Erfassung der Apoptoserate von Lymphozyten und Granulozyten

Transcription

Aus der Neurologischen Klinik des St. Josef-Hospital Bochum
– Universitätsklinik – der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. H. Przuntek
Erfassung der Apoptoserate von Lymphozyten und Granulozyten
und Messung von Zytokinen, Adhäsionsmolekülen und
Entzündungsparametern im Serum von Patienten mit
akutem ischämischen Hirninfarkt in Korrelation zum
klinischen Verlauf in der postakuten Phase
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Christos Krogias
aus Wissen
2004
2
__________________________________________________________
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. H. Przuntek
Korreferent:
Priv.-Doz. Dr. med. P. Faustmann
Tag der mündlichen Prüfung: 07. Dezember 2004
3
Meinen Eltern gewidmet.
Ekaterina Krogia, geb. Zioga, aus Sykorachi / Alexandroupolis
und Dimitrios Krogias aus Thalassia / Xanthi.
„ Wir riefen Gastarbeiter und es kamen Menschen “
Max Frisch
4
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................
6
Tabellenverzeichnis ..........................................................................................
8
Abbildungsverzeichnis .....................................................................................
9
1
Einführung ........................................................................... 10
1.1
Das Krankheitsbild des ischämischen Hirninfarktes .............................. 11
1.1.1
Definition und Epidemiologie ...................................................
11
1.1.2
Risikofaktoren und deren Behandlung ......................................
12
1.1.3
Die Therapie des akuten ischämischen Hirninsultes ..................
14
1.1.3.1
Therapie in der Akutphase ................................................. 14
1.1.3.2
Sekundärprophylaxe ...........................................................
1.1.3.3
Lysetherapie ....................................................................... 17
1.1.4
1.2
16
Die ischämische Penumbra ........................................................ 18
Immunologische Grundlagen ................................................................
19
1.2.1
Apoptose .................................................................................... 19
1.2.2
Zytokine
.................................................................................... 23
1.2.2.1
Interleukin-1β . ..................................................................... 23
1.2.2.2
Interleukin-6 ......................................................................... 25
1.2.3
Interzelluläres Adhäsionsmolekül – 1 ( ICAM-1 ) .................... 26
1.2.4
Akute Phase – Proteine . ............................................................. 27
1.2.4.1
C–Reaktives Protein (CRP) .................................................. 27
1.2.4.2
Fibrinogen
........................................................................... 28
2
Methodik ............................................................................... 29
2.1
Übersicht zum experimentellen Vorgehen ............................................. 29
2.2
Auswahl der Patienten ............................................................................ 30
2.3
2.2.1
Einschlußkriterien ...................................................................... 30
2.2.2
Ausschlußkriterien ..................................................................... 31
Graduierung des klinischen Verlaufes ................................................... 32
2.3.1
European Stroke Scale ………………………………………... 32
2.3.2
National Institutes of Health Stroke Scale ……………………. 32
5
2.4
2.5
Nachweis von Apoptose .......................................................................... 33
2.4.1
Prinzip der Durchflußzytometrie ................................................. 33
2.4.2
Isolierung und Markierung von peripheren Leukozyten ............. 37
2.4.3
FACScan® - Auswertungsprozedur ............................................ 39
Bestimmung von Zytokin- und Adhäsionsmolekülkonzentrationen ....... 40
2.5.1
Prinzip eines nicht-kompetetiven, direkten EIA .......................... 40
2.5.2
Probengewinnung und –bearbeitung ........................................... 42
2.5.3
Materialien und Testdurchführung ............................................. 42
2.6
Messung der CRP- und Fibrinogenkonzentration ................................... 46
2.7
Statistische Datenanalyse ........................................................................ 46
3
Ergebnisse ............................................................................. 47
3.1
Aufteilung der Patienten nach klinischem Verlauf ................................ 47
3.2
Apoptose peripherer Lymphozyten im Vergleich .................................. 49
3.3
3.4
3.2.1
Lymphozyten-Gesamtpopulation ............................................... 50
3.2.2
CD4+ - Lyphozyten
3.2.3
Granulozyten ............................................................................... 52
................................................................... 51
Zytokine und Adhäsionsmoleküle .......................................................... 53
3.3.1
Interleukin-1β ............................................................................. 53
3.3.2
Interleukin-6 ............................................................................... 54
3.3.3
Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) ......................... 55
Akute-Phase-Proteine ............................................................................. 56
3.4.1
C-Reaktives Protein (CRP) ........................................................ 56
3.4.2
Fibrinogen ................................................................................... 57
4
Diskussion .............................................................................. 59
4.1
Apoptose nach cerebraler Ischämie ......................................................... 59
4.2
Inflammatorische Reaktion nach cerebraler Ischämie ............................ 62
5
Zusammenfassung ................................................................. 69
6
Anhang ................................................................................... 70
7
Literaturverzeichnis .............................................................. 73
6
Abkürzungsverzeichnis
A.
Arteria
Abb.
Abbildung
ACM
Arteria cerebri media
ACTH
Adrenocorticotropes Hormon
AK
Antikörper
APP
Akute Phase Proteine
ASS
Acetylsalicylsäure
Ca2+
Kalziumionen
CBF
Cerebral Blood Flow
cCT
Cranielle Computertomographie
CD
Cluster of Differentiation
CRH
Corticotropin-Realising Hormon
CRP
C–Reaktives Protein
DISC
Death Inducing Signaling Complex
DNS
Desoxiribonukleinsäure
EASIA
Enzyme-Amplified-Sensitivity-Immunoassays
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EIA
Enzyme-Immuno-Assay
ESS
European Stroke Scale
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorter and Analyzer
FITC
Fluoreszeinisothiozyanat
FL-Detektor Fluoreszenz-Detektor
FSC
Forward Light Scatter
GF
Growth Factor
griech.
Griechisch
H2O2
Wasserstoffperoxid
H2SO4
Schwefelsäure
HDL
High Density Lipoproteins
HEPES
4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinethansulfonsäure
HSF
Hepatozyten-stimulierende Faktoren
i.S.
im Serum
ICAM–1
Interzelluläres Adhäsionsmolekül–1
7
ICE
Interleukin-1 Converting Enzyme
IF
Interferon
IgG
Immunglobulin G
IL
Interleukin
Jh.
Jahrhundert
KHK
Koronare Herzkrankheit
LFA
Lymphozyte Function-Associated Antigen
λ
Lambda = Wellenlänge
MBP
Mannosebindende Protein
mg/l
Milligramm pro Liter
ml
Milliliter
µl
Mikroliter
n.s.
Nicht signifikant
NIHSS
National Institutes of Health Stroke Scale
NO
Stickoxid
PBS
phosphate buffered saline
PE
Phycoerythin
PE-Cy5
Phycoerythrin Cyanin-5
pg
Pikogramm
PG
Prostaglandine
RANTES
Regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted
rt-PA
Recombinant Tissue Plasminogen Activator
SAP
Serumamyloidprotein
SSC
Side Light Scatter
Tab.
Tabelle
TFH
Thrombozytenfunktionshemmer
TMB
Tetrametylbenzidine
TNF
Tumornekrosefaktor
TNF-R1
Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1
TRAIL
TNF-related-Rezeptoren
U/min
Umdrehungen pro Minute
VCAM
Vascular Cell Adhesion Molecule
zDEVD-fmk N-Benzyloxycarbonyl-Fluoromethyl-Ketone
ZNS
Zentrales Nervensystem
8
Tabellenverzeichnis:
Tab. 1:
Schlaganfall - modifizierbare Risikofaktoren .............................. 13
Tab. 2:
Grundsätzliche Unterschiede zwischen Nekrose und Apoptose ... 20
Tab. 3:
Einteilung der Caspasen ............................................................... 21
Tab. 4:
Akute-Phase-Proteine - Vergleich reaktionskinetischer Parameter 28
Tab. 5:
Bestimmung der IL-1β-Konzentration im Serum ........................ 45
Tab. 6:
Bestimmung der ICAM-1-Konzentration im Serum ................... 45
Tab. 7:
Deskriptive Merkmale der beiden Vergleichsgruppen . ............... 47
Tab. 8:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer Lymphozyten .... 50
Tab. 9:
Verlauf der relativen Apoptoserate peripherer Lymphozyten .... 50
Tab. 10:
Verlauf der absoluten Apoptoserate
peripherer CD4+ - Lymphozyten ................................................ 51
Tab. 11:
Verlauf der relativen Apoptoserate
peripherer CD4+ - Lymphozyten ............................................... 51
Tab. 12:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer Granulozyten ... 52
Tab. 13:
Verlauf der relativen Apoptoserate peripherer Granulozyten .... 52
Tab. 14:
Verlauf der absoluten Konzentration von Interleukin-6 i.S. ....... 54
Tab. 15:
Verlauf der Konzentration von IL-6 i.S.
in Relation zum Ausgangswert .................................................... 54
Tab. 16:
Verlauf der absoluten Konzentration von ICAM-1 i.S. .............. 55
Tab. 17:
Verlauf der Konzentration von ICAM-1
in Relation zum Ausgangswert .................................................... 55
Tab. 18:
Verlauf der absoluten Konzentration von CRP i.S. ..................... 56
Tab. 19:
Verlauf der Konzentration von CRP i.S.
in Differenz zum Ausgangswert .................................................. 56
Tab. 20:
Verlauf der absoluten Konzentration von Fibrinogen i.S. ............ 57
Tab. 21:
Verlauf der Konzentration von Fibrinogen
in Relation zum Ausganswert ..................................................... 57
Tab. 22:
Synopsis der Ergebnisse ............................................................. 58
Tab. 23:
Die European Stoke Scale .............................................................. 68
Tab. 24:
Die National Institutes of Health Stroke Scale ............................ 70
9
Abbildungsverzeichnis:
Abb. 1:
Schematische Zeichnung über die Veränderungen
der Penumbra ............................................................................ 19
Abb. 2:
Rezeptormediierte und nichtrezeptormediierte Apoptosewege ... 22
Abb. 3:
Übersicht zum experimentellen Vorgehen .................................. 29
Abb. 4:
Funktionsprinzip eines Durchflußzytometers ............................ 34
Abb. 5:
Beispiel eines dot-plot Graphen . ................................................ 35
Abb. 6:
Überlappung der Emissionsspektren von FITC und PE ............ 37
Abb. 7:
Histogramm zur Selektion von CD4+Lymphozyten ................. 39
Abb. 8:
Histogramme zur Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen
Abb. 9:
Prinzip eines nicht-kompetetiven, direkten
40
Enzym-Immuno-Assay ………………………………………… 41
Abb. 10:
Prinzip des „Sandwich-EIA“ .....................................................
41
Abb. 11:
Exemplarisches Schema auf der Mikrotiterplatte
Abb. 12:
Beispiel einer Eichkurve ............................................................ 44
Abb. 13:
Klinischer Verlauf beider Gruppen anhand der Schlaganfallskalen 48
Abb. 14:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer Lymphozyten ... 50
Abb. 15:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer
..................... 43
CD4+-Lymphozyten ................................................................... 51
Abb. 16:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer Granulozyten ... 52
Abb. 17:
Verlauf der absoluten IL-6 - Konzentration
in den Vergleichsgruppen ........................................................... 54
Abb. 18:
Verlauf der absoluten ICAM-1-Konzentration
Abb. 19:
Verlauf der absoluten CRP-Konzentration
in beiden Vergleichsgruppen ...................................................... 56
Abb. 20:
Verlauf der absoluten Fibrinogenkonzentration
10
1 Einführung
„Die Apoplexia nun betrifft den Körper im Ganzen, und bei ihr kann sowohl das Gefühl
als auch der Verstand und die Bewegung verloren gehen „
(Aretaios von Kappadokien, 1. Jh. n. Chr.).
Dieses aus der Antike stammende Zitat verdeutlicht einerseits die Vielgestaltigkeit der
Symptomatik
als
auch
die
diachrone
Prävalenz
des
Hirninfarktes
in
der
Menschheitsgeschichte (Karenberg et al. 1997). Bis heute ist der Hirninsult eine der
häufigsten schweren Erkrankungen mit weitreichenden Folgen für Patient und
Gesellschaft. In der westlichen Welt stellt er nach dem Herzinfarkt und den Krebsleiden
die dritthäufigste Todesursache dar (Klijn 2003 et al.).
Neben dem bekannten ischämisch bedingten nekrotischen neuronalen Zelltod, werden
darüber hinaus gehende, immunologisch vermittelte Nervenzellverluste durch Apoptose
und sekundäre Inflammation, zunehmend in pathophysiologischen Ischämiemodellen
berücksichtigt (Graham et al. 2001). Tierexperimentell gewonnene Erkenntnisse
belegen, dass ein nicht unerheblicher Anteil an Neuronen und Gliazellen einen
induzierten apoptotischen Zelltod sterben (Moskowitz et al. 2003). Darüber hinaus hat
eine ischämische Nekrose eine sekundäre Entzündungsreaktion zur Folge, die ihrerseits
das Ausmaß der resultierenden Hirnschädigung erweitert (Buisson et al. 2003, Vila et
al. 2000).
Das Verständnis dieser immunologischen Reaktionen könnte in Zukunft zu einem
weiteren Therapieansatz in der Behandlung von Schlaganfallpatienten führen.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Verlauf mehrerer immunologischer
Parameter in der postakuten Phase eines ischämischen Hirninfarktes zu dokumentieren
und einen möglichen Zusammenhang zwischen dieser Dynamik und dem klinischen
Verlauf zu prüfen. Dabei wurden die Apoptoserate von Lymphozyten und Granulozyten
sowie Zytokine, Adhäsionsmoleküle und Akute-Phase-Proteine im peripheren Blut
untersucht, um gegebenenfalls einen für den klinischen Alltag praktikablen Marker
herausstellen zu können.
Einen Überblick über den aktuellen Stand der Kenntnisse in der Therapie und
Sekundärprohylaxe des ischämischen Hirninsultes sowie einen Überblick über relevante
immunologische Grundlagen soll folgendes Kapitel bieten.
11
1.1
Das Krankheitsbild des ischämischen Hirninsultes
1.1.1
Definition und Epidemiologie
Beim Schlaganfall ist die Blutversorgung einer Hirnregion unterbrochen. Daraus
resultiert eine Funktionsstörung, die mit neurologischen Symptomen einhergeht (Adams
and Victor 1993). Es handelt sich um ein Syndrom. Die Ätiologien sind vielfältig. Wir
unterscheiden zwei Kategorien: Erstens den ischämischen und zweitens den
hämorrhagischen Hirninsult. 85% aller Schlaganfälle sind ischämisch bedingt (Williams
1999). Pathologisch unterscheidet man hierbei eine Makroangiopathie der supraaortalen
Gefäße (Häufigkeit 35%) von einer cerebralen Mikroangiopathie (Häufigkeit 30%). In
weiteren 30% der Fälle sind proximale Emboliequellen, am häufigsten eine
Thrombenbildung bei kardialem Vorhofflimmern für das ischämische Ereignis
verantwortlich (Hufschmidt und Lücking 1999). Sehr seltene Ursachen von
Mangeldurchblutungen sind Gerinnungsstörungen und hämatologische Erkrankungen
(Häufigkeit <5%).
15% aller Schlaganfälle sind auf vaskuläre Hirnblutungen zurückzuführen. Neben einer
hypertensiven Massenblutung bei Hypertonikern, können intracerebrale Hämatome und
Subarachnoidalblutungen auf dem Boden vaskulärer Malformationen entstehen (Poeck
und Hacke 1998). Eine Amyloid-Angiopathie oder Koagulation mit Marcumar sind
weitere Ursachen für eine Hirnblutung.
Mit jeder gewonnenen Lebensdekade verdoppelt sich das Risiko eines Schlaganfalls.
Die alterspezifische Inzidenz beträgt bis zum 64. Lebensjahr 300, zwischen dem 65. und
74. Lebensjahr 670, zwischen dem 75. und 84. Lebensjahr 1.620 und jenseits des 85.
Lebensjahres mehr als 2.400 pro 100.000 Einwohner (Eckstein et al. 1999). In
Deutschland erleiden pro Jahr über 250.000 Menschen einen Schlaganfall. Nur ein
Drittel der Kranken wird wieder voll rehabilitiert. 30% der Schlaganfallpatienten
bleiben auf Dauer schwer behindert und auf die Hilfe Dritter angewiesen (Berlit 2000).
Entsprechend hoch sind medizinische und soziale Folgekosten. In den USA jährlich 40
Mrd. US$, entsprechend 10% der jährlichen Gesamtgesundheitsausgaben der
Vereinigten Staaten für cerebrovaskuläre Erkrankungen benötigt (Taylor et al. 1996).
Nach Angaben der Deutschen Schlaganfallstiftung werden in Deutschlang ca. 16 Mrd.
DM jährlich zur Behandlung des Schlaganfalles und seiner Folgen ausgegeben
(Eckstein et al. 1999).
12
1.1.2
Risikofaktoren und deren Behandlung
Der ischämische Hirninfarkt ist eine typische risikofaktorassoziierte Erkrankung, wobei
sich durch Reduktion der Risikofaktoren eine deutliche Reduktion der oben genannten
Inzidenzzahlen erreichen liesse.
Wie bereits erwähnt ist der Schlaganfall typischerweise eine Erkrankung des höheren
Lebensalters, jedoch sind in seltenen Fällen auch Kinder- und Jugendliche betroffen.
Frauen in mittleren Lebensjahren haben ein geringeres Risiko als Männer einen
Hirninfarkt zu erleiden (Brown et al. 1996).
Die arterielle Hypertonie stellt sowohl für den ischämischen als auch für den
hämorrhagischen Hirninsult den wichtigsten modifizierbaren Risikofaktor dar
(Goldstein et al. 2001). Eine antihypertensive Behandlung reduziert dabei nicht nur das
Schlaganfallrisiko, sondern wirkt auch der Entwicklung einer vaskulären Demenz
entgegen (Forette et al. 1998). Nach Empfehlungen der HOT-Studie ist eine
Blutdruckeinstellung mit Werten um 135/85 mmHg anzustreben (Hansson et al. 1998).
Nach Ergebnissen der SHEP-Studie läßt sich durch Senkung des isoliert erhöhten
systolischen Blutdrucks um 11 mmHg das Schlaganfallrisiko um 36% reduzieren
(SHEP 1991).
Neben hohem Alter und Hypertonie sind verschiedene kardiale Erkrankungen wie
Vorhofflimmern oder Linksherzinsuffizienz die dritte wichtige Ursache von
Hirninfarkten. Durch Flussunregelmäßigkeiten besteht hierbei die Gefahr der kardialen
Thrombenbildung mit konsekutiver Hirnembolie (Hufschmidt und Lücking 1999, Poeck
und Hacke 1998).
Bei Nikotinabusus ist das Risiko zerebraler Ischämien und Blutungen um das zweifache
erhöht. Ursachlich ist dabei eine Fibrinogen- und Hämatokriterhöhung, eine vermehrte
Plättchenaggregabilität, eine verminderter HDL-Cholesterol-Spiegel und eine direkte
Endothelschädigung anzusehen (Berlit 2000). Nach Einstellung des Nikotinkonsums ist
nach fünf Jahren statistisch kein erhöhtes Schlaganfallrisiko im Vergleich zu
Nichtrauchern mehr gegeben (Wilson et al. 1997). Auch Alkoholkonsum bietet ein
erhöhtes Risiko einen Hirninfarkt zu erleiden. Dies gilt jedoch für nur für den Konsum
hoher Alkoholmengen. Niedrigen Mengen hingegen wird sogar eine protektive
Wirkung zugesprochen (Rodgers et al. 1993).
Ein weiterer wichtiger Risikofaktor ist der Diabetes mellitus, der aufgrund einer
diabetischen Angiopathie mit einem 2- bis 3-fach erhöhtem Risiko ischämischer
Hirninfarkte einhergeht (Klijn et al. 2003).
13
Die Bedeutung der Hyperlipidämie als eigenständigen Risikofaktor ist weiterhin unklar,
jedoch
ist
ein
Kausalzusammenhang
zwischen
Hypercholesterinämie
und
arteriosklerotischen Veränderungen hirnversorgender Gefässe nachgewiesen (Heiss et
al. 1991). Verschiedene Studien mit lipidsenkenden Medikamenten erbrachten
uneinheitliche Ergebnisse. Bisher sind für Simvastatin und Pravastatin eine Reduktion
des Schlaganfallrisikos dokumentiert (Plehn et al. 1999, SSSS 1994).
Bei der Frage nach Erhöhung des Infarktrisikos durch Hormonpräparate wie
Kontrazeptiva scheint sich eine klare Dosisabhängigkeit herausgestellt zu haben. So
haben zwei großangelegte Studien ergeben, daß ein Östrogenanteil unter 50µg nicht mit
einem erhöhten Schlaganfallrisiko einhergeht (Petitte et al. 1996, Schwartz et al. 1998).
Dies gilt jedoch nur für den Fall dass keine weiteren Risikofaktoren bestehen, da auch
die Einnahme geringer Östrogenmengen das Schlaganfallrisiko bei bestehender
Hypertonie oder Nikotinabusus zu potenzieren scheint (Poulter et al. 1999).
Ein weiterer unabhängiger Risikofaktor ist eine Hyperhomocysteinämie (Diaz et al.
2004). Zur Behandlung wird ein Substitutionsversuch mittels Vitamin B6, Vitamin B12
und Folsäure empfohlen (Hankey et al. 2001). Adipositas und Bewegungsmangel gelten
wie für den Myokardinfarkt auch als Risikofaktoren für cerebrale Ischämien (Berlit
2000).
Einen Überblick über die genannten beeinflußbaren Risikofaktoren und über die relative
Erhöhung des Schlaganfallrisikos gibt folgende Tabelle (Tab. 1):
Tab. 1: Schlaganfall - modifizierbare Risikofaktoren (nach Berlit 2000)
Modifizierbare Risikofaktoren
Erhöhung des Schlaganfallrisikos
Arterielle Hypertonie
2- bis 10fach
Vorhofflimmern
1- bis 17fach
Nikotinabusus
2- bis 2,5fach
Alkoholkonsum
1,5- bis 2fach (J-förmige Beziehung)
Diabetes mellitus
2- bis 3fach
Hyperlipidämie
1,5- bis 2fach
Kontrazeptiva (Östrogengehalt > 50µg)
bis 2fach
Hyperhomocysteinämie
bis 5fach
Übergewicht
1,5- bis 2fach
Bewegungsmangel
1,5- bis 2fach
14
1.1.3
Die Therapie des akuten ischämischen Hirninsultes
„Eine schwere Apoplexia zu heilen, ist unmöglich, eine leichte [zu bessern] schwierig“
konstantiert einer der berühmten hippokratischen Aphorismen (Karenberg et al. 1997).
Seit Jahrtausenden hat sich an dieser therapeutischen Ohnmacht gegenüber einem
stattgehabten Schlaganfall wenig geändert. Den Erkenntnissen und Fortschritten in der
Primär- und Sekundärprophylaxe durch Modifikation der Risikofaktoren (siehe
Abschnitt 1.1.2.) stehen nur begrenzte kurative Interventionen gegenüber. Die Therapie
des
akuten
Schlaganfalles
hat
überwiegend
nur
supportiven
Charakter.
Kardiorespiratorische und andere Komplikationen werden vermieden und behandelt.
Mit Einführung der fibrinolytischen Therapie ergab sich erstmals die Möglichkeit das
Ausmaß der zentralen Hirnschädigung aktiv zu begrenzen. Die Anwendbarkeit der
Lyse-Therapie ist nur innerhalb eines kurzen Zeitfensters von bis zu 6 Stunden gegeben.
Jeder Schlaganfall ist somit ein Notfall (Grond et al. 1998).
1.1.3.1 Therapie in der Akutphase
a) Blutdruck
Der Blutdruck sollte in der Akutphase hochnormal toleriert werden. Erst Werte >220
mmHg syst. und Werte >120 mmHg diast. erfordern eine moderate Senkung mit gut
steuerbaren Antihypertonika (Klijn et al. 2003, Cummins et al. 2000). Werte über
160/95 mmHg werden bei über 70% der Patienten in der Akutphase beobachtet, und
normalisieren sich nach ca. einer Woche (Harper et al. 1994). Dies wird als
physiologische reaktive Autoregulation zur Erhaltung eines ausreichenden cerebralen
Blutflusses erachtet. Eine vorzeitige aggressive Normalisierung der Blutdruckwerte
ging in mehreren Studien mit einem ungünstigeren Verlauf einher (Chalmers et al.
1998, Kaste et al. 1994, Lisk et al.1993).
b) Körpertemperatur
Da eine erhöhte Körpertemperatur die Bildung eines Hirnödems fördert, und weiterhin
das Risiko einer sekundären Einblutung erhöht, sollten Hyperthermien mit Antipyretika
behandelt, und gegebenenfalls eine Infektionsquelle antibiotisch saniert werden
(Ginsberg et al. 1998, Davalos et al. 1997).
15
c) Blutzucker
Erhöhte Blutzuckerwerte gehen ebenfalls mit einer schlechteren Prognose einher. Eine
Korrektur wird bei Blutzuckerwerten über 140 mg/dl empfohlen (Bruno et al. 1999).
d) Hirndruck
Ein letaler Ausgang in der postakuten Phase ist meist auf ein Hirnödem und erhöhten
intrakraniellen Druck zurückzuführen. Deshalb sollten Patienten mit großem
hemisphärischen Infarkt in 20-30 Grad hochgestelltem Oberkörper gelagert werden.
Auf eine ausreichende Oxygenierung ist zu achten. Gegebenfalls sind eine kontrollierte
Hyperventilation, die Gabe von Osmotherapeutika und Diuretika oder auch eine
operative Dekompression mittels Hemikraniektomie indiziert (Schwarz et al. 2002).
e) Antikoagulantien oder Thrombozytenaggrerationshemmer?
Weiterhin kontrovers wird die Diskussion darüber geführt, ob in der Akutphase
Antikoagulantien gegenüber Thrombozytenaggregationshemmer von Vorteil sind
(Cummins et al. 2000, Diener 2000, Bousser et al. 1997, Schellinger et al. 1997).
In der IST-Studie wurde an über 19.000 Patienten die subkutane Gabe von Heparin
getestet (IST 1997). In diesem Teil der Studie erhielten die Patienten zwei mal täglich
entweder 5.000 oder 12.500 IE Heparin s.c. bzw. kein Heparin. Zwar traten in der
Heparin-Gruppe weniger Reinfarkte und thromboembolische Ereignisse im venösen
Stromgebiet auf (2,9% vs. 3,8%), dieser positive Effekt wurde jedoch durch die erhöhte
Blutungsrate wieder aufgehoben (1,2% vs. 0,4%). Ein Vergleich zwischen der mit 5.000
IE und der mit 12.500 IE Heparin behandelten Patientengruppe zeigt auf, dass das
Blutungsrisiko bei Hochdosis-Heparinisierung erhöht ist. Auch nach Veröffentlichung
von weiteren Studienanalysen wird der Nutzen einer Heparinbehandlung zunehmend in
Frage gestellt (Diener 2000).
Somit stehen in der Therapie des akuten nicht kardioembolischen Hirninfarktes
Thrombozytenfunktionshemmer
wasserlösliches,
(TFH)
wie Acetylsalicylsäure (ASS) und ihr
injezierbares Mono-Lysinsalz (Aspisol®) an erster Stelle (CAST
1997, IST 1997, SPIRIT 1997, MAST-I 1995, Böger et al. 1993).
Zusammenfassend gilt, daß eine high-dose Heparintherapie aktuell nur bei kardiogenen
oder arterioarteriellen Embolien, bei Dissektionen, bei höhergradigen Stenosen
hirnversorgender Gefäße und beim progressive Stroke nach Ausschluß von
Kontraindikationen empfohlen wird (Klijn et al. 2003, Cummins et al. 2000).
16
1.1.3.2 Sekundärprophylaxe
Thrombozytenaggregationshemmer sind in der Sekundärprophylaxe die etablierten
Substanzen (Diener 2000, ATC 1994, SALT1991, Dutch-TIA 1991, UK-TIA 1991).
ASS ist dabei die am besten untersuchte Substanz, wobei weiterhin Unklarheit über die
optimale Dosis besteht (Masuhr et al. 1998).
In der Sekundärprophylaxe kardiogen-embolischer Hirninfarkte werden jedoch orale
Antikoagulantien empfohlen. In der Europäischen Vorhofflimmern-Studie konnte eine
relative
Schlaganfallrisikoreduktion
von
über
60%
im
Vergleich
zu
Thrombozytenfunktionshemmern erreicht werden (EAFT 1993).
Neuere TFH wie Ticlopidin und Clopidogrel, und die Kombination von ASS und
Dipyridamol erlauben unter Berücksichtigung des individuellen Risikoprofils eine noch
bessere sekundärprophylaktische Einstellung von Schlaganfallpatienten (CAPRIE 1996,
Diener 1996, CATS 1989, Hass et al. 1989).
Bedingt
durch
ein
stärkeres
Nebenwirkungsprofil
(Durchfälle,
Neutropenien,
thrombotisch thrombozytopenische Purpura), sollte Ticlopidin jedoch nur Patienten
verordnet werden, die ASS nicht tolerieren. Vorteilhafter erweist sich Clopidogrel, da
sich eine relative Risikoreduktion gegenüber ASS erreichen liesse, ohne dabei ein
erhöhtes Risikoprofil aufzuzeigen (CAPRIE 1996).
Untersuchungen ob eine Kombination von ASS und Dipyridamol gegenüber einer
Monotherapie mit ASS von Vorteil ist, erbrachten uneinheitliche Ergebnisse. In der
Anwendung von Dipyridamol besteht weiterhin Zurückhaltung, da es in Verdacht steht,
Angina pectoris-Attacken auszulösen. In der mit 6602 Patienten größten Studie konnte
jedoch eine klare relative Risikoreduktion durch die Kombinationsbehandlung (50mg
ASS und 400mg Dipyridamol tgl. gegenüber ASS 50mg) erreicht werden, und darüber
hinaus konnte in einer Subgruppenanalyse gezeigt werden, dass die Gabe von
retardiertem Dypiridamol keine negativen Auswirkungen auf kardiale Ereignisse bei
Patienten mit KHK hat (Diener et al. 2001).
17
1.1.3.3 Lysetherapie
Im Jahr 1995 begann mit der Veröffentlichung zweier Studien (ECASS und NINDS)
mit systemischer Gabe von rekombinantem Gewebsplasminogenaktivator (rt-PA) die
Ära rekanalisierender Therapien, die erstmals die Möglichkeit einer aktiven
Intervention zur Begrenzung des ischämischen Hirnschadens, über die genannten
supportiven und präventiven Maßnahmen hinaus bot (Hacke 1995, NINDS 1995).
Beide Studien (ECASS erst nach Abzug mehrerer Protokollverletzungen) konnten
positive Resultate bzgl. des klinischen Outcomes aufzeigen, jedoch war die Behandlung
in beiden Studien mit einer erhöhten Rate cerebraler Blutungskomplikationen
verbunden.
Weitere Studien belegten, daß eine thrombolytische Therapie nur unter konsequenter
Beachtung der Ein- und Ausschlußkriterien wie Infarktausdehnung, Infarkfrühzeichen,
Zeitfenster usw. als effektiv und sicher gelten kann, so daß sie nur für weniger als 5%
aller Hirninfarktpatienten in Frage kommt (Cummins et al. 2000, Steiner et al. 2000,
Clark et al. 1999, Hacke et al. 1998). Auch durch eine lokale Lysetherapie läßt sich
keine wesentliche Erweiterung der Zielgruppe erreichen (Furlan et al. 1999). Dem
verlängerten Zeitfenster von sechs Stunden steht die geringe Anzahl von
neuroradiologischen Interventionszentren entgegen. Des weiteren ist eine lokale
Lysetherapie nur bei einer geringen Anzahl von Patienten mit isoliertem proximalen
Mediastammverschluß indiziert.
Diese geringe Anzahl von thrombolytisch behandelbaren Patienten zeigt die
Notwendigkeit
auf,
nach
weiteren,
über
die
rekanalisierende
Möglichkeit
hinausgehenden Therapiemaßnahmen zu forschen, denn neben dem direkt ischämisch
bedingten Zelltod werden beim Hirninfarkt sekundär weitere biochemische Vorgänge
wie Exzitotoxizität und Apoptose in Gang gesetzt, welche einen zusätzlichen Untergang
von Nervenzellen in der Penumbra bedingen (Graham et al. 2001, Morgenstern et al.
2001, Block et al. 1999). Die Begrenzung solcher postischämisch-immunologischen
Reaktionen könnte eine Therapieoption zum Überleben der Penumbra bieten, und
zugleich einem größeren Patientengut zugänglich sein (Onteniente et al. 2003).
Im folgenden sollen das Penumbramodell und die für vorliegende Studie relevanten
immunologischen Grundlagen vorgestellt werden.
18
1.1.4 Die ischämische Penumbra
Als Penumbra wird die Randzone um das nekrotische Kerngebiet eines Hirninfarktes
definiert, in der zwar der Funktionsstoffwechsel erloschen, der Strukturstoffwechsel
hingegen noch erhalten ist (Astrup et al. 1981).
Das Gehirn mit nur 2% der Körpermasse benötigt etwa 20% des Herzzeitvolumens, um
seinen enormen Sauerstoff- und Energieverbrauch zu decken. Da es nur über geringe
Energiereserven und Kompensationsmechanismen verfügt, führt die Abnahme des
zerebralen Blutflusses (CBF, normal ca. 0,5 ml/g/min), zu neuronalen Funktions- und
Strukturausfällen (Hamann 1997).
Im Falle einer fokalen Ischämie führt der Verschluß einer hirnversorgenden Arterie zum
Auftreten von Regionen mit unterschiedlicher Restdurchblutung und Kompensation
durch Kollateralisierung. Dabei können zwei Schwellenwerte reduzierter Hirnperfusion
definiert werden: bei einem Abfall des CBF auf 40% des Normwertes kommt es zum
elektrischen Funktionsausfall von Nervenzellen, bei einem Abfall auf 20% der Norm
kommt es zum Zusammenbruch des Membranpotentials und damit zu einem
strukturellen Nervenzellschaden (Hamann 1997). Eine Hirnregion mit einem CBF
zwischen diesen Schwellenwerten entspricht der Penumbra.
Es handelt sich dabei nicht um eine statische Region, sondern vielmehr um ein Gebiet,
in dem eine Vielzahl von Zellreaktionen wie Exzitotoxizität, vermehrte Bildung freier
Radikale, Apoptose und Inflammation stattfinden (Block et al. 1999). Vom Ausmaß
dieser Zellschädigungen und vom zeitlichen Einsetzen einer möglichen Reperfusion
hängt es ab, ob eine Nekrosematuration (Umwandlung der Penumbra in eine
nekrotische Infarktzone) oder eine funktionelle Erholung stattfindet. Im Allgemeinen
wird davon ausgegangen, daß die Penumbra nur innerhalb der ersten sechs Stunden
nach Onset des Schlaganfalles revitalisierbar ist (Ginsberg et al. 1994). In Einzelfällen
konnte jedoch eine vollständige Nekrosematuration erst nach 48 Stunden nachgewiesen
werden (Heiss et al. 1992).
Die Penumbra stellt somit den sensiblen und gefährdeten Bereich beim Schlaganfall
dar. Die Einflussnahme auf in ihr stattfindende immunologische Prozesse stellt eine
potentielle
Interventionsmöglichkeit dar, um das endgültige Ausmaß der Hirn-
schädigung zu reduzieren.
19
Abb. 1:
Schematische Zeichnung über die Veränderungen der Penumbra (Block 1999).
oben: Ohne Intervention kann es zu einer Ausbreitung des Infarktes (grau) auf die
gesamte Penumbraregion (hellgrau) kommen.
unten: Durch Reperfusion, antiapoptotische und antiinflammatorische Intervention
erhofft man sich, diese Ausbreitung einzugrenzen, so daß ein Teil der Penumbra als
intaktes Gewebe (weiß) erhalten bleibt.
1.2 Immunologische Grundlagen
1.2.1
Apoptose
Bereits 1951 wurden verschiedene Formen des Zelltodes nach morphologischen
Charakteristika klassifiziert (Glücksmann et al. 1951). In den sechziger Jahren wurde
beobachtet, daß bestimmte Zellen nach einem vorbestimmten Muster untergehen, und
daß dieser Vorgang von der zelleigenen Proteinsynthese abhängig ist (Lockshin et al.
1964, Tata et al. 1966). Es entstand somit der Begriff des „programmierten Zelltodes“,
welcher der Nekrose morphologisch und funktionell gegenüber gestellt wurde.
20
Die Apoptose (griech. für Herabfallen welkender Blütenblätter), als häufigste Form des
programmierten Zelltodes, wurde erstmals 1972 von Kerr, Wyllie und Currie
beschrieben (Kerr et al. 1972). Es handelt sich hierbei um einen im Erbgut
programmierten Selbstmordmechanismus, der unter aktiver zellulärer Kontrolle abläuft
(Steller et al. 1995). Die grundsätzlichen Unterschiede zur Nekrose sind in Tabelle 2
aufgelistet.
Durch diese selektive Zelleliminierung sind die vielzelligen Organismen in der Lage,
die Homöostase zwischen Zellproliferation und Zelltod aufrecht zu halten.
Tab. 2: Grundsätzliche Unterschiede zwischen Nekrose und Apoptose
Nekrose
Apoptose
Zellschwellung
Zellschrumpfung
Plasmamembran lysiert
Plasmamembran intakt
Energieunabhängig
ATP-abhängig
Konjunkter Gewebsuntergang
isolierter Zelluntergang
Entzündliche Gewebsreaktion
keine Entzündung
Morphologisch zeichnet sich die Apoptose durch Zellschrumpfung bei erhaltenen
Membranstrukturen, sowie durch Chromatinkondensation mit meist folgender DNSFragmentation durch aktivierte Endonukleasen aus (Gold et al. 2001, Kuschinski and
Gillardon 2000, Wyllie et al. 1980). Diese Autolyse erfolgt ohne Freisetzung
proinflammatorischer Enzyme, und ist somit auch nicht von einer sekundären
Entzündungsreaktion gefolgt.
In der Terminalphase zerfällt die apoptotische Zelle in mehrere apoptotische
Körperchen, die schliesslich von benachbarten Zellen phagozytiert werden. Es wird
angenommen, daß es sich bei der Apoptose um einen relativ raschen, innerhalb von 4-5
Stunden ablaufenden Prozess handelt (Bursch et al. 1990).
Verschiedene unspezifische und spezifische Stimuli wie ionisierende Strahlen, der
Entzug von Wachstumsfaktoren oder freie Radikale können das Apoptoseprogramm
einer Zelle aktivieren (Lewen et al. 2000, Warren et al. 2000, Jacobson et al. 1997).
21
Dabei
werden
rezeptormediierte
und
nichtrezeptormediierte
Mechanismen
unterschieden (siehe Abbildung 2). Zu den Apoptoserezeptoren gehören z.B. der
Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNF-R1), die TNF-related-Rezeptoren 1 und 2
(TRAIL-R1 und TRAIL-R2) als auch das ebenfals zur TNF-Rezeptorfamilie zählende
Fas-Protein (Apo1/CD95).
Es handelt sich dabei um transmembrane Proteine, die nach Aktivierung an ihrer
zytosolischen Seite spezifische Proteininteraktionen in Gang setzen. Durch diesen als
„death inducing signaling complex (DISC)“ bezeichneten Komplex, werden Caspasen
aktiviert, welche die Spaltung wichtiger Regulator- und Strukturproteine bewirkten, und
damit die für die Apoptose typische DNS-Fragmentation hervorrufen.
„Caspase“ ist der Name für die bis vor wenigen Jahren noch als „ICE (interleukin-1
converting enzyme) – artige Proteasen“ bezeichneten Enzyme. „C“ steht für
Cysteinproteinaseaktivität, „aspase“ für die Eigenschaft jeweils nach Asparaginsäure zu
schneiden. Inzwischen sind 14 Caspasen beschrieben, die entsprechend ihrer
funktionellen Rolle in der Apoptosekaskade, in drei Gruppen unterschieden werden
(Graham et al. 2001):
Tab. 3: Einteilung der Caspasen
Gruppe
Funktion
Caspasen
I
Zytokinprozessoren
Caspase 1, 4, 5, 11, 12, 13 und 14
II
Effektorcaspasen
Caspase 3, 6 und 7
III
Initiatorcaspasen
Caspase 2, 8, 9 und 10
Nichtrezeptormediierte Auslöser wie frei Radikale, bewirken die Freisetzung von
Cytochrom C aus den Mitochondrien, wodurch ebenfalls die Aktivierung der Caspasen
ausgelöst wird.
Des weiteren greifen verschiedene Proteine der bcl-2 Familie regulatorisch in die
Apoptosekaskade ein (Gold et al. 2001).
22
Apoptoserezeptoren wie
TNF-R1, Fas (CD95),
TRAIL-R1 und -R2
andere Apoptose-induktoren
wie Toxine, erhöhter Ca2+Einstrom und freie Radikale
DISC
Mitochondrium
Initiator - Caspasen
Cytochrom C
Aktivierung von
Effektorkaspasen
EffektorCaspasen
(-)
(+)
Spaltung von Enzymen,
Strukturproteinen,
Apoptoseinhibitoren
bcl-2, bcl-xL u.a.
bax, bad, bak u.a.
anti- und
proapoptotische
Regulatorproteine
DNS- Fragmentation
=> Zelltod
Abb. 2:
Rezeptormediierte und nichtrezeptormediierte Apoptosewege
(vereinfachte schematische Darstellung nach Gold et al. 2001)
Eine Rezeptoraktivierung (z.B. Fas und Fas-Ligand) bewirkt über Proteininteraktionen
die Aktivierung von Effektorcaspasen. Weitere Apoptoseauslöser (z.B. freie Radikale)
führen über eine Cytochrom C –Ausschüttung der Mitochondrien zur Aktivierung der
selben Effektorcaspasen. Verschiedene Proteine wie bcl-2 und bax greifen regulierend
in die Apoptosekaskade ein. Eine transkriptionelle Aufregulation dieser pro- und
antiapoptotischen Proteine bietet der Zelle einen weiteren Mechanismus in ihr
Suizidprogramm regulatorisch einzugreifen.
23
1.2.2
Zytokine
Zytokine sind von verschiedenen Zellen produzierte Proteine, die als Signalmoleküle
das Verhalten anderer Zellen beeinflussen (Janeway and Travers, 1995). Sie üben
regulatorische Funktionen im Rahmen der Hämatopoese, der Hämostase, der
Zelldifferenzierung, der Immunreaktion und Immunmodulation aus.
Die
überwiegend
parakrin
sezernierten
Polypeptide
binden
an
bestimmten
Rezeptorkomplexen, und lösen verschiedene Proteininteraktionen innerhalb der
Zielzelle aus. Dadurch können Zellaktivierung, Proliferation, Differenzierung,
Chemotaxis und Proteinsynthese induziert werden.
Ebenso können Zytokine die
Zielzelle zur Produktion von weiteren Zytokinen, Zytokinrezeptoren oder auch deren
Antagonisten stimulieren.
Die von Leukozyten produzierten Zytokine werden übergeordnet als Interleukine (IL)
bezeichnet. Weitere Gruppierungen stellen die Tumornekrosefaktoren (TNF), die
Interferrone (IF) und die Wachstumsfaktoren (GF) dar.
All diese Faktoren interagieren untereinander, so daß im Organismus ein komplexes
Zytokin-Netzwerk existiert, welches zur Koordination von Prozessen wie der
Immunreaktion beiträgt.
Die in dieser Studie gemessenen Zytokine sollen im folgenden etwas genauer
vorgestellt werden.
1.2.2.1 Interleukin-1β
IL-1
ist
zentraler
Mediator
infektiöser,
entzündlicher
und
immunologischer
Reaktionen. Es werden zwei verschiedene Polypeptid-Monomere (IL-1α und IL-1β)
unterschieden, die jedoch an die selben Oberflächenrezeptoren (CDw121a+b) binden,
und somit gleiche biologische Aktivität besitzen (Colotta et al. 1998). IL-1β stellt dabei
den weit überwiegenden Anteil des zirkulierenden Plasma-IL-1 dar.
Zellen der Monozyten-Makrophagen-Reihe (im ZNS die Mikrogliazellen) bilden die
Hauptproduzenten von IL-1β, jedoch sind eine Vielzahl weiterer Zellen, wie T- und BLymphozyten und Endothelzellen in der Lage dieses Zytokin zu exprimieren (Sairanen
1997).
24
Verschiedene Induktoren wie Lipopolysaccharide, Komplementfaktoren und Zytokine
(TNF, IFN-γ und auch IL-1β selbst) stimulieren die Produktion von IL-1β. Das
Aktionsspektrum von IL-1β erreicht eine Vielzahl von Zellen und Geweben (Colotta et
al. 1998, Dinarello et al. 1991 und 1994).
Über die Induktion von Wachstumsfaktoren hat IL-1β Einfluß auf die Differenzierung
und Proliferation hämatopoetischer Zellen wie T- und B-Lymphozyten (Oppenheim et
al. 1993). In Endothelzellen wird die Produktion von Chemokinen, vasodilatatorischen
Mediatoren (NO, PG) und die Expression von Adhäsionsmolekülen induziert
(Mantovani 1992). Außer diesem stark proinflammatorischen Einfluß ist auch ein
prothrombotischer Effekt von IL-1β auf Gefäßzellen beschrieben worden (Colotta et al.
1998).
IL-1β ist zentraler Mediator der Akute-Phase-Reaktion. Die Produktion von AkutePhase-Proteinen in der Leber, wird einerseits direkt durch IL-1β, zum anderen indirekt
über die Induktion von IL-6 stimuliert (s. Kapitel 1.2.2.2). Somit werden IL-1β und
IL-6 oft als „Hepatozyten-stimulierende Faktoren (HSF)“ zusammengefaßt.
Im zentralen Nervensystem (ZNS) bewirkt IL-1β über eine vermehrte Produktion von
Prostaglandinen (PGE2) im Hypothalamus eine Erhöhung der Körpertemperatur.
Aufgrund dieser Eigenschaft wird IL-1β ebenso wie IL-6 und TNF als endogenes
Pyrogen bezeichnet. Weitere Einflüsse von IL-1β auf das ZNS sind das Hervorrufen
von Schläfrigkeit und Anorexie, welche oft infektassoziiert auftreten (Krueger et al.
1994, Hellerstein et al. 1989).
Des weiteren stimuliert IL-1β die Freisetzung von Corticotropin-Realising Hormon
(CRH) und bewirkt damit eine Erhöhung des Cortisol-Spiegels i.S. (Basedovsky et al.
1986). Da Glucocorticoide eine antiinflammatorische und immunsuppressive Wirkung
haben, und da sie die Bildung von IL-1β direkt hemmen, wird dies als FeedbackMechanismus betrachtet, der den Körper vor einer möglichen IL-1β Intoxikation
bewahrt (Colotta et al. 1998).
25
1.2.2.2 Interleukin-6
Interleukin–6 ist ein Hauptmediator in der akuten Phase eines inflammatorischen
Prozesses. Erhöhte Werte von IL-6 können mehrere Stunden bis Tage vor Erhöhung
anderer Entzündungsparameter im Blut gemessen werden. Zu Beginn einer
entzündlichen Reaktion wird IL-6 von Zellen der Monozyten-Makrophagen-Reihe
sezerniert. Unter weiterem stimulatorischen Einfluss von IL-1 und TNF beginnen auch
Fibroblasten, Keratinozyten, Endothelzellen und Lymphozyten mit der Produktion von
IL-6 (Richards et al. 1998).
Außer
IL-1
und
TNF,
induzieren
verschiedene
Faktoren
wie
bakterielle
Lipopolysaccharide, Fibrinfragmente, Interferron-γ und weitere Zytokine die Bildung
von Interleukin-6.
Glucocorticoide und einige Zytokine (IL-4, IL-10) inhibieren
dagegen dessen Produktion (Janeway und Travers 1995).
IL-6 wirkt regulatorisch auf die Reifung und Differenzierung von B-Lymphozyten zu
Plamazellen und auf die Aktivierung von T-Helfer-Zellen, zytotoxischen TLymphozyten und natürlichen Killerzellen (Richard et al. 1998).
Wie erwähnt ist IL-6 zentraler Initiator der hepatischen Akute-Phase-Reaktion.
Es induziert in der Leber die Bildung positiver akute-Phase-Proteine wie CRP und
Fibrinogen, und reduziert die Produktion von Albumin und Transferrin (Tilg et al. 1997,
Castell et al. 1989).
Im Nervensystem wirkt IL-6 als endogenes Pyrogen und es erhöht die Synthese von
adrenocorticotropen Hormon (ACTH).
Viele dieser Funktionen von Interleukin-6 werden durch Interaktion mit IL-1
synergistisch ausgeübt. Für IL-6 ist gezeigt worden, daß es die Produktion von IL-1Rezeptorantagonisten induziert, und damit die Wirkung von IL-1 hemmt (Tilg et al.
1994, Schindler et al. 1990). Somit ist hier auf einen negativen Rückkoppelungsmechanismus innerhalb des Zytokin-Netzwerkes zu schliessen.
26
1.2.3
Interzelluläres Adhäsionsmolekül – 1 ( ICAM-1 )
Adhäsionsmoleküle sind Bindungsproteine die bei der Leukozytenwanderung, bei ihrer
Zielortbestimmung (homing) und bei Zell-Zell-Interaktionen beteiligt sind (Janeway
and Travers 1995). Die wichtigsten Klassen die bei der Leukozytenadhäsion eine Rolle
spielen sind die Selektine (z.B. L-Selektin), die Integrine ( z.B. LFA-1), Mitglieder der
Immunglobulinsuperfamilie (ICAM-1 bis -3 und VCAM-1), einige dem Mucin ähnliche
Adressine (GlyCAM-1) und das CD44-Rezeptormolekül.
Zu Beginn der Zelladhäsionskaskade nähern sich zirkulierende Leukozyten der
Gefäßwand und gehen mittels L-Selectinen eine lockere Bindung untereinander und mit
dem Gefäßendothel ein. Proadhäsive Zytokine wie IL-1, TNF-α, IL-8 und RANTES
induzieren die Expression von Integrinen wie LAF-1 auf Leukozyten (Frijns et al.
2002).
Diese Integrine interagieren nun mit Molekülen der Immunglobulin-Superfamilie auf
den Gefäßendothelien. Dadurch kommt es zu einer stabilen Zelladhäsion an der
Gefäßwand. Über Diapedese können nun die Leukozyten ihre Migration ins Gewebe
fortsetzen (Schürmann et al. 1997).
Das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) ist ein Membranprotein mit
Rezeptorfunktion aus der Immunglobulin-Superfamilie. Es wird sowohl auf
hämatopoetischen als auch auf nicht-hämatopoetischen Zellen, am stärksten jedoch auf
Gefäßendothelzellen exprimiert (Dustin et al. 1986).
Die Expression wird dabei durch Zytokine wie IL-1, TNF-α und IL-6 stimuliert
(Mickelson et al. 1995). Endotheliales ICAM-1 reguliert die Adhäsion von Leukozyten
an die Gefäßwand, und ermöglicht damit die Diapedese ins subepitheliale Gewebe. Des
weiteren ist es an der Adhäsion zwischen Zellen beteiligt, und somit für eine Reihe
weiterer Leukozytenfunktionen wie T- und B-Zellproliferation und T-Zell-vermittelte
Zytolyse von Bedeutung.
Aufgrund der Fähigkeit, zirkulierende Zellen in Entzündungsgewebe zu rekrutieren,
wird ICAM-1 als essentieller Regulator der lokalen immunoinflammatorischen
Aktivierung angesehen (Schürmann et al. 1997).
27
1.2.4
Akute-Phase-Proteine
Als Immunantwort der akuten Phase (acute phase response) bezeichnet man die
Veränderungen im Blut in der frühen Phase einer entzündlichen Reaktion.
Dazu gehört die Produktion von bestimmten Proteinen und zellulären Elementen
(Janeway und Travers 1995).
Wie erwähnt, stimuliert IL-6 die Hepatozyten zur Synthese von Akute-Phase-Proteinen
(APP). IL-1 gilt als indirektes Stimulans, da es Kupffer’sche-Zellen zur Produktion von
IL-6 anregt.
Zu den Proteinen der akuten Phase gehören das C-reaktive Protein (CRP), das
mannosebindende Protein (MBP), Fibrinogen und das Serumamyloidprotein (SAP).
Albumin und Transferrin gelten als typische negative Akute-Phase-Proteine, da ihre
Synthese bei einer entzündlichen Reaktion durch IL-1 und IL-6 herunterreguliert wird
(Richards et al. 1998).
1.2.4.1
C – Reaktive Protein (CRP)
Das C – Reaktive Protein (CRP) erhielt seinen Namen aufgrund des Bindungsvermögens am C-Polysaccharid der Zellwand von Streptococcus pneumoniae. In seiner
biochemischen Struktur bildet es ein Pentraxin, das die Eigenschaft besitzt an
Phosphorylcholin, einem Membranbestandteil vieler Mikroorganismen zu binden.
Dadurch wirkt es einerseits opsonierend, und andererseits kann es durch Aktivierung
der klassischen Komplementkaskade die direkte Lyse eines Erregers induzieren
(Janeway und Travers 1995).
Obwohl das CRP als klassischer Marker einer bakteriellen Infektion gilt, wird eine
Erhöhung des CRP auch in nicht-infektiösen immunologischen Erkrankungen wie
Kollagenosen und Vaskulitiden, und auch nach Traumata beobachtet (Kalabalikis et al.
1999). Bei inflammatorischen Ereignissen zeigt die CRP-Konzentration einen relativ
raschen und steilen Anstieg. Dabei können Werte um das 10- bis 1000- fache der Norm
ansteigen (Normwert: <8 mg/l). Die Reaktionszeit liegt zwischen 6 und 10 Stunden, so
daß das CRP als reaktionsschneller Marker einer zunehmenden oder abklingenden
Entzündungsreaktion gilt (Greiling und Gressner 1995, Schulz et al. 1990).
28
1.2.4.2 Fibrinogen
Fibrinogen ist zentraler Gerinnungsfaktor in der plasmatischen Blutgerinnungskaskade.
Sowohl endogene als auch exogene Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems
gehen in ihrer Endreaktion mit der Umwandlung von löslichem Fibrinogen in eine
unlösliche, polymere Faserform, dem Fibrin einher (Dörner 1992).
Fibrinogen ist ein großes Dimeres Molekül, das größtenteils in Hepatozyten gebildet
wird. Es gehört zu den typischen positiven Akute-Phase-Proteinen, dessen Synthese
ebenfalls durch IL-6 stimuliert wird (Richards et al. 1998).
Im Unterschied zu CRP, zeigt die Fibrinogen-Konzentration bei entzündlichen
Reaktionen einen langsameren und flacheren Anstieg. Die vergleichenden kinetischen
Parameter der in dieser Studie gemessenen akute-Phase-Proteine sind in folgender
Tabelle aufgelistet (nach Greiling und Gressner 1995):
Tab. 4: Akute-Phase-Proteine - Vergleich reaktionskinetischer Parameter
Normwert
Reaktionszeit
Anstieg
CRP
< 8 mg/l
6 – 10 h
10 – 1000 fach
Fibrinogen
200 - 400 mg/dl
24 – 48 h
2 – 3 fach
29
2.
Methodik
2.1
Übersicht zum experimentellen Vorgehen
In die Studie wurden Patienten mit akutem ischämischen Mediainfarkt aufgenommen.
Innerhalb von 24 Stunden nach Onset, als auch am 3., 5. und 10. postapoplektischen
klinische Untersuchung
Tag, wurden folgende klinische und experimentelle Untersuchungen durchgeführt:
Scoring
-
European Stroke Scale
-
Nachweis von Apoptose
-
Lymphozyten Gesamtpopulation
CD4+ - Lymphozyten
Granulozyten
Blutentnahme
Durchflußzytometrie
Messung von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen
-
Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)
Interleukin – 1ß
Interleukin – 6
Enzym-Immuno-Assay
Messung von akute Phase-Proteinen
-
C – Reaktives Protein
Fibrinogen
im Rahmen von klinisch-chemischen Routineuntersuchungen
Abb. 3:
Übersicht zum experimentellen Vorgehen
30
2.2
Auswahl der Patienten
In der Studie wurden Patienten rekrutiert, die innerhalb von 24 Stunden nach Auftreten
eines akut einsetzenden und persistierenden neurologischen Defizites, auf der StrokeUnit
der
neurologischen
Universitätsklinik
im
St.
Josef-Hospital
Bochum
(Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum) stationär aufgenommen wurden.
Folgende Ein- und Ausschlußkriterien mussten erfüllt werden:
2.2.1
Einschlußkriterien
Patienten wurden in die Studie eingeschlossen, wenn alle der folgenden Kriterien erfüllt
wurden:
Ö Der Zeitraum zwischen dem Einsetzen der neurologischen Symptomatik und der
stationärer Aufnahme, musste weniger als 24 Stunden betragen.
Ö Die Diagnose eines Insultes im Versorgungsgebiet der Arteria cerebri media
(ACM), wurde zunächst klinisch vom diensthabenden Neurologen in der
Notaufnahme, und vom Ärzteteam der Stroke-Unit gestellt.
Ö Die Bestätigung der Diagnose erfolgte durch die radiologische Darstellung eines
frischen ischämischen Infarktes im Versorgungsgebiet der A. cerebri media,
mittels kranieller Computertomographie (cCT) bei Aufnahme.
Ö Bei unauffälligem initialem cCT-Befund, musste sich die Diagnose durch
Demarkierung
eines
frischen
computertomographischen
ischämischen
Kontrolluntersuchung
Mediainfarktes
bestätigen.
in
der
Die
Kontrollunteruchung erfolgte um den fünften stationären Behandlungstag, und
wurde auch bei positivem Aufnahmebefund zur Verlaufskontrolle und zum
Ausschluß einer sekundären Einblutung durchgeführt.
Ö Der Patient musste sein Einverständnis an der Studie teilzunehmen mündlich
bekunden.
Ö Erlaubte der klinische Zustand des Patienten ihm nicht, sein Einverständnis oder
Widerspruch frei zu bekunden (z.B. bei global-aphasischer Symptomatik), war die
Zustimmung eines Angehörigen erforderlich.
Ö Das Alter des Patienten sollte zwischen 18 und 90 Jahren betragen.
31
2.2.2
Ausschlußkriterien
Patienten wurden aus der Studie ausgeschlossen, wenn mindestens eines der folgenden
Kriterien zutraf:
Ö Radiologischer Nachweis eines primär oder sekundär hämorrhagischen Insultes
Ö radiologischer Nachweis eines nicht dem Versorgungsgebiet der A. cerebri media
entsprechenden Infarktareals.
Ö Cerebrovaskuläres
Ereignis
in
der
Vorgeschichte
mit
persistierendem
neurologischem Defizit.
Ö Andere Erkrankungen, welche die Bewertung der neurologischen Untersuchung
verzerren könnten.
Ö Rückbildung der neurologischen Symptomatik innerhalb von 24 Stunden
(Transitorische Ischämische Attacke).
Ö Bekannte maligne Erkrankungen.
Ö Bekannte infektiöse Begleiterkrankungen (es erfolgten Röntgenaufnahmen des
Thorax zum Ausschluß pneumonischer Infiltrate, und Kontrollen des Urinstatus
zum Ausschluß von Harnwegsinfektionen).
Ö Bekannte rheumatologisch-immunonolgische Erkrankungen.
Ö Therapie mit Kortikosteroiden oder zytostatischen Medikamenten innerhalb der
letzten 30 Tage vor dem ischämischen Ereignis.
Ö Bestrahlung von lymphoidem Gewebe innerhalb der letzten 90 Tage vor dem
ischämischen Ereignis.
In die Studie wurden insgesamt 15 Patienten eingeschlossen.
Davon waren 5 männlichen und 10 weiblichen Geschlechts. Bei einem Alterspektrum
zwischen 54 und 87 Jahren, betrug das Durchschnittsalter 75 Jahre (Median).
Bezüglich der Infarktlokalisation überwogen 11 Patienten mit linkhemisphärischem,
gegenüber 4 Patienten mit rechtshemisphärischem Mediainfarkt.
32
2.3
Graduierung des klinischen Verlaufes
Zur standardisierten Beurteilung des klinischen Verlaufes wurde bei Aufnahme, am 3.,
5. und am 10. postapoplektischen Tag der neurologische Status eines jeden Patienten
einem Punktewert einer Schlaganfallskala zugeordnet. Als Vorlage dienten die
European Stroke Scale und die National Institute of Health Stroke Scale.
2.3.1 European Stroke Scale
Die European Stroke Scale (ESS) ist eine von Hanston et al. entwickelte
Schlaganfallskala, die insbesondere zur Erfassung des neurologischen Defizites in der
akuten und postakuten Phase eines Infarktes im Mediastromgebiet Anwendung findet
(Hantson et al. 1994). Der Bewußtseinsstatus, bestehende Blickfeldausfälle, das
Sprachverständnis, die Sprachproduktion, verschiedene Hirnnervenfunktionen, die
proximale und distale Kraftentwicklung in den Extremitäten und die Gehfähigkeit
werden mit Punkten bewertet (siehe Tabelle 5). Der zu vergebende Punktebereich liegt
zwischen 0 und 100 Punkten. Je schwerer das neurologische Defizit, desto niedriger ist
die erreichte Punktzahl.
2.3.2
Die National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) ist eine aus 15 Items bestehende
Schlaganfallskala, welche den Bewußtseinstatus, die Orientierung, bestehende
Blickfeldausfälle, das Sprachverständnis und die Sprachproduktion, verschiedene
Hirnnervenfunktionen,
die
grobe
Kraft
in
Armen
und
Beinen,
bestehende
Sensibilitätsausfälle, die Koordination und das Vorhadensein von Neglect und
pathologischen Reflexen, in ihre Bewertung einbezieht (Brott et al. 1989).
Der zu vergebende Punktebereich liegt zwischen 0 und 42 Punkten, wobei eine hohe
Punktzahl, ein größeres neurologisches Defizit widerspiegelt.
Es existieren mehrere leicht modifizierte Versionen dieser Schlaganfallskala (Kothari et
al. 1997, Lyden et al. 1999, Spilker et al. 2000), wobei in dieser Studie die von Brott et
al. publizierte Originalversion Anwendung fand (siehe Tab. 6).
Inzwischen sind für ESS und NIHSS standartisierte deutsche Versionen ausgearbeitet
worden (Berger et al. 1999).
33
2.4 Nachweis von Apoptose
Der durchflußzytometrische Nachweis von apoptotischen Zellen erfolgte selbständig im
neuroimmunologischen Labor des St. Josef-Hospitals Bochum.
Verwendung fand das Annexin V/Propidiumiodid-Assay, eine Methode, die auf die
Bindungsaffinität von Annexin V auf Phosphatidylserin beruht (Vermes et al. 1995).
Phosphatidylserin ist ein negativ geladenes Phospholipid, das normalerweise auf der
dem Zytosol zugewandten Seite der Zellmembran exprimiert wird. Beim apoptotischen
Zelluntergang
wird
diese
Phospholipidasymmetrie
aufgehoben,
so
daß
Phosphatidylserin auf die Zelloberfläche transloziert wird (Martin et al. 1995). Das auf
der Oberfläche exprimierte Phophatidylserin kann nun mit Annexin V, einem
kalziumabhängigen,
phospholipidbindenden
Protein
mit
hoher
Affinität
zu
Phosphatidylserin markiert werden.
Da die Aufhebung der Phospholipidasymmetrie auch beim nekrotischen Zelluntergang
beobachtet wird, ist es notwendig, zeitgleich mit der Annexin-Markierung die Integrität
der Zellmembran zu überprüfen. Dies geschieht mit der Markierung von DNA durch
Propidiumiodid. Somit sind Zellen als apoptotisch definiert, wenn sie ein positives
Signal für Annexin V und zugleich ein negatives Signal für Propidiumiodid aufweisen,
während nekrotische Zellen für beide Marker positiv sind (Van der Eijnde et al. 1997).
2.4.1
Prinzip der Durchflußzytometrie
Die Analyse einzelner Zellen wird in der Durchflußzytometrie über die simultane
Messung von Fluoreszenzintensität und Streulichtsignalen ermöglicht. Mittels mehrerer
unterschiedlicher
Fluoreszenzfarbstoffe
besteht
die
Möglichkeit,
verschiedene
Zellmerkmale gleichzeitig darzustellen.
Die zu untersuchende Zellsuspension wird in einer Kapillarküvette zu einem laminaren
Strom vereinzelt. Während die Zellen einen Laserstrahl passieren, erfolgt für jede
einzelne Zelle eine separate Analyse mehrerer physikalischer und chemischer Parameter
(Carter and Meyer 1994).
Das grundlegende Funktionsprinzip wird in Abbildung 4 erläutert.
34
numerische und
graphische Aufbereitung
Filter
PEDetektor
integrierte Software
halbdurchlässige
Spiegel
SSCDetektor
FSCDetektor
LASER
Meßkammer
Funktionsprinzip eines Durchflußzytometers
Abb. 4:
(vereinfachte Darstellung nach Carter und Mayer, 1994)
Die markierten Zellen werden nach dem Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung in
die Meßkammer aufgesaugt. Dort trifft ein Laserstrahl auf die einzelne Zelle und wird,
abhängig von den Eigenschaften dieser Zelle, gestreut. Durch optische Einrichtungen
und elektronische Detektoren wird das nach vorn (FSC = forward light scatter) und das
um 90º gestreute Licht (SSC = side light scatter) gemessen. Zwei weitere Detektoren
registrieren quantitativ die den Fluoreszenzfarbstoffen FITC (Fluoreszeinisothiozyanat)
und
PE
(Phykoerythin)
Wellenlänge.
entsprechenden
Emissionssignale
jeweils
definierter
35
In vorliegender Studie kam ein FACScan® (Fluorescence Activated Cell Sorter and
Analyzer) zur Verwendung (Becton Dickinson, Heidelberg).
Die Einstellung der Betriebsparameter, die Steuerung der Messungen sowie die
numerische und graphische Aufbereitung der vom Durchflußzytometer übertragenen
Daten erfolgte über das integrierte Softwarepaket CellQuest® auf dem angeschlossenen
Rechnersystem, einem Apple Macintosh Quadra 650 (Becton Dickinson, Heidelberg).
Die Streulichtsignale bilden die Grundlage zur Identifikation und Selektion der zu
untersuchenden Zellpopulationen. Das forward light scatter (FSC)-Signal ist von der
Querschnittsfläche abhängig und gibt somit Auskunft über die Zellgröße. Das side light
scatter (SSC)-Signal hängt von der Oberflächenbeschaffenheit und von intrazellulären
Einschlüssen ab und erlaubt somit Rückschlüsse auf die Granularität der Zellen (Jacobs
1996). Die graphische Darstellung der Steulichtsignale erfolgt in einem sogenannten
Zytogramm
oder
„dot-plot“-Graphen.
Es
handelt
sich
um
eine
korrelierte
Zweiparameterdarstellung, die auf der Abszisse die Größe (FSC) und auf der Ordinate
die Granularität (SSC) der Zellen darstellt.
Abb. 5:
Beispiel eines dot-plot Graphen.
Nach Größe (FSC) und Granularität (SSC) lassen sich die registrierten Zellen identifizieren und
können mit Hilfe von Gates selektiert werden.
Die Messung erfolgt oberhalb eines als „Threshold“ bezeichneten Schwellenwertes (Pfeil), um
Zelldetritus weitgehend auszuschliessen.
36
Jede Zelle wird als einzelner Punkt dargestellt, so daß sich abgrenzbare Punktwolken
ergeben, die jeweils distinkte Zellpopulationen repräsentieren. Hier zeigt sich die
Qualität der durchgeführten Leukozytenisolierung: die homogenen Lymphozyten- und
Granulozytenpopulationen lassen sich untereinander und von Erythrozyten und
Zelldetritus abgrenzen.
Aus dem dot-plot Graphen läßt sich im nächsten Schritt die zu untersuchende
Zellgruppe selektieren, indem bestimmte Punktwolken mit einem Fenster umrahmt
werden (Gating). Die Software betrachtet anschliessend die Zellen in diesem Gate als
Ausgangspopulation für weitere Analysen (entsprechend 100 %).
Weiterhin
lassen
sich
die
ausgewählten
Zellen
nach
den
ermittelten
Fluoreszenzintensitäten differenzieren. Bei der Fluoreszenz handelt es sich um eine
rasch abklingende Lichtemission von Molekülen nach Absorption energiereicher
Strahlung. Absorptions- und Emissionsspektrum eines jeden fluoreszierenden
Farbstoffes liegen dabei in einem charakteristischen, unterschiedlich breitem
Wellenlängenbereich mit definiertem Maximum.
Grundsätzlich verfügt jede Zelle über eine gewisse Autofluoreszenz. Sind jedoch
zusätzlich mit Fluorochromen gekoppelte Antikörper (z.B. Annexin V-FITC) zwecks
Apoptosenachweis auf der Zelle gebunden, wird die Fluoreszenzintensität erheblich
stärker: Der Fluoreszenzfarbstoff wird durch das monochromatische Licht (ArgonLaser, λ=488nm) angeregt, und emittiert Lichtsignale von bekannter Wellenlänge, die
mit geeigneten Photodetektoren erfaßt werden können (siehe Abb. 4).
Das in dieser Studie eingesetze Gerät verfügte über drei Photodetektoren, die jeweils
unterschiedliche Fluoreszenzen quantitativ nachweisen können: FL1- Detektor
(Spektralmeßbereich
λ=515-545
nm),
nimmt
Emissionen
des
Farbstoffes
Floureszeinthiozyanat (FITC) wahr, während Phycoerythrin (PE) von Detektor FL2
(Spektralmeßbereich λ=564-606 nm) und Phycoerythrin Zyanin-5 (PE-Cy5) von Kanal
FL3 (Spektralmeßbereich λ >650 nm) detektiert werden. Die ermittelten Daten werden
als Histogramm der Fluoreszenzintensität gegen die Zellzahl dargestellt.
Um diese spezifischen Meßsignale von der unspezifischen Autofluoreszenz einer Zelle
zu unterscheiden, müssen vorerst die Fluoreszenzkanäle durch eine Negativkontrolle
justiert werden (Isotyp-Kontrolle). Im einzelnen wird zunächst durch die Gabe eines
Isotypen-Antikörpers die höchste Kanalnummer bestimmt, in die die Fluoreszenz
(Autofluoreszenz und unspezifische Bindung) einer negativen Zelle noch fallen kann.
37
Die Software berücksichtigt diesen Kanalwert als Schwellenwert für die folgenden
Messungen, und die Ergebnisse werden als Prozentwerte positiver und negativer Zellen
ausgedrückt.
Weiterhin ist zu berücksichtigen, daß durch den Einsatz mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe
die Möglichkeit der Überlagerung der Fluoreszenzspektren gegeben ist. Durch
Kompensationseinstellungen wird der Fluoreszenzanteil, der durch die spektrale
Überlappung verursacht wird, von jedem Signalpuls subtrahiert (siehe Abb.6).
FL1
FL2
(515-545 nm)
500
(564 – 606nm)
550
600
Wellenlänge in nm
650
FITC
PE
Überlappung der Emissionsspektren
(Kompensation durch FL2 - % FL1)
Abb. 6:
Überlappung der Emissionsspektren von FITC und PE
(vereinfachte Darstellung nach Carter and Mayer, 1994)
Die Fluoreszenz-Kompensationselektronik subtrahiert den Anteil der FITC-Emission, der im
Bereich des Photodetektors FL2 erscheint.
2.4.2 Isolierung und Markierung von peripheren Leukozyten
Nach der an einer Cubitalvene vorgenommenen Blutentnahme (5ml EDTA–Vollblut je
Patient und Untersuchungstag), erfolgte umgehend die Isolierung und Markierung von
peripheren Leukozyten nach folgendem Präparationsschema:
38
a) Lysierung von im Vollblut enthaltenen Erythrozyten:
Dazu wurden jeweils 100 µl des EDTA-Vollblutes in vier FACS-Röhrchen pipettiert,
mit 1000 µl einer Lyse-Lösung (Immunotech, 1:25 in PBS verdünnt) versetzt und für 10
min inkubiert.
b) Abwaschen der lysierten Erythrozyten und der zugefügten Lyse-Lösung:
Nach Zugabe von 3ml HEPES-Lösung wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei 1200
U/min mit Bremse zentrifugiert (Heraeus Sepatech Minifuge RF). Nach der
Zentrifugation erfolgte die vorsichtige Dekantierung des flüssigen Überstandes, so daß
nur die mononukleären Zellen als Bodensatz erhalten blieben. Der Waschvorgang
wurde nochmals wiederholt, so daß am Ende dieses Präparationsschrittes vier FACSRöhrchen mit gereinigten Leukozyten zur weiteren Bearbeitung zur Verfügung standen.
c) Markierung der Leukozyten mit Fluorochrom gekoppelten Reagentien:
Für den durchflußzytometrischen Nachweis der Apoptose wurden die nun isolierten
Leukozyten in 200 µl HEPES-Lösung resuspendiert und mit entsprechenden Reagentien
versetzt: FACS-Röhrchen 1 wurde mit 10µl PE-Cy5-gekoppeltem Maus-IgG1 (CoulterImmunotech #1473, Marseille, France) versetzt und diente als Negativ- und
Isotypenkontrolle zum Abgleich der Autofluoreszenz und unspezifischen Bindung für
die folgenden Messungen.
FACS-Röhrchen 2 und 3 wurden mit 10 µl Fluoreszeinisothiozyanat (FITC)gekoppeltem Annexin V (Bender MedSystems #BMS306FI, Wien, Austria) bzw. 20 µl
eigenfluoreszierenden Propidiumiodid (Sigma-Aldrich #4170, Deisenhofen) versetzt,
und dienten als Kompensationsproben zur Korrektur von Überlagerungen in den
Emmissionsspektren.
FACS-Röhrchen 4 wurde mit 10µl Annexin V-FITC, 20µl Propidiumiodid und 10µl
PE-Cy5-gekoppelten CD4-Antikörpern (Coulter-Immunotech #1574, Marseille, France)
versetzt, und diente somit als die eigentliche Komplettprobe im Meßansatz.
Nach Hinzufügen der fluorochromgekoppelten Reagentien, wurden die Messansätze für
15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Es folge ein weiterer Waschvorgang mit HEPESLösung, um ungebundene Antikörper, Propidiumiodid und Annexin V aus den Proben
zu entfernen.
Vor den anschliessenden FACScan®-Messung wurde das Zellpellet mit den markierten
Zellen in 500µl HEPES-Lösung resuspendiert.
39
2.4.3
FACScan®-Auswertungsprozedur
Die standartisierte Auswertung der vom Durchflußzytometer übertragenen Daten
erfolgte nach folgender Prozedur :
a) Mit
Hilfe
der
Kompensationsproben
Negativkontrolle
erfolgte
die
(Isoptypen-Kontrolle)
Justierung
und
und
den
Kontrolle
der
Geräteeinstellungen.
b) In der anschliessenden Komplettprobenmessung, wurde die Lymphozyten- bzw.
Granulozytenpopulation im Dot-plot-Graphen lokalisiert und eingegrenzt.
c) Die Selektion der CD4+-Zellen erfolgte über die Identifizierung von CD4-PE-Cy5positiven Zellen in einem gesonderten Histogramm (siehe Abb. 7)
Abbildung 7: Histogramm zur Selektion von CD4+Lymphozyten
Der hier klar abgrenzbare, spezifische Fluoreszenz-Peak erlaubt die Auswahl der CD4+-Zellen
für weitergehende Analysen dieser Subpopulation
d) Für jede zu untersuchende Population (Gesamt-Lymphozyten, CD4+-Lymphozyten
und Granulozyten) erfolgte die Markierung des Anteils FL1-(Annexin V)-positiver
und FL2-(Propidiumiodid)-positiver Zellen in den jeweiligen Histogrammen
e)
Berechnung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen in der jeweiligen
Zellpopulation, und Übertragung der gewonennen Daten in die statistische
Datenverarbeitung. (siehe Abb. 8)
40
Abb. 8:
Histogramme zur Bestimmung des relativen Anteils apoptotischer Zellen
Die Häufigkeit Annexin V -, und Propidiumiodid - positiver Zellen wurde separat ermittelt.
Für abgebildetes Beispiel gilt: Von über 11.000 registrierten Zellen waren 2036 (17,08%) für
Annexin V, und nur 75 (0,63%) für Propidiumiodid positiv. Somit beträgt der Anteil
apoptotischer Zellen in dieser Granulozytenpopulation ( 17,08% - 0,63% ) = 16,45 %.
2.5 Bestimmung von Zytokin- und Adhäsionsmolekülkonzentrationen
Die Bestimmung der Serumkonzentrationen von Interleukin-1β (IL-1 β), Interleukin-6
(IL-6) und vom Interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) erfolgte selbständig im
neurochemischen Labor des St.Josef-Hospitals Bochum. Verwendung fanden nichtkompetitive, direkte Enzyme-Immuno-Assay (EIA)-Tests, deren Prinzip im folgenden
vorgestellt wird.
2.5.1
Prinzip eines nicht-kompetetiven, direkten Enzym-Immuno-Assay
Zur quantitativen Bestimmung von Antigenkonzentrationen ist der Enzyme-ImmunoAssay eine etablierte Methode (Varsanyi 1994). Die gebundenen Antigene werden mit
Hilfe eines gekoppelten Enzyms, das ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt
umwandelt, nachgewiesen. Die Extinktion dieses Farbkomplexes wird mit einem
Spektrophotometer
gemessen,
wobei
proportional der Antigenkonzentration ist.
die
ermittelte
Farbstoffintensität
direkt
41
E
Antigen
(IL-1ß, IL-6
bzw. ICAM-1)
Abb.9:
Enzymgekoppelter
Antikörper
E
E
Substrat
markierter
Antikörper
gebunden an
Antigen
farbloses
Substrat
farbiges
Produkt
Prinzip eines nicht-kompetetiven, direkten Enzym-Immuno-Assay
Bei den in dieser Studie verwendeten EIA-Kits sind die sogenannten „FängerAntikörper“ (AK-1) bereits an die feste Phase der mitgelieferten Mikrotiterplatten
gebunden. Nach Hinzufügen der antigenhaltigen Probe (Patientenserum) läßt sich das
gebundene Antigen durch einen zweiten, markierten Antikörper (AK-2) nach oben
beschriebenem Prinzip nachweisen. Der zweite Antikörper muß gegen ein anderes
Epitop gerichtet sein als der primäre Antikörper. Dieser auch als „Sandwich-EIA“
bezeichnete Test ist hochspezifisch, da Antigene, die mit einem Antikörper
kreuzreagieren, mit großer Wahrscheinlichkeit nicht auch noch an den zweiten binden.
1. Antikörper 1 (AK-1) ist bereits an die feste
Phase der Mikrotiterplatte gebunden.
AK-1
2. Antigenhaltige Probe (Patientenserum)
wird hinzugegeben.
3.
Der zweite, fluoreszenzgekoppelte Antikörper (AK-2)
wird hinzugefügt. Dieser Antikörper reagiert
AK-2
E
mit einem anderen Epitop am Antigen als der
erste Antikörper.
4.
Nach Substratzugabe wird die Extinktion
des entstandenen farbigen Produktes spektrophotometrisch bestimmt, die direkt proportional
der Antigenkonzentration in der Probe ist.
Abb. 10:
Prinzip des „Sandwich-EIA“
E
42
2.5.2
Probengewinnung und -bearbeitung
Zur Serumgewinnung wurden Röhrchen verwendet, die mehrere kaolinbeschichtete
Polystyrolkügelchen als Gerinnungsaktivatoren enthielten.
Pro Patient und Untersuchungstag wurden 20 ml Vollblut aus einer Cubitalvene in ein
solches Serum-Röhrchen entnommen.
Es erfolgte die 10 Minuten lange Zentrifugation bei 3000 U/min (Hereus Sepatech
Minifuge RF) mit anschliessender Aliquotierung der flüssigen Fraktion.
Bis zur Testdurchführung der Enzymimmunoassays, wurde das Serum bei -20º C
eingefroren.
2.5.3
Materialien und Testdurchführung
Folgende Enzyme-Amplified-Sensitivity-Immunoassays (EASIA)-Kits der Firma
BioSource Europe S.A., Nivelles / Belgium, wurden verwendet:
Medgenix IL-6 EASIA Kit (#40.126.00), Medgenix IL-1β EASIA Kit (#40.121.00)
und Medgenix sICAM-1 EASIA Kit (# 40.115.00)
1. Bestimmung der IL-6 Konzentration im Serum
Den Angaben des Herstellers entsprechend, wurden folgende Prozeduren befolgt:
a) Ansetzen der Proben: Von jeder Patientenprobe und von jeder der mitgelieferten
Standard- und Kontrollproben, wurden jeweils 100µl auf die mit „FängerAntikörpern“ beschichtete Mikrotiterplatte pipettiert. Die Standardproben dienten
der Erstellung einer Eichkurve für die Spektrophotometrie, die Kontrollproben
dienten der abschliessenden Qualitätskontrolle. Jeder Probenansatz wurde doppelt
gestellt, so daß sich folgendes exemplarisches Schema auf der Mikrotiterplatte (96
wells) widerspiegelte (Abbildung 11):
43
Standard Standard Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 Patient 9 Patient 10
1
5
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
1
5
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
2
6
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
2
6
Standard Kontroll
3
e1
Standard Kontroll
3
e1
Standard Kontroll
4
e1
Standard Kontroll
4
e1
Abb. 11:
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 Patient 9 Patient 10
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
Exemplarisches Schema der angesetzten Proben auf der Mikrotiterplatte
A= Probe vom Tag des Schlaganfalls, B= Probe vom 3. postapoplektischen Tag,
C= Probe vom 5. postapoplektischen Tag, D= Probe vom 10. postapoplektischen Tag
b) Nach Zugabe von 50 µl einer mitgelieferten Pufferlösung wurden die Ansätze 60
Minuten lang, auf einem horizontalen „Shaker“ bei 700 rpm inkubiert.
c) Um die nicht gebundenen, irrelevanten Serumbestandteile zu entfernen, erfolgte die
dreimalige Aspiration und Waschung mit der mitgelieferten und nach Angaben des
Herstellers verdünnten Medgenix-Waschlösung.
d) 100 µl eines Peroxidase (HRP)-gekoppelten Antikörpers wurden hinzugefügt, der an
ein zweites Epitop von IL-6 bindet, und somit das „EIA-Sandwich“ komplettiert.
e) Die Ansätze wurden erneut für 60 Minuten auf dem Shaker bei 700rpm inkubiert.
f) Um die ungebundenen enzymgekoppelten Antikörper aus der Probe zu entfernen,
erfolgten wiederum drei Waschvorgänge wie oben beschrieben.
g) Nach Zugabe von jeweils 200µl des chromogenen Substrates (TetrametylbenzidineH2O2), erfolgte eine 30 Minuten lange Inkubation im Dunkeln und unter
kontinuierlichem Schütteln bei 700 rpm.
h) Die
chromogene
Reaktion
wurde
durch
Zugabe
von
50
µl
einer
schwefelsäurehaltigen Lösung gestoppt, so daß die Proben nun meßbereit für die
Spektrophotometrie zur Verfügung standen.
44
i) Die Extinktionswerte des in jedem Well der Mikrotiterplatte entstandenen
Farbproduktes wurden nun bei 450 nm spektrophotometrisch ermittelt.
j) Da jeder Probenansatz doppelt gestellt wurde, wurde der Mittelwert der beiden
Extiktionswerte für jede Probe berechnet. Dies war zugleich die erste interne
Qualitätskontrolle für den durchgeführten Test, da sich die ermittelten
Extinktionswerte beider Ansätze nur unwesentlich unterscheiden durften.
k) Anhand der angegebenen Konzentrationen in den Standardproben, wurde nun eine
Eichkurve erstellt. Die angegebene Konzentration wurde gegen die ermittelte
Extinktion aufgetragen (Abbildung 12):
Abb. 12:
Beispiel einer Eichkurve
Die angegebene Konzentration der Standardproben wird gegen die ermittelte Extinktion
aufgetragen.
l) Anhand dieser Eichkurve berechnete die Software die jeweilige Konzentration in
jedem Probenansatz.
m) Als zweite interne Qualitätskontrolle dienten die angegebenen Konzentrationen der
mitgelieferten Kontrollproben. Sie wurden mit den ermittelten Konzentrationen
verglichen, und durften nicht außerhalb des angegebenen Bereichs liegen.
n) Die gewonnenen Daten konnten nun in die statistische Datenverarbeitung
übertragen werden.
45
Entsprechend wurde bei der Bestimmung der Konzentrationen von IL-1β und ICAM-1
verfahren. Die jeweiligen Präparationsschritte sollen hier nur tabellarisch aufgezeigt
werden:
Tab. 5:
Bestimmung der IL-1β -Konzentration im Serum:
Standart-, Kontroll- und Patientenproben
200µl
HRP-gekoppeltes Anti-IL-1β
50 µl
120 min Inkubation auf horizontal continuous shaker bei 700 rpm
Dreimaliger Waschvorgang mit 0,4 ml verdünnter Medgenix-Waschlösung
Chromogenes Substrat (TMB+H2O2)
200µl
15 min Inkubation im Dunkeln auf horizontal continuous shaker bei 700 rpm
Stop-Lösung (H2SO4)
50 µl
Spektrophotometrische Extinktionmessung bei 450 nm
Berechnung der jeweiligen Konzentrationen
Tab. 6:
Bestimmung der ICAM-1-Konzentration im Serum:
Verdünnung der Proben in Medgenix-Lösung
1:100
Standart-, Kontroll- und Patientenproben
25µl
HRP-gekoppeltes Anti-ICAM-1
75 µl
120 min Inkubation auf horizontal continuous shaker bei 700 rpm
Dreimaliger Waschvorgang mit 0,4 ml verdünnter Medgenix-Waschlösung
Chromogenes Substrat (TMB+H2O2)
200µl
30 min Inkubation im Dunkeln auf horizontal continuous shaker bei 700 rpm
Stop-Lösung (H2SO4)
Spektrophotometrische Extinktionmessung bei 450 nm
Berechnung der jeweiligen Konzentrationen
50 µl
46
2.6 Messung der CRP- und Fibrinogenkonzentration
Die Messung der CRP- und Fibrinogenkonzentrationen i.S. erfolgte im Rahmen von
klinisch-chemischen Laboruntersuchungen durch die Mitarbeiter im Zentrallabor des
St.-Josef Hospitals Bochum, so daß hier auf eine ausführliche Darstellung der
Bestimmungsmethoden
verzichtet
wird.
Anwendung
fanden
die
funktionelle
Bestimmung der Fibrinogenkonzentration nach Clauss und nephelometrische Verfahren
für die Bestimmung der CRP-Konzentration.
Als
Referenzbereiche
gelten
nach
den
regelmäßig
durchgeführten
Ringversuchszertifikaten für CRP eine Konzetration von < 8,0 mg/l und für Fibrinogen
eine Konzentration von 200-400 mg/dl.
2.7
Statistische Datenanalyse
Die statistische Datenanalyse erfolgte mit dem Softwarepaket SPSS Version 10.1., die
graphische Darstellung mit dem Softwareprogramm Microsoft Excel 97. Aufgrund der
relativ kleinen Stichproben fanden nichtparametrische Verfahren Verwendung.
Im Rahmen der deskriptiven Statistik wurde als Lagemaß der Median und als
entsprechendes Streuungsmaß der mittlere empirische Quartilsabstand verwendet:
mittlere empirische Quartilsabstand = ½ * [(Median -1.Quartile)+(3. Quartile-Median)]
Wo es sinnvoll erschien, wurden zusätzlich Streubereich, 1. und 3. Quartile angegeben.
Neben der deskriptiven Darstellung mit absoluten Werten, erfolgte zur Analyse von
dynamischen Verläufen die zusätzliche Darstellung der Relativ- oder Differenzwerte in
Bezug zum Ausgangswert.
Die graphische Darstellung erfolgt in Form von Kurvendiagrammen. Wo es sinnvoll
erschien, wurden den Kurven Whiskers hinzugeführt (beispielhaft erläutert in Abb. 14)
um Streuungsmaße in die Graphik mit einzubeziehen.
Um Unterschiede zwischen den beiden Gruppen auf statistische Signifikanz zu prüfen,
wurde der nichtparametrische Mann-Whitney U-Test für zwei unabhängige Stichproben
durchgeführt (Kolles 1989). Um Unterschiede, die sich während des zehntägigen
Beobachtungszeitraums innerhalb der gleichen Gruppe einstellten, auf statistische
Signifikanz zu prüfen, wurde der nichtparametrische Wilcoxon-Test für zwei
verbundene Stichproben angewendet (Kolles 1989).
47
3. Ergebnisse
Inhalt vorliegender Studie war, den dynamischen Verlauf mehrerer immunologischer
Parameter in der postakuten Phase eines ischämischen Hirninfarktes zu dokumentieren,
und einen möglichen Zusammenhang zwischen dieser Dynamik und dem klinischen
Verlauf, zu prüfen. Dazu wurden die Patienten, ihrem klinischen Verlauf entsprechend,
in zwei Gruppen aufgeteilt. Für jede Gruppe erfolgte zunächst eine deskriptivstatistische Auswertung der erhobenen Daten, um anschliessend den dynamischen
Verlauf in beiden Gruppen miteinander zu vergleichen. Unterschiedliche Verläufe
wurden auf ihre statistische Signifikanz hin geprüft.
3.1 Aufteilung der Patienten nach klinischem Verlauf
Anhand des klinischen Verlaufes wurden die Patienten in zwei Untersuchungsgruppen
aufgeteilt:
Ö Gruppe A:
Patientenkollekiv mit deutlich rückläufigen neurologischen
Ausfallerscheinungen („positiver Verlauf“)
Ö Gruppe B:
Patientenkollekiv mit nur geringer Rückbildung oder auch
Progredienz der Symptomatik („negativer Verlauf“)
Als
Trennlinie
zwischen
positivem
und
negativem
Verlauf
wurde
ein
Anstieg im ESS-Score von über 15 Punkten während des Untersuchungszeitraums
definiert. Es ergab sich folgende Aufteilung der 15 Patienten:
Tab. 7:
Deskriptive Merkmale der beiden Vergleichsgruppen
Gruppe A
Gruppe B
Anzahl der Patienten:
7
8
Altersverteilung (in Jahren):
54-86 (Median = 70)
57-87 (Median=76)
Geschlechtsverteilung:
weibl.= 5, männl. = 2
weibl.= 6, männl.= 2
Anstieg im ESS-Score:
16 bis 36 (Median=25)
-7 bis11 (Median=10,5)
Abfall im NIHSS-Score:
5 bis 9 (Median=7)
-3 bis 8 (Median 3)
Gruppe A: Patienten mit Anstieg im ESS-Score von über 15 Punkten = „positiver Verlauf“
Gruppe B: Patienten mit geringerem Anstieg oder Abfall im ESS-Score = „negativer Verlauf“
48
Der unterschiedliche klinische Verlauf beider Gruppen ist in den folgenden
Diagrammen dargestellt. Es sei nochmals erwähnt, daß eine Rückbildung des
neurologischen Defizits in der ESS mit einem Anstieg, in der NIHSS jedoch mit einem
Abfall des Scores einhergeht.
Schlaganfallskalen - Gruppe A
100
36
30
80
60
24
18
42
40
NIHSS - Score
ESS - score
65
61
59
ESS
NIHSS
12
16
20
13
0
0
0
1. Tag
10,5
10
0
3. Tag
0
5. Tag
6
0
10. Tag
S c h la g a n fa lls k a le n - G ru p p e B
100
36
30
80
24
ESS - score
2 0 ,5
60
2 0 ,5
17
18
40
32
30
2 7 ,5
ESS
N IH S S
12
28
20
0
NIHSS - Score
22
6
0
1. Tag
0
3. Tag
0
5. Tag
0
0
10. Tag
Abb. 13: Klinischer Verlauf beider Gruppen anhand der Schlaganfallskalen
Die erreichten Punktwerte (Median) in den jeweiligen Schlaganfallskalen zeigen die deutlich
schwächere Erholungstendenz der Gruppe B gegenüber der Gruppe A auf.
Die während dieser Zeit gemessenen immunologischen Parameter werden im folgenden
zwischen beiden Gruppen verglichen.
49
3.1
Apoptose peripherer Lymphozyten im Vergleich
In einer Vorauswertung werden die erhobenen absoluten Apoptoseraten jeder
untersuchten Leukozytenpopulation für jeden Untersuchungstag deskriptiv dargestellt.
Um den dynamischen Verlauf zu prüfen, werden die postapoplektischen Apoptoseraten
in Relation zu den am Tag des Ereignisses ermittelten Ausgangswert gesetzt.
Wie
aus
folgenden
Diagrammen
hervorgeht,
lässt
der
Vergleich
beider
Untersuchungsgruppen unterschiedliche Tendenzen im dynamischen Verlauf erhobener
Apoptoseraten vermuten:
Einige der Patienten mit ungünstigerem klinischen Verlauf (Gruppe B) verzeichneten in
den
ersten
beiden
Tagen
eine
leichtgradig
ansteigende
Rate
apoptotischer
Lymphozyten, während Patienten mit rückläufiger Stroke-Symptomatik (Gruppe A)
eine stabile bzw. leicht abnehmende Apoptoserate aufwiesen.
Diese Beobachtung erreicht jedoch im angewandten Mann-Whitney U-Test keine
statistische Signifikanz.
Bei der Analyse der CD4+-Lymphozyten-Subpopulation ist diese Beobachtung nur sehr
schwach ausgeprägt, wobei die Analyse der Granulozyten-Population keinen
erkennbaren Unterschied zwischen beiden Gruppen erbrachte.
Der Vergleich der Apoptoseraten peripherer Granulozyten lässt keinen Unterschied
zwischen den beiden Gruppen erkennen.
50
3.2.1
Lymphozyten-Gesamtpopulation
Tab. 8:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer Lymphozyten
Median der Apoptoserate (mittlerer Quartilsabstand) in %
Gruppe A
15,04 (0,54)
14,97 (0,60)
15,16 (1,70)
13,57 (1,58)
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
14,07 (1,80)
15,56 (1,16)
15,12 (2,86)
16,75 (2,31)
pb
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
pª
n.s.
n.s.
n.s.
pª= Signifikanzniveau (Wilcoxon) für Vergleich zwischen Verlaufs- und Ausgangswerte (bei p<0,05).
pb= Signifikanzniveau (Mann-Withney U) für Vergleich zwischen Gruppe A und B (bei p<0,05).
Gruppe A
Gruppe B
25
25
20
15,04
15
14,97
15,16
13,57
10
5
0
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Apoptoserate in %
Apoptoserate in %
20
15
14,07
15,56
16,75
15,12
10
5
0
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Abb. 14: Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer Lymphozyten
Auf diesen Graphiken ist der Verlauf der absoluten Apoptoseraten (Mediane) dargestellt.
Die sich vertikal aus jedem Wert nach oben und unten erstreckenden Ausläufer (whiskers)
repräsentieren den Bereich zwischen 1. und 3. Quartile.
Tab. 9: Verlauf der Apoptoserate peripherer Lymphozyten in Relation zum Ausgangswert
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
1 (0)
1,00 (0,06)
1,00 (0,12)
0,91 (0,10)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
1 (0)
1,08 (0,06)
1,04 (0,07)
1,14 (0,17)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
pb
n.s.
n.s.
n.s.
51
3.2.2
CD4+ - Lymphozyten - Subpopulation
Anmerkung: Da der zur Markierung von CD4+-Leukozyten benötigte PE-Cy5–CD4-Antikörper
zum Untersuchungszeitpunkt eines Patienten nicht vorrätig war, werden hier die 7 Patienten
der Gruppe A nur mit 7 (anstatt 8) Patienten aus der Gruppe B verglichen.
Tab. 10:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer CD4+-Lymphozyten
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
13,46 (0,68)
13,23 (0,84)
12,87 (1,05)
11,95 (0,55)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
13,36 (1,51)
13,68 (0,94)
14,70 (2,43)
12,69 (1,51)
pb
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe A
Gruppe B
25
25
20
20
Apoptoserate in %
15
13,36
13,23
11,95
12,87
10
5
Apoptoserate in %
13,46
13,68
14,70
15
12,69
10
5
0
0
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Abb. 15: Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer CD4-Lymphozyten
Tab. 11:
Verlauf der Apoptoserate peripherer CD4-Lymphozyten in Relation zum Ausgangswert
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
1 (0)
0,99 (0,08)
0,96 (0,02)
0,89 (0,07)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
1 (0)
1,03 (0,05)
1,06 (0,10)
1,02 (0,09)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
pb
n.s.
n.s.
n.s.
52
3.2.3
Granulozyten
Tab. 12:
Verlauf der absoluten Apoptoserate peripherer Granulozyten
Gruppe A
11,27 (2,36)
12,87 (4,42)
13,63 (3,64)
13,56 (3,25)
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
10,05 (4,05)
9,56 (2,30)
8,48 (5,10)
10,54 (4,22)
pb
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe A
25
20
20
13,63
13,56
15
Apoptoserate in %
12,87
15
Apoptoserate in %
Gruppe B
25
11,27
10
5
10
10,05
9,56
10,54
8,48
5
0
0
1. Tag
1. Tag
3, Tag
5.Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
10. Tag
Abb. 16: Verlauf der absoluten Apoptoseraten peripherer Granulozyten
Tab. 13: Verlauf der Apoptoserate peripherer Granulozyten in Relation zum Ausgangswert
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
1 (0)
1,05 (0,40)
1,17 (0,27)
1,20 (0,10)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
1 (0)
1,25 (0,44)
1,46 (0,47)
0,87 (0,33)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
pb
n.s.
n.s.
n.s.
Der Vergleich der Apoptoseraten peripherer Granulozyten lässt keinen Unterschied zwischen
den beiden Gruppen erkennen. Auffällig ist die große Streubreite der ermittelten Werte.
53
3.3 Zytokine und Adhäsionsmolekule
3.3.1
Interleukin-1β
Bei der Bestimmung der Interleukin-1β-Konzentration i.S. der ersten 9 Patienten lagen
die ermittelten Werte durchgehend im nicht messbaren Bereich bzw. konstant unter 1
pg/ml, und zeigten somit keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen.
Dies entspricht den von Tarkowski und Mitarbeitern veröffentlichten Ergebnissen, so
daß von weiteren Untersuchungsgängen aus Kostengründen abgesehen wurde
(Tarkowski et al. 1995).
Auf eine tabellarische oder graphische Darstellung der ermittelten Konzentrationen wird
aus Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet. Die Interpretation dieses Ergebnisses wird
in der Diskussion erörtert.
Dem analytischen Vorgehen bei der Darstellung der unterschiedlichen Apoptoseraten
entsprechend, werden auch in diesem Abschnitt die ermittelten Konzentrationen
zunächst tabellarisch in Absolutwerten und in Relation zum Ausgangswert aufgeführt.
Dabei ist zu erkennen, daß Patienten mit einem ungünstigeren klinischen Verlauf
(Gruppe B) höhere Konzentrationen mehrere Entzündungsparameter aufweisen, als die
Patienten mit rückläufiger Stroke-Symptomatik (Gruppe A). Diese Unterschiedlichkeit
erreicht bei einigen Messparametern statistische Signifikanz (s.u.).
Um Fehlinterpretationen zu vermeiden galt bei der Prüfung des dynamischen Verlaufs
der CRP-Konzentrationen nicht die Relation, sondern die Differenz zur Ausgangswert
als Vergleichparameter.
(Bsp.: ein Anstieg von 1 auf 3 mg/l bedeutet eine Erhöhung um 200%, gilt jedoch nicht
als pathologisch. Hingegen bedeutet ein Anstieg von 25 auf 35 mg/l lediglich eine
Erhöhung um 40%, weist jedoch auf eine vorliegende Entzündungsreaktion hin.
Der Vergleich der Differenzen (in diesem Beispiel 2 und 10 mg/l) erlaubt eine der
klinisch-chemischen Bedeutung des Parameters angepasste Interpretation.)
54
3.3.2
Interleukin-6
Tab. 14:
Verlauf der absoluten Konzentration von Interleukin-6 i.S.
Median der Konzentrationen (mittlerer Quartilsabstand) in pg/ml
Gruppe A
23,29 (7,92)
16,96 (7,70)
15,71 (22,58)
14,89 (8,08)
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
32,65 (18,31)
32,91 (11,31)
44,49 (16,16)
38,36 (19,64)
pb
n.s.
0,040
n.s.
n.s.
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
80
60
60
44,49
32,91
40
23,29
16,96
15,71
20
14,89
0
1. Tag
Abb. 17:
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Konzentration in pg/ml
Konzentration in pg/ml
Gruppe A
80
40
38,36
32,65
20
0
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Verlauf der absoluten IL-6 - Konzentration in den Vergleichsgruppen
Tab. 15: Verlauf der Konzentrationen von IL-6 i.S. in Relation zum Ausgangswert
Median der Apoptoserate (mittlerer Quartilsabstand) in pg/ml
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
1 (0)
0,87 (0,12)
0,77 (5,32)
1,28 (1,12)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
1 (0)
0,67 (0,84)
1,28 (0,85)
0,65 (0,30)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
pb
n.s.
n.s.
n.s.
55
3.3.3
Interzelluläres Adhäsionsmolekül – 1 (ICAM-1)
Tab. 16:
Verlauf der absoluten Konzentration von ICAM-1 i.S.
Median der Konzentrationen (mittlerer Quartilsabstand) in ng/ml
Gruppe A
293,3 (254,9)
562,6 (289,8)
524,8 (201,3)
617,7 (282,6)
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
479,82 (400,29)
477,41 (295,36)
376,86 (226,29)
373,53 (276,69)
pb
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe A
Gruppe B
1000
1000
750
524,8
562,6
617,7
500
293,3
250
0
1. Tag
Abb. 18:
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Konzentration in ng/ml
Konzentration in ng/ml
750
477,4
500
376,9
479,8
373,5
250
0
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Verlauf der absoluten ICAM-1 - Konzentration in den Vergleichsgruppen
Tab. 17: Verlauf der Konzentrationen von ICAM-1 i.S. in Relation zum Ausgangswert
Median der Apoptoserate (mittlerer Quartilsabstand) in ng/ml
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
1 (0)
1,33 (0,25)
0,98 (0,30)
1,05 (0,32)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
1 (0)
1,00 (0,08)
1,16 (0,20)
1,07 (0,13)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
pb
n.s.
n.s.
n.s.
56
3.4
Akute-Phase Proteine
3.4.1 C-Reaktives Protein
Tab. 18:
Verlauf der absoluten Konzentration von CRP i.S.
Median der Konzentrationen (mittlerer Quartilsabstand) in mg/l
Gruppe A
7,9 (11,9)
5,1 (9,3)
4,5 (5,9)
4,0 (5,5)
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
16,7 (5,4)
29,8 (12,9)
34,8 (16,4)
18,8 (11,8)
pb
n.s.
n.s.
0,029
n.s.
pª
0,050
0,036
n.s.
Gruppe B
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
7,9
10
5,1
4,5
4
0
1. Tag
Abb. 19:
Tab. 19:
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Konzentration in mg/l
Konzentration in mg/l
Gruppe A
70
34,8
29,8
20
18,8
16,7
10
0
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Verlauf der absoluten CRP-Konzentration in beiden Vergleichsgruppen
Verlauf der Konzentrationen von CRP i.S. in Differenz zum Ausgangswert
Median der Apoptoserate (mittlerer Quartilsabstand) in mg/l
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
0 (0)
-2,70 (1,92)
-3,40 (6,38)
-1,20 (9,18)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
0 (0)
17,05 (15,70)
18,30 (12,83)
8,10 (9,30)
pª
0,050
0,036
n.s.
pb
0,021
0,040
n.s.
57
3.4.2
Fibrinogen
Tab. 20:
Verlauf der absoluten Konzentration von Fibrinogen i.S.
Median der Konzentrationen (mittlerer Quartilsabstand) in mg/dl
Gruppe A
381 (36)
396 (75)
420 (72)
443 (49)
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
381 (73)
456 (59)
534 (86)
496 (58)
pb
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
pª
0,050
0,017
n.s.
Gruppe B
600
500
500
420
396
381
443
400
300
200
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
534
456
496
Konzentration in mg/dl
Konzentration in mg/dl
Gruppe A
600
400
381
300
200
1. Tag
3, Tag
5.Tag
10. Tag
Abb. 20:
Verlauf der absoluten Fibrinogenkonzentration in den Vergleichsgruppen
Tab. 21:
Verlauf der Konzentrationen von Fibrinogen i.S. in Relation zum Ausgangswert
Median der Apoptoserate (mittlerer Quartilsabstand) in mg/dl
1. Tag
3. Tag
5. Tag
10. Tag
Gruppe A
1 (0)
1,17 (0,10)
1,09 (0,09)
1,12 (0,09)
pª
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe B
1 (0)
1,15 (0,09)
1,32 (0,10)
1,33 (0,35)
pª
0,035
0,017
n.s.
pb
n.s.
n.s.
n.s.
58
Tab. 22:
Synopsis der Ergebnisse
Vergleich von Apoptoseraten:
Patienten mit einem ungüstigeren klinischen Verlauf (Gruppe B) zeigten eine leicht
aufsteigende Tendenz in der Apoptoserate von Lymphozyten, während Patienten mit
günstigerem klinischen Verlauf (Gruppe A) eine stabile bzw. leicht abnehmende
Apoptoserate aufwiesen. Diese Beobachtung erreichte jedoch keine statistische
Signifikanz.
Lymphozyten:
Ein tendentiell unterschiedlicher Verlauf zwischen beiden Gruppen
erreichte keine statistische Signifikanz.
CD4+-Lyphozyten:
Die unterschiedliche Tendenz war nur noch schwach ausgeprägt.
Granulozyten:
Es war kein unterschiedlicher Verlauf zwischen beiden Gruppen zu
erkennen.
Vergleich von immunologisch-inflammatorischen Parametern:
Patienten mit einem ungünstigeren klinischen Verlauf (Gruppe B) zeigten eine deutlich
stärkere postischämische Entzündungsreaktion als Patienten mit einem günstigeren
klinischen Verlauf (Gruppe A). Einige Parameter erreichten statistische Signifikanz.
Interleukin-1β:
Die ermittelten Serumwerte von IL-1β lagen in beiden Gruppen
durchgehend unter 1 pg/ml bzw. im nicht detektierbaren Bereich.
Interleukin-6:
Patienten der Gruppe B zeigten am 3. Tag einen statistisch signifikant
erhöhten Wert gegenüber der Gruppe A.
ICAM-1:
Es war kein unterschiedlicher Verlauf zwischen beiden Gruppen zu
erkennen.
C-reaktives Protein:
Patienten der Gruppe B zeigten am 3. und am 5. postapoplektischen
Tag einen statistisch signifikanten Anstieg der CRP-Werte im
Vergleich zum Ausgangs-wert. Auch im Vergleich zur Gruppe A
waren die Werte signifikant erhöht.
Fibrinogen:
Patienten der Gruppe B zeigten am 3. und am 5. postapoplektischen
Tag einen statistisch signifikanten Anstieg der Fibrinogenwerte im
Vergleich zum Ausgangswert. Auch im Vergleich zur Gruppe A waren
tendentiell deutlich erhöhte Fibrinogenwerte gemessen worden, dieser
Unterschied erreichte jedoch keine statistische Signifikanz.
59
4.
Diskussion
4.1
Apoptose nach cerebraler Ischämie
Bis
vor
wenigen
postapoplektischen
Jahren
neuronalen
war
das
pathophysiologische
Zellunterganges
auf
einen
Verständnis
des
ischämiebedingten
nekrotischen Zelltod limitiert.
Vorliegende Untersuchung beschäftigte sich u.a. mit der Frage, inwieweit der klinische
Verlauf von Patienten mit akutem ischämischen Mediainfarkt, von dem Ausmaß der
Apoptose beeinflußt wird. Obwohl nur sehr vereinzelte Daten über einen apoptotischen
Zelltod nach cerebraler Ischämie beim Menschen vorliegen, belegen tierexperimentell
gewonnene Erkenntnisse, daß eine nicht unerhebliche Anzahl von Neuronen und
Gliazellen einen induzierten apoptotischen Zelltod sterben (Zhu et al. 2004, Moskowitz
et al. 2003, Graham et al. 2001).
Die vorliegenden Ergebnisse erbrachten keinen signifikanten Zusammenhang zwischen
der Apoptoserate peripherer Lymphozyten bzw. Granulozyten und dem klinischen
Verlauf. Bei der Interpretation ist jedoch zu berücksichtigen, daß die hier aufgestellte
Hypothese zwei hypothetische Ansätze beinhaltet.
Erstens stellte sich die Frage ob eine Hirnischämie eine relevante Apoptose neuronaler
Zellen induziert, und zweitens ob diese indirekt über die Apoptose peripherer
Lymphozyten bzw. Granulozyten messbar ist.
Die in den letzten Jahren publizierten Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen erbrachten
Evidenz für ersteren Ansatz in der aufgestellten Hypothese. So konnten Li und
Mitarbeiter in einem Ischämiemodell an Ratten bereits 1995 den elektronenmikroskopischen Nachweis apoptotischer Zellcharakteristika erbringen (Li et al. 1995).
Dabei war die typische DNA-Fragmentation in einer schmalen Zone um den
Infarktkern, die der ischämischen Penumbra entspricht, lokalisiert. Wie in Abschnitt
1.1.4 beschrieben, findet in dieser Randzone eine Restperfusion statt, die den
Strukturmetabolismus in den Zellen aufrecht erhält. Offensichtlich ermöglicht gerade
dieser Grundmetabolismus den Zellen, das ATP-abhängige Apoptoseprogramm
auszuführen. Weitere Arbeitsgruppen kommen in ähnlich angelegten Studien zu
gleichen Ergebnissen (Zheng et al. 2003, Li et al. 2002, Charriaut-Marlangue et al.
1996).
60
Neben dem morphologischen Nachweis von Apoptose konnten auch biochemische
Nachweismethoden die Bedeutung des apoptotischen Zelluntergangs nach einem
ischämischen Hirninfarkt belegen. So ist die Aktivität von Caspase-3 nach fokaler
Ischämie in der betroffenen Hemisphäre signifikant erhöht (Rau et al. 2003, Namura et
al. 1998).
Durch Gabe eines Caspasen-Inhibitors (zDEVD-fmk) kann das apoptotische
Selbstmordprogramm gestoppt werden, wodurch sich im Rattenversuch eine deutliche
Reduktion des resultierenden Infarktvolumens erreichen läßt (Fink et al. 1998).
Der
Caspasen-Inhibitor
boc-Aspartyl-Fluoromethyl-Keton
(BAF)
erbrachte
tierexperimentell ebenfalls eine Reduktion des Infarktvolumens, jedoch ohne
statistische Signifikanz zu erreichen (Joly et al. 2004).
In Caspasen-Knockout-Mäusen ist das Infarktvolumen nach fokaler Ischämie ebenfalls
signifikant reduziert im Vergleich zu Wildtypen (Le et al. 2002, Hara et al. 1997).
Untersuchungen über die Genexpression von apoptoseregulierenden Proteinen der bcl2-Familie erbrachten ebenfalls Erkenntnisse über die Relevanz von Apoptose nach
cerebraler Ischämie (Graham et al. 2001). Eine vermehrte Expression von
antiapoptotischen bcl-2-Genen wurde in Neuronen dokumentiert, die eine transiente
cerebrale Ischämie überlebten (Minami et al. 2000). Eine Hemmung der bcl-2Expression nach fokaler Ischämie führt in Tiermodellen erwartungsgemäß zu größeren
Infarktvolumina (Chen et al. 2000).
Kürzlich konnten Zhu und Mitarbeiter im Tierexperiment belegen, dass durch eine
adäquate Hypothermie-Behandlung die apoptosefördernde Cytochrom C-Ausschüttung
und Caspase-3-Aktivität gehemmt werden können (Zhu et al. 2004). Die Autoren sehen
in dieser Apoptosehemmung eine Erklärung für den bekannten neuroprotektiven Effekt
einer Hypothermie-Behandlung.
Somit ist am ehesten der zweite Ansatz der Hypothese, nämlich daß der Anteil peripher
apoptotischer Lymphozyten oder Granulozyten ein Korrelat zur Infarktausdehnung und
zur klinischen Symptomatik bei Patienten mit akutem ischämischen Hirninsult bietet, zu
verwerfen.
Dieser Ansatz wurde von Erkenntnissen aus Studien mit Polysklerosepatienten
abgeleitet, in denen die periphere Apoptoserate ein Korrelat zur zentralnervösen
Apoptose darstellt (Bansil et al. 1997, Zipp et al. 1998). Ebenso wie bei der Multiplen
Sklerose, wurde auch nach akuter Hirnischämie eine Fas-sensitive Apoptose berichtet
(Felderhoff-Mueser et al. 2000, Rosenbaum et al. 2000).
61
Als weitere Apoptose-Induktoren gelten freie Radikale, eine Kalziumüberladung und
verschiedene Exzitotoxine wie das Glutamat (Zhu et al. 2004, Graham et al. 2001,
Kuschinsky et al. 2000).
Durch die nach Ischämie resultierende Störung der Blut-Hirn-Schranke ist ein
peripherer Nachweis der zentralen apoptotischen Reaktion denkbar. In vorliegender
Studie ist eine solche Tendenz bei der Apoptoserate der Gesamtpopulation der
Lymphozyten zu erkennen, diese erreicht jedoch keine statistische Signifikanz.
Bedingt durch das relativ kleine Kollektiv von insgesamt 15 Patienten sind die
errechneten statistischen Testwerte jedoch nur von deskriptiver Bedeutung.
Die Tatsache daß keine gültigen Normwerte für die Apoptoserate peripherer
Lymphozyten bestehen, wirkt sich ebenfalls limitierend auf die Interpretation
vorliegender
Daten
aus.
Die
im
Rahmen
einer
anderen
Studie
im
neuroimmunologischen Labor des St. Josef- Hospitals anhand von 15 gesunden jungen
Kontrollpersonen aufgestellten Vergleichswerte lagen gering unterhalb der vorliegenden
Apoptoseraten (Aktaş 1999). Die Vergleichbarkeit mit diesen Werten ist jedoch
eingeschränkt, da es sich um ein deutlich jüngeres Kollektiv (Alter = 32 +/- 6 Jahre)
ohne
weitere
Erkrankungen
handelte,
und
altersabhängige
immunologische
Reaktionsprofile beschrieben sind (Chipeta et al. 1998).
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die Apoptose von neuronalen Zellen
zunehmend an Bedeutung in pathophysiologischen Ischämiemodellen gewinnt. Der in
dieser Studie unternommene Versuch einen aussagekräftigen und für den klinischen
Alltag praktikablen peripheren Marker herauszustellen erwies sich als verfrüht. Weitere
klinisch- als auch grundlagenorientierte wissenschaftliche Arbeiten sind notwendig, um
die tierexperimentell gewonnenen Erkenntnisse und Therapieansätze in Zukunft in ein
Humanmodell zu übertragen, und dies für Patienten nutzbar zu machen.
62
4.2
Inflammatorische Reaktion nach cerebraler Ischämie
Seit mehreren Jahren ist bereits nachgewiesen, daß das zentrale Nervensystem
immunmodulatorische Eigenschaften besitzt, und daß es nach einem ischämischen
Ereignis mit der Freisetzung von verschiedenen Zytokinen und Adhäsionsmolekulen
reagiert. Dabei sind neben den im ZNS lokalisierten Monozyten, Fibroblasten,
Endothelzellen
und
T-Lymphozyten
auch
Mikroglia
und
Astrozyten
zur
Zytokinproduktion befähigt (Kim 1996).
Hypothese vorliegender Studie ist, daß ein ischämischer Hirninsult eine sekundäre
Entzündungsreaktion bedingt, die ihrerseits Einfluß auf das Ausmaß der resultierenden
Hirnschädigung und damit auf den klinischen Verlauf nimmt. Die dabei erhobenen
Parameter zeigten bei Schlaganfallpatienten mit einem ungünstigen klinischen Verlauf
in der postakuten Phase eine deulich stärkere postischämische Entzündungsreaktion als
bei Patienten mit rückläufiger Schlaganfallsymptomatik, so daß die aufgestellte
Hypothese angenommen werden konnte. Die jeweils ermittelten Parameter werden im
folgenden einzeln diskutiert:
a) Interleukin-1β:
Nach Durchführung des ersten Enzym-Immuno-Assay-Kit, bei dem die Werte der
ersten neun in die Studie aufgenommenen Patienten ermittelt wurden, ergab die
Untersuchung durchgehend Werte unterhalb von 1 pg/ml, teilweise sogar Werte im
nicht detektierbaren Bereich.
Dies entspricht der von Medgenix BioSource S.A. angegebenen Referenzwerte von
gesunden Probanden (Referenzbereich= 0-15 pg/ml, mean= 5 pg/ml, SD=8 pg/ml).
Somit war weder ein Unterschied zu gesunden Individuen, noch zwischen den beiden
Vergleichsgruppen zu erkennen.
In einer Studie an 30 Schlaganfallpatienten dokumentierten Tarkowski et al. ebenfalls,
daß die gemessenen Serumwerte von IL-1β unterhalb von 1 pg/dl lagen (Tarkowski et
al. 1995), so daß hier auf die Durchführung weiterer EIA-Kits verzichtet wurde.
Anzumerken ist, daß in der erwähnten Studie von Tarkowski und Mitarbeitern die
parallel dazu ermittelten Liquorkonzentrationen von IL-1β erhöhte Werte ergaben.
Daneben waren die zusätzlich erhobenen Liquor- und Serumwerte von Interleukin-6 im
Vergleich zu gesunden Probanden signifikant erhöht, wobei auch für IL-6 höhere
Liquor- als Serumwerte ermittelt wurden.
63
Die Autoren schlußfolgerten, daß eine cerebrale Ischämie eine lokale und im Liquor
nachweisbare Entzündungsreaktion bedingt, die sich im Serum durch IL-6 und nicht
durch IL-1β widerspiegeln läßt. Dies konnte durch die vorliegenden IL-1β- und IL-6Werte (s.u.) bestätigt werden.
b) Interleukin-6:
Die in dieser Studie ermittelten IL-6 Werte waren im Vergleich zu den von Medgenix
BioSource S.A. angegebenen Referenzwerten von gesunden Probanden (0 – 8,5 pg/ml)
deutlich erhöht. Postischämisch erhöhte Serumwerte von IL-6 sind in der Literatur
mehrfach beschrieben, und als Marker einer ablaufenden ischämiebedingten
Entzündungsreaktion interpretiert worden (Vila et al. 2000, Kim et al. 1996). Darüber
hinaus, konnte in vorliegender Studie beobachtet werden, daß die am 3. Tag
gemessenen Serumwerte von IL-6 bei Patienten mit ungünstigerem Verlauf (Gruppe B),
signifikant gegenüber Patienten mit günstigerem Verlauf (Gruppe A) erhöht sind
(p=0,04).
Dies ergibt einen ersten Hinweis darauf, daß eine stärkere entzündliche Reaktion die
Erholungstendenz in der postakuten Phase eines Schlaganfalles ungünstig beeinflußt.
Ein Zusammenhang zwischen IL-6-Serumwert und klinischen Verlauf konnten auch
Vila und Mitarbeiter aufzeigen, wobei stark erhöhte IL-6-Werte mit einer klinischen
Verschlechterung einhergingen (Vila et al. 2000).
Auf diesen Ergebnissen aufbauend, überprüften Clark et al. die Hypothese, daß eine
Hemmung der IL-6-Synthese mit einem günstigeren Verlauf einhergehen würde (Clark
et al. 2000). Sie versetzten IL-6-knockout-Mäuse in eine reversible fokale Ischämie.
Weder für das Infarktvolumen, noch für den Grad der neurologischen Behinderung
konnten signifikante Unterschiede im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen beobachtet
werden.
Diese Beobachtung zeigt auf, daß es sich bei der inflammatorischen Reaktion nach
cerebraler
Ischämie
um
eine
komplexe
Interaktion
zwischen
mehreren
immunologischen Faktoren handeln muß, die simplifizierende Schlußfolgerungen nicht
zulässt, zumal für Interleukin-6 auch antiinflammatorische Eigenschaften beschrieben
wurden (Vgl. Abschnitt 1.2.2.2).
64
c) ICAM-1
Bereits 1996 wurde eine vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen im Bereich
eines Hirninfarktareales beschrieben, welche mit einer Leukozytenakkumulation
einherging (Lindsberg et al. 1996). Akkumulierte Leukozyten stehen dabei in Verdacht
die lokale Perfusion durch physikalische Obstruktion kleiner Gefäße zu verschlechtern,
und somit den therapeutischen Effekt von rheologischen Maßnahmen nach cerebraler
Ischämie zu reduzieren. In einer Studie an ICAM-1-knockout-Mäusen konnten
Kitagawa et al. aufzeigen, daß ein ICAM-1-Defekt die Mikrozirkulation im
Infarktgebiet deutlich verbessert, und damit das resultierende Infarktvolumen gegenüber
Wildtypen signifikant reduziert (Kitagawa et al. 1998).
Über dieses lokale Geschehen hinaus, sind bei Schlaganfallpatienten auch erhöhte
Serumwerte von ICAM-1 dokumentiert (Shyu et al. 1997). Die in dieser Studie
ermittelten Serumwerte von ICAM-1 lagen insgesamt leicht oberhalb den von
Medgenix BioSource S.A. angegebenen Referenzwerten von gesunden Probanden
(range= 73 – 604 ng/ml, mean= 304 ng/ml, SD= 158 ng/ml).
Da sowohl der angegebene Referenzbereich, als auch die eigenen Daten eine sehr hohe
Streuung aufweisen, und die erhobenen Werte sich zwischen den beiden
Untersuchungsgruppen nicht unterschieden, ist aus diesem Vergleich keine verwertbare
Aussage über einen Zusammenhang zwischen den im Serum gemessenen ICAM-1Werten un dem klinischen Verlauf in der postakuten Phase zu treffen.
Ein Zusammenhang zwischen der Expression von Adhäsionsmolekülen und dem
klinischen Outcome ist jedoch aufgrund publizierter tierexperementeller Erkenntnisse
zu postulieren, zumal auch klinische Studien Hinweise erbrachten, daß der
neuroprotektive Effekt einer Hypothermiebehandlung beim Schlaganfall u.a. auf eine
verminderte ICAM-1-Expression beruht, da diese auch von der Körpertemperatur
abhängig ist (Inamasu et al. 2001).
Eine
vermutete
Manifestation
dieses
lokalen
Prozesses
im
Schlaganfallpatienten lies sich in vorliegender Studie nicht bestätigen.
Serum
von
65
d) C-reaktives Protein
Der pathophysiologische Zusammenhang, als auch die prognostische Aussagekraft von
C-reaktivem Protein (CRP) in kardiocaskulären Erkrankungen ist hinreichend
beschrieben (Möckel et al. 2000, Albert et al. 1999, Hoffmeister et al. 1998). Die
Bedeutung von CRP bei cerebrovaskulären Ereignissen wird jedoch weiterhin
kontrovers diskutiert.
Die in den letzen Jahren gewonnene Einsicht, daß ein ischämischer Hirninsult eine
sekundäre Entzündungsreaktion bedingt, die ihrerseits Einfluß auf das Ausmaß der
resultierenden Hirnschädigung nimmt, legt die Vermutung nahe, daß das CRP als
Marker dieser Reaktion dienen, und somit prognostische Aussagekraft zum klinischen
Verlauf liefern könnte.
Muir und Mitarbeiter konnten erstmals dokumentieren, daß Patienten mit einem
erhöhten CRP-Wert in den ersten 72 Stunden nach einem Hirninfarktergnis ein
signifikant schlechteres Outcome aufwiesen als Patienten mit niedrigen CRP-Werten
(Muir et al. 1999). Das Design entsprach dabei vorliegendem Studienabschnitt, jedoch
wurden die Patienten nach initialem CRP-Wert in zwei Gruppen eingeteilt und mit dem
klinischen Verlauf gemessen an der NIHSS getestet. Patienten mit rückläufiger
Schlaganfallsymptomatik wiesen dabei nach 72 Stunden einen CRP-Mittelwert von 4,2
mg/l , Patienten mit ungünstigerem Verlauf einen CRP-Mittelwert von 33,9 mg/l.
Dies entpricht auch den in vorliegender Studie ermittelten Daten:
Patienten mit ungünstigerem Verlauf verzeichneten einen signifikanten Anstieg der
CRP-Konzentration im Vergleich zum Ausgangswert mit Maximun am dritten
(p=0,050) bis fünften (p=0,036) Untersuchungstag.
Die CRP-Werte von Patienten mit günstigerem Verlauf hingegen, lagen überwiegend
im physiologischen Bereich, oder zeigten bei vereinzelt erhöhten Ausgangswerten einen
abnehmenden dynamischen Verlauf. Dieser Unterschied zwischen beiden Gruppen
zeigte statistische Signifikanz (p=0,029), so daß hier ein weiterer Hinweis darauf
besteht, daß eine stärkere entzündliche Reaktion die Rückbildung neurologischer
Defizite in der postakuten Phase eines Hirninsultes ungünstig beeinflußt.
Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen, konnten Canova und Mitarbeiter keinen
signifikanten Zusammenhang zwischen CRP-Konzentration und Schweregrad der
neurologischen Beeinträchtigung feststellen (Canova et al. 1999).
66
Diese inkonsistente Studienlage veranlasste Di Napoli et al. den Verlauf der CRPKonzentration zwischen dem 24-Stundenwert und dem 72-Stundenwert mit dem
klinischen Verlauf zu korrelieren (Di Napoli et al. 2001b).
Es konnte demonstriert werden, daß Patienten mit konstant erhöhten CRP-Werte über
15 mg/dl, als auch Patienten mitaufsteigenden CRP-Konzentrationen ein signifikant
schlechteres Outcome gegenüber Patienten haben, deren CRP-Konzentrationen einen
konstant niedrigen oder einen abfallenden Verlauf zeigten. Die Autoren interpretieren
ihre Ergebnisse dahingehend, daß aufsteigende CRP-Werte als Marker für eine
zunehmende postischämische Entzündungsreaktion gelten, und die Ausbreitung des
Infarktareals wiederspiegeln können
In vorliegender Studie wurde erstmals der dynamische Verlauf der CRP-Konzentration
in den ersten zehn Tagen nach einem cerebroischämischen Ereignis gemessen.
Vereinzelte Patienten aus der Gruppe A (günstigeres klinisches Outcome) zeigten dabei
nach 24 Stunden erhöhte CRP-Werte, welche sich jedoch – im Gegensatz zu den
Werten von den Patienten aus der Gruppe B (ungünstigeres klinisches Outcome) – im
weiteren Verlauf normalisierten. Somit ist die von Di Napoli et al. aufgestellte
Hypothese, daß neben dem absoluten CRP-Wert auch der relative Verlauf einen
prognostischen Marker darstellt, in der vorliegenden Studie zu bestätigen.
67
e) Fibrinogen
Bei beiden Untersuchungsgruppen lag der am Tag des Schlaganfalles gemessene
Ausgangswert im Normbereich (Referenzbereich für Fibrinogen: 200-400 mg/dl).
Beide Gruppen zeigten im weiteren Verlauf steigende Fibrinogenwerte, mit Maximum
am 5. Untersuchungstag. Patienten mit ungünstigerem Verlauf verzeichneten jedoch
einen stärkeren Anstieg, so daß der am 5. Tag gemessene Fibrinogenwert signifikant
gegenüber dem Ausgangswert erhöht war (p=0,017).
Fibrinogen ist ebenso wie das CRP ein Akute-Phase-Protein, dessen Synthese von IL-6
induziert wird. Aufgrund seiner relativ langen Reaktionszeit von ca. 48 Stunden ist ein
Anstieg der Fibrinogenkonzentration erst 48 Stunden nach einem immunologischen
Ereignis zu detektieren
(vgl. Abschnitt 1.2.4.2). In diesem Zusammenhang sind
vorliegende Ergebnisse als weiteres Indiz für eine postischämisch aktivierte
Inflammationskaskade zu werten.
Für Fibrinogen ist in der Literatur eine gering signifikante prognostische Wertigkeit für
den Verlauf nach cerebroischämischen Ereignissen beschrieben (Di Napoli et al.
2001a). Die Ergebnisse sind jedoch nur mit dem Hintergrund über den Einfluss dieses
Parameters auf das Gerinnungssystem zu interpretieren, denn unabhängig von der
immunologischen Funktion kann Fibrinogen bei ischämischen Ereignissen eine
hämostaseologische Relevanz einnehmen. Durch die prokoagulatorische Wirkung auf
die Gerinnungskaskade könnte darin ein weiterer pathophysiologischer Mechanismus
bestehen, der zur Verschlechterung der Versorgungssituation in der Penumbra führt
(Toghi et al. 2000).
68
f) Fazit:
Verschiedene Studien haben in den letzten Jahren Hinweise erbracht, daß ein
ischämischer Hirninsult eine sekundäre lokale inflammatorische Reaktion bedingt, die
ihrerseits Einfluß auf das Ausmaß der resultierenden Hirnschädigung und damit auf den
klinischen Verlauf hat.
Ein Zusammenhang zwischen der Stärke einer postischämischen Entzündungsreaktion
und dem klinischen Verlauf in der postakuten Phase konnte auch in vorliegender Studie
dokumentiert werden. Da in dieser Studie periphere Entzündungsparameter erhoben
wurden, stellt sich die Frage, ob es sich hierbei um periphere Marker einer im ZNS
lokalisierten postischämischen inflammatorischen Reaktion handelt, oder ob die
beobachtete Entzündungsreaktion auf ein vom Hirninsult unabhängiges Ereignis
zurückzuführen
ist.
Obwohl
Patienten
mit
bekannten
inflammatorischen
Begleiterkrankungen (z.B. Harnwegsinfekt oder Pneumonie) zu Beginn oder im Verlauf
aus der Studie ausgeschlossen wurden, läßt sich dieser Aspekt nicht mit absoluter
Sicherheit ausschliessen, jedoch spricht der dokumentierte zeitliche Zusammenhang
dafür, daß es sich hierbei um ein mit der Schlaganfallreaktion konkomitierendes
inflammatorisches Geschehen handelt, und daß dieses Einfluß auf den Schweregrad der
neurologischen Beeinträchtigung von Schlaganfallpatienten nimmt.
Durch diese Tatsache wird die Wichtigkeit einer kontinuierlichen Überwachung und
einer optimalen supportiven Therapie von Schlaganfallpatienten, wie sie in
spezialisierten Zentren (Stroke Units) durchgeführt werden kann, unterstrichen.
Neben frühzeitiger Rekanalisierung, kardiopulmonalem Monitoring, Durchführung von
physio-
und
ergotherapeutischen
sowie
logopädischen
Behandlungen
sind
antiinflammatorische Maßnahmen wie die Fiebersenkung ebenfalls relevant für den
klinisch-neurologischen Verlauf von Schlaganfallpatienten.
Somit erscheint die frühzeitige Gabe von ASS auch aus immunologischen
Gesichtspunkten sinnvoll. Über den thrombozytenfunktionshemmenden Effekt hinaus,
besitzt ASS auch antiinflammatorische und antipyretische Wirkungen, welche zur
Eingrenzung der postischämischen Entzündungsreaktion beitragen (Aude 2002). Die
Eigenschaft als Radikalfänger impliziert darüber hinaus einen antiapoptotischen Effekt,
so daß die ASS mit ihren multimodalen Wirkungsansätzen weitere Argumente für ihre
Stellung als Medikament der ersten Wahl in der Frühphase eines Schlaganfalles bietet
(Fiorucci 2002, Hellwig 1999).
69
5.
Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit immunologischen Reaktionen nach einem ischämischen
Hirninsult, mit peripheren Markern dieser Reaktionen und mit der prognostischen Wertigkeit
dieser Parameter bezogen auf den klinischen Verlauf von Schlaganfallpatienten in der
subakuten Phase.
Zu diesem Zweck wurden fünfzehn Patienten mit akutem ischämischen Mediainfarkt über zehn
Tage klinisch-neurologisch und immunologisch-laborchemisch untersucht. Abhängig vom
klinischen Verlauf, wurden die Patienten in zwei Gruppen aufgeteilt, und die erhobenen
immunologischen Parameter anschliessend miteinander verglichen und auf statistische
Signifikanz geprüft. Dabei wurden Apoptoseraten und Entzündungsparameter untersucht. Der
Verlauf von Apoptoseraten peripherer Lymphozyten und Granulozyten wurde eigenständig
mittels durchflußzytometrischer Verfahren erhoben. Der Verlauf inflammatorischer Parameter
(IL-1β, IL-6 und ICAM-1) wurde eigenständig mittels Enzym-Immuno-Assay ermittelt. Der
Verlauf zweier Akute-Phase-Proteine (CRP und Fibrinogen) wurden im Rahmen von klinischchemischen Routineuntersuchungen dokumentiert.
Bezogen auf die Apoptoseraten war kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den
Vergleichsgruppen zu erkennen. Lediglich eine leicht steigende Tendenz im dynamischen
Verlauf der Apoptoserate bei Patienten mit einem ungünstigeren klinischen Verlauf konnte
beobachtet
werden,
welche
als
Manifestation
einer
stärkeren
postischämischen
Apoptoseinduktion interpretiert werden kann. Tierexperimentell gewonnene Ergebnisse
belegen, daß neben dem ischämisch bedingten nekrotischen Zelltod, ein nicht unerheblicher
Anteil an Neuronen und Gliazellen einen induzierten apoptotischen Zelltod sterben. Der in
vorliegender Studie unternommene Versuch, einen aussagekräftigen und für den klinischen
Alltag praktikablen peripheren Marker der zentralnervösen Apoptosereaktion herauszustellen,
erwies sich als verfrüht.
Bezogen auf die Inflammationsparameter zeigten Patienten mit ungünstigerem klinischen
Verlauf eine stärkere postischämische Entzündungsreaktion als Patienten mit günstigerem
klinischen Verlauf. Der Vergleich von IL-6 und CRP erreichte dabei statistische Signifikanz, so
daß die aufgestellte Hypothese von einer Beeinflussung des klinischen Verlaufs durch die
postischämisch ablaufende Entzündungsreaktion angenommen werden konnte.
Vorliegende Arbeit sollte einen Beitrag zur Erweiterung des pathophysiologischen
Ischämiemodells liefern. Sowohl lokale, als auch systemische neuroimmunologische Aspekte
nehmen Einfluß auf die Revitalisierung bzw. auf die Nekrosematuration der Penumbra.
Weitere klinisch- als auch grundlagenorientierte wissenschaftliche Arbeiten sind notwendig, um
die tierexperimentell gewonnenen Erkenntnisse in Zukunft in ein Humanmodell zu übertragen
und dies für Patienten nutzbar zu machen.
70
6.
Anhang
Tab. 23:
Die European Stroke Scale
(nach Hantson 1994)
1. Level of Consiousness:
Alert, keenly responsive
Drowsy, but can be aroused by minor stimulation to obey, answer or respond
Requires repeated stimulation to attend, or is lethargic or obtunded, requiring strong/painfull stimulation to
make movements
Cannot be roused by any stimulation, does react purposefull to painful stimuli
Cannot be roused by any stimulation, does react with decerebration to painfull stimuli
Cannot be roused by any stimulation, does not react to painfull stimuli
2.
10
8
6
4
2
0
Comprehension:
Verbally give the patient the following commands:
1. Stick out your tongue
2. put your fingers on your nose
3. close your eyes
3. Speech:
The examiner makes a conversation with the patient
(how is the patient feeling, did he sleep well,
for how long has the patient been in hospital...)
patient performs 3 commands
patient performs 2 or 1 commands
patient does not perform any command
8
4
0
normal speech
slight word-finding difficulties,
conversation possible
severe word-finding difficulties,
conversation difficult
only yes or no
mute
8
normal
deficit
8
0
6
4
2
0
4. Visual Fiel:
The examiner compares the patients field of vision by
advancing a moving finger from the periphery inwards.
5.
Gaze:
The examiner steadies the patients head and asks him to
follow his finger. The examiner observes the resting eye
position and subsequently the full range of movements by
moving the indexfinger from the left to the right and vice
versa.
6.
Facial Movement:
The examiner observes the patient as he talks and smiles,
noting any asymmetrical elevation of one corner of mouth,
flattening of nasolabial fold. Only the muscles in the lower
half of the face are assessed.
7.
normal
median eye position, deviation to one side
impossible
lateral eye position, return to midline
possible
lateral eye position, return to midline
impossible
normal
paresis
paralysis
Arm (maintain outstreched position):
The examiner asks the patient to close the eyes and
actively lifts the patient’s arms into position so that they
are outstreched at 45 degreeswith both hands in midposition so that the palms face each other. The patient is
asked to maintain this position for 5 sec. Only the affected
side is evaluated.
arm maintains position for 5 sec
arm maintains position, but affected hand
pronates
arm drifts before 5 sec , and maintains a
lower position
arm can’t maintain position, attempts to
oppose gravity
arm falls
8
4
2
0
8
4
0
4
3
2
1
0
71
8.
Arm (raising):
The patients arm is rested next to the leg with the hand in
mid-position. The examiner asks the patient to raise the
arm outstreched to 90 degrees.
9.
4
3
2
1
0
normal
straight arm, movement not full
flexed arm
trace movements
no movement
Extension of the Wrist:
The patient is tested with the forearm supported and the
hand unsupported, relaxed in pronation. The patient is
asked to extend the hand.
normal
full isolated movement, reduced strength
movement not isolated and/or full
trace movements
no movement
8
6
4
2
0
10. Fingers:
The examiner asks the patient to form with both hands and
as strongly as possible a pinch grip with the thumb and
forefinger and to try to resist a weak pull. The examiner
checks the strenght of this grip by pulling the pinch with
one finger.
11. Leg (maintain position):
The examiner actively lifts the patient’s affected leg into
position so that the thigh forms an angle of 90 degrees
with the bed, with the shin parallel with the bed. The
examiner asks the patient to close the eyes and to maintain
this position for 5 sec
equal strength
reduced strenght on affected side
pinch grip impossible on affected side
8
4
0
leg maintains position for 5 sec
leg drifts to intermediate position by the end
of 5 sec
leg drifts to bed within 5 sec, but not
immediately
leg falls to bed immediately
4
12. Leg (flexing):
The patient is in supine position eith the legs outstreched.
The examiner asks the patient to flex the hip knee.
normal
movement against resistance,
strength
mavement against gravity
trace movements
no movement
14. Gait:
1
0
4
reduced
13. Dorsiflexion of the Foot:
The patient is tested with the leg outstreched. The
examiner asks the patient to dorsiflex the foot.
2
normal
leg outstreched, full movement, reduced
strenght
movement not full or knee flexed or foot in
supination
trace movements
no movement
normal
gait
has
abnormal
aspect
and/or
distance/speed limited
patient can walk with aid
patient can walk with the physical
assistance of persons
patient cannot walk, but can stand supported
patient cannot walk nor stand
3
2
1
0
8
6
4
2
0
10
8
6
4
2
0
72
Tab. 24:
Die National Institutes of Health Stroke Scale
(nach Brott 1989)
1.b. LOC – Questions
(actual month, age of the patient)
alert
drowsy
stuporous
coma
answers both correctly
answers one correctly
incorrect
0
1
2
3
0
1
2
1.c. LOC – Commands
(open, close eyes; make fist, let go)
obeys both correctly
obeyes one correctly
incorrect
0
1
2
both reactive
one reactive
neither reactive
normal
partial gaze palsy
forced deviation
no visual loss
partial hemianopsia
complete hemianopsia
normal
minor
partial
complete
no drift
drift
can`t resist gravity
no effort against gravity
no drift
drift
can`t resist gravity
no effort against gravity
normal
equivocal
extensor
bilateral extensor
absent
present in upper or lower
present in both
normal
partial loss
dense loss
no neglect
partial neglect
complete neglect
normal articulation
mild to moderate dysarthria
near unintelligible or worse
no aphasia
mild to moderate aphasia
severe aphasia
mute
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
3
1.a. Level of Consciousness (LOC)
2.
Pupillary Response
3.
Best Gaze
4.
Best Visual
5. Facial Palsy
6.
Best Motor Arm
7.
Best Motor Leg
8.
Plantar reflex
9.
Limb Ataxia
10.
Sensory
11.
Neglect
12.
Dysarthria
13.
Best Language
73
7.
Literaturverzeichnis:
1) Aktaş Orhan (1999)
Einfluß von Copolymer-I auf die Apoptoserate und die Zytokinsynthese von
Lymphozyten bei Patienten mit schubförmig remittierender Multipler Sklerose in
stabiler Krankheitsphase und bei gesunden Individuen.
Neurologische Klinik des St. Josef-Hospital Bochum. – Universitätsklinik –
Inaugural-Dissertation, S. 57 ff., Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum.
2) Adams R.D., Victor M. (1993)
Principles of Neurology
Fifth Edition, section 34, p. 669ff, McGraw-Hill, New York 1993, ISBN 0-07-112533-7
3) Albert M.A., Ridker P.N. (1999)
The role of C-reactive Protein in cardiovascular disease risk.
Curr Cardiol Rep 1, 99-104
4) Astrup J., Symon L., Siesjö B.K. (1981)
Thresholds in cerbral ischemia – the ischemic penumbra.
Stroke 12, 723-725
5) ATC – Antiplatelet Trialists Collaboration (1994)
Collaborative overview of randomised trials of antiplatelet therapy. Prevention of death,
myocardial infarction, and stroke by prolonged antiplatelet therapy in various categories
of patients. Brit Med J 308, 81-106
6) Aude Y.W., Mehta J.L. (2002)
Nonplatelet-mediated effects of aspirin.
Drugs Today 38, 501-7
7) Bansil S., Holtz C.R., Cook S.D., Rohowsky-Kochan C. (1997)
Serum sAPO-1/Fas levels in multiple sclerosis.
Acta Neurol Scand 95, 208-210
8) Basedovsky H., Del Rey A., Dinarello C.A. (1986)
Immunoregulatory feedback between interleukin-1 and glucorticoid hormons.
Science 233, 652-654
9) Berger K., Weltermann B., Kolominsky-Rabas P.L., Meves S., Heuschmann P.U.,
Boehner J., Neundoefer B., Hense H.W., Buettner T. (1999)
Untersuchung zur Reliabilität von Schlaganfallskalen: Die deutsche Versionen von
NIHSS, ESS und Rankin Scale.
Fortschr Neurol Psychiatr 67, 81-93
10) Berlit P. (2000)
Schlaganfall, Möglichkeiten der Primärprävention.
Nervenarzt 70, 231-237
11) Block F., Schwarz M. (1999)
Neuroprotektion beim Schlaganfall.
74
12) Böger R.H., Bode-Böger S.M., Gutzki F.M., Tsikas D., Fröhlich J.C. (1993)
Rapid and selective inhibition of platelet aggregation and thromboxane formation by
intravenous „low dose“ aspirin in man.
Clinical Science 84, 517-524
13) Bousser M.G. (1997)
Aspirin or heparin immediatly after a stroke?
Lancet 349, 1564-1565
14) Brott T., Adams H.P. jr., Olinger C.P., Marler J.R., Barsan W.G., Biller J., Spilker
J., Holleran R., Eberle R., Hertzberg V. (1989)
Measurements of acute cerebral infarction: a clinical examination scale.
Stroke 20, 864-870
15) Brown R.D., Whisnant J.P., Sicks J.D., O’Fallon W.M., Wiebers D.O. (1996)
Stroke incidence, prevalence and survival secular trends in Rochester, Minnesota.
Stroke 27, 373-380
16) Bruno A., Biller J., Adams H.P. jr., Clarke W.R., Williams L.S., Hansen M.D.
(1999) Acute blood glucose level and outcome from ischemic stroke.
Neurology 52 280-284
17) Buisson A., Lesne S., Docagne F., Ali C., Nicole O., MacKenzie E.T., Vivien D.
(2003): Transforming growth factor-beta and ischemic brain injury.
Cell Mol Neurobiol 23, 539-50
18) Bursch W., Paffe S., Putz B., Barthel G., Schulte-Hermann R. (1990)
Determination of the lenght of the histological stages of apoptosis in normal liver and in
altered hepatic foci of rats.
Carcinogenesis 11, 847-853
19) Canova CR., Courtin C., Reinhardt W.H. (1999)
C-reaktive protein (CRP) in cerebrovascular events.
Atherosclerosis 147, 49-53
20) CAPRIE Steering Committee (1996)
A randomized trial of Clopidogrel vs. Aspirine in patients at risk of ischemic events.
Lancet 348, 1329-1339
21) Carter N.P. and Meyer E.W. (1994)
Introducrion to the principles of flow cytometry.
Ormerod MG ed. Flow Cytometry, 2nd edition. IRL Press, Oxford
22) CAST - Chinese Acute Stroke Trial Collaborativ Group (1997)
Randomized placebo-controlled trial of early aspirin use in patients with acute
ischaemic stroke.
Lancet 349, 1641-49
23) Castell J.V., Andus T., Kunz D., Heinrich P.C. (1989)
Interleukin-6: the major regulator of acute-phase protein syntehsis in man and rat.
Ann NY Acad Sci USA 557, 86-101
75
24) CATS (1989)
The Canadian American Ticlopidine Study in thromboembolic stroke.
Lancet 3, 1215-1220
25) Chalmers J. (1998)
Brain, blood pressure and stroke.
J Hypertension 16, 1849-1858
26) Charriaut-Marlangue C., Margaill I. (1996)
Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia:
an in situ DNA fragmentation analysis.
J Cereb Blood Flow Metab 16, 186-94.
27) Chen J., Simon R.P., Nagayama T., Zhu R., Loeffert J.E., Watkins S.C., Graham
S.H. (2000)
Suppression of endogenous bcl-2 expression by antisense treatment exacerbates
ischemic neuronal death.
J Cereb Blood Flow Metab 20, 1033-9.
28) Chipeta J., Komada Y., Zhang X.L., Deguchi T., Azuma E., Sakurai M. (1998)
CD4+ and CD8+ cell cytokine profiles in neonates, older children and adults. Increasing
T helper type 1 and T cytotoxic type 1 cell populations with age.
Cell Immunol 185, 149-156
29) Clark W.M., Wissmann S., Albers G.W., Jhamandas J.H., Madden K.P. Hamilton S.
for the ATLANTIS Stroke Study Investigators (1999)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (Alteplase) for ischemic stroke 3 to 5
hours after symptom onset: the ATLANTIS study: a randomized controlled trial.
JAMA 282, 2019-2026
30) Clark W.M., Rinker L.G., Lessov N.S., Hazel K, Stenzel-Poore M., Eckenstein F.
(2000) Lack of interleukin-6 expression is not protective against focal central nervous
system ischemia.
Stroke 31, 1219-22
31) Colotta F., Ghezzi P., Mantovani A. (1998)
Interleukin 1. Cytokines.
Edited by Anthony R, Mire-Sluis and Robin Thorpe
Academic Presss Lim., San Diego, London. ISBN 0-12-498340-5
32) Cummins R.O., Hazinski M.F. (2000)
Acute Stroke. The Era of Reperfusion.
Circulation 102 (Suppl 1), 204-216
33) Davalos A., Castillo J., Pumar J.M., Noya M. (1997)
Body temperature and fibrinogen are related to early neurological deterioration in acute
ischemic stroke.
J Cerebrovasc Dis 7, 64-69
76
34) Di Napoli M., Papa F., Bocola V. (2001a)
Prognostic influence of increased C-reaktive protein and fibrinogen levels in ischemic
stroke.
Stroke 32, 133-138
35) Di Napoli M., Papa F., Bocola V. (2001b)
C-reactive protein in ischemic stroke: an independent prognostic factor.
Stroke 32, 917-924.
36) Diaz J., Sempere A.P. (2004)
Cerebral ischemia: new risc factors.
Cerebrovasc Dis 17 (Suppl 1), 43-50
37) Diener H.C. (2000)
Schlaganfallprävention mit Thrombozytenfunktionshemmern und Antikoagulantien.
Internist 41, 540-548
38) Diener H.C., Cunha L., Forbes C., Sivenius J., Smets P., Lowenthal A. (1996)
European Stroke Prevention Study 2. Dipyridamole and acetylsalicylic acid in the
secondary prevention of Stroke.
J Neurol Sci 143, 1-13
39) Dinarello C.A. (1991)
Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism.
Blood 77, 1627-1652
40) Dinarello C.A. (1994)
Blocking interleukin –1 receptors.
Int J Clin Lab Res 24, 61-79
41) Dörner K. (1992)
Klinische Chemie.
Ferdinand Enke Verlag Stuttgart. 2. Auflage 1992, S. 172 ff. ISBN 3-432-97312-8
42) Dustin M.L., Rothlein R., Bhan A.K., Dinarello C.A., Springer T.A. (1986)
Induction by IL 1 and interferon-gamma: tissue distribution, biochemistry, and function
of a natural adherence molecule (ICAM-1).
J Immunol 137, 245-54.
43) Dutch TIA Trial Study Group (1991)
A comparision of two doses of aspirin in patients after a transient ischemic attack of
minor ischemic stroke.
New Engl J Med 325, 1017-1024
44) EAFT (European Atrial Fibrillation Trial) Sutdy Group (1993)
Secondary prevention in non-rheumatic atrial fibrillation after transient ischemic attack
of minor stroke.
Lancet 342, 1255-1262
45) Eckstein H., Maeder N., Allenberg J.R. (1999)
Carotischirurgie als Apoplexprophylaxe.
Chirurg 70, 353-363
77
46) Felderhoff-Mueser U., Taylor D.L., Greenwood K., Kozma M., Stibenz D., Joashi
U.C., Edwards A.D., Mehmet H. (2000)
Fas/CD95/APO-1 can function as a death receptor for neuronal cells in vitro and in vivo
and is upregulated following cerebral hypoxic-ischemic injury to the developing rat
brain. Brain Pathol 10, 17-29
47) Fink K., Zhu J., Namura S., Shimizu-Sasamata M., Endres M., Ma J., Dalkara T.,
Yuan J., Moskowitz M.A. (1998)
Prolonged therapeutic window for ischemic brain damage caused by delayed caspase
activation.
J Cereb Blood Flow Metab 18, 1071-6
48) Fiorucci S., Mencarelli A., Mannucci R., Distrutti E., Morelli A., del Soldato.,
Moncada S. (2002)
NCX-4016, a nitric oxide-releasing aspirin, protects endothelial cells against apoptosis
by modulating mitochondrial function.
FASEB J 16, 1645-7
49) Forette F., Seux M.L., Staessen J.A., Thijs L., Birkenhager W.H., Baberskiene
M.R., Babeanu S., Bossini A., Gil-Extremara B., Girerd X., Laks T., Lilov E.,
Moisseyev U., Tuomilehto J., Vanhanen H., Webster J., Yodfat Y., Fagard R. (1998)
Prevention of dementia in randomised double-blind placebo-controlled systolic
hypertension in Europe (Syst-Eur) trial.
Lancet 352, 1347-1351
50) Frijns C.J., Kappelle L.J. (2002)
Inflammatory cell adhesion molecules in ischemic cerebrovascular disease.
Stroke 33, 2115-22
51) Furlan A.J., Higashida R., Wechsler L., Gent., Rowley H., Kase C., Pessin M.,
Ahuja A., Callahan F., Clark W.M., Silver F., Rivera F. (1999)
Intraarterial pro-urokinase for acute ischemic stroke: the PROACT II Study: a
randomized, controlled trial.
JAMA 282, 2003-2011
52) Gilles W.H., Croft J.B., Greenlund K.J., Ford E.S., Kittner S.J. (1998)
Total homocyst(e)ine concentration and the likelihood of nonfatal stroke.
Stroke 29, 2473-2477
53) Ginsberg M.D., Busto R. (1998)
Combating hyperthermia in acute stroke.
Stroke 29, 529-534
54) Ginsberg M.D., Pulsinelli W.A. (1994)
The ischemic penumbra, injury thresholds, and the therapeutic window for acute stroke.
Ann Neurol 36, 553-554
55) Glücksmann A. (1951)
Cell deaths in normal vertebrate ontogeny.
Biol Rev 26, 59-86
78
56) Gold R., Stadelmann C., Brück W., Lassmann H. (2001)
Apoptotischer Zelltod bei neuroinflammatorischen und neurodegenerativen
Erkrankungen.
Akt Neurol 28, 17-25
57) Goldstein L.B., Adams R., Becker K., Furberg C.D., Gorelick P.B., Hademenos G.,
Hill M., Howard G., Howard V.J., Levine S.R., Mosca L., Sacco R.L., Sherman D.G.,
Wolf P.A. del Zoppo G.J. (2001)
Primary prevention of ischemic stroke: A statement for healthcare professionals from
the Stroke Council of the American Heart Association.
Stroke 32, 280-99
58) Graham S.H., Chen J. (2001)
Programmed Cell Death in Cerebral Ischemia.
J Cerebr Blood Flow & Metab 21, 99-109
59) Greiling H., Gressner A.M. (1995)
Lehrbuch der klinischen Chemie und Pathobiochemie
Zweite Auflage, S. 211, Schattauer Verlg. Stuttgart – New York. ISBN: 3-7945-1548-X
60) Grond M, Stenzel C, Schneweis S, Heiss WD et al. (1998)
Early intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke in a community-based
approach.
Stroke 1998 29, 1544-9
61) Hacke W., Kaste M., Fieschi C., von Kummer R., Davalos A., Meier D., Larrue V.,
Bluhmki E., Davis S., Donnan G., Schneider D., Diez-Tejedor E., Troullas P. (1998)
Randomised, double-blind, placebo-controlled trial of thrombolytic therapy with
intravenous recombinant tissue plasminogen activator in patients with acute ischaemic
stroke. Results of the second European-Australian Acute Stroke Study (ECAS II)
Lancet 352, 1245-1251
62) Hacke W., Kaste M., Fieschi C., Toni D., Lesaffre E., von Kummer R., Boysen G.,
Bluhmki E., Hoxter G., Mahagne M.H. for the ECASS study group (1995)
Intravenous thrombolysis with recombinant tissue plasminogen activator for acute
hemispheric stroke: the European Cooperative Acute Stroke Study (ECASS).
JAMA 274, 1017-1025
63) Hacke W. (1997)
Intensive care in acute stroke.
Cerebrovasc Dis 7 (Suppl 3), 18-23
64) Hamann G.F. (1997)
Der akute Hirninfarkt: Pathophysiologie und moderne Therapiekonzepte.
Radiologe 37, 843-852
65) Hankey G.J., Eikelboom J.W. (2001)
Homocysteine and stroke.
Current Opinion in Neurology 14, 95-102
79
66) Hansson L., Zanchetti A., Carruthers S.G., Dahlof B., Elmfeldt D., Julius S.,
Menard J., Rahn K.H., Wedel H., Westerling S. (1998)
Effects of intensive blood-pressure lowering and low-dose aspirin in patients with
hypertension: principal results of the Hypertension Optimal Treatment (HOT)
randomised trial.
Lancet 351, 1755-1762
67) Hantson L., De Weerdt W., De Keyser J., Diener H.C., Franke C., Palm R., Van
Orshoven M., Schoonderwalt H., De Klippel N. (1994)
The European Stroke Scale.
Stroke 25, 2215-9
68) Hara H., Fink K., Endres M. (1997)
Attenuation of transient focal cerebral ischemic injury in transgenic mice expressing a
mutant ICE inhibitory protein.
69) Harper G., Castleden C.M., Potter J.F. (1994)
Factors affecting changes in blood pressure after acute stroke.
Stroke 25, 1726-1729
70) Hass W.K., Easton J.D., Adams H.P. jr., Pryse-Phillips W., Molony B.A. Anderson
S., Kamm B. (1989)
A randomized trial comparing ticlopidine hydrochloride with aspirin for the prevention
of stroke.
N Eng J Med 321, 501-507
71) Hellwig Kerstin (1999)
Die Akutbehandlung des ischämischen Hirninfarktes mit dem Mono-Lysinsalz der
Acetylsalicylsäure in Kombination mit diedrig dosiertem Heparin. Ein Sicherheitsprofil.
Neurologische Klinik im St. Josef-Hospital Bochum.
Inaugural-Dissertation, Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum.
72) Heiss G., Sharret A.R., Barnetz R., Chambless L.E., Szklo M., Alzola C. (1991)
Carotid athesosclerosis measured by B-mode ultrasound in populations: association
with cardiovascular risk factors in the ARIC-Study.
Am J Epidemiol 134, 250-256
73) Heiss W.D., Huber M., Fink G.R., Herholz K., Pietrzyk U., Wagner R., Wienhard
K. (1992)
Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke.
74) Hellerstein M.K., Meydani S.N., Meydani M., Dinarello C.A. (1989)
Interleukin-1-induced anorexia in rat.
J Clin Invest 84, 228-235
75) Hoffmeister H.M., Helber U., Seipel L. (1998)
Inflammation und Plaqueinstabilität.
Z Kardiol 87(Suppl 2), 20-25.
80
76) Hufschmidt A., Lücking C.H. (1999)
Neurologie compact, S. 36 ff.,
Zweite Auflage 1999, Georg Thieme Verlag, ISBN 3-13-106792-6
77) Inamasu J., Suga S., Sato S., Horiguchi T., Akaji K., Mayanagi K., Kawase T.
(2001)
Intraischemic hypothermia attenuates intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and
migration of neutrophils.
Neurol Res 23, 105-111
78) IST - International Stroke Trial Collaborative Group (1997)
A randomized trial of aspirin, subcutaneous heparin, both, or neither among 19435
patients with acute ischaemic stroke.
Lancet 349, 1569-1581
79) Jacobson M.D., Weil M., Raff M.C. (1997)
Programmed cell death in animal development.
Cell 88, 347-354
80) Janeway C.A., Travers P. (1995)
Immunologie.
Spektrum Akad. Verl. Heidelberg-Berlin-Oxford. ISBN 3-86025-266-6
81) Joly L.M., Mucignat V., Mariani J., Plotkine M., Charriaut-Marlangue C. (2004)
Caspase inhibition after neonatal ischemia in the rat brain.
82) Kalabalikis P., Papazoglou G., Gouriotis S. (1999)
Correlation between serum IL-6 and CRP levels and severity of head injury in children.
Intensive Care Med 25, 288-292
83) Karenberg A., Moof F.P. (1997)
Die Apoplexie im medizinischen Schriftum der Antike.
Fortschr Neurol Psychiat 65, 489-503
84) Kaste M., Fogelholm R., Erila T., Palomaki H., Murros K., Rissanen A., Sarna S.
(1994)
A randomized, double-blind, placebo controlled trial of nimodipine in acute ischemic
hemispheric stroke.
Stroke 25, 1348-1353
85) Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972)
Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue
kinetics.
Br J Cancer 26, 239-257
86) Kim J.S. (1996)
Cytokines and adhesion molecules in stroke and related diseases.
J Neurol Sci 137, 69-78
81
87) Kitagawa K., Matsumoto M., Mabuchi T., Yagita Y., Ohtsuki T., Hori M.,
Yanagihara T. (1998)
Deficiency of intercellular adhesion molecule-1 attenuates microcirculation disturbance
and infarction size in focal cerebral ischemia.
88) Klijn C.J., Hankey G.J., American Stroke Assosiation and European Stroke
Initiative (2003)
Management of acute ischemic stroke: new guidelines from the American Stroke
Assosiation and European Stroke Initiative.
Lancet Neurol 11, 698-701
89) Kolles H. (1989)
Statistische Auswertungen in der Medizin. S.39 ff.
Jungjohann Verlag, München. ISBN 3-8243-1041-4
90) Krueger J.M., Toth L.A., Floyd R., Fang J., Kapas L., Bredow S., Obal F Jr. (1994)
Sleep, microbes and cytokines.
Neuroimmunomodulation 1, 100-109
91) Kuschinski W., Gillardon F. (2000)
Apoptosis and Cerebral ischaemia.
Cerebrovasc Dis 110, 165-169
92) Le D., Wu Y., Huang Z., Matsushita K., Plesnila N., Augustinack J.C., Hyman B.T.,
Yuan J., Kuida K., Flavell R.A. Moskowitz (2002)
Caspase activation and neuroprotection in caspase-3 deficient mice after in vivo
cerebral ischemia and in vitro oxygen glucose deprivation.
Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15188–15193
93) Lewen A., Matz P., Chan P.H. (2000)
Free radical pathways in CNS injury.
J Neurotraum 17, 871-890
94) Li F., Omori N., Li F., Sato K., Nagano I., Manabe Y., Shoji M., Abe K. (2002)
Coordinate expression of survival p-ERK and proapoptotic cytochrome c signals in rat
brain neurons after transient MCAO.
Brain Res 958, 83-8
95) Li Y., Chopp M., Jiang N., Zhang Z.G., Zaloga C. (1995)
Induction of DNA fragmentation after 10 to 120 minutes of focal cerebral ischemia in
rats. Stroke 26, 1252-7
96) Lindsberg PJ, Carpen O, Pateau A, Karjalainen-Lindsberg ML, Kaste M (1996)
Endothelial ICAM-1 exression associated with inflammatory cell response in human
ischemic stroke.
Circulation 94, 939-45
82
97) Linnik M.D., Miller J.A., Sprinkle-Cavallo J., Mason P.J., Thompson F.Y.,
Montgomery L.R., Schroeder K.K. (1995)
Apoptotic DNA fragmentation in the rat cerebral cortex induced by permanent middle
cerebral artery occlusion.
Brain Res Mol Brain Res 32, 116-24.
98) Lisk D.R., Grotta J.C., Lamki L.M., Tran H.D., Taylor J.W., Molony D.A., Barron
B.J. (1993)
Should hypertension be treated after acute stroke? A randomized controlled trial using
single photon emission computed tomography.
Arch Neurol 50, 855-582
99) Lockshin R.A., Williams C.M. (1964)
Programmed cell death.
J Insect physiol 10, 643-649
100) Mantovani A., Bussolino F., Dejana E. (1992)
Cytokine regulation of endothelial cell function.
FASEB J 6, 2591-2599
101) Martin S.J., Reutelingsperger C.P.M., McGahon A.J., Rader J.A., Van Schie R.,
LaFace D.M., Green D.R. (1995)
Earlier distribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of
apoptosis regardless of the initiating stimulus
J Exp Med 182, 1545-1556
102) MAST-I – Multicenter Acute Stroke Trial – Italy Group (1995)
Randomized controlled trial of streptokinase, aspirin, and combination of both in the
treatment of acute ischemic stroke.
Lancet 346, 1509-1514
103) Masuhr F., Busch M., Einhäupl K.M. (1998)
Differences in medical and surgical therapy for stroke prevention between leading
experts in North America and Western Europe.
Stroke 29, 339-345
104) Mickelson J.K., Kukielka G., Bravenec J.S., Mainofli E., Rothlein R., Hawkins
H.K., Kelly J.H., Smith C.W. (1995)
Differential expression and release of CD54 induced by cytokines.
Hepatology 22, 866-875
105) Minami M., Jin K.L., Li W., Nagayama T., Henshall D.C., Simon R.P. (2000)
Bcl-w expression is increased in brain regions affected by focal cerebral ischemia in the
rat.
Neurosci Lett 279, 193-5.
106) Möckel M., Heller G., Müller C., Störk T. (2000)
C-reaktives Protein als unabhängiger Prognosemarker beim akuten Koronarsyndrom im
Vergleich zu Troponin T.
Z Kardiol 89, 658-66
83
107) Morgenstern LB (2001)
What have we learned from clinical neuroprotective trials?
Neurology 57 (Suppl 2), 45-47
108) Moskowitz M.A., Lo E.H. (2003)
Neurogenesis and apoptotic cell death.
Stroke 34, 324-6
109) Muir W.K., Weir C.J., Alwan W., Squire I.B., Lees K.R. (1999)
C-reaktive protein and outcome after ischemic Stroke.
Stroke 30, 981-985
110) Namura S., Zhu J., Fink K., Endres M., Srinivasan A., Tomaselli K.J., Yuan J.,
Moskowitz M.A. (1998)
Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral
ischemia. J Neurosci 18, 3659-68.
111) NINDS - The National Insitute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke
Study Group (1995)
Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke.
N Engl J Med 333, 1581-1587
112) Onteniente B., Couriaud C., Braudeau J., Benchoua A., Guegan C. (2003)
The mechanisms of cell death in focal carebral ischemia highlight neuroprotective
perspectives by anti-cyspase therapy.
Biochem Pharmacol 66, 1643-9
113) Oppenheim J.J., Gery I. (1993)
From lymphodrek to interleukin 1 (IL-1).
Immunol Today 14, 232-234
114) Petitti D.B., Sidney S., Bernstein A., Wolf S., Quesenberry C., Ziel H.K. (1996)
Stroke in users of low-dose oral contraceptives.
N Eng J Med 335, 8-15
115) Plehn J., Davis B.R., Sacks F.M., Rouleau J.L., Pfeffer M.A., Bernstein V., Cuddy
T.E., Moye L.A., Piller L.B., Rutherford J., Simpson L.M., Braunwald F. (1999)
Reduction of stroke incidence after myocardial infarction with pravastatin.
Circulation 99, 216-223
116) Poeck K., Hacke W. (1998)
Neurologie
Zehnte Auflage 1998, S. 183ff, Springer Verlag, ISBN 3-540-63028-7
117) Poulter N.R., Chang C.L., Farley T.M., Marmot M.G., Meirik O. (1999)
Effect on stroke of different progestagens in low oestrogen dose oral contraceptives:
WHO Collaborative Study of Cardiovascular Disease and Steroid Hormone
Contraception.
Lancet 354, 301–302
84
118) Rau S.W., Dubal D.B., Bottner M., Gerhold L.M., Wise P.M. (2003)
Estradiol attenuates programmed cell death after stroke-like injury.
J Neurosci 23, 11420-6
119) Richards Carl D. (1998)
Interleukin – 6. Cytokines. Edited by Anthony R, Mire-Sluis aund Robin Thorpe.
Academic Presss Lim., San Diego, London. ISBN 0-12-498340-5
120) Rodgers H., Aitken P.D., French J.M., Curless R.H., Bates D., James O.F. (1993)
Alcohol and stroke.
Stroke 24, 1473-1477
121) Rosenbaum D.M., Gupta G., D’Amore J., Singh M., Weidenheim K., Zhang H.,
Kessler J.A. (2000)
Fas (CD95/APO-1) plays a role in the pathophysiology of focal cerebral ischemia.
J Neurosci Res 61, 686-692 (2000).
122) Sairanen T.R., Lindsberg P.J., Brenner M., Siren A.L. (1997)
Global forebrain ischemia results in differential cellular expression of interleukin-1beta
(IL-1beta) and ist receptor at mRNA and protein level.
123) SALT Collaborative Group (1991)
Swedish Aspirin Low-dose Trial of 75 mg aspirin as secondary prophylaxis after
cerebrovascular ischaemic events.
Lancet 338, 1345-1349
124) Schellinger P.D., Orbeck E., Hacke W. (1997)
Antithrombotische Therapie nach zerebraler Ischämie.
Fortschr Neurol Psychiat 65, 425-434
125) Schindler R., Mancilla J., Endres S., Gorbani R., Clark S.C., Dinarello C.A. (1990)
Correlations and interactions in the production of interleukin-6 (IL-6), IL-1 and tumor
necrosis factor in human blood mononuclear cells: IL-6 suppresses IL-1 and TNF.
Blood 75, 40-47
126) Schulz D.R., Anroldi P.I. (1990)
Properties of four acute phase reactants.
Semin Arthritis Rheum 20, 129-47
127) Schürmann G. (1997)
Zelladhäsion.
Der Chirurg 68, 477-487
128) Schwartz S., Petitti D.B., Siscovick D.S., Longstreth W.T., Sidney S.,
Raghunathan T.E., Quesenberry C.P., Kelaghan J. (1998)
Stroke and use of low dose oral contraceptives in young women.
Stroke 29, 2277-2284
85
129) Schwarz S., Georgiadis D., Schwab S., Aschoff A., Hacke W. (2002)
Aktuelle Konzepte der Intensivtherapie des raumfordernden Mediainfarktes.
130) SHEP Cooperative Research Group (1991)
Prevention of stroke by antihypertensive drug treatment in older persons with isolated
systolic hypertension: final results of the systolic hypertension in the elderly program
(SHEP).
JAMA 265, 3255-3264
131) Shyu K.G., Chang H., Linn C.C. (1997)
Serum levels of intercellular adhesion molecule-1 and E-Selektin in patients with acute
ischaemic stroke.
J Neurol 244, 90-93
132) SPIRIT – The Stroke Prevention in Reversible Ischemia Trial Study Group (1997)
A randomized trial of anticoagulants versus aspirin after cerebral ischemia of presumed
arteial origin.
133) SSSS - Scandinavian Simvastatin Survival Study Group (1994)
Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease:
the Scandinavian Simvastatin Survival Study.
Lancet 344, 1383-1389
134) Steiner T., Hennes H.J., Kretz M., Hacke W. (2000)
Akute klinische Schlaganfallbehandlung.
Anästhesist 49, 2-8
135) Steller H. (1995)
Mechanisms genes of cellular suicide.
Science 267, 1445-1449
136) Tarkowski E., Rosengren L., Blomstrand C., Wikkelso C., Jensen C., Ekholm S.,
Tarkowski A. (1995)
Early intrathecal production of interleukin-6 predicts the size of brain lesion in stroke.
Stroke 26, 1393-8.
137) Tata J.R. (1966)
Requirement for RNA and protein synthesis for induced regression of tadpole tail in
organ culture.
Dev Biol 13, 77-94
138) Taylor T.N., Davis P.H., Torner J.C., Holmes J., Meyer J.W., Jacobson M.F.
(1996)
Lifetime cost of stroke in the United States.
Stroke 67, 1459-1466
86
139) Tilg H., Dinarello C.A., Mier J.W. (1997)
IL-6 and APPs: anti-inflammatory and immunosuppressive mediators
Immunol Today 18, 428-432
140) Tilg H., Trehu E., Atkins M.B., Dinarello C.A., Mier J.W. (1994)
Interleukin-6 (IL-6) as an anti-inflammatory cytokine: induction of circulating IL-1
receptor antagonist and soluble tumor necrosis factor receptor p55.
Blood 83, 113-118
141) Toghi H., Konno S., Takahashi S., Koizumi D., Kondo R., Takahashi H. (2000)
Activated coagulation / fibrinolysis system and platelet function in acute thrombotic
stroke patients with increased C-reaktiv protein levels.
Thromb Res 100, 373-379
142) UK-TIA Study Group (1991)
The United Kingdom transient ischemic attack aspirin trial: Final results.
J Neurol Neurosurg Psychiatry 54, 1044-1054
143) Varsanyi M. (1994)
Biochemisch-molekularbiologisches Praktikum für Mediziner.
3. verbesserte Auflage. Universitätsverlag Brockmeyer, Bochum. ISBN 3-88339-978-7
144) Van den Eijnde S.M., Boshard L., Reutelingsperger C.P.M., De Zeeuw C.I.,
Vermeij-Keers C. (1997)
Phosphatidylserine plasma membrane asymmetry in vivo: A pancellular phenomenon
which alters during apoptosis.
Cell Death Diff 4, 311-316
145) Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C.A. (1995)
A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression
on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V.
J Immunol Methods 184, 39-51
146) Vila N., Castillo J., Davalos A., Chamorro A. (2000)
Proinflammatory Cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke.
Stroke 31, 2325-29
147) Warren M.C., Bump E.A., Medeiros D., Braunhut S.J. (2000)
Oxidative stress-induced apoptosis of endothelias cells.
Free Radic Biol Med 29, 537-547
148) Williams G.R., Jiang J.G., Matchar D.B., Samsa G.P. (1999)
Incidence and occurrence of total (first-ever and recurrent) stroke.
Stroke 30, 2523-2528
149) Wilson P.W.F., Hoeg J.M., D’Agostino R.B. (1997)
Cumulative effects of high cholesterol levels, high blood pressure and cigarette smoking
on carotid stenosis.
N Eng J Med 337, 516-522
87
150) Wyllie A.H. (1980)
Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous
endonuclease activation.
Nature 284, 555-556
151) Zheng Z., Zhao H., Steinberg G.K., Yenari M.A. (2003)
Cellular and molecular events underlying ischemia-induced neuronal apoptosis.
Drugs News Perspect 16, 497-503
152) Zhu C., Wang X., Cheng X., Qui L., Xu F., Simbruner G., Blomgren K. (2004)
Post-ischemic hypothermia-induced tissue protection and diminished apoptosis after
neonatal cerebral hypoxia-ischemia.
Brain Res 16, 996,67-75
153) Zipp F., Weller M., Calabresi P.A., Frank J.A., Bash C.N., Dichgans J., McFarland
H.F., Martin R. (1998)
Increased serum levels of soluble CD95 (APO-1/Fas) in relapsing-remitting multiple
sclerosis.
88
Danksagung
Herrn Dr. med. Sebastian Schimrigk danke ich für die stets anwesende
wissenschaftliche Betreuung, für die Übermittlung neuroimmunologischer Kenntnisse,
für verständnisvolle Geduld und motivierende Unterstützung bei der Erstellung dieser
Arbeit.
Herrn Prof. Dr. med. H. Przuntek danke ich für die Überlassung des Themas, für die
begeisternde Lehre, die meine Entscheidung meine berufliche Zukunft im Fach
Neurologie zu finden bekräftigte, und für Verständnis und Vertrauen welche er mir als
jungen Mitarbeiter entgegenbrachte.
Hernn Prof. Dr. med. Th. Büttner danke ich für seine Anregung, neuroimmunologische
Aspekte bei Schlaganfallpatienten zu berücksichtigen.
Frau Dr. rer. nat. Maike Rieks danke ich für die Anleitung in die Durchflusszytometrie
und für die stets freundliche Betreuung im neuroimmunologischen Labor.
Meinen Eltern, meiner Schwester Maria, Nektarios, Petros und Annabella danke ich für
Motivation und Unterstützung, womit sie zur Fertigstellung dieser Arbeit entscheidend
beigetragen haben.
89
Lebenslauf
17. Januar 1974
Geboren in Wissen an der Sieg
1979 – 1982
Griechische Grundschule
1982 – 1985
Grundschule und Orientierungsstufe in Betzdorf
1985 – 1993
Freiherr-von-Stein-Gymnasium Betzdorf
Juni 1993
Allgemeine Hochschulreife
Oktober 1993
Beginn des Studiums der Humanmedizin
an der Ruhr-Universität Bochum
Mai – Juli 1999
Ausbildung im Institute of Acupuncture,
Kalubowila University Hospital, Colombo, Sri Lanka
1999 – 2000
Praktisches Jahr in der Chirurgischen und Medizinischen Klinik
im American-Hellenic-Educational-Progressive-AssociationHospital der Aristoteles Universität Thessaloniki, Hellas
Mai – Sept. 2000
Praktisches Jahr in der Neurologischen Universitätsklinik
der Ruhr-Universität im St. Josef Hospital Bochum
November 2000
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Dezember 2000
Beginn der Tätigkeit als Arzt im Praktikum in der Neurologischen
Klinik der Ruhr-Universität im St.Josef-Hospital Bochum
September 2002
Approbation als Arzt
Seit Sept. 2002
Assistenzarzt in der Neurologischen Klinik der Ruhr-Universität
im St. Josef-Hospital Bochum

Erfassung der Apoptoserate von Lymphozyten und Granulozyten

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