Sulfonate-sulfur assimilation in Escherichia coli - ETH E

Diss. ETH Nr. 13651
Sulfonate-sulfur assimilation
in Escherichia coli
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH
for the degree of
DOCTOR OF NATURAL SCIENCES
presented by
ERIC EMMANUEL EICHHORN
Dip!. Biotech.
Ecole Superieure de Biotechnologie de Strasbourg
born on August 21, 1971
from France
accepted on the recommendationof
Prof. Dr. Thomas Leisinger, examiner
Prof. Dr. Linda Thöny-Meycr, co-examiner
Zürich 2000
I
Summary
Summary
In bacteria sulfur is mainly assimilated from inorganic sulfate
Via
the cysteine
biosynthetic pathway. In nature, however, the levels of inorganic sulfate may be low,
and bacteria have to re1y on organosulfur compounds such as sulfate esters, sulfamates
and sulfonates as sulfur sources.
Two sets of genes have previously been identified in Escherichia coli that are only
expressed when sulfate or cysteine are not available as sulfur source. The tauABCD
gene cluster enables E. coli to assimilate taurine-sulfur, and the ssuEADCB gene cluster
encodes proteins involved in sulfonate-sulfur utilization. In the present study the
biochemistry of desulfonation of taurine and other alkanesulfonates is e1ucidated, and
evidence is presented that the TauABC and SsuABC proteins form two distinct
transport systems for the uptake of these compounds.
The sequence relatedness of the TauD protein to the u-ketoglutarate-dependent
2,4-dichlorophenoxyacetate dioxygenase TfdA from Ralstonia eutropha suggested that
TauD is an u-ketoglutarate-dependent dioxygenase catalyzing the oxygenolytic release
of sulfite from taurine. The TauD protein was purified after overexpression of the
corresponding gene in E. coli and characterized. TauD converted taurine to sulfite and
aminoacetaldehyde, which was identified by HPLC after enzymatic conversion to
ethanolamine. Taurine desulfonation by TauD consumed equimolar amounts of taurine,
oxygen and c-ketcglutarate, and absolutely required ferrous iron. The properties and the
amino acid sequence of this enzyme define it as a new member of the u-ketoglutaratedependent dioxygenase family. Taurine was the preferred substrate of TauD, but
pentanesulfonic acid, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) and 1,3-dioxo2-isoindolineethanesulfonic acid were also desulfonated at significant rates. The only
«-keto acid used as a cosubstrate was u-ketoglutarate.
The SsuD and SsuE proteins were purified after overexpression of the corresponding
genes in E. coli and characterized. It was demonstrated that the SsuE enzyme catalyzes
an NAD(P)H-dependent reduction of FMN, and that it is also able to reduce FAD and
riboflavin. The pure SsuD enzyme catalyzed the conversion of pentanesulfonic acid to
sulfite and pentaldehyde and was able to desulfonate a wide range of sulfonated
substrates, including C2 to C IO unsubstituted linear alkanesulfonates, substituted
ethanesulfonic acids and sulfonated buffers. Taurine was not desulfonated by SsuD.
2
Summary
SsuD catalysis was absolutely dependent on FMNH 2 and oxygen. These results
demonstrate that SsuD and SsuE form a two-component monooxygenase system
involved in the desulfonation of a variety of alkanesulfonates other than taurine.
The tauABC and ssuABC genes encode proteins with sequence similarity to proteins
of ABC-type transport systems. TauA and SsuA are putative periplasmic substratebinding proteins, TauB and SsuB resemble ATP-hydrolyzing enzymes, and the TauC
and SsuC proteins are thought to be integral membrane components. To investigate the
requirement for the TauABC and SsuABC proteins for growth of E. coli with taurine
and alkanesulfonates as sulfur sourees, chromosomally located in-frame deletions of
single tauA, tauB, tauC and ssuA, ssuB, ssuC genes were constructed. The growth
properties of the deletion strains were studied and it was found that the substrate
specificities of the TauD and SsuD desulfonation systems were largely reflected in the
substrate range of the corresponding transport system. However, some substrates for
TauD were transported exclusively by the SsuABC system. Mutants in which only
formation of hybrid transporters was possible, were unable to grow with sulfonates,
indicating that the individual components of the two transport systems were not
functionally exchangeable. Thus, TauABC and SsuABC form two distinct transport
systems for uptake of taurine and alkanesulfonates, respectively.
In conclusion, the TauABCD and SsuEADCB systems are two distinct but
complementary systems that enable sulfur assimilation from taurine and other linear
alkanesulfonates when cysteine or sulfate are not available.
3
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Schwefelassimilation erfolgt bei Bakterien ausgehend von anorganischem Sulfat
über den Cysteinbiosyntheseweg. In vielen Ökosystemen liegen allerdings nur geringe
Mengen an Sulfat vor. Infolgedessen müssen sich Bakterien ihren Bedarf an Schwefel
aus organischen Schwefelquellen wie z.B. Sulfatestern, Sulfamaten oder Sulfonaten
erschliessen.
In früheren Arbeiten wurden in Escherichia coli zwei Gencluster identifiziert, deren
Expression nur stattfindet, wenn Cystein oder Sulfat nicht als Schwefelquelle vorliegen.
Das
tauABCD
Operon
ermöglicht
E. coli
die
Verwertung
von
Taurin
(2-Aminoethansulfonat) als Schwefelquelle. Dagegen wird das ssuEADCB Operon für
die Schwefelassimilation aus anderen Sulfonaten gebraucht. In der vorliegenden Arbeit
ist die Biochemie der Desulfonierung von Taurin und anderen Alkansulfonaten in
E. coli aufgeklärt worden. Es wurde auch bewiesen, daß die TauABC und SsuABC
Proteine zwei eigenständige Transportsysteme darstellen, die für die Aufnahme dieser
Verbindungen in die Zelle zuständig sind.
Die Aminosäuresequenz des TauD Proteins zeigt nahe Verwandtschaft zu derjenigen
des TfdA Proteins
von Ralstonia
eutropha,
einer
a-Ketoglutarat-abhängigen
Dioxygenase. Es wurde deshalb vermutet, daß TauD für die oxygenolytische
Abspaltung von Sulfit aus Taurin zuständig ist. Das TauD Protein wurde nach
Überexpression des tauD Gens in E. coli gereinigt und charakterisiert. TauD
katalysierte
die Umwandlung
von Taurin
zu Sulfit und Aminoacetaldehyd.
Aminoacetaldehyd, das organische Produkt der Reaktion konnte wegen seiner
Instabilität
nur
indirekt
nach
enzymatischer
Umwandlung
zu
Ethanolamin
nachgewiesen werden. Bei der Desulfonierung von Taurin durch TauD wurden
stöchiometrische Mengen von Taurin, a- Ketoglutarat und Sauerstoff verbraucht.
Katalyse erfolgte nur unter Anwesenheit von Eisen(I1) Ionen. Aufgrund der
biochemischen Eigenschaften und der Aminosäuresequenz des TauD Enzyms lässt sich
schließen, daß TauD der Familie der a-Ketoglutarat-abhängigen Dioxygenasen
angehört. Taurin war das beste Substrat für dieses Enzym, welches auch fähig war,
Pentansulfonat,
1,3-Dioxo-2-isoindolinethansulfonat und 3-(N- Morpholino )propan-
sulfonat (MOPS) zu desulfonieren.
Dagegen war a-Ketoglutarat die einzige
«-Ketosäure, die als Cosubstrat dienen konnte.
Zusammenfassung
4
Die SsuD und SsuE Proteine wurden ebenfalls nach Überexpression der
entsprechenden Gene in E. coli gereinigt und charakterisiert. Es wurde gezeigt, daß das
SsuE Enzym die NAD(P)H-abhängige Reduktion von FMN katalysiert und in der Lage
ist, auch FAD sowie Riboflavin zu reduzieren. Das SsuD Enzym katalysierte die
Umwandlung von Pentansulfonat zu Sulfit und Pentaldehyd sowie die Desulfonierung
einer Reihe anderer Alkansulfonate. Dazu gehören nicht-substituierte Alkansulfonate,
deren
Kettenlänge
2
bis
10
Kohlenstoffatome
beträgt
SOWIe
substituierte
Ethansulfonatderivate und sulfonierte Pufferverbindungen. Taurin ist kein Substrat für
SsuD. Die durch SsuD katalysierte Desulfonierungsreaktion ist FMNH 2- und
sauerstoffabhängig.
Daraus
lässt
sich
schließen,
daß
SsuD
und
SsuE
ein
Zweikomponenten-Monooxygenasesystem bilden, das für die Desulfonierung einer
Reihe von Alkansulfonaten, nicht aber von Taurin zuständig ist.
tauABC und ssuABC codieren für Proteine, welche Ähnlichkeit zu Komponenten von
Transportsystemen des ABC-Typs aufweisen. TauA und SsuA sind vermutlich
periplasmatische Substratbindeproteine, TauB und SsuB ähneln ATP-hydrolysierenden
Enzymen, und es wird vermutet, daß TauC und SsuC integrale Membranproteine sind.
Um die Notwendigkeit der TauABC und SsuABC Proteine für das Wachstum von
E. coli auf Taurin und anderen Alkansulfonaten zu überprüfen, wurden chromosomale
Deletionen der tauA, tauB, tauC, ssuA, ssuB, ssuC Gene, einzeln oder in verschiedenen
Kombinationen im gleichen Leseraster konstruiert. Die Wachstumseigenschaften der
einzelnen
Deletionsmutanten wurden
untersucht. Dabei zeigte sich, daß das
Substratspektrum des TauD bzw. des SsuD Enzyms weitgehend jenem des jeweiligen
Transportsystems entspricht. Einige Substrate von TauD konnten allerdings nur über
den SsuABC Transporter in die Zelle gelangen. Deletionsmutanten, in welchen nur
hybride Transportsysteme gebildet werden konnten, waren unfähig Alkansulfonate als
Schwefelquelle zu verwerten. Dies hat den Beweis dafür gebracht, daß die einzelnen
Komponenten der TauABC und SsuABC Transportsysteme nicht austauschbar sind;
TauABC und SsuABC sind zwei eigenständige Transportsysteme.
Die vorliegende Arbeit zeigt, daß TauABCD und SsuEADCB zwei Systeme sind, die
durch ihre Komplementarität die Verwertung von Taurin und anderen Alkansulfonaten
als Schwefelquellen ermöglichen, wenn Cystein oder Sulfat nicht verfügbar sind.
5
Resurne
Resurne
L'assimilation de soufre par les bacteries se fait principalement par biosynthese de
cysteine
ä
partir d'ions sulfate. Cependant, dans leur environnement, les ions sulfate ne
sont d'ordinaire pas la source de soufre la plus abondante, et les bacteries sont de ce fait
souvent tributaires de sources de soufre organique.
En l'absence de cysteine ou d'ions sulfate comme source de soufre, Escherichia coli
exprime specifiquement deux operons. L'un, tauABCD, permet l'assimilation du soufre
de la taurine (acide 2-aminoethanesulfonique), l'autre, ssuEADCB permet l'assimilation
du soufre d'autres acides sulfoniques. Le travail presente d'une part les mecanismes
biochimiques responsables de la desulfonation de la taurine et d'autres acides
sulfoniques, et, d'autre part, conforte l'hypothese de la presence de deux systemes de
transport de type ABC, dont le röle est l'absorption de ces composes,
L'homologie de sequence entre TauD et TfdA, une dioxygenase u-cetoglutaratedependante isolee de Ralstonia eutropha suggere que TauD est responsable de la
liberation du soufre de la taurine par un mecanisme oxygenolytique de rupture de la
liaison C-S0 3H. TauD a ete purifiee apres surexpression du gene codant dans E. coli et
caracterisee. La reaction de desulfonation de la taurine catalysee par TauD conduit a la
formation de sulfite et daminoacetaldehyde qui, vu sa faible stabilite, n'a pu etre
detecte
qu 'indirectement
apres
conversion enzymatique
en ethanolamine,
La
desulfonation de la taurine par TauD est tributaire de la presence d'ions ferreux ; la
reaction consomme de la taurine, de I' acide u-cetoglutarique et de I' oxygene en
quantites
equimolaires,
Ainsi,
les
proprietes
enzymatiques
de
TauD
et
les
caracteristiques de sa sequence d'acides amines, permettent de considerer cette proteine
comme membre apart entiere de la famille des dioxygenases o-cetoglutaratedependantes. Apart la reaction de desulfonation de la taurine, TauD catalyse egalement
la
desulfonation
de
l'acide
pentanesulfonique,
de
l'acide
3-(N-morpholino)
propanesulfonique (MOPS) et de l'acide 1,3-dioxo-2-isoindoline-ethanesulfonique,
avec toutefois une efficacite moindre. L' acide c-cetoglutarique est le seul «-cetoacide
utilise comme cosubstrat par TauD.
Les proteines SsuD et SsuE ont egalement ete purifiees apres surexpression dans
E. coli du gene codant correspondant. La caracterisation de ces deux enzymes a montre
que SsuE est une FMN reductase NAD(P)H-dependante qui catalyse aussi la reduction
Resurne
6
du FAD et de la riboflavine. L'enzyme SsuD, quant
ä
lui, catalyse la reaction de
desulfonation de l'acide pentanesulfonique en sulfite et pentaldehyde. Un grand nombre
d'autres acides sulfoniques sont desulfones par SsuD, parmi ceux-ci des acides
alkanesulfoniques lineaires non substitues de longueur de chaine carbonee allant de 2
ä
10 atomes de carbone, des acides ethanesulfoniques substitues, ainsi que des composes
tampon sulfonates,
ä
I' exclusion de la taurine. La reaction de desulfonation catalysee
par SsuD est FMNH2-dependante et consomme de I' oxygene, 11 apparait donc que SsuD
et SsuE forment ensemble un systeme bi-enzymatique responsable de la desulfonation
d'un large spectre d'acides sulfoniques
ä
l'exclusion de la taurine.
Les proteines codees par les genes tauABC et ssuABC presentent une homologie de
sequence avec des composantes de systemes de transport de type ABC. TauA et SsuA
sont probablement deux pro teines periplasmatiques, TauB et SsuB sont supposees etre
des
ATPases,
TauC
et
SsuC
presentent
des
caracteristiques
de
proteines
transmembranaires. Pour montrer que les proteines TauABC et SsuABC sont
indispensables pour la production de biomasse par E. coli lorsque celui-ci utilise la
taurine ou d'autre acides alkanesulfoniques comme source soufree, une serie de
deletions geniques chromosomiques de genes codant pour ces proteines on
ete
construites dans le meme cadre de lecture en combinaisons diverses. L' etude de la
croissance des souches mutantes obtenues a montre que la specificite de substrat des
enzymes TauD et SsuD se superpose largement
a celle
du systeme de transport
correspondant. Cependant, certains substrats de TauD ne peuvent entrer dans les
cellules que par le systeme de transport SsuABC. Par ailleurs, l'absence de croissance
de souches mutantes potentiellement capables de former des systemes de transport
hybrides, montre que les composantes des systemes de transport TauABC et SsuABC
ne sont pas interchangeables. Par consequent, TauABC et SsuABC sont deux systemes
de transport distincts et independants.
En conclusion, le travail montre que TauABCD et SsuEADCB permettent de par leur
complementarite, l'utilisation de la taurine et d'autres acides alkanesulfoniques comme
source soufree alternative lorsque la cysteine ou les ions sulfate font defaut,