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Aus der Klinik für Allgemeine Innere Medizin
(Direktor: Prof. Dr. U.R. Fölsch)
im Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel,
an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
CHARAKTERISIERUNG ZUR
SIGNALTRANSDUKTION DER
RETINOLSÄURE-INDUZIERTEN
APOPTOSE
IN HUMANEN HEPATOMZELLEN HEPG2
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung der Doktorwürde
der
Medizinischen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
MATTHIAS FUERST
aus Hamburg
Kiel, 2008
Thema der Arbeit
¾In klinischen Studien konnte durch die
Einnahme eines Retinoids die Rezidivrate
nach potentiell kurativer HCC Resektion
signifikant gesenkt werden. (Muto et al.
1996, Muto et al. 1999, Takai et al. 2005 )
¾Welche durch Retinoide induzierten
molekularen Mechanismen in humanen
Hepatomzellen sind verantwortlich für die
chemopräventive Wirkung ?
Versuchsaufbau
¾HepG2 Zellen wurden Zeit- und Dosisabhängig
mit All-trans Retinolsäure (RA) stimuliert.
¾Anhand von Westernblot Analysen und der
Fluoreszenzmikroskopie untersuchten wir
morphologische und molekularbiologische
Veränderungen in der Heptozellulären
Tumorzellline (HepG2-Zellen).
1)Nachweis von Apoptose in der Kernfärbung
und Immunfluoreszenz nach Stimulation mit
RA
Retinolsäure induzierte Apoptose
in Hepatomzellen HepG2
Gespaltenes
Zellkernfragmente
Cytokeratin 18
2) Nachweis von
Apoptose in HepG2
Zellen nach Stimulation mit RA anhand
von Westernblott Analysen
Apoptoseinduktion
durch All-Trans-Retinolsäure in Hepatomzellen HepG2
Zytosol
A
P
O
P
T
O
S
E
Mikroskopisch:
Zellfragmentierung + Membranblasen “blebs“
Spaltung von DNAReparatur-Enzymen: PARP
Spaltung des
Cytoskelettbestandteils
Zytokeratin 18
Zelldifferenzierung
Proliferationshemmung
ApoptoseApoptose?
maschinerie
Caspase 9/3
Aktivierung
Stunden
C
1
3
6
12
24
cCaspase 3
Minuten
C
15
30
Stunden
1
2
cCaspase 9
3) Bedeutung der Protein-Kinasen in der RA
vermittelten Apoptose.
Bedeutung der Mitogen-Aktivierenden-Protein-Kinasen in der RetinolsäureWachstumsvermittelten
Apoptose in Hepatomzellen
HepG2
Zellstress durch
UV-,
faktoren,
Mitogene
Stimulus
C
1
2
Röntgenstrahlung, Osmose,
Zytokine
3
3h
MAPKKK
MAPKK
3h
MAPK
pP44/42 MAP-Kinase
1h
CPARP
MLK,TAk,etc.
Raf
C
1
2
C 1
2
3
1: 10µM PD098059
3
2
3
4
P44/42MAPK
1: leer
2: RA
Biologische
Reaktion
2: 50µM all-trans
MKK4/7
Retinolsäure
MKK3/6
cPARP PJNK
MEK1/2
1
MEKK1,4,etc..
5: RA+Curcumin
Wachstum
Differenzierung
5
38MAPK
P
PD0
9805
9
Curcumin
3: 50µM
all-trans
P
JNK und
Retinolsäure
PD098059
Caspase 9/3
Apoptose
Aktivierung
Apoptose
4) Zusammenfassung der Ergebnisse.
Zusammenfassung der Retinolsäure-induzierten Apoptose in
Hepatomzellen ( HepG2 ):
All-trans Retinolsäure induziert Apoptose in HepG2 Zellen
RA aktiviert Stresskinasen ( pJNK/P-38MAPKinase). Die Inhibition der
JNK Phosphorylierung durch Curcumin hemmt die Apoptose.
Der mit Zellwachstum assoziierte P44/42MAPK Signalweg ist in HepG2Zellen konstitutiv aktiviert. Die Hemmung dieser Kaskade mit einem
spezifischen Inhibitor verstärkt die All-trans Retinolsäure induzierte
Apoptose
Die vorliegenden Ergebnisse geben erste Hinweise auf einen
potentiellen synergistischen Effekt von Multikinaseinhibitoren und
Retinoiden in der Apoptoseinduktion.
Der erfolgreiche Einsatz des Multikinaseinhibitor Sorafenib zeigt die
klinische Bedeutung der Proteinkinasen in der Therapie des
fortgeschrittenen HCC
Vielen Dank für Ihre
Aufmerksamkeit!
3) Die Retinolsäure induzierte Apoptose in
HepG2 ist Caspasenabhängig
Die Retinolsäure-vermittelte Apoptose caspasenabhängig
Mitochondrien
Caspaseinhibitor
Mitochondrien
Caspase 9/3
Hemmung
Aktivierung
Z-Vad-FMK
Mirkoskopisch:
Zellfragmentierung + Membranblasen “blebs“
Spaltung vonüberleben!
DNAHepatomzellen
Reparatur-Enzymen: PARP
Keine Apoptosezeichen!
APOPTOSE
Spaltung des Cytoskelettbestandteils
Zytokeratin 18
CPARP
CK18
Fragment
1: leer
2: DMSO
5: Z-VAD-FMK100µM
6: Z-VAD-FMK100µM 2h Praeinkubation
3: RA50µM 12h
+RA50µM 12h
4: RA100µM 12h
7: Z-VAD-FMK100µM 2h Praeinkubation
+RA100µM 12h
3) Die Retinolsäure induzierte Apoptose ist
Gentranskriptionsunabhängig
Modell der transkriptionsunabhängigen Apoptose
Zugabe des RNA-Transkriptionsinhibitors Aktinomycin D
durch All-Trans-Retinolsäure
in Hepatomzellen
verhindert die Apoptose durch
Retinolsäure nicht!
1: leer 2: RA 7: RA+Aktinomycin 4: Aktinomycin
Beweis für
CPARP
Akt
transkriptions?
D
1 2
4 Zugabe
7 des
RNA-Transkriptionsunabhängige
inhibitors Aktinomycin D
Apotose
verhindert
die Apoptose
durch
Apoptose
durch
maschinerie
Retinolsäure nicht!
Mikroskopisch:
Retinolsäure.
Zellfragmentierung + Membran3
5 6
8 9 10 11 12
blasen “blebs“
Spaltung von DNAReparatur-Enzymen: PARP
Spaltung des
Cytoskelettbestandteils
Zytokeratin 18
Caspase 9/3
Aktivierung
12h
St
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
CPARP
1: leer
2: RA
4: Aktinomycin
7: RA+Aktinomycin
Growth
Hormon
Rezeptor
FCS
AKT
1
2
3
4
5
6
7
8
PAKT
Protein3
Kinase
Beeinflusst
PI3k
PAKT
Inh.
Retinolsäure
„ survival “
CPARP
Signalwege und
1: leer
dadurch
2: PIK3-Inhibitor LY294002
50µM 12hdie Apoptose?
3: Wachstumsfaktoren ( FCS )
Antiapoptotisch
4: RA50µM 12h
6: RA+PI3K-Inhibitor LY294002
Apoptose
„Survival“
CPARP
Signalwege aktiviert
12h
12h
CPARP
PAKT
1: leer
2: PIK3-Inhibitor LY294002 50µM 12h
3: Wachstumsfaktoren ( FCS )
4: RA50µM 12h
6: RA+PI3K-Inhibitor LY294002 12h
Klinische Einleitung
¾ Das hepatozelluläre Karzinom ist weltweit eine der
häufigsten Tumorerkrankung
¾ Die steigende Inzidenz in westlichen Ländern ist vor allem
durch die steigende Prävalenz von Patienten mit einer
Hepatitis- C-Virus-assoziierten Leberzirrhose bedingt.
¾ Nach chirurgischer oder nicht-chirurgischer Therapie
limitieren HCC-Neubildungen in der koexistierenden
Leberzirrhose die Prognose des Patienten.
¾ Bisher sind im fortgeschrittenen Tumorstadium die
therapeutischen Möglichkeiten stark eingeschränkt.
Synthetic retinoid CD437 induces mitochondria-mediated apoptosis in
hepatocellular carcinoma cells (Gonda K Biochem Biophys Res Commun jun 2008)
SHARP Trial Llovet et al. 2007, ASCO 2007
Prevention of second primary tumors by an acyclic retinoid, polyprenoic acid, in
patients with hepatocellular carcinoma. Hepatoma Prevention Study Group. (Muto
et. N Engl J Med. 1996)
Prevention of second primary tumors by an acyclic retinoid, polyprenoic acid, in
patients with hepatocellular carcinoma (Muto et al 1999)
Prevention of second primary tumors by an acyclic retinoid in patients with
hepatocellular carcinoma. Updated analysis of the long-term follow-up data. (Takai
Intervirology. 2005)
Einsatz von Retinoiden in der Onkologie.
Bei folgenden Neoplasien:
Mit dem Ziel:
Leukoplakien der Mundschleimhaut, bronchogene
Metaplasie, laryngeale Papillomatose und Zervixdysplasie:
Chemopräventive Wirkung.
( Lippman, Journal of the National Cancer Institute 1992 )
•Chemopräventive Wirkung:
Verhindern das Auftreten von
primären/sekundären Neoplasien
•Direkte
antitumoröse Wirkung:
Auf hämatologische
und solide
Promyelozytenleukämie:
Differenzierung
der leukämischen
Blasten
Neoplasien
in funktionelle
und phänotypische Leukozyten.
(Fenaux, Chastang, Chevret, European APL Group. Blood 1999)
Vesanoid (all-trans-Retinolsäure) 45mg/m²
Cytoplasma
CRABPII
tische –
Retinsäurebindungsprotein
RAR/RXR
DNA
Gentranskription
RARE
Genprodukte
Apoptose?
Zelldifferenzierung
Proliferationshemmung