caractérisation de la famille des protéines abc et étude

PHILIPPE LEPROHON
CARACTÉRISATION DE LA FAMILLE DES
PROTÉINES ABC ET ÉTUDE TRANSCRIPTOMIQUE
DE LA RÉSISTANCE À L’ANTIMOINE CHEZ LE
PARASITE PROTOZOAIRE LEISHMANIA
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en microbiologie et immunologie
pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2008
© Philippe Leprohon, 2008
Résumé
Les parasites protozoaires du genre Leishmania sont responsables de différentes
pathologies et représentent une cause importante de morbidité et de mortalité au niveau
mondial. En absence de vaccins, le contrôle de la leishmaniose repose sur l’administration
d’agents chimiothérapeutiques. Les médicaments disponibles sont peu nombreux et la
plupart d’entre eux sont associés à des facteurs limitants, comme une toxicité relative à leur
administration ou un coût trop élevé pour être utilisés de routine au niveau des zones
endémiques les plus pauvres. Les composés à base d’antimoine pentavalent sont utilisés en
thérapie depuis plusieurs décennies et demeurent encore aujourd’hui un traitement de
première ligne contre les différentes formes de leishmanioses. Cependant, l’augmentation
du nombre d’infections réfractaires au traitement, associée à la présence de foyers
épidémiques de résistance, amenuisent le potentiel thérapeutique de ces molécules. Les
mécanismes impliqués dans la résistance sont partiellement élucidés et ont révélé
l’importance de la famille des protéines ATP-binding cassette (ABC) dans la résistance. De
plus, l’étude de mutants résistants sélectionnés en laboratoire indique la présence de
mécanismes de résistance supplémentaires, pour lesquels les gènes impliqués n’ont pas
encore été identifiés.
Les objectifs de cette thèse étaient i) de définir la famille des protéines ABC chez
Leishmania et d’en effectuer l’analyse phylogénique, pour ensuite ii) étudier l’implication
de la sous-famille ABCC dans la résistance à l’antimoine chez ce parasite, et finalement iii)
de profiter de la disponibilité de la séquence du génome de Leishmania pour évaluer le
profil d’expression génique associé au phénotype de résistance à l’antimoine à l’échelle
génomique.
L’analyse phylogénique a d’abord permis de démontrer la diversité de la famille des
protéines ABC chez Leishmania, qui semble avoir évoluée par des événements de
duplication génique suite à la divergence évolutive du parasite. Ensuite, des études de
localisation protéique, associées à des expériences de surexpression génique, ont permis de
déterminer la localisation intracellulaire de l’ensemble des protéines appartenant à la sousfamille ABCC chez Leishmania et de démontrer l’implication de deux d’entre elles dans la
résistance à l’antimoine chez ce parasite. Enfin, une étude transcriptomique a confirmé
ii
l’importance du gène MRPA dans la résistance à l’antimoine et a permis d’identifier les
mécanismes de recombinaison homologue impliqués dans son amplification chez une
souche de L. infantum hautement résistante. Finalement, l’analyse transcriptomique a
également révélé la présence de chromosomes aneuploïdes chez différents mutants
résistants à l’antimoine, alors que la sélection d’une souche révertante partielle a permis
d’observer une bonne corrélation entre les niveaux de résistance et le nombre de copies des
chromosomes aneuploïdes.
iii
Abstract
The parasite Leishmania is responsible for considerable morbidity and mortality around the
world. No effective vaccine is yet available against this parasite and treatment thus relies on
chemotherapy. Few drugs are available and most of them are associated with limitations
such as toxicity and high cost. Pentavalent antimonials have been used for decades in the
treatment of leishmaniasis and remain the mainstay against all forms of Leishmania
infections in most endemic regions. However, the efficacy of these compounds is
compromised by the selection of resistant parasites that are now described on a frequent
basis in several endemic regions. The mechanisms involved in antimony resistance are
partly understood and have pinpointed the role of ATP-binding cassette (ABC) proteins.
Moreover, drug resistance studies with different in vitro-selected mutants have suggested
the presence of unidentified mechanisms involved in antimony resistance.
The objectives of this thesis were i) to define the complete ABC protein family in
Leishmania and to analaze their evolution by phylogenetic analyses, ii) to assess the role of
the entire ABCC subfamily in antimony resistance, and iii) to take advantage of the
availability of the Leishmania genome sequence to study the gene expression profile
associated with an antimony resistance phenotype at the genomic level.
Phylogenetic analyses revealed the magnitude of the ABC gene family in Leishmania,
which seemed to have undergone gene duplication events following the divergence of the
Leishmania lineage. Moreover, subcellular localization experiments indicated that the
entire ABCC protein subfamily is located to intracellular compartments in Leishmania, and
gene overexpression experiments revealed the involvement of two of these proteins in
antimony resistance. Finally, a whole-genome transcriptomic study confirmed the
involvement of MRPA in antimony resistance and revealed the recombination events
associated with its amplification in the highly resistant L. infantum Sb2000.1 mutant. More
importantly, the transcriptomic study revealed the presence of aneuploid chromosomes in at
least two different antimony-resistant mutants and selection of a partial revertant strain
allowed the observation of a good correlation between the antimony resistance levels and
the copy number of the aneuploid chromosomes.
Avant-Propos
Remerciements
Tout d’abord, je tiens à remercier mon directeur de thèse, le Professeur Marc Ouellette,
pour m’avoir donné l’opportunité d’effectuer mes études graduées dans son laboratoire,
ainsi que pour la confiance et la liberté qu’il m’a accordé tout au long de mon cheminement
académique. Son assiduité, sa rigueur, sa détermination et son extraordinaire passion sont
autant d’éléments qui font de lui un directeur de thèse exceptionnel et qui m’ont permis de
développer un esprit scientifique rigoureux.
Aussi, j’aimerais remercier les membres de l’équipe MOU que j’ai côtoyés au cours des
dernières années. J’ai grandement apprécié votre présence et le climat de travail qui règne
au sein de l’équipe. Nos discussions scientifiques, tout comme votre amitié, m’ont été très
agréables et très bénéfiques. Un merci particulier à Gaétan Roy pour ses nombreux conseils
et à Dave Richard pour son assistance lors de mes débuts au laboratoire.
De plus, je désire remercier le Fond de la Recherche en Santé du Québec et les Instituts de
Recherche en Santé du Canada pour leur support financier.
Enfin, un merci très spécial à ma famille, qui a toujours été présente. Merci du fond du
cœur à mes parents, André et Louise, je leur serai éternellement reconnaissant pour leur
présence, leur confiance, leur soutien et leur amour. Ce sont des personnes extraordinaires
qui demeureront toujours des modèles à tenter d’égaler. Merci aussi à ma sœur Geneviève,
pour son amitié qui m’est chère et pour notre belle complicité.
Finalement, je veux remercier mon amour, Marie-Ève, qui depuis bientôt cinq ans égaie
chacune de mes journées et enrichit tous les moments de ma vie. Sa présence et sa
compréhension ont été des plus précieuses au cours de cette entreprise, autant lors des
moments plus difficiles que des moments heureux. Merci pour tes sourires et ta joie de
vivre qui me réchauffe le cœur quotidiennement.
v
Contributions
Les travaux présentés dans cette thèse ont été en grande majorité effectués par moi-même,
Philippe Leprohon, sous la supervision de mon directeur de recherche, Professeur Marc
Ouellette.
Le manuscrit présenté au chapitre 5, intitulé : “Modulation of Leishmania ABC protein
gene expression through life stages and among drug resistant parasites” a été publié dans la
revue Eukaryotic Cell. Les analyses informatiques et phylogéniques ont été effectuées en
totalité par moi-même. La conception des oligonucléotides 70-mers utilisés lors de
l’analyse transcriptomique par puces à ADN et des oligonucléotides utilisés pour les PCR
en temps réel a été effectuée par moi-même. J’ai aussi effectué l’impression des
oligonucléotides 70-mers sur les lames de verre pour générer les puces à ADN. Toutes les
étapes impliquées dans l’hybridation des puces à ADN et l’analyse des résultats ont été
effectuées par moi-même. La confirmation des résultats de puces à ADN par PCR en temps
réel a été effectuée par Isabelle Girard.
Le manuscrit présenté au chapitre 6, intitulé : “Characterization and localization of the
ABCC proteins of Leishmania and their involvement in resistance to antimonials” sera
bientôt soumis à la revue Molecular and Biochemical Parasitology pour publication.
L’élaboration des stratégies de clonage et toutes les étapes de clonage ont été effectuées par
moi-même. La microscopie confocale a été effectuée par moi-même. L’ensemble des essais
de susceptibilité à l’antimoine a été effectué par moi-même. J’ai également effectué les
analyses informatiques et phylogéniques.
Le manuscrit présenté au chapitre 7, intitulé : “Gene expression modulation is associated
with gene amplification, supernumerary chromosomes and chromosome loss in antimonyresistant Leishmania infantum” sera bientôt soumis à la revue Nucleic Acids Research pour
publication. La conception et l’impression des puces à ADN ont été effectuées par Dr.
Jacques Corbeil et son équipe. Toutes les étapes impliquées dans l’hybridation des puces à
ADN ont été effectuées par moi-même. L’analyse des résultats des puces à ADN a été
effectuée par moi-même à l’aide d’un programme d’analyse dont la conception revient à
Frédéric Raymond. Les PCR en temps réel ont été effectués au Centre de Génomique de
vi
Québec. Les Southern blots et leurs hybridations ont été effectués par moi-même. Les
clonages et les tests de suceptibilité à l’antimoine ont été effectués par moi-même. La
stratégie et les manipulations impliquées dans l’élucidation des événements de
recombinaison homologue pour la génération de l’amplicon circulaire ont été effectuées par
moi-même.
vii
À mes parents, Louise et André, ces
personnes merveilleuses dont le support et les
encouragements sont à la base de cet
accomplissement.
Table des matières
Résumé.....................................................................................................................................i
Abstract................................................................................................................................. iii
Avant-Propos .........................................................................................................................iv
Table des matières .............................................................................................................. viii
Liste des figures ....................................................................................................................10
Liste des abréviations............................................................................................................11
CHAPITRE 1. LE PARASITE LEISHMANIA ET LA LEISHMANIOSE ..........................13
1.1
Le parasite Leishmania .........................................................................................13
1.2
Épidémiologie et distribution géographique.........................................................14
1.3
Cycle de vie et morphologie .................................................................................16
1.3.1 Stade extracellulaire promastigote.......................................................................17
1.3.2 Métacyclogénèse..................................................................................................18
1.3.3 Transmission et stade intracellulaire amastigote .................................................18
1.4
Manifestations cliniques .......................................................................................19
1.4.1 Leishmaniose asymptomatique............................................................................20
1.4.2 Leishmaniose cutanée ..........................................................................................20
1.4.3 Leishmaniose muco-cutanée................................................................................21
1.4.4 Leishmaniose viscérale ........................................................................................21
1.4.5 Latence, immunité et réactivation........................................................................22
1.5 Diagnostic ...................................................................................................................22
1.5.1 Visualisation directe des parasites .......................................................................23
1.5.2 Immunodiagnostic ...............................................................................................23
1.5.3 Détection d’ADN de parasites .............................................................................23
1.6 Contrôle et prévention ................................................................................................24
1.6.1 Contrôle des vecteurs et des réservoirs................................................................24
1.6.2 Vaccins.................................................................................................................24
1.7 Agents thérapeutiques.................................................................................................26
1.7.1 Dérivés d’antimoine pentavalent .........................................................................26
1.7.2 Pentamidine .........................................................................................................28
1.7.3 Amphotéricine B..................................................................................................29
1.7.4 Miltefosine ...........................................................................................................30
1.7.5 Paromomycine .....................................................................................................31
1.7.6 Autres médicaments.............................................................................................31
CHAPITRE 2. RÉSISTANCE AUX MÉDICAMENTS......................................................33
2.1 Mécanismes généraux de résistance aux médicaments ..............................................33
2.1.1 Diminution de l’entrée du médicament ...............................................................34
2.1.2 Inactivation du médicament.................................................................................35
2.1.3 Inhibition de l’activation du médicament ............................................................35
2.1.4 Modification de la cible du médicament..............................................................36
2.1.5 Augmentation de la synthèse de la cible..............................................................36
2.1.6 Réparation des dommages et voie métabolique alternative.................................36
2.1.7 Augmentation de l’efflux du médicament ...........................................................37
2.1.8 Séquestration du médicament ..............................................................................38
2.2 Superfamille des protéines ABC.................................................................................38
ix
2.2.1 Topologie des protéines ABC..............................................................................39
2.2.2 Le domaine de liaison aux nucléotides ................................................................41
2.2.3 Les domaines transmembranaires........................................................................41
2.2.4 Classification et fonctions des protéines ABC ....................................................42
2.3 Résistance aux métalloïdes .........................................................................................50
2.3.1 Chez les bactéries.................................................................................................50
2.3.2 Chez la levure ......................................................................................................51
2.3.3 Chez les mammifères...........................................................................................52
2.3.4 Chez Leishmania..................................................................................................53
CHAPITRE 3. LE GÉNOME DE LEISHMANIA ................................................................60
3.1 Séquençage du génome...............................................................................................60
3.2 Expression génique .....................................................................................................61
3.3 Modulation de l’expression génique...........................................................................61
3.3.1 Plasticité du génome ............................................................................................62
3.3.2 Puces à ADN........................................................................................................64
3.3.3 Approches protéomiques .....................................................................................64
CHAPITRE 4. PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS ...........................65
CHAPITRE 5. Modulation de l’expression des gènes ABC au cours du cycle de vie de
Leishmania et chez les parasites résistants à l’antimoine. ....................................................67
5.1 Résumé........................................................................................................................67
5.2 Article .........................................................................................................................68
CHAPITRE 6. Localisation subcellulaire de la famille des protéines ABCC et
caractérisation de leurs implications dans la résistance à l’antimoine chez Leishmania....106
6.1 Résumé......................................................................................................................106
6.2 Article .......................................................................................................................107
CHAPITRE 7. Événements d’amplification génique, de chromosomes surnuméraires et de
perte de chromosomes associés à la résistance à l’antimoine chez le parasite Leishmania
infantum. .............................................................................................................................129
7.1 Résumé......................................................................................................................129
7.2 Article .......................................................................................................................131
CHAPITRE 8. DISCUSSION GÉNÉRALE .....................................................................167
8.1 Étude des mécanismes de résistance.........................................................................167
8.2 Diversité de la famille des protéines ABC chez Leishmania....................................169
8.3 Évolution des protéines ABC chez Leishmania .......................................................170
8.4 Les protéines ABC comme cibles thérapeutiques ....................................................172
8.5 La sous-famille ABCC chez Leishmania..................................................................173
8.6 Les puces à ADN du génome complet de Leishmania pour l’étude de la résistance176
8.7 L’aneuploïdie est associée à la résistance aux médicaments chez Leishmania ........178
8.8 Modulation génique spécifique comme marqueur de la résistance ..........................180
Conclusions.........................................................................................................................182
Bibliographie ......................................................................................................................184
Liste des figures
Figure 1.1 Organigramme des espèces de Leishmania……………………………….……12
Figure 1.2 Distribution géographique des zones endémiques de leishmanioses…………..13
Figure 1.3 Cycle parasitaire de Leishmania………………………………………..………14
Figure 1.4 Principales manifestations cliniques associées aux leishmanioses….….………18
Figure 1.5 Molécules utilisées en thérapie contre les leishmanioses…………….………...26
Figure 2.1 Mécanismes de résistance aux médicaments……………………….….……….32
Figure 2.2 Topologie des protéines ABC………………………………………………......38
Figure 2.3 Mécanismes de résistance aux métalloïdes chez Leishmania………….……….52
Figure 3.1 Organisation de l’expression génique chez Leishmania……………….……….60
11
Liste des abréviations
ABC
ATP-binding cassette
ADN
Acide déoxyribonucléique
ARN
Acide ribonucléique
ARNm
Acide ribonucléique messager
AsIII
Arsénite
AsV
Arsenate
BT1
Transporteur de bioptérine 1
CR3
Récepteur du complément 3
DHFR
Dihydrofolate réductase
DHFR-TS
Dihydrofolate réductase-thymidylate synthase
fPPG
Protéophosphoglycan filamenteux
-GCS
-glutamylcystéine synthétase
GP63
Glycoprotéine de surface 63
GSH
Glutathion
GST
de l’anglais « Glutathione S-transferase »
HMT1
de l’anglais « Heavy metal tolerance 1 »
LdMT
Transporteur de la miltefosine de Leishmania donovani
LPG
Lipophosphoglycan
MATE
de l’anglais « Multidrug and toxin extrusion »
MDR
Résistance multiple aux médicaments
MDR1
de l’anglais « Multidrug resistance protein 1 »
MFS
de l’anglais « Major facilitator superfamily »
MRP1
de l’anglais « Multidrug resistance-associated protein »
MRPA
de l’anglais « Multidrug resistance-associated protein A »
MTAP
Méthylthioadénosine phosphorylase
MTX
Méthotrexate
NBD
Domaine de liaison aux nucléotides
ODC
Ornithine décarboxylase
PCR
Réaction de polymérisation en chaîne
PKDL
Leishmaniose dermique post-kala-azar
PRP1
Protéine de résistance à la pentamidine 1
12
RND
de l’anglais « Resistance-Nodulation-Division »
SbIII
Antimonite
SbV
Antimonate
SMR
de l’anglais « Small multidrug resistance »
TDR1
Réductase dépendante des thiols 1
TMD
Domaine transmembranaire
TSH
Trypanothion
TST
de l’anglais « Trypanothione S-transferase »
VIH
Virus de l’immunodéficience humaine
YCF1
de l’anglais « Yeast cadmium factor 1 »
13
CHAPITRE 1. LE PARASITE LEISHMANIA ET LA
LEISHMANIOSE
1.1 Le parasite Leishmania
Leishmania est un parasite protozoaire appartenant à l’ordre des Kinetoplastidae et à la
famille des Trypanosomatidae. Ce protiste unicellulaire a été décrit pour la première fois en
1903 de façon indépendante par Charles Donovan et William Leishman. La transmission du
parasite s’effectue par l’intermédiaire d’un arthropode du genre Phlebotomus ou Lutzomyia,
communément appelé mouche des sables. Le genre Leishmania est composé de plusieurs
espèces, dont une vingtaine est responsable d’une panoplie de manifestations cliniques chez
les mammifères (section 1.4). Le sous-genre Sauroleishmania regroupe des espèces
apparentées aux Leishmania qui parasitent les lézards (e.g Leishmania tarentolae) plutôt
que les mammifères. En raison de l’homogénéité morphologique des différentes espèces, la
classification est principalement basée sur des critères comme la distribution géographique,
les manifestations cliniques et certaines caractéristiques biologiques (194). Cependant, la
venue de données immunologiques, biochimiques et génétiques plus approfondies permet
maintenant une meilleure définition des différentes espèces (26, 156, 230, 231) (Figure
1.1). Les espèces en mesure d’infecter les mammifères peuvent être différenciées en deux
sous-genres, Leishmania et Viannia, selon que le parasite se développe dans la partie
centrale ou postérieure de l’intestin du vecteur, respectivement. De plus, la niche
écologique du parasite permet la distinction de deux grandes situations géographiques, soit
l’Ancien-monde (sud de l’Europe, Afrique, Asie) et le Nouveau-monde (Amérique Centrale
et Amérique du Sud). Bien que des manifestations cliniques similaires soient observées au
sein des deux localisations géographiques, celles-ci sont généralement causées par des
espèces de Leishmania différentes. Ainsi, alors que le sous-genre Leishmania est retrouvé
au niveau des deux régions géographiques, la présence du sous-genre Viannia est limitée au
Nouveau-monde. Pour ce qui est de la distribution du vecteur, le genre Phlebotomus est
principalement retrouvé dans les régions arides et semi-arides de l’Ancien-monde alors que
le genre Lutzomyia est localisé au niveau des forêts d’Amérique du Sud.
14
Figure 1.1 Organigramme des espèces de Leishmania. Inspiré de Banuls, A.L., 2000.
1.2 Épidémiologie et distribution géographique
Les leishmanioses constituent un problème de santé publique majeur à l’échelle mondiale.
Elles sont principalement retrouvées au niveau des régions tropicales et subtropicales du
globe, où elles sont responsables d’environ 70 000 décès annuellement. On estime une
prévalence globale de 12 millions de personnes, avec une incidence annuelle de 500 000
nouveaux cas de leishmaniose viscérale (section 1.4.4) et 1,5 million de nouveaux cas de
leishmaniose cutanée (100) (section 1.4.2). Le parasite est endémique dans au moins 88
pays (Figure 1.2), dont certains comptent parmi les plus pauvres. La grande majorité (90%)
des cas d’infections cutanées est retrouvée en Afghanistan, en Arabie Saoudite, au Pakistan,
en Syrie, en Algérie, en Iran, au Brésil et au Pérou, tandis que la majorité des cas
d’infections viscérales (90%) sont retrouvés en Inde, au Bangladesh, au Népal, au Soudan
et au Brésil (100). La réactivation de foyers endémiques au Brésil (22), l’émergence de
nouveaux foyers épidémiques en Israël et au Maroc (4, 63, 144, 166, 314), la progression
du nombre de cas d’infections diagnostiquées au cours de la dernière décennie (40, 100),
l’émergence de la leishmaniose en tant que zoonose aux États-Unis (117, 234, 292), ainsi
15
que l’incidence accrue de cas de leishmanioses cutanées chez les soldats (382) et les
voyageurs en zones endémiques (revue dans (304)) sont autant d’événements qui reflètent
l’ampleur de la problématique générée par le parasite au niveau des pays en voie de
développement et des pays industrialisés. La situation n’est guère améliorée par
l’émergence de cas de co-infection Leishmania/VIH en zone d’endémicité croisée.
Initialement retrouvée au niveau du bassin méditerranéen (Espagne, Italie, France et
Portugal) et du Brésil, ce type d’infection s’étend maintenant à différentes régions
d’Afrique et d’Asie (81).
Figure 1.2 Distribution géographique des zones endémiques de leishmanioses. Les
régions principalement affectées par la leishmaniose viscérale sont indiquées en vert tandis
que celles principalement affectées par la leishmaniose cutanée sont indiquées en rouge.
Les régions en mauve sont autant affectées par les leishmanioses viscérales que cutanées.
Tiré de Handman, 2001.
16
1.3 Cycle de vie et morphologie
Le parasite Leishmania a un cycle de vie dimorphique constitué de la forme promastigote
extracellulaire qui se développe et se multiplie au niveau du système digestif de l’insecte
vecteur et de la forme amastigote intracellulaire qui réside et se multiplie au niveau du
phagolysosome des macrophages de l’hôte vertébré. Ainsi, au cours de son cycle parasitaire
(Figure 1.3), Leishmania sera exposé à différents environnements extracellulaires et
intracellulaires.
Figure 1.3 Cycle parasitaire de Leishmania. Modifié de Handman, 2001.
17
1.3.1 Stade extracellulaire promastigote
Le cycle parasitaire est initié par la piqûre de mouches des sables femelles appartenant aux
genres Phlebotomus ou Lutzomyia sur un animal infecté (leishmaniose zoonotique) ou sur
un homme infecté (leishmaniose anthroponotique). Dans le cas de leishmanioses
zoonotiques, plusieurs mammifères sauvages (ex. rongeurs) ou domestiques (ex. chiens)
peuvent jouer le rôle de réservoirs dans la transmission de la maladie. Une piqûre au site
d’infection permet l’ingestion de parasites amastigotes libres ou de macrophages infectés à
partir de la circulation sanguine de l’hôte. Au cours des heures suivant le repas sanguin, les
parasites passent d’une forme immobile, quasi sphérique ou ovoïde d’environ 4-5 m de
diamètre, la forme amastigote intracellulaire, à une forme allongée (11-20 m), flagellée et
mobile, la forme promastigote. Ces parasites promastigotes nouvellement différenciés sont
dit procycliques et sont caractérisés par une mobilité réduite et une multiplication active. La
multiplication observée au stade procyclique est suivie de la transformation des parasites en
une forme plus allongée et plus mobile appelée le stade nectomonade. Les parasites
nectomonades se dirigent vers la zone antérieure de l’intestin médian où ils s’attachent aux
cellules épithéliales de la paroi de l’intestin. Cette capacité d’adhérence serait un des
principaux facteurs responsables du tropisme de la mouche des sables pour certaines
espèces de Leishmania.
1.3.1.1 Interactions promastigotes-vecteurs
Plusieurs espèces d’insecte des genres Phlebotomus et Lutzomyia sont responsables de la
transmission du parasite. Alors que la plupart des espèces de mouche des sables ont une
spécificité d’infection limitée à une seule espèce de Leishmania (vecteur restrictif), d’autres
sont permissives et susceptibles de transmettre plusieurs espèces de Leishmania (vecteur
permissif). Ce tropisme d’espèces chez le vecteur semble être influencé par la physiologie
de digestion du repas sanguin qui oblige le parasite à devoir surmonter un certain nombre
d’obstacles tels les enzymes protéolytiques et la membrane péritrophique générés dans
l’intestin du vecteur suite au repas sanguin (296). Cependant, le principal facteur
responsable du tropisme d’espèces semblerait résider en la capacité de la forme
promastigote à s’attacher aux cellules épithéliales de l’intestin du vecteur afin d’éviter
d’être expulsée lors de l’excrétion du repas sanguin. Cette adhérence semble être médiée
18
soit par l’interaction du lipophosphoglycan (LPG), un glycolipide à la surface des
promastigotes, avec une galectine des cellules épithéliales de l’intestin du vecteur (179),
soit par un processus indépendant du LPG (250). Le LPG est la molécule la plus abondante
de la surface des promastigotes et est constitué de répétitions du phosphodisaccharide
galactose-mannose qui, selon les espèces de Leishmania, peuvent être modifiées ou non par
des chaînes latérales de longueur variable. La spécificité du tropisme des espèces d’insectes
restrictives serait dictée par l’affinité de leurs galectines pour les chaînes latérales
polymorphiques du LPG.
1.3.2 Métacyclogénèse
À partir du septième jour suivant le repas sanguin, les parasites nectomonades se
différencient en la forme leptomonade et subissent une deuxième ronde de multiplication
avant d’entreprendre un processus de différenciation appelé métacyclogénèse. La forme
métacyclique correspond à la forme infectieuse des promastigotes, celle la mieux adaptée
pour la transmission chez l’hôte vertébré. Les parasites métacycliques migrent vers
l’œsophage et le pharynx de l’insecte où l’accumulation de parasites et la sécrétion d’un
protéophosphoglycan filamenteux (fPPG) finiront par causer une obstruction. Cette
obstruction augmente l’efficacité d’infection en obligeant l’insecte vecteur à régurgiter les
parasites au site d’injection avant l’ingestion du repas sanguin subséquent. La
métacyclogénèse implique certains changements essentiels à la transmission du parasite et à
sa survie lors des premiers instants chez l’hôte mammifère. Entre outre, on remarque une
modification du LPG à la surface du parasite qui diminue sa capacité d’interagir avec les
lectines de l’intestin du vecteur. Aussi, l’augmentation de l’expression de la
métalloprotéase de surface GP63 et l’élongation des molécules LPG permettent aux
parasites de résister à la lyse médiée par le complément et facilitent l’invasion des
macrophages chez l’hôte mammifère.
1.3.3 Transmission et stade intracellulaire amastigote
Au cours d’un repas sanguin d’une mouche des sables infectée sur un hôte mammifère, les
parasites métacycliques sont régurgités au site d’injection alors que l’insecte tente de se
libérer de l’obstruction occasionnée par les parasites et le fPPG. Leishmania infecte
19
principalement les cellules du système réticulo-endothélial comme les monocytes, les
cellules dendritiques, les histiocytes et les macrophages. Suite à leur inoculation, les
parasites métacycliques doivent d’abord éviter la lyse par le complément avant d’être
phagocytés par les macrophages. Le LPG aurait un rôle à jouer dans ce processus en
prévenant l’attachement du complexe C5b-C9 à la surface du parasite (276), alors que la
métalloprotéase de surface GP63 induirait la conversion du C3b en C3bi à la surface du
parasite. Cette conversion permettrait aux parasites d’être phagocytés via l’interaction avec
le récepteur du complément CR3 à la surface du macrophage (42), ce qui représente un
avantage majeur puisque la phagocytose via le CR3 n’induit pas d’explosion oxydative
chez le macrophage (240). D’autres molécules à la surface du parasite et de la cellule hôte
seraient également impliquées dans la phagocytose de Leishmania (revue dans (254)). Des
études récentes suggèrent que la phagocytose des parasites par les neutrophiles au site
d’inoculation favoriserait l’infection en permettant aux parasites d’être transférés aux
macrophages de façon silencieuse lorsque ceux-ci migrent au site d’infection pour effectuer
la phagocytose des neutrophiles apoptotiques infectés (368). À l’intérieur du
phagolysosome du macrophage, les parasites métacycliques se différencient en la forme
amastigotes qui est mieux adaptée à l’environnement du phagolysosome. La différenciation
est induite par le changement de température (de 25oC chez l’insecte à 37oC au niveau du
macrophage) et de pH (de pH alkalin chez l’insecte à pH 4.5-6.0 au niveau du
phagolysosome) (revue dans (405)).
1.4 Manifestations cliniques
Les différentes espèces de Leishmania démontrent habituellement un tropisme d’infection
préférentiel, c’est-à-dire que des manifestations cliniques spécifiques sont généralement
associées à des espèces de Leishmania particulières. Cependant, en fonction de différents
facteurs comme l’état de santé du patient et certaines de ses caractéristiques génétiques,
plusieurs pathologies peuvent parfois être associées à une même espèce. Ainsi, la réponse
immuno-inflammatoire du patient joue un rôle prépondérant quant à l’issue de l’infection.
On distingue trois principaux types d’infection à Leishmania: les leishmanioses cutanées,
muco-cutanées et viscérales qui sont respectivement caractérisées par une infection
20
ulcérative de la peau, une destruction inflammatoire des muqueuses du visage et une
infection viscérale disséminée (Figure 1.4) (revue dans (248)).
Figure 1.4 Principales manifestations cliniques associées aux leishmanioses. A,
Leishmaniose viscérale; B. Leishmaniose cutanée; C. Leishmaniose mucocutanée. (source :
http://phil.cdc.gov/phil/home.asp)
1.4.1 Leishmaniose asymptomatique
Les infections à Leishmania peuvent parfois demeurer complètement asymptomatiques,
surtout celles causées par les espèces viscérotropiques. Ceci laisse suggérer que certains
facteurs de susceptibilité comme l’âge, l’état nutritionnel et le système immunitaire de
l’hôte influencent l’expression de la maladie (248).
1.4.2 Leishmaniose cutanée
Selon la localisation géographique, les leishmanioses cutanées peuvent être causées par
plusieurs espèces de Leishmania : L. major, L. tropica, L. aethiopica et L. donovani (115)
(Ancien-monde); L. infantum (bassin Méditérranéen et Mer Caspienne), L. mexicana, L.
panamensis, L. amazonensis, L. peruviana, L. braziliensis et L. guyanensis (Nouveaumonde). L’apparition des symptômes est précédée d’une période d’incubation qui peut
21
varier de quelques semaines à quelques mois, selon l’espèce en cause (28). La maladie est
caractérisée par l’apparition d’une papule rougeâtre au site d’inoculation qui se développe
éventuellement en un nodule plus large, ulcéreux ou non. La lésion se résorbe
spontanément en quelques mois mais laisse généralement une cicatrice importante. Pour les
infections cutanées dues à L. tropica, l’apparition de nouveaux nodules autour d’une lésion
guérie peut survenir (leishmaniasis recidivans). La présence de multiples lésions chez le
patient peut être signe d’inoculations multiples mais peut aussi indiquer la présence d’une
variante plus rare de la leishmaniose cutanée, la leishmaniose cutanée diffuse. Cette forme
de leishmaniose se caractérise par la présence de plusieurs nodules non-ulcéreux
disséminés sur tout le corps, qui ne se résorbent pas spontanément et qui sont plus difficiles
à traiter. L’apparition de leishmaniose cutanée diffuse semblerait être associée à un défaut
au niveau de l’immunité cellulaire du patient.
1.4.3 Leishmaniose muco-cutanée
Une dissémination au niveau des muqueuses du visage, appelée leishmaniose mucocutanée, peut survenir dans 1-5% des cas de leishmanioses causées par L. braziliensis, L.
panamensis et L. guyanensis, et ce parfois jusqu’à 5 ans après la guérison de l’infection
cutanée initiale. Cette complication se caractérise par l’apparition de rougeurs au niveau
des muqueuses nasales qui évoluent ensuite en lésions inflammatoires destructrices. Si
l’infection n’est pas traitée à temps, une perforation du septum nasal s’ensuit, causant une
défiguration irréversible chez le patient. En plus de causer une morbidité appréciable, la
leishmaniose muco-cutanée peut entraîner la mort advenant l’implantation d’une infection
secondaire (eg. pneumonie). L’apparition de leishmaniose muco-cutanée pourrait être due
à une réponse immunitaire inappropriée (350).
1.4.4 Leishmaniose viscérale
La leishmaniose viscérale est une maladie systémique causée par L. donovani en Inde et en
Afrique, par L. chagasi en Amérique du sud et par L. infantum au niveau des pays
méditerranéens.
Occasionnellement,
d’autres
espèces
normalement
responsables
d’infections cutanées comme L. tropica et L. amazonensis peuvent aussi se montrer
viscérotropiques. Après une période d’incubation variant de deux à six mois, la
22
leishmaniose viscérale se caractérise par la présence de symptômes évocateurs d’une
infection systémique persistante comme de la fièvre, de la fatigue, une faiblesse
généralisée, de l’anorexie et une perte de poids, ainsi que de symptômes indiquant
l’invasion du système réticulo-endothélial par les parasites comme une hépatomégalie, une
splénomégalie, une enflure des ganglions lymphatiques et de l’anémie. En l’absence de
traitement, les symptômes persistent plusieurs mois, après quoi le patient décède
généralement d’une co-infection bactérienne ou d’anémie sévère. Une complication appelée
leishmaniose dermique post-kala-azar (PKDL) peut survenir dans les mois suivant la
guérison de la leishmaniose viscérale. Cette complication survient principalement au
Soudan et en Inde, où les infections viscérales sont dues à L. donovani. La PKDL se
caractérise par des éruptions cutanées qui apparaissent sur tout le corps après la disparition
des symptômes de leishmaniose viscérale et survient chez 5-50% des patients, selon la
région géographique (404). La PKDL est habituellement plus difficile à traiter et les
patients atteints peuvent servir de réservoir pour la transmission anthroponotique de la
leishmaniose viscérale.
1.4.5 Latence, immunité et réactivation
Dans tous les types de leishmanioses, les parasites semblent persister dans l’organisme,
même après la guérison de la maladie. La plupart des patients développent une immunité
protectrice,
mais
les
parasites
en
latence
peuvent
se
réactiver
lors
d’une
immunosuppression résultant de traitements anti-inflammatoires (eg. corticostéroïdes), de
traitements immuno-modulateurs chez les patients greffés ou résultant d’une co-infection
comme chez les personnes atteintes du SIDA.
1.5 Diagnostic
Le diagnostic différentiel de la leishmaniose est important en raison de l’existence de
pathologies à étiologie différente de Leishmania causant des symptômes similaires, comme
la lèpre, la sarcoïdose, certains cancers et certaines mycoses dans le cas des leishmanioses
cutanées, ainsi que la malaria ou la shistosomiase dans le cas des leishmanioses viscérales.
Le diagnostic de la leishmaniose peut s’effectuer au moyen de diverses techniques, comme
23
la détection directe des parasites amastigotes au niveau de biopsies à l’aide d’un
microscope, la culture de parasites en laboratoire à partir de biopsies, un test sérologique
positif, la détection d’antigènes et la détection d’ADN de parasites.
1.5.1 Visualisation directe des parasites
La coloration au Giemsa des parasites isolés d’une biopsie de lésions cutanées (pour la
leishmaniose cutanée) ou d’aspirations de la rate, de la moelle osseuse ou de ganglions
(pour la leishmaniose viscérale) suivie de la visualisation des parasites amastigotes au
microscope démontre une bonne spécificité et demeure la méthode de détection de premier
choix en zone endémique en raison du coût trop élevé des méthodes plus sophistiquées.
Cependant, en plus de démontrer une sensibilité variable, cette méthode ne permet pas la
distinction des différentes espèces de Leishmania et une culture des parasites à partir de la
biopsie est souvent nécessaire.
1.5.2 Immunodiagnostic
Le test Montenegro, qui consiste en la quantification de la réaction cellulaire cutanée
associée à l’injection d’un cocktail antigénique de Leishmania au niveau de l’avant-bras du
patient, démontre une bonne sensibilité pour la détection de leishmanioses cutanées mais ne
permet pas la distinction entre une infection passée et une infection en cours. Un test
sérologique basé sur la détection d’anticorps dirigés contre un antigène conservé de 39
acides aminés (50) (test rK39) démontre une excellente efficacité (59) pour la détection de
la leishmaniose viscérale en Inde (342, 346) et au Népal (58). Ce test est simple, peu
coûteux et adapté pour l’utilisation en zones endémiques, ce qui fait du rK39 un test
diagnostic très prometteur pour les infections viscérales.
1.5.3 Détection d’ADN de parasites
Le diagnostic par détection d’ADN de parasites par PCR (Polymerase Chain Reaction)
offre une très bonne sensibilité (87, 120, 289). Une amélioration des techniques d’isolement
d’ADN ainsi que la mise au point d’une méthode d’amplification de l’ADN directement à
partir du sang ou de biopsies fait de la PCR un excellent outil diagnostic (372). Cependant,
la nécessité d’infrastructures adéquates, d’une expertise technique et son coût relativement
24
élevé représentent des facteurs qui limitent son utilisation au niveau des zones endémiques
des pays moins développés.
1.6 Contrôle et prévention
Le contrôle des différentes formes de leishmanioses repose principalement sur le traitement
des infections à l’aide d’agents chimiothérapeutiques. L’élimination du vecteur (mouche
des sables) à l’aide d’insecticides et le contrôle des réservoirs en zones de transmission
zoonotique domestique démontrent aussi une certaine efficacité. Il n’existe encore aucun
vaccin contre Leishmania mais différentes formulations vaccinales prometteuses se
retrouvent présentement à des phases de développement plus ou moins avancées (section
1.6.2).
1.6.1 Contrôle des vecteurs et des réservoirs
L’approche traditionnelle quant au contrôle du vecteur consiste en la vaporisation des
pièces de la maison avec des insecticides. Cependant, bien que les programmes de
vaporisation sont utiles pour réduire le risque d’infection (86, 284), ceux-ci sont souvent
difficiles à maintenir en régions endémiques en raison du manque de ressources et de
l’instabilité politique. Une autre approche consiste en la distribution de moustiquaires
imprégnés d’insecticides à installer autour des lits afin de diminuer les infections dues aux
piqûres nocturnes. Ce type d’installations a déjà démontré un potentiel protecteur
intéressant (32, 116, 284). Quant au contrôle des réservoirs, une réduction de la
transmission du parasite aux humains par la vaccination des animaux domestiques (eg.
chiens) semble être envisageable dans le cas de leishmanioses zoonotiques domestiques
(38, 237). Aussi, l’utilisation de colliers à chiens imprégnés d’insecticides a permis une
réduction substantielle de l’incidence de leishmaniose canine en Italie (224) et en Iran
(130).
1.6.2 Vaccins
Il n’y a présentement aucun vaccin utilisé de routine contre les infections à Leishmania.
Cependant, le développement d’une immunité protectrice chez les personnes ayant guéri
25
d’une première infection à Leishmania sous-entend la possibilité de générer un vaccin
prophylactique contre ce parasite. Le vaccin anti-Leishmania idéal devrait être en mesure
de protéger contre l’ensemble des espèces du parasite, induire principalement une réponse
immunitaire à médiation cellulaire TH1 et induire une mémoire immunologique à long
terme (181). Traditionnellement, la technique de la « leishmanisation » était utilisée dans
plusieurs pays du Moyen-Orient et de l’ex-URSS. Cette pratique consistait à exposer le dos
des enfants aux piqûres de la mouche des sables ou à provoquer délibérément une infection
contrôlée à un endroit stratégique du corps suite à l’inoculation de matériel infectieux
provenant de lésions. Cette technique, qui permettait d’induire une immunité protectrice
durable, a été abandonnée en raison de l’apparition de lésions chroniques inacceptables
chez certaines personnes. La culture axénique de parasites a ensuite mené aux premiers
essais de vaccins vivants en Israël et en ex-URSS (140, 182). Malgré de bons résultats
quant à la protection contre une réinfection, la présence d’effets secondaires considérables
(eg. lésions incontrôlées) entraîna la cessation de cette pratique. L’intérêt subséquent pour
la vaccination à partir de diverses formulations de parasites tués a initialement donné des
résultats variables quant à la protection contre les réinfections, et ce malgré la génération
d’une réponse à médiation cellulaire (181). Toutefois, l’addition de bacille Calmette-Guérin
(BCG) à une formulation de parasites promastigotes tués semble produire un vaccin
thérapeutique efficace contre les leishmanioses cutanées et muco-cutanées en Amérique du
Sud (74, 75). Aussi, la vaccination avec des parasites infectieux rendus atténués par
diverses délétions génétiques semble être sécuritaire et efficace chez le modèle murin (7,
261, 355). Une approche intéressante consiste à utiliser une souche de Leishmania vivante
non-pathogène afin d’immuniser contre les espèces pathogènes. En effet, Leishmania
tarentolae, qui infecte normalement les lézards et qui est non-pathogène aux mammifères,
est phagocyté par les cellules dendritiques lorsque injecté chez la souris et induit une
réponse immunitaire à médiation cellulaire en mesure de protéger contre L. donovani (41).
La plupart des études récentes se sont attardées aux vaccins recombinants. Ces vaccins sont
composés de protéines recombinantes, d’ADN nu codant pour une protéine immunogène
ou de bactéries/virus modifiés génétiquement exprimant les protéines recombinantes. Les
études chez le modèle murin ont démontré que les antigènes du parasite Leishmania
n’induisent pas tous une immunité protectrice efficace (72) et que le développement d’un
26
traitement prophylactique exige la caractérisation immunogénique des candidats vaccinaux
potentiels ainsi que l’élucidation des meilleures voies d’administration. Leish-111f est l’un
des candidats vaccinaux de seconde génération les plus prometteurs quant à l’immunisation
contre la leishmaniose cutanée. Leish-111f consiste en une polyprotéine constituée de
fragments de trois protéines immunogènes: la protéine anti-oxydante spécifique aux thiols
(TSA), l’homologue de la protéine eucaryote inductible au stress (LmSTI1) et le facteur
d’initiation et d’élongation de Leishmania. Lorsque administré avec l’adjuvant approprié
(IL-12 ou le dérivé détoxifié du lipide A), Leish-111f semble induire une immunité
protectrice contre L. major (73) et L. infantum (71).
1.7 Agents thérapeutiques
En l’absence de vaccins efficaces, le contrôle de la leishmaniose repose sur l’administration
d’agents chimiothérapeutiques aux patients infectés. L’arsenal de médicaments disponibles
pour le traitement des infections à Leishmania est limité et comprend les dérivés
d’antimoine, la pentamidine, l’amphotéricine B et la miltefosine; le fluconazole, la
paromomycine et la sitamaquine sont en phases d’essais relativement avancées alors qu’un
certain nombre de médicaments sont présentement à différentes phases de développement
(Figure 1.5).
1.7.1 Dérivés d’antimoine pentavalent
L’antimoine est un métalloide aux propriétés physicochimiques et biologiques similaires à
l’arsenic. Selon le niveau d’oxydation, on retrouve l’antimoine sous la forme trivalente ou
la forme pentavalente. Les premiers registres rapportant l’utilisation d’antimoine trivalent
pour le traitement de la leishmaniose cutanée et de la leishmaniose viscérale ont été
respectivement publiés par Macado et Vianna en 1913 et par di Cristina, Carona et Rodgers
en 1915. Le développement de l’antimoine pentavalent en 1920, qui démontre une toxicité
réduite pour le patient par rapport à la forme trivalente, amena la synthèse du premier
antimonié pentavalent, le Solustibosan (sodium antimonyl gluconate), dont l’efficacité
contre la leishmaniose viscérale fût rapportée en Chine en 1937. La synthèse du Pentostam
(stibogluconate de sodium) par les Britanniques en 1945 fût rapidement suivie de la
27
synthèse du Glucantime (antimoniate de méglumine) par les Français et ces formulations
d’antimoine pentavalent demeurent utilisées de nos jours en tant que traitement classique
contre les différentes formes de leishmanioses (79). Une formulation générique du
stibogluconate de sodium, beaucoup moins dispendieuse que le Pentostam et démontrant
une efficacité comparable (238, 286, 371), est maintenant disponible en Inde. Une étude
récente à démontré que selon le coût et l’efficacité, le traitement de première ligne de choix
pour les infections viscérales consiste en la formulation générique du Pentostam (369).
L’utilisation de dérivés d’antimoine pentavalent pour le traitement des leishmanioses
comporte certains désavantages. On note entre autre la nécessité d’une administration
parentérale quotidienne pour une durée prolongée et une toxicité appréciable associée au
traitement (pancréatites, arthralgies, myalgies, nausées, vomissements, toxicité cardiaque)
(79). Cependant, une formulation d’antimoniate de méglumine conjugué à des
oligosaccharides cycliques administrée par voie orale a démontré une efficacité comparable
à l’administration de la forme non-conjuguée par voie intrapéritonéale contre une infection
à Leishmania amazonensis chez le modèle murin (96), suggérant la possibilité de remédier
aux désavantages de l’administration parentérale.
Malgré plus de 50 ans d’utilisation thérapeutique, le mode d’action et les cibles
moléculaires de l’antimoine n’ont toujours pas été clairement identifiés. Des études
biochimiques réalisées au cours des dernières décennies ont indiqué que l’antimoine
induirait une diminution de l’activité bioénergétique du parasite en inhibant la glycolyse et
l’oxydation des acides gras (30, 31). D’autres études ont révélé certaines cibles potentielles
dont l’ADN topoisomérase I (57, 167, 217) et la trypanothion-réductase (84, 389). Enfin,
l’antimoine trivalent semblerait induire un stress oxydatif (334, 389) occasionnant une
fragmentation de l’ADN (311, 334) et semblerait tuer les parasites par un processus
apoptotique (93).
La résistance représente un problème majeur associé aux traitements à base d’antimoine.
Bien que l’antimoine pentavalent demeure un agent thérapeutique de première ligne contre
toutes les formes de leishmanioses, son efficacité est gravement compromise au niveau de
certaines régions géographiques (122, 149, 290) et atteint parfois des proportions
épidémiques au niveau de quelques zones endémiques (344). L’émergence de la résistance
28
a probablement été accélérée par certains facteurs retrouvés au niveau de ces régions
comme l’endémicité du parasite, la grande proportion de patients traités et le mode de
transmission presque exclusivement anthroponotique (homme à homme). Les mécanismes
impliqués dans la résistance de souches mutantes sélectionnées in vitro sont partiellement
connus et seront discutés en détail à la section 2.2.4.
Figure 1.5 Molécules utilisées en thérapie contre les leishmanioses. Modifié de Croft,
2006.
1.7.2 Pentamidine
La pentamidine est un diamidine aromatique introduit en 1952 qui a été utilisé comme
médicament de seconde ligne pour le traitement des leishmanioses cutanées (326) et des
leishmanioses viscérales réfractaires à l’antimoine pentavalent (352). Bien que son mode
d’action exact demeure inconnu, certaines évidences suggèrent que la pentamidine pourrait
cibler la mitochondrie (27, 241, 373). L’utilisation de la pentamidine pour le traitement de
la leishmaniose est en déclin progressif en raison d’une diminution d’efficacité associée à
29
une résistance croissante (336) et de la toxicité résultant de son administration chez le
patient (hypotension, hypoglycémie, diabète, toxicité rénale et une douleur au site
d’injection). La résistance de souches mutantes de L. mexicana et L. donovani sélectionnées
in vitro semble être associée à une diminution de l’accumulation de la pentamidine au
niveau de la mitochondrie (27, 241) et la surexpression du transporteur de type ABC
intracellulaire PRP1 confère de faibles niveaux de résistance chez L. major (66-68).
1.7.3 Amphotéricine B
L’amphotéricine B est un antibiotique polyène utilisé pour le traitement des mycoses
systémiques. L’action fongicide de l’amphotéricine B provient de son interaction
préférentielle avec l’ergostérol, le stérol membranaire majeur des fungi, par rapport au
cholestérol, qui est le stérol membranaire principal des cellules de mammifères.
L’interaction de l’amphotéricine B avec l’ergostérol s’ensuivrait de la formation de pores
au niveau de la membrane plasmique causant une altération de la perméabilité
membranaire. L’ergostérol est aussi le stérol membranaire principal de Leishmania (136) et
le mode d’action de l’amphotéricine B contre le parasite serait similaire (281).
L’amphotéricine B est utilisée comme traitement de seconde ligne contre les leishmanioses
viscérales résistantes à l’antimoine pentavalent ou comme traitement de première ligne au
niveau des régions où la résistance à l’antimoine est endémique. Son utilisation est
cependant limitée par la toxicité rénale et cardiaque associée à son administration. Le
développement de formulations liposomales permet une efficacité comparable (343) et une
tolérance au traitement accrue, mais la disponibilité de ces formulations au niveau des pays
en développement est limitée en raison de leur coût exorbitant. Une approche moins
dispendieuse consistant en l’administration d’une dose massive unique d’amphotéricine B
liposomale a démontré une bonne efficacité (338). Bien que la résistance à l’amphotéricine
B ne représente pas encore de problèmes majeurs chez les souches cliniques, l’étude de
mutants résistants sélectionnés in vitro a permis d’identifier certains mécanismes de
résistance. Ainsi, une étude a corrélé l’émergence de résistance avec une diminution de la
fluidité membranaire qui résulterait de la présence d’un précurseur de l’ergostérol comme
stérol majeur chez les mutants résistants (232). Cette modification des stérols
30
membranaires pourrait être reliée à un défaut d’expression du gène ERG6 qui code pour
une méthylase des stérols (274).
1.7.4 Miltefosine
La miltefosine ou hexadecylphosphocholine est un analogue de phospholipides
originalement développé pour ses propriétés anti-néoplasiques. La démonstration de son
efficacité contre L. donovani in vitro (77) et in vivo (192) fût suivie d’études cliniques qui
ont démontré le potentiel thérapeutique de la miltefosine contre les infections viscérales en
Inde (34, 170, 337, 341, 345) et contre les infections cutanées en Colombie (324, 325, 327,
328). De plus, la miltefosine semble démontrer une certaine utilité pour le traitement de la
leishmaniose dermique post-kala-azar réfractaire à l’antimoine pentavalent (340). Bien que
son mode d’action précis ne soit pas encore connu, il a été démontré que la miltefosine
interfère avec le métabolisme des alkyl-lipides et la biosynthèse des phospholipides (219,
279) en plus d’induire un processus similaire à l’apoptose (265, 375). Le principal avantage
de la miltefosine consiste en son administration orale, qui contraste avec l’administration
parentérale des autres agents utilisés en thérapie contre Leishmania. De plus, les effets
secondaires limités (principalement gastro-intestinaux) de la miltefosine en font un
médicament attrayant, bien que ses propriétés tératogènes en limite l’utilisation chez les
femmes enceintes. La miltefosine a récemment été officiellement introduite pour le
traitement de la leishmaniose viscérale en Inde et contre la leishmaniose cutanée en
Colombie (78). Bien que la résistance clinique ne représente pas encore de problème,
l’étroite fenêtre thérapeutique associée à la longue demi-vie de la miltefosine, ainsi que la
démonstration qu’il est facile de générer des mutants résistants en laboratoire (308)
suggèrent que l’utilisation conjointe d’un second médicament pourrait être utile afin de
ralentir l’apparition de cas de résistance. L’étude de mutants résistants sélectionnés en
laboratoire a démontré un défaut d’accumulation de la miltefosine chez les parasites
résistants (269). Cette diminution d’accumulation serait causée par l’inactivation du gène
LdMT (270) codant pour une translocase des phospholipides qui est responsable de l’entrée
de la miltefosine à l’intérieur du parasite. De plus, une augmentation de l’efflux de la
miltefosine a été observée chez les parasites résistants et a été associée à une surexpression
31
du transporteur ABC MDR1 (271). Certains mutants résistants ont aussi démontré une
altération de la perméabilité membranaire (280).
1.7.5 Paromomycine
La paromomycine est un antibiotique aminoglycoside initialement utilisé pour le traitement
des infections bactériennes. La démonstration de son efficacité contre L. major chez le
modèle murin fût suivie d’un certain nombre de petites études cliniques pour l’évaluation
de son potentiel thérapeutique contre les leishmanioses cutanées et viscérales (revue dans
(79)). Ainsi, une formulation topique de paromomycine démontre une activité appréciable
contre L. major (111) mais est associée à une irritation au niveau du site d’application.
Aussi, une étude clinique récente a démontré que l’efficacité de la paromomycine
administrée par voie intra-musculaire pour le traitement de la leishmaniose viscérale en
Inde est comparable à l’efficacité du traitement conventionnel (339). L’activité de la
paromomycine contre Leishmania semblerait être dirigée contre les ribosomes (223) et
certaines enzymes mitochondriales (221), en plus de causer une altération au niveau de la
fluidité membranaire et du métabolisme lipidique (222). Étant donné l’utilisation clinique
limitée de la paromomycine jusqu’à maintenant, la résistance ne représente pas encore de
problèmes mais des études à partir de mutants résistants sélectionnés en laboratoire ont tout
de même été effectuées. Contrairement à E. coli où la résistance à la paromomycine
survient suite à des mutations au niveau des ARN ribosomaux, la résistance chez
Leishmania semblerait résulter d’une diminution de l’accumulation à l’intérieur du parasite
(220).
1.7.6 Autres médicaments
1.7.6.1 Azolés
Le fluconazole est un triazolé utilisé dans le traitement des infections fongiques. L’action
du fluconazole contre Leishmania repose sur l’inhibition de la déméthylation du lanostérol,
un précurseur de l’ergostérol. Des études ont démontré une efficacité appréciable du
fluconazole administré par voie orale pour le traitement d’infections cutanées à L. major
(14, 359) alors qu’une autre n’a pas démontré d’amélioration par rapport au placebo (239).
32
1.7.6.2 Sitamaquine
La sitamaquine est une 8-aminoquinoline en développement pour le traitement des
leishmanioses viscérales (78). Des études cliniques de phases I/II ont révélé des résultats
prometteurs en Afrique (381) et en Inde (171), mais pas en Amérique du Sud (105). Le
mode d’action de la sitamiquine n’est pas encore connu mais semblerait être relié à son
métabolisme chez l’hôte.
1.7.6.3 Imiquimod
L’imiquimod est un agent anti-viral abondamment utilisé en application topique pour le
traitement des verrues génitales causées par le papillomavirus humain. Cet immunomodulateur stimule la réponse inflammatoire au site d’application en activant la production
de cytokines et d’oxyde nitrique par les macrophages. L’imiquimod s’est avéré efficace
pour le traitement de leishmanioses cutanées chez le modèle murin (48) et a été utilisé
conjointement avec l’antimoine pour le traitement de lésions cutanées réfractaires à la
monothérapie d’antimoine (21). Cependant, une étude récente a démontré que
l’administration conjointe d’imiquimod et d’antimoine ne semble pas plus efficace que la
monothérapie d’antimoine pour le traitement des leishmanioses cutanées (124). Ce
composé est maintenant en essais cliniques de phase II pour le traitement topique des
leishmanioses cutanées (78).
33
CHAPITRE 2. RÉSISTANCE AUX MÉDICAMENTS
La formule idéale pour le contrôle des infections consiste évidemment à en prévenir
l’apparition. Cependant, malgré des efforts soutenus, il n’existe toujours aucun vaccin
contre les parasites pathogènes à l’humain. Ainsi, dans la situation où l’application de
méthodes de contrôle et de prévention s’avère difficile ou irréalisable, le traitement à base
d’agents chimiothérapeutiques demeure le point d’appui dans la lutte aux infections
parasitaires. Relativement peu de médicaments spécifiques aux parasites ont été
développés, et ce malgré l’existence d’un certain nombre de voies biochimiques uniques
chez ces organismes. Aussi, les propriétés pharmacologiques des médicaments disponibles
ne sont souvent pas optimales, avec un index thérapeutique réduit et une toxicité relative à
leur administration. De plus, une contrainte majeure dans le traitement des infections
parasitaires consiste en la lenteur du processus de développement de nouveaux
médicaments et au manque de financement nécessaire à leur mise en marché. Finalement,
l’émergence de résistance aux médicaments actuellement disponibles témoigne de la
précarité associée à l’arsenal d’agents thérapeutiques utilisés contre les parasites et de la
nécessité d’étudier les mécanismes de résistance responsables de leur inefficacité en
thérapie.
2.1 Mécanismes généraux de résistance aux médicaments
Les cellules ont développé plusieurs mécanismes leur permettant de résister à l’action des
médicaments. Un aspect commun à la plupart de ces mécanismes consiste à entraîner une
diminution des interactions entre le médicament et sa (ses) cible(s) cellulaire(s). Les
principaux mécanismes de résistance sont illustrés à la figure 2.1 et seront discutés plus en
détail, en abordant quelques exemples connus chez différents organismes.
34
Figure 2.1 Mécanismes de résistance aux médicaments. Modifié de Borst, 1995.
2.1.1 Diminution de l’entrée du médicament
Afin d’exercer ses propriétés inhibitrices, un médicament doit d’abord pénétrer la cellule et
s’y accumuler à une concentration suffisante pour interférer avec sa cible cellulaire. Ainsi,
une diminution de l’entrée du médicament à l’intérieur de la cellule constitue un
mécanisme de résistance. La diminution de l’entrée peut survenir suivant la perte ou la
modification de transporteurs impliqués dans l’accumulation des médicaments ainsi que par
une modification de la perméabilité membranaire. Chez Trypanosoma brucei, des
mutations au niveau du gène codant pour le transporteur d’adénosine P2 (TbAT1) sont
impliquées dans la résistance au mélarsoprol (55, 228), un dérivé d’arsenic utilisé pour le
traitement de la phase tardive de l’infection. Chez Leishmania, l’inactivation du gène FT1
codant pour le transporteur majeur de folate/méthorexate suite à un réarrangement génique
35
ou par des événements mutationnels (180, 285) résulte en une diminution de l’entrée de
méthotrexate (MTX). Finalement, une mutation ponctuelle au niveau de chacun des allèles
du gène codant pour une translocase des aminophospholipides (LdMT) confère la
résistance à la miltefosine chez Leishmania (270).
2.1.2 Inactivation du médicament
Un mécanisme de résistance efficace consiste en l’inactivation du médicament suite à son
entrée à l’intérieur de la cellule, ce qui permet d’obtenir des niveaux de résistance très
élevés. Les médicaments peuvent être modifiés par l’addition de groupements chimiques de
façon à inhiber leurs propriétés toxiques ou ils peuvent être hydrolysés de façon à les rendre
inactifs. Alors que l’inactivation des médicaments est un mécanisme fréquemment exploité
par les bactéries résistantes aux antibiotiques, aucun exemple de ce type de résistance n’a
encore été observé chez les parasites. Ainsi, la production de -lactamases et d’estérases
des macrolides permettent aux bactéries d’inactiver les pénicillines et les macrolides. De
plus, la modification enzymatique des aminoglycosides et du chloramphénicol peut être
retrouvée chez les bactéries comme mécanisme de résistance (revue dans (6)).
2.1.3 Inhibition de l’activation du médicament
Dans certains cas, le médicament administré ne correspond pas à la forme active de la
molécule et celui-ci doit d’abord être activé à l’intérieur de la cellule afin d’acquérir ses
propriétés effectrices. Ainsi, une diminution de l’expression des enzymes responsables de
l’activation des médicaments constitue un mécanisme de résistance. Le métronidazole, qui
est utilisé pour le traitement des infections à Trichomonas vaginalis et à Giardia
duodenalis, nécessite d’être activé par la réduction de son groupement nitrogène. Cette
réduction implique l’activité d’une oxido-réductase du pyruvate dépendante de la
ferredoxine (PFOR) retrouvée chez le parasite. Une diminution de l’expression de PFOR et
de la ferredoxine confère une résistance au métronidazole (260, 278).
36
2.1.4 Modification de la cible du médicament
Un autre mécanisme de résistance consiste à altérer la cible cellulaire du médicament de
façon à en diminuer l’affinité d’interaction avec l’agent thérapeutique tout en conservant
l’activité de la cible. Ce mécanisme de résistance est fréquemment rencontré chez différents
organismes résistants aux antifolates. En effet, des mutations au niveau de l’enzyme
dihydrofolate réductase (DHFR) sont rencontrées chez certaines souches de Plasmodium
falciparum résistantes aux antifolates pyriméthamine (349, 351) et cycloguanil (127, 272),
de même que chez les bactéries (e.g. Streptococcus pneumoniae (1, 229)) résistantes à
l’antifolate triméthoprime (6).
2.1.5 Augmentation de la synthèse de la cible
Afin de tolérer la présence d’un médicament, il arrive qu’une cellule augmente la synthèse
ou la disponibilité de la cible du médicament dans le but d’en assurer une quantité
suffisante pour répondre à ses besoins métaboliques. Ainsi, malgré l’inhibition d’une
certaine proportion de la cible par l’agent thérapeutique, celle-ci demeure présente à une
concentration intracellulaire convenable à la survie de la cellule. Chez les parasites
Plasmodium falciparum et Leishmania major, on observe fréquemment une augmentation
de la synthèse de DHFR chez les mutants résistants aux antifolates (33, 65, 145, 164, 351)
2.1.6 Réparation des dommages et voie métabolique alternative
La cellule peut développer des mécanismes lui permettant de survivre à l’action d’un
médicament. Les cellules résistantes peuvent par exemple augmenter la réparation des
dommages cellulaires occasionnés par l’action du médicament. En effet, certains
médicaments causent des dommages au niveau de l’ADN et une augmentation de l’activité
des enzymes impliquées dans la réparation peut être observée chez les cellules résistantes.
Notamment, un haut niveau d’expression du système de réparation d’ADN par excision de
nucléotides (NER) est associé au phénotype de résistance à la cisplatine chez certains types
de cancer (revue dans (39)). À défaut d’augmenter le niveau de réparation des dommages,
la cellule peut aussi utiliser une voie métabolique alternative, qui constitue un mécanisme
de compensation permettant à la cellule de tolérer la perte de la voie métabolique ciblée par
le médicament. Chez Leishmania, l’inhibition de la dihydrofolate réductase-thymidylate
37
synthase (DHFR-TS) par le MTX est compensée chez les parasites résistants par
l’amplification du gène PTR1 codant pour une déshydrogénase à chaîne courte
normalement impliquée dans la réduction de ptérines mais qui est capable de suppléer à la
DHFR-TS pour la réduction du dihydrofolate en tétrahydrofolate (29, 264). De plus, on a
observé chez les cellules résistantes au MTX qu’une surexpression du gène codant pour le
transporteur des ptérines BT1 (193) peut compenser pour l’inactivation du transporteur
majeur des folates/MTX FT1, puisque BT1 peut transporter les folates mais pas le MTX.
2.1.7 Augmentation de l’efflux du médicament
La diminution de l’accumulation de médicaments résultant de leur expulsion à l’extérieur
de la cellule est un des mécanismes de résistance les plus fréquemment utilisés par les
eucaryotes. Cette diminution d’accumulation implique l’action de protéines membranaires
agissant en tant que pompes d’efflux capables de transporter le médicament contre un
gradient de concentration. Certaines protéines d’efflux sont spécifiques à un médicament
unique ou à une famille de médicaments apparentés, alors que d’autres sont en mesure de
transporter plusieurs substrats structurellement dissimilaires. L’action des protéines
d’efflux est un processus dépendant de l’énergie et on distingue deux principaux systèmes
de transport selon la source d’énergie utilisée : ceux utilisant la force proton-motrice
(transporteurs secondaires) et ceux utilisant l’énergie libérée par l’hydrolyse de l’ATP
(transporteurs primaires). Quatre familles de transporteurs secondaires sont impliquées
dans la résistance aux médicaments : la superfamille « major facilitator » (MFS), la famille
« resistance-nodulation-division » (RND), la famille « multidrug and toxic-compounds
extrusion » (MATE) et la famille « small multidrug resistance » (SMR). La seule famille de
transporteurs primaires impliquée dans la résistance aux médicaments est la superfamille
des protéines « ATP-binding cassette » (ABC). La résistance aux médicaments implique
souvent une augmentation de l’expression d’une ou plusieurs protéines d’efflux. Ainsi, la
surexpression de la famille RND est principalement impliquée dans le phénomène de
résistance multiple aux antibiotiques chez les bactéries à Gram négatif (e.g. le système Mex
chez Pseudomonas aeruginosa (204, 273) et le système AcrAB chez Escherichia coli
(253)), alors que la surexpression de la famille MFS est impliquée dans la résistance aux
antibiotiques chez les bactéries à Gram positif (e.g. les systèmes NorA (177, 251, 252) et
38
PmrA (134) chez Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae, respectivement) et
dans la résistance multiple chez la levure (5, 51, 299). L’implication de la famille des
protéines ABC dans la résistance aux agents toxiques est ubiquitaire et une description
détaillée de cette famille de protéines fera l’objet de la section 2.2.
2.1.8 Séquestration du médicament
Finalement, à défaut d’être expulsé directement à l’extérieur de la cellule, le médicament
peut être transporté à l’intérieur d’une vésicule ou d’une organelle de détoxification
intracellulaire, empêchant ainsi l’interaction avec sa cible thérapeutique localisée au niveau
d’un compartiment cellulaire différent. Parmi les exemples les plus connus, on note les
pompes vacuolaires YCF1 (206) et HMT1 (255) qui sont impliquées dans la résistance aux
métaux chez la levure Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe,
respectivement, ainsi que la protéine MRPA (PGPA) qui est impliquée dans la résistance à
l’arsenic et à l’antimoine chez le parasite Leishmania (section 2.3.4.4).
2.2 Superfamille des protéines ABC
La famille des protéines ATP-binding cassette (ABC) représente l’une des plus grandes
familles de protéines transmembranaires. C’est une famille ubiquitaire de protéines qui
lient l’ATP et qui utilisent l’énergie pour faire traverser une variété de substrats définis
comme les lipides, les peptides, les ions, les sucres ou les toxines au travers des membranes
biologiques. Chez les procaryotes, les protéines ABC sont principalement impliquées dans
l’importation de composés essentiels qui ne peuvent traverser la membrane par diffusion
alors que chez les eucaryotes elles sont surtout impliquées dans le transport de molécules
du cytoplasme vers l’extérieur de la cellule ou vers des compartiments intracellulaires.
L’attention grandissante pour cette famille de protéines vient entre autre du fait que la
surexpression de certaines protéines ABC est en mesure de conférer une résistance à une
vaste gamme de molécules de structures et de fonctions dissimilaires, un phénomène appelé
résistance multiple aux médicaments (MDR).
39
2.2.1 Topologie des protéines ABC
Les protéines ABC sont constituées de deux types de domaines, les domaines
transmembranaires (TMD) et les domaines de liaison aux nucléotides (NBD). Les
domaines TMD contiennent généralement six hélices- qui s’assemblent au niveau de la
membrane pour former un pore au travers duquel les substrats seront transportés. Ces
domaines contiennent aussi les résidus impliqués dans la spécificité de reconnaissance des
substrats. Quant aux domaines NBD, ils sont cytoplasmiques, ils sont impliqués dans la
liaison de l’ATP et ils sont responsables de la génération de l’énergie nécessaire au
transport du substrat. La séquence des domaines NBD est très conservée parmi la famille
des protéines ABC et est à l’origine de la définition de cette superfamille des protéines
(157). Pour qu’un transporteur ABC soit fonctionnel, on doit retrouver la présence de deux
domaines TMD associés à deux domaines NBD. La topologie des transporteurs ABC
correspond principalement à l’arrangement TMD1-NBD1-TMD2-NBD2 (topologie
directe) mais la topologie inversée NBD1-TMD1-NBD2-TMD2 peut aussi être rencontrée
(Figure 2.2). Chez les eucaryotes, certains gènes ABC codent pour une protéine contenant
les quatre domaines fusionnés sur une même molécule (transporteur complet) alors que
d’autres encodent des molécules ne contenant qu’un domaine TMD fusionné à un domaine
NDB (demi-transporteur) (Figure 2.2). Les demi-transporteurs doivent alors s’assembler en
homodimères ou en hétérodimères au niveau de la membrane afin d’acquérir leurs
fonctions de transport. Chez les procaryotes, les quatre domaines sont souvent encodés
séparément et doivent alors s’assembler en multimères au niveau de la membrane. Tandis
que la plupart des protéines ABC sont impliquées dans le transport de molécules, certaines
protéines ABC ne possèdent pas de domaines transmembranaires et sont constituées de
deux domaines NBD fusionnés. Ces protéines ne possèdent évidemment pas de fonctions
de transport.
40
Figure 2.2 Topologie des protéines ABC. A. Transporteur complet de topologie directe;
B. Transporteur complet de topologie directe avec domaine TMD0 et domaine L
supplémentaires; C. Demi-transporteur de topologie directe; D. Demi-transporteur de
topologie inversée.
41
2.2.2 Le domaine de liaison aux nucléotides
Les domaines NBD sont impliqués dans la liaison et l’hydrolyse de l’ATP et sont donc
responsables de la génération de l’énergie nécessaire pour la translocation des substrats. La
séquence de ces domaines est assez bien conservée au sein de la famille des protéines ABC
et cette conservation est d’autant plus marquée au niveau de certaines régions particulières.
Cette conservation de séquence au niveau des domaines NBD facilite l’identification et la
classification phylogénique des protéines ABC encodées dans un génome à l’aide
d’analyses informatiques. En plus de contenir deux motifs communs à la plupart des
protéines liant l’ATP, les motifs Walker A et Walker B (379), les domaines NBD sont
caractérisés par la présence d’un motif spécifique, le motif signature C (162), qui est
positionné juste en amont du motif Walker B et qui constitue une caractéristique distinctive
de la famille des protéines ABC. Les autres régions conservées sont la boucle A (15), la
boucle Histidine (H) (209) et la boucle Glutamine (Q) (104, 159). Le motif Walker A est
impliqué dans la liaison des phosphates  et  de l’ATP alors que le motif Walker B est
impliqué dans la coordination de l’ion Mg2+ au niveau du site de liaison de l’ATP. Le motif
signature C semblerait agir en tant que senseur de la présence du phosphate de l’ATP et
pourrait être impliqué dans la coordination de l’hydrolyse de l’ATP avec le transport du
substrat. La boucle A correspond à un acide aminé aromatique conservé qui est important
pour la liaison de l’ATP en favorisant les interactions hydrophobes avec son anneau
adénine (15). Finalement, la boucle H stabilise le phosphate  de l’ATP au niveau du NBD
via une interaction impliquant une molécule d’eau alors qu’un changement de conformation
au niveau de la boucle Q semblerait impliqué dans l’hydrolyse de l’ATP et dans la
transmission du signal entre les domaines (175).
2.2.3 Les domaines transmembranaires
Les domaines transmembranaires sont moins bien conservés que les domaines NBD et ont
donc un potentiel phylogénique plus modeste. Les sites nécessaires à la reconnaissance des
substrats sont retrouvés au niveau des domaines TMD et des expériences de marquage par
photo-affinité et de mutagenèse dirigée facilitent l’identification des résidus impliqués dans
ce processus. Plusieurs expériences ont ainsi démontré qu’une conservation de la séquence
42
des domaines TMD n’est pas nécessairement prédictive de la spécificité de substrats (revue
dans (95)).
2.2.4 Classification et fonctions des protéines ABC
Les protéines ABC peuvent être divisées en différentes sous-familles sur la base
d’homologies de séquence des domaines NBD, de similarités de structure (transporteurs
complets vs demi-transporteurs) et de l’organisation des domaines dans la protéine. Ainsi,
on distingue huit sous-familles de protéines ABC chez les eucaryotes (ABCA-ABCH),
chacune démontrant certaines caractéristiques structurales et fonctionnelles distinctes, ainsi
que certaines spécificités au niveau du type de substrats transportés. Les protéines ABC de
l’humain étant parmi les plus étudiées chez les eucaryotes, la description des
caractéristiques des différentes sous-familles s’appuie fortement sur les données obtenues
par l’étude des protéines ABC de mammifères.
2.2.4.1 Sous-famille ABCA
Les protéines appartenant à la sous-famille ABCA sont parmi les plus grandes protéines
ABC, certaines comptant plus de 2000 acides aminés. Le haut poids moléculaire de ces
protéines est associé à la présence de larges boucles extracellulaires de quelques centaines
d’acides aminés retrouvées entre la première et la deuxième hélice- de chaque domaine
TMD (49, 125). Cette sous-famille est principalement constituée de transporteurs complets
de topologie directe, bien que des demi-transporteurs ABCA soient retrouvés chez
Arabidopsis thaliana. La sous-famille ABCA est impliquée dans le transport de lipides et
de stérols et les protéines ABCA1 et ABCA4 chez l’humain constituent les prototypes les
plus étudiés. ABCA1 est impliquée dans la régulation du métabolisme des lipoprotéines de
haute densité (HDL) en participant au transport inverse du cholestérol. Des mutations au
niveau du gène ABCA1 sont associées à la maladie de Tangier (37, 47, 295) qui est
caractérisée par la quasi absence de HDL et par l’accumulation d’esters de cholestérol dans
les cellules du système réticulo-endothélial. ABCA1 serait aussi impliquée dans la
phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages en induisant l’exposition des
phosphatidylsérines à la surface des cellules (154). ABCA4 est une flippase impliquée dans
la translocation de N-rétinylidene-phosphatidyléthanolamine (335) au niveau de cellules de
43
la rétine et des mutations de son gène sont associées à différentes maladies rétiniennes (11,
12). La sous-famille ABCA semble avoir subi un très haut taux de duplication et de
délétion génique au cours de l’évolution (90). L’absence de protéines ABCA chez la levure
suggéra initialement que cette sous-famille était réservée aux organismes multicellulaires,
mais le séquençage du génome de protistes ainsi que des évidences expérimentales ont
permis de démontré que cette supposition était fausse. En effet, deux protéines de la sousfamille ABCA sont impliquées dans le transport de phospholipides chez Leishmania
tropica (20, 266) alors qu’une autre est impliquée dans le trafic vésiculaire chez
Trypanosoma cruzi (357).
2.2.4.2 Sous-famille ABCB
La sous-famille ABCB est unique par le fait qu’elle est la seule sous-famille à posséder des
demi-transporteurs et des transporteurs complets chez différents organismes. Les
transporteurs ABCB complets sont constitués de deux moitiés très similaires et proviennent
probablement de la duplication de demi-transporteurs. Chez l’humain, tous les
transporteurs ABCB complets sont localisés au niveau de la membrane plasmique
(ABCB1, ABCB4, ABCB11) alors que tous les demi-transporteurs sont localisés au niveau
de la membrane de différentes organelles comme la mitochondrie (ABCB6, ABCB7,
ABCB8, ABCB10), le réticulum endoplasmique (TAP1/ABCB2, TAP2/ABCB3) et les
lysosomes (ABCB9). De ce fait, les protéines ABCB sont associées à des fonctions
hétérogènes, comme le transport de phospholipides (322, 365), le transport de peptides
(183, 275, 330, 331, 395), la biogenèse de protéines Fe/S cytosoliques (82, 185, 186, 236)
et la résistance multiple aux médicaments (MDR). Le gène codant pour le transporteur
complet Pgp/MDR1/ABCB1 est le premier gène ABC à avoir été cloné chez l’humain, en
raison de sa capacité à conférer le phénotype MDR lorsque surexprimé chez les cellules
ovariennes cancéreuses du hamster (CHO) (176). La résistance résulte de la capacité de ce
transporteur à expulser diverses molécules antinéoplasiques à l’extérieur de la cellule
contre un gradient de concentration. Le spectre de médicaments affecté par la surexpression
de MDR1 contient majoritairement des molécules amphiphiles neutres ou légèrement
cationiques
comme
les
anthracyclines,
les
vinca-alkaloïdes,
les
taxanes,
les
épipodophyllotoxines, la colchicine, l’ivermectine et des inhibiteurs de protéases du VIH.
44
MDR1 est principalement localisée à la membrane apicale des cellules épithéliales (354) ou
des cellules endothéliales (76) de certains organes et semble être impliquée dans la
protection des tissus contre les molécules nocives (303, 323, 329). Bien que le
développement de la MDR survienne principalement au cours du traitement de néoplasies,
des homologues de MDR1 ont été identifiés chez plusieurs organismes et le phénotype
MDR ne se restreint pas aux cellules du cancer. Chez Leishmania, le gène leMDR1 est en
mesure de conférer le phénotype MDR lorsque surexprimé chez L. enrietti et sa
surexpression est induite chez des mutants sélectionnés en laboratoire pour la résistance à la
vinblastine. Bien que la vinblastine ne soit pas utilisée en thérapie contre Leishmania, les
mutants sélectionnés démontrent une résistance croisée à la miltefosine et la surexpression
de MDR1 pourrait donc compromettre l’efficacité de cette molécule dans le traitement des
leishmanioses. Une deuxième protéine ABCB a été identifiée chez Leishmania (ltrMDR2)
en raison de sa capacité à conférer une résistance au 5-fluorouracil. Cependant,
contrairement à leMDR1, ltrMDR2 n’est pas impliquée dans le phénotype MDR lorsque
surexprimée. Chez le parasite apicomplexe Plasmodium, la surexpression du gène Pgh1
codant pour la protéine pfMDR1 est associée à une augmentation de la résistance à la
méfloquine et à une augmentation de la sensibilité à la chloroquine. Le seul transporteur
ABC bactérien responsable du phénotype MDR est LmrA, une protéine homologue à
MDR1 retrouvée chez Lactococcus lactis (367). Ce transporteur est localisé au niveau de la
membrane plasmique et est impliqué dans la résistance à une vaste gamme de molécules de
structures chimiques différentes (366, 367).
2.2.4.3 Sous-famille ABCC
La sous-famille ABCC est composée de transporteurs complets de topologie directe pour
lesquels chacune des moitiés de la protéine démontrent peu d’homologies. En effet,
contrairement aux transporteurs complets de la sous-famille ABCB pour lesquels la moitié
N-terminale de la protéine est plus similaire à la moitié C-terminale de la même protéine
qu’à la moitié N-terminale d’une protéine ABCB paralogue, la moitié N-terminale d’une
protéine ABCC est plus similaire à la moitié N-terminale d’une protéine ABCC paralogue
ou orthologue qu’à la moitié C-terminale de la même protéine. Ce phénomène est
facilement discernable lors d’analyses phylogéniques où on distingue clairement les moitiés
45
N- et C-terminales des protéines ABCC qui s’assemblent en deux groupes indépendants.
Une caractéristique distinctive de la sous-famille ABCC consiste en la présence d’un
domaine transmembranaire de cinq hélices- supplémentaires (TMD0) localisé en Nterminal de certaines protéines ABCC (Figure 2.2b) (25, 362). En effet, sur la base de la
topologie des domaines TMD, on peut diviser la sous-famille ABCC en deux groupes.
Alors que certaines protéines ABCC démontrent la topologie directe TMD1-NBD1-TMD2NBD2 commune à l’ensemble des transporteurs ABC, d’autres protéines ABCC (dont
MRP1 chez l’humain) possèdent un domaine TMD additionnel et démontrent la topologie
TMD0-L-TMD1-NBD1-TMD2-NBD2, où L représente un domaine jonction cytosolique
supplémentaire qui est retrouvé chez l’ensemble des protéines ABCC. Alors que la délétion
du domaine TMD0 n’affecte ni la localisation ni la fonction de la protéine MRP1, la
délétion du domaine jonction cytoplasmique génère une protéine inactive et est nécessaire à
la fonction des protéines ABCC (23, 24, 129, 277, 383). L’essentialité du domaine jonction
L pourrait expliquer sa présence chez l’ensemble des protéines ABCC. Enfin, une autre
spécificité des protéines ABCC consiste en la délétion de treize acides aminés entre le motif
Walker A et la boucle Q du NBD en N-terminal de la protéine ainsi que la présence d’un
motif signature C atypique au niveau du NBD en C-terminal de la protéine.
La première protéine ABCC identifiée est codé par un gène nommé cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR) et est impliquée dans le transport d’ions
chlorure. La première protéine ABCC impliquée dans la résistance aux médicaments
(MRP1/ABCC1) a été identifiée chez une lignée cellulaire du cancer du poumon
sélectionnée pour la résistance à la doxorubicine (H69AR) qui démontrait un phénotype
MDR sans surexpression de la protéine MDR1 (69). Le gène MRP1 était hautement
surexprimé chez les cellules H69AR et le clonage de celui-ci a révélé son appartenance à la
famille des transporteurs ABC. La transfection de MRP1 chez différentes lignées cellulaires
a permis de démontrer sa localisation au niveau de la membrane plasmique à l’aide
d’anticorps monoclonaux (126, 398) et de vérifier son implication dans le phénotype MDR
(70, 139, 191). Bien que la protéine MRP1 (MDR- associated protein 1) appartenait
clairement à la famille des protéines ABC et qu’elle était capable de conférer la résistance à
une gamme de molécules similaire (mais pas identique) à la protéine MDR1, elle ne
démontrait qu’une faible homologie de séquence avec cette dernière. L’identification
46
subséquente de plusieurs autres protéines ABCC comme les protéines MRP2
(cMOAT/ABCC2) (267), MRP3 (ABCC3), MRP4 (ABCC4), MRP5 (ABCC5) (189),
MRP6 (ABCC6) (190) et d’autres protéines ABCC chez l’humain (10, 89, 91, 92) et chez
divers organismes (46, 206, 256) a permis la définition sans équivoque des protéines ABCC
comme sous-famille distincte des protéines ABC.
Plusieurs protéines ABCC sont impliquées dans la résistance aux médicaments lorsqu’elles
sont surexprimées. Cependant, contrairement à MDR1, qui transporte des molécules
amphiphiles neutres ou légèrement cationiques, la plupart des protéines ABCC étudiées
transportent des molécules amphiphiles anioniques. Le caractère anionique des substrats
provient entre autre de leur conjugaison ou de leur co-transport avec un thiol de faible poids
moléculaire comme le glutathion (GSH). En effet, MRP1 et MRP2 sont impliquées dans le
transport de conjugués de thiols comme le leucotriène C4, le 17-glucoronosyl-estradiol
(E217G) ou le S-(2,4-dinitrophényl)-GSH (DNP-SG) (83, 119, 169, 200, 214, 247) et
l’association du transport des substrats avec le GSH, le glucoronide ou le sulfate (168, 282),
sous forme conjuguée ou non-conjuguée, constitue une particularité de cette sous-famille. Il
a été démontré que MRP1 et MRP2 agissent en synergie avec certaines enzymes de type
GSH S-transférases et UDP-glucoronosyl-transférases pour transporter différentes
molécules (99, 151, 203).
Un attribut des protéines ABCC consiste en leur capacité à transporter l’arsenic conjugué
au glutathion. Ainsi, des homologues de la famille ABCC impliqués dans la résistance aux
métaux de façon dépendante du GSH ont été identifiés chez divers organismes. Par
exemple, la surexpression de la protéine YCF1 est impliquée dans la résistance au cadmium
et à l’arsenic chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Chez Leishmania, la surexpression
de la protéine MRPA est fréquemment induite lors de la sélection de mutants résistants à
l’antimoine ou à l’arsenic et son implication dans la résistance aux métalloïdes a été
démontrée. Chez Trypanosoma brucei, la surexpression de la protéine TbMRPA est
impliquée dans la résistance à l’arsenic in vitro (8, 218, 312), bien que la pertinence de sa
surexpression dans la résistance au mélarsoprol chez les souches cliniques reste encore à
préciser (8). Finalement, l’inactivation d’un homologue de MRP1 chez Caenorhabditis
elegans sensibilise le nématode à un choc d’arsenic (46).
47
2.2.4.4 Sous-famille ABCD
La sous-famille ABCD ne contient que des demi-transporteurs de topologie directe qui sont
localisés au niveau de la membrane des peroxisomes. Les protéines ABCD de la levure S.
cerevisiae (Pxa1 et Pxa2) et de l’humain (ABCD1-4) sont les plus étudiées. Les protéines
Pxa1 et Pxa2 s’assemblent en hétérodimères (315) au niveau de la membrane du
peroxisome et sont impliquées dans le transport d’acides gras à longues chaînes en vue de
leur éventuelle dégradation à l’intérieur des peroxisomes (155). Chez l’humain, des
mutations du gène ABCD1 sont responsables de l’adénoleucodystrophie liée au
chromosome X, une maladie neurodégénérative caractérisée par une diminution de la oxydation des acides gras à très longues chaînes associée à une augmentation de leurs
concentrations plasmatiques et de leur accumulation tissulaire (353). Il semblerait que les
protéines ABCD chez l’humain soient aussi impliquées dans le transport des acides gras à
longues chaînes et à très longues chaînes au niveau des peroxisomes.
2.2.4.5 Sous-familles ABCE et ABCF
Alors que la plupart des protéines ABC sont impliquées dans des fonctions de transport,
deux sous-familles de protéines ABC sont caractérisées par l’absence de domaines
transmembranaires. En effet, les sous-familles ABCE et ABCF regroupent des protéines
ABC qui sont constituées de deux domaines NBD fusionnés et qui sont principalement
impliquées dans la régulation de la traduction des ARNm.
2.2.4.5.1 Sous-famille ABCE
La sous-famille ABCE est représentée par la protéine ABCE1 qui compte parmi les
protéines les plus conservées au niveau de l’évolution. Cette protéine est retrouvée en copie
unique chez tous les eucaryotes et toutes les archéobactéries étudiés, à l’exception
d’Arabidopsis qui en possède deux copies. ABCE1 est composée de deux domaines NDB
associés à deux domaines de liaison Fe/S localisés en N-terminal de la protéine. Cette
protéine a initialement été identifiée en raison de son implication dans l’inhibition de la
ribonucléase L (35), une ribonucléase induite par l’interféron- chez les mammifères.
Cependant, l’ubiquité évolutive de ABCE1 associée au fait que le système interféron est
réservé aux mammifères suggère une fonction plus conservée. Ainsi, il a récemment été
48
démontré que ABCE1 est essentielle à la survie de la levure S. cerevisiae (107) en raison de
son implication dans l’assemblage du complexe de pré-initiation nécessaire à la traduction
des ARNm (107, 187, 393). Une fonction similaire au niveau de la traduction a été
observée chez le nématode C. elegans (16) ainsi que chez l’humain (61). Bien que ABCE1
démontre des fonctions similaires entre la levure et l’humain, la protéine humaine ne
semble pas être en mesure de complémenter le phénotype létal conféré par l’inactivation de
ABCE1 chez la levure (61), ce qui suggère qu’il pourrait y avoir des différences
fonctionnelles entre les organismes et ce, malgré la conservation évolutive de la protéine.
Néanmoins, ABCE1 semble également être essentielle chez les parasites puisque la
déplétion de son ARNm chez Trypanosoma brucei entraîne un arrêt de la croissance des
parasites associé à une diminution de la synthèse protéique (118) et des expériences
préliminaires suggèrent que son gène serait essentiel chez Leishmania (Leprohon, P., nonpublié).
2.2.4.5.2 Sous-famille ABCF
Tout comme la sous-famille ABCE, la sous-famille ABCF est composée de protéines
solubles à deux domaines NBD fusionnés qui sont impliquées dans la régulation de la
traduction. Cette sous-famille de protéines est bien conservée chez les eucaryotes, puisque
les protéines ABCF de la levure S. cerevisiae (qui sont les plus étudiées) possédent des
orthologues chez l’ensemble des organismes pour lesquels l’inventaire des protéines ABC a
été effectué. Ainsi, chez la levure, la protéine YEF3 est un facteur essentiel à l’élongation
de la traduction (360), la protéine GCN20 est impliquée dans l’activation de la kinase
GCN2 responsable de la phosphorylation du facteur eIF2 chez les cellules en pénurie
d’acides aminés (227, 370) et la protéine ARB1 est impliquée dans la voie de biogenèse des
ribosomes (106). Chez l’humain, la protéine ABC50 (ABCF1) s’associe avec le facteur
eIF2 et semblerait faciliter la formation du complexe tertiaire en favorisant l’incorporation
du méthionyl-ARNt (363). Le haut degré de conservation de cette sous-famille suggère que
les orthologues de différents organismes possèdent probablement des fonctions similaires et
un homologue de GCN20 a déjà été identifié chez Leishmania.
49
2.2.4.6 Sous-famille ABCG
La sous-famille ABCG est caractérisée par la topologie inversée des protéines qui la
composent. En effet, cette sous-famille est constituée uniquement de transporteurs pour
lesquels le domaine NBD est localisé en N-terminal du domaine TMD (Figure 2.2). Les
protéines ABCG ont initialement été identifiées chez Drosophila melanogaster où les
protéines White, Scarlet et Brown s’assemblent en hétérodimères pour transporter des
précurseurs de pigments de l’œil. Cinq protéines ABCG (ABCG1, ABCG2, ABCG4,
ABCG5, ABCG8) ont été identifiées chez l’humain. ABCG1 a été identifiée en raison de sa
similarité avec la protéine White de D. melanogaster. Quant à la protéine ABCG2, elle a
été identifiée en raison de sa surexpression chez une lignée cellulaire sélectionnée pour la
résistance à la doxorubicine qui ne démontrait pas de surexpression de MDR1 ou de MRP1
(108). Tout comme MDR1 et certaines MRP, ABCG2 transporte une variété de molécules
structurellement dissimilaires et joue un rôle important dans le phénotype MDR (108). Bien
que la protéine ABCG2 soit en mesure de transporter les médicaments sous forme nonconjugués, elle est aussi capable de transporter certains anions organiques conjugués au
glucoronate ou au sulfate (163).
Mis à part ABCG2, les protéines ABCG sont
habituellement impliquées dans le transport de stérols. En effet, les protéines ABCG1 et
ABCG4 sont impliquées dans le transport inverse de l’excès de cholestérol des
macrophages vers le foie (188, 380) alors que l’hétérodimère ABCG5/ABCG8 (138) est
impliqué dans l’excrétion biliaire du cholestérol (396, 397) et dans la prévention de
l’absorption des phytostérols au niveau de l’intestin. Chez Leishmania, une protéine ABCG
(LiABCG4) exprimée au niveau de la membrane plasmique du parasite est impliquée dans
le transport d’analogues de phosphatidylcholine et confère une résistance modeste aux
alkyl-phospholipides comme la miltefosine (56).
2.2.4.7 Sous-famille ABCH
La sous-famille ABCH contient des protéines de fonctions inconnues. Elles ont initialement
été identifiées chez D. melanogaster (91) et ont ensuite été observées chez d’autres
organismes (17, 293, 300, 317), mais pas chez les mammifères. Des analyses ont révélées
que ces protéines sont plus apparentées aux protéines ABC des procaryotes qu’à celles des
eucaryotes. Les protéines ABCH sont généralement des demi-transporteurs.
50
2.3 Résistance aux métalloïdes
Les métaux de transition (Cu, Zn), bien qu’essentiels à certaines réactions biochimiques et
enzymatiques, sont généralement toxiques pour les cellules lorsque présents à des
concentrations intracellulaires trop élevées. De même, l’accumulation intracellulaire de
certains métaux lourds (Pb, Cd) ou de métalloïdes comme l’antimoine et l’arsenic
représente un stress toxique aux cellules et les mécanismes impliqués dans le maintien de
l’homéostasie sont ubiquitaires. Les sources de contamination aux métalloïdes peuvent être
d’origine géologique, industrielle ou médicale. Alors que l’antimoine est utilisé dans le
traitement des leishmanioses, l’arsenic est utilisé en thérapie contre Trypanosoma brucei et
contre la leucémie (316). La présence d’arsenic dans l’environnement a favorisé le
développement de mécanismes de tolérance chez plusieurs organismes, des bactéries
jusqu’à l’homme (291). Bien que les mécanismes impliqués dans la toxicité et la résistance
des métalloïdes aient principalement été étudiés pour l’arsenic, les mécanismes identifiés
s’appliquent généralement aussi à l’antimoine. Ainsi, la résistance aux métalloïdes
pentavalent (arsenate (AsV), antimoniate (SbV)) et trivalent (arsénite (AsIII), antimonite
(SbIII)) est multifactorielle et implique plusieurs étapes : 1) l’entrée d’AsV par des
transporteurs de phosphate et l’entrée d’AsIII par certaines aquaglycéroporines; 2) la
réduction du métalloïde de la forme pentavalente en la forme trivalente par des réductases
spécifiques; 3) l’expulsion ou la séquestration intracellulaire de l’AsIII conjugué ou nonconjugué aux thiols, selon le système de transport et l’organisme étudié. Les sections
suivantes définiront les mécanismes biochimiques et moléculaires impliqués dans la
résistance aux métalloïdes chez divers organismes, en mettant l’emphase sur la résistance
chez Leishmania.
2.3.1 Chez les bactéries
L’AsV est chimiquement similaire au phosphate et la substitution de ce dernier au niveau
du métabolisme cellulaire serait l’une des principales causes de la toxicité de l’AsV. Chez
Escherichia coli, l’entrée de l’AsV exploite deux transporteurs de phosphate, les systèmes
Pit et Pst (384). Pour ce qui est de l’AsIII, son entrée directement à l’intérieur de la cellule
s’effectue par l’aquaglycéroporine GlpF (298). Les aquaglycéroporines constituent une
51
famille de canaux multifonctionels transportant des composés neutres comme le glycérol et
l’urée (2). Suivant l’entrée de l’AsV à l’intérieur de la cellule, la réductase ArsC (135, 173)
catalyse la réduction de l’AsV en AsIII. La protéine ArsC de E. coli utilise le glutathion et
la glutaredoxine comme co-facteurs (318) alors que celle de S. aureus utilise la
thioredoxine (172). Bien que l’AsIII soit davantage toxique que l’AsV, l’étape de réduction
est nécessaire à l’expulsion de l’arsenic par la cellule. La copie chromosomique de ArsC
chez E. coli fait partie d’un opéron contenant deux autres gènes codant pour le transporteur
membranaire ArsB et pour le répresseur ArsR. Le répresseur ArsR inhibe l’expression de
l’opéron en absence d’arsenic alors que le transporteur ArsB utilise le potentiel électrochimique membranaire pour expulser l’AsIII directement à l’extérieur de la cellule (revue
dans (291)). Un opéron similaire de trois gènes est retrouvé sur le plasmide pI258 de S.
aureus (174). Le plasmide R773 de E. coli contient un opéron Ars de cinq gènes qui
permettent d’obtenir des niveaux de résistance plus élevés que les opérons Ars de trois
gènes. En plus des gènes ArsR, ArsB et ArsC, ce plasmide code pour l’ATPase ArsA et
pour la métallochaperone ArsD. L’ATPase ArsA se lie à la protéine ArsB au niveau de la
membrane plasmique et agit comme sous-unité catalytique hydrolysant l’ATP pour
convertir le transporteur secondaire ArsB en transporteur primaire ArsAB (101). En ce qui
concerne la métallochaperone ArsD, elle contient des résidus cystéines liant l’AsIII et le
SbIII et augmente l’affinité de ArsAB pour les métalloïdes trivalents (207, 208).
2.3.2 Chez la levure
Chez la levure, l’entrée d’AsV s’effectue aussi par des transporteurs de phosphate et
l’entrée d’AsIII et de SbIII s’effectue par l’aquaglycéroporine Fps1 (392) ainsi que par
certaines perméases d’hexoses (210). Suivant son entrée à l’intérieur de la cellule, l’AsV
est réduit en AsIII par la réductase ACR2 (244). Bien que ACR2 utilise le GSH et la
glutaredoxine comme co-facteurs (245), cette protéine n’a aucun lien évolutif avec la
réductase ArsC de E. coli. Notamment, les similarités de séquence entre ACR2 et les
protéines tyrosine phosphatases suggèrent que ACR2 aurait évoluée à partir de la famille
des protéines tyrosine phosphatases dont fait partie CDC25a (246). Chez S. cerevisiae, le
gène ACR2 fait partie d’un groupe de trois gènes en tandem qui sont impliqués dans la
résistance aux métalloïdes (36). En plus de contenir ACR2, ce locus code pour deux autres
52
protéines, le facteur de transcription ACR1 et le transporteur membranaire ACR3 (391).
ACR3 est un transporteur secondaire impliqué dans l’expulsion de l’AsIII à l’extérieur de
la cellule. La délétion de ACR3 confère une sensibilité accrue à l’AsIII (mais pas au SbIII)
associée à une augmentation de son accumulation. L’existence d’un deuxième système de
transport d’AsIII a été démontrée chez S. cerevisiae (133). Le second système correspond
au transporteur de type ABC YCF1 (sous-famille ABCC) qui catalyse la séquestration de
l’AsIII à l’intérieur d’une vacuole intracellulaire. L’accumulation de métaux à l’intérieur de
la vacuole est dépendante de l’ATP et du glutathion (GSH) et le fait que la protéine YCF1
soit une pompe de conjugués de thiols (205, 206, 356) suggère que le substrat de YCF1 est
l’AsIII conjugué au GSH. Alors que la délétion de ACR3 cause une sensibilité spécifique à
l’AsIII, la délétion de YCF1 augmente la sensibilité des cellules pour l’AsIII et le SbIII
(133).
2.3.3 Chez les mammifères
Chez les mammifères, l’entrée d’AsIII et de SbIII s’effectue par les aquaglycéroporines
AQP7 et AQP9 (211, 213) ainsi que par le transporteur de glucose GLUT1 (212). Le
transporteur d’AsV n’a pas encore été identifié mais correspond probablement à un
transporteur de phosphate, par analogie avec les bactéries et la levure. Aucune réductase
d’AsV n’a été clairement identifiée jusqu’à maintenant, l’homologie de ces protéines avec
les protéines tyrosine phosphatases compliquant l’identification d’homologues de ACR2
par une approche génomique comparative. Chez les mammifères, on observe une
augmentation du niveau de GSH chez les cellules résistantes aux métalloïdes et la déplétion
du GSH à l’aide d’inhibiteurs spécifiques occasionne une augmentation de la sensibilité des
cellules envers l’antimoine et l’arsenic (62). De plus, des analogues du GSH qui ne
possèdent pas de groupement thiol libre ne supportent pas le transport de l’AsIII (bien
qu’ils supportent le transport de certains substrats de MRP1 (215)), ce qui suggère que
l’AsIII est transporté sous forme de conjugués de GSH (203). La surexpression de la
protéine de type ABC MRP1 (sous-famille ABCC) diminue la susceptibilité des cellules
aux métalloïdes (70, 332, 376) et son inactivation induit une augmentation de la sensibilité
à l’AsIII (9, 216). Enfin, l’expulsion de l’AsIII sous forme de conjugués de GSH par MRP1
a été confirmée par des études de transport à l’aide de vésicules membranaires inversées
53
(203, 399) et l’activité enzymatique d’une GSH S-transférase P1-1 (GSTP1-1) semble être
nécessaire à la détoxification de l’AsIII en favorisant la formation de conjugués d’AsIII
avec le GSH (203). Bien que la capacité de MRP1 à conférer la résistance aux métalloïdes
in vitro ait été bien démontrée, son implication dans la détoxification de l’arsenic in vivo est
moins bien définie puisque des souris chez lesquelles le gène MRP1 a été inactivé ne sont
pas plus sensibles à l’administration d’arsenic que des souris sauvages. Cependant, la forte
dose d’arsenic administrée lors de ces expériences, associée à la forte affinité et à la faible
capacité de MRP1 à transporter l’arsénite (203), pourrait expliquer cette disparité, à défaut
de quoi la redondance fonctionnelle de MRP1 avec d’autres MRP pourrait expliquer ce
phénomène. En effet, l’élimination de l’AsIII et du SbIII au niveau du foie est dépendante
du GSH (146-148, 178) et résulte du transport de conjugués de thiols par la protéine MRP2
(178, 203), alors que la protéine MRP5 est capable de conférer une faible résistance à
l’antimoine lorsqu’elle est surexprimée chez une lignée cellulaire de rein (233).
2.3.4 Chez Leishmania
La résistance aux médicaments chez Leishmania a principalement été étudiée à partir de
mutants résistants sélectionnés en laboratoire, bien qu’il y ait maintenant une tendance vers
l’étude de souches cliniques isolées de patients. Certains diront que l’étude de la résistance
chez les souches cliniques est plus susceptible de représenter les mécanismes
physiologiques impliqués dans la résistance, mais l’utilisation de souches de laboratoire est
tout de même justifiée. En effet, la sélection de mutants en laboratoire permet de travailler
avec une population clonale génétiquement bien définie et la disponibilité de la souche
parentale facilite l’élucidation des processus impliqués dans la résistance. Quant aux
populations de souches isolées de patients, elles sont souvent hétérogènes et leur culture en
laboratoire est susceptible de modifier le phénotype de résistance ou de sélectionner une
sous-population ne représentant pas nécessairement la population initiale, ce qui complique
le processus d’identification des mécanismes de résistance.
54
Figure 2.3 Mécanismes de résistance aux métalloïdes chez Leishmania.
Les travaux portant sur les mécanismes de résistance à l’AsIII chez Leishmania tarentolae
ont servi de paradigme à l’étude de la résistance à l’antimoine chez Leishmania. En effet,
Leishmania tarentolae a longtemps servi de modèle pour l’étude des mécanismes de
résistance aux médicaments pour des raisons de commodités de culture et en raison de son
absence de pathogénicité chez l’humain. De plus, sa proximité phylogénique avec les
espèces pathogènes implique des similarités au niveau de nombreuses voies métaboliques
et de plusieurs mécanismes de résistance aux médicaments. Finalement, aucun isotope
radioactif de l’antimoine n’était facilement disponible à l’époque où l’étude de la résistance
aux métalloïdes a été entreprise et l’73AsO2- a donc substitué à l’antimoine lors des études
55
de transport. Ainsi, les premiers travaux portant sur la résistance à l’AsIII chez Leishmania
ont permis l’élaboration du modèle présenté à la figure 2.3 qui implique plusieurs étapes: 1)
l’entrée de l’arsenic/antimoine sous forme trivalente ou pentavalente, 2) la réduction de
l’AsV/SbV en AsIII/SbIII, 3) une augmentation des niveaux de thiols intracellulaires, 4) la
conjugaison des métalloïdes trivalents avec le trypanothion, 5) la séquestration ou
l’expulsion des conjugués de thiols par l’action du transporteur de type ABC intracellulaire
MRPA ou d’un système d’efflux membranaire. La résistance aux métalloïdes est
multifactorielle chez Leishmania et chacune des étapes est nécessaire à l’obtention de hauts
niveaux de résistance.
2.3.4.1 Entrée des métalloïdes
Il a récemment été démontré par spectrométrie de masse que l’AsIII inhibe l’accumulation
intracellulaire de SbIII chez Leishmania tarentolae et que l’accumulation de ces
métalloïdes s’effectue probablement par le même système d’entrée (45). La transfection du
gène AQP1, qui code pour une aquaglycéroporine similaire à AQP9 chez l’humain,
provoque une augmentation de l’accumulation d’AsIII et de SbIII chez différentes espèces
de Leishmania (137, 225). De plus, le niveau d’expression d’AQP1 est fréquemment
diminué chez certains (mais pas tous) mutants résistants à l’AsIII ou au SbIII, alors que sa
surexpression provoque une augmentation de la sensibilité aux métalloïdes trivalents (137,
225). Enfin, l’inactivation d’une allèle d’AQP1 chez une souche sauvage de Leishmania
major occasionne une diminution de la sensibilité au SbIII et il est donc suggéré que cette
aquaglycéroporine serait responsable de l’entrée des métalloïdes trivalents chez Leishmania
(137). Quant à l’accumulation du Pentostam (SbV), elle n’est aucunement affectée par la
présence d’AsIII ou d’AsV, ce qui suggère que le Pentostam possèderait une voie d’entrée
spécifique chez Leishmania (45).
2.3.4.2 Réduction des métalloïdes pentavalent
Il est généralement bien accepté que l’antimoine pentavalent ne correspond pas à la forme
toxique du métal et que celui-ci doit être réduit en la forme trivalente afin d’acquérir ses
propriétés effectrices contre le parasite. Toutefois, le mécanisme de réduction et le site
exact de conversion demeurent obscurs. En effet, des études ont montré que seule la forme
56
intracellulaire des amastigotes (et non les amastigotes axéniques) sont sensibles à
l’antimoine pentavalent et suggèrent donc que la réduction surviendrait au niveau du
macrophage (287, 310). Paradoxalement, une autre étude a démontré que les parasites
amastigotes en culture axénique (mais pas les promastigotes) sont sensibles à l’antimoine
pentavalent et seraient donc en mesure de réduire le SbV suite à son entrée à l’intérieur du
parasite (313). Ces résultats ne sont pas nécessairement mutuellement exclusifs et la
réduction a possiblement lieu au niveau du macrophage et du parasite (123).
Bien qu’une partie de la réduction du SbV en SbIII semblerait survenir au niveau du
macrophage, Leishmania possède tout de même des enzymes qui pourraient être impliquées
dans l’étape de réduction. En effet, un homologue du gène ACR2 de S. cerevisiae et un
gène codant pour une réductase dépendante des thiols (TDR1) ont récemment été clonés
chez Leishmania. La protéine ACR2 de L. major possède une activité réductase pour l’AsV
et le SbV et sa surexpression au niveau de parasites amastigotes intracellulaires cause une
augmentation de la sensibilité au Pentostam (403). Quant à TDR1, elle démontre une
activité réductase dépendante du GSH pour les métalloïdes pentavalent et son expression
plus abondante chez les amastigotes par rapport aux promastigotes pourrait expliquer les
différences de sensibilité retrouvées entre les deux stades de vie du parasite face à
l’antimoine pentavalent (98). Finalement, une diminution de l’activité des enzymes
impliquées dans la réduction des métalloïdes pourrait entraîner une augmentation de la
résistance à l’antimoine pentavalent chez Leishmania et il a été démontré qu’une souche de
L. donovani ayant perdu son activité réductase présente un certain degré de résistance au
SbV (313).
2.3.4.3 Augmentation des thiols
La sélection de mutants résistants à l’AsIII entraîne une augmentation des niveaux
intracellulaires de thiols de faible poids moléculaire. En effet, les niveaux de cystéine, de
glutathion (GSH) et plus particulièrement de trypanothion (TSH) sont augmentés chez
l’ensemble des mutants résistants à l’AsIII (141, 199, 243). Le TSH, le thiol majeur chez
Leishmania (121), est composé de deux molécules de GSH conjuguées à une molécule de
spermidine et joue un rôle important dans le maintien du potentiel réduit à l’intérieur du
parasite. L’augmentation des niveaux de TSH résulte de l’amplification (141) et de la
57
surexpression (152) des gènes codant pour les enzymes impliquées dans les étapes
limitantes de la biosynthèse du GSH (-glutamylcystéine synthétase) et de la spermidine
(ornithine décarboxylase), respectivement. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de la
synthèse du GSH (buthionine sulfoximine) et de la spermidine (difluorométhylornithine)
cause une réversion du phénotype de résistance à l’AsIII chez les mutants sélectionnés en
laboratoire et chez les souches cliniques résistantes (54, 149), ce qui démontre l’importance
du TSH pour la résistance aux métalloïdes chez Leishmania. Cependant, une simple
augmentation du niveau de TSH chez une souche sauvage n’est pas en mesure de conférer
d’augmentation de la résistance aux métalloïdes et indique que de hauts niveaux de TSH,
bien qu’essentiels, ne sont pas suffisants à la résistance au SbIII chez Leishmania.
2.3.4.4 Séquestration intracellulaire des métalloïdes trivalents conjugués aux thiols
Deux systèmes de transport d’AsIII et de SbIII ont été identifiés chez Leishmania pour
lesquels une augmentation de l’activité a été observée chez les parasites résistants aux
métalloïdes. Le premier correspond au transporteur de type ABC MRPA (256) alors que le
deuxième correspond à un système d’efflux membranaire actif (102, 103). Le gène MRPA
est fréquemment amplifié chez différents mutants L. tarentolae hautement résistants à
l’AsIII suite à des événements de recombinaison homologue survenant au niveau de
séquences répétées (142, 258). Des expériences de transfection et de délétion génique ont
démontré que le transporteur MRPA est impliqué dans la résistance à l’AsIII et au SbIII
chez Leishmania et que le niveau de résistance conféré par la surexpression de MRPA est
variable selon l’espèce étudiée. Bien que MRPA soit le premier gène dont l’amplification a
été corrélée avec la résistance à l’AsIII chez Leishmania (52, 263), son amplification ne
cause qu’une modeste augmentation de la résistance et n’explique pas les hauts niveaux de
résistance observés chez les mutants sélectionnés en laboratoire. Ainsi, d’autres facteurs
sont essentiels à l’obtention de hauts niveaux de résistance à l’AsIII et au SbIII chez
Leishmania.
L’augmentation des niveaux de TSH combinée à l’amplification de MRPA confèrent une
synergie permettant d’obtenir de hauts niveaux de résistance aux métalloïdes. Cette
synergie nécessite toutefois un génotype particulier puisqu’elle n’est retrouvée que chez les
58
souches révertantes (un mutant résistant cultivé en absence d’AsIII pour une période
prolongée) et non chez les souches sauvages. Ainsi, il est clair qu’au moins une autre
mutation nécessaire à l’obtention de hauts niveaux de résistance est présente chez le mutant
et que cette mutation est stable puisqu’elle demeure présente chez la souche révertante. Par
analogie avec les mécanismes de résistance à l’AsIII chez l’humain qui semblent nécessiter
la présence d’une glutathion S-transférase (GST), il a été proposé que la mutation
manquante corresponde à une trypanothion S-transférase (TST). En effet, la fonction de
MRPA dans la résistance consiste à transporter les métalloïdes conjugués aux thiols à
l’intérieur d’une vésicule de détoxification intracellulaire (197) et une modification de
l’activité TST chez les parasites résistants pourrait être nécessaire à la formation du substrat
transporté par MRPA. Des activités TST ont déjà été détectées chez Leishmania (377, 378).
Bien qu’une augmentation de l’activité TST n’ait pas été observée chez des souches de L.
tarentolae résistantes au SbIII (390), une relocalisation de la protéine pourrait être
impliquée dans la résistance (203).
2.3.4.5 Expulsion des métalloïdes trivalents conjugués aux thiols
Des études de transport effectuées à l’aide d’arsénite radioactif (73AsO2-) ont démontré une
diminution de l’accumulation chez les parasites résistants aux métalloïdes par rapport aux
parasites sensibles (103), bien qu’il semble que ce ne soit pas toujours le cas (45). Cette
diminution d’accumulation est indépendante de MRPA et résulte de l’expulsion d’AsIII
conjugué au TSH à l’extérieur de la cellule par un système d’efflux membranaire actif (102,
262). Des vésicules membranaires inversées préparées à partir de mutants résistants à
l’AsIII n’accumulent pas plus de radioactivité que celles préparées à partir de souches
sensibles (102), ce qui suggère que le système d’efflux ne représente pas l’étape limitante
de l’expulsion des métalloïdes et que la pompe d’efflux n’est probablement pas
surexprimée chez les parasites résistants. Par analogie avec MRPA, il est possible que
l’étape limitante corresponde à la formation du substrat transporté par le système d’efflux et
que la diminution d’accumulation observée chez les mutants résistants nécessite au moins
une mutation supplémentaire. La dépendance du système d’efflux pour le TSH suggère
fortement que ce système puisse correspondre à une protéine ABCC. Le gène MRPA fait
partie d’une famille de gènes comprenant au moins quatre autres membres (PgpB, PgpC,
59
PgpD, PgpE) (198, 256) et il a été suggéré que le système d’efflux puisse être codé par un
des homologues de MRPA.
2.3.4.6 Autres mécanismes de résistance
La surexpression de la protéine HSP70 est observée chez certains parasites résistants à
l’antimoine et une augmentation de l’expression de la protéine peut être induite suite à
l’exposition de parasites sauvages à un choc au SbIII. Il semblerait que la surexpression de
HSP70 ne soit pas directement impliquée dans la résistance mais permettrait plutôt aux
parasites de mieux tolérer la présence de SbIII (44). Aussi, une protéine appartenant à la
famille de protéines contenant des répétitions riches en leucine (LLRs) est en mesure de
conférer une résistance modeste au SbIII lorsque surexprimée chez les amastigotes (131).
La fonction de cette protéine dans la résistance est inconnue mais il sera intéressant
d’effectuer des expériences d’immunoprécipitations pour identifier ses partenaires.
2.3.4.7 Mécanismes de résistance chez les souches cliniques
Peu d’études ont jusqu’à maintenant rapporté les mécanismes impliqués dans la résistance
des souches cliniques réfractaires aux traitements à base d’antimoine pentavalent. Certaines
de ces études ont démontré que les mécanismes de résistance caractérisés chez les mutants
sélectionnés en laboratoire sont aussi présents (149, 242), ou partiellement présents (94),
chez les souches cliniques, alors que d’autres ont démontré l’implication de nouveaux
mécanismes de résistance, comme une diminution de l’apoptose engendrée par l’antimoine
(374).
60
CHAPITRE 3. LE GÉNOME DE LEISHMANIA
3.1 Séquençage du génome
Les espèces de Leishmania de l’Ancien-monde (L. major et L. infantum) possèdent 36
paires de chromosomes variant de 0.28 à 2.8 Mb (386) alors que les espèces du Nouveaumonde possèdent 34-35 paires de chromosomes en raison de la fusion de certains
chromosomes (43). Le séquençage du génome de Leishmania major Friedlin (165) a été
complété en 2005 et a rapidement été suivi du séquençage des génomes de Leishmania
infantum et de Leishmania braziliensis en 2007 (268). Le génome haploïde de Leishmania
major compte environ 33 Mb, possède un contenu G-C de 59.7% et démontre une densité
génique moyennement élevée avec un gène tous les 3.5 kb. On y dénombre une quarantaine
de pseudogènes, plus de 900 gènes codant pour des ARNs et un peu moins de 8300 gènes
codant pour des protéines. Alors que la plupart des gènes des petites familles multigéniques
sont regroupés en tandem et semblent avoir évolué suite à des événements de duplication
génique, les gènes des plus grandes familles sont organisés seuls ou en tandem au niveau de
plusieurs loci. La très grande majorité des gènes encodant des protéines ne contiennent pas
d’introns et une fonction a été prédite pour environ 36% d’entre eux (165). Malgré une
divergence évolutive estimée à 20-100 millions d’années, l’architecture et la synténie du
génome des trois espèces séquencées sont très bien conservées (268). En effet, on ne trouve
que très peu de gènes spécifiques à l’une ou à l’autre des espèces, avec 5 gènes spécifiques
à L. major, 26 gènes spécifiques à L. infantum, 47 gènes spécifiques à L. braziliensis et
environ 50 gènes retrouvés chez L. major et L. infantum mais absents de L. braziliensis. La
force déterminante de l’évolution de ces gènes spécifiques semble être la formation de
pseudogènes puisque pour 80% d’entre eux on peut retrouver une séquence dégénérée au
niveau de la région synténique correspondante au gène spécifique chez les espèces ne
possédant pas de copie fonctionnelle du gène (268).
61
3.2 Expression génique
L’expression génique chez Leishmania comporte quelques particularités distinctives par
rapport aux autres organismes (Figure 3.1). Chez la plupart des organismes, l’expression de
la majorité des gènes est contrôlée au niveau de l’initiation de la transcription grâce à des
séquences promotrices auxquelles se lient des facteurs régulateurs. De plus, les gènes
codant pour les ARNm sont transcrits par l’ARN polymérase II alors que les ARN
ribosomaux et les ARN de transfert sont transcrits par les ARN polymérases I et III,
respectivement. Chez Leishmania, la transcription des ARNm par l’ARN polymérase II a
été démontrée mais aucune séquence promotrice n’a été identifiée en amont des gènes. De
plus, une analyse du génome a démontré que Leishmania possède beaucoup moins de
facteurs régulateurs de la transcription que la plupart des eucaryotes (165), ce qui corrèle
avec le contrôle post-transcriptionnel de l’expression des gènes chez ce parasite (64). Le
génome de L. major est organisé en 133 unités polycistroniques qui peuvent contenir des
dizaines ou des centaines de gènes codant pour des protéines sans fonctions apparentées sur
un même brin d’ADN (165, 249, 387). Ces unités de transcription peuvent être
convergentes ou divergentes et peuvent s’étendre sur plus de 1200 kb. Les jonctions entre
les unités polycistroniques sont séparées par des régions « changement de brin » mesurant
de 0,9 à 14 kb (358). Les ARN pré-messagers polycistroniques sont maturés en ARNm par
un processus d’épissage en trans qui implique l’ajout d’une séquence d’ARN de 39-42
nucléotides appelée « mini-exon » en 5’ de chacun des ARNm. Ce processus s’effectue
dans les régions intergéniques au niveau d’un site accepteur constitué d’un dinucléotide AG
précédé d’une séquence riche en pyrimidines (85, 160) et est couplé à la polyadénylation de
l’ARN messager du gène situé en amont (196).
3.3 Modulation de l’expression génique
La pression de sélection médicamenteuse et le développement de résistance qui en résulte
nécessite souvent une modification de l’expression génique chez les cellules résistantes.
Cependant, puisque le contrôle de l’expression des gènes s’effectue au niveau posttranscriptionnel chez Leishmania, la modulation de l’expression génique nécessaire à
l’acquisition de la résistance chez ce parasite résulte souvent de l’amplification des gènes
62
d’intérêt par la formation d’amplicons extrachromosomiques. Bien que la modification du
nombre de copies est un mécanisme fréquemment utilisé pour augmenter l’expression
génique chez Leishmania, l’expression différentielle de certains gènes sans modification du
nombre de copies a déjà été observée à quelques reprises (145, 152, 225).
Figure 3.1 Organisation de l’expression génique chez Leishmania. Tiré de Ouellette,
2003 (259).
3.3.1 Plasticité du génome
Le génome haploïde de Leishmania est suffisamment petit pour permettre la détection
d’événements d’amplification génique par l’analyse comparative d’ADN génomique de
parasites sensibles et résistants digérée et migrée en parallèle sur gels d’agarose (65, 257).
Cette stratégie a initialement été utilisée pour la détection d’amplification génique chez des
parasites promastigotes sélectionnés pour la résistance au MTX (65) et s’est ensuite avérée
63
utile pour la détection de gènes amplifiés chez plusieurs mutants résistants à différents
médicaments utilisés en thérapie contre Leishmania (150, 153, 319, 321). En plus d’être
générés chez les parasites résistants aux médicaments, des amplicons extrachromosomiques
ont également été observés chez des souches soumises à un stress nutritif (294) et lors de
du maintien des parasites en culture (294, 307). L’amplification de séquences d’ADN chez
Leishmania peut aussi être observée au niveau de chromosomes entiers. En effet, bien que
Leishmania soit un organisme diploïde, certaines souches aneuploïdes démontrent une
triploïdie pour le chromosome 1 (347). De plus, l’inactivation de gènes essentiels chez
Leishmania résulte en la génération de copies supplémentaires du gène ciblé, soit par la
sélection de copies supplémentaires du chromosome entier (80, 226) ou par la génération
d’amplicons extrachromosomiques (132). Cette tolérance de Leishmania aux changements
de ploïdie est utilisée comme évidence de l’essentialité des gènes. La tendance de
Leishmania à recourir au besoin à l’amplification génique afin d’augmenter l’expression de
certains gènes d’intérêts pourrait être une conséquence de l’absence de contrôle de
l’expression des gènes au niveau de la transcription chez ce parasite. Les amplicons
extrachromosomiques générés peuvent être circulaires ou linéaires et leur formation
survient suite à des événements de recombinaison homologue au niveau de séquences
répétées retrouvées de part et d’autre de la région amplifiée (142, 143, 258). Il est possible
d’isoler les amplicons circulaires par lyse alkaline et de visualiser les amplicons linéaires
par migration de l’ADN génomique sur gel d’agarose à champs pulsés (257). La présence
de fragments d’ADN amplifiés chez les parasites résistants aux médicaments suggère un
lien circonstanciel avec le phénotype de résistance. Avant l’achèvement de la séquence du
génome de Leishmania, il était nécessaire de procéder au sous-clonage de fragments
d’ADN de l’amplicon à l’aide de vecteurs d’expression de Leishmania et de vérifier l’effet
de leur surexpression sur le phénotype de susceptibilité d’une souche sensible jusqu’à
l’identification du ou des fragments impliqués dans le phénotype de résistance (53, 264).
Avec la disponibilité de la séquence du génome, il est maintenant possible d’identifier les
gènes présents sur un amplicon en élucidant premièrement la séquence d’un petit fragment
d’ADN d’amplicon pour ensuite identifier les gènes candidats au niveau de la région
correspondante du génome.
64
3.3.2 Biopuces à ADN
Différentes techniques ont été développées pour détecter la modulation de l’expression des
gènes chez Leishmania (60, 184, 195, 388) et depuis quelques années les puces à ADN sont
utilisées dans le domaine de la parasitologie. Des sondes spécifiques sont fixées sur un
support solide (lame de verre) et sont utilisées pour l’hybridation compétitive d’ADN
complémentaires (cDNA) marquées avec des fluorophores, ce qui permet d’évaluer
l’expression relative des gènes entre deux conditions. Une variété de sondes ont été
utilisées au cours de différentes études transcriptomiques chez Leishmania. En effet, des
cDNA, des fragments d’ADN génomique, des fragments PCR et des oligonucléotides ont
été utilisés pour l’analyse de l’expression des gènes entre les différents stades de vie du
parasite (3, 13, 235, 288, 302), entre différentes manifestations cliniques (297) et chez des
parasites résistants aux médicaments (113, 145, 202). La disponibilité de la séquence du
génome de Leishmania permet maintenant d’exploiter la technologie des puces à ADN du
génome complet du parasite pour étudier l’expression génique à l’échelle génomique (158,
201, 301, 364). En plus de servir à l’étude de l’expression des transcrits, l’utilité des puces
à ADN pour la détection d’événements d’amplification génique a été démontrée chez
Leishmania (113, 145, 364) et cette technique offre aussi l’avantage de pouvoir détecter la
délétion de gènes (364), ce que l’analyse des gels d’agarose permet difficilement de faire.
3.3.3 Approches protéomiques
Tout comme les puces à ADN, l’utilisation d’approches protéomiques à grande échelle est
en croissance dans le domaine de la parasitologie. En effet, la technologie des gels de
protéines en deux-dimensions, où les protéines sont d’abord séparées selon leur charge pour
ensuite être séparées en fonction de leur masse, est utilisée pour étudier l’expression des
protéines chez les parasites résistants aux médicaments (109, 110), ou entre les différents
stades de vie des parasites (114, 235). Un avantage de l’approche protéomique réside en sa
capacité à détecter les modifications post-traductionnelles (109), qui peuvent parfois être
associées à la résistance (128). Cependant, un désavantage de l’approche par gels de
protéines en deux-dimensions consiste en la limitation de la représentation du protéome, ce
qui requiert souvent l’utilisation de techniques de fractionnement supplémentaires afin
d’obtenir une représentation plus complète de l’expression du génome.
65
CHAPITRE 4. PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES
ET OBJECTIFS
Problématique
Les différentes pathologies causées par le genre Leishmania sont responsables d’un taux de
mortalité et de morbidité considérable. En absence de vaccins, le traitement des
leishmanioses repose sur l’administration d’agents thérapeutiques. L’arsenal de molécules
utiles en thérapie est limité et le développement de nouveaux médicaments est un processus
lent, coûteux et jugé non-prioritaire. Bien que les composés à base d’antimoine pentavalent
demeurent le traitement de première ligne au niveau de plusieurs régions géographiques,
leur efficacité est compromise par l’augmentation du nombre de cas d’infections
réfractaires. La résistance à l’antimoine est multifactorielle chez Leishmania et implique
une diminution de l’entrée, une séquestration intracellulaire et une augmentation de
l’efflux. Bien que plusieurs mécanismes de résistance aient été identifiés, ceux-ci ne
permettent pas toujours d’expliquer la résistance observée chez les différents mutants
résistants. Ainsi, la disponibilité de la séquence du génome de Leishmania favorise
maintenant l’étude des mécanismes de résistance à l’échelle génomique et permet d’évaluer
l’implication de familles de gènes entières dans la résistance.
Hypothèses
La sous-famille des protéines ABCC est impliquée dans la détoxification des métalloïdes
chez différents organismes, dont Leishmania. En effet, il a déjà été démontré que la
protéine intracellulaire MRPA est impliquée dans la séquestration de l’antimoine conjugué
au trypanothion chez ce parasite. MRPA fait partie d’une famille de gènes pour lesquels la
fonction dans la résistance à l’antimoine n’a que partiellement été évaluée. Ainsi, un
homologue de MRPA pourrait correspondre à un système d’efflux d’antimoine localisé au
niveau de la membrane plasmique du parasite. De plus, l’utilisation de souches mutantes
66
résistantes et de souches révertantes pour l’étude de la résistance à l’antimoine a clairement
indiqué la présence de mutations impliquées dans la résistance qui n’ont toujours pas été
identifiées.
Objectifs
Les travaux présentés dans cette thèse avaient comme objectif principal l’élucidation de
nouveaux mécanismes impliqués dans la résistance à l’antimoine chez le parasite
Leishmania.
Plus spécifiquement, la première partie (Chapitre 5) avait comme objectifs 1) d’identifier
toutes les protéines appartenant à la superfamille des protéines ABC qui sont encodées dans
le génome du parasite, 2) d’effectuer la classification de ces protéines parmi les différentes
sous-familles (ABCA-ABCH) à l’aide d’analyses phylogéniques et 3) d’étudier les
caractéristiques évolutives majeures de ces protéines chez Leishmania à l’aide d’analyses
phylogéniques comparatives.
La deuxième partie (Chapitre 6) avait comme objectif d’évaluer l’implication de la sousfamille ABCC dans la résistance à l’antimoine chez Leishmania à l’aide d’expériences de
surexpression génique et de localisation de protéines.
La troisième partie (Chapitre 7) avait comme objectif d’évaluer le profil d’expression
génique différentiel associé au phénotype de résistance à l’antimoine chez Leishmania à
l’aide de puces à ADN du génome complet du parasite dans le but d’identifier de nouveaux
mécanismes de résistance à l’antimoine.
67
CHAPITRE 5. Modulation de l’expression des gènes
ABC au cours du cycle de vie de Leishmania et chez les
parasites résistants à l’antimoine.
Ce chapitre a fait l’objet d’une publication dans le revue Eukaryotic Cell (2006
Oct;5(10):1713-25) et est constitué de la version finale telle que publiée.
5.1 Résumé
Le superfamille des protéines ATP-binding cassette (ABC) représente l’une des plus larges
familles de protéines conservées au cours de l’évolution. Le récente complétion de la
séquence du génome de Leishmania nous a permis de procéder à l’identification et à la
classification des protéines ABC qui y sont codées. La séquence du génome a révélé la
présence de 42 gènes codant pour des protéines appartenant à la superfamille ABC, avec
des représentants de chacune des sous-familles (ABCA-ABCH) identifiées chez les
eucaryotes. Une analyse comparative a démontré la présence d’un complément de gènes
ABC identique entre Leishmania major et Leishmania infantum, en plus de permettre
l’identification de gènes ABC orthologues au niveau du génome des parasites apparentés
Trypanosoma brucei et Trypanosoma cruzi. Des puces à ADN ciblées ont été générées pour
l’étude de l’expression des gènes ABC entre les différents stades de vie du parasite. Ainsi,
deux gènes ABC (ABCA3 et ABCG3) ont démontré une surexpression significative chez les
amastigotes, alors qu’un seul gène ABC (ABCF3) a démontré une surexpression
significative chez les promastigotes. L’étude transcriptomique par puces à ADN ciblées a
aussi révélé la surexpression de trois gènes ABC (ABCA3, ABCC3, ABCH1) chez deux
mutants résistants à l’antimoine sélectionnés de façon indépendante comparativement à la
souche parentale sensible. Les résultats obtenus à l’aide des puces à ADN ciblées ont été
confirmés par PCR en temps réel quantitatif. Cette étude offre une classification des
protéines ABC de Leishmania et une analyse phylogénique rigoureuse qui pourra servir de
base aux études fonctionnelles qui seront éventuellement entreprises avec cette importante
famille de protéines.
68
5.2 Article
Modulation of Leishmania ABC protein gene expression through life stages and
among drug resistant parasites
Philippe Leprohon, Danielle Légaré, Isabelle Girard, Barbara Papadopoulou and Marc
Ouellette*
Centre de Recherche en Infectiologie et Division de Microbiologie, Université Laval,
Québec, Canada.
* Corresponding author: Marc Ouellette Ph.D.
Centre de Recherche en Infectiologie
2705 boul. Laurier
Québec, Québec
G1V 4G2
Tel : 1-418-654-2705
Fax : 1-418-654-2715
e-mail : [email protected]
Running title: ABC proteins of Leishmania
Keywords: ABC proteins; drug resistance; phylogeny; Leishmania; DNA microarrays
69
Abstract
The ATP-binding cassette (ABC) protein superfamily is one of the largest evolutionary
conserved families and is found in all kingdom of life. The recent completion of the
Leishmania genome sequence allowed us to analyze and classify its encoded ABC proteins.
The complete sequence predicts a dataset of 42 ORFs coding for proteins belonging to the
ABC superfamily, with representative members of every major subfamily (ABCA to
ABCH) commonly found in eukaryotes. Comparative analysis showed that the same ABC
dataset is found between Leishmania major and Leishmania infantum and that some
orthologues are found in the genome of the related parasites Trypanosoma brucei and
Trypanosoma cruzi. Customized DNA microarrays were made to assess ABC gene
expression profiling throughout the two main Leishmania life stages. Two ABC genes
(ABCA3 and ABCG3) are preferentially expressed in the amastigote stage whereas one
ABC gene (ABCF3) is more abundantly expressed in promastigotes. Microarray-based
expression profiling experiments also revealed that three ABC genes (ABCA3, ABCC3 and
ABCH1) are overexpressed in two independent antimony-resistant strains compared to the
parental sensitive strain. All microarray results were confirmed by real-time RT-PCR
assays. This work provides a thorough phylogenic classification of the Leishmania ABC
proteins and sets the basis for further functional studies on this important class of proteins.
70
Introduction
ATP-binding cassette (ABC) proteins form the largest family of transmembrane proteins
and are found in all living organisms (31). Most of these proteins are involved in the ATPdependent transport of a variety of molecules across biological membranes, including
amino acids, sugars, peptides, lipids, ions and chemotheurapeutic drugs [reviewed in (31)].
The functional significance of this family of proteins is reflected by the diversity of
Mendelian and complex disorders associated with human genetic diseases involving ABC
genes [reviewed in (7) and (12)]. Proteins of the ABC superfamily contain in their
sequences a strongly conserved nucleotide-binding domain (NBD) with three major motifs
(13, 31). Along with the Walker A and B motifs found in many ATPase families, the NBD
is composed of a characteristic ABC signature, the “C” motif, which is located between the
two Walker motifs, just upstream of the Walker B site (33). Furthermore, in addition to the
nucleotide-binding domains, ABC proteins involved in transport also contain
transmembrane domains (TMD) composed of multiple transmembrane -helices. A
functional transporter appears to require a minimum of at least two NBDs coupled with two
TMDs. Eukaryotic ABC transporter genes are organized either as full transporters
containing two TMDs and two NBDs, or as half transporters containing only one of each
domain encoded on the same molecule (33). The half transporter molecules need to
assemble as homodimers or heterodimers in the membrane to create a functional
transporter. Some ABC proteins apparently not involved in transport activities but
implicated in other conserved cellular processes do not have any TMD and are composed of
two NBDs fused on the same molecule. On the basis of gene structure similarity and
homology in the NBD sequence, eukaryotic ABC proteins can be divided into eight
different subfamilies (ABCA to ABCH), seven of which (ABCA to ABCG) are found in
the human genome (2). The ABCH subfamily has been identified for the first time in
Drosophila (14).
In the protozoan parasite Leishmania, several ABC transporters have already been
characterized. At least 20 different Leishmania species are responsible for a variety of
clinical manifestations ranging from self-healing skin ulcers (e.g. L. major) to lifethreatening visceral diseases (e.g. L. donovani, L. infantum) (30). Human leishmaniasis has
71
a prevalence of 12 million cases, an estimated population of 350 million at risk and an
incidence of 2 million new cases annually (43). Leishmania has a relatively simple life
cycle with two main stages, the flagellated promastigotes, which is found in the gut of the
insect vector, and the intracellular amastigotes, living inside macrophages of the
mammalian host. No effective vaccine is yet available against this parasite and its control
relies primarily on chemotherapy. Antimony containing compounds such as sodium
stibogluconate (Pentostam) and N-methylglucamine (Glucantime) remain the mainstay
against all forms of Leishmania infections (43), despite the emergence of antimonyresistant parasites now described on a frequent basis in several endemic regions (27, 41,
48).
The first ABC protein identified in Leishmania is MRPA (PGPA) (45), a member of the
ABCC subfamily able to confer antimony resistance by sequestering thiol-metal conjugates
in an intracellular vesicle (40). MRPA was shown to be part of a large gene family with at
least four other members (39). More recently, another ABCC member named PRP1 was
shown to confer pentamidine resistance and antimony cross-resistance when overexpressed
in L. major (11). Among the ABCB subfamily, MDR1 was found to be amplified in L.
donovani mutants selected for vinblastine or daunomycin resistance and was shown to
confer multidrug resistance by transfection experiments (9, 10, 25, 29, 36). Furthermore,
the overexpression of another ABCB protein, named MDR2, was shown to decrease
accumulation of 5-fluorouracil in L. amazonensis (35). Finally, two proteins of the ABCA
subfamily termed LtrABC1.1 (46) and LtrABCA2 (5) were recently implicated in
phospholipid trafficking and reduced infectivity when overexpressed in L. tropica.
The availability of the genome sequences of Leishmania major (34) and Leishmania
infantum (www.genedb.org) now enabled database mining and identification of the
complete ABC protein dataset in Leishmania. Transcriptional analysis of these family
members could provide further insights on the role of these related proteins in the biology
of the parasite and in drug resistance. Low-density DNA microarrays are well suited for
that purpose giving their relative simplicity and reproducibility. As a prelude to and
resource for future functional genomic investigations of this relevant group of proteins, we
present here a complete inventory and phylogenetic classification of the ABC proteins
72
found in the protozoan parasite Leishmania. Moreover, microarray-based expression
analyses were conducted to evaluate the ABC gene expression throughout parasite life
stages and in parasites resistant to antimonial drugs.
73
Materials and Methods
Database Searches and Sequence Analyses
The putative L. major ABC genes were retrieved from the GeneDB database
(www.genedb.org) using the Motif Search tool with the ABC signature (“C”) motif as
query sequence. ORFs identified as encoding proteins containing such motif were then
screened for the presence of flanking Walker A and Walker B conserved sequences.
Furthermore, a series of BLAST searches were conducted on L. major predicted proteins in
GeneDB using the model ABC domain ABC_tran (accession PF00005) as a query. A series
of BLAST searches were done on the assembled contig sequences of L. major Friedlin until
no more new ABC coding genes could be identified. Finally, the complete L. major ABC
gene dataset was used as query for multiple BLAST searches in the GeneDB database to
reveal the complete sequence of the L. infantum orthologues. The amino acid sequence of
nucleotide-binding domains of ABC proteins were extracted by performing Pfam searches
at the Sanger Institute website (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/). Comparisons of the
Leishmania ABC genes to homologues present in other sequenced eukaryotic genomes
were made using BlastP at the NCBI website. Sequences were assigned as orthologues if
they showed the highest score in BLAST search analyses and if they clustered on the same
tree branch in phylogenetic analyses. The ABC sequences of Trypanosoma brucei and
Trypanosoma cruzi were retrieved using the Pfam browse option at GeneDB and using
BLAST searches with the PF00005 motif as a query.
Phylogenetic Analyses
Multiple sequence alignments were performed on the complete protein sequences or on the
amino acid sequences of the ATP-binding domains using ClustalW (56) with the default
settings. The two NBDs of full length ABC proteins were treated independently for
alignments. If needed, gaps were removed from the alignment using the BioEdit software
(28). The resulting multiple sequence alignments were subjected to analyses using the
maximum parsimony algorithm and the neighbour-joining algorithm (49) with the Poisson
74
correction distance method of the MEGA package version 3.1 (38). The robustness of the
neighbour-joining tree was assessed by 1000 bootstrap resamplings.
Cell Lines
Leishmania infantum amastigotes were kept in culture as axenic amastigotes at 37oC with
5% CO2 in MAA medium as described (52). L. infantum promastigotes were derived from
the axenic amastigotes by culturing at 25oC in the same medium adjusted to pH 7.0. The L.
infantum Sb2000.1 mutant selected for Sb(III) resistance was described previously (20).
The L. infantum promastigote Sb4000.4 mutant was selected for Sb(III) resistance using a
stepwise selection until it was resistant to 4000 M.
Array Generation
The microarrays were generated by arraying fifty-one 70-mers oligonucleotides
representing L. infantum ATP-binding cassette transporters and different controls (GAPDH
and -actin as housekeeping control genes). The Leishmania infantum ABC protein coding
gene (LinJ12.0790) was not identified at the time the arrays were generated. Furthermore,
the BLASTn searches done on the L. infantum assembled contig sequences available at the
time failed to distinguish between the ABCG1, ABCG2 and ABCG3 gene sequences.
Therefore, an oligonucleotide recognizing these three ABCG genes was designed. Finally,
the genes LinJ11.1200 and LinJ11.1230 are 100% identical and thus one oligonucleotide
had been synthesized for the two genes. The gene-specific oligonucleotides were chosen in
the last 1000 nucleotides of each ABC gene and were designed to recognize both L. major
and L. infantum genes. BLAST searches against the Leishmania genome were conducted to
assess the theoretical specificity of all designed 70-mers. Along with the ABC specific
oligonucleotides, fifteen genes of the Leishmania trypanothione biosynthesis pathway were
represented on the array as PCR fragments generated as described (26). The 70-mers
oligonucleotides and PCR fragments were dried in a 384 wells plate prior of being
resuspended in a 50% DMSO solution. The DNA was denatured at 95oC and printed onto
75
CMT-GAPS II
TM
(Corning) or SuperchipTM (ERIE Scientific) slides using a SDDC-2
Arrayer (Virtek) in a constant 60% humidity atmosphere. Each oligonucleotide and PCR
fragment was printed in 24 replicates. Slides were UV cross-linked at 600mJ (Stratalinker)
and printing quality control of each slide batch was assessed by performing a TOTO-3
iodine staining (Molecular Probes).
RNA Isolation
Total RNA was isolated from 1x107 Leishmania cells during the mid-log phase of growth
using the TRIzol reagent (Invitrogen) as described by the manufacturer. The RNAs were
treated with RNase-free DNAse I (Ambion) to avoid any genomic contamination and
further purified using RNeasy columns (QIAGEN). The quality and quantity of RNA were
assessed using RNA 6000 Nano Assay chips on a Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies).
The major criterion for RNA integrity was the presence of three clear ribosomal peaks
(18S, 24S and 24S) and the absence of RNA degradation.
RNA Labeling and Microarray Hybridization
The RNA conversion to cDNAs and the hapten-antibody-based microarray detection was
done with the MICROMAX TSATM labeling and detection kit (Perkin Elmer) according to
the supplier’s recommendations. For each reaction, fluorescein-labeled and biotin-labeled
cDNAs were synthesised from 2g of purified total RNA previously mixed with two
exogenous mRNAs (CAB1 at 2 pg/l and NAC1 at 2 pg/l from Arabidopsis thaliana;
Stratagene) added as external standards to adjust for variations in the incorporation
efficiency of the modified nucleotides and for differences in first strand cDNA synthesis
reaction. The labeled cDNA were precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol,
dried and resuspended each in 15 l hybridization buffer (50% formamide, 5X SSC, 0,1%
SDS, 25 g/ml salmon sperm DNA, 460 g/ml yeast tRNA). Two differentially labeled
target cDNAs were pooled for hybridization overnight at 42oC under a coverslip (ERIE
76
Scientific) in a hybridization chamber (Corning). After hybridization, the microarrays were
washed once with 2X SSC, 0.1% SDS preheated at 42oC and then with 1X SSC, 0.2X SSC
and 0.05X SSC at room temperature. Hybridization signals from fluorescein-labeled and
biotin-labeled cDNA were sequentially detected on the microarray using Cy3-Tyramide
and Cy5-Tyramide reagents, respectively. Each hybridization experiment was performed in
four replicates using four independent RNA extractions and two dye-swapping.
Microarray Data Processing and Analysis
Detection of the Cy5 and Cy3 signals was sequentially performed on a ScanArray 4000XL
scanner (Perkin-Elmer) at a 5 m resolution. The signal intensity data were extracted from
the primary scanned images using the GenePix Pro 6.0 software (Axon Technologies). The
saturated spots, those with an unusual shape and spots showing a signal to noise ratio less
than 3 were flagged as bad spots and were excluded from further analysis. Signal intensity
data were exported into the GeneSpringR7.2 software. Local background was subtracted
from the intensity value of each spot. The Cy3/Cy5 ratio of each spot was normalized with
Cy3/Cy5 ratios of the housekeeping genes (GAPDH and -actin) and of the A. thaliana
NAC1 and CAB1 spikes. Measures of significance were assessed by the Student’s t-test.
Genes were considered as statistically differentially expressed if they satisfied a p-value
cut-off of 0.05. Data can be found in the supplementary material.
Real-time RT-PCR
Primers were designed based on the ABC sequences of L. infantum using the GeneRunner
software (www.generunner.com). Complementary DNA was synthesized from 2 g of total
RNA using the SuperscriptIITM RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) and Oligo
(dT)12-18 primers (Invitrogen) following manufacturer’s instructions. Real-time PCR was
performed exactly as described (21). The relative amount of PCR products generated from
each primer set was determined based on the threshold cycle (Ct) value and amplification
77
efficiencies, and was normalized by dividing the values by the relative amount of the
GAPDH gene used as a control.
78
Results
The Leishmania ABC protein family
The combined use of systematic BLAST searches against the Leishmania major genome
(www.genedb.org) using the ABC signature sequence as a query and of the analysis of the
current annotated database allowed the identification of 42 ORFs that could be assigned to
the ABC superfamily. This represents 0.5% of the total number of genes (approximately
8300) in L. major. The retrieved sequences were designated as ABC proteins based on the
presence of the characteristic ABC signature motif flanked by the Walker A and B motifs.
Of the 42 ORFs, the L. major genome was found to encode 32 intrinsic membrane ABC
proteins and 10 ABC proteins without any TMD. Among the intrinsic membrane proteins,
full transporters were more frequent than half transporters (20:12). The number of predicted
transmembrane spans varies from ten to fourteen for the full molecules whereas in half
molecules the number of putative transmembrane spans varies from two to six. A detailed
inventory of these ORFs, including names, GeneDB database accession numbers for the L.
major and L. infantum orthologues, overall structural organization and most similar ORFs
found in the genome of the related parasites Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi is
presented in Table 1.
Classification of the Leishmania ABC proteins
An alignment of the ATP-binding domains was generated and used for phylogenetic
analysis to classify the 42 ABC proteins encoded by the Leishmania genome. Figure 1
displays a neighbour-joining tree clustering the 42 ABC proteins into eight subfamilies,
seven of these being found in the human genome. As shown in Fig 1, Leishmania has ten
members of the ABCA family (ABC1), four members of the ABCB family (MDR/TAP),
eight members of the ABCC family (MRP/CFTR), three members of the ABCD family
(ALD), one member of the ABCE family (OABP), three members of the ABCF family
(GCN20) and six members of the ABCG family (WHITE). We could also find three
members belonging to the ABCH family and four proteins not clustering to any of the
79
above subfamilies. The same clusters were obtained when using a maximum parsimony
phylogenetic analysis (data not shown). The Leishmania ABC genes are largely dispersed
in the genome being found on 19 different chromosomes (Fig. 2). Most of the genes are
found alone on chromosomes but some are grouped in a head-to-tail fashion as part of two
or three genes clusters (Fig. 2). All of those clusters contain members of the same
subfamily: ABCA genes (chromosomes 11 and 27), ABCC genes (chromosomes 23 and
31) or ABCG genes (chromosome 6). Interestingly, the non-contiguous ABCA2 and ABCA4
genes of chromosome 11 share a one-hundred percent identity at the nucleotide level.
Orthology of the ABC proteins in Trypanosomatids
We compared the ABC dataset of L. major to the L. infantum contig sequences and to the
related parasite Trypanosoma brucei (6) and Trypanosoma cruzi (19) genomes. Table 1
shows that a L. infantum orthologue was found for every L. major ABC gene with a
conserved synteny. Furthermore, the L. infantum contig sequences did not reveal any
additional ABC protein coding ORF that has not been previously found in the L. major
genome. With its 42 ABC genes, Leishmania is the parasite with the largest ABC dataset in
the Trypanosomatidae family, the T. cruzi and T. brucei genomes encoding 28 and 22 ABC
proteins, respectively (Table 1). This variation in the number of ABC genes between the
three organisms seems to be the result of an expansion of the ABCA, ABCC and ABCG
subfamilies that occured in Leishmania after the split with the Trypanosoma lineage, and of
the loss of some ABC genes in T. brucei after speciation events within trypanosomes (Fig.
3). The ABCB, ABCD, ABCE, ABCF and ABCH subfamilies seem to be evolutionary
more stable in Trypanosomatids, in particular between Leishmania and T. cruzi (Fig. 3).
Cross-organism searches revealed multiple homologous ORFs in the genomes of T. brucei
and T. cruzi when compared to Leishmania but only some of these could be assigned as
orthologous sequences by phylogenetic analyses. These clusters of orthologous genes,
where homologues found in the three genomes are grouped on the same cluster in a
phylogenetic tree, are observed in the most evolutionary stable subfamilies (Table 1 and
Fig. 3). Indeed, only one cluster of orthologous genes was found between Leishmania, T.
cruzi and T. brucei in the ABCA subfamily (Table 1 and Fig. 3A) whereas two have been
80
identified in the ABCB subfamily (Table 1 and Fig. 3B). No ABCC orthologue could be
found between Trypanosoma and Leishmania. The ABCD, ABCE and ABCF subfamilies
show the highest level of orthology with all of the Leishmania genes forming unambiguous
pairs with their T. brucei and T. cruzi homologues. Within the ABCG subfamily, three of
the six Leishmania genes paired with an orthologue in the Trypanosoma genomes (Table 1
and Fig. 3G). Several Leishmania ABC proteins either included in the ABCH class or still
unclassified had orthologues in usually both T. brucei and T. cruzi. One exception is
LmjF32.2060 which has no orthologue in the sequenced Trypanosoma genes (Fig. 3H).
The Leishmania ABC proteins paralogous relationship
One way to address the putative function of a gene is to identify orthologues of known
function. One such approach based on phylogenetic analysis was applied here in order to
compare the ABC proteins of Leishmania to those of other eukaryotic genomes whose
ABC gene inventory and classification have already been done (H. sapiens, S. cerevisiae,
D. melanogaster, C. elegans and D. discoideum). As examplified by the ABCA subfamily
in Fig 4A, the Leishmania proteins cluster in phylogenetic branches along with their
Trypanosomatid homologues but apart from proteins encoded by the other eukaryotic
genomes. This is also the case for the proteins of the ABCC and ABCG subfamilies (results
not shown). Among the other subfamilies, very few clear orthologues have been identified
by phylogenetic analyses. Among these are the L. major ABCB3 protein which is found on
a strong cluster with the yeast ATM1 protein and the L. major ABCE1 protein which is an
orthologue of the yeast ABCE1-like YDR091c protein. The three L. major ABCF proteins
were also successfully paired; ABCF1 is clustering with the human ABCF3 and the yeast
GCN20 proteins, ABCF2 is clustering with the human ABCF2 protein among others and
ABCF3 is found on a cluster along with the human ABCF1 protein (Fig. 4B). In some
instances (ABCB1, ABCD3 and ABCG5 proteins), Leishmania ABC proteins are
clustering with more than one homologue of another organism (data not shown), rendering
the assignment of a putative function more ambiguous.
81
The Leishmania genome encodes seven ABC proteins not clustering with any of the
mammalian ABC subfamilies. Those proteins were referred as members of the ABCH
subfamily or as unclassified ABC proteins (“others” in Table 1), whether they clustered or
not with representatives of the Drosophila ABCH proteins (Table 1). Most of them do not
possess any transmembrane domain, LmjF32.2060 being the only exception with 6
predicted amino terminal membrane-spanning -helices. Furthermore, with the exception
of LmjF30.1330 which possesses a carboxy terminal NBD and a degenerated amino
terminal NBD, all unclassified proteins possess a single NBD usually located at the
carboxy termini of the molecule (Table 1). Phylogenetic analyses revealed that the
LmjF11.0040 and LmjF29.1640 proteins are orthologues of the D. discoideum ABCh.2 and
ABCh.1 proteins, respectively, and that they are found along with LmjF30.1330 on a
cluster containing the D. melanogaster CG9990, CG6162 and CG11147 ABCH proteins
(data not shown). All the other unclassified proteins of Leishmania seem to be more related
to bacterial ABC proteins by BLASTp searches.
Generation of DNA microarrays to study ABC gene expression in the two main life stages
of Leishmania
L. major and L. infantum have the same complement of ABC proteins (Table 1) and
oligonucleotides were designed to detect the genes of both species. Changes in mRNA
abundance were examined by customized DNA microarrays comprising 70-mers
oligonucleotides representing the entire ABC dataset of Leishmania in multiple replicates
in addition to PCR fragments of several genes known to be involved in the trypanothione
biosynthetic pathway or in antimony resistance (26). In order to estimate the accuracy of
the protocol, arrays were first hybridized to Cy3 and Cy5 labelled cDNA generated from
the same RNA preparation and hybridization was found to be uniform (data not shown).
Once the spotting, hybridization and washing conditions were optimized, and hybridization
signals could be consistently reproduced, the arrays were used for the parallel analysis of
ABC gene expression throughout the life cycle of Leishmania infantum and in antimony
resistant mutants of L. infantum.
82
The ABC gene expression profiling between promastigotes and axenic amastigotes of L.
infantum is shown in Figure 5A. From the selected genes printed on the array, one ABC
gene, ABCF3 (2.5-fold, P < 0.01), appeared to be consistently upregulated in the
promastigote stage. The expression of another gene, S-adenosylhomocysteine hydrolase
(SAHH) (2.8-fold, P < 0.01), is also increased in promastigotes. When applying a cutoff of
at least two-fold differential expression, three ABC genes showed a consistent upregulation
in the amastigote stage. One corresponds to the ABC transporter ABCA3 (2.5-fold, P <
0.01), the second one to the ABC transporter ABCG3 (2.0-fold, P < 0.01) and the last one
to ABCF2 (3.0-fold, P < 0.02). The expression of the aquaglyceroporin AQP1 (2.0-fold, P
< 0.02) also seems to be increased in axenic amastigotes. No other ABC gene showed a
significant differential expression in any of the two life stages when respecting a cutoff
between 1.5 and 2. The putative differential expression of ABC genes was further
confirmed by real-time RT-PCR and the increased mRNA levels of ABCF3 in
promastigotes and of ABCA3 (Fig. 5B) and ABCG3 in amastigotes were confirmed by this
technique (Fig. 5C). The expression of ABCC4, a gene that was not found to be
differentially regulated by microarrays, was also found to be similarly expressed between
the two stages of Leishmania in real-time RT-PCR experiments (Fig. 5C). While ABCF2
was found to be significantly overexpressed in the amastigote stage by microarrays, this
could not be confirmed by real-time RT-PCR (Fig. 5C).
ABC gene expression in antimony resistant mutants
The role of the ABC transporter MRPA (ABCC3) in antimonial resistance is well
established (20, 40). Since antimony resistance is multifactorial, it is possible that other
ABC proteins could also be implicated (44). To test if antimony resistance is correlated
with the differential expression of other ABC genes, we performed microarray analyses
using an antimony-sensitive L. infantum promastigote wild-type (WT) strain compared to
an antimony-resistant L. infantum promastigote mutant strain (Sb2000.1). The ABC gene
expression between the L. infantum sensitive (WT) and resistant (Sb2000.1) strains is
shown in Figure 6A. As expected, the majority of the spots aligned along the regression
curve, suggesting that the genes represented by these spots are equally expressed in both
83
samples. When applying a cut off of at least two-fold differential expression, the only gene
found to be differentially expressed between the sensitive and the resistant strains is the one
coding for the ABC transporter MRPA (ABCC3) (3.8-fold, P < 0.01). However, when
applying a cut off between 1.5 and 2-fold difference in mRNA abundance, two more ABC
genes, ABCA3 (1.8-fold, P < 0.02) and ABCH1 (1.8-fold, P < 0.01), showed a statistically
significant higher expression in the antimony-resistant strain. Interestingly, the same
mutant was recently studied with a Leishmania full genome array and, while the expression
of several genes was modulated, the expression of the same three ABC protein genes was
found to be upregulated (unpublished observations). The differential expression of these
three genes in the antimony resistant mutant was confirmed by real-time RT-PCR
experiments (Fig. 6B-C). The overexpression of ABCA3 and ABCH1 is described for the
first time in an antimony resistant Leishmania strain. To test whether this is also the case in
other antimony resistant mutants, we analyzed by real-time RT-PCR the expression of these
genes in the L. infantum Sb4000.4 promastigote line selected for resistance to Sb(III).
Interestingly, MRPA was found grossly overexpressed but also ABCA3 and ABCH1 were
found to be increased in this independent mutant (Fig. 6D). As observed in the Sb2000.1
mutant, the ABCE1 gene was not found to be differentially expressed in the Sb4000.4 line
(Fig. 6D). Transfection of MRPA in L. infantum conferred a three fold increase in Sb(III)
resistance. Despite the overexpression of ABCA3 and ABCH1 in two independent mutants,
attempts to overexpress ABCA3 or ABCH1 in a L. infantum wild type background did not
result in antimony resistance, however (result not shown). The co-expression of either
ABCA3 or ABCH1 with ABCC3 in a wild-type background did not confer higher resistance
than ABCC3 overexpression alone (result not shown).
84
Discussion
The completion of the Leishmania genome sequencing project (34) has allowed the
characterization of 42 members of the Leishmania ABC gene family, a number
considerably higher in comparison to related Trypanosomatids (Table 1) or to the
Apicomplexa parasites Plasmodium (less than 20 members) (22) and Toxoplasma gondii
(20 members) (50). Phylogenetic analysis has allowed the classification of the Leishmania
ABC proteins in different subfamilies using a nomenclature ABCA to ABCH adopted by
the community of investigators working with eukaryotic ABC proteins (14). Another
classification of the L. major ABC genes has also been done using the TCDB system
(www.tcdb.org), and 45 Leishmania ABC proteins were classified in 22 different groups
belonging to the 3.A.1 TCDB class (6). The discrepancy between the 42 proteins
highlighted in the present study and the 45 pinpointed by a preliminary analysis of the L.
major genome is explained by the inclusion of 4 proteins in the latter analysis (6)
(LmjF21.0880, LmjF27.1700, LmjF29.0930, LmjF34.2070) that are, according to all search
criteria used here, unlikely to be ABC proteins, and by the omission of LmjF33.3040 (see
Fig. 3H) that is clearly an ABC protein. For the remaining of the discussion, we shall keep
the ABCA to ABCH family nomenclature.
Leishmania has representative members of each subfamily and the proportion of proteins in
each of them seems relatively well conserved when compared to other eukaryotes,
especially for the ABCD, ABCE and ABCF subfamilies (13). It is interesting to note that
the Leishmania genome encodes for three proteins of the ABCH subfamily originally
discovered in D. melanogaster (14). Interestingly, three of the four unclassified ABC
proteins are well conserved in Trypanosomatids (see Table 1). Homologues of this
heterologous group of unclassified proteins have already been identified in other genomes
(13, 15, 54) and appear to be more related to bacterial ABC proteins. A comparison of the
ABC proteins of Leishmania to those of five other eukaryotic genomes revealed few
unambiguous orthologous sequences. This is in agreement with previous studies that
evaluated the frequency of orthologous ABC transporter pairs between different eukaryotic
genomes (14, 53). Therefore, no detailed predictions of function in Leishmania ABC
proteins can be draw on the basis of phylogeny alone. As previously observed (14, 53), the
85
frequency of orthologous sequences was found to be lower in the transporter subfamilies A,
B, C, D and G compared to those not involved in transport activities (subfamilies E and F).
The difference in ABC gene number in Leishmania compared to other eukaryotic
microorganisms is mostly due to an expansion of the ABCA, ABCC and ABCG genes,
several of which have likely resulted from gene duplication events occurring after the split
between the Leishmania and Trypanosoma lineages (Fig. 3). Several genes coding for
members of those subfamilies have been found grouped in a head-to-tail fashion in the
genome of Leishmania (Fig. 2), consistent with gene duplication. The duplication events
seem to have occurred recently given the high similarity between the paralogues (Fig. 3A,
3C and Fig. 3G). This difference in the ABC complement between Leishmania and
Trypanosoma could result from the different environment encountered by the parasitic
organisms which translates in distinct needs and maintains a selective pressure on the ABC
gene dataset. The known function of members of the ABCA, ABCC and ABCG subfamily
in other eukaryotes allows tentative explanations as to why the expansion of these ABC
proteins occurred in Leishmania when compared to other eukaryotic microorganisms. The
life style and life cycle of Leishmania differs considerably from other eukaryotic
pathogens. Indeed, it migrates and differentiates in the digestive tract of the sand fly vector,
and in contrast to most eukaryotic pathogens, it remains within the phagolysosome of the
host macrophages. These inhospitable habitats are likely to produce a number of toxic
molecules for which the parasite has to defend itself. The ABCCs are best known to
provide protection against a vast repertoire of xeno- and endobiotics and their glutathione,
glucuronide, and sulfate conjugates (reviewed in (16)). Thus, it is possible that the
expansion of the ABCC subfamily in Leishmania (Table 1, Fig. 3) is necessary to protect
the cells in both life stages against toxic molecules. Interestingly, two ABCC proteins of
Leishmania, MRPA (ABCC3) and PRP1 (ABCC7) have already proven role in dealing
with xenobiotics (11, 40). Some eukaryotic members of the ABCG, most notably ABCG2
is involved in the detoxification of drugs and an expansion of the ABCG proteins in
Leishmania (Fig. 3) (the parasite ABCG1, 2 and 3 are distantly related to the human
ABCG2) may also help the parasites to cope with the variety of adverse conditions they are
encountering.
86
Leishmania has 10 ABCA proteins but these are absent in yeast (15) and in Apicomplexa
parasites (50) and their number is considerably less in Trypanosoma. The ABCA and the
ABCG proteins are best known for the transport of a variety of lipids, including cholesterol,
plant sterols, sphingolipids, and phospholipids (37)(reviewed in (55)). At least two
Leishmania ABCA transporters have proven ability to transport phospholipids (5, 46).
There are considerable evidences that lipid transport and salvage are implicated in several
aspects of Leishmania biology and this provides a plausible explanation for the expansion
of the ABCA and ABCG subfamilies. Indeed, the major sphingolipid of Leishmania,
inositol phosphorylceramide, is absolutely required for metacyclogenesis (infectious
promastigotes) in L. major (17, 60). Sphingolipid metabolites have been shown to modulate
a wide variety of cellular events in a number of cells including Leishmania (18).
Surprisingly, Leishmania amastigotes cannot make these sphingolipids and need to salvage
them from the host (17, 59, 60) and ABC proteins could possibly be implicated in this
phenomenon. Interestingly and consistent with the above proposal, our targeted DNA
microarrays indicated that the expression of ABCA3 and ABCG3 was consistently
upregulated in axenic amastigotes (Fig. 6). An homologue of the L. major ABCA3 in T.
cruzi (TcABC1) was shown to be overexpressed in the epimastigote and amastigote stages
(57) and the preferential expression in amastigotes of a gene coding for an ABCA protein
has recently been reported in Leishmania using random genomic DNA microarrays (1).
Glycosylinositolphospholipids are highly abundant and important in host-parasite
interactions and were shown to be translocated across membranes (47) and this could also
involve ABC proteins. Leishmania has specialised sterols including ergosterol (24), and if
ABCGs were required for their transport, it may also explain partly the expansion of
ABCGs in Leishmania.
DNA microarrays are useful in the field of parasitology, as exemplified by numerous
studies on stage specific expression and on drug resistance in Leishmania (1, 3, 20, 26, 32,
51). Furthermore, custom-made ABC transporter-targeted microarrays have already been
used to study multidrug resistance in cancer cells (4, 23). The only ABC gene found to be
preferentially expressed in the promastigote stage of Leishmania is ABCF3, an orthologue
of the human ABCF1. The human ABCF1 protein co-purifies with the eukaryotic initiation
factor 2 and associates with the ribosomes in an ATP-dependent manner (58). Given the
87
orthologous relationship with L. major ABCF3, one can expect a similar role in translation
initiation for the Leishmania protein. Stage-specific regulation of gene expression in
Leishmania is often controlled at the translation level (8, 42) and thus it is possible that
genes expressed in a stage-specific manner such as ABCF3 are involved in stage-specific
gene regulation.
The customized DNA microarrays were also used for the analysis of ABC gene expression
in antimony resistant mutants. The gene MRPA was found overexpressed in the Sb2000.1
resistant mutant, in agreement with previously reported results (20). ABCA3 and ABCH1
were also overexpressed in the Sb2000.1 mutant (Fig. 6C). Interestingly, the same three
genes, MRPA, ABCA3 and ABCH1, were found to be overexpressed in an independent
novel Sb(III) L. infantum resistant mutant (Fig. 6D). Furthermore, given the involvement in
vesicular trafficking and exocytosis pathway of an ABCA3 homologue in T. cruzi (57), an
attractive scheme to the antimony resistance pathway in the Sb2000.1 or Sb4000.4 mutants
would be an increased sequestration of the thiol-Sb(III) complexes in intracellular vesicles
by the overexpression of MRPA, followed by an increased exocytosis of those vesicles
resulting from ABCA3 overexpression. Preliminary analysis of an antimony resistant L.
donovani field isolate also suggests that ABCA3 expression may be increased in these
resistant parasites (unpublished observations). Overexpression of ABCA3 or ABCH1 in a
wild type background was not sufficient to observe an antimony resistance phenotype
(result not shown), so the role, if any, in antimony resistance requires further experimental
work. The ABCA3 and/or ABCH1 genes may contribute to resistance, however, in other
contexts such as when other mutations are present as in the mutants Sb2000.1 or Sb4000.4.
Our work has highlighted, in contrast to other protozoan parasites, the magnitude of the
ABC protein family of Leishmania. Given the multiple proteins found in the transporter
subfamilies, Leishmania seems equipped to export a wide variety of compounds. This study
has also illustrated the usefulness of small targeted microarrays of 70-mers
oligonucleotides. These ABC arrays will be useful tools for studying the physiological
function of ABC proteins and to detect modulation in gene expression in Leishmania
parasites resistant to various chemotherapeutic drugs.
88
Acknowledgments
We thank the Sanger Center, Pr. D. Smith and Pr. J. Mottram for the availability of the L.
infantum sequences (www.sanger.ac.uk). We thank Dr. Éric Leblanc for help in initial
phylogenetic analyses and Dr. Jean Morisette for using the GeneSpringR7.2 software. This
work was funded in part by the CIHR group GR14500 and operating grants to M.O.,
through a FQRNT group grant, and through a Wellcome Trust-Burroughs Wellcome Fund
new initiative in infectious diseases programme grant to M.O., P.L. is a recipient of a CIHR
studentship. B.P. and M.O. are Burroughs Wellcome Fund New Investigators and Scholar
in Molecular Parasitology and M.O. holds a Canada Research Chair in Antimicrobial
Resistance.
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95
Table 1. The Leishmania ABC proteins.
96
Subfamily names given are according to the HUGO nomenclature (www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/) and
gene accession numbers were taken from the GeneDB database (www.genedb.org). In the case of T. cruzi, all
alleles were included because of the hybrid nature of this genome (19). A star after the gene name indicates
alleles representing the same T. cruzi ORF. The name of genes already studied in Leishmania is included as
aliases. Potential orthologous sequences between the Tri-Tryp genomes are represented by a “Yes” in the last
column. Tc00.1047053447255.29 and Tc00.1047053510231.29 probably represent two fragments of the same
molecule. The same applies to the Tc00.1047053503749.60 and Tc00.1047053511537.8 sequences. TM,
transmembrane domain. NBD, nucleotide-binding domain.
97
Legend to figures
Fig 1. Phylogenetic analysis of the L. major ABC proteins.
Nucleotide-binding domains were aligned using ClustalW. The resulting multiple
alignment was subjected to phylogenetic analysis using the neighbour-joining algorithm of
the MEGA software. The reliabilities of each branch point were assessed by the analysis of
1000 bootstrap replicates. A human representative of each mammalian subfamily was
incorporated in the analysis to define each subfamily. The subfamily groups are shown as
bars on the right of the tree and I and II represent the N and C-terminal NBD of full length
proteins, respectively. lm, Leishmania major; hs, Homo sapiens.
Fig 2. Chromosomal location of the ABC protein coding genes in Leishmania.
Chromosomes are indicated as horizontal lines and ABC genes as colored blocks. A dashed
line below genes indicates clusters of tandem genes. A break in the chromosome indicates
members of the same subfamily not grouped in tandem.
Fig 3. Phylogenetic analysis of the ABC proteins in the Trypanosomatidae family.
Phylogeny derived and displayed according to the procedure outlined in Figure 1.
Subfamilies ABCA to ABCH are shown. For the purpose of the figure, the unclassified
proteins were incorporated in the ABCH subfamily tree. The coding sequences
Tc00.1047053503749.60 and Tc00.1047053511537.8 in Table 1 probably represent two
fragments of the same molecule so only one sequence was incorporated in Fig. 3B. The
same applies to the Tc00.1047053447255.29 and Tc00.1047053510231.29 sequences in
Fig. 3C. lm, L. major; Tc, T. cruzi; Tb, T. brucei.
98
Fig 4. Phylogenetic tree of selected ABC proteins with other eukaryotic ABC proteins.
Phylogeny derived and displayed according to the procedure outlined in Figure 1, except
that complete protein sequences were used instead of just the NBD. A. Phylogenetic tree of
ABCA proteins in seven eukaryotic genomes. B. Phylogenetic tree of the ABCF proteins in
Leishmania, with man and yeast proteins. lm, L. major; Tc, T. cruzi; Tb, T. brucei; Hs, H.
sapiens; Dm, D. melanogaster; Ce, C. elegans; Dd, D. discoideum, Sc, S. cerevisiae.
Fig 5. ABC gene expression in life stages of L. infantum.
A. Scatter plot of hybridization intensities representing the average of four independent
experiments between L. infantum amastigote and promastigote parasites. The external lines
indicate a least 2-fold difference and genes whose expression differs significantly are
indicated. The expression of genes represented by dots within the two external lines is
considered as similar in the two tested conditions, unless mentioned. B. Real-time PCR
fluorescence curves representing duplicates of the ABCA3 gene amplification in
promastigotes (dashed and full lines) and amastigotes (dotted and broken lines). The
amplification curves of the GAPDH gene used for normalization are shown in the insert. C.
Validation of microarrays data by real-time RT-PCR. The gene ABCC4 was not found to be
differentially expressed by microarrays and was used as a negative control. A mean of four
independent experiments is shown for microarrays and a mean of two independent
experiments is shown for real-time RT-PCR
Fig 6. ABC gene expression in L. infantum antimony resistant mutants.
A. Scatter plot of hybridization intensities representing the average of four independent
experiments between L. infantum wild-type and L. infantum Sb2000.1. The external lines
indicate 2-fold differences and genes whose expression differs significantly are indicated.
The expression of genes represented by dots within the two external lines is considered as
similar in the two tested conditions, unless mentioned. B. Real-time PCR fluorescence
99
curves representing duplicates of the MRPA gene amplification in the wild-type strain
(dotted and full lines) and the Sb2000.1 strain (dashed and broken lines). The amplification
curve of the GAPDH gene used for normalization is shown in the insert. C. Validation of
microarrays data by real-time RT-PCR. The gene ABCE1 was not found to be differentially
expressed by microarrays and was used as a negative control. *The curve for this gene was
outside the standard curve and the fold difference could be underestimated. A mean of four
independent experiments is shown for microarrays and a mean of two independent
experiments is shown for real-time RT-PCR. D. Real-time RT-PCR expression analysis of
four ABC genes in L. infantum Sb4000.4 antimony resistant mutant. The expression ratios
of four ABC genes in the Sb4000.4 antimony resistant mutant relative to the wild-type
antimony sensitive strain are shown. Mean of three independent experiments performed
from three different RNA preparations.
100
Figure 1
101
Figure 2
102
Figure 3
103
Figure 4
104
Figure 5
105
Figure 6
106
CHAPITRE 6. Localisation subcellulaire de la famille des
protéines ABCC et caractérisation de leurs implications
dans la résistance à l’antimoine chez Leishmania.
Une version similaire de l’article sera soumise prochainement à Molecular and
Biochemical Parasitology pour publication.
6.1 Résumé
La sous-famille MRP/ABCC des transporteurs de type ATP-binding cassette (ABC) est
constituée de protéines impliquées dans la détoxification des métaux conjugués aux thiols
chez divers organismes. Chez le parasite protozoaire Leishmania, la résistance aux
traitements à base d’antimoniés pentavalent implique le transport de l’antimoine conjugué
au trypanothion à l’intérieur d’une vésicule de détoxification par le transporteur
intracellulaire ABCC3/MRPA. Une récente analyse du génome a révélé la présence de huit
protéines ABCC chez Leishmania major. Nous rapportons l’identification d’une nouvelle
protéine ABCC qui est spécifique à Leishmania infantum et que nous avons appelée
liABCC9. De plus, nous avons déterminé que l’ensemble des protéines ABCC est localisé
au niveau de compartiments intracellulaires chez Leishmania. Finalement, le phénotype de
résistance à l’antimoine conféré par la surexpression de ABCC4 et ABCC5 nécessite un
génotype particulier chez le parasite modèle Leishmania tarentolae.
107
6.2 Article
Characterization and localization of the ABCC proteins of Leishmania and their
involvement in resistance to antimonials.
Philippe Leprohon1, Danielle Légaré1 and Marc Ouellette1,*
1
Centre de Recherche en Infectiologie et Division de Microbiologie, Université Laval,
Québec, Canada, G1V 4G2.
* Corresponding author: Marc Ouellette Ph.D.
Centre de Recherche en Infectiologie
2705 boul. Laurier
Québec, Québec
G1V 4G2
Tel : 1-418-654-2705
Fax : 1-418-654-2715
e-mail : [email protected]
Running title: The ABCC protein subfamily in Leishmania
Keywords: ABC proteins, Leishmania, antimony resistance.
108
Abstract
The MRP/ABCC subfamily of ATP-binding cassette (ABC) transporters contains proteins
involved in the detoxification of metal thiolates in many organisms. In the protozoan
parasite Leishmania, resistance to the first-line drug antimony is mediated in part by the
sequestration of its thiol-conjugates by the protein ABCC3/MRPA. A recent survey of the
genome revealed eight ABCC proteins in Leishmania major. We identified here a new
member of the ABCC subfamily, liABCC9, which is specific to Leishmania infantum.
Also, we report that every ABCC proteins of Leishmania has an intracellular localization.
Interestingly, the ABCC4 and ABCC5 proteins are involved in antimony resistance when
overexpressed in a specific genetic background of Leishmania tarentolae.
109
Introduction
The protozoan parasite Leishmania is responsible for a variety of clinical manifestations
ranging from mild cutaneous infections to life-threatening visceral diseases (20). No
effective vaccine is yet available against this parasite and its control relies primarily on
chemotherapy. Pentavalent antimony containing compounds such as sodium stibogluconate
(Pentostam) and N-methylglucamine (Glucantime) remain one of the first-line drugs
against all forms of Leishmania infections in developing countries (31), but their efficacy is
threatened by the emergence of resistant parasites in several endemic regions (17, 28, 38).
Our previous in vitro work on metal resistance in Leishmania tarentolae led to the
definition of a model of resistance involving multiple steps where the metal is first
conjugated to trypanothione (TSH) (12), a bisglutathione-spermidine conjugate, before
being transported inside an intracellular detoxification organelle by the ABC transporter
MRPA/ABCC3 (24) or being extruded outside the cell by an efflux pump of unknown
identity (7). ABC proteins form one of the largest family of transmembrane proteins and
are involved in drug resistance in several organisms. Their sequences are characterized by
the presence of a strongly conserved domain, the nucleotide-binding domain (NBD), which
is composed of three major motifs. Along with the Walker A and B motifs found in many
nucleotide-binding proteins, the NBD is composed of a characteristic ABC signature “C”
motif located just upstream of the Walker B site. Eukaryotic ABC proteins can be divided
into eight different subfamilies (ABCA to ABCH) on the basis of gene structure and NBD
sequence homologies.
The efflux system located at the plasma membrane of Leishmania catalyzes the active
extrusion of metal thiolates (7), a feature of the ABCC subfamily of ABC proteins ((21, 23,
45)(reviewed in (1)). The Leishmania genome encodes eight ABCC proteins (25) and it has
been suggested that one of these could correspond to the ATP-dependent efflux system.
MRPA/ABCC3 (2, 11, 24, 35) and PRP1/ABCC7 (4) are two ABCC proteins that have
been associated with antimony resistance in Leishmania. However, the localization of both
proteins to intracellular compartments (5, 24) is not compatible with their involvement as
plasma membrane efflux pumps. Furthermore, transfection of MRPA is not involved with a
110
change in the accumulation of the metal (35), leaving the other six ABCC members as
putative candidates. We report here the identification of an additional member of the ABCC
subfamily in Leishmania infantum, the cellular localization of the ABCC proteins in
Leishmania using green fluorescent protein (GFP) fusions and have studied their role in
resistance to antimonials with the model system L. tarentolae.
111
Materials and Methods
DNA manipulations
The ABCC genes were amplified from L. infantum and their stop codon removed by PCR.
Each PCR fragment was cloned in pGEM T-easy vector (Invitrogen), digested with the
restriction enzymes underlined for each primer pairs and subcloned in-frame with the green
fluorescent protein (GFP) gene in the Leishmania expression vectors pSP72neo or
pSP72hygro. The full length liABCC9 gene was amplified from L. infantum. Each
construct was verified by restriction digests and by sequencing of the inserted genes using
an Applied Biosystems 377 Automated sequencer.
Cell culture, Transfection and Growth curves
Promastigotes of L. tarentolae and L. infantum were cultured in SDM79 medium
supplemented with 10 g/ml hemin and 5% and 10% heat-inactivated fetal bovine serum,
respectively. The revertant mutant As20.3rev has been described previously (34).
Promastigotes were transfected with expresion vectors by electroporation as previously
described (36). Growth curves were obtained by measuring absorbance at 600nm at 72
hours after inoculation using an automated microplate reader (Organon Teknica microwell
system).
Confocal microscopy
Cells were immobilized in 30% glycerol and mounted on microscope slides with coverslips.
Samples were viewed with an Olympus FV300 confocal scanning laser system installed on
an Olympus IX-70 inverted microscope with an argon laser. Visualization of the
fluorophore was achieved using a 488 nm excitation filter and 510/530 nm emission filter.
Samples were simultaneously scanned for green fluorescence and DIC using a 100x
112
objective and a 2x zoom. Images of 512x512 pixels were obtained using Olympus Fluoview
300 software and processed using Adobe Photoshop software.
Phylogenetic analysis
Phylogenetic analysis of the nucleotide-binding domains of ABC proteins has been
performed has previously described (25).
113
Results
Subcellular localization of Leishmania ABCC proteins
The ABCC proteins MRPA/ABCC3 and PRP1/ABCC7 have already been localized to
intracellular compartments in Leishmania (5, 24). The subcellular localization of the six
remaining ABCC proteins was assessed by producing C-terminal GFP fusions and confocal
microscopy. Confocal microscopy analyses of immobilized transfected L. infantum
promastigotes revealed that all tested ABCC proteins of Leishmania are located in
intracellular compartments (Figure 1). Indeed, cells transfected with ABCC1-GFP, ABCC2GFP and ABCC6-GFP revealed a fluorescence signal located to a network of intracellular
membranes, cells transfected with the ABCC8-GFP fusion showed a punctuated
fluorescence signal located near the posterior end of the parasite and cells transfected with
the ABCC4-GFP and ABCC5-GFP fusions revealed a fluorescence signal located to a
tubular compartment oriented along the longitudinal axis of the parasite. We also made a
N-terminal GFP fusion of ABCC5 and found that it localized to a similar tubular
compartments as the C-terminal fusion (results not shown).
Involvement of the Leishmania ABCC family in antimony resistance
The involvement of the intracellular ABCC proteins MRPA/ABCC3 and PRP1/ABCC7 in
antimony resistance has already been reported (4, 5, 24). We next tested if overexpression
of the intracellular ABCC1, ABCC2, ABCC4, ABCC5, ABCC6 and ABCC8 proteins
could be associated with metal resistance in different Leishmania strains. Growth curves
experiments cleary showed that none of the ABCC proteins is associated with antimony
reistance when overexpressed in a wildtype (WT) background of L. infantum (not shown)
or L. tarentolae (Table 1 and Figure 2A). However, the ABCC4 and ABCC5 proteins
confered a two fold increase in resistance to Sb(III) when overexpressed in the partial
revertant line L. tarentolae As20.3rev (Figure 2B). This partial revertant line, which was
generated from the arsenite-resistant mutant L. tarentolae As20.3 (34) by successive
passages in absence of As(III) (35), has lost most of its antimony cross-resistance
114
phenotype but retained residual levels of Sb(III) resistance compared to the sensitive WT
parent. The ABCC4-GFP and ABCC5-GFP fusions were functional since both conferred
resistance levels similar to the unfused versions in L. tarentolae As20.3rev (Table 1). The
N-terminal GFP fusion of ABCC5 also conferred a two-fold increase in Sb(III) resistance
(Table 1). Furthermore, the ABCC5 genes from L. infantum and L. tarentolae induced
similar levels of antimony resistance when transfected in L. tarentolae As20.3rev (result
not shown). Apart from MRPA/ABCC3, ABCC4 and ABCC5, none of the other ABCC
proteins tested was associated with antimony resistance when overexpressed in L.
tarentolae As20.3rev (Table 1).
Identification of a new member of the ABCC subfamily in Leishmania infantum
A previous survey indicated the presence of eight ABCC protein-coding genes in the
genome of L. major and L. infantum (25). However, a search of the latest version of the L.
infantum genome (GeneDB V3.0) for unkown ABC gene sequences revealed the presence
of a new member of the ABC protein-coding gene superfamily (LinJ24_V3.1510 ). The
new ORF is 10,119 bp in length and has between 14-16 putative transmembrane domains.
This gene could not be found in the genomes of L. major (GeneDB V5.1) and L.
braziliensis (GeneDB V2.0) and seems to be specific to L. infantum. Indeed, no ORF is
found at the orthologous chromosomal location in the genome of L. major, whereas a
pseudogene of low homology is found at the orthologous chromosomal location in the
genome of L. braziliensis. Phylogenetic analyses revealed that LinJ24_V3.1510 is part of
the ABCC subfamily and has consequently been named liABCC9. Furthermore, a neighborjoining tree of the L. infantum ABC proteins showed that liABCC9 is the most divergent
member of the ABCC subfamily (result not shown). Whereas the Walker A and B motifs
are relatively well conserved in all ABCC proteins of Leishmania, the signature “C” motif
appears to be more divergent in liABCC9 (Figure 3). Indeed, the conserved glycine in the
fourth position of the signature motif is replaced by a serine residue in both NBDs whereas
a threonine residue is found at the site of the conserved serine in the second position of the
NBD2 signature motif. Interestingly, the conserved motif located between the C motif and
the Walker B site is very well conserved in both NBDs of liABCC9. Transfection
115
experiments of liABCC9 in L. infantum WT, L. tarentolae WT and L. tarentolae As20.3rev
revealed no antimony resistance phenotype in any of the transfected strains (result not
shown and Table 1).
116
Discussion
At least to types of metal-thiol pumps are present in Leishmania. The first pump correspond
to the well characterized MRPA protein (33) that mediate the sequestration of metal
thiolates inside an intracellular organelle (24). The second pump correspond to an ABCClike active efflux system present at the plasma membrane of the parasite (7, 8). We have
identified two more ABCC proteins involved in antimony resistance in Leishmania. The
resistance levels confered by the overexpression of ABCC4 and ABCC5 are low but have
been reproducible with several different transfectants. Low-level Sb(III) resistance
conferred by ABCC proteins have already been reported in Leishmania and in others
organisms (4, 29). It has been suggested that the efflux system located at the plasma
membrane of Leishmania could be encoded by one of the MRPA homologs. However, we
could not provide support for this assumption since the entire family of ABCC proteins
were found to be intracellularly localized in Leishmania. Indeed, while most ABCC
proteins not involved in antimony resistance (ABCC1, ABCC2 and ABCC6) localized to a
network of intracellular membranes, the ABCC4 and ABCC5 proteins localized to a tubular
organelle oriented along the longitudinal axis of the parasite. Interestingly, another ABCC
protein involved in antimony resistance in L. major seems to be located to a similar tubular
organelle (4, 5). Resistance mediated by sequestration appears to be a frequent mechanism
involved in metal tolerance. Whereas the S. pombe ABC transporter HTM1p confers
cadmium tolerance by mediating the sequestration of its phytochelatin (a GSH-like
molecule) conjugates (32), the S. cerevisiae ABCC protein Ycf1p confers resistance to
cadmium, arsenite and antimonite by mediating the vacuolar transport of their GSH
conjugates (14, 27, 43). For an intracellular parasite like Leishmania, it might be
advantageous to transport toxic compounds and waste metabolites inside intracellular
compartments. Indeed, whereas several ABC proteins have been localized to the plasma
membrane in many cell types, almost every ABC proteins that have been localized in
Leishmania, including the MDR1 orthologue (9),
compartments.
are found as part of intracellular
117
An interesting observation is the strain-specificity of the antimony resistance phenotype
confered by the overexpression of ABCC4 and ABCC5. It has been reported that increased
thiol levels are required in antimony resistance in Leishmania. The TSH levels are
increased ten times in the L. tarentolae As20.3 resistant mutant and remain at least three
fold higher in the partial revertant line L. tarentolae As20.3rev than in L. tarentolae WT
(16, 18, 19). Transport experiments have shown that plasma membrane vesicules prepared
from a MRP1-overexpressing lung cancer cell line accumulated As(GS)3 in an ATPdependent manner but failed to accumulate unconjugated arsenite in the presence of ATP
and GSH without the activity of a glutathione S-transferase (26). By analogy, the ABCC4
and ABCC5 proteins might transport Sb(III) as part of TSH complexes, where the
formation of conjugates would be the rate limiting step of the transport process. The
increased antimony resistance of L. tarentolae As20.3rev compared to L. tarentolae WT
suggests that a stable mutation occured in the revertant strain. While it is not unreasonable
to believe that a stable increase in TSH S-transferase activity could have occured in L.
tarentolae As20.3rev, this seems unlikely in light of recent results (44).
A recent genome survey of the three sequenced species of Leishmania revealed a very
small number of species-specific differences in gene content. Indeed, only 5 L. majorspecific genes, 26 L. infantum-specific genes and about 47 L. braziliensis-specific genes
were identified (37), despite the broad difference in disease phenotypes and the 20-100
million years of divergence between the three species (22, 30). Among the genes with an
annotated function that varied between species was LinJ30.1840 (which is now annotated
LinJ24_V3.1510 in GeneDB V3.0) (37). We report here that LinJ24_V3.1510/liABCC9 is
the most divergent member of the ABCC subfamily in Leishmania, partly because of the
degenerated sequence of the signature C motifs. It remains to be determined whether
liABCC9 has any specific functions associated with the visceralisation of L. infantum.
Some conserved residues in the signature motif are essential to the function of ABC
proteins (13). The conserved glycine in the fourth position of the signature motif is replaced
by a serine residue in both NBD of liABCC9. In human MRP1, mutation of these
conserved glycines with aspartic acid residues resulted in the complete loss of both ATPase
118
and transport activities (39, 40). The impact of a glycine to serine polymorphism on the
function of liABCC9 is not known but it is interesting to observe that the same
polymorphism occured at both positions in the protein. Moreover, a mutation resulting in a
change of the conserved serine in the second position of the signature motif to a cysteine
residue at either NBD inhibit CFTR channel activity (6) and mutations has been shown to
occur at this site in cystic fibrosis patients (15). Mutagenesis studies of mouse MDR3
suggested that the hydroxyl functional group of the conserved serine is responsible for the
essentiality of this residue in the signature motif (42). It would be interesting to assess the
impact of the conservative serine to threonine polymorphism of the liABCC9 C-terminal
NBD on ATPase and transport activities of the protein.
.
119
Acknowledgements
This work was funded in part by a CIHR group grant and operating grants to MO. PL
received a CIHR studenship and MO is a Burroughs Wellcome Fund Scholar in molecular
parasitology and holds the Canada Research Chair in Antimicrobial Resistance.
120
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Legend to figures
Figure 1. Intracellular localization of the entire ABCC subamily in Leishmania. L.
infantum promastigotes expressing fluorescence signal to a network of intracellular
membranes (ABCC1-, ABCC2- and ABCC6-GFP), to a tubular organelle oriented along
the longitudinal axis of the parasite and to the posterior end (ABCC8-GFP) of the parasites.
Lane 1, Differential interference contrast (DIC); Lane 2, fluorescence only (GFP); Lane 3,
Merge of the DIC and GFP images.
Figure 2. Overexpression of ABCC4 and ABCC5 confers low levels antimony
resistance in L. tarentolae As20.3rev. (A) The antimony susceptibilities of L. tarentolae
WT ABCC4 and ABCC5 transfectants were not significantly different from control cells.
(B) Transfection of ABCC4 and ABCC5 in the revertant line L. tarentolae As20.3rev led to
Sb(III) resistance.
Figure 3. Sequence alignment of the NBDs of L. infantum ABCC proteins. (A) Nterminal NBDs and (B) C-terminal NBDs. The Walker A, Walker B and signature C motifs
of both NBDs are shown as boxes. An ABCC-like motif found in most ABCC proteins is
underlined. The alignment was performed by ClustalW (41) and the figure was formatted
using Jalview (3).
126
Figure 1
127
Figure 2
128
Figure 3
129
CHAPITRE 7. Événements d’amplification génique, de
chromosomes surnuméraires et de perte de chromosomes
associés à la résistance à l’antimoine chez le parasite
Leishmania infantum.
Une version similaire de l’article sera soumise prochainement à Nucleic Acids Research
pour publication.
7.1 Résumé
Les dérivés d’antimoine pentavalent demeurent un des médicaments de première ligne pour
le traitement des leishmanioses. Cependant, l’efficacité de ces composés s’amenuise en
raison de la sélection de souches cliniques résistantes. La résistance à l’antimoine chez
Leishmania est multifactorielle et fait intervenir plusieurs processus cellulaires. Les
mécanismes de résistance qui ont été élucidés jusqu’à maintenant impliquent une
augmentation de la séquestration d’antimoine conjugué au trypanothion à l’intérieur d’une
vésicule de détoxification intracellulaire, ou une diminution de l’accumulation d’antimoine
résultant de la diminution de son entrée ou de l’augmentation de son efflux. Afin d’évaluer
le profil d’expression génique associé au phénotype de résistance à l’échelle génomique,
nous avons effectué une étude transcriptomique comparative d’une souche sensible (WT) et
d’une souche résistante (Sb2000.1) à l’antimoine de Leishmania infantum à l’aide de puces
à ADN du génome complet du parasite. Plusieurs gènes ont démontré une expression
différentielle entre les deux souches, la plupart d’entre eux étant modulés d’un facteur
variant de 1,5 à 2. Certains gènes ont démontré une modulation d’expression spécifique,
alors que d’autres ont été localisés au niveau de groupes de gènes modulés. Ainsi, le gène
MRPA, qui code pour un transporteur ABC impliqué dans la résistance, était surexprimé
avec trois autres gènes en tandem au niveau du chromosome 23. Des répétitions directes de
1,4 kb impliquées dans la génération d’un nouvel amplicon circulaire ont été identifiées de
chaque côté du locus de quatre gènes amplifié. Enfin, l’expression génique différentielle de
chromosomes entiers a été observée chez la souche résistante à l’antimoine et a été corrélée
à une aneuploïdie pour certains de ces chromosomes chez deux mutants résistants
130
indépendants. Finalement, la sélection d’une souche révertante partielle a permis d’observer
une bonne corrélation entre les niveaux de résistance à l’antimoine et la ploïdie des
chromosomes, ce qui suggère un lien potentiel entre l’aneuploïdie et la résistance chez
Leishmania.
131
7.2 Article
Gene expression modulation is associated with gene amplification, supernumerary
chromosomes and chromosome loss in antimony-resistant Leishmania infantum.
Philippe Leprohon1, Danielle Légaré1, Frédéric Raymond1,2, Jacques Corbeil1,2 and Marc
Ouellette1,*
1
Centre de Recherche en Infectiologie et Division de Microbiologie, Université Laval,
Québec, Canada, G1V 4G2.
2
Centre de Recherche en Endocrinologie Moléculaire et Oncogénique, Université Laval,
Québec, Canada, G1V 4G2.
* Corresponding author: Marc Ouellette Ph.D.
Centre de Recherche en Infectiologie
2705 boul. Laurier
Québec, Québec
G1V 4G2
Tel : 1-418-654-2705
Fax : 1-418-654-2715
e-mail : [email protected]
Running title: Whole-genome microarrays of antimony-resistant Leishmania
Keywords: Leishmania; DNA microarrays; gene amplification; aneuploidy, resistance
132
Abstract
Antimonials remain one of the first line drugs against the protozoan parasite Leishmania
but their efficacy is threatened by resistant clinical isolates. This resistance seems
multifactorial and involves many cellular processes. Resistance mechanisms are partly
understood and include a reduced drug accumulation resulting from a decreased influx or
an increased efflux, a reduced drug activation and drug sequestration following transport of
thiol conjugates inside an intracellular organelle. In order to study gene expression
modulation in antimony resistance on a full-genomic scale, we present a RNA expression
profiling analysis comparing an antimony-sensitive (WT) and an antimony-resistant
(Sb2000.1) strain of Leishmania infantum using whole-genome 70-mer oligonucleotides
microarrays. Several genes were found to be differentially expressed between the two
strains, most of which by a factor between 1,5 and 2. Some of the differentially expressed
genes are found alone in the genome whereas others are part of groups of modulated genes.
MRPA, an ABC gene already known to be involved in antimony resistance, was
overexpressed in the antimony-resistant mutant along with three other tandemly linked
genes on chromosome 23. This four genes locus is flanked by 1,4 kb direct repeat
sequences from which a new extrachromosomal circular amplicon was generated in the
antimony-resistant cells. Interestingly, gene expression modulation of entire chromosomes
occurred in the antimony-resistant mutant and aneuploidy for some of these chromosomes
was confirmed in two independently-selected strains by southern blot hybridizations.
Selection of a partial revertant strain allowed the observation of a good correlation between
the antimomy resistance levels and the copy number of aneuploid chromosomes,
suggesting a putative link between aneuploidy and resistance in Leishmania.
133
Introduction
The protozoan parasite Leishmania is the etiological agent of a group of diseases termed
leishmaniasis. Human leishmaniasis has a prevalence of 12 million cases, an estimated
population of 350 million at risk and an incidence of 2 million new cases annually (44).
Leishmania has a relatively simple life cycle with two main stages, the flagellated
promastigotes, which is found in the gut of the insect vector, and the intracellular
amastigotes, living inside macrophages of the mammalian host. No effective vaccine is yet
available against this parasite and its control thus relies primarily on chemotherapy.
Pentavalent antimony containing compounds such as sodium stibogluconate (Pentostam)
and N-methylglucamine (Glucantime) remain the mainstay against all forms of Leishmania
infections (44), despite the emergence of antimony-resistant parasites now described on a
frequent basis in several endemic regions (24, 35, 54). Second-line drugs include
pentamidine and amphotericin B but severe side effects and high cost have limited their
widespread use. Paromomycin is now more frequently used (10, 30, 44). The first oral drug
miltefosine shows promising efficacy but evidence suggests that resistance could develop
rapidly (51). Because there are few new drugs in the pipeline (1, 9, 10, 46, 63), resistance to
first-line drug(s) has a significant therapeutic impact on this important parasitic disease and
a better understanding of the molecular and biochemical mechanisms leading to resistance
is warranted.
The mechanisms involved in antimony resistance in Leishmania are partly understood, at
least in in vitro selected antimony-resistant strains. Pentavalent antimony (SbV) is believed
to be a prodrug that requires biological reduction to its trivalent form (SbIII) in either the
macrophages and/or the parasites to acquire antileishmanial activity (reviewed in (10, 46)).
A decreased reduction rate has been reported in sodium stiboglucanate-resistant
amastigotes (58). The uptake of Sb(III) in Leishmania has been shown to be mediated by
aquaglyceroporins and downregulation of aquaglyceroporin 1 (AQP1) was associated with
an increased Sb(III) resistance (18, 39). Upregulation of the genes coding for the heatshock protein 70 (4) or for a protein of the leucine-rich repeats (LRRs) superfamily (17)
were associated with an increased tolerance toward antimony in some parasites. An
134
increased level of trypanothione (TSH), the main cellular thiol in Leishmania, has been
observed in mutants selected for antimony resistance (25, 31, 43) following the
amplification (19, 22) and overexpression (26) of genes involved in glutathione (gsh1) and
spermidine (odc) biosynthesis, the two building blocks of TSH (16). Increased TSH levels
could help to restore thiol redox potential which is perturbed following antimony
accumulation (38, 69). The expression of membrane transporters recognizing Sb(III)
conjugated to TSH were often increased in antimony-resistant strains. This was mediated
by amplification of the ATP-Binding-Cassette (ABC) transporter MRPA as part of
extrachromosomal amplicons (19, 20, 47). MRPA confers antimony resistance (5, 48) by
the sequestration of thiol-antimony conjugates inside an intracellular detoxification
organelle located near the flagellar pocket of the parasite (32). Thiol adducts of antimony
can also be extruded form the cell by a plasma membrane efflux pump that still need to be
identified (13, 43). Finally, antimonials appear to kill Leishmania by a process showing
several features of programmed cell death (PCD) and alteration in the PCD pathway
mediated by an increased expression of HSP83 at the protein level has been reported in a
Sb(V)-resistant Leishmania donovani clinical isolate (67). Several, but not all of these
mechanisms were also found in resistant field isolates (12, 23, 42).
Resistance to metalloids such as antimony is multifactorial (46) and can implicate several
mutational events co-existing within the same cell. Accordingly, the simultaneous analysis
of the whole genome could provide useful information about the complex events leading to
drug resistance. Small targeted DNA microarrays have already shown their usefulness in
studying drug resistance mechanisms in Leishmania (15, 22, 34). In order to study gene
expression modulation associated with antimony resistance on a full-genomic scale in
Leishmania, we have carried out a RNA expression profiling experiment comparing an
antimony-sensitive (WT) and an antimony-resistant (Sb2000.1) strain of Leishmania
infantum using whole-genome 70-mer oligonucleotides microarrays that were recently
generated for Leishmania (66). These experiments pinpointed specific mechanisms and
novel changes in ploidy (supernumerary chromosomes and monosomy) that were
correlated to resistance.
135
Materials and Methods
Cell Lines
Leishmania infantum promastigotes were grown at 25oC in SDM-79 medium supplemented
with 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 10 g/ml hemin. The L. infantum wildtype (WT) strain (MHOM/MA/67/ITMAP-263), the L. infantum Sb2000.1 mutant (15) and
the L. infantum Sb4000.4 mutant (34) selected for Sb(III) resistance have been described
previously. The L. infantum Sb400.2 and Sb1000.3 mutants were selected for Sb(III)
resistance using a stepwise selection until they were resistant to 400 and 1000 M Sb(III),
respectively. The L. infantum Sb2000.1 mutant was grown in the absence of Sb(III) for 30
passages in order to obtain a (partial) revertant line. Leishmania promastigotes were
transfected by electroporation as reported previously (49). Growth curves were obtained by
measuring absorbance at 600 nm of a 200l culture aliquot 72 hours after inoculation using
an automated microplate reader (Organon Teknica microwell system).
DNA manipulations
Total DNA was isolated using DNAzol reagent (Invitrogen) as recommended by the
manufacturer. Southern blot hybridizations and washing were performed following standard
protocols (55) and all probes were obtained by PCR. Densitometric analyses of southern
blots were performed using ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics). The pspneo-MRPA
construct transfected in the L. infantum Sb2000.1rev P30 strain has been described
previously (48).
Microarray Design
The recent completion of the genome sequencing of L. major (29) and L. infantum (50) has
allowed the generation of multispecies high-density oligonucleotide microarrays. Our
analysis of ORF sequence conservation between L. major and L. infantum revealed that
136
these species share 91-96% nucleotide identity (unpublished). 70-mer oligonucleotides
were designed for each ORF of L. infantum and L. major using automated bioinformatic
procedures. The genome of both species was first compared using BLAST and homologous
genes were grouped together. Probes were designed with consistent thermodynamic
properties. Probes were initially designed for L. infantum with the added requirement that
the region targeted by the probes had a perfect homology between the two species. For
common probes, up to two mismatches (out of 70) were tolerated. In the case that more
than two mismatches were present in a given gene between L. infantum and L. major, an
additional probe was designed for L. major. The microarray included a total of 8,841 70mer oligonucleotides that recognized all L. infantum genes with no mismatches (8,184,
GeneDB version 2) and also all L. major genes (8,370, GeneDB version 5.1) with two
mismatches or less. A total of 372 control probes were also included in the microarray for
assessing the synthesis variability, the location of probes within a given ORF and the
number of mismatches. The probes were synthetised in 384-well plates at Invitrogen. The
microarrays were printed on SuperChip (Erie Scientific) using a BioRobotics MicroGrid
(Genomic solutions Inc, Ann Arbor, MI). Each probe was printed in duplicate on the
microarray.
RNA isolation and labeling
Total RNA was isolated from 108 Leishmania cells during the mid-log phase of growth
using the RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) as described by the manufacturer. The RNAs
were treated with RNase-free DNAse I Turbo (Ambion) to avoid any genomic
contamination. The quality and quantity of RNA were assessed using RNA 6000 Nano
Assay chips on a Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies). The major criterion for RNA
integrity was the presence of three clear ribosomal peaks (18S, 24S and 24S) and the
absence of RNA degradation. 10g of RNA were converted to aminoallyl-dUTP
incorporated cDNA using random hexamers (Roche) and the SuperScript III Rnase HReverse Transcriptase (Invitrogen). Aminoallyl-dUTP incorporated cDNAs were thereafter
coupled to Alexa Fluor 555 or Alexa Fluor 647 following manufacturer recommendations.
137
Fluorescent cDNAs were purified with MinElute Spin Column (Qiagen) and quantified
spectrophotometrically.
Microarrays Hybridization
Pre-hybridization and hybridization were performed in hybridization chambers (Corning) at
42oC under immersion. Slides were pre-hybridized for 90 minutes in 5X Denhardt, 30%
formamide, 6X SSPE, 0.5% SDS, 100g/ml salmon sperm DNA. After pre-hybridization
and hybridization, slides were washed twice with 2X SSC, 0.1% SDS for 5 minutes at 42oC
with gentle agitation and then in 1X SSC, 0.2X SSC and 0.05X SSC for 3 minutes at room
temperature. For hybridization, fluorescently-labeled cDNAs were dried, resuspended in
2.5X Denhardt, 30% formamide, 6X SSPE, 0.5% SDS, 100g/ml salmon sperm DNA and
750g/ml Yeast tRNA, pooled, denatured 5 minutes at 95 oC and cooled at
42oC.
Hybridization were performed under a coverslip for 16 hours. Hybridizations were
performed in five replicates using five independent RNA extractions and appropriate dye
swapping.
Microarray Data Acquisition and Analysis
Detection of the Alexa Fluor 555 and Alexa Fluor 647 signals was sequentially performed
on a ScanArray 4000XL scanner (Perkin-Elmer) at a 5 m resolution. The signal intensity
data were extracted from the primary scanned images using the GenePix Pro 6.0 software
(Axon Technologies). Raw data were imported and normalization and statistical analyses
were performed in R 2.2.1 using the LIMMA (Linear Models for Microarray Data) 2.7.3
package (59-61). Before processing, probes were flagged according to their hybridization
quality (45).Weights were assigned to each array in order to give less weight to arrays of
lesser quality (52). Data were corrected using background substraction based on
convolution of normal and exponential distributions (53). Intra-arrays normalization was
carried out using the “print-tip loess” statistical method and inter-arrays normalization was
done using the “quantiles of A” test for each array (70). Statistical analysis was done using
138
linear model fitting and standard errors were moderated using a simple empirical Bayes
(59). Multiple testing corrections were done using the false discovery rate method with a
threshold p-value of 0.05. Only genes statistically significant with an absolute log2transformed expression ratio greater than 0.58 were considered as differentially expressed.
GeneSpring GX 3.1 was used for the generation of the chromosome map of expression
ratios.
Real-time RT-PCR
Three independent RNA preparations were used for each real-time PCR experiment. Firststrand cDNA was synthesized from 10g of RNA using random hexamers (Roche) and the
SuperScript III Rnase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) according to the manufacturer
recommendations. Equal amounts of cDNA were run in triplicate and amplified in 15 l
reactions containing 7.5l of 2X Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 10nM
Z-tailed forward primer, 100nM reverse primer, 250nM Amplifluor Uniprimer probe
(Chemicon) and 1uL cDNA target. Mixtures were incubated at 50°C for 2 minutes, at 95°C
for 4 minutes, and then cycled 55 times at 95°C for 15 seconds and at 55°C for 30 seconds
using an Applied Biosystems Prism 7900 Sequence Detector at the Gene Quantification
Core Laboratory of the Centre de Génomique de Québec (https://genome.ulaval.ca/qrtpcr).
No-template controls were used as recommended. Amplification were normalized to the
LinJ18_V3.0630 and LinJ36_V3.0850 genes, for which a highly stable expression was
noted in several conditions by different microarrays experiments, before quantities of target
genes were calculated according to standard curves. Primers were designed using Primer
Express 2.0 (Applied Biosystems).
139
Results
Gene expression profiling in Leishmania infantum antimony-resistant mutants
The completion of the Leishmania major (29) and Leishmania infantum (50) genome
sequences allowed the generation of full genome 70-mer oligonucleotides DNA
microarrays suitable for genome-wide expression profiling analyses in Leishmania major
and Leishmania infantum (66). The arrays were used to study gene expression modulation
associated with antimony resistance in the Leishmania infantum Sb2000.1 mutant. This
mutant is highly resistant to Sb(III) compared to its parental sensitive WT strain (Figure 1).
This mutant has already been studied with small targeted arrays of 50 genes (15, 34) but not
at the whole genome level. The log2-transformed gene expression ratios of the Sb2000.1
mutant compared to its parental strain are shown in Figure 2. As expected, the majority of
the spots aligned along the line of best fit, suggesting that genes represented by these spots
were equally expressed in both samples. Nonetheless, when applying a cut off of at least 2fold differential expression (p<0.05), 24 genes were found to be significantly modulated at
the RNA level in the Sb2000.1 mutant (Table 1). These included the gene coding for the
ABC transporter MRPA. Also, when the cut off was changed from 2-fold to 1.5-fold
difference in mRNA abundance (p<0.05), a total of 84 genes were found to be significantly
modulated in the Sb2000.1 mutant (Table 1). These included the ABCH1 gene for which a
slight increase in expression has recently been reported in this mutant (34).
DNA microarrays data were confirmed by real-time RT-PCR (qRT-PCR) experiments
performed on a set of twenty-one selected genes and an excellent correlation was found
between the two techniques with only few discrepant results (Figure 3A). Indeed, whereas
LinJ26_V3.0120 was found downregulated using DNA microarrays (-1.6 fold), it was
found to be overexpressed in the qRT-PCR experiments (+1.7 fold), although not at a
significant level. Furthermore, whereas LinJ14_V3.1450 and LinJ20_V3.1740 were
significantly upregulated using DNA microarrays, the overexpression was not significant in
the qRT-PCR experiments. The remaining genes showed similar significant differences in
mRNA abundance whether they were analyzed by qRT-PCR or DNA microarrays.
140
Intuitively, genes modulated in several independent resistant mutants would be those more
susceptible to be involved in resistance. Therefore, in order to associate specific gene
expression modulation with antimony resistance, the expression of the same set of genes
was assayed by qRT-PCR in another independently-selected antimony-resistant line, the L.
infantum Sb4000.4 mutant. Out of the sixteen genes significantly modulated by qRT-PCR
in Sb2000.1, seven showed a correlated differential expression in Sb4000.4 (Figure 3B).
The other nine genes predicted to be modulated in Sb2000.1 by qRT-PCR were either not
modulated at a significant level or were inversely regulated (althought not significantly) in
Sb4000.4. With its four fold decreased expression, LinJ05_V3.0830 is the gene that showed
the highest fold difference in both mutants, apart from LinJ23_V3.0290 (MRPA) which
upregulation is frequently reported in mutants selected for antimony resistance (Figure 3A
and B). This is the first report of LinJ05_V3.0830 being downregulated in antimonyresistant mutants of Leishmania and interestingly this gene was also shown to be highly
downregulated in two other independently-selected Sb(III)-resistant Leishmania infantum
strains, the Sb400.2 and Sb1000.3 mutants (Figure 3C). Since the expression of seven
genes was similarly modulated in two independent mutants, we performed transfection
experiments to test whether any of these seven genes could be involved in antimomy
resistance. The upregulated and downregulated genes were transfected in Leishmania
infantum WT and Sb2000.1, respectively. However, under our experimental conditions, we
could not observe a change in susceptibility except for cells transfected with
LinJ23_V3.0290 (MRPA) (results not shown and Figure 1).
Extrachromosomal circular amplification of a gene locus on chromosome 23
The data generated from the microarray hybridizations can be illustrated by a chromosome
map representing gene expression levels on a genomic scale (Figure 4). The expression
ratios of every gene on a particular chromosome is represented by a color code with
overexpressed genes shown as orange to red features, downregulated genes shown as pale
to bright green features and unmodulated genes shown as yellow features. This
representation enabled the identification of a locus on chromosome 23 that was clearly
overexpressed in Sb2000.1 (Figure 4, red locus on chromosome 23). A close examination
141
of the expression data derived from the microarrays allowed to precisely define the genes
located on this overexpressed locus. Indeed, the overexpressed genomic region comprises
the
genes
LinJ23_V3.0270,
LinJ23_V3.0280,
LinJ23_V3.0290
(MRPA)
and
LinJ23_V3.0300 (Figure 5A) which were all significantly upregulated in Sb2000.1,
whereas the genes flanking this four genes locus (LinJ23_V3.0260 and LinJ23_V3.0310)
were not differentially expressed. LinJ23_V3.0290 (MRPA) is frequently amplifed as part
of extrachromosomal amplicons in antimony-resistant mutants (19, 20, 47). Given that
alkaline lysis allowed the recovery of a circular amplicon from this mutant (Figure 5C), the
increased gene expression observed by DNA microarrays at the MRPA locus probably
resulted from the circular amplification of a small genomic region. Generation of circular
amplicons in Leishmania is often due to homologous recombination between direct repeats
(2, 20, 21, 47) and a close examination of the sequences bordering the amplified locus
indeed revealed the presence of a 1389 bp repeated sequence of 100% nucleotide identity
on each side of the locus amplified (Figure 5A). These direct repeats were also found on
chromosome 23 of Leishmania major and Leishmania braziliensis (data not shown). To
ascertain that the extrachromosomal circular amplicon was generated from homologous
recombinaison between these direct repeats, a pair of PCR primers was designed to amplify
a DNA fragment of 1.8 kb only from an extachromosomal circular template created by
recombination of the repeats and not from the chromosomal locus (Figure 5A). As
expected, amplification of the 1.8 kb DNA fragment was observed from total DNA of L.
infantum Sb2000.1 while no amplification was observed from total DNA of L. infantum
WT (Figure 5D). Sequencing of the PCR fragment confirmed that the circle was formed by
homologous recombination between the repeated sequences (data not shown).
Antimony resistance selection leads to aneuploidy
The expression of whole chromosomes seemed to be modulated in L. infantum Sb2000.1,
as suggested by the chromosome map of gene expression ratios (Figure 4). Indeed, whereas
genes from chromosomes 1, 11 and 25 seemed entirely overexpressed (predominantly
coloured in red), the chromosomes 9, 12 and 32 seemed entirely downregulated
(predominantly coloured in green). A close analysis of the normalized expression data
142
generated by the microarrays experiments confirmed that most genes located on these
chromosomes were modulated by a factor ranging from 1.5 to 2 in mRNA abundance (data
not shown). Plotting the expression data as a function of microarrays probes ordered by
chromosomal location for the entire genome (insert in Figure 4) or for selected
chromosomes (Figure 6) confirmed the uniform gene expression modulation of these
chromosomes. Although a number of hypotheses could explain the above phenomenon, one
favoured explanation for the modulated expression of entire chromosomes would be a
concomitant specific change in the number of allele for these chromosomes. This
contention received support from quantitative Southern blot hybridizations from which the
DNA contents of chromosomes 1, 11 and 25 were estimated to be respectively increased by
1.5-, 2- and 1.5-fold in Sb2000.1 (Figure 6 A, B and C, lane 1 and 2) while those of
chromosomes 12 and 32 (Figure 6 E and F, lanes 1 and 2) were decreased by 2-fold in this
mutant. Conversely, whereas gene expression of the entire chromosome 9 was decreased by
microarrays in L. infantum Sb2000.1, its DNA content was unchanged compared to L.
infantum WT (Figure 6 D, lanes 1 and 2). Interestingly, the DNA content of chromosome
11 was also increased in the Sb4000.4 antimony-resistant mutant (Figure 6B, lane 3) while
the DNA content of the entire chromosome 12 was also decreased in this independentlyselected strain (Figure 6E, lane 3). As a control, chromosomes 30 and 35, whose gene
expression was unchanged in the microarrays data, showed equal DNA content in L.
infantum WT, Sb2000.1 and Sb4000.4 (Figure 6A-F).
Finally, as examplified by
chromosomes 11 and 32, the probes used for DNA hybridization were physically located
far apart from each other, supporting a change in ploidy for the entire chromosomes.
A correlation between aneuploidy and drug resistance has already been described in yeast
(57). In order to verify if the aneuploidy observed in Sb2000.1 and Sb4000.4 could be
associated with antimony resistance, a partial revertant line of Sb2000.1 (Sb2000.1rev) was
generated by successive passages in absence of antimony. Resistance levels of the revertant
line to Sb(III) decreased with the increasing number of passages in absence of drug but
never completely reverted to the parental wildtype level (Figure 1). The decreased
resistance after 30 passages in the absence of Sb(III) was correlated with the concomitant
143
loss of the extrachromosomal amplicon carrying MRPA (Figure 1 and 7A) and of the
regression of aneuploidy of chromosomes 1, 11 and 25 to wildtype ploidy (Figure 1 and
7B). Furthermore, the transfection of MRPA into the revertant line only partially restored its
resistance against antimony (Figure 1), thus circumstantially linking the antimony
resistance levels and the supernumerary chromosomes copy number. Leishmania appeared
haploid for chromosomes 12 and 32 and this genotype was stable for 30 passages without
antimony (Figure 7C) and thus could be associated with the residual Sb(III) resistance
levels observed in L. infantum Sb2000.1revP30 compared to L.infantum WT (Figure 1).
Despite this partial haploid genome, the mutant divided at the same rate as wildtype cells
(results not shown).
144
Discussion
Microarrays are now being used for studying various aspects of Leishmania. The initial
studies have dealt with a limited number of genes but genome-wide surveys are now being
reported (27, 33, 56, 66). Gene expression studies using whole-genome 70-mer
oligonucleotide microarrays revealed the complexity of the genotype associated with
antimony resistance in the L. infantum Sb2000.1 resistant mutant. Indeed, several genes
showed a significant difference in expression compared to the parental sensitive WT strain,
some of which were part of an extrachromosomal amplicon while others were located on
supernumerary chromosomes. The set of differentially regulated genes between L. infantum
WT and Sb2000.1 included two ABC protein-coding genes, LinJ11_V3.0040/ABCH1 and
LinJ23_V3.0290/MRPA, whose upregulation in Sb2000.1 had previously been reported but
for which the mechanisms leading to an increased expression were not understood (34).
The genome-wide survey reported here revealed that the overexpression of ABCH1 is due
to an increase in the number of copies of chromosome 11. The microarrays were also useful
to map precisely the region amplified encoding MRPA and three other genes on
chromosome 23. Repeated sequences bordered the amplified locus and homologous
recombination between these direct repeats was responsible for the generation of the
circular amplicon isolated from Sb2000.1. Gene amplification through homologous
recombination between repeated sequences is a common mechanism of drug resistance in
Leishmania (2, 6, 20, 21, 36, 47). This propensity of Leishmania to resort to genetic
recombination as a mean to modulate gene expression may be a consequence of the lack of
transcriptional control in trypanosomatid parasites (7). Indeed, gene-specific expression
modulation happened only for a limited number of genes, and genes with a gross variation
in RNA are usually part of amplicons generated by DNA recombination events.
Accordingly, repeated sequences may flank key drug resistance genes to allow their
amplification under conditions where an increase of a specific protein is required.
Consistent with this proposal, the direct repeats flanking MRPA on chromosome 23 are
conserved in L. infantum, L. major and L. braziliensis, despite over fifteen million years of
proposed divergence (37).
145
It is plausible that in absence of direct or inverted repeats in the vicinity of a resistance
gene, Leishmania could resort to aneuploidy to modulate the expression of relevant genes.
Indeed, analysis of our microarrays data showed that gene expression modulation of entire
chromosomes (e.g chromosomes 1, 11, 12, 25, 32) was associated with a concomitant
change in ploidy in the Sb2000.1 antimony-resistant mutant. The only exception was the
minor decrease in gene expression of chromosome 9 that was not correlated to a change in
copy number. This phenomenon was previously observed in a L. major methotrexateresistant strain (66) and may involve some epigenetic mechanisms that remain to be
elucidated. Supernumerary chromosomes have already been described when attempting to
inactivate essential genes in Leishmania (11, 40), and drug-resistant parasites could also
increase the copy number of chromosomes carrying genes relevant to resistance. Wholechromosome aneuploidy and specific segmental aneuploidy were observed for
chromosomes encoding drug resistance genes in azole-resistant strains of Candida albicans
(8, 57) and in drug-resistant carcinomatous lung cancer cells (14). The expression of genes
present on chromosomes 12 and 32 was lower since the lost of one copy of their
chromosome led to a partial haploid mutant. While segmental haploidy could be induced by
telomere-mediated chromosome fragmentation (64), this is the first example of druginduced haploidy in Leishmania. The antimony-related metalloid arsenite is known to
induce several mitotic abnormalities such as derangement of the spindle apparatus and
alteration of chromosome segregation leading to aneuploidy and to chromosome loss in
human fibroblasts (71). It is possible that haploidy coming from the loss of specific
chromosomes could be associated with antimony resistance in Leishmania, like in ovarian
carcinoma cell lines selected for resistance to microtubules stabilizing agents (68).
A role for aneuploidy in Leishmania drug resistance is supported by the presence of similar
changes in ploidy for two chromosomes in the independently-selected Sb4000.4 antimonyresistant strain (Figure 6) and by the good correlation observed between Sb(III) resistance
levels and the copy number of aneuploid chromosomes in Sb2000.1 (Figure 1 and Figure
7). Accordingly, given that supernumerary chromosomes have also been observed in a
Leishmania major strain selected for methotrexate resistance (66), it is possible that
146
alterations in the number of copy of chromosomes could be associated with gene
expression changes implicated in drug resistance in Leishmania. Obviously, further work
will be required to identify which genes, if any, could be associated with antimony
resistance in Sb2000.1. One such candidate could be LinJ11_V3.0710, a gene located on
chromosome 11 that is supernumerary in both Sb(III)-resistant mutants tested and which
encodes an anion-transporting ATPase homologous to the bacterial ArsA protein. Although
ArsA homologs were not thought to be involved in metal resistance in eukaryotes, it has
recently been reported that downregulation of the ArsA homolog in Caenorhabditis elegans
(asna-1) resulted in sensitization of the worm to antimony and to its related metalloid
arsenite (65).
Finally, the LinJ05_V3.0830 gene encodes a methylthioadenosine phosphorylase (MTAP)
and was downregulated several folds in many independent L. infantum Sb(III)-resistant
mutants (Figure 3). Accordingly, although a link with antimony resistance is still missing,
downregulation of this gene might be a good biomarker candidate predictive of Sb(III)
resistance, at least in L. infantum parasites. The genes flanking LinJ05_V3.0830 were not
differentially expressed between L. infantum WT and Sb2000.1 (result not shown) so its
specific downregulation could be mediated by changes in mRNA stability (3, 41). MTAP is
part of the methionine recycling pathway and downregulation of its yeast homologue
(meu1) is associated with an increase in ornithine decarboxylase (ODC) activity (62). ODC
is frequently overexpressed (26, 42) along with GSH1 (19, 42) in metal-resistant
Leishmania mutants in order to increase the synthesis of trypanothione (TSH), a key player
of antimony resistance in trypanosomatid parasites. Interestingly, ODC (LinJ12_V3.0100)
is located on chromosome 12 which has lost a copy in Sb2000.1 and Sb4000.4, and
downregulation of LinJ05_V3.0830 could thus be linked to the decreased polyamine pool
following haploidy of this chromosome. Further experimental work will be required to test
this but its is interesting to note that a relation between expression of specific genes and
aneuploidy has already been described in Saccharomyces cerevisiae (28).
147
Overall, the whole-genome expression profiling experiments enabled the identification of
several genotypic changes associated with antimony resistance in Leishmania. Although
few genes in this study showed a dramatic modulation in expression, the antimonyresistant phenotype might occurs from the synergistic interactions of several genes. With
the exception of MRPA, the expression of several genes known to be involved in
antimonials resistance (see Introduction) was not modulated in the Sb2000.1 mutant, which
suggest that several mechanisms can lead to resistance. The arrays also allowed the
identification of two novel phenomenons, including partial haploidy and supernumerary
chromosomes. Further work is required to isolate the putative resistance genes located on
aneuploid chromosomes and should also reveal if similar genetic events occur in clinical
isolates.
148
Aknowledgments
We thank Dr. Eric Madore for his help during the optimization of the microarray
hybridization protocol. This work was funded in part by CIHR group grant to JC and MO
and operating grants to MO. PL and FR are recipients of a CIHR studenship, JC holds the
Canada Research Chair in Medical Genomics, and MO is a Burroughs Wellcome Fund
Scholar in Molecular Parasitology and holds the Canada Research Chair in Antimicrobial
Resistance.
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GeneDB V3.0
systematic ID
LinJ02_V3.0520
LinJ03_V3.0360
LinJ05_V3.0280
LinJ05_V3.0830
LinJ06_V3.1280
LinJ06_V3.1340
LinJ06_V3.1350
LinJ09_V3.0100
LinJ09_V3.0580
LinJ09_V3.0650
LinJ09_V3.0690
LinJ09_V3.0970
LinJ09_V3.0980
LinJ09_V3.1050
LinJ12_V3.0010
LinJ12_V3.0020
LinJ12_V3.0040
LinJ12_V3.0080
LinJ12_V3.0110
LinJ12_V3.0120
LinJ12_V3.0130
LinJ12_V3.0290
LinJ12_V3.0350
LinJ12_V3.0680
LinJ12_V3.0690
LinJ17_V3.0120
LinJ18_V3.1640
LinJ23_V3.1830
LinJ23_V3.1930
LinJ26_V3.0120
LinJ29_V3.0260
LinJ30_V3.2870
LinJ31_V3.0610
LinJ31_V3.0430
LinJ31_V3.1240
LinJ31_V3.2380
LinJ32_V3.0240
LinJ32_V3.0360
LinJ32_V3.0690
LinJ32_V3.1760
LinJ32_V3.2020
LinJ32_V3.2030
LinJ32_V3.2150
LinJ32_V3.2400
LinJ32_V3.3100
LinJ32_V3.3110
LinJ32_V3.3350
LinJ32_V3.4080
LinJ34_V3.2150
LinJ35_V3.1050
LinJ36_V3.0430
Gene description
Downregulated in ldi Sb2000.1
hypothetical protein, unknown function
hypothetical protein, conserved
protein tyrosine phosphatase, putative
methylthioadenosine phosphorylase, putative
hypothetical protein, conserved
protoporphyrinogen oxidase-like protein
hypothetical protein, unknown function
RNA-binding protein 5-like protein
leucine-rich repeat protein, putative
cyclin 1, putative
hypothetical protein, conserved
calmodulin, putative
calmodulin, putative
hypothetical protein, conserved
surface antigen protein 2, putative
surface antigen protein 2, putative
surface antigen protein 2, putative
No description
surface antigen protein, putative
HGPRT,hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
XRPT, xanthine phosphoribosyltransferase
hypothetical protein, unknown function
3'-nucleotidase/nuclease, putative
surface antigen protein 2, putative
surface antigen protein 2 precursor
receptor-type adenylate cyclase a
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, unknown function
hypothetical protein, conserved
adenine phosphoribosyltransferase
oxidase-like protein
hypothetical protein, conserved
amino acid transporter aATP11, putative
calpain-like cysteine peptidase, putative
vacuolar-type proton translocating pyrophosphatase 1
3'-nucleotidase/nuclease precursor, putative
dynein light chain, flagellar outer arm, putative
hypothetical protein, conserved
centrin, putative
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
COP-coated vesicle membrane protein p24 precursor
hypothetical protein, unknown function
nucleoside diphosphate kinase b
nucleoside diphosphate kinase b
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, unknown function
hypothetical protein, unknown function
hypothetical protein, conserved
2000.1/WT ratios
-1,72
-2,08
-1,73
-3,01
-2,60
-1,74
-2,00
-1,70
-1,70
-1,78
-2,00
-1,89
-1,89
-1,69
-1,88
-1,75
-1,88
-1,88
-1,99
-1,77
-1,87
-1,72
-1,68
-1,75
-1,88
-1,80
-1,76
-1,79
-1,98
-1,85
-2,81
-1,73
-1,72
-1,87
-1,94
-2,59
-1,79
-1,70
-1,79
-2,57
-1,96
-1,72
-1,84
-2,33
-1,69
-1,69
-1,79
-1,71
-1,87
-2,06
-1,71
156
Upregulated in ldi Sb2000.1
LinJ01_V3.0470
LinJ01_V3.0540
LinJ11_V3.0020
LinJ11_V3.0030
LinJ11_V3.0040
LinJ11_V3.0080
LinJ11_V3.0130
LinJ11_V3.0170
LinJ11_V3.0180
LinJ11_V3.0210
LinJ11_V3.0240
LinJ11_V3.0520
LinJ11_V3.0550
LinJ11_V3.0560
LinJ11_V3.0570
LinJ11_V3.0580
LinJ11_V3.0590
LinJ11_V3.0680
LinJ11_V3.0690
LinJ11_V3.0730
LinJ14_V3.1420
LinJ14_V3.1450
LinJ17_V3.0390
LinJ19_V3.0870
LinJ20_V3.1740
LinJ23_V3.0270
LinJ23_V3.0280
LinJ23_V3.0290
LinJ23_V3.0300
LinJ23_V3.0700
LinJ25_V3.0740
LinJ25_V3.0750
LinJ25_V3.0760
LinJ25_V3.1040
LinJ25_V3.1210
LinJ25_V3.1680
LinJ25_V3.1700
LinJ25_V3.2260
LinJ25_V3.2360
LinJ25_V3.2580
LinJ29_V3.1320
LinJ29_V3.2940
LinJ31_V3.0750
LinJ33_V3.3260
LinJ33_V3.3390
a
p< 0.05
alpha/beta-hydrolase-like protein
long chain fatty acid CoA ligase, putative
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
ABC transporter, putative
hypothetical protein, conserved
NGG1 interacting factor 3-like protein
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
acidocalcisomal pyrophosphatase
proteasome alpha 7 subunit, putative
nucleoside transporter-like protein
amino acid permease/transporter, putative
protein kinase, putative
hypothetical protein, conserved
tetratricopeptide repeat (TPR) protein
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved in leishmania
hypothetical protein, conserved in leishmania
hypothetical protein, conserved
delta-6 fatty acid desaturase, putative
myo-inositol-1-phosphate synthase
hypothetical protein, conserved
pteridine transporter, putative
aminoacylase, putative
hypothetical protein, conserved
terbinafine resistance locus protein (yip1)
multidrug resistance protein, putative
argininosuccinate synthase, putative
hypothetical protein
eukaryotic initiation factor 5a, putative
eukaryotic initiation factor 5a, putative
eukaryotic initiation factor 5a, putative
hypothetical protein, conserved
ATPase beta subunit, putative
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
ATPase beta subunit, putative
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
hypothetical protein, conserved
h1 histone-like protein
2,24
1,77
1,89
1,69
1,75
1,68
1,72
1,71
2,13
1,99
2,08
2,49
1,78
1,71
2,09
1,86
1,83
1,88
1,88
1,95
1,69
2,27
1,76
1,70
2,35
4,30
8,50
5,39
5,59
1,92
1,91
1,91
1,91
2,02
1,80
1,69
1,71
1,68
1,69
1,96
1,73
1,88
2,16
1,77
2,15
157
Legend to figures
Fig. 1. Antimony susceptibility of L. infantum. Growth of L. infantum promastigote cells
was monitored at 72 hours by OD mesurements at 600 nm. The average of three
experiments is shown.
Fig. 2. Gene expression profiling of antimony-resistant L. infantum promastigotes. Plot
of log2-transformed Sb2000.1/WT expression ratios as a function of hybridization
intensities. An average of five independent experiments is presented. External lines and
dashed lines indicate 2-fold and 1.5-fold differences, respectively. The entire dataset was
deposited to GEO under the reference number series GSE9949.
Fig. 3. Validation of DNA microarrays expression data by quantitative real-time RTPCR (qRT-PCR). A. The mean log2 ratios of selected genes from microarrays expression
data (black bars) are compared to qRT-PCR data (grey bars) for L. infantum Sb2000.1. B.
The mean log2 qRT-PCR expression ratios of selected genes compared between the L.
infantum Sb2000.1 (black bars) and Sb4000.1 (grey bars) mutants. C. The mean log2 qRTPCR expression ratios of LinJ05_V3.0830 and LinJ_V3.0290 in different L. infantum
antimony-resistant mutants.
Fig. 4. Chromosome map of L. infantum Sb2000.1/WT expression modulation. DNA
microarray data were analyzed with the GeneSpring GX3.1 software to illustrate the
Sb2000.1/WT expression ratios on a chromosome map of L. infantum. Orange to red
features indicate genes overexpressed in Sb2000.1 whereas pale to bright green features
indicate genes downregulated in Sb2000.1. Yellow features indicate genes equally
expressed in both samples. (Insert) Log2-transformed Sb2000.1/WT expression ratios
plotted as a function of the chromosomal location of every probes represented on the full-
158
genome microarrays from chromosome 1 (left end)) to chromosome 36 (right end). Probes
are plotted by coordinate along each chromosome. Vertical bars represent the log2transformed expression ratio of individual genes. Whereas most of the genes represented by
the microarrays do not show a modulated expression, some chromosomes are entirely
overexpressed or downregulated at the RNA level. The plot represent the average values of
five independent hybridizations. (A) chromosome 1; (B) chromosome 11; (C) overexpresed
locus on chromosome 23; (D) chromosome 25; (E) chromosome 9; (F) chromosome 12;
(G) chromosome 32.
Fig. 5. Extrachromosomal circular amplification of a genomic region encoding the
MRPA gene on chromosome 23 of Leishmania. A. Genomic organization of the MRPA
locus in L. infantum showing the relative expression of genes in the Sb2000.1 mutant as
determined by DNA microarrays. Direct repeats of 1.4 kb are indicated by small boxes and
the approximate position of PCR primers 1a and 1b is indicated. B. Model for the formation
of the extrachromosomal circular DNA generated through homologous recombination
between direct repeats. C. Isolation of a circular DNA amplicon by standard alkaline lysis
preparation. D. PCR amplification of a 1.8 kb DNA fragment with primers 1a and 1b to
support the model shown in Fig. 5B. Lane 1, L. infantum wild-type; Lane 2, L. infantum
Sb2000.1.
Fig. 6. Chromosome aneuploidy in L. infantum Sb2000.1 and Sb4000.4 antimonyresistant mutants. Log2-transformed Sb2000.1/WT expression ratios of the upregulated
(A) chromosome 1, (B) chromosome 11 and (C) chromosome 25 and of the downregulated
(D) chromosome 9, (E) chromosome 12 and (F) chromosome 32 plotted as a function of
the location of microarray probes on individual chromosomes. For each plot, the log2transformed expression ratios of chromosome 30, which was equally expressed in both
samples, are shown as a control. Quantitative Southern blot hybridizations of digested
genomic DNA extracted from L. infantum WT (lane 1), Sb2000.1 (lane 2) and Sb4000.4
(lane 3) were performed to correlate gene expression modulation of entire chromosomes
159
with the chromosome DNA copy number. The hybridization signals of LinJ30_V3.2990
and LinJ35_V3.1740 located on chromosomes equally expressed between L. infantum WT
and Sb2000.1 were used for normalization. The hybridization signals were quantified using
ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics) and values are found below each blot.
Fig. 7. Stability of the extrachromosomal circular amplicon and of chromosome
aneuploidy in the revertant strain L. infantum Sb2000.1rev. Extrachromosomal circular
amplicon isolated by alkaline lysis (A) and quantitative Southern blots of digested genomic
DNA hybrized with probes specific to chromosomes 1, 11 and 25 (B) or specific to
chromosomes 12 and 32 (C) for L. infantum WT (Lane 1), L. infantum Sb2000.1 (Lane 2)
and for a revertant strain of L. infantum Sb2000.1 grown for 5 (Lane 3), 10 (Lane 4), 20
(Lane 5) and 30 (Lane 6) passages in the absence of Sb(III). The hybridization signals of
LinJ30_V3.2990 located on a chromosome equally expressed between L. infantum WT and
Sb2000.1 were used for normalization of Southern blots hybridization signals. Fold
differences in hybridization intensities between L. infantum Sb2000.1 and WT are indicated
below the Southern blots.
160
Figure 1
161
Figure 2
162
Figure 3
163
Figure 4
164
Figure 5
165
Figure 6
166
Figure 7
167
CHAPITRE 8. DISCUSSION GÉNÉRALE
8.1 Étude des mécanismes de résistance
La résistance aux médicaments est un problème global qui amenuise le traitement des
infections en général. Dans le cas des infections parasitaires, la résistance clinique est
maintenant retrouvée en proportion épidémique au niveau de certaines régions du monde.
De plus, l’absence de vaccins et la lenteur du développement de nouveaux médicaments
sont des éléments qui démontrent l’essentialité d’étudier les mécanismes responsables de
l’échec thérapeutique des anti-protozoaires. Alors que l’étude des mécanismes d’action des
médicaments favorise l’identification de combinaisons synergiques permettant la
prévention ou le ralentissement du développement de la résistance, l’étude des mécanismes
sous-jacents à la résistance favorise 1) l’identification de biomarqueurs qui facilite la
détection précoce des cas d’infections résistantes, ce qui permet une meilleure utilisation
des médicaments disponibles et 2) l’élucidation des principaux mécanismes de défense
cellulaires et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, ce qui facilite l’élaboration
de médicaments plus efficaces.
L’étude de la résistance aux médicaments chez Leishmania s’effectue généralement par la
sélection en gradation croissante de mutants résistants suivie de l’analyse comparative des
génotypes entre les parasites résistants et la souche parentale sensible. Ainsi, la
comparaison des génotypes de plusieurs mutants résistants favorise l’identification des
mécanismes généraux impliqués dans la résistance. La plupart des mécanismes impliqués
dans l’échec des agents chimiothérapeutiques proviennent d’événements qui diminuent les
interactions entre le médicament et sa cible cellulaire. La sélection de résistance étant en
mesure d’engendrer plusieurs modifications au niveau de la cellule, différentes techniques
génomiques sont maintenant utilisées en parasitologie pour l’étude des mécanismes de
résistance à grande échelle. Chacune des techniques possède certains avantages et certains
inconvénients, l’utilisation de plusieurs d’entre elles étant parfois nécessaire à l’obtention
du portrait global des mécanismes de résistance. Le clonage fonctionnel consiste en la
168
transfection d’une banque de cosmides couvrant le génome entier de Leishmania suivie de
la sélection de résistance ou de susceptibilité contre le médicament à l’étude. Seuls les
transfectants ayant acquis un cosmide comprenant un gène impliqué dans la résistance
seront en mesure de croître en conditions de sélection et l’analyse subséquente du cosmide
en question permet l’identification du (des) gène(s) impliqué(s) dans la résistance. Une
autre approche consiste à étudier l’expression des gènes du génome entier du parasite par
puces à ADN ou par certaines approches protéomiques. L’avantage des puces à ADN réside
en leur capacité à détecter la présence d’amplifications ou de délétions géniques et en la
facilité avec laquelle elles permettent l’élucidation des mécanismes impliqués dans ces
phénomènes. L’avantage de la protéomique provient de sa capacité à détecter les
modifications post-traductionnelles et du fait que l’étude des protéines est plus
représentative de l’activité métabolique cellulaire. Finalement, le séquençage du génome de
parasites sensibles et de parasites résistants constitue une dernière approche génomique
utilisée en parasitologie. Cette approche permet l’identification des mutations qui seraient
survenues chez les mutants résistants et qui sont impliquées dans le phénotype de
résistance.
La disponibilité de la séquence du génome de Leishmania (www.genedb.org) facilite
l’identification des familles de protéines démontrant un rôle potentiel dans la résistance aux
médicaments. En effet, des analyses systématiques de type BLAST en utilisant une région
conservée comme séquence interrogatrice permettent de retrouver l’ensemble des protéines
appartenant à une même famille qui sont encodées dans le génome du parasite. L’étude
subséquente de la fonction des protéines à l’aide d’expériences de surexpression et de
délétion génique permet d’apprécier l’implication de la famille d’intérêt dans la résistance.
Les travaux présentés dans cette thèse ont porté sur l’étude de l’implication des protéines
ABCC dans la résistance à l’antimoine chez Leishmania ainsi que sur l’étude
transcriptomique du génome complet du parasite en réponse au phénotype de résistance à
l’antimoine. En outre, l’analyse du génome de Leishmania nous a permis de démontrer la
diversité de la famille des protéines ABC chez ce parasite, la surexpression des gènes de la
sous-famille ABCC nous a permis de démontrer l’implication de deux protéines
intracellulaires dans la résistance à l’antimoine, alors que les analyses transcriptomiques par
169
puces à ADN ont démontré l’utilité de l’approche transcriptomique à grande échelle pour
l’étude de la résistance chez Leishmania.
8.2 Diversité de la famille des protéines ABC chez Leishmania
La superfamille des protéines ABC représente une famille de protéines ubiquitaires pour
laquelle l’importance et la diversité fonctionnelle peuvent être représentées par la multitude
de maladies génétiques associées aux mutations de leurs gènes chez l’humain (88). Les
homologies de séquence retrouvées au niveau des domaines NBD de ces protéines
permettent la division de la superfamille en plusieurs sous-familles de protéines aux
fonctions apparentées. La caractérisation de la famille ABC chez Leishmania a été
entreprise suite au désir d’investiguer le rôle de la sous-famille ABCC dans la résistance à
l’antimoine chez ce parasite. Ainsi, la définition et la classification phylogénique de la
famille ABC complète était nécessaire afin d’identifier l’ensemble des membres
appartenant à la sous-famille ABCC chez Leishmania. L’analyse du génome de L. major
avec la séquence pfam0005 (http://pfam.janelia.org/) comme séquence référence a révélé la
présence de 42 gènes codant pour des protéines ABC. Une analyse phylogénique à partir
des domaines NBD a ensuite permis de déterminer que les 42 protéines sont réparties parmi
les huit sous-familles de protéines ABC retrouvées chez les eucaryotes. En effet, le génome
de Leishmania encode 10 protéines ABCA, 4 protéines ABCB, 8 protéines ABCC, 3
protéines ABCD, 1 protéine ABCE, 3 protéines ABCF, 6 protéines ABCG, 3 protéines
ABCH et 4 protéines n’appartenant à aucune sous-famille eucaryote. De plus, l’analyse
phylogénique des protéines ABC à partir des domaines NBD seuls ou à partir de la
séquence complète des protéines démontrent une classification similaire, ce qui suggère que
chaque sous-famille contient probablement des acides aminés conservés mis à part la
séquence NBD.
Le séquençage du génome de L. infantum venait tout juste de se terminer lors de
l’identification des gènes ABC chez Leishmania et une première analyse de la séquence des
contigs révéla un complément de gènes ABC identique entre L. major et L. infantum.
Cependant, l’analyse d’une version plus récente (GeneDB V3.0) du génome de L. infantum
a révélé la présence d’un gène ABCC supplémentaire (liABCC9) qui est spécifique à cette
170
espèce. Le fait que liABCC9 soit absent du génome de L. major mais présent sous forme de
pseudogène chez L. braziliensis favorise grandement l’hypothèse selon laquelle ce gène
était présent lors de la divergence évolutive du genre Leishmania, mais qu’il ait été perdu
lors de la divergence de certaines espèces. Un phénomène similaire a été observé chez le
nématode Caenorhabditis. La comparaison de C. elegans, C. briggsae et C. remanei a
démontré un complément de protéines ABC très similaire entre les trois espèces, bien que
l’analyse phylogénique des différentes sous-familles suggère que des événements de
délétion et de duplication de gènes soient survenus après la divergence individuelle de ces
espèces (402). Une analyse comparative du génome de L. major, L. infantum et L.
braziliensis a révélé très peu de gènes spécifiques à chacune des espèces du parasite (268).
De plus, très peu de gènes ont été identifiés comme étant impliqués dans le tropisme
d’infection différentiel de ces trois espèces. Ainsi, il sera intéressant d’étudier l’impact de
la délétion de liABCC9 sur la pathogenèse de L. infantum.
8.3 Évolution des protéines ABC chez Leishmania
Avec 42 représentants, Leishmania possède le complément de protéines ABC le plus
complet parmi les protistes qui ont été analysés jusqu’à maintenant. En effet, les génomes
des Apicomplexes Plasmodium et Toxoplasma encodent respectivement 15 (348) et 20
(300) protéines ABC, alors que les génomes de Trypanosoma brucei et Trypanosoma cruzi
encodent respectivement 22 et 28 protéines ABC. Chez Leishmania, les gènes ABC sont
répartis sur plusieurs chromosomes, un phénomène qui est observé chez d’autres
organismes. Alors que la plupart des gènes ABC sont retrouvés seuls dans le génome,
d’autres sont retrouvés en groupes de deux ou trois gènes en tandem sur certains
chromosomes. La présence de gènes ABC regroupés en tandem est suggestif d’événements
de duplication génique, une hypothèse renforcée par le fait que ces groupes de gènes sont
constitués de membres appartenant à une même sous-famille. L’analyse génomique
comparative d’organismes apparentés permet d’étudier l’évolution des gènes paralogues
qui sont générés lors de l’expansion des familles de gènes. Le terme paralogie est utilisé
pour définir les gènes homologues d’origine commune qui sont générés suite à des
événements de duplication génique chez un organisme et qui sont généralement retrouvés
171
au niveau de groupes de gènes en tandem. Les paralogues d’un organisme subissent
habituellement des pressions de sélection qui génèrent des fonctions soient similaires,
soient divergentes. Ainsi, la comparaison des protéines ABC de Leishmania avec celles de
Trypanosoma a confirmé que les sous-familles ABCA, ABCC et ABCG ont subi une
expansion chez Leishmania après la divergence évolutive de ces deux genres. Cette
observation corrèle avec une analyse génomique qui a démontré que les protéines possédant
des fonctions de transport semblent évoluer rapidement entre Leishmania et Trypanosoma,
particulièrement entre L. major et T. brucei (112). Cette disparité au niveau des protéines
ABC entre Leishmania et Trypanosoma pourrait résulter de leurs niches écologiques
différentes qui nécessitent des besoins variés et qui induisent une pression de sélection sur
le complément de protéines ABC. Les protéines ABCC sont impliquées dans l’expulsion ou
la séquestration de molécules toxiques (95) et pourraient protéger Leishmania des
environnements inhospitaliers que représentent le système digestif de l’insecte vecteur et le
phagolysosome des macrophages. Les sous-familles ABCA et ABCG sont impliquées dans
le transport de phospholipides et de stérols et au moins deux protéines ABCA et une
protéine ABCG ont démontré une capacité à transporter les phospholipides chez
Leishmania (20, 56, 266). Ainsi, ces protéines pourraient être impliquées dans le transport
et la récupération de lipides chez Leishmania, un aspect important de la biologie du parasite
(97, 400, 401).
L’identification de gènes orthologues de fonctions connues permet d’émettre certaines
hypothèses quant à la fonction des protéines et favorise la compréhension de la biologie de
l’organisme à l’étude. Le terme orthologie est utilisé pour définir les gènes homologues
d’origine commune séparés par la divergence évolutive des espèces. Ainsi, des orthologues
retrouvés au niveau d’organismes différents possèdent généralement des fonctions très
similaires. Très peu de gènes ABC orthologues ont été identifiés entre Leishmania et les
organismes eucaryotes analysés qui sont situés à l’extérieur de la famille des
Trypanosomatidae. En effet, l’analyse phylogénique a révélé que les gènes ABC
orthologues appartiennent principalement aux sous-familles de protéines ABC solubles
(ABCE et ABCF), qui sont plus conservées et qui ont subi très peu d’événements de
duplication ou de délétion génique au cours de l’évolution. Une conclusion similaire a été
rencontrée pour la quasi totalité des études qui se sont attardées à l’évolution des protéines
172
ABC chez d’autres eucaryotes (17, 92, 317), avec les sous-familles ABCA, ABCB, ABCC
et ABCG démontrant la plus grande divergence entre les organismes. Par exemple, un
groupe de cinq gènes ABCA dupliqués en tandem chez l’humain semble avoir subi
plusieurs événements de duplication et de délétion génique au cours de l’évolution (18). De
plus, alors que le gène ABCC13 est retrouvé sous forme de pseudogène chez certains
mammifères comme les rongeurs, la plupart des primates et l’humain, une copie
fonctionnelle de ce gène demeure présente chez le chien et les macaques rhésus (18, 19).
Finalement une analyse a révélé que la fréquence de gènes ABC orthologues entre
l’humain, la drosophile, le nématode C. elegans et la levure S. cerevisiae est inférieure à
20% lors de la comparaison par paires de ces organismes (317). Ainsi, il est évident que la
famille des protéines ABC évolue selon les besoins spécifiques de chaque organisme par
des événements de duplication et de délétion génique qui sont responsables de l’expansion
et de l’élimination des différentes sous-familles.
8.4 Les protéines ABC comme cibles thérapeutiques
Les analyses phylogéniques comparatives permettent de révéler certains aspects importants
de la biologie des organismes et peuvent aider à l’identification de nouvelles cibles
thérapeutiques. En effet, il est intéressant de noter la présence d’une seule copie du gène
ABCE1 au niveau du génome de Leishmania. ABCE1 est une protéine soluble à
groupement Fe/S qui joue un rôle essentiel dans l’assemblage des ribosomes (107, 186,
187, 393). La déplétion de son ARNm entraîne un arrêt de croissance associé à une
diminution de la synthèse protéique chez T. brucei (118) et des expériences préliminaires
suggèrent que ABCE1 serait également essentiel chez Leishmania. Ainsi, tout indique que
la protéine ABCE1 pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement des
leishmanioses. Cependant, bien que certaines différences fonctionnelles semblent avoir été
observées entre la protéine ABCE1 de la levure et son orthologue humain, la conservation
de séquence exceptionnelle de ABCE1 entre les différents eucaryotes (61) suggère que
l’inhibition spécifique de ABCE1 chez Leishmania pourrait être difficile à réaliser. Chez la
levure S. cerevisiae, il a été démontré que l’assemblage des protéines cytosoliques à
groupements Fe/S comme ABCE1 nécessite le transport des groupements Fe/S de la
173
mitochondrie vers le cytoplasme par le demi-transporteur mitochondrial ATM1 (sousfamille ABCB) et que la délétion de ATM1 induit un arrêt de croissance (186). Chez
Leishmania, la sous-famille ABCB contient deux transporteurs complets (ABCB2 et
ABCB4) et deux demi-transporteurs (ABCB1 et ABCB3). Le demi-transporteur ABCB1
est un homologue des protéines TAP et MDL qui sont impliquées dans le transport de
peptides au niveau du réticulum endoplasmique et de la mitochondrie, alors que le demitransporteur ABCB3 est un orthologue des transporteurs mitochondriaux ATM1 et ABCB7
de la levure et de l’humain, respectivement. Il est important d’insister que ABCB3 est le
seul orthologue de ATM1 qui a été identifié chez Leishmania et que la séquence de cette
protéine est moins conservée entre les différents eucaryotes que celle de ABCE1. Ainsi,
advenant l’impossibilité d’une inhibition spécifique de la protéine ABCE1 chez
Leishmania, il serait intéressant de vérifier l’effet de son inhibition indirecte en ciblant le
transporteur ABCB3 qui est impliqué dans le transport du groupement Fe/S essentiel à la
fonction de cette protéine.
8.5 La sous-famille ABCC chez Leishmania
Plusieurs membres de la sous-famille ABCC sont responsables de l’expulsion active ou de
la séquestration de métalloïdes conjugués aux thiols chez divers organismes. Ainsi, ces
protéines jouent un rôle important dans la détoxification des métaux. MRPA est le premier
transporteur ABC pour lequel une implication dans la résistance aux métalloïdes chez
Leishmania a été démontrée et on retrouve fréquemment une amplification de son gène
chez les mutants résistants à l’antimoine et à l’arsenic. Ce transporteur ABCC est localisé
au niveau de la membrane d’une vésicule intracellulaire et est impliqué dans la
séquestration des métalloïdes conjugués au TSH. L’analyse phylogénique a permis de
déterminer que mis à part MRPA, la sous-famille ABCC compte sept autres membres chez
L. major et huit autres membres chez L. infantum. Aucune information n’a pu être obtenue
quant à la fonction de la sous-famille ABCC par analyses phylogéniques en raison de la
relation paralogique de ses protéines. Ainsi, une caractérisation fonctionnelle devenait
nécessaire afin d’évaluer l’implication de cette sous-famille dans la résistance à l’antimoine
chez Leishmania. La contribution de quelques unes de ces protéines (ABCC1, ABCC2,
174
ABCC4 et ABCC5) dans la résistance à l’arsénite avait déjà été partiellement étudiée à
l’aide d’expériences de surexpression génique chez une souche L. tarentolae de type
sauvage (198), mais aucun phénotype de résistance n’avait pu être observé. De façon
similaire, nous avons observé que parmi les huit protéines ABCC que nous avons étudiées
(ABCC1-6, ABCC8-9), MRPA est la seule protéine dont la surexpression chez une souche
sauvage de L. infantum ou de L. tarentolae est en mesure de conférer un phénotype de
résistance à l’antimoine. Quant à la protéine ABCC7/PRP1, elle est localisée au niveau
d’un organelle intracellulaire et elle est en mesure de conférer une faible résistance à
l’antimoine lorsque surexprimée chez L. major (66, 68).
La résistance aux métalloïdes chez Leishmania est multifactorielle et nécessite la
contribution de plusieurs facteurs de résistance indépendants et interdépendants. En outre,
l’obtention de hauts niveaux de résistance nécessite une synthèse accrue des thiols de faible
poids moléculaire. En ce sens, une augmentation des niveaux de TSH est observée chez la
grande majorité des mutants résistants à l’antimoine. De plus, les souches révertantes
générées par la croissance des mutants résistants en absence de pression de sélection pour
une durée prolongée conservent une résistance résiduelle qui est indépendante des
mécanismes de résistance identifiés jusqu’à maintenant. Ainsi une (des) mutation(s)
stable(s) impliquée(s) dans la résistance à l’antimoine semble(nt) être présente(s) chez les
révertants. Cette (ces) mutation(s) joue(nt) un rôle important dans la résistance
puisqu’elle(s) est (sont) nécessaire(s) à la résistance conférée par les protéines ABCC4 et
ABCC5. En effet, alors que ces protéines ne confèrent pas de résistance à l’antimoine chez
une souche sauvage, leur surexpression chez la souche révertante L. tarentolae As20.3rev
permet d’obtenir de faibles niveaux de résistance à l’antimoine. Par analogie avec MRP1
chez les cellules du cancer pour laquelle la relocalisation d’une enzyme de type GSH Stransférase au niveau de la membrane plasmique est nécessaire à la résistance à l’arsénite
(203), il est possible que le substrat de ABCC4 et ABCC5 soit l’antimoine conjugué au
TSH et que la mutation stable retrouvée chez L. tarentolae As20.3rev consiste en la
modification d’une activité enzymatique de type TSH S-transférase. Bien qu’un niveau
d’activité enzymatique TSH S-transférase similaire ait déjà été observé entre une souche
résistante à l’antimoine et sa souche parentale sensible (390), une relocalisation de
l’enzyme chez les mutants résistants ne peut être exclus pour le moment.
175
Tout comme MRPA, les protéines ABCC4 et ABCC5 ont été localisées au niveau de
compartiments intracellulaires. Ainsi, la séquestration semble être un mécanisme
fréquemment impliqué dans la tolérance aux métaux chez différents organismes. En effet,
le transporteur HMT1 est impliqué dans la séquestration du cadmium conjugué aux
phytochélatines chez S. pombe (255) alors que le transporteur YCF1 est impliqué dans la
séquestration d’arsénite, d’antimonite et de cadmium conjugués au GSH chez S. cerevisiae
(133, 205). Pour un organisme intracellulaire comme Leishmania, il pourrait être
avantageux de transporter les composés toxiques à l’intérieur de compartiments
intracellulaires. En effet, alors que plusieurs protéines ABC ont été localisées au niveau de
la membrane plasmique chez différents types cellulaires, la quasi totalité des protéines
ABC qui ont été localisées jusqu’à maintenant chez Leishmania sont retrouvées au niveau
de compartiments intracellulaires.
Des expériences de transport ont préalablement démontré la présence d’un système d’efflux
d’arsénite dépendante du TSH et d’ATP localisé au niveau de la membrane plasmique du
parasite (102). La sous-famille ABCC étant constituée de protéines impliquées dans le
transport actif de conjugués de thiols, il avait été suggéré que le système d’efflux puisse
correspondre à un homologue de MRPA. Cependant, la localisation intracellulaire de
l’ensemble des protéines de la sous-famille ABCC chez Leishmania ne supporte pas cette
hypothèse et l’identité du système d’efflux demeure malheureusement inconnue. Ainsi,
différentes techniques moléculaires comme le clonage fonctionnel, les puces à ADN et
l’analyse de protéines candidates n’ont pu révéler l’identité de la pompe d’efflux
recherchée. Le séquençage du génome de Leishmania a révélé la présence d’un homologue
de ArsA chez ce parasite. ArsA est une protéine qui est localisée au niveau de la membrane
des bactéries et qui est impliquée dans l’efflux d’arsénite et d’antimonite. Bien que ArsA ne
semble pas être impliquée dans la résistance aux métaux chez la levure et chez l’humain,
l’inactivation de son gène chez C. elegans confère une sensibilité à l’arsénite (361). Ainsi,
il pourrait être intéressant d’évaluer l’effet de l’inactivation de ArsA sur le phénotype de
susceptibilité à l’antimoine chez Leishmania.
176
8.6 Les puces à ADN du génome complet de Leishmania pour
l’étude de la résistance
Au cours des dernières années, plusieurs mécanismes de résistance aux métalloïdes ont été
identifiés chez Leishmania par l’analyse de mutants résistants à l’aide de différentes
techniques moléculaires. En 2005, l’achèvement de la séquence du génome de Leishmania
permettait alors d’entreprendre des études d’expression génique à l’échelle génomique. En
effet, la synthèse d’oligonucléotides 70-mer spécifiques à chacun des gènes du parasite
permet d’étudier l’expression du génome complet en réponse au phénotype de résistance à
l’antimoine. Les premières expériences effectuées visaient à confirmer la validité des puces
à ADN tout en essayant d’identifier de nouveaux mécanismes de résistance à l’antimoine.
Ainsi, le choix de la souche résistante à étudier devenait primordial puisqu’on se devait d’y
retrouver un gène pour lequel une expression différentielle déjà connue allait pouvoir servir
de contrôle à la validité des hybridations, en plus de démontrer des évidences pour la
présence de mécanismes de résistance inconnus qui allaient pouvoir être étudiés. La souche
L. infantum Sb2000.1 hautement résistante à l’antimoine avait déjà été partiellement
étudiée. En outre, des études de spectrométrie de masse y avaient révélé une diminution de
l’accumulation d’antimoine (45), alors que des puces à ADN ciblées avaient révélé la
surexpression de ABCH1 et de MRPA (113, 202), pour lequel l’augmentation de
l’expression était associée à son amplification. Puisque la surexpression de MRPA n’est pas
responsable du défaut d’accumulation d’antimoine chez les mutants résistants de
Leishmania (263) et que l’expression de GSH1, ODC (202) et AQP1 (225) n’est pas
modulée chez L. infantum Sb2000.1, il est évident que des mécanismes de résistance
inconnus sont susceptibles d’être identifiés chez ce mutant résistant. Ainsi, en raison de la
surexpression de MRPA qui peut agir en tant que contrôle d’hybridation et de la présence
de mécanismes de résistance inconnus, L. infantum Sb2000.1 constituait un modèle de
choix pour l’étude de la résistance à l’antimoine par puces à ADN du génome complet de
Leishmania.
L’analyse transcriptomique de L. infantum Sb2000.1 a permis d’identifier 84 gènes dont
l’expression était significativement modulée par rapport à la souche parentale sensible, pour
lesquels un peu moins du tiers démontrait une différence d’expression égale ou supérieure à
177
2. Les valeurs obtenues sont similaires à celles d’un autre groupe qui a évalué l’expression
d’environ mille gènes entre une souche clinique sensible et une souche clinique résistante à
l’antimoine à l’aide de puces à ADN (320). De plus, la surexpression des gènes MRPA et
ABCH1 a été observée chez L. infantum Sb2000.1, ce qui confirmait la validité de
l’expérimentation. Très peu de gènes ont été identifiés pour lesquels la modulation de
l’expression ne s’accompagnait pas d’un changement au niveau du nombre de copies
d’ADN. En effet, une modulation d’expression spécifique n’a été observée que pour
certains gènes, alors que les gènes les plus modulés ont été retrouvés au niveau d’un
amplicon extrachromosomique circulaire. Parallèlement, des expériences d’expression
génique à l’aide de puces à ADN du génome complet ont révélé l’amplification de plusieurs
gènes chez une souche sélectionnée pour la résistance au MTX (364). Ainsi, Leishmania
répond souvent à la pression de sélection aux médicaments par l’amplification de portions
spécifiques de son génome sous forme d’amplicons extrachromosomiques linéaires ou
circulaires. Une récente analyse de la séquence du génome a révélé la présence de multiples
séquences répétées dispersées sur l’ensemble des chromosomes du parasite. De plus, des
analyses préliminaires ont montré une assez bonne conservation de ces séquences au niveau
des génomes de L. major et de L. infantum, ce qui suggère qu’un avantage sélectif conféré
par leur présence doit être à la base de leur maintien chez les différentes espèces. La
présence de ces séquences répétées permettrait au parasite d’amplifier n’importe quelle
partie de son génome et de procéder à l’amplification de la (ou des) région(s) appropriée(s)
en réponse à un stress quelconque, ce qui corrèle avec la biologie particulière de
Leishmania relativement à l’absence de promoteurs pour la régulation de l’expression
génique. Le locus H de MRPA est souvent amplifié en réponse à différents stress et
plusieurs mécanismes d’amplification ont été décrits. Alors qu’une partie du locus H est
fréquemment amplifiée par des événements de recombinaison homologue au niveau d’une
séquence répétée d’environ 700 nucléotides correspondant à la portion 3’ des gènes MRPA
et ABCC2 situés à proximité sur le chromosome 23 (258), les puces à ADN du génome
complet de Leishmania ont permis d’élucider relativement facilement les mécanismes de
recombinaison responsables de la formation d’un nouvel amplicon de MRPA. En effet, des
événements de recombinaison homologue au niveau d’une séquence répétée de 1.4 kb
178
localisée de part et d’autre du locus de MRPA sont impliqués dans la génération de
l’amplicon extrachromosomique circulaire isolé à partir du mutant L. infantum Sb2000.1.
8.7 L’aneuploïdie est associée à la résistance aux médicaments
chez Leishmania
Les puces à ADN du génome complet de Leishmania ont révélé l’expression différentielle
de chromosomes entiers chez le mutant résistant L. infantum Sb2000.1. Des hybridations
quantitatives d’ADN génomique entre le mutant résistant et la souche parentale sensible ont
ensuite permis de démontrer une altération au niveau de ploïdie pour la plupart de ces
chromosomes chez L. infantum Sb2000.1. En effet, puisque Leishmania est un organisme
diploïde (bien qu’une aneuploïdie du chromosome 1 ait été observée chez une sous-espèce
de L. major (283, 347)), les chromosomes 1 et 25 sont triploïdes et le chromosome 11 est
tétraploïde chez L. infantum Sb2000.1. De plus, alors que les chromosomes 12 et 32 sont
retrouvés en proportion deux fois moindre chez L. infantum Sb2000.1 que chez L. infantum
WT, le chromosome 9 est le seul chromosome à avoir démontré une expression
différentielle qui n’a pu être associée à un changement de ploïdie.
Bien qu’une augmentation du nombre de copies de chromosomes entiers ait déjà été
observée chez une souche de T. brucei sélectionnée pour la résistance à l’acide
mycophénolique (385), un changement de ploïdie suivant la sélection de résistance aux
médicaments n’avait jamais été observé chez Leishmania avant l’utilisation des puces à
ADN du génome complet. Jusqu’alors, une modification de la ploïdie chez ce parasite
n’avait été observée que par l’inactivation de gènes essentiels, où la délétion des gènes est
accompagnée de la génération de copies supplémentaires du chromosome ciblé (80). Il a
même été démontré que certains gènes nécessitent la présence de deux copies intactes et
que la délétion d’un seul de leurs allèles induit une augmentation de la ploïdie
(226)(Mukherjee, A., non-publié). Ainsi, il est très intéressant d’observer une corrélation
entre l’expression génique différentielle et le nombre de copies de certains chromosomes
suite à la sélection de résistance à l’antimoine chez Leishmania. Par analogie avec
l’arsénite, qui est un carcinogène reconnu pour induire plusieurs types d’altérations
génétiques (161), la génération de chromosomes surnuméraires chez le mutant résistant L.
179
infantum Sb2000.1 pourrait survenir suite à des événements d’endoréduplication
caractérisés par la formation d’une deuxième boucle de réplication. Quant à l’apparition de
chromosomes sous-numéraires, une altération au niveau de l’assemblage des chromosomes
lors de la division cellulaire pourrait résulter en la perte de chromosomes chez certaines
cellules filles, un phénomène déjà décrit chez les cellules traitées à l’arsénite (305, 306,
394). Finalement, la diminution de l’expression du chromosome 9 sans altération au niveau
de la ploïdie pourrait résulter de facteurs épigénétiques, comme le niveau d’acétylation des
histones, qui devront être étudiés plus en détail.
Une corrélation entre l’aneuploïdie et la résistance aux médicaments a déjà été décrite chez
la levure C. albicans (309). Parallèlement, environ 30 passages suivant le retrait de la
pression de sélection, on a pu observer une diminution des niveaux de résistance à
l’antimoine associée à la perte de l’amplicon MRPA et au retour des chromosomes
surnuméraires à une ploïdie sauvage chez la souche révertante L. infantum Sb2000.1rev.
Puisque la transfection de MRPA chez la souche révertante ne permet pas de revenir au
niveau de résistance initial observé chez le mutant L. infantum Sb2000.1, il apparaît
raisonnable de suggérer qu’un (des) gène(s) présent(s) sur les chromosomes surnuméraires
sont impliqués dans le phénotype de résistance à l’antimoine. De plus, la stabilité de
l’aneuploïdie des chromosomes 12 et 32 en absence de pression de sélection, associée au
niveau de résistance à l’antimoine résiduel observé chez la souche révertante L. infantum
Sb2000.1rev, constituent un lien de circonstance entre l’aneuploïdie de ces chromosomes et
le phénotype de résistance à l’antimoine. De plus, le lien entre la modification du nombre
de copies des chromosomes et le phénotype de résistance est renforcé par la présence des
chromosomes 11 et 12 aneuploïdes chez deux mutants résistants à l’antimoine sélectionnés
de façon indépendante. Ainsi, il est probable que la modulation de l’expression de certains
gènes au niveau de ces chromosomes puisse être 1) soit impliquée directement dans la
résistance à l’antimoine, ou 2) soit impliquée dans un phénomène de compensation à la
résistance. Il est important de noter qu’une augmentation du nombre de copies de certains
chromosomes a été observée chez un mutant sélectionné pour la résistance au MTX (364)
et que le recours à l’aneuploïdie ne semble donc pas spécifique à la résistance à
l’antimoine. La raison pour laquelle Leishmania procède parfois à l’amplification
spécifique de gènes par recombinaison homologue et parfois à l’aneuploïdie pour la
180
modulation de l’expression génique demeure obscure. Il est plausible que l’aneuploïdie soit
plus avantageuse advenant la nécessité de moduler l’expression de plusieurs gènes localisés
sur un même chromosome. Il est aussi possible que le parasite ait recours à l’aneuploïdie en
condition où l’absence de séquences répétées à proximité des gènes d’intérêt empêche la
formation d’amplicons extrachromosomiques, bien que ce scénario soit moins probable
étant donné que l’analyse du génome de Leishmania a révélé la présence de multiples
répétitions localisées de façon relativement uniforme au niveau des différents chromosomes
du parasite (Raymond, F., non-publié).
8.8 Modulation génique spécifique comme marqueur de la
résistance
LinJ05_V3.0830 est le gène qui a témoigné de la plus forte sous-expression chez L.
infantum Sb2000.1. De plus, l’analyse des gènes flanquants LinJ05_V3.0830 a révélé une
expression comparable à la souche sauvage, ce qui démontre une sous-expression
spécifique qui pourrait résulter d’un événement post-transcriptionnel comme une
modification de la stabilité de l’ARN. L’analyse par PCR en temps réel a permis d’observer
la sous-expression de ce gène chez l’ensemble des mutants L. infantum résistants à
l’antimoine qui ont été testés. Malgré tout, la transfection de LinJ05_V3.0830 chez L.
infantum Sb2000.1 n’a pas été accompagnée d’un changement de susceptibilité à
l’antimoine. Bien qu’un lien avec la résistance soit toujours manquant, la constance de la
sous-expression de LinJ05_V3.0830 pourrait être exploitée en tant que biomarqueur de la
résistance à l’antimoine pour le complexe L. donovani/L. infantum. De toute évidence,
certaines expérimentations supplémentaires seront requises, particulièrement en ce qui
concerne l’évaluation du niveau d’expression de ce gène chez les souches cliniques
résistantes à l’antimoine.
LinJ05_V3.0830 code pour la méthylthioadénosine phosphorylase (MTAP), une enzyme
impliquée dans la voie du recyclage de la méthionine. Chez la levure, la sous-expression du
gène MEU1, qui code pour un orthologue de MTAP, est associée à une augmentation de
l’activité enzymatique de ODC (333), l’enzyme impliquée dans l’étape limitante de la
biosynthèse de la spermidine. Il a été démontré que la modulation de l’expression de ODC
181
chez un mutant L. tarentolae résistant à l’arsénite ne résulte pas d’événements
d’amplification ou de réarrangements géniques, ni d’une augmentation de la transcription
de son ARNm, mais résulte plutôt de l’action d’un facteur trans dont l’activité est
augmentée chez la souche résistante par rapport à la souche parentale sensible (152). Ainsi,
la régulation de ODC chez les souches de Leishmania résistantes aux métalloïdes semble
être particulière et pourrait impliquer un phénomène similaire à la levure où une diminution
de l’expression de MTAP est associée à une augmentation de l’activité de ODC. Le gène
ODC est localisé au niveau du chromosome 12
sous-numéraire chez les mutants L.
infantum Sb2000.1 et Sb4000.4 et la sous-expression de LinJ05_V3.0830 pourrait donc être
liée à la diminution du pool de polyamines résultant de l’haploïdie de ODC.
182
Conclusions
La résistance à l’antimoine chez Leishmania représente un problème d’importance pour
lequel de nombreux efforts ont été investis depuis plusieurs années. Ainsi, les travaux
précédents à cette thèse avaient permis d’apprécier l’importance des événements
d’amplification génique dans la modulation de l’expression des gènes de résistance chez
Leishmania. De plus, l’élucidation de la fonction du transporteur intracellulaire MRPA
chez les mutants résistants aux métalloïdes avaient permis de démontrer l’importance de la
famille des protéines ABC dans la résistance. Enfin, l’analyse des caractéristiques de
transport d’un système d’efflux actif d’antimoine localisé au niveau de la membrane
plasmique du parasite avait amené à l’hypothèse selon laquelle la pompe d’efflux pourrait
correspondre à un homologue de MRPA. Finalement, l’étude de mutants résistants
sélectionnés en laboratoire avait permis d’observer la présence de mutations impliquées
dans la résistance dont l’identité n’avait pas pu être révélée.
Les travaux de recherche rapportés au cours de cette thèse ont permis de faire la lumière sur
quelques points et d’améliorer les connaissances en rapport à la résistance à l’antimoine
chez Leishmania. Nous avons entre autre démontré l’ampleur de la famille des protéines
ABC chez Leishmania ainsi que sa propension à évoluer afin de répondre aux besoins
spécifiques du parasite. De plus, nous avons évalué le rôle des protéines de la sous-famille
ABCC dans la résistance à l’antimoine, ce qui a permis de confirmer l’importance du
transporteur MRPA et de révéler le potentiel de deux autres protéines de cette sous-famille
à participer au phénotype de résistance à l’antimoine chez Leishmania. Aussi, le fait que la
totalité des protéines ABCC aient été localisées au niveau de compartiments intracellulaires
ne supporte pas l’hypothèse selon laquelle le système d’efflux membranaire soit encodé par
un gène de la sous-famille ABCC. Enfin, l’analyse transcriptomique du génome complet de
L. infantum en réponse au phénotype de résistance à l’antimoine a permis de démontrer que
la modulation de l’expression de gènes spécifiques est un événement relativement rare et
que l’expression différentielle de la plupart des gènes est associée à un changement du
nombre de copie au niveau de l’ADN. Finalement, l’étude d’une souche partiellement
révertante a permis de corréler l’aneuploïdie de certains chromosomes avec le phénotype de
résistance à l’antimoine chez Leishmania.
183
En définitive, il sera intéressant de procéder à la caractérisation de l’organelle où ont été
localisées les protéines ABCC4 et ABCC5 ainsi que d’évaluer leur rôle dans la résistance à
l’antimoine chez différents mutants résistants. Aussi, il sera intéressant d’identifier le ou les
gènes localisés au niveau des chromosomes aneuploïdes qui pourraient être impliqués dans
le phénotype de résistance et de comprendre les raisons motivant le parasite à recourir à
l’amplification spécifique de gènes ou à l’aneuploïdie. Enfin, aucun marqueur de résistance
à l’antimoine n’est présentement disponible chez Leishmania et il sera important d’évaluer
le potentiel de la sous-expression spécifique de LinJ05_V3.0830 comme biomarqueur chez
L. donovani/L. infantum.
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