séparation des nouveaux antidépresseurs par clhp en phase

39
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2002, 141, 39-52
SÉPARATION DES NOUVEAUX
ANTIDÉPRESSEURS PAR CLHP EN PHASE
INVERSE ET ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE
DE ZONE (*)
L. LABAT, P. DALLET, E. KUMMER, J.P. DUBOST
(**)
Nous avons utilisé deux techniques analytiques pour étudier
la séparation des antidépresseurs de nouvelle génération, la
chromatographie liquide haute performance en phase inverse
(CLHP) et l’électrophorèse capillaire de zone (ECZ). Les
molécules sont au nombre de douze : huit principes actifs de
différentes spécialités pharmaceutiques (citalopram, fluoxétine,
fluvoxamine, paroxétine, sertraline, milnacipran, venlafaxine,
mirtazapine) et quatre métabolites pharmacologiquement actifs
(déméthylcitalopram, déméthylmirtazapine, déméthylvenlafaxine et
norfluoxétine). Chacune des techniques est couplée à un détecteur
à barrette de diodes.
En CLHP, l’analyse est réalisée en mode isocratique sur
deux colonnes de nouvelle génération (Satisfaction® RP 18 AB et
Satisfaction® C8+, 250 mm x 4,6 mm, 5 µm). En ECZ, la
séparation est obtenue sur un capillaire en silice fondue (600 mm
x 75 µm) en appliquant une tension de 15 kV à chaque extrémité.
L’étude de l’influence de différents paramètres (composition de la
phase mobile en CLHP ou du tampon de migration en ECZ,
température) sur la séparation a permis d’optimiser les conditions
(*)
(**)
Manuscrit reçu le 08 avril 2002.
Laboratoire de Chimie Analytique, UFR des Sciences Pharmaceutiques,
Université Victor Segalen Bordeaux 2, 146, rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux
cedex. [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected]
40
d’analyse pour les deux méthodes. Une excellente séparation des
douze molécules en CLHP est obtenue en 20 minutes sur la
colonne Satisfaction® RP 18 AB à 45 °C avec une phase mobile
composée d’un mélange de KH2PO4 25 mM + TEA 10 mM
(pH 4,8) et d’acétonitrile (65 : 35, v/v). En ECZ, la séparation est
réalisée pour une durée d’analyse comparable, avec un tampon de
migration composé de tampon borate 42 mM (pH 9,5) et de
méthanol (80 : 20, v/v).
Les résultats obtenus montrent que les deux techniques
peuvent être utilisées pour l’étude de la séparation de molécules
appartenant à la famille des antidépresseurs de nouvelle
génération.
INTRODUCTION
Depuis une dizaine d’années, une nouvelle génération
d’antidépresseurs est utilisée dans le traitement des troubles dépressifs.
Doués de propriétés pharmacologiques différentes des composés utilisés
auparavant (tricycliques, IMAO ou lithium), ils sont aussi généralement
mieux tolérés et possèdent moins d’effets secondaires [1,2].
Chronologiquement, la première classe thérapeutique apparue sur le marché
est représentée par les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la
sérotonine ou ISRS. Cinq molécules en font partie, le citalopram, la
fluoxétine, la fluvoxamine, la paroxétine et la sertraline. Une deuxième
classe comprend le milnacipran et la venlafaxine. Ce sont des inhibiteurs de
la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline, regroupés sous
l’appellation IRSNa. Le dernier antidépresseur de nouvelle génération
commercialisé est la mirtazapine. Son profil pharmacologique se singularise
de celui des ISRS ou des IRSNa. C’est un antidépresseur noradrénergique et
sérotoninergique spécifique, seul représentant à l’heure actuelle de la classe
des NaSSA.
De nombreuses méthodes d’analyse ont été développées pour le
dosage de ces composés dans certaines spécialités pharmaceutiques ou dans
les milieux biologiques. À côté de la spectrophotométrie UV [3] ou de la
chromatographie en phase gazeuse (CPG) [4], la chromatographie liquide
haute performance (CLHP) en phase inverse demeure la méthode de choix
dans la majorité des cas [5-7]. La phase mobile est le plus souvent constituée
d’un mélange d’acétonitrile et d’un tampon phosphate contenant parfois de
la triéthylamine (TEA) pour améliorer la symétrie des pics et minimiser les
41
interactions silanophiles avec la phase stationnaire [8-11 ]. L’emploi de
colonnes de nouvelle génération à base de silice B ultra pure et moins acide
donne aussi de meilleurs résultats [12 ]. Parmi les nouvelles techniques
analytiques, l’électrophorèse capillaire (EC) a été quelquefois utilisée [13].
Cependant, dans la majorité des cas, particulièrement en EC, les
méthodes décrites ne permettent pas la détermination simultanée de
l’ensemble des antidépresseurs. Il nous a donc paru intéressant de
développer des méthodes de séparation de l’ensemble de ces molécules
faisant appel à deux techniques séparatives différentes : la CLHP [14 ] et
l’électrophorèse capillaire de zone (ECZ), en étudiant l’influence de divers
paramètres sur les résultats obtenus. Ainsi, de telles méthodes pourraient
être utilisées dans le cadre de recherches larges de médicaments dans le
domaine de la toxicologie.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Produits chimiques
Tous les produits chimiques et solvants sont de qualité analytique.
L’acétonitrile (ACN) provient de chez Baker (Deventer, Hollande). Le
dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) et l’acide phosphorique
(H3PO4) de chez Merck (Darmstadt, Allemagne), la TEA de chez Lancaster
(Morecambe, Grande-Bretagne) et le tétraborate de sodium (Na2B4O7, 10
H2O) de chez Riedel-de Haën (Seelze, Allemagne).
Le citalopram (CIT) (HBr) et le déméthylcitalopram (DMCIT) ont
été gracieusement fournis par Lundbeck A/S (Copenhague, Danemark), la
fluvoxamine (FLUV) (maléate) par Solvay Pharma (Suresnes, France), le
milnacipran (MIL) (HCl) par Pierre Fabre (Castres, France), la mirtazapine
(MIR) et la déméthylmirtazapine (DMMIR) par Organon (Oss, Hollande), la
paroxétine (PAR) (HCl) par Smith Kline Beecham (Nanterre, France), la
sertraline (SER) (HCl) par Pfizer (Amboise, France), la venlafaxine (VEN)
(HCl) et la déméthylvenlafaxine (DMVEN) (HCl) par Lederle (Pearl River,
N.Y., États-Unis). La fluoxétine (FLUO) (HCl) et la norfluoxétine
(NFLUO) (HCl) proviennent de chez Sigma (Saint Quentin Fallavier,
France). L’étalon interne (EI) F2570 nous a été gracieusement fourni par
Pierre Fabre (Castres, France). Les structures chimiques des molécules
étudiées sont présentées dans la Figure 1.
42
F3C
NC
NC
CH3
NH
O
CH3
N
CH3
O
F
CH3
NH
H
OC
F
CIT
DMCIT
HN
F3C
H
OC
FLUO
CH3
F
CH3
N
CH3
O
O
O
N
H
Cl
Cl
NFLUO
SER
PAR
F3C
O
N
CH3
O
NH2
CH3
MIL
N
NH2
O
CH3
N
N
N
CH3
MIR
FLUV
N(CH3)2
OH
N(CH3)2
OH
N
OH
OCH3
VEN
DMVEN
N
NH
DMMIR
Fig. 1 : Structure chimique des molécules étudiées.
Des solutions mères à 1 mg/ml de chaque antidépresseur et de
l’étalon interne sont préparées dans du méthanol et conservées à -20 °C.
Parallèlement, une solution mère contenant l’ensemble des molécules à des
concentrations respectives de 1 mg/ml est préparée dans du méthanol. Les
solutions de travail (20 µg/ml pour chaque molécule) sont préparées
extemporanément par dilution des solutions mères dans de la phase mobile
en CLHP et dans de l’eau en ECZ. Elles sont filtrées avant leur injection
(filtres nylon de 0,45 µm).
43
Appareillage et conditions d’analyse
CLHP
Nous avons effectué les séparations sur un chromatographe équipé
d’une pompe SpectraSystem P1000 (San José, CA, États-Unis), d’un
injecteur manuel de type Rhéodyne 7125 muni d’une boucle d’injection de
20 µl, d’un chauffe-colonne de type CROCO-CIL® (CIL, Sainte-Foy-laGrande, France) et d’un détecteur à barrette de diodes modèle 990 (Waters,
Saint-Quentin-en-Yvelines, France). Nous avons testé deux colonnes
Satisfaction®, une RP 18 AB et une C8+ (250 x 4,6 mm, 5 µm) (CIL). Sur la
première colonne, la séparation des douze composés a été optimisée à une
température de 45 °C avec une phase mobile constituée par un mélange de
KH2PO4 25 mM + TEA 10 mM (pH 4,8) et d’ACN (65 : 35, v/v). Le débit
est de 1 ml/min [14]. Avant utilisation, la phase mobile est filtrée (0,45 µm)
et dégazée aux ultrasons.
ECZ
Les analyses sont réalisées sur un appareil d’électrophorèse
capillaire de type P/ACE MDQ (Beckman, Fullerton, CA, USA) avec une
détection par barrette de photodiodes. La séparation a été optimisée sur un
capillaire en silice fondue (long. totale = 60 cm, long. efficace = 50 cm,
d.i. = 75 µm) maintenu à une température de 15 °C. Le tampon de migration
est un mélange de tampon borate (42 mM, pH 9,5) et de méthanol (80 : 20,
v/v). On applique une tension de 15 kV entre l’anode et la cathode pendant
l’analyse. Les échantillons sont analysés après injection en mode
hydrodynamique pendant 10 secondes à 0,5 psi [15]. Les conditions strictes
de conditionnement du capillaire ont été décrites par ailleurs [16].
RÉSULTATS ET DISCUSSION
CLHP
Dans un premier temps, nous avons optimisé les conditions
opératoires pour obtenir une séparation satisfaisante des douze
antidépresseurs sur la colonne RP 18 AB. L’influence de la composition de
la phase mobile et de la température a été étudiée. Nous avons fixé la valeur
44
du pH du tampon aqueux à 3,5 pour diminuer l’ionisation des sites silanols,
limitant ainsi les interactions avec les composés basiques. L’utilisation de
sels de potassium pour la préparation du tampon et le choix de l’ACN
comme solvant organique sont également recommandés [12]. Nous avons
travaillé à 25 °C et fait varier le pourcentage d’ACN de 30 % à 50 %. Les
résultats obtenus (variations des valeurs du facteur de rétention k de chaque
antidépresseur en fonction du pourcentage d’ACN) sont présentés dans la
Figure 2. Pour le calcul de k, nous avons pris comme temps de rétention (tR)
la moyenne des valeurs de 3 mesures consécutives et comme valeur du
temps mort la perturbation de la ligne de base due à la présence de méthanol
dans l’échantillon (2,40 ± 0,03 min.). Dans une séparation
chromatographique, il est souhaitable que la valeur de k soit comprise entre
0,5 (pour que le premier pic soit élué après le temps mort) et 10 (pour éviter
un temps d’analyse trop long et un élargissement des pics) [17]. Ainsi, un
pourcentage en ACN de 35 % donne les meilleurs résultats, avec cependant
une élution un peu rapide de la DMVEN et de la DMMIR. Dans ces
conditions, le tR du dernier pic correspondant à la SER est de 18,3 ± 0,06
min. (k = 6,63).
16
DMVEN
DMMIR
MIR
MIL
VEN
EI
DMCIT
CIT
PAR
FLUV
NFLUO
FLUO
SER
Facteur de rétention (k)
14
12
10
8
6
4
2
0
30
35
40
45
50
% ACN (Temp. 25 °C, pH 3,5)
Fig. 2 : Influence du pourcentage d’acétonitrile sur la rétention.
45
Nous avons ensuite étudié l’influence du pH de la phase mobile sur
la rétention des différentes molécules après avoir fixé le pourcentage
d’ACN à 35 % et la température à 25 °C. Nous présentons les résultats
(log k en fonction du pH) dans la Figure 3. On peut noter l’importance
particulière de ce paramètre sur les tR de la MIR et à un degré moindre de la
DMMIR. L’influence de la variation de pH sur la rétention de l’ensemble
des dix autres antidépresseurs est beaucoup moins marquée. Les propriétés
acido-basiques particulières de la MIR (et de la DMMIR) sont certainement
responsables de ce comportement. En effet, ces deux composés possèdent
un groupement 2-amino pyridine substitué pour lequel nous avons trouvé
une valeur de pKa de 3,50 ± 0,10 (mesures spectrophotométriques et
potentiométriques) [15 ]. Il est donc tout à fait normal que les propriétés
chromatographiques (rétention et sélectivité) de ces deux molécules soient
très dépendantes du pH dans la zone étudiée. Nous avons obtenu la
meilleure séparation de l’ensemble des composés à pH 4,80, mais la
résolution entre la VEN et la MIR est insuffisante. Pour des pH > 4,85, la
MIR et l’EI commencent à coéluer en raison de l’asymétrie élevée du pic de
MIR (1,70).
1
DMVEN
DMMIR
MIR
MIL
VEN
EI
DMCIT
CIT
PAR
FLUV
NFLUO
FLUO
SER
0,8
0,6
log k
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
-0,6
3
3,2
3,4
3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
pH (Temp. 25 °C, 35 % ACN)
Fig. 3 : Influence du pH sur la rétention.
Facteur de rétention (k)
Une fois le pH du tampon fixé à 4,80 et le pourcentage d’ACN à
35 %, nous avons étudié l’influence de la température entre 25 et 50 °C. Les
résultats obtenus sont présentés dans la Figure 4. En général, la température
diminue la rétention et n’a que peu d’effet sur la sélectivité. Toutefois, elle
46
agit sur l’équilibre d’ionisation et modifie les propriétés de rétention de la
colonne vis-à-vis des solutés ionisés. On peut alors observer des
modifications de sélectivité permettant l’amélioration de la séparation [18].
Lors de cette étude, c’est effectivement ce que l’on constate, principalement
pour la MIR. Alors que le tR de la plupart des molécules diminue lorsque la
température d’analyse varie de 25 à 50 °C, celui de la MIR augmente. Cette
constatation peut s’expliquer par l’influence de l’équilibre acido-basique lié
à la fonction amino-2-pyridine de la MIR dans la zone de pH choisie [15].
0,95
DMVEN
DMMIR
MIR
MIL
VEN
EI
DMCIT
CIT
PAR
FLUV
NFLUO
FLUO
SER
0,75
0,55
log k
0,35
0,15
-0,05
-0,25
-0,45
-0,65
25
30
35
40
45
50
Température (°C) (35 % ACN, pH 4,8)
Fig. 4 : Influence de la température sur la rétention.
Ainsi, dans les conditions décrites précédemment ( température
d’analyse de 45 °C (ou 50 °C) et phase mobile ACN – tampon pH 4,8 (35 :
65, v/v)), on obtient le chromatogramme représenté dans la Figure 5. Pour
une durée d’analyse de l’ordre de 20 minutes, toutes les molécules sont
parfaitement séparées avec une résolution et des facteurs de rétention
satisfaisants.
On notera cependant le manque de robustesse de la méthode en ce
qui concerne le choix du pH de la phase mobile. Il doit être parfaitement
ajusté à 4,8 pour obtenir une bonne séparation entre la VEN, la MIR et l’EI.
D’autre part, la DMVEN a son tR proche du temps mort, ce qui impose de
solubiliser le mélange dans la phase mobile ou dans un solvant qui
n’absorbe pas à la longueur d’onde de mesure (225 nm) pour éviter la
coélution du pic de DMVEN avec celui du solvant.
47
Molécules
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
DMVEN
DMMIR
MIL
VEN
MIR
EI
DMCIT
CIT
PAR
FLUV
NFLUO
FLUO
SER
tR (min.)
3,16
3,63
4,26
4,74
5,14
5,89
6,98
7,66
10,24
12,44
15,22
17,94
20,00
Fig. 5 : Chromatogramme du mélange d’antidépresseurs.
La même démarche analytique a été réalisée sur une colonne
Satisfaction® C8+. Malgré un profil d’élution comparable, nous n’avons pas
pu obtenir la séparation complète des 13 molécules. À pH < 5, on observe
une coélution de la SER et de la FLUO. Une résolution correcte entre ces 2
composés n’est possible qu’au-delà de pH 6, mais la durée de l’analyse est
alors très longue et d’autres coélutions apparaissent (entre la MIR et la PAR
et entre la DMMIR et le MIL) avec une dissymétrie du pic de la MIR.
Contrairement à la colonne Satisfaction® RP 18 AB, la C8+ ne convient pas
pour la séparation de cette série de molécules.
ECZ
Parallèlement à l’étude chromatographique, nous avons développé
une méthode de séparation de l’ensemble des antidépresseurs en ECZ. Dans
les conditions opératoires décrites dans le paragraphe matériel et méthodes,
la séparation de onze molécules est possible en moins de 18 minutes. Un
exemple d’électrophorégramme est donné dans la Figure 6. On peut
observer la séparation de la majorité des molécules entre la 12e et la 16e
minute alors que la MIR et la DMMIR ont des temps de migration (tM) plus
importants, respectivement de 17,06 et 17,54 minutes. Ces deux molécules
migrent à proximité du flux électroosmotique (FEO), qui correspond à la
48
migration des composés non chargés [16]. En effet, au pH du tampon de
migration (pH 9,5), la MIR et la DMMIR sont très faiblement ionisées (pKa
mesuré pour la MIR à 7,5) expliquant ainsi leurs migrations proches du FEO
et leur excellente séparation d’avec les autres antidépresseurs [15]. À ce pH,
ces derniers se retrouvent par contre dans un état d’ionisation comparable,
ont des mobilités électrophorétiques voisines et migrent plus rapidement que
les molécules neutres. Seule la présence d’un modificateur organique
comme le méthanol additionné au tampon de migration permet de les
séparer en ECZ.
Molécules
01 DMCTI
02 FLUO
03 PAR
04 MIL
05 VEN
06 CIT
07 SER
08 DMVEN
09 FLUV
10 DMMIR
11 MIR
tM (min.)
12,67
13,01
13,22
13,45
13,65
14,47
14,65
14,78
15,38
17,06
17,54
Fig. 6 : Électrophorégramme du mélange d’antidépresseurs.
49
Comme en CLHP, nous avons étudié l’influence sur les tM des
différentes molécules de plusieurs paramètres comme le pH ou le
pourcentage en méthanol dans le tampon de migration, la température
d’analyse et la tension appliquée entre l’anode et la cathode.
L’augmentation du pH du tampon de migration (9,2 à 9,9) ralentit la
migration de l’ensemble des antidépresseurs et ne permet pas la séparation
du pic de la MIR et du FEO. Pour cela, il faudrait opérer à des pH beaucoup
plus acides pour augmenter l’état d’ionisation de ce composé, mais rendant
alors la séparation des autres molécules impossible en ECZ [19 ]. De la
même façon, l’augmentation du pourcentage de méthanol de 0 à 20 % dans
le tampon de migration, la diminution de la température d’analyse de 40 à
15 °C ou la diminution de la tension appliquée pendant l’analyse de 30 à
12 kV entraînent une augmentation des tM de l’ensemble des molécules.
En aucun cas, les conditions optimales de séparation des différentes
molécules ne permettent de séparer correctement la MIR et le FEO. Ceci a
pour conséquence la perte de symétrie du pic de MIR, rendant difficile une
analyse quantitative satisfaisante de ce composé.
CONCLUSION
Dans cette étude, nous avons optimisé les conditions de séparation
en CLHP et en ECZ d’un mélange d’antidépresseurs de nouvelle génération.
En CLHP, une bonne séparation de l’ensemble des molécules est
obtenue en mode isocratique sur une colonne Satisfaction® RP 18 AB. La
sélectivité et la robustesse de la méthode sont toutefois dépendantes du pH
de la phase mobile.
En ECZ, l’état d’ionisation comparable des différents composés au
pH du tampon de migration rend nécessaire l’adjonction de méthanol afin de
les séparer. La MIR et la DMMIR dont les propriétés acide-base se
singularisent de celles des autres molécules migrent près du FEO. Cette
étude illustre la difficulté de séparer les membres d’une même famille
chimique en ECZ quand les composés présentent des pKa et des masses
molaires similaires. Il faut alors utiliser d’autres techniques
électrophorétiques et opérer, par exemple, en mode micellaire où
l’adjonction d’un détergent dans le tampon de migration est à l’origine de la
formation d’une nouvelle phase séparative. Les premiers résultats obtenus
dans notre laboratoire par cette technique montrent une amélioration de la
séparation de l’ensemble des molécules pour des temps d’analyse plus
courts [20]. Aussi, de nouvelles études mettant à profit les performances de
50
l’électrophorèse capillaire en mode micellaire sont en cours de réalisation
pour optimiser la séparation de ces nouveaux antidépresseurs.
Remerciements : les auteurs remercient la société CIL Cluzeau Info Labo
pour le prêt des colonnes chromatographiques.
BIBLIOGRAPHIE
123-
4-
5-
6-
7-
8-
Informations communiquées par Organon et Riom Laboratoires en
Psychiatrie. - Le Moniteur des Pharmacies, Mars 2000, 3-15.
Kent (J.M.) - SnaRIs, NaSSAs, and NaRIs: new agents for the
treatment of depression. - Lancet, 2000, 355(9207), 911-918.
Karasen (N.), Altinoz (S.) - Determination of mirtazapine in tablets by
UV spectrophotometric and derivative spectrophotometric methods. J. Pharm. Biomed. Anal., 2000, 24(1), 11-17.
Lacassie (E.), Ragot (S.), Gaulier (J.M.), Marquet (P.), Lachatre (G.) A specific dosage method for the analysis of 24 antidepressants using
gas chromatography-mass spectrometry. - Acta Clin. Belg. Suppl.,
1999, 1, 20-24.
Aymard (G.), Livi (P.), Pham (Y.T.), Diquet (B.) - Sensitive and rapid
method for the simultaneous quantification of five antidepressants
with their respective metabolites in plasma using high-performance
liquid chromatography with diode-array detection. - J. Chromatogr. B,
Biomed. Sci. Appl., 1997, 700(1-2), 183-189.
Matoga (M.), Pehourcq (F.), Titier (K.), Dumora (F.), Jarry (C.) Rapid high-performance liquid chromatographic measurement of
venlafaxine and O-desmethylvenlafaxine in human plasma.
Application to management of acute intoxications. - J. Chromatogr. B,
Biomed. Sci. Appl., 2001, 760(2), 213-218.
Kristoffersen (L.), Bugge (A.), Lundanes (E.), Slørdal (L.) Simultaneous determination of citalopram, fluoxetine, paroxetine and
their metabolites in plasma and whole blood by high-performance
liquid chromatography with ultraviolet and fluorescence detection. - J.
Chromatogr. B, Biomed. Sci. Appl., 1999, 734(2), 229-246.
López-Calull (C.), Dominguez (N.) - Determination of paroxetine in
plasma by high-performance liquid chromatography for
bioequivalence studies. - J. Chromatogr. B, Biomed. Sci. Appl., 1999,
724(2), 393-398.
51
9-
10 -
11 -
12 13 -
14 -
15 -
16 -
17 -
18 -
19 -
20 -
Shin (J.G.), Kim (K.A.), Yoon (Y.R.), Cha (I.J.), Kim (Y.H.), Shin
(S.G.) - Rapid simple high-performance liquid chromatographic
determination of paroxetine in human plasma. - J. Chromatogr. B,
Biomed. Sci. Appl., 1998, 713(2), 452-456.
Holladay (J.W.), Dewey (M.J.), Yoo (S.D.) - Quantification of
fluoxetine and norfluoxetine serum levels by reversed-phase highperformance liquid chromatography with ultraviolet detection. - J.
Chromatogr. B, Biomed. Sci. Appl., 1997, 704(1-2), 259-263.
Belmadani (A.), Combourieu (I.), Bonini (M.), Creppy (E.E.) – High
performance liquid chromatography with ultraviolet detection used for
laboratory routine determination of fluvoxamine in human plasma. Hum. Exp. Toxicol., 1995, 14(1), 34-37.
Mc Calley (D.V.) - Reversed-phase HPLC of basic samples-An
update. - LC-GC Europe, 1999, 12, 638-650.
Pucci (V.), Raggi (M.), Kenndler (E.) - Separation of eleven central
nervous system drugs by capillary zone electrophoresis. – J.
Chromatogr. B, Biomed. Sci. Appl., 1999, 728(2), 263-271.
Dallet (P.), Labat (L.), Richard (M.), Langlois (M.H.), Dubost (J.P.) A reversed-phase HPLC method development for the separation of
new antidepressants. - J. Liq. Chrom. Rel. Technol., 2002, 25,
101–111.
Labat (L.), Dallet (P.), Kummer (E.), Dubost (J.P.) Spectrophotometric, spectrofluorimetric, HPLC and CZE
determination of mirtazapine in pharmaceutical tablets. - J. Pharm.
Biomed. Anal., 2002, 28(2), 365-371.
Labat (L.), Deveaux (M.), Dubost (J.P.) - Applications de
l’électrophorèse capillaire en toxicologie clinique et médico-légale. Ann. Toxicol. Anal., 2000, 12(3), 179-195.
Snyder (L.R.), Kirkland (J.J.), Glajch (J.L.) - Practical HPLC
Development, 2nd Ed., New York : Wiley-Interscience, 1997,
p 31–34.
Dolan (J.W.) - LC troubleshooting : Starting out right, part IVAdditional variables to control selectivity. - LC-GC Europe, 2000, 13,
220-224.
Hudson (J.), Golin (M.), Malcolm (M.), Whiting (C.) - Capillary zone
electrophoresis in a comprehensive screen for drugs of forensic
interest in whole blood : an update. - Can. Soc. Forens. Sci., 1998,
31(1), 1-29.
Labat (L.), Deveaux (M.), Dallet (P.), Dubost (J.P.) - Separation of
new antidepressants and their metabolites by micellar electrokinetic
capillary chromatography. - J. Chromatogr. B, Analyt. Technol..
Biomed. Life Sci., 2002, 773(1), 17-23.
52
ABSTRACT
Separation of new antidepressants by reversed-phase liquid
chromatography and capillary zone electrophoresis
Two methods using reversed-phase liquid chromatography (RPLC)
and capillary zone electrophoresis (CZE) with diode array detection were
developed for the separation of eight new antidepressants, five selective
serotonin reuptake inhibitors (fluvoxamine, fluoxetine, sertraline, paroxetine
and citalopram), two serotonin noradrenergic reuptake inhibitors
(venlafaxine and milnacipran), one noradrenergic specific serotoninergic
antidepressant (mirtazapine) and four active metabolites (norfluoxetine,
desmethylcitalopram, desmethylvenlafaxine and desmethylmirtazapine).
The chromatographic analysis was carried out under isocratic conditions on
two new-generation columns (Satisfaction® RP 18 AB and Satisfaction®
C8+, 250 mm x 4.6 mm, 5 µm). The electrophoretic separation was
optimised on an uncoated fused-silica capillary (600 mm x 75 µm i.d.) at an
operating voltage of +15 kV. The effect of mobile phase composition for
RPLC, running buffer composition for CZE and temperature on the
resolution allowed to select the best analysis conditions for both methods.
With RPLC, a baseline resolution of all the antidepressants was obtained at
45°C (or 50°C) in 20 minutes on the RP 18 AB column with a mobile phase
consisting of a mixture of KH2PO4 25 mM + TEA 10 mM (pH 4.8) and
acetonitrile (65 : 35, v/v). The CZE separation was achieved using a
methanol - 42 mM borate buffer (pH 9.5) (80 : 20, v/v) as running buffer.
Both methods provided good results and are well suited for a rapid
screening of these drugs.
Key-words: antidepressants, capillary zone
reversed-phase liquid chromatography.
__________
electrophoresis,