Röntgenstrukturanalyse der 6-Hydroxy-D-Nikotin

Transcription

Röntgenstrukturanalyse der 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase
aus Arthrobacter nicotinovorans
sowie Darstellung und Charakterisierung einer
Protein-Protein-Kontaktfläche mit der
6-Phospho-β-Galaktosidase aus Lactococcus lactis
INAUGURALDISSERTATION
Zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Diplom-Chemiker Jochen Kötter
Freiburg im Breisgau, November 2005
Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 15.12.2005
Dekan: Prof. Dr. Andreas Bechthold
Referent: Prof. Dr. Georg E. Schulz
Korreferent: Prof. Dr. Thorsten Friedrich
« Per aspera ad astra »
Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden in den folgenden Artikelen veröffentlicht:
Koetter, J. W. A. and Schulz, G. E. (2005). Crystal structure of 6-hydroxy-D-nicotine
oxidase from Arthrobacter nicotinovorans. J. Mol. Biol. 352, 418-428.
Grüninger, D., Koetter, J. W. A., Treiber, N. and Schulz, G. E. (2005). Engineering
protein-protein interfaces for oligomerization. Manuskript in Vorbereitung.
Koordinaten
und
Strukturfaktoren
sind
in
der
Protein
(http://www.rsbc.org/pdb/) unter folgenden Eintragungen verfügbar:
6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase Kristallform 1
2BVG
2BVH
2BVF
Data
Bank
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG ......................................................................................................................................................... 1
1.1
1.2
1.3
2
6-HYDROXY-D-NIKOTIN-OXIDASE (6HDNO) ....................................................................................................... 2
1.1.1
Der Abbau von Nikotin durch Arthrobacter nicotinovorans .................................................................... 2
1.1.2
Charakterisierung der 6-Hydroxy-Nikotin-Oxidasen ............................................................................... 4
1.1.3
Studien zur Flavinylierung der 6HDNO................................................................................................... 5
6-PHOSPHO-β-GALAKTOSIDASE (PGAL) ............................................................................................................... 7
1.2.1
Nichtkovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen................................................................................. 7
1.2.2
6-Phospho-β-D-Galaktosidase ................................................................................................................. 8
1.2.3
Kristallographische Eigenschaften der PGAL ....................................................................................... 10
AUSGANGSPUNKTE UND ZIELE DER ARBEIT ......................................................................................................... 11
1.3.1
6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase ............................................................................................................... 11
1.3.2
6-Phospho-β-D-Galaktosidase ............................................................................................................... 12
MATERIALIEN.................................................................................................................................................... 13
2.1
GERÄTE ............................................................................................................................................................... 13
2.2
CHEMIKALIEN, ENZYME UND KITS ....................................................................................................................... 15
2.3
BAKTERIENSTÄMME UND PLASMIDE .................................................................................................................... 17
2.4
NÄHRMEDIEN, LÖSUNGEN UND PUFFER ............................................................................................................... 17
3
METHODEN ......................................................................................................................................................... 21
3.1
3.2
GENTECHNISCHE METHODEN............................................................................................................................... 21
3.1.1
Polymerasekettenreaktion ...................................................................................................................... 21
3.1.2
Ortsgerichtete Mutagenese..................................................................................................................... 21
3.1.3
Primer-Design........................................................................................................................................ 23
3.1.4
Plasmidpräparation................................................................................................................................ 24
3.1.5
Hydrolyse von DNA mit Restriktions-Endonukleasen ............................................................................ 24
3.1.6
Agarosegel-Elektrophorese .................................................................................................................... 25
3.1.7
Isolierung von DNA aus Agarosegelen................................................................................................... 26
3.1.8
Ligation von DNA-Fragmenten.............................................................................................................. 26
3.1.9
DNA-Sequenzierung ............................................................................................................................... 27
3.1.10
Kompetente Zellen und Transformation ................................................................................................. 27
3.1.11
Stammkulturen........................................................................................................................................ 27
PROTEINPRÄPARATION ........................................................................................................................................ 28
3.2.1
Bakterienkultivierung ............................................................................................................................. 28
3.2.2
Zellaufschluß .......................................................................................................................................... 28
3.2.3
Inkorporation von Selenomethionin in Proteine..................................................................................... 29
3.2.4
Ionenaustausch-Chromatographie ......................................................................................................... 30
3.2.5
Ammoniumsulfatfällung.......................................................................................................................... 31
3.2.6
Affinitätschromatographie mit Ni-NTA-Sepharose................................................................................. 31
3.2.7
Gelpermeationschromatographie........................................................................................................... 32
3.2.8
Konzentrierung der Proteinlösung ......................................................................................................... 33
3.2.9
Dialyse ................................................................................................................................................... 33
II
Inhaltsverzeichnis
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
4
PROTEINANALYTIK ...............................................................................................................................................34
3.3.1
Bestimmung der Proteinkonzentration....................................................................................................34
3.3.2
Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ....................................................................35
3.3.3
Dynamische Lichtstreuung......................................................................................................................36
3.3.4
Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie......................................................................................37
KRISTALLISATION ................................................................................................................................................37
3.4.1
Kristallisation mittels Gasphasenmethode ..............................................................................................38
3.4.2
Kristallmontage.......................................................................................................................................39
RÖNTGENOGRAPHISCHE METHODEN.....................................................................................................................40
3.5.1
Kristallgitter und Kristallsymmetrie .......................................................................................................40
3.5.2
Bestimmung der Molekülanzahl in der asymmetrischen Einheit.............................................................41
3.5.3
Röntgenstrahlung....................................................................................................................................42
3.5.4
Theorie der Röntgenstreuung..................................................................................................................43
3.5.5
Reziprokes Gitter und Ewaldkonstruktion...............................................................................................46
3.5.6
Temperaturfaktoren ................................................................................................................................47
3.5.7
Fouriertransformation und Phasenproblem............................................................................................48
3.5.8
Datensammlung ......................................................................................................................................49
3.5.9
Prozessierung, Skalierung und Reduktion kristallographischer Daten...................................................51
3.5.10
Bestimmung nicht-kristallographischer Symmetrie.................................................................................53
3.5.11
Lösung des Phasenproblems ...................................................................................................................56
3.5.12
Phasenbestimmung mittels multiwavelength anomalous diffraction (MAD)...........................................56
3.5.13
Phasenbestimmung durch molekularen Ersatz........................................................................................62
3.5.14
Dichtemodifikation..................................................................................................................................62
3.5.15
Modellbau und Elektronendichtekarten ..................................................................................................63
VERFEINERUNG ....................................................................................................................................................65
3.6.1
Methode des kleinsten quadratischen Fehlers (least squares) ................................................................67
3.6.2
Verfeinerung von Temperaturfaktoren....................................................................................................67
3.6.3
Rigid body Verfeinerung .........................................................................................................................68
3.6.4
Molekulardynamik-Simulation (simulated annealing) ............................................................................68
3.6.5
Verfeinerung mit REFMAC.....................................................................................................................68
3.6.6
Verfeinerung mit CNS .............................................................................................................................69
3.6.7
Einbau von Wassermolekülen und Liganden ..........................................................................................69
PROTEINSTRUKTUREN ..........................................................................................................................................70
3.7.1
Homologiemodell....................................................................................................................................70
3.7.2
Qualität von Proteinstrukturen ...............................................................................................................70
3.7.3
Darstellung und Analyse von Proteinstrukturen .....................................................................................72
3.7.4
Proteinstrukturvergleiche .......................................................................................................................73
ERGEBNISSE UND DISKUSSION ZUR 6HDNO .............................................................................................75
4.1
EXPRESSION, REINIGUNG UND KRISTALLISATION DER 6HDNO.............................................................................75
4.1.1
Expression und Reinigung der 6HDNOns...............................................................................................76
4.1.2
Expression und Reinigung der SeMet-6HDNOns ...................................................................................77
4.1.3
Charakterisierung der 6HDNOns und SeMet-6HDNOns .......................................................................78
4.2
KRISTALLISATION UND CHARAKTERISIERUNG DER KRISTALLE .............................................................................78
4.3
KRISTALLOGRAPHISCHE DATENSAMMLUNG .........................................................................................................81
Inhaltsverzeichnis
4.4
4.5
5
III
STRUKTURLÖSUNG .............................................................................................................................................. 83
4.4.1
MAD-Phasierung ................................................................................................................................... 83
4.4.2
Modellbau in den Kristallformen-1, -2 und -3........................................................................................ 85
4.4.3
Verfeinerung der Kristallform-3............................................................................................................. 86
4.4.4
Qualität der 6HDNOns-Struktur der Form-3......................................................................................... 87
4.4.5
6HDNOns-Strukturen in den Kristallformen-1 und -2 ........................................................................... 91
STRUKTURBESCHREIBUNG DER 6HDNONS .......................................................................................................... 93
4.5.1
Sekundärstruktur .................................................................................................................................... 93
4.5.2
Tertiärstruktur und Domänen-Organisation .......................................................................................... 94
4.5.3
Quartärstruktur ...................................................................................................................................... 95
4.5.4
Kristallpackung ...................................................................................................................................... 97
4.5.5
Strukturelle Verwandtschaft mit anderen Proteinen............................................................................. 102
4.5.6
FAD-Bindung und das aktive Zentrum ................................................................................................. 105
4.5.7
Autoflavinylierung ................................................................................................................................ 107
4.5.8
Katalytischer Mechanismus und Enantioselektivität ............................................................................ 109
ERGEBNISSE UND DISKUSSION ZUR PGAL ............................................................................................. 115
5.1
PLANUNG DER MUTANTEN................................................................................................................................. 115
5.1.1
Ausgangpunkt der Mutantenplanung.................................................................................................... 115
5.1.2
Planung weiterführender Mutanten...................................................................................................... 118
5.2
DURCHFÜHRUNG DER MUTAGENESE .................................................................................................................. 125
5.3
EXPRESSION UND REINIGUNG DER PGAL-MUTANTEN ....................................................................................... 126
5.3.1
Reinigung einer der PGAL Mutanten ................................................................................................... 127
5.3.2
GPC-Chromatogramme aller präparierten PGAL-Mutanten .............................................................. 129
5.4
EIGENSCHAFTEN DER PRÄPARIERTEN PGAL-MUTANTEN ................................................................................... 131
5.5
ALTERNATIVE PGAL-REINIGUNG ..................................................................................................................... 134
5.5.1
5.6
5.7
6
PGAL-Reinigung durch Affinitätschromatographie mit His6-tag......................................................... 134
ÜBERSICHT ÜBER DIE ALTERNATIV GEREINIGTEN PGAL-MUTANTEN ................................................................. 138
KRISTALLISATION .............................................................................................................................................. 142
5.7.1
Kristallisation des PGAL-Dimers......................................................................................................... 142
5.7.2
Kristallisation der alternativ gereinigten PGAL-Dimere ..................................................................... 143
ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK...................................................................................................... 145
6.1
6-HYDROXY-D-NIKOTIN-OXIDASE .................................................................................................................... 145
6.2
6-PHOSPHO-β-GALAKTOSIDASE......................................................................................................................... 146
7
LITERATUR ....................................................................................................................................................... 149
8
ANHANG ............................................................................................................................................................. 157
8.1
VEKTORKARTE PET-15B ................................................................................................................................... 157
8.2
GPC-EICHGERADEN .......................................................................................................................................... 158
8.3
SEQUENZ DER HDNO (DNA UND PROTEIN) ...................................................................................................... 159
8.4
SEQUENZ DER PGAL-MUTANTE KEDWFF (DNA UND PROTEIN) ..................................................................... 160
8.5
ERGEBNISSE ZUR MUTANTE TKEDFWMF-NR.11............................................................................................. 162
DANKSAGUNG............................................................................................................................................................. 165
IV
Abkürzungen
Abkürzungen
Ax
Absorption bei der Wellenlänge x in nm
aar
Aminosäurerest (amino acid residue)
ASU
asymmetrische Einheit (asymmetric unit)
B-Faktor
kristallographischer Temperaturfaktor (Versetzungsfaktor)
BASA
Proteinkontaktfläche (buried accessible surface area)
BFG
Bakterienfeuchtgewicht
DLS
Dynamische Lichtstreuung (dynamic light scattering)
GPC
Gelpermeationschromatographie
6HDN
6-Hydroxy-D-Nikotin
6HDNO
6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase
6HDNOn
6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase mit N-terminaler Verkürzung um die Aminosäuren 2-4.
6HDNOns
6HDNOn mit Cystein an Position 433 gegen Serin ausgetauscht.
6HLN
6-Hydroxy-L-Nikotin
6HLNO
6-Hydroxy-L-Nikotinoxidase
IEC
Ionenaustausch-Chromatographie (ion exchange chromatography)
IPTG
LMW
Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid
Niedrige Molekularmassen (low molecular weight)
MWCO
Ausschlußgrenze für Molekularmassen (molecular weight cut off)
MAD
MolRep
multiple-Wellenlängen anomale Diffraktion (multiple wavelength anomalous
diffraction)
molekularer Ersatz (molecular replacement)
NCS
nicht-kristallographische Symmetrie (non-crystallographic symmetry)
ODx
optische Dichte bei der Wellenlänge x nm
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR
Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PDB
Datenbank für Proteinstrukturen (Protein data bank)
PEG x
Polyethylenglykol mit einer mittleren Molekularmasse von x g/mol
PGAL
PMSF
6-Phospho-β-D-Galaktosidase
Phenylmethylsulfonylfluorid
Rcryst
kristallographischer R-Faktor
Rfree
freier kristallographischer R-Faktor
Rsym-I
R-Faktor für symmetrieverwandte Reflexintensitäten
rmsd
mittlere quadratische Abweichung (root mean square deviation)
rpm
Umdrehungen pro Minute (rotations per minute)
RT
Raumtemperatur
SeMet
L-Selenomethionin
VE
Elutionsvolumen
Vt
Säulenvolumen
v/v
Volumen pro Volumen (volume per volume)
w/v
Masse pro Volumen (weight per volume)
WT
Wildtyp
Abkürzungen, die im European Journal of Biochemistry ohne Definition verwendet werden dürfen, sind nicht
aufgeführt [Information for Authors (1996). Eur. J. Biochem. 235, 1-7]
V
PGAL Mutationen
PGAL Mutationen
DF
D445F
EDFF
E434F-D445F
KEDWFF-Nr.1
K381W-E434F-D445F
WKEDAWFF-Nr.2
W43A-K381W-E434F-D445F
KEDDWFLF-Nr.3
K381W-E434F-D443L-D445F
KEEDWFFF-Nr.4
K381W-E383F-E434F-D445F
TKEDFWFF-Nr.5
T45F-K381W-E434F-D445F
TEFF-Nr.6
T45F-E434F
TKEFWF-Nr.7
T45F-K381W-E434F-
TEDFFF-Nr.8
T45F-E434F-D445F
KDWF-Nr.9
K381W-D445F
TKDFWF-Nr.10
T45F-K381W-D445F
TKEDFWMF-Nr.11
T45F-K381W-E434M-D445F
TKEDFIFF-Nr.12
T45F-K381I-E434F-D445F
TKEDFYFF-Nr.13
T45F-K381Y-E434F-D445F
TKEDFIMF-Nr.14
T45F-K381I-E434M-D445F
TKEEDFIFFF-Nr.15
T45F-K381I-E383F-E434F-D445F
TKEDFWFM-Nr.16
T45F-K381W-E434F-D445M
WTKEDAFWFF-Nr.17
W43A-T45F-K381W-E434F-D445F
WTKEDAFIFF-Nr.18
W43A-T45F-K381I-E434F-D445F
WTKEDAFWMF-Nr.19
W43A-T45F-K381W-E434M-D445F
TKEDDFWFNF-Nr.20
T45F-K381W-E434F-D443N-D445F
TKEDDFIFNF-Nr.21
T45F-K381I-E434F-D443N-D445F
TKEDDFWMNF-Nr.22
T45F-K381W-E434M-D443N-D445F
WTKEDAFIMF-Nr.23
W43A-T45F-K381I-E434M-D445F
TKEEDFIFMF-Nr.24
T45F-K381I-E383F-E434M-D445F
WTKEEDAFIFFF-Nr.25 W43A-T45F-K381I-E383F-E434F-D445F
WTKEDAFWFM-Nr.26
W43A-T45F-K381W-E434F-D445M
XXXHis-tag
PGAL-Mutante XXX mit N-terminalem His-tag
XXX*
PGAL-Mutante XXX nach proteolytischer Entfernung des N-terminalen His-tags
VI
Symbole und mathematische Zeichen
Symbole und mathematische Zeichen
r r r
a , b , c , α, β, γ
r r r
*
* *
a * , b* , c * , α , β , γ
Elementarzellparameter im realen Raum
Elementarzellparameter im reziproken Raum
Å
Ångström (10-10 m = 0.1 nm)
d
Netzebenenabstand, Auflösung
f
Atomformfaktor
F
Strukturfaktoramplitude
F, (F*)
komplexer Strukturfaktor (konjugiert komplexer Strukturfaktor)
Fcalc
aus dem Modell berechnete Strukturfaktoramplitude
Fobs
gemessene (observierte) Strukturfaktoramplitude
FP, FPH, FH
Strukturfaktoren des Proteins, des Schweratomderivats, des
Schweratoms
hkl, ( hk l )
Millersche Indices (Friedelpaare)
i
imaginäre Einheit (i 2 = –1)
I
Reflexintensität
r
k
Richtungsvektor von Röntgenwellen
λ
Wellenlänge
m
figure-of-merit
ϕ
Phase des Strukturfaktors F
ϕcalc
berechnete Phase
P(ϕ)
Phasenwahrscheinlichkeit
P(u,v,w)
Pattersonfunktion
r
r
Ortsvektor im realen Raum
ρel, (ρobs, ρcalc)
Elektronendichte (gemessen, berechnet)
σ
Standardabweichung
r
s
Ortsvektor im reziproken Raum
VEZ
Elementarzellvolumen
VM
Matthews- oder Packungsparameter
x, y, z
Ortskoordinaten im realen Raum
VII
Glossar
Glossar
alignment
Ausrichtung ähnlicher Proteinsequenzen
annealing
Tempern
backbone
Rückgrat (Hauptkette eines Proteins)
ball-and-stick
Kugel und Stab (Darstellungsform von Molekülen)
barrel
Faß, bzw. faßförmige Struktur
beamline
Meßstation am Synchrotron
bulk solvent correction
Aufnahme des ungeordneten Solvensbereiches in das Modell
blunt end
„stumpfe“ DNA-Enden, ohne überhängende Basen
constrained
eine Abweichung vom Idealwert wird nicht zugelassen
cryo-loop
Nylonschleife zur Kristallmontage in der Cryokristallographie
cryo-protectant
Zusatz zur Vermeidung von Eiskristallen
frame shift
Verschiebung des Leserasters
frame/image
Röntgenaufnahme
inflection point
Wendepunkt einer Kurve
induced fit
Anpassung einer Proteinstruktur an ein Substrat
greek key
Strukturmotiv bei Proteinen
interface
Kontaktfläche
linker
Verbindungsstück(e)
least squares
Methode der kleinen Quadrate
loop
Schleife, Bereich ohne Sekundärstruktur in Proteinstrukturen
maximum likelihood
statistische Methode der maximalen Wahrscheinlichkeit
model bias
Einfluß des verwendeten Modells
overfitting
Anpassen der Modells an experimentelles Rauschen
peak
Spitzen einer Verteilung
pellet
sedimentiertes Material
primer
Oligonukleotid zur Synthese von DNA
restrained
eine Abweichungen vom Idealwert wird eingeschränkt
ribbon
Band; Bänderdarstellung der Peptidkette
rigid-body
starrer Körper
screening
Reihentest (bei der Kristallisation)
selfrotation
Überlagerung von zwei Pattersonfunktionen
simulated anealing
simuliertes Tempern bei der Strukturverfeinerung
solvent flattening
Solvensglättung einer Elektronendichtekarte
sticky end
dsDNA-Enden mit überhängenden ungepaarten Basen
tag
Markierung eines Proteins zur vereinfachten Reinigung
template
Matrize
turn
Kehre in einer Polypeptidkette
1
Einleitung
1 Einleitung
Im Mittelpunkt der biochemischen Forschung steht die Aufklärung der molekularen
Grundlagen des Lebens. Dazu gehören die Erforschung der Stoffwechselwege sowie die
Analyse der Sequenzen aller Gene eines Organismus und die Zuordnung der gencodierten
Proteine zu ihrer Funktion. Da in den letzten Jahren die Genome von verschiedensten
Organismen vollständig aufgeklärt wurden, rückt die Frage nach der Struktur und der
biologischen Funktion der Proteine in den Mittelpunkt des Interesses. Die Funktionen von
Proteinen umfassen ein breites Spektrum: Katalyse chemischer Reaktionen, Regulation der
Genexpression und von Stoffwechselprozessen, Erkennung von Signalen, Bildung
formgebender Gerüststrukturen, Energiespeicher, Grundlage für den Transport von
Molekülen und die Bewegung von Organismen.
Die Kenntnis des dreidimensionalen Aufbaus bei atomarer Auflösung ist ein
wesentlicher Bestandteil bei der Erforschung der Eigenschaften von Proteinen oder
Nukleinsäuren.
Atomar
aufgelöste
Proteinstrukturen
können
heutzutage
mittels
Kernresonanzspektroskopie oder Röntgenstrukturanalyse erhalten werden, wobei die
Strukturen größerer Komplexe im Allgemeinen nur mit letzterer Methode aufklärbar sind.
Daher hat sich die Röntgenkristallographie zu einem wichtigen Gebiet der biochemischen
Forschung entwickelt. Die Ergebnisse röntgenkristallographischer Untersuchungen fließen
in
zahlreichen
naturwissenschaftlichen
Gebieten
wie
der
pharmazeutischen
Wirkstoffforschung (rational drug design) oder der enzymgesteuerten präparativen
Chemie mit ein.
Für das Verständnis von Signaltransduktion und Regulationsprozessen in der Zelle
sind außerdem spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen von großer Bedeutung.
Diese sind meist nichtkovalenter Natur und umfassen van-der-Waals- und hydrophobe
Wechselwirkungen sowie Wasserstoffbrücken. Für die Kristallisation von Proteinen
spielen nichtkovalente Wechselwirkungen ebenfalls eine Rolle, da gezielt verbesserte
Kontaktflächen zu stabileren, größeren und besser geordneten Kristallen führen können.
Außerdem spielen unspezifische Aggregationen von Proteinen bei Krankheiten wie
beispielsweise Prionen-Erkrankungen oder Sichelzellanämie eine Rolle. Eine mögliche,
gezielte Veränderung von spezifischen Protein-Wechselwirkungen könnte dabei eine
Vielzahl von therapeutischen Anwendungen eröffnen.
2
Einleitung
1.1 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase (6HDNO)
1.1.1 Der Abbau von Nikotin durch Arthrobacter nicotinovorans
Menschen nehmen Nikotin hauptsächlich beim Konsum von Tabak auf, wobei sie
sich einem großen gesundheitlichen Risiko aussetzen. Das inhalierte Tabakalkaloid wird
nach der bukkalen Resorption als Xenobiotika behandelt und auf mindestens sechs
verschiedenen Wegen abgebaut (Hukkanen et al., 2005). Im Gegensatz zum Menschen
verwenden einige Bakterien Nikotin als Nährstoffquelle. Dazu gehört das aerobe,
grampositive Bakterium Arthrobacter nicotinovorans, welches seinen Stickstoff und
Kohlenstoffbedarf allein aus dem Abbau von Nikotin deckt (Eberwein et al., 1961). Die
Gattung Arthrobacter gehört zur Gruppe der coryneformen Bakterien, deren Lebensraum
Böden mit leicht zersetzlicher organischer Materie sind (Schlegel, 1981). Eine ergiebige
Quelle für Nikotin sind Tabakpflanzen, deren Blätter bis zu 3% Nikotin enthalten. Dabei
liegt das Verhältnis zwischen dem biosynthetischen L-Nikotin (2’-S-Nikotin)-zum seltenen
D-Nikotin bei 200:1. Außerdem enthalten die Pflanzen noch 0.2% Nornikotin in einem
L:D Verhältnis von 5:1 (Armstrong et al., 1998 & 1999). Allerdings kommt es beim Zerfall
der Tabakpflanzen zu einer Racemisierung, wobei D-Nikotin und D-Nornikotin
angereichert werden. Es wird deshalb davon ausgegangen, daß Bakterien die von Nikotin
Leben über Enzyme verfügen, welche beide Enantiomere von Nikotin und Nornikotin
umsetzen können.
Die Fähigkeit vieler Mikroorganismen komplexe organische Verbindungen
vollständig zu metabolisieren, ist häufig an das Vorhandensein kataboler Plasmide
geknüpft (Jones & Keddie, 1992). Die Strukturgene dieser Plasmide codieren für
bestimmte Enzyme, die in der Lage sind, ungewöhnliche Substrate umzusetzen. Mit
solchen Plasmiden ausgestattete Mikroorganismen haben in Lebensräumen, in denen
einfache organische Moleküle nur noch limitiert zur Verfügung stehen, einen
Selektionsvorteil. Diese zirkulären DNA-Stränge werden auch als energieliefernde
Plasmide bezeichnet. Bei A. nicotinovorans wird diese Fähigkeit durch das 160 kb große
Plasmid pAO1 vermittelt, auf dem alle für den Nikotinabbau essentiellen Gene vorhanden
sind (Brandsch & Decker, 1984). Darauf sind auch die Enzyme der ersten beiden
Abbauschritte, die Nikotindehydrogenase (EC 1.5.99.4), die 6-Hydroxy-D-NikotinOxidase (6HDNO, EC 1.5.3.6) und die 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase (6HLNO,
EC 1.5.3.5) lokalisiert.
3
Die ersten Schritte des Nikotinabbaus sind in Abbildung 1 skizziert. Zuerst werden
beide Enantiomere des Nikotins unter Retention ihrer Konformation durch die
Nikotindehydrogenase am C6-Atom des Pyridinrings hydroxyliert (Hochstein &
Rittenberg, 1959; Gloger & Decker, 1969). Die entstandenen optischen Isomere
6-Hydroxy-D/L-Nikotin werden im darauffolgenden Abbauschritt durch die beiden
enantioselektiven Enzyme 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase (6HLNO) und 6-Hydroxy-DNikotin-Oxidase (6HDNO) in einer FAD-abhängigen Oxidation an Position 2 des
Pyrrolidinringes in das optisch inaktive Produkt 6-Hydroxy-N-methylmyosmin überführt
(Gries et al., 1961). Dieses Enamin hydrolysiert spontan (Decker & Dai, 1967) zum
stabileren [6-Hydroxypyridyl-(3)]-(γ-N-methylaminopropyl)-keton, das zur Bestimmung
der Enzymaktivität photometrisch detektiert werden kann. Das dabei entstehende FADH2
wird anschließend durch Sauerstoff oxidiert, wobei Wasserstoffperoxid entsteht
(Gherna et al., 1965; Brühmüller et al., 1972).
Abbildung 1
Reaktionsschritte des Nikotinabbaus, die von Enzymen Nikotindehydrogenase, 6-HLNO
und 6HDNO katalysiert werden (Gloger & Decker, 1969).
Der weitere Abbau von Nikotin erfolgt sequentiell bis zu den Endprodukten
Maleinsäuremonoamid,
methylmyosmin
4-Methylaminobutyrat,
(Abbildung 2).
Nikotinblau
und
2,6-Dihydroxy-N-
Maleinsäuremonoamid wird durch gewöhnliche
mikrobiologische Metabolismusschritte weiter abgebaut, wohingegen der genaue
Abbauweg des 4-Methylaminobutyrat noch nicht bekannt ist, es reichert sich aber nicht im
Medium an. 2,6-Dihydroxy-N-methylmyosmin bildet sich spontan aus 2,6-Dihydroxypseudooxynikotin und wird genauso wie Nikotinblau, welches sich unter aeroben
4
Einleitung
Bedingungen spontan aus 2,3,6-Trihydroxypyridin bildet, nicht weiter abgebaut und von
A. nicotinovorans ausgeschieden. Das charakteristische wasserunlösliche Pigment färbt
flüssige Kulturen von A. nicotinovorans tief blau (Baitsch et al., 2001; Vickers, 2004).
Abbildung 2
Abbauweg des Nikotins (Vickers, 2004).
1.1.2 Charakterisierung der 6-Hydroxy-Nikotin-Oxidasen
Die Expression der beiden hoch enantioselektiven Oxidasen 6HDNO und 6HLNO
wird in Gegenwart von Nikotin vom Bakterium A. nicotinovorans hochreguliert (Gloger &
Decker, 1969). Beide Enzyme katalysieren eine FAD-abhängige Reaktion (Decker & Dai,
1967), unterscheiden sich aber durch die Art Ihrer Kofaktor-Anbindung. Das L-Enzym
liegt in vivo als Dimer vor und hat an beiden Polypeptidketten je ein FAD nichtkovalent
gebunden (Dai et al., 1968). Die Molekularmasse des Polypeptids beträgt 46'227 Da. Die
6HDNO ist dagegen ein Monomer mit einer Molekularmasse von 49'571 Da und einem
kovalent gebundenen FAD (Brühmüller et al., 1972). Das Enzym zeigt aufgrund des
gebundenen FAD ein charakteristisches UV/Vis-Spektrum, bei dem neben der typischen
Absorption von Proteinen bei einer Wellenlänge von 280 nm weitere Absorptionsmaxima
bei 375 nm und 450 nm auftreten.
5
Die beiden Oxidasen 6HLNO und 6HDNO besitzen ein sehr hohes Maß an
Substratspezifität und zeigen absolute Stereoselektivität. Dennoch binden sowohl die
6HLNO, als auch die 6HDNO die jeweiligen optischen Antipoden von 6-Hydroxy-Nikotin
mit vergleichbarer Affinität. Durch die Bindung des jeweils antistereomeren Edukts
kommt
es
zu
einer
kompetitiven
Inhibition
der
Enzyme.
Der
KM-Wert der 6HDNO für das Substrat 6HDN beträgt 0.05 mM. Der KI-Wert des
L-Enantiomers für 6HDNO liegt bei 1.5 mM (Schenk & Decker, 1999).
Zwischen der 6HDNO und 6HLNO besteht keinerlei Sequenzhomologie (Brandsch
et al., 1987). Es wurde postuliert, daß diese Oxidasen ein Beispiel für konvergente
Evolution darstellen (Schenk & Decker, 1999). Dies bedeutet, daß die Enzyme sich von
verschiedenen Vorläuferproteinen ableiten (Doolittle, 1994). Die Enzyme wurden
strukturell unterschiedlichen Flavoenzymfamilien zugeordnet: die 6HLNO zur großen
Glutathion-Reduktase Familie (Schenk & Decker, 1999) und die 6HDNO zur p-CresolMethylhydroxylase-Vanillyl-Alkohol-Oxidase (PCMH-VAO) Familie (Fraaije et al., 1998;
Dym & Eisenberg, 2001). Die strukturell bekannten Enzyme aus der PCMH-VAO Familie
haben weniger als 20% Sequenzidentität zur 6HDNO. Das Interesse an den Oxidasen
6HLNO und 6HDNO konzentriert sich auf ein verbessertes Verständnis der Beziehung
zwischen Proteinstruktur und Substratspezifität. Der Vergleich der dreidimensionalen
Struktur der 6HDNO mit der bereits bekannten Struktur der 6HLNO (Kachalova et al.,
2000) würde dazu einen signifikanten Beitrag leisten. Die Strukturkoordinaten der 6HLNO
wurden bis jetzt allerdings noch nicht publiziert und wahrscheinlich auch noch nicht
verfeinert.
1.1.3 Studien zur Flavinylierung der 6HDNO
Eine kovalente Bindung zwischen einem FAD und einem Polypeptid wurde
erstmals bei dem Membranprotein Succinat-Dehydrogenase beobachtet (Singer et al.,
1956). Eine ähnliche Bindung wurde später bei der 6HDNO entdeckt und mittels
Dünnschichtchromatographie von Peptidfragmenten als Histidyl-(N3)-(8α)-FAD-Bindung
identifiziert (Möhler et al., 1972). Da der Umgang mit diesem löslichen Protein wesentlich
einfacher war als mit dem Membranprotein, wurden anhand der 6HDNO umfangreiche
Studien zur kovalenten Flavinylierung durchgeführt.
Zuerst wurde angenommen, daß andere Enzyme an der Flavinylierung beteiligt
sind, dagegen sprach aber die Beobachtung, daß in E. coli katalytisch aktive 6HDNO mit
kovalentem FAD rekombinant produziert werden konnte (Brandsch & Bichler, 1985).
6
Einleitung
Daraufhin wurde einem autokatalytischen Mechanismus angenommen. Mit einem in vitro
Transkriptions/Translations-System wurde Apoenzym erhalten, welches nicht mit FAD
rekonstituiert werden konnte, dies wies zusätzlich auf einen kotranslationalen
Mechanismus hin (Brandsch & Bichler, 1986). Später wurde herausgefunden, daß
C3-Moleküle wie Glycerin als allosterische Effektoren wirken und daß durch die
Flavinylierung das Enzym vor proteolytischen Verdau geschützt wird (Brandsch et al.,
1989). Nach vielen weiteren Studien wurde abschließend für die Flavinylierung ein
autokatalytischer Mechanismus vorgeschlagen, der ohne die Beteiligung dritter
Reaktanden auskommt (Brandsch & Bichler, 1991). Dazu führte vor allem die Tatsache,
daß durch die Expression der 6HDNO als Fusionsprotein Apoenzym gereinigt werden
konnte, welches anschließend in vitro zur autokatalytischen Flavinylierung fähig war. Es
wurde vermutet, daß es bei der Flavinylierung zu einer Konformationsänderung kommen
könnte.
Da zur Aufklärung des autokatalytischen Mechanismus keine Struktur zur
Verfügung stand wurde versucht Informationen aus Mutagenesestudien zu erhalten. Durch
Mutation von Arg68 zu Ala bzw. Lys konnte gezeigt werden, daß für die Flavinylierung an
dieser Position eine positive geladene Aminosäure benötigt wird (Mauch et al., 1990). Es
wurde
beobachtet,
daß
Sulfhydrylverbindungen
wie
Dithiobenzoesäure
die
Autoflavinylierung inhibieren. Dies führte zu der Vermutung, daß Cysteine an der
Inkorporation des FAD in das Apoenzym beteiligt sind (Brandsch & Bichler, 1991). Durch
gezielte Mutation von Cystein zu Serin wurde festgestellt, daß die Aktivitäten in vivo der
Mutanten Cys136Ser und Cys260Ser nur noch 4% bzw. 15% im Vergleich zum WT
betrugen. Durch Kultivierung in Anwesenheit von [14C]-FAD wurde festgestellt, daß beide
Mutanten innerhalb der Meßgrenzen kein FAD enthielten. Die geringe Aktivität wird
durch minimales Vorhandensein von Holoenzym erklärt (Brandsch et al., 1993).
Die His72Cys-Mutante war gegen Trypsinverdau resistent, deshalb wurde davon
ausgegangen, daß eine konformationelle Änderung des Enzyms bei der Inkorporation von
FAD nicht von der Ausbildung der kovalenten Bindung abhängt. Die Deletion der
Aminosäurereste Phe448 und Arg449 führte zu einem inaktiven Enzym, das nicht
flavinyliert werden konnte. Daher wird vermutet, daß zunächst das gesamte Polypeptid
synthetisiert werden muß, bevor FAD kovalent gebunden werden kann (Stoltz & Brandsch,
1998). Insgesamt war zu erhoffen, daß die Strukturaufklärung des Enzyms 6HDNO diese
diversen experimentellen Resultate erklären könnte.
7
1.2 6-Phospho-β-Galaktosidase (PGAL)
1.2.1
Nichtkovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen
Spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden die Basis für eine Vielzahl
von biochemischen Prozessen in der Zelle. Proteine steuern über spezifische reversible
Wechselwirkungen das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung, die Immunantwort,
vielfältige Signaltransduktionskaskaden und die Zellorganisation. Zum detaillierten
Verständnis dieser nichtkovalenten Protein-Protein-Wechselwirkungen hat hauptsächlich
die Analyse von bekannten Strukturdaten von Proteinkomplexen beigetragen und zur
Definition und Charakterisierung von Protein-Protein-Kontakten geführt (Jones &
Thornton, 1995; Janin, 1995).
Die Proteinkontaktfläche einer Dimer-Untereinheit wird nach Gleichung 1
berechnet (Jones & Thornton, 1995). Wie dort zu sehen ist, wird zur Definition von
Proteinkontakten von der verdeckten zugänglichen Oberfläche (buried accessible surface
area, BASA) ausgehen. Die BASA ist definiert als die Differenz zwischen der dem Wasser
zugänglichen Oberfläche (accessible surface area, ASA) der Monomere und der ASA des
Proteinoligomers bzw. Proteinkomplexes (Chothia & Janin, 1975; siehe Gleichung 39).
Kontaktflächen, die kleiner als 1200 Å2 sind, kommen selten vor und sind meist von
geringer Stabilität.
AK =
AK:
AU1, AU2:
AU12:
[AU 1 + AU 2 ] − AU 12
2
=
1
BASA
2
Gleichung 1
ASA der Kontaktfläche einer Dimer-Untereinheit
ASA der zwei dissozierten Untereinheiten
ASA der assoziierten Untereinheiten im Dimer
Es wird zwischen Protein-Protein-Wechselwirkungen in Proteinkomplexen und in
Kristallkontakten unterschieden (Jones & Thornton, 1995). Beide Kontakte sind prinzipiell
sehr ähnlich, unterscheiden sich aber in einigen wichtigen Punkten. Die BASA in
Kristallkontakten ist gewöhnlich kleiner als bei natürlichen Protein-Interaktionen. Die an
der Kristallkontaktbildung beteiligten Oberflächenregionen sind sehr variabel und eher
zufällig in die Kontakte miteinbezogen (Janin, 1995), deshalb ist eine Unterscheidung von
der restlichen Oberfläche des Proteins sehr schwierig. Es kann daher vorkommen, daß ein
Protein
unter
verschiedenen
Kristallisationsbedingungen
in
unterschiedlichen
Kristallformen, welche andere Kristallkontakte enthalten, kristallisiert. Um einen stabilen
8
Einleitung
Kristall zu erhalten, sollten etwa 10% der ASA an Kristallkontakten beteiligt sein. Die
restliche ASA und der hohe Solvensgehalt im Kristall reichen häufig für eine enzymatische
Aktivität im Kristall noch aus (Carugo & Argos, 1997).
Wenn zwei Moleküle assoziieren, muß der Energieverlust aufgrund der negativen
Entropiedifferenz durch die Bildungsenthalpie des Komplexes kompensiert werden. Dabei
wird der größte Beitrag von hydrophoben Wechselwirkungen geliefert und nur ein geringer
Teil von Wasserstoffbrücken und ionischen Wechselwirkungen. Bei natürlichen,
nichtkovalenten Protein-Protein-Wechselwirkungen sind die Oberflächen der Proteine
komplementär
zueinander
und
dicht
gepackt
(Chothia
&
Janin,
1975).
Die
Komplementarität umfaßt nicht nur die Form der Oberfläche, sondern auch die Anordnung
geladener Gruppen. Die Protein-Kontaktfläche ist gewöhnlich hydrophober als der Rest
der Proteinoberfläche, aber weniger hydrophob als das Proteininnere. Dabei treten in den
Kontaktflächen vermehrt Aminosäuren mit hydrophoben oder aromatischen Resten, aber
auch Arginin auf (Korn & Burnett, 1994; Young et al., 1994; Jones & Thornton, 1995;
Lo Conte et al., 1999). Bei Kontakten mit einer Fläche größer als 1500 Å2 wird
durchschnittlich eine Wasserstoffbrücke pro 170 Å2 BASA ausgebildet (Lo Conte et al,
1999). In den Kontaktflächen treten keine bevorzugten Sekundärstrukturmotive auf. Das
Volumen des Zwischenraums ist ungefähr proportional zur BASA (Jones &
Thornton, 1995).
1.2.2 6-Phospho-β-D-Galaktosidase
Die 6-Phospho-β-D-Galaktosidase (PGAL, EC 3.2.1.85) gehört zur Familie 1 der
Glycosylhydrolasen und katalysiert die Hydrolyse von Phospholactose zu Glucose und
Galaktose-6-Phosphat. Die entstandene Glucose gelangt anschließend in die Glycolyse und
wird abgebaut. Die 6-Phospho-Galaktose wird ebenfalls abgebaut und tritt als
Glyceraldehyd-3-Phosphat auch in die Glycolyse ein. Die in dieser Arbeit untersuchte
PGAL stammt aus Lactococcus lactis, einem grampositiven Milchsäurebakterium. Das
biotechnologische Interesse an diesem Enzym liegt im Einsatz bei Milchfermentation
Prozessen (Hengstenberg et al., 1989). Das korrespondierende lacG Gen wurde 1989
kloniert und rekombinant exprimiert (DeVos et al., 1989).
PGAL ist im nativen Zustand ein Monomer aus 468 Aminosäureresten und hat eine
Molekularmasse von 54’072 Da. Die Struktur wurde 1995 von Wiesmann gelöst
(Wiesmann et al., 1995). Dabei zeigte sich, daß die Tertiärstruktur im wesentlichen durch
ein (βα)8 barrel oder auch TIM barrel (Banner et al., 1975) gekennzeichnet ist.
9
Das TIM barrel kommt auffallend oft bei zuckerabbauenden Enzymen vor (Brändén &
Tooze,
1999).
Zusätzlich
sind
weitere
α-Helices,
fünf
sowie
ein
drei-
und ein fünfsträngiges β-Faltblatt enthalten, wobei letzteres ein greek key Motiv bildet.
Abbildung
3
zeigt
eine
Bänderdarstellung
der
PGAL-Struktur
und
eine
Topologiezeichnung.
a)
b)
Abbildung 3
Kristall-Struktur der PGAL aus L. lactis (Wiesmann et al., 1995). a) Ribbon-Darstellung
eines PGAL-Monomers. α-Helices sind rot und β-Stränge blau markiert. b)
Topologiezeichnung der PGAL. Senkrecht zur Papierebene liegende β-Stränge sind als
Dreiecke, α-Helices als Kreise und 310-Helices als Sechsecke gezeichnet. β-Stränge in der
Papierebene sind als Pfeile dargestellt. Das TIM barrel wird von den β-Strängen b, c, d, e,
f, h, m und n und den α-Helices C, E, H, J, L, O, P und Q gebildet. Die β-Stränge g, i, l, k,
und j bilden das greek key Motiv (Wiesmann, 1996).
Aufgrund
von
strukturellen
und
biochemischen
Daten
wurde
ein
Reaktionsmechanismus für die PGAL postuliert (Wiesmann et al., 1997). Das katalytische
Zentrum befindet sich in der Nähe des C-Terminus des Enzyms und liegt etwa 20 Å von
der Oberfläche des Proteins entfernt. Das Substrat kann das katalytische Zentrum durch
einen Kanal erreichen, der von zwei loops verschlossen werden kann. Sie versperren den
Kanal aber nicht vollständig, so daß die Reaktionsprodukte aus dem Kanal austreten
können (Wiesmann et al., 1995; Wiesmann et al., 1997).
10
Einleitung
1.2.3 Kristallographische Eigenschaften der PGAL
PGAL besitzt einige kristallographische Besonderheiten, die sie als System zur
Untersuchung von Kristallkontakten, nichtkovalenten Protein-Protein Wechselwirkungen
und zum Aufbau von Protein-Netzwerken besonders geeignet erscheinen lassen. Sie
kristallisiert
in
drei
verschiedenen
Raumgruppen
mit
nichtkristallographischen
zweizähligen Dreh- und Schraubenachsen, wobei jeweils große Kristallkontakte von 600
bis 900 Å2 pro Monomer ausgebildet werden (Wiesmann & Schulz, 1997). Im
Allgemeinen sind im Durchschnitt nur etwa 8% der Kristallkontakte größer als 500 Å2
(Carugo & Argos, 1997). Alle drei Kristallformen können als Faser-Assoziationen
betrachtet werden. Tabelle 1 gibt eine Zusammenfassung über alle kristallographischen
Daten der PGAL (Wiesmann & Schulz, 1997).
Tabelle 1
Kristallographische Daten der PGAL (Wiesmann & Schulz, 1997)
Kristallform
A
B
C
PGAL
WT
S265C
WT
S265C (reduziert)
(oxidiert)
Reservoirpuffer:
28% PEG 4000
0.2 M Li2SO4
0.1 M Tris pH 7.5
28% PEG 4000
0.2 M Li2SO4
0.1 M Tris pH 7.5
1.9 M (NH4)2SO4
2% PEG 600
0.1 M Tris pH 7.5
Raumgruppe
P21
C2221
P21212
v v v
a , b , c [Å]
60.5, 83.2, 105.7
104.0, 179.6, 60.6
107.1, 174.5, 61.0
β [°]
93.7
-
-
Moleküle in der ASU
2
1
2
Zellparameter
Wie in Abbildung 4 zu sehen ist, werden in Kristallform A Fasern innerhalb des
Kristalls von gegenseitig versetzten Monomeren gebildet, deshalb ist diese Kristallform
besonders interessant für den Aufbau von Protein-Netzwerken. Die Monomere ihrerseits
besitzen C2-Symmetrie zueinander. Die Drehachsen liegen auf einer Achse parallel zur
x-Achse der Einheitszelle. In den Kristallformen B und C wird die interne Symmetrie der
Fasern durch 21-Schraubenachsen dargestellt.
Insgesamt besitzt PGAL eine ASA von 16’200 Å2. Der zweitgrößte Kristallkontakt
in Kristallform A ist 633 Å2 groß, bildet 6 Wasserstoffbrücken aus und wird in
Abbildung 4 als f-f bezeichnet. Zusammen mit dem größten Kristallkontakt a-a (900 Å2)
machen diese beiden Kontakte 49% der gesamten BASA aus, also bedeutend mehr als die
erwarteten 33% für eine der drei Raumrichtungen (Wiesmann & Schulz, 1997).
11
1.3 Ausgangspunkte und Ziele der Arbeit
Abbildung 4
Kristallform A der PGAL (Wiesmann & Schulz, 1997). Zwischen jeweils zwei
Monomeren sind die zweizähligen Achsen dargestellt, die Kontaktflächen a-a und f-f sind
ebenfalls bezeichnet.
1.3 Ausgangspunkte und Ziele der Arbeit
1.3.1
6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase
Primäres Ziel der Arbeiten an der 6HDNO war die Bestimmung der
dreidimensionalen Struktur des Enzyms. Dazu stand von M. Claus das Plasmid
pKK223-3-6HDNOns im E. coli Stamm JM101 und eine Reinigung für dieses
Expressionssystem zur Verfügung. Kristalle der 6HDNOns wiesen in röntgenographischen
Untersuchungen allerdings eine sehr hohe Mosaizität auf und streuten nur bis zu einer
geringen Auflösung, so daß sich die bis zum Beginn der Dissertation gewonnenen Daten
nicht zur Strukturlösung eigneten. Eine Reihe von Mutationen solvenszugänglicher
Aminosäuren erbrachten keine Kristalle (Farnleitner, 2002). Darauf aufbauend sollten
Präparation und Kristallisation modifiziert werden, um röntgentaugliche Kristalle zu
erhalten, welche eine Bestimmung der Struktur erlauben.
Durch
Analyse
des
aktiven
Zentrums
sollte
der
enantioselektive
Reaktionsmechanismus der 6HDNO ermittelt und wenn möglich mit dem der 6HLNO
verglichen werden. Außerdem sollte anhand der Struktur ein Vorschlag zum Mechanismus
der Autoflavinylierung gemacht werden.
12
Einleitung
1.3.2 6-Phospho-β-D-Galaktosidase
Aufgrund der ungewöhnlich großen Kristallkontakte und der Bildung von Fasern in
den verschiedenen Kristallformen wurde die PGAL als Modellprotein für die gezielte
Veränderung von Kristallkontakten ausgewählt. Diese sollte zu einem besseren
Verständnis von nichtkovalenten Protein-Protein-Wechselwirkungen führen.
Ziel dieser Arbeit war es, den zweitgrößten Kristallkontakt der PGAL (f-f-Kontakt
in der Kristallform A) durch gezielte Mutationen so zu verändern, daß es durch gesteigerte
Protein-Protein-Wechselwirkungen zu einer Dimerisierung in Lösung kommt. Aufbauend
auf Erfahrungen und Ergebnissen aus der eigenen und vorangegangener Diplomarbeiten
(Kötter, 2002; Rothweiler, 2001) sollten neue Mutanten geplant, produziert, gereinigt,
kristallisiert und strukturell charakterisiert werden.
13
2.1 Geräte
2 Materialien
2.1 Geräte
Allgemeine Geräte
Pipetten
2, 20, 200, 1000 und 5000 µL
Multipetten Research Pro 10 und 100
Gilson
Eppendorf
Reinwasseranlage
Milli-Q Gradient
Millipore
Spektrophotometer
Lambda 5
BIO-Photometer
Perkin-Elmer
Eppendorf
Waagen
AE 240, PE 3600
pH Elektrode
IJ44/Meteo
pH Meter
761 Calimatic
Knick
Wasserbad
FC 200
K4 Electronic
Julabo
MGW Lauda
Zentrifugen
5415 C
5804 R
SpeedVac Concentrator
Thermoblock
50126101
Mettler
GAT
Eppendorf
Eppendorf
Savant
Liebisch
Molekularbiologische Arbeiten
AgarosegelElektrophorese-Kammer
Netzgerät
GNA 100
Pharmacia
ECPS 3000/150
Pharmacia
Thermocycler
PTC-200 Peltier Thermal Cycler
MJ-Research
Bakterienkultivierung
Dampfsterilisator
Varioklav 500 EV
Brutschrank
BK8
Kulturenschüttler
KS 125
Novotron
Küvetten
K-Küvetten 407 1/1
H & P Labortechnik
Memmert
IKA Labortechnik
Infors AG
Eppendorf
Proteinpräparation
Zentrifugen
RC-2B
RC-5C
Ultraschallbad
Sonorex RK 106 Super
Ultraschallgenerator
Modell 7100
Einmal-Filterhalter
0.20 µm, steril
Pumpen
Pump P-50
Sorvall
Sorvall
Bandelin
Measuring & Scientific
Equipment
Renner GmbH
Pharmacia
14
Material
Dialyse
Schläuche
Knöpfe
Konzentratoren
Centriprep YM-30
Centricon 2mL Concentrator
Serva
Institutswerkstatt
Amicon
Amicon
Chromatographie
Säulen/Materialien
Chromatographieanlagen
Steuerungssoftware
Ni-NTA
Q-Sepharose FF
Source-15Q
Source-30 Q
Superdex-200 16/60 prep grade
Superdex-200 26/60 prep grade
Superdex-75 26/60 prep grad
ÄKTA Purifier 100
ÄKTA Explorer 100
ÄKTA prime
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
Pharmacia
UNICORN Version 3.21
PrimeView 1.0
Pharmacia
Pharmacia
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Elektrophorese-Apparatur
Mini-Protean II
Biorad
Spannungsquelle
Power Pac 3000
Biorad
Geltrockneranlage
Eigenbau
Mikrowellengerät
Y 50
Gel-Dokumentationsanlage
Digit-store
Scan Jet 3400C
Institutswerkstatt
Moulinex
Intas
HP
Dynamische Lichtstreuung
DL-Apparatur
DynaPro-801
Protein Solutions
Software
DynaPro-801, Version 5.25.44, April 2000
Protein Solutions
Kristallisation
Deckgläser
∅ 21 mm, Stärke 2
Kristallisationsboxen
Linbro-Zellkultur-Box
Crystal Clear Strips, 96er
Crystalquick Platte, 96er
Crystal-Clear-TapeTM
Pufferaufbewahrung
Deepwell Plattes, 96er
Temperierschränke
Wine-cooler
Mikroskope
475265
Laborlux-12POL S
Kristallaufnahmen
Cammedia C-3030 Zoom
Hecht-Assistent
Flow Laboratories
Hampton Research
Greiner
Scotch
Eppendorf
Bosch
Zeiss
Leitz
Olympus
15
2.2 Chemikalien, Enzyme und Kits
Röntgenographische Methoden
Glaskapillaren
∅ 0.3, 0.5, 0.7 mm
Goniometerkopf
Huber
Hartwachs
Deiberit
cryo-loops
0.1-0.7 mm
Röntgengenerator
RU-2HC
W. Müller Glas
Hampton Research
Böhme, Bad Sachsa
Hampton Research
Rigaku
image plate
Tieftemperaturgenerator
Marresearch
600series
Oxford Cryosystems
2.2 Chemikalien, Enzyme und Kits
Gängige Chemikalien sind nicht aufgeführt. Soweit nicht anders beschrieben,
wurden alle Chemikalien mit Reinheitsgrad p.a. verwendet. Die Aminosäuren und Basen
für das LeMaster Medium stammten von den Firmen Aldrich, Fluka, Merck, Serva und
Sigma. Enzyme wurden von Amersham und New England Biolabs bezogen.
Chemikalien
Acrylamid, research grade
Serva
Agar-Agar
Gibco
Agarose, research grade
Serva
Ampicillin, Natriumsalz
Gerbu
Ammoniumperoxidisulfat
Merck
Bromphenolblau
Casein Pepton (Pepton 140)
Serva
Gibco BRL
Coomassie Brilliant Blue R-250
Fluka
DTT
Serva
Kb DNA-Längenstandard
Pharmacia
EDTA, Natriumsalz
Gerbu
Ethidiumbromid
Merck
Glycerin
Serva
Hefeextrakt
Gibco
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid)
Gerbu
LMW-Längenstandard
Pharmacia
β-Mercaptoethanol
Serva
N,N’-Methylenbisacrylamid, research grade
Serva
Ponçeau-S
Fluka
PEG 200
Sigma
PEG 400
Sigma
PEG 600
Fluka
16
Material
PEG 4000
Fluka
PEG 8000
Fluka
SDS
Fluka
Silikonisierungslösung
Serva
L-Seleno-Methionin
Sigma
TEMED
Merck
Tris
Fluka
Enzyme und Proteine
BamH I - Restriktionsendonuklease (10 U/µL)
MBI-Fermentas
Nde I Restriktionsendonuklease (10 U/µL)
MBI-Fermentas
Vsp I Restriktionsendonuklease (10 U/µL)
MBI-Fermentas
Benzonase (250 U/µL)
BSA
Thrombin Protease
Merck
Fluka
Pharmacia
Kits
E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit II
Lösung-1, Lösung-2, Lösung-3, HB-Puffer, DNA-Waschpuffer, RNase
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit
TurboPfu DNA-Polymerase, 10xReaktionspuffer, Dpn I
Restriktionsendonuklease, Kontroll-primer #1 und #2, Kontroll-Plasmide,
dNTP-Mix, Epicurian Coli XL1-Blue superkompetente Zellen
QIAquick Gel Extractions Kit
PeqLab
Stratagene
Qiagen
Puffer-QG, Puffer-PE, Puffer-EB, Iso-Propanol
QIAquick PCR Purification Kit
Qiagen
Puffer-PB, Puffer-PE, Puffer-EB
Rapid DNA Ligations Kit
MBI Fermentas
T4-DNA-Ligase, 5xPuffer
Crystal ScreenI/II
Hampton Research
98 verschiedene Pufferlösungen zur Proteinkristallisation
JB-Screen 1-10
Jena Biosciences
je 24 verschiedene Pufferlösungen zur Proteinkristallisation
Wizard Screen I/IITM
Emerald Biostructures
Wizard Cryo I/II TM
Emerald Biostructures
Additive Screen I-III TM
Hampton Research
je 24 verschiedene Additive zur Proteinkristallisation
Die Zusammensetzung der einzelnen Puffer und Lösungen kann den jeweiligen
Produktbeschreibungen entnommen werden.
17
2.3 Bakterienstämme und Plasmide
2.3 Bakterienstämme und Plasmide
Bakterienstämme
E. coli XL1-blue
F‘,Tn10, proA+B+ , lacIq, ∆(lacZ9M15/recA1, endA1,
gyrA96(NaIr), thi, hsdR17 (rK-mK-), supE44, relA1, lac
Stratagene
E. coli BL21 (DE3)
E. coli B, F´, ompT, hsdSB (rB-mB-), dcm+, galλ(DE3)
Invitrogen
E. coli One Shot
BL21 Star (DE3)
F‘, ompT, hsdSB (rB-mB-), dcm+, galλ(DE3)
Invitrogen
E. coli B834 (DE3)
F´, ompT, galλ(DE3), met (rB-mB-)
JM101
F‘, traD36, proA+B+, lacIqZ∆M15
Novagen
Stammsammlung
des Arbeitskreises
Plasmid
pET-3b
Expressionsvektor, T7-Promotor, Ampicillinresistenz
Novagen
pET-15b
Expressionsvektor, T7-Promotor, Ampicillinresistenz, His6-tag
Novagen
pKK223-3
Expressionsvektor, Ampicillinresistenz
Amersham
Biosciences
2.4 Nährmedien, Lösungen und Puffer
Nährmedien
LB-Medium
Caseinpepton
Hefeextrakt
NaCl
LBA-Medium
LB-Medium mit Ampicillin
(steril filtriert)
100 µg/mL
LB-Agar
LB-Medium mit Agar-Agar
15 g/L
LBA-Agar
LB-Agar mit Ampicillin (steril
filtriert)
LeMaster Medium
L-Alanin
L-Arginin HCl
L-Asparaginsäure
L-Cystein
L-Glutaminsäure
L-Glutamin
L-Glycin
L-Histidin
L-Isoleucin
L-Leucin
L-Lysin HCl
L-Phenylalanin
L-Prolin
L-Serin
L-Threonin
(autoklavierbare Portion)
10 g/L
5 g/L
10 g/L
pH 7.5 (RT, 1 M NaOH)
100 µg/mL
0.50g/L
0.58g/L
0.40g/L
0.03g/L
0.67g/L
0.33g/L
0.54g/L
0.06g/L
0.23g/L
0.23g/L
0.42g/L
0.13g/L
0.10g/L
2.08g/L
0.23g/L
18
Material
L-Tyrosin
L-Valin
Adenin
Guanin
Thymin
Uracil
Natriumacetat
Bernsteinsäure
NH4Cl
NaOH
K2HPO4
Thiamin (5 g/L)
Zusätze zum LeMaster Medium
(steril filtrierte Medienzusätze pro MgSO4 (1 M)
L autoklavierbarer Portion)
Glucose (20% (w/v))
L-Selenomethionin (10 g/L)
FeSO4·7H2O (6 g/L)
Ampicillin (100 mg/mL)
0.17g/L
0.23g/L
0.50g/L
0.67g/L
0.17g/L
0.50g/L
1.50g/L
1.50g/L
0.75g/L
1.08g/L
10.50g/L
pH 7.5 (NaOH, 25 °C)
1.0 mL
1.3 mL
60 mL
2.5 mL
0.65 mL
1.0 mL
SOC-Medium
Hefeextrakt
Caseinpepton
NaCl
KCl
MgCl2
Glucose
5 g/L
20 g/L
5 mM
2.5 mM
10 mM
20 mM
2×YT-Medium
Caseinpepton
Hefeextrakt
NaCl
16 g/L
10 g/L
5 g/L
2×YTA-Medium
2×YT-Medium mit Ampicillin
(steril filtriert)
100 µg/mL
Alle verwendeten Medien für Vorkulturen und Übernacht-Kulturen wurden soweit
nicht anders angegeben für 20 min bei 120 °C und 1 bar Druck dampfsterilisiert.
Agarosegel-Gelelektrophorese
50xTAE-Puffer
Tris
Essigsäure
EDTA
Ethidiumbromid-Lsg.
TAE Puffer mit Ethidiumbromid
Probenpuffer
Tris
EDTA
Glycerin
Bromphenolblau
kb-Standard
0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0,
8.0, 10.0 kb
2.0 M
1.0 M
0.1 M
pH 8.1 (RT, 6 M HCl)
1 mg/mL
10 mM
1 mM
50% (v/v)
0.05% (w/v)
Pharmacia
19
2.4 Nährmedien, Lösungen und Puffer
Proteinpräparation
6HDNO:
IEC-A Puffer
NaH2PO4·H2O
20 mM
IEC-B Puffer
NaH2PO4·H2O
NaCl
20 mM
2M
GPC-A-Puffer
NaH2PO4·H2O
NaCl
50 mM
200 mM
IEC-C Puffer
Tris
DTT
EDTA
50 mM
1 mM
0.1 mM
IEC-D Puffer
Tris
DTT
EDTA
NaCl
50 mM
1 mM
0.1 mM
1M
His-tag-Lyse-Puffer
Hepes
NaCl
Imidazol
50 mM
200 mM
20 mM
His-tag-Elution-Puffer Hepes
NaCl
Imidazol
50 mM
200 mM
600 mM
GPC-B-Puffer
50 mM
1 mM
0.1 mM
150 mM
PGAL:
Tris
DTT
EDTA
NaCl
SDS-PAGE
AcrylamidStammlösung
Acrylamid
Bisacrylamid
39% (w/v)
1% (w/v)
Elektrophoresepuffer
Tris
Glycin
SDS
50 mM
380 mM
0.1% (w/v)
pH 8.3 (stellt sich ein)
Sammelgelpuffer
Tris
SDS
0.5 M
0.4% (w/v)
Sammelgel 6% (w/v)
Acrylamid-Stammlösung
Sammelgelpuffer
0.375 mL
0.625 mL
20
Material
ddH2O
APS 1% (w/v)
TEMED
Trenngelpuffer
Tris
SDS
Trenngel 12% (w/v)
Acrylamid-Stammlösung
Trenngelpuffer
ddH2O
APS 10% (w/v)
TEMED
SDS-Probenpuffer
Sammelgelpuffer
SDS 16% (w/v)
Glycerin
Bromphenolblau 0.2% (w/v)
LMW-Längenstandard Phosphorylase B (94 kDa)
BSA (67 kDa)
Ovalbumin (43 kDa)
Carboanhydrase (30 kDa)
Trypsin-Inhibitor (20 kDa)
α-Lactalbumin (14 kDa)
Sucrose in SDS-Probenpuffer
1.5 mL
25 µL
2.5 µL
1.5 M
0.4% (w/v)
1.5 mL
1.25 mL
2.25 mL
50 µL
5 µL
2 mL
2 mL
4 mL
1 mL
64 µg/µL
83 µg/µL
147 µg/µL
83 µg/µL
88 µg/µL
121 µg/µL
27 µg/µL
0.25% (w/v)
30% (v/v)
10% (v/v)
Färbelösung
Coomassie Brilliant Blue R-250
Ethanol
Essigsäure
Entfärbelösung
Ethanol
Essigsäure
10% (v/v)
10% (v/v)
Methanol
Essigsäure
10% (v/v)
0.7% (v/v)
ESI-MS
MS-Puffer
21
3.1 Gentechnische Methoden
3 Methoden
3.1.1
Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur in vitro Amplifikation
doppelsträngiger, linearer DNA-Fragmente. Ausgangspunkt ist ein dsDNA-Fragment,
welches das zu amplifizierende Gen enthält (template). Zum Start der Reaktion sind zwei
das Fragment flankierende primer notwendig, die mit den komplementären Strängen der
Templat-DNA hybridisieren können. Nach thermischer Denaturierung (95 °C) der dsDNA
binden die primer auf beiden Seiten des zu synthetisierenden Genabschnittes (annealing,
40-70 °C), so daß das gewünschte Fragment durch die thermostabile PfuTurboTMPolymerase synthetisiert werden kann (elongation, 72 °C). Die DNA-Polymerase benötigt
zur Replikation von 1000 bp etwa 2 min. Durch eine zyklische Wiederholung dieser
Reaktionsschritte nimmt die Menge an Genfragment exponentiell zu. Die primer können
zusätzlich Spaltstellen von Restriktionsendonucleasen enthalten (Kapitel 3.1.3), so daß das
Fragment nach Verdau und Aufreinigung (Kapitel 3.1.5 bzw. Kapitel 3.1.6) in einen
Vektor mit den entsprechenden Schnittstellen ligiert werden kann (Kapitel 3.1.8).
3.1.2
Ortsgerichtete Mutagenese
Die ortsgerichtete Mutagenese, eine Variante der PCR, ist ein Verfahren zur
gezielten Veränderung von einzelnen oder auch mehreren Nukleotiden innerhalb einer
DNA-Sequenz.
Die
verwendete
QuikChange™-Methode
(Fa. Stratagene)
ist
in
Abbildung 5 schematisch dargestellt. Zur Amplifizierung der modifizierten DNA werden
die gleichen Zyklen wie bei der PCR durchlaufen. Das vom Hersteller vorgeschlagene
Temperaturprogramm dafür wurde direkt übernommen und ist in Tabelle 2 dargestellt.
Als letzter Schritt wird die parentale, methylierte DNA mit Dpn I verdaut, einem
Restriktionsenzym, welches lediglich methylierte DNA schneidet. Da die in vitro
hergestellte DNA nicht methyliert ist, wird sie nicht von Dpn I geschnitten. Zuletzt wird
die DNA transformiert und in den Zellen zum zirkulären Plasmid geschlossen.
22
Methoden
Abbildung 5
Schematische Darstellung der QuikChangeTM-Methode (Fa. Stratagene).
Nach der Vorschrift des Herstellers wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Lösungen
und Enzyme in 0.2 mL PCR-Reaktionsgefäßen zusammengegeben. Es wurden immer mit
mindestens drei Ansätzen mit verschiedenen templat Mengen gearbeitet. Bei Mißerfolg
wurde zusätzlich noch ein Temperaturgradient (40-70 °C) für den annaeling Schritt
eingeführt.
Tabelle 2
Tabelle 3
Temperaturprogramm für einen QuikChange™ Mutagenese Ansatz
Zyklen
Temperatur [°C]
Zeit [sec]
1
95
30
12-18
95
30
55
60
68
120 pro kb des Plasmids
Zusammensetzung der Reaktionslösung für einen QuikChange™ Mutagenese Ansatz
Menge [µL]
Inhalt
Konzentration
5
10xReaktionspuffer
0.5 - 5
dsDNA templat
10 ng/µL
1
primer #1
125 ng/µL
1
primer #2
125 ng/µL
1
dNTP Lösung
41.5-38
ddH2O
1
PfuTurbo DNA Polymerase
2.5 U/mL
23
Der Erfolg der PCR wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese überprüft und die
Ansätze nach dem vorgeschriebenen Transformationsprotokoll (Fa. Stratagene) in
superkompetente E. coli® XL1blue Zellen transformiert. Zur Selektion wurden die Zellen
nach der Transformation auf LBA-Platten ausgestrichen. Von den so erhaltenen Kolonien
wurden zwei bis vier ausgewählt und die DNA mittels Plasmidpräparation isoliert
(Kapitel 3.1.4). Zur Verifikation der Mutanten wurden die erhaltenen Plasmide von der
Fa. SEQLAB sequenziert.
3.1.3 Primer-Design
Für die ortsgerichtete Mutagenese nach der QuikChange™-Methode werden primer
benötigt. Primer sind Oligonukleotide mit einer Länge von 15 bis 40 Basen. Mutageneseprimer sollen laut Herstellerangaben ca. 25-45 Basen lang sein (QuikChange™ Kit, Fa.
Stratagene). Die Mutationen sollten etwa in der Mitte der primer liegen, so daß jeweils
10-15 Basen zu beiden Seiten der Mutationsstelle mit korrekt gepaarter Sequenz
vorhanden sind. Dabei sollten idealerweise die Enden der primer guanin- oder cytosinreich
sein und der Guanin- und Cytosinanteil insgesamt mindestens 40% betragen. Weiterhin
sollte die Schmelztemperatur Tm höher als 78 °C sein.
Die Schmelztemperatur errechnet sich nach Gleichung 2. Für die ortsgerichtete
Mutagenese nach der QuikChange™-Methode müssen zwei primer entworfen werden,
einer für den kodierenden und einer für den komplementären Strang. Die primer müssen
im Kernbereich von etwa 25 Basen komplementär sein, dürfen aber an den Enden
überhängen oder auch eine unterschiedliche Länge besitzen.
Tm = 81.5 + 0.41 (% GC ) −
675
− [% Fehler ]
N
Gleichung 2
N:
Anzahl der Basen
% Fehler: Anteil der mit dem template fehlgepaarten Basen
Für die Isolierung, eines Gens aus einem Plasmid, mit gleichzeitiger Einführung
neuer Restriktions-Schnittstellen, werden primer benötigt, die etwa 15-20 Basen lang sind,
deren Schmelzpunkt bei ca. 60 °C liegt und einen GC-Gehalt von über 40% haben. Ein
Teil des primers ist dabei nicht komplementär zum Plasmid und beinhaltet die neuen
Restriktionsschnittstellen mit einem für das zu verwendende Restriktionsenzym
ausreichenden Überhang an Basen. Für Sequenzprimer gelten die gleichen Eigenschaften,
allerdings wird der Primer so gewählt, daß er etwa 60-100 Basen entfernt auf der 5´-Seite
von der zu untersuchenden Stelle liegt.
24
Methoden
3.1.4 Plasmidpräparation
Plasmide sind kleine ringförmige extrachromosomale DNA-Moleküle, welche in
mehreren Kopien in Bakterien vorkommen. Plasmide sind für die Zelle nicht unbedingt
notwendig, enthalten aber oft Gene, die den Bakterien zu einem Vorteil verhelfen. In der
Gentechnik werden Plasmide als Klonierungsvektoren eingesetzt und zwar meist in
Verbindung mit einer Antibiotika Resistenz.
Für die Präparation von Plasmid wurden 15 mL LBA-Medium mit einem Klon
angeimpft und bei 37 °C ü.N. unter Schütteln (500 rpm) inkubiert. Die Sedimentation der
Zellen erfolgte mittels Zentrifugation (5000 rpm, 4 °C, 10 min). Das Pellet wurde auf zwei
Plasmidpräparationen verteilt, die mit Hilfe des E.Z.N.A PlasmidMiniprep Kit II
(Fa. PeqLab) durchgeführt wurden. Die Isolation der Plasmide erfolgt bei diesem Kit nach
der klassischen Methode der alkalischen Lyse mit NaOH und SDS (Birnboim & Doly,
1979), wobei Proteine und chromosomale DNA denaturiert werden und RNA durch
Zugabe von RNAse verdaut wird. Die Plasmid-DNA wird von NaOH und dem Detergenz
kaum beeinflußt, da sie in der ‘supercoiled’ Form vorliegt und den Reagenzien so kein
Zugang bietet.
Anschließend wurde durch Zugabe von 3 M Kaliumacetat-Lösung neutralisiert und
durch die hohe Salzkonzentration: denaturierte Proteine,
chromosomale DNA,
Zelltrümmer und SDS gefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt und
die im Überstand verbleibende lösliche Plasmid-DNA wurde anschließend bei hoher
Salzkonzentration an Silikagel-Säulen gebunden (Sambrook et al., 1989). Abschließend
werden nicht-gebundene Bestandteile in einem Waschschritt mit ethanolhaltigem Puffer
entfernt und schließlich das Plasmid mit vorgewärmten (60 °C) 2 x 25 µL bidestilliertem
Wasser eluiert.
3.1.5 Hydrolyse von DNA mit Restriktions-Endonukleasen
Restriktions-Endonukleasen sind Enzyme, die dsDNA unter Hydrolyse der
Phosphodiesterbindungen
spalten.
Dabei
sind
drei
Klassen
von
Restriktions-
Endonukleasen zu unterscheiden. Nur Klasse II Restriktions-Endonukleasen sind in der
Gentechnik von Interesse, weil nur diese innerhalb einer spezifischen Erkennungssequenz
schneiden. Die Erkennungssequenz ist üblicherweise 4-8 Basenpaare lang und ist sehr oft
palindromisch aufgebaut. Der Schnitt kann entweder blunt ends oder sticky ends erzeugen.
Da bei Benutzung von sticky ends die Orientierung des insertierten DNA-Fragments bei
25
einer Ligation eindeutig festgelegt werden kann, werden in der Gentechnik bevorzugt
Restriktions-Endonukleasen benutzt, die sticky ends erzeugen. Es wurden sowohl
analytische als auch präparative Verdaue durchgeführt.
Um optimale Bedingungen für die verschiedenen Restriktions-Endonukleasen zu
gewährleisten,
wurde
die
Auswahl
und
Zusammensetzung
der
Puffer
laut
Herstellerangaben durchgeführt, wobei die Bedingungen für das weniger aktive Enzym
optimiert wurden. Der Restriktions-Verdau wurde bei 37 °C für 1 h inkubiert. In Tabelle 4
ist die Zusammensetzung für einen typischen analytischen und präparativen Doppelverdau
dargestellt.
Tabelle 4
3.1.6
Zusammensetzung eines Restriktionsdoppelverdaus. Es wurde der für das weniger aktive
Restriktionsenzym empfohlene 10xPuffer verwendet.
päparativ [µL]
analytisch [µL]
DNA-Lösung (100-200 ng/µL)
10
1
10xPuffer
2
1
Restriktionsenzym I
2
1
Restriktionsenzym II
2
1
ddH2O
4
6
Agarosegel-Elektrophorese
Zur Trennung von DNA wurde die Agarosegel-Elektrophorese eingesetzt. Die
DNA ist aufgrund des Zucker-Phosphat-Rückgrats bei normalen pH-Werten negativ
geladen und wandert somit im elektrischen Feld zur Anode. Dabei werden die einzelnen
Fragmente aufgrund des Molekularsiebeffekts durch die porenartige Struktur der Agarose
getrennt. Die Porengröße hängt dabei von der Agarosekonzentration ab. Zur Trennung von
DNA-Fragmenten zwischen 200 bp und 10'000 bp werden in der Regel 1-2%ige Gele
verwendet. Außer dem pH-Wert und der Länge der DNA hat auch ihre Form einen Einfluß
auf die Trennung. DNA kann in verschiedenen Konformationen vorliegen (relaxed, linear,
supercoiled), die unterschiedlich kompakt oder entspannt sind.
Die Längenbestimmung erfolgte durch Vergleich mit einem künstlich hergestellten
Kilobasen-Standard (Fa. Pharmacia). Zum Anfärben der DNA wurde Ethidiumbromid
verwendet, das zwischen die Basen der DNA interkaliert und bei 254 nm Einstrahlung
orange fluoresziert (Sharp et al., 1973).
26
Methoden
Für ein Agarosegel wurde die Agarose in TAE-Puffer aufgenommen und durch
kurzes Kochen aufgelöst. Sobald die Agaroselösung auf etwa 60 °C abgekühlt war, wurde
Ethidiumbromid mit einer Endkonzentration von 0.5 µg/mL zugesetzt und die Lösung in
einen Gelträger gegossen. Zur Ausbildung der Probentaschen wurde ein Kamm eingesetzt.
Nach Verfestigung der Agarose wurde das Gel in eine Flachbett-Elektrophorese-Apparatur
gelegt, mit TAE-Puffer überschichtet und der Kamm vorsichtig entfernt. Die DNA-Proben
wurden mit mindesten 30% (v/v) Probenpuffer versetzt und in die Probentaschen pipettiert.
Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Stromstärke von 120 mA für ca. 45 min
durchgeführt. Zur Auswertung wurden die Gele unter UV-Licht bei 254 nm fotografiert.
3.1.7 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das QIAquick® Gel
Extraction-Kit
(Fa.
Qiagen)
verwendet.
Die
Extraktion
erfolgte
nach
den
Herstellerangaben. Dazu wurde zuerst das gewünschte DNA-Fragment unter UV-Licht aus
dem Gel ausgeschnitten. Das Agaraosegel-Stück wurde anschließend bei 60 °C mit einem
Puffer (QG-Puffer) mit hoher Ionenstärke aufgelöst. Die gelösten DNA-Fragmente binden
bei hoher Ionenstärke an Silikagel (Sambrook et al., 1989). Durch Auftrag der Lösung auf
Silikagel-Säulen konnten die DNA-Fragmente von den Resten des Gels abgetrennt und mit
ethanolhaltigem Puffer gereinigt werden. Bei einer niedrigen Ionenstärke wurden die
gereinigten DNA-Fragmente mit 30 µL TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7.6) eluiert.
3.1.8 Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Klonierung von DNA-Fragmenten in einen geöffneten Vektor müssen die
Enden verknüpft werden, diese Verknüpfung zweier DNA-Stücke wird als Ligation
bezeichnet. Dazu werden Ligasen eingesetzt, die eine Phosphodiesterbindung zwischen
zwei Nukleotiden knüpfen.
Das DNA-Fragment und der geöffnete Vektor wurden im Verhältniss 1:1 zu der
gebrauchsfertigen T4 DNA-Ligase (Ready-To-Go™ , Fa. Pharmacia) gegeben und auf
20 µL Endvolumen mit ddH2O aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wurde für 5 min bei
Raumtemperatur und danach für 30 bis 45 min bei 16 °C im Wasserbad inkubiert. 1 µL des
Ligationsansatzes wurde in E. coli® XL1blue Zellen transformiert.
27
DNA-Sequenzierung
3.1.9
Die DNA Sequenzierung wurde extern von der Fa. Sequence Laboratories
Göttingen GmbH (SEQLAB) durchgeführt. Dazu wurden 3 µg DNA gelöst in ddH2O
(Konzentration 200 ng/µL) zur Analyse eingeschickt. Für die Sequenzanalyse wird bei
Fa. SEQLAB eine Variation der Sanger Didesoxymethode verwendet.
3.1.10 Kompetente Zellen und Transformation
Die Aufnahme von Plasmiden in bakterielle Wirtszellen wird als Transformation
bezeichnet. Die Fähigkeit zu diesem Prozeß ist die Kompetenz der Zellen. Diese hängt
stark von der Art des verwendeten Bakterienstammes und dem physiologischen Zustand
der Zellen ab. Beste Ergebnisse werden mit Zellen der frühen log-Phase erzielt, die in
einem mit divalenten Metallionen (z.B. Mg2+, Ca2+) supplementierten Nährmedium
kultiviert werden. In dieser Arbeit wurden die superkompetenten E. coli-Zellen
One Shot BL21 Star (DE3) der Fa. Invitrogen für die Proteinexpression und XL1Blue
der Fa. Stratagene für gentechnische Arbeiten erworben. Kompetente Zellen der Stämme
JM101, BL21(DE3) und B834(DE3) wurden nach der Methode von Hanahan (1983)
präpariert.
Die Transformation erfolgte in allen Fällen nach der Hitzeschock-Methode,
welche
auf
der
erhöhten
Permeabilität
der
Membran
bei
einer
kurzzeitigen
Temperaturerhöhung beruht. Dazu wurden 50-100 µL der Zell-Lösung langsam auf Eis
aufgetaut, mit 1-2 µL Plasmidlösung (ca. 100 ng/µL) versetzt und 30 min auf Eis inkubiert.
Zum Hitzeschock wurden die Zellen für 45 sec auf 42 °C erwärmt, 2 min auf Eis gestellt
und anschließend mit 500 µL auf 42 °C vorgewärmten SOC-Medium verdünnt.
Abschließend wurde der Transformationsansatz mit einem Drygalski-Spatel auf
LBA-Agarplatten plattiert (500µL bei Ligationsansätzen, sonst 50-100 µL) und für 12-16 h
bei 37 °C inkubiert. Lediglich Zellen, die Plasmide aufgenommen haben, können aufgrund
der plasmidkodierten Ampicillinresistenz Kolonien ausbilden. Die Platten wurden zur
weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.
3.1.11 Stammkulturen
Stammkulturen werden dazu benutzt, Bakterienstämme über längere Zeit zu lagern.
Dazu wurde zu einer sich in der Wachstumsphase befindliche Kultur bei einer OD578 von
0.6 10-20% steriles Glycerin (90% v/v) zugegeben, um Eiskristalle zu verhindern.
28
Methoden
Die Zellsuspension wurde in 1.5 mL Cryo-Röhrchen aliquotiert, in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei -80 °C gelagert.
3.2 Proteinpräparation
Alle
Chromatographien
durchgeführt.
Über
einen
wurden
mit
angeschlossenen
einem
Äkta-System
Computer
mit
der
(Fa. Pharmacia)
Steuerungs- und
Auswertungssoftware Unicorn wurde der Verlauf gesteuert und kontrolliert. Die
Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE auf ihren Proteingehalt hin untersucht. Die
Fraktionen, welche das zu reinigende Protein enthalten, wurden vereinigt.
3.2.1 Bakterienkultivierung
Zur Kultivierung der plasmidtragenden E. coli Stämme wurden 10-20 mL LBAMedium unter sterilen Bedingungen mit einer Einzelkolonie inokuliert. Die Kultur wurde
über Nacht in einem Schüttler bei 37 °C und 500 rpm inkubiert. Als Hauptkultur wurden
vier 1 L Erlenmeyerkolben mit Schikane mit je 350 mL 2YTA-Medium (PGAL, 400 mL
LBA- bzw. LeMaster-Medium für 6HDNO Expression) verwendet. Die Hauptkulturen
wurden mit 1% der Vorkultur unter sterilen Bedingungen angeimpft und bis zu einer OD578
von 0.6 bis 0.8 bei 37 °C im Luftschüttler inkubiert. Die Schüttlergeschwindigkeit (140190 rpm) wurde so gewählt, daß ein Minimum an Einschlußkörpern bei hoher
Expressionrate resultierte. Die Induktion erfolgte mit einer Endkonzentration von 1 mM
IPTG. Anschließend wurde die Wachstumstemperatur bei 6HDNO zur Verringerung der
Menge an Einschlußkörpern auf 25 °C gesenkt. Die Zellernte erfolgte nach 1.5 h (PGAL)
bzw. 22 h (6HDNO) durch Zentrifugation (13'000*g, 10 min, 4 °C). Die Zellpellets
wurden teilweise bei -20 °C bis zur Weiterverarbeitung eingefroren.
3.2.2 Zellaufschluß
Die Zellpellets wurden in dreifachen Volumen (w/v) des Bakterienfeuchtgewichtes
IEC-A-Puffer, IEC-C-Puffer bzw. His-tag-Lyse-Puffer resuspendiert und zum Abbau von
DNA mit 1 µL Benzonase pro 25 mL Suspension versetzt.
Der Zellaufschluß erfolgte mit einem Ultraschallgerät bei einer Geräteleistung von
70%. Die mit Eis gekühlte Zellsuspension war dabei einem Puls von 5 sec ausgesetzt, dem
eine Pause von 10 sec folgte. Durch die Pulsunterbrechungen und die ständige Kühlung
sollte ein Aufwärmen der Proben verhindert werden. Die Gesamtschallzeit betrug 5 min.
Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (SS34, 40’000*g, 4 °C, 40 min) abgetrennt.
Der erhaltene Rohextrakt wurde vor dem Auftrag auf die Chromatographiesäule filtriert
(0.2 µm), um Schwebeteilchen aus der Proteinlösung zu entfernen.
3.2.3
Inkorporation von Selenomethionin in Proteine
Für die Phasierung bei der Strukturlösung werden Schweratomderivate des Proteins
benötigt. Eine elegante Methode, um ein solches Derivat zu erhalten, ist der Einbau von
Selenomethionin anstelle von Methionin in das Zielprotein. Zur Inkorporation von
Selenomethionin in Proteine durch Überexpression in E. coli stehen zwei Möglichkeiten
zur Verfügung. Zum einen kann die Selenomethionin-Inkorporation nach der Methode der
Produkt-Inhibition (VanDuyne et al., 1993; Doublie & Carter, 1992) erfolgen, zum
anderen kann ein Methionin-auxotropher Stamm verwendet werden (Cowie & Cohen,
1957; Doublie, 1997).
In beiden Fällen wird das Protein unter Zugabe von SeMet exprimiert. Bei der
Produktinhibition wird dem Medium bei Induktion zusätzlich eine Mischung aller
Aminosäuren der Pyruvat- und Aspartat-Familie zugesetzt, um die Synthese von
Methionin im Organismus zu reprimieren. Bei der Verwendung des auxotrophen Stammes
ist durch die Defizienz der Cystathionin-γ-Synthase eine vollständige Inkorporation von
SeMet in das Protein garantiert. Allerdings muß die Bakterienkultivierung in einem
aufwendig herzustellenden Medium, dem LeMaster Medium (Hendrickson et al., 1990),
erfolgen. Zudem sinkt die Expressionsrate, da das Bakterienwachstum im LeMaster
Medium deutlich gehemmt ist. Bei der Herstellung des Mediums werden zunächst
sämtliche Basen und alle Aminosäuren bis auf Methionin einzeln eingewogen und
zusammen mit den Puffersubstanzen (Kapitel 2.4) autoklaviert. Das abgekühlte Medium
kann anschließend mit den Medienzusätzen komplettiert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde nach der Methode von LeMaster gearbeitet. Dazu
wurde das Plasmid pET3b*6HDNOns und der Methionin-auxotrophe E. coli-Stamm
B834 (DE3) verwendet. Die Vorkulturen (Kapitel 3.2.1) wurden zur Entfernung von
Methionin abzentrifugiert (4400*g, 10 min, 4 C), das Pellet mit 20 mL ddH2O gewaschen,
erneut abzentrifugiert und das Pellet abschließend in 20 mL LeMaster-Medium
resuspendiert. Die Bakterienkultivierung und der Zellaufschluß erfolgten wie beschrieben.
29
30
Methoden
3.2.4 Ionenaustausch-Chromatographie
Zur Reinigung der PGAL wurde Q-Sepharose FF Anionenaustauscher-Material
(Fa. Pharmacia) verwendet, da PGAL mit einen pI-Wert von 4.70 (Beste, 1994) in Puffern
im physiologischen pH-Bereich negativ geladen ist. Q-Sepharose besteht aus einer
vernetzten Agarosematrix, die als funktionelle Gruppen Trimethylaminoethyl trägt.
6HDNO mit einem pI von 4.5 (Maun, 1998) wurde ebenfalls mit Hilfe eines
Anionenaustauschers gereinigt. Als Chromatographiematerial diente Source Q, das aus
monodispersen Kügelchen eines Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymers besteht, das mit
positiv geladenen quarternären Ammonium-Substituenten funktionalisiert ist.
Zur Vorreinigung der 6HDNOns wurde der Rohextrakt zunächst auf eine
Source 30Q-Säule aufgetragen. Anschließend wurde die Reinigung der 6HDNOns mit
Hilfe einer Source 15Q-Säule fortgeführt. Diese beiden Materialien unterscheiden sich
lediglich durch die Größe der Partikel, an welche die funktionellen Gruppen gebunden
sind. Durch ein größeres Volumen erlaubt die Source-30Q-Säule den Auftrag einer
größeren Gesamtproteinmenge, hingegen ermöglicht der geringere Durchmesser und die
kleineren Partikel des Source-15Q-Materials eine höhere Trennleistung. In Tabelle 5 sind
die technischen Daten der IEC-Säulen aufgelistet.
Tabelle 5
IEC-Säulenchromatographie
Säulenmaterial
Q-Sepharose FF
Source-30Q
Source-15Q
Säulendurchmesser [mm]
26
25
15
Säulenhöhe [mm]
72
65
57
Säulenvolumen [mL]
38
32
10
Auftragsvolumen [mL]
30-50
30-40
15-25
Äquilibrierung [Vt]
3
3
4
Auftrag (Fluß) [mL/min]
5
2
1
Waschen [Vt]
3
3
3
Salzgradient
0-600
0-1000
0-400
Fraktionsvolumen [mL]
6
5
1.5
Detektion [nm]
280
280/450
280/450
Temperatur [°C]
4
4
4
31
3.2.5
Ammoniumsulfatfällung
Die
vereinigten
PGAL
IEC-Fraktionen
wurden
Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen (Scopes, 1994).
einer
fraktionierenden
Ammoniumsulfat
als
nicht-
chaotropes Salz ist ein besonders schonendes Fällungsmittel und kann leicht wieder über
Dialyse entfernt werden. Für die Fällung wurde die Proteinlösung unter schwachem
Rühren bei 4 °C mit Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 55% (2.7 M)
versetzt und ü.N. bis zur vollständigen Einstellung des Lösungsgleichgewichts gerührt. Der
Niederschlag wurde durch Zentrifugation (40’000*g, 4 °C, 30 min) abgetrennt und
verworfen. Der Überstand wurde anschließend mit Ammoniumsulfat auf eine 80%-ige
Sättigung (4.3 M) eingestellt, ü.N. bei 4 °C gerührt und erneut wie oben beschrieben
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1-2 mL GPC-Puffer aufgenommen und nach Filtration
über eine 0.2 µm Membran der GPC zugeführt.
3.2.6 Affinitätschromatographie mit Ni-NTA-Sepharose
Die
Affinitätschromatographie
basiert
auf
spezifischen,
reversiblen
Wechselwirkungen zwischen Proteinen und an die Chromatographiematrix gekoppelten
Liganden. Beim Reinigungseffekt mit einer Ni-NTA-(Ni-trilotriacetic)-Säule wird die
Komplexbildung zweiwertiger Metallionen mit Proteinen ausgenutzt, an deren N- oder
C-terminalem Ende sich mehrere aufeinanderfolgende Histidine (hier: 6) befinden, der
sogenannte His6-tag (Hochuli et al., 1987).
Ebenfalls gebunden werden Proteine, an deren Oberfläche sich ein oder mehrere
Histidine, Cysteine oder Tryptophane befinden. Als Metallionen dienen meist Nickel- oder
Cobaltionen, welche über einen vierzähnigen 2-(Biscarboxylatomethyl-amino)-6-(1-amin)Hexansäure-Ligand an eine Sepharose-Matrix gekoppelt sind. Die Desorption der
gebundenen Proteine kann durch Variationen des pH-Wertes, einen Salzgradienten oder
durch eine steigende Imidazolkonzentration erreicht werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde für die alternative PGAL Aufreinigung eine
NTA-Säule, mit Ni2+ als Ionen, verwendet. Um unspezifische Wechselwirkungen zu
verringern, enthielt der Auftragspuffer sowohl eine relativ hohe Salzkonzentration
(200 mM NaCl), als auch Imidazol (20 mM). Eluiert wurde mit steigendem
Imidazolgradienten (20-600 mM Imidazol), die Regeneration der Säule erfolgte nach
Vorschrift des Herstellers (Pharmacia). Die genauen Säulendaten sind in Tabelle 6
zusammengestellt.
32
Methoden
Tabelle 6
Parameter der Ni-NTA-Säule
Säulenmaterial
Chelating-Sepharose
16
Säulenhöhe [mm]
45
Säulenvolumen [mL]
9
10-15
5
Auftrag (Fluß) [mL/min]
1
Waschen [Vt]
3
Imidazolgradient [mM]
20-600
Elution [mL]
45
5
Detektion [nm]
280
Temperatur [°C]
4
3.2.7 Gelpermeationschromatographie
Bei der Gelpermeationschromatographie werden Proteine aufgrund ihrer Größe
bzw. ihres hydrodynamischen Radius getrennt. Als Matrix werden Polydextrankugeln mit
Poren definierter Größe verwendet, wobei diese auf die Molekularmasse des Zielproteins
abgestimmt sind. Die Trennung beruht auf der unterschiedlichen Fähigkeit der Proteine, in
die Poren der Säulenmatrix zu diffundieren. Deshalb werden Proteine, die größer als die
Poren sind, zuerst eluiert. Kleine Proteine werden je nach Größe unterschiedlich stark
retardiert. Der GPC-Puffer enhielt 150 mM (PGAL) bzw. 200 mM (6HDNO) NaCl, um
unspezifische Interaktionen der Proteine untereinander und mit dem Säulenmaterial zu
vermeiden. Zur abschließenden Reinigung, wurde die Proteinlösung auf etwa 1% des
Säulenvolumens konzentriert. Um Schwebeteilchen abzutrennen wurde die Probe vor dem
Auftrag auf die Säule filtriert (0.2 µm).
In dieser Arbeit wurde die GPC auch im analytischen Maßstab eingesetzt, um das
Dimerisierungsverhalten der PGAL-Mutanten zu untersuchen. Dazu wurden sehr kleine
Proteinmengen (<0.1mg) rechromatographiert. Als Monomer-Dimer-Standard diente eine
Mischung aus PGAL-WT und einem über den N-Terminus zum C-Terminus mit fünf
Aminosäuren (LEGGH) kovalent verknüpftem PGAL-Dimer (PGAL-Tandem; Hergestellt
von Dr. P. Ringler). Die Daten der verwendeten Dextransäulen sind in Tabelle 7
zusammengefaßt.
33
Tabelle 7
GPC-Säulenchromatographie
Säulenmaterial
Superdex-200
Superdex-200
Superdex-75
SigmaChromTM
16/60 prep grade 26/60 prep grade 26/60 prep grade GFC-1300
analyt. grade
Agarose mit
Agarose mit
Agarose mit
Agarose mit
Dextran
Dextran
Dextran
Dextran
quervernetzt
quervernetzt
quervernetzt
quervernetzt
optimaler Trennbereich [kDa]
10-600
10-600
10-70
10-600
16
26
26
7.5
Säulenhöhe [mm]
600
600
600
300
Gelvolumen [mL]
120
320
320
13.25
1-2
2-4
2-4
0.05-0.2
2
2
2
2
Fluß [mL/min]
0.6
1.6
1.6
0.4
1.8
4
2
0.5
Detektion [nm]
280
280
280
280
Temperatur [°C]
4
4
4
4
3.2.8
Konzentrierung der Proteinlösung
Zur Konzentrierung der PGAL-haltigen Fraktionen wurden Konzentratoren der
Fa. Centricon [MWCO 30 kDa] verwendet. Dabei wird die Proteinlösung beim
Zentrifugieren (3000*g, 4 °C) gegen die Membran gedrückt, so daß Wasser- und
Puffermoleküle passieren können. Moleküle mit einer Molekularmasse größer als der
MWCO-Wert werden an der Membran zurückgehalten. Vor der Dialyse wurde die
Proteinlösung auf die erwünschte Konzentration eingeengt.
Bei der PGAL-Reinigung wurde teilweise während des Konzentrieren umgepuffert,
indem bis zu einem Volumen von 2 bis 5 mL konzentriert, dann 15 mL
Kristallisationspuffer zugegeben und wiederum auf das gleiche Volumen konzentriert
wurde. Dieser Vorgang wurde insgesamt drei Mal wiederholt. Abschließend wurde bis zur
gewünschten Proteinkonzentration eingeengt.
3.2.9
Dialyse
Die Dialyse ist ein gängiges Mittel zur Entsalzung oder Umpufferung von
Proteinlösungen. Hierzu werden semipermeable Membranen mit einem definierten
Ausschlußvolumen verwendet, durch die nur kleine Salz-Ionen und Pufferlösungen
diffundieren können. Moleküle, die das Ausschlußvolumen überschreiten, werden
34
Methoden
zurückgehalten. Zur Dialyse der Proteinlösungen wurden diese in einen Dialyseschlauch
[MWCO 14 kDa] überführt und gegen einen tausendfachen Überschuß Puffer dialysiert.
Die Dialyse erfolgte bei 4 °C über Nacht.
3.3 Proteinanalytik
3.3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Proteinkonzentration einer gereinigten, homogenen Proteinlösung läßt sich
über
die
Absorption
des
Proteins
bei
280 nm
bestimmen.
Dazu
wird
die
Aminosäurezusammensetzung des Proteins benötigt. Alle in der Sequenz vorkommenden
Tryptophane, Tyrosine und Cysteine tragen zum molaren Extinktionskoeffizienten ε280 bei
(Gill & von Hippel, 1989, Gleichung 3).
ε 280 [ M −1cm −1 ] = nTrp ⋅ ε Trp + nTyr ⋅ ε Tyr + nCystin ⋅ ε Cystin
Gleichung 3
nx: Anzahl der enstprechenden Aminosäuren im Protein
εTrp: 5500 M-1cm-1, εTyr = 1490 M-1cm-1, εCystin = 125 M-1cm-1
Nach Gleichung 3 berechnet sich der molare Extinktionskoeffizient von PGAL-WT
zu 104’880 M-1cm-1. Der Extinktionskoeffizient ε280 des 6HDNO Apoenzyms ist 45'090 M1
cm-1, da aber FAD bei der Wellenlänge von 263 nm ein Absorptionsmaximum hat
(ε263 = 37’000 M-1cm-1), trägt der Cofaktor auch zur Extinktion bei 280 nm bei. In der
Abteilung von Prof. Decker wurde der molare Extinktionskoeffizient ε280 des Holoenzyms
der 6HDNO zu 72’850 M-1cm-1 bestimmt. Dieser Wert wird im Folgenden verwendet. Über
das Lambert-Beersche Gesetz ergibt sich die Konzentration des Proteins in der Lösung
(Gleichung 4):
A ⋅Mr
c mg  = 280
 ml 
ε 280 ⋅ d
d:
Gleichung 4
Schichtdicke der Küvette (1cm)
Durch das in der 6HDNO enthaltene FAD existieren weitere Absorptionsmaxima
bei 375 nm (ε375 = 9300 M-1cm-1) und 450 nm (ε450 = 11’300 M-1cm-1). Daher wurden zur
Konzentrationsbestimmung die Werte von A280 und A450 herangezogen. Auftretende
Änderungen des Extinktionskoeffizienten durch Austausch von Aminosäuren wurden
berücksichtigt. Im Idealfall ergibt sich durch Einsetzen der Konstanten in Gleichung 4 ein
35
3.3 Proteinanalytik
Wert für A280/A450 von 6.45. Dieser Wert kann zur Ermittlung des Verhältnisses von
Holoenzym zu Apoenzym genutzt werden. Damit ergeben sich für die 6HDNOns zur
Konzentrationsbestimmung folgende Gleichungen:
c 280 [mg mL] = 0.676 ⋅ A280
[
]
c450 mg mL = 4.358 ⋅ A450
3.3.2
Gleichung 5
Gleichung 6
Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Zur Abschätzung der Reinheit und des Proteingehalts einer Proteinlösung wurde
die Diskontinuierliche-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) verwendet
(Laemmli, 1970). Die Gele wurden durch Copolymerisation von Acrylamid mit
N,N‘-Methylenbisacrylamid hergestellt. Durch Variation der Konzentration und des
Verhältnisses der beiden Monomeren kann die Porengröße und der Vernetzungsgrad des
Gels beeinflusst werden. Die Trennung der Proteine erfolgte in 12%-igen Acrylamidgelen
bei pH 8.8. Zuvor durchlaufen die Proteine ein 6%-iges großporiges Sammelgel bei
pH 6.8, wodurch eine Fokussierung der Proteinbanden erfolgte und somit die
Trennleistung gesteigert wurde (Righetti et al., 1990).
SDS ist ein anionisches Detergenz, das in einem konstanten Massenverhältnis von
1.4 : 1 an Proteine bindet und dieses in Mizellen denaturiert. Somit wird die Eigenladung
der Proteine maskiert und die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine im elektrischen
Feld hängt im Wesentlichen von ihrer Größe ab. Durch einen Vergleich mit einem
mitlaufenden Standard kann die Molekularmasse der Proben abgeschätzt werden.
In dieser Arbeit wurde die diskontinuierliche SDS-PAGE zur Kontrolle des
Verlaufs einer Proteinpräparation und zur Bestimmung der Reinheit von Proteinlösungen
verwendet. Es wurden je Probentasche 5-35 µg Protein in 10-20 µL Lösung aufgetragen.
Die Lösung bestand mindestens zu einem Drittel aus Probenpuffer und wurde vor dem
Auftrag für 2 min bei 95 °C zur Denaturierung erhitzt. Die Elektrophorese wurde
35-50 min bei 45 mA durchgeführt. Sobald die Bromphenolblau-Bande die untere
Gelkante erreicht hatte, wurde die Elektrophorese gestoppt. Anschließend wurden die Gele
5 min in heißer Coomassie-Lösung gefärbt und dann mit Entfärber behandelt. Gelagert
wurden die entfärbten Gele in 10% AcOH (v/v), bevor sie zwischen zwei Cellophanfolien
an der Luft in einem Trockengestell getrocknet wurden. Zur Dokumentation wurden die
getrockneten Gele eingescannt.
36
Methoden
3.3.3 Dynamische Lichtstreuung
Die dynamische Lichtstreuung wird in der Biochemie zur Bestimmung von
Molekularmasse, Reinheit und Homogenität einer Proteinprobe eingesetzt. Bei der DLS
werden Fluktuationen der Intensität des Streulichts eines monochromatischen Lichtstrahls
in einer Probe unter einem bestimmten Winkel gemessen. Verursacht werden die
Fluktuationen durch Molekülbewegungen, wodurch die nötigen Informationen über die
Mobilität und den Diffusionskoeffizienten D meßbar werden.
Mit Kenntnis des Diffusionskoeffizienten D läßt sich der hydrodynamische Radius
RH über die Stokes-Einstein-Gleichung (Gleichung 7) berechnen (Burchard, 1985). Aus RH
kann unter Annahme einer mittleren Dichte ρ und der Annahme eines globulären Teilchens
die Masse berechnet werden (Gleichung 8) (Rawle, 1990).
RH =
k:
T:
η:
D:
kT
6πηD
Gleichung 7
Boltzmann Konstante [J·K-1]
absolute Temperatur [K]
Vikosität des Lösungsmittels [kg·m-1·s-1]
Diffusionskoeffizient [m2·s-1]
M r = 4 π RH ⋅ ρ
3
3
Gleichung 8
Der vom Hersteller verwendete Begriff der baseline beschreibt die
Übereinstimmung
der
experimentellen
Daten
mit
einer
theoretisch
ermittelten
Größenverteilung (Tabelle 8). Dadurch läßt sich die Einheitlichkeit der Probe in Bezug auf
die Partikelgrößenverteilung abschätzen. Bei einer baseline von 1.000 stimmt die
experimentell ermittelte Größenverteilung genau mit der theoretisch ermittelten
Größenverteilung für eine ausschließlich monomodale Probe (Teilchen einer Größe)
überein. Die DLS gibt Aufschluß über die Kristallisierbarkeit eines Proteins
(D´Arcy, 1994; Ferré-D´Amaré & Burley, 1997). Falls die Proteinprobe monomodal
vorliegt, ist die Wahrscheinlichkeit, daß das Protein kristallisiert, wesentlich höher als bei
polydispersen Proben.
Tabelle 8
Beziehung von baseline zur Beschaffenheit der Probe
baseline
Partikelgrößenverteilung
0.997 - 1.001
monomodal
1.002 - 1.005
bimodal
> 1.005
polydispers
37
3.4 Kristallisation
Die Messung der DLS erfolgte mit Proteinkonzentrationen von etwa 1-2 mg/mL.
Insgesamt wurden etwa 12 µL Lösung über einen feinporigen Filter (0.02 µm für
Proteinmassen < 150 kDa und 0.1 µm für Proteinmassen > 150 kDa) in eine Quarzküvette
gegeben. Es wurden ca. 20 Messungen durchgeführt und mit der Auswertesoftware
DynaPro-801 (Fa. Protein Solutions) analysiert. Die Funktionsfähigkeit wurde mit dem
Kontrollprotein BSA (1 mg/mL) kontrolliert.
3.3.4
Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie
Mit
der
Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie
(ESI-MS)
können
empfindliche Substanzen massenspektrometrisch untersucht werden. Die flüssige Probe
wird unter Normaldruck in einem Zerstäuber in kleine Tröpfchen zerteilt. Durch eine
Kapillare tritt das Aerosol in die Ionen-Fokussierungsregion ein. In dieser Kammer
herrscht ein Druck von 10-4 Torr. Hier liegt ebenfalls ein starkes elektrisches Feld (2 bis
7 kV) an. Durch den Unterdruck und das elektrische Feld werden die positiv geladenen
Tropfen weiter zerteilt, bis nur noch einzelne mehrfach geladene Ionen vorliegen. Dieser
Prozeß erfolgt aufgrund von Verdunstung des Lösungsmittels und durch die Abstoßung der
eigenen Oberflächenladungen.
Die so entstandenen mehrfach geladenen Ionen werden in einem QuadrupolAnalysator über ihr Masse:Ladung-Verhältnis (m/z) bei einem Druck von 10-8 Torr
getrennt. Über das so erhaltene charakteristische Spektrum kann auf die Masse des
Moleküls geschlossen werden (Banks & Whitehouse, 1997).
Die ESI-MS-Messungen wurden zur Überprüfung der Inkorporation von
Selenomethionin
bei
der
Präparation
von
6HDNO
und
zur
Kontrolle
der
Proteinhomogentität im Hause von Herrn Christian Warth durchgeführt.
3.4 Kristallisation
Voraussetzung für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen
mittels Röntgenstrukturanalyse sind hochgeordnete Einkristalle ausreichender Größe. Bis
heute ist es allerdings nicht möglich, geeignete Bedingungen für die Kristallisation eines
Proteins vorherzusagen. Die Züchtung von Proteinkristallen ist daher ein empirischer und
extrem zeitintensiver Vorgang.
Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Kristallisation beruhen auf dem
langsamen Entzug von Lösungsmittel aus einer Proteinlösung, wodurch sich die
Konzentration des zugesetzten Fällungsmittels erhöht (vergleiche, Abbildung 6). Wird die
38
Methoden
Löslichkeitsgrenze überschritten, können sich in der übersättigten Lösung Kristallkeime
bilden. Durch das langsame Wachsen der Kristalle sinkt die Proteinkonzentration und das
System geht im Idealfall in die metastabile Phase über. In dieser Phase werden keine
weiteren Kristallisationskeime gebildet, das Kristallwachstum schreitet jedoch fort.
labile Region
Keimbildung und Wachstum
metastabile Region
Keimwachstum
ungesättigte Region
Keimauflösung
Fällungsmittelkonzentration
Abbildung 6
Phasendiagramm der Kristallisation (McPherson, 1990)
Die Bildung von Kristallen wird durch eine Vielzahl von Parametern wie der
Protein-, Fällungsmittel- und Salzkonzentration, den verwendeten Puffersubstanzen, dem
pH-Wert und der Temperatur beeinflusst (Gilliland & Ladner, 1996). Eine systematische
Variation aller Parameter ist aufgrund des dazu notwendigen Zeit- und Materialaufwandes
kaum möglich. Daher wird bei der Suche nach initialen Kristallisationsbedingungen in
Reihenexperimenten
(screenings)
der
vieldimensionale
Parameterraum
punktuell
abgetastet (Carter & Carter, 1979, Cudney et al., 1994). Häufig wird dabei ein von
Jancarik und Kim (1991) entwickeltes screening verwendet, das auf der statistischen
Analyse erfolgreicher Kristallisationsbedingungen basiert. In der Zwischenzeit sind von
zahlreichen Herstellern eine ganze Reihe solcher screenings kommerziell erhältlich. Als
Fällungsmittel dienen dabei Salze, organische Lösungsmittel oder auch lösliche Polymere
wie Polyethylenglycol (PEG). Proteinkristalle aus den initial erhaltenen Bedingungen
können durch eine feinere Variation der Parameter optimiert werden. Zusätzlich kann die
Kristallisation durch Einführung gezielter Mutationen an der Proteinoberfläche beeinflußt
werden.
3.4.1 Kristallisation mittels Gasphasenmethode
Die gängigsten Methoden für die Proteinkristallisation sind die Gasphasendiffusion,
batch-Verfahren und die Dialysemethode (McPherson, 1990). In dieser Arbeit wurden
zwei Varianten der Gasphasenmethode verwendet, die Hängetropfen- (hanging drop) und
3.4 Kristallisation
die Sitztropfenmethode (sitting drop). In beiden Fällen wird die Proteinlösung mit
Kristallisationspuffer in einem Tropfen gemischt und über der Reservoirlösung an einem
Deckplättchen aufgehängt bzw. auf ein Plateau gesetzt (Abbildung 7). Durch Abdichten
mit Silikonöl bzw. durch Abkleben mit Crystal-Clear-TapeTM entsteht ein geschlossenes
System. Die Konzentration an Fällungsmittel und Salzen im Tropfen ist normalerweise
geringer als im Reservoir. Über Dampf-Diffusion wird dem Tropfen Wasser entzogen und
so die Konzentration von Fällungsmittel, Salzen und Protein langsam, bis zur
Übersättigung erhöht. Ist die übersättigte Phase erreicht, können sich Kristalle bilden.
Bei der Suche von initialen Kristallisationsbedingungen wurde vorwiegend die
sitting drop Methode verwendet. Dazu wurden in eine 96er Box 60-80 µL Reservoirpuffer
pipettiert und ein Tropfen mit je 1 µL Proteinlösung und Reservoirpuffer gesetzt. Zur
Verfeinerung der Bedingungen diente die hanging drop Methode. Das Reservoir in den
verwendeten 24er Boxen enthielt 500 µL Puffer, der am silikonisierten Deckplättchen
hängende Tropfen bestand aus 1-5 µL Protein und 1-5 µL Kristallisationspuffer. Die
fertigen Kristallisationsansätze wurden bei 20 °C in erschütterungsfreien Kühlschränken
aufbewahrt und in regelmäßigen Abständen mit einem Lichtmikroskop auf Kristalle
untersucht.
Abbildung 7
3.4.2
Schematische Darstellung der hanging drop (links) und der sitting drop Methode (rechts).
Kristallmontage
Für röntgenographische Untersuchungen müssen die Proteinkristalle aus der
Mutterlauge entfernt werden, da die Kristalle aber einen hohen Solvensgehalt besitzen,
müssen sie während der Messung vor dem Austrocknen geschützt werden. Für Messungen
bei Raumtemperatur geschieht das durch Montage in einer silikonisierten Kapillare aus
Quarzglas (Durchmesser 0.5 – 0.7 mm). Dafür wird der Kristall in die Kapillare gesaugt,
zusätzlich etwas Mutterlauge eingefüllt, der Kristall mittels Filterpapier oder einer
dünneren Kapillare trocken gelegt und die Kapillare mit Hartwachs verschlossen.
39
40
Methoden
Abbildung 8
Kristallmontage in Kapillaren
Für lange Messreihen bzw. Messreihen mit hoher Intensität des Röntgenstrahls
(z. B. am Synchrotron) ist diese Methode nicht geeignet, da sie keinen Schutz vor
Strahlenschäden bietet. Durch Absenkung der Temperatur auf 100 K können die
Strahlenschäden minimiert werden (Rodgers, 1994). Dafür wurden die Kristalle in einer
vorgefertigten Nylonschleife (cryo-loop) montiert und im kalten Stickstoffgasstrom
schockgekühlt (Abbildung 9). Der Durchmesser der verwendeten loops (Durchmesser
0.1 – 1.0 mm) wurde dabei etwas größer als die größte Kristalldimension gewählt. Zur
Vermeidung von Eiskristallen, die störende Reflexe hervorrufen und den Proteinkristall
beschädigen können, wurden dem Puffer Glasbildner (cryo-protectants) zugesetzt. Beim
Test verschiedener cryo-protectants für 6HDNOns Kristalle erwies sich Polyethylenglycol
als am besten geeignet. Zusätzlich wurde die Konzentration schrittweise auf 15-20%
Polyethylenglycol (v/v) erhöht.
Abbildung 9
Kristallmontage im cryo-loop zur Messung bei 100 K. Zur Vermeidung von Eisbildung
ist der Stickstoffstrom von einem Trockenluftstrom umgeben.
3.5 Röntgenographische Methoden
3.5.1 Kristallgitter und Kristallsymmetrie
Ein Kristall ist ein regelmäßiger, sich aus periodisch wiederholenden Einheiten
(Elementarzellen) aufbauender dreidimensionaler Körper. Die Elementarzelle wird durch
41
die drei sie aufspannenden Einheitsvektoren a , b , c mit den Achsenlängen a, b, c sowie
deren eingeschlossene Winkel α, β, γ beschrieben. Anhand der Beziehungen zwischen
Achsenlängen und Winkeln der Elementarzelle sowie der Symmetrien lassen sich sieben
Kristallsysteme unterscheiden: triklin, monoklin, orthorhombisch, tetragonal, trigonal,
hexagonal und kubisch. Durch Kombination der Kristallsysteme mit den drei möglichen
Kristallpackungen (primitiv, innen- und flächenzentriert) werden die 14 Bravaisgitter
erhalten.
Die
Moleküle
stehen
durch
Symmetrie-Elemente
wie
Inversionszentren,
Drehachsen, Spiegelebenen, Schraubenachsen und Gleitspiegelebenen zueinander in
Beziehung. Die Symmetrie-Elemente werden durch Symmetrie-Operationen beschrieben,
deren Anwendung auf eine asymmetrische Einheit erzeugt die Elementarzelle. Für die
Röntgenstrukturanalyse ergibt sich daraus, daß es ausreichend ist, die atomare Anordnung
in der asymmetrischen Einheit zu bestimmen. Die drei Symmetrieoperationen Inversion,
Drehung und Spiegelung enthalten im Gegensatz zur Schraubenachse und Gleitspiegelung
keine Translationskomponente. Durch Kombination dieser sogenannten Punktsymmetrien
werden die 32 Punktgruppen gebildet, die mögliche Symmetrien von Molekülen
beschreiben. Aus der Kombination der Punktgruppen und der Translationssymmetrie eines
Kristalls ergeben sich die 230 kristallographischen Raumgruppen (International Tables for
Crystallography, 1996).
Aufgrund der Chiralität der Aminosäuren, treten bei Proteinkristallen jedoch keine
Inversionszentren und Spiegelebenen auf. Daher gibt es für Biomakromoleküle lediglich
elf Punktgruppen und 65 kristallographische Raumgruppen (Drenth, 1999), die
sogenannten Bio-Raumgruppen.
3.5.2
Bestimmung der Molekülanzahl in der asymmetrischen Einheit
Die Packungsdichte von Proteinkristallen bewegt sich innerhalb eines begrenzten
Bereichs. Daher kann in vielen Fällen die Anzahl z der Proteinmoleküle in der
asymmetrischen Einheit ohne Kenntnis der Kristallstruktur bestimmt werden. Aus den
Parametern der Elementarzelle wird dazu der von Matthews (1968) eingeführte
Packungsparamter VM für verschiedene Werte z berechnet (Gleichung 9). Durch Vergleich
mit einer Statistik bekannter Proteinkristallstrukturen kann z relativ gut bestimmt werden.
Im allgemeinen wird für cytosolische Proteine ein Packungsparameter von 1.7 bis
3.5 Å3/Da erwartet, meist liegt er um 2.4 Å3/Da (Kantardjieff & Rupp, 2003) mit einem
Solvensgehalt von ca. 50%.
42
Methoden
VM =
VEZ
Mr ⋅ z ⋅ n
Gleichung 9
VM:
Packungsparameter
VEZ:
Volumen der Elementarzelle [Å3]
Mr:
Molekularmasse [Da]
n:
Zahl der asymmetrischen Einheiten pro Elementarzelle
z:
Zahl der Moleküle pro asymmetrische Einheit
3.5.3 Röntgenstrahlung
Als Röntgenstrahlung werden elektromagnetische Wellen der Wellenlänge
10 bis 0.1 Å (1-120 keV) bezeichnet. Für die Röntgenstrukturanalyse von Proteinen wird
eine geeignete monochromatische Röntgenstrahlung von etwa 1 Å Wellenlänge benötigt.
Diese Strahlung läßt sich auf verschiedene Arten erzeugen. Im Labor werden DrehanodenRöntgengeneratoren verwendet. Hierbei werden Elektronen aus einem Glühdraht
(Filament) emittiert und treffen, nachdem sie durch ein elektrisches Feld von 45 kV
beschleunigt wurden, auf eine Kupferanode. Um die Abnutzung der Anode zu minimieren,
wird diese in Rotation versetzt. Die Anode muß ausreichend gekühlt werden, da der
überwiegende Anteil der Strahlung durch strahlungslose Absorption verloren geht. Mit
Hilfe von Nickel-Filtern oder Graphitkristallen wird aus der emittierten Röntgenstrahlung
monochromatische CuKα-Strahlung mit einer Wellenlänge von 1.5418 Å erhalten. Diese
Strahlung wird über einen Kollimator direkt auf den zu untersuchenden Proteinkristall
gelenkt.
In dieser Arbeit wurde die Kupfer-Drehanode RU-2HC der Firma Rigaku
verwendet. Bei dieser Anode wird die CuKα-Linie mit einem Graphit-Monochromator
selektiert. Der Strahl wurde auf 0.3 mm Breite fokussiert. Der Röntgengenerator wurde mit
einer Spannung von 44 kV und einer Stromstärke von 118 mA betrieben.
Da diese Röntgenstrahlung jedoch nicht ausreicht um qualitativ hochwertige und
hochaufgelöste Datensätze zu erzeugen, wird zunehmend Synchrotronstrahlung, die in
sogenannten Synchrotrons (Teilchenbeschleunigern) zur Verfügung steht, verwendet. Dort
werden Elektronen oder Positronen im Hochvakuum auf einer Kreisbahn auf relativistische
Geschwindigkeiten (1-6 GeV) beschleunigt, wobei tangential Synchrotronstrahlung
freigesetzt wird. Die Ablenkung erfolgt dabei durch starke Magneten. Bei jeder
Richtungsänderung im Magnetfeld entsteht Strahlung im Wellenlängenbreich von harter
Röntgenstrahlung (0.01 nm) bis zu sichtbarem Licht (600 nm). Die gewünschte
Wellenlänge
kann
durch
Einkristallreflektion
sehr
genau
eingestellt
werden.
43
Diese Variabilität der Wellenlänge ist eine Voraussetzung für die hier angewendete
Phasenbestimmung nach der MAD-Methode. Die Synchrotron-Messungen wurden an den
Meßstationen (beamlines) X06SA des SLS in Villigen (Schweiz) und BW7B am DESY in
Hamburg durchgeführt.
3.5.4
Theorie der Röntgenstreuung
Die Röntgenstrukturanalyse beruht auf der Streuung von Röntgenstrahlung an
Materie. Die Elektronen des Streuers werden dabei durch die elektrische Komponente des
elektromagnetischen Wechselfeldes der Welle in Schwingung versetzt. Die angeregten
Elektronen stellen selbst oszillierende Dipole dar, die ihrerseits eine Sekundärstrahlung
emittieren, welche die gleiche Wellenlänge und eine definierte Phasenbeziehung zu der
Primärstrahlung
besitzt.
Diese
elastische
Streuung
wird
als
kohärente
oder
Thomsonstreuung bezeichnet. Das Auftreten von inkohärenter Streustrahlung mit
verminderter Frequenz (Compton Streuung) wird bei der Röntgenstrukturanalyse
vernachlässigt.
Bei der Röntgenstrukturanalyse liegt die Wellenlänge der verwendeten Strahlung in
der Größenordnung der Bindungsabstände der Atome im Protein und die Streuer sind
periodisch angeordnet, daher kommt es zu Interferenzerscheinungen der kohärenten
Sekundärstrahlung.
Das
Interferenzbild
(Reflexmuster)
hängt
dabei
von
der
Elektronendichteverteilung der streuenden Materie im Kristall ab. Die Symmetrie des
Reflexmusters wird durch die Symmetrie des Kristallgitters bestimmt, während die
Intensität der Reflexe von der Elektronendichteverteilung innerhalb der asymmetrischen
Einheit abhängt. Ein Modell zur Veranschaulichung des Streuvorgangs, bei dem die
Röntgenstrahlung als ebene Welle betrachtet wird, ist in Abbildung 10 dargestellt.
tor
tek
De
Streuer
einfallende
Welle
Abbildung 10 Schematische Darstellung der Röntgenstreuung an Materie. Der einfallende Strahl wird dabei
als ebene Welle betrachtet. die in Richtung des Detektors gestreut wird.
44
Methoden
Besitzt die einfallende Primärstrahlung den Richtungsvektor k 0 und die gestreute
v
Welle den Richtungsvektor k mit dem gleichen Betrag 2π/λ, so ergibt sich die
v
Streuamplitude E am Ort R , nach Gleichung 10, durch Integration über alle
v
Volumenelemente im streuenden Materiepartikel mit der Elektronendichte ρ el (r ) .
vv
r
E = const ⋅ e i (ω ⋅t − kR ) ∫ ρ el ( r ) ⋅ e i (k −k 0 ) r d r
Gleichung 10
Vol
ω = 2πc/λ:
t:
r
k0 :
r
k:
v
ρ el ( r ):
Kreisfrequenz ω und Wellenlänge λ der Röntgenstrahlung
Zeit
Wellenvektor des einfallenden Strahls mit k 0 = 2π/λ
Wellenvektor des gestreuten Strahls mit k
= 2π/λ
Elektronendichte am Ort r
Die Terme vor dem Integral enthalten physikalische Informationen über die
Ausbreitung der ebenen Welle. Das Integral enthält Informationen über die Verteilung der
Elektronendichte im streuenden Volumenelement und wird daher als Strukturfaktor F
v
bezeichnet. Durch die Einführung des Streuvektors s mit 2πs = k − k 0 wird der
Strukturfaktor zu folgender Form vereinfacht:
v
F (s ) =
v
∫ ρel ( r ) ⋅ e
2 πi s r
dr
Gleichung 11
Vol
In Gleichung 11 wird die ortsabhängige Elektronendichte ρel ( r ) aus dem realen
Raum in den reziproken Raum, der vom Streuvektor s abhängigen komplexen
v
Strukturfaktoren F (s ) , überführt. Mathematisch gesehen stellt dieses Integral eine
Fourieranalyse dar. Bei der Röntgenstreuung an Kristallen kommt es nur dann zu positiven
Interferenzen, wenn die Phasenverschiebung zwischen gestreuten Sekundärwellen ein
Vielfaches von 2π ist. Daraus resultieren die Laue-Bedingungen:
v
a⋅s = h
v
b⋅s = k
v
c⋅s = l
h,k,l = ...,-2,-1,0,1,2,...
Gleichung 12
45
Die ganzen Zahlen h, k und l werden als Millersche Indizes bezeichnet.
Anschaulich betrachtet beschreiben sie Netzebenen im realen Raum (siehe unten). Durch
die Darstellung des Ortsvektors r in fraktionellen Koordinaten des realen Raums und
Berücksichtigung der Laue-Bedingungen wird Gleichung 11 in folgende Form überführt:
1
F (hkl) = VEZ
1
1
∫ ∫ ∫ ρel ( x, y, z) ⋅ e
2 πi ( hx + ky + lz )
dxdydz
Gleichung 13
x =0 y =0 z =0
Eine anschauliche, wenn auch physikalisch stark vereinfachende, Erklärung der
Streuung von Röntgenstrahlen an einem Kristall liefert das Braggsche Gesetz (Bragg &
Bragg, 1913):
nλ = 2d hkl sin Θ hkl
n:
λ:
dhkl:
Θhkl:
Gleichung 14
1, 2, 3, ...
Wellenlänge [Å]
Netzebenenabstand [Å]
Glanzwinkel des Reflexes hkl [°]
Das Braggsche Gesetz behandelt den Streuvorgang als Reflexion der unter dem
Glanzwinkel Θhkl einfallenden monochromatischen Röntgenstrahlen an den sogenannten
parallelen Netzebenen. Diese verlaufen durch die Gitterpunkte des Kristallgitters und
werden durch die Millerschen Indices h k l beschrieben. Eine positive Interferenz der an
unterschiedlichen Ebenen mit Abstand dhkl gestreuten Röntgenstrahlung tritt dann auf,
wenn der Gangunterschied ein ganzzahliges Vielfaches der Wellenlänge λ ist. In
Abbildung 11 wird das Braggsche Gesetz graphisch veranschaulicht.
einfallender
Strahl
gestreuter
Strahl
Θ hkl
.
dhkl . sin Θ hkl
Abbildung 11
Θ hkl
dhkl
.
dhkl. sin Θ hkl
Schematische Darstellung der Röntgenstreuung gemäß des Braggschen Gesetzes.
46
Methoden
3.5.5 Reziprokes Gitter und Ewaldkonstruktion
Die Millerschen Indizes hkl beschreiben Scharen von parallelen Netzebenen im
realen Raum. Durch die Streuung von Röntgenstrahlen an einer Netzebenenschar entsteht
im Fall positiver Interferenz ein Reflex mit dem Streuvektor s , dessen Länge dem
reziproken Ebenenabstand 1/dhkl entspricht und der senkrecht zu den streuenden Ebenen
steht. Jeder Streuvektor s erzeugt einen Punkt P(hkl) im sogenannten reziproken Raum.
v
Die für s erlaubten diskreten Werte definieren dabei das reziproke Gitter mit den
v v
Basisvektoren a * , b* und c* :
v
v
s = ha * + kb * + l c *
Gleichung 15
Unter Berücksichtigung der Laue-Bedingungen (Gleichung 12) ergibt sich nach
Gleichung 16 eine definierte räumliche Beziehung zwischen realem und reziprokem Raum.
Dabei sind die Dimensionen des reziproken Raums umgekehrt proportional zu den
v v
v
Dimensionen des realen Raums. Die Basisvektoren des reziproken Gitters a * , b* und c*
v
stehen senkrecht zu den Basisvektoren a , b und c des realen Raums, wobei im Fall
rechtwinkliger Elementarzellen die Vektoren beider Systeme kolinear sind.
v
v
( b* × c * )
v
a =
VEZ
v
v
( c* × a * )
b =
VEZ
( a * × b* )
v
c =
VEZ
Gleichung 16
Die Ewaldkonstruktion (Ewald, 1921) überträgt die Braggsche Gleichung in den
dreidimensionalen Raum und verdeutlicht den Zusammenhang zwischen realem Gitter,
reziprokem Gitter und dem Auftreten von Röntgenreflexen (Abbildung 12).
P(hkl)
s
Θ hkl
2Θ hkl
O
b* a*
1/λ
Abbildung 12
Darstellung der Ewald-Konstruktion zur Verbindung von realem und reziprokem Raum.
47
In der Ewald-Konstruktion wird der streuende Kristall in den Mittelpunkt der
sogenannten Ewaldkugel mit dem Radius 1/λ gelegt. Der Ursprung O des reziproken
Gitters liegt im Austrittspunkt des Primärstrahls aus der Ewaldkugel. Ein Reflex wird nur
dann beobachtet, wenn der Streuvektor s des reziproken Gitterpunktes P(hkl) mit der
Ewaldkugel zusammenfällt und F(hkl) ≠ 0 ist. Eine Drehung des Kristalls im
Röntgenstrahl bedingt auch eine Drehung des reziproken Gitters, wodurch nach und nach
alle reziproken Gitterpunkte P(hkl) in den Schnittpunkt mit der Ewaldkugel gebracht
werden.
Unter Vernachlässigung der anomalen Röntgenstreuung besitzt das reziproke Gitter
in Bezug auf die Reflexintensitäten im Gegensatz zum realen Kristallgitter ein zusätzliches
Inversionszentrum. Diese Eigenschaft wird durch das Friedelsche Gesetz beschrieben:
F (hkl )
2
= F (h k l )
2
Gleichung 17
Die Intensität des Reflexes hkl ist identisch mit der Intensität des invertierten
Reflexes hk l . Daher muß bei der Messung der Reflexintensitäten nur die Hälfte des
reziproken Raums erfaßt werden. Durch Symmetrien des Kristallgitters wird das bei der
Messung zu erfassende Volumen des reziproken Raums zusätzlich verkleinert. Das
Friedelsche Gesetz gilt jedoch nicht bei anomaler Diffraktion. Mit Hilfe von anomaler
Streuung kann unter Ausnutzung der Intensitätsdifferenzen der einzelnen Friedel-Paare das
Phasenproblem gelöst werden (Kapitel 3.5.12).
3.5.6
Temperaturfaktoren
Der in Gleichung 13 definierte Strukturfaktor F(hkl) kann auch durch die Summe
der Beiträge aller Atome in der Elementarzelle ausgedrückt werden (Gleichung 18). Die
thermischen Bewegungen der Atome und die statistischen Fehlordnungen im Kristall
führen zu einer auflösungsabhängigen Veränderung der Intensitäten (Debye, 1914), die
durch einen Korrekturterm berücksichtigt werden.
F (hkl) =
n Atom
∑
1
− Bs 2
0
f j (s) ⋅ e 4
vv
⋅ e 2 πi⋅s ⋅ rj
j
f j0 (s) : Streufaktor für punktförmiges Atom j
B:
isotroper Temperaturfaktor (B-Faktor)
Gleichung 18
48
Methoden
Der isotrope Temperaturfaktor B, der auch als isotroper Versetzungsfaktor
bezeichnet wird, ist dabei proportional zum mittleren Verschiebungsquadrat u 2
der
Atome in einer Koordinate:
B = 8 π2 u 2
Gleichung 19
Ein mittlerer B-Faktor von 30 Å² entspricht einem mittleren Verschiebungsquadrat
von 0.62 Å. Nach Wilson (1949) läßt sich der mittlere Temperaturfaktor aus den
gemessenen Intensitäten abschätzen (Gleichung 20).
ln
I( s )
= ln C − 2 ⋅ B
∑ (f j ) 2
0
sin 2 Θ
Gleichung 20
λ2
j
Wird der des natürlichen Logarithmus des Quotienten aus der gemessenen mittleren
v
Intensität I( s ) und der unter Vernachlässigung thermischer Bewegung berechneter
mittlerer
Intensität
∑ (f
0
j
)
2
sin2 Θ / λ2
gegen
aufgetragen,
so
lassen
sich
der
Skalierungsfaktor C aus dem y-Achsenabschnitt und der mittlere Temperaturfaktor B aus
der Steigung der Geraden ermitteln.
3.5.7 Fouriertransformation und Phasenproblem
Der Strukturfaktor F(hkl) ist in Gleichung 13 als Funktion der ortsabhängigen
v
Elektronendichte ρel ( r ) dargestellt. Mathematisch betrachtet handelt es sich bei der
Röntgenstreuung an Kristallen um eine Fouriertransformation der Elektronendichte in den
reziproken Raum (Fourieranalyse). Umgekehrt läßt sich die Elektronendichte am Ort xyz
durch
die
entsprechende
Rücktransformation
(Fouriersynthese)
der
komplexen
Strukturfaktoren berechnen. Dabei kann das Integral durch eine Summation ersetzt werden,
da die Strukturfaktorfunktion gemäß den Laue-Bedingungen (Gleichung 12) nur für
diskrete Reflexe ungleich Null ist:
ρ el ( x , y, z) =
1
VEZ
∑∑∑ F(hkl) ⋅ e −2πi( hx +ky+lz)
h
k
l
Gleichung 21
49
Der Strukturfaktor F(hkl) eines Reflexes hkl ist eine komplexe Zahl, die durch
Amplitude und Phase beschrieben werden kann:
F(hkl) = F(hkl) ⋅ e iϕ hkl
F(hkl):
ϕ hkl :
Die
Gleichung 22
Strukturfaktoramplitude
Strukturfaktorphase
Strukturfaktoramplituden F(hkl)
sind
durch
Messung
der
Reflexintensitäten I(hkl) experimentell zugänglich. Die observierten Intensitäten Iobs(hkl)
sind dabei proportional zum Produkt aus den komplexen Strukturfaktoren F(hkl) und ihren
konjugiert komplexen Strukturfaktoren F*(hkl):
I obs (hkl) ~ F (hkl) 2 = F (hkl) ⋅ F* (hkl)
Gleichung 23
Die Phasen ϕ hkl der Strukturfaktoren sind dagegen experimentell nicht direkt
zugänglich und müssen indirekt bestimmt werden. Dies wird als Phasenproblem der
Röntgenstrukturanalyse bezeichnet. Für die Bestimmung der Phasen kommen in der
Proteinkristallographie vier Methoden in Betracht: multipler isomorpher Ersatz (MIR),
molekularer Ersatz (MR; siehe Kapitel 3.5.13), multiple anomale Dispersion (MAD, siehe
Kapitel 3.5.12) und direkte Methoden bei atomarer Auflösung.
3.5.8
Datensammlung
Die möglichst genaue und vollständige Messung der Reflexintensitäten ist für die
Röntgenstrukturanalyse von entscheidender Bedeutung, da die Qualität der gemessenen
Daten ausschlaggebend für den Gang der Strukturlösung und die erreichbare Genauigkeit
des Strukturmodells ist. Für die Messungen wurde in dieser Arbeit sowohl CuKαStrahlung als auch Synchrotron-Strahlung verwendet (Kapitel 3.5.3). Der Kristall wurde
dazu auf einem Goniometerkopf montiert (Kapitel 3.4.2) und während der Messung in
kleinen Winkelintervallen um eine Achse gedreht (Arndt et al., 1973). Nach jeder
Aufnahme wurden die gestreuten und vom Detektor akkumulierten Röntgenquanten
zusammengefaßt und die gemessenen Intensitätswerte zusammen mit den Daten zur
Geometrie der Meßanordnung gespeichert. Zur Detektion der Reflexe wurden
zweidimensionale, ortsempfindliche Detektoren, wie image plates oder CCD-Detektoren
(charge coupled devices) verwendet.
50
Methoden
Die Image Plate
Die image plate besteht aus einer Trägerplatte, die mit einer röntgensensitiven
Beschichtung
aus
Eu3+-dotiertem
BaFCl
überzogen
ist.
Bei
Absorption
von
Röntgenquanten werden die Eu3+-Ionen (sogenannte Farbzentren) in einen metastabilen
Zustand angeregt. Das Auslesen einer image plate erfolgt durch Bestrahlung mit rotem
Licht eines Helium-Neon-Lasers, wodurch die Farbzentren unter Emission von blauem
Licht wieder in den Grundzustand zurückkehren. Die dabei emittierte Strahlung wird von
einem Lichtverstärker (photomultiplier) detektiert. Vor jeder Aufnahme (image) müssen
eventuell angeregte Farbzentren durch Bestrahlung mit weißem Halogenlicht gelöscht
werden.
In dieser Arbeit wurde die image plate der Hausanlage (MAR300, Marresearch) an
einer Kupfer-Drehanode (RU-H2C, Rigaku) sowie eine image plate (MAR345,
Marresearch) am Synchrotron-Meßplatz BW7B der EMBL Außenstation verwendet. Die
Belichtungszeit pro image betrug je nach Streukraft der Kristalle bei Verwendung von
CuKα-Strahlung 10-15 min, während bei Verwendung von Synchrotronstrahlung
30-60 sec belichtet wurde. Die Kristalle wurden dabei in Winkelintervallen von 1-2° pro
image um den Winkel ϕ gedreht, eine Drehung um den Winkel 2Θ zur Erreichung der
Auflösungsgrenze war nicht notwendig. Abbildung 13 zeigt eine schematische Darstellung
der entsprechenden Meßanordnung. Die optimalen Datensammlungsparameter wie z. B.
Kristall-Detektor-Abstand, Oszillationswinkel und Belichtungszeit wurden mit dem
Programmpaket MOSFLM (Leslie, 1999) bestimmt. Dazu wurden zwei bis drei
Cry
o
-G
ene
rat
o
r
Aufnahmen bei verschiedenen Winkeln ausgewertet.
Drehanode
Monochromator
image plate
Kristall
im loop
Goniometer
ω
ϕ
Kollimator
Abbildung 13
Messanordnung an der image plate. Der Kristall wird lediglich um die ϕ-Achse gedreht.
Der Cryo-Generator kühlt den Kristall auf 100 K mittels Stickstoffstrom.
51
CCD-Detektoren
Die Abkürzung CCD (charge coupled device) wird mit: Ladungsgekoppeltes
Bauelement übersetzen. Dahinter verbirgt sich ein Bildsensor, der in den letzten Jahren
sowohl in der Wissenschaft als auch in der Unterhaltungselektronik weite Verbreitung
gefunden hat. In der Proteinkristallographie werden CCD-Detektoren vor allem zur
Messung mit Synchrotron-Strahlung verwendet. Die einfallende Röntgenstrahlung wird an
einer fluoreszierenden Phosphorbeschichtung in sichtbares Licht umgewandelt, das über
Glasfaserkabel an einen CCD-Detektor weitergeleitet wird. Die Licht-Photonen treffen
dort auf einen dotierten Silizium-Kristall, der proportional zur Photonenzahl elektrische
Ladungen in Gestalt frei beweglicher Elektronen erzeugt, indem Valenzelektronen ins
Leitungsband angeregt werden und dadurch sogenannte Elektronen-Loch-Paare entstehen.
Die Mindestenergie für eine solche Anregung beträgt 1.14 eV. Bis zu einer Energie von
5 eV werden einzelne Elektronen-Loch-Paare gebildet. Bei mehr als 5 eV kommt es zu
multiplen Paaren. Die in den einzelnen Sensorzellen entstandenen unterschiedlich großen
Ladungspakete werden nach der Belichtung durch periodische Potentialänderungen an der
Elektrodenstruktur horizontal durch den Siliziumkristall geschoben. Bei jedem
Verschiebungsvorgang kommt das jeweils letzte Ladungspaket am Ausgangsfenster an.
Dort befindet sich ein Auswerteverstärker, der die enthaltene Ladung erfasst und in eine
proportionale Spannung umsetzt, die dann detektiert wird.
Vorteile von CCD-Detektoren liegen in einer extrem schnellen Auslesezeit
(Sekunden), in einer hohen Detektorauflösung und der Vermeidung von anfälliger
Mechanik im Gehäuse des Detektors. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der CCD-Detektor
(16.5 cm Durchmesser, MAR Research) am Synchrotron-Meßplatz X06SA der Swiss
Light Source (SLS) in Villigen verwendet.
3.5.9
Prozessierung, Skalierung und Reduktion kristallographischer Daten
Für die Prozessierung der Röntgendaten wurde das Programm XDS (Kabsch, 1993)
verwendet. Ziel der Prozessierung und Datenreduktion ist es, jedem Reflex hkl eine
gemittelte Intensität zuzuordnen. Zunächst werden auf den images bzw. frames Reflexe
identifiziert, mit denen die Orientierungsmatrix berechnet und die Raumgruppe bestimmt
werden kann. Aus starken Reflexen werden mittlere Reflexprofile errechnet, die zur
Bestimmung der Intensitäten aller Reflexe dienen. Die gemessenen Rohintensitäten werden
dann
um
Absorption,
Lorentzpolarisation
und
andere
Faktoren
korrigiert.
Elementarzellparameter, Kristallorientierung, Messgeometrie und Mosaizität werden im
52
Methoden
Anschluß mit Hilfe starker Reflexe verfeinert (postrefinement). Das Ergebnis der
Prozessierung
sind
die
Intensitäten
der
integrierten
Reflexe
sowie
deren
Standardabweichung.
Durch die sich während der Messung ändernden experimentellen Bedingungen
(schwankende Intensität des Röntgenstrahls, Strahlenschäden am Kristall, Anisotropie des
Kristalls etc.) wird eine interne Skalierung der Intensitäten nötig. Dazu werden die Reflexe
einer vorgegebenen Anzahl von frames oder images mit einem Skalierungsfaktor und
einem auflösungsabhängigen Exponentialfaktor versehen, so daß mehrfache Messungen
eines Reflexes möglichst geringe Abweichungen von der gemittelten Intensität dieses
Reflexes aufweisen. Nach der Skalierung werden die Intensitäten symmetrieäquivalenter
Reflexe gemittelt und auf eine asymmetrische Einheit reduziert. Zur Skalierung und
Datenreduktion wurde das Programme XSCALE aus dem XDS Programmpaket
verwendet.
Damit
wurden
auch
die
verschiedenen
MAD-Datensätze,
die
bei
unterschiedlichen Wellenlängen an einem Kristall gemessen wurden, auf einen Standard
skaliert. Die erhaltenen Intensitäten wurden mit dem Programm XDSCONV (Kabsch,
1993) in Strukturfaktoramplituden umgerechnet.
Als Maß für die Datenqualität werden üblicherweise mehrere statistische Werte in
Auflösungsschalen angegeben. So ist der für symmetrieverwandte Reflexintensitäten I(hkl)
definierte Rsym ein Maß für die Übereinstimmung mehrfach gemessener, identischer
Reflexe:
Rsym =
∑ I(hkl) i − I(hkl) i
∑∑ I(hkl) i
Gleichung 24
hkl i
hkl i
Der häufig verwendete Rsym ist allerdings stark von der gemessenen Anzahl nhkl
symmetrieverwandter Reflexe (sogenannte Multiplizität) abhängig und kann daher durch
die Einführung eines im Bezug auf die Redundanz gewichteten Rmeas korrigiert werden. Da
eine hohe Redundanz die Datenqualität verbessert, ist auch die mittlere Multiplizität ein
Maß für die Güte der gemessenen Daten. Weitere wichtige Werte sind die Vollständigkeit
der gesammelten Daten sowie das Signal/Rausch-Verhältnis I/σ(I), das durch den
Quotienten
aus
der
mittleren
Reflexintensität
Standardabweichung σ(I) beschrieben wird.
I
und
der
zugehörigen
53
Für die Skalierung eines Schweratomdatensatzes oder eines Datensatzes einer
Mutante auf den nativen Datensatz gilt der isomorphe R-Faktor Riso (Gleichung 25) als
Gütekriterium. Durch Fehler im Kristall oder durch Umwandlungen treten im Vergleich zu
einem nativen Kristall Änderungen in den Reflexintensitäten auf, die für die Bestimmung
initialer Phasen verwendet werden können (Green et al., 1954, Crick & Magdoff, 1956).
Hierzu wurde in dieser Arbeit das Programm SCALEIT (CCP4, 1994) verwendet.
FPH − FP
Riso =
hkl
∑ FP
Gleichung 25
hkl
Im allgemeinen besitzen gute Schweratomderivate Riso-Werte von etwa 10% bis
30%. Bei Werten größer als 30% ist mit Nicht-Isomorphie zwischen derivatisiertem und
nativem Kristall zu rechnen. Der auflösungsabhängige Verlauf der in Gleichung 26
definierten isomorphen Differenzen ∆iso gibt einen Hinweis auf die Qualität eines Derivats.
Die isomorphen Differenzen sind proportional zu den Strukturfaktoren FP und nehmen
daher bei isomorphen Derivaten mit zunehmender Auflösung ab, wohingegen der nichtisomorphe Anteil mit steigender Auflösung gleichbleibt oder sogar zunimmt (McRee,
1992).
∆iso = FPH − FP
Gleichung 26
3.5.10 Bestimmung nicht-kristallographischer Symmetrie
Die asymmetrische Einheit einer Elementarzelle ist der kleinste Baustein der
Kristallpackung (siehe Kapitel 3.5.1). Durch Anwendung der kristallographischen
Symmetrieoperationen der zugrunde liegenden Raumgruppe läßt sich aus ihr das
Kristallgitter aufbauen. Enthält die asymmetrische Einheit mehrere identische Moleküle, so
werden diese durch lokale, nur innerhalb der asymmetrischen Einheit gültige
Symmetrieoperationen ineinander überführt. Diese lokale Symmetrie wird als nichtkristallographische Symmetrie (NCS) bezeichnet. Im Fall von Proteinkristallen handelt es
sich dabei häufig um eine geschlossene Punktgruppensymmetrie (sogenannte proper
symmetry), so daß die chiralen Moleküle durch eine n-zählige Rotation ineinander
überführt werden. Allerdings kann die NCS ebenso aus einer Kombination von Rotation
und Translation bestehen (sogenannte improper symmetry).
54
Methoden
Nicht-kristallographische Symmetrien werden in Proteinkristallen häufig beobachtet
(Wang & Janin, 1993; Kleywegt, 1996). In 40% aller bis Anfang 1998 in der
Proteindatenbank Protein Data Bank (PDB; Berman et al., 2002) abgelegten, nichtredundanten
Kristallformen
lagen
mehrere
Kopien
eines
Polypeptids
in
der
asymmetrischen Einheit vor (Vonrhein & Schulz, 1999). Innerhalb dieser Kristallformen
wurden in 68% der Fälle ausschließlich n-zählige Rotationssymmetrien ohne
Translationskomponente beobachtet, wobei die asymmetrische Einheit in diesen Fällen oft
ein funktionelles Homooligomer beinhaltet. Analog zur kristallographischen Symmetrie
wird auch die NCS durch einen Rotations-Translations-Operator (sogenannter RTOperator) beschrieben. Durch den RT-Operator wird der ursprüngliche Koordinatensatz
(x0,y0,z0) in den symmetrieverwandten Koordinatensatz (x1,y1,z1) überführt:
 x 1   a 11
  
 y1  =  a 21
 z  a
 1   31
a 12
a 22
a 32
a 13   x 0   t x 
    
a 23  ⋅  y 0  +  t y 
a 33   z 0   t z 
Gleichung 27
Entsprechend der Rotationsmatrix bewirkt der RT-Operator eine Drehung der
ursprünglichen Koordinaten (x0,y0,z0) um den kristallographischen Ursprung. Durch die
anschließende Translation (tx,ty,tz) werden diese Koordinaten dann zu den Zielkoordinaten
(x1,y1,z1)
verschoben.
Je
nach
Problemstellung werden
nicht-kristallographische
Symmetrien auch durch Eulerwinkel α, β und γ oder Polarwinkel ω, ϕ und κ beschrieben
(Abbildung 14). Im Fall der Polarwinkel beschreibt der Winkel ω die Verkippung der
NCS-Achse von der z-Achse des kartesischen Koordinatensystems in Richtung der
x-Achse. Der Winkel ϕ gibt die Drehung dieser Achse um die z-Achse in Richtung der
y-Achse an und der Winkel κ beschreibt schließlich eine Drehung um die so erhaltene
Achse.
55
(a)
z
(b)
z
β
z'
κ
ω
x
α
γ
y
β
y'
φ
y
x'
x
Abbildung 14
Definition (a) der Euler-Winkel α, β und γ sowie (b) der Polarwinkel ω, ϕ und κ zur
Beschreibung einer nicht-kristallographischen Symmetrieachse (Drenth, 1994).
Der Rotationsanteil R einer NCS läßt sich ohne Phaseninformationen aus den
Strukturfaktoramplituden bestimmen. Die Pattersonfunktion einer Struktur besteht aus
zwei Klassen von Differenzvektoren: Selbstvektoren zwischen Atomen desselben
Moleküls und Kreuzvektoren zwischen Atomen verschiedener Moleküle. Zur Bestimmung
des Rotationsanteils sind nur die Selbstvektoren eines Moleküls relevant, wobei diese zum
überwiegenden Teil eine geringere Länge als die Kreuzvektoren aufweisen. Im
Pattersonraum sind die Anfangswerte der Distanzvektoren im Ursprung positioniert. Die
Selbstvektoren, deren relative Anordnung für jede Kopie eines Moleküls bis auf eine
Rotationskomponente C identisch ist, liegen innerhalb einer Kugel, deren Radius Rmax der
Länge des größten Atomabstandes innerhalb eines Moleküles entspricht. Durch geeignete
Wahl des äußeren und inneren Integrationsradius Rmax und Rmin werden die meisten der
störenden Kreuzvektoren sowie die im Urspung angehäuften Distanzvektoren der Atome
auf sich selbst (sogenannter Ursprungs-peak) ausgeschlossen.
Zur Auffindung des Rotationsanteils der NCS wird die Pattersonfunktion in
vorgegebenen Schritten um den Ursprung rotiert. Bei optimaler Überlagerung der
ursprünglichen Pattersonfunktion P1( u ) mit der um die Rotationsmatix C gedrehten
r
Pattersonfunktion P2(C u ) zeigt die von Rossmann & Blow (1962) beschriebene
Rotationsfunktion R(α,β,γ) ein Maximum:
R max
R (α, β, γ ) =
r
r r
∫ P1 (u ) ⋅ P2 (Cu )du
R min
Gleichung 28
56
Methoden
Für die Berechnung der auch als selfrotation bezeichneten Eigenrotationsfunktion
wurde das Programm POLARRFN (CCP4, 1994) verwendet. Das Programm berechnet die
Maxima der Rotationsfunktion sowohl in Euler- als auch in Polarwinkeln. Da in der Regel
nach Rotationssymmetrien wie zwei-, drei- oder vierzähligen Drehachsen gesucht wird,
entsprechen diese NCS-Achsen Werten des Polarwinkels κ von 180°, 120° oder 90°.
3.5.11 Lösung des Phasenproblems
Wie alle elektromagnetischen Wellen, haben Röntgenstrahlen Amplituden- und
Phaseninformation. Um ein Reflektionsmuster zu erzeugen, werden beide Informationen
benötigt. Leider können nur die Amplituden mittels Intensitäten gemessen werden, die
Phaseninformation geht bei der Aufnahme des Bildes verloren (siehe Kapitel 3.5.7).
Diese Problematik wird in der Kristallographie als das „Phasenproblem“ bezeichnet.
Anhand von Modellrechnungen konnte gezeigt werden, daß eine korrekte Phase für die
Strukturlösung wichtiger ist, als eine korrekte Amplitude. Es gibt verschiedene Ansätze,
das Phasenproblem zu lösen. Bei Vorliegen einer homologen und bereits bekannten
Struktur kann diese als Suchmodell zur Phasenbestimmung mittels Molekularem Ersatz
(molecular replacement, MolRep) verwendet werden. Als weitere Methode existiert die
Phasenbestimmung durch multiplen isomorphen Ersatz (MIR). Hierbei werden
Schweratomverbindungen mit hohen Elektronenzahlen spezifisch an definierten Stellen im
Protein gebunden, ohne daß dabei signifikante Änderungen der Kristallpackung oder der
Proteinstruktur auftreten. Dafür werden neben dem nativen Datensatz noch ein oder mehr
Schweratomderivat-Datensätze benötigt. Als mittlerweile häufigste Methode der
Strukturaufklärung neuer Proteinstrukturen wird die MAD-Methode (multiwavelength
anomalous diffraction) verwendet, bei der ein Schweratomderivat bei mehreren
Wellenlängen gemessen wird.
3.5.12 Phasenbestimmung mittels multiwavelength anomalous diffraction (MAD)
Anomale Streuung
Nach Gleichung 17 (siehe Kapitel 3.5.5) werden die Elektronen im Protein als
unabhängig vom Atomkern betrachtet. Diese Vereinfachung trifft nicht mehr zu, wenn die
Wellenlänge der einfallenden Röntgenstrahlung im Bereich einer Absorptionskante eines
Atoms im Proteinkristall liegt. Die Absorptionskanten der häufigsten Atome in Proteinen
(C, N, O, S) liegen sehr weit entfernt von den in der Proteinkristallographie gebräuchlichen
57
Wellenlängen.
In
Anwesenheit
von
schwereren
Atomen
im
Kristall,
deren
Absorptionskante der einfallenden Strahlung entspricht, unterscheiden sich die Intensität
der Friedel-Paare, was als anomale Diffraktion bezeichnet wird. Diese Anomalie entsteht
dadurch, daß zur kohärenten Strahlung die inkohärente, welche durch inelastische Streuung
an Elektronen der inneren Schalen emittiert wird, hinzukommt. Dabei sind die
Intensitätsunterschiede abhängig vom Atom, das für diese anomale Diffraktion
verantwortlich ist, und von der Wellenlänge des Röntgenstrahls. Aus den auftretenden
Intensitätsunterschieden zwischen den Friedel-Paaren läßt sich schließlich eine
Phaseninformation ableiten. Bei Verwendung von Synchrotron-Strahlung kann die
Wellenlänge zwischen 0.6 und 2 Å variiert werden, um die Absorptionskante des
Schweratoms exakt zu erfassen und damit den Effekt der anomalen Streuung relativ groß
werden zu lassen. Die zur normalen Streuung zusätzlichen Terme sind in Gleichung 29
dargestellt.
f = f ′(λ ) + i ⋅ f ′′(λ )λ
Gleichung 29
f′ (λ): dispersiver Term
f ″ (λ): Absorptionsterm der anomalen Streuung
Damit ergeben sich folgende Strukturfaktoren:
+
+
+
+
+
+
−
PH
−
P
−
H
−
P
−
HN
−
HA
F PH (hkl) = F P (hkl) + F H (hkl) = F P (hkl) + F HN (hkl) + F HA (hkl)
F (hkl) = F (hkl) + F (hkl) = F (hkl) + F
FPH:
FHN:
FHA:
(hkl) + F
Gleichung 30
(hkl)
gemessener Strukturfaktor Protein mit Schweratom
normale Anteil des Strukturfaktors des anomalen Streuers
anomaler Anteil des Strukturfaktors des anomalen Streuers
MAD-Experiment
Zum genaueren Verständnis ist die Auftragung dieser Zusammenhänge in
+
Abbildung 15 dargestellt. Der Unterschied zwischen den beiden Strukturfaktoren F PH und
−
F PH beträgt genau 2 F HA . Der anomale Anteil der Streuung liegt bei einem typischen
MAD-Experiment an Proteinkristallen durchschnittlich im Bereich von 3-5%, was eine
sehr sorgfältige Datensammlung erforderlich macht, die oft nur durch eine hohe
Redundanz der Daten erreicht wird.
58
Methoden
Abbildung 15
Zusammensetzung des Strukturfaktors für einen Reflex hkl unter Berücksichtigung der
anomalen Streuung. Dabei setzt sich FH aus einem anomalen und einem normalen Anteil
des Strukturfaktors des anomalen Streuers zusammen. Zur Verdeutlichung ist der Anteil
der anomalen Streuung stark vergrößert dargestellt.
Die Differenzen zwischen den Friedel-Partnern wird Bijvoet-Differenzen genannt.
Diese
Differenzen
können
bei
den
Messungen
bestimmt
werden
und
zur
Phasenbestimmung herangezogen werden (Hendrickson, 1985; Hendrickson et al., 1990).
Zur Phasierung werden mehrere Datensätze bei unterschiedlicher Wellenlänge
aufgenommen, bei denen die jeweiligen f ′ und f ″ unterschiedliche Anteile haben. Der
wellenlängenabhängige Verlauf von f ′ und f ″ ist in Abbildung 16 für Selen dargestellt.
Abbildung 16
Wellenlängenabhängiger Verlauf von f ′ und f ″ für Selen.
59
Zur optimalen Ausnutzung der Anteile von f ′ und f ″ wird bei der peakWellenlänge (Maximum der f ″-Kurve) und bei der inflection-point-Wellenlänge
(Minimum von f ′ und Wendepunkt von f ″) gemessen. Da diese Wellenlängen sehr dicht
beisammen liegen und zudem von der Umgebung der anomalen Streuer im Protein
abhängen, muß vor der Datensammlung ein Fluoreszenzscan am Proteinkristall
durchgeführt werden, bei dem die Kurven von f ′ und f ″ experimentell ermittelt werden
können.
In dieser Arbeit wurde die Fluoreszenzmessung in einem Winkel von 90° zum
einfallenden Röntgenstrahl mit einem Szintillationszähler durchgeführt. Zusätzlich wird
noch ein weiterer Datensatz weit entfernt von der Absorptionskante gemessen, der als
Referenzdatensatz dient (high oder low energy remote).
Phasenbestimmung
Um die Bindungsstellen der anomalen Streuer zu erhalten, werden die anomalen
Differenzen |Fano| in eine Differenz-Pattersonfunktion eingesetzt. Die Pattersonfunktion
(Gleichung 31) ist eine Fouriersynthese der Reflexintensitäten (Patterson, 1934) und kann
ohne Phaseninformation berechnet werden. Hierbei bezeichnen u, v und w relative
Koordinaten in der Elementarzelle.
P(u, v, w) =
1
VEZ
∑ F(hkl)
2
⋅ cos[2π(hu + kv + lw)]
Gleichung 31
hkl
Die Funktionsmaxima entsprechen den Abstandsvektoren der Atome in der
Elementarzelle. Da zwischen jedem Paar von Atomen zwei entgegengesetzte Vektoren
(jeweils von Atom A nach Atom B und umgekehrt) existieren, besitzt die PattersonRaumgruppe im Vergleich zur realen Raumgruppe des Kristalls eine zusätzliche
Zentrosymmetrie. In einer Zelle mit N Atomen existieren N·(N-1) unterschiedliche
Vektoren. Bei Kristallen mit nur wenigen Atomen in der Elementarzelle können die
Positionen aller Atome direkt aus diesen Vektoren bestimmt werden. In Proteinkristallen
ist die Zahl der Atome für dieses Vorgehen allerdings viel zu groß. Es lassen sich jedoch
die Positionen der Schweratome eines Derivates mit Hilfe der Differenz-Pattersonfunktion
bestimmen. Durch den Einbau von nur wenigen Schweratomen an definierte
Bindungsstellen im Protein wird das Problem auf ein Problem mit wenigen Atomen
60
Methoden
reduziert. Aus der Differenz-Pattersonfunktion lassen sich also die Positionen der
Schweratome ermitteln. Dazu werden die Bijvoet-Differenzen nach Gleichung 32
berechnet (Drenth, 1994).
{
∆Fano = F + PH − F − PH
}2ff′′′ ∆
Gleichung 32
Die Differenz-Pattersonfunktion ∆P(u,v,w) mit den Koeffizienten ∆Fano
2
liefert
dann die Bindungsstellen der anomalen Streuer:
∆P(u, v, w) =
1
VEZ
∑ ∆F
2
ano
⋅ cos [2π (hu + kv + lw )]
Gleichung 33
hkl
F + PH : Amplitude des Strukturfaktors des Reflexes (hkl )
F − PH : Amplitude des Strukturfaktors des Reflexes (h k l )
∆Fano : normierte Differenz der Strukturfaktoramplituden des Friedelpaares
Die Phasen der Strukturfaktoren FP des nativen Proteins können mit Hilfe der
Harker-Konstruktion (Abbildung 17) bestimmt werden (Harker, 1956). Gemessen werden
F+PH und F-PH. Da sich die Strukturfaktoren FPH aus den Anteilen des Proteins und des
Schweratoms zusammensetzen gilt:
+
+
+
Gleichung 34
−
−
−
Gleichung 35
F P = − F H + F PH
F P = − F H + F PH
F+H und F-H können aus den Atompositionen der anomalen Streuer bestimmt
werden. Da die reinen nativen Strukturfaktoren F+P und F-P, die keinen anomalen Anteil
enthalten, aufgrund des Friedel-Gesetzes (Gleichung 17) den gleichen Wert haben müssen,
ist dieses Gleichungssystem erfüllt, wenn sich die Kreise für -F+PH + F+H und -F-PH + F-H
schneiden. Die Zweideutigkeit der Phasen, die wiederum durch die zwei Schnittpunkte der
Kreise (Abbildung 17a) zustande kommt, läßt sich durch die Messung bei einer zweiten
Wellenlänge in der Nähe der Absorptionskante des anomalen Streuers (Abbildung 17b)
lösen, da die reinen Proteinstrukturfaktoren F+P und F-P unabhängig von der Wellenlänge
sind.
Abbildung 17
Harker-Konstruktion zur Phasenbestimmung unter Berücksichtigung des anomalen
Signals (a) Experiment bei nur einer Wellenlänge; die Schnittpunkte der beiden Kreise
stellen die beiden möglichen Lösungen für FP dar. (b) Experiment bei zwei Wellenlängen;
FP kann nun eindeutig bestimmt werden.
Der Vorteil der MAD-Methode ist, daß alle Datensätze am gleichen Kristall
gemessen werden und nur ein Derivat für die Phasenbestimmung nötig ist, und in der
Regel keine Non-Isomorphie entsteht. Zusätzlich können Selen-Atome als anomale Streuer
sehr einfach als Selenomethionin inkorporiert werden, was zudem den Vorteil hat, daß
beim anschließenden Modellbau sehr einfach an den Selenomethionin-Positionen mit dem
Bau des Modells begonnen werden kann.
Zur Lokalisierung der anomalen Streuer wurden in dieser Arbeit das Programm
SHELXD (Schneider & Sheldrick, 2002) verwendet. Die Phasierung erfolgte mit den
Programmen SHARP (de La Fortelle & Bricogne, 1997) und SHELXE (Sheldrick et al.,
2001).
61
62
Methoden
3.5.13 Phasenbestimmung durch molekularen Ersatz
Die Methode des molekularen Ersatzes (MR) kann zur Strukturaufklärung von
Proteinen angewendet werden, bei denen die Raumstruktur eines ähnlichen Proteins bereits
bekannt ist. Proteine mit einer Sequenzidentität von mehr als 30% besitzen mit hoher
Wahrscheinlichkeit auch eine vergleichbare dreidimensionale Faltung (Sander &
Schneider, 1991). Aufgrund statistischer Überlegungen kann außerdem davon ausgegangen
werden, daß für lösliche, globuläre Proteine nur eine begrenzte Anzahl von etwa 500 bis
1000 Strukturfamilien existiert (Schulz, 1981; Chothia, 1992; Benner et al., 1997). Da die
Zahl der veröffentlichten Proteinstrukturen in den letzten Jahren stark ansteigt, wird es
zunehmend wahrscheinlicher, durch Sequenzvergleiche und Sekundärstrukturvorhersagen
ein geeignetes Suchmodell für die Strukturlösung eines Proteins zu finden.
Die Methode des molekularen Ersatzes ermöglicht es, ein atomares Suchmodell
korrekt in der asymmetrischen Einheit einer unbekannten Kristallstruktur zu plazieren. Bei
dieser Suche handelt es sich um ein 6-dimensionales Problem, das in eine Rotations- und
eine Translationssuche unterteilt werden kann (Rossmann & Blow, 1962). Das
grundlegende Prinzip der Methode ist der Vergleich der Pattersonfunktionen
(Gleichung 31) von Suchmodell und Zielmolekül. Aus dem plazierten Modell können
anschließend MR-Phasen bestimmt werden, die zusammen mit den experimentell
gemessenen Strukturfaktoramplituden zur Berechnung der Elektronendichte herangezogen
werden. Für eine erfolgreiche Suche ist der Grad der strukturellen Verwandtschaft
zwischen Suchmodell und Zielstruktur von großer Bedeutung. Hochsymmetrische
Raumgruppen sowie eine große Anzahl von Molekülen in der Elementarzelle erschweren
allerdings die Suche nach der korrekten Lösung. In dieser Arbeit wurde die Methode des
molekularen Ersatzes dazu verwendet, um die 6HDNO Proteinstruktur, oder Teilmodelle
davon, auf andere Kristallformen zu übertragen und zwar mit Hilfe des Programm
PHASER (Read, 2001).
3.5.14 Dichtemodifikation
Die initial bestimmten Phasen sind in den meisten Fällen noch zu ungenau, um die
resultierenden
Elektronendichtekarten
vollständig
interpretieren
zu
können.
Zur
Verbesserung der Phasen werden daher zusätzliche physikalische und chemische
Informationen verwendet, die aus den allgemeinen Grundlagen makromolekularer
Strukturen abgeleitet werden können. Dazu gehören zum Beispiel der Solvensgehalt,
63
Anzahl der nichtkristallographischen Proteinmoleküle und der peptidische Aufbau eines
Proteins. Die hieraus folgenden Einschränkungen für die Elektronendichte im realen Raum
führen gleichzeitig zu Einschränkungen der möglichen Phasen im reziproken Raum. In
dieser Arbeit wurden dazu verschiedene Versionen des Programms RESOLVE
(Terwilliger, 2002 und 2003) verwendet, welche die folgenden Methoden der
Elektonendichte-Modifikation verwenden:
− Solvensglättung (solvent flattening)
− Histogramm-Anpassung (histogram matching)
− Skeletonisierung
− NCS-Dichtemittelung
− Zyklische Dichtemodifikation und Phasenerweiterung
− Lokale Musteranpassung (Local pattern matching)
3.5.15 Modellbau und Elektronendichtekarten
Modellbau
Sind die Phasen der Strukturfaktoren so gut bestimmt, daß daraus zumindest eine
partiell interpretierbare Elektronendichte resultiert, kann mit dem Bau eines Proteinmodells
begonnen
werden.
Je
nach
Qualität
der
Elektronendichte
können
dabei
Sekundärstrukturelemente zugeordnet, der Verlauf der Polypeptidkette und auch bereits
Seitenketten identifiziert werden. Allerdings ist die aus den initialen und anschließend
modifizierten Phasen berechnete Elektronendichte meist noch stark mit Fehlern behaftet,
so daß die vollständige Struktur nicht in einem Schritt modelliert werden kann. Daher wird
das Proteinmodell in einem zyklischen Verfahren aus Korrektur und Neubau von Teilen
des Modells sowie anschließender Strukturverfeinerung (siehe Kapitel 3.6) schrittweise
verbessert. Oft kann der Modellbau stark erleichtert werden, wenn eine Proteinstruktur mit
ähnlicher Faltung bereits bekannt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde zuerst mit Hilfe des
interaktiven Graphikprogramms O (Jones et al., 1991) ein Polyalaninmodell in die
experimentellen MAD-Phasen eingebaut. Dieses Teilmodell wurde dann als Suchmodell
für den molekularen Ersatz in anderen Kristallformen verwendet. Das abschließende
Modell wurde zu großen Teilen automatisch von dem Programm ARP/wARP (Perrakis
et al., 1997) in die MR-Phasen der Kristallform mit der höchsten Auflösung eingebaut.
ARP/wARP fügt zuerst freie Atome mit einem Abstand von 1.1 Å in Bereiche hoher
Elektronendichte ein, die anschließend unter Berücksichtigung der Peptidgeometrie zum
64
Methoden
Proteinrückgrat zusammengefügt werden. Fehlende Teile des endgültigen Proteinmodells
wurden mit Hilfe des interaktiven Graphikprogrammes XFIT (McRee, 1999) erstellt und
verändert.
Ungewichtete Elektronendichtekarten wurden mit dem Programmen FFT (CCP4,
1994) und SFALL (CCP4, 1994) berechnet. Für gewichtete Dichtekarten wurden die
verwendeten Koeffizienten entweder mit dem Programm SIGMAA (CCP4, 1994)
berechnet oder aber direkt aus dem Programm REFMAC (Murshudov et al., 1997)
erhalten.
Zur
Ergänzung
und
Korrektur
der
Modelle
wird
mit
wurden
folgende
Elektronendichtekarten verwendet:
(Fobs-Fcalc)-Elektronendichtekarte
Die
(Fobs-Fcalc)-Differenz-Fourierkarte
den
Koeffizienten
(Fobs-Fcalc) ·exp(iϕcalc) berechnet. Diese Karten zeigen den Unterschied zwischen dem
Modell und der tatsächlichen Struktur. Fehlende Atome erscheinen mit positiver
Differenzdichte, falsch positionierte Bereiche mit negativer Differenzdichte. Die
Differenzen erscheinen mit halber tatsächlicher Höhe und sind signifikant ab einem
Differenzdichteniveau von etwa drei Standardabweichungen der durchschnittlichen
Elekronendichte (3σ). Diese Dichtekarten werden sowohl für den Einbau fehlender
Aminosäuren,
Wassermoleküle
oder
Liganden,
als
auch
zur
Korrektur
von
Modellbereichen, verwendet.
(2Fobs-Fcalc)-Elektronendichtekarte
Diese Dichtekarte wird mit den Koeffizienten (2Fobs-Fcalc) ·exp(iϕcalc) berechnet und
entspricht der Addition einer (Fobs-Fcalc) ·exp(iϕcalc)-Differenz-Fourierkarte mit einer
Fobs·exp(iϕcalc)-Karte. Sie wird zumeist oberhalb eines Differenzdichteniveaus von etwa
1 σ dargestellt und zeigt neben der Elekronendichte des Modells die Differenzdichte in
voller Höhe. (2Fobs-Fcalc)-Dichtekarten sind allerdings stark vom Modell beeinflußt (model-
bias).
σA-gewichtete (mFobs-DFcalc)- und (2mFobs-DFcalc)-Elektronendichtekarten
Stellt das verwendete Modell nur einen Teil der tatsächlichen Struktur dar oder ist
das Modell stark fehlerbehaftet, so ist es sinnvoll, die Strukturfaktoren zu gewichten und
65
3.6 Verfeinerung
Phasen aus unterschiedlichen Quellen mit einzubeziehen. Die dazu verwendeten Terme
lassen sich nach Read (1986, 1990) durch einem sogenannten σA-Term ausdrücken. In
dieser Arbeit wurden vorwiegend σA-gewichtete (2mFo-DFc)- bzw. (mFo-DFc)Elektronendichtekarten verwendet,
3.6 Verfeinerung
Die auf der Grundlage eines initialen Modells errechneten Strukturfaktoren
stimmen in der Regel nur schlecht mit den gemessenen Daten überein. Ziel der
Verfeinerung des Proteinmodells ist es, durch Variation der Ortskoordinaten und
B-Faktoren der Atome eine möglichst gute Übereinstimmung zwischen berechneten und
gemessenen Strukturfaktoren zu erreichen. Ein Maß für den Grad an Übereinstimmung von
gemessenen Strukturfaktoramplituden Fobs und den aus dem Modell berechneten
Strukturfaktoramplituden Fcalc ist der kristallographische R-Faktor Rcryst (Gleichung 36).
Initiale Proteinmodelle weisen in der Regel einen R-Faktor von 40-50%, eine zufällige
Verteilung von Proteinatomen in der asymmetrischen Einheit resultiert in einem R-Faktor
von ca. 59% (Wilson, 1949). Verfeinerte Röntgenstrukturen erreichen dagegen, je nach
Auflösung der röntgenographischen Daten, R-Faktoren zwischen etwa 10% und 30%.
Fobs (hkl) − k ⋅ Fcalc (hkl)
∑
Rcryst = hkl
Fobs (hkl)
∑
hkl
w (hkl) ⋅ Fobs (hkl) ⋅ Fcalc (hkl)
k=
hkl
∑ w (hkl) ⋅ Fcalc (hkl) 2
Gleichung 36
hkl
w(hkl): auflösungsabhänger Gewichtungsfaktor
Durch die Strukturverfeinerung werden die Ortskoordinaten und B-Faktoren der
Proteinatome so verändert, daß die aus dem Modell berechneten Strukturfaktoramplituden
optimal mit den experimentell bestimmten Strukturfaktoramplituden übereinstimmen.
Da die gemessenen Daten stets Fehler enthalten, muß gleichzeitig die Modellierung
des experimentellen Rauschens ausgeschlossen werden (overfitting). Bei der Verfeinerung
sollte die Zahl der zu verfeinernden Parameter (Variablen) die Zahl der Observablen (der
Röntgenreflexe) nicht übersteigen. Die Zahl der Röntgenreflexe ist durch die
Auflösungsgrenze, die Vollständigkeit der gesammelten Daten und die Raumgruppe des
Kristalls begrenzt, weshalb zusätzliche Bedingungen in die Verfeinerung eingeführt
werden. Die stereochemischen Parameter von Peptidstrukturen (Bindungsabstände,
Bindungswinkel, Chiralität und Torsionswinkel) sind mit großer Genauigkeit aus den
66
Methoden
Röntgenstrukturen kleinerer Moleküle bekannt (Engh & Huber, 1991). Diese können
verwendet werden, um die Werte der verfeinerten Parameter zu beschränken. Die
Einschränkungen (restraints) wirken dabei wie zusätzliche, künstliche Observablen.
Analog dazu kann auch die Ähnlichkeit NCS-verwandter Polypeptidketten zur Begrenzung
der freien Verfeinerungsparameter verwendet werden (Kleywegt, 1996; Kleywegt & Read,
1997).
Zu Beginn der Strukturverfeinerung sollte die Anzahl der verfeinerten Parameter
zunächst gering gehalten und dann von Runde zu Runde langsam erhöht werden (Kleywegt
& Jones, 1995). Gute Proteinmodelle weisen am Ende der Verfeinerung sinnvolle
Stereochemie und Temperaturfaktoren auf und erklären die kristallographischen und
biochemischen Daten mit einer möglichst geringen Anzahl von Parametern. Werden zu
viele Parameter gleichzeitig freigegeben, besteht die Gefahr des overfitting. Um dies zu
vermeiden, wird ein zufälliger Satz von etwa 3-5% der Röntgenreflexe ausgewählt und
nicht in die Verfeinerung einbezogen (Testdatensatz). Mit diesen Reflexen wird in
Analogie zum kristallographischen R-Faktor Rcryst der freie R-Faktor Rfree berechnet
(Brünger, 1992a):
Fobs (hkl) − k ⋅ Fcalc (hkl)
Rfree =
hkl∈T
∑ Fobs (hkl)
Gleichung 37
hkl∈T
T: Röntgenreflexe im Testdatensatz
Ein overfitting zeichnet sich dadurch aus, daß Rcryst im Laufe der Verfeinerung
kleiner wird, während Rfree gleich bleibt oder sogar ansteigt. Die Größe von Rfree korreliert
mit dem mittleren Phasenfehler des Modells und kann daher als Kriterium für den
Fortschritt der Verfeinerung verwendet werden (Kleywegt & Brünger, 1996). Die
absoluten Werte des kristallographischen und des freien R-Faktors unterscheiden sich
üblicherweise um etwa 5% bis 10%. Im allgemeinen verwenden Programme zur
Verfeinerung von Proteinstrukturen entweder die Methode des kleinsten quadratischen
Fehlers (least squares) oder arbeiten nach dem maximum likelihood Prinzip.
67
3.6 Verfeinerung
3.6.1
Methode des kleinsten quadratischen Fehlers (least squares)
Die Minimierung des kleinsten quadratischen Fehlers (least squares minimizing) ist
ein grundlegender Algorithmus zur Verfeinerung von Proteinstrukturen. Unter der
Annahme, daß die Abweichungen der aus dem Modell berechneten Strukturfaktoren Fcalc
von den observierten Strukturfaktoren Fobs einer Gauß-Verteilung entsprechen, werden die
Quadrate der Differenzen zwischen Fobs und Fcalc in der Funktion Q minimiert:
Q = ∑ w (hkl) ⋅ ( Fobs (hkl) − Fcalc (hkl) ) 2
Gleichung 38
hkl
w(hkl): auflösungsabhängiger Gewichtungsfaktor
Das Verfahren benötigt relativ wenig Rechenzeit, hat aber einen geringen
Konvergenzradius
und
erfordert
daher
häufiges
manuelles
Eingreifen
in
die
Strukturverfeinerung. Am Ende jeder Verfeinerungsrunde befindet sich das Modell in
einem lokalen Minimum, das jedoch nicht notwendigerweise das globale Minimum
darstellt.
3.6.2
Verfeinerung von Temperaturfaktoren
Statistische Fehlordnungen und thermische Bewegungen der Atome im
Proteinkristall bewirken eine auflösungsabhängige Änderung der Reflexintensitäten (siehe
Kapitel 3.5.6), die durch eine Minimierung der Temperaturfaktoren nach der Methode des
kleinsten quadratischen Fehlers modelliert werden kann. In Abhängigkeit von der
Auflösung
der
gemessenen
Daten
werden
dabei
unterschiedlich
viele
Verfeinerungsparameter zugelassen. Bei Auflösungen oberhalb 3 Å wird nur ein mittlerer
B-Faktor für das gesamte Protein bestimmt, bei Auflösungen zwischen 3 Å und 2.5 Å
werden dagegen meist zwei B-Faktoren pro Aminosäure verfeinert (jeweils ein B-Faktor
für alle Atome der Hauptkette und der Seitenkette). Individuelle isotrope B-Faktoren lassen
sich erst unterhalb einer Auflösung von etwa 2.5 Å sinnvoll verfeinern. Dabei wird
einschränkend angenommen, daß sich die B-Faktoren benachbarter Atome nicht beliebig
stark voneinander unterscheiden. Bei atomarer Auflösung kleiner als 1.5 Å können
anisotrope thermische Bewegungen einzelner Atome verfeinert werden. Dazu sind für
jedes Atom neben den drei Parametern der Ortskoordinaten noch sechs weitere Parameter
erforderlich, die den anisotropen B-Faktor beschreiben.
68
Methoden
3.6.3 Rigid body Verfeinerung
Die rigid body Verfeinerung wird häufig am Anfang einer Verfeinerung
angewandt. Dabei werden definierte Atomgruppen (z.B. das ganze Molekül, einzelne
Domänen oder Sekundärstrukturelemente) als starre Körper definiert, deren Rotations- und
Translationsfreiheitsgrade unabhängig voneinander verfeinert werden können. Dadurch
wird nur eine geringe Anzahl von freien Parametern eingeführt, und die Verfeinerung kann
bei niedriger Auflösung durchgeführt werden. Der Konvergenzradius wird damit
vergrößert. Oft wird diese Methode auch angewendet, um Modelle korrekt in
unterschiedlichen Einheitszellen zu positionieren, wenn leichte Änderungen in den
Zellparametern auftreten.
3.6.4 Molekulardynamik-Simulation (simulated annealing)
Zu Beginn der Strukturlösung bietet sich eine Verfeinerung des Modells durch eine
Molekulardynamik-Simulation (simulated annealing) an. Dabei werden den Modellatomen
Anfangsgeschwindigkeiten zugeordnet, die den molekularen Bewegungen bei hohen
Temperaturen (2000-3000 K) entsprechen. Lokale Minima können hierdurch von den
Atomen verlassen werden. Nun wird das Molekül in der Simulation schrittweise (in 50 K)
Schritten abgekühlt, um so ein Energieminimum und optimale Torsionswinkelparameter zu
finden. Bei der Verfeinerung der niedrig aufgelösten 6HDNOns Struktur wurden
Molekulardynamik-Simulationen mit CNS (Brünger et al., 1998) durchgeführt.
3.6.5 Verfeinerung mit REFMAC
Die Verfeinerung mit dem Programm REFMAC (Murshudov et al., 1997) basiert
auf
einem
maximum
likelihood
Algorithmus.
Dieser
Algorithmus
stellt
eine
Verallgemeinerung der least squares Methode dar und behandelt die observierten
Parameter nicht mehr als Gauss-Verteilungen. Somit bietet die Methode eine verbesserte
Annäherung an die Realität, wobei die komplizierten Arten von Verteilungen allerdings
eine möglichst gute Abschätzung der Meßfehler voraussetzen. Prinzipiell zeigen
Verfeinerungsmethoden, die auf einem maximum likelihood Algorithmus basieren einen
größeren Konvergenzradius als least squares Methoden. Ein weiterer Vorteil dieser
Methode ergibt sich daraus, daß die σA-Werte nur aus Reflexen des Testdatensatzes
abgeschätzt
werden,
wodurch
Elektronendichtekarten verringert.
sich
der
model
bias
in
(2mFobs-DFcalc)-
69
3.6 Verfeinerung
Außerdem ist die TLS-Methode im Programm implementiert. Diese Methode
(Winn et al., 2001) erlaubt eine gruppenweise, anisotrope Bestimmung der B-Faktoren bei
einer Auflösung von 1.5-2.5 Å und berücksichtigt die in der Regel anisotropen
Bewegungen von ganzen Domänen, Sekundärstrukturelementen oder Seitenketten. Die
Anzahl der freien Parameter wird durch die Verwendung von kollektiven Variablen für
eine ganze Gruppe von Atomen (TLS-Gruppe) gegenüber einer anisotropen Verfeinerung
aller Atome stark reduziert. Die TLS-Gruppen werden dabei als pseudo-starre Körper
angesehen. Bei der Verfeinerung der hochaufgelösten 6HDNOns Struktur wurden vier
TLS-Gruppen definiert, die jeweils eine Domäne eines Proteinmoleküls beinhalteten.
3.6.6
Verfeinerung mit CNS
Das Programm CNS (Brünger et al., 1998) stellt eine Weiterentwicklung des
Programmes X-PLOR (Brünger, 1992b) dar und bietet ebenfalls die Implementierung des
maximum likelihood Algorithmus. Es enthält Unterprogramme zur Strukturlösung,
Verfeinerung
und
Analyse
biologischer
Makromoleküle
ausgehend
von
Röntgendiffraktionsdaten. Generell wird erst eine rigid-body Verfeinerung vor einem
simulated annealing durchgeführt, erst dann werden die Atompositionen verfeinert und
energieminimiert. Abschließend werden die B-Faktoren verfeinert.
3.6.7
Einbau von Wassermolekülen und Liganden
Wassermoleküle wurden mit dem in REFMAC implementiert Programm
ARP/water bei einem (2Fobs-Fcalc)-Dichteniveau von mehr als 0.9 σ automatisch in das
Proteinmodell eingebaut. Dabei wurden nur solche Wassermoleküle akzeptiert, die
mindestens 2.2 Å von allen anderen Atomen entfernt lagen und zusätzlich eine
Wasserstoffbrücke (2.4 - 3.2 Å) zu einem Donor- oder Akzeptoratom des Proteins
ausbilden konnten.
Zur Verfeinerung von neuen Strukturbausteinen wie dem Kofaktor FAD wurde das
Modell aus der Strukturformel des Moleküls mit Hilfe des PRODRG2-Servers
(Schüttelkopf, 2004) erstellt. Dabei wird von dem Molekül unter Berücksichtigung von
Kraftfeldern eine Energieminimierung berechnet und Parameterdateien für alle wichtigen
Verfeinerungsprogramme ausgegeben. Die Position wurde mit Hilfe einer (Fobs-Fcal)Elektronendichtekarte (siehe Kapitel 3.5.15) identifiziert.
70
Methoden
3.7 Proteinstrukturen
3.7.1 Homologiemodell
Anhand von Sequenzvergleichen lassen sich vielfach Aussagen über Funktion und
Faltung eines unbekannten Proteins machen, da funktionell und strukturell verwandte
Proteine oft auch auf Sequenzebene Ähnlichkeiten aufweisen. Eine beliebige Sequenz
kann mit Hilfe des Programms BLAST (Altschul et al., 1997) mit Einträgen von
Sequenzdatenbanken verglichen werden. Ein Maß für die lokale Ähnlichkeit zweier
Sequenzen wird dabei durch den sogenannten E-Wert angegeben, welcher für zwei
beliebige Sequenzen 1.0 beträgt. Je niedriger der E-Wert, desto höher ist die
Verwandtschaft zweier Sequenzen. Eng verwandte Sequenzen besitzen einen E-Wert von
e-50 bis e-10, bei e-2 wird von einer entfernten Verwandtschaft ausgegangen. Bei ausreichend
hoher Sequenzidentität (≥ 25%) zu einem strukturell bekannten Enzym ist es möglich, ein
Homologiemodell des unbekannten Proteins zu berechnen. Grundlage des Modells ist eine
Überlagerung der beiden Aminosäuresequenzen (alignment).
Für die Erstellung des Modells der 6HLNO wurde mit einer BLAST-Suche die
Monoaminoxidase B (Binda et al., 2003) mit einer Sequenzidentität von 25%, als am
nächsten verwandtes und strukturell bekanntes Enzym identifiziert. Anschließend wurden
mit den Programmen CLUSTALW (Higgins et al., 1994) und T-COFFEE (Notredame
et al., 2000) Sequenzvergleiche durchgeführt. Mit den Informationen aus den
Sequenzvergleichen wurde anschließend mit Hilfe des Programmes SWISS-MODEL
(Guex & Peitsch, 1997) ein initiales Strukturmodell von Hand erstellt. Dieses Modell
wurde abschließend einer automatischen Energieminimierung und Optimierung der
geometrischen Parameter unterzogen.
3.7.2 Qualität von Proteinstrukturen
Proteinstrukturen beinhalten auch nach der Strukturverfeinerung noch Fehler. Diese
sind allerdings unterschiedlich schwerwiegend und beschränken sich meist auf eng
begrenzte Bereiche der Struktur. Zur Beurteilung der Qualität eines Strukturmodells gibt es
zahlreiche Kriterien, die sich entweder auf die Gesamtstruktur oder aber auf lokale
Bereiche wie etwa einzelne Aminosäurereste beziehen (Dodson et al., 1998). Damit die
Qualitätskriterien unabhängig und aussagekräftig sind, dürfen sie nicht in den
Zielfunktionen
der
zur
Verfeinerung
verwendeten
Programme
enthalten
sein.
71
Programme zur Validierung von Proteinstrukturen wie PROCHECK (Laskowski et al.,
1993) oder WHATCHECK (Hooft et al., 1996) verwenden möglichst viele unabhängige
Kriterien sowie statistische Analysen, um Fehler in Proteinmodellen sicher aufzufinden.
Letztlich ist die Güte eines Strukturmodells aber entscheidend von der Qualität der
gemessen kristallographischen Daten abhängig.
Der
kristallographische
R-Faktor
Rcryst
(Gleichung 36)
beschreibt
die
Übereinstimmung zwischen den gemessenen Strukturfaktoramplituden Fobs und den aus
dem Strukturmodell berechneten Strukturfaktoramplituden Fcalc. Da er stark vom
Verhältnis der Observablen zur Anzahl der verfeinerten Parameter abhängig ist, besitzt er
für sich betrachtet nur eine geringe Aussagekraft. Zusammen mit dem freien R-Faktor Rfree
(Gleichung 37) können aber Rückschlüsse auf den Verlauf der Strukturverfeinerung
gezogen werden.
Die Torsionswinkel φ und ϕ der Polypeptid-Hauptkette sind aufgrund der
sterischen Hinderungen zwischen Haupt- und Seitenkettenatomen für alle Aminosäuren
mit Ausnahme von Glycin stark eingeschränkt. Zur Veranschaulichung werden die
Torsionswinkel der einzelnen Aminosäuren daher im sogenannten RamachandranDiagramm gegeneinander aufgetragen (Ramachandran & Sasisekharan, 1968). Innerhalb
des in dieser Arbeit verwendeten Programms PROCHECK wird das RamachandranDiagramm anhand einer Statistik über die Winkelverteilung in hoch aufgelösten
Proteinstrukturen in vier Bereiche unterteilt, die mit "energetisch günstig", "erlaubt",
"zusätzlich erlaubt" und "verboten" bezeichnet werden. Dabei sollten in gut verfeinerten
Strukturen mehr als 90% der Aminosäuren im "energetisch günstigen" Bereich liegen.
Der von Engh & Huber (1991) abgeleitete Satz von idealen Bindungslängen und
Bindungswinkeln für Proteine beruht auf einer Analyse hochaufgelöster Kristallstrukturen
von
Verbindungen
mit
kleiner
Molekularmasse.
Die
mittleren
quadratischen
Abweichungen (rmsd) von diesen Idealwerten können für Proteinstrukturen mit
Programmen wie PROCHECK oder WHATCHECK analysiert werden. Da diese
stereochemischen
Parameter
in
den
Zielfunktionen
der
verwendeten
Verfeinerungsprogramme enthalten sind, ist ihre Aussagekraft über die generelle
Richtigkeit einer Struktur eher beschränkt. Allerdings können aus der rmsd Hinweise auf
die Qualität und den Verlauf der Strukturverfeinerung erhalten werden.
Liegen in der asymmetrischen Einheit mehrere Kopien eines Moleküls vor, so
sollten diese abgesehen von den an Kristallkontakten beteiligten Bereichen annähernd
identisch sein. Als Qualitätskriterium eines Strukturmodells kann die rmsd der
72
Methoden
überlagerten Atomkoordinaten bestimmt werden, wobei größere Abweichungen aus der
Umgebung oder der Funktion des Moleküls erklärbar sein sollten. Wurde die Ähnlichkeit
NCS-verwandter
Moleküle
in
den
Zielfunktionen
der
verwendeten
Verfeinerungsprogramme bereits berücksichtigt, so können Abweichungen zwischen den
Molekülen anhand von Elektronendichte-Korrelationen identifiziert werden.
3.7.3 Darstellung und Analyse von Proteinstrukturen
Die atomare Darstellung von Proteinen ist aufgrund ihrer Größe und Komplexität
meist nur in kleinen Ausschnitten möglich. Aus Gründen der Anschaulichkeit werden
daher
Abstraktionen
bei
der
Darstellung
größerer
Bereiche
verwendet.
Sekundärstrukturelemente werden häufig in Form von Bändermodellen (ribbonDarstellungen)
dargestellt.
Die
Zuordnung
der
einzelnen
Aminosäurereste
zu
Sekundärstrukturen erfolgte in dieser Arbeit automatisch mit den Programmen DSSP
(Kabsch & Sander, 1983) und STRIDE (Frishman & Argos, 1995). Darstellungen von
atomaren Modellen, Cα-Hauptketten und Bändermodellen wurden mit dem Programm
POVScript+ (Fenn et al., 2003) erstellt. Um den Abbildungen photorealistische Qualität zu
verleihen, wurde das Programm POVRay (http://www.povray.org) verwendet.
Die Analyse der Kristall- und Dimerkontakte erfolgte mit dem Programm
CONTACT
(CCP4,
1994).
Dabei
wurde
bei
der
Bestimmung
von
polaren
Wechselwirkungen zwischen Donor und Akzeptor ein maximaler Abstand von 3.5 Å
zugelassen, bei nonpolaren Wechselwirkungen betrug dieser 5.0 Å. Zur Analyse von
Kontaktflächen nach der Lee & Richards Methode (1971) diente NACCESS (Hubbard &
Thornton, 1993). Bei dieser Methode wird die Oberfläche eines Proteins durch das
Abrollen einer kugelförmigen Probe mit dem Radius eines Wassermoleküls (1.4 Å) über
das Proteinmolekül berechnet. Die solvenszugängliche Oberfläche ASA (accessible
surface area) wird durch das Zentrum dieser Probe beschrieben, wohingegen die durch den
Kontakt mit der äußeren Begrenzung definierte Fläche als molekulare Oberfläche
(molecular surface) bezeichnet wird. Zur Darstellung der Oberflächen wurde mit dem
Programm MSMS (Sanner et al., 1996), mit Hilfe eines analytischen Algorithmus, eine
triangulierte Oberfläche berechnet Die Proteinkontaktfläche BASA (buried accessible
surface area) beschreibt die Änderung der ASA bei Proteinfaltung oder Assoziation:
BASADimer AB = ASAProtomer A + ASAProtomer B - ASADimer AB
Gleichung 39
3.7.4
Proteinstrukturvergleiche
Die meisten der zur Zeit bekannten Proteinstrukturen besitzen keine einzigartige
Faltung, sondern sind Mitglieder von Strukturfamilien. Häufig werden überraschend
ähnliche Strukturen auch dann beobachtet, wenn die betreffenden Proteine weder in ihrer
Sequenz noch in ihrer Funktion miteinander verwandt sind. Der strukturelle Vergleich von
Proteinen erfordert die möglichst genaue Überlagerung der zu vergleichenden Moleküle.
Als Kriterien für die Ähnlichkeit von Molekülen werden die mittlere quadratische
Abweichung (rmsd) der Positionen sich entsprechender Atome (Maiorow & Crippen,
1994) oder sogenannte Distanzmatrizes (Holm & Sander, 1993) verwendet. Entscheidend
für die optimale Überlagerung von Proteinstrukturen ist die Zuordnung der sich
entsprechenden Aminosäurereste. Diese kann auf einem alignment der Proteinsequenzen
oder aber wie in den Programmen DALI (Holm & Sander, 1993) und LSQMAN
(Kleywegt & Jones, 1995) auf automatischen Methoden basieren. Das Programm DALI
gibt einen Z-score aus, der ein Maß für den Grad der strukturellen Übereinstimmung ist. In
dieser Arbeit wurden alle Proteine aus einer DALI-Suche mit der 6HDNO Struktur, welche
einer Z-score > 6.0 aufwiesen, mit dem Programm LSQMAN überlagert. Dabei wurde eine
maximale Abweichung der überlagerten Cα-Atome von 3 Å bei einer MindestSegmentlänge von drei Aminosäuren zugelassen.
73
75
4.1 Expression, Reinigung und Kristallisation der 6HDNO
4 Ergebnisse und Diskussion zur 6HDNO
Das Gen der 6HDNO aus Arthrobacter nicotinovorans wurde von Maun (1998)
mittels PCR, mit einer N-terminalen Deletion der ersten drei Aminosäuren (6HDNOn),
amplifiziert und über die Schnittstellen der Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII
in den Expressionsvektor pKK223-3 kloniert. H. Maun konnte aus keiner der 6HDNOn
Präparationen Kristalle erhalten. Eine Ursache dafür war die Dimerisierung unter
Ausbildung von Disulfidbrücken, welche durch den Vergleich von oxidativen und
reduktiven SDS-PAGE Läufen bestätigt wurde. Deshalb wurden von Claus (1999) alle
sechs Cysteine zu Serin mutiert und die Mutanten präpariert. Dabei bildete die Mutante
C433S
(6HDNOns,
Kristallisationsversuchen
Anhang 8.3)
ein
stabiles
Monomer
initiale
Kristalle.
Die
Verfeinerung
und
der
bei
ersten
gefundenen
Kristallisationsbedingungen erbrachte jedoch keine röntgentauglichen Kristalle (Claus,
1999; Farnleitner, 2002).
Die Präparation und Reinigung der 6HDNOns erfolgte analog zu Claus (1999).
Deren Verlauf wird im Flußdiagramm in Abbildung 18 dargestellt.
Transformation von E. coli JM101 mit dem Expressionssystem
pKK223-6HDNOns
Bakterienkultivierung und Aufschluß mit Ultraschall
Ionenaustausch-Chomatographie an Source-30Q
Dialyse
Ionenaustausch-Chomatographie an Source-15Q
Gelpermeationschromatographie an einer Superdex-75 26/60
prep grade Säule
Dialyse
Kristallisation
Abbildung 18
Flußdiagramm der Proteinreinigung der 6HDNO. Aus einem Liter LBA-Medium konnten
ca. 10 mg reines Protein erhalten werden.
76
Ergebnisse und Diskussion zur 6HDNO
4.1.1 Expression und Reinigung der 6HDNOns
Zur Expression wurde das Plasmid in den E. coli Stamm JM101 transformiert
(Kapitel 3.1.10). Nach Expression (Kapitel 3.2.1) und Zellaufschluß (Kapitel 3.2.2) wurde
mit dem Rohextrakt die erste Anionenaustausch-Chromatographie (Source 30 Q,
Kapitel 3.2.4) durchgeführt. Die noch stark verunreinigten 6HDNOns-haltigen Fraktionen
wurden dann vereinigt, über Nacht gegen IEC-A-Puffer dialysiert (Kapitel 3.2.9) und dann
auf die zweite IEC (Source 15Q) aufgetragen. Abschließend wurde mit den vereinigten
Fraktionen der zweiten IEC zur Abtrennung der letzten Verunreinigungen eine
Gelpermeationschromatographie
an
einer
Superdex-75 26/60
prep
grade
Säule
durchgeführt (Kapitel 3.2.7).
0.7
Absorption [AU]
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Elutionsvolumen [mL]
Abbildung 19
Elutionsdiagramm der GPC an Superdex-75 26/60 prep grade Säule von der 6HDNOns.
Der Balken unter dem peak markiert die zur Kristallisation vereinigten Fraktionen.
kDa
94
67
43
30
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Abbildung 20
Bahn 1: LMW-Standard
Bahn 2: Fraktion 56 (112 mL)
Bahn 4: Fraktion 68 (136mL)
SDS-Gel ausgewählter Fraktionen des GPC-Laufs aus Abbildung 19. Aufgetragen sind
jeweils 3 µL der einzelnen Fraktionen.
Abbildung 19 zeigt das Chromatogramm, eines GPC-Laufs. Anhand des
Elutionsvolumens von 148 mL wurde die molekulare Masse Mr mit Hilfe der Eichgerade
(Kapitel 8.2) zu etwa 46.3 kDa bestimmt. Dies bedeutet eine Abweichung von lediglich
6% von der erwarteten Masse für das Monomer von 49.3 kDa. Wie im Elutionsdiagramm
und im dazugehörigen SDS-Gel (Abbildung 20) zu erkennen ist, konnten letzte
Verunreinigungen abgetrennt und die 6HDNOns bis zu Homogenität gereinigt werden. Ein
Teil der 6HDNOns wird auch schon bei 125 mL eluiert. Mittels Rechromatographie eines
Teils aller Fraktionen auf einer Superdex-200 16/60 Säule konnte gezeigt werden, daß es
sich bei der früher eluierten 6HDNOns nicht um ein Dimer sondern um oligomeres Protein
handelt.
Für die Kristallisation und analytische Versuche wurden die 6HDNOns Fraktionen
vereinigt, konzentriert und gegen ddH2O dialysiert. Bei der Vereinigung wurden während
der gesamten Reinigung immer Fraktionen in einem engen Bereich um den peak
verwendet, um eine homogene Proteinprobe zu bekommen. Trotz dieser großzügigen
Vorgehensweise wurde aus einem Liter LBA-Medium im Durchschnitt 10 mg reines
Protein gewonnen.
4.1.2
Expression und Reinigung der SeMet-6HDNOns
Um das Phasenproblem zu lösen, wurde versucht, den anomalen Streuer Selen in
Form von Seleno-L-Methionin (SeMet) in die 6HDNOns zu inkorporieren, um
anschließend mittels MAD-Phasierung (Kapitel 3.5.12) die Struktur zu erhalten. In der
vorliegenden Arbeit wurde dazu nach der Methode von LeMaster gearbeitet
(Kapitel 3.2.3). Für die Expression in den Methionin-auxotrophen E. coli-Stamm
B834(DE3) mußte das Gen der 6HDNOns in einen Expressionsvektor mit T7 Promotor
kloniert werden. Dazu wurde das entsprechende Genfragment ausgehend vom
Vektorkonstrukt pKK223-3-6HDNOns mittels PCR amplifiziert (Kapitel 3.1.1), mit
Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und isoliert (Kapitel 3.1.6 bzw. 3.1.7). Da sich im
6HDNOns Gen eine NdeI Schnittstelle befindet und VspI den gleichen 5`-TA-Überhang
erzeugt enthielt der forward-primer zur Klonierung in den Vektor pET3b eine VspI-, der
reverse-primer eine BamHI-Schnittstelle. Nach der Ligation (Kapitel 3.1.8) wurde der
Erfolg der Umklonierung mittels DNA-Sequenzierung überprüft (Kapitel 3.1.9).
Das Vektorkonstrukt pET-3b-6HDNOns wurde dann in den E. coli-Stamm
B834(DE3) transformiert und in LeMaster-Medium (Hendrickson et al., 1990) mit
25 mg/L SeMet kultiviert. Die Expression und Reinigung erfolgte identisch zur
77
78
unmarkierten 6HDNOns (Kapitel 4.1.1). Um eine Oxidation des Selens zu verhindern,
wurde zu allen Puffern 5 mM DTT zugegeben Die Ausbeute an reinem Protein betrug
6 mg pro Liter Kulturmedium.
4.1.3 Charakterisierung der 6HDNOns und SeMet-6HDNOns
Um die Reinheit und das Verhältnis von Holo- zu Apoenzym zu überprüfen, wurde
nach der Präparation das Absorptionsverhältnis A280/A450 bestimmt. Die gemessenen Werte
lagen immer in einem Bereich von 10% um den idealen Wert von 6.45 (Kapitel 3.3.1). Die
Molekularmasse wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestätigt, sie ergab sich zu
50 ± 5 kDa. Zudem konnte mittels DLS der Reinheitsgrad der Proben bestimmt werden
(Kapitel 3.3.3). Die Basislinie lag bei einem Wert von 1.001. Dieser Wert deutet auf eine
monomodale Lösung hin, die sich in der Regel gut zur Kristallisation eignet (D’Arcy,
1994).
Mit Hilfe der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) wurden die
Inkorporation von Selenomethionin bei der Präparation von 6HDNO kontrolliert
(Kapitel 3.3.4). Bei vollständigem Ersatz aller zehn in der Sequenz vorhandenen
Methionine, beträgt die Massendifferenz zwischen 6HDNOns (49*377 Da inklusive
kovalent gebundenem FAD) und SeMet-6HDNOns 469 Da. Das Massenspektrum der
6HDNOns zeigt eine Bande bei 49’375 Da, dieser Wert stimmt sehr gut mit dem
theoretischen überein. Für SeMet-6HDNOns wurde eine Bande bei 49’842 Da detektiert.
Daraus ergibt sich eine Massedifferenz von 467 Da, welche den Ersatz sämtlicher
Methionine durch SeMet bestätigt.
4.2 Kristallisation und Charakterisierung der Kristalle
Die Kristallisation der 6HDNOns wurde nach der Hänge-bzw. Sitztropfenmethode
wie in Kapitel 3.4.1 beschrieben durchgeführt. Dazu wurde das Protein über Nacht gegen
ddH2O dialysiert, entstandenes Präzipitat mittels Zentrifugation entfernt und die
Proteinkonzentration auf 5-10 mg/mL eingestellt. Die von Farnleitner (2002) gefundenen
Bedingung von 23% PEG 4000, 0.1M Tris/HCl pH 9.2 und 0.2 M Natriumacetat konnte
reproduziert
und
weiter
verfeinert
werden.
Zusätzlich
wurde
bei
allen
Kristallisationsversuchen die Proteinkonzentration variiert.
In Abbildung 21a und b (Kristallform 1 bzw. 2) sind Beispiele von verfeinerten
Kristallen dargestellt, welche nach ein bis zwei Tagen aus dem Präzipitat erschienen und
79
4.2 Kristallisation und Charakterisierung der Kristalle
nach ungefähr einer Woche ihre endgültige Größe erreichten. Die maximal
600*150*50 µm3 großen Kristalle setzten sich durch ihre gelbe Farbe deutlich vom
Lösungsmittel ab. Als cryoprotectant wurde 20% (v/v) Polyethylenglykol, wie in
Kapitel 3.4.2 beschrieben, verwendet. Die Kristallformen 1 und 2 ließen sich der
monoklinen Raumgruppe P21 zuordnen. Die Anzahl der Moleküle in der asymmetrischen
Einheit wurde zu vier bestimmt (Tabelle 9). Der Matthews-Parameter beträgt 3.1 Å3/Da für
Form 1 und 2.5 Å3/Da für Form 2, was einem Solvensgehalt von 60% bzw. 51% entspricht
(Kapitel 3.5.2). Dies bedeutet eine losere Packung der Proteinmoleküle in Kristallen der
Form 1 und ist auch eine Erklärung für das schlechtere Streuverhalten im Vergleich zu
Form 2 (Kantardjieff & Rupp, 2003).
a)
c)
b)
150 µm
Abbildung 21
100 µm
75 µm
Einkristalle der 6HDNOns aus verfeinerten Kristallisationsbedingungen:
a) Reservoir: 16%PEG 4000, 0.1 M Tris/HCl pH 9.2, 0.2 M Natriumacetat
Tropfen: 3 mg/mL 6HDNOns; 50%ige Vorsättigung (Kristallform 1)
b) Reservoir: 20%PEG 4000, 0.1 M Tris/HCl pH 9.2, 0.2 M Natriumacetat
Tropfen: 3.7 mg/mL 6HDNOns; 50%ige Vorsättigung (Kristallform 2)
c) Reservoir: 6%PEG 8000, 0.1 M Imidazol pH 8.0, 0.2 M Calciumacetat
Tropfen: 3.7 mg/mL 6HDNOns; 50%ige Vorsättigung (Kristallform 3)
Da aus den bekannten Bedingungen bisher keine röntgentauglichen Kristalle
isoliert werden konnten (Farnleitner, 2002), wurden gleichzeitig unter der Verwendung
von kommerzielle screenings (Kapitel 2.2) neue Kristallisationbedigungen gesucht. Die in
einer PEG 8000 Bedingung gefundenen initialen Kristalle sind in Abbildung 22a
dargestellt. Durch Verfeinerung der Bedingung konnten Kristalle (Abbildung 21c) erhalten
werden, welche in 2 Wochen ihre maximale Größe von 300*150*50 µm3 erreichten
(Kristallform 3). Diese Kristalle in Form 3, welche bis zu einer hohen Auflösung streuten,
wurden aber erst zu einem späteren Zeitpunkt entdeckt, da sie neben Kristallen der Form 2
vorlagen. Als cryoprotectant wurde 15% (v/v) Polyethylenglykol verwendet. Die
Kristallform 3 ließ sich der primitiven Raumgruppe P1 zuordnen. Bei zwei Molekülen in
80
der asymmetrischen Einheit beträgt der Matthews-Parameter 2.8 Å3/Da bei einem
Solvensgehalt von 56% (Kapitel 3.5.2).
a)
b)
100 µm
50 µm
Abbildung 22
Kristalle aus initiale und verfeinerten Kristallisationsbedingungen von SeMet-6HDNOns:
a) Reservoir: 10%PEG 8000, 0.1 M Imidazol pH 8.0, 0.2 M Calciumacetat
Tropfen: 2.5 mg/mL 6HDNOns; 50%ige Vorsättigung
b) Reservoir: 9.5%PEG 8000, 0.1 M Tris/HCl pH 9.4, 0.2 M Calciumacetat
Tropfen: 5.5 mg/mL 6HDNOns; 30%ige Vorsättigung
Für die Kristallisation von SeMet-6HDNO wurde, da in Ansätzen mit DTT als
Reduktionsmittel keine Kristalle wuchsen, abschließend gegen 10 mM Tris/HCl pH 7.5
mit 0.5 mM Tris(2-Carboxyethyl) Phosphinhydrochlorid dialysiert. Initiale Kristalle
wurden
aus
den
Kristallisationsansätze
bekannten
mit
PEG 4000
kommerziellen
und
PEG 8000
screenings
Bedingung
erbrachten
keine
erhalten.
neuen
Bedingungen. Nur die Verfeinerung der PEG 8000 Bedingung führte zu röntgentauglichen
Einkristallen (Abbildung 22b). Um größere Kristalle zu erhalten und die Menge des
Präzipitats zu verringern wurden Tropfen mit 5 µL Proteinlösung und 2 µL
Reservoirpuffer angesetzt und der Reservoirpuffer anschließend mit ddH2O auf 110% (v/v)
verdünnt. Nach dem direkten Transfer in 15% Ethylenglycol wurden die Kristalle
vermessen und konnten der Kristallform 1 zugeordnet werden.
4.3 Kristallographische Datensammlung
4.3 Kristallographische Datensammlung
Vor der Sammlung der vollständigen Datensätze mit Hilfe von SynchrotronStrahlung wurden von allen Kristallen zur Ermittlung des Diffraktionsvermögens einzelne
Aufnahmen von verschiedenen Kristallorientierungen auf einer Röntgenanlage mit CuKαStrahlung (Rigaku, hausinterne Röntgenanlage) unter Cryo-Bedigungen (Kapitel 3.4.2)
gemacht. Anhand der erhaltenen Reflexmuster wurden Anisotropie und Auflösungsgrenze
der Streuung eines jeden Kristalls beurteilt. Der beste Kristall jeder Form wurde dann an
den beamlines PX am SLS bzw. der BW7B am DESY bei 100 K im Stickstoffstrom
vermessen.
Zur Strukturlösung mit MAD (Kapitel 3.5.12) wurden Datensätze bei drei
unterschiedlichen Wellenlängen am selben 6HDNOns-SeMet-Kristall der Form 1
aufgenommen. Die Wellenlängen waren zuvor durch eine Fluoreszenz-Messung des
Kristalls bestimmt worden. Der peak- Datensatz (Maximum von f ′′) wurde als erster bei
λ = 0.9790 Å gemessen, anschließend der inflection point- Datensatz (Minimum von f ′)
bei λ = 0.9794 Å. Als dritter Datensatz wurde ein high energy remote-Datensatz bei
λ = 0.9417 Å aufgenommen.
Alle gemessenen Daten wurden mit dem XDS-Programmpaket (Kabsch, 1993)
ausgewertet und skaliert. Tabelle 9 zeigt die Statistiken aller Datensätze, die zur
Strukturlösung beigetragen haben. Daraus geht hervor, daß sich die Achsen der Form 1
Kristalle nur unwesentlich unterscheiden (<1% Unterschied). Dies ist eine wichtige
Voraussetzungen für eine mögliche Phasenerweiterung der experimentellen Phasen aus der
MAD-Messung auf den nativen Datensatz der Form 1.
81
82
Statistiken der MAD-Messung und der verschiedenen Kristallformen der 6HDNOns an
den Synchrotrons DESY und SLS bei 100 K. Die Werte in Klammern beziehen sich auf
die letzte Auflösungsschale. Friedel-Paare wurden bei den MAD-Datensätzen als
unabhängige Reflexe behandelt.
Tabelle 9
Kristallform
Form 1
Form 2
Form 3
Datensätze
Native
Native
Native
SLS
SLS
DESY
0.9787
0.9787
0.8430
P21
P21
P1
103.6, 95.2, 123.0
103.3, 90.9, 104.4
60.5, 62.4, 73.4
90.0, 94.1, 90.0
90.0, 100.3, 90.0
89.6, 85.3, 73.0
40-3.2 (3.4-3.2)
40-2.9 (3.1-2.9)
70 – 1.9 (2.0-1.9)
Anzahl der Observablen
124’597
132’555
340’580
Anzahl der unabhängigen
Reflexe
39’704 (5964)
42’083 (6121)
76’158 (7709)
98.3 (93.1)
98.3 (91.4)
95.9 (83.7)
Rsym-I [%]
6.9 (24)
9.6 (32)
4.9 (36)
Multiplizität
3.1(3.0)
3.1(3.0)
4.5 (3.8)
mittleres I/σI
14.6 (4.9)
12.8 (6.5)
18.19 (4.2)
Röntgenquelle
Wellenlänge [Å]
Raumgruppe
Elementarzelle a, b, c [Å]
α, β, γ [°]
Auflösung [Å]
Vollständigkeit [%]
Fortsetzung von Tabelle 9:
Kristallform
SeMet Form 1
Datensätze
Peak
Inflection
High remote
Röntgenquelle
SLS
SLS
SLS
0.9790
0.9794
0.9417
P21
P21
P21
103.9, 95.3, 122.7
104.0, 95.3, 122.7
104.0, 95.2, 122.7
90.0, 93.8, 90.0
90.0, 93.8, 90.0
90.0, 93.8, 90.0
40-3.4 (3.6-3.4)
40-3.5 (3.7-3.5)
40-3.5 (3.8-3.5)
Anzahl der Observablen
231’402
224’305
217’613
Anzahl der unabhänigen
Reflexe
60’227 (8936)
58’394 (8154)
56’358 (8738)
97.8 (90.7)
96.8 (83.4)
98.9 (95.6)
Rsym-I [%]
8.1 (25)
7.2 (23)
8.4 (28)
Multiplizität
3.8(3.7)
3.8 (3.6)
3.9 (3.7)
mittleres I/σI
12.4 (4.7)
13.7 (5.6)
12.1 (4.9)
Wellenlänge [Å]
Raumgruppe
Elementarzelle a, b, c [Å]
α, β, γ [°]
Auflösung [Å]
Vollständigkeit [%]
83
4.4 Strukturlösung
4.4 Strukturlösung
MAD-Phasierung
4.4.1
Die skalierten SeMet-Datensätze wurden mit dem Programm XPREP (Firma
Bruker AXS) analysiert. Die dabei für verschiedene Auflösungsschalen berechneten
anomalen Differenzen der Daten sowie die anomalen Korrelationskoeffizienten zwischen
den einzelnen Datensätzen sind in Tabelle 10 aufgelistet. Da nur Daten mit einem
Signal/Rausch-Verhältnis über eins und einer anomalen Korrelation größer 30% für die
Phasierung berücksichtigt werden sollten, wurden nur die Daten bis 4.5 Å für die
Auffindung der Se-Positionen benutzt. Die Abweichungen des high energy remoteDatensatzes sind darauf zurückzuführen, daß dieser mit Abstand das geringste anomale
Signal aufweist.
Tabelle 10
Anomale Korrelationskoeffizienten zwischen den einzelnen Datensätzen und anomales
Signal/Rausch-Verhältnis der einzelnen Datensätze in Abhängigkeit von der Auflösung.
Auflösung
Korrelationskoeffizient [%]
Anomales
[Å]
Signal/Rausch Verhältnis
peak/inflection
peak/remote
inflection/remote
inflection
peak
remote
∞ -8.0
88.0
90.9
85.3
1.69
2.85
2.02
8.0 - 6.0
74.5
73.5
60.4
1.54
2.48
1.60
6.0 - 5.3
58.8
53.4
42.4
1.33
1.89
1.39
5.3 - 5.1
51.6
43.0
33.1
1.26
1.67
1.25
5.1 - 4.9
53.1
40.6
31.4
1.16
1.66
1.24
4.9 - 4.7
39.0
41.8
29.5
1.13
1.52
1.17
4.7 - 4.5
32.1
35.0
20.0
1.10
1.39
1.15
4.5 - 4.3
29.4
23.6
13.2
1.10
1.35
1.12
4.3 - 4.1
13.5
18.7
11.5
1.08
1.22
1.09
4.1 - 3.9
9.5
10.9
4.4
1.08
1.14
1.08
Mit dem Progammm XPREP wurden nach der Datenanalyse eine Eingabe-Datei für
das Programm SHELXD (Schneider & Sheldrick, 2002) erstellt. Das Programm SHELXD
wurde dann zur automatischen Bestimmung der Selen-Positionen verwendet. Die besten
Lösungen von SHELXD hatten einen Korrelationskoeffizienten zwischen den gemessenen
Schweratom-Positionen und den aus den anomalen Substrukturpositionen errechneten
Differenzen von über 40%. Tabelle 11 zeigt die 45 von SHELXD gefundenen
Se-Positionen. Dort ist zwischen Position 34 und 35 als auch zwischen 37 und 38 ein
Abfall in der Besetzungszahl zu erkennen. Um die richtige Anzahl der Positionen zu
84
bestimmen wurden die 37 besten Positionen mit dem Programmen MLPHARE (CCP4,
1994) und SHARP (de la Fortelle & Bricogne, 1997) überprüft und weiter verfeinert.
Dabei wurden alle Positionen ausgenommen der Position 30 bestätigt.
Tabelle 11
Mit dem Programm SHELXD ermittelte Se-Positionen.
Se - Position
x
y
z
Beseztungszahlen
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
2.660
2.675
-15.163
-14.286
-13.336
-19.300
-16.967
-12.169
-23.933
3.886
-26.506
9.824
0.803
-30.123
-13.486
3.049
-22.052
-19.540
13.176
2.384
-22.401
-35.020
-20.332
28.243
7.475
-3.415
9.318
-38.830
12.385
-7.069
1.985
-42.288
27.103
-12.405
-12.338
1.007
-8.705
9.036
17.119
17.762
32.638
-34.558
-30.857
-12.207
-37.711
2.660
2.675
-15.163
-14.286
-13.336
-19.300
-16.967
-12.169
-23.933
3.886
-26.506
9.824
0.803
-30.123
-13.486
3.049
-22.052
-19.540
13.176
2.384
-22.401
-35.020
-20.332
28.243
7.475
-3.415
9.318
-38.830
12.385
-7.069
1.985
-42.288
27.103
-12.405
-12.338
1.007
-8.705
9.036
17.119
17.762
32.638
-34.558
-30.857
-12.207
-37.711
26.408
24.163
32.235
41.834
59.851
47.800
43.052
48.918
69.157
14.348
50.793
37.134
12.428
40.512
36.664
-1.593
39.418
52.570
32.215
32.188
20.026
22.048
71.638
22.533
2.009
14.115
30.070
60.533
5.867
16.302
24.883
30.156
3.844
17.726
53.102
6.290
72.248
38.946
28.738
17.640
8.527
61.617
46.210
45.569
30.391
1.000
0.970
0.940
0.906
0.900
0.890
0.865
0.855
0.832
0.826
0.825
0.807
0.803
0.779
0.744
0.724
0.721
0.703
0.688
0.676
0.621
0.613
0.609
0.604
0.591
0.586
0.579
0.555
0.543
0.539
0.508
0.490
0.472
0.471
0.362
0.352
0.328
0.259
0.258
0.257
0.255
0.251
0.233
0.222
0.221
85
4.4 Strukturlösung
In SHARP wurde dann mit den 36 Se-Positionen eine initiale Phasierung bis 3.5 Å
vorgenommen und die Auswahl der richtigen Händigkeit bestätigt. Mit den Positionen
konnte außerdem noch die Anordnung der 6HDNOns Protomere in der asymmetrischen
Einheit bestimmt werden (Kapitel 3.5.10). Mit dem Programm RESOLVE (Terwilliger,
2003)
konnte
mittels
NCS-Dichtemittelung
und
Dichtemodifikation
eine
Phasenausweitung auf den nativen Datensatz der Form 1 bis 3.2 Å (Tabelle 9) erreicht
werden.
4.4.2
Modellbau in den Kristallformen-1, -2 und -3
Für den initialen Modellbau in Kristallform-1 wurde die im Anschluß an die
Phasenerweiterung bis 3.2 Å berechnete Elektronendichtekarte (Kapitel 3.5.15) verwendet.
Dabei wurde mit Hilfe des interaktiven Graphikprogramms O (Jones et al., 1991) eine
Polyalaninkette in eines der vier Protomere der initialen Elektronendichtekarte modelliert.
Als Anhaltspunkt für den Verlauf der Kette dienten die von RESOLVE gebauten
Polyalaninfragmente und eine von dem Programm CAPRA (Ioerger & Sacchettini, 2002)
erstellte partielle Cα-Kette, welche mit Hilfe des Programms LSQMAN (Kleywegt &
Jones, 1995) und der NCS-Matrix in dasselbe Protomer verschoben wurde.
Die eingepaßte Polyalaninkette wurde als Suchmodell für einen molekularen Ersatz
(Kapitel 3.5.13) in der Kristallform-2 mit dem Programm PHASER (Read, 2001)
verwendet. Die 6HDNO wurde aufgrund von Aminosäuresequenzvergleichen der
p-Cresol Methylhydroxylase − Vanillyl-Alkohol-Oxidase Strukturfamilie (PCMH-VAO)
zugeordnet (Fraaije et al, 1998). Deshalb wurde der Modellbau unter Zuhilfenahme je
eines Protomers der PCMH bzw. der VAO, welche mit den in der Elektronendichte
erkennbaren Sekundärstrukturelementen überlagert wurden, fortgesetzt. Als die Hauptkette
zu 50% gebaut worden war, wurde der hochaufgelöste Datensatz von Kristallen der
Form-3 gemessen. Daraufhin wurde das vorhandene Modell durch molekularen Ersatz mit
PHASER auf die neue Kristallform-3 mit zwei Protomeren pro ASU übertragen.
Die Polyalaninkette wurde mit einer Kombination von verschiedenen Versionen
des Programms RESOLVE (Terwilliger, 2002 und 2003) und dem Programm ARP/wARP
(Perrakis et al., 1997) in einem iterativen Verfahren so lange verlängert bis die Qualität der
aus dem Modell berechneten Elektronendichtekarte ausreichend war, damit ARP/wARP
die Polypeptidkette zu 97% (811von 912 Resten) automatisch bauen konnte. Von den
fehlenden Aminosäureresten konnten 25 von Hand mit dem Programm XFIT
(McRee, 1999) gebaut werden. Als Hilfe dazu wurden die beiden Protomere mit LSQMAN
86
übereinandergelegt, in denen aufgrund unterschiedlicher Bereiche von schlecht definierter
Elektronendichte andere Aminosäurefragmente gebaut worden waren. Aufgrund fehlender
Elektronendichte konnten nur der erste und die letzten zwei Reste in beiden
Polypeptidketten nicht gebaut werden.
4.4.3 Verfeinerung der Kristallform-3
Das fast vollständige Modell der 6HDNOns wurde mit dem Programm REFMAC
(Murshudov et al., 1997), das mit einem auf maximum likelihood basierenden Algorithmus
arbeitet, ohne NCS-restraints verfeinert (Kapitel 3.6.5). Anhand von (2Fobs-Fcalc)- und
(Fobs-Fcalc)-Dichtekarten (Kapitel 3.5.15) wurden manuelle Korrekturen des Modells
während der einzelnen Verfeinerungsläufe mit XFIT durchgeführt.
Als
beim
kristallographischen
und
freien
R-Faktor
(Kapitel 3.6)
keine
Verbesserung mehr zu verzeichnen war, wurde der Kofaktor FAD, der zuvor mit dem
Programm PRODRG2 (Schüttelkopf & van Aalten, 2004) erstellt und energieminimiert
worden
war,
in
jede
Untereinheit
modelliert.
Dazu
wurde
eine
(Fobs-Fcalc)-
Elektronendichtekarte berechnet, die FAD Position konnte somit bei einer Konturierung
auf dem 3 σ-Niveau eindeutig bestimmt werden. Anschließend wurden die von PRODRG2
berechneten, idealisierten Molekülparameter so abgeändert, daß sie eine kovalente
Bindung des Kofaktors an die Polypeptidkette ermöglichten. Diese wurden dann bei den
folgenden Verfeinerungsrunden mit REFMAC statt der Standardparameter verwendet.
Abbildung 23
(Fobs-Fcalc)-Elektronendichte-Karte der 6HDNO im aktiven Zentrum. Die
Elektronendichtekarte wurde vor der Modellierung von FAD gerechnet. FAD wurde dann
als fertig verfeinertes Modell nachträglich eingefügt. Die Konturhöhe beträgt 3 σ.
87
4.4 Strukturlösung
Abbildung 23 zeigt die zuvor berechnete (Fobs-Fcalc)-Elektronendichte mit dem
anschließend verfeinerten FAD-Molekül. Darin wird die gebogene Form des IsoalloxazinRings sowie dessen kovalente Bindung über das C8α an das Nδ1 des His72 durch die
Elektronendichte
bestätigt.
In
früheren
Beobachtungen
wurde
mittels
Dünnschichtchromatographie mit Vergleichssubstanzen (Möhler et al., 1972) die kovalente
Bindung zum Nε2 Atom des His72 bestimmt. Dagegen ist hier der Nachweis direkt.
Die Wassermoleküle wurden automatisch mit der ARP/water Option von REFMAC
detektiert und gebaut. Der letzte Schritt war die TLS-Verfeinerung in REFMAC, dazu
wurden die FAD- und die Substratbindungsdomäne (Reste: 5-205 sowie 411-457 bzw.
206-410) als zwei TLS-Gruppen definiert. Der endgültige Rfree-Wert lag bei 20.8% und der
Rcryst bei 16.9%. Zur Berechnung des Rfree-Wertes wurden dabei generell 3% aller Reflexe
zufällig ausgewählt, die von der Verfeinerung ausgeschlossen wurden.
4.4.4
Qualität der 6HDNOns-Struktur der Form-3
Das verfeinerte Modell der 6HDNOns enthält in der Kristallform-3 mit der
Raumgruppe P1 zwei Moleküle pro asymmetrischer Einheit. Die Polypeptidkette besteht
aus den Aminosäureresten 5-457, von denen der erste und die letzten zwei Reste in keinem
der beiden Moleküle in der Elektronendichte definiert waren. Mit 906 von 912 Resten in
der asymmetrischen Einheit ist das verfeinerte Modell damit zu über 99% vollständig.
Außerdem enthält das Modell, neben 1090 an die Polypeptidkette koordinierten
Wassermolekülen, in beiden Ketten einen FAD Kofaktor über eine kovalente Histidyl(Nδ1)-(8α)-FAD-Bindung.
Die Qualität des verfeinerten Modells hängt von der Übereinstimmung mit den
gemessenen Daten (Kapitel 3.6) und von sinnvollen stereochemischen Parametern
(Kapitel 3.7.2) ab. Die Qualität der verfeinerten Struktur wurde mit Hilfe der Programme
PROCHECK (Laskowski et al., 1993) und WHATCHECK (Hooft et al., 1996) überprüft.
In Tabelle 12 sind die Qualitätskriterien aufgelistet die üblicherweise für die Beurteilung
des Verlaufs einer Verfeinerung herangezogen werden. Dabei weisen die erhaltenen
R-Faktoren, für die Auflösung von 1.9 Å, sinnvolle Werte auf. Auch stereochemische
Parameter, wie die mittleren quadratischen Abweichungen (rmsd) der Bindungswinkelund Längen, liegen in sinnvollen Bereichen (Engh & Huber, 1991).
88
Tabelle 12
Verfeinerungsstatistik der 6HDNOns Struktur in der Kristallform-3
Auflösungsbereich [Å]
70-1.9
Anzahl der Reflexe
76’158
Proteinatome
6808
Anzahl der Wassermoleküle
1´90
FAD-Atome
106
Mittlerer B-Faktor
Hauptkette [Å2]
2
Alle Atome [Å ]
26.9
29.5
Rcryst [%]
16.9
Rfree (3% Testdatensatz) [%]
20.8
rms-Abweichung der Geometrie:
Bindungslängen [Å]
0.011
Bindungswinkel [°]
1.40
Ramachandran Winkel im
günstigsten Bereich [%]
90.5
erlaubten Bereich [%]
9.2
verbotenen Bereich [%]
0.3
Aus der Verteilung der B-Faktoren über die Aminosäurereste (Abbildung 24) lassen
sich flexible Bereiche in Proteinstrukturen erkennen. Große Beweglichkeit von Resten
oder Bereichen wird durch hohe B-Faktoren repräsentiert. Da sich die Diagramme für
Untereinheit A und B nur unwesentlich unterscheiden, wurde nur das Diagramm für
Untereinheit A dargestellt. Wie dort zu sehen ist, gibt es in zwei Bereichen sehr große
Abweichungen vom durchschnittlichen B-Faktor. Dabei handelt es sich um allgemein
flexible loops im Bereich der Aminosäuren 305 und 342, welche durch Kristallkontakte
unterschiedlich geformt wurden.
Abbildung 24
Verlauf der B-Faktoren der Kristallform-3 entlang der Hauptkette in Untereinheit A der
6HDNOns. Der Verlauf des isotropen B-Faktors ist für die Untereinheiten A und B
nahezu identisch und deshalb exemplarisch an der Kette A dargestellt. Die Balken
markieren die Sekundärstrukturelemente im verfeinerten Proteinmodell.
89
4.4 Strukturlösung
Zum Vergleich der beiden Protomere wurden außerdem die Abweichungen der
jeweils entsprechenden Cα-Positionen berechnet und aufgetragen (Abbildung 25). Die
beiden Protomere in der ASU sind mit einer mittleren rms-Abweichung der Cα-Atome von
0.24 Å sehr ähnlich obwohl ohne NCS verfeinert wurde. Die größten Abweichungen mit
bis zu 2 Å befinden sich wiederum in den schon erwähnten loop-Regionen oder in
bereichen mit schlecht definierter Dichte in einem der beiden Protomere.
2.5
∆C( α) [ Å ]
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Aminosäurerest
Abbildung 25
rms-Abweichung in zwischen den Cα-Positionen in den Protomeren A und B der
Kristallform-3 in Abhängigkeit des jeweiligen Aminosäurerestes.
Zur Beurteilung der stereochemischen Parameter des verfeinerten Modells gehört
auch die Analyse der Hauptkettentorsionswinkel ϕ und ψ. Dazu wurde mit dem Programm
PROCHECK ein so genanntes Ramachandran-Diagramm (Kapitel 3.7.2) erstellt. Da die
Torsionswinkel im verwendeten Verfeinerungsprogramm REFMAC nicht eingeschränkt
werden und somit prinzipiell in weiten Bereichen variieren können, läßt sich ihre
Verteilung zur Qualitätskontrolle verwenden. Aufgrund der äußerst geringen Unterschiede
zwischen den einzelnen Protomeren des Modells ist in Abbildung 26 nur das Diagramm
der Untereinheit A des 6HDNOns-Modells dargestellt.
90
Abbildung 26
Ramachandran-Diagramm der Untereinheit A des 6HDNOns-Modells in Kristallform-3.
Glycine sind als Dreiecke dargestellt, alle anderen Aminosäuren (außer Proline) werden
durch Quadrate symbolisiert. Je dunkler der Hintergrund, desto bevorzugter ist die (ϕ,ψ)Konformation (Laskowski et al., 1993).
Insgesamt befinden sich 91% aller Reste (Glycin und Prolin ausgenommen) des
verfeinerten Modells im energetisch günstigsten Bereich (Tabelle 12). Die übrigen Reste
liegen im erlaubten Bereich außer Lys428, das auch nach intensivster Verfeinerung im
verbotenen Bereich liegt. Dieses Lysin nimmt eine besondere Position im Modell ein, da es
die einzige Aminosäure ist, welche die zwei C-terminalen zueinander orthogonalen
α-Helices verbindet (Abbildung 28).
Außer der Verteilung der Hauptkettentorsionswinkel kann auch die Verteilung der
Seitenkettentorsionswinkel zur Beurteilung der Qualität eines Modells herangezogen
werden. Die Verteilung der Seitenketten-Torsionswinkel χ1 und χ2 von Leucin, Isoleucin
und Phenylalanin ist dabei besonders charakteristisch, da deren hydrophobe Seitenketten
meistens im Inneren des Proteins liegen und oft besser geordnet sind als hydrophile
Seitenketten. Für das Protomer A ist diese Verteilung in Abbildung 27 aufgetragen. Sie
deckt sich, außer für einen geringen Teil der Leucine, gut mit den aus hochaufgelösten
Strukturen abgeleiteten Verteilungen (Ponder & Richards, 1987).
4.4 Strukturlösung
Abbildung 27
4.4.5
Verteilung der Torsionswinkel χ1 und χ2 für die Aminosäuren Leucin, Isoleucin und
Phenylalanin in Untereinheit A des 6HDNOns Modells in Kristallform-3. Die
bevorzugten Bereiche des (χ1, χ2)- Torsionswinkelraums sind durch einen zunehmend
grün gefärbten Hintergrund gekennzeichnet (Laskowski et al., 1993). Die (χ1, χ2)Konformationen der einzelnen Seitenketten sind durch Quadrate symbolisiert. Gelbe
Quadrate entsprechen einer bevorzugten, rote Quadrate einer nicht bevorzugten
Konformation.
6HDNOns-Strukturen in den Kristallformen-1 und -2
Die Statistiken der beiden niedrig aufgelösten Datensätze aus Kristallform-1 und -2
sind in Kapitel 4.3, Tabelle 9 aufgeführt. Die Strukturlösung erfolgte in beiden Fällen
mittels molekularem Ersatz mit dem Programm PHASER. Dabei wurde das verfeinerte
6HDNOns-Modell aus der Kristallform-3 ohne Wassermoleküle als Suchmodell
eingesetzt. Um erneut einen Nachweis für die Position der kovalenten Bindung zwischen
FAD und Polypeptidkette zu erhalten wurden auch die Koordinaten des FAD-Moleküls aus
dem Suchmodell entfernt. Es wurden jeweils 4 Protomere pro ASU gefunden. Wie schon
in Form-3 konnte auch hier in beiden Formen die kovalente Bindung des FAD Kofaktors
über das C8α an das Nδ1 des His72 mit einer (Fobs-Fcalc)-Elektronendichte bei einer
Konturhöhe von 3 σ nachgewiesen werden.
Die Verfeinerung erfolgte mit dem Programm CNS (Brünger et al., 1998) unter
Verwendung der initialen Lösungen aus dem molekularen Ersatz. Dabei wurden alle
Protomere der asymmetrischen Einheit als identisch betrachtet (strict-NCS). Die Position
des als starrer Körper (rigid-body) behandelten Protomers sowie die Positionen der nur
über ihre NCS-Operatoren definierten übrigen Protomere wurden zunächst durch eine
rigid-body Verfeinerung optimiert. Beim anschließenden simulated annealing des Modells
konnten aufgrund der Verwendung der torsion-angle dynamics (Rice & Brünger, 1994) für
die einzelnen Protomere individuelle starke NCS-restraints definiert werden. Das
annealing wurde bei 2500 K gestartet und das Modell dann stufenweise in 25 K Schritten
abgekühlt.
91
92
Zu diesem Zeitpunkt der Verfeinerung der Form-1 und -2 wurde der Kofaktor
FAD, der zuvor mit dem Programm PRODRG2 (Schüttelkopf & van Aalten, 2004)
energieminimiert gebildet worden war, in jede der vier Untereinheit modelliert. Die
Positionen
wurden
mit
Hilfe
von
(Fobs-Fcalc)-Elektronendichtekarten
bei
einer
Konturierungsniveau von 3 σ bestimmt. Für die Verfeinerung mit CNS wurden die, von
PRODRG2 berechneten, idealisierten Molekülparameter so abgeändert, daß sie eine
kovalente Bindung des Kofaktors an die Polypeptidkette ermöglichten. Die Modelle
wurden anschließend unter Verwendung von strict-NCS energieminimiert und die
B-Faktoren mit zwei Gruppen pro Rest verfeinert. Wenn Unterschiede in der (Fobs-Fcalc)Elektronendichte sichtbar waren wurde zwischen den Verfeinerungsrunden die
Proteinketten manuell mit dem Programm Coot modifiziert (Emsley & Cowtan, 2004).
Die Statistiken der Verfeinerungen der Aminosäurereste 5-457 in den
Kristallformen
1 und 2 sind in Tabelle 13 dargestellt. Die dort aufgeführten
Qualitätskriterien für die Übereinstimmung mit den gemessenen Daten und die
stereochemischen Parameter weisen für die Auflösungen von 3.2 bzw. 2.9 Å sinnvolle
Werte auf. Wie schon beim Modell in Form-3 liegt nur der Rest Lys428 in beiden
Kristallformen im verbotenen Bereich des Ramachandran-Diagramms.
Tabelle 13
Verfeinerungsstatistiken der 6HDNOns Strukturen in der Kristallform-1 und -2.
Form-1
Form-2
Auflösungsbereich [Å]
40-3.2
40-2.9
Anzahl der Reflexe
39’704
42’083
Proteinatome
13’596
13’596
FAD-Atome
212
212
47.6
45.0
52.0
47.5
Rcryst [%]
25.5
27.4
Rfree (5% Testdatensatz) [%]
29.2
29.7
Bindungslängen [Å]
0.011
0.008
Bindungswinkel [°]
1.59
1.55
günstigsten Bereich [%]
79.4
85.6
erlaubten Bereich [%]
20.3
14.1
0.3
0.3
Mittlerer B-Faktor
Hauptkette [Å2]
2
Alle Atome [Å ]
rms-Abweichung der Geometrie:
Ramachandran Winkel im
verbotenen Bereich [%]
93
4.5 Strukturbeschreibung der 6HDNOns
Im folgenden Kapitel wird, wenn nicht anders erwähnt, die hoch aufgelöste
Struktur der 6HDNOns in Kristallform-3 beschrieben, welche zur Raumgruppe P1 mit
zwei Molekülen pro asymmetrischer Untereinheit gehört (Tabelle 9 und Tabelle 12).
4.5.1
Sekundärstruktur
Aufgrund charakteristischer Wasserstoffbrücken-Bindungsmuster zwischen den
Atomen der Peptidbindungen lassen sich Sekundärstrukturelemente definieren. Die
Zuordnung der Sekundärstrukturelemente der 6HDNOns wurde automatisch mit den
Programmen DSSP (Kabsch & Sander, 1983) und STRIDE (Frishman & Argos, 1995)
durchgeführt. In Abbildung 28 sind die Zuordnungen der beiden Programme, die sich nur
unwesentlich voneinander unterscheiden, aufgeführt. Mit Hilfe des Programms Coot
wurden diese überprüft und eine resultierende Zuordnung der Sekundärstrukturelemente
ermittelt, welche in Abbildung 28 in der ersten Zeile dargestellt ist. Damit verfügt die
Struktur der 6HDNOns insgesamt über 19 β-Stränge und 13 α-Helices.
β1
α1
α2
β3 .
β4
β5
.
.
.
. β2
.
.
.
.
. β6

SEQ
4
mKLATPLSIQGEVIYPDDSGFDAIANIWDGRHLQRPSLIARCLSAGDVAKSVRYACDNGLEISVRSGGHNPNGYATNDGGIVLDLRLMNSIHIDTAGSRA
STR
TTTT
EEETTTT HHHHHH
TTTT
TTEEEE
HHHHHHHHHHHHHH
EEEETTT TTTTTTTTTTTEEEETTTTT EEEEGGG EE
DSSP
SSS
SSEEE TTSTTHHHHH S TT
SEEEE SHHHHHHHHHHHHHHT EEEESS
TT TT SSSEEEE TT
EEEETTTTEE
103
α3 .
β7
α4 .
α5
β10.
.
.
.
.β8
. β9
. α6
.

SEQ 104 RIGGGVISGDLVKEAAKFGLAAVTGMHPKVGFCGLALNGGVGFLTPKYGLASDNILGATLVTATGDVIYCSDDERPELFWAVRGAGPNFGVVTEVEVQLY
STR
EEETTTBHHHHHHHHHH EEE
TTTTBHHHHHH
HHHHH GGGGEEEEEEETTTT EEEEETTTTHHHHHHHHHHGGG EEEEEEEEEE
DSSP
EEETT BHHHHHHHHHTTTEEE
S TTSBHHHHHTT
TTHHHH GGGGEEEEEEE TTS EEEEESSSSHHHHHHHHHHGGGT EEEEEEEEEE
203
α7.
β12 .
β13.
β14 .
α9.
. β11
.
.
. α8
.

SEQ 204 ELPRKMLAGFITWAPSVSELAGLLTSLLDALNEMADHIYPSVFVGVDENRAPSVTVCVGHLGGLDIAERDIARLRGLGRTVSDSIAVRSYDEVVALNAEV
STR
E TTTEEEEEEEE TTTHHHHHHHHHHHHHHHTTTTT EEEEEETTTTEEEEEEEE
HHHHHHHHHHHHH
TTEE EEE HHHHHHHHHHH
DSSP
E
SEEEEEEEE
HHHHHHHHHHHHHHHHTTTTT
EEEEEE TTSEEEEEEEE S HHHHHHHHHHHHTTS SEE EEE HHHHHHHHHHT
303
β15
α10 .
β16.
β17 .
β18
α11
.
.
.
.
.
.
.

SEQ 304 GSFEDGMSNLWIDREIAMPNARFAEAIAGNLDKFVSEPASGGSVKLEIEGMPFGNPKRTPARHRDAMGVLALAEWSGAAPGSEKYPELARELDAALLRAG 353
STR
TTTEEEEEEEEEE
HHHHHHHHHH GGG EEEGGG EEEEEEEE
TTTT
EEEEEEEEETTTTTTHHHHHHHHHHHHHHHHH
DSSP
S
DD EEEEEEEEE S HHHHHHHHHTTGGG EEETTTTEEEEEEEE
TT SS
SS EEEEEEEE TTSTTTTHHHHHHHHHHHHHHHTT
β19 .
α13 .
. α12
.
.

SEQ 404 VTTSGFGLLNNNSEVTAEMVAEVYKPEVYSRLAAVKREYDPENRFRHNYNIDPEgs 459
STR
EEEEE GGGTTTT HHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHTTTTTTTTTTT
DSSP
EEEEE GGG SS HHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHH TT
SSS
Abbildung 28
Sekundärstrukturelemente der 6HDNOns. Die Aminosäuresequenz befindet sich in der
dritten Zeile, die automatisch von den Programmen DSSP und STRIDE zugeordneten
Sekundärstrukturelemente in der 4. und 5. Zeile. Bedeutung der Symbole: H=α-Helix,
E=β-Strang, G=310-Helix, T=turn, S=Biegung. Die tatsächlich verwendete
Sekundärstrukturzuordnung ist in der 2. Zeile graphisch dargestellt. Die 1. Zeile enthält
die Nummerierung der Sekundärstrukturelemente sowie einen Punkt an jeder 10.
Aminosäure.
94
4.5.2 Tertiärstruktur und Domänen-Organisation
In der Kristallform-3 liegt in der ASU ein 6HDNO Disulfid-Dimer vor. Die beiden
Moleküle unterscheiden sich dabei kaum voneinander (Kapitel 4.4.4). Jedes Protomer
besteht, wie aus Abbildung 29 erkennbar, aus 4 Segmenten, die 3 Domänen bilden. Die
Domänen wurden dabei anhand unterscheidbarer Faltungseinheiten entlang der
Polypeptidkette definiert. An der FAD Bindung sind die N-terminale Domäne I (Reste 591) sowie Domäne IIa (Reste 92-205) und -IIb (Reste 411-457) beteiligt. Darunter liegt die
Substratbindungsdomäne III (Reste 206-410).
Abbildung 29
Stereo-ribbon-Darstellung der 6HDNO. Das kovalent an His72-Nδ1 gebundene FAD und
das Substrat 6-Hydroxy-D-Nikotin (HDN) an seiner vermutlichen Position sind als balland-stick Modell gezeigt. Die Einteilung der Domänen I (grün), IIa (blau), III (orange)
und IIb (rosa) erfolgte entlang der Polypeptidkette. Die Sekundärstrukturen sind gemäß
Abbildung 28 gekennzeichnet.
Das Enzym beinhaltet drei β-Faltblätter die von den α-Helices 1-11 umgeben sind.
Diese werden von den Strängen β1-β2+β4+β3 (- antiparallel, + parallel) in Domäne I,
β5-β6-β10-β8-β9 in Domäne IIa und β14-β11-β13-β12-β17-β18-β15 in Domäne III
gebildet. Die Domäne IIb, deren Benennung sich von der engen Anbindung an Domäne IIa
ableitet, besteht aus den Helices α12 und α13 und dem anschließenden C-terminalen loop
mit den beiden Reste Asp443 und Pro444 , welche als einzige in der gesamten
Proteinfamilie konserviert sind. Das Asp443 bildet eine interne Salzbrücke zu Lys439 und
drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den Amiden des Proteinrückgrats aus. Die so
vordefinierte Konformation des loops paßt genau in eine Spalte zwischen der Domäne I
und IIa. Durch die enge Anbindung der C-terminalen Domäne IIb an die N-terminale
Region wird die Proteinstabilität erhöht.
Die vorliegende Domänenanordnung ließ die Vermutung zu, daß sich die Domänen
bei Substratbindung, wie bei einem induced-fit-Mechanismus, relativ zueinander bewegen.
Um festzustellen, ob es in den 10 verschiedenen Molekülen aus den drei Kristallformen
unterschiedliche Domänenanordnungen gibt wurden die einzelnen Moleküle mit dem
Programm ESCET (Schneider, 2000) untersucht. Dabei wurden unter Verwendung von
Differenz-Abstands-Matrizen keine Unterschiede in den Domänenanordnung gefunden.
Zusätzlich wurde dieses Ergebnis noch dadurch bestätigt, daß bei der Überlagerung der
Domänen II aller Moleküle, unter Verwendung des Programms LSQMAN, keine
Unterschiede in den Positionen der Domänen I und III festgestellt werden konnten.
4.5.3
Quartärstruktur
Bei der Proteinreinigung und Analytik (Kapitel 4.1) der 6HDNO war bisher immer
ein Monomer in Lösung beobachtet worden. Dagegen liegen die zwei Moleküle der
Kristallform-3 im Kristall als disulfidverbrücktes, kovalentes Dimer vor. Die
Disulfidbrücke wird wie in Abbildung 30 zu sehen ist zwischen Cys59 und Cys59’ über
eine lokale zweizählige Achse ausgebildet. Die entsprechende Kontaktfläche stellt mit
556 Å2 einen großen Kristallkontakt dar, ist aber zu klein für eine natürliches interface. Die
gleiche kovalente Bindung und der dazugehörige Kontakt wurde auch in den verfeinerten
Strukturen der Kristallformen 1 und 2 beobachtet.
Abbildung 30
Stereodarstellung der Disulfidbrücke in einem Kristallkontakt der Kristallform-3. Die
Konturhöhe der dargestellten (2Fobs-Fcalc)-Dichtekarten beträgt 1.5 σ (blau) und 3 σ (rot).
Der gleiche Kontakt kommt auch in den Kristallformen 1 und 2 vor. Der Betrachter
schaut direkt auf die quasi-zweizählige Achse in der Bildmitte.
Durch das Disulfid werden die längsten Achsen der 6HDNO Moleküle, welche die
Form eines gestreckten Ellipsoids haben, verbunden. Dadurch erhält das Dimer eine
hantel-ähnliche Form mit einer maximalen Ausdehnung von 130 Å und einer zweifachen
Symmetrieachse. Da diese Achsen in allen drei Kristallformen immer um ein paar Grad
95
96
von den 180° abweichen, ist davon auszugehen, daß der Kontakt um die Disulfidbrücke
flexibel ist und es sich somit um eine quasi-zweifache Symmetrieachse handelt.
Die unerwarteten Disulfid-Dimere konnten mittels SDS-PAGE unter oxidativen
und reduktiven Bedingungen für alle Kristallformen bestätigt werden. Dazu wurden
Kristalle aus bis zu einem Jahr alten Kristallisationsansätzen isoliert und im
Reservoirpuffer mehrmals gewaschen, bevor sie in Probenpuffer ohne β-Mercaptoethanol
aufgelöst wurden. Wie in Abbildung 31 zu sehen ist, liegt die 6HDNO aus den Kristallen
unter oxidativen Bedingungen als Dimer vor, obwohl nur Monomer zur Kristallisation
eingesetzt worden war.
kDa
Bahn 1: LMW-Standard mit β-ME
97
66
45
Bahn 2: 3 komplette Kristallisationstropfen mit β-ME
Dimer
Monomer
Bahn 3: 4 µL Mutterlösung mit β-ME
Bahn 4: LMW-Standard mit β-ME
Bahn 5: Keine Probe
Bahn 6: keine Probe
30
Bahn 7: 3 komplette Kristallisationstropfen mit β-ME
Bahn 8: 4 µL Mutterlösung ohne β-ME
20
Bahn 9: ca. 20 aufgelöste Kristalle ohne β-ME
1
2 3 4
5 6 7 8 9
Abbildung 31
SDS-Gel von 1 Jahr alten Kristallisationsansätzen mit Kristallen der Form-1 und -2 unter
reduktiven (Bahnen 1-4) und oxidativen (Bahnen 7-9) Bedingungen. Das gleiche
Ergebnis wurde auch unter Bedingungen die zu Kristallform-3 führen erhalten.
Noch überraschender war die Beobachtung, daß die 6HDNO in der Mutterlösung
trotz oxidativen Milieus immer noch als Monomer vorlag. Deshalb wurde angenommen,
daß die kovalente Bindung erst während oder nach der Packung im Kristallverband
ausgebildet wird. Um dies zu überprüfen wurde das Cys59 gegen Serin ausgetauscht. Die
Doppelmutante (C59S-C433S) wurde nach den bekannten Protokollen produziert und
gereinigt. Ansätze mit screenings im Bereich der bekannten Kristallisationsbedingungen
und allen kommerziellen screenings führten nicht zu Kristallen. Diese Beobachtung spricht
dafür, daß sich das Disulfid-Dimer erst bei der Kristallisation bildet. Da kein Dimer in der
Mutterlösung gefunden wurde, muß dieses komplett kristallisiert oder präzipitiert sein. Es
scheint so, daß in diesem Fall die Kristallisation erst durch die kovalente Dimerisierung
ermöglicht wird. Im Allgemeinen wird die Kristallisation durch Disulfidbildung gestört.
Selbst bei der 6HDNO wurde der negative Einfluß einer solchen Dimeriserung durch das
Disulfid Cys433-Cys433’ beobachtet. Eine mögliche Erklärung dafür ist, daß der Rest
Cys59 im Gegensatz zu Cys433 weniger exponiert ist und das resultierende Disulfiddimer
somit weniger flexibel und damit für die Kristallisation bevorzugt ist.
97
4.5.4
Kristallpackung
Wie bereits erwähnt kristallisiert die 6HDNO in den Kristallformen-1 und -2 in der
monoklinen Raumgruppe P21 (Abbildung 33) und in der hochauflösenden Kristallform-3
in der triklinen Raumgruppe P1. In der Raumgruppe P21, mit 2 asymmetrischen
Untereinheiten pro Zelle, befinden sich in jeder ASU zwei Disulfid-Dimere, deren
Moleküle über 3 nichtkristallographische, zweizählige Achsen abgebildet werden
(Abbildung 34 a und b). Wie in Abbildung 32 a und b zu sehen ist liegt die zweifache
Achse zwischen B und C parallel zur y-Achse. Die quasi-zweifachen Achsen zwischen den
kovalent verknüpften Molekülen A und B bzw. C und D liegen dagegen in der xy-Ebene
der Zelle. Die gleiche quasi-Achse bildet die Protomere A und B in der primitiven Zelle
der Kristallform-3 ab.
a)
Abbildung 32
b)
c)
Packung der 6HDNO in der xz-Ebene in den Kristallformen-1 (a), -2 (b) und -3 (c). Die
vier bzw. zwei Moleküle der asymmetrischen Einheiten sind in unterschiedlichen Farben
dargestellt. Um die Packung zu verdeutlichen sind durch Translation erzeugte
Symmetrieverwandte in transparent dargestellt. Die nichtkristallographische zweizählige
Achse in y-Richtung ist durch Ellipsen angedeutet. Die zweizähligen Achsen zwischen
den Disulfiddimeren (rot (A)/blau (B) und grün (C)/gelb (D)) liegen in der xz-Ebene. Die
Elementarzellachsen sind zum besseren Verständnis eingezeichnet.
z
x
Abbildung 33
Kristallographische Darstellung der Raumgruppe P21 (International Tables of
Crystallography, 1996). Die Kreise stellen die asymmetrischen Positionen dar.
21-Schraubenachsen sind als Ellipsen mit Fähnchen dargestellt.
98
Abbildung 33 zeigt die kristallographische Darstellung der Raumgruppe P21. In
dieser sind 21-Schraubenachsen neben der Translation die einzigen Symmetrieelemente. In
Abbildung 34a und b sind die ausgeführten Symmetrieoperationen durch die farbliche
Unterscheidung der Moleküle leicht zu erkennen. Wie aus Abbildung 32 und Abbildung 34
deutlich wird, unterscheiden sich die Packungen in den Kristallformen 1 und 2 nur
geringfügig. In der kleineren Elementarzelle der Form-2 ist die Packung in der xy-Ebene in
der x-Richtung kompakter, dadurch ergibt sich auch der niedrigere Matthews-Parameter
(Tabelle 9). Die Packung in Kristallform-3 unterscheidet sich von den anderen vor allem
dadurch, daß die einzelnen bogenförmigen Disulfideinheiten in einer Ebene hintereinander
gestapelt sind und nicht wie in Form-1 und -2 je zwei mit der konvexen Seite aneinander
liegen und diese Vierereinheiten dann in der Ebene gestapelt sind.
a)
b)
c)
Abbildung 34
Stereodarstellung der Elementarzellen der Kristallformen-1 (a), -2 (b) und -3 (c). Die vier
bzw. zwei Moleküle der asymmetrischen Einheiten sind in unterschiedlichen Farben
dargestellt, die Farbgebung entspricht derjenigen in Abbildung 32. Um die Packung zu
verdeutlichen sind Symmetrieverwandte in transparent dargestellt. In den Kristallformen
1 und 2 mit der Raumgruppe P21 werden diese durch die kristallographischen
21-Schraubenachsen erzeugt und in der Raumgruppe P1 der Kristallform-3 durch eine
Translation. Die nichtkristallographischen 2-zähligen Symmetrieachsen und die
Elementarzellen sind zum besseren Verständnis eingezeichnet.
99
Die
durch
die
Packung in
den
einzelnen
Kristallformen
entstandenen
Kontaktflächen sind in den Tabelle 14 bis Tabelle 16 aufgelistet. Die Kontaktflächen
wurden mit dem Programm NACCESS berechnet, wobei nur Aminosäurereste betrachtet
wurden, bei denen eine Oberfläche von mehr als 5 Å2 im Kontakt verborgen wird.
Tabelle 14
Packungskontakte der vier 6HDNO Moleküle in der ASU von Kristallform-1
Kontakt
Kontaktfläche [Å2]
Beteiligte
Moleküle
Beteiligte
Reste a,b
Symmetrieoperationen
Symmetriebeziehung
I
641
BC
a-b
-x+2, y-1/2, -z+1
21 + Translation
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
641
557
482
425
335
335
321
321
222
222
194
194
193
193
154
96
54
54
CB
AC
AB
CD
BD
DB
AC
CA
AA’
A’A
AB
BA
DD’
D’D
AD
BC
AB
BA
b-a
c-d
e-f
g-h
i-j
j-i
k-l
l-k
m-n
n-m
o-p
p-o
q-r
r-q
s-t
u-v
w-x
x-w
-x+2, y+1/2, -z+1
x, y, z
x, y, z
x, y, z
x+1, y, z-1
x-1, y, z+1
x-1, y, z
x+1, y, z
-x+1, y,+1/2 -z+1
-x+1, y-1/2, -z+1
x-1, y, z
x+1, y, z
-x+1, y-1/2 -z+2
-x+1, y+/2, -z+2
x, y, z
x, y, z
-x+1, y+/2 -z+1
-x+1, y-2, -z+1
21 + Translation
lokale 2-zählige Achse
Translation (lokale 2-zählige Achse)
21 + Translation
21 + Translation
Translation
Translation
21 + Translation
21 + Translation
a
21 + Translation
21 + Translation
Es wurden nur Aminosäurereste betrachtet, die eine Kontakt-Oberfläche ≥ 5 Å2 gebildet haben
alle Kontakt-Aminosäurereste im Detail:
a=
B(236, 239-240, 269, 272-273, 276, 355, 357-359, 361, 428, 430, 434)
b=
C(236, 237, 239-240, 269, 272-273, 276, 355, 357-359, 361, 428, 430, 434)
c=
A(13, 15, 46-49, 52-53, 56, 90, 93, 95, 97, 104, 168-170)
d=
C(13, 46-47, 90-95, 97-99, 104, 121, 170-172, 177-178, 197)
e=
A(6-8, 56, 59-62, 166-167, 440-441, 444-445, 447)
f=
B(7, 56, 59-62, 166-167, 169, 440-441, 444-445, 447)
g=
C(7-8, 56, 59-62, 166, 167, 169, 445, 447)
h=
D(7-8, 56, 59-62, 166, 167, 169, 445, 447)
i=
B(275, 278-279, 281-283, 284, 286)
j=
D(275, 278-279, 281-283, 286)
k=
A(275, 278-279, 281-282, 284, 286)
l=
C(275, 278-279, 281-282, 286)
m=
A(175-176, 179, 355-357, 361, 368)
n=
A’(20, 222, 25, 29, 38, 381-383)
o=
A(220-221, 252-253, 332, 335)
p=
B(98-99, 120-121, 207)
q=
D(175, 179-180, 361, 434)
r=
D’(36, 381-384, 387)
s=
A(117, 120-121)
t=
D(7-9,11)
u=
B(13, 49, 53, 56)
v=
C(98, 120-121, 207)
w=
A(272)
x=
B(430, 433)
b
100
Tabelle 15
Kontakt
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
XXI
XXII
XXIII
XXIV
XXV
XXVI
XXVII
a
b
Packungskontakte der vier 6HDNO Moleküle in der ASU von Kristallform-2
706
706
612
556
484
379
379
351
351
316
316
303
303
290
290
237
237
236
210
210
204
147
147
141
141
64
64
Beteiligte
Moleküle
BC
CB
AC
AB
CD
AA’
A’A
AC
CA
DD’
D’D
BD
DB
CD
DC
AB
BA
AD
BC
CB
BC
AD
DA
AD
DA
AB
BA
Beteiligte
Reste a,b
a-a
a-a
b-c
d-e
f-g
h-i
i-h
j-k
k-j
l-m
m-l
n-o
o-n
p-q
q-p
r-s
s-r
t-u
v-w
w-v
x-y
a’ - b’
b’ - a’
c’ - d’
d’ - c’
e’ - f’
f’ - e’
-x+2, y-1/2, -z
-x+2, y+1/2, -z
x, y, z
x, y, z
x, y, z
-x+1, y-1/2, -z
-x+1, y+1/2, -z
x-1, y, z
x+1, y, z
-x+1, y,+1/2 -z+1
-x+1, y-1/2, -z+1
x+1, y, z-1
x-1, y, z+1
x+1, y, z
x-1, y, z
x-1, y, z
x+1, y, z
x, y, z
x, y, z-1
x, y, z+1
x, y, z
-x+1, y+1/2, -z+1
-x+1, y-1/2, -z+1
x, y, z-1
x, y, z+1
-x+1, y+1/2, -z
-x+1, y-1/2, -z
Symmetriebeziehung
21 + Translation
21 + Translation
21 + Translation
21 + Translation
21 + Translation
21 + Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
21 + Translation
21 + Translation
Translation
Translation
21 + Translation
21 + Translation
a=
b=
c=
d=
e=
f=
g=
h=
i=
j=
k=
l=
m=
n=
o=
p=
q=
r=
s=
t=
u=
v=
w=
x=
y=
a’ =
b’ =
c’ =
d’ =
e’ =
B,C(236, 239-240, 269, 272-273, 276, 321, 355, 357-361, 428, 430-431, 434)
A(13, 15, 46-49, 52-53, 56, 90, 93-95, 97, 104, 162, 168-170)
C(13, 46, 47, 90-95, 97, 99, 104, 121, 169-172, 177-178, 197)
A(6-8, 56, 59-62, 166-167, 440-441, 444-445, 477)
B(6-8, 56, 59-62, 166-167, 169, 440-442, 444-445, 477)
C(56, 59-62, 166-167, 169, 441-442, 444-445, 447)
D(6-8, 56, 59-62, 167, 445, 447)
A(19-22, 25-26, 29, 381-383)
A’(175-176, 355-359, 361, 368, 428)
A(275, 278-279, 281-284, 286)
C(275, 278-279, 281-283, 286)
D(4, 20-23, 25-26, 29, 38)
D’(322, 355-358, 361, 366, 368, 428, 430)
B(271-272, 275, 278-279, 282)
D(208, 267-268, 271-272, 275, 278-279, 290)
C(219-221, 252-254, 331-332, 334-336, 394)
D(95-96, 98-99, 117, 120-121, 207-208)
A(219-221, 253, 255, 331-332, 334-335)
B(95-96, 98, 120-121, 204, 207-208)
A(98,120-122, 207, 292)
D(4, 9, 11-13, 53, 56)
B(219-222, 251-253)
C(386, 390, 393, 419, 421)
B(13, 47, 49, 53, 56, 169-170)
C(98, 120-121, 207)
A(98-101, 201, 204)
D(321-322, 324-325, 328)
A(36, 81, 386, 390, 419)
D(221-222, 252, 282, 335)
A(272) f’ = B(433, 457)
101
In den Tabellen sind auch alle Aminosäuren, die an den jeweiligen Kontakten
beteiligt sind, sowie die Symmetrieoperation und die resultierende Symmetriebeziehung
aufgelistet. Daraus geht hervor, daß in der Kristallform-2 alle Kontakte aus der Form-1
außer XIV und XV ebenso vorhanden sind, wenn auch mit geringfügigen Unterschieden in
Größe und Kontaktfläche. Da es aufgrund der dichteren Packung noch viele zusätzliche
Kontakte gibt, ist der prozentuale Anteil der Kontakte an der Gesamtoberfläche mit 12%
höher als der in Form-1 von 8%. Die Kontakte, an denen das Protomer D beteiligt ist,
machen in Form-1 nur 18% der Gesamtkontaktfläche aus, in Form-2 dagegen ist es mit
24% im gleichen Verhältnis wie alle Protomere an der Packung beteiligt.
Tabelle 16
Kontakt
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
Packungskontakte der zwei 6HDNO Moleküle in der ASU von Kristallform-3
694
694
556
443
443
379
379
207
207
141
141
57
57
Beteiligte
Moleküle
A-B
B-A
A-B
A-B
B-A
A-B
B-A
A-B
B-A
A-A’
A’-A
A-B
B-A
Beteiligte
Reste a,b
a-b
b-a
c-d
e-f
f-e
g-h
h-g
i-j
j-i
k-l
l-k
m-n
n-m
x-1, y, z+1
x+1, y, z-1
x, y, z
x-1, y-1, z+1
x+1, y+1, z-1
x, y-1, z-1
x, y+1, z-1
x, y, z+1
x, y, z-1
x+1, y, z
x-1, y, z
x, y-1, z
x, y+1, z
Symmetriebeziehung
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
Translation
a
a=
A(236, 239-240, 269, 272-273, 276, 355, 357-361, 428, 430, 434)
b=
B(180, 236, 239-240, 269, 272-273, 276, 355, 357-361, 428, 430, 434)
c=
A(6-8, 56, 59-62, 167, 169, 441, 444-445, 447)
d=
B(6-8, 56, 59- 62, 167, 441, 444-445, 447
e=
A(217-219 ,221-222, 250, 252, 254, 282-284)
f=
B(207-208, 267, 271-272, 275, 278, 285-290, 292, 295)
g=
A(116, 132, 286-289, 291, 295, 298-299, 302,306)
h=
B(251-253, 339-343, 383)
i=
A(98-99, 104, 162, 172, 176-177)
j=
B(336, 390, 394, 401, 407, 421)
k=
A(11-15, 46)
l=
A’(325, 401-403)
m=
A(381, 383)
n=
B(5, 20-21)
b
Wie schon erwähnt, ist der Disulfid-Dimer-Kontakt in der Kristallform-3 der
gleiche wie in den anderen beiden Formen. Wie aus Tabelle 16 hervorgeht, sind zusätzlich
noch die jeweils größten Kontakte aller drei Kristallformen die gleichen. Der prozentuale
Anteil der Kontakte an der Gesamtoberfläche ist mit 12% der gleiche wie bei Form-2.
102
Daran ist das Protomer A, mit 54% aller Kontakte stärker beteiligt als das Protomer B. Die
Packungsunterschiede zwischen Kristallform-3 und -2 geben allerdings keinen Aufschluß
über die besseren Diffraktionseigenschaften der Form-3.
4.5.5 Strukturelle Verwandtschaft mit anderen Proteinen
Mit der verfeinerten 6HDNO Struktur wurde, wie im Kapitel 3.7.4 beschrieben, ein
struktureller Vergleich mit Hilfe des DALI-Servers (Holm & Sander, 1993) durchgeführt.
Die damit gefundenen strukturverwandten Enzyme der 6HDNO sind in Tabelle 17
aufgeführt. Der Z-score, welcher der von DALI ausgegebene Wert für die Ähnlichkeit
zweier Proteinstrukturen ist, lag für fünf Enzyme in einem Bereich der für eine signifikante
strukturelle Verwandtschaft spricht. Der engste strukturelle Verwandte ist demnach die
Cytokinin Dehydrogenase (Malito et al., 2004) gefolgt von der Cholesterol Oxidase Typ 2
(Coulombe et al., 2001), p-Cresol Methylhydroxylase (Cunane et al., 2000), D-Lactat
Dehydrogenase (Dym et al., 2000) und Vanillyl-Alkohol Oxidase (Mattevi et al., 1997).
Diese Enzyme gehören alle zur p-Cresol Methylhydroxylase - Vanillyl-Alkohol Oxidase
Familie (PCMH-VAO). Der Name dieser Familie leitet sich von der initial beobachteten
Faltung der PCMH (Mathews et al., 1991) und der ersten kompletten Struktur der VAO ab.
Der Z-score von unter 15 für MurB (Benson et al., 1997) kann dadurch erklärt werden, daß
es bei diesem Enzym nur homologe für die an der FAD-Bindung beteiligten Domänen gibt.
Tabelle 17
Ergebnisse der DALI-Suche mit 6HDNO und Art der FAD Bindung.
Protein
Z-score /
rmsdb
Prozentsatz der
überlagerten
Reste
% Identität der
überlagerten
Reste
Kovalente
Bindung
zum FAD
PDB-Code
Cytokinin Dehydrogenase
30.5 / 3.3
86 (91)
17
His105-Nδ1
1W1O
Cholesterol Oxidase Typ 2
23.3 / 3.3
72 (86)
14
His121-Nδ1
1I19
p-Cresol Methylhydroxylase
22.1 / 4.0
78 (89)
17
Tyr384-Oη
1DII
Vanillyl-Alkohol Oxidase
21.6 / 3.9
73 (88)
15
His422-Nε2
1QLT
D-Lactat Dehydrogenase
19.1 / 4.0
72 (80)
10
keine
1F0X
14.5 / 3.7
76 (57)
11
keine
2MBR
MurB
a
c
Die Zahlen in der Klammer beziehen sich auf 6HDNO mit ihren 459 Aminosäureresten.
Bei mehr als 25 Polypeptidfragmenten.
c
Bei MurB fehlt die Domäne III. Der Nächste Eintrag hat einen Z-score unter 6.0 und damit keine
signifikante Verwandtschaft zur 6HDNO.
b
103
Wie aus Tabelle 17 deutlich wird, überlagern mindestens 80% der 6HDNO Reste
mit den ersten fünf homologen. Dazu werden die Polypeptidketten dieser Enzyme
allerdings in mindestens 25 Fragmente gespalten. Im Gegensatz zu der hohen strukturellen
Verwandtschaft der Enzyme der PCMH-VAO Familie steht die mit maximal 17% geringe
Sequenzhomologie. Aufgrund von Sequenzvergleichen mit dem Programm BLAST
(Altschul et al., 1997) war die 6HDNO allerdings schon vorher (Fraaije, et al., 1998)
dieser Familie zugeordnet worden.
Zur strukturellen Charakterisierung der Sequenzhomologen Enzyme der 6HDNO
wurde ein strukturbasiertes alignment der beiden Enzyme durchgeführt, das in
Abbildung 35 gezeigt ist. Dazu wurden jeweils die FAD bindenden Domänen I, IIa und IIb
beziehungsweise die Substratbindungsdomäne III der 6HDNO mit dem Programm
LSQMAN auf eines der Sequenzhomologen geschoben und die Abstände der überlagerten
Reste berechnet. Anschließend wurden alle Überlagerungen mit Hilfe des Programms Coot
dargestellt und von Hand überprüft, korrigiert und ergänzt.
Wie anhand dieses alignments zu erkennen ist, liegen hauptsächlich im Bereich der
FAD-Bidungsdomänen Cα-Atome der Homologen innerhalb einer Distanz von 3 Å zum
korrespondierendem 6HDNO-Cα-Atom. Das für die Familie typische FAD-Bindungsmotiv
ist
von
der
Rossmann-Faltung
abgeleitet.
Vor
allem
die
Lage
der
Sekundärstrukturelemente stimmt dort größtenteils überein, wohingegen es große
Unterschiede in der Lage der verbindenden loops gibt. Diese Unterschiede sind in der
Substratbindungsdomäne viel deutlicher, wo die loops durch Insertionen zusätzlich noch in
Ihrer Länge variieren. Das zentrale Sekundärstrukturmotiv mit dem 7-strängigen
β-Faltblatt und den umgebenden α-Helices ist jedoch bei allen Mitgliedern der Familie
vorhanden.
104
β1
α1
α2
β3
β4
.
.
.
. β2
.
.
.
.

6HDNO
1
mvssKLATPL-SIQGEVIYPD-------------DSGFDAIA---NIWDGR-----HLQ-RPSLIARCLSAGDVAKSVRYACDN----GLEISVRSGGHNP--NG---YAT--N----D------G-GIVLDLR 89
CKX
46
---------------KLRTD--------------SNATAAAS---TDFGNI-----TSA-LPAAVLYPSSTGDLVALLSAANS-TPGWPYTIAFRGRGHSL--MG---QAF--A----P------G-GVVVNMA 122
BCO2
62
----TPPNFPNDI---ALFQ-----------------QA--Y---QNWSKE-----IMLDAT-WVCSPKTPQDVVRLANWAHEH----DYKIRPRGAMHGW--TP---LTV--EKGANV------EKVILADTM 143
PCMH
33
----------------NVLVE-------------SDQLVPYN---KIMM-PVENAA-HA--PSAAVTATTVEQVQGVVKICNEH----KIPIWTISTGRNFG-YG---SAAPVQ----R------G-QVILDLK 111
VAO
36
---------------NVEVISSKDQIVDGSYMKP--------THTHDPHHV-MDQD-YF-LASAIVAPRNVADVQSIVGLANKF----SFPLWPISIGRNSGYGG----AAR-V----S------G-SVVLDMG 124
DLDH
29
---------------HLLTD--------------PAKTARYR---KGFR-S-----GQG-DALAVVFPGSLLELWRVLKACVTA----DKIILMQAANTGL--TE---GST--P----NGNDYDRD-VVIISTL 102
MURB
8
---------------------------------------------WNTFG------IDH-NAQHIVCAEDEQQLLNAWQYATAE----GQPVLILGEGSNV--LFLED----------Y------R-GTVIINR 66
PxxxxxxGRN
β5
β6
α3
β7
α4.
β9
.
.
.
.
.
. α5
. β8
.

6HDNO 90
-LMN------SI-HIDTA--G-–SRARIGGGVISGDLVKEAAK--F--GL-AA--VTGM-H-P--KVGFCGLALNGGVGFLTPK-----------YGLASDNILGATLVTA----T-GDVIYCS---------- 174
CKX
123
-SLGDAAAPPRI-NVSAD--G--RYVDAGGEQVWIDVLRASLA--R--GV-APR-SWTD-Y-L--YLTVGGTLSNAGISGQAFR-----------HGPQISNVLEMDVITG----H-GEMVTCS---------- 214
BCO2 144
THLN------GI-TVNTG--GPVATVTAGAGASIEAIVTELQK--H--DL-GWA-NLPA-P-G--VLSIGGALAVNAHGAA-LPAVGQTTLPGHTYGSLSNLVTELTAVVW-NGTT-YALETYQ---------- 245
PCMH 112
-KMN------KIIKIDPE--M--CYALVEPGVTFGQMYDYIQENNL--PV-ML--SFSA-PSA--IAGPVGNTMDRGVGYT--P-----------YGEHFMMQCGMEVVLA----N-GDVYRTGMGGVPGSNTW 208
VAO
125
KNMN------RVLEVNVE--G--AYCVVEPGVTYHDLHNYLEANNLRDKL-WL--DVPD-L-G--GGSVLGNAVERGVGYT--P-----------YGDHWMMHSGMEVVLA----N-GELLRTGMGALPDPKRP 223
DLDH 103
-RLD------KL-HVLGK--G--EQVLAYPGTTLYSLEKALKP--L--GR-EP--HSVIGS-SCIGASVIGGICNNSGGSL-VQ-----------RGPAY--TEMSLFARINEDGK-LTLVNH-LGIDLGETPE 200
MURB
67
--IK------GI-EIHDEPDA--WYLHVGAGENWHRLVKYTLQ--E--GMPGLEN--LA-L-I--PGCVGSSPIQNIGAYGV---------------ELQRVCAYVDSVEL----ATGKQVRLTLTAKECRFGY 160
RxxxxxxExxx--xYxxVxxGxxxxxxxxY
GxxxxxxxGY
V
β10
α7
. α6
.
.
. β11
.
.

6HDNO 175
---------------------------------------------------DD---ERPELFWA-VRGAGPNFGVVTEVEVQLYELPRKMLAGFITWAPSVSELAGLLT-------SLLDALNEM-A--D---- 239
CKX
215
---------------------------------------------------KQ---LNADLFDA-VLGGLGQFGVITRARIAVEPAPARARWVRFVYTD-----FAAFS-------ADQERLTA------PRPG 275
BCO2 246
---------------------------------------------------RN---—-DPRITP-LLTNLGRC-FLTSVTMQAGPNFR-QRCQSYTDIP----WRELFAPKGADGR-TFEKFVAES-------- 307
PCMH 209
QIFK-----------------------------------------------WGYGP---TLDGM-FTQA--NYGICTKMGFWLMPKPPVFKPFEVIFED----EA-DIV-------EIVDALRPL-RMSN---- 272
VAO
224
ETMGLKPEDQPWSKIAHLFP-------------------------------YGFGP--Y-ID-GLF--SQSNMGIVTKIGIWLMPNPRCYQSYLITLPK-----DGDLK-------QAVDIIRPL-R--LGMAL 305
DLDH 201
QILSKLDDDRIKDDDVRHDGRHAHDYDYVHRVRDIEADTPARYNADPDRLF------------E-SSGCAGK-LAVFAVRLDTFEAEKNQQVFYIGTN--------QPE-------VLTEIRRHI-L------- 297
MURB 161
RDSIFKHEYQDR-------------------------------------------------------------FAIVAVGLRLPK------------------------------------------------- 182
GxxL
β12 .
β13 .
.

6HDNO 240
--------HI--YPSVFVGVDE--------------------------------------------------------------------------NRAPSVTVCVGHL-G---------G------------- 266
CKX
276
GGGASFGPMS--YVEGSVFVNQSLATDLANTGFFTDADVARIVALAGERRNA----------------------------------------------TTVYSIEATLN-YDNATAAAAAV------------- 346
BCO2 308
---------G--GAEAIWYP--FT---------------------------------------------------------------------------EKPWMKVWTV-S---------PTKPDSSNEVGSLG 343
PCMH 273
--------TIPNSVVIAST---LWEAGSAHLTRAQYTTEPGHTPDSVIKQMQKDTGMG------------------------------------------AWNLYAALY-GTQEQ-----V------------- 334
VAO
306
--------QN--VPTIRHIL--LDAAVLGDKRSYSSRTEPLSDEELDKIAKOLNLG--------------------------------------------RWNFYGALY-GPEPI-----R------------- 364
DLDH 298
--------LPV-AGEYMHRD--IYDIAEYGKDTFLMIDKLGTDKMPFFFNLKGRTDAMLEKVKFFRPHFTDRAMQKFGHLFPSHLPPRMKNWRDKY----EHHLLLKMAG-D--------G------------- 400
MURB
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------L
β14 .
α9
. α8
.

6HDNO 267
------------------------------------------------------------------LDIAERDIARLRG-LG-R-TVSDSIAVR--------------------------------SYDEVVAL 299
CKX
347
------------------------------------------------------------------DQELASVLGTL---SY-V-EGFAFQRDV--------------------------------AYAAFLDR 377
BCO2 344
SAGSLVGKPPQAREVSGPYNYIFSDNLPEPITDMIGAINAGNPGIAPLFGPAMYEITKLGLAATNA-----------------------NDI-WG-------------------------------WSKDVQF- 421
PCMH 335
------------------------------------------------------------------DVNWKIVTDVFKK-LGKG-R--IVT---QEEAGDTQPFKYRAQLMSGVPNLQEFGLYNWR-------- 387
VAO
365
------------------------------------------------------------------RVLWETIKDAFSA-IP-GVK--FYF---PEDTPENSVLRVRDKTMQGIPTYDELKWIDWL-------- 417
DLDH 401
------------------------------------------------------------------VGEAKSWLVDYFKQAE------GDFFVC--------------------------------TPEEGSKA 430
MURB
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------β15
α10 .
β16.
β17 .
. α9
.
.
.

6HDNO 300
NA--EVGSFE---------------DGMSNLWIDREIA---------------------MPNARFAEAIAGN--LD------------KF-------VSEPASGGS-VKLEIE-GMP--FGNP---------K- 360
CKX
378
VH--GEE----------VALNKLGLWRVPHPWLNMFVP---------------------R---SRIADFDRGVFKG------------IL---QG--TD------IVGPLIVY-PLNKSMW-----------DD 440
BCO2 422
YIKA-----------------------LRLTEGGGAVV-------------TSRANIAT-VINDFTEWFHER--IEEFYRAKGEFPLN-------------------GPVEIR-CC---GLDQAADVKVPSV-- 492
PCMH 388
-------------------------GGGGSMWFAPVS---------------------EVRGSECKKQAAMA--KR------------VLHKYGLDY-----------VAEFI-VAP----------------- 432
VAO
418
-------------------------PNGAHLFFSPIAK---------------------VSGEDAMMQYAVT--KK------------RCQEAGL----------D-FIGTFT-VGM----------------- 462
DLDH 431
FL--HRFAAAGAAIRYQAVHSDEVE---DILALDIALRRNDTEWYEHLPPEIDSQLVHK-------------------------------------------------LYYGHFMC------------------ 492
MURB
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------β18
α11
β19 .
α13
.
.
.
.
. α12
.
.

6HDNO 361
RTP--ARH----------R---DAMGVLALAE-WSGAAPGS-E-KYPELARELDAALLRAGV----------TTSGFGLLNNNSEV------------T--AEMVAEVYK-------PEVYSRLAAVKREYDPE 445
CKX
441
GMS--AAT----------PSEDVFYAVSLLFS-S-----ND-LARLQEQNRRILRFCDLAGIQ---------YK--TYL---A--R------------HTDRSDWVRHFG-------AAKWNRFVEMKNKYDPK 520
BCO2 593
GPPTISATRPRPDHPDWD----VAIWLNVLGVP---------G---TPGMFEFYREMEQWM--RSHYNNDDA-TFRP-EWSKG--WAFGPDPYTDNDIV--TNKMRATYIEGVPTTE--NWDTARARYNQIDPH 591
PCMH 433
----------------------RDMHHVIDVL-YDRTNPEETK-RADACFNELLDEFEKEG------------YAVY---------RVNTR-------F--QDRVAQSYG-------PVKRKLEHAIKRAVDPN 505
VAO
463
----------------------REMHHIVCIV-FNKK---D-L-IQKRKVQWLMRTLIDDC--AANG------W-GEYRT--HLA-------------F--MDQIMETYNWNN----SSFLRFNEVLKNAVDPN 538
DLDH 493
------------------------YVFHQDYI--VKKGVDV-H-ALKEQMLELLQQRG---------------AQYPAEH------NVGHLYKA--------------------------PETLQKFYRENDPT 551
MURB
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------R
.

6HDNO 446
NRF-R-H-----NYNIDPEgs 459
CKX
521
RLLSP-G-----Q-DIF---- 530
BCO2 592
RVF-T-NGFMDK--LLP---- 604
PCMH 506
NIL-APG-----RSGID---- 516
VAO
539
GII-APG-----KS------- 546
DLDH 552
NSM-N---------------- 555
MURB
---------------------
Abbildung 35
Strukturbasiertes Sequenzalignment der 6HDNO mit Cytokinin Dehydrogenase (CKX,
früher Cytokinin Oxidase) aus Arabidopsis thaliana, Cholesterol Oxidase Typ 2 (BCO2)
aus Brevibacterium sterolicum, p-Cresol Methylhydroxylase aus Pseudomonas putida
Vanillyl-Alkohol Oxidase aus Penicillium simplicissimum, D-Lactat Dehydrogenase
(DLDH) und MurB beide aus Escherichia coli. Diejenigen Reste, die innerhalb einer
Cα-Distanz von 3 Å überlagert wurden, sind unterstrichen. Jeder zehnte Rest der 6HDNO
ist mit einem Punkt markiert. Die graphisch gezeigte Sekundärstruktur ist diejenige der
6HDNO (Abbildung 28). Reste die eine kovalente Bindung zum Kofaktor FAD ausbilden
sind grau hinterlegt. In der untersten Zeile sind die in der PCMH-VAO Strukturfamilie
konservierten Motive und Reste in einer fetten Schreibweise aufgeführt (Dym &
Eisenberg, 2001).
Wie in Tabelle 17 und in Abbildung 35 zu sehen ist, bindet der FAD-Kofaktor in
den vier nächsten Verwandten der 6HDNO auch kovalent. Die nächsten Homologen sind
sogar über das gleiche Histidin Nδ1 Atom kovalent an die re-Seite des FAD gebunden.
Wie im alignment zu sehen ist, stimmen die Histidin Positionen sogar mit der von His72
105
der 6HDNO überein. Diese liegen in dem als PP-loop (Mattevi et al., 1997) bezeichneten
Bereich, welcher eines der konservierten Motive der PCMH-VAO Strukturfamilie ist
(Dym & Eisenberg, 2001). Die p-Cresol Methylhydroxylase und die Vanillyl-Alkohol
Oxidase dagegen binden über ein Tyrosin bzw. das Nε2 Atom eines Histidins an das FAD.
Diese beiden Reste befinden sind allerdings in der Domäne III und binden über die si-Seite
des Flavins.
Interessanterweise ist das Isoenzym der Cholesterol Oxidase Typ 2 aus
Brevibacterium sterolicum, die Cholesterol Oxidase Typ 1 (Sampson & Vrielink, 2003)
strukturell verwandt mit der 6HLNO. Beide Enzyme gehören zur großen Familie der
Glutathion-Reduktasen (Schenk & Decker, 1999; Dym & Eisenberg, 2001). Die beiden
Cholesterol Oxidasen katalysieren allerdings dieselbe Reaktion mit dem gleichen Substrat
wohingegen die beiden Oxidasen aus A. nicotinovorans das jeweilige Enantiomer von
6-Hydroxy-Nikotin selektiv umsetzen.
4.5.6
FAD-Bindung und das aktive Zentrum
Wie schon mehrfach erwähnt, ist das FAD über die kovalente Bindung zwischen
dem C8α und dem Nδ1 Atom des His72 an die Domäne I gebunden und nicht wie früher
angenommen über das Nε2 Atom (Abbildung 23). Das FAD ist außerdem nichtkovalent
zwischen Domäne I und II eingebunden, zu denen es Kontakflächen von 360 Å2 bzw.
470 Å2 ausbildet. Wie in Abbildung 36 gezeigt, ist der Isoalloxazinring über das His72 von
der re-Seite her fixiert. Das andere Ende des Ringsystems bildet Wasserstoffbrücken zu
Met129-N, Val144-N, Val144-O, Asn413-Nδ2 und zu der 2´-Hydroxylgruppe des Ribitols
aus. Diese feste Einbindung führt zu einer Krümmung des Isoalloxazinrings um etwa 10°,
welche auch bei anderen Flavoproteinen mit kovalenter FAD-Bindung beobachtet wurde
(Fraaije & Mattevi, 2000). Die Phosphate werden durch die fünf Amide der Reste 69 bis
73 aus dem PP-loop fixiert. Die beiden negativen Ladungen werden, da es keine positiven
Reste für den Ladungsausgleich über kurze Strecken gibt, über die weiter entfernten
Arginine 68 und 89 (7 Å bzw. 10 Å) elektrostatisch ausgeglichen.
Die Hydroxylgruppen der Ribose liegen in einer allgemein unpolaren Umgebung
und bilden Wasserstoffbrücken zu Val67-O und His450-O aus. Durch die 2´-endo
Konformation der Ribose wird die Base Adenin weiter von den Phosphaten weggeschoben.
Das Adenin liegt in einer nonpolaren Bindungstasche, welche von den Resten Val67,
Leu88, Leu140, Pro190 und Val195 gebildet wird. Die FAD-Bindung wird durch
106
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Base und den Resten Ser69-Oγ, Gly107-O,
Val195-N und 195-O komplettiert.
Abbildung 36
Stereodarstellung der FAD-Bindung. FAD ist in gelb und die Wasserstoffbrücken sind als
gepunktete Linien dargestellt. Halos um ein Atom markieren einen Kettenabbruch.
Insgesamt ist das FAD in einer unpolaren Umgebung fest gebunden. Die
Anbindung wird durch die Lage zwischen den beiden Domänen I und II unterstützt. Im
Gegensatz zu den meisten Flavoproteinen (Fraaije & Mattevi, 2000) gibt es bei der
6HDNO keine ganze (Lys oder Arg) oder partielle Ladung (N-Terminus einer
α-Helix oder Peptid-N-cluster) in der Nähe des N1-C2=O2-Motiv des Flavins. Diese
positive Ladung stabilisiert normalerweise die negative Ladung des reduzierten Flavins
und
erhöht
damit
dessen
Redoxpotential.
Auch
eine
oft
beobachtete
Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Peptid und dem N5 Atom des Isoalloxazinrings
ist nicht vorhanden, wodurch das Redoxpotential erhöht wird (Ghisla & Massey, 1989).
Durch die Krümmung und die kovalente Bindung des Isoalloxazinrings kommt es zu einer
weiteren Potentialerhöhung (Fraaije et al., 1999).
Das aktive Zentrum liegt in einer großen Bindungstasche auf der si-Seite des
Flavins. Auf der anderen Seite wird die Tasche von dem großen siebensträngigen
β-Faltblatt der Domäne III begrenzt (Abbildung 29). Die Helix α9 deckt den Eingang zum
aktiven Zentrum teilweise ab. Wie schon aus dem B-Faktorverlauf (Abbildung 24) deutlich
wurde ist diese Helix sehr beweglich und konnte nur deshalb in der Röntgenstruktur
beobachtet werden, da sie bei einem Molekül der Kristallform-3 an einem Kristallkontakt
beteiligt ist und dadurch stabilisiert wird. Die Helix α9 könnte in vivo als Tor für das aktive
Zentrum fungieren und dieses vom Lösungsmittel abtrennen. Hier ist die Bindungstasche
107
allerdings mit acht Wasser Molekülen gefüllt, welche einen durchschnittlichen B-Faktor
von 54 Å2 haben. Dieser liegt damit um einiges höher als der durchschnittliche B-Faktor
der Peptidkette (29.5 Å2) und den anderen Wassermolekülen (42 Å2). Eines dieser
Wassermoleküle bildet eine gute Wasserstoffbrückenbindung zum N5 Atom des
Isoalloxazinrings aus (Abbildung 36), es ist aber nur lose mit anderen Wassern und
Peptidseitenketten verbunden. Für den Hydridtransfer müssen diese Wasser durch das
Substrat ersetzt werden.
4.5.7
Autoflavinylierung
Eine kovalente Bindung zwischen einem FAD und einem Polypeptid wurde
erstmals beim Membranprotein Succinat-Dehydrogenase beobachtet (Singer et al., 1956).
Später wurde eine ähnliche Bindung bei der 6HDNO entdeckt. Da der Umgang mit diesem
löslichen Protein wesentlich einfacher war, wurden anhand der 6HDNO umfangreiche
Studien (siehe Einleitung Kapitel 1.1.3) zur kovalenten Flavinylierung durchgeführt
(Mewies et al., 1998). Abschließend wurde für die Flavinylierung ein autokatalytischer
Mechanismus vorgeschlagen, der ohne die Beteiligung dritter Reaktanden auskommt
(Brandsch & Bichler, 1991).
Abbildung 37
Stereodarstellung der Umgebung des His72, welches autokatalytisch eine kovalente
Bindung zum FAD (gelb) ausbildet. Der grüne Teil von Lys 132 wurde in eine mögliche
Position modelliert, welche den Protonentransfer zwischen His72 und His130 ermöglicht.
Die in der Kristallstruktur beobachtet Konformation des Lysins ist in orange dargestellt.
Wasserstoffbrücken sind als gepunktete schwarze Linien und Kettenabbrüche als Halos
um ein Atom dargestellt.
108
Es wird angenommen, daß das oxidierte Isoalloxazinringsystem nach der Abgabe
eines Protons ein Quinonmethid Tautomer ausbildet (Edmondson & Newton-Vinson,
2001). Anschließend kommt es nach dem Angriff eines Nukleophils zur Ausbildung einer
kovalenten Bindung, das FAD wird reduziert und ein Proton wird am N5 Atom
hinzugefügt. Dementsprechend entsteht immer dann eine solche Bindung, wenn das
Quinonmethid in der Anwesenheit eines Nukleophils stabilisiert wird.
Die benötigte FAD Deprotonierung erfolgt bei der 6HDNO durch das His72-Nδ1.
Wie in Abbildung 37 dargestellt kann das eingefangene Proton über His72-Nε2, Lys132,
Trp31 und His130 abtransportiert werden. Die Protonenbewegung von Nδ1 zu Nε2 des
His72 wird wahrscheinlich von den Indol-π-Elektronen des Trp31 ermöglicht, welche auch
das Quinonmethid Tautomer stabilisieren. Der abschließende nucleophile Angriff des
His72-Nδ1 am C8α des Flavins führt zur Ausbildung der kovalenten Bindung. In
Abbildung 38 ist der vorgeschlagene Reaktionsmechanismus der Autoflavinylierung
schematisch dargestellt.
Abbildung 38
Vorgeschlagener Reaktionsmechanismus für die Autoflavinylierung der 6HDNO. Der
Mechanismus verläuft über ein Quinonmethid Intermediat. Am N1 des FAD ist kein
Proton verfügbar. Zusätzlich zu dem angezeigten Transfer, wandert vermutlich ein Proton
vom Nδ1 (N1) Atom entlang der π-Elektronen des Trp31 zum Nε2 (N3) Atom des His72
(Abbildung 37).
Da die nächsten Verwandten der 6HDNO sehr ähnliche Bindungen ausbilden
(Tabelle 17) wurde überprüft, ob die Umgebung der Methylgruppen der entsprechenden
Flavine Gemeinsamkeiten aufweisen. Außer bei Cholesterol Oxidase Typ 2, mit dem
konservierten Rest Trp31, konnten keine Ähnlichkeiten festgestellt werden. Für die
Vanillyl-Alkohol Oxidase ist auch ein Autoflavinylierungsmechanismus vorgeschlagen
worden, bei dem ein zweites Histidin beteiligt ist (Fraaije et al., 2000). Das zweite Histidin
sitzt dort allerdings hinter dem ersten und ist mit diesem direkt über eine
109
Wasserstoffbrücke verbunden. Daraus kann der Schluß gezogen werden, daß die kovalente
Bindung an das Flavin eine einfache chemische Reaktion ist, die von vielen
Proteinumgebungen ermöglicht werden kann. Dies führt zu einer geringen Konservierung
der Reste im Bereich der kovalenten Bindung während der Evolution.
4.5.8
Katalytischer Mechanismus und Enantioselektivität
Die 6HDNO katalysiert die Oxidation von 6-Hydroxy-D-Nikotin (6HDN) an der
Position 2 des Pyrrolidinrings (Abbildung 1). Dabei wird der kovalent gebundene Kofaktor
FAD reduziert. Diese Reaktion wird durch das enantiomer des Substrates (6-Hydroxy-LNikotin) kompetitiv inhibiert. Um die Lage von Substrat und Inhibitor in der großen
Bindungstasche des aktiven Zentrums auf der si-Seite des Flavins zu bestimmen, wurden
zahlreiche Tränk- und Kokristallisationsexperimente mit 6HDNO Kristallen der Form-3
bzw. Kristallisationsansätze unter allen bekannten Bedingungen durchgeführt. Da das
Substrat 6HDN nicht verfügbar war wurde dazu der Inhibitor 6-Hydroxy-L-Nikotin
benutzt.
Allerdings
wurden
aus
den
Kokristallisationsexperimenten
keine
röntgentauglichen Kristalle erhalten und die Struktur aus den Tränk-Experimenten zeigte
im aktiven Zentrum keine Elektronendichte für den Inhibitor. Deshalb wurden die mit dem
PRODRG2-Server (Schüttelkopf & van Aalten, 2004) erstellten und energieminimierten
Modelle vom Substrat und Inhibitor von Hand im aktiven Zentrum platziert.
Abbildung 39
Stereodarstellung der vorgeschlagenen Reaktions- und Inhibitionsgeometrie im aktiven
Zentrum der 6HDNO. Das Modell des gebundenen Substrats 6-Hydroxy-D-Nikotin
(6HDN) ist in grün, das des enantiomeren Inhibitors 6-Hydroxy-L-Nikotin ist in
transparent orange dargestellt. Der natürliche Hydrid und Protonentransfer ist durch rote,
und Wasserstoffbrücken durch schwarz gepunktete Linien dargestellt. Halos um ein Atom
markieren einen Kettenabbruch.
110
Wie in Abbildung 39 zu sehen ist, wurde die Position des Substrats 6HDN so
gewählt, daß zwischen dem C2’ Atom und dem N5 Atom des FAD ein Abstand von 3.6 Å
vorlag und der Winkel N10-N5-C2’ 117° war. Diese Werte entsprechen denen von anderen
Flavoproteinen, welche einen Hydridtransfer vollziehen (Fraaije & Mattevi, 2000). Die
C2’ Position ist ideal für den Hydridtransfer, da das entstehende Carbokation sehr gut über
die Ladungsbeiträge vom Hydroxypyridinring und vom N1’ Atom des Pyrrolidinrings
stabilisiert wird (Abbildung 40). Am C3’ Atom, das auf der anderen Seite der eingeführten
Doppelbindung liegt, wäre eine solche Stabilisierung nicht möglich. Außer durch die
Position des C2’ zum N5 wird die Lage des 6HDN im aktiven Zentrum auch durch die
Wasserstoffbrücken vom Pyridin-Stickstoff und vom Hydroxyl zum Glu350-Oε2 bzw.
Lys348-Nζ beeinflußt (Abbildung 39).
Wie im postulierten Reaktionsmechanismus in Abbildung 40 gezeigt, wird nach
dem Hydridtransfer ein Proton vom C3’ auf Glu352-Oε1 übertragen. Dieses Proton wird
wahrscheinlich über Glu350, welches Teil eines Glu-Arg Wasserstoffbrückennetzwerks an
der Unterseite des aktiven Zentrums ist (Abbildung 39), an das Lösungsmittel abgegeben.
Die beiden Glutamate stabilisieren das instabile Carbokation, wodurch der Hydridtransfer
ermöglicht wird.
Die Modellierung des L-Enantiomers von 6HDN, 6-Hydroxy-L-Nikotin, war nur in
einer unproduktiven Konformation möglich. Dabei wurden das N1 Atom und die
6-Hydroxy Gruppe des Pyrrolidinrings, sowie das C2’ auf die gleichen Positionen wie
beim 6HDN gelegt. Diese sterisch sehr ähnliche Konformation ermöglicht auch einen
Hydridtransfer. Der Unterschied zwischen den Enantiomerkonformationen führt dazu, daß
das C3’ Atom jetzt auf der Position des metylierten N1’ liegt. Da an dieser Position aber
keine Base für die Protonabstraktion verfügbar ist, wird die Umsetzung des Enantiomers
nach der Hydridübertragung gestoppt. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, daß die
6HDNO vom L-Enatiomer kompetitiv inhibiert wird. Die Inhibitionskonstante ist mit
1.5 mM wesentlich höher als die Michaelis-Menten Konstante der 6HDNO von 0.05 mM
(Schenk & Decker, 1999). Deshalb wird angenommen, daß das L-Enantiomer mit seinem
um 180°-gedrehten Methylpyrrolidinring nicht so gut in die Bindungstasche des aktiven
Zentrums paßt wie das Substrat 6HDN.
Abbildung 40
111
Postulierter schematischer Reaktionsmechanismus der 6HDNO. Der Protonierungszustand der beiden Glutamate wechselt während der Reaktion, wobei die abstrahierten
Protonen ans Lösungsmittel abgegeben werden.
Wie schon in der Einleitung (Kapitel 1.1.2) erwähnt arbeitet das L-Enzym
(6HLNO) genau umgekehrt: es setzt das L-Enantiomer um (KM = 0.02 mM) und wird
durch 6HDN inhibiert (KI = 0.1 mM). Die Struktur der 6HLNO ist zwar gelöst (Kachalova
et al., 2000), die Strukturkoordinaten sind bis jetzt aber nicht publiziert worden und nicht
erreichbar. Um ein Modell der 6HLNO zu erstellen wurde deshalb eine BLAST-Suche
gegen die PDB-Datenbank zur Ermittlung von Sequenzhomologen mit bekannter Struktur
durchgeführt. In Tabelle 18 sind die Ergebnisse dieser Suche aufgelistet, woraus deutlich
wird, daß nur die ersten drei eine signifikante Sequenzhomologie aufweisen. Eine
Überlagerung der Strukturen dieser nächsten Verwandten zeigte, daß sich die Faltung der
drei Strukturen, auch im aktiven Zentrum nur minimal voneinander unterscheiden. Von der
Polyamin Oxidase (PAO) ist bekannt, daß sie eine Strukturhomologe der 6HLNO ist
(www.biochemie.uni-freiburg.de/decker/abstract.htm). Mit einer DALI-Suche wurde
gezeigt, daß die PAO der nächste Strukturverwandte (Z-score = 30.5) der Monoamin
Oxidase B (MAO-B) ist. Deshalb wurde die Struktur der MAO-B, welche die nächste
Sequenzverwandte der 6HLNO ist (25% Sequenzidentität), als Vorlage für das 6HLNOModell benutzt. Das Modell wurde wie in Kapitel 3.7.1 beschrieben erstellt.
112
Tabelle 18
Ergebnis einer BLAST-Suche mit der 6HLNO gegen die PDB-Datenbank
Protein
PDB-code
Score
e-Wert
Monoamine Oxidase B (MAO-B)
1GOS
77
5e-15
L-Aminoacid Oxidase
1F8R
45
3e-05
Polyaminoxidase (PAO)
1B37
40
8e-04
UDP-Galaktopyranose Mutase
1I8T
31
0.3
In Abbildung 43 ist das aktive Zentrum des 6HLNO-Modells abgebildet. In der
Substratbindungstasche liegen im Gegensatz zur 6HDNO hauptsächlich unpolare Reste.
Eine Ausnahme bildet der Rest Asp199, der das Gln206 der MAO-B ersetzt. Aus
denselben Gründen wie beim 6HDN wird ebenfalls ein Hydridtransfer vom C2’ des
Substrates (L-Enantiomer) auf das N5 des FAD angenommen. Die Lage des Substrates im
aktiven Zentrum wurde auch hier durch die vorbestimmte Position des C2’ stark
beeinflußt. Interessanterweise liegt dadurch das C3’ Atom des L-Enantiomers in der Nähe
des Asp199, welches nach dem Hydridtransfer als Base fungieren könnte. Da die Base in
diesem Fall auf der anderen Seite des Pyrrolidinrings liegt, wird diesmal die Reaktion des
D-Enantiomers (6HDN) nach dem Hydridtransfer gestoppt. Diese Beobachtungen führen
zu dem Schluß, daß Aufgrund der chemischen Struktur des 6-Hydroxy-Nicotin sowohl die
6HLNO als auch die 6HDNO den gleichen Hydridtransfer verwenden und zwischen den
sterisch sehr ähnlichen L- und D-Enantiomeren nur durch die Position der Base auf der
jeweiligen Seite des Pyrrolidinrings unterscheiden.
Abbildung 41
Stereodarstellung der Reaktions- und Inhibitionsgeometrie im aktiven Zentrum eines
6HLNO Modells. Das Modell wurde mit SWISS-Modell (Guex & Peitsch, 1997) erstellt
und beruht auf der Struktur der homologen Monoamin Oxidase B. Das Substrats
6-Hydroxy-L-Nikotin ist in grün, der enantiomere Inhibitor 6-Hydroxy-D-Nikotin ist in
transparent orange dargestellt. Der natürliche Hydrid und Protonentransfer ist durch rote,
und Wasserstoffbrücken durch schwarz gepunktete Linien dargestellt. Halos um ein Atom
markieren einen Kettenabbruch.
113
In Arthrobacter nicotinovorans werden in Gegenwart von Nikotin sowohl das
L-Enzym als auch das D-Enzym exprimiert (Gloger & Decker, 1969). Aufgrund der
gegenseitigen Inhibition wird die 6HDNO vom biosynthetisch zugänglichem und damit als
einzigen in größeren Mengen vorliegenden L-Enantiomer inhibiert. Nachdem das meiste
L-Nikotin verbraucht wurde kann die 6HDNO das noch vorhandene D-Nikotin umsetzen.
Andererseits ist das aktive Zentrum der 6HDNO groß genug um auch andere Substrate als
6HDN darin zu binden. Daher ist es möglich, daß das Hauptsubstrat der 6HDNO bis jetzt
noch nicht entdeckt wurde.
5.1 Planung der Mutanten
115
5 Ergebnisse und Diskussion zur PGAL
5.1.1
Ausgangpunkt der Mutantenplanung
In dieser Arbeit wurden aufbauend auf Erfahrungen und Ergebnissen aus
vorangegangenen Diplomarbeiten (Rothweiler, 2001; Kötter, 2002) neue Mutationen zur
Verstärkung des f-f-Kontakts (Kristallform A) geplant. Bei dem f-f-Kontakt handelt es sich
um den mit 633 Å2 zweitgrößten Kontakt in den PGAL-Kristallen (Wiesmann & Schulz,
1997). Durch die gezielte Mutagenese der Kontaktfläche sollte durch gesteigerte ProteinProtein-Wechselwirkungen eine Dimerisierung in Lösung erzielt werden.
Wie in Kapitel 1.2.1 bereits erwähnt wurde, zeichnen sich natürliche ProteinKontaktflächen im Vergleich zur restlichen Oberfläche durch eine größere Dichte an
hydrophoben Aminosäuren aus. Ladungsbezogene Wechselwirkungen sind nicht so stark
wie die hydrophoben Wechselwirkungen dafür aber spezifischer. Da aber in der
Diplomarbeit (Kötter, 2002) durch Verstärkung der polaren Wechselwirkungen keine
Dimersisierung erzielt werden konnte, wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, die
Hydrophobizität der Oberfläche im Kontaktbereich schrittweise zu erhöhen, ohne dabei
ladungsbezogene Wechselwirkungen zu verlieren.
Als Ausgangspunkt für die Mutagenese diente die Mutante KEDWFF-Nr.1 (siehe
unten: Tabelle 20), welche zu Beginn der Doktorarbeit hergestellt wurde und eine neue
Kombination von bekannten Mutationen (Rothweiler, 2001) darstellt. Wie in Abbildung 42
gezeigt, wird dabei der Kontakt durch den Austausch von drei polaren Resten gegen drei
hydrophobe Reste verstärkt. Die Aminosäurereste der Mutanten D445F und E434F
befinden sich an der zweizähligen Achse des Kontaktes und bilden dadurch hydrophobe
Wechselwirkungen mit sich selbst aus. Die Seitenkette vom W381 erweitert den
hydrophoben Bereich der Kontaktfläche, indem sie den Hohlraum zu den Reste Pro48,
Tyr433 und der Mutante Phe445 des anderen Moleküls schließt, zu denen sie schwache
hydrophobe Wechselwirkungen ausbildet.
116
Ergebnisse und Diskussion zur PGAL
a)
b)
C2
Abbildung 42
Ribbon-Darstellungen des f-f-Kristallkontaktes der PGAL Mutante KEDWFF-Nr.1, mit
den ausgetauschten Aminosäureresten als ball-and-stick Modellen. Die Monomere sind in
unterschiedlichen Farben dargestellt (Gelb/Orange bzw. Rot/Vilolett). Die zweizählige
Achse ist als schwarze Linie eingezeichnet. a) Vollbild der beiden Monomere.
b) Stereodarstellung eines Ausschnittes. Die Oberfläche des unteren Monomers ist grau
transparent dargestellt und erstreckt sich über alle am f-f-Kontakt beteiligten
Aminosäuren. Die Aminosäuren des PGAL-WT sind transparent dargestellt. Die
integrierten Wildtyp Reste P48 und Y433 eines Moleküls sind durch schwarze C-Atome
gekennzeichnet.
Wie aus Tabelle 19 hervorgeht, wird das Interface durch die Mutationen deutlich
größer (von 633 Å2 auf 832 Å2) und hydrophober, wobei nur die intermolekulare
Wasserstoffbrücke zwischen D445 und D443 verloren geht. Die Seitenketten auf den
Positionen 381 und 434 tragen jetzt zu Verstärkung des Kontaktes bei, da sie nicht mehr in
intramolekulare Wechselwirkungen eingebunden sind.
Tabelle 19
Vergleich der intermolekularen Wechselwirkungen am f-f-Kontakt von PGAL-WT und
der Mutante KEDWFF-Nr.1. Die Kontakt-Aminosäuren sind für die beiden Monomere
aufgrund der zweizähligen Achse identisch. Die BASA wurde nach Kapitel 3.7.3
berechnet.
Kontaktaminosäure
Wechselwirkung
K381
intramolekulare Wasserstoffbrücke zu E434
Beitrag zur BASA
pro Monomer [Å2]
51
intramolekulare Wasserstoffbrücke zu K381
76
D445
intermolekulare Wasserstoffbrücke zu D443
99
W381
hydrophobe Wechselwirkung
74
132
147
E434
F434
F445
WT
Mutante
117
Abbildung 43 zeigt das Elutionsdiagramm des abschließenden GPC-Laufes der
Reinigung von KEDWFF-Nr.1. Wie daraus hervorgeht, war es zum ersten Mal gelungen
ein nichtkovalentes PGAL-Dimer in Lösung zu isolieren. Mit Hilfe des Monomer-DimerStandards und durch Bestimmung der Molekularmasse mit der DLS konnte diese Aussage
verifiziert werden. Aus den Rechromatographien der Monomer- und Dimer-Fraktionen in
Abbildung 43 kann abgeleitet werden, daß ein Monomer-Dimer-Gleichgewicht vorliegt,
welches auf der Seite des Monomers liegt.
KEDWFF-Nr.1
3
Dimer rechromatographiert (A 280*10)
Monomer rechromatographiert
Absorption A 280
Monomer-Dimer-Standard
2
1
V0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
Elution [mL]
Abbildung 43
Elutionsdiagramme von GPC-Läufen der PGAL-Mutante KEDWFF-Nr.1 auf einer
Superdex-200-16/60 prep grade Säule. Der Balken unter den peaks markiert die zur
Rechromatographie vereinigten PGAL-Fraktionen, der Pfeil das Ausschlußvolumen (V0).
Die vereinigten Monomer-bzw. Dimer-Fraktionen wurden nach 12 Tagen Lagerung bei
4 °C auf derselben Säule rechromatographiert. Der Monomer-Dimer-Standard ist eine
Mischung aus PGAL-Tandem und PGAL-WT (siehe Kapitel 3.2.7).
Aufgrund des geringen Dimer-Anteils (von etwa 5%) nach der Chromatographie
war die Menge des produzierten Dimers nicht ausreichend für Kristallisationsversuche.
Deshalb wurde versucht das Gleichgewicht, durch Inkubation des Proteins in 1.4 M bzw.
3.6 M Ammoniumsulfat, vom PGAL-Monomer auf die Dimerseite zu verschieben. Die
Elutionsdiagramme der Rechromatographien von inkubierten Monomer-Fraktionen (nicht
gezeigt) ergaben jedoch, daß damit keine Erhöhung des Dimer-Anteiles erreicht werden
konnte. Ausgehend von der PGAL-Mutante KEDWFF-Nr.1, wurden daher zusätzliche
hydrophobe Reste im f-f-Kontakt eingeführt.
118
5.1.2 Planung weiterführender Mutanten
Zur Planung der einzelnen Mutanten wurde das Computerprogramm O (Jones
et al., 1991) verwendet. Damit wurde der 633 Å2 umfassende Kristallkontakt f-f, ausgehend
von der PGAL-Mutante KEDWFF-Nr.1 untersucht. Für weitere mögliche Positionen
wurden die geeigneten hydrophoben Aminosäurereste mit Hilfe einer Simulation der
intermolekularen Wechselwirkungen ausgewählt. Dabei wurde darauf geachtet, daß die
gewünschte Konformation der neuen Aminosäureseitenkette so gut wie möglich einem
Rotamer
entspricht.
Als
Abstände
wurden
für
hydrophobe
Wechselwirkungen
3.5 - 5.0 Å, für Salz- und Wasserstoffbrücken 2.0 - 3.5 Å bzw. 1.8 - 3.0 Å verwendet.
Mutationen der PGAL-Mutante KEDWFF-Nr.1
Auf der Suche nach einer Möglichkeit, den f-f-Kontakt ausgehend von der PGALMutante KEDWFF zu verstärken, ergaben sich drei wesentliche Möglichkeiten.
Beispielsweise kann die große Seitenkette von W43, welche eine Annäherung der beiden
Monomere blockiert, durch eine sterisch viel anspruchslosere Methylgruppe von Alanin
ersetzt werden (WKEDAWFF-Nr.2, Abbildung 44a). Durch diese Mutation am Rand des
Kontaktes können die Reste im Zentrum besser miteinander wechselwirken.
Bei der zweiten Variante wird der Rest D443 zu Leucin mutiert, das dann aufgrund
seiner orthogonalen Stellung zur zweizähligen Achse mit sich selbst hydrophobe
Wechselwirkungen ausbilden kann (KEDDWFLF-Nr.3, Abbildung 44b). Zusammen mit
dem zu Phenylalanin ausgetauschtem Rest 445 entsteht in diesem Bereich ein Netzwerk
aus hydrophoben Wechselwirkungen. Dieses Netzwerk könnte in ähnlicher Weise zur
Spezifität des Kontaktes beitragen wie zuvor die Reste D443 und D445 über ihre
Wasserstoffbrücken.
Der dritte Weg beruht auf einen Austausch des polaren Restes T45 durch
Phenylalanin zu TKEDFWFF-Nr.5 (Abbildung 44c). In Abbildung 45 ist der f-f-Kontakt in
Bereich der durchgeführten Aminosäureaustausche der Mutante TKEDFWFF-Nr.5 im
Vergleich
zum
WT
dargestellt,
wobei
die
Oberfläche
entsprechen
der
Ladungseigenschaften der darunterliegenden Aminosäuren eingefärbt wurde. Wie dort zu
sehen ist wird die Packung des Kontaktes durch den Austausch von polaren zu großen
hydrophoben Aminosäuren deutlich hydrophober und enger.
119
a)
b)
c)
Abbildung 44
Stereo-ribbon-Darstellungen des f-f-Kristallkontaktes der PGAL im Bereich der
zusätzlichen Mutationen von WKEDAWFF-Nr.2 (a), KEDDWFLF-Nr.3 (b) und
TKEDFWFF-Nr.5 (c). Die Aminosäurereste in diesem Bereich sind als ball-and-stick
Modelle und passend zum jeweiligen Monomer in unterschiedlichen Farben dargestellt
(Gelb bzw. Rot). Zur Verdeutlichung der neu eingeführten Reste A43, L443 und F45 sind
die WT Aminosäuren W43, D443 und T45 transparent und die C-Atome aller PGAL-WT
Aminosäurereste in schwarz dargestellt. Die zweizählige Achse ist als schwarze Linie
eingezeichnet. Drei der kürzesten Abstände (Å) zwischen den dargestellten Aminosäuren
sind als gepunktete Linien eingezeichnet.
120
a)
b)
Abbildung 45
Stereo-Oberflächendarstellungen im Bereich des f-f-Kristallkontaktes der PGAL.
Vergleich der Oberflächeneigenschaften von WT (a) und der Mutante TKEDFWFF-Nr.5
(b) mit der vierten Mutation T45F. Die ausgetauschten Aminosäuren des einen Moleküls
sind darin als ball-and-stick Modell dargestellt. Die Positionen an denen ein Austausch
vorgenommen wurde sind in beiden Molekülen eingezeichnet. Die dargestellte
Oberfläche ist im Bereich des f-f-Kontakes anhand der Ladungseigenschaften der
beteiligten Seitenketten eingefärbt: Bei positiv geladenen Seitenketten blau, negativ
geladenen rot, polaren grün und hydrophoben gelb. Die zweizählige Achse ist als
schwarze Linie eingezeichnet.
Mutationen der PGAL-Mutante TKEDFWFF-Nr.5
Mit der Mutante TKEDFWFF-Nr.5 konnte der PGAL-Dimer Anteil erheblich
erhöht werden (siehe unten Abbildung 51). Daraufhin wurde untersucht, welche
Mutationen außer der neu eingeführten T45F für den erhöhten Dimeranteil verantwortlich
sind.
Dazu
wurden
die
Dreifachmutanten
TKEFWF-Nr.7,
TEDFFF-Nr.8
und
TKDFWF-Nr.10 generiert und die GPC-Elutionsdiagramme (Abbildung 53) vermessen.
Diese wiesen T45F den größten Einfluß auf das Dimerisierungsverhalten zu. Weshalb
T45F in den nachfolgenden Mutationen beibehalten wurde.
121
Tabelle 20
Nr.
Übersicht über die generierten Mutanten am f-f-Kontakt. Aufgelistet sind die Positionen
der Aminosäureaustausche sowie der verwendete primer und das Ausgangsplasmid. Zur
Verdeutlichung der neu eingeführten Reste sind die Aminosäuren, welche mit denen
Ausgangsmutanten KEDWFF-Nr.1 und TKEDFWFF-Nr.5 übereinstimmen gelb bzw.
grün hinterlegt. Die Mutanten sind in chronologischer Reihenfolge durchnumeriert.
PGAL-Mutante
43
45
381
383
434
443
445
0
WT
W
T
K
E
E
D
D
K381Wa
1
KEDWFF
-
-
W
-
F
-
F
K381Wa
EDFFa
2
WKEDAWFF
A
-
W
-
F
-
F
W43A-a
Nr.1
3
KEDDWFLF
-
-
W
-
F
L
F
D443L
Nr.1
4
KEEDWFFF
-
-
W
F
F
-
F
E383F-a
Nr.1
5
TKEDFWFF
-
F
W
-
F
-
F
T45F
Nr.1
6
TEFF
-
F
-
-
F
-
-
T45F
EFa
7
TKEFWF
-
F
W
-
F
-
-
K381Wa
Nr.6
8
TEDFFF
-
F
-
-
F
-
F
T45F
EDFFa
9
KDWF
-
-
W
-
-
-
F
K381Wa
DFa
10
TKDFWF
-
F
W
-
-
-
F
T45F
Nr.9
11
TKEDFWMF
-
F
W
-
M
-
F
F434M
Nr.5
12
TKEDFIFF
-
F
I
-
F
-
F
K381I
Nr.8
13
TKEDFYFF
-
F
Y
-
F
-
F
K381Y
Nr.8
14
TKEDFIMF
-
F
I
-
M
-
F
F434M
Nr.12
15
TKEEDFIFFF
-
F
I
F
F
-
F
E383F-b
Nr.12
16
TKEDFWFM
-
F
W
-
F
-
M
F445M
Nr.5
17
WTKEDAFWFF
A
F
W
-
F
-
F
W43A-b
Nr.5
18
WTKEDAFIFF
A
F
I
-
F
-
F
W43A-b
Nr.12
19
WTKEDAFWMF
A
F
W
-
M
-
F
W43A
Nr.11
20
TKEDDFWFNF
-
F
W
-
F
N
F
D443N
Nr.5
21
TKEDDFIFNF
-
F
I
-
F
N
F
D443N
Nr.12
22
TKEDDFWMNF
-
F
W
-
M
-
F
D443N
Nr.11
23
WTKEDAFIMF
A
F
I
-
M
-
F
W43A-b
Nr.14
24
TKEEDFIFMF
-
F
I
F
M
-
F
F434M
Nr.15
25
WTKEEDAFIFFF
A
F
I
F
F
-
F
W43A-b
Nr.15
26
WTKEDAFWFM
A
F
W
-
F
-
M
F445M
Nr.17
a
Bereits vorhandene primer und Plasmide (Rothweiler, 2001).
Erzeugender
primer
Mutiertes
Plasmid
122
a)
b)
c)
Abbildung 46
Stereo-ribbon-Darstellungen des f-f-Kristallkontaktes der PGAL im Bereich der
Mutationen
von
TKEDFWMF-Nr.11
(a),
TKEDFWFM-Nr.16
(b)
und
TKEEDFIFFF-Nr.15 (c). Die Aminosäurereste in diesem Bereich sind als ball-and-stick
Modelle und passend zum jeweiligen Monomer in unterschiedlichen Farben dargestellt
(Gelb bzw. Rot). Zur Verdeutlichung der neu eingeführten Reste sind die ausgetauschten
Aminosäuren (ausgehend von TKEDFWFF-Nr.5) transparent und die C-Atome aller
PGAL-WT Aminosäurereste in schwarz dargestellt Die neuen Mutationen sind:
a) F434M, b) F445M und c) W381I und E383F. In c) ist F45 zur Veranschaulichung der
möglichen Wechselwirkungen mit 383F in einer zweiten Konformation dargestellt. Für
den Rest W43 wurde in c) aufgrund der sterischen Abstoßungen mit I381 eine andere
mögliche Konformation ausgewählt. Die zweizählige Achse ist als schwarze Linie
dargestellt. Die drei kürzesten und wesentlichen Abstände (Å) zwischen den dargestellten
Aminosäuren sind als gepunktete Linien eingezeichnet.
123
Für die angestrebte Kristallisation des PGAL-Dimers wird eine homogene
Proteinprobe benötigt. Um das zu erreichen, wurden ausgehend von der Mutante
TKEDFWFF-Nr.5 neue Mutationen geplant. Nach ausführlicher Inspektion wurde
deutlich, daß außer E383 und D443 keine weitere Position zur Einführung von neuen
hydrophoben Aminosäuren im f-f-Kontakt zur Verfügung stand. Deshalb wurden an
Positionen an denen bereits mutiert wurde, Austausche mit anderen hydrophoben
Aminosäureresten vorgenommen.
In Abbildung 46a, b sind die Austausche an den Positionen 434 und 445 dargestellt.
Dort wurde jeweils ein Phenylalanin gegen die etwas weniger hydrophobe, dafür aber
sterisch weniger anspruchsvolle Aminosäure Methionin ausgetauscht, wodurch der
Kontakt kompakter werden sollte. Für den Rest W381 waren Isoleucin (Abbildung 46c)
und Tyrosin weitere hydrophobe Alternativen. Wie in Abbildung 46c dargestellt ist, war
durch die Einführung eines Isoleucins an der Position 381 genügend Raum vorhanden, um
den Rest E383 zu Phenylalanin zu mutieren, welcher dann mit F45 des anderen Monomers
hydrophobe Wechselwirkungen ausbilden sollte.
Außerdem wurde, wie schon in der Diplomarbeit (Kötter, 2002), zur Spezifizierung
des Kontaktes D443 durch Asparagin ersetzt. Da dieser Rest an der zweizähligen Achse
steht (siehe Abbildung 46b) sollte es durch die Mutation D443N zur Verdopplung der
Wasserstoffbrücken zwischen den beiden Asparaginen kommen, wodurch die Bindung
verstärkt würde. Alle auf TKEDFWFF-Nr.5 aufbauenden Mutationen wurden zusammen
mit
der
Mutation
W43A
in
verschiedensten
Kombinationen
in
Vier-
bis
Sechsfachmutanten verwendet. Eine detaillierte Aufstellung der generierten Mutationen
zeigt Tabelle 20.
Als abschließende Übersicht zur Mutantenplanung ist in Abbildung 47a,b der
gesamte f-f-Kontakt des PGAL-WT als Vollbild und detailliert dargestellt. In
Abbildung 47c ist zum Vergleich der Kontakt der gut dimerisierenden (siehe unten
Tabelle 22) Mutante TKEDFWMF-Nr.11 dargestellt.
124
a)
b)
c)
Abbildung 47
Stereo-ribbon-Darstellungen des f-f-Kristallkontaktes. Die Monomere sind in
unterschiedlichen Farben dargestellt (Gelb/Orange bzw. Rot/Vilolett). Die zweizählige
Achse ist als schwarze Linie eingezeichnet. Gezeigt sind: (a) Vollbild von den zwei
Molekülen des PGAL-WT, (b) Wildtyp Kontakt und (c) Planungsstruktur des Kontaktes
der Mutante TKEDFWMF-Nr.11. In b) und c) sind allen beteiligten Aminosäurereste (mit
BASA ≥ 10 Å2 zuzüglich T45F und E383, die ebenfalls mutiert wurden) als ball-andstick Modelle und passend zum jeweiligen Monomer in unterschiedlichen Farben
dargestellt (Gelb bzw. Rot). Zur Verdeutlichung der neu eingeführten Reste F45, W381,
M434 und F445 in c) sind die C-Atome dieser Aminosäurereste schwarz dargestellt.
Aufgrund der besseren Darstellbarkeit sind β-Faltblätter als ungeordnete Polypeptikette
mit einem größeren Durchmesser farbig dargestellt.
125
5.2 Durchführung der Mutagenese
5.2 Durchführung der Mutagenese
Für die Planung der neuen Mutanten wurde die zu den PGAL-Mutanten
KEDWFF-Nr.1,
TKEDFWFF-Nr.5,
TEDFFF-Nr.8
bzw.
TKEDFIFF-Nr.12
korrespondierenden Gene im Expressionsvektor (6.4 kbp) verwendet, die zwischen den
Schnittstellen Nde I und BamH I vorlagen. In dieser Arbeit wurden die in Kapitel 5.1.2
geplanten Oberflächenmutationen mit ortsgerichteter Mutagenese (Kapitel 3.1.2) erzeugt.
Dafür wurden primer nach den Anforderungen der Firma Stratagene für das
QuikChangeTM Mutagenese Kit entworfen (Kapitel 3.1.2) und extern von der Fa. MWG
synthetisiert.
Verwendete primer für ortsgerichtete Mutagenese. Gezeigt ist jeweils nur der forwardprimer. Das Basentriplett, das für die mutierte Aminosäure kodiert, ist fett
hervorgehoben, die ausgetauschten Basen sind unterstrichen.
Tabelle 21
primer
W43A-a a
T45F
b
E383F-a
c
Templat
theoretische
Schmelztemperatur [°C]
Basenanzahl
GC-Gehalt [%]
KEDWFF-Nr.1
78.4
44
40.9
KEDWFF-Nr.1
75.2
44
38.6
KEDWFF-Nr.1
78.6
53
37.7
D443L
d
KEDWFF-Nr.1
76.5
47
38.3
K381Y
e
TEDFFF-Nr.8
78.5
45
40.0
TEDFFF-Nr.8
78.5
45
40.0
TKEDFWFF-Nr.5
79.7
53
35.8
W43A h
TKEDFWFF-Nr.5
78.4
44
40.9
F445M
i
TKEDFWFF-Nr.5
79.5
47
40.4
D443N
j
TKEDFWFF-Nr.5
79.8
47
36.2
TKEDFIFF-Nr.12
79.4
54
38.9
K381I
f
F434M
g
E383F-b k
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
-GTATCTTGAAGACAATTATGCGTATACAGCAGAACCTGCAAGTG- 3'
-GTATCTTGAAGACAATTATTGGTATTTCGCAGAACCTGCAAGTG- 3'
-CACTGAAAACGGTCTCGGATACTGGGATTTCTTTGTAGATAATACTGTTTATG- 3'
-CGTTATGGATTGTTCTATGTACTGTTTTTTACGCAAGAACGCTATCC- 3'
-CTGAAAACGGTCTCGGATACTACGATGAGTTTGTAGATAATACTG- 3'
-CTGAAAACGGTCTCGGATACATCGATGAGTTTGTAGATAATACTG- 3'
-GGACGTTTTCTCATGGTCAAATGGTTATATGAAACGTTATGGATTGTTCTATG- 3'
-GTATCTTGAAGACAATTATGCGTATTTCGCAGAACCTGCAAGTG- 3'
-CGTTATGGATTGTTCTATGTAGACTTTATGACGCAAGAACGCTATCC- 3'
-CGTTATGGATTGTTCTATGTAAACTTTTTTACGCAAGAACGCTATCC- 3'
-CGGTCTCGGATACATCGATTTCTTTGTAGATAATACTGTTTATGATGATGGTCG- 3'
Die verwendeten primer sind in Tabelle 21 aufgeführt. Aufgrund des
geringen
GC-Gehaltes
im
Bereich
der
Mutationen
wurden
teilweise
längere
Oligonukleotide verwendet, als die empfohlenen 25-45 Basen, um die benötigte
Schmelztemperatur Tm zu erreichen.
126
Der GC-Gehalt lag zumeist unter den empfohlenen 40%. Die eingeführten
Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung von der Fa. SEQLAB bestätigt. Dafür
wurde, je nach Position der neu eingeführten Mutation, der T7-Promotor primer oder der
Sequenzierungsprimer Seq-W339-primer (Kohl, 2000) verwendet. Tabelle 20 zeigt die
erzeugten PGAL-Mutanten, deren Ausgangsplasmid (template) und die zur Sequenzierung
verwendeten primer.
5.3 Expression und Reinigung der PGAL-Mutanten
Die Produktion und Reinigung aller PGAL-Mutanten erfolgte mit dem etablierten
Verfahren (Kötter, 2002), welches in Abbildung 48 dargestellt ist.
Transformation von E. coli One Shot BL21 (DE3) mit
dem Expressionssystem pET-3b-lacG
Ionenaustausch-Chromatographie an einer
38 mL Q-Sepharose FF Säule
Fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung mit
55% und 80% Sättigung
Gelpermeationschromatographie an einer
Superdex-200 16/60 prep grade Säule
Konzentrierung der Proteinlösung
Proteinanalytik
Abbildung 48
Flußdiagramm der Proteinreinigung der PGAL-Mutanten.
Die Summe der gereinigten Monomer- und Dimer-Fraktionen lag je nach Mutante
und Präparation im Bereich zwischen 2 mg und 20 mg pro 1.4 L 2xYT-Medium. Dabei
war folgender Trend zu erkennen: Je größer die Zahl der eingeführten Mutanten desto
geringer die Ausbeute. Die Gründe dafür lagen in der geringeren Expression in löslicher
Form sowie in den hohen Verlusten bei der Reinigung. Letzteres wird nachfolgend am
Beispiel der PGAL-Mutante TKEDFWFF-Nr.5 erörtert.
127
5.3.1
Reinigung einer der PGAL Mutanten
Zur Expression der PGAL Mutante TKEDFWFF-Nr.5 wurde das Plasmid in den
E. coli Stamm BL21 (DE3) transformiert (Kapitel 3.1.10). Nach Expression (Kapitel 3.2.1)
und Zellaufschluß (Kapitel 3.2.2) wurde der Rohextrakt durch AnionenaustauschChromatographie (Kapitel 3.2.4) gereinigt (Abbildung 49).
3000
100
100
A 280
Leitfähigkeit [mS]
80
2000
60
1500
40
1000
20
80
60
40
Gradient B [%]
Absorpion [mAU]
Gradient B [%]
PGAL-Fraktionen
Leitfähigkei [mS/cm]
2500
20
500
0
0
0
0
100
200
300
400
500
Abbildung 49
Elutionsdiagramm der IEC am Beispiel der Mutante TKEDFWFF-Nr.5 an Q-SepharoseFF. Die Elution erfolgte mit einem Salzgradienten. Der Balken unter dem peak markiert
die vereinigten PGAL Fraktionen.
Die noch verunreinigten PGAL-Fraktionen wurden vereinigt und mit einer
fraktionierenden Ammoniumsulfat-Fällung (Kapitel 3.2.5) weiter gereinigt. Dabei werden
zuerst Verunreinigungen mit 55% (NH4)2SO4 und anschließend die PGAL-Mutante mit
80% (NH4)2SO4 gefällt. Wie in Abbildung 50a zu erkennen ist, fällt ein großer Teil der
gelösten PGAL-Mutante schon bei der ersten Fällung aus. Dieser Verlust war auch schon
beim WT und anderen PGAL-Mutanten aufgetreten und konnte dort aufgrund der
allgemein hohen Ausbeuten zugunsten des guten Reinigungseffektes hingenommen
werden. Wie aber Abbildung 50b zu entnehmen ist, kann der Anteil an Ammoniumsulfat
bei der ersten Fällung nicht erniedrigt werden, da sonst die starke Verunreinigung bei
ca. 45 kDa, welche in der Gelpermeationschromatographie im Bereich des Dimers eluiert
wird (78-82 mL; Abbildung 52), nicht abgetrennt werden kann. Außerdem würde dies auch
zu einer Erhöhung des Anteils an hochmolekularen Verunreinigungen führen, welche
ebenfalls bei der PGAL-Dimer Reinigung stören können (siehe unten).
128
a)
kDa
b)
[% Ammoniumsulfat]
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
kDa
94
67
94
67
43
43
30
30
[% Ammoniumsulfat]
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Gele von SDS-PAGE-Läufen nach Ammoniumsulfat-Fällungen (20-80%) der Mutante
TKEDFWFF-Nr.5. Aufgetragen sind: a) 10 µL der in 100 µL IEC-C-Puffer gelösten
Niederschläge bzw. b) 10-20 µL des Überstandes nach der Fällung von 200 µL
vereinigten PGAL-Fraktionen aus der IEC. Markiert ist die PGAL Bande.
Abbildung 50
1.0
TKEDFW FF-Nr.5
Dimer rechromatographiert
0.8
Monomer rechromatographiert
Absorption A 280
0.6
0.4
0.2
V0
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Elution [mL]
Elutionsdiagramm eines GPC-Laufes der PGAL-Mutante TKEDFWFF-Nr.5 an
Superdex-200-16/60 prep grade. Der Balken unter dem peak markiert die zur
Kristallisation vereinigten PGAL Dimer-Fraktionen, der Pfeil das Ausschlußvolumen
(V0). Der Monomer-Dimer-Standard ist eine Mischung aus PGAL-Tandem und PGALWT (siehe Kapitel 3.2.7).
Abbildung 51
kDa
94
67
43
30
20
1
Abbildung 52
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
SDS-PAGE der PGAL-Mutante TKEDFWFF-Nr.5 nach GPC. Aufgetragen sind jeweils
5 µL der einzelnen Fraktionen.
129
Zum
Abtrennen
der
letzten
Verunreinigung
wurde
eine
Gelpermeationschromatographie durchgeführt (Kapitel 3.2.7). Abbildung 51 zeigt das
Chromatogramm des GPC Laufes der Mutante TKEDFWFF-Nr.5. Wie dort zu erkennen
ist, konnten per GPC Monomer und Dimer getrennt werden. Dabei wurde das Monomer
wahrscheinlich aufgrund von Wechselwirkungen seiner hydrophoben Oberflächenreste mit
dem Säulenmaterial nicht als einzelner peak eluiert, sondern in einem sehr großen Bereich.
Dieser Effekt blieb bei einer Rechromatographie der gesamten Monomer-Fraktionen aus,
dafür wurde aber wie schon bei der Mutante KEDWFF-Nr.5 ein erneuter Dimer peak bei
der Rechromatographie des Monomers beobachtet. Das Dimer war jedoch stabil.
In Abbildung 52 ist das zum Elutionsdiagramm zugehörige SDS-Gel abgebildet.
Wie dort zu erkennen ist, gibt es nach der GPC nur noch geringe Verunreinigungen im
hoch- und niedermolekularen
Bereich,
wobei
gerade
die
hochmolekularen
Verunreinigungen bei der Reinigung von PGAL-Dimer ein Problem darstellen. Für die
Proteinanalytik und Kristallisation wurden jeweils die Monomer- und Dimer-Fraktionen
vereinigt, konzentriert (Kapitel 3.2.8) und wenn nötig umgepuffert (Kapitel 3.2.9).
5.3.2
GPC-Chromatogramme aller präparierten PGAL-Mutanten
Alle generierten PGAL Oberflächenmutanten (Tabelle 20) wurden wie zuvor
beschrieben (Kapitel 5.3.1) exprimiert und gereinigt. Die Gelpermeationsdiagramme aller
präparierten PGAL-Mutanten sind in Abbildung 53 dargestellt. Von Mutanten, welche
mehrmals gereinigt wurden, sind die besten Diagramme dargestellt. Trotz der allgemein
geringen PGAL-Dimer Ausbeute konnte für sechs Mutanten mehr als 1 mg annähernd
reines
PGAL-Dimer
pro L Kultur
produziert
werden
Kristallisationsexperimente durchzuführen (Kapitel 5.7).
(Tabelle
22),
um
erste
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0
0
0
0
0
0.9
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0
1
2
3
0
1
2
3
20
20
20
30
20
10
20
30
30
Nr.5
Säule A
10
Nr.4
Säule A
10
Nr.3
Säule A
10
30
30
Nr.2
Säule A
10
Nr.1
Säule A
40
40
V0
60
70
80
70
80
70
80
70
80
70
80
90
90
90
90
90
100
100
100
100
100
110
110
110
110
110
120
120
120
120
120
130
130
130
130
130
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0
1
2
3
0
0
0
0
0
20
20
20
20
10
20
Nr.11
Säule A
10
Nr.10
Säule A
10
Nr.8
Säule A
10
Nr.7
Säule A
10
Nr.6
Säule A
30
30
30
30
30
40
40
40
40
50
50
50
V0
50
V0
50
V0
V0
40
V0
60
70
80
70
80
70
80
70
80
70
80
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
90
90
90
90
90
100
100
100
100
100
110
110
110
110
110
120
120
120
120
120
130
130
130
130
130
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0
1
2
3
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
0
0
0
0
0
20
20
20
20
10
20
Nr.17
Säule A
10
Nr.16
Säule A
10
Nr.14
Säule A
10
Nr.13
Säule A
10
Nr.12
Säule A
30
30
30
30
30
V0
40
40
50
50
50
50
50
V0
V0
40
V0
40
40
V0
60
70
80
70
80
70
80
70
80
70
80
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
90
90
90
90
90
100
100
100
100
100
110
110
110
110
110
120
1 20
120
120
120
130
1 30
130
130
130
0
20
40
60
80
100
120
140
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
0
100
200
300
400
500
600
700
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0
100
200
300
400
500
0
0
0
0
0
4
4
4
4
2
4
Nr. 21
Säule B
2
Nr.20
Säule B
2
Nr.19
Säule B
2
Nr.18
Säule B
2
Nr.15
Säule B
6
6
6
6
6
8
V0
8
V0
8
V0
8
V0
8
V0
10
12
14
12
10
12
12
14
12
14
Elution [mL]
10
Elution [mL]
10
Elution [mL]
14
14
Elution [mL]
10
Elution [mL]
16
16
16
16
16
18
18
18
18
18
20
20
20
20
20
22
22
22
22
22
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
0
100
200
300
400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
0
0
0
0
4
20
2
Nr.26
Säule C
2
Nr.25
Säule C
2
Nr.23
Säule C
10
Nr.24
Säule A
2
Nr.22
Säule B
30
6
50
4
V0
4
V0
4
V0
40
V0
8
V0
10
12
14
70
80
Elution [mL]
6
Elution [mL]
6
Elution [mL]
6
Elution [mL]
60
Elution [mL]
8
8
8
90
16
100
10
10
10
110
18
120
20
12
12
12
130
22
GPC-Läufe aller gereinigten PGAL-Mutanten auf den GPC-Säulen A (Superdex-200-16/60), B (Superdex-200-10/30) und C (Sigmachrom
1300). Der Monomer-Dimer-Standard ist jeweils als gepunktete Linie eingetragen, es wurden 2 verschiedene Mischungen verwendet. Ein Pfeil
zeigt das Ausschlußvolumen (V0) an.
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
60
Elution [mL]
50
50
50
50
50
V0
40
V0
40
V0
40
V0
Abbildung 53
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
Absorption A 280
130
5.4 Eigenschaften der präparierten PGAL-Mutanten
131
Für die Herstellung eines nicht-kovalenten Dimers war vor allem das
Dimerisierungsverhalten der neuen Mutanten von Bedeutung. Dieses konnte am besten
anhand der Elutionsdiagramme der GPC Läufe (Abbildung 53) analysiert werden. Dazu
wurden die Flächen unter der Verteilung mittels Integration bestimmt und zueinander ins
Verhältnis gesetzt. Wie aus Tabelle 22 hervorgeht, war es mit verschieden PGALMutanten gelungen, den Dimeranteil von 5% auf bis zu 56% zu erhöhen. Dabei wurde aber
auch eine Oligomerisierung der PGAL beobachtet, welche eine Folge von undefinierten
Zusammenlagerungen der PGAL Moleküle ist. Teilweise waren die Übergänge zwischen
Oligomer-, Dimer- und Monomerfraktion so schlecht aufgelöst, daß eine Auswertung
unmöglich war.
Durch die erwähnte schlechte Expression in Lösung und die Verluste bei der
Reinigung war die Ausbeute an reinem PGAL-Dimer trotz des hohen relativen
Dimeranteils insgesamt nur sehr gering. Damit reichte die Proteinmenge meist nicht für
Kristallisationsexperimente aus. Aufgrund dessen wurden zur Zeitersparnis die Mutanten
Nr.15 und Nr.18-26 (Tabelle 22) nur in 0.6 L statt 1.2 L Kultur exprimiert und mittels
analytischer GPC analysiert (Kapitel 3.2.7, Säulen B und C in Abbildung 53). Bei
Mutationen mit sehr hohem Dimeranteil wurde die Präparation wiederholt, um genügend
Protein für weitere Analysen zu erhalten. Zum Teil wurden die auf 5-10 mg/mL
konzentrierten Monomer- bzw. Dimer-Fraktionen nach 7-14 Tagen rechromatographiert.
Damit wurde festgestellt, ob sich zwischen Monomer und Dimer ein Gleichgewicht
ausbildet. Wie der Tabelle 22 zu entnehmen ist, war dies bei fast allen untersuchten
Mutanten der Fall.
Mit der Mutante TKEDFWFF-Nr.5 war es gelungen den PGAL-Dimer Anteil
gegenüber KEDWFF-Nr.1 von 5% auf 43% zu erhöhen. Daraufhin wurde untersucht,
welche Mutationen außer der neu eingeführten T45F für den erhöhten Dimeranteil
verantwortlich sind. Wie aus Tabelle 23 hervorgeht lag der Dimeranteil der Mutanten
TKEFWF-Nr.7, TEDFFF-Nr.8 und TKDFWF-Nr.10 bei 6-20%. Daraus ergibt sich die
Schlußfolgerung, daß jede der vier Mutationen einen signifikanten Einfluß auf das
Dimerisierungsverhalten am f-f-Kontakt hat. Zusätzlich wird durch den Rückgang des
Dimeranteils im Vergleich zur Mutante TKEDFWFF-Nr.5 (Tabelle 23) deutlich, daß die
132
Mutationen T45F und E434F den größten und die Mutanten D445F und K381W einen
geringen Einfluß auf das Dimerisierungsverhalten ausüben.
Eigenschaften der präparierten PGAL-Mutanten in der eingeführten chronologischern
Reihenfolge (siehe Tabelle 20). Monomer-, Dimer- und Oligomeranteil sind aus den
Elutionsdiagrammen der GPC-Läufe abgeleitet. Außerdem ist noch der relative
Monomer- und Dimeranteil nach Rechromatographie der vereinigten Monomer- bzw.
Dimer-Fraktionen aufgeführt.
Tabelle 22
Mutante
-Nr.
Dimer
[%]
Monomer
[%]
Oligomer Ausbeute Dimer
[%]
[mg pro L Kultur]
Rechromatographie
Monomer
Rechromatographie
Dimer
Dimer
[%]
Monomer
[%]
Dimer
[%]
Monomer
[%]
1
5
95
-
0.2
3
97
71
29
2
12
88
-
0.5
4
96
-
-
a
25
25
50
-
-
-
-
-
4
37
63
-
-
7
93
-
-
5
43
57
-
2.5
4
96
100
0
6
6
94
-
-
-
-
-
-
7
15
85
-
-
-
-
-
-
8
20
80
-
-
-
-
-
-
10
6
94
-
-
-
-
-
-
11
56
44
3.5
-
-
92
8
12
45
55
<5
7.5
-
-
-
-
13
47
42
11
-
-
-
-
-
14
37
63
-
1
-
-
-
-
15
22
78
-
-
-
-
-
-
16
33
67
-
3.5
-
-
90
10
17
34
66
-
3.5
-
-
-
-
18
38
62
<5
-
-
-
-
-
19
19
81
-
-
-
-
-
-
20
31
61
8
-
-
-
-
-
a
40
40
20
-
-
-
-
-
22a
40
30
30
-
-
-
-
-
23
22
78
-
-
-
-
-
-
24
47
53
<5
-
19
80
80
20
25
25
75
-
-
-
-
-
-
a
30
50
20
-
-
-
-
-
3
21
26
a
Keine Trennung, deshalb wurden die Oligomer-, Dimer- und Monomer-Anteile geschätzt.
133
Tabelle 23
Einfluß der vier verschiedenen Muationen der PGAL-Mutante TKEDFWFF-Nr.5 auf die
Dimerisierung.
Mutante-Nr.
Dimer [%]
5
Fehlende Mutation im
Vergleich zu Nr.5
T45F
Rückgang des
Dimeranteils [%]
38
1
7
15
D445F
28
8
20
K381W
23
10
6
E434F
37
Da die Ausbildung eines Gleichgewichts die Kristallisation behindern könnte,
wurde das Oligomerisierungsverhalten zusätzlich noch mit DLS (Kapitel 3.3.3) untersucht.
Die DLS gibt Aufschluß über die Polydispersivität einer Probe, dabei sollten monomodal
ausgewertete Proben erfahrungsgemäß besser kristallisieren als polydisperse Systeme
(D’Arcy, 1994). Es wurde die mittlere Masse der vereinigten Dimer-Fraktionen der
Mutanten bei Raumtemperatur bestimmt, welche für das Experiment in ausreichender
Menge und Reinheit vorlagen.
Tabelle 24
Ergebnisse der DLS von den vereinigten Dimer-Fraktionen einiger PGAL-Mutanten. Die
DLS wurde bei Raumtemperatur durchgeführt.
Mutante-Nr.
Masse [kDa]
baseline
Dispersität
1
113
1.009
polydispers
5
113
1.002
bimodal
6
118
1.007
polydispers
8
106
1.002
bimodal
11
106
1.003
bimodal
12
109
1.002
bimodal
14
94
1.005
bimodal
17
107
1.001
monomodal
24
97
1.001
monomodal
Die Molekularmasse der untersuchten Mutante lag zwischen 94 und 118 kDa
(Tabelle 24) und damit im erwarteten Fehlerbereich von 20% um die PGAL-Dimer
Molekularmasse von 108 kDa. Der Fehler ergibt sich, da bei der DLS lediglich der
Diffusionskoeffizient der Teilchen in Lösung gemessen und daraus die Masse der Proteine,
unter Annahme eines globulären Teilchens mit einer mittleren Proteindichte, bestimmt
wird. Aus dem Wert baseline läßt sich die Einheitlichkeit der Probe in Bezug auf die
Partikelgrößenverteilung abschätzen. Der Bereich für eine ausschließlich monomodale
Probe liegt bei 0.999 bis 1.001 (siehe oben Tabelle 8). Nur für die Dimere von
WTKEDAFWFF-Nr.17 und TKEEDFIFMF-Nr.24 wurde ein Wert in diesem Bereich
134
ermittelt. Die anderen Proben wurden als bimodal bzw. polydispers detektiert. Der Wert
für das bei der Rechromatographie stabile Dimer von TKEDFWFF-Nr.5 liegt dabei im
Grenzbereich, was eine Folge der Temperaturerhöhung beim DLS-Experiment von 4° C
auf Raumtemperatur sein könnte (siehe unten Tabelle 27).
Da auch dieses Ergebnis das Vorliegen des für die Kristallisation ungünstigen
Monomer-Dimer-Gleichgewichtes bestätigt, wurde nachfolgend der Einfluß von
Temperatur und Salzkonzentration auf das Gleichgewicht untersucht (Kapitel 5.6), um das
Dimer für die Kristallisation zu stabilisieren. Außerdem wurde zur Steigerung der
Ausbeute an reinem PGAL-Dimer nach einer alternativen Reinigung gesucht (Kapitel 5.5).
5.5 Alternative PGAL-Reinigung
Wie schon im Kapitel 5.3.1 festgestellt wurde, ist die 55%ige AmmoniumsulfatFällung der limitierende Schritt bei der bis dahin verwendeten Reinigung. Deshalb wurde
nach alternativen Trennverfahren gesucht, um den größten Anteil der Verunreinigungen
schon vor der Fällung abzutrennen und damit die fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung
zu umgehen. Dazu wurden der pH-Wert und das Säulenmaterial bei der IEC variiert und
zusätzlich verschiedene Farbstoffsäulen (Reaktive DYE Ligand Test Kit der Firma Sigma)
und hydrophobe Interaktions-Chromatographie-Materialien (HiTrap HIC Selektion Kit der
Firma Amersham Biosciences) getestet. Da mit diesen Verfahren keine Verbesserung der
Reinigung erreicht werden konnte, wurde beschlossen, die PGAL mit einem
N-Terminalen His6-tag zu exprimieren und mittels Affinitätschromatographie an
Ni-NTA-Sepharose zu reinigen.
5.5.1 PGAL-Reinigung durch Affinitätschromatographie mit His6-tag
Zur Reinigung der PGAL-Mutanten mittels Affinitätschromatographie wurde das
Gen der entsprechenden Mutante in den Vektor pET-15b kloniert, welcher für ein
N-terminales His6-tag codiert. Dazu wurde das Gen durch enzymatischen Doppelverdau
mit Nde I und BamH I aus dem Vektor pET-3b ausgeschnitten (Kapitel 3.1.5), mittels
Agarosegelelektophorese gereinigt (Kapitel 3.1.6) und anschließend aus dem Gel isoliert
(Kapitel 3.1.7). Mit dem Vektor pET-15b wurde ebenso verfahren, nur daß hier der offene
Vektor isoliert wurde und nicht das ausgeschnittene DNA-Fragment der multiple cloning
site (Vektorkarte im Anhang 8.1). Das gewünschte Gen wurde durch Ligation
(Kapitel 3.1.8) in den offenen Vektor pET-15b kloniert. Eine von der Fa. SEQLAB
durchgeführte Sequenzanalyse bestätigte den Erfolg der Umklonierung.
135
Transformation von E. coli BL21 (DE3) mit
dem Expressionssystem pET-15b-lacG
Affinitäts-Chromatographie an
9 mL Ni-NTA-Sepharose
Gelpermeationschromatographie an einer
Superdex-200 26/60 prep grade Säule
Proteolytische Entfernung des His6-tag von
den konzentrierten PGAL-His-tag-Dimer Fraktionen
Ni-NTA- Affinitäts-Chromatographie mit dem
prozessiertem PGAL*-Dimer
Gelpermeationschromatographie mit PGAL*-Dimer
an einer Superdex-200 26/60 prep grade Säule
Abbildung 54
Flußdiagramm der Reinigung von PGAL-Dimer für Mutanten mit His6-tag.
Im Flußdiagramm in Abbildung 54 ist die alternative Proteinpräparation für die
PGAL-His-tag Mutanten zusammengefaßt. Die Expression von TKEDFWFF-Nr.5 mit
N-terminalem His6-tag erfolgte bis zum ersten chromatographischen Reinigungsschritt
analog zur Reinigung aus Kapitel 5.3.1, allerdings mit der 3fachen Menge an Medium. Für
den ersten Reinigungsschritt des Rohextraktes wurde eine 9 mL Ni-NTA-Sepharose
Affinitätschromatographiesäule verwendet (Kapitel 3.2.6). Das typische Elutionsprofil ist
in Abbildung 55 gezeigt, die Elution erfolgte mit steigendem Imidazolgradienten.
Das Elutionsprofil der Affinitätschromatographie weist nur einen Bande auf, deren
Fraktionen mittels SDS-PAGE auf ihren PGAL-Gehalt hin untersucht wurden
(Abbildung 56). Wie dort zu erkennen ist, waren nach der Affinitätschromatographie nur
noch
geringe
Verunreinigungen
neben
TKEDFWFF-Nr.5-His-tag
vorhanden.
Diese Verunreinigungen sollten durch eine Gelpermeationschromatographie abgetrennt
werden, außerdem sollte damit das gewünschte PGAL-Dimer vom Monomer getrennt
werden. Dazu wurden die PGAL-Fraktionen 20-24 vereinigt, konzentriert und dann eine
GPC mit einer Superdex-200 26/60 prep grade Säule durchgeführt (Kapitel 3.2.7). Das
Elutionsprofil der GPC ist in Abbildung 57a dargestellt. Neben dem Monomer (bei
230 mL) und Dimer (bei 200 mL) ist im Elutionsdiagramm noch ein peak im Bereich des
Ausschlußvolumens (ca. 150 mL) der verwendeten Säule detektiert worden. Dabei handelt
136
es sich um PGAL-Oligomere, wie aus dem zum Elutionsdiagramm zugehörigen SDS-Gel
(Abbildung 58a) hervorgeht.
100
4000
A 280
Gradient B [%]
80
3000
2500
60
2000
40
1500
Gradient B [%]
Absorption [mAU]
3500
1000
20
500
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100 110 120 130 140 150
Elutionsdiagramm der Affinitätschromatographie am Beispiel der Mutante TKEDFWFFNr.5-His-tag an Ni-NTA-Sepharose. Die Elution erfolgte durch einen Imidazolgradienten
(20-600mM). Der Balken unter dem peak markiert die vereinigten PGAL Fraktionen.
Abbildung 55
kDa
Bahn 2: Fraktion 6 (30 mL) Durchfluß
94
67
43
30
20
1
2
Abbildung 56
3
4
5
6
7
8
9
10
SDS-PAGE der Ni-NTA-chromatographischen Reinigung der PGAL-Mutante
TKEDFWFF-Nr.5-His-tag aus Abbildung 55. Aufgetragen sind jeweils 2 µL der
einzelnen Fraktionen.
Der N-terminale His6-tag kann Protein-Protein-Wechselwirkungen verstärken,
wodurch es zu ungewünschten Oligomerisierungen kommen könnte. Wie aus der
Darstellung der multiple cloning site von pET-15b in Abbildung 62 (Anhang 8.1)
hervorgeht, besitzt der linker zwischen His6-tag und dem PGAL-N-Terminus eine
hochspezifische Schnittstelle, die von der Serinprotease Thrombin erkannt wird. Deshalb
wurde der His6-tag von den vereinigten und konzentrierten PGAL-Dimer Fraktionen durch
einem proteolytischen Verdau (20 U Protease pro mg Protein) über Nacht bei 4 °C
abgeschnitten. Die prozessierten PGAL*-Mutanten (proteolytisch verdautes Protein ist
durch einen * gekennzeichnet) haben, im Vergleich zu PGAL-Mutanten, N-terminal
137
zusätzlich noch das Peptid Gly-Ser-His-. Anschließend wurde das ungespaltene Protein
durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie und Thrombin (39 kDa) durch eine zweite GPC
vom prozessierten PGAL*-Dimer abgetrennt.
a)
b)
1.6
0.6
TKEDFWFF-Nr.5*
1.4
0.5
Absorption [AU]
Absorption [AU]
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.3
0.2
0.4
0.1
0.2
0.0
0.0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
0
20
Abbildung 57
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Elutionsdiagramme der PGAL-Mutante TKEDFWFF-Nr.5-His-tag (a) bzw. von dem
prozessiertem PGAL*-Dimer (TKEDFWFF-Nr.5*) (b) mit einer Superdex-200 26/60
prep grade Säule. Der Balken unter den peaks markiert die zur proteolytischen Spaltung
(a) bzw. zur Kristallisation (b) vereinigten PGAL Dimer-Fraktionen. Der MonomerDimer-Standard ist eine Mischung aus PGAL-Tandem und PGAL-WT (siehe Kapitel
3.2.7).
a) kDa
94
67
43
30
20
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12 13 14 15
b) kDa
94
67
43
30
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Abbildung 58
40
SDS-PAGE Diagramme der PGAL-Mutante TKEDFWFF-Nr.5 nach GPC Läufen
(Abbildung 57a,b) zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Reinigung: a) nach
Affinitätschromatographie (TKEDFWFF-Nr.5-His-tag) und b) prozessiertes PGAL*Dimer (TKEDFWFF-Nr.5*). Aufgetragen sind jeweils 5 µL der einzelnen Fraktionen.
138
In Abbildung 57b ist das Elutionsdiagramm der GPC mit dem prozessierten
TKEDFWFF-Nr.5*-Dimer abgebildet. Wie dort zu erkennen ist, gibt es neben dem Dimer
nur einen geringen Monomer und keinen neuen Oligomeranteil. Die Fraktionen wurden
mittels SDS-PAGE (Abbildung 58b) auf Proteingehalt und Reinheit analysiert. Auf dem
SDS-Gel waren fast keine Verunreinigungen des PGAL-Dimers mehr zu erkennen. Für die
Kristallisation und analytische Versuche wurden die TKEDFWFF-Nr.5*-Dimer Fraktionen
vereinigt und konzentriert. Dabei wurden nur die Kernfraktionen des Dimer peaks
verwendet, um eine homogene Proteinprobe zu bekommen.
5.6 Übersicht über die alternativ gereinigten PGAL-Mutanten
Neben TKEDFWFF-Nr.5 wurden aus der großen Anzahl dimerisierender
PGAL-Mutanten (Tabelle 22) noch sechs weitere ausgewählt (siehe unten Tabelle 26).
Deren Gen wurde jeweils umkloniert und das Protein produziert und gereinigt, wie in
Kapitel 5.5 beschrieben. Als Auswahlkriterien dienten neben Oligomerisierungsverhalten
bei GPC und DLS auch der Grad an Überexpression im Vektor pET-3b. Alle PGAL-Histag
Mutanten
konnten
überexprimiert
und
mit
Hilfe
von
Ni-NTA-
Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Die GPC Läufe des darauf folgenden
Reinigungsschritts sind in Abbildung 59 dargestellt. Dabei wurden die Absorptionsmaxima
der Monomer peaks alle auf den Wert von TKEDFIFF-Nr.12-His-tag skaliert, um den
Dimeranteil der einzelnen Mutanten besser vergleichen zu können. Wie auch in Tabelle 25
zu sehen ist, hatte die Mutante TKEDFIMF-Nr.14-His-tag mit 41% den höchsten und
WTKEDAFWFF-Nr.17-His-tag mit 27% den geringsten Dimer Anteil. Der Anteil an
Oligomer lag insgesamt unter 9%. Die gleiche Tendenz wurde bei der bisher verwendeten
Reinigung beobachtet (Tabelle 22).
139
1.4
TKEDFWMF-Nr.11-His-tag
TKEDFIFF-Nr.12-His-tag
Absorption [AU]
1.2
TKEDFIMF-Nr.14-His-tag
1.0
TKEDFWFM-Nr.16-His-tag
W TKEDAFWFF-Nr.17-His-tag
0.8
TKEEDFIFMF-Nr.24-His-tag
0.6
0.4
∼300 kDa
0.2
0.0
0
50
100
150
200
250
300
Abbildung 59
Elutionsdiagramme der PGAL-His-tag-Mutanten nach GPC mit einer Superdex-200
26/60 prep grade Säule. Die Absorptionsmaxima der Monomer peaks aller Läufe wurden
auf den Wert von TKEDFIFF-Nr.12-His-tag skaliert. Der Monomer-Dimer-Standard ist
eine Mischung aus PGAL-Tandem und PGAL-WT.
Tabelle 25
Relative Mengen von Monomer, Dimer und Oligomer aus den GPCEluationsdiagrammen der PGAL-His-tag-Mutanten aus Abbildung 59. Zum Vergleich
sind in Klammer die Dimeranteile aus der herkömmlichen Reinigung angegeben (siehe
Tabelle 22).
Mutante-Nr.
5-His-tag
Dimer [%]
34 (43)
Monomer [%] Oligomer [%]
57
9
11-His-tag
34 (56)
59
7
12-His-tag
37 (45)
54
9
14-His-tag
41 (37)
53
6
16-His-tag
40 (33)
55
5
17-His-tag
27 (34)
65
8
24-His-tag
38 (47)
53
9
Nach dem proteolytischen Verdau der vereinigten Dimer-Fraktionen aus dem ersten
GPC-Lauf (Abbildung 59), wurde das ungeschnittene Protein mittels Ni-NTAAffinitätschromatographie
abgetrennt.
Anschließend
wurde
das
prozessierte
PGAL*-Dimer von Thrombin und vom restlichen oder während der Proteolyse
entstandenem PGAL*-Monomer mit einer zweiten GPC abgetrennt. Wie aus Tabelle 26
hervorgeht
lag
der
Monomer-Anteil
bei
6%-20%
(TKEDFIFF-Nr.12*
bzw.
TKEEDFIFMF-Nr.24*). In Anhang 8.5 sind für die Mutante TKEDFWMF-Nr.11
beispielhaft die hier präsentierten Ergebnisse, auch im Vergleich zur herkömmlichen
Reinigung, detailliert dargestellt.
140
0.6
TKEDFWFF-Nr.5*
TKEDFWMF-Nr.11*
0.5
TKEDFIFF-Nr.12*
Absorption [AU]
TKEDFIMF-Nr.14*
0.4
TKEDFWFM-Nr.16*
W TKEDAFWFF-Nr.17*
TKEEDFIFMF-Nr.24*
0.3
0.2
0.1
0.0
0
50
100
150
200
250
300
Abbildung 60
Tabelle 26
Mutante-Nr.
5*
Elutionsdiagramme von GPC-Läufen verschiedener Mutanten mit dem prozessiertem
PGAL*-Dimer (Dimer nach proteolytischer Spaltung) auf einer Superdex-200 26/60 prep
grade Säule.
Ausbeute an reinem prozessiertem PGAL*-Dimer, aus 4.2 L LBA-Medium, nach der finalen
GPC. Die relativen Dimer- und Monomeranteil wurden aus den GPC-Eluatiosdiagrammen in
Abbildung 60 bestimmt. Die mittlere Molekularmasse wurde durch DLS von vereinigten
PGAL*-Dimer-Fraktionen bestimmt.
Ausbeute an Dimer [%] Monomer [%] Molekularmasse
PGAL-Dimer
aus der DLS
[mg]
[kDa]
12
86
14
123
baseline
Dispersität
1.005
bimodal
11*
12
88
12
136
1.005
bimodal
12*
16
94
6
124
1.001
monomodal
14*
11
93
7
103
1.004
bimodal
16*
15
92
8
103
1.001
monomodal
17*
10
86
14
120
1.003
bimodal
24*
8
80
20
146
1.004
bimodal
Die Ausbeuten an reinem Dimer (Tabelle 26) aus einer Präparation war bei allen
Mutanten ausreichend für die geplanten Kristallisationsexperimente. Allerdings lagen nur
die Mutanten TKEDFWFM-Nr.16* und TKEDFIFF-Nr.12* monomodal vor. Da aber in
den SDS-Gelen der anderen Mutanten keine Verunreinigungen sichtbar waren, ist davon
auszugehen, daß die Ursache für die Polydispersität bei den DLS Messungen das
Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer ist. Diese Gleichgewichtsverschiebung
kann, wie auch in Kapitel 5.4 diskutiert wurde, durch die Temperaturerhöhung auf
141
Raumtemperatur während des DLS-Experimentes verursacht werden. Es wurde erwartet,
daß diese Inhomogenität einen negativen Einfluß auf die Kristallisation des PGAL-Dimers
hat. Deshalb wurde der Einfluß von Salzkonzentration und Temperatur auf das
Gleichgewicht untersucht, um Bedingungen zu finden, bei denen das Gleichgewicht in
dem Zeitraum bis zur Kristallisation auf der Dimerseite stabilisiert werden kann.
Dazu wurden Mengen von weniger als 0.1 mg von reinem PGAL-Dimer der
Mutante TKEDFWFM-Nr.16 bei verschiedenen Bedingungen inkubiert und anschließend
auf einer analytischen GPC-Säule (Kapitel 3.2.7) rechromatographiert. Es wurde bei
folgenden Temperaturen inkubiert: 4° C (Präpäration), 20° C (Kristallisation), 28° C
(erhöhte Raumtemperatur) sowie bei 40° C und 45° C (Denaturierungsbereich). Die
Ergebnisse der Untersuchung des Temperatureinflusses sind in Tabelle 27 wiedergegeben.
Daraus wird deutlich, daß eine Erhöhung der Temperatur und des Inkubationszeitraums zur
Dissoziation des Dimers zum Monomer bzw. zur Denaturierung führen. Schon bei der für
die Kristallisation üblicherweise verwendeten Temperatur von 20 °C wurde eine deutliche
Abnahme des Dimeranteils im Gleichgewicht beobachtet. Deshalb wurden die
Kristallisationsexperimente mit den PGAL*-Mutanten wie die Präparation bei 4 °C
durchgeführt.
Tabelle 27
Temperatureinfluß auf das Monomer-Dimer Gleichgewicht. Aufgelistet ist der Anteil an
Dimer, Monomer und Oligomer aus der Rechromatographie auf einer analytischen GPCSäule nach Inkubation von reinem TKEDFWFM-Nr.16-Dimer bei verschiedenen
Temperaturen.
Temperatur [° C]
Inkubationszeit [h]
Dimer [%]
Monomer [%]
Oligomer [%]
4
> 48
90-100
0-10
0
20
13
78
22
0
28
3
79
21
0
40
0.5
58
42
0
40
1
49
51
0
40
2
36
64
0
45
0.5
27
70
3
45
1
17
75
8
45
2
10
77
13
Für die Untersuchung des Konzentrationseinflusses von Salz auf das MonomerDimer-Gleichgewicht wurden die Proteinproben 30 Minuten in Lösungen mit
unterschiedlichem Salzgehalt (ddH2O, IEC-C-Puffer, GPC-Puffer und IEC-C-Puffer mit
500 mM NaCl) inkubiert, anschließend wurde die selbe Lösung als Laufmittel für die
142
Rechromatographie der Proteinproben, auf einer analytischen GPC, verwendet. Mit Hilfe
dieses
Experimentes
konnten
keine
signifikanten
Gleichgewichtsverschiebungen
beobachtet werden. Da das Protein bei der Lagerung (Konzentration > 5 mg/ml) aber nur
im
GPC-Puffer
(150 mM
NaCl)
stabil
in
Lösung
vorlag,
wurden
alle
Kristallisationsexperimente mit PGAL-His-tag-Mutanten im GPC-Puffer durchgeführt.
5.7 Kristallisation
5.7.1 Kristallisation des PGAL-Dimers
Die Kristallisation wurde nach der Sitztropfen- bzw. Hängetropfenmethode
durchgeführt (Kapitel 3.4.1). Alle präparierten Mutanten, bei denen PGAL-Dimer in
ausreichender Menge erzeugt wurde, wurden auf Kristallisierbarkeit überprüft (Tabelle
28). Dazu wurde das aufgereinigte Dimer gegen ddH2O dialysiert, entstandenes Präzipitat
mittels Zentrifugation entfernt und die Proteinkonzentration auf 5-10 mg/mL eingestellt.
Neben den kommerziell erhältlichen screenings wurden auch solche benutzt, deren
Grundlage die Kristallisationsbedingung des PGAL-WT für die Kristallform A darstellte,
nämlich: 28% PEG 4000, 0.2 M Li2SO4, 0.1 M Tris pH 7.5 (Wiesmann & Schulz, 1997).
Dabei wurde die PEG 4000-Konzentration (25-30%), die Li2SO4-Konzentration
(0.1 M-0.3 M) als auch der pH-Wert (pH 7.0 - 8.6) variiert. Zusätzlich wurde alle
Kristallisationsversuche bei mehreren Proteinkonzentrationen ausgeführt. Dazu wurden zur
Material und Zeitersparnis meist zwei bis drei Tropfen mit unterschiedlichen
Proteinkonzentrationen in einer Reservoirkammer angesetzt.
Tabelle 28
Mutante Nr.
Kristallisationsansätze der PGAL-Mutanten mit reinem Dimer bei 20° C.
Crystal
Screen I+II
Wizard
I+II
5
+
+
11
+
Wizard
cryo I+II
2
JB Screens
[Nummer]
2, 3
PEG-4000
Screens
+
(NH4)2SO4
Screens
2,3,4, 6,7,10
+
+
+
+
+
+
+
+
12
14
+
16
+
+
17
+
+
+
1-10
+
1-10
+
Aus den in Tabelle 28 aufgeführten Kristallisationsexperimenten wurden als
einzige die in Abbildung 61 dargestellten initialen „Kristalle“ mit Ammoniumsulfat
enthalten. Die Kristalle haben große Ähnlichkeit mit dem Literaturbeispiel von zu schnell
143
5.7 Kristallisation
wachsenden Kristallen (Bergfors, 1999). Deshalb wurden screenings um diese Bedingung
durch Variation von Fällungsmittel, Salz und pH-Wert hergestellt und mit einigen PGALMutanten bei unterschiedlichen Proteinkonzentrationen verwendet (Tabelle 28). Jedoch
konnten keine klaren Kristalle erzeugt werden.
a)
b)
20 µm
Abbildung 61
5.7.2
20 µm
Vermutliche Kristalle der PGAL-Mutante TKEDFWMF-Nr.11 aus Bedingungen mit
1-3% PEG 600, 0.8-1.3 M (NH4)2SO4 und 0.1 M Tris pH 6.5-7.1 in zwei Tropfen.
Kristallisation der alternativ gereinigten PGAL-Dimere
Mit Hilfe der auf Affinitätschromatographie basierenden alternativen Reinigung
war es gelungen, für die ausgewählten Mutanten große Mengen an reinem Dimer zu
produzieren (Tabelle 26). Alle Kristallisationsansätze wurden, wie in Kapitel 5.6 erörtert,
bei 4 °C mit Proteinlösungen in GPC-Puffer bei einer Konzentration von 4 und 8 mg/ml
nach der Sitztropfenmethode (Kapitel 3.4.1) durchgeführt (Tabelle 29). Dazu wurden
neben
kommerziellen
screenings
zusätzlich
noch
zwei
weitere
screenings
zusammengestellt. Eines mit 48 verschiedenen Ammoniumsulfat-Bedingungen und das
Zweite mit 96 Bedingungen nach einer Vorlage aus dem Arbeitskreis von R. Huber. In den
insgesamt ca. 10’000 angesetzten Tropfen dieser Kristallisationsexperimentes, konnten
auch nach Monaten keine Proteinkristalle beobachtet werden.
Tabelle 29
Kristallisationsansätze mit PGAL*-Dimer-Mutanten bei 4° C.
+
HuberScreen
+
(NH4)2SO4
Screen
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
16*
+
+
+
+
+
+
17*
+
+
+
+
+
+
24*
+
+
+
+
+
+
Mutante-Nr.
Wizard
I+II
+
Wizard
cryo I+II
+
JB Screens
5*
Crystal
Screen I+II
+
11*
+
+
12*
+
14*
6.1 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase
145
6 Zusammenfassung und Ausblick
6.1 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase
In dieser Arbeit wurde die Struktur der 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase aus
Arthrobacter nicotinovorans aufgeklärt und analysiert. Das Enzym katalysiert die
enantioselektive Oxidation von 6-Hydroxy-D-Nikotin, dem zweiten Schritt des
Nikotinmetabolismus des coryneformen Bakteriums A. nicotinovorans, welches seinen
Stickstoff-und Kohlenstoffbedarf allein aus dem Abbau von Nikotin decken kann.
Ausgehend von einem ersten Reinigungsprotokoll für die 6HDNO-Oberflächenmutante Cys433Ser (6HDNOns) wurden mit dem zur Homogenität gereinigten Enzym
unter verschiedenen Kristallisationsbedingungen röntgentaugliche Kristalle erhalten. Dabei
wurden zuerst nur schwach streuende Kristalle der Form 1 und 2 und zu einem späteren
Zeitpunkt die bis zu einer Auflösung von 1.9 Å streuende Kristalle der Form-3 erhalten.
Zur Phasenbestimmung wurde die Methode der anomalen Streuung bei mehreren
Wellenlängen (MAD) mit Kristallen der Form-1 verwendet. Hierzu wurde das anomale
Streuverhalten von Se-Atomen ausgenutzt, die als Seleno-L-Methionin in das Protein
inkorporiert worden waren. Dazu war das Gen in einen mit dem Methionin auxothrophen
E. coli-Stamm kompatiblen Vektor umkloniert worden. Die Struktur der 6HDNOns wurde
durch Molekularen Ersatz mit einem von Hand gebauten initialen Teilstruktur als
Suchmodell in der Kristallform-3 gelöst. Anschließend wurden wiederum mittels
Molekularen Ersatzes die niedrig aufgelösten Strukturen der Kristallformen 1 und 2
bestimmt.
In allen Strukturen der 6HDNO sind je zwei Moleküle über eine kovalente
Disulfidbrücke zwischen Cys59-Cys59’ entlang einer lokalen zweizähligen Achse
miteinander verbunden. Es konnte gezeigt werden, daß diese Disulfid-Dimere für die
Kristallisation essentiell waren. Jedes Molekül besteht aus 459 Aminosäuren, von denen
die Reste 5-457 lokalisiert werden konnten, und läßt sich in die vier Segmente I, IIa, IIb
und III einteilen. Die Domänen I und II sind an der Bindung des FAD-Cofaktors beteiligt
und bilden das von der Rossmann-Faltung abgeleitete Nukleotid-Bindungsmotiv. Die
Substratbindungsdomäne III besteht aus einem von α-Helices umgebenen, großen
siebensträngigen β-Faltblatt. In der Struktur wurde eine kovalente Bindung zwischen den
Nδ1 des His72 und dem C8α des FAD beobachtet und damit frühere Beobachtungen einer
146
Zusammenfassung und Ausblick
Bindung über das Nε2 Atom korrigiert. Aufgrund der Kettenfaltung wurde die 6HDNO der
p-Cresol-Methylhydroxylase - Vanillyl-Alkohol Oxidase Familie zugeordnet. In den
beiden nächsten Verwandten aus dieser Familie ist das FAD über ähnliche kovalente
Bindungen mit der Polypeptidkette verknüpft.
Aufgrund der erhaltenen Struktur sowie durch Vergleiche mit den homologen
Strukturen wurde ein Modell des Substratkomplexes erstellt, mit dessen Hilfe ein
Reaktionsmechanismus postuliert werden konnte. Das Enzym ist spezifisch für 6HDN und
wird durch das L-Enantiomer inhibiert. Diese Beobachtung wurde durch die modellierten
Enzymsubstrat- und Enzyminhibitorkomplexe bestätigt. Die Enantioselektivität beruht
dabei nicht auf dem Hydridtransfer, sondern auf der anschließenden Deprotonierung. Ein
Modell der zur 6HDNO nicht sequenzhomologen 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase, welche
das L-Enantiomer umsetzt und von 6HDN inhibiert wird, wurde anhand der Struktur des
sequenzhomologen Enzyms Monoaminoxidase B erstellt. Auch hier wurde der Einfluß der
deprotonierenden Base auf die Spezifität anhand von Substrat- und InhibitorKomplexmodellen bestätigt. Außerdem konnte durch Analyse der Struktur ein
Mechanismus für die Autoflavinylierung der 6HDNO postuliert werden.
Wenn das Substrat verfügbar wäre, könnte der postulierte Reaktionsmechanismus
in zukünftigen Arbeiten durch Mutationsstudien und Aktivitätsmessungen sowie durch
inaktive Enzymsubstratkomplexe hinterfragt werden. Durch Mutationsstudien könnte
außerdem der Autoflavinierungsmechanismus genauer untersucht werden.
6.2 6-Phospho-β-Galaktosidase
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Oberfläche der 6-Phospho-βGalaktosidase am Kristallkontakt f-f der Kristallform A so zu verändern, daß stabile
Dimere in Lösung gebildet werden und diese strukturell zu charakterisieren. Als
Ausgangspunkt für die Mutagenese diente die Mutante KEDWFF, welche zu Beginn der
Doktorarbeit hergestellt wurde und eine neue Kombination von bekannten Mutationen
(Rothweiler, 2001) darstellt. Mit dieser Mutante ist es hier erstmalig gelungen ein
nichtkovalentes Dimer in Lösung nachzuweisen. Da aber ein Monomer-DimerGleichgewicht mit nur 5% Dimeranteil vorlag und es nicht möglich war das Gleichgewicht
auf die Dimerseite zu verschieben, konnte für Kristallisationsversuche nicht genügend
dimeres Protein produziert werden. Deshalb wurden mit Hilfe des Programms O und der
147
6.2 6-Phospho-β-Galaktosidase
bekannten
PGAL-Struktur
neue,
auf
KEDWFF
basierende,
hydrophobe
Oberflächenmutanten geplant.
Des weiteren wurde bei Oberflächenmutanten, die zu einer Erhöhung des
Dimeranteiles geführt hatten, auf denselben Positionen verschiedene hydrophobe
Aminosäuren eingeführt und mit neuen Mutationen kombiniert. Die 21 geplanten
Mutationen konnten im Expressionsvektor pET-3b durch ortsgerichtete Mutagenese
erzeugt und durch Sequenzierung auf DNA-Ebene verifiziert werden. Alle erzeugten
Mutanten konnten im Expressionsstamm E.coli BL21 (DE3) überexprimiert und bis zur
Homogenität gereinigt werden. Allerdings lag die Ausbeute an Dimer nur bei 0.2-7.5 mg
pro Liter Kulturmedium, obwohl die Mutanten wie geplant mit 12% - 56% einen deutlich
höheren Dimeranteil aufwiesen. Die Dimerisierung konnte für einige Mutanten neben der
GPC auch mittels DLS verifiziert werden. Aber nur bei zweien wurde dabei eine für die
Kristallisation günstige monomodale Verteilung gemessen. Für sieben Mutanten konnte
genügend Protein produziert werden, um umfangreiche Kristallisationsexperimente
durchzuführen, welche aber zu keinen verwertbaren Kristallen führten.
Um für die Kristallisation ausreichend und vor allem homogenes Dimer zu erhalten,
wurde der Einfluß von Temperatur und Salzkonzentration auf das Monomer-Dimer
Gleichgewicht untersucht und zusätzlich Voruntersuchungen für eine alternative Reinigung
der
PGAL-Mutanten
durchgeführt.
Die
alternative
Reinigung
mittels
Affinitätschromatographie führte zu ausreichenden Mengen an homogenem Dimer. Für die
Reinigung wurden die PGAL-Mutanten mit einem N-Terminalen His6-tag exprimiert,
welcher nach der Reinigung enzymatisch abgespalten wurde. Insgesamt wurden die sieben
Oberflächenmutanten mit dem höchsten Dimeranteilen für die alternative Reinigung in den
Vektor pET-15b umkloniert. Für alle Mutanten wurde homogenes Dimer in ausreichenden
Mengen erhalten. Die Untersuchungen des Monomer-Dimer-Gleichgewichts hatten
ergeben, daß 150 mM NaCl (GPC-Puffer) und 4 °C die optimale Aufbewahrungsbedingungen für das Dimer zum Schutz vor Dissoziation sind. Unter Berücksichtigung
dieser Ergebnisse waren insgesamt über 10'000 Kristallisationstropfen mit den alternativ
gereinigten PGAL-Mutanten unter 700 verschiedenen Bedingungen angesetzt worden. Alle
Kristallisationsversuche mit dem in Lösung stabilen nichtkovalenten Dimer der PGALOberflächenmutanten hatten jedoch nicht zu Kristallen geführt.
Da feste Proteine im Allgemeinen immer irgendeine Form von Kristallen ergeben
auch wenn diese röntgenuntauglich sind, darf über die Kristallisations-Resistenz spekuliert
werden. Wahrscheinlich führte der gebildete Kontakt aus nonpolaren Aminosäure-Resten
148
Zusammenfassung und Ausblick
zu keiner einheitlichen Verzahnung, weil die nonpolaren Wechselwirkungen wesentlich
schlechter
ausgerichtet
sind
als
Dipolwechselwirkungen.
Dadurch
wird
jedes
Kristallwachstum im Keim inhibiert. Deshalb sollte versucht werden die Ausrichtung der
vorhandenen
hydrophoben
Kontaktflächen
durch
Einführung
von
polaren
Wechselwirkungen zu verfestigen. Am f-f-Kontakt waren aber keine Positionen zur
Einführung von zusätzlichen dipolaren Wechselwirkungen verfügbar.
Literatur
149
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157
Anhang
8 Anhang
8.1 Vektorkarte pET-15b
Abbildung 62
pET-15b Vektorkarte mit multiple cloning site
158
Anhang
8.2 GPC-Eichgeraden
Albumin 67.0 kDa
5.2
5.0
Ovalbumin 43.5 kDa
log M r
4.8
Chymotrypsinogen A 25.0 kDa
4.6
Ribonuclease A 13.7 kDa
4.4
4.2
Cytochrom C 12.3 kDa
4.0
100
120
140
160
180
200
220
Volume [ml]
Abbildung 63
Eichgerade der bei der Präparation der 6HDNO verwendeten Superdex-75 26/60 GPCSäule. Gleichung der Geraden: log Mr = -0.011 * Elutionsvolumen [mL] + 6.294
3.0
Ferritin 440 kDa
2.8
2.6
Catalase 232 kDa
2.4
log M r
2.2
BSA-Monomer 67 kDa
2.0
1.8
Ovalbumin 43.5 kDa
1.6
1.4
1.2
Cytochrom C 12.3 kDa
1.0
0.8
50
60
70
80
90
100
110
Volume [ml]
Abbildung 64
Eichgerade der bei der herkömmlichen Reinigung der PGAL verwendeten Superdex-S200
16/60 GPC-Säule (Säule A, Abbildung 53). Gleichung der Geraden: log Mr = -0.03849 *
Elutionsvolumen [mL] + 5.0379. Für die analytischen Säulen B und C wurde nur eine
Mischung aus PGAL-Tandem und PGAL-WT (Kapitel 3.2.7) als Standard verwendet.
6.0
5.8
5.6
Thyreoglobulin 670 kDa
Ferritin 440 kDa
Catalase 232 kDa
log M r
5.4
BSA-Dimer 134 kDa
BSA-Monomer 67 kDa
5.2
5.0
4.8
Ovalbumin 43.5 kDa
4.6
4.4
4.2
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Volume [ml]
Abbildung 65
Eichgerade der bei der alternativen His-tag-Reinigung der PGAL verwendeten Superdex200 26/60 GPC-Säule (Abbildung 57, Abbildung 59 und Abbildung 60). Gleichung der
Geraden: log Mr = -0.0104 * Elutionsvolumen [mL] + 7.0808
159
Anhang
8.3 Sequenz der HDNO (DNA und Protein)
1
1
M V S S K L A T P L S I Q G E V I Y P D
ATGGTGTCATCAAAACTAGCCACCCCCCTTAGTATTCAAGGTGAAGTTATTTACCCTGAT
21
61
D S G F D A I A N I W D G R H L Q R P S
GACAGCGGATTTGATGCCATCGCGAATATTTGGGACGGCCGTCATTTGCAGCGGCCGTCG
41
121
L I A R C L S A G D V A K S V R Y A C D
CTAATTGCCCGGTGTCTGAGTGCGGGCGACGTTGCGAAGTCCGTCCGCTACGCATGTGAC
61
181
N G L E I S V R S G G H N P N G Y A T N
AACGGCCTGGAGATCTCGGTTCGATCCGGTGGCCACAATCCGAATGGCTATGCGACCAAC
81
241
D G G I V L D L R L M N S I H I D T A G
GACGGTGGCATCGTCTTGGACCTCAGACTCATGAACAGCATCCACATCGACACCGCCGGG
101
301
S R A R I G G G V I S G D L V K E A A K
AGTCGCGCGCGGATCGGGGGTGGCGTAATCAGTGGCGATCTCGTGAAGGAGGCGGCCAAA
121
361
F G L A A V T G M H P K V G F C G L A L
TTCGGTCTAGCGGCAGTCACCGGCATGCATCCTAAGGTCGGGTTCTGTGGACTAGCGCTC
141
421
N G G V G F L T P K Y G L A S D N I L G
AATGGGGGCGTCGGCTTCCTCACCCCCAAATATGGTCTCGCCAGTGACAATATCTTGGGA
161
481
A T L V T A T G D V I Y C S D D E R P E
GCGACTCTGGTGACCGCAACTGGTGACGTTATCTACTGCTCTGATGATGAACGCCCGGAA
181
541
L F W A V R G A G P N F G V V T E V E V
TTGTTCTGGGCGGTTAGAGGTGCGGGCCCCAACTTCGGTGTCGTCACAGAGGTCGAGGTC
201
601
Q L Y E L P R K M L A G F I T W A P S V
CAGCTCTACGAGCTACCGAGGAAGATGCTCGCCGGATTCATTACCTGGGCCCCCTCGGTC
221
661
S E L A G L L T S L L D A L N E M A D H
AGCGAACTCGCAGGGCTCCTGACATCCCTCCTTGATGCGCTCAACGAAATGGCGGATCAC
241
721
I Y P S V F V G V D E N R A P S V T V C
ATCTACCCCAGCGTTTTCGTCGGCGTGGACGAAAACAGGGCACCTTCCGTTACGGTATGC
261
781
281
841
V G H L G G L D I A E R D I A R L R G L
GTGGGGCACCTCGGAGGGCTCGATATCGCTGAACGGGACATAGCACGGCTTCGGGGTCTG
G R T V S D S I A V R S Y D E V V A L N
GGTCGGACGGTGTCCGATTCGATCGCCGTCCGATCATATGACGAGGTAGTGGCTCTTAAC
301
901
A E V G S F E D G M S N L W I D R E I A
GCTGAGGTGGGCAGTTTCGAGGACGGAATGTCCAATCTCTGGATCGACCGGGAGATCGCG
321
961
M P N A R F A E A I A G N L D K F V S E
ATGCCGAACGCTCGTTTCGCCGAAGCGATTGCAGGCAATCTTGACAAGTTTGTTAGTGAA
341
1021
P A S G G S V K L E I E G M P F G N P K
CCCGCAAGCGGAGGCTCCGTCAAACTGGAGATCGAGGGAATGCCGTTCGGAAACCCCAAG
361
1081
R T P A R H R D A M G V L A L A E W S G
AGGACGCCCGCTAGACATCGCGATGCGATGGGCGTGCTGGCCCTGGCGGAATGGAGCGGG
381
1141
A A P G S E K Y P E L A R E L D A A L L
GCGGCTCCTGGAAGTGAAAAGTACCCCGAGTTGGCACGTGAACTGGACGCCGCGCTCCTT
160
Anhang
401
1201
R A G V T T S G F G L L N N N S E V T A
CGCGCAGGCGTGACGACTTCTGGGTTTGGACTGCTAAACAACAACTCAGAGGTCACAGCA
421
1261
E M V A E V Y K P E V Y C R L A A V K R
GAGATGGTCGCTGAAGTTTATAAGCCGGAAGTTTATTGTCGTCTTGCGGCAGTCAAACGT
441
1321
E Y D P E N R F R H N Y N I D P E G S STOP
GAATACGACCCTGAGAACCGTTTTCGTCACAACTACAATATAGATCCCGAGGGATCTTGA
Stellen an denen mutiert wurde und die dazugehörigen Aminosäuren sind in fett gedruckt und unterstrichen.
Die Aminosäuren bzw. Basen, welche durch die N-terminale Deletion (6HDNOn) fehlen sind schwarz
hinterlegt.
8.4 Sequenz der PGAL-Mutante KEDWFF (DNA und Protein)
1
1
M T K T L P K D F
AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTAAAACACTTCCTAAAGATTTT
10
28
I F G G A T A A Y Q A E G A T H T D G K
ATTTTTGGTGGTGCTACAGCTGCTTATCAAGCAGAAGGTGCAACTCACACAGATGGTAAG
30
88
G P V A W D K Y L E D N Y W Y T A E P A
GGCCCAGTAGCATGGGATAAGTATCTTGAAGACAATTATTGGTATACAGCAGAACCTGCA
50
148
S D F Y H K Y P V D L E L A E E Y G V N
AGTGATTTTTACCATAAATACCCAGTTGATTTAGAATTAGCTGAAGAATATGGTGTTAAT
70
208
G I R I S I A W S R I F P T G Y G E V N
GGTATTCGTATTTCTATTGCCTGGTCTCGTATTTTCCCAACGGGTTACGGTGAAGTAAAT
90
268
E K G V E F Y H K L F A E C H K R H V E
GAAAAAGGTGTTGAATTCTACCATAAACTATTTGCTGAATGCCACAAGCGTCATGTTGAA
110
328
P F V T L H H F D T P E A L H S N G D F
CCATTTGTGACTTTGCATCATTTTGACACACCAGAAGCTCTTCATTCAAATGGAGATTTC
130
388
L N R E N I E H F I D Y A A F C F E E F
TTAAACCGCGAAAATATAGAACACTTTATAGATTATGCCGCTTTCTGTTTTGAAGAGTTT
150
448
P E V N Y W T T F N E I G P I G D G Q Y
CCAGAAGTAAACTACTGGACAACTTTCAATGAAATTGGCCCAATTGGTGATGGTCAATAC
170
508
L V G K F P P G I K Y D L A K V F Q S H
TTGGTTGGTAAATTCCCTCCAGGCATTAAATATGATCTTGCCAAAGTCTTCCAATCACAC
190
568
H N M M V S H A R A V K L Y K D K G Y K
CACAACATGATGGTCTCTCATGCACGTGCTGTAAAATTGTATAAGGATAAAGGTTATAAA
210
628
G E I G V V H A L P T K Y P Y D P E N P
GGTGAAATTGGTGTTGTTCATGCTTTACCAACTAAATACCCTTATGATCCGGAAAATCCA
230
688
A D V R A A E L E D I I H N K F I L D A
GCAGATGTTCGTGCTGCTGAACTTGAAGACATCATCCATAACAAATTTATCTTGGATGCA
250
748
T Y L G H Y S D K T M E G V N H I L A E
ACCTATCTTGGGCACTATTCAGATAAAACGATGGAAGGTGTCAACCATATCCTAGCTGAG
270
808
N G G E L D L R D E D F Q A L D A A K D
AATGGTGGAGAACTTGATCTTCGTGATGAAGACTTCCAAGCTCTTGACGCAGCTAAAGAT
290
868
L N D F L G I N Y Y M S D W M Q A F D G
TTGAATGATTTCCTTGGTATCAACTATTACATGAGTGATTGGATGCAAGCTTTTGATGGT
161
Anhang
310
928
E T E I I H N G K G E K G S S K Y Q I K
GAGACTGAAATCATTCACAATGGTAAGGGTGAAAAAGGAAGCTCTAAGTACCAAATTAAG
330
988
G V G R R V A P D Y V P R T D W D W I I
GGTGTTGGTCGTCGAGTAGCTCCTGACTATGTTCCGCGCACAGACTGGGATTGGATTATT
350
1048
Y P E G L Y D Q I M R V K N D Y P N Y K
TATCCTGAAGGCTTGTATGACCAAATCATGCGAGTGAAAAATGATTATCCGAATTACAAG
370
1108
K I Y I T E N G L G Y W D E F V D N T V
AAGATTTACATCACTGAAAACGGTCTCGGATACTGGGATGAGTTTGTAGATAATACTGTT
390
1168
Y D D G R I D Y V K Q H L E V L S D A I
TATGATGATGGTCGTATTGATTACGTGAAGCAACACTTGGAAGTTTTATCAGACGCGATT
410
1228
A D G A N V K G Y F I W S L M D V F S W
GCGGATGGTGCAAATGTTAAAGGTTACTTCATTTGGTCACTTATGGACGTTTTCTCATGG
430
1288
S N G Y F K R Y G L F Y V D F F T Q E R
TCAAATGGTTATTTTAAACGTTATGGATTGTTCTATGTAGACTTTTTTACGCAAGAACGC
450
1348
Y P K K S A H W Y K K L A E T Q V L E C
TATCCTAAGAAATCAGCACATTGGTATAAGAAATTAGCAGAAACTCAAGTGCTCGAGTGC
470
1408
STOP
TAATATCACCTGAGAATGTAATAATTTGTTATCTGATTTTTAGATCAGGCTTTGAAAAGG
1468
TATATATTATTAATTTAGAAGATTGTCCTATAATTCCTGAGCTTGAAGCTACCTCACTAC
1528
AAAATGTAGTAACTGGTATGTTTCACCTGGAAAAGAAAGGATTTGCCATTCTGATTTAGC
1588
ATTATCCGAATTTGAATGGGAAGTTTTACAATTACTCGATGTAGCAATATGTGAGACTGT
1648
TCACTTCGAGGTAGATTATTTGCCTTTCCAATAACAAAAAGAAAGGAATTGACTGTGACT
1728
ATCGAATTAAAAAACGAGTATCTTACGGTTCAGTTTGACGGATCCGGCTGCTAACAAA
In der Sequenzliste des pET3b-Vektors ist das zu Mutante KEDWFF korrespondierende Gen durch graue
Schreibweise hervorgehoben. Die Zählung der Sequenzen startet mit dem Gen der Mutante. Stellen an denen
mutiert wurde und die dazugehörigen Aminosäuren sind in schwarz und fett gedruckt und unterstrichen. Die
Nde I und BamH I Schnittstelle sind grau beziehungsweise schwarz hinterlegt.
162
Anhang
8.5 Ergebnisse zur Mutante TKEDFWMF-Nr.11
Bei
der
Mutante
TKEDFWMF-Nr.11
wurden
polare
und
geladene
Aminosäureresten durch große hydrophobe ausgetauscht. Dadurch wurde der f-f-Kontakt
von 633 Å2 auf 873 Å2 vergrößert und durch die neuen hydrophoben Wechselwirkungen
stabilisiert.
In Abbildung 66 sind beispielhaft die GPC-Elutionsdiagramme, der herkömmlichen
(Kapitel 5.3) und der alternativen His-tag-Reinigung, der Mutante TKEDFWMF-Nr.11
detailliert dargestellt. Der Dimeranteil der Mutante aus der herkömmlichen Produktion lag
im Idealfall bei 56% (Abbildung 66a, Tabelle 22). Dies war der höchste je erreichte Anteil
aller präparierten Mutanten. Allerdings waren nicht alle Präparationen dieser Mutante
homogen, das heißt es wurde mehrmals nur etwa 40 % Dimer, neben Oligomer und einem
breiten Monomer-peak, erhalten. Mittels DLS wurde die Molekularmasse der vereinigten
Dimerfraktionen zu 106 kDa bestimmt (Tabelle 24). Eine Abschätzung der Einheitlichkeit
der Partikelgrößenverteilung beruhend auf dem Wert baseline (Tabelle 8) ergab eine
bimodale Verteilung. Dies läßt den Schluß zu, daß ein Teil des Dimers zum Monomer
dissoziert. Dieses wird durch die Rechromatographie des Dimer-peaks bestätigt nach der
das Dimer nur zu 92% vorlag (Abbildung 66b, Tabelle 22).
Wie in Abbildung 66c zu sehen ist, war die Ausbeute an Dimer bei der alternativen
His-tag-Reinigung mit 34% geringer (Abbildung 59, Tabelle 25). Nach dem
proteolytischem Verdau der vereinigten Dimer-Fraktionen und Aufreinigung mittels GPC
lag der Anteil an prozessiertem PGAL*-Dimer dann bei 88% (Abbildung 66d, Tabelle 26).
Bei der DLS mit PGAL*-Dimer wurde ein Molekularmasse von 136 kDa bei einer
bimodalen Verteilung detektiert (Tabelle 26). Dieser Wert liegt noch im Fehlerbereich der
erwarteten 108 kDa.
Aus der großen Anzahl von Kristallisationsexperimenten (Tabelle 28) mit den
vereinigten TKEDFWMF-Nr.11 Dimer-Fraktionen wurden nur mit Ammoniumsulfat
initalen „Kristalle“ (Abbildung 61) erhalten. Diese Kristalle konnten mit Protein aus
verschiedenen
Präparationen
dieser
Mutante
reproduziert
werden.
Die
Kristallisationsbedingung (Abbildung 61) ähnelt allerdings der von Kristallform C (Tabelle
1) und nicht der von der erwarteten Kristallform A. Diese vermutlichen Kristalle, welche
große Ähnlichkeit mit dem Literaturbeispiel von zu schnell wachsenden Kristallen
(Bergfors,
1999)
hatten,
konnten
bei
TKEDFWMF-Nr.11* nicht reproduziert werden.
Kristallisationsexperimenten
mit
163
Anhang
0.9
b)
TKEDFWMF-Nr.11
0.9
0.8
0.8
0.7
0.7
0.6
0.6
Absorption A 280
Absorption A 280
a)
0.5
0.4
0.3
TKEDFWMF-Nr.11
0.5
0.4
0.3
0.2
0.2
v0
0.1
v0
0.1
0.0
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0
130
10
20
30
40
50
c)
1.6
60
70
80
90
100
110
120
Elution [mL]
Elution [mL]
d)
TKEDFWMF-Nr.11-His-tag
0.5
TKEDFWMF-Nr.11*
1.4
Absorption [AU]
Absorption [AU]
0.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.3
0.2
0.4
0.1
V0
0.2
V0
0.0
0.0
0
50
100
150
200
Abbildung 66
250
300
0
50
100
150
200
250
Elutionsdiagramme von GPC-Läufen der Mutante TKEDFWMF-Nr.11 auf Superdex-200
prep grade Säulen (a,b: 16/60, c,d: 26/60): (a) nach herkömmlicher Reinigung
(TKEDFWMF-Nr.11) (b) Rechromatographie des Dimer-peaks aus a) (c) nach His-tagReinigung (TKEDFWMF-Nr.11-His-tag) (d) prozessiertes PGAL*-Dimer aus c)
(TKEDFWMF-Nr.11*). Der Balken unter den peaks markiert die zur Rechromatographie
(a) bzw. zur proteolytischen Spaltung (c) vereinigten Fraktionen. Der Monomer-DimerStandard ist jeweils als gepunktete Linie eingetragen.
130
Danksagung
165
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde im Arbeitskreis von Prof. Dr. Georg E. Schulz am
Institut für Organische Chemie und Biochemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
im Breisgau angefertigt.
Prof. Dr. Georg E. Schulz danke ich für die Vergabe der vielseitigen Themen, sein
Interesse am Fortgang der Arbeit und seine stete Diskussionsbereitschaft.
Ein ganz besonderer Dank gilt den Computer-Administratoren des Arbeitskreises:
Michael Claus, Markus Krömer, Dirk Reinert und Christian Schleberger und Georg
Zocher. Durch deren ständige Modernisierung und Pflege der Computersysteme und
Programme meine Arbeit wesentlich erleichtert wurde. Außerdem waren sie immer
Ansprechpartner in allen kristallographischen Fragen. Besonderer Dank gilt in diesem
Zusammenhang auch Daniel Kloer für die ständige Diskussionsbereitschaft, die mir auf
meinem Weg zu Strukturlösung sehr geholfen hat.
Linda Böhm danke ich recht herzlich für ihre Hilfsbereitschaft und ihr großes
Engagement im Arbeitskreis. Vielen Dank an Bärbel Dirr für die Hilfe bei der Präparation
der PGAL-Mutanten.
Ein großes Dankeschön geht an alle jetzigen und ehemaligen Office-Insassen für
die schönen Jahre im und auch außerhalb des Labors.
Allen Mitarbeitern des Labors, die hier nicht explizit erwähnt wurden, möchte ich
für die angenehme Atmosphäre, die Hilfsbereitschaft und die stets gute Stimmung danken.
Zuguterletzt danke ich meinen Eltern herzlich dafür, daß sie mich in all den Jahren
unterstützt haben. Ganz besonderen danke ich Anike für das große Verständnis, die
Unterstützung und Aufmunterung auf dem Weg zu den Sternen.

Röntgenstrukturanalyse der 6-Hydroxy-D-Nikotin

Transcription

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