Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren

Transcription

Evaluierung adenoviraler und herpesviraler
Vektoren zur anti-retroviralen Vakzinierung im
Friend-Virus-Modell
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
an der Fakultät für Chemie und Biochemie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt in der
Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie
Arbeitsgruppe PD Dr. med. Oliver Wildner
vorgelegt von
Diplom-Biochemikerin Wibke Bayer
aus Hagen
Bochum, Dezember 2007
Success consists of going from failure to failure without loss of enthusiasm.
Winston Churchill
I
Abkürzungsverzeichnis
Ad5
AdV
AEC
AIDS
APC
Adenovirus Typ 5
Adenovirus
Aminoethylcarbazol
Aquired Immunodeficiency Syndrome
Allophycocyanin
BAC
BSA
bacterial artificial chromosome
bovines Serum-Albumin
CAR
CFSE
CMV
CpG-ODN
CTL
Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor
Carboxyfluoresceinsuccinimidylester
Cytomegalovirus
CpG-Sequenz enthaltendes Oligodeoxynukleotid
cytotoxische T-Lymphozyten
DC
DNA
d p.i.
Dendritische Zelle
Desoxyribonukleinsäure
Tage nach Belastungsinfektion
Env
envelope
FCS
FITC
FFU
F-MuLV
FV
fetales Kälberserum
Fluoresceinisothiocyanat
focus forming units
Friend Murine Leukemia Virus
Friend Virus
Gag
GM-CSF
gp
group antigen
Granulozyten-Macrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
Glykoprotein
HAART
HBsAg
HIV
HPV
HRP
HSV
HTLV
Hoch-aktive anti-retrovirale Therapie
Hepatitis B-Virus Oberflächenantigen
Humanes Immundefizienzvirus
Humanes Papilloma-Virus
Horseraddish-Peroxidase
Herpes simplex-Virus
Humanes T-Zell-Leukämie-Virus
i.d.
i.m.
i.p.
i.v.
IC
ICP
IL
intradermal
intramuskulär
intraperitoneal
intravenös
infektiöse Zentren
intrazelluläres Protein
Interleukin
kb
Kilobasen
MHC
MVA
MV
major histocompatibility complex
Modifiziertes Vakzinia-Virus Ankara
Masernvirus
OD
optische Dichte
II
PCR
PE
p.i.
poly(I:C)
Polymerase-Kettenreaktion
Phycoerythrin
nach Infektion
Polyriboinosin-Polyribocytidinsäure
RNA
RPE
RSV
RT
Ribonukleinsäure
Rhodamin-Phycoerythrin
Respiratorisches Syncytialvirus
Raumtemperatur
SFFU
SFFV
SIV
spleen focus forming units
Spleen Focus Forming Virus
Affen-Immundefizienzvirus (simian immunodeficiency virus)
TAP
TLR
TM
Treg
transporter associated with antigen processing
Toll-like-Rezeptor
Transmembrandomäne
regulatorische T-Zelle
vp
virale Partikel
III
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
1. Einleitung
II
VII
VIII
1
1.1 Retroviren......................................................................................................................... 1
1.1.1 Humanes Immundefizienz-Virus .............................................................................. 1
1.1.2 Friend-Virus .............................................................................................................. 6
1.2 Adenovirale Vektoren ...................................................................................................... 7
1.3 Herpesvirale Vektoren.................................................................................................... 10
1.4 Immunisierungsstrategien .............................................................................................. 12
2. Zielsetzung
15
3. Material und Methoden
17
3.1 Material .......................................................................................................................... 17
3.1.1 Geräte ...................................................................................................................... 17
3.1.2 Verbrauchsmaterialien ............................................................................................ 18
3.1.3 Chemikalien ............................................................................................................ 18
3.1.4 Enzyme.................................................................................................................... 20
3.1.5 Reagenzsysteme ...................................................................................................... 21
3.1.6 Puffer und Lösungen ............................................................................................... 21
3.1.7 Medien..................................................................................................................... 23
3.1.7.1 Medien für die Kultur eukaryontischer Zellen................................................. 23
3.1.7.2 Medien für die Bakterienkultur ........................................................................ 24
3.1.8 Plasmide .................................................................................................................. 24
3.1.9 Oligonukleotide....................................................................................................... 26
3.1.10 Standards ............................................................................................................... 28
3.1.11 Peptide................................................................................................................... 28
3.1.12 Antikörper und Tetramere..................................................................................... 28
3.1.13 Bakterien ............................................................................................................... 29
3.1.14 Zelllinien ............................................................................................................... 29
3.1.15 Viren...................................................................................................................... 30
3.1.16 Versuchstiere......................................................................................................... 30
3.2 Methoden........................................................................................................................ 30
3.2.1 Molekularbiologische Arbeitsmethoden ................................................................. 30
3.2.1.1 PCR .................................................................................................................. 30
3.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA ............................................................. 31
3.2.1.3 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen ...................................................... 31
3.2.1.4 TA-Klonierung ................................................................................................. 31
3.2.1.4.1 Anhängen eines überhängenden Adenosin ................................................... 31
3.2.1.4.2 TA-Klonierung .............................................................................................. 31
3.2.1.5 Ligation von DNA-Fragmenten ....................................................................... 31
3.2.1.6 Transformation von Bakterien ......................................................................... 31
3.2.1.6.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien............................................... 31
3.2.1.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien ........................................ 32
3.2.1.6.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien.................................................... 32
3.2.1.6.4 Transformation elektrokompetenter Bakterien ............................................. 32
IV
Inhaltsverzeichnis
3.2.1.7 Plasmid-Isolation im analytischen Maßstab (Mini-Prep)................................. 32
3.2.1.8 Plasmid-Isolation im präparativen Maßstab (Maxi-Prep)................................ 33
3.2.1.9 Restriktion ........................................................................................................ 33
3.2.1.10 DNA-Fällung.................................................................................................. 33
3.2.1.11 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) von Proteinen.................... 33
3.2.1.12 Western Blot................................................................................................... 34
3.2.2 Zytologische Methoden........................................................................................... 34
3.2.2.1 Kultivierung von Zelllinien.............................................................................. 34
3.2.2.2 Zellen einfrieren und auftauen ......................................................................... 35
3.2.2.3 DNA-Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Methode ............... 35
3.2.2.4 DNA-Transfektion von Zellen mittels Lipofektion ......................................... 35
3.2.2.5 Luciferase-Assay.............................................................................................. 35
3.2.2.6 Virus-Aufreinigung .......................................................................................... 35
3.2.2.6.1 Aufreinigung von Adenoviren ...................................................................... 35
3.2.2.6.2 Aufreinigung von Herpesviren...................................................................... 36
3.2.2.7 Titerbestimmung .............................................................................................. 36
3.2.2.7.1 TCID50 ........................................................................................................... 36
3.2.2.7.2 Titerbestimmung über optische Dichte ......................................................... 36
3.2.3 Immunologische Methoden..................................................................................... 37
3.2.3.1 Vakzinierungen ................................................................................................ 37
3.2.3.2 Belastungsinfektion.......................................................................................... 37
3.2.3.3 Palpation der Milz ............................................................................................ 37
3.2.3.4 Blutentnahme ................................................................................................... 37
3.2.3.5 Bestimmung der Viruslast................................................................................ 38
3.2.3.5.1 Bestimmung der Plasma-Virämie ................................................................. 38
3.2.3.5.2 Immuncytochemische Bestimmung der Viruslast in der Milz im infectious
center- (IC-) Assay....................................................................................................... 38
3.2.3.5.3 Bestimmung der Viruslast in der Milz durch quantitative PCR.................... 39
3.2.3.6 Bestimmung der humoralen Immunantwort .................................................... 39
3.2.3.6.1 Bindende Antikörper ..................................................................................... 39
3.2.3.6.2 Neutralisierende Antikörper.......................................................................... 40
3.2.3.7 Bestimmung der zellulären Immunantwort...................................................... 40
3.2.3.7.1 Tetramerfärbung............................................................................................ 40
3.2.3.7.2 Proliferationstest............................................................................................ 41
4. Ergebnisse
42
4.1 Herstellung der Impfvektoren ........................................................................................ 42
4.1.1 Herstellung der adenoviralen Impfvektoren............................................................ 42
4.1.2 Herstellung der herpesviralen Impfvektoren........................................................... 47
4.2 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden adenoviralen Vektoren .............................. 49
4.2.1 Ermittlung der geeigneten Route der Vektor-Applikation...................................... 49
4.2.2 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg......................................... 49
4.2.3 Vergleich homologer und heterologer Impfstrategien ............................................ 51
4.2.3.1 Bestimmung der Immunprotektion durch homologe und heterologe
Vakzinierungen ............................................................................................................ 51
4.2.3.2 Charakterisierung der Immunantwort auf homologe und heterologe adenovirale
Vakzinierungen ............................................................................................................ 54
4.2.4 Einfluss der Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels mit Cardiotoxin auf den
Impferfolg......................................................................................................................... 57
4.2.5 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen auf den
Impferfolg......................................................................................................................... 58
V
Inhaltsverzeichnis
4.2.6 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg....................... 59
4.2.7 Beurteilung von Env-Fusionsproteinen für die Vakzinierung ................................ 60
4.3 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden Herpes simplex-Viren ............................... 62
4.3.1 Vergleich replikations-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren........................ 62
4.3.2 Vergleich des Immunschutzes nach Vakzinierung mit replikations-defekten HSVVektoren und mit replikations-kompetenten HSV-Vektoren unter gleichzeitiger
Aciclovir-Behandlung ...................................................................................................... 64
5. Diskussion
66
6. Zusammenfassung
73
7. Referenzen
74
8. Dissertationsbezogene bibliografische Daten
89
Publikationen................................................................................................................ 89
Präsentationen .............................................................................................................. 90
9. Lebenslauf
91
10. Danksagung
92
VI
Abb. 1.1 Weltweite Verbreitung der HIV-Infektion 2006 ..................................................... 2
Abb. 1.2 HIV-Genom............................................................................................................. 3
Abb. 1.3 Genomaufbau von F-MuLV und SFFV .................................................................. 6
Abb. 1.4 Splenomegalie nach FV-Infektion........................................................................... 6
Abb. 1.5 Schematischer Aufbau des Genoms des humanen Ad5 .......................................... 8
Abb. 1.6 Struktur des AdV-Virion ......................................................................................... 8
Abb. 1.7 Bindung von Ad5 an Zielzelle................................................................................. 9
Abb. 1.8 Genom von HSV-1................................................................................................ 11
Abb. 3.1 Immunisierungsschema ......................................................................................... 37
Abb. 3.2 MHC I- und -II-Tetramere .................................................................................... 40
Abb. 4.1 AdEasy-System ..................................................................................................... 42
Abb. 4.2 Env- und Gag-kodierende AdV............................................................................. 43
Abb. 4.3 Zytokin-kodierende AdV ...................................................................................... 44
Abb. 4.4 Env-Fusionsprotein-kodierende AdV.................................................................... 46
Abb. 4.5 HSVQuik-System.................................................................................................. 47
Abb. 4.6 Herpesvirale Impfvektoren.................................................................................... 48
Abb. 4.7 Ermittlung der geeigneten Route der Vektor-Applikation .................................... 49
Abb. 4.8 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg in C57BL/6-Mäusen..... 50
Abb. 4.9 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg in CB6F1-Mäusen ........ 50
Abb. 4.10 Vergleich homologer und heterologer Prime-Boost-Vakzinierungen von
C57BL/6- und CB6F1-Mäusen .................................................................................... 52
Abb. 4.11 Einfluss der Vakzinierung auf den FV-induzierten Krankheitsverlauf............... 53
Abb. 4.12 Einfluss der Vakzinierung auf die späte Phase der Infektion.............................. 54
Abb. 4.13 Nachweis FV-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen im Proliferationstest ....... 55
Abb. 4.14 nachweis Epitop-spezifischer CD4+ T-Zellen durch MHC II-Tetramerfärbung. 55
Abb. 4.15 Nachweis bindender und neutralisierenderAntikörper........................................ 56
Abb. 4.16 Einfluss der Vorbehandlung des injizierten Muskels mit Cardiotoxin ............... 57
Abb. 4.17 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen auf den
Impferfolg............................................................................................................................. 58
Abb. 4.18 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg................... 60
Abb. 4.19 Env-Fusionsproteine für die Vakzinierung ......................................................... 61
VII
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abb. 4.20 Neutralisierende Antikörper-Antwort auf pIX-Env-Fusionsprotein-exprimierende
AdV .............................................................................................................................. 62
Abb. 4.21 Vergleich des durch replikations-kompetente und –defekte HSV-Vektoren
vermittelten Schutzes ................................................................................................... 63
Abb. 4.22 Überleben nach Vakzinierung mit replikations-kompetenten oder -defekten
HSV-Vektoren.............................................................................................................. 64
Abb. 4.23 Einfluss von Aciclovir-Behandlung auf den durch HSV-Vektoren vermittelten
Immunschutz in der frühen und späten Infektionsphase.............................................. 65
Tabellenverzeichnis
Tabelle 4.1 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env- und Gag-kodierenden
adenoviralen Impfvektoren ................................................................................ 43
Tabelle 4.2 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Zytokin-exprimierenden
Tabelle 4.3 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env-Fusionsprotein-exprimierenden
Tabelle 4.4 Klonierungsstrategien zur Herstellung der herpesviralen Impfvektoren .......... 48
VIII
Einleitung
1. Einleitung
1.1 Retroviren
Das erste Retrovirus wurde Anfang des 20. Jahrhunderts beschrieben, als Peyton Rous das
nach ihm benannte onkogene Rous-Sarkom-Virus in zellfreien Extrakten aus Geflügelsarkomen identifizierte [1]. In den darauf folgenden Jahren wurden eine Vielzahl weiterer Retroviren entdeckt, darunter das Simian Foamy-Virus [2], das Friend-Virus [3] und das Feline Leukämie-Virus [4]. Anfang der 1980er Jahre wurde mit dem Humanen T-Zell-Leukämie-Virus
(HTLV) [5] das erste humanpathogene Retrovirus beschrieben. Weltweit sind heute etwa 20
Millionen Menschen mit HTLV-1 infiziert, von denen etwa 4 % nach oft langer Latenzphase
von 40 bis 60 Jahren an einer T-Zell-Leukämie erkranken [6].
Die Familie der Retroviridae umfasst die sieben Genera der α-, β-, γ-, δ- und ε-Retroviren
sowie der Lentiviren und der Spumaviren. Retroviren kommen überwiegend bei Wirbeltieren
vor, wo sie teils schwerwiegende Erkrankungen wie Immundefizienzen und Tumorerkrankungen verursachen. Neben exogenen Retroviren, die einen vollständigen Infektionszyklus mit Freisetzung infektiöser Viruspartikel durchlaufen, gibt es endogene Retroviren, die
in allen Zellen eines Organismus ins Genom integriert sind und vertikal über die Keimbahnzellen übertragen werden, die Genome dieser Viren weisen häufig große Deletionen auf [7].
Retroviren sind umhüllte RNA-Viren mit einer Größe von 80-100 nm, die zwei Kopien linearer Positivstrang-RNA von etwa 10 kb Länge enthalten und über ein DNA-Intermediat replizieren. Nach der Infektion einer Wirtszelle wird das RNA-Genom durch das viruseigene Enzym Reverse Transkriptase in ein doppelsträngiges DNA-Molekül umgeschrieben, das in den
Zellkern transportiert und durch die virale Integrase in das Wirtsgenom integriert wird [7].
1.1.1 Humanes Immundefizienz-Virus
Kurz nach der Entdeckung der humanpathogenen Retroviren HTLV-1 und HTLV-2 wurde
1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency
syndrome) Erkrankten isoliert, das zunächst als Humanes T-Zell-Leukämie-LymphomaVirus-III oder Lymphadenopathie-assoziiertes Virus bezeichnet wurde [8]. Nach Angaben der
Weltgesundheitsorganisation waren 2007 weltweit 33,2 Millionen Menschen mit HIV infiziert und 2,1 Millionen starben an den Folgen von HIV/AIDS [9;10]. Mehr als die Hälfte der
HIV-Infizierten lebt im subsaharischen Afrika, wo die Seroprevalenz in manchen Gegenden
bei ~35 % liegt, etwa ein Viertel der HIV-Infizierten lebt in Süd-/Südost-Asien (Abb. 1.1) [9].
1
Einleitung
Abb. 1.1 Weltweite Verbreitung der HIV-Infektion 2007
Etwa 33,2 Millionen Menschen waren im Jahr 2007 mit HIV infiziert. Mehr als die Hälfte der Infizierten lebt im
subsaharischen Afrika, ein weiterer großer Teil der Infizierten lebt in Süd-/Südost-Asien [9].
Man unterscheidet die beiden Typen HIV-1 und HIV-2, welche jeweils zahlreiche Subtypen
und Intersubtypen umfassen, die in den Gruppen M, N und O (HIV-1) bzw. A-H (HIV-2) zusammengefasst werden. Bei der HIV-Infektion handelt es sich um eine Zoonose, wobei die
beiden Typen HIV-1 und HIV-2 in den Affen-Immundefizienzviren (SIV) der Schimpansen
(Pan troglodytes troglodytes; SIVcpz) bzw. der Halsbandmangaben (Cercocebus atys atys;
SIVsmm) unterschiedliche Ursprünge haben. Die verschiedenen Virusgruppen stammen jeweils aus voneinander isolierten Affen-Populationen und sind auf separate Übertragungsereignisse zurückzuführen [11;12]. Die Ausbreitung von HIV-1 und HIV-2 und auch der Subgruppen ist unterschiedlich, Infektionen mit HIV-1/N- und HIV-1/O sind weitestgehend auf
Gabun und Kamerun beschränkt [13;14], wohingegen die Gruppe M-Viren weltweit pandemisch verbreitet sind [15;16]. HIV-2 ist generell weniger verbreitet als HIV-1, die meisten Infizierten sind in Westafrika zu finden [17;18]. Die HIV-Pandemie wurde erst Anfang der
1980er Jahre wahrgenommen, jedoch konnte retrospektiv eine Serumprobe eines Patienten
aus Kinshasa aus dem Jahr 1959 als seropositiv identifiziert werden [19]. Genetische Analy-
2
Einleitung
sen haben ergeben, dass die erste Übertragung des HIV-1/M-Vorläufers auf den Menschen
Anfang der 1930er Jahre stattgefunden hat [20].
HIV gehört zu den Lentiviren, das komplexe Genom hat eine Länge von etwa 9,8 kb, es kodiert die viralen Strukturproteine Gag, Pol und Env sowie die regulatorischen Proteine Tat
und Rev und die akzessorischen Proteine Vif, Vpr, Vpu (bzw. Vpx bei HIV-2) und Nef (Abb.
1.2).
Ψ
Abb. 1.2 Genom von HIV-1
Das HIV-Genom hat eine Länge von etwa 9,8 kb. Es enthält LTR- (long terminal repeat-) Regionen an den Genom-Enden und das Verpackungssignal Ψ und kodiert neben den Strukturproteinen Gag, Pol und Env die akzessorischen und regulatorischen Proteine Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat und Nef.
Das env-kodierte Hüllprotein gp120 vermittelt die Adsorption des Virus an das auf Helfer-TZellen, Monocyten und Makrophagen exprimierte Oberflächenprotein CD4 [21;22] Zur Fusion mit der Zellmembran ist die Interaktion mit den Chemokinrezeptoren CCR5 oder CXCR4
als Korezeptor notwendig. In der akuten Phase der HIV-Infektion nutzen die Viren CCR5 als
Korezeptor, was die Infektion von Makrophagen, dendritischen Zellen und Gedächtnis-CD4+
T-Zellen erlaubt [23-25]. Es kommt zu einer massiven Depletion von CD4+ CCR5+ T Zellen
im Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe und potentiell irreversiblen Schädigung der
CD4+ T-Zell-mediierten Immunfunktionen. In der chronischen Phase der HIV-Infektion entstehen Virus-Mutanten, die den Korezeptor CXCR4 nutzen, was nun zu einer Infektion von
ruhenden, naiven CD4+ T-Zellen und einer systemischen Depletion von CD4+ T-Zellen führt
[25-27]. Dies führt zu Immundefizienz und damit verbundenen opportunistischen Infektionen
und Malignomen.
Zwar gibt es die Möglichkeit, durch eine antivirale Kombinationstherapie aus meist zwei
nukleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitoren und einem Proteasehemmer bzw. einem
nicht-nukleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitor und eventuell einem Fusions- oder Integrase-Inhibitor die HIV-Infektion über längere Zeit zu kontrollieren, jedoch kann die Infektion nicht vollständig eliminiert werden, so dass es in den meisten Fällen nach längerer Therapie auf Grund von Resistenzbildung dennoch zur erneuten Ausbreitung des Virus und zur
3
Einleitung
Erkrankung kommt. Die antivirale Kombinationstherapie ist mit zum Teil erheblichen Nebenwirkungen verbunden, was häufig zu Therapieabbrüchen führt, und verursacht des Weiteren erhebliche Kosten, weshalb sie einem Großteil der HIV-Infizierten nicht zugänglich ist
[28]. Daher ist die Entwicklung eines effektiven präventiven Impfstoffes von herausragender
Bedeutung. Ein effektiver HIV-Impfstoff sollte neutralisierende Antikörper induzieren, die
gegen möglichst viele primäre Virusisolate reaktiv sind, um die Primärinfektion und die Virusausbreitung zu verhindern. Weiterhin sollte der Impfstoff auch spezifische zytotoxische
CD8+ T-Zellen induzieren, um die Elimination infizierter Zellen zu ermöglichen [29]. Die
Entwicklung eines solchen Impfstoffes wird durch zahlreiche Herausforderungen erschwert.
Das Virusgenom zeigt eine Hypervariabilität sowohl in infizierten Personen als auch innerhalb von Populationen, die durch schnelle Replikation, durch die virale Reverse Transkriptase
bedingte hohe Mutationsraten [30] sowie durch Rekombinationen verursacht wird. Das Hüllprotein von HIV besitzt eine dichte Glykosylierung, was die Bildung von neutralisierenden
Antikörpern erschwert. Da HIV eine persistierende Infektion etabliert, muss die Immunantwort innerhalb eines engen Zeitfensters die Infektion verhindern. Weiterhin konnte bislang
nicht geklärt werden, welche HIV-Antigene sich für die Ausbildung einer effektiven Immunantwort eignen [29].
Die Entwicklung einer effektiven HIV-Vakzine wird außerdem durch das Fehlen eines geeigneten Kleintiermodells erschwert. Nur Schimpansen sind permissiv für eine HIV-1-Infektion,
jedoch ist die Viruslast im Plasma von mit primären HIV-Isolaten infizierten Schimpansen
sehr niedrig und die Tiere entwickeln in der Regel auch nach langer Zeit keine AIDSSymptomatik, weshalb die Relevanz dieses Tiermodells kontrovers diskutiert wird [31;32].
Hinzu kommen ethische und finanzielle Gründe, die gegen die Verwendung von Schimpansen
für Vakzinierungsstudien sprechen [33]. Mäuse sind nicht permissiv für eine HIV-Infektion,
daher kann in Vakzinierungsexperimenten in Mäusen nur die Immunantwort charakterisiert
werden. Es gibt aber artifizielle Modelle, in denen immundefiziente Mäuse mit humanen
Leukozyten rekonstituiert werden [34;35]. Dies erlaubt die Testung von antiviralen Agenzien
und Vakzinen, das Modell hat aber den Nachteil, dass die Effizienz der Repopulation variieren kann und nur jeweils eine begrenzte Anzahl an Tieren zur Verfügung steht [33]. Für zahlreiche Studien wurde die Infektion von Rhesus-Makaken mit SIV genutzt, dieses Modell hat
den Vorteil, dass einige SIV-Isolate in Makaken AIDS verursachen und ein ähnlicher Infektionsverlauf zu beobachten ist [36;37]. Neben strukturellen Unterschieden zwischen SIV und
HIV ist auch die Korezeptor-Verwendung unterschiedlich, was die Interpretation von Vakzinierungsstudien erschweren kann. Dieses Problem kann durch die Verwendung von chimären
4
Einleitung
SIV (SHIV), welche die HIV-Env-Glycoproteine exprimieren, umgangen werden [38-42].
Die Kinetik der Reduktion CD4+ T-Zellen kann aber auch bei der Infektion mit diesen SHIV
schneller sein als bei der HIV-Infektion im Menschen [43]. Zusätzlich ist der Vergleich verschiedener Impfstrategien auf Grund meist niedriger Tierzahlen und des heterogenen genetischen Hintergrundes der Makaken erschwert [33]. Daher werden Vakzinierungsstudien auch
in anderen Infektionsmodellen durchgeführt, ein nützliches Modell für eine retrovirale Infektion ist die Infektion von Mäusen mit dem Friend-Virus (FV) [3]. Zwar ist die Pathogenese
dieser Infektion anders, doch gibt es Ähnlichkeiten in der Immunreaktion und es lassen sich
verschiedene Vakzine in genetisch identischen Tieren vergleichen, weshalb aus solchen Studien Schlüsse auf die für eine effektive Vakzinierung notwendigen Erfordernisse gezogen
werden können [44-46].
Das letztendliche Ziel der Impfstoffentwicklung ist eine HIV-Vakzine, welche die Infektion
durch das weite Spektrum der weltweit auftretenden HIV-Isolate verhindert und darüber hinaus auch in Entwicklungsländern anwendbar ist. Jedoch würde auch eine Vakzine, welche die
Viruslast senkt und das Fortschreiten zu AIDS verlangsamt, einen signifikanten Einfluss auf
die HIV-Epidemie haben [29]. Eine Vielzahl von Impfstrategien wurde bislang für die HIVVakzinierung evaluiert, darunter Peptid- und Protein-Subunit-Vakzine, DNA- und virale Vektoren sowie verschiedene Kombinationen aus diesen, von denen einige zur Zeit in klinischen
Studien getestet werden. Hier konnte ein auf gp120 basierender Proteinimpfstoff keinen
Schutz vor nachfolgender HIV-Infektion zeigen [47], was vermutlich darauf zurückzuführen
ist, dass Proteinimpfstoffe kaum die Ausbildung zellulärer Immunität induzieren. Auch DNAImpfstoffe alleine führten in klinischen Phase I-Studien zu eher geringen Immunantworten
[48;49]. Häufig verwendete virale Vektoren basieren auf Vakzinia- oder Adenoviren, meistens werden auf dem modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) bzw. auf humanem Adenovirus Typ 5 (Ad5) basierende Vektoren verwendet. Die MVA-basierenden Vektoren wurden
in einer Phase I-Studie evaluiert und führten hier zu eher geringen Immunantworten [50].
Ad5-basierende Vektoren führten in einer Phase I-Studie zu sowohl humoraler als auch zellulärer Immunantwort [51]. In einer groß angelegten multinationalen Phase IIb-Studie hingegen
wurde zum Test des Konzepts eine HIV-Gag, -Pol und -Nef kodierende Ad5-basierende Vakzine evaluiert, die ausschließlich zelluläre Immunität, und nicht wie die meisten für Infektionskrankheiten zugelassenen Impfstoffe neutralisierende Antikörper, induzieren sollte. Dieser
als STEP-Studie bekannte Versuch wurde vorzeitig abgebrochen, nachdem eine Zwischenanalyse keinen Schutz vor HIV-Infektion belegen konnte [52]. In einer heterologen PrimeBoost-Kombination von DNA mit viraler Boost-Immunisierung ließen sich im Tiermodell
5
Einleitung
viel versprechende Immunantworten erreichen [53], die Vakzinierung mit einer DNA-Primeund Ad5-Boost-Immunisierung soll demnächst in der klinischen Phase IIb-Studie PAVE 100
getestet werden, die aber bis zur vollständigen Auswertung der STEP-Studie vorerst aufgeschoben wurde [54].
1.1.2 Friend-Virus
Das Friend-Virus (FV) gehört
Ψ
zu den γ-Retroviren, es ist ein
immunsuppressiver retroviraler
Komplex, der aus dem replikationsdefekten,
pathogenen
Spleen Focus Forming Virus
Ψ
(SFFV) sowie dem replikations-kompetenten,
nicht-pa-
thogenen Helfervirus Friend
Murine
Leukemia
Virus
(F-MuLV) besteht [3]. Beide
Viren besitzen einfache retro-
Abb. 1.3 Genomaufbau von F-MuLV und SFFV
F-MuLV und SFFV besitzen einfache retrovirale Genome, die aus
den für Env, Gag und Pol kodierenden Bereichen sowie LTRRegionen bestehen. Im Genom von SFFV finden sich sieben Deletionen.
virale Genome (Abb. 1.3), jedoch enthält das Genom des SFFV mehrere Deletionen [55], auf
Grund derer das SFFV replikations-defekt und zur Replikation auf das Helfervirus F-MuLV
angewiesen ist. Die Deletion im Env-Protein ist darüber hinaus für die Pathogenität des SFFV verantwortlich. Das trunkierte Env-Protein ist in der Lage,
an der Oberfläche der infizierten Zelle mit dem Erythropoietin-Rezeptor zu interagieren und diesen zu
aktivieren. Diese konstitutive Aktivierung führt zu
einer polyklonalen Proliferation der infizierten Erythroblasten und daraus resultierend zur Entwicklung einer Erythroleukämie und Splenomegalie
(Abb. 1.4; [56]). Die Suszeptibilität für die FVInfektion hängt von verschiedenen genetischen Faktoren ab. Der MHC-Haplotyp bedingt die Fähigkeit,
potente zelluläre Immunantworten gegen FV zu
Abb. 1.4 Splenomegalie nach FVInfektion
Auf Grund der durch die konstitutive Aktivierung des Erythropoietin-Rezeptors verursachten Proliferation der Erythroblasten
entwickeln suszeptible Mäuse nach der Infektion eine Splenomegalie (Infektionsverlauf von links nach rechts) [56].
6
Einleitung
entwickeln, wobei man zwischen den resistenten (H2b) und suszeptiblen Haplotypen unterscheidet (H2d>H2a) [57], das Resistenzgen rfv3 hingegen hat Einfluss auf die humorale Immunantwort gegen FV [57;58]. Das Resistenzgen fv2 beeinflusst die FV-Infektion direkt. Fv2
kodiert eine trunkierte Form der zellulären Kinase Stk (sf-Stk), welche die Interaktion des
SFFV-Env mit dem Erythropoietin-Rezeptor vermittelt [59;60]. In Abwesenheit der sf-Stk
(Fv2r/r) kann keine Interaktion und somit keine konstitutive Proliferation von Erythroblasten
stattfinden, infizierte Mäuse entwickeln weder Leukämie noch Splenomegalie. Zwei in Bezug
auf die FV-Suszeptibilität prototypische Mausstämme sind C57BL/6 und BALB/c. Mäuse des
Stamms C57BL/6 (H2b/b, Fv2r/r, Rfv3r/r) entwickeln nach der Infektion weder Leukämie noch
Splenomegalie [61]. BALB/c-Mäuse (H2d/d, Fv2s/s, Rfv3s/s) hingegen können keine effektive
zelluläre und humorale Immunantwort hervorbringen und entwickeln innerhalb kurzer Zeit
nach der Infektion Leukämie und Splenomegalie und auch Infektionen mit geringsten Mengen FV verlaufen innerhalb weniger Wochen tödlich.
Ähnlich wie andere Retroviren wirkt FV immunsuppressiv durch die Induktion von regulatorischen T-Zellen (Treg) [61]. Daher sind auch die resistenten Mausstämme nicht in der Lage,
die Infektion vollständig auszuräumen, die zunächst entwickelte zelluläre Antwort wird durch
die Treg-Zellen unterdrückt und die Mäuse bleiben persistierend infiziert.
Bislang wurden attenuiertes bzw. replikations-defektes F-MuLV, rekombinante Vakziniaviren, sowie Protein- und Peptidvakzine für die Vakzinierung gegen FV evaluiert [44;56;6266]. Die Vakzinierungsstudien wurden meist in Hybridmäusen von mittlerer FVSuszeptibilität durchgeführt, und es ließen sich mit all diesen Vakzinierungsstrategien relativ
gute Ergebnisse erzielen. Es zeigte sich jedoch, dass mit rekombinanten Vakziniaviren geimpfte suszeptible Hybridmäuse zwar gegen die FV-induzierte Erkrankung geschützt waren
[65], die Tiere waren jedoch nicht in der Lage, eine persistierende Infektion zu beseitigen
[67]. Die einzige Vakzine, welche die höchst suszeptiblen BALB/c-Mäuse gegen FVinduzierte Erkrankung schützt, ist attenuiertes F-MuLV [68].
1.2 Adenovirale Vektoren
Adenoviren (AdV) wurden erstmals 1953 nach Isolation aus adenoidem Gewebe und Rachensekret respiratorisch erkrankter Personen isoliert [69]. Aufgrund ihres Wirtsspektrums wird
die Familie der Adenoviridae, die derzeit über 100 verschiedene, serologisch unterscheidbare
Virustypen umfasst, in die vier Gattungen Aviadenoviren der Vögel, Atadenoviren der Reptilien, Siadenoviren der Amphibien und Mastadenoviren, zu denen die Adenoviren der Säuger,
7
Einleitung
Abb. 1.5 Schematischer Aufbau des Genoms des humanen Ad 5
Das Genom hat eine Länge von etwa 36 kb, es enthält neun Transkriptionseinheiten, die für etwa 40 verschiedene regulatorische und strukturelle Proteine sowie zwei nicht-translatierte RNAs (VA) kodieren.
einschließlich der bis heute bekannten 51 verschiedenen humanen Serotypen gehören, unterteilt. Die humanpathogenen AdV werden anhand ihres onkogenen Potenzials im immunkompetenten Versuchstier und einer Reihe weiterer Merkmale, wie der Fähigkeit zur Hämagglutination, ihrem GC-Gehalt und Sequenzhomologien des viralen Genoms, in die Subgenera A
bis F eingeteilt [70]. AdV verursachen sowohl lytische als auch persistierende Infektionen
und sind mit einer Vielzahl klinischer Symptome assoziiert. Die Krankheitsbilder umfassen
dabei okuläre, respiratorische und gastroenterale Erkrankungen, Zystitis, Harnwegsinfektionen, Hepatitis und Meningoenzephalitis. In seltenen Fällen kann bei immunsupprimierten
Personen eine Infektion mit Adenoviren zum Tode führen. AdV sind nicht-umhüllte Viren
mit 80-100 nm großen ikosaedrischen Kapsiden, die ein lineares doppelsträngiges DNAGenom von etwa 34-44 kb Länge bei humanen AdV beinhalten. Zu den am ausführlichsten
untersuchten Adenoviren gehören die nahe verwandten Seroty-
Fiberprotein (IV)
pen 2 und 5 (Ad2 und Ad5) der
Lineares DNA-Genom
Subgruppe C. Die Genome von
Pentonbasisprotein (III)
Ad2 und Ad5 enthalten neun
Hexonprotein (II)
Transkriptionseinheiten, die für
Coreprotein (V)
etwa 40 verschiedene regulatori-
Protein IIIa
sche und strukturelle Proteine
Protein VI
Protein VIII
Terminales Protein
Core-Protein (VII)
Protein IX
und
zwei
nicht
translatierte
RNAs kodieren (Abb. 1.5) [70].
Das Fiber-Protein, welches aus
Abb. 1.6 Struktur des AdV-Virion
AdV besitzt ein nicht-umhülltes, ikosaedrisches Kapsid, dessen
Ecken durch das Penton-Basis-Protein gebildet werden, auf dem
das Fiber-Protein sitzt.
einer Schaft- und einer globulären Kopf-Region besteht und an
8
Einleitung
Fiberknob
Penton-Basis-Protein
1
Bindung
Ad5
2
αV CAR
Internalisierung
H+
Nukleus
den durch das Penton-BasisProtein gebildeten Ecken des
Kapsids sitzt (Abb. 1.6), vermittelt die Adsorption an den
auf der Zielzelle lokalisierten
Rezeptor (Abb. 1.7) [71]. Der
zelluläre Rezeptor ist für viele
Mikrotubuli
Endosom
Abb. 1.7 Bindung von Ad5 an Zielzelle
Ad5 bindet zuerst mit dem Fiber-Protein an den CoxsackieAdenovirus-Rezeptor (1.), das Penton-Basis-Protein interagiert dann
mit Integrinen auf der Zelloberfläche (2.), was zur Internalisierung
des Virus führt.
humane AdV-Typen der Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor
(CAR), einige Typen nutzen
hingegen andere Oberflächenmoleküle wie CD46. Nach der
Bindung an diesen primären Rezeptor findet eine Interaktion von Penton-Basis-Protein und
Integrinen auf der Zelloberfläche statt, worauf die Internalisierung des Virus in die Zielzelle
folgt (Abb. 1.7) [71]. Adenoviren können sich teilende, aber auch post-mitotisch ruhende Epithelzellen des Hals-, Nasen-, Rachenraumes, der Lunge und des Verdauungstraktes infizieren.
Adenovirale Vektoren werden häufig als Gentransfervektoren eingesetzt. Sie haben die Vorzüge, dass sie relativ große Transgenkassetten aufnehmen und eine Vielzahl verschiedener
Zelltypen mit hoher Effizienz transduzieren können und man sie mit einfachen Mitteln in
großen Mengen und hohen Konzentrationen herstellen kann [72]. Man unterscheidet bei adenoviralen Vektoren zwischen den Vektoren der ersten und zweiten Generation sowie den Gutless-Vektoren und onkolytischen Vektoren. Adenovirale Vektoren der ersten Generation enthalten Deletionen der essentiellen E1- und optional der E3-Genregion, wodurch die Vektoren
ihre Replikationskompetenz in den meisten Zellen verlieren. Die Transgenkapazität der E1/E3-deletierten Vektoren beträgt etwa 8,2 kb [73]. In den adenoviralen Vektoren der zweiten
Generation wurden weitere Deletionen der E2- und E4-Region eingeführt, wodurch die
Transgenkapazität auf etwa 14 kb erhöht werden und die Attenuierung verbessert werden
konnte [74]; durch die fehlende Spätgenexpression konnte bei diesen Vektoren auch die Immunantwort gegen transduzierte Zellen verringert werden. Die Verpackung der Vektoren der
ersten und zweiten Generation wird durch trans-komplementierende Zelllinien ermöglicht.
Gutless-Vektoren fehlen alle kodierenden Bereiche des Genoms, sie enthalten lediglich die
Sequenzelemente, die für die Genomreplikation und –Verpackung nötig sind. Die Transgenkapazität der Gutless-Vektoren beträgt bis zu 27 kb. Zur Verpackung dieser Vektoren ist ein
Helfervirus notwendig, dass außer der E1-Funktion alle zur Replikation notwendigen regula9
Einleitung
torischen Elemente und Strukturgene enthält [75]. Onkolytische Vektoren hingegen sind anders konstruiert, sie sollen Tumorzellen möglichst selektiv lysieren. Dies wird dadurch erreicht, dass man essentielle Gene unter die Kontrolle Tumor- bzw. Gewebe-spezifischer Promotoren stellt, durch die Deletion eines essentiellen Gens, dessen Funktion durch einen Defekt der Tumorzelle komplementiert wird, oder durch eine Veränderung des Tropismus [7680].
Adenovirale Vektoren wurden als Vakzinvektoren für zahlreiche Infektionen evaluiert, unter
anderem als Vakzine gegen HIV, Ebola, Influenza und Tuberkulose [51;81-83]. Das bislang
sowohl für gentherapeutische Ansätze als auch für Vakzinierungen am häufigsten verwendete
Adenovirus ist das humane Ad5 [72;84;85]. Auf Grund der hohen Seroprävalenz dieses Typs
sind in den letzten Jahren seltener vorkommende Typen wie Ad11, Ad35 und Ad49 mit verstärktem Interesse als Vakzinvektoren eingesetzt worden [86-89]. Auch für die Tumortherapie
können andere Typen sehr interessant sein, da viele primäre Tumore CAR nur in sehr geringem Maß oder gar nicht exprimieren [90]. Die gegen den Vektor gerichtete Immunität ist
auch bei wiederholten Injektionen relevant, so haben einige Publikationen gezeigt, dass die
heterologe Kombination von DNA- und AdV-Vakzine bzw. von zwei immunologisch distinkten AdV zu einer Verbesserung des Impferfolges führen kann [91-95].
1.3 Herpesvirale Vektoren
Herpesviren sind umhüllte DNA-Viren von 150 bis 200 nm Durchmesser mit linearen DNAGenomen von 120 bis 250 kb Länge. Die Herpesviren lassen sich auf Grund ihrer Pathogenität, ihres Zelltropismus sowie ihrer Vermehrungseigenschaften in die drei Unterfamilien α-, βund γ-Herpesviren einteilen, welche sich wiederum in mehrere Genera unterteilen. Es gibt
acht humanpathogene Herpesviren sowie eine Vielzahl tierpathogener Herpesviren, die unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen können. Das Genom der meisten Herpesviren enthält terminale bzw. terminale und interne Wiederholungssequenzen und enthält zwischen 70
und 200 zum Teil überlappende Gene. Alle Herpesviren kodieren neben Strukturproteinen
auch für Enzyme, die an Nukleinsäuremetabolismus, DNA-Synthese und Proteinprozessierung beteiligt sind, und können eine latente Infektion in ihrem natürlichen Wirt etablieren.
Das humane Herpes-simplex-Virus-1 (HSV-1) gehört zu den α-Herpesviren, das Genom hat
eine Länge von etwa 160 kb, das in die beiden nicht-repetitiven Bereiche UL und US sowie
terminale und interne Wiederholungssequenzen unterteilt werden kann (Abb. 1.8), und kodiert etwa 90 Proteine, von denen 38 nicht essentiell sind. Die Gene lassen sich nach der Ki10
Einleitung
netik ihrer Transkription in die drei Klassen der α- (immediate early-), β- (early-) und γ- (late-) Gene einteilen, ihre Expression erfolgt in einer von viralen Proteinen regulierten Kaskade.
HSV-1 zeichnet sich durch einen weiten Wirtszelltropismus und schnellen Replikationszyklus
aus und kann auch sich nicht teilende Zellen infizieren. Während der Infektion werden die
Struktur und der Metabolismus der Wirtszelle gravierend beeinflusst, so wird die in der
ab
UL
b’ a’ c’
US
c
Abb. 1.8 Genom von HSV-1
Das Genom von HSV-1 hat eine Länge von etwa 160 kb, es enthält die beiden nicht-repetitiven Bereiche UL und
US sowie die terminalen und internen Wiederholungssequenzen a, b, b’, a’, c’ und c.
infizierten Zelle vorhandene zelluläre RNA degradiert, die Transkription zellulärer Gene inhibiert, zelluläre Proteine werden degradiert oder selektiv stabilisiert und einige zelluläre Proteine werden zu neuen Aufgaben umgeleitet [70;96;97]; diese Veränderungen führen schließlich zum Tod der infizierten Zelle. HSV-1 kodiert für eine Reihe von Proteinen, welche die
Detektion und Zerstörung der infizierten Zelle durch das Immunsystem verhindern. So binden
virale Proteine Komplement-Komponenten oder Immunglobuline [98;99], verhindern die Präsentation von Epitopen auf MHC I- und II-Molekülen [100;101], oder blockieren intrazelluläre Signaltransduktionswege, welche die Aktivierung von Immunzellen und eine antivirale
Antwort vermitteln würden [99;102-104].
Herpesvirale Vektoren werden häufig als onkolytische Vektoren für die Tumortherapie oder
wegen ihrer hohen Transgenkapazität als Gentransfervektoren genutzt. Herpesvirale Vektoren
haben die Vorteile, dass sie je nach Vektortyp sehr hohe Transgenkapazitäten bieten, auf
Grund ihrer genetischen Komplexität die Generierung verschiedener attenuierter, onkolytischer Viren erlauben und in sensorischen Ganglia und anderen Neuronen lebenslange Latenz
etablieren können [105]. Onkolytische, für die Replikation in teilungsaktiven Zellen selektive
Vektoren wurden durch die Deletion von am Nukleotid-Metabolismus beteiligten Enzymen
wie der viralen Thymidin-Kinase [106] oder Ribonukleotid-Reduktase [107-109] generiert.
Durch die Deletion weiterer Gene wurden die Vektoren weiterentwickelt, um ihre Neurotoxizität zu reduzieren und ihre Effektivität zu erhöhen; um die Sicherheit der Vektoren zu gewährleisten, wird die virale Thymidin-Kinase aus modernen Vektoren nicht mehr deletiert
[110-114]. Im Gegensatz zu den onkolytischen Vektoren werden als Gentransfervektoren
replikationsdefekte rekombinante Viren oder sogenannte Amplikonvektoren verwendet. Die
replikationsdefekten rekombinanten Viren enthalten Deletionen in essentiellen Genen und zu11
Einleitung
sätzliche Transgenkassetten [115-117]. Amplikonvektoren hingegen enthalten keine viralen
Sequenzen außer der Verpackungssequenz, einem Replikationsursprung und einem immediate
early-Promotor, unter dessen Kontrolle das Transgen gesetzt werden kann [118]. Sie vereinen
somit die Vorteile einer DNA-Plasmidimmunisierung und des effizienten viralen Gentransfers
in sich. Auf Grund des Fehlens weiterer viraler Sequenzen haben diese Vektoren eine Transgenkapazität von bis zu 150 kb. Die Herstellung von Amplikonvektoren in großen Mengen
und in hohen Titern bereitet aber Schwierigkeiten. Amplikonvektoren sind sowohl für Gentransfer- als auch für Vakzinierungs-Experimente eingesetzt worden, unter anderem für Tumorvakzinierungen oder Vakzinierungen gegen HIV [119-121], wo sie sowohl zelluläre als
auch humorale Immunantwort vermittelten.
1.4 Immunisierungsstrategien
Die meisten der heute erfolgreich zur Impfung gegen Infektionskrankheiten eingesetzten
Vakzine induzieren neutralisierende Antikörper, welche die systemische Ausbreitung des Pathogens verhindern. Starke humorale Immunantworten können durch die Impfung mit Proteinen, Proteinuntereinheiten oder inaktivierten Pathogenen induziert werden. Internalisierte
Proteine werden in der Zelle prozessiert und hauptsächlich auf MHC II-Molekülen präsentiert. Da nur sehr geringe Mengen auf MHC I-Molekülen präsentiert werden, ist die Induktion
von CD8+ T-Zellen durch Protein-Vakzine äußerst gering.
Attenuierte Viren sind durch Mutationen in ihrer Replikation stark eingeschränkt, diese Impfstoffe können sehr effektiv sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten induzieren
[122]. Auf Grund der Möglichkeit der Bildung von Revertanten und der Wiederherstellung
der Virulenz durch Mutationen oder Rekombinationen bieten diese Impfstoffe jedoch keine
ausreichende Sicherheit [123].
Genetische Impfstoffe hingegen sind DNA-Vakzine oder rekombinante virale Vektoren, welche die für ein immunogenes Protein kodierende DNA-Sequenz tragen. Das Protein wird nach
Transduktion der Zielzelle in der Zelle selbst produziert und kann nach Degradation auf
MHC I-Molekülen präsentiert werden. Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass genetische
Vakzinierungen sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten induzieren [53;124126].
Seit langem werden die Möglichkeiten untersucht, die Immunantwort auf Antigene zu erhöhen, sei es, um einen verbesserten Impfschutz zu erzielen, bei einer Impfung die notwendige
Menge an Antigen zu reduzieren oder um experimentell Antikörper zu produzieren. Eine
12
Einleitung
Standard-Methode zur Steigerung der Immunität und zur gezielten Ausbildung von Gedächtnis-Immunität ist die wiederholte Applikation einer Vakzine als sog. Prime-BoostImmunisierung. Hierbei kann es sich um die wiederholte Applikation desselben Impfstoffes
oder von verschiedenen Vektoren handeln [48;51;53].
Eine weitere Methode ist der Einsatz von Adjuvantien. Bekannte Adjuvantien wie zum Beispiel komplettes Freund’sches Adjuvans (Mineralöl-Wasser-Emulsion mit Mycobakterienextrakt) [127] oder Alum (Aluminium-hydroxidgel) können die Immunogenität eines Antigens erhöhen, indem sie eine verlangsamte Freisetzung des Antigens sowie eine erhöhte Aufnahme durch Makrophagen und die Expression von kostimulatorischen Molekülen durch Immunzellen bewirken. Der Einsatz dieser Adjuvantien ist aber mit teils heftigen Entzündungsreaktionen und Gewebezerstörung verbunden, daher sollte ihr Einsatz möglichst vermieden
werden.
Gezieltere Methoden zur Steigerung der Immunogenität einer Vakzine sind die Koexpression
bzw. Koapplikation von Zytokinen oder Toll-like-Rezeptor- (TLR-) Liganden. Für eine Reihe
von Zytokinen konnte bislang für DNA- und Protein-Vakzine eine Steigerung der Immunantwort gezeigt werden [128-131]. Toll-like-Rezeptoren sind Rezeptoren des angeborenen
Immunsystems, die Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen erkennen und die Aktivierung
des angeborenen Immunsystems und die Expression von Immunmodulatoren wie Zytokinen,
Chemokinen sowie kostimulatorischen Molekülen vermitteln können [132]. Doppelsträngige
RNA als Virus-assoziierte Struktur ist ein Ligand für TLR3, die synthetische RNA Polyriboinosin-Polyribocytidinsäure (poly(I:C)) wurde in verschiedenen Studien als Adjuvans für antivirale und anti-tumorale Vakzinierungen evaluiert, wo sie einen positiven Effekt auf den Vakzinierungserfolg zeigte [133-136]. Spezifische unmethylierte CpG-enthaltende DNASequenzen als Bakterien-assoziierte Strukturen sind Liganden für TLR9, synthetische CpGOligodeoxynukleotide wurden ebenfalls erfolgreich als Adjuvantien für Vakzinierungen eingesetzt [137-139].
Eine weitere Methode zur Steigerung der Immunogenität eines Antigens kann eine genetische
Fusionierung mit stimulatorischen Molekülen bzw. hoch-immunogenen Molekülen darstellen.
Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Fusion des Tumorantigens HER2/neu mit
dem an der Reifung dendritischer Zellen beteiligten Wachstumsfaktor GM-CSF (granulocytemacrophage colony stimulating factor) zu der Induktion einer potenten Immunantwort gegen
das an sich schwach immunogene HER2/neu führt [140]. Die Fusionierung mit Molekülen
wie CTLA-4 oder einem anti-DC-SIGN-Antikörper, welche an Moleküle auf der Oberfläche
von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen binden, kann die Immunogenität eines
13
Einleitung
Antigens steigern, indem dieses gezielt an die Antigen-präsentierende Zelle herangeführt und
dort dann aufgenommen und effektiver prozessiert werden kann [141;142]. Durch einen ähnlichen Mechanismus konnte durch die Fusion verschiedener Antigene mit mehreren C3dMolekülen, einem Fragment der Komplement-Komponente C3, durch die Bindung von C3d
an seinen auf B-Zellen exprimierten Rezeptor CD21 eine deutliche Verstärkung der Antikörperantwort erreicht werden [143-145]. Eine weitere Möglichkeit zur Steigerung der Immunogenität eines schwach immunogenen Antigens ist die Fusion mit einem stark immunogenen
Antigen. Die Immunogenität eines Onkoproteins des Humanen Papillomavirus Typ 16 konnte
durch die Fusion mit HBsAg, dem Oberflächenprotein des Hepatitis-B-Virus, deutlich erhöht
und die Antikörper- und CTL-Antworten verbessert werden [146].
14
Zielsetzung
2. Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene genetische Immunisierungen mittels AdV- und HSVbasierender Vektoren in anti-retroviralen Vakzinierungsstrategien zu vergleichen. Zunächst
sollte ermittelt werden, ob sich die Friend-Virus-Infektion als Modellinfektion für die Entwicklung verbesserter viral vektorisierter anti-retroviraler Impfstrategien eignet. Für Vakzinierungen gegen FV stehen verschiedene Maus-Stämme zur Verfügung, die sich in ihrer FVSuszeptibilität unterscheiden und somit unterschiedliche Stringenzen zur Testung der Impfvektoren anbieten. Es sollten also zunächst die Vakzinierung verschiedener Mausstämme sowie verschiedene Applikationsformen evaluiert werden. Für die Vakzinierung mit adenoviralen Vektoren sollten F-MuLV-Env- und -Gag-exprimierende Ad5-basierende Vektoren hergestellt und evaluiert werden. Neben Ad5-basierenden Vektoren sollten Fiber-chimäre Vektoren
hergestellt werden, in denen die Kopf- und Schaft-Domänen des Fiberproteins durch die des
Typs 35 ersetzt wurden. Diese Vektoren besitzen einen anderen Tropismus als die Ad5basierten Vektoren und können zumindest teilweise eine gegen Ad5 gerichtete humorale Immunantwort umgehen. Es sollte ein Vergleich des durch diese Fiber-chimären Vektoren und
durch Ad5-basierende Vektoren vermittelten Schutzes sowie zwischen homologen und heterologen Prime-Boost-Immunisierungen angestellt werden. Zur Verbesserung der Immunogenität des Impfstoffes sollten verschiedene Strategien verfolgt werden, zum einen die
Koexpression von verschiedenen Zytokinen oder fusogenen Membranproteinen, die Koapplikation eines TLR-Liganden oder von Cardiotoxin, sowie die Herstellung genetischer Fusionen
des Env-Proteins mit einer PEST-Sequenz, mit dem mittelgroßen Oberflächenprotein des Hepatitis B-Virus, der extrazellulären Domäne des T-Zell-Korezeptors CTLA4 oder dem adenoviralen Kapsid-Protein pIX. Letzteres sollte zur Präsentation des Env auf dem adenoviralen
Kapsid führen.
Da sich für viele Vakzine eine Überlegenheit replizierender Vektoren gegenüber abgetöteten
oder attenuierten Pathogenen gezeigt hat, sollten replikations-kompetente und –defekte Vektoren für die anti-retrovirale Vakzinierung verglichen werden. Hierzu sollten HSV-1basierende Vektoren, die in murinen Zellen replizieren können, hergestellt werden. Zunächst
sollte das HSVQuik-System modifiziert werden, um die Herstellung replikations-defekter
HSV-Vektoren zu ermöglichen. Die im Rahmen der Arbeit hergestellten F-MuLV-Env- und –
Gag-kodierendenVektoren sollten dann im FV-Modell getestet werden.
15
Zielsetzung
Der Impferfolg sollte zunächst über die Analyse der Viruslast und des Krankheitsverlaufs verfolgt werden. Bei deutlichen Impferfolgen sollte außerdem die humorale und zelluläre Immunantwort genauer charakterisiert werden.
16
Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte
Brutschrank HS12
Dampfsterilisatoren
Durchflusszytometer FACS Calibur
Elektrophoresesystem
Elektroporator Gene Pulser Excell
Geldokumentationskammer
Labor-pH-Meter
Lichtmikroskop CK40
Luminometer
pH-Meter GHPR 1400A
Heraeus Instruments (Osterode)
H+P Labortechnik (Oberschleißheim)
Becton Dickinson (Heidelberg)
PEQLAB Biotechnologie (Erlangen)
BioRad (München)
Biozym (Oldendorf)
Greisinger electronic (Regenstauf)
Olympus (Hamburg)
Hamamatsu Photonics (Herrsching am Ammersee)
Greisinger electronic (Regenstauf)
Photometer Eppendorf BioPhotometer
Eppendorf (Hamburg)
Pipetten
Eppendorf (Hamburg)
Pipettierhilfe Repeater Plus
Peltier Thermal Cycler PTC 200
Real Time-PCR-System Lightcycler
Schüttelapparat Certomat SII
Hirschmann Laborgeräte, Eppendorf (Hamburg)
MJ Research (Ramsey, USA)
Roche Diagnostics (Mannheim)
B. Braun Biotech International (Melsungen)
Schüttelwasserbad 1086
GFL (Großburgwedel)
Thermoschüttler Thermomixer compact
Eppendorf (Hamburg)
Tiefkühlschrank -86C ULT Freezer
Ultraschallbad
Thermo Forma (Braunschweig)
MERCK eurolab (Darmstadt)
Ultrazentrifugenrotoren:
Festwinkelrotor NVT100
Beckman Coulter (Krefeld)
Ausschwingrotor SW28, SW41
Vortexer K-550-GE
BENDER & HOBEIN AG (Bruchsal)
Waagen
Analysewaage SCALTEC SPB64
Scaltec (Göttingen)
Präzisionswaage SCALTEC SBH31
Scaltec (Göttingen)
Wasserbad E100
LAUDA (Lauda-Königshofen)
17
Zentrifugen:
Mikrofuge 18 Zentrifuge
6-15K Laboratory Zentrifuge
Sigma (Osterode am Harz)
Optima L-70K Ultrazentrifuge
Zentrifuge 5810
Eppendorf (Hamburg)
3.1.2 Verbrauchsmaterialien
96-, 24-, 6-Loch-Platte
Nunc (Wiesbaden), Sarstedt (Nümbrecht)
96-Loch-Platte Maxisorp
Nunc (Wiesbaden)
Filter Papier 288
Sartorius (Göttingen)
Nitrocellulose
Schleicher & Schuell (Einbeck)
Pipettenspitzen
Starlab (Ahrensburg)
Petrischalen
Sarstedt (Nümbrecht)
PE-Röhrchen
Sarstedt (Nümbrecht)
Reaktionsgefäße
Greiner (Frickenhausen), Sarstedt (Nümbrecht)
Sterilfilter
Ultrazentrifugenröhrchen
Whatman-Papier
Zellkulturflaschen (25 cm2, 75 cm2, 175 cm2)
Zellkulturflaschen (300 cm2)
Roth (Karlsruhe), Sarstedt (Nümbrecht)
Beckmann Coulter (Krefeld)
Schleicher & Schuell (Einbeck)
Nunc (Wiesbaden), Sarstedt (Nümbrecht)
TPP (Trasadingen, Schweiz)
3.1.3 Chemikalien
Aciclovir-ratiopharm 500 mg
Ratiopharm (Ulm)
Acrylamid
Merck (Darmstadt)
Agar
Agarose
AppliChem (Darmstadt)
Invitrogen (Karlsruhe)
Aminoethylcarbazol
Sigma (München)
Ammoniumpersulfat
Roth (Karlsruhe)
Ampicillin
Aqua bidest.
β-Mercaptoethanol
Bovines Serum-Albumin
Bromphenolblau
Braun (Melsungen)
Sigma (München)
Applichem (Darmstadt)
Sigma (München)
18
2-Butanol
Carboxyfluoresceindiacetat-N-succinimidylester
Cardiotoxin
Calciumchlorid
J.T.Baker (Deventer, Niederlande)
Sigma (München)
Latoxan (Valence, Frankreich)
Cäsiumchlorid
Chloramphenicol
Cpg ODN 1826
Dimethylformamid (DMFA)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
InvivoGen (San Diego, USA)
Sigma (München)
dNTP-Mix
Pharmacia (Freiburg)
Essigsäure
Ethanol
Ethidiumbromid 1 %
Ethylen-Diamin-Tetraacetat
VWR (Darmstadt)
FACS-Flow
BD Bioscience (Heidelberg)
FACS-Rinse
FACS-Clean
fetales Kälberserum
Formaldehyd
Formamid (deionisiert)
Biochrom AG (Berlin)
Sigma (München)
Geneticindisulfat (G418)
Gentamycinsulfat
Glucose
Glycerin
Glycin
Biomol (Hamburg)
Hefeextrakt
Heparin
4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure
Isofluran
Biomol (Hamburg)
Baxter (Unterschleißheim)
Isopropanol
Kaliumacetat
Kaliumchlorid
Kanamycinsulfat
Lipofectamine 2000
19
Magermilchpulver
Neuform (Zarrentin)
Magnesiumchlorid
Meerschweinchen-Komplement
Sigma (München)
Methanol
Natriumacetat
Natriumazid
Natriumchlorid
Natriumcitrat
Natriumdihydrogenphosphat
VWR (Darmstadt)
Natriumdodecylsulfat
Natriumhydroxid
NycoPrep Universal (60 % Nycodenz)
Greiner Bio-One (Frickenhausen)
poly(I:C)
InvivoGen (San Diego, USA)
Proteinase K
Roche (Mannheim)
RNaseA
Sucrose
Tetracyclin
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
Sigma (München)
TMB+
Dako (Hamburg)
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-HCl
Biomol (Hamburg)
TriZol
Trypsin/EDTA
Biochrom (Berlin)
Trypton
Tween 20
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid
3.1.4 Enzyme
Calf Intestinal Phosphatase
MBI Fermentas (St. Leon-Rot)
Klenow DNA-Polymerase
New England BioLabs (Frankfurt a. M.)
T4 DNA-Ligase
Taq-Polymerase
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (München)
Restriktionsendonukleasen
20
3.1.5 Reagenzsysteme
Adenopack 20/100
Vivascience/Sartorius (Göttingen)
Combizyme DNA-Polymerase-Mix
Invitek (Berlin)
ECL Chemiglow
Alpha Innotech (San Leandro, USA)
Jetsorb Gel Extraction
Genomed (Löhne)
Luciferase Detection Kit
Promega (Mannheim)
NucleoSpin Extract
Macherey-Nagel (Düren)
NucleoSpin Plasmid
Macherey-Nagel (Düren)
QuantiTect Probe RT-PCR Kit
Qiagen (Hilden)
TA-Cloning-Kit
3.1.6 Puffer und Lösungen
AEC-Gebrauchslsg.
1 % AEC-Stammlsg. in 0,05 M Natriumacetat
AEC-Stammlsg.
20 mg/ml in DMFA
Ampicillin-Stammlsg. (1000x)
100 mg/ml Ampicillin
Blockpuffer
5 % (w/v) Magermilchpulver in PBS-T
Chloramphenicol-Stammlsg. (1000x)
68 mg/ml Chloramphenicol (in Ethanol)
DNA-Ladepuffer
0,25 % (w/v) Bromphenolblau
0,25 % (w/v) Xylencyanol FF
30 % (v/v) Glycerin
autoklavieren
ELISA-Coating-Puffer
200 mM NaC2O3
pH 9,6
Ethidiumbromid-Stammlsg.
1 % (w/v) Ethidiumbromid
FACS-Puffer
1 % BSA
0,02 % Natriumazid
in PBS
FSB
100 mM KCl
44 mM MnCl2
10 mM CaCl2
21
FSB (fortges.)
3 mM HACoCl3
10 % (v/v) Glycerol
10 mM Kaliumacetat
pH 6,4 mit 0,1 M HCl
Kanamycin-Stammlsg. (1000x)
50 mg/ml Kanamycin
10x Laufpuffer
0,25 M Tris-Base
1,9 M Glycin
1x Laufpuffer
10 % (v/v) 10x Laufpuffer
0,1 % (w/v) SDS
OD-Lyse-Puffer
0,1 % (w/v) SDS
1 mM EDTA
10 mM Tris-HCL
P1
6,06 g/l Tris-Base
3,72 g/l Na2EDTA*H2O
pH 8,0 mit HCl
100 mg/l RNAse
P2
8,0 g/l NaOH
10 g/l SDS
P3
294,5 g/l Kaliumacetat
150 ml Eisessig
PBBS
0,2 g/l KH2PO4
1,15 g/l Na2HPO4
0,14 g/l CaCl2
0,32 g/l KCl
7,2 g/l NaCl
0,2 g/l MgCl2 x 6H2O
0,2 g/l MgSO4 x 7 H2O
1,0 g/l Glucose
0,001 % Phenolrot
pH 7,3
PBS
8 g/l NaCl
22
PBS (fortges.)
0,2 g/l KCl
2,68 g/l Na2HPO4*7 H2O
0,24 g/l KH2PO4
pH 7,4
autoklavieren
PBS-T
0,1 % (v/v) Tween 20
in PBS
SDS-PAGE-Probenpuffer
150 mM TrisHCl
30 % (v/v) Glycerin
1,2 % (w/v) SDS
0,0018 % (w/v) Bromphenolblau
15 % (v/v) β-Mercaptoethanol
TAE
40 mM Tris
5 mM NaOAc
1 mM EDTA
TE
1 % (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0
1 mM EDTA
Tetracyclin-Stammlsg. (300x)
6,5 mg/ml Tetracyclin (in Ethanol)
Transferpuffer
8 % (v/v) 10x Laufpuffer
20 % (v/v) Methanol
10x Trypsin/EDTA
0,5 % (w/v) Trypsin
0,1 % (w/v) EDTA
in 10x PBS
3.1.7 Medien
3.1.7.1 Medien für die Kultur eukaryontischer Zellen
DMEM (4,5 g/l D-Glucose)
Gibco, Invitrogen (Karlsruhe)
RPMI1640
Gibco, Invitrogen (Karlsruhe)
23
3.1.7.2 Medien für die Bakterienkultur
Alle Medien werden nach dem Ansetzen autoklaviert. Die entsprechenden Platten werden
durch Zusatz von 2 % (w/v) Agar zum Medium hergestellt.
LB
1 % (w/v) Hefe-Extrakt
1 % (w/v) Bacto-Peptone
0,5 % (w/v) NaCl
SOB
2 % (w/v) Tryptone
0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt
10 mM NaCl
2,5 mM KCl
autoklavieren
10 mM MgCl2 (sterilfiltriert)
pH 6,8-7,0
SOC
2 % (w/v) Bacto-Peptone
1 % (w/v) Hefe-Extrakt
0,1 % (w/v) NaCl
20 mM Glucose
TB
1,2 % Bacto-Peptone
2,4 % Hefe-Extrakt
0,4 % Glycerol
0,17 M KH2PO4
0,72 M K2HPO4
3.1.8 Plasmide
fHSVQuik1
bakterielles artifizielles Chromosom (BAC), enthält das gesamte Genom des Herpes Simplex Virus (Stamm F) mit Deletionen beider Kopien des Gens γ34,5 sowie einer Insertion der BAC-Sequenzen im
nicht-essentiellen Gen ICP6 [147]
pAdEasy-1
Rekombinationsplasmid, enthält das Genom des Adenovirus Typ 5
mit Deletionen der E1- und E3-Region, durch homologe Rekombination mit pShuttle bzw. pAdTrack können rekombinante Adenoviren
erhalten werden [148]
24
pAdEasyF35
Rekombinationsplasmid, wie pAdEasy-1, jedoch wurden hier die
Kopf- und Schaft-Domänen des Fiber-Proteins durch die des Adenovirus Typ 35 ersetzt [149]
pAdTrack-CMV
Klonierungsvektor für die Herstellung rekombinanter Adenoviren mit
Hilfe des AdEasy-Systems, erlaubt die Klonierung eines Transgens
unter CMV-Promotor-Kontrolle, enthält eine zusätzliche GFPExpressionskassette [148]
pBluescript
Klonierungsvektor, der in hoher Kopienzahl in Bakterien vorliegt
pBR322
Klonierungsvektor, der in niedriger Kopienzahl in Bakterien vorliegt
pcn-Cre
Cre-Rekombinase-Expressions-Vektor [147]
pCG-env
kodiert F-MuLV Env (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)
pCG-leadergag
kodiert F-MuLV Gag (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)
pCR2.1-TA
TA-Klonierungsvektor, zur direkten Klonierung von PCR-Produkten
mit Adenosin-Überhängen (Invitrogen, Karlsruhe)
pCR3.1-IL18
enthält die cDNA des murinen IL18 (erhalten von Camille Locht, Institut Pasteur, Lille, Frankreich)
pEBHICP27
enthält die HSV-Gene icp27 und icp4
pFTP-T
Flp-Rekombinase-Expressions-Vektor [147]
pGT60mIL2
enthält die cDNA des murinen IL2 (InvivoGen, San Diego, USA)
pGT60mGM-CSF
enthält die cDNA des murinen GM-CSF (InvivoGen, San Diego,
USA)
pORF9-mIL15
pORF9-mIL21
pShuttle-CMV
Klonierungsvektor für die Herstellung rekombinanter Adenoviren mit
Hilfe des AdEasy-Systems, erlaubt die Klonierung eines Transgens
unter CMV-Promotor-Kontrolle [148]
pTransfer
Klonierungsvektor für die Herstellung rekombinanter Herpesviren
mit Hife des HSVQuik-Systems, enthält loxP- und FRT-Sequenzen,
erlaubt die Klonierung eines Transgens unter CMV-PromotorKontrolle sowie einen R6Kγ-Replikationsursprung [147]
pUC9-CTLA4
enthält die cDNA des murinen CTLA4 (erhalten von von Abdul M.
Jabbar, Emory University, Atlanta, USA)
25
pUMVC3-mIL12
enthält die cDNA des murinen IL12 (erhalten von Alexander Rakhmilevich, University of Wisconsin-Madison, Madison, USA)
3.1.9 Oligonukleotide
Die verwendeten Oligonukleotide wurden bei biomers (Ulm) bezogen.
CMVMCSpAantisense
CGCGTTAAGATACATTGATGA
CMVMCSpAsense
TAATAGTAATCAATTACGGGGTCA
CTLA4EcoRI
GAATTCATGGAAGCCATACAGGTG
CTLA4SalI
GTCGACGTCAGAATCCGGGCA
env-stopNotI
GCGGCCGCATGGCGTGTTCAACGCTCTCAAAA
env-stopSalI
GTCGACTTGTGGCTCGTATTCTAGTG
env-tmHindIII
AAGCTTTTATCTTTTATGTCTATGGGATT
env-tmNotI
GCGGCCGCATGGCGTGTTCAACGCTCTCAAAA
env-tmstopEcoRI
GAATTCATGGCGTGTTCAACGCTCTC
env-tmstopSalI
GTCGACTCTTTTATGTCTATGGGATT
envHindIII
AAGCTTGTCTAGAACCCCGCTGGAAA
envNotIBstZ17Ias
AAGAGGAGGGCTTCCAGTATAC
envNotIBstZ17Is
GATCGCGGCCGCCCCGTTACATAACTTACGGTA
envSalI
GTCGACAAAGATCAGCTTGCATGCCT
FVdown
AGTGCCTGGTAAGCTCCCTGT
FVSonde
6-Fam-ACTCCCACATTGATTTCCCCGTCC-Tamra
FVup
AAGTCTCCCCCCGCCTCTA
gagNotIAflIIas
TTGTGGGCTGTCCGTTCGACATCCT
gagNotIAflIIs
GATCGCGGCCGCCCCGTTACATAACTTACGGTA
HBsAgpreS2S-stopEcoRI
GAATTCATGCAGTGGAACTCCACAAC
HBsAgpreS2s-stopSalI
GTCGACAATGTATACCCAAAGACAAAA
illinkerantisense
CCTCGAGGCTAGCTCTAGACTGCAGGCGGCCGC
GATATCCCATGGGTCGACGTGCACAGATCTGTT
AACGGTAC
illinkersense
CGTTAACAGATCTGTGCACGTCGACCCATGGGA
TATCGCGGCCGCCTGCAGTCTAGAGCTAGCCTC
GAGGAGCT
leadergagHindIII
AAGCTTGGATCCGTGGTGACCATGAC
leadergagXbaI
TCTAGAAGATCAGCTTGCATGCCTGC
26
linkerBRsense
TATGAGATCTGTGCACAAGCTTA
linkerBRantisense
ATATGAGATCTGTGCACAAGCTTACTA
linkerdpIXsense
CCAATTGGTGCACAGATCTC
linkerdpIXantisense
TCGAGAGATCTGTGCACCAATTGGGTAC
mIL15SalKpnNotas
GATCGCGGCCGCGGTACCCTAGCAATAACAGA
AACACGG
mIl15SalKpnNots
GATCGTCGACACCTGAGATCACCGGTAGGA
pestlinkersense
CAGATCTCCGCGGCCGCGTGCACGTCGACCA
CGGCTTCCCCCCCGAGGTGGAGGAGCAGGAC
GACGGCACCCTGCCCATGTCCTGCGCCCAGGA
GTCCGGCATGGACCGGTAAAAAGCTTGAGCT
pestlinkerantisense
CAAGCTTTTTACCGGTCCATGCCGGACTCCTGG
GCGCAGGACATGGGCAGGGTGCCGTCGTCCTGC
TCCTCCACCTCGGGGGGGAAGCCGTGGTCGACG
TGCACGCGGCCGCGGAGATCTGGTAC
pIXEcoRI
GAATTCATGAGCACCAACTCGTT
pIXSalI
GTCGACAACCGCATTGGGAGG
sftpdlinkersense
CAGATCTGAATTCGTGCACGTCGACCAATTGC
AGCTGGGATTGAAGGGGGACAAAGGCATTCCTG
GAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTCCAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCTTACAGGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAAGAAAGTTGAACTCTTCCCAAATGGCCAATTGGGGATCCGCGGCCGCACTAGTAAGCTTGAGCT
sftpdlinkerantisense
CAAGCTTACTAGTGCGGCCGCGGATCCCCAATT
GGCCATTTGGGAAGAGTTCAACTTTCTTATACTGAGAGAAAGCAGCCTGGAGGTGCTGTACTTGTCCCTGTAAGGCCTCAACCTGCTGCCTCAGAGAAGCAACATCTGGAAGCCCACTTTCTCCCTTTGCTCCTTTGTCTCCAGGAATGCCTTTGTCCCCCTTCAATCCCAGCTGCAATTGGTCGACGTGCACGAATTCAGATCTGGTAC
27
TLsense
AATTCGCTAGCGCGGCCGCCCATGGCTTAA
GACCGGTGTATACGTGCACCTCGAGG
TLantisense
GATCCCTCGAGGTGCACGTATACACCGGTC
TTAAGCCATGGGCGGCCGCGCTAGCG
3.1.10 Standards
DNA 1kb-Leiter
DNA 100bp-Leiter
Prestained Precision Protein-Standard
Biorad (München)
3.1.11 Peptide
AbuAbuLAbuLTVFL
CTL-Epitop aus der Leader-Region des Gag-Proteins, die
in der Originalsequenz vorhandenen Cysteine wurden
durch α-Aminobuttersäure ersetzt (PANATecs, Tübingen)
EPLTSLTPRCNTAWNRLKL
Th-Epitop aus dem Env-Protein (PANATecs, Tübingen)
3.1.12 Antikörper und Tetramere
Kaninchen-α-Maus Ig-HRP
Dako (Hamburg)
Ziege-α-Maus Ig-RPE
Dako (Hamburg)
Maus-α-F-MuLV env (AK720)
Zellkulturüberstand der Hybridoma-Zelllinie H720
Maus-α-F-MuLV env (AK48)
Maus-α-F-MuLV leader-gag (AK34)
Fluoreszenzmarkierte Antikörper: Allophycocyanin- (APC)-α-CD4, APC-α-C-D8, Fluoresceinisothiocyanat- (FITC)-α-CD11b, FITC-α-CD43 (alle BD Bioscience, Heidelberg)
Phycoerythrin (PE)-MHC-I-AbuAbuLAbuLTVFL-Tetramer
PE-MHC-II- EPLTSLTPRCNTAWNRLKL-Tetramer
erhalten von Ton Schumacher,
Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam, Niederlande
28
3.1.13 Bakterien
Alle Bakterien wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen.
Escherichia coli BJ5183
endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR)
Escherichia coli DH10B
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG
Escherichia coli DH5α
supE44 ΔlacU169 (Φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
Escherichia coli PIR2
F- Δlac169 rpoS(Am) robA1 creC510 hsdR514 endA recA1 uidA(ΔMluI)::pir
3.1.14 Zelllinien
HEK-293
Humane Nierenepithelzellen, welche die Ad5 E1-Genregion exprimieren, Microbix (Toronto, Kanada)
293T
Humane Nierenepithelzellen, welche die Ad5 E1-Genregion und
das große T-Antigen des Simian Virus 40 exprimieren, ATCC#
CRL-11268, LGC Standards (Wesel)
3T6
Murine Fibroblastenzellen, ATCC# CCL-96, LGC Standards (Wesel)
H34
Hybridoma-Zelllinie, die einen Antikörper gegen das F-MuLVGag-Vorläuferprotein auf infizierten Zellen produziert (erhalten
von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)
H48
Hybridoma-Zelllinie, die einen neutralisierenden Antikörper gegen
F-MuLV-Env produziert (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)
H720
Hybridoma-Zelllinie, die einen Antikörper gegen F-MuLV-Env
produziert (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)
Vero2-2
Affen-Nierenzellen, die HSV-1 ICP0, ICP4 und ICP27 exprimieren, erhalten von Rozanne Sandri-Goldin (University of California,
Irvine, USA)
29
3.1.15 Viren
FV-B
Der FV-Komplex wurde als 10%iges (w/v) Homogenat von Milzen
infizierter BALB/c-Mäuse 14 d p.i. hergestellt (erhalten von Prof.
Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)
F-MuLV
von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen, zur Verfügung gestellt
Ad5MVFH
von Dr. Dennis Hoffmann, AG PD Dr. O. Wildner, erhalten
Ad5RSVFG
von Dr. Thomas Grunwald, AG Prof. Dr. Überla, erhalten
3.1.16 Versuchstiere
Es wurden weibliche Mäuse verwendet, die bei Beginn der Vakzinierungen acht Wochen alt
waren.
BALB/c (H2b/b Fv1d/d Fv2s/s Rfv3s/s)
Élevage Janvier (Le Genest St Isle, Frankreich)
CB6F1 (H2b/b Fv1b/d Fv2r/s Rfv3r/s)
Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld
C57BL/6 (H2b/b Fv1b/b Fv2r/r Rfv3r/r)
Élevage Janvier (Le Genest St Isle, Frankreich)
3.2 Methoden
3.2.1 Molekularbiologische Arbeitsmethoden
3.2.1.1 PCR
Für präparative PCRs wurde das Proofreading-Polymerase-Kit von Combizyme nach Herstellerangaben angewendet.
Für Standard-PCRs wurden folgende Temperatur-Zyklen eingesetzt:
1. Denaturierung
95 °C
4:00 min
2. Denaturierung
95 °C
0:30 min
3. Annealing
52 °C
0:30 min
4. Elongation
72 °C
1:00 min
30 Wiederholungen der Schritte 2-4
5. Elongation
72 °C
10:00 min
Die Wahl der Annealing-Temperatur wurde an die Schmelztemperatur der verwendeten Primer angelehnt, die sich nach folgender Formel ermitteln lässt:
Tm = 69,3 °C + 0,41·(% G+C) °C
bei pH 7,0, 165 mM NaCl
30
Je nach Größe der erwarteten Fragmente wurde die Elongationszeit auf bis zu 3 min erhöht.
3.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA
DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt.
Die verwendeten 1%igen Gele wurden durch Aufkochen der Agarose in TAE-Puffer, Zusatz
von 0,01 % Ethidiumbromid-Lösung und Erstarren in der Elektrophoresekammer hergestellt.
Die DNA-Proben wurden mit etwa 1/6 Ladepuffer versetzt und in die Taschen des mit TAEPuffer überschichteten Gels geladen.
Als Größenstandard wurden 10 µl der DNA 1kb-Leiter von Invitrogen aufgetragen.
3.2.1.3 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen
Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem NucleoSpin
Extract-Kit von Macherey-Nagel oder dem Jetsorb Gel Extraction Kit von Genomed nach
Herstellerangaben.
3.2.1.4 TA-Klonierung
3.2.1.4.1 Anhängen eines überhängenden Adenosin
Die durch PCR mit einer Proofreading-Polymerase erhaltenen PCR-Produkte wurden vor der
TA-Klonierung mit einem überhängenden Adenosinrest versehen, hierzu wurden die PCRFragmente in Anwesenheit von Taq-Polymerase und 10 mM ATP 15 min bei 72 °C inkubiert.
3.2.1.4.2 TA-Klonierung
Die TA-Klonierungen wurden mit dem TA-Cloning-Kit von Invitrogen nach Herstellerangaben durchgeführt.
3.2.1.5 Ligation von DNA-Fragmenten
Ligationen wurden mit der T4-DNA-Ligase in dem zugehörigen Puffer durchgeführt. Für
Standard-Ligationen wurden 20 µl-Ansätze verwendet. Hierzu wurden 1 µl Backbone-DNA,
5 µl Insert-DNA, 2 µl Ligase-Puffer, 1 µl T4-Ligase und 11 µl Wasser in einem Reaktionsgefäß zusammen gegeben und für 1-2 h bei RT oder für längere Zeit bei 16 °C inkubiert.
3.2.1.6 Transformation von Bakterien
3.2.1.6.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien
Bakterien einer Übernachtkultur wurden in 2 l SOB-Medium verdünnt und bei 30 °C inkubiert bis eine OD600 von 0,5 +/- 0,2 erreicht war. Die Bakterien wurden 1 h auf Eis geschüttelt
31
und dann bei 3 200 g und 4 °C für 12 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1/3 des ursprünglichen Kulturvolumens FSB-Puffer resuspendiert und nach 15 min Inkubation auf Eis
erneut bei 3 200 g und 4 °C für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1/12,5 des ursprünglichen Volumens FSB resuspendiert und mit 3,5 % des aktuellen Volumens DMSO versetzt.
Nach vorsichtigem Schwenken wurde 5 min auf Eis inkubiert und nach Zusatz weiterer 3,5 %
DMSO nochmals für weitere 10 min. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Bakterien portioniert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
3.2.1.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien
50 µl der Bakteriensuspension wurden in einem 13 ml-Röhrchen auf Eis vorgelegt und mit
der zu transformierenden DNA versetzt. Von Ligationsansätzen wurden hierbei 3 µl verwendet, die DNA-Menge musste unter 1 µg liegen. Nach Inkubation auf Eis für 30 min erfolgte
der Hitzeschock für 30 s bei 42,2 °C, es wurden 500 µl SOC zugegeben. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 1 h wurden die Bakterien auf Selektionsmedium ausplattiert.
3.2.1.6.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien
Bakterien einer Übernachtkultur wurden verwendet, um eine 300 ml-Kultur anzuimpfen. Es
wurde bis zu einer OD600 von ~0,8 bei 32 °C oder 37 °C geschüttelt. Die Zellen wurden in einem Zentrifugationsbecher gesammelt und 10-60 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden
bei 2 600 g und 4 °C für 10 min pelletiert, dann mit demselben Volumen eiskalten Wassers
(+ 15 % Glycerol) gewaschen und für 30 min pelletiert. Nach Wiederholen des Waschschrittes wurden die Zellen in 20 ml Restvolumen resuspendiert, in ein 50 ml-Gefäß überführt und
nach erneutem 10-minütigen Pelletieren in 5 ml Restvolumen resuspendiert. Die Zellen wurden portioniert und in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
3.2.1.6.4 Transformation elektrokompetenter Bakterien
In einer 2 mm-Küvette wurden 50 µl Bakterien auf Eis vorgelegt und zwischen 0,1 und 1,0 µg
DNA dazu pipettiert. Die Elektroporation erfolgte bei einer Spannung von 2,5 kV. Nach Zusatz von 200 µl SOC-Medium wurden die Bakterien auf LB-Platten ausplattiert.
3.2.1.7 Plasmid-Isolation im analytischen Maßstab (Mini-Prep)
Die DNA-Präparation wurde mit dem NucleoSpin Plasmid-Kit nach Herstellerangaben
durchgeführt.
32
3.2.1.8 Plasmid-Isolation im präparativen Maßstab (Maxi-Prep)
300 ml LB- oder TB-Medium wurden mit einer Kolonie oder 200 µl einer Übernachtkultur
angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden bei 5 000 g und 4 °C für
10 min pelletiert und anschließend in 10 ml P1 resuspendiert. Nach Zusatz von 10 ml P2 und
sechsmaligem Invertieren wurde für 10 min bei RT inkubiert. Es wurden 10 ml P3 zugesetzt,
erneut sechsmal invertiert und durch einen Faltenfilter filtriert. Dem Filtrat wurden
0,7 Volumen Isopropanol zugesetzt und dann für 30 min bei 4 °C und 12 500 g zentrifugiert.
Das erhaltene Pellet wurde in 4 ml P1 resuspendiert, mit 4,6 g CsCl und 40 µl Ethidiumbromidlösung versetzt und in ein Ultrazentrifugationsröhrchen überführt. Die Zentrifugation erfolgte im Rotor NVT100 bei 20 °C entweder bei 70 000 rpm für 4,5 h, bei 90.000 rpm für
2,5 h oder bei 50 000 rpm über Nacht. Die erhaltenen Banden wurden abgesaugt, das Volumen auf etwa 4 ml erweitert und mit TE-gesättigtem 2-Butanol zweimal ausgeschüttelt. Das
Volumen wurde anschließend auf 5 ml eingestellt, mit 0,7 Volumen Isopropanol versetzt und
bei 20 °C und 12 500 g für 30 min zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
3.2.1.9 Restriktion
Die DNA-Restriktion wurde in 50 µl-Ansätzen durchgeführt. 10 µg Plasmid-DNA einer Maxi-Prep oder 20 µl einer Mini-Prep wurden mit 5 µl des entsprechenden 10x-Puffers, 1 µl jedes verwendeten Enzyms und der zum Erreichen des Endvolumens benötigten Menge Wasser
versetzt und für 1-3 h bzw. über Nacht inkubiert. Die optimale Pufferzusammensetzung sowie
die erforderliche Inkubationstemperatur wurden den Herstellerangaben entnommen.
3.2.1.10 DNA-Fällung
Die DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen 3 M NaAc und 3 Volumen Ethanol versetzt und
30 min bei 18 000 g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen
und nach erneuter Zentrifugation getrocknet und in Wasser resuspendiert.
3.2.1.11 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) von Proteinen
Für eine 10%ige SDS-PAGE wurden die Gele in der nachstehenden Zusammensetzung gegossen, wobei TEMED und APS als radikale Kettenstarter für die Polymerisierung dienten.
Die Proben wurden vor der SDS-PAGE für 15 min bei 95 °C in Probenpuffer denaturiert.
Als Standard wurden 5 µl des Prestained Precision Protein-Markers aufgetragen. Es wurde eine konstante Spannung von 150 V für einen Zeitraum von etwa 2 h angelegt, bis die Lauffront
aus dem Gel ausgetreten war.
33
Sammelgel
Protogel (30 %)
Trenngel
560 μl
4 ml
2 ml
-
-
6 ml
1,4 ml
1,8 ml
SDS (10 %)
40 μl
120 µl
APS (4 °C)
40 µl
120 µl
6 µl
10 µl
0,5 M Tris pH 6,8
2 M Tris pH 8,8
H2O
TEMED
3.2.1.12 Western Blot
In einer Blotapparatur wurden die in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine von dem Acrylamid-Gel auf Nitrocellulose übertragen. Der Transfer erfolgte bei einer Spannung von 100 V
in einem Zeitraum von einer Stunde.
Anschließend wurde die Membran in Blockpuffer inkubiert (30 min-12 h), um unspezifische
Bindungen der Antikörper an freie Bindestellen zu verhindern.
Nun erfolgte die Inkubation mit dem in Blockpuffer verdünnten Primär-Antikörper für 5-12 h.
Bevor man den sekundären Antikörper hinzugeben konnte, musste der Blot mit PBS-T gewaschen werden (4 x 10 min). Der HRP-gekoppelte Zweitantikörper wurde ebenfalls für 1-2 h
auf der Membran inkubiert.
Bevor die Detektion erfolgte, wurde die Membran erneut, wie oben beschrieben, gewaschen.
Die Detektion erfolgte mit dem ECL Chemiglow-Kit. Die Chemilumineszenz wurde im Hamamatsu-Luminometer sichtbar gemacht.
3.2.2 Zytologische Methoden
3.2.2.1 Kultivierung von Zelllinien
Alle verwendeten Zelllinien wurden, je nach Flaschengröße, in 5 ml, 20 ml oder 50 ml des
entsprechenden Mediums bei 37 °C, 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.
Im Abstand von 3-4 Tagen wurden die Zellen passagiert. Hierzu wurden die Zellen zunächst
mit 1x PBS gewaschen, dann mit Trypsin/EDTA-Lösung inkubiert und schließlich in Medium
resuspendiert. Danach wurde ein Teil dieser Suspension (1/3 – 1/10) in eine neue Kulturflasche mit Medium gegeben.
34
3.2.2.2 Zellen einfrieren und auftauen
Um Zellen einzufrieren, wurden diese zunächst mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und sedimentiert (1 000 g, 10 min, 4 °C). Dann erfolgte eine Aufnahme in 10 % DMSO-haltigem
Zellkulturmedium. Die Zellen konnten in Aliquots bei -193 °C gelagert werden.
Für weitere Verwendungen wurden die Zellen bei 37 °C aufgetaut und in frischem Medium
aufgenommen. Um das DMSO, welches toxisch für die Zellen ist, zu entfernen, wurden die
Zellen zuvor sedimentiert.
3.2.2.3 DNA-Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Methode
Für die Transfektion von Zellen wurden diese subkonfluent in 25 cm2-Kulturflaschen ausplattiert. Ein Mediumwechsel fand 2 h vor der Transfektion statt. Die Transfektion wurde nach
der Calcium-Phosphat-Methode durchgeführt [150]: Zuerst wurden 31 µl 2 M CaCl2, 5–10 µg
DNA und bidest. Wasser vermischt, so dass ein Ansatz mit dem Endvolumen von 250 µl entstand. Dieser wurde gemischt und tropfenweise mit 250 µl 2x HBS versetzt. Nach einer 10minütigen Inkubation bei Raumtemperatur konnte der Transfektionsansatz zu den ausplattierten Zellen gegeben werden. Das Medium wurde nach 5-12 h gewechselt.
3.2.2.4 DNA-Transfektion von Zellen mittels Lipofektion
Die Lipofektion von DNA in Zellen erfolgte mit Lipofectamine 2000 (Gibco) nach Herstellerangaben.
3.2.2.5 Luciferase-Assay
Der Nachweis von Luciferase-Expression erfolgte mit dem Luciferase Detection-Kit (Promega). Nach Abnehmen des Mediums und Waschen der Zellen mit 1x PBS wurden die Zellen
direkt mit 100 µl Lysepuffer (für eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte) überschichtet. Nach
einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur und 10 min bei -80 °C wurden die abgelösten Zellen in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und anschließend 15 Sekunden bei
14 000 g zentrifugiert. 50 µl des Überstandes wurden mit 50 µl Luciferase-Substrat gemischt
und die Luciferase-Aktivität über 5 s im Luminometer bestimmt.
3.2.2.6 Virus-Aufreinigung
3.2.2.6.1 Aufreinigung von Adenoviren
Adenoviren wurden in HEK-293-Zellen expandiert, die Überstände von zwei bzw. fünf
300 cm2-Flaschen wurden mit Hilfe des AdenoPack 20- bzw. AdenoPack 100-Kits nach Herstellerangaben aufgereinigt.
35
3.2.2.6.2 Aufreinigung von Herpesviren
Herpesviren wurden in Vero2-2-Zellen expandiert. Die Überstände von sechs 300 cm2Flaschen wurden vereinigt und aufgereinigt. Hierzu wurden die Überstände dreimal eingefroren und aufgetaut, anschließend wurden die Zellreste abzentrifugiert. In Zentrifugenröhrchen
wurden 7 ml 40 % Sucrose-Lösung vorgelegt und mit 30 ml Virus-Überstand überschichtet.
Die Viren wurden durch Zentrifugation bei 25 000 rpm im Rotor SW28 für 2,5 h pelletiert
und anschließend in 500 µl 30 % Nycodenz resuspendiert. In Zentrifugenröhrchen wurden
3 ml 40 % Nycodenz vorgelegt, mit der Virussuspension und weiteren 2 ml 10 % NycodenzLösung überschichtet. Nach erneuter Zentrifugation bei 25 000 rpm im Rotor SW40 für 2,5 h
wurde die Virus-Bande abgesaugt, portioniert und bei –80 °C gelagert.
3.2.2.7 Titerbestimmung
3.2.2.7.1 TCID50
Die Titerbestimmung wurde nach der TCID50-Methode durch Infektionen von Zellen in
96-Loch-Platten mit Verdünnungen des Virus durchgeführt. In den Vertiefungen einer neuen
Platte wurden zunächst 100 µl Medium vorgelegt, in die erste Vertiefung jeder Reihe wurden
je 10 µl des Virus-Stocks zugesetzt. 10 µl dieser ersten Verdünnung wurden in die nächste
Vertiefung der Reihe überführt und mit dem vorgelegten Medium vermischt. Durch sukzessives Überführen der Verdünnungen in die folgenden Vertiefungen erhielt man so eine Verdünnungsreihe. Das Medium der Zellen wurde entfernt und durch jeweils 100 µl des virushaltigen
Mediums der Verdünnungsreihe ersetzt. Nach 3 Tagen wurde der zytopathische Effekt bzw.
die GFP-Expression beurteilt. Es wurde für jede Verdünnung der Quotient der Vertiefungen
bestimmt, in denen die Zellen einen zytopathischen Effekt zeigten, und die TCID50 nach folgender Formel berechnet:
T = 101+d(S-0,5)
mit
d = log10 der Verdünnung
S = Summe der Quotienten
Das Ergebnis gibt den Titer des Virus-Stocks in TCID50 für das eingesetzte Volumen an.
3.2.2.7.2 Titerbestimmung über optische Dichte
Die Virusstocks wurden in OD-Lyse-Puffer verdünnt und für 15 min bei 56 °C unter Schütteln inkubiert. Von diesem Ansatz wurde die optische Dichte bei 260 nm bestimmt und die
optischen Partikeleinheiten nach folgender Formel berechnet:
virale Partikel/ml = OD260·Verdünnungsfaktor·1,1·1012
36
3.2.3 Immunologische Methoden
3.2.3.1 Vakzinierungen
Die Vakzinierungen wurden
nach
einem
Prime-Boost-
Schema mit einem Abstand
Palpation der Milz
PrimeImmunisierung
BoostImmunisierung
FV-Infektion
1
21
42
von drei Wochen durchgeführt (Abb. 3.1). Hierzu wurden die Env- und Gag-
Bestimmung
von Virämie und
neutralisierenden
Antikörpern
exprimierenden Viren in einem 1:1-Verhältnis gemischt
und eine Konzentration von
1010
viralen
Partikeln
(vp)/100 µl in PBS ein-
52
60
Tage
Bestimmung
der Viruslast
in Milz
Abb. 3.1 Immunisierungsschema
Die Immunisierung erfolgte zweimal im Abstand von 21 d. Die Belastungsinfektion erfolgte 21 d nach der zweiten Immunisierung. Der Infektionsverlauf wurde duch Palpation der Milz verfolgt, die Virämie
wurde 10 d p.i., die Viruslast in der Milz 18-21 d p.i. bestimmt.
gestellt. Die Viren wurden entweder intramuskulär in beide M. gastrocnemii (jeweils 50 µl),
intradermal (100 µl) im Bereich der Flanke oder in die Plantarseite beider Hinterpfoten (jeweils 50 µl) gespritzt.
3.2.3.2 Belastungsinfektion
Die Belastungsinfektion wurde drei Wochen nach der Boost-Immunisierung intravenös verabreicht (Abb. 3.1). C57BL/6-Mäuse wurden mit 3 000 Milz-Fokus-bildenden Einheiten (spleen
focus forming units, SSFU) FV in 100 µl PBS belastet, CB6F1-Mäuse mit 500 SFFU FV.
3.2.3.3 Palpation der Milz
Nach der Belastungsinfektion wurde mindestens einmal pro Woche die Milz palpiert, um den
Krankheitsverlauf zu verfolgen (Abb. 3.1). Die Palpation erfolgte unter Inhalations-IsofluranNarkose, die Milzgrößen wurden Kategorien von 1 (nicht vergrößert) bis 4 (sehr stark vergrößert) zugeordnet, diese entsprechen den folgenden Milzgewichten: 1: bis 0,5 g; 1,5: 0,5-0,6 g;
2: 0,6-0,8 g; 2,5: 0,8-1,2 g; 3: 1,2-1,7 g; 4: ab 1,7 g.
3.2.3.4 Blutentnahme
Zur Bestimmung der Antikörperantwort wurden den vakzinierten Mäusen eine Woche nach
der Boost-Immunisierung unter Inhalations-Isofluran-Narkose etwa 200 µl Blut retroorbital
entnommen. Zur Serum-Gewinnung wurde das geronnene Blut 10 min bei 1 000 g zentrifugiert und das Serum abgenommen. Zur Bestimmung der Viruslast wurde den belasteten Mäu37
sen 10 d nach Belastungsinfektion 5 Tropfen Blut entnommen und in Eppendorf-Gefäßen
aufgefangen, in denen 2,5 µl Heparin vorgelegt wurden. Das Plasma wurde durch Zentrifugation von den Blutzellen getrennt und bei –80 °C gelagert.
3.2.3.5 Bestimmung der Viruslast
3.2.3.5.1 Bestimmung der Plasma-Virämie
Zur Bestimmung der Virämie wurde den Mäusen 10 d nach Belastungsinfektion eine geringe
Menge Blut abgenommen und hieraus das Plasma gewonnen (Abb. 3.1). In einer 96-LochPlatte wurden 100 µl PBS in der ersten Vertiefung bzw. 80 µl PBS in den fünf folgenden Vertiefungen vorgelegt. In die erste Vertiefung wurden 10 µl Plasma zugegeben, durch Überführen von je 40 µl in die nächsten Vertiefungen wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt. In das
Medium
von
am
Vortag
in
24-Loch-Platten
ausplattierten
3T6-Zellen
(7,5·103 Zellen/Vertiefung) wurden zunächst 10 µl Polybren (800 µg/ml) und anschließend
50 µl der Plasma-Verdünnungen zugesetzt. Die Zellen wurden 3-4 d bis zur Konfluenz inkubiert und anschließend mit Ethanol fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS+0,1 % BSA
wurden die Zellen mit AK720 (200 µl/Vertiefung) für 30 min bei RT inkubiert. Nach erneutem Waschen folgte die Inkubation mit dem Zweitantikörper Ziege-α-Maus-HRP (1:300 verdünnt) für 30 min bei RT. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen 15 min mit
2 ml/Vertiefung der AEC-Gebrauchslösung inkubiert. Anhand der erkennbaren Foki wurde
die Anzahl Fokus-bildender Einheiten (focus forming units; FFU)/ml Plasma berechnet.
3.2.3.5.2 Immuncytochemische Bestimmung der Viruslast in der Milz im infectious center- (IC-) Assay
18-21 d nach der Belastungsinfektion wurden die infizierten Mäuse durch cervikale Dislokation getötet und die Milzen entnommen (Abb. 3.1). Die Milzen wurden zunächst gewogen
und dann in 5 ml PBBS auf kleinen Metallsieben zerrieben, die Zellsuspension wurde in
15 ml-Gefäße überführt und auf 10 ml mit PBBS aufgefüllt. Die Zellkonzentration wurde bestimmt und auf 1·108 Zellen/ml in PBBS eingestellt. In einer 24-Loch-Platte wurden je Vertiefung 1,8 ml DMEM vorgelegt, in die erste Vertiefung wurden 200 µl der Milzzellsuspension
zugegeben und durch Weiterpipettieren von je 200 µl Verdünnungsreihen hergestellt. 1 ml
dieser Milzzellverdünnungen wurde am Vortag in 6-Loch-Platten ausplattierten 3T6-Zellen
(2·104 Zellen/Vertiefung) zugesetzt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz inkubiert und anschließend fixiert und inkubiert wie für den Virämie-Assay beschrieben. Anhand der Zahl der
angefärbten Foki wurde die Viruslast als infektiöse Zentren (IC)/Milz berechnet.
38
3.2.3.5.3 Bestimmung der Viruslast in der Milz durch quantitative PCR
Aus 2·107 wie im vorigen Abschnitt beschrieben isolierten Milzzellen wurde die GesamtRNA isoliert, hierzu wurden die Milzzellen bei 1 000 g für 10 min pelletiert und in 400 µl
TriZol aufgenommen. Die RNA-Präparation erfolgte nach Herstellerangaben. Vor der quantitativen PCR wurde zunächst eine reverse Transkription durchgeführt, es wurde das Quantitect
Probe RT-PCR Kit von Qiagen verwendet. Hierzu wurden 5 µl der zu untersuchenden RNA,
1 µl des Primers FVdown, 1 µl der 6-Fam/Tamra-markierten Sonde, 2,8 µl Wasser, 10 µl Puffer und 0,2 µl Enzym-Mix zusammenpipettiert, für die reverse Transkription wurden die Proben 20 min bei 50 °C inkubiert, danach folgte eine Inkubation bei 95 °C für 5 min zur Inaktivierung der Reversen Transkiptase. In Lightcycler-Kapillaren wurde je 1 µl des Primers FVup
vorgelegt und der RT-Ansatz hinzugefügt, die Kapillaren wurden bei 1 000 g 1 min zentrifugiert. Die quantitative PCR wurde als Zwei-Schritt-PCR durchgeführt, Annealing und Elongation fanden bei 60 °C statt.
Die zur Quantifizierung verwendeten Standards waren Verdünnungen bekannter Konzentration des Produkts einer in vitro-Transkription mit den Primern FVup und FVdown mit einem
Volllänge-F-MuLV-Plasmid als Template, sie wurden von Nicole Gerlach (Universitätsklinikum Essen) zur Verfügung gestellt.
3.2.3.6 Bestimmung der humoralen Immunantwort
3.2.3.6.1 Bindende Antikörper
96-Loch-Maxisorp-Platten wurden mit 0,5 µg Gesamtvirusantigen in 100 µl Coatingpuffer
pro Vertiefung über Nacht inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS+0,5 % Tween
wurden die Vertiefungen mit PBS+10 % FCS für 30 min bei RT geblockt. Mit PBS+10 %
FCS wurden serielle Verdünnungen der Serumproben hergestellt, je 100 µl wurden in eine
Vertiefung der mit Virusantigen beschichteten Platte gegeben und für 1 h bei 4 °C inkubiert.
Nach mehrmaligem Waschen wurden je Vertiefung 100 µl einer 1:10 000-Verdünnung des
Antikörpers Kaninchen-α-Maus-Ig-HRP zugesetzt und für 1 h bei RT inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden je Vertiefung 100 µl des Substrats TMB+ zugegeben und für 15 min bei
RT im Dunkeln inkubiert, die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl 2 N Schwefelsäure
abgestoppt und die Absorption bei 450 nm bestimmt. Das Dreifache des mit Serum von naiven Mäusen erhaltenen Wertes wurde als Grenzwert angenommen.
39
3.2.3.6.2 Neutralisierende Antikörper
Mäusen wurde 7 d nach Boost-Immunisierung bzw. 10 d nach Belastungsinfektion Blut abgenommen und das Serum bzw. Plasma isoliert. Das Plasma wurde 30 min bei 56 °C inaktiviert,
danach wurden in PBS Verdünnungen, beginnend mit 1:4 und dann mit 1:2 weitergehend,
hergestellt. In einer 96-Loch-Platte wurden 15 µl einer F-MuLV-Verdünnung, die so gewählt
wurde, dass man in Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern etwa 30 Foki in der abschließenden Färbung erhielt, und 10 µl einer 1:2-Verdünnung von MeerschweinchenKomplement gemischt und zu 15 µl der Plasma-Verdünnungen gegeben. Als Positivkontrolle
wurden 15 µl des AK48, als Negativkontrolle 15 µl PBS an Stelle der Plasmaverdünnung eingesetzt. Die Ansätze wurden 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend mit 120 µl kaltem PBS
versetzt. 50 µl dieser Ansätze wurden zu am Vortag in 24-Loch-Platten ausplattierten 3T6Zellen (7,5·103 Zellen/Vertiefung), die zuvor mit 10 µl Polybren (800 µg/ml) versetzt worden
waren, gegeben, welche dann 3-4 d bis zur Konfluenz inkubiert und anschließend wie für den
Virämie-Assay beschrieben fixiert und gefärbt wurden. Die Verdünnungen, die eine Reduktion der Anzahl der Foki um mindestens 50 % bewirkten, wurden als positiv gewertet.
3.2.3.7 Bestimmung der zellulären Immunantwort
A
3.2.3.7.1 Tetramerfärbung
B
Peptid
Zur Analyse von Antigen-spezifischen T-Zellen
wurde die Tetramer-Technologie angewendet. Diese
basiert darauf, dass an Fluorochrom-gekoppeltes
Streptavidin
gebundene
MHC-Peptid-Komplexe
MHC-Molekül
Fluorochromgekoppeltes
Streptavidin
(Abb. 3.2; [151]) an Antigen-spezifische T-ZellRezeptoren binden. Die so markierten T-Zellen können durchfluss-zytometrisch quantifiziert werden.
Die Milzzellen infizierter Mäuse wurden 3 d nach
der Belastungsinfektion gewonnen wie in 3.2.3.5.2
beschrieben. Etwa 106 Zellen wurden in eine 96-
Abb. 3.2 MHC I- und –II-Tetramere
MHC I- (A) und MHC II-Tetramere (B)
bestehen aus an Fluorochrom-gekoppeltes
Streptavidin gebundenen, Peptid-beladenen
MHC I- bwz. MHC II-Molekülen und
können zur Quantifizierung Antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden.
[151]
Loch-Platte überführt und mit 200 µl FACS-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit 1 µl PE-MHC-I-AbuAbuLAbuLTVFLTetramer, 0,3 µl APC-α-CD8 und 0,3 µl FITC-α-CD43 für 30 min bei RT bzw. mit 1 µl PEMHC-II- EPLTSLTPRCNTAWNRLKL-Tetramer für 2 h bei 37 °C und anschließend mit
0,3 µl APC-α-CD4 und 0,3 µl FITC-α-CD11b für 30 min bei RT gefärbt. Nach der Färbung
40
wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen, in FACS-Flow aufgenommen, mit 3 µl
7-AAD versetzt und durchfluss-zytometrisch analysiert.
3.2.3.7.2 Proliferationstest
Die Milzzellen vakzinierter Mäuse wurden 14 d nach der Boostimmunisierung gewonnen wie
in 3.2.3.5.2 beschrieben und mit PBS auf eine Konzentration von 1·108 Zellen/ml eingestellt.
1 ml der Zellsuspension wurden mit 1 ml einer 6 µM CFSE-Lösung gemischt und 3 min inkubiert. Anschließend wurden 13 ml PBS zugegeben und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in RPMI-Medium aufgenommen. 107 Milzzellen wurden anschließend in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte überführt und mit 106 dendritischen Zellen, die
aus dem Knochenmark naiver CB6F1-Mäuse gewonnen, 7 d in Gegenwart von GM-CSF
(5 ng/ml) und IL-4 (1 ng/ml) kultiviert [152] und vor dem Test mit den Peptiden AbuAbuLAbuLTVFL und EPLTSLTPRCNTAWNRLKL beladen worden waren, gemischt. Die Zellen
wurden 7 d inkubiert und anschließend wie im vorigen Abschnitt beschrieben mit den Antikörpern APC-α-CD4 und PE-α-CD8 gefärbt und durchfluss-zytometrisch analysiert.
41
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Herstellung der Impfvektoren
4.1.1 Herstellung der adenoviralen Impfvektoren
Für die Vakzinierungen wurden rekombinante, replikations-defekte Adenoviren mit Hilfe des
AdEasy-Systems hergestellt (Abb. 4.1). Hierzu wurden zunächst die Transgene in das Transferplasmid pAdTrack-CMV bzw. pShuttle-CMV [148] kloniert. Durch homologe Rekombination mit pAdEasy-1 in E. coli BJ5183 [148] und anschließende Transfektion der AdenovirusPlasmidvektoren in HEK-293-Zellen wurden die infektiösen rekombinanten AdV hergestellt.
Zur Herstellung der Fiber-Chimären, in denen die Fiber-Kopf- und -Schaft-Domänen durch
die des Typ 35 ersetzt sind (Ad5F35), erfolgte die Rekombination mit dem modifizierten
AdEasy-Plasmid pAdEasyF35 [149].
ori
Ampr
RITR
Kan
rechter homologer
Arm
ori
linker
homologer
Arm
homologe
Rekombination
PacI
CMV-Promotor
Transgen X
Transgenkassette
pA
CMV-Promotor
GFP
pA
PmeI
rechter homologer
Arm
ori Kanr
PacI Verpackungs-
linker homologer
RITR LITR
Arm
pAd5X
pA
CMV-Promotor
GFP
pA
RITR
Linearisierung
(PmeI)
Ad5 ΔE1 ΔE3
Transgen X
LITR
Verpackungssequenz
pAdTrack-CMV
pAdEasy-1
LITR
Verpackungssequenz
CMV-Promotor
r
sequenz
Transgenkassette
rechter homologer
Arm
Linearisierung (PacI)
ΔE3
RITR
linker
homologer
Arm
Ad5X
Abb. 4.1 AdEasy-System
Das Transgen X wird zunächst in das Plasmid pAdTrack-CMV kloniert und dann durch homologe Rekombination in E. coli BJ5138 mit pAdEasy in das AdV-Genom (ΔE1 ΔE3) eingebracht. Nach der Linearisierung wird das
Plasmid pAd5X zur Virus-Produktion in HEK-293-Zellen transfiziert [148].
42
Ergebnisse
Es wurden zunächst rekombinante Ad5 und Ad5F35 hergestellt, welche die F-MuLV-Proteine
Env und Gag kodieren. Die Klonierungsstrategien sind in Tab. 4.1 zusammengefasst, eine
schematische Darstellung der Vakzinierungsvektoren findet sich in Abb. 4.2.
Tabelle 4.1 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env- und Gag-kodierenden adenoviralen Impfvektoren
Klonierungsstrategie
pAdTrack-env
Ad5env
pA
CMV-Promotor
GFP
pA
LITR
Verpackungssequenz
CMV-Promotor
pAdTrack-leadergag
PCR-Produkt envHindIIISalI (Template pCG-env; HindIII, SalI) aus pGemenvHindIIISalI in pAdTrack-CMV (HindIII, SalI)
PCR-Produkt leadergag (Template pCG-leadergag; HindIII, XbaI) aus pGemleadergagHindIIIXbaI in pAdTrack-CMV (HindIII, XbaI)
ΔE3
RITR
Plasmid
env
gag
Ad5gag
Abb. 4.2 Env-und Gag-kodierende AdV
Mit Hilfe des AdEasy-Systems wurden rekombinante AdV hergestellt, welche die F-MuLV-Proteine Env und
Gag kodieren. Die Transgene ersetzen die AdV E1-Region, die E3-Region des AdV ist deletiert.
Des Weiteren wurden rekombinante Ad5 hergestellt, welche die murinen Zytokine IL2, IL12,
IL15, IL18, IL21 und GM-CSF kodieren. Die Klonierungsstrategien sind in Tab. 4.2 zusammengefasst, eine schematische Darstellung des Virusgenoms findet sich in Abb. 4.3.
Ebenfalls in Ad5- und Ad5F35-Vektoren wurden genetische Fusionen des Env-Proteins konstruiert; durch das Anhängen einer PEST-Sequenz sollte die Degradation des Env-Proteins
und damit die Präsentation von Env-Epitopen auf MHC I-Komplexen erhöht werden. Durch
die Fusion der extrazellulären Domäne des Env-Proteins mit dem mittelgroßen Hepatitis BVirus-Oberlächenprotein M-HBsAg, der extrazellulären Domäne des murinen T-ZellKorezeptors CTLA4 oder dem adenoviralen Kapsid-Protein pIX sollte die Immunogenität des
Env-Proteins und die humorale Immunantwort erhöht werden.
43
Ergebnisse
Tabelle 4.2 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Zytokin-kodierenden adenoviralen Impfvektoren
Plasmid
pILlinker
synthetischer Linker illinker in pBluescript (SacI, KpnI)
pILlinkermIL2
mIL2 (SalI, NheI) aus pGT60-mIL2 in pILlinker (SalI, XbaI)
pILlinkermIL18
mIL18 (NcoI, PstI) aus pCR3.1-mIL18 in pILlinker (NcoI, PstI)
pILlinkermIL21
mIL21 (NcoI, NheI) aus pORF9-mIL21 in pILlinker (NcoI, XbaI)
pAdTrackmIL2
mIL2 (KpnI, XhoI) aus pILlinkermIL2 in pAdTrack-CMV (KpnI, XhoI)
pAdTrackmIL15
pAdTrackmIL18
pAdTrackmIL21
Ad5ILx
pA
CMV-Promotor
GFP
pA
LITR
Verpackungssequenz
CMV-Promotor
pAdTrackmGM-CSF
ΔE3
RITR
mIL12 (NdeI (blunt), NotI) aus pUMVC3-mIL12 in pAdTrack-CMV
(BglII (blunt), NotI)
PCR-Produkt mIL15SalIKpnINotI (Template pORF9-mIL15; SalI,
NotI) in pAdTrack-CMV (SalI, NotI)
mIL18 (BglII, XhoI) aus pILlinkermIL18 in pAdTrack-CMV (BglII,
XhoI)
mIL21 (BglII, XhoI) aus pILlinkermIL21 in pAdTrack-CMV (BglII,
XhoI)
mGM-CSF (SalI, NheI (blunt)) aus pGT60-mGM-CSF in pAdTrackCMV (SalI, EcoRV)
pAdTrackmIL12
ILx
Abb. 4.3 Zytokin-kodierende AdV
Mit Hilfe des AdEasy-Systems wurden rekombinante AdV hergestellt, welche die murinen Zytokine IL2, IL12,
IL15, IL18, IL21 und GM-CSF kodieren.
Tabelle 4.3 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env-Fusionsprotein-kodierenden adenoviralen
Impfvektoren
Plasmid
Env-PEST-Sequenz-Fusion
pSexpestlinker
synthetischer Linker pestlinker in pSex (SmaI)
44
Ergebnisse
Env-PEST-Sequenz-Fusion (fortges.)
PRC-Produkt env-stopNotISalI (Template pCG-env; NotI, SalI) in
pSexpestlinker (NotI, SalI)
envpest aus pSexenvpest (BglII, HindIII) in pAdTrack-CMV (BglII,
HindIII)
pSexenvpest
pAdTrackenvpest
Env-CTLA4-Fusion
pSexsftpdlinker
synthetischer Linker sftpdlinker in pSex (SmaI)
pSex-trimlinker
Religat aus MfeI-restringiertem pSexsftpdlinker
pSexCTLA4-trim
PCR-Produkt CTLA4EcoRISalI (Template pUC9-CTLA4; EcoRI, SalI)
in pSex-trimlinker (EcoRI, SalI)
pBRlinkerBR
synthetischer Linker linkerBR in pBROW12 (SpeI, NdeI)
CTLA4-trim (BglII, HindIII) aus pSexCTLA4-trim in pBRlinkerBR
(BglII, HindIII)
PCR-Produkt env-stoptmNotIHindIII (Template pCG-env; NotI,
HindIII) in pBRCTLA4-trim (NotI, HindIII)
CTLA4-trimenv (BglII, HindIII) aus pBRCTLA4-trimenv in pAdTrackCMV (BglII, HindIII)
pBRCTLA4-trim
pBRCTLA4-trimenv
pAdTrackCTLA4env
Env-pIX-Fusion
pShuttledpIX
Religat aus MfeI-, BglII-, Mung Bean-Nuclease-restringiertem pShuttle
pShuttledpIXlinker
synthetischer Linker linkerdpIX in pShuttledpIX (KpnI, XhoI)
CMVpA (EcoRI, BamHI) aus pTLCMVpA in pShuttledpIXlinker
(MfeI, BglII)
PCR-Produkt pIXEcoRISalI (Template pShuttle; EcoRI, SalI) in pSextrimlinker (EcoRI, SalI)
pIX-trim (BglII, HindIII) aus pSexpIX-trim in pBRlinkerBR (BglII,
HindIII)
HindIII) in pBRpIX-trim (NotI, HindIII)
pIX-trimenv (BglII, HindIII) aus pBRpIX-trimenv in pShuttledpIXCMV (BglII, HindIII)
pShuttledpIXCMV
pSexpIX-trim
pBRpIX-trim
pBRpIX-trimenv
pShuttlepIXenv
Env-HBsAg-Fusion mit Trimerisierungssequenz
pSexHBsAgpreS2Ssftpd
pBRHBsAgpreS2Ssftpd
pBRHBsAgpreS2Ssftpdenv
pAdTrackHBsAgpreS2ssftpdenv
PCR-Produkt HBsAgpreS2S-stopEcoRISalI (Template HBV-positives
Patientenserum; EcoRI, SalI) in pSexsftpdlinker (EcoRI, SalI)
HBsAgpreS2Ssftpd (BglII, HindIII) aus pSexHBsAgpreS2Ssftpd in
pBRlinkerBR (BglII, HindIII)
HindIII) in pBRHBsAgpreS2Ssftpd (NotI, HindIII)
HBsAgpreS2Ssftpdenv (BglII, HindIII) aus pBRHBsAgpreS2Ssftpdenv
in pAdTrack-CMV (BglII, HindIII)
Env-HBsAg-Fusion ohne Trimerisierungssequenz
pSexHBsAgpreS2S-trim
pBRHBsAgpreS2S-trim
pBRHBsAgpreS2S-trimenv
pAdTrackHBsAgpreS2S-trimenv
PCR-Produkt HBsAgpreS2S-stopEcoRISalI (Template HBV-positives
Patientenserum; EcoRI, SalI) in pSex-trimlinker (EcoRI, SalI)
HBsAgpreS2S-trim (BglII, HindIII) aus pSexHBsAgpreS2S-trim in
pBRlinkerBR (BglII, HindIII)
HindIII) in pBRHBsAgpreS2S-trim (NotI, HindIII)
HBsAgpreS2S-trimenv (BglII, HindIII) aus pBRHBsAgpreS2S-trimenv
in pAdTrack-CMV (BglII, HindIII)
45
ΔE3
RITR
ΔE3
RITR
pA
CMV-Promotor
GFP
pA
LITR
Verpackungssequenz
CMV-Promotor
Ergebnisse
env PEST-Sequenz
Ad5envpest
CTLA4
(extrazelluläre Domäne) env (ohne TM)
Ad5CTLA4env
HBsAgpreS2S Trimerisierungsenv (ohne TM)
sequenz
Ad5HBsAgsftpdenv
HBsAgpreS2S
env (ohne TM)
pIX
pA
LITR
Verpackungssequenz
CMV-Promotor
Ad5HBsAg-trimenv
env (ohne TM)
pIXenv
Abb. 4.4 Env-Fusionsprotein-kodierende AdV
Mit Hilfe des AdEasy-Systems wurden rekombinante adenovirale Vektoren hergestellt, welche Fusionsproteine
des F-MuLV-Env mit einer PEST-Sequenz, bzw. der extrazellulären Domäne des F-MuLV-Env mit der extrazellulären Domäne von CTLA4, dem HBV-Oberflächenprotein M-HBsAg bzw. dem adenoviralen Kapsid-Protein
pIX exprimieren.
46
Ergebnisse
Das HBsAg-Env-Fusionsprotein wurde in zwei Varianten konstruiert, in einem Konstrukt
sind die beiden Proteine durch einen acht Aminosäuren langen Linker verbunden (HBsAgtrimenv). In dem anderen Konstrukt befindet sich zwischen HBsAg und Env die neck region
genannte Trimerisierungssequenz des Surfactant-Protein D (HBsAgsftpdenv) [153]. Die Klonierungsstrategien sind in Tab. 4.3 zusammengefasst, eine schematische Darstellung der Genome der Vakzinierungsvektoren findet sich in Abb. 4.4.
Die Integrität der klonierten Plasmide wurde durch Restriktions-, Sequenzierungs- sowie
durch Western Blot-Analysen kontrolliert (Daten nicht gezeigt).
4.1.2 Herstellung der herpesviralen Impfvektoren
Die Herstellung der rekombinanten HSV-Vektoren erfolgte mit Hilfe des HSVQuik-Systems
(Abb. 4.5). Die Vektoren besitzen Deletionen beider Kopien des γ34.5, die Insertion des
Transgens erfolgt in die ICP6-Region.
Abb. 4.5 HSVQuik-System
Die das Transgen X enthaltende Expressionskassette wird zunächst in das Plasmid pTransfer kloniert, durch FlpRekombination in Bakterien wird die gesamte Sequenz des pTransfer-X in das BAC fHSVQuik-1 eingebracht.
Durch Cre-loxP-Rekombination werden die BAC-Rückgratsequenzen in Vero-Zellen aus dem HSV-Genom entfernt, es entsteht das rekombinante Virus HSV-X [147].
Durch eine Flp-Rekombinase-vermittelte Rekombination wird zunächst der pTransfer-Vektor
in das BAC fHSVQuik-1 integriert, das rekombinierte BAC wird in Vero2-2-Zellen transfiziert, in denen durch eine Cre-loxP-Rekombination die BAC-Sequenzen aus dem Virusgenom
entfernt werden. Durch Insertion einer Kanamycin-Resistenz-Kassette in die für ICP27 kodierende Sequenz wurde das System um die Möglichkeit, replikations-defekte Viren herzustel47
Ergebnisse
len, erweitert. Tabelle 4.4 gibt eine Übersicht über die Klonierungsstrategien zur Herstellung
der Transfervektoren und des veränderten HSV-BAC. Es wurden auf diese Weise die replikations-kompetenten Vektoren HSVenv und HSVgag sowie die replikations-defekten Vektoren
HSVΔ27env und HSVΔ27gag hergestellt (Abb. 4.6).
Tabelle 4.4 Klonierungsstrategien zur Herstellung der herpesviralen Impfvektoren
Plasmid
pTL
synthetischer Linker TL aus TLsense und TLantisense in pTransfer
(EcoRI, BamHI)
pTLCMVpA
PCR-Produkt CMVMCSpA (BamHI, EcoRI) in pTL (BamHI, EcoRI)
PCR-Produkt envNotIBstZ17I (Template pCG-env; NotI, BstZ17I) aus
pGem-envNotIBstZ17I in pTLCMVpA (NotI, BstZ17I)
PCR-Produkt leadergagNotIAflII (Template pCG-leadergag; NotI,
AflII) aus pGem-leadergagNotIAflII in pTLCMVpA (NotI, AflII)
Kan (HindIII, AflII, Mung Bean Exonuklease) aus pBROW12-2Kan in
pEBHICP27 (SalI, Mung Bean Exonuklease)
homologe Rekombination des NdeI, AvrII-Kan-Fragments aus pEBHICP27Kan mit fHSVQuik-1
pTLenv
pTLgag
pEBHICP27Kan
fHSVΔ27
HSVenv /
HSVgag
ab
x
j
UL
ΔICP6
ICP27 b’a’c’
x
Δγ34.5
US
c
US
c
Δγ34.5
CMV-IEPromotor
GFP
HSVΔ27env / a b
HSVΔ27gag xj
Δγ34.5
UL
env / gag
Δ ICP6
Δ ICP27 b’a’c’
x
x
Δγ34.5
CMV-IEPromotor
GFP
env / gag
Abb. 4.6 Herpesvirale Impfvektoren
Mit Hilfe des HSVQuik-Systems wurden replikations-kompetente (oben) und replikations-defekte (unten) HSVVektoren hergestellt, welche die F-MuLV-Proteine Env bzw. Gag exprimieren.
Die Integrität der klonierten Plasmide wurde durch Restriktions-, Sequenzierungs- sowie
durch Western Blot-Analysen kontrolliert (Daten nicht gezeigt).
48
Ergebnisse
4.2 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden adenoviralen Vektoren
4.2.1 Ermittlung der geeigneten Route der Vektor-Applikation
Zunächst sollte festgestellt werden, welche Route der Vektor-Applikation die beste Immunantwort erzielt. Hierzu wurden C57BL/6-Mäuse zweimal im Abstand von drei Wochen mit
1010 vp Ad5eg (5·109 vp Ad5env und 5·109 vp Ad5gag) entweder intradermal in die Flanke,
intramuskulär in beide Musculi gastrocnemii oder in die Plantarseite beider Hinterpfoten injiziert. Drei Wochen nach der Belastungsinfektion wurden die Milzen entnommen und in einem
IC-Assay die Viruslast bestimmt. Wie in Abb. 4.7 gezeigt wird, lag die mediane Viruslast
nach der Belastungsinfektion bei den unvakzinierten Kontrolltieren bei 1 660 infektiösen
Zentren (IC)/Milz. Die mediane Viruslast der plantar, intramuskulär und intradermal immunisierten Mäuse betrug 0, 430 bzw. 260 IC/Milz. Die Viruslast in plantar immunisierten Mäusen
war somit signifikant niedriger als die der Kontrolltiere (P=0,002; Mann-WhitneyRangsummen-Test), während die anderen Vakzinierungsgruppen keine statistische Signifikanz erreichten. Für die folgenden Vakzinierungsexperimente wurde daher die Immunisierung in die Plantarseite der Hinterpfoten gewählt.
IC / Milz
8000
P=0,002
Abb. 4.7 Ermittlung der geeigneten Route
der Vektor-Applikation
C57BL/6-Mäuse wurden plantar, intramuskulär
oder intradermal mit Ad5env und -gag immunisiert, 3 Wochen nach der Belastungsinfektion
wurde die Viruslast im IC-Assay bestimmt. Die
Vakzinierung mit adenoviralen Vektoren führte
zu einer niedrigeren Viruslast nach der Belastungsinfektion, wobei die Immunisierung in die
Hinterpfoten den besten Immunschutz und eine
signifikante Reduktion der Viruslast bewirkte.
6000
4000
2000
ra
m
us
ku
lä
r
in
tr
ad
er
m
al
ar
pl
an
t
in
t
K
on
tr
ol
le
0
4.2.2 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg
Als weitere Strategie zur Verbesserung des Impferfolges wurde die Koexpression von Zytokinen von adenoviralen Vektoren untersucht. Für Protein- und DNA-Immunisierungen wird von
einer verbessertern Immunantwort nach Koapplikation von Zytokinen bei der Vakzinierung
49
Ergebnisse
berichtet, da die Zytokine die Immunogenität dieser Vakzine erhöhte und immunstimulatorisch wirkte [128-131]. Um den Effekt auf eine AdV-basierte Vakzine zu testen, wurden
Mäuse mit Ad5-basierten Vektoren geimpft, und sowohl bei der Prime- als auch bei der
7,0×10 3
IC / Milz
6,0×10 3
5,0×10 3
4,0×10 3
*
*
3,0×10 3
*
2,0×10 3
1,0×10
*
*
3
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
K
on
tr
ol
le
A
d5
G
A FP
d5
A IL
d5 2
A IL1
d5 2
A IL1
d5 5
A IL1
A d5 8
d5 IL
G 21
M
-C
SF
A
d5
G
A FP
d5
A IL
d5 2
A IL1
d5 2
I
A L15
d5
IL
A Ad5 18
d5 I
G L2
M 1
-C
SF
A
d5
G
A FP
d5
A IL
d5 2
A IL1
d5 2
A IL1
d5 5
A IL1
A d5 8
d5 IL
G 21
M
-C
SF
0
plantar Ad5eg +
i.m. Ad5eg +
i.d. Ad5eg +
Abb. 4.8 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg in C57BL/6-Mäusen
C57BL/6-Mäuse wurden über verschiedene Routen mit Env- und Gag-exprimierenden Ad5-basierenden Vektoren geimpft, zusätzlich wurden IL2-, IL12-, IL15-, IL18-, IL21-, GM-CSF- oder als Kontrolle GFPexprimierende Ad5-Vektoren appliziert. Die Koexpression führte nicht zu einem verbesserten Impferfolg. n = 6;
* = signifikant niedriger als die unvakzinierten Kontrollmäuse
6,0x104
A
d5
I
A
d5
G
L2
A
d5
IL
12
A
d5
IL
18
A
d5
IL
A
d5
21
G
M
-C
SF
4
ol
le
2,0x10
4
FP
4,0x10
K
on
tr
FFU / ml plasma
P ≤0,006
Abb. 4.9 Einfluss von Zytokin-Koexpression
auf den Impferfolg in CB6F1-Mäusen
CB6F1-Mäuse wurden mit Ad5eg und Zytokinexprimierenden Ad5-Vektoren durch plantare
Applikation immunisiert. Der durch Ad5eg allein
vermittelte Impfschutz konnte durch Koexpression von Zytokinen nicht verbessert werden.
Ad5eg +
50
Ergebnisse
Boost-Immunisierung wurden IL2-, IL12-, IL15-, IL18-, IL21- bzw. GM-CSF-exprimierende
Ad5-Vektoren koappliziert.
Dieses Vakzinierungsexperiment wurde zunächst in C57BL/6-Mäusen durchgeführt, wobei
die plantare, intramuskuläre (i.m.) und intradermale (i.d.) Applikationsrouten verglichen wurden. Um jeder vakzinierten Maus die gleiche Menge Virus zu applizieren, wurde ohne Zytokine immunisierten Mäusen ein GFP-exprimierendes Adenovirus koappliziert. Die unvakzinierten Mäuse hatten 21 d p.i. eine mediane Viruslast von 1 660 IC/Milz (Abb. 4.8). Die in
die Hinterpfoten, i.m. bzw. i.d. mit Ad5eg vakzinierten Mäuse hatten Virusbeladungen von 0,
435 und 259 IC/Milz und waren somit signifikant niedriger als die unvakzinierten Kontrollmäuse (P<0,05; Student-Newman-Keuls-Test). Die mit Zytokin-exprimierenden Vektoren
koimmunisierten Mäuse wiesen keine niedrigeren Virusbeladungen auf als die nur mit Ad5eg
geimpften Tiere (P>0,05; Student-Newman-Keuls-Test). In CB6F1-Mäusen wurde das Experiment wiederholt, jedoch wurde hier nur die plantare Injektion durchgeführt (Abb. 4.9). Gegenüber den unvakzinierten Kontrollmäusen (mediane Viruslast 45 127 FFU/ml) wiesen alle
immunisierten Mäuse eine niedrigere Viruslast im Plasma auf (P<0,006; Mann-WhitneyRangsummen-Test). Im Vergleich mit den mit Ad5eg immunisierten Mäusen (7 920 FFU/ml)
war die Viruslast der mit IL2-, IL12-, IL18-, IL21- und GM-CSF-exprimierenden Ad5Vektoren koimmunisierten Mäuse nicht signifikant erniedrigt (7 590, 18 480, 14 865, 7 260
bzw. 9 900 FFU/ml; P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).
4.2.3 Vergleich homologer und heterologer Impfstrategien
4.2.3.1 Bestimmung der Immunprotektion durch homologe und heterologe Vakzinierungen
Als nächstes sollte untersucht werden, ob durch eine Kombination unterschiedlicher adenoviraler Vektoren in einer heterologen Prime-Boost-Immunisierung eine Verbesserung der Immunprotektion gegenüber der homologen Prime-Boost-Immunisierung erreicht werden kann.
Die Impfung mit viralen Vektoren induziert nicht nur eine Immunantwort gegen das Transgen
sondern auch gegen den Vektor selbst. Daher wird häufig eine DNA-Immunisierung mit einer
viralen Boost-Immunisierung kombiniert [95]. Um homologe und heterologe Impfungen
miteinander zu vergleichen wurden einerseits Ad5-basierende Vektoren verwendet und
anderseits Fiber-chimäre Vektoren, in denen die Fiber-Kopf- und –Schaft-Domänen durch die
des Adenovirus Typ 35 ersetzt wurden.
51
Ergebnisse
Die beiden Impfstrategien wurden zunächst in den FV-resistenten C57BL/6-Mäusen charakterisiert, hierzu wurden die Mäuse nach homologem oder heterologem Prime-Boost-Protokoll
mit den Vektoren Ad5eg und Ad5F35eg immunisiert. Drei Wochen nach der Belastungsinfektion wurde die Viruslast in den Milzen der infizierten Mäuse im IC-Assay bestimmt. Wie in
Abb. 4.10A gezeigt ist, war die mediane Viruslast aller immunisierten Mäuse mit <10 IC/Milz
gegenüber 1 840 IC/Milz bei den unvakzinierten Mäusen signifikant reduziert (P=0,003;
Mann-Whitney-Rangsummen-Test), wobei in etwa der Hälfte der Tiere die Viruslast unter der
Nachweisgrenze lag. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den homologen und
der
heterologen
Prime-Boost-Immunisierungs-Gruppe
(P>0,05;
Mann-Whitney-
Rangsummen-Test).
A
B
P =0,002
P=0,003
19000
3000
FFU / ml Plasma
2500
2000
1500
100
80
60
40
20
0
9000
4000
1500
1000
500
d5
F3
5e
g
A
d5
eg
/A
d5
F3
5e
g
/A
d5
eg
A
d5
F3
5e
g
d5
eg
/A
tr
ol
le
A
on
K
A
d5
/A
d5
F3
5
d5
F3
5
A
d5
F3
5/
A
d5
0
A
d5
/A
K
on
tr
ol
le
IC / Milz
P =0,026
14000
Abb. 4.10 Vergleich homologer und heterologer Prime-Boost-Vakzinierungen von C57BL/6- und CB6F1Mäusen
C57BL/6- und CB6F1-Mäuse wurden zweimal mit Ad5env und –gag (Ad5eg/Ad5eg), Ad5F35env und –gag
(Ad5F35eg/Ad5F35eg) oder einer Kombination beider Vektortypen (Ad5eg/Ad5F35eg) vakziniert und drei Wochen nach der Boost-Immunisierung mit 3 000 bzw. 500 SFFU FV belastet. (A) Drei Wochen nach der Belastungsinfektion von C57BL/6-Mäusen wurde die Viruslast in der Milz bestimmt. In etwa der Hälfte der vakzinierten Mäuse lag die Viruslast unter der Nachweisgrenze des IC-Assays (B) Zehn Tage nach der Belastungsinfektion von CB6F1-Mäusen wurden Blutproben entnommen und die Viruslast im Plasma bestimmt. Alle vakzinierten
Mäuse zeigten eine signifikant niedrigere Viruslast als die unvakzinierten Kontrollmäuse, die mit der heterologen Prime-Boost-Kombination vakzinierten Mäuse hatten eine signifikant niedrigere Viruslast als die mit den
homologen Kombinationen vakzinierten.
Da die Viruslast in den FV-resistenten C57BL/6-Mäusen sehr niedrig war, wurden die Vakzinierungsstrategien als nächstes für die Vakzinierung der hoch FV-suszeptiblen CB6F1-Mäuse
52
Ergebnisse
eingesetzt. Nach der homologen bzw. heterologen Immunisierung der Mäuse erfolgte die Belastungsinfektion mit 500 SFFU FV, danach wurde der Krankheitsverlauf durch wöchentliche
Palpation der Milzen sowie durch die Bestimmung der Viruslast 10 Tage und 18-22 Tage
nach der Belastungsinfektion bestimmt. Wie in Abb. 4.10B gezeigt wird, war die Viruslast im
Plasma 10 d p.i. bei allen vakzinierten Mäusen signifikant niedriger als bei den unvakzinierten
Kontrollmäusen (P=0,002; Mann-Whitney-Rangsummen-Test), wo sie 13 850 FFU/ml betrug. Des Weiteren war die Viruslast in den mit der heterologen Prime-Boost-Kombination
vakzinierten Mäusen mit 110 FFU/ml signifikant niedriger als in den mit den homologen
Kombinationen vakzinierten Mäusen (Ad5eg/Ad5eg: 550 FFU/ml; Ad5F35eg/Ad5F35eg:
1 250 FFU/ml; P=0,026; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).
Wie in Abb. 4.11 gezeigt, lässt sich anhand der Milzgrößen der infizierten Mäuse zeigen, dass
die Vakzinierung mit adenoviralen Vektoren zu einer Verzögerung der FV-induzierten
Krankheit führt. Die Milzen der vakzinierten Mäuse waren 5 d p.i. etwas kleiner als die der
unvakzinierten Kontrollmäuse, von 10 bis 20 d p.i. waren die Milzen der vakzinierten Mäuse
signifikant kleiner als die der Kontrollmäuse (Ad5eg/Ad5eg: P=0.009; Ad5F35eg/Ad5F35eg:
P=0.026; Ad5eg/Ad5F35eg: P=0.001; Mann-Whitney-Rangsummen-Test). 25 d p.i. waren
die Milzen der mit der heterologen Kombination vakzinierten Mäuse noch kleiner als die der
mediane Milzgröße
Kontrollmäuse, allerdings war der Unterschied nicht mehr signifikant.
4
3
2
1
0
5
10
20
25
Tage nach Belastungsinfektion
Abb. 4.11 Einfluss der Vakzinierung auf den FV-induzierten
Krankheitsverlauf
Ad5eg/Ad5eg
Nach der Belastungsinfektion wurde
Ad5F35eg/Ad5F35eg durch wöchentliche Palpation der
Milzen der Krankheitsverlauf verAd5eg/Ad5F35eg
folgt, die Milzgrößen wurden in KaKontrolle
tegorien von 1 bis 4 eingeordnet.
Aufgetragen wurden die MedianWerte für die Milzgrößen. Die FVinduzierte Milzvergrößerung setzte
bei den vakzinierten Mäusen signifikant später ein als bei den unvakzinierten Kontrollmäusen. n = 6
Zum Abschluss des Experimentes wurde die Viruslast in den Milzen der infizierten Mäuse
18-22 d p.i. bestimmt (Abb. 4.12). Die Viruslast der mit Ad5eg/Ad5eg, Ad5F35eg/Ad5F35eg
und Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Mäuse war zu diesem Zeitpunkt mit 1,671·107, 1,323·107
und 1,244·107 IC/Milz noch signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse
(5,49·107 IC/Milz; P<0,05, Mann-Whitney-Rangsummen-Test), jedoch fanden sich keine sig53
Ergebnisse
nifikanten Unterschiede zwischen den mit homologen bzw. heterologen VektorKombinationen vakzinierten Mäusen.
P <0,05
2,5×10 8
IC / Milz
2,0×10 8
Abb. 4.12 Einfluss der Vakzinierung auf
die späte Phase der Infektion
18 bis 22 Tage nach der Belastungsinfektion wurde die Viruslast in den Milzen der
infizierten Mäuse bestimmt. Alle vakzinierten Mäuse zeigten eine niedrigere Viruslast als die unvakzinierten Mäuse.
n = 18
1,5×10 8
1,0×10 8
5,0×10 7
d5
F3
5/
A
d5
F3
5
A
d5
/A
d5
F3
5
d5
/A
d5
A
A
K
on
t
ro
lle
0
4.2.3.2 Charakterisierung der Immunantwort auf homologe und heterologe adenovirale
Vakzinierungen
Um die protektive Determinante zu ermitteln, die für den verbesserten Immunschutz nach heterologer Prime-Boost-Vakzinierung verantworlich ist, wurden die humorale und zelluläre
Immunantwort charakterisiert.
Zur Bestimmung der zellulären Immunantwort wurden ein Proliferationstest sowie Tetramerfärbungen durchgeführt. Für den Proliferationstest wurden CFSE-markierte Milzzellen vakzinierter Mäuse für 7 d mit Peptid-beladenen DCs kokultiviert, anschließend mit anti-CD4- und
anti-CD8-Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Wie in Abb. 4.13 gezeigt wird, wurde für die Milzzellen aller Vakzinierungsgruppen eine signifikante Abnahme
der CFSE-Fluoreszenz festgestellt (CD4+: P=0,001; CD8+: P<0,001; Student-Newman-KeulsTest), was die erhöhte Proliferation dieser Zellen anzeigt.
Für die Tetramerfärbungen wurden die vakzinierten Mäuse belastungsinfiziert und 3 d p.i.
wurden die Milzzellen isoliert und in den Tetramerfärbungen eingesetzt. Für alle Vakzinierungsgruppen wurden mit den MHC II-Tetrameren signifikant höhere Zahlen Epitopspezifischer CD4+ T-Zellen nachgewiesen als in unvakzinierten Kontrolltieren (P=0,001; Student-Newman-Keuls-Test; Abb. 4.14). Mit den MHC I-Tetrameren konnten keine spezifischen CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
54
Ergebnisse
A
mittlere Fluoreszenzintensität CD8+
1000
500
2000
1500
1000
500
0
A
d5
eg
eg
/A
d5
F3
A
d5
5e
eg
g
/A
d5
F3
5e
g
A
d5
F3
5
A
K
on
tr
d5
eg
/
eg
/A
d5
F3
A
d5
5e
eg
g
/A
d5
F3
5e
g
A
d5
eg
A
d5
F3
5
d5
eg
/
A
K
on
tr
ol
le
0
ol
le
mittlere Fluoreszenzintensität CD4+
1500
P ≤ 0,001
B
P = 0,001
Abb. 4.13 Nachweis FV-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen im Proliferationstest
Zwei Wochen nach der Boost-Immunisierung wurden die Milzzellen von immunisierten und von nicht immunisierten Mäusen gewonnen und in einen in vitro-Proliferationstest eingesetzt. Für alle immunisierten Mäuse ließ
sich eine signifikant höhere Proliferationsrate der CD4+ und CD8+ T-Zellen nach Stimulation mit Peptidbeladenen DCs feststellen.
Ad5eg/Ad5eg
Kontrolle
104
0,05 ± 0,03 %
0,31 ± 0,14 %
103
102
101
CD4
100
104
Ad5F35eg/Ad5F35eg
Ad5eg/Ad5F35eg
0,38 ± 0,11 %
0,34 ± 0,14 %
103
102
101
100
100
101
102
103
104
100
101
102
103
Abb. 4.14 Nachweis Epitop-spezifischer
CD4+ T-Zellen durch MHC II-Tetramerfärbung
Die Milzzellen vakzinierter und belastungsinfizierter Mäuse wurden 3 d p.i. gewonnen und
mit MHC II-Tetrameren gefärbt. In allen Vakzinierungsgruppen ließ sich ein signifikant höherer Anteil Epitop-spezifischer CD4+ T-Zellen
nachweisen als bei den unvakzinierten Kontrollmäusen. n = 6
104
MHC II-Tetramer
Um die humorale Immunantwort zu charakterisieren wurden 7 d nach der BoostImmunisierung Blutproben entnommen und bindende sowie neutralisierende Antikörper gegen F-MuLV bestimmt, die neutralisierenden Antikörper-Titer wurden außerdem auch
55
Ergebnisse
B
P<0,05
P<0,05
128
64
32
16
8
4
d5
e
g/
A
d5
e
A
A
K
on
tr
ol
g
<4
35
e
1/1250
le
Ad5eg/Ad5F35eg
1/250
d5
F
Ad5F35eg/Ad5F35eg
1/50
g
Ad5eg/Ad5eg
1/10
g/
A
<1/10
d5
e
bindende Antikörper-Titer
neutralisierende AK-Titer
-1
A
Abb. 4.15 Nachweis bindender und neutralisierender Antikörper
(A) Sieben Tage nach der Boost-Immunisierung wurden die bindenden Antikörper-Titer im Blut der immunisierten Mäuse nachgewiesen. Die Titer der Ad5eg/Ad5eg- und Ad5eg/Ad5F35eg-vakzinierten Mäuse waren signifikant höher als die der Ad5F35/Ad5F35-vakzinierten Mäuse. n = 13 (B) In 10 d p.i. gewonnenen Plasmaproben
wurden die neutralisierenden Antikörper bestimmt. Sowohl die mit der homologen als auch die mit der heterologen Prime-Boost-Kombination geimpften Mäuse hatten signifikant höhere neutralisierende Antikörper-Titer als
die unvakzinierten Mäuse. Die Titer der mit der heterologen Vakzine geimpften Mäuse waren signifikant höher
als die der mit der homologen Vakzine geimpften Mäuse.
10 d p.i.bestimmt. Die Vakzinierung mit Ad5eg/Ad5eg und Ad5eg/Ad5F35eg führte zu bindende Antikörper-Titern (Abb. 4.15A) zwischen 1:50 und 1:1 250 (median 1:250 bzw. 1:50),
die Titer der Ad5F35eg/Ad5F35eg-vakzinierten Mäuse lagen zwischen <1:10 und 1:250 (median 1:50) und waren somit signifikant niedriger als die der anderen Gruppen
(P≤0,033;Mann-Whitney-Rangsummen-Test). Vor der Belastungsinfektion waren keine neutralisierenden Antikörper in den immunisierten Mäusen nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
Zehn Tage nach der Belastungsinfektion lag der neutralisierende Antikörper-Titer der unvakzinierten Mäuse bei <1:4 bis 1:4 (Abb. 4.15B). Sowohl nach homologer als auch nach heterologer Immunisierung wiesen die Mäuse signifikant höhere neutralisierende Antikörper-Titer
auf (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-Keuls-Test). Mit einem medianen
Titer von 1:32 zeigten die mit heterologer Vakzine geimpften Mäuse einen signifikant höheren neutralisierende Antikörper-Titer als die mit homologer Kombination geimpften Mäuse
(1:8; P<0,05).
56
Ergebnisse
4.2.4 Einfluss der Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels mit Cardiotoxin auf den Impferfolg
Im Zusammenhang mit i.m.-verabreichten DNA-Vakzinen wird häufig der zu injizierende
Muskel mit Cardiotoxin vorbehandelt. Hierbei handelt es sich um eine Substanz des KobraGiftes, das durch eine irreversible Membrandepolarisierung zur Gewebenekrose führt. Das
nach der Nekrose regenerierende Gewebe ist aufnahmefähiger für die applizierte DNA. Es
sollte untersucht werden, ob sich ein positiver Effekt auch für AdV-basierende Vakzine beobachten lässt.
Hierzu wurden zwei Gruppen mit der heterologen Prime-Boost-Kombination aus Ad5eg und
Ad5F35eg immunisiert, einer Gruppe wurden jeweils 4 d vor Immunisierung je 50 µl 10µM
Cardiotoxin-Lösung in beide M. gastrocnemii injiziert. Der Impferfolg wurde 10 d p.i. durch
Bestimmung der Plasma-Virämie kontrolliert (Abb. 4.16). Die mediane Viruslast der unvakzinierten Kontrollmäuse betrug 13 850 FFU/ml, mit 975 FFU/ml und 525 FFU/ml war die Virusbeladung der Ad5eg/Ad5F35eg- bzw. Ad5eg/Ad5F35eg+Cardiotoxin-geimpften Mäuse
signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse (P<0,05; Mann-WhitneyRangsummen-Test), jedoch wurde der Impferfolg durch die Cardiotoxin-Behandlung nicht
signifikant verbessert (P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).
P <0,05
Abb. 4.16 Einfluss der Vorbehandlung
des injizierten Muskels mit Cardiotoxin
CB6F1-Mäuse wurden durch i.m.-Injektion
in die M. gastrocnemii immunisiert. Den
Tieren einer Gruppe wurde 4 d vor der Immunisierung zur Vorbehandlung Cardiotoxin auf dieselbe Art injiziert. Drei Wochen
nach der Belastungsinfektion wurde die Viruslast im Plasma bestimmt. Beide Vakzinierungsgruppen zeigten niedrigere Virusbeladungen als die unvakzinierten Kontrollmäuse.
20000
15000
10000
1500
1000
500
d5
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C d
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A
A
d5
eg
/A
on
d5
F3
5e
g
tr
ol
le
0
K
FFU / ml Plasma
25000
57
Ergebnisse
4.2.5 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen
auf den Impferfolg
Im Kontext der Tumorvakzinierung haben sich virale fusogene Membranproteine in der Vergangenheit durch ihre Fähigkeit herausgestellt, potente anti-tumorale Immunantworten zu induzieren. Auf Grund der Xenogenisierung transduzierter Tumorzellen und der durch die fusogenen Membranproteine induzierten Freisetzung von Syncitiosomen genannten Exosomen
wird die durch einen viralen Vektor vermittelte Tumorimmunisierung signifikant verbessert
[154-157]. Es sollte in diesem Projekt untersucht werden, ob die fusogenen Membranproteine
auch die Immunantwort auf eine anti-retrovirale Vakzinierung steigern.
CB6F1-Mäuse wurden mit der heterologen Kombination aus Ad5eg und Ad5F35eg geimpft.
Zusätzlich wurden den Mäusen adenovirale Vektoren koinjiziert, die die fusogenen Membranproteine F und H des Masernvirus (MV-F/H) bzw. das Fusionsprotein F und das Glycoprotein G des Respiratorischen Synzytialvirus (RSV-F/G) exprimieren. Zehn Tage nach der Belastungsinfektion wurde die Virusbeladung im Plasma ermittelt. Die Koimmunisierung mit
MV-F/H-exprimierenden AdV führte wie die Vakzinierung mit Ad5eg/Ad5F35eg allein zu
B
3
0
4
2,0×10
4
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5,0×10
4,0×10
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1,5×10
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2,0×10
P<0,05
4
K
2,5×10
4
P<0,05
FFU / ml Plasma
FFU / ml Plasma
A
Abb. 4.17 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen auf den Impferfolg
CB6F1-Mäuse wurden mit der heterologen Kombination aus Ad5eg und Ad5F35eg und mit MV-F/H- (A) bzw.
RSV-F/G-exprimierenden Ad5- und Ad5F35-Vektoren immunisiert (B). Die mit Ad5eg/Ad5F35eg bzw. mit
Ad5eg/Ad5F35eg und Ad5MVFH/Ad5F35MVFH immunisierten Mäuse hatten eine niedrigere Viruslast als die
unvakzinierten Mäuse. Die Koexpression von MV-F/H führte nicht zu einem verbesserten Immunschutz, die
Koexpression von RSV-F/G führte zu einer Verschlechterung des Impfergebnisses.
58
Ergebnisse
einer signifikant niedrigeren Viruslast als in unvakzinierten Kontrollmäusen (P<0,05; MannWhitney-Rangsummen-Test; Abb. 4.17), allerdings war die Viruslast nicht signifikant niedriger als nach Vakzinierung mit Ad5eg/Ad5F35eg allein (P>0,05; Mann-WhitneyRangsummen-Test). Die Koimmunisierung mit RSV-F/G-kodierenden AdV führte zu einer
Verschlechterung des Impfschutzes, die Viruslast war nicht signifikant niedriger als die der
unvakzinierten Kontrollmäuse (P>0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-KeulsTest).
4.2.6 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg
Als weitere Strategie zur Steigerung des Impferfolges wurde die Koapplikation von TLRLiganden untersucht. TLR-Liganden sind Pathogen-assoziierte Strukturen, die von Toll-likeRezeptoren auf Zellen des angeborenen Immunsystems erkannt werden und die Aktivierung
des angeborenen Immunsystems und die Expression immunmodulatorischer und kostimulatorischer Moleküle induzieren. TLR-Liganden wurden bereits als Adjuvantien für einige Vakzinierungen erfolgreich eingesetzt [133;135;137;138]. In diesem Projekt sollte der Effekt von
poly(I:C) und CpG-ODN auf den durch AdV-Vektoren vermittelten Immunschutz untersucht
werden. Hierzu wurden CB6F1-Mäuse mit Ad5eg/Ad5F35eg vakziniert und es wurden poly(I:C) oder poly(I:C) und CpG-ODN koappliziert oder 7 d nach der Immunisierung appliziert. Zehn Tage nach der Belastungsinfektion wurde die Viruslast im Plasma ermittelt.
Wie in Abb. 4.18 gezeigt, betrug die mediane Viruslast nach Koapplikation von poly(I:C)
1 592 FFU/ml und war nicht signifikant niedriger im Vergleich mit den mit Ad5eg/Ad5F35eg
allein immunisierten Mäusen (3 620 FFU/ml; P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).
Die Applikation von poly(I:C) und CpG-ODN am Tag der Immunisierung oder 7 d nach der
Immunisierung resultierte ebenfalls nicht in einer Verbesserung des Immunschutzes, die mediane Viruslast war mit 8 387 FFU/ml bzw. 3 630 FFU/ml sogar signifikant höher als bei den
mit Ad5eg/Ad5F35eg allein immunisierten Mäusen (2 887 FFU/ml; P<0,05; Kruskal-WallisAnalyse, Student-Newman-Keuls-Test) und die Viruslast der am Tag der Immunisierung mit
poly(I:C) und CpG-ODN behandelten Mäuse war nicht signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse (P>0,05).
59
Ergebnisse
A
B
P<0,05
4
8,0×10
FFU / ml Plasma
4
2,0×10
4
1,5×10
4
1,0×10
3
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0
6,0×10
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2,0×10
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P<0,05
4
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A
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A
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A
A
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A
K
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F3
5
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0
K
FFU / ml Plasma
2,5×10
P<0,05
Abb. 4.18 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg
CB6F1-Mäuse wurden mit Ad5eg/Ad5F35eg immunisiert. Zusätzlich wurden poly(I:C) (A) oder poly(I:C) und
CpG-ODN gleichzeitig oder 7 d später injiziert (B). Der Impferfolg wurde 10 d p.i. durch Bestimmung der
Plasma-Virämie kontrolliert. Die Koapplikation von poly(I:C) führte zu keiner signifikanten Änderung der Viruslast im Vergleich zu Ad5eg/Ad5F35eg immunisierten Mäusen. Bei Koapplikation von poly(I:C) und CpGODN bzw. bei um 7 d verzögerter Applikation von poly(I:C) und CpG-ODN war die Viruslast signifikant höher
als bei den nur mit Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Kontrollmäusen.
4.2.7 Beurteilung von Env-Fusionsproteinen für die Vakzinierung
In einem weiteren Experiment sollte untersucht werden, ob durch die genetische Fusion des
Env-Proteins mit einer PEST-Sequenz (envpest), mit dem mittelgroßen Hüllprotein des Hepatitis B-Virus (HBsAgsftpdenv (mit Trimerisierungssequenz) bzw. HBsAg-trimenv (ohne Trimerisierungssequenz)), mit der extrazellulären Domäne des kostimulatorischen Proteins
CTLA4 (CTLA4env) oder dem adenoviralen Kapsid-Protein pIX (pIXenv) und damit der Präsentation des Env-Proteins auf dem AdV-Kapsid die Immunogentität und somit der durch die
Vakzine vermittelte Schutz gesteigert werden kann. Bei einer PEST-Sequenz handelt es sich
um eine Peptid-Sequenz, die reich an Prolin, Glutamat, Serin und Threonin ist. Die Sequenz
vermittelt den Abbau des Proteins durch zelluläre Proteasomen, und die entstandenen Peptide
können auf MHC I-Molekülen präsentiert werden [158]. Durch das Anhängen einer PESTSequenz könnte also möglicherweise die Verfügbarkeit von Env-Epitopen auf MHC IMolekülen und die zelluläre Immunantwort erhöht werden. Durch die Fusion mit CTLA4,
welches an B7-Moleküle auf dendritischen Zellen bindet, sollte das Env-Protein gezielt an die
dendritischen Zellen herangeführt werden [141]. HBsAg-exprimierende Zellen setzen mit
HBsAg besetzte Vesikel frei, durch die Fusion von Env an HBsAg könnte die Verfügbarkeit
von Env-Proteinen für die Ausbildung von neutralisierenden Antikörpern erhöht werden
60
Ergebnisse
[146]. Auch die Präsentation des Env-Proteins auf dem adenoviralen Kapsid sollte zur verstärkten Ausbildung von neutralisierenden Antikörpern führen.
CB6F1-Mäuse wurden mit heterologen Kombinationen Env-Fusionsprotein- und Gagexprimierender Ad5- und Ad5F35-Vektoren (Ad5efusg bzw. Ad5F35efusg; efus = envpest,
CTLA4env, HBsAgsftpdenv, HBsAg-trimenv bzw. pIXenv) immunisiert. Der Impferfolg
wurde durch Bestimmung der Viruslast 10 d p.i. analysiert. Die mediane Viruslast der unvakzinierten Kontrollmäuse betrug 51 480 FFU/ml und war signifikant höher als die Viruslast aller vakzinierten Mäuse (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-Keuls-Test; Abb.
4.19). Die Viruslast der mit Env-PEST-, CTLA4-Env- und HBsAg-trim-Env-kodierenden
AdV vakzinierten Mäuse betrug 4 042, 4 372 bzw. 4 180 FFU/ml und war somit nicht signifikant niedriger als die Viruslast der mit Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Mäuse (2 887; P>0,05).
Die Viruslast der mit HBsAgsftpd-Env-kodierenden AdV vakzinierten Mäuse war mit 2 392
FFU/ml etwas niedriger als die Viruslast der mit Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Mäuse
(P>0,05). Die Viruslast der mit pIX-Env-exprimierenden AdV vakzinierten Mäuse betrug 660
FFU/ml und war somit signifikant niedriger als die der anderen Vakzinierungsgruppen
(P<0,05).
P <0,05
FFU / ml Plasma
8,0×10
4
6,0×104
4,0×10
4
2,0×10
4
P <0,05
8,0×103
4,0×10
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B
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Xe
nv
K
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tr
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le
0
Abb. 4.19 Env-Fusionsproteine für die Vakzinierung
Zur Steigerung der Immunogenität wurden genetische Fusionen des Env-Proteins hergestellt und
von Ad5- und Ad5F35-Vektoren exprimiert.
CB6F1-Mäuse wurden mit Ad5eg/Ad5F35eg
bzw. den Fusionsproteine exprimierenden Vektoren Ad5efusg/Ad5F35efusg (efus = envpest,
CTLA4env, HBsAgsftpdenv, HBsAg-trimenv
bzw. pIXenv) vakziniert. Die Viruslast im Plasma wurde 10 d p.i. bestimmt. Alle vakzinierten
Mäuse hatten eine niedrigere Viruslast als die
unvakzinierten Kontrollmäuse, die mit pIX-Envexprimierenden AdV vakzinierten Mäuse hatten
eine niedrigere Viruslast als alle anderen vakzinierten Mäuse.
Ad5efusg/Ad5F35efusg
Um zu ermitteln, ob die verbesserte Immunprotektion auf eine verstärkte humorale Immunantwort zurückzuführen ist, wurden die neutralisierende Antikörper-Titer 10 d p.i. bestimmt
(Abb. 4.20). Der mediane Antikörper-Titer der unvakzinierten Mäuse war mit <1:4 signifikant
61
Ergebnisse
niedriger als die Titer der mit Ad5eg/Ad5F35eg und Ad5pIXeg/Ad5F35pIXeg vakzinierten
Mäuse (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-Keuls-Test). Der mediane neutralisierende Antikörper-Titer der mit Ad5IXeg/Ad5F35pIXeg vakzinierten Mäuse betrug 1:128
und war damit signifikant höher als bei den Ad5eg/Ad5F35eg geimpften Mäusen (1:32;
P=0.009; Mann-Whitney-Rangsumment-Test).
P=0,009
256
128
64
32
16
8
4
pI
Xe
nv
ga
g
K
on
tr
en
vg
ag
<4
ol
le
neutralisierende AK-Titer
-1
P<0,05
Abb. 4.20 Neutralisierende AntikörperAntwort auf pIX-Env-Fusionsproteinexprimierende AdV
In 10 d p.i. gewonnenen Plasmaproben von
Ad5eg/Ad5F35egbzw.
mit
Ad5pIXeg/Ad5F35pIXeg-geimpften bzw.
unvakzinierten Mäusen wurden die neutralisierende Antikörper-Titer bestimmt. Die
neutralisierende Antikörper-Titer der vakzinierten Mäuse waren signifikant höher als
bei unvakzinierten Mäusen. Die mit
Ad5pIXeg/Ad5F35pIXeg vakzinierten Mäuse hatten signifikant höhere Antikörper-Titer
als die mit Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten
Mäuse.
4.3 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden Herpes simplex-Viren
4.3.1 Vergleich replikations-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren
Humane AdV können auf Grund ihrer Wirtsspezifität nicht in murinem Gewebe replizieren.
Um replikations-kompetente und –defekte Impfvektoren vergleichen zu können, wurden
HSV-1-basierende Vektoren hergestellt. Durch die Deletion des essentiellen immediate earlyGens icp27 wurden replikations-defekte Vektoren erhalten.
Die replikations-kompetenten bzw. –defekten HSV-1-Vektoren HSVenv und –gag bzw.
HSVΔ27env und –gag wurden zur Impfung von CB6F1-Mäusen verwendet. Zehn Tage p.i.
wurde die Viruslast im Plasma festgestellt. Die unvakzinierten Kontrollmäuse zeigten eine
mediane Virusbeladung von 70 950 FFU/ml Plasma (Abb. 4.21A). Mit 37 455 bzw. 37 537
FFU/ml war die Viruslast der HSV- bzw. HSVΔ27-vakzinierten Mäuse signifikant niedriger
als die der Kontrollmäuse (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Studen-Newman-Keuls-Test),
jedoch ließ sich kein Unterschied zwischen den HSV- und HSVΔ27-vakzinierten Mäusen
62
Ergebnisse
A
B
P <0,05
2,0×10 08
3,0×10 5
5
1,0×10 5
1,5×10 08
1,0×10 08
5,0×10 07
0
SV
d2
7
H
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H
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H
SV
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7
K
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tr
o
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va
k
2,0×10
P <0,05
2,5×10 08
4,0×10 5
IC / Milz
FFU / ml Plasma
5,0×10 5
Abb. 4.21 Vergleich des durch replikations-kompetente und –defekte HSV-Vektoren vermittelten Schutzes
CB6F1-Mäuse wurden mit HSV- bzw. HSVΔ27-Vektoren vakziniert. (A) 10 d p.i. wurde die Virusbeladung im
Plasma festgestellt. Beide Vakzinierungsgruppen hatten signifikant niedrigere Virusbeladungen im Plasma als
die unvakzinierten Kontrollmäuse. n = 28 (B) 18-21 d p.i. wurden die Milzen der infizierten Mäuse entnommen
und ihre Virusbeladung bestimmt. Die vakzinierten Mäuse hatten keine niedrigere Viruslast als die unvakzinierten Kontrollmäuse. n = 16
feststellen (P>0,05).
Um den Effekt der Vakzinierung auf die späte Phase der Infektion zu untersuchen, wurden
18-21 d p.i. die Milzen der infizierten Mäuse entnommen und in einem IC-Assay die Viruslastbestimmt (Abb. 4.21B). Zu diesem Zeitpunkt war die Viruslast der HSV- bzw. HSVΔ27vakzinierten Mäuse nicht signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse
(P>0,05; Student-Newman-Keuls-Test), allerdings war die Viruslast der HSV-vakzinierten
Mäuse höher als die der HSVΔ27-vakzinierten Mäuse (P<0,05).
Um den Krankheitsverlauf über längere Zeit zu verfolgen wurden wöchentlich die Milzen der
infizierten Mäuse palpiert. Tiere mit deutlich vergrößerten Milzen (ab 2) wurden als krank
gewertet. Wie in Abb. 4.22 gezeigt wird, waren ab 11 d p.i. 100 % der unvakzinierten bzw.
mit HSV-Vektoren vakzinierten Mäuse krank oder tot, bei den HSVΔ27-vakzinierten Mäusen
hingegen waren 16,6 % bzw. 33,3 % der Mäuse nach Tag 11 bzw. 20 p.i. nicht krank. Nach
90 Tagen wurden die Milzen dieser Tiere entnommen, und 1·106 Milzzellen wurden in
BALB/c-Mäuse injiziert. Diese Mäuse wurden über einen Zeitraum von 6 Monaten beobachtet; sie entwickelten keine FV-induzierte Krankheit, was auf eine sterile Immunität der vakzinierten CB6F1-Mäuse schließen lässt.
63
HSVeg
HSVd27eg
100
Kontrolle
50
90
41
34
27
20
11
5
0
0
% krank oder gestorben
Ergebnisse
Abb. 4.22 Überleben nach Vakzinierung mit replikations-kompetenten oder –defekten HSV-Vektoren
Nach der Belastungsinfektion wurde durch wöchentliche Palpation
der Milz der Krankheitsverlauf verfolgt. Tiere mit deutlich vergrößerten Milzen (ab Milzgröße 2) wurden als krank betrachtet. n = 6
d p.i.
4.3.2 Vergleich des Immunschutzes nach Vakzinierung mit replikationsdefekten HSV-Vektoren und mit replikations-kompetenten HSVVektoren unter gleichzeitiger Aciclovir-Behandlung
Da mit den replikations-kompetenten Vektoren weniger gute Ergebnisse erzielt wurden als
mit den replikations-defekten, sollte untersucht werden, ob dies durch die Replikation an sich
oder durch ein verändertes Genexpressionsprofil durch die Deletion des immediate earlyGens icp27 in den replikations-defekten HSVΔ27-Vektoren bedingt ist. Hierzu wurden
CB6F1-Mäuse entweder mit HSVΔ27- oder HSV-Vektoren immunisiert, ein Teil der mit
HSV-Vektoren immunisierten Mäuse wurde gleichzeitig 14 Tage lang, beginnend einen Tag
vor der Immunisierung, zweimal täglich mit Aciclovir (10 mg/kg Körpergewicht) behandelt.
Aciclovir wirkt virostatisch, ohne die Genexpression zu beeinflussen oder die infizierte Zelle
zu zerstören .
Zehn Tage nach der Belastungsinfektion wurde die Plasma-Virämie bestimmt (Abb. 4.23A).
Die unvakzinierten Kontrollmäuse hatten eine mediane Viruslast von 2,67·105 FFU/ml Plasma. Die mediane Viruslast der HSV- bzw. HSVΔ27-vakzinierten Mäuse war mit 1,005·105
bzw. 1,325·105 FFU/ml signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse
(P=0,009 bzw. P=0,003; Mann-Whitey-Rangsummen-Test). Die Viruslast der HSVvakzinierten und Aciclovir-behandelten Mäuse war mit 3,32·105 FFU/ml höher als die der unvakzinierten Kontrollmäuse (P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test). Die Viruslast wurde außerdem in der Milz 18 d p.i. quantifiziert (Abb. 4.23B). Wie im vorhergegangenen Experiment lässt sich zu diesem Zeitpunkt keine signifikant niedrigere Viruslast für die vakzinierten Mäuse mehr feststellen (P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test). Die Viruslast der
während der Immunisierung mit Aciclovir behandelten Mäuse war auch zu diesem Zeitpunkt
64
Ergebnisse
höher als die der anderen Vakzinierungsgruppen und signifikant höher als die der unvakzinierten bzw. mit HSVΔ27 vakzinierten Mäuse (P<0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).
A
B
P <0,05
8,0×10 5
P <0,05
4,0×10 08
P =0,009
6,0×10 5
2,0×10 08
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K
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1,0×10 08
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2,0×10 5
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7
4,0×10 5
H
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H
SV
+A
ci
cl
ov
ir
IC / Milz
3,0×10 08
ro
lle
FFU / ml Plasma
P =0,003
Abb. 4.23 Einfluss von Aciclovir-Behandlung auf den durch HSV-Vektoren vermittelten Immunschutz in
der frühen und späten Infektionsphase
CB6F1-Mäuse wurden mit HSV- oder HSVΔ27-Vektoren immunisiert, während der Vakzinierung mit den HSVVektoren wurde ein Teil der Mäuse mit Aciclovir behandelt. n = 10 (A) 10 d p.i. wurde die Viruslast im Plasma
ermittelt. Die ohne Aciclovir-Behandlung vakzinierten Mäuse hatten signifikant niedrigere Virusbeladungen als
die unvakzinierten Kontrollmäuse. (B) 18 d p.i. hatten die mit Aciclovir behandelten Mäuse signifikant höhere
Virusbeladungen als die unvakzinierten bzw. HSVΔ27-vakzinierten Mäuse.
65
Diskussion
5. Diskussion
Adenovirale Vektoren wurden bereits in zahlreichen Tierversuchen und einigen klinischen
Studien als Vektoren für die Vakzinierung gegen HIV evaluiert. Hier lieferten sie viel versprechende Resultate, da sie in der Lage waren, humorale und zelluläre Immunantworten zu
induzieren [51;53]. Allerdings hat die kürzliche vorzeitige Beendigung der STEP-Studie, bei
der sich eine Ad5-basierende HIV-Vakzine als unwirksam herausgestellt hat [52], verdeutlicht, dass noch ein großer Verbesserungsbedarf der anti-retroviralen Vakzinierungsstrategien
besteht. Probleme bei der Entwicklung einer effizienten Vakzine liegen häufig in der Schwierigkeit, umfassend neutralisierende Antikörper zu induzieren, die für eine effektive präventive
Vakzine essentiell sind [29]. Die Beurteilung neuer Vakzinierungsstrategien wird des Weiteren dadurch erschwert, dass es kein geeignetes Kleintiermodell für HIV/AIDS gibt. Studien
der SIV-Infektion in Schimpansen oder Makaken ermöglichen auf Grund limitierter Tierzahlen, der genetischen Heterogenität der Versuchstiere sowie der unterschiedlichen Infektionsverläufe einen Vergleich verschiedener Vakzinierungen sowie die Übertragung auf die klinische Situation von HIV/AIDS im Menschen nur eingeschränkt [29].
In dieser Arbeit wurde das FV-Modell genutzt, um verschiedene AdV- und HSV-basierende
anti-retrovirale Vakzinierungsstrategien zu evaluieren. Das FV-Modell bietet den Vorteil,
dass verschiedene Vektoren und Strategien direkt miteinander vergleichbar sind, da die Experimente in einer ausreichend großen Zahl genetisch identischer Tiere durchgeführt werden
können. Die unterschiedliche Suszeptibilität verschiedener Mausstämme für FV erlaubt die
Evaluierung von Vakzinierungen unter verschiedenen Stringenzen [46].
Die Vakzinierung von FV-resistenten C57BL/6-Mäusen mit F-MuLV-Env- und –Gagkodierenden AdV führte zu einer signifikant niedrigeren Viruslast nach der Belastungsinfektion, der Vakzinierungserfolg hing aber von der Vakzinierungsroute ab. Die Applikation in
die Hinterpfoten führte zum besten Immunschutz, die Viruslast war sehr niedrig und lag für
einige Tiere unterhalb der Nachweisgrenze. Dies ist möglicherweise auf den hohen interstitiellen Druck im Pfotenballen nach Vakzin-Injektion und damit eine erhöhte Transduktionseffizienz oder auf die Nähe ableitender Lymphknoten und damit eine verbesserte Immunpräsentation zurückzuführen.
Die Koapplikation von Zytokin-exprimierenden AdV wurde in C57BL/6-Mäusen für mehrere
Applikationsrouten und in den hoch-suszeptiblen CB6F1-Mäusen evaluiert. Es ließ sich in allen Fällen keine Verbesserung des Impferfolges beobachten. Frühere Vakzinierungsstudien
hatten im Kontext von DNA-Vakzinen bzw. von Tumor-Vakzinierungen einen positiven Ef66
Diskussion
fekt für die Koexpression von Zytokinen zeigen können [23;128;129;155-157]. Jedoch ist im
Gegensatz zu Adenoviren die Immunogenität einer DNA-Vakzine gering, und Tumore sind
meist für das Immunsystem nicht erkennbar, daher profitieren solche Vakzinierungen von einem zusätzlichen Immunstimulus. AdV hingegen sind hoch immunogen [159;160], die Infektion mit AdV löst eine akute Entzündungsreaktion im infizierten Gewebe und das Einwandern
von Immunzellen aus.
Die heterologe Kombination von zwei AdV-Typen in einer Prime-Boost-Immunisierung wurde ebenfalls sowohl in C57BL/6-Mäusen als auch in CB6F1-Mäusen evaluiert. Während in
C57BL/6-Mäusen kein Unterschied erkennbar war, führte die Vakzinierung von CB6F1Mäusen mit der heterologen Prime-Boost-Kombination zu einer signifikant niedrigeren Viruslast als mit den homologen Impfungen. Dieser Unterschied wurde erst auf Grund der höheren
Stringenz der Belastungsinfektion der CB6F1-Mäuse erkennbar. Die verbesserte Immunprotektion nach heterologer Vakzinierung ist im Einklang mit Publikationen, die für DNA-VirusKombinationen bzw. die heterologe Prime-Boost-Kombination verschiedener Viren oder Serotypen einen verbesserten Vakzinierungserfolg berichteten, was vermutlich auf die Umgehung von gegen den Vektor gerichteten Immunantworten zurückzuführen ist [91-93;95;119].
Mit Hilfe von MHC II-Tetramer-Färbung und Proliferationstest war es möglich, F-MuLVspezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen nachzuweisen. Hier ließ sich kein Unterschied zwischen
homologer und heterologer Prime-Boost-Immunisierung feststellen. Mit MHC I-Tetrameren
ließen sich keine F-MuLV-spezifischen CD8+ T-Zellen nachweisen, dies liegt vermutlich an
dem auf den Tetrameren präsentierten Peptid. Dieses stammt aus der Leader-Region des GagProteins, welche vermutlich nicht korrekt prozessiert wird, wenn das Gag-Protein von einem
Vakzinierungsvektor exprimiert wird. Daher erkennen nur wenige CD8+ T-Zellen dieses Epitop, im Gegensatz zur natürlichen Infektion [61]. Diese Annahme wird dadurch unterstützt,
dass spezifische CD8+ T-Zellen im in vitro-Proliferationstest nachweisbar waren. In einigen
Mäusen ließ sich mit dem angewandten Assay keine Virämie nachweisen, allerdings zeigten
alle Tiere ein, im Vergleich mit nicht immunisierten Tieren verzögertes, Einsetzen FVinduzierter Krankheit. Daher ist zu schließen, dass die CD8+ T-Zell-Antwort, obwohl nachweisbar, nicht ausreichend war, um den Krankheitsausbruch zu verhindern.
Die neutralisierende Antikörper-Antwort hingegen war signifikant höher nach heterologer als
nach homologer Prime-Boost-Immunisierung, was darauf schließen lässt, dass die neutralisierenden Antikörper ein entscheidender Faktor für den Schutz vor FV-Infektion und den verbesserten Impferfolg nach heterologer Vakzinierung sind. Da die T-Zell-Antworten nicht unterschiedlich waren, ist der höhere neutralisierende Antikörper-Titer wahrscheinlich auf das
67
Diskussion
Umgehen Vektor-neutralisierender Antikörper und eine effizientere B-Zell-Induktion zurückzuführen. Die wichtige Rolle neutralisierender Antikörper für einen effektiven Immunschutz
wurde bereits für die FV-Infektion [161] gezeigt. Die enttäuschenden Ergebnisse einer Phase
II-Studie, in der eine adenovirale Vakzine getestet wurde, die ausschließlich eine CTLAntwort hervorrufen sollte [52], unterstreicht auch die Bedeutung von HIV-neutralisierenden
Antikörpern für eine effektive AIDS-Vakzine. Die neutralisierende Antikörper-Titer sind in
der Größenordnung wie sie zuvor für die Vakzinierung mit rekombinanten Vakzinia-Viren
[65;66], attenuiertem F-MuLV [66] und Peptiden [162;163] beschrieben wurde, dies bestätigt
die Eignung adenoviraler Vektoren für die anti-retrovirale Vakzinierung. Weiterhin ist die
Größenordnung ähnlich wie für HIV- und SIV-Vakzinierungsstudien beschrieben [164-166],
was die Relevanz der FV-Infektion für die Evaluation anti-retroviraler Impfstoffe unterstreicht.
Der Vergleich mit anderen Vakzinen wird etwas dadurch erschwert, dass häufig unterschiedliche Mausstämme verwendet werden. Die rekombinanten Vakzinia-Vektoren wurden in den
FV-suszeptiblen (B10.A × A.BY)F1-Mäusen evaluiert, welche vor FV-induzierter Krankheit
geschützt waren, obwohl sie persistierend infiziert blieben. Diese Mäuse sind aber auf Grund
ihres genetischen Hintergrundes (H2a/b) geringer suszeptibel als die in dieser Arbeit verwendeten CB6F1-Mäuse (H2b/d), weshalb nur schwer eine Aussage getroffen werden kann, ob rekombinante AdV einen schlechteren Impfschutz vermitteln als rekombinante Vakzinia-Viren.
Die Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels mit Cardiotoxin führte zu keiner signifikanten Verbesserung des Immunschutzes. Die Behandlung eines Muskels mit Cardiotoxin führt
zur Degeneration von Muskelzellen, der anschließend regenerierende Muskel lässt sich mit
höherer Effizienz mit DNA-Impfstoffen transduzieren [167;168], und einwandernde Immunzellen erhöhen die Immunogenität einer DNA-Vakzine [169]. Die Effektivität der AdVVakzine wurde durch die Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels nicht verbessert, dies
ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Transduktionseffizienz murinen Gewebes mit
AdV im Vergleich zu DNA ohnehin recht hoch ist [170], und die hohe Immunogenität des
AdV [159;160], wie auch bei der Koexpression von Zytokinen, eine immunstimulatorische
Wirkung des Cardiotoxin überdeckt.
Die Koexpression von fusogenen Membranproteinen von Masernvirus und Respiratorischem
Syncytialvirus führte zu keiner Verbesserung des Impferfolges. In Tumortherapieexperimenten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Expression von fusogenen
Membranproteinen zu einer verbesserten Tumorvakzinierung führte [155-157]. Der Mechanismus bei der Tumorvakzinierung ist aber anders als bei der hier eingesetzten Vakzine, da
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Diskussion
bei der Tumorvakzinierung die Antigene aus der infizierten Zelle selbst stammen, und ihre
Immunogenität und Verfügbarkeit für das Immunsystem auf Grund der Xenogenisation der
Tumorzelle durch die Expression viraler Proteine bzw. durch die Bildung von Syncytiosomen
durch die Expression fusogener Membranproteine erhöht wird [154;171;172].
Die Applikation von TLR-Liganden bei der Vakzinierung bzw. eine Woche nach der Vakzinierung führte zu keiner Verbesserung der Immunantwort, vielmehr zeigten die mit der Kombination von poly(I:C) und CpG-ODN koimmunisierten Mäuse höhere Virusbeladungen als
die nur mit Env- und Gag-kodierenden Vektoren immunisierten Mäuse. Die Erhöhung der Viruslast war stärker ausgeprägt, wenn poly(I:C) und CpG-ODN mit der AdV-Vakzine koappliziert wurden. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Kombination von poly(I:C)
und CpG-ODN mit einer adenoviralen Vakzine eine Reduktion der CTL-Antwort hervorruft
[173;174]. Eine Studie zeigte eine verbesserte Tumor-Immunität bei Koapplikation von CpGODN trotz erniedrigter CTL-Antwort [173]. Dieses Ergebnis konnte jedoch im FV-Modell
nicht bestätigt werden.
In dieser Arbeit wurden verschiedene gentische Modifikationen des Env-Proteins durchgeführt. Neben dem Anhängen einer PEST-Sequenz wurden Fusionen der extrazellulären Domäne des Env-Proteins mit dem mittelgroßen Hepatitis-B-Virus-Oberflächenprotein MHBsAg, mit der extrazellulären Domäne des T-Zell-Oberflächenproteins CTLA4 und dem adenoviralen Kapsid-Protein pIX hergestellt. Die Vakzinierung mit den pIX-EnvFusionsprotein-exprimierenden AdV führte zu einer signifikanten Verbesserung des Immunschutzes gegenüber der Vakzinierung mit Env-kodierenden AdV, während die Vakzinierung
mit den Trimerisierungssequenz-enthaltenden HBsAg-Fusionsprotein-kodierenden AdV nur
in einer geringen und mit den übrigen Fusionsprotein-kodierenden AdV in keiner Verbesserung des Immunschutzes resultierte. In den mit pIX-Env-Fusionsprotein-exprimierenden AdV
vakzinierten Mäusen ließen sich signifikant höhere neutralisierende Antikörper-Titer nachweisen als in den mit Env-kodierenden AdV immunisierten Mäusen, diese verbesserte neutralisierende Antikörper-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für die verbesserte Immunprotektion. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Trimerisierung des Env-Proteins eine wichtige Rolle für die Vermittlung eines Immunschutzes spielt. In der Literatur wird die Oligomerisierung des F-MuLV-Env beschrieben, es scheint im natürlichen Infektionsverlauf Dimere,
Trimere und Tetramere zu bilden [175;176]. Das adenovirale Kapsid-Protein pIX liegt im
Kapsid zwischen den Hexon-Kapsomeren und fungiert als molekularer Zement [177]. Strukturanalysen haben gezeigt, dass pIX als Trimer im Kapsid vorliegt [178]. Somit ist es wahrscheinlich, dass das an pIX fusionierte Env-Protein ebenfalls in einer trimerisierten Form auf
69
Diskussion
dem modifizierten AdV-Kapsid vorliegt und die Bildung von Monomer-übergreifenden neutralisierenden Antikörpern ermöglicht bzw. immunologisch relevante Eptiope exponiert. Auch
das eine Trimerisierungssequenz enthaltende HBsAg-Env-Fusionsprotein vermittelte einen
etwas besseren Schutz als das Fusionsprotein ohne Trimerisierungssequenz, was die Annahme
unterstützt, dass trimerisierte Env-Proteine eine verbesserte Immunprotektion vermitteln.
Auch die Hüllproteine von HIV und SIV liegen im Virion als Trimere vor [179-181] und es
finden sich Hinweise darauf, dass funktionelle trimerisierte Env-Proteine durch die Exposition
relevanter Epitope einen effektiveren Immunschutz vermitteln können [182-185].
Das Anhängen einer PEST-Sequenz sowie die Fusionierung der extrazellulären Domäne des
Env-Proteins mit M-HBsAg und der extrazellulären Domäne von CTLA4 führte zu keiner
signifikanten Verbesserung des Immunschutzes. Mehrere Publikationen berichten von einer
verbesserten Immunantwort auf ein Antigen nach Fusion mit löslichem CTLA4 durch Zuführung des Antigens zu Antigen-präsentierenden Zellen [141;186;187], allerdings wurden die
Fusionsproteine in diesen Versuchen von DNA-Vakzinen exprimiert. Auch hier dürfte die
fehlende Steigerung darauf zurückzuführen sein, dass auf Grund der hohen Immunogenität
der AdV-Vektoren die Präsentation des Antigens für das Immunsystem, im Gegensatz zu einer DNA-Vakzine, ohnehin recht effektiv ist. Für die Vakzinierung gegen das Humane Papilloma-Virus (HPV) wurde eine Steigerung der Immunogenität und des Immunschutzes nach
Anhängen einer PEST-Sequenz an das HPV-Onkoprotein E7 bzw. nach Fusion mit dem
HBV-Oberflächenprotein HBsAg berichtet [146;188]. In dem hier durchgeführten Experiment
konnte jedoch nur für das Trimerisierungssequenz-enthaltende Fusionsprotein mit HBsAg eine leichte Verbesserung des Immunschutzes festgestellt werden. Dies liegt vermutlich in den
unterschiedlichen Eigenschaften der beiden Proteine begründet. Während das Env-Protein ein
Membran-ständiges Protein ist, ist das HPV-E7 intrazellulär lokalisiert und daher weniger zugänglich für das Immunsystem. Durch Anhängen einer PEST-Sequenz konnte die Degradation des Proteins und die folgende Präsentation auf MHC I-Molekülen erhöht werden [188], die
Fusion mit HBsAg führte zur Präsentation des gesamten Moleküls außerhalb der Zelle auf
durch HBsAg gebildeten Vesikeln und damit zu verbesserten Antikörper-Antworten
[146;189].
Im Gegensatz zu AdV kann HSV in murinem Gewebe replizieren, daher bieten diese Vektoren die Möglichkeit, replikations-kompetente und –defekte Impfvektoren miteinander zu vergleichen. Zur Herstellung eines replikations-defekten HSV wurde das essentielle immediate
early-Gen icp27 deletiert. Bei der Vakzinierung gegen FV ließ sich überraschenderweise feststellen, dass in Bezug auf Virämie 10 d p.i. und Viruslast in der Milz 18-21 d p.i. kein Unter70
Diskussion
schied für die Impfung mit replikations-kompetenten und –defekten Vektoren besteht. Im Überlebensexperiment zeigte sich, dass mit replikations-defekten Viren geimpfte Mäuse signifikant besser geschützt waren. Dies ist überraschend, da auf Grund der Ausbreitung der Impfvektoren und damit der verstärkten Antigenexpression der replizierenden Vektoren eine stärkere Immunantwort zu erwarten wäre. So gilt auch in der Literatur die Annahme, dass Lebendimpfstoffe als immunogener und effektiver als lebend-attenuierte oder tote Impfstoffe
sind [190]. Um zu klären, ob die Replikation des Virus an sich einen negativen Effekt auf den
Impferfolg hat, wurde die Vakzinierung mit replikations-kompetenten HSV-Vektoren unter
gleichzeitiger Behandlung der Mäuse mit Aciclovir durchgeführt. Aciclovir ist ein Nukleotidanalogon, dass durch die herpesvirale Thymidinkinase phosphoryliert wird und anschließend
bei der DNA-Synthese zu einem Kettenabbruch führt [191]. Durch Aciclovir wird daher die
Replikation des Virusgenoms verhindert, die Genexpression des HSV hingegen wird nicht
beeinflusst. Die Vakzinierung der Mäuse bei gleichzeitiger Aciclovir-Behandlung führte zu
einem deutlich schlechteren Impfschutz im Vergleich zu den anderen vakzinierten Mäusen.
Daraus ist zu schließen, dass nicht die Replikationskompetenz an sich das schlechtere Vakzinierungsergebnis bedingt, vielmehr scheint es sich um einen Effekt der veränderten Genexpression der replikations-defekten Vektoren zu handeln. In dem replikations-defekten Virus wurde mit dem icp27 ein essentielles immediate early-Gen deletiert, diese Deletion hebt
die Replikations-Kompetenz des Vektors auf [192], bewirkt aber auch eine fehlende Expression der in der Expressionskaskade nachgeschalteten Gene [70;193]. Herpesviren besitzen eine Vielzahl von Proteinen, die ein Umgehen der Immunantwort bewirken, durch die Deletion
des ICP27 könnte auch die Expression dieser Proteine verändert sein, was den besseren Impferfolg der ICP27-deletierten Vektoren erklären würde. Um einen besseren Vergleich replikations-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren zu ermöglichen, würde sich die Deletion eines essentiellen Strukturproteins, zum Beispiel eines Glykoproteins [117] anbieten. Diese Deletion würde ebenfalls die Replikations-Kompetenz des Vektors aufheben, aber kein verändertes Genexpressionsprofil verursachen.
Das Ergebnis ist dennoch im Einklang mit einigen anderen Publikationen, die ebenfalls berichten, dass replikations-defekte Vektoren ähnliche Impferfolge erzielten wie replikationskompetente. Murphy et al. haben ebenfalls ein ICP27-deletiertes HSV mit einem replikationskompetenten HSV-Vektor für die Vakzinierung von Rhesusaffen gegen SIV verglichen und
konnten keine Unterschiede in Bezug auf die Immunantwort und die Immunprotektion feststellen [194]. Allerdings war die Aussagekraft dieses Experiments begrenzt, da die Gruppen
nur fünf bzw. zwei Tiere umfassten. Vergleiche von MVA-Vakzinen mit konventionellen
71
Diskussion
Vakzinia-Vektoren für Vakzinierungen gegen Influenza [195] und SIV [196] zeigten ebenfalls, dass das sehr stark attenuierte MVA Immunantworten erzeugte, die mit denen auf den
konventionellen, replizierenden Vakzinia-Vektor vergleichbar waren.
Der direkte Vergleich von adenoviralen und herpesviralen Vektoren zeigt deutlich einen besseren Impfschutz nach Vakzinierung mit rekombinanten Adenoviren. Dies ist wahrscheinlich
auf das Design der herpesviralen Vektoren zurückzuführen. HSV kodiert für zahlreiche Proteine, die an der Immunevasion des Virus beteiligt sind, z.B. durch Blockierung der MHC Iund –II-Beladung [101;197], durch Suppression der Expression inflammatorischer Zytokine
[103], durch Bindung von Komplement-Faktoren oder Immunglobulinen [98;99] und durch
die Inhibition von Signaltransduktionswegen in Immunzellen [102;104]. Bei den in dieser Arbeit verwendeten HSV-Vektoren wurden nur wenige Deletionen eingefügt, nämlich in beiden
Kopien des γ34.5 zur Reduktion der Neurotoxizität und in der für die RibonukleotidReduktase kodierenden Sequenz. Es wurden aber keine der bekannten immunsuppressiven
Proteine deletiert. Beim humanen Ad5 hingegen hat nur die E3-Region immunmodulatorische
Funktion, so verhindert das E3/19K-Protein den Transport neu-synthetisierter MHC-Moleküle
und bindet an TAP- (transporter associated with antigen processing-) Moleküle [198-200]
um die Beladung von MHC I-Molekülen zu verhindern. Die E3-Region ist in den verwendeten adenoviralen Vektoren deletiert. Somit ist der genetische Hintergrund geeigneter für Vakzinierungsexperimente, wo eine Immunantwort gegen ein viral kodiertes Transgen erwünscht
ist. Um die Effektivität der HSV-vektorisierten Vakzine zu verbessern, sollten weitere Deletionen in die Vektoren eingebracht werden, um die Immunevasion zu reduzieren. Ein ICP47deletiertes onkolytisches HSV ist beschrieben worden, das im Tiermodell auf Grund der verstärkten MHC I-Präsentation eine verbesserte Tumorvakzinierung erreichte [111]. Ein ähnlicher positiver Effekt durch die Deletion immunsuppressiver Proteine sollte für die antiretrovirale Vakzinierung angenommen werden.
Die FV-Infektion hat sich als geeignetes Modell für die Entwicklung verbesserter viral vektorisierter Impfstrategien erwiesen. Während die geringe Suszeptibilität und daraus resultierende niedrige Viruslast resistenter Mäuse einen Vergleich verschiedener Vakzine erschwert, bietet die Infektion von FV-suszeptiblen Hybridmäusen ein ausreichend stringentes Modell, um
einen Impfschutz erreichen und verschiedene Vakzinierungsstrategien vergleichen zu können.
Zwar lassen sich die Ergebnisse nicht direkt auf die HIV-Infektion übertragen, da die Pathogenese der FV-induzierten Krankheit sowie deren Kinetik und die Struktur der viralen Proteine sich von HIV/AIDS unterscheiden, doch bietet die FV-Infektion ein stringentes Modell für
die Evaluation anti-retroviraler Impfstoffe.
72
Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Im FV-Modell wurden verschiedene Adenovirus- und Herpesvirus-basierende Impfstrategien
evaluiert. Es zeigte sich, dass die Route der Vektorapplikation einen entscheidenden Einfluss
auf den Impferfolg hatte, welcher bei Applikation in die Hinterpfoten am besten war und zu
einer deutlich niedrigeren Viruslast in sowohl FV-resistenten als auch -suszeptiblen Mäusen
führte. Der Impferfolg konnte durch die Koapplikation von TLR-Liganden oder von Zytokinexprimierenden Adenoviren nicht verbessert werden, was vermutlich auf die hohe Immunogenität der Adenoviren selbst zurückzuführen ist. Der durch die Impfung vermittelte Schutz
konnte hingegen durch die Kombination zweier AdV-Typen in einer heterologen PrimeBoost-Kombination signifikant verbessert werden. Der verbesserte Schutz korrelierte mit einer Erhöhung der neutralisierende Antikörper-Titer nach heterologer Immunisierung. Bei
i.m.-Injektion wurde der Impferfolg nicht durch die Vorbehandlung des zu injizierenden
Muskels mit Cardiotoxin verbessert, was vermutlich durch eine ohnehin hohe Transduktionseffizienz der AdV zu begründen ist. Die Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen führte zu keiner Verbesserung des Impferfolges, ebenso wie die genetische Fusionierung
des Env-Proteins mit HBsAg, CTLA-4 und einer PEST-Sequenz. Die Vakzinierung mit pIXEnv-Fusionsprotein-kodierenden AdV führte zu einer signifikant niedrigeren Viruslast als die
Vakzinierung mit Env-kodierenden AdV, der verbesserte Schutz korrelierte mit erhöhten
neutralisierende Antikörper-Titern und ist vermutlich auf die bessere Exposition immunologisch relevanter Epitope des auf dem AdV-Kapsid präsentierten Env-Proteins zurückzuführen. Der Vergleich replikations-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren zeigte, dass die
Replikations-Kompetenz des Impfvektors nicht zu einem verbesserten Impferfolg führt. Dies
kann an dem Vektor-Design liegen, der Vergleich ist allerdings schwierig, da in dem replikations-defekten Vektor ein möglicherweise immunologisch relevantes Gen deletiert wurde. Der
Vergleich von AdV- und HSV-Vektoren zeigte einen besseren Impferfolg für die Vakzinierung mit AdV-Vektoren, dies ist vermutlich auf die Anwesenheit einiger immunsupprimierender Gene in den HSV-Vektoren zurückzuführen. Die FV-Infektion hat sich als geeignetes
Modell für die Entwicklung verbesserter anti-retroviraler Impfstrategien bewiesen.
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Dissertationsbezogene bibliografische Daten
8. Dissertationsbezogene bibliografische Daten
Publikationen
Hoffmann D, Bangen JM, Bayer W, Wildner O
Synergy between expression of fusogenic membrane proteins, chemotherapy and facultative
virotherapy in colorectal cancer
Gene Ther. 2006 Nov;13(21):1534-44
Hoffmann D, Bayer W, Wildner O
Local and distant immune-mediated control of colon cancer growth with fusogenic membrane
glycoproteins in combination with viral oncolysis
Hum Gene Ther. 2007 May;18(5):435-50
In situ tumor vaccination with adenovirus vectors encoding measles virus fusogenic membrane proteins and cytokines
World J Gastroenterol. 2007 Jun 14;13(22):3063-70
Hoffmann D, Bayer W, Grunwald T, Wildner O
Intratumoral expression of respiratory syncytial virus fusion protein in combination with cytokines encoded by adenoviral vectors as in situ tumor vaccine for colorectal cancer
Mol Cancer Ther. 2007 Jul;6(7):1942-50
Therapeutic immune response induced by intratumoral expression of the fusogenic membrane
protein of vesicular stomatitis virus and cytokines encoded by adenoviral vectors
Int J Mol Med. 2007 Nov;20(5):673-81
Hoffmann D, Bayer W, Heim A, Potthoff A, Nettelbeck DM, Wildner O
Evaluation of Twenty-One Human Adenovirus Types and One Infectivity-Enhanced Adenovirus for the Treatment of Malignant Melanoma
J Invest Dermatol. 2007 Oct 25; [Epub ahead of print]
89
Dissertationsbezogene bibliografische Daten
Bayer W, Schimmer S, Hoffmann D, Dittmer U, Wildner O
Evaluation of the Friend Virus model for the development of improved adenovirus-vectored
anti-retroviral vaccination strategies
Vaccine (zur Publikation akzeptiert)
Präsentationen
Use of Different Adenovirus Serotypes in Prime-Boost Vaccination Enhances Immune Protection against Friend Virus
Third European Congress of Virology, Nürnberg, 1.-5. September 2007
Use of Different Adenovirus Serotypes in Prime-Boost Vaccination Enhances Immune Protection against Friend Virus
37. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Heidelberg, 5.-8. September
2007
90
Lebenslauf
9. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Wibke Bayer
Geburtstag:
03.03.1981
Geburtsort:
Hagen
Nationalität:
Deutsch
Schulische Ausbildung
1987-1991
Grundschule in Hamm-Werries und Hamm-Rhynern
1991-2000
Gymnasium Hammonense, Hamm
Studium und Promotion
WS 2000/01 - WS 2004/05
Studium der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum
Oktober 2004
Diplomarbeit in der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie, AG Dr. med. O. Wildner: „Identifikation und
Charakterisierung zellulärer und viraler Interaktionspartner der
humanen Adenovirus E4-Genprodukte mittels Hefe TwoHybrid-Screening“
seit November 2004
Promotion in der Abteilung für Molekulare und Medizinische
Virologie, AG PD Dr. med. O. Wildner
Stipendium
11/2004 –08/2007
DFG-Doktoranden-Stipendium im Rahmen des Graduiertenkollegs 1045/1 „Modulation von Wirtszellfunktionen für die Behandlung viraler und bakterieller Infektionen“
Preise
07.12.2005
Förderpreis der Sophia & Fritz Heinemann-Stifung zur Förderung der Entwicklung rekombinanter Herpesviren zur Behandlung des malignen Melanoms
91
Danksagung
10. Danksagung
Ich danke Herrn PD Dr. med. Oliver Wildner für die Überlassung des Themas, sein Interesse
am Fortgang der Forschungsarbeiten, seine Unterstützung bei der Umsetzung des Projekts
und die ständige Ermunterung, eigene Ideen einzubringen.
Herrn Prof. Dr. rer. nat. Michael Hollmann danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Bei Prof. Dr. rer. nat. Ulf Dittmer möchte ich mich für die sehr gute Kooperation während
dieser Arbeit sowie seine guten Ratschläge und hilfreiche Diskussionen bedanken. Den Mitgliedern seiner Arbeitsgruppe, besonders Simone Schimmer, möchte ich für die zahlreichen
praktischen Ratschläge und die Hilfestellung bei einigen Experimenten danken.
Ich möchte mich bei allen Mitarbeitern der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie für das freundschaftliche Arbeitsklima und ihre Hilfsbereitschaft bedanken. Einen besonderen Dank möchte ich an meinen langjährigen Labornachbarn Dr. Dennis Hoffmann richten, für die gute Zusammenarbeit, gemeinsame Projekte und Publikationen, seine Hilfsbereitschaft, geteilte Freud und geteiltes Leid und die Hilfe bei zahllosen Vakzinierungen. Ebenfalls
einen besonderen Dank an Dr. Matthias Tenbusch für viele hilfreiche Diskussionen und
Ratschläge und aufmunternde Gespräche. Claudius Großmann danke ich für die Hilfe bei den
Vakzinierungen. Klaus Sure möchte ich für seine ständige Hilfsbereitschaft, die Einführung in
quantitative PCRs und die Rettung bei vielen Computer-Problemen danken.
Ich danke allen Mitgliedern des Graduiertenkolleg 1045/1 für die tolle Gemeinschaft, das
große Engagement, lehrreiche Vorträge und hilfreiche Diskussionen.
Meiner Familie danke ich für ihre Unterstützung während meines Studiums und meiner Promotion, die mir diese Ausbildung ermöglicht hat.
Ich danke besonders meinem Freund Uwe Schmidt, der mir immer den Rücken gestärkt und
mich unterstützt hat.
92

Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren

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