
ces extraits , passe par des événements mitochondriaux.
Aussi, nous avons montré, en utilisant le test TRAP, que les extraits d’Inula viscosa sont
capables d’inhiber l’activité télomérase des cellules SiHa et HeLa aprés 72h de traitement. Ceci a
été confirmé par l’hybridation du simple brin télomérique (TTAGGG), démontrant que IV-HE et
IV-DF induisent un raccourcissement du simple brin télomérique significativement dans les
cellules SiHa et HeLa d’une manière dose-dépendante. Il apparait donc clairement que ces
extraits ciblent spécifiquement la machinerie télomères-télomérase.
Le fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L., nous à permis
l’isolement d’un sesquiterpène lactone, tomentosine, qui a montré un effet inhibiteur significatif
de la prolifération des cellules SiHa et HeLa. Notre étude a mis en évidence pour la première fois
que la tomentosine est capable d’inhiber l’élongation des télomères et d’induire une apoptose des
cellules cancéreuses du col de l’utérus, Caspases-dépendante, via des événements
mitochondriaux, ainsi qu’un arrêt du cycle cellulaire des cellules SiHa et HeLa en phase G2/M.
L’ensemble des données obtenues, sont fortement corrélé aux résultats obtenus avec l’extrait
153
Conclusion générales & Perspectives
hexanique d’Inula viscosa, suggérant que la tomentosine est probablement le principe actif
responsable de l’activité biologique de l’extrait hexanique.
D’autre part, nous avons étudié l’effet des extraits d’Inula viscosa ainsi que la tomentosine
sur la croissance des cellules MRC5/V1, fibroblastes de phénotype ALT transféctées par
l’antigène T de SV40, déficientes en télomérase. Les cellules MRC5/V1 sont 5 fois plus
sensibles à la tomentosine que les cellules parentales MRC5, suggérant que la tomentosine est
capable d’inhiber la croissance aussi bien des cellules cancéreuses télomérase positives que les
cellules ALT déficientes en télomérase.
Par ailleurs, nous avons évalué l’effet de ces extraits sur des cellules MDR exprimant la Pglycoprotéine (Pgp) et la Multidrug-Resistance Associated Protein (MRP1). Il est apparu
clairement que ces cellules ne présentent pas de résistance significative vis-à-vis des produits
testés. A l’issue de cette étude, il ressort que ces plantes présentent une activité cytotoxique
importante contre les cellules cancéreuses et un fort potentiel pour le développement d’agents
anticancéreux contre le cancer notamment le cancer du col de l’utérus.
Enfin, les perspectives immédiates de ce travail sont principalement la validation de nos
résultats en confirmant l’effet anticancéreux des extraits d’Inula viscosa, de Retama
monosperma ainsi que celui de la tomentosine in vivo chez l'animal. Des expériences sur des
souris Nude sont en cours d’investigation. De même il est nécessaire d’évaluer la toxicité in vivo
de ces extraits sur des souris afin de s’assurer de la spécificité tumorale sans apparition de
toxicité secondaire. Il serait également intéressant d’évaluer l’effet antiprolifératif de ces extraits
sur d’autres modèles cellulaires provenant d’autres cancers.
Les plantes étudiées constituent une source importante en composés d’un grand intérêt
biologique. Les multiples activités pharmacologiques de ces plantes médicinales sont basées sur
la richesse avérée d’Inula viscosa en flavonoïdes et en composés terpéniques et la présence
d’alcaloïdes et de flavonoïdes dans le genre Retama. D’ou l’intérêt de réaliser le fractionnement
bio-guidé des autres extraits ayant présentés un effet cytotoxique intéressant telles les fractions
dichlorométhane d’Inula viscosa L. et de Retama monosperma L.. Ce qui devrait permettre
l’isolement de certains métabolites prometteurs dans la recherche de nouveaux agents
anticancéreux. La réalisation d’autres investigations pharmacologiques complémentaires sur
d’autres aspects thérapeutiques est d’une importance cruciale et pourrait permettre
l’identification de nouvelles substances aux activités thérapeutiques multiples.
154
Références
bibliographiques
Références bibliographiques
A
Aafi A., Achhal A.K., Benabid A., M., R., 2005. Richesse et diversité floristique de l’écosystème
de chêne-liège de la forêt de la Mamora. Acta Bot Malacitana 30, 127-138.
Abbott B.L., , 2003. ABCG2 in hematopoietic stem cells. Hematol Oncol Rep 21 1-16.
Agosti J. M., Goldie S. J. , 2007. Introducing HPV vaccine in developing countries--key challenges
and issues. N Engl J Med 356, 1908-1910.
Ai-Rong L., Zhu Y., Li X.N., Tian X.J., 2007. Antimicrobial activity of four species of
Berberidaceae. Fitoterapia 78, 379–381.
Al-Dissi N.M., Salhab A.S., Al-Hajj H.A., 2001. Effects of Inula viscosa leaf extracts on abortion
and implantation in rats. J Ethnopharmacol 77, 117-121.
Alain S., Hantz S., Denis F., 2010. Papillomavirus : les virus et la physiopathologie de l’infection
MT Pediatrie 13, 5-19.
Algandaby, M.M., Alghamdi, H.A., Ashour, O.M., Abdel-Naim, A.B., Ghareib, S.A., Abdel-Sattar,
E.A., Hajar, A.S., 2010. Mechanisms of the antihyperglycemic activity of Retama raetam in
streptozotocin-induced diabetic rats. Food Chem Toxicol 48, 2448-2453.
Ali-Shtayeh M.S., Yaghmour R.M., Faidi Y.R., Salem K., Al-Nuri M.A., 1998. Antimicrobial
activity of 20 plants used in folkloric medicine in the Palestinian area. J Ethnopharmacol 60, 265–271.
Alkofahi A., Atta A.H., 1999 Pharmacological screening of the anti-ulcerogenic effects of some
Jordanian medicinal plants in rats. J Ethnopharmacol 67, 341-345.
Allen R.T., Hunter W.J., r., Agrawal D.K., 1997. Morphological and biochemical characterization
and analysis of apoptosis. J Pharmacol Toxicol Methods 37, 215-228.
Amani H., Rouhi R., Idrissi Hassani L.M., 2008. Étude anatomique et screening phytochimique de
trois espèces du sud marocain: Chamaecytisus mollis, Retama monosperma et Hesperolaburnum
platycarpum. Détermination du potentiel antifongique des extraits aqueux. Agadir, Maroc. The 3rd
International Symposium on Aromatic and Medicinal Plants (SIPAM3)The first International symposium
on Bioactive Molecules (CIMB1) Oujda –Morocco 29-30 May.
Ambudkar S.V., Kimchi-Sarfaty C., Sauna Z.E., Gottesman M.M., 2003. P-glycoprotein: from
genomics to mechanism. Oncogene 22, 7468-7485.
Ammar R.B., Kilani S., Bouhlel I., Ezzi L., Skandrani I., Boubaker J., Sghaier M.B., Naffeti A.,
Mahmoud A., Chekir-Ghedira L., Ghedira K., 2008. Antiproliferative, antioxidant, and antimutagenic
activities of flavonoid-enriched extracts from (Tunisian) Rhamnus alaternus L.: combination with the
phytochemical composition. Drug Chem Toxicol 31, 61-80.
155
Amrani M., Lalaoui K., El Mzebri M., Lazo PA., Belabbas M.A., 2003 Molecular detection of
humain Papillomavirus in 594 uterine cervix samples from Morocco women (147 biopsies and 447
swabs). Journal of Clinical Virology 27, 286-295.
Amrani M., Lalaoui K., El Mzebri M., Rouas L., Benkirane L., Lamaalmi N., Regragui A., Gamra
L., Bellabas M.A., 2002. Place de la cytologie cervicale et du typage moléculaire des Papillomavirus
humain (HPV) : résultats d’une étude critique Marocaine. Maroc Médical 24, 206-211.
Anderson D., Yu T.W., Browne M.A., , 1997. The use of the same image analysis system to detect
genetic damage in human lymphocytes treated with doxorubicin in the Comet and fluoresence in situ
hybridisation (FISH) assays. Mutat Res 390, 69-77.
Arcamone F., Animati F., Berettoni M., Bigioni M., Capranico G., Casazza A.M., , 1997.
Doxorubicin disaccharide analogue: apoptosis-related improvement of efficacy in vivo. J Natl Cancer Inst
89, 1217-1223.
Autexier C., Lue N.F., 2006. The Structure and Function of Telomerase Reverse Transcriptase.
Annu Rev Biochem 75, 493-517
Awen B.Z., Unnithan C.R., Ravi S., Kermagy A., Sasikumar J.M., Khrbash A.S., Ekreem W.L.,
2011. Essential oils of Retama raetam from Libya: chemical composition and antimicrobial activity. Nat
Prod Res 25, 927-933.
B
Baggetto L.G., 1997. Biochemical, genetic, and metabolic adaptations of tumor cells that express
the typical multidrug-resistance phenotype. Reversion by new therapies. J Bioenerg Biomembr 29, 401413.
Baldwin E.L., Osheroff N., 2005. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Curr Med Chem
Anticancer Agents 5 (4), 363-372.
Barbetti P., Chiappini I., Fardella G., Menghini A., , 1985. A new eudesmane acid from Dittrichia
(Inula) viscosa. Planta Medica 51, 471.
Baseman J.G., Koutsky L.A., 2005. The epidemiology of human papillomavirus infections. J Clin
Virol 32, 16-24.
Bellakhdar J., 1997. La pharmacopée marocaine traditionnelle. Médecine arabe ancienne et savoirs
populaires. Ed Ibis press.
Beneke S., Cohausz O., Malanga M., Boukamp P., Althaus F., Burkle A., 2008. Rapid
regulation of telomere length is mediated by poly(ADP-ribose) polymerase-1. Nucleic Acids Res 36
6309-6317.
Benetti R., Garcia-Cao M., Blasco M.A., , 2007. Telomere length regulates the epigenetic status
ofmammalian telomeres and subtelomeres. Nat Genet 39, 243-250.
156
Benrahmoune I.Z., 2003. Invitation à l’Amour des plantes - Réserve biologique de Sidi-Boughaba.
Ed Scriptra 114, 228-227
Bergeron C., 2008. HVP et cancer : Classification des lésions. Revue Francophone des
Laboratoires 405, 43-50.
Bhuyan B. K., Loughman B. E., Fraser T.J., Day K.J., 1976. Comparison of different methods of
determining cell viability after exposure to cytotoxic compounds. Exp Cell Res 97, 275-280.
Binaschi M., Bigioni M., Cipollone A., Rossi C., Goso C., Maggi C.A., Capranico G., Animati F.,
2001. Anthracyclines : selected new developments. Curr Med Chem Anti-Canc Agents 1 113- 130.
Blackburn E.H., 2001. Switching and signaling at the telomere. Cell 106, 661–673.
Borst P., Evers R., Kool M., Wijnholds J., 2000. A family of drug transporters: the multidrug
resistance-associated proteins. J Natl Cancer Inst 92 1295-1302.
Bousarghin L., Touze A., Gaud G., I.S., Alvarez E., R.P., Gaitan J., Jourdan M.L., , Sizaret P.Y.,
Coursaget P.L., 2009. Inhibition of cervical cancer cell growth by human papillomavirus virus‐like
particles packaged with human papillomavirus oncoprotein short hairpin RNAs. Mol Cancer Ther 8, 357365.
Boyd M.R., 1989. Status of the NCI preclinical antitumor drug discovery screen. Principles &
Practices of Oncology 3, 2-12.
Brady L.W., Micaily B., Miyamoto C.T., Keit J. I., Mieszkalski G.B., 1993. Therapeutic advances
in radiologic treatment of cancer. Cancer 72, 3463-3469.
Brenner C., Kroemer G. 2000. Apoptosis. Mitochondria--the death signal integrators. Science 289
1150-1151.
Bruneton J., 1993. phytochimie et pharmacognosie des plantes médicinales. Techniques et
documentations lavoisier.
Bryan T.M., Englezou A., Dalla-Pozza L., Dunham M.A., Reddel R.R., 1997. Evidence for an
alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines. Nat
Med 3, 1271-1274.
Bssaibis F., Gmira N., Meziane M., 2009. Activité antibactérienne de Dittrichia viscosa (L.) W.
Greuter. Rev Microbiol Ind San et Environn 3, 44-55.
Buschman E., Arceci R.J., Croop J.M., Che M., Arias I.M., Housman D.E., Gros P., 1992. mdr2
encodes P-glycoprotein expressed in the bile canalicular membrane as determined by isoform-specific
antibodies. J Biol Chem 267, 18093-18099.
157
C
Cafarchia C., De Laurentis N., Milillo M.A., Losacco V., (3-4):., P.V., 2002. Antifungal activity of
oils from leaves and flowers of Inula viscosa (Asteraceae) by Apulian region. Parassitologia 44, 153-156.
Carcopino X., Henry M., Olive D., Boubli L., Tamalet C., 2011. [Detection and quantification of
human papillomavirus genital infections: virological, epidemiological, and clinical applications]. Med
Mal Infect 41, 68-79.
Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D., Mitchell J.B., 1987. Evaluation of a
tetrazolium based semi automated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res
47, 936-942.
Cathers B.E., Sun D., Hurley L.H., , 1999. Accurate determination of quadruplex binding affinity
and potency of G-quadruplex-interactive telomerase inhibitors by use of a telomerase extension assay
requires varying the primer concentration. Anticancer Drug Des 14 367-372.
Cesare A.J., Reddel R.R., 2008. Telomere uncapping and alternative lengthening of telomeres.
Mech Ageing Dev 129, 99-108.
Chen C.J., Chin J.E., Ueda K., Clark D.P., Pastan I., Gottesman M.M., , 1986. Internal duplication
and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrugresistant human cells. Cell 47 381-389.
Chen C.N., Huang H.H., Wu C.L., Lin C.P.C., Hsu J.T.A., Hsieh H.P., Chuang S.E., G.M., L.,
2007. Isocostunolide,a sesquiterpene lactone, induces mitochondrial membrane depolarization and
Caspase-dependent apoptosis in human melanoma cells. Cancer Letters 246, 237-252
Chen Q.M., Liu J., Merrett J.B., , 2000 Apoptosis or senescence-like growth arrest: influence of
cell-cycle position, p53, p21 and bax in H2O2 response of normal human fibroblasts. Biochem J 347 543551.
Cheng E.H., Wei M.C., Weiler S., Flavell R.A., Mak T.W., Lindsten T., Korsmeyer S.J., 2001.
BCL-2, BCL-X(L) sequester BH3 domain-only molecules preventing BAX- and BAK-mediated
mitochondrial apoptosis. Mol Cell 8, 705-711.
Choi K., Frommel T.O., Stern R.K., Perez C.F., Kriegler M., Tsuruo T., Roninson I.B., 1991.
Multidrug resistance after retroviral transfer of the human MDR1 gene correlates with P-glycoprotein
density in the plasma membrane and is not affected by cytotoxic selection. Proc Natl Acad Sci U S A 88,
7386-7390.
Choi S.H., Im E., Kang H.K., Lee J.H., Kwak H.S., Bae Y.T., Park H.J., Kim N.D., 2005.
Inhibitory effects of costunolide on the telomerase activity in human breast carcinoma cells. Cancer Lett
227, 153-162.
Clifford G., Franceschi S., Diaz M., Munoz N., Villa L.L., 2006. Chapter 3: HPV type-distribution
in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine 24, 26-34.
158
Cohen J., Enserink M., 2008. Nobel Prize in Physiology or Medicine. HIV, HPV researchers
honored, but one scientist is left out. . Science 322, 174-175.
Cole S.P.C., Bhardwaj G., Gerlach J.H., Mackie J.E., Grant C.E., Almquist K.C., Stewart A.J.,
Kurz E.U., Duncan A.M.W., Deeley R.G., 1992. Overexpression of a transporter gene in a multidrugresistant human lung cancer cell line. Science 258, 1650-1654.
Colombo P., Gunnarsson K., Latropoulos M., Brughera M., , 2001. Toxicological testing of
cytotoxic drugs International journal of oncology 19 1021-1028.
Conforti F., Statti G., Tundis R., Loizzo M.R., Bonesi M., Menichini F., Houghton P. J., 2004.
Antioxidant and cytotoxic activities of Retama raetam subsp. Gussonei. Phytother Res 18, 585-587.
Cong Y.S., Wen J., Bacchetti S., 1999. The human telomerase catalytic subunit hTERT:
organization of the gene and characterization of the promoter. Hum Mol Genet 8, 137-142.
Crespi M.D., Ivanier S.E., Genovese J., Baldi A., 1986. Mitoxantrone affects topoisomerase
activities in human breast cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 136:, 521-528.
Cristofalo V.J., Lorenzini A., Allen R.G., Torres C., Tresini M., 2004. Replicative senescence: a
critical review. Mech Ageing Dev 125, 827-848.
D
Dalton W.S., Grogan T.M., Rybski J.A., , 1989. Immunohistochemical detection and quantification
of P-glycoprotein in multiple drug-resistant human myeloma cells: association with level of drug
resistance and drug accumulation. Blood 73, 747- 752.
Damm K., Hemmann U., Garin-Chesa P., Hauel N., Kauffmann I., Priepke H., Niestroj C., Daiber
C., Enenkel B., Guilliard B., Lauritsch I., Muller E., Pascolo E., Sauter G., Pantic M., Martens U.M.,
Wenz C., Lingner J., Kraut, N., Rettig, W.J., Schnapp, A., 2001. A highly selective telomerase inhibitor
limiting human cancer cell proliferation. EMBO J 20, 6958-6968.
de Boer M. A., Jordanova E. S., Kenter G.G., Peters A. A., Corver W. E., Trimbos J. B., Fleuren G.
J., 2007. High human papillomavirus oncogene mRNA expression and not viral DNA load is associated
with poor prognosis in cervical cancer patients. Clin Cancer Res 13, 132-138.
De Cian A., Lacroix L., Douarre C., Temime-Smaali N., Trentesaux C., Riou J. F., Mergny J. L., ,
2008. Targeting telomeres and telomerase. Biochimie 90 131-155.
De Lange T., 2005. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres.
Genes Dev 19, 2100-2110.
de Lange T., 2009. How telomeres solve the end-protection problem. Science 326, 948-952.
de Souza Nascimento P., Alves G., Fiedler W., , 2006. Telomerase inhibition by an siRNA directed
against hTERT leads to telomere attrition in HT29 cells. Oncol Rep 16 423-428.
159
De Villiers E.M., Fauquet C., Broker T.R., Bernard H.U., zur Hausen H., 2004. Classification of
papillomaviruses. Virology 324, 17-27.
Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R., 2001. The human ATP-Binding Cassette (ABC) transporter
superfamily. Genome Res 11, 1156-1166.
Denizot F., Lang R., 1986 Rapid calorimetric assay for cell growth and survival: Modification to
tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability J Immunol Methods 89, 271.
Ding P.L., Huang H., Zhou P., Chen D.F., 2006. Quinolizidine alkaloids with anti-HBV activity
from Sophora tonkinensis. Planta Med 72 854-856.
Dirsch V.M., Stuppner H., Vollmar A.M., , 2001. Cytotoxic sesquiterpene lactones mediate their
death-inducing effect in leukemia T cells by triggering apoptosis. Planta Med 67, 557- 559.
Doorbar J., 2006. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clin
Sci 110, 525-541.
Doorbar J., , 2005. The papillomavirus life cycle. J Clin Virol 32, 7-15.
Dorn D.C., Alexenizer M., Hengstler J.G., Dorn A., 2006. Tumor cell specific toxicity of Inula
helenium extracts. Phytother Res 20, 970-980.
E
Eddouks, M., Maghrani, M., Lemhadri, A., Ouahidi, M.L., Jouad, H., 2002. Ethnopharmacological
survey of medicinal plants used for the treatment of diabetes mellitus, hypertension and cardiac diseases
in the south-east region of Morocco (Tafilalet). J Ethnopharmacol 82, 97-103.
Eddouks, M., Maghrani, M., Louedec, L., Haloui, M., Michel, J.B., 2007. Antihypertensive activity
of the aqueous extract of Retama raetam Forssk. leaves in spontaneously hypertensive rats. J Herb
Pharmacother 7, 65-77.
Edziri H., Ammar S., Groh P., Mahjoub M.A., Mastouri M ., Gutmann L. , Mighri Z., Mahjoub A.,
2007. Antimicrobial and cytotoxic activity of Marrubium alysson and Retama raetam grown in Tunisia.
Pak J Biol Sci 10, 1759-1762.
Edziri H., Mastouri M., Cheraif I., Aouni M., 2010. Chemical composition and antibacterial,
antifungal and antioxidant activities of the flower oil of Retama raetam (Forssk.) Webb from Tunisia. Nat
Prod Res 24, 789-796.
Eisenbrand G., Pool-Zobel B., Baker V., Balls M., Blauuboer A., Boobis A., Carere A.,
Kevekordes S., Lhuguenot J.C., Pieters R., Kleiner J., 2002. Methods of in vitro toxicology. Food and
Chemical Toxicology 40, 193- 236.
El-Shazly A., Ateya A.M., Witte L., Wink M., 1996. Quinolizidine Alkaloids Profiles of Retama
raetam, R. sphaerocarpa and R. monosperma. Z Naturforsch 51, 301-308.
160
El Hanbali F., Mellouki F., Akssira M., Balasquez A., 2004. Etude Comparative des Compositions
Chimiques et de l’Activité Antibactérienne des Huiles Essentielles de Chamaemelum eriolepis Maire et
Chamaemelum Africana J.&Four. 1er Congrès Maroco-Espagnol sur la Chimie Organique et 4ème
Rencontre Andalou-Marocaine sur la Chimie des Produits Naturels 16-18.
El Hanbali F., Oulmoukhtar A.S., Lemrani M., Akssira M., Mellouki F., 2005. Activité antileishmanienne des huiles essentielles de deux camomilles : Ormenis eriolepis et Ormenis africana.
International Congress On Medicinal Plants, Errachidia March 16-19, Morocco.
Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S., 1998. A Caspaseactivated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 391, 43-50.
F
Fadok V.A., Bratton D.L., Rose D.M., Pearson A., Ezekewitz R.A., Henson P.M., , 2000. A
receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells. Nature 405 85-90
Fairchild C. R., Ivy S. P., Kao-Shan C. S., Whang-Peng J., Rosen N., Israel M. A., Melera P. W.,
Cowan K. H., Goldsmith M. E., 1987. Isolation of amplified and overexpressed DNA sequences from
adriamycin-resistant human breast cancer cells. Cancer Res 47, 5141-5148.
Fernandes M.B., Scotti M.T., Ferreira M.J., Emerenciano V.P., 2008. Use of self-organizing maps
and molecular descriptors to predict the cytotoxic activity of sesquiterpene lactones. Eur J Med Chem 43,
2197-2205.
Flens M.J., Izquierdo M.A., Scheffer G.L., Fritz J.M., Meijer C.J., Scheper R.J., Zaman G.J., 1994.
Immunochemical detection of the multidrug resistance-associated protein MRP in human multidrugresistant tumor cells by monoclonal antibodies. Cancer Res 54, 4557-4563.
Fletcher T.M., Cathers B.E., Ravikumar K.S., Mamiya B.M., Kerwin S.M., , 2001. Inhibition of
human telomerase by 7-deaza-2′-deoxyguanosine nucleoside triphosphate analogs: potent inhibition by
6-thio-7-deaza-2′-deoxyguanosine 5′-triphosphate. Bioorg Chem 26, 36–55.
Folini M., Gandellini P., Zaffaroni N., 2009. Targeting the telosome: therapeutic implications.
Biochim Biophys Acta 1792, 309-316.
Fontana G., La Rocca S., Passannanti S., Paternostro M.P., 2007. Sesquiterpene compounds from
Inula viscosa. Nat Prod Res 21, 824-827.
Forsythe H.L., Jarvis J.L., Turner J.W., Elmore L.W., Holt S.E., 2001. Stable association of hsp90
and p23, but Not hsp70, with active human telomerase. J Biol Chem 276, 15571-15574.
Franco E.L., Harper D.M., :. 2005. Vaccination against human papillomavirus infection: a new
paradigm in cervical cancer control. Vaccine 23, 2388-2394.
Fukuda K., Hibiya Y., Mutoh M., Koshiji M., Akao S., Fujiwara H., 1999. Inhibition by berberine
of cyclooxygenase-2 transcriptional activity in human colon cancer cells. J Ethnopharmacol 66, 227-233.
161
Future L.L., 2007. Quadrivalent vaccine against human papillomavirus to prevent high-grade
cervical lesions. N Engl J Med 356, 1915-1927.
G
Gellert G.C., Jackson S.R., Dikmen Z.G., Wright W.E., Shay J.W., 2005. Telomerase as
therapeutic target in cancer. Drug Discovery Today Dis Mech 2, 159-164.
Gentile V., Thomazy V., Piacentini M., Fesus L., Davies P.J., 1992. Expression of tissue
transglutaminase in Balb-C 3T3 fibroblasts: effects on cellular morphology and adhesion. J Cell Biol 119,
463-474.
Ghantous A., Gali-Muhtasib H., Vuorela H., Saliba N.A., Darwiche N., 2010. What made
sesquiterpene lactones reach cancer clinical trials? Drug Discov Today 15, 668-678.
Ghittoni R., Accardi R., Hasan U., Gheit T., Sylla B., Tommasino M., 2010. The biological
properties of E6 and E7 oncoproteins from human papillomaviruses. Virus Genes 40, 1-13.
Gigant, B., Wang, C., Ravelli R.B., Roussi F., Steinmetz M.O., Curmi, P.A., Sobel A., Knossow
M., 2005. Structural basis for the regulation of tubulin by vinblastine. Nature 435, 519-522.
Goldstein L.J., Galski H., Fojo A., Willingham M., Lai S.L., Gazdar A., 1989. Expression of a
multidrug resistance gene in human cancers. J Natl Cancer Inst 81, 116-124.
Gomez M., Wu J., Schreiber V., Dunlap J., Dantzer F., Wang Y., Liu Y., 2006 PARP1 Is a
TRF2-associated poly(ADP-ribose)polymerase and protects eroded telomeres Mol Biol Cell 17, 16861696.
Gomez D., Aouali N., Londono-Vallejo A., Lacroix L., Megnin-Chanet F., Lemarteleur T.,
Douarre C., Shin-ya K., Mailliet P., Trentesaux C., Morjani H., Mergny, J.L., Riou, J.F., 2003. Resistance
to the short term antiproliferative activity of the G-quadruplex ligand 12459 is associated with telomerase
overexpression and telomere capping alteration. J Biol Chem 278, 50554-50562.
Gomez D., Lemarteleur T., Lacroix L., Maillet P., Mergny J.L., Riou J.F., 2004a. Telomerase
downregulation induced by the G-quadruplex ligand 12459 in A549 cells is mediated by hTERT RNA
alternative splicing. Nucleic Acids Res 32 371-379.
Gomez D., Paterski R., Lemarteleur T., Shin-Ya K., Mergny J.L., Riou J.F., 2004b. Interaction of
telomestatin with the telomeric single-strand overhang. J Biol Chem 279, 41487-41494.
Gottesman M.M., Pastan I., 1993. Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug
transporter. Annu Rev Biochem 62 385-427.
Gottlieb E., Oren M., 1998. p53 facilitates pRb cleavage in IL-3-deprived cells: novel pro-apoptotic
activity of p53. The EMBO Journal 17, 3587-3596.
162
Gowan S.M., Harrison J.R., Patterson L., Valenti M., Read M.A., Neidle S., Kelland L.R., 2002. A
G-quadruplex-interactive potent small-molecule inhibitor of telomerase exhibiting in vitro and in vivo
antitumor activity. Mol Pharmacol 61, 1154-1162.
Grand C.L., Han H., Munoz R.M., Weitman S., Von Hoff D.D., Hurley L.H., Bearss D.J., 2002.
The cationic porphyrin TMPyP4 down-regulates c-MYC and human telomerase reverse transcriptase
expression and inhibits tumor growth in vivo. Mol Cancer Ther 1, 565-573.
Green D.R., Kroemer G., , 2004. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science 305,
626-629.
Greenberg R. A., O'Hagan R.C., Deng H., Xiao Q., Hann S.R., Adams R.R., Lichtsteiner S., Chin
L., Morin G.B., DePinho R.A., 1999. Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-Myc but
is not functionally equivalent in cellular transformation. Oncogene 18, 1219-1226.
Greider C.W., Blackburn E.H., 1985. Identification of a specific telomere terminal transferase
activity in Tetrahymena extracts. Cell 43, 405-413.
Greider C.W., Blackburn E.H., 1989 A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase
required for telomere repeat synthesis. Nature 337, 331-337.
Gros P., Neriahy B., C.J., Housman D.E., , 1989. Isolation and expression of a complementary
DNA that confers multidrug resistance. Nature 323, 728-731.
Gryaznov S.M., 2010. Oligonucleotide n3'-->p5' phosphoramidates and thio-phoshoramidates as
potential therapeutic agents. Chem Biodivers 7, 477-493.
Gunes C., Lichtsteiner S., Vasserot A.P., Englert C., 2000. Expression of the hTERT gene is
regulated at the level of transcriptional initiation and repressed by Mad1. Cancer Res 60, 2116-2121.
Guo Q.L., Lin S.S., You Q.D., Gu H.Y., Yu J., Zhao L., Qi Q., Liang F., Tan Z., Wang X., , , 2006.
Inhibition of human telomerase reverse transcriptase gene expression by gambogic acid in human
hepatoma SMMC-7721 cells. Life Sci 78 1238-1245.
H
Haddad P.S., Depot M., Settaf A., Chabli A., Cherrah Y., 2003. Comparative study on the
medicinal plants most recommended by traditional practitioners in Morocco and Canada. J Herbs Spices
Med Plants 10(3), 25-45.
Hahn W.C., 2003. Role of telomeres and telomerase in the pathogenesis of human cancer. J Clin
Oncol 21, 2034–2043.
Hanahan D., Weinberg R.A., , 2000 The hallmarks of cancer. Cell 100, 57-70.
Hantz S., Alain S., Denis F., 2006 Human papillomavirus prophylactic vaccines: stakes and
perspectives. Gynecol Obstet Fertil 34, 647-655.
163
Harapanhalli R.S., Howell R.W., Rao D.V., 1994. Bis-benzimidazole dyes, Hoechst 33258 and
Hoechst 33342: radioiodination, facile purification and subcellular distribution. Nucl Med Biol 21, 641647.
Harley C.B., Futcher A.B., C.W., G., , 1990. Telomeres shorten during ageing of human
fibroblasts. Nature 345, 458.
Hawley-Nelson P., Vousden K.H., Hubbert N.L., Lowy D.R., Schiller J.T., 1989. HPV16 E6 and
E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes. EMBO J 8, 3905-3910.
Hawley-Nelson P., Vousden K.H., Hubbert N.L., e.a.H.E.a.E.p.c.t.i.h.f.k.T.E.J., 8(12), 3905-3910.
Hayakawa N., Nozawa K., Ogawa A., Kato N., Yoshida K., Akamatsu K., Tsuchiya M., Nagasaka
A., Yoshida S., 1999. Isothiazolone derivatives selectively inhibit telomerase from human and rat cancer
cells in vitro. Biochemistry 38, 11501-11507.
Hayflick L., 1998 A brief history of the mortality and immortality of cultured cells. Keio J Med 47,
174-182.
Heard I., 2005. Lésions ano-génitales liées à l’infection par les papillomavirus humains chez la
femme. Médecine et maladies infectieuses 35, 302-305.
Henson J.D., Neumann A.A., Yeager T.R., Reddel R.R., 2002. Alternative lengthening of
telomeres in mammalian cells. Oncogene 21, 598-610.
Hernandez V., Recio M.C., Manez S., Giner R.M., Rios J.L., 2007. Effects of naturally occurring
dihydroflavonols from Inula viscosa on inflammation and enzymes involved in the arachidonic acid
metabolism. Life Sci 81, 480-488.
Hernandez V., Recio M.C., Manez S., Prieto J.M., Giner R.M., Rıos J.L., 2001. A mechanistic
approach to the in vivo anti-inflammatory activity of sesquiterpenoid compounds isolated from Inula
viscosa. Planta Med 67, 726–731.
Hmamouchi M., 2001. Les plantes Médicinales et aromatiques Marocaines. 2ème ed.
Hofmann K., Bucher P., Tschopp J., 1997. The CARD domain: a new apoptotic signalling motif.
Trends Biochem Sci 22 155-156.
Hortobagyi G.N., , 1997. Anthracyclines in the treatment of cancer. An OverviewDrugs 54 1-7.Hou
M., Xu D., Bjorkholm M., Gruber A., 2001. Real-time quantitative telomeric repeat ampliﬁcation
protocol assay for the detection of telomerase activity. Clin Chem 47, 519-524.
Howie H.L., Katzenellenbogen R.A., Galloway D.A., 2009. Papillomavirus E6 proteins. Virology
384, 324-334.
Hseini S., Kahouadji A., Lahssissene H., Tijane M., 2007. Analyses floristique et ethnobotanique
des plantes vasculaires médicinales utilisées dans la région de Rabat (Maroc occidental). Lazaroa 28, 93100.
164
Hsu H.L., Gilley D., Galande S.A., Hande M.P., Allen B., Kim S H., Li G.C., Campisi J., KohwiShigematsu T., Chen D.J., 2000. Ku acts in a unique way at the mammalian telomere to prevent end
joining. Genes Dev.
Huang P.R., Yeh Y.M., Wang T.C., 2005. Potent inhibition of human telomerase by helenalin.
Cancer Lett 227, 169-174.
Huard S., Moriarty T.J., Autexier C., 2003. The C terminus of the human telomerase
reversetranscriptase is a determinant of enzyme processivity. Nucleic Acids Res 31, 4059-4070
I
Indran I.R., Tufo G., Pervaiz S., Brenner C., 2011. Recent advances in apoptosis, mitochondria and
drug resistance in cancer cells. Biochim Biophys Acta 1807, 735-745.
Izbicka E., Wheelhouse R.T., Raymond E., Davidson K.K., Lawrence R.A., Sun D., Windle B.E.,
Hurley L.H., Von Hoff D.D., 1999. Effects of cationic porphyrins as G-quadruplex interactive agents in
human tumor cells. Cancer Res 59, 639-644.
J
Jaattela M., 2002. Programmed cell death: many ways for cells to die decently. Ann Med 34 480488.
Johung K., Goodwin E.C., DiMaio D., 2007. Human papillomavirus E7 repression in cervical
carcinoma cells initiates a transcriptional cascade driven by the retinoblastoma family, resulting in
senescence. Journal of Virology 81 2102-2116.
Jouad H., Haloui M., Rhiouani H., El Hilaly J., M., E., 2001. Ethnobotanical survey of medicinal
plants used for the treatment of diabetes, cardiac and renal diseases in the North centre region of Morocco
(Fez-Boulemane). J Ethnopharmacol 77, 175-182.
Juliano R.L., Ling V., 1976. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese
hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta 455 152-162.
K
Kanno S., Kitajima Y., Kakuta M., Osanai Y., Kurauchi K., Ujibe M., Ishikawa M., 2008.
Costunolide-induced apoptosis is caused by receptor-mediated pathway and inhibition of telomerase
activity in NALM-6 cells. Biol Pharm Bull 31, 1024-1028.
Karlseder J., Broccoli D., Dai Y., Hardy S., de Lange T., 1999. p53- and ATM-dependent apoptosis
induced by telomeres lacking TRF2. Science 283, 1321-1325.
Keppler B.R., Jarstfer M.B., 2004. Inhibition of telomerase activity by preventing proper
assemblage. Biochemistry 43, 334-343.
165
Kerr J.F., Winterford C.M., Harmon B.V., 1994. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer
therapy. Cancer 73, 2013-2026.
Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R., 1972. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26, 239-257.
Khan A.L., Hussain J., Hamayun M., Gilani S.A., Ahmad S., Rehman G., Kim Y.H., Kang S.M.,
Lee I.J., 2010. Secondary metabolites from Inula britannica L. and their biological activities. Molecules
15, 1562-1577.
Khan M., Giessrigl B., Vonach C., Madlener S., Prinz S., Herbaceck I., Holzl C., Bauer S., Viola
K., Mikulits W., Quereshi R. A., Knasmuller S., Grusch M., Kopp B., Krupitza G., 2010. Berberine and a
Berberis lycium extract inactivate Cdc25A and induce alpha-tubulin acetylation that correlate with HL-60
cell cycle inhibition and apoptosis. Mutat Res 683, 123-130.
Kim M.Y., Gleason-Guzman M., Izbicka E., Nishioka D., Hurley L.H., 2003. The different
biological effects of telomestatin and TMPyP4 can be attributed to their selectivity for interaction with
intramolecular or intermolecular G-quadruplex structures. Cancer Res 63, 3247-3256.
Kim N.W., Piatyszek M. A., Prowse K. R., Harley C. B., West M. D., L., H.P., Coviello G. M.,
Wright W. E., Weinrich S. L., Shay J. W., 1994. Specific association of human telomerase activity with
immortal cells and cancer. Science 266, 2011-2015.
Kim N.W., 1997. Clinical implications of telomerase in cancer. Eur J Cancer 33, 781-786.
Kimura M., Stone R.C., Hunt S.C., Skurnick J., Lu X., Cao X., Harley C.B., Aviv A., 2010.
Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.
Nat Protoc 5, 1596-1607.
Kinghorn A.D., Chin Y.W., Swanson S.M., 2009. Discovery of natural product anticancer agents
from biodiverse organisms. Curr Opin Drug Discov Devel 12, 189-196.
Kirk K.E., Harmon B.P., Reichardt I.K., Sedat J.W., E.H., B., 1997. Block in anaphase
chromosome separation caused by a telomerase template mutation. Science 275 1478-1481.
Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I., Germer M., Pawlita M., Krammer P.H., Peter M.E.,
1995. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling
complex (DISC) with the receptor. EMBO J 14, 5579-5588.
Kiyono T., Foster S.A., Koop J.I., McDougall J.K., Galloway D.A., Klingelhutz A.J., 1998. Both
Rb/p16INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells.
Nature 396, 84-88.
Klingelhutz A.J., Foster S.A., McDougall J.K., 1996. Telomerase activation by the E6 gene product
of human papillomavirus type 16. Nature 380, 79-82.
Koehn H., Magan N., Isaacs R.J., Stowell K.M., 2007. Differential regulation of DNA repair
protein Rad51 in human tumour cell lines exposed to doxorubicin. Anticancer Drugs, 18: 419-425.
166
Konishi T., Shimada Y., Nagao T., Okabe H., Konoshima T., 2002. Antiproliferative sesquiterpene
lactones from the roots of Inula helenium. Biol Pharm Bull 25, 1370-1372.
Kool M., van der Linden M., de Haas M., Scheffer G.L., de Vree J.M., Smith A.J., , 1999. MRP3,
an organic anion transporter able to transport anti-cancer drugs. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 6914-6919.
Kraemer K., Fuessel S., Schmidt U., Kotzsch M., Schwenzer B., Wirth M.P., , 2003. Antisensemediated hTERT inhibition specifically reduces the growth of human bladder cancer cells. Clin Cancer
Res 9 3794-3800.
Kramer K. M., Haber J. E., 1993. New telomeres in yeast are initiated with a highly selected subset
of TG1-3 repeats. Genes Dev 7 2345-2356.
Krishna S., Low I.C., Pervaiz S., 2011. Regulation of mitochondrial metabolism: yet another facet
in the biology of the oncoprotein Bcl-2. Biochem J 435, 545-551.
Krupp G., Kuhne K., Tamm S., Klapper W., Heidorn K., Rott A., 1997. Molecular basis of artifacts
in the detection of telomerase activity and a modified primer for a more robust 'TRAP' assay. Nucleic
Acids Res 25, 919-921.
Kuwano M., Toh S., Uchiumi T., Takano H., Kohno K., Wada M., 1999. Multidrug
resistanceassociated protein subfamily transporters and drug resistance. Anticancer Drug Des 14 123-131.
L
Lastra C., Lopez A., Motiva V., , 1993. Gastroprotection and prostaglandin E2 generation in rats by
flavenoids of Dittrichia viscosa. Planta Medica 59, 497-501.
Lauro L., Rolih C., 1990. Observations and research on an extract of Inula viscosa Ait. Boll Soc
Ital Biol Sper 66, 829-834.
Lawrence N. J., McGown A.T., Nduka J., Hadfield J.A., R.G., P., 2001. Cytotoxic michael-type
amine adducts of α-methylene lactones alantolactone and isoalantolactone. . Bioorganic & Medicinal
Chemistry Letters 11, 429-431.
Li S., Nosrati M., Kashani-Sabet M., 2007. Knockdown of telomerase RNA using hammerhead
ribozymes and RNA interference. Methods Mol Biol 405, 113-131.
Li X.W., Weng L., Gao X., Zhao Y., Pang F., Liu J.H., Zhang H.F., Hu J.F., 2011.
Antiproliferative and apoptotic sesquiterpene lactones from Carpesium faberi. Bioorg Med Chem Lett 21,
366-372.
Li Y., Wicha M.S., Schwartz S.J., Sun D., 2011. Implications of cancer stem cell theory for cancer
chemoprevention by natural dietary compounds. J Nutr Biochem.
Liao C.H., Hsiao Y.M., Sheu G.T., Chang J.T., Wang P.H., Wu, M.F., Shieh G.J., Hsu C.P., Ko
J.L., 2007. Nuclear translocation of telomerase reverse transcriptase and calcium signaling in repression
167
of telomerase activity in human lung cancer cells by fungal immunomodulatory protein from Ganoderma
tsugae. Biochem Pharmacol 74, 1541-1554.
Lin Z., Huang C.F., Liu X.S., Jiang J., 2011. In vitro anti-tumour activities of quinolizidine
alkaloids derived from Sophora flavescens Ait. Basic Clin Pharmacol Toxicol 108 304-309.
Liu K., Hodes R.J., Weng N.p., 2001. Cutting edge: telomerase activation in human T lymphocytes
does not require increase in telomerase reverse transcriptase (hTERT) protein but is associated with
hTERT phosphorylation and nuclear translocation. J Immunol 166, 4826-4830.
Liu X., Dakic A., Zhang Y., Dai Y., Chen R., Schlegel R., 2009. HPV E6 protein interacts
physically and functionally with the cellular telomerase complex. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 1878018785.
Liu X., Roberts J., Dakic A., Zhang Y., Schlegel R., 2008. HPV E7 contributes to the telomerase
activity of immortalized and tumorigenic cells and augments E6-induced hTERT promoter function.
Virology 375, 611-623.
Longthorne V.L., Williams G.T., 1997. Caspase activity is required for commitment to Fasmediated apoptosis. EMBO J 16, 3805-3812.
Lv M., Xu H., 2011. Recent Advances in Semisynthesis, Biosynthesis, Biological Activities, Mode
of Action, and Structure-Activity Relationship of Podophyllotoxins: An Update (2008-2010). Mini Rev
Med Chem. xxx.
M
Maghrani M., Michel J.B., Eddouks M., 2005a. Hypoglycaemic activity of Retama raetam in rats.
Phytother Res 19, 125-128.
Maghrani M., Zeggwagh N.A., Haloui M., Eddouks M., 2005b. Acute diuretic effect of aqueous
extract of Retama raetam in normal rats. J Ethnopharmacol 99, 31-35.
Magné N., Deutsch E., Haie-Meder C., 2008. Données actuelles des associations
chimioradiothérapeutiques et place potentielle des thérapies ciblées dans les cancers du col utérin.
Cancer/Radiothérapie 12 31-36.
Mamoci E., Cavoski I., Simeone V., Mondelli D., Al-Bitar L., Caboni P., 2011. Chemical
composition and in vitro activity of plant extracts from Ferula communis and Dittrichia viscosa against
postharvest fungi. Molecules 16, 2609-2625.
Manez S., Hernández V., Giner R.M., Ríos J.L., Recio M.C., 2007. Inhibition of pro-inflammatory
enzymes by inuviscolide, a sesquiterpene lactone from Inula viscosa. Fitoterapia 78 329–331.
Manez S., Recio M.C., Gil I., Gomez C., Giner R.M., Waterman P.G., Rios J. L., 1999. A glycosyl
analogue of diacylglycerol and other antiinflammatory constituents from Inula viscosa. J Nat Prod 62,
601-604.
168
Maoz M., Neeman I., 1998. Antimicrobial effects of aqueous plant extracts on the fungi
Microsporum canis and Trichophyton rubrum and on three bacterial species. Lett Appl Microbiol 26, 6163.
Maoz M., Neeman I., 2000. Effect of Inula viscosa extract on chitin synthesis in dermatophytes and
Candida albicans. Journal of Ethnopharmacology 71, 479-482.
Massard C., Zermaty Y., Pauleau A.L., Larochette N., Metivier D., Sabatier L., Kroemer G., Soria
J.C., , 2006. hTERT: a novel endogenous inhibitor of the mitochondrial cell death pathway. Oncogene 25,
4505-4514.
McEachern M.J., Krauskopf A., Blackburn E.H., 2000. Telomeres and their control Annu Rev
Genet 34, 331-358.
Meenakshi S., Srivastava S., 2007. Antimicrobial activities of Indian Berberis species. Fitoterapia
78, 574-576.
Melnikow J., Nuovo J., Willan A.R., Chan B.K., Howell L.P., 1998. Natural history of cervical
squamous intraepithelial lesions: a meta-analysis. Obstet Gynecol 92, 727-735.
Middleton K., Peh W., Southern S., Griffin H., Sotlar K., Nakahara T., El-Sherif A., Morris L.,
Seth R., Hibma M., Jenkins D., Lambert P., Coleman N., Doorbar J., 2003. Organization of human
papillomavirus productive cycle during neoplastic progression provides a basis for selection of diagnostic
markers. J Virol 77, 10186-10201.
Modzelewska A., Sur S., Kumar S.K., Khan S.R., 2005. Sesquiterpenes: natural products that
decrease cancer growth. Curr Med Chem Anticancer Agents 5, 477-499.
Monneret C., 2010. [Current impact of natural products in the discovery of anticancer drugs]. Ann
Pharm Fr 68, 218-232.
Monsonego J., Pintos J., Semaille C., Beumont M., Dachez R., Zerat L., Bianchi A., Franco E.,
2006. Human papillomavirus testing improves the accuracy of colposcopy in detection of cervical
intraepithelial neoplasia. Int J Gynecol Cancer 16, 591-598.
Moore A., Donahue C. J., Bauer K. D., Mather J. P., 1998. Simultaneous measurement of cell cycle
and apoptotic cell death. Methods Cell Biol 57, 265-278.
Morin G.B., 1989. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that
synthesizes TTAGGG repeats. Cell 59 521-529.
Mosmann T., 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65, 55-63.
Mougin C., Bourgault-Villada I., Coursaget P., 2009. [HPV immunization for the prevention of
cervical cancer]. Presse Med 38, 1750-1768.
169
Mougin C., Nicolier M., Decrion-Barthod A.Z., 2008 HPV et cancers : mécanismes de
l’oncogenèse. Revue Francophone Des Laboratoires 405, 35-42.
Munger K., Baldwin A., Edwards K.M., Hayakawa H., Nguyen C.L., Owens M., Grace M., Huh
K., 2004. Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis. J Virol 78, 11451-11460.
Munger K., Phelps W.C., Bubb V., Howley P.M., Schlegel R., 1989. The E6 and E7 genes of the
human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human
keratinocytes. J Virol 63, 4417-4421.
Munoz N., Bosch F. X., Castellsague X., Diaz M., de Sanjose S., Hammouda D., Shah K. V.,
Meijer C. J., 2004. Against which human papillomavirus types shall we vaccinate and screen? The
international perspective. Int J Cancer 111, 278-285.
Munoz N., Bosch F. X., De Sanjose S., Herrero R., Castellsague X., Shah K. V., Snijders P. J.,
Meijer C. J., 2003. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical
cancer. N Engl J Med 348, 518-527.
Munoz N., Castellsague X., De Gonzalez A.B., Gissmann L., 2006. Chapter 1: HPV in the etiology
of human cancer. Vaccine 21, 1-10.
Murakami J., Nagai N., Shigemasa K., Ohama K., 1999. Inhibition of telomerase activity and cell
proliferation by a reverse transcriptase inhibitor in gynaecological cancer cell lines. Vaccine 35, 1027–
1034
Murnane J.P., Sabatier L., Marder B. A., Morgan W.F., , 1994. Telomere dynamics in an immortal
human cell line. Embo J 13 4953-4962.
N
Naasani I., Seimiya H., Yamori T., Tsuruo T., 1999. FJ5002: a potent telomerase inhibitor
identified by exploiting the disease-oriented screening program with COMPARE analysis. Cancer Res 59,
4004-4011.
Naredi P., Heath D. D., Enns R. E., Howell S. B., 1994. Cross-resistance between cisplatin and
antimony in a human ovarian carcinoma cell line. Cancer Res 54, 6464-6468.
Newman D.J., Cragg G.M., 2007. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. J
Nat Prod 70, 461-477.
Nobili S., Lippi D., Witort E., Donnini M., Bausi L., Mini E., Capaccioli S., 2009. Natural
compounds for cancer treatment and prevention. Pharmacol Res 59, 365-378.
O
O'Sullivan R.J., Karlseder J., 2010. Telomeres: protecting chromosomes against genome instability.
Nat Rev Mol Cell Biol 11, 171-181.
170
Oh S., Song Y.H., Yim J., Kim T.K., 2000. Identification of Mad as a repressor of the human
telomerase (hTERT) gene. Oncogene 19, 1485-1490.
OMS, 2002. Communiqué de presse OMS/52 28 juin 2002 : Un nouveau rapport sur le cancer
donne de l'espoir aux patients et aux communautés.
Opresko P. L., Cheng W. H., von Kobbe C., Harrigan J. A., Bohr V. A., 2003. Werner syndrome
and the function of the Werner protein; what they can teach us about the molecular aging process.
Carcinogenesis 24, 791-802.
Orth K., O'Rourke K., Salvesen G.S., Dixit V.M., , 1996. Molecular ordering of apoptotic
mammalian CED-3/ICE-like proteases. . J Biol Chem 271, 20977-20980.
Ostor A.G., 1993. Natural history of cervical intraepithelial neoplasia: a critical review. Int J
Gynecol Pathol 12, 186-192.
Ozbun M.A., Meyers C., 1998. Human papillomavirus type 31b E1 and E2 transcript expression
correlates with vegetative viral genome amplification. Virology 248, 218-230.
P
Paavonen J., Jenkins D., Bosch F.X., Naud P., Salmeron J., Wheeler C.M., Chow S.N., Apter D.L.,
Kitchener H.C., Castellsague X., de Carvalho N.S., Skinner S.R., Harper D.M., Hedrick J.A., Jaisamrarn
U., Limson G.A., Dionne M., Quint W., Spiessens B., Peeters P., Struyf F., Wieting S.L., Lehtinen M.O.,
Dubin G., 2007. Efficacy of a prophylactic adjuvanted bivalent L1 virus-like-particle vaccine against
infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: an interim analysis of a phase III
double-blind, randomised controlled trial,. Lancet 369, 2161-2170.
Pal H.C., Sehar I., Bhushan S., Gupta B.D., Saxena A.K., 2010. Activation of Caspases and poly
(ADP-ribose) polymerase cleavage to induce apoptosis in leukemia HL-60 cells by Inula racemosa.
Toxicol In Vitro in press.
Palm W., and De Lange T., , 2008. How Shelterin Protects Mammalian Telomeres. Annu Rev
Genet 42 21-34.
Papanicolaou G.N., Traut H.F., 1943. Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear New
York, The Commonwealth Fund.
Park H.J., Kwon S.H., Han Y.N., Choi J.W., Miyamoto K., Lee S.H., Lee K.T., , 2001. ApoptosisInducing costunolide and a novel acyclic monoterpene from the stem bark of Magnolia sieboldii. Arch
Pharm Res 24, 342- 348.
Paul S., Breuninger L.M., Tew K.D., Shen H., Kruh G.D., 1996. ATP-dependent uptake of natural
product cytotoxic drugs by membrane vesicles establishes MRP as a broad specificity transporter. Proc
Natl Acad Sci U S A 93 6929-6934.
Peralta-Zaragoza O., Bermudez-Morales V.H., Madrid-Marina V., 2010. [RNA interference:
biogenesis molecular mechanisms and its applications in cervical cancer]. Rev Invest Clin 62, 63-80.
171
Pereira R., Hitzeroth ll, R.E.P., 2009. Insights into the role and function of L2, the minor capsid
protein of papillomaviruses. Archives of Virology 154, 187-197.
Pereira W.O., Amarante-Mendes G.P., 2011. Apoptosis: a programme of cell death or cell
disposal? Scand J Immunol 73, 401-407.
Perry D.K., Hannun Y.A., 1998. The role of ceramide in cell signaling. Biochim Biophys Acta
1436, 233-243.
Petit P.X., Zamzami N., Vayssiere J.L., Mignotte B., Kroemer G., Castedo M., 1997. Implication
of mitochondria in apoptosis. Mol Cell Biochem 174, 185-188.
Picman A.K., 1986. Biological Activities of Sesquiterpene Lactones. Biochemical Systematics and
Ecology 14, 255-281.
Pointreau Y., Ruffier Loubiere A., Denis F., Barillot I., 2010. [Cervix cancer]. Cancer Radiother 14
Suppl 1, S147-153.
Ponnusamy S., Meyers-Needham M., Senkal C.E., Saddoughi S.A., Sentelle D., Selvam S.P., Salas
A., Ogretmen B., 2010. Sphingolipids and cancer: ceramide and sphingosine-1-phosphate in the
regulation of cell death and drug resistance. Future Oncol 6, 1603-1624.
Poon S.S., Martens, U.M., Ward R.K., Lansdorp P.M., 1999. Telomere length measurements using
digital fluorescence microscopy. Cytometry 36, 267-278.
Pretet J.L., Alvarez E., Monnier-Benoit S., Touze A., 2006. Vaccination against human
papillomavirus infections. Rev Prat 56, 1914-1918.
Psyrri A., DiMaio D., 2008. Human papillomavirus in cervical and head-and-neck cancer. Nature
Clinical Practice Oncology 5, 24-31.
Q
Qasem J.R., Al-Abed A.S., Abu-Blan M.A., 1995. Antifungal activity of clammy inula (Inula
viscosa) on Helminthrosporium sativum and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Phytopathol Mediterr
34, 7-14.
R
Rankin A.M., Faller D.V., Spanjaardk R.A., 2008a. Telomerase inhibitors and ‘T-oligo’ as cancer
therapeutics: contrasting molecular mechanisms of cytotoxicity Anti-cancer Drugs 19 329-338.
Reers M., Smith T.W., L.B., C., 1991. J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative
fluorescent indicator of membrane potential. Biochemistry 30, 4480-4486.
Richart R.M., 1987. Causes and management of cervical intraepithelial neoplasia. Cancer 60, 19511959.
172
Riou J.F., Guittat L., Mailliet P., Laoui A., Renou E., Petitgenet O., Megnin-Chanet F., Helene C.,
Mergny J.L., 2002. Cell senescence and telomere shortening induced by a new series of specific Gquadruplex DNA ligands. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 2672-2677.
Riou J.F., Morjani H., Trentesaux C., 2006 Télomères et télomérase, de nouvelles cibles pour la
chimiothérapie anticancéreuse. Ann Pharm Fr 64, 97-105.
Riou J.F., Morjani H., Trentesaux C., , 2006. Télomères et télomérase, de nouvelles cibles pour la
chimiothérapie anticancéreuse. Ann Pharm Fr 64 97-105.
Robey R.W., Honjo Y., Morisaki K., Nadjem T. A., Runge S., Risbood M., Poruchynsky M. S.,
Bates S. E., 2003. Mutations at amino-acid 482 in the ABCG2 gene affect substrate and antagonist
specificity. Br J Cancer 89, 1971-1978.
Rocch E., Khodjakov A., Volk E.L., Yang C.H., Litman T., Bates S.E., Schneider E., 2000. The
product of the ABC half-transporter gene ABCG2 (BCRP/MXR/ABCP) is expressed in the plasma
membrane. Biochem Biophys Res Commun 271, 42-46.
Rodriguez E., Towers G.H.N., Mitcheu J.C., 1976. Biological activities of sesquiterpene lactones.
Phytochemistry 15, 1573-1580.
Rohde V., Sattler H.P., Bund T., Bonkhoff H., Fixemer T., Bachmann C., Lensch R., Unteregger
G., Stoeckle M., Wullich B., 2000. Expression of the human telomerase reverse transcriptase is not
related to telomerase activity in normal and malignant renal tissue. Clin Cancer Res 6, 4803-4809.
Ross D.D., Yang W., Abruzzo L.V., W.S., D., Schneider E., Lage H., Dietel M., Greenberger L.,
Cole S.P., Doyle L.A., 1999. Atypical multidrug resistance: breast cancer resistance protein messenger
RNA expression in mitoxantrone-selected cell lines. J Natl Cancer Inst 91, 429-433.
Roth A., Harley C.B., Baerlocher G.M., 2010. Imetelstat (GRN163L)--telomerase-based cancer
therapy. Recent Results Cancer Res 184, 221-234.
Rozenblat S., Grossman S., Bergman M., Gottlieb H., Cohen Y., Dovrat S., 2008. Induction of
G2/M arrest and apoptosis by sesquiterpene lactones in human melanoma cell lines. Biochem Pharmacol
75, 369-382.
Rufer N., Dragowska W., Thornbury G., Roosnek E., Lansdorp P.M., 1998. Telomere length
dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat Biotechnol 16, 743747.
S
Saeboe-Larssen S., Fossberg E., Gaudernack G., 2006. Characterization of novel alternative
splicing sites in human telomerase reverse transcriptase (hTERT): analysis of expression and mutual
correlation in mRNA isoforms from normal and tumour tissues. BMC Mol Biol 7, 26.
Salhi S., Fadli M., Zidane L., Douira A., 2010. Etudes floristique et ethnobotanique des plantes
médicinales de la ville de Kénitra (Maroc). Lazaroa 31, 133-146.
173
Sassi A.B., Harzallah-Skhiri F., Bourgougnon N., Aouni M., 2008. Antiviral activity of some
Tunisian medicinal plants against Herpes simplex virus type 1. Nat Prod Res 22, 53-65.
Sathiyamoorthy P., Lugasi-Evgi H., Schlesinger P., Kedar I., Gopas J., Pollack Y., GolanGoldhirsh A., 1999. Screening for Cytotoxic and Antimalarial Activities in Desert Plants of the Negev
and Bedouin Market Plant Products. Pharmaceutical Biology (Formerly International Journal of
Pharmacognosy) 37, 188-195.
Satrani B., Ghanm M., Farah A., Aafi A., Fougrach H., Bourkhiss B., Boust D., Talbi M., 2007.
Composition chimique et activité antimicrobienne de l’huile essentielle de Cladanthus mixtus. . Bull Soc
Pharm 146, 85-96.
Scaffidi C., Fulda S., Srinivasan A., Friesen C., Li F., Tomaselli K.J., Debatin K.M., Krammer
P.H., Peter M.E., 1998. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. EMBO J 17, 1675-1687.
Scheffer G. L., Kool M., Heijn M., de Haas M., Pijnenborg A. C., Wijnholds J., van Helvoort A.,
de Jong M. C., Hooijberg J. H., Mol C. A., van der Linden M., de Vree J. M., van der Valk P., Elferink
R. P., Borst P., Scheper R. J., 2000. Specific detection of multidrug resistance proteins MRP1, MRP2,
MRP3, MRP5, and MDR3 P-glycoprotein with a panel of monoclonal antibodies. Cancer Res 60, 52695277.
Scheffner M., Werness B.A., Huibregtse J.M., Levine A.J., Howley P.M., 1990. The E6
oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell 63,
1129-1136.
Schinella G.R., Tournier H.A., Prieto J.M., Mordujovich de Buschiazzo P., Rios J.L., 2002.
Antioxidant activity of anti-inflammatory plant extracts. Life Sciences 70, 1023-1033.
Schneider, E., Horton, J.K., Yang, C.H., Nakagawa, M., Cowan, K.H., 1994. Multidrug resistanceassociated protein gene overexpression and reduced drug sensitivity of topoisomerase II in a human
breast carcinoma MCF7 cell line selected for etoposide resistance. Cancer Res 54, 152-158.
Schurr E., Raymond M., Bell JC., Gros P., 1989. Characterization of the multidrug resistance
protein expressed in cell clones stably transfected with the mouse mdr1 c DNA. Cancer Res 49, 27292733.
Shamanin V.A., Sekaric P., Androphy E.J., 2008. hAda3 degradation by papillomavirus type 16 E6
correlates with abrogation of the p14ARF-p53 pathway and efficient immortalization of human mammary
epithelial cells. J Virol 82, 3912-3920.
Shay J.W., Bacchetti S., 1997. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer 33,
787-791.
Sherman M. E., Schiffman M. H., Lorincz A. T., Herrero R., Hutchinson M. L., Bratti C., Zahniser
D., Morales J., Hildesheim A., Helgesen K., Kelly D., Alfaro M., Mena F., Balmaceda I., Mango L.,
Greenberg M., 1997. Cervical specimens collected in liquid buffer are suitable for both cytologic
screening and ancillary human papillomavirus testing. Cancer 81, 89-97.
174
Shippen-Lentz D., Blackburn E.H., 1989. Telomere terminal transferase activity from Euplotes
crassus adds large numbers of TTTTGGGG repeats onto telomeric primers. Mol Cell Biol 9 2761-2764.
Shore D., 1995. Aging; Silence is golden. Curr Biol 5 822-825.
Singh J., Kakkar P., 2009. Antihyperglycemic and antioxidant effect of Berberis aristata root
extract and its role in regulating carbohydrate metabolism in diabetic rats. J Ethnopharmacol 123, 22-26.
Slee E.A., Harte M.T., Kluck R.M., Wolf B.B., Casiano C.A., Newmeyer D.D., Wang H.G., Reed
J.C., Nicholson D.W., Alnemri E. S., Green D. R., Martin S.J., 1999. Ordering the cytochrome cinitiated Caspase cascade: hierarchical activation of Caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a Caspase-9dependent manner. J Cell Biol 144, 281-292.
Smiley S.T., Reers M., Mottola-Hartshorn C., Lin M., Chen A., Smith T.W., 1991. Intracellular
heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation
JC-1. Proc Natl Acad Sci U S A 88 3671-3675.
Smogorzewska A., De Lange T., , 2004. Regulation of telomerase by telomeric proteins. Annu Rev
Biochem 73, 177-208.
Soder A.I., Hoare S.F., Muire S., Balmain A., Parkinson E.K., Keith W.N., 1997. Mapping of the
gene for the mouse telomerase RNA component, Terc, to chromosome 3 by fluorescence in situ
hybridization and mouse chromosome painting. Genomics 41, 293-294.
Sofowora A., 1993. Medicinal plants and traditional medicine in Africa, 2. Spectrum Books
Limited, Ibadan, Nigeria, 289.
Solary E., 2006. La mort cellulaire induite par les agents cytotoxiques. Bull Cancer hors série : 6170.
Solomon D., Davey D., Kurman R., Moriarty A., O'Connor D., Prey M., 2002. The 2001 Bethesda
System: terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA 287 2114-2119.
Song G., Luo Q., Qin J., Wang L., Shi Y., Sun C., 2006. Effects of oxymatrine on proliferation and
apoptosis in human hepatoma cells. Colloids Surf Biointerfaces 48, 1-5.
Sonoda E., Sasaki M.S., Morrison C., Yamaguchi-Iwai Y., Takata M., Takeda S., , , 1999. Sister
chromatid exchanges are mediated by homologous recombination in vertebrate cells. Mol Cell Biol 19,
5166-5169.
Stanley M., 2010. HPV - immune response to infection and vaccination. Infect Agent Cancer 5, 19.
Stansel R.M., de Lange T., Griffith J.D., 2001. T-loop assembly in vitro involves binding of TRF2
near the 3’ telomeric overhang. EMBO J 20, 5532-5540.
Strahl C., Blackburn E.H., , 1996. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and
telomerase activity in two immortalized human cell lines. Mol Cell Biol 16, 53-65.
175
Suffness M., Pezzuto J.M., 1990. Assays Related to Cancer Drug Discovery. In: Methods in Plant
Biochemistry: Assays for Bioactivity. Hostettmann, K (Ed) Vol.6, 71 - 133.
Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot
E., Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.
M., Kroemer G., 1999. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature
397, 441-446.
T
Talib W.H., Mahasneh A.M., 2010. Antimicrobial, cytotoxicity and phytochemical screening of
Jordanian plants used in traditional medicine. Molecules 15, 1811-1824.
Tauchi T., Ohyashiki J.H., Ohyashiki K., 2007. Telomerase inhibition combined with other
chemotherapeutic reagents to enhance anti-cancer effect. Methods Mol Biol 405, 181-189.
Taylor R.C., Cullen S.P., Martin S.J., , 2008. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level.
. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 231-241.
Terencio M.C., Sanz M.J., Paya M., 1990. A hypotensive procyanidin-glycoside from Rhamnus
lycioides ssp. Lycioides. J Ethnopharmacol 30, 205-214.
Thompson C.B., 1995. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267, 14561462.
Tomasz M., Lipman R., Chowdary D., Pawlak J., Verdine G.L., Nakanishi K., 1987. Isolation and
structure of a covalent cross-link adduct between mitomycin C and DNA. Science 235, 1204-1208.
Touati D., Allain P., Pellecuer J., Fkih-Tetouani S., 1996a. Alkaloids from Retama monosperma
ssp. Eumonosperma. Fitoterapia 67, 49-52.
Touati D., Allain P., Pellecuer J., Fkih-Tetouani S., Agoumi A., , 1996b. Alkaloids from Retama
monosperma ssp. Eumonosperma. Fitoterapia 67, 49-52.
Trentesaux C., Riou J.F., 2010. [Senescence and cellular immortality]. Bull Cancer 97, 1275-1283.
Tsujimoto Y., Shimizu S., 2000. Bcl-2 family: life-or-death switch. FEBS Lett 466, 6-10.
U
Uehara H., Nardone G., Nazarenko I., Hohman R.J., 1999. Detection of telomerase activity
utilizing energy transfer primers: comparison with gel- and ELISA-based detection. Biotechniques 26,
552-558.
Ulaner G.A., Hu J.F., , 1998. Telomerase activity in human development is regulated by human
telomerase reverse transcriptase (hTERT) transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts.
Cancer Res 18, 4168-4172.
176
USAID., 2008. Stratégie nationale de développement du secteur des plantes aromatiques et
médicinales agriculture & agrobusiness intègres. Agriculture & agrobusiness integres.
V
Valdovinos-Torres H., Orozco-Morales M., Pedroza-Saavedra A., Padilla-Noriega L., EsquivelGuadarrama F., Gutierrez-Xicotencatl L., 2008. Different Isoforms of HPV-16 E7 Protein are Present in
Cytoplasm and Nucleus. Open Virol J 2, 15-23.
Vaziri H., Schachter F., Uchida I., Wei L., Zhu X., Effros R., Cohen D., Harley C.B., 1993. Loss of
telomeric DNA during aging of normal and trisomy 21 human lymphocytes. Am J Hum Genet 52, 661667.
Veldman T., Liu X., Yuan H., Schlegel R., 2003. Human papillomavirus E6 and Myc proteins
associate in vivo and bind to and cooperatively activate the telomerase reverse transcriptase promoter.
Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8211-8216.
Verdun R.E., Karlseder J., 2007. Replication and protection of telomeres. Nature 447, 924-931.
Von Schwarzenberg K., Vollmar A.M., 2010. Targeting apoptosis pathways by natural compounds
in cancer: Marine compounds as lead structures and chemical tools for cancer therapy. Cancer Lett.
Vulliamy T., Marrone A., Goldman F., Dearlove A., Bessler M., Mason P. J., Dokal I., 2001. The
RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature 413,
432-435.
W
Walboomers J.M., Jacobs M.V., Manos M.M., Bosch F.X., Kummer J.A., Shah K.V., Snijders P.J.,
Peto J., Meijer C.J., Munoz N., 1999. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical
cancer worldwide. J Pathol 189, 12-19.
Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay N.J., 1982. Distantly relatedsequences in the alphaand beta- subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP requiring enzymes and a common
nucleotid binding fold. Embo J 1, 941-951.
Wang Y.F., Guo K.J., Huang B.T., Liu Y., Tang X.Y., Zhang J.J., 2006. Inhibitory effects of
antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides on pancreatic cancer cell Bxpc-3 telomerase activity
and cell growth in vitro. World J Gastroenterol 12, 4004-4008.
Weng N.P., Granger L., Hodes R.J., 1997. Telomere lengthening and telomerase activation during
human B cell differentiation. Proc NatlAcad Sci USA 94 10827-10832.
Wick M., Zubov D., Hagen G., 1999. Genomic organization and promoter characterization of the
gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). Gene 232, 97-106.
Wilson V.G., West M., Woytek K., Rangasamy D., 2002. Papillomavirus E1 proteins: form,
function, and features. Virus Genes 24, 275-290.
177
Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E., Byrd W., Shay J.W., 1996. Telomerase activity in
human germline activity and embryonic tissues and cells. Dev Genet 18, 173-179.
Wu K.J., Grandori C., 1999. Direct activation of TERT transcription by c-MYC. Nat Genet 2, 220224
Wu Y.Y., Hruszkewycz A.M., Delgado R.M., A., Y., Vortmeyer A.O., Moon Y.W., Weil R.J.,
Zhuang Z., Remaley A.T., 2000. Limitations on the quantitative determination of telomerase activity by
the electrophoretic and ELISA based TRAP assays. Clin Chim Acta 293, 199-212.
Y
Yang Y., Chen Y., Zhang C., Huang H., Weissman S.M., 2002. Nucleolar Localization of hTERT
Protein Is Associated with Telomerase Function. Exp Cell Res 2, 201-209.
Yasumoto S., Kunimura C., Kikuchi K., Tahara H., Ohji H., Yamamoto H., Ide T., Utakoji T.,
1996. Telomerase activity in normal human epithelial cells. Oncogene 13, 433-439.
Yi X., Tesmer V.M., Savre-Train I., Shay J.W., Wright W.E., 1999. Both transcriptional and
posttranscriptional mechanisms regulate human telomerase template RNA levels. Mol Cell Biol 19, 39893997.
Z
Zahler A.M., Prescott D.M., 1988. Telomere terminal transferase activity in the hypotrichous
ciliate Oxytricha nova and a model for replication of the ends of linear DNA molecules. Nucleic Acids
Res 16,, 6953-6972.
Zaman G.J., Flens M.J., van Leusden M.R., de Haas M., Mulder H.S., Lankelma J., Pinedo H.M.,
Scheper R.J., Baas F., Broxterman H.J., 1994. The human multidrug resistance-associated protein MRP is
a plasma membrane drug-efflux pump. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8822-8826.
Zarga M.H., Sabri S.S., Hamed E.M., Khanfar M.A., Zeller, K.P., Atta Ur R., 2003. A new
eudesmane type sesquiterpene from Inula viscosa. Nat Prod Res 17, 99-102.
Zeggwagh, N.A., Ouahidi, M.L., Lemhadri, A., Eddouks, M., 2006. Study of hypoglycaemic and
hypolipidemic effects of Inula viscosa L. aqueous extract in normal and diabetic rats. J Ethnopharmacol
108, 223-227.
Zhang Y., Liu H., Jin J., Zhu X., Lu L., Jiang H., 2010. The role of endogenous reactive oxygen
species in oxymatrine-induced Caspase-3-dependant apoptosis in human melanoma A375 cells.
Anticancer Drugs 21, 494-501.
Zhao J., Bilsland A., Hoare S.F., Keith W.N., , 2003. Involvement of NF-Y and Sp1 binding
sequences in basal transcription of the human telomerase RNA gene. FEBS Lett 536 111-119.
178
Zhao J.Q., Glasspool R.M., Hoare S.F., Bilsland A., Szatmari I., Keith W.N., , 2000. Activation of
telomerase rna gene promoter activity by NF-Y, Sp1, and the retinoblastoma protein and repression by
Sp3. Neoplasia 2, 531-539.
Zhou D.C., Zittoun R., Marie J.P., 1995. Homoharringtonine: an effective new natural product in
cancer chemotherapy. Bull Cancer 82, 987-995.
Zhu J., Zhao, Y., Wang S., 2010. Chromatin and epigenetic regulation of the telomerase reverse
transcriptase gene. Protein Cell 1, 22-32.
Zhu X.D., Kuster B., Mann M., Petrini, J.H., T., d.L., 2000. Cell-cycle-regulated association of
RAD50/MRE11/NBS1 with TR F2 and human telomeres. Nat Genet 25 347-352.
Zovko Koncic M., Kremer D., Karlovic K., Kosalec I., 2010. Evaluation of antioxidant activities
and phenolic content of Berberis vulgaris L. and Berberis croatica Horvat. Food Chem Toxicol 48, 21762180.
179
Annexes
Annexes
I
Annexes
RT: 5.00 - 60.03
SM: 9G
NL:
1.60E6
TIC F: MS
IH1
RT: 47.27
100
95
90
85
RT: 40.56
80
75
70
Relative Abundance
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
RT: 55.92
15
10
5
8.59
12.79
RT: 24.99
RT: 18.91
RT: 54.32
RT: 35.36
0
10
15
20
25
30
35
Time (min)
40
45
50
55
60
Figure 66 : Spectre d’analyse de l’extrait hexanique d’Inula viscosa (IV-HE) par CPG.
RT: 5.00 - 60.02
SM: 9G
NL:
2.33E6
TIC F: MS
ID1
RT: 24.98
100
95
90
85
80
RT: 30.45
75
70
Relative Abundance
65
60
55
50
45
40
35
30
RT: 47.26
25
RT: 18.89
RT: 35.36
20
RT: 55.92
RT: 39.62
15
RT: 53.09
10
5
RT: 12.74
33.01
0
10
15
20
25
30
35
Time (min)
40
45
50
55
60
Figure 67 : Spectre d’analyse de la fraction dichlorométhane d’Inula viscosa (IV-DF) par CPG.
I
Annexes
RT: 5.00 - 60.01
SM: 9G
RT: 53.73
100
95
NL:
8.87E5
TIC F: MS
RD1
90
85
RT: 24.99
80
75
70
65
RT: 30.46
60
55
50
45
40
35
RT: 13.79
30
RT: 44.23
25
RT: 18.91
20
15
RT: 35.36
RT: 48.78
RT: 9.89
50.14
10
5
0
10
15
20
25
30
35
Time (min)
40
45
50
55
60
Figure 68 : Spectre d’analyse de la fraction dichlorométhane de Retama monosperma (Rm-DF)
par CPG.
II
Annexes
Figure 69: Spectre RMN 1H de la fraction F3-a.
III
Annexes
Figure 69: Spectre RMN 13C de la fraction F3-a.
IV
Annexes
Figure 71: Spectre RMN 1H de la fraction F6-3.
V
Annexes
Figure 72: Spectre RMN 13C de la fraction F6-3.
VI
Cell. Mol. Biol. 57 (supp): OL1581-OL1591
Published on October 7, 2011; DOI 10.1170/183
IN VITRO ANTIPROLIFERATIVE EFFECT AND INDUCTION OF
APOPTOSIS BY Retama monosperma L. EXTRACT IN HUMAN
CERVICAL CANCER CELLS
N. MERGHOUB1,2,3, L. BENBACER1, H. EL BTAOURI3, H. AIT BENHASSOU4, C. TERRYN5, M.
ATTALEB1, C. MADOULET3, A. BENJOUAD2, M. EL MZIBRI1*, H. MORJANI3* AND S.
AMZAZI2*
1 Unité Biologie & Recherche Médicale CNESTEN, Rabat, Maroc.
2 Laboratoire de Biochimie-Immunologie. Faculté des sciences de Rabat, Agdal, Maroc.
3 MEDyC CNRS UMR 6237, UFR Sciences et UFR Pharmacie, Reims, France.
4 IIER, EA4303, UFR Pharmacie, Reims, France.
5 IFR 53, Plateforme Imagerie Cellulaire et Tissulaire, Université de Reims, Reims, France.
Abstract
The antiproliferative effect of different extracts obtained from Retama monosperma L. was investigated on
human SiHa and HeLa cervical cancer cell lines using a MTT colorimetric assay. The Retama monosperma L.
dichloromethane fraction (Rm-DF) was the most active extract, exhibiting a significant cytotoxic activity on both
cell lines in a dose-dependent manner, after 72h of treatment. IC50 values obtained were 14.57±4.15µg/ml and
21.33±7.88µg/ml, for SiHa and HeLa cell lines respectively. The morphological features assessment of
apoptosis in Rm-DF-treated cells showed a condensation of chromatin and apoptotic bodies, accompanied by a
decrease in mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and an increase in reactive oxygen species in both cell
lines. The induction of apoptosis was further confirmed by Western blotting pro-caspase 3, Bcl2 and PARP;
caspase 3 activity assay; and Annexin V labelling. Analysis of Rm-DF by CG/MS revealed the presence of five
known quinolizidine alkaloids as well as, sparteine (10,97%), L- methyl cytisine (9.11%), 17- oxosparteine
(3.49%), lupanine (0.93%) and anagyrine (39.63%). This study shows that Retama monosperma L. extract
exhibits a potential anticancer activity against cervical cancer cell lines in vitro through the inhibition of
proliferation and induction of apoptosis, which may involve a mitochondria-mediated signaling pathway.
Key words: Oxidative stress, dietary restriction, lipid peroxidation, protein carbonyl.
Article information’s
INTRODUCTION
Received on June 1, 2011
Accepted on September 1, 2011
Corresponding author
Dr. Mohammed EL MZIBRI
Unité de Biologie et Recherche Médicale, CNESTEN. BP
1382 RP. 10001 Rabat. Morocco
Tel: +212.537.71.27.51
Fax: +212.537.71.18.46
E-mail: [email protected]
*managed equally this work
Abbreviations: Rm: Retama monosperma; Rm-HE:
Retama monosperma hexanic extract; Rm-ME: Retama
monosperma methanolic extract; Rm-DF: Retama
monosperma dichloromethane fraction; Rm-AF: Retama
monosperma ethyl acetate fraction
Natural products have been shown to be
an important source for the development of
new drugs. Cancer continues to be one of the
major causes of death worldwide. To date,
there is an increasing interest in screening
medicinal plants and identification of active
components that are effective against cancer
cells. Approximately 50% of a total of 155
clinically approved anticancer drugs were
either unmodified natural products or in the
forms of their semi-synthetic derivatives, or
synthesized molecules based on natural
product compound pharmacophores (29).
The emergence of multidrug resistance in
several tumors requires a continuing need for
the development of new anticancer drugs and
Copyright © 2011 Cellular & Molecular Biology
http://www.cellmolbiol.com
1581
N. MERGHOUB et al. / Apoptosis induction by Retama Monosperma L. extract
new chemotherapy strategies. Targeting
apoptosis is one of the most important and
promising mechanisms against uncontrolled
growth of tumor cells (17, 36). A wide
variety of natural substances found in
medicinal plants such as curcumin,
artemisinin have been recognized to induce
apoptosis in various human tumor cells
(14,22).
Retama monosperma L. (Boiss.) or
Genista monosperma L. (Lam.), locally
named as “R’tam”, is an annual and
spontaneous plant belonging to the Fabaceae
family. The genus Retama includes four
species with a geographic distribution in the
Mediterranean area, North Africa, and the
Canary islands (13). In Morocco, Retama
genus is largely located in desert regions and
the Middle Atlas (26). This plant is used in
traditional medicine in many countries, as a
purgative, vermifuge, antihelmintic, and
abortive (3). Moreover, several studies
investigated Retama Genus for various
pharmacological
effects,
including
hypoglycemic and diuretic (26,27), cytotoxic
(6,12,25), antioxidant and antiviral (11),
antihypertensive (10), and anti-inflammatory
(4) activities.
The aim of this study was to investigate the
antiproliferative effects of extracts obtained
from Retama monosperma L. against two
cervical cancer cells lines, SiHa and HeLa.
Further experiments were carried out to
determine whether this antiproliferative
effect was associated with apoptotic
signaling. We evaluated alterations in
morphology, phosphatidyl serine distribution,
the activation of pro-caspase-3, the cleavage
of PARP, and Bcl2 expression in SiHa and
HeLa cells treated with Retama monosperma
extract. We also investigated the preliminary
chemical analysis of the most active extract,
using GC/MS.
MATERIALS AND METHODS
Plant material and extraction procedures
Retama monosperma L. (Boiss.) leaves were collected
in March 2009 from Sidi Boughaba reserve in Mehdia-Rabat
(Morocco). The plant was identified at the Scientific
Institute of Rabat by Pr. M. Fennane, and the specimen was
deposited in the Scientific Institute herbarium under the
voucher specimen reference N° RAB78140. The powder of
the dried plant was extracted successively using a Soxhlet
apparatus with n-hexane and methanol to obtain hexanic
extract (Rm-HE) and methanolic extract (Rm-ME). The
resulting extracts were then evaporated by a Rotavapor to
give dried extracts. The methanol concentrated extract was
dissolved in distilled water and was successively extracted
with dichloromethane and ethyl acetate to obtain
dichloromethane fraction (Rm-DF) and ethyl acetate fraction
(Rm-AF). All extracts were evaporated and kept at -20°C
until use.
Cell culture
Human cervical adenocarcinoma cells lines, HeLa and
SiHa, used in this work were kindly provided by Dr. P.
Coursaget (INSERM, University François Rabelais, Tours,
France). Cells were cultured in modified eagle medium
(MEM) supplemented with 10% (v/v) heat-inactivated fetal
bovine serum (FBS) and 1% penicillin–streptomycin. Cells
were maintained at 37°C and 5% CO2 in a humid
environment. All experiments were performed with cells in
exponential growth phase.
Cell proliferation and cytotoxicity assay
HeLa and SiHa cells were seeded in a 96-multiwell
plate at a density of 5. 103 cells/well for 24h. The cells were
then treated with plant extracts and fractions at
concentrations between (5-80µg/ml) for 72h. Vinblastin was
used as positive control. After incubation, 10µl MTT
(5mg/ml) were added to each well and cells were incubated
at 37°C for 4h. The supernatant was then removed and
replaced by 150µl DMSO to dissolve insoluble formazan
crystal. The absorbance was measured with a plate reader
(Genesys 10 UV scanning, Thermo Electron Corporation) at
550nm. The absorbance of untreated cells was considered as
100%. The IC50 (concentrations which reduce the viability
of treated cells by 50%) values were graphically obtained
from the dose–response curves.
Assessment of apoptosis (Hoechst 33342 staining)
Morphology alterations due to apoptosis were detected
by Hoechst 33342 staining. HeLa and SiHa cells were
cultured on glass chamber slides in 2 well plates and were
treated with the Rm-DF for 24, 48 and 72h at a
concentration of 20µg/ml. After incubation, cells were
washed twice with PBS and fixed with (4%
paraformaldehyde and 0.1% Triton X-100) for 5min. The
cells were then washed with PBS and incubated with
10µg/ml Hoechst 33342 (Sigma) at 37°C for 30min. Cells
were visualized using fluorescence inverted microscope
(Axiovert 200M Zeiss, Germany) equipped with an LD
achroplan 40X objective. The 360nm and 460nm filters were
used respectively for excitation and emission. The images
were collected with a CCD cooled camera (Coolsnap HQ,
Ropper Scientific).
Annexin V-FITC/propidium iodide flow cytometric analysis
Analysis of phosphatidylserine externalization in
apoptotic cells was determined by an ApoTarget AnnexinV-FITC Apoptosis kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, France),
according to the manufacturer’s instructions. Cells (2.105
cells) were seeded in 6-well plates and treated with 20µg/ml
Rm-DF for 48h. They were then collected and suspended in
100µl of Annexin V binding buffer. 5µL of Annexin-VFITC and 10µL of propidium iodide were added and then
incubated 15min at room temperature in the dark. Flow
cytometry analysis was carried out using a FACScalibur
(BD Biosciences) flow cytometer.
1582
Mitochondrial membrane potential (∆Ψm ) measurement
Analysis of mitochondrial membrane potential was
carried out using the lipophilic cationic probe, JC-1
(Molecular Probes, Eugene, OR) whose monomer emits at
530nm (green) after excitation at 500nm. Depending on the
mitochondrial membrane potential, JC-1 is able to form Jaggregates which shifts the fluorescence emission from
green to yellow-orange (590nm) as mitochondrial membrane
becomes more polarized. Therefore, the I590nm/I530nm
emission ratio value allows observation of mitochondrial
dysfunction. Residual mitochondrial potential as a
percentage of control was expressed as follows: (R treated/R
control) x 100; R = I590 nm/I530 nm. SiHa and HeLa cells
were treated with Rm-DF for 24h and 48h. JC-1 reagent
(10µM) was added for 20min at 37°C in the dark. Cells were
then washed with PBS and centrifuged at 1500 rpm, for
5min at 4°C. The obtained pellet was resuspended in 1ml
ice-cold PBS and the measurements were performed using
the Spectrofluorometer (RF-5301PC, Shimadzu, Tokyo,
Japan).
Measurement of ROS production
Production of ROS (reactive oxygen species) was
monitored via oxidation of the carboxydichlorofluorescein
analog probe, C2938. SiHa and HeLa cells (2 x105) were
seeded into 6-well plates and treated with the appropriate
concentration of the extract for 24h. Control and treated
cells were washed and stained with 10µM C2938 (30 min,
37˚C). Fluorescence emission from the oxidized probe was
quantified with a Spectrofluorophotometer (RF-5301PC,
Shimadzu) (excitation: 488±1 nm; emission: 518±1 nm).
Western blot analysis
Cells were treated with 20µg/ml of Rm-DF for 24, 48
and 72h, scraped, washed with PBS and lysed in ice-cold
lysis buffer [(10mM Tris pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM
EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM dithiothreitol, 10 µg/ml
Leupeptin , 10µg/ml aprotinin, 10% glycerol, 1%Brij (v/v)],
placed on ice for 20min and centrifuged at 14,000g for
15min at 4 °C. The amount of protein was determined using
the Bio-Rad protein quantification kit. Equal amounts of
proteins (25-30µg/ml) were subjected to electrophoresis on
SDS-polyacrylamide gels and, transferred to a nitrocellulose
membrane by electroblotting. After blocking non-specific
sites, the membrane was incubated overnight with
appropriate primary antibodies: monoclonal anti- proCaspase 3 (1/700), monoclonal anti-β actin (dilution
1/5000), monoclonal anti-BCl2 (1/700), and polyclonal antiPARP (1/1000). Horseradish peroxidase-conjugated goat
anti-rabbit or anti-mouse IgG were used as secondary
antibodies and proteins were detected using an enhanced
chemiluminescence (ECL) kit.
Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis
The identification of the compounds from Retama
monosperma dichloromethane fraction (Rm-DF) was
performed by GC/MS analysis using (TRACE CG TRA)
Chromatograph, equipped with (Polaris Q MS) Mass
selective detector and
VB5 (5% phenyl ; 95%
methylpolisyloxane) capillary column (30m, 0.25mm, film
thickness 0.25µm). Injection volume was 1 µl with a
splitless; the injector and detector temperatures were held
constant at 250. For GC/MS detection an electron ionization
system with ionization energy of 70eV was used. Helium
was used as the carrier gas with an inlet pressure of 10.48
psi, corresponding to a flow rate of 1.0ml/min. The
analytical conditions were as follows: oven temperature
from 60 to 280°C at rate of 16°C min-1 and the final
temperature of 300°C was held for 10min. Identification of
the compounds was based on the comparison of their
relative retention time and spectral mass with those of Nist
and Wiley7 library data of the GC/MS system.
Statistical analysis
Data are presented as means ± SD of at least triplicate
determinations of three different assays. Statistical analysis
was performed by Student’s-test with Microsoft excel
software. Significant differences are indicated by *p < 0.05;
**p < 0.01; ***p < 0.001.
RESULTS
Effect of Rm extracts on SiHa and HeLa cell
growth
In order to investigate the effects of Retama
monosperma extracts and its fractions on cell
proliferation, SiHa and HeLa cervical cancer
cells were treated with the extracts at different
concentrations (5-80µg/ml) for 72h. Cell growth
was assessed using MTT assay. IC50 values were
calculated from the dose–response curves
obtained by plotting percentage of cell growth as
a function of extracts concentrations. As
displayed in Fig.1, cell growth curves show that
only Rm-DF exerts a dose-dependent effect on
cell proliferation. SiHa cells were relatively more
sensitive to Rm-DF than HeLa cells with IC50
value of 14.57±4.15µg/ml and 21.33±7.88µg/ml
respectively (Table.1). However, the ethyl acetate
extract showed weak activity while hexanic and
methanolic extracts exhibited no effect. Rm-DF
at a dose of 20µg/ml was chosen for further
mechanistic studies.
Morphological
features
associated
with
apoptosis
To determine whether cell growth inhibition
by Rm-DF was associated with apoptosis, SiHa
and HeLa cells were treated with Rm-DF for 24,
48 and 72h, and Hoechst 33342 staining was
performed. Cells with nuclear chromatin
condensation or apoptotic bodies, which are the
typical characteristic of apoptosis, were observed
after treatment. The percentage of apoptotic cells
was calculated and data showed that apoptotic
cells significantly increased in a time-dependent
manner in both SiHa and HeLa cells after
exposure to Rm-DF (Fig.2).
Plasma membrane redistribution of Annexin V
During apoptosis, the plasma membrane
changes
include
a
redistribution
of
phosphatidylserine from the cytoplasmic face to
the outer leaflet making it available for AnnexinV binding. To differentiate cells undergoing
1583
necrosis or apoptosis, Rm-DF treated cells were
analyzed by flow cytometry using PI and
Annexin V labeling. After treatment with Rm-DF
(20µg/ml) for 48 h, early apoptosis (annexin
labeling) was seen in 28.34% and 57.68% in
SiHa cells and HeLa cells respectively (Fig.3).
While, late apoptosis (annexin and PI labeling)
was observed in 5.84% of SiHa cells and 10.35%
of HeLa cells.
Figure 1. Cytotoxic activity of Retama monosperma L.
extracts in cervical cancer cells. SiHa and HeLa cells were
incubated with different concentrations of extracts (580µg/ml) for 72h. Cell growth was determined by MTT
assay. IC50 values (µg/ml) were determined graphically
from viability curves. Vinblastin was used as positive
control. Data are expressed as means ± SD of quadruplicate
determinations.
Effects of Rm-DF on the expression of proteins
involved in apoptosis
In order to elucidate the mechanisms of
apoptosis induced by Rm-DF, we investigated the
effects of Rm-DF on the expression of apoptosis
related proteins by Western blot. We examined
whether Rm-DF induces the activation of procaspase-3 in SiHa and HeLa cells. Our data
showed that Rm-DF significantly increased the
cleavage of pro-caspase-3 to the active form in a
time-dependent manner (Fig.4). Subsequently,
the presence of activated caspase-3 is further
confirmed by detecting the cleavage of PARP. In
Rm-DF-treated cells, the cleavage of PARP
(116KDa) into 85KDa fragment occurred in a
time-dependent manner. Moreover, as can be
seen in Fig.4 a decrease in Bcl-2 expression
occurred in Rm-DF-treated cells, in a timedependent manner.
Table 1. MTT assay: IC50 values of extracts and fractions of Retama monosperma against SiHa and HeLa
cervical cancer cells.
IC50 (µg/ml)
Substances
SiHa
HeLa
Hexane extract (Rm-HE)
› 80
› 80
Methanolic extract (Rm-ME)
› 80
› 80
Dichloromethane fraction (Rm-DF)
14.57±4.15
21.33±7.88
Ethyl Acetate fraction (Rm-AF)
27.54±5.64
77.47±2.25
10.88±0.78
6.28±0,35
Retama monosperma L. extracts
Vinblastin
Cells were exposed to different concentrations of Retama monosperma L. extracts (Hexane and methanol extracts) and
fractions (dichloromethane and ethyl acetate fractions) for 72h. Data are expressed as IC50 values are means ± SD of three
independent experiments. Vinblastin was used as a positive control.
1584
Figure 2. Detection of apoptotic cells in SiHa and HeLa cells treated with Rm-DF by fluorescence microscopy and Hoechst
33342 staining. Cells were treated with 20µg/ml of Rm-DF for 24, 48 and 72h. The stained nuclei were visualized and
photographed with an inverted fluorescence microscope (Axiovert 200M Zeiss). The percentage of apoptotic cells, indicated
by arrowheads, was calculated relatively to total cell number. Data represent at least two independent experiments
(Magnification: 400X).
Depolarization of mitochondrial membrane
potential (∆Ψm) in Rm-DF-treated cells
In order to characterize the effect of Rm-DF
on the mitochondrial apoptotic pathway, we
measured the mitochondrial membrane potential
(∆Ψm) in SiHa and HeLa cells after treatment
with Rm-DF (20µg/ml) for 24h. As shown in
Fig.5, Rm-DF significantly induced a decrease in
mitochondrial membrane potential in a dosedependent manner in SiHa and HeLa cells.
Production of reactive oxygen species (ROS)
induced by Rm-DF
In order to investigate whether the
intracellular reactive oxygen species ROS are
involved in the signal transduction pathways of
apoptosis, we measured the production of ROS
after cells were treated with Rm-DF (20µg/ml)
for 24h, using C2938, an oxydation-sensitive
fluorescent probe. Data were normalized relative
to the untreated cells. As shown in Fig.6, a
significant increase in ROS level was observed in
Rm-DF-treated SiHa and HeLa cells after 24h
exposure, when compared with control cells.
Characterization of compoundsin the Rm-DF
CG/MS analysis was carried out on the
dichloromethane fraction of Retama monosperma
L. (Rm-DF) that exerted the significant growth
inhibitory effect. CG Chromatogram of Rm-DF is
presented in figure 7 and analysis of its MS
spectral data revealed a total of 11 compounds
1585
Figure 3. Annexin V and propidium iodide staining of SiHa and HeLa cells exposed to Rm-DF were analysed by flow
cytomety . Cells were treated with Rm-DF (20µg/ml) for 48h. The x-axis shows Annexin V-FITC binding and the y-axis
staining of propidium iodide (PI) labeled population. Lower left quadrant are viable cells: AnnexinV negative and PI
negative; lower right, early apoptotic cells: AnnexinV positive and PI negative; upper right, necrotic cells or late apoptotic
cells: AnnexinV positive and PI positive.
Figure 4. Western blot analysis of Pro-caspase 3 , Bcl-2 and PARP protein expression, performed in HeLa and SiHa cells
after treatment with 20µg/ml Rm-DF during 24h , 48h and 72h. Cell lysates were prepared and the proteins were separated
on SDS-polyacrylamide gel and transferred onto nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated
antibodies. β-actin was used as a control for protein loading. The results shown here were from two or three independent
experiments.
1586
Figure 5. Effects of Retama monosperma extract on ROS production in SiHa (A) and HeLa (B). The level of ROS
production was measured via oxydation of the carboxydichlorofluorescein analog probe C2938 after treatment with Rm-DF.
Data represent the means ± standard deviations for three independent experiments.
Figure 6. Induction of apoptosis in SiHa and HeLa cells by Rm-DF. Mitochondrial membrane potential was measured by
spectrofluorimetry and JC-1 probe in SiHa (A) and HeLa (B). Cells were treated with 20 and 40µg/ml Rm-DF for 24h as
described in Materials and Methods. The results are presented as the mean ± SD of three independent experiments.
which are summarized in Table.2. CG/MS
analysis identified compounds including five
known quinolizidine alkaloids: Sparteine
(10.97%), L-methyl-cytisine (9.11%), 17oxosparteine (3.49%), Lupanine (0.93%) and
anagyrine (39.63%).
DISCUSSION
A large number of novel anticancer drugs
have been discovered from natural products and
new ones are still under development. The
induction of apoptosis in cancer cells is among
one of the useful strategies for anticancer drug
development. Currently, the plants of the Retama
genus have attracted an increasing interest due to
their wide range of pharmacological effects,
including antihyperglycemic activity (2),
cytotoxic effect (6,12,25), antihypertensive
activity (12) and anti-inflammatory activity (4),
antibacterial, antifungal and antioxidant (11)
activities. It has been reported that Retama
species contain quinolizidine alkaloids (1,35) and
flavonoids (18,24,25) as bioactive constituents.
However, to our knowledge, the antiproliferative and apoptotic effect of Retama
monosperma L. (Boiss.) has not yet been
explored. The aim of this study was to investigate
antiproliferative activity of Retama monosperma
L. extracts against SiHa and HeLa cervical
cancer cell lines. To identify whether the
induction of apoptosis was a mechanism
underlying the growth inhibition of cancer cells,
several assays was performed. We found that the
dichloromethane fraction of Retama monosperma
1587
Fig.7: Chromatogram of the Retama monosperma dichloromethane fraction (Rm-DF) obtained by CG. Compounds were
identified by computer searches in the reference libraries of NIST and Wiley7, and fragmentation patterns were compared
with literature data. Rm-DF constituent are presented in Table.1.
Table 2. Compounds present in Dichloromethane fraction of Retama monosperma identified by
CG/MS.
RT
Identified compounds
CAS
Area (%)
9,89
α-Pinene
7785-70-8
2.73
13,79
1,8-Cineole
470-82-6
8.03
18.91
Benzeneacetic acid, α,4-bis[(trimethylsilyl)oxy]-,
trimethylsilyl ester
56114-69-3
4.71
24.99
9H-pyrrolo[3',4':3,4]pyrrolo[2,1-a]phthalazine-9,
95647-39-5
19.05
11(10H)-dione,10-ethyl-8-phenyl
38,98
Sparteine
90-39-1
10.97
42,71
Hexadecanoic acid
57-10-3
0.86
44,23
L methyl cytisine
486-86-2
9.11
46,67
17- oxosparteine
489-79-5
3.49
47.78
100633-91-8
0.50
48,78
4-(N-(3-trifluoromethylphenyl)-amino)-5,6
dimethyl-7H-pyrro[2.3-d]pyrimidine
Lupanine
550-90-3
0.93
53 ,73
Anagyrine
486-89-5
39.63
RT : Retention time (min). - CAS number: Chemical Abstracts Service.
Area (%): area percentage (peak area relative to the total peak area).
1588
(Rm-DF) exhibited the most significant
antiproliferative effect in a dose-dependent
manner. Rm-DF IC50 values were 14 and
22µg/ml in SiHa and HeLa cell lines
respectively. This is in agreement with the
National Cancer Institute guidelines. In fact, the
criteria of cytotoxic activity for the crude extracts
is an IC50 value < 30µg/ml in preliminary assays
(34). Many reports have also shown that other
plants of the Retama genus exhibit a cytotoxic
effect against various cancer cells. The methanol
extracts of Retama raetam subsp. gussonei leaves
exhibited a significant cytotoxic activity against
COR-L23 cell line with an IC50 of 40μg/ml (6).
Extracts and flavonoids obtained from aerial
parts of Retama sphaerocarpa Boiss. exerted a
dose-dependent cell growth inhibition against
three human cancer cell lines TK-10, MCF-7 and
UACC-62 (25).
Apoptosis is a major mode of cell death in
response to drug treatment and possesses typical
morphological features including cytoplasmic
blebbing, chromatin condensation, nuclear
fragmentation, cell rounding and cell shrinkage
(19,32). The morphological assessment of SiHa
and HeLa cells treated with Rm-DF showed
significant features associated with apoptosis in a
time-dependent manner. We also confirmed that
Rm-DF possesses the ability to induce apoptosis
via the Annexin V/PI redistribution in plasma
membrane. Annexin V positive cells reflect the
externalization of phosphatidylserine residues in
membrane bilayers in early apoptotic events. We
found that after 48h of exposure to Rm-DF, the
number of SiHa and HeLa viable cells decreased
with a concomitant increase in both early
apoptotic and late stage apoptotic cell
populations.
Two pathways are known to mediate antiproliferative drug-induced apoptosis, death
receptor-dependent (extrinsic) and mitochondrialdependent (intrinsic) pathways. In order to
elucidate the mechanisms of apoptosis, we
investigated the effect of Rm-DF on the
expression of specific proteins involved in
apoptosis. Caspases 3, 6, 7 have been implicated
in the execution phase of apoptosis and their
activation and subsequent cleavage of a set of
important cellular proteins lead to the appearance
of apoptotic morphology (20,32). Our data show
that Rm-DF significantly increased the cleavage
of pro-caspase-3 to the active form Fig.4.
Subsequently, the presence of activated caspase-3
is further confirmed by detecting the cleavage of
PARP (116KDa) into 85KDa fragment in RmDF-treated cells. PARP is one of the potential
target molecules of caspase 3 and PARP cleavage
has been widely used as a hallmark of cell
apoptosis (37).
One of the most important regulators of the
intrinsic pathway is the Bcl-2 family of proteins.
Increased expression of the anti-apoptotic protein
Bcl-2 causes resistance to chemotherapeutic
drugs, while a decrease in Bcl-2 expression may
promote apoptotic response to anticancer drugs
(16). We demonstrate here that Bcl-2 expression
was markedly decreased in Rm-DF-treated cells.
Our data clearly show that the molecular
mechanisms involved in Rm-DF-induced
apoptosis of SiHa and HeLa cells, seemed to be
via the intrinsic pathway.
The loss in mitochondrial membrane
potential, an early event in apoptosis, represents
mitochondrial dysfunction which is an
irreversible checkpoint in apoptosis (7,21). Thus,
the effect of Rm-DF on the mitochondrial
transmembrane potential (∆Ψm) has been
evaluated after 24h, using the lipophilic cationic
probe, JC-1. A significant decrease in
mitochondrial membrane potentials (∆Ψm) was
observed in Rm-DF-treated SiHa and HeLa cells
after 24h, the effect is in dose-dependent.
Mitochondrial damage caused by an increase in
ROS results in the loss of the membrane potential
and cytochrome c release, inducing the execution
of apoptosis (31). Intracellular production of
ROS active oxygen species such as -OH, O2- and
H2O2 is associated with the arrest of cell
proliferation. Generation of oxidative stress in
response to various external stimuli has been
implicated in the activation of transcription
factors and to the triggering of apoptosis (28).
Our data indicate that a significant ROS
production occured in Rm-DF treated SiHa and
HeLa cells after 24h. These findings confirm that
apoptosis induced by Rm-DF could be associated
with a caspase-dependent cascade that involves
the activation of the mitochondrial pathway.
Data obtained from CG/MS analysis showed the
presence of quinolizidine alkaloids as major
compounds, particularly the presence of
sparteine, L methyl-cytisine , 17- oxosparteine ,
Lupanine and anagyrine. Our results were in
agreement with previous reports (13,35).
Considering that quinolizidine alkaloids have
been found to elicit a range of biological
activities,
including
antiviral
(8,9),
antihypoglycemic (5,15,30) anti-tumoral (38)
activities, the marked antiproliferative activity of
Retama monosperma extract could be attributed
to the quinolizidine alkaloids, major compounds
contained in dichloromethane fraction. Previous
1589
reports have shown that oxymatrine, a natural
quinolizidine alkaloid, inhibits proliferation and
induces apoptosis of human hepatoma cells. This
effect was mediated by a cell cycle arrest in
G2/M and S phase, down-regulation of Bcl-2 and
up-regulation of p53 (33). Recently, it has been
reported that six quinolizidine alkaloids isolated
from Sophora Flavescens Ait. including,
sophoridine, aloperine, sophocarpine, matrine,
oxymatrine and cytisine, aloperine exerted the
most potent in vitro cytotoxic activity against the
human cancer cell lines (23).
This study provides evidence that Retama
monosperma extracts exert antiproliferative
effects in cervical cancer cells via induction of
mitochondria-dependent apoptosis pathway.
Thus, this plant could be a potential source for
new lead structures in drug design of
quinolizidine alkaloids derivatives against
cervical cancer. Further investigations to
characterize the mechanistic action of the
individual bioactive compounds in the
dichloromethane fraction of this plant are
required.
Acknowledgements - This work is supported by the
“Comité Mixte Inter-Universitaire Franco-Marocain”.
Volubilis AI N° MA/07/178 - Egide n° 13466WE; (20072010). The authors would also like to thank Pr. G.
Sockalingum for providing assistance for the revision of the
manuscript and Pr. M. Fennane for his help in the
identification of the plant.
REFERENCES
1. Abdel Halim, O.B., Abdel Fattah, H., Halim, A.F. and
Murakoshi, I., Comparative chemical and biological studies
of the alkaloidal content of Lygos species and varieties
growing in Egypt. Acta Pharm. Hung 1997, 67: 241-247.
2. Algandaby, M.M., Alghamdi, H.A., Ashour, O.M.,
Abdel-Naim, A.B., Ghareib, S.A., Abdel-Sattar, E.A. and
Hajar, A.S., Mechanisms of the antihyperglycemic activity
of Retama raetam in streptozotocin-induced diabetic rats.
Food Chem. Toxicol. 2010, 48: 2448-2453.
3. Bellakhdar, J., La Pharmacopée Marocaine
Traditionnelle., 1997, (eds.) Ibis Press, Paris,.
4. Bremner, P., Rivera, D., Calzado, M.A., Obon, C.,
Inocencio, C., Beckwith, C., Fiebich, B.L., Munoz, E. and
Heinrich, M., Assessing medicinal plants from SouthEastern Spain for potential anti-inflammatory effects
targeting nuclear factor-Kappa B and other proinflammatory mediators. J. Ethnopharmacol. 2009, 124:
295-305.
5. Brukwicki, T., Włodarczak, J. and Wysocka, W., The
spatial structure of 13a-hydroxy-2-thionosparteine - a
potential hypoglycemic agent - and some related
compounds. Journal of Molecular Structure. 2009, 928:
189-194.
6. Conforti, F., Statti, G., Tundis, R., Loizzo, M.R., Bonesi,
M., Menichini, F. and Houghton, P. J., Antioxidant and
cytotoxic activities of Retama raetam subsp. Gussonei.
Phytother. Res. 2004, 18: 585-587.
7. Desagher, S. and Martinou, J.C., Mitochondria as the
central control point of apoptosis. Trends Cell. Biol. 2000,
10: 369-377.
8. Ding, P.L., Huang, H., Zhou, P. and Chen, D.F.,
Quinolizidine alkaloids with anti-HBV activity from
Sophora tonkinensis. Planta Med. 2006a, 72: 854-856.
9. Ding, P.L., Liao, Z.X., Huang, H., Zhou, P. and Chen,
D.F.,
(+)-12alpha-Hydroxysophocarpine,
a
new
quinolizidine alkaloid and related anti-HBV alkaloids from
Sophora flavescens. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006b, 16:
1231-1235.
10. Eddouks, M., Maghrani, M., Louedec, L., Haloui, M.
and Michel, J.B., Antihypertensive activity of the aqueous
extract of Retama raetam Forssk. leaves in spontaneously
hypertensive rats. J. Herb. Pharmacother. 2007, 7: 65-77.
11. Edziri, H., Mastouri, M., Cheraif, I. and Aouni, M.,
Chemical composition and antibacterial, antifungal and
antioxidant activities of the flower oil of Retama raetam
(Forssk.) Webb from Tunisia. Nat. Prod. Res. 2010, 24: 789796.
12. Edziri , H., Ammar, S., Groh, P., Mahjoub, M.A.,
Mastouri, M ., Gutmann, L. , Mighri, Z. and Mahjoub A.,
Antimicrobial and cytotoxic activity of Marrubium alysson
and Retama raetam grown in Tunisia. Pak. J. Biol. Sci.
2007. 10: 1759-1762.
13. El-Shazly, A., Ateya, A.M., Witte, L. and Wink, M.,
Quinolizidine Alkaloids Profiles of Retama raetam, R.
sphaerocarpa and R. monosperma. Z. Naturforsch. 1996,
51: 301-308.
14. Firestone, G.L. and Sundar, S.N., Anticancer activities
of artemisinin and its bioactive derivatives. Expert. Rev.
Mol. Med. 2009, 11: 32.
15. Garcia Lopez, P.M., de la Mora, P.G., Wysocka, W.,
Maiztegui, B., Alzugaray, M.E., Del Zotto, H. and Borelli,
M.I., Quinolizidine alkaloids isolated from Lupinus species
enhance insulin secretion. Eur. J. Pharmacol. 2004, 504:
139-142.
16. Ghobrial, I.M., Witzig, T.E. and Adjei, A.A., Targeting
apoptosis pathways in cancer therapy. CA. Cancer. J. Clin.
2005, 55: 178-194.
17. Hu, W. and Kavanagh, J.J., Anticancer therapy targeting
the apoptotic pathway. Lancet. Oncol. 2003, 4: 721-729.
18. Kassem, M., Mosharrafa, S.A., Saleh, N.A. and AbdelWahab, S.M., Two new flavonoids from Retama raetam.
Fitoterapia 2000. 71: 649-654.
19. Kerr, J.F., Winterford, C.M. and Harmon, B.V.,
Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy.
Cancer 1994, 73: 2013-2026.
20. Kolenko, V.M., Uzzo, R.G., Bukowski, R. and Finke,
J.H., Caspase-dependent and -independent death pathways
in cancer therapy. Apoptosis, 2000, 5: 17-20.
21. Kroemer, G., Galluzzi, L. and Brenner, C.,
Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.
Physiol. Rev. 2007, 87: 99-163.
22. Kuo, M.L., Huang, T.S. and Lin, J.K., Curcumin, an
antioxidant and anti-tumor promoter, induces apoptosis in
human leukemia cells. Biochim. Biophys. Acta. 1996, 1317:
95-100.
23. Lin, Z., Huang, C.F., Liu, X.S. and Jiang, J., In vitro
anti-tumour activities of quinolizidine alkaloids derived
from Sophora flavescens Ait. Basic Clin. Pharmacol.
Toxicol. 2011, 108: 304-309.
24. López-Lázaro, M., Martín-Cordero, C., Ayuso, M.J.,
Flavonoids of Retama sphaerocarpa. Planta Med. 1999,
65:777-8.
1590
25. López-Lázaro, M., Martin-Cordero, C., Cortes, F.,
Pinero, J. and Ayuso, M.J., Cytotoxic activity of flavonoids
and extracts from Retama sphaerocarpa Boissier. Z.
Naturforsch 2000, 55: 40-43.
26. Maghrani, M., Michel, J.B. and Eddouks, M.,
Hypoglycaemic activity of Retama raetam in rats. Phytother.
Res. 2005a, 19: 125-128.
27. Maghrani, M., Zeggwagh, N.A., Haloui, M. and
Eddouks, M.,. Acute diuretic effect of aqueous extract of
Retama raetam in normal rats. J. Ethnopharmacol. 2005b,
99: 31-35.
28. Mates, J.M. and Sanchez-Jimenez, F.M., Role of
reactive oxygen species in apoptosis: implications for cancer
therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2000, 32: 157-170.
29. Newman, D.J. and Cragg, G.M., Natural products as
sources of new drugs over the last 25 years. J. Nat. Prod.
2007, 70: 461-477.
30. Paolisso, G., Sgambato, S., Passariello, N., Pizza, G.,
Torella, R., Tesauro, P., Varricchio, M. and D'Onofrio, F.,
Plasma glucose lowering effect of sparteine sulphate
infusion in non-insulin dependent (type 2) diabetic subjects.
Eur. J. Clin. Pharmacol. 1988, 34: 227-232.
31. Ricci, J.E., Gottlieb, R.A. and Green, D.R., Caspasemediated loss of mitochondrial function and generation of
reactive oxygen species during apoptosis. J. Cell. Biol. 2003,
160: 65-75.
32. Saraste, A. and Pulkki, K., Morphologic and
biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovascular
Research 2000, 45: 528-537.
33. Song, G., Luo, Q., Qin, J., Wang, L., Shi, Y. and Sun,
C., Effects of oxymatrine on proliferation and apoptosis in
human hepatoma cells. Colloids Surf. Biointerfaces 2006,
48: 1-5.
34. Suffness, M. and Pezzuto, J.M., Assays related to cancer
drug discovery Methods in Plant Biochemistry: Assays for
Bioactivity. Academic Press: London Hostettmann, K.,
(eds.) 1990, 6: 71-133.
35. Touati, D., Allain, P., Pellecuer, J. and Fkih-Tetouani,
S.,
Alkaloids
from
Retama
monosperma
ssp.
Eumonosperma. Fitoterapia 1996, 67: 49-52.
36. Wu, X., Kassie, F. and Mersch-Sundermann, V.,
Induction of apoptosis in tumor cells by naturally occurring
sulfur-containing compounds. Mutat. Res. 2005, 589: 81102.
37. Yang, Y., Zhao, S. and Song, J., Caspase-dependent
apoptosis and -independent poly(ADP-ribose) polymerase
cleavage induced by transforming growth factor beta1. Int.
J. Biochem. Cell. Biol. 2004, 36: 223-234.
38. Zhang, Y., Liu, H., Jin, J., Zhu, X., Lu, L. and Jiang, H.,
The role of endogenous reactive oxygen species in
oxymatrine-induced caspase-3-dependant apoptosis in
human melanoma A375 cells. Anticancer Drugs. 2010, 21:
494-501.
1591
Journal of Medicinal Plants Research Vol. 3(12), pp. 1045-1050, December, 2009
Available online at http://www.academicjournals.org/jmpr
ISSN 1996-0875© 2009 Academic Journals
Full Length Research Paper
Cytotoxic effect of some Moroccan medicinal plant
extracts on human cervical cell lines
Nawal Merghoub1,2, Laïla Benbacer1, Saaid Amzazi2, Hamid Morjani3 and Mohamed El mzibri1*
1
Unité de Biologie and Recherche Médicale CNESTEN, Rabat, Marocco or CNESTEN BP 1382 RP, 10001 Rabat,
Marocco.
2
Laboratoire de Biochimie-Immunologie. Faculté des sciences de Rabat, Agdal, Marocco.
3
MEDyC CNRS UMR 6237, UFR Sciences et UFR Pharmacie, Reims, France.
Accepted 16 October, 2009
Organic extracts of 7 selected plant species, used by Moroccan traditional healers to treat cancer or
non-cancer diseases, were tested for their anti-cancerous activities. The plant selection was based on
ethnobotanic information and interviews with local healers. Extracts from Inula viscosa (L.) Ait., Retama
monosperma (L.) Bois., Ormenis mixta (L.) Dumont., Ormenis eriolepis Coss., Rhamnus lycioides (L.),
Berberis hispanica Bois and Reut. and Urginea maritima (L.) Baker. were tested for their potential
cytotoxic effects on the human cervical cancer cell lines SiHa and HeLa, harbouring HPV16 and HPV 18
respectively. MTT (Tetrazolium blue) colorimetric assay was used to evaluate the viability of cell
cultures in the presence of the extracts. The extract from Inula viscosa (L.) Ait., Retama monosperma
(L.) Bois., Ormenis eriolepis Coss. exhibited marked cytotoxic effect on the two cell lines. These
species could be considered as potential sources of anticancer compounds. Further studies are
necessary for chemical characterization of the active principles and more extensive biological
evaluations.
Key words: Moroccan medicinal plants, cervical cancer cells, cytotoxic activity.
INTRODUCTION
Cervical cancer is a major cause of death. It is the
second most frequent cancer in women worldwide,
accounting for 15% of all cancer related deaths in women
(Boyle and Ferlay, 2005). Each year 470,000 women are
diagnosed with invasive cervical cancer worldwide,
230,000 women die of this disease and 80% of these
occur in developing countries (Bosch and de Sanjosé,
2003). In Morocco, cervical cancer is the second most
frequent female cancer after breast cancer and
represents a major public health problem. The diagnosis
is usually made in advanced stages and mortality is high
(Amrani et al., 2003).
Human Papillomavirus (HPV) is considered as the
etiologic agent of cervical cancer. Epidemiological and
biological studies have shown close relationship between
*Corresponding author. E-mail: [email protected],
[email protected]. Tel: +212.37.71.27.51, +212.66.83.59.11.
Fax: +212.37.71.18.46.
HPV infection and cervical cancer development. High risk
HPV, such as HPV16 and HPV18, has been detected in
94 - 100% of cervical precancerous lesions and cancer
(Castellsagué et al., 2006).
Though the cervical cancer therapy is in advance, side
effects due to the non-specific cytotoxicity of drugs and
resistance to treatment represent a great problem in the
cervical cancer management. Therefore, development
and search of novel and effective anticancer agents,
which in addition should overcome resistance, have
become very important issues (Cameron and Bell, 2004).
Natural compounds have provided many effective
anticancer agents in current use. Currently, over 50% of
drugs used in clinical trials for anticancer activity were
isolated from natural sources or are related to them
(Newman and Gragg, 2007). The use of plants or plants
products, traditionally, as antiviral agents is relatively
wider than their use in modern medicine. Some antiviral
substances have so far been isolated from higher plants,
algae and lichens (Abonyi et al., 2009).
To our knowledge, few studies described the use of
1046
J. Med. Plant. Res.
medicinal plants in treatment of infections by Human
Papilloma Virus, HPV. Craigo et al. (2000) have shown
that, some methylated derivatives of plant lignan, nordihydroguaiaretic acid, which were found to be a potent
antiviral agent against the Human Immunodeficiency
Virus (HIV) and Herpes Simplex Virus (HSV), inhibit the
gene expression from the early promoter P97 of HPV 16
and can be used in the therapy of papillomavirus infections. Likewise, Deng et al. (2004) have also found that
water extracts from Asarum heterotropoides are effective
on anti-human papillomavirus.
There are two main strategies for the selection of plants
species in anticancer drug discovery: random screening
and ethnomedical knowledge. The second approach
includes plants used in organize traditional medical
systems like herbalism and folklore (Pieters and Vlietnick,
2005).
Uncontrolled proliferation is a universal property of
tumour cells. Investigation of the cellular growth control
mechanisms has contributed to the understanding of
carcinogenesis and identification of compounds with
specific antitumoral activities. Thus, cytotoxicity screening
models provide important preliminary data to help select
plant extracts with potential antitumoral properties for
future studies (Cardellina et al., 1999).
In Morocco, the use of traditional medicine is
widespread practice. The ethnobotanical and ethnopharmacological surveys conducted in different areas allowed
the compilation of an inventory of 360 species and more
than 500 prescriptions are recorded (Bellakhdar, 1997).
In the Moroccan traditional medicine, the use of plants in
the form of infusions or decoctions is a common practice
among people of rural communities and their use is
increasing in urban populations. Moroccan medicinal
plants were already studied for their use in different
human diseases (Gonzalez-Tejero et al., 2008).
In the course of our screening strategy for the
anticancer compounds from plants, we undertook the
present study to evaluate the in vitro cytotoxic activity of
seven plants used in the Moroccan traditional medicine
for various diseases such as cancer, inflammation or
infectious diseases. The selection of plants was made on
the basis of their reputation as folk medicines in the
treatment of tumours and related diseases. Table 1
shows the ethnobotanical data of the investigated plant
species, including botanical names, local names,
ethnomedical uses, as well as the plant parts employed
in this study. The cytotoxic activity of selected plants was
studied on the human cervical carcinoma cells lines, SiHa
and HeLa, harbouring HPV16 and HPV18 respectively.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
The selected plants were collected in different areas of Morocco in
May, 2007 and were identified by Dr. M. Fennane from the
Scientific Institute of Rabat. Voucher specimens are kept in the
“Herbarium” of the Institute.
Preparation of extract
Plant materials were dried at room temperature in the dark and
ground finely using blender. Exactly 20 g of each powdered sample
(aerial plants, leaves, root bark or bulbs) were extracted by absolute methanol (100 ml, three times) for 72 h at room temperature
with constant shaking. The extracts were pooled and evaporated to
dryness under reduced pressure at 40°C. A total of 40 mg of
obtained extract were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to
give a solution stock to 40 mg/ml. Extracts were sterilized by
filtration using sterile 0.22 µm pore size filters.
In vitro cytotoxic activity assay
Cell lines and culture medium
Cancer cell lines were kindly provided by Dr. P. Coursaget,
INSERM U618, University François Rabelais, Tours, France. Two
Human cervical cancer cell lines were used in this study, SiHa
harbouring the HPV16 and HeLa harbouring the HPV18. Cells were
grown as monolayers in Minimum Essential Medium (MEM)
supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum and 1%
Penicillin-Spreptomycin mixture. Cultures were maintained at 37°C
in 5% CO2 and 100% relative humidity atmosphere.
Cytotoxicity assay
Cytotoxicity of sample on tumor cells was measured by microculture
tetrazolium (MTT) assay (Mosmann, 1983). For the assays, 96-well
microplates were seeded with 100 µl medium containing 10, 000
cells in suspension. After 24 h incubation and attachment, the cells
were treated with 6 fourfold dilution of crude extracts. Exactly from
the stock solution (40 mg/ml), each extract sample was applied in a
series of 6 dilutions (final concentrations ranging from 15.6 to 500
µg/ml) with a final DMSO concentration of 0.1% and was tested in
quadruplicate.
After 48 h incubation, cell viability was determined by adding
(Sigma) tetrazolim salt as cytotoxicity indicator and by reading
absorbance at 590 nm with a scanning multiwell spectrophotometer. Tetrazolium salts are cleaved to formazan dye by cellular
enzymes (only in the viable cells). The level of absorbance directly
correlates to the metabolically active cells. Mitomycin C (~ 95 %
HPLC, sigma-Aldrich) was used as a positive control.
RESULTS AND DISCUSSION
Using the ethnomedical data approach, some Moroccan
plants that are used in the Moroccan traditional medicine
for various diseases, including cancer, were collected
and evaluated for their cytotoxic activities. The search for
new anti-cancer drugs is one of the most prominent
research areas of natural products. To investigate the
cytotoxic potential of 7 extracts from Morrocan plants
used in traditional medicine for the treatment of various
diseases such as cancer, inflammation or infectious
diseases. We collected a selection of seven plants in
order to screen them for possible cytotoxic activity
cytotoxic activity against cervical cancer cell lines.
The cytotoxic activity was evaluated on two human cer-
Merghoub et al.
1047
Table 1. Ethnobotanical data and some reported pharmacological activities of plants species used in this study.
Plants species (Family)
Inula viscosa L. Ait
(Asteraceae)
Retama monosperma
L. Bois (Fabaceae)
Trivial name
Place of collection
MagramaneTerhala
Ain atik Temara
R’tm
Sidi-Boughaba
Mahdia
Part plant collected
Leaves
Leaves
Purgative, vermifuge,
antihelmintic, abortive and
disinfectant
(Benrahmoune, 2003)
Blood pressure, digestive
disorders, anorexia, urinary
system, nephritic, liver and
gastrointestinal disorders, ocular
affections, febrifuge.
Antileishmania, antitumoral.
(Bellakhdar, 1997)
Antimicrobial activity
(Li et al., 2007 ; Singh et al.,
2007)
Antitumor activities
(Fukuda et al., 1999)
Stomachic,
anthelmintic and antidiabetic
(Bellakhdar, 1997)
anxiolytic, nervous breakdown,
hepatic and gastric insufficiencies
(Haddad et al., 2003)
Antibactrial activities
Antileishmania activities
(Antifungic activity
Argis - Azargnat
Tamahdit
Bark roots
Ormenis eriolepis Coss.
(Asteraceae)
Hellala
Ouarzazat
Aerial part
Ormenis mixta
(Asteraceae)
Hellala
Sidi-Boughaba
Mahdia
Aerial part
S’afira El- harcha
Sidi-Boughaba
Mahdia
Leaves
Urginea maritima L. Baker
(Lemnaceae)
Ansal-Baslet el
dib
Sidi-Boughaba
Mahdia
pharmacological activities
Inflammatory effects
(Hernandez et al., 2007)
(Maoz and Neeman, 1998)
Antifungal activity (Cafarchia et
al., 2002)
Antitumoral activity
(Rozenblat et al., 2008)
Skin diseases, treats cutaneous
abcesses,
wound healing,
Tuberculosis, bronchial infections
(Bellakhdar, 1997)
Berberis hispanica
Bois and Reut.
(Berberidaceae)
Rhamnus lycioides ssp. Oleoides
(Rhamnaceae)
Traditional use
Bulbs
No information available.
Laxative and diuretic
Hypotensive activity
Terencio et al., 1990)
Cardiac failures, whooping-cough,
pneumonia, abortive, vipers bites,
and aphrodisiac
Cough, bronchitis, the jaundice,
diuretic, and internal tumours
(Bellakhdar, 1997)
Cytotoxic and antimalarial
activities (Sathiyamoorthy et al.,
1999)
Anti-insect activity (PascualVillalobos and Fernandez, 1999)
1048
J. Med. Plant. Res.
Figure 1. Cytotoxic activity of methanolic extracts from 7 medicinal plants against SiHa cells (A) and Hela cells
(B).
Cells were incubated with different concentrations of the plant extracts (ranged from 15.6 to 500 µg/ml) for 48 h.
Cell viability was determined by the MTT assay (n=4).
Viability curves: Percentage viability = absorbance of test wells/absorbance of control wells) × 100) plotted
against the concentration of extract.
vical cancer cell lines, SiHa and HeLa, harbouring
respectively HPV 16 and 18, the high oncogenic human
papillomavirus (Pater and Pater, 1985).
The cytotoxic effect of 7 methanolic plant extracts on
SiHa and HeLa cell lines was determined using the MTT
assay. The MTT assays data are presented respectively
in Figures 1(A and B) and the corresponding IC50 are
summarized in Table 2.
Among the 7 medicinal plants tested methanolic
extracts from Inula viscosa (L.) Ait., Retama monosperma
(L.) Bois. and Ormenis eriolepis Coss. showed significant
growth inhibitory effects in both SiHa and HeLa cells
compared to the control. Their IC50 were 54, 99 and 94
µg/ml in SiHa cells respectively. In HeLa cells, the IC50 of
the same plant extracts were 60, 112 and 96 µg/ml
respectively. To be a good drug candidate, the IC50 value
Merghoub et al.
of such agent should be sufficiently low to avoid any
possible unspecific effects. The American National
Cancer Institute assigns a significant cytotoxic effect of
promising anticancer product for future bioguided studies
if it exerts an IC50 value
30 µg/ml (Suffness and
Pezzuto, 1999). In this preliminary study, we have
focused our interest on crude plant extracts, the cytotoxic
activity could be due to the presence in the methanolic
extracts of active products that could probably have
highly anti-growth effects.
I. viscosa (L.) Ait. extract had the greatest activity with
lowest IC50 values. Several studies have been reported
on the phytochemical and other biological properties of
Inula viscosa (L.) Ait. It has been described to exhibit
several biological activities such as anti-inflammatory
(Hernandez et al., 2007), antimicrobial (Maoz and
Neeman, 1998) and antifungal effects (Cafarchia et al.,
2002). This plant is a source of a number of bioactives
compounds as well as flavonoids (Hernandez et al.,
2007) and sesquiterpene derivatives (Fontana et al.,
2007). Recently, Rozenblat et al. (2008) reported that
tomentosin and inuviscolide, a sesquiterpene lactones
isolated from I. viscosa (L.) Ait. were able to inhibit cell
growth of three different human melanoma cell lines.
R. monosperma (L.) Bois. and O. eriolepis Coss.
extracts showed also a significant growth inhibitory
effects in both SiHa and HeLa cells. Theses effects are
less marked than that obtained with I. viscosa (L.) Ait.
extract. These two plants were also reported in previous
studies. The Retama species have been reported to
contain alkaloids (Abdelhalim et al., 1997) and flavonoids
(Kassem et al., 2000). Fifteen quinolizidine and 3
dipiperidine alkaloids were isolated from the leaves of
flowering plants of R. monosperma subsp. Eumonosperma collected from Morocco (Touati et al., 1996). On the
other hand, Retama genus has been described to contain
flavonoids, alkaloids and tannins. In addition, a variety of
plant flavonoids and alkaloids have also been shown to
be anti-carcinogenic in several animal models (Cassady
et al., 1990).
O. eriolepis Coss. has been described to have an
antibacterial, antileishmania and antifungic effects. To our
knowledge, no data relative to the chemical constituents
of O. eriolepis Coss. has being proposed. This plant has
not yet been assessed for in vitro cytotoxicity against
cancer cells.
The results obtained in this preliminary study indicate
that the methanolic extracts of the plants I. viscosa (L.)
Ait, R. monosperma (L.) Boiss and O. eriolepis Coss.
were shown to induce significant and dose-dependent
inhibitory activities against human cervical cancer cell
lines SiHa and HeLa. There remains interesting to evaluate the cytotoxic activity of selected plants in vitro on
other cancer cell lines.
This study provides an important basis for further
investigation into the isolation, characterization and
mechanism of cytotoxic compounds from the screened
1049
medicinal plants. We also plan to carry more biological
activities, including the in vivo studies and the statute of
inhibition of HPV. Thus, these plants could be as a
source for new lead structures in drug design to combat
cancer.
Experiments were performed in quadruplicate (n = 4)
and data were expressed as means ± SDs. IC50 (inhibitory concentration 50%) and SD (standard deviation for
95% confidence) were determined by interpolation from
the viability curves of SiHa and HeLa cells versus methanolic plant extract concentrations. Mitomycin C was used
as a positive control.
Cells were incubated with different concentrations of
the plant extracts (ranged from 15.6 to 500 µg/ml) for 48
h. Cell viability was determined by the MTT assay (n = 4).
Viability curves: Percentage viability = absorbance of
test wells/absorbance of control wells) × 100) plotted
against the concentration of extract.
REFERENCES
Abdelhalim OB, Abdel Fattah H, Halim AF, Murakoshi I (1997).
Comparative chemical and biological studies of the alkaloid content
of Lygos species and varieties growing in Egypt. Acta Pharmaceutica
Hungarica 67: 241-247.
Abonyi DO, Adikwu MU, Esimone CO, Ibezim EC (2009). Plants as
sources of antiviral agents. Afr. J. Biotechnol. 8: 3989-3994.
Amrani M, Lalaoui K, El Mzibri M, Lazo P, Belabbas MA (2003).
Molecular detection of human papillomavirus in 594 uterine cervix
samples from Moroccan women (147 biopsies and 447 swabs). J.
Clin. virol. 27: 286-295.
Bellakhdar J (1997). La pharmacopée marocaine traditionnelle- Médecine arabe ancienne et savoirs populairs, Paris, Editions Ibis Press.
Benrahmoune IZ (2003). Invitation à l’Amour des plantes– Réserve
biologique de Sidi-Boughaba ; Edition Scriptra pp. 114-228.
Bosch FX, de Sanjosé S (2003). Human papillomavirus and cervical
cancer-burden and assessment of causality. J. Natl. Cancer Inst.
Monogr. 31: 3-13.
Boyle P, Ferlay J (2005). Cancer incidence and mortality in Europe,
2004. Ann. Oncol. 16: 481-488.
Cafarchia C, De Laurentis N, Milillo MA, Losacco V, Puccini V (2002).
Antifungal activity of essential oils from leaves and flowers of Inula
viscosa (Asteraceae) by Apulian region. Parassitologia. 44: 153-156.
Cameron D, Bell R (2004). Optimizing treatment for patients with breast
cancer. Semin. Oncol. 31: 4–5.
Cardellina JH, Fuller RW, Gamble WR, Westergaard C, Boswell J,
Munro MHG, Currens M, Boyd MP (1999). Evolving strategies for the
selection dereplication and prioritization of antitumor and HIVinhibitory natural products extracts. In: Bohlin, L., Bruhn, J.G. (Eds),
Bioassay Methods in Natural Product Research and Development.
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht pp. 25-36.
Cassady JM, Baird WM, Chang CJ (1990). Natural products as a
source of potential cancer chemotherapeutic and chemopreventive
agents. J. Nat. Prod. 53: 23-41.
Castellsagué X, Diaz M, de Sanjosé S, Munoz N, Herrero R, Franceschi
S, Peeling RW, Ashley R, Smith JS, Snijiders PJ, Meijer CJ, Bosch
FX (2006). Woldwide human papillomavirus etiology of cervical
adenocarcinoma and its cofactors: implications for screening and
prevention. J. Natl. Cancer Inst. 98: 303-315.
Craigo J, Callahan M, Huang RC, DeLucia AL (2000). Inhibition of
human papillomavirus type16 gene expression by nordihydroguaiaretic acid plant lignan derivatives. Antiviral Res. 47: 19-28
Deng Y, Feng Y, Sun J, Zhou D, Yang L, Lai J (2004). Study on antiHPV activity of Asarum heterotropoides. Zhong Yao Cai. 27: 665667.
Fontana G, La Rocca S, Passannanti S, Paternostro MP (2007). Ses-
1050
J. Med. Plant. Res.
quiterpene compounds from Inula viscose. Nat. Prod. Res. 20: 824827.
Fukuda K, Hibiya Y, Mutoh M, Koshiji M, Akao S, Fujiwara H (1999).
Inhibition by berberine of cyclooxygenase-2 transcriptional activity in
human colon cancer cells. J. Ethnopharmacol. 66 : 227-233.
Gonzalez-Tejero MR, Casares-Porcel M, Sanchez-Rojas CP, RamiroGutierrez JM, Molero-Mesa J, Pieroni A, Giusti ME, Censorii, E, de
Pasquale C, Della A, Paraskeva-hadijchambi D, Hadjichambis A,
Houmani Z, EL-Demerdash M, El-Zayat M, Hmamouchi M, Eljohriq S
(2008). Medicinal plants in the Mediterranean Area: synthesis of the
results of the project Rubia. J. Ethnopharmacol. 116: 341-357.
Haddad PS, Depot M, Settaf A, Chabli A, Cherrah Y (2003).
Comparative study on the medicinal plants most recommended by
traditional practitioners in Morocco and Canada. J. Herbs Spices
Med. Plants 10: 25-45.
Hernández V, Recio MC, Manez S, Giner RM, Rios J.L (2007). Effects
of naturally occurring dihydroflavonols from Inula viscosa on inflammation and enzymes involved in the arachidonic acid metabolism.
Life Sci. 80 : 480–488.
Kassem M, Mosharrafa SA, Saleh NA, Abdel-Wahab S-M (2000). Two
new flavonoids from Retama raetam. Fitoterapia. 71: 649-654.
Li AR, Zhu Y, Li XN, Tian XJ (2007). Antimicrobial activity of four
species of Berberidaceae. Fitoterapia. Short report. 78 : 379–381.
Maoz M, Neeman I (1998). Antimicrobial effects of aqueous plant
extracts on the fungi Microsporum canis and Trichophyton rubum and
on three bacterial species. Lett. Appl. Microbiol. 26: 61-63.
Mosmann T (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J.
Immunol. Methods 16: 55-63.
Newman DJ, Gragg GM (2007). Natural Products as Sources of New
Drugs over the Last 25 Years. J. Nat. Prod. 70: 461-477.
Pascual-Villalobos MJ, Fernandez M (1999). Insecticidal activity of
ethanolic extracts of Urginea maritima (L.) Baker bulbs. Industrial
Crops and Products. 10: 115-120.
Pater MM, Pater A (1985). Human papillomavirus types 16 and 18
sequences in carcinoma cell lines of the cervix. Virol. 145: 313-318.
Pieters L, Vlietnick AJ (2005). Bioguided isolation of pharmacologically
active plant components, still a valuable strategy for the finding of
new lead compounds?. J. Ethnopharmacol. 100: 57-60.
Rozenblat S, Grossman S, Bergman M, Gottlieb H, Cohen Y, Dovrat S
(2008). Induction of G2/M arrest and apoptosis by sesquiterpene
lactones in human melanoma cell lines. Biochem. Pharmacol. 75:
369-382.
Sathiyamoorthy P, Lugasi-Evgi H, Schlesinger P, Kedar I, Gopas
J, Pollack Y, Golan-Goldhirsh A (1999). Screening for Cytotoxic and
Antimalarial Activities in Desert Plants of the Negev and Bedouin
Market Plant Products. Pharm. Biol (Formerly Int. J. Pharmacogn.).
37: 188-195.
Singh M, Srivastava S, Rawat AK (2007). Antimicrobial activities of
Indian Berberis species. Fitoterapia 78: 574-576.
Suffness M, Pezzuto J.M (1990). Assays related to cancer drug
discovery. In: Hostettmann, K. (Ed). Methods in Plant Biochemistry:
Assays for Bioactivity, vol. 6. Academic Press, London, 71-133.
Terencio MC, Sanz MJ, Paya M (1990). A hypotensive procyanidinglycoside from Rhamnus lycioides ssp. Lycioides. J. Ethnopharmacol. 30: 205-214.
Touati D, Allain P, Pellecuer J, Fkih-Tétouani, S, Agoumi (1996). A
Alkaloids from Retama monosperma ssp. eumonosperma.
Fitoterapia. 67: 49-52.

these de doctorat

Transcription

Documents pareils

Autour de la Voix L`École de musique Maurice ANDRÉ

No Blues - Hela Hela

Demande dèxtrait dàcte ou de copie intégrale dàcte

Panorama de la littérature et des idées en France : du Moyen

HIDA 2014 fiche élève

Seigneur, quel cinéma

Fiche Suivi de projet - Grandchamp`Bardement

clotures mobiles de chantier

Et pour tout dirE

“Développer la capacité d`écoute des enfants avec la musique”