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Untersuchungen zur Beeinflussung des
Sekundärmetabolismus von Streptomyceten
durch das bldA-Gen
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Arne Gessner
aus Karlsruhe
2014
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Prof. Dr. Thorsten Koslowski
Referent:
Prof. Dr. Andreas Bechthold
Korreferent:
Prof. Dr. Thorsten Friedrich
Datum der Promotion:
06.02.2014
Gutta cavat lapidem non vi sed saepe cadendo.
Steter Tropfen höhlt den Stein.
Ovid
Für meine Großmutter
Wissenschaftliche Publikationen
Lindsay Kalan, Arne Gessner, Maulik N. Thaker, Nicholas Waglechner, XiMing Zhu, Anjuli Szawiola,
Andreas Bechthold, Gerry D. Wright, David L. Zechel: A cryptic biosynthetic gene cluster in
Streptomyces calvus is expressed upon complementation with a functional bldA gene. Chem.
Biol. (2013), 20, 10, 1214-1224
Arne Gessner, David L. Zechel, Andreas Bechthold: Overexpression of the bldA gene activates
cryptic biosynthetic gene clusters in seven Streptomyces strains. (in Vorbereitung)
Vorträge
Streptomyces calvus – from bald to beautiful, Internationaler VAAM Workshop 2011, 09/2011,
Bonn
Streptomyces calvus – from bald to beautiful, Doktorandenseminar 2011, 10/2011, Freiburg
Natural products from Streptomycetes as putative inhibitors of actin polymerization, Structural
Biology group meeting, 07/2012, Kingston, ON, Kanada
Poster
Streptomyces calvus – from bald to beautiful, Tag der Forschung der Universität Freiburg 2011,
07/2011, Freiburg
To be bald or not to be bald – the bldA gene as a tool to activate cryptic biosynthetic gene
clusters in Streptomycetes, 1st European Conference on Natural Products, 09/2013,
Frankfurt/Main
Bypassing regulatory mechanisms in Streptomycetes to activate cryptic biosynthetic gene
clusters, DPhG Jahrestagung 2013, 10/2013, Freiburg
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ..................................................................... 1
2 Einleitung ................................................................................... 3
2.1
Streptomyceten - Bakterien mit einem außergewöhnlichen
Lebenszyklus und Sekundärmetabolismus ......................................... 3
2.1.1
Lebenszyklus der Streptomyceten ................................................................... 3
2.1.2
Sekundärmetabolismus der Streptomyceten .................................................. 5
2.2
Die Naturstoffklasse der Polyketide ................................................... 6
2.2.1
Polyketidsynthasen vom Typ I ......................................................................... 7
2.2.2
Polyketidsynthasen vom Typ II ........................................................................ 8
2.2.3
Weitere Polyketidsynthasen und Hybridformen ............................................. 9
2.3
Die Naturstoffklasse der nicht-ribosomal gebildeten Peptide .......... 10
2.4
Regulation des Sekundärmetabolismus in Streptomyceten ............. 13
2.4.1
Verschiedene Einflüsse auf die Regulation des Sekundärmetabolismus ...... 13
2.4.2
Clusterspezifische Regulatoren ...................................................................... 13
2.4.3
BldA – eine tRNA mit regulatorischer Funktion ............................................. 14
2.5
Komplementierung eines Defekts des bldA-Gens in S. calvus .......... 16
3 Zielsetzung ............................................................................... 19
4 Material und Methoden ........................................................... 20
4.1
Laborgeräte ..................................................................................... 20
4.2
Chemikalien, Medienbestandteile, Enzyme und Kits ........................ 21
4.2.1
Chemikalien, Medienbestandteile, Lösungsmittel und
Verbrauchsmaterialien .................................................................................. 21
4.2.2
Enzyme ........................................................................................................... 23
4.2.3
Kits.................................................................................................................. 23
4.3
Lösungen, Nährmedien und Antibiotika-Lösungen .......................... 24
4.3.1
Lösungen zur DNA Isolierung ......................................................................... 24
4.3.2
Lösungen für Agarosegelelektrophorese ....................................................... 24
I
Inhaltsverzeichnis
4.3.3
Lösungen für Blau-Weiß-Selektion ................................................................ 25
4.3.4
Lösungen zur Herstellung von Streptomyces spp. Dauerkulturen ................ 25
4.3.5
Nährmedien ................................................................................................... 25
4.3.6
Antibiotika-Lösungen ..................................................................................... 27
4.4
Verwendete Mikroorganismen ........................................................ 28
4.4.1
Escherichia coli spp. ....................................................................................... 28
4.4.2
Bacillus subtilis ............................................................................................... 28
4.4.3
Streptomyces spp. .......................................................................................... 28
4.4.4
Pilz-Stämme ................................................................................................... 29
4.5
Verwendete Plasmide, Vektoren und Primer ................................... 29
4.5.1
Verwendete Plasmide und Vektoren ............................................................. 29
4.5.2
Selbsterstellte Plasmide und Vektoren .......................................................... 30
4.5.3
Verwendete Primer ........................................................................................ 30
4.6
Molekularbiologische Methoden ..................................................... 30
4.6.1
Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Analytik von DNA .................... 30
4.6.2
Methoden zur Klonierung von DNA ............................................................... 32
4.6.3
Methoden zum Transfer von DNA ................................................................. 32
4.6.4
Amplifizierung von DNA ................................................................................. 34
4.7
Geninaktivierung in Streptomyces spp. ............................................ 35
4.7.1
4.8
Geninaktivierung mittels Insertionsmutagenese in S. calvus pTESa-bldA ..... 35
Bedingungen zur Kultivierung von Mikroorganismen....................... 36
4.8.1
Kultivierung von E. coli ................................................................................... 36
4.8.2
Kultivierung von B. subtilis ............................................................................. 37
4.8.3
Kultivierung von Streptomyces spp................................................................ 37
4.9
Isolierung und Analytik von Naturstoffen......................................... 38
4.9.1
Extraktion von Naturstoffen mit Ethylacetat ................................................. 38
4.9.2
Extraktion von Naturstoffen mit Diaion HP-20 .............................................. 39
4.9.3
Säulenchromatographie an Kieselgel ............................................................ 39
4.9.4
Säulenchromatographie an Sephadex LH-20................................................. 40
4.9.5
Präparative HPLC ........................................................................................... 40
4.9.6
Präparative MPLC........................................................................................... 42
II
Inhaltsverzeichnis
4.9.7
Analytische HPLC/ESI-MS ............................................................................... 42
4.9.8
Untersuchungen zur Bioaktivität ................................................................... 43
4.10 Software, Datenbanken und Internetservices .................................. 44
5 Ergebnisse ................................................................................ 45
5.1
Funktionelle Charakterisierung des Biosynthesegenclusters des
Polyens Annimycin in S. calvus ......................................................... 45
5.1.1
Geninaktivierungen zur Identifizierung des Biosynthesegenclusters für
Annimycin ...................................................................................................... 45
5.1.2
Produktionsanalyse ........................................................................................ 46
5.1.3
Inaktivierungsnachweis für S. calvus pTESa-bldA x 3100 .............................. 47
5.1.4
Analyse des Biosynthesegenclusters ............................................................. 49
5.1.5
Analyse des Produktionsverlaufs der Annimycin Isomere ............................ 52
5.2
Bioaktivität von Annimycin .............................................................. 54
5.2.1
HPLC-Reinigung von Annimycin ..................................................................... 54
5.2.2
Bioaktivitätstest mit Annimycin ..................................................................... 56
5.2.3
Co-Kultivierung von S. calvus mit S. coelicolor .............................................. 57
5.3
Identifizierung eines nicht-ribosomal gebildeten Peptids in S. calvus
pTESa-bldA x 3100 ........................................................................... 60
5.3.1
Isolierung von 3 durch Mitteldruck-Chromatographie.................................. 61
5.3.2
Strukturaufklärung von 3 mittels NMR-Spektroskopie ................................. 61
5.3.3
Analyse der Genomsequenz von S. calvus auf mögliche
Biosynthesegencluster für WS9326A............................................................. 65
5.4
Konstitutive Expression des bldA-Gens in S. albovinaceus ............... 70
5.4.1
Auswirkungen auf den Sekundärmetabolismus und die Morphologie ......... 70
5.4.2
Produktion und Isolierung von B4 ................................................................. 71
5.4.3
Strukturaufklärung von B4 mittels NMR-Spektroskopie ............................... 73
5.4.4
Bioaktivität von Streptophenazin A ............................................................... 76
5.5
Konstitutive Expression des bldA-Gens in S. glomeroaurantiacus .... 77
5.5.1
5.5.2
Produktion und Isolierung von M2 ................................................................ 78
5.5.3
Strukturaufklärung von M2 mittels NMR- und HR-MS-Spektroskopie ......... 79
5.5.4
Bioaktivität von Glomeromycin ..................................................................... 85
III
Inhaltsverzeichnis
5.6
Konstitutive Expression des bldA-Gens in S. curacoi ........................ 86
5.6.1
5.6.2
Produktion und Isolierung von J2 .................................................................. 87
5.7
Konstitutive Expression des bldA-Gens in S. orinoci,
S. olivochromogenes, S. yanii und S. asterosporus sowie weiteren
Stämmen ......................................................................................... 89
5.7.1
Auswirkungen auf S. orinoci........................................................................... 89
5.7.2
Auswirkungen auf S. olivochromogenes ........................................................ 90
5.7.3
Auswirkungen auf S. yanii .............................................................................. 91
5.7.4
Auswirkungen auf S. asterosporus ................................................................. 92
5.7.5
Auswirkungen auf weitere Stämme .............................................................. 93
6 Diskussion ................................................................................ 94
6.1
Funktionelle Charakterisierung des Biosynthesegenclusters des
Polyens Annimycin in S. calvus ......................................................... 94
6.1.1
Inaktivierung des Biosynthesegenclusters von Annimycin ............................ 94
6.1.2
Analyse des Biosynthesegenclusters von Annimycin .................................... 95
6.1.3
Analyse des Produktionsverlaufs von Annimycin .......................................... 96
6.1.4
Untersuchungen zur Bioaktivität von Annimycin .......................................... 98
6.2
Identifizierung eines nicht-ribosomal gebildeten Peptids in S. calvus
pTESa-bldA x 3100 und S. calvus #9 ............................................... 100
6.2.1
Analyse der Genomsequenz auf mögliche Biosynthesegencluster ............. 100
6.2.2
Potentielle Biosynthese des Peptidgrundgerüsts von WS9326A ................ 104
6.3
Konstitutive Expression des bldA-Gens in weiteren StreptomycetenStämmen ....................................................................................... 107
6.3.1
Auswirkungen auf die Morphologie und den Sekundärmetabolismus ....... 107
6.3.2
Auswirkungen auf den Sekundärmetabolismus von S. albovinaceus ......... 111
6.3.3
Auswirkungen auf den Sekundärmetabolismus von S. glomeroaurantiacus ....
...................................................................................................................... 113
6.4
Schlussfolgerung ............................................................................ 115
7 Literaturverzeichnis................................................................ 116
8 Anhang ................................................................................... 126
IV
Inhaltsverzeichnis
8.1
Abkürzungsverzeichnis ................................................................... 126
8.2
Plasmidkarten ................................................................................ 130
8.2.1
pUC19-del1697 ............................................................................................ 130
8.2.2
pUC19-del3100 ............................................................................................ 130
8.2.3
pTESa ............................................................................................................ 131
8.2.4
pTESa-bldA ................................................................................................... 131
8.3
NMR-Spektren ............................................................................... 132
8.3.1
1D-NMR Spektren von WS9326A ................................................................ 132
8.3.2
1D- und 2D-NMR Spektren von Streptophenazin A (B4) ............................. 134
8.3.3
1D- und 2D-NMR Spektren von Glomeromycin (M2) .................................. 139
9 Danksagungen ........................................................................ 146
10 Bildungsgang .......................................................................... 148
V
Zusammenfassung
1 ZUSAMMENFASSUNG
Das bldA-Gen spielt eine besondere Rolle bei morphologischen und physiologischen Prozessen im
Lebenszyklus von Streptomyceten. Es codiert für eine tRNA, welche als einzige tRNA effektiv das
in Streptomyceten sehr selten vorkommende TTA-Codon translatieren kann, und übernimmt
dadurch eine regulatorische Funktion auf Translationsebene. TTA-Codons sind überrepräsentiert
in Genen, deren Produkte wichtige regulatorische Funktionen bei der morphologischen
Entwicklung und im Sekundärmetabolismus haben. Eine defekte bldA-tRNA sorgt bei
Streptomyceten für einen Ausfall der Bildung des Luftmycels und eine fehlende Biosynthese
diverser Sekundärmetaboliten. Bei Streptomyces calvus liegt ein dementsprechender Phänotyp
vor. Es wurde eine Mutation im bldA-Gen identifiziert, die zu einer funktionsunfähigen tRNA führt.
Nach Komplementierung des Gendefekts war es S. calvus möglich, Luftmycel auszubilden, und das
Sekundärmetabolitenprofil zeigte Veränderungen. Die neu gebildeten Metaboliten konnten als
4-Z-(cis)- und 4-E-(trans)-Polyene identifiziert werden und erhielten die Namen cis- bzw.
trans-Annimycin.
Im Rahmen dieser Arbeit war es möglich, das Biosynthesegencluster für Annimycin in S. calvus
experimentell zu identifizieren. Da das Cluster in keinem Gen ein TTA-Codon enthält, ist
anzunehmen, dass die Abhängigkeit der korrekten Genexpression von bldA indirekt sein muss.
Weiterhin wurden Untersuchungen zur Biosynthese eines cisund eines trans-Isomers dieses
Polyens durchgeführt, welche außergewöhnlicherweise gleichzeitig erfolgt. Dabei zeigte sich, dass
das Verhältnis der Isomere zueinander nicht konstant, sondern dynamisch ist. Bei weiteren
Untersuchungen wurde festgestellt, dass eine Mischung aus 90% cisund 10% trans-Annimycin
keine Bioaktivität gegen pathogene Mikroorganismen aufweist, jedoch die morphologische
Entwicklung einiger Actinobacteria behindert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass durch
Annimycin der Sekundärmetabolismus von Streptomyces coelicolor M145 verändert wurde.
Bei den Inaktivierungsexperimenten zur Identifizierung des Biosynthesegenclusters von
Annimycin fiel auf, dass die produzierte Menge eines weiteren Sekundärmetaboliten durch die
Komplementierung mit einem funktionsfähigen bldA-Gen und die Inaktivierung der AnnimycinBiosynthese beeinflusst wird. Dieser Metabolit wurde als das bereits aus
Streptomyces violaceusniger bekannte nicht-ribosomal gebildete Peptid WS9326A identifiziert,
das eine ungewöhnliche chemische Modifizierung eines Tyrosinrests besitzt. Basierend auf der
Struktur und den Genomdaten von S. calvus konnte ein Vorschlag für die potentielle Biosynthese
dieser Substanz gemacht werden. Das mögliche Biosynthesegencluster von WS9326A zeigt einen
äußerst ungewöhnlichen Aufbau für eine nicht-ribosomale Peptidsynthase.
In weiteren Experimenten wurde der Einfluss des bldA-Gens auf den Sekundärmetabolismus von
13 Streptomyceten-Stämmen aus der Stammsammlung des DSMZ untersucht, speziell in Hinsicht
auf die mögliche Aktivierung stiller Biosynthesegene. In bisher veröffentlichten Untersuchungen
wurde gezeigt, dass eine Inaktivierung des bldA-Gens den Sekundärmetabolismus größtenteils
zum Erliegen bringt. Die Auswirkungen einer konstitutiven Expression dieses Gens wurden
allerdings noch nicht untersucht. Es zeigte sich, dass die Morphologie der untersuchten Stämme
unverändert blieb. Bei sieben der 13 Stämme veränderte sich jedoch das
Sekundärmetabolitenprofil in verschiedenen Produktionsmedien deutlich, so dass mehrere neue
1
Zusammenfassung
Substanzen detektiert werden konnten. Zwei dieser Substanzen wurden isoliert und ihre
chemische Struktur durch NMR- und HR-MS-Spektroskopie aufgeklärt. Bei einer der Substanzen
handelt es sich um das bereits aus einem marinen Streptomyceten, Streptomyces sp. HB202,
isolierte und bekannte Streptophenazin A. Die andere Substanz ist ein bisher unbekannter Stoff
und erhielt den Namen Glomeromycin. Es konnte somit gezeigt werden, dass die konstitutive
Expression des bldA-Gens ein wirksames Werkzeug zur Identifizierung neuartiger Naturstoffe aus
Streptomyceten sein kann. Ein Vorteil dieser Herangehensweise ist, dass eine Vielzahl an Genen in
unterschiedlichen Stämmen aktivierbar ist und somit, auch in Unkenntnis von Genomdaten, das
Potential von Streptomyceten besser genutzt werden kann.
2
Einleitung
2 EINLEITUNG
2.1 STREPTOMYCETEN - BAKTERIEN MIT EINEM AUßERGEWÖHNLICHEN LEBENSZYKLUS UND
SEKUNDÄRMETABOLISMUS
Streptomyceten sind aerobe, ubiquitär vorkommende Bakterien aus der Gattung der
Actinobacteriae, deren erster Vertreter sich vor ca. 450 Millionen Jahren entwickelte (Chater
2006). Sie besitzen die Fähigkeit, beispielsweise Pflanzenabfälle zu verdauen und somit für sich
nutzbar zu machen, spielen also eine große Rolle beim Abbau toten organischen Materials. Eine
Besonderheit dieser Bakterien ist, dass ihre DNA linear vorliegt und nicht, wie sonst üblich, einen
zirkulären Aufbau besitzt. Zusätzlich können lineare oder zirkuläre Plasmide vorkommen. Der
Anteil an Guanin- und Cytosin-Basen in der DNA beträgt mehr als 70%, verteilt auf etwa 7-10
Millionen Basenpaare insgesamt. Beispielsweise hat das Genom von Streptomyces coelicolor A3(2)
eine Größe von 8.667.507 bp (Bentley et al. 2002) oder das von Streptomyces avermitilis MA-4680
9.025.608 bp (Omura et al. 2001). Aufgrund ihrer hochkompetitiven Umwelt haben
Streptomyceten einen außerordentlich reichhaltigen Sekundärmetabolismus entwickelt, was sie
spätestens seit der Isolierung von Streptomycin aus dem Filtrat von Fermentationskulturen von
Streptomyces griseus (Waksman 1953) zum Gegenstand intensiver Forschung macht.
2.1.1 LEBENSZYKLUS DER STREPTOMYCETEN
Unter Bakterien ist das am weitesten verbreitete Prinzip der Vermehrung die binäre Teilung, wie
sie v.a. durch Escherichia coli bekannt ist. Dennoch gibt es zahlreiche alternative
Vermehrungsstrategien (Angert 2005). Die Streptomyceten, wie auch andere Actinobacteria,
erinnern in ihrem Wachstum eher an Pilze als an Bakterien (Abbildung 2-1). Die
Wachstumsgeschwindigkeit von Streptomyceten kann von Spezies zu Spezies variieren. Es gibt
aber in fast allen Fällen das gleiche Wachstumsmuster. Wenn eine freie Streptomyceten-Spore
günstige Lebensbedingungen vorfindet, beispielsweise das Vorhandensein löslicher Nährstoffe
und ausreichend Wasser, beginnt sie auszukeimen und ein verzweigtes, fadenartiges Mycel zu
bilden. Das Wachstum des Mycels ist ausgeprägt polar, es erfolgt fast nur durch
Spitzenwachstum, unterbrochen durch gelegentliche Verzweigungen. Sind die löslichen
Nährstoffe weitgehend aufgebraucht, was im Zentrum des Mycels früher passiert als am Rand,
bildet sich ein Luftmycel aus. Hierbei wachsen Bakterienstränge senkrecht in die Luft, die sich
nach einer Weile segmentieren. Diese Segmente wiederum wandeln sich in Sporen um, was als
morphologische Differenzierung bezeichnet wird.
3
Einleitung
Abbildung 2-1: Grafische Darstellung des typischen Lebenszykluses von Streptomyceten mit Ausbildung von
Substratmycel, Luftmycel und Sporen (modifiziert nach Angert 2005).
Diese komplexen Vorgänge erfordern viele fein aufeinander abgestimmte Prozesse. Für die
Ausbildung des Luftmycels ist es beispielsweise nötig, die Spitzen des Mycels mit einer
hydrophoben Hülle zu umgeben, da sonst kein Durchbrechen der Oberflächenspannung des
Wachstumsmediums möglich wäre. Diese Umhüllung wird, soweit bekannt, durch das Protein
SapB, die Chaplins und die Rodlins gewährleistet (Flärdh und Buttner 2009). Die Biosynthese
dieser Proteine ist wiederum durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren reguliert, was
anschaulich verdeutlicht, wie differenziert die Biosynthese solcher Stoffe erfolgen muss. Sporen
von Streptomyceten dienen als Dauerformen zur Überbrückung ungünstiger Lebensbedingungen
und zur Verbreitung, jedoch besitzen sie nicht dieselbe Robustheit wie Endosporen verschiedener
Bacillus-Spezies (McCormick und Flärdh 2012). Die morphologische Differenzierung ist meist
assoziiert mit einer physiologischen Differenzierung, bei der der Stoffwechsel weg von der
Bereitstellung von Stoffen für das reine Wachstum, hin zu einem für jede Spezies einzigartigen
Sekundärmetabolismus geht. Diese Umstellung kann als dramatisch bezeichnet werden, da fast
jede metabolische Aktivität einer Streptomycetenzelle betroffen ist (Nieselt et al. 2010). Durch
den Sekundärmetabolismus wird eine Vielzahl an Stoffen gebildet, deren Sinn u.a. darin zu
bestehen scheint, aufgrund ihrer Bioaktivität das Mycel und Nährstoffe vor Fressfeinden und
Konkurrenten zu schützen (Chater 2006). Alternativ könnten diese Stoffe aber auch eine Rolle in
der Kommunikation innerhalb einer Kolonie und mit anderen Lebewesen im gleichen Lebensraum
spielen (Davies 2011).
4
Einleitung
2.1.2 SEKUNDÄRMETABOLISMUS DER STREPTOMYCETEN
Die Menschheit hat vom Sekundärmetabolismus der Streptomyceten durch Gewinnung wichtiger
Wirkstoffe ungemein profitiert. Heutzutage gibt es kaum ein Therapiefeld, in dem nicht ein
Wirkstoff aus einem Streptomyceten, oder ein semisynthetisches Derivat von selbigem, zum
Einsatz kommt. Es handelt sich dabei nicht nur um Antibiotika wie beispielsweise Vancomycin
(Baltz 2008), sondern auch um Antimykotika (z.B. Amphotericin B) (Caffrey et al. 2008),
Zytostatika (z. B. Mitomycin C) (Olano et al. 2009), Antiparasitika (z. B. Ivermectin) (Shiomi und
Omura 2004) oder Immunsuppressiva (z. B. Rapamycin) (Graziani 2009). Diese Liste ließe sich
lange fortsetzen und verdeutlicht die enorme Bedeutung der Streptomyceten. Biosynthesegene
für Sekundärmetaboliten liegen in sogenannten Clustern auf dem Bakterienchromosom oder den
Plasmiden vor (Liu et al. 2013). Neben den Genen, die für strukturelle Enzyme codieren, existieren
auch solche, die in die Regulation der Genexpression oder Resistenzmechanismen eingebunden
sind. Dieser geclusterte Aufbau erleichtert die Analyse von Stoffwechselwegen, die zu bestimmten
Metaboliten führen. Zusätzlich lässt sich aus dem Vorhandensein entsprechender Gene auf das
mögliche Potential zur Biosynthese von Sekundärmetaboliten schließen.
Das bisher bekannte Potential zur Biosynthese nützlicher Sekundärmetaboliten der
Streptomyceten scheint nur ein kleiner Anteil am tatsächlich vorhandenen zu sein. Als Anfang der
2000er Jahre die ersten kompletten Genome sequenziert wurden, fiel auf, dass eine Vielzahl an
Biosynthesegenclustern existiert, denen kein aus den Fermentationskulturen isolierbares Produkt
zuzuordnen ist (Bentley et al. 2002; Omura et al. 2001). Inzwischen konnten für S. coelicolor A3(2)
29 und für S. avermitilis 37 Cluster identifiziert werden (Nett et al. 2009), von denen bisher nur
wenige einem Produkt zugeordnet werden konnten. In anderen Streptomyceten-Spezies zeigt sich
ein ähnliches Bild. Es besteht also ein großes Interesse, diese sogenannten stillen oder kryptischen
Biosynthesegencluster zu aktivieren und damit bisher ungenutztes Potential zu nutzen. Im Laufe
der letzten Jahre wurden zahlreiche Strategien entwickelt um dies zu ermöglichen
(zusammengefasst von Baltz 2011 oder Davies 2011). Es handelt sich dabei um verschiedene
Ansätze, wie die Manipulation der Regulation des Sekundärmetabolismus auf genetischer Ebene
(s. auch 2.4), Ausschalten kompetitiver Stoffwechselwege, Manipulationen des Ribosoms zur
Erhöhung der Translationseffizienz oder die Expression einzelner Cluster in heterologen Wirten.
Da die Analyse von Genomen und die Vorhersage ihrer möglichen Produkte in letzter Zeit stetig
verbessert wurden, ist es auch möglich, gezielt nach Stoffen zu suchen, die zu bestimmten
Genclustern passen könnten.
Nicht nur vor dem Hintergrund, dass Antibiotika im klinischen Gebrauch zunehmend unwirksamer
werden, ist es eminent wichtig, die Entdeckung neuer potentieller Wirkstoffe voranzutreiben. Die
stillen Biosynthesegencluster in Streptomyceten bieten hierfür ein gewaltiges, ungenutztes
Reservoir an Stoffen, die nicht nur selbst als Wirkstoffe dienen, sondern auch wertvolle
Leitstrukturen bieten können. Auch lassen sich oft effiziente enzymatische Systeme identifizieren,
die komplexe chemische Reaktionen katalysieren und für Ansätze der kombinatorischen
Biosynthese nutzbar sind.
5
Einleitung
2.2 DIE NATURSTOFFKLASSE DER POLYKETIDE
Abbildung 2-2: Arzneistoffe, die zur Klasse der Polyketide gehören und aus Streptomyceten-Kulturen isoliert wurden.
Gezeigt sind Beispiele für verschiedene Klassen der Polyketide: Polyether (Monensin (Oliynyk et al. 2003)), Makrolide
(Oleandomycin (Rodriguez et al. 2001)), Anthracycline (Doxorubicin (Lomovskaya et al. 1999)), Enediyne
(Neocarzinostatin (Kobayashi et al. 2006)) und Polyene (Amphotericin B (Caffrey et al. 2008)).
Eine große Gruppe an medizinisch genutzten Sekundärmetaboliten aus Streptomyceten wird von
Polyketiden gebildet (Abbildung 2-2). Die Biosynthese der Polyketide durch Polyketidsynthasen
(PKS) weist große Ähnlichkeiten zur Biosynthese von Fettsäuren auf. Beide nutzen einfache
Bausteine, wie Acetyl-CoA bzw. Malonyl-CoA, die durch Claisen-Kondensationen miteinander
verknüpft werden. Einzelne Biosyntheseschritte werden von Domänen der Enzyme ausgeführt,
während die wachsende Polyketidkette an ein Acyl-Carrier-Protein (ACP) gebunden ist. Die
Knüpfung der Bindung erfolgt durch Ketosynthase-Domänen (KS), anschließend können
Ketoreductase-(KR), Dehydratase-(DH) und Enoylreductase-Domänen (ER) die Bindungen bis hin
zu vollständig reduzierten Acylketten prozessieren. Die Auswahl und Aktivierung der Bausteine
6
Einleitung
erfolgt durch Acyltransferase-Domänen (AT) und die Freisetzung des Produkts durch eine
Thioesterase-Domäne (TE). Entscheidende Unterschiede zu Fettsäuresynthasen sind die
Verwendung eines größeren Spektrums an Bausteinen, Aufbau verschiedener Kettenlängen und
vor allem das Vorhandensein verschiedener Reduktionsstufen der Acylkette (Hertweck 2009).
Dies ermöglicht das Einbringen verschiedener Stereozentren in ein Molekül, welche mit einer
hohen Spezifität gebildet werden, und trägt zu der enormen Strukturvielfalt dieser
Naturstoffklasse bei. Darüber hinaus finden häufig Zyklisierungsreaktionen statt und die
Polyketid-Grundgerüste werden weiter modifiziert, sei es durch Anhängen von Zuckerresten oder
durch Methylierungen und Oxidierungen. Es existieren verschiedene Typen von PKS, die in Tabelle
2-1 zusammengefasst sind und in den folgenden Abschnitten 2.2.1 bis 2.2.3 genauer eingeführt
werden.
Tabelle 2-1: Charakteristika und Vorkommen verschiedener PKS-Typen (adaptiert nach Hertweck 2009).
PKS-Typ
nicht-iterativer Typ I
Bausteine
ACP, verschiedene Extendereinheiten
iterativer Typ I
ACP, nur Malonyl-CoA Extendereinheiten
iterativer Typ II
ACP, nur Malonyl-CoA Extendereinheiten
Acyl-CoA, nur Malonyl-CoA
Extendereinheiten
ACP, Malonyl-CoA, Aminosäuren
iterativer Typ III
Hybridtypen
Organismen
Bakterien
hauptsächlich Pilze, einige
Bakterien
Bakterien
hauptsächlich Pflanzen,
einige Pilze und Bakterien
Bakterien und Pilze
2.2.1 POLYKETIDSYNTHASEN VOM TYP I
Bei PKS vom Typ I (PKS I) gilt es, die nicht-iterativen von den iterativen zu unterscheiden.
Während nicht-iterative PKS I fast ausschließlich in Prokaryoten vorkommen, finden sich iterative
PKS I vor allem in Pilzen und nur selten in Bakterien.
Die Funktionsweise nicht-iterativer PKS I wurde für die Biosynthese von Deoxyerythronolid B, dem
Polyketidgrundkörper von Erythromycin, detailliert untersucht (Abbildung 2-3 A) und gilt als
beispielhaft für nicht-iterative PKS I (Rawlings 1999). Es handelt sich dabei um einen großen
Multienzymkomplex mit modularem Aufbau. Ein Modul besteht aus mindestens einer KS-, ATund ACP-Domäne und kann mit zusätzlichen prozessierenden Domänen ausgestattet sein. Ein
Modul zeichnet sich im Normalfall für den Einbau und die Prozessierung eines Bausteins
verantwortlich. Man kann also über die Spezifität der AT-Domäne und dem Vorhandensein von
KR-, DH- oder ER-Domänen auf die Art und den Status der Prozessierung des Bausteins schließen
(Walsh 2004; Fischbach und Walsh 2006). Der Aufbau der gesamten PKS weist auf die Struktur des
gebildeten Produkts hin, was als Co-Linearität bezeichnet wird. Eine relativ häufig zu
beobachtende Abweichung von diesem Prinzip sind sogenannte trans-AT-Domänen. Dabei verfügt
ein Modul nicht selbst über eine AT-Domäne, sondern die Aktivierung der Bausteine erfolgt durch
eigenständige, nicht fest im Komplex eingebundene AT-Domänen (Cheng et al. 2003).
7
Einleitung
Abbildung 2-3: (A) Aufbau der nicht-iterativen PKS I zur Biosynthese von Deoxyerythronolid B. (B) Aufbau der iterativen
PKS I zur Biosynthese von Lovastatin (adaptiert nach Hertweck 2009).
Iterative PKS I lassen sich hauptsächlich bei Pilzen finden, bei Bakterien kommen sie seltener vor.
Sie sind hauptsächlich an der Biosynthese kleiner Aromaten oder Polyene beteiligt (Hertweck
2009). Ein gut untersuchtes Beispiel stellt die Biosynthese von Lovastatin dar (Abbildung 2-3 B).
Der Grad der Prozessierung der einzelnen Extendereinheiten kann trotz der iterativen
Verwendung des gleichen Moduls variieren, da KR-, DH-, ER- und auch Methyltransferase-(MT)Domänen optional genutzt werden. Gründe und Faktoren, die diese optionale Verwendung
bestimmen, sind weitgehend unbekannt.
2.2.2 POLYKETIDSYNTHASEN VOM TYP II
PKS vom Typ II (PKS II) wurden bisher nur in Bakterien gefunden. Sie verwenden alleinstehende
Enzyme, codiert durch einzelne Gene, die iterativ verwendet werden. Meist wird nur ein
minimales Set aus Enzymen verwendet, bestehend aus zwei KS-Domänen, wovon eine als
Kettenlängenfaktor dient, sowie einer ACP-Domäne. Zusätzliche Untereinheiten können
KR-Domänen, Zyklasen und Aromatasen sein, die das Faltungsmuster der wachsenden Kette und
somit die Struktur des Produkts bestimmen (Rawlings 1999; Hertweck et al. 2007). Ein gut
untersuchtes Beispiel zeigt Abbildung 2-4 mit der Biosynthese der Polyketidkette von Doxorubicin.
8
Einleitung
Abbildung 2-4: Biosynthese der Polyketidkette für das Anthracyclin Doxorubicin durch eine PKS II (adaptiert nach
Hertweck 2009).
2.2.3 WEITERE POLYKETIDSYNTHASEN UND HYBRIDFORMEN
PKS vom Typ III spielen bei Bakterien und Pilzen eine untergeordnete Rolle, sind aber sehr weit
verbreitet bei Pflanzen (Hertweck 2009). Sie variieren stark in der Auswahl der Startereinheiten
für die Polyketidbiosynthese. Weiterhin existieren einige Hybridformen der PKS-Typen
untereinander oder aus PKS und Fettsäuresynthasen. Besonders erwähnenswert sind Hybride aus
PKS und NRPS (s. 2.3). Durch derartige Hybride kann es zu einem Einbau von Aminosäuren in
Naturstoffe kommen, wodurch die Möglichkeiten der Diversifizierung deutlich erhöht werden
(Fischbach und Walsh 2006).
9
Einleitung
2.3 DIE NATURSTOFFKLASSE DER NICHT-RIBOSOMAL GEBILDETEN PEPTIDE
Abbildung 2-5: Naturstoffe, die zur Klasse der nicht-ribosomal gebildeten Peptide gehören. Gezeigt sind das Siderophor
Enterobactin (Samel et al. 2008), das Immunsuppressivum Ciclosporin (Hoffmann et al. 1994) und das Antibiotikum
Vancomycin (Walsh et al. 1990).
Neben den Polyketiden bilden nicht-ribosomal gebildete Peptide (NRP) eine weitere große und
bedeutende Gruppe von Naturstoffen, die als wichtige Wirkstoffe Eingang in weite Teile der
Medizin gefunden haben. Abbildung 2-5 zeigt mit Vancomycin und Ciclosporin Beispiele für NRP
als Antibiotikum oder Immunsuppressivum. Bakterien nutzen NRP nicht nur als bioaktive
Sekundärmetaboliten, sondern auch, wie im beispielhaften Fall von Enterobactin, als Siderophore
zum Chelatieren und effektiven Aufnehmen von Eisen. NRP werden von sogenannten
nicht-ribosomalen Peptidsynthasen gebildet (NRPS). Diese nutzen keine mRNA als Vorlage für die
Peptid-Biosynthese. NRPS sind ähnlich wie nicht-iterative PKS I große modulare Enzymkomplexe,
deren Abfolge der katalytischen Einheiten die Aminosäure-Sequenz und den Aufbau des
Endprodukts bestimmt. Oft werden auch nicht-proteinogene Aminosäuren in die Peptidketten
eingebaut (Marahiel 2009; Fischbach und Walsh 2006). Die Module einer NRPS sind in katalytische
Domänen aufgeteilt, wobei jede für eine spezifische Reaktion zuständig ist; drei davon sind
essentiell (Schwarzer et al. 2003). Die erste essentielle Domäne ist die Adenylierungs-Domäne (A).
10
Einleitung
Sie wählt aufgrund einer spezifischen Aminosäurenabfolge, die als Stachelhaus-Code bezeichnet
wird (Stachelhaus et al. 1999), einen Baustein aus und aktiviert ihn durch Bildung eines
Aminoacyladenylats (Abbildung 2-6 A). Anschließend wird das aktivierte Substrat auf die
Thiolgruppe eines Phosphopantetheinarms übertragen, der an einer Peptidyl-Carrier-ProteinDomäne (PCP) hängt (Abbildung 2-6 B). Die PCP stellt die zweite essentielle Domäne dar. Bei der
dritten handelt es sich um die Kondensations-Domäne (C). Durch sie wird zwischen einer
α-Aminogruppe einer PCP-gebundenen Aminosäure und der nachfolgenden Aminosäure die
Bildung einer Amidbindung katalysiert (Abbildung 2-6 C). Die Weiterleitung von einem Modul zum
nächsten Modul wird durch die PCP gewährleistet. Ein Erweiterungsmodul besteht standardmäßig
aus C-A-PCP auf meist einem Polypeptid (Marahiel 2009). Die Freisetzung des Produkts von der
NRPS erfolgt durch eine Thioesterase-Domäne (TE) am C-terminalen Ende (Kohli et al. 2001).
Dabei ist es möglich, dass eine Makrozyklisierung stattfindet.
Abbildung 2-6: Darstellung der für eine NRPS essentiellen Domänen A (A), PCP (B) und C (C) und der von ihnen
katalysierten Reaktionen. Der Phosphopantetheinarm der PCP ist als geschwungene Linie dargestellt (adaptiert nach
Marahiel 2009).
Weitere Domänen, die für eine Diversifizierung der NRP sorgen, werden in Abbildung 2-7 gezeigt
(Marahiel 2009). Durch Epimerisierungs-Domänen (E) werden aus L-Aminosäuren die
nicht-proteinogenen D-Aminosäuren erzeugt. N-Methyltransferase-Domänen (NMT) übertragen
Methylgruppen auf den Amidstickstoff, wie es bei sieben von elf Stickstoffen im Ciclosporin zu
sehen ist (Abbildung 2-5). Des Weiteren existieren C-Methyltransferase-Domänen (CMT) zur
Übertragung von Methylgruppen auf C-Atome von Cystein. Zyklisierungs-Domänen (Cy) erzeugen
kleine Heterozyklen im Molekül, wie z.B. Oxazolin oder Thiazolin. Eventuell weiterführende
Oxidationen bzw. Reduktionen werden von Oxidations-(Ox) oder Reduktions-Domänen (R)
ausgeführt. Schließlich sind noch Formyltransferase-Domänen (F) bekannt, die einen Formylrest
auf Amidstickstoffe übertragen können. Die Vielfalt der Möglichkeiten zur Diversifizierung durch
unterschiedlichste Domänen lässt erkennen, wie aus einfachen Bausteinen eine riesige
Molekülvielfalt entstehen kann. Wie bereits in 2.2 erwähnt, kann diese Vielfalt noch erweitert
werden, wenn zur Biosynthese von Naturstoffen Hybridenzyme aus PKS und NRPS eingesetzt
werden.
11
Einleitung
Abbildung 2-7: Reaktionen, die zur Modifizierung von NRP während der Biosynthese beitragen. Modifizierungsstellen
und Donorgruppen von Co-Faktoren sind gelb markiert. Auf der linken Seite sind die Positionen der jeweiligen Domänen
innerhalb der NRPS Module gezeigt (adaptiert nach Marahiel 2009).
12
Einleitung
2.4 REGULATION DES SEKUNDÄRMETABOLISMUS IN STREPTOMYCETEN
2.4.1 VERSCHIEDENE EINFLÜSSE AUF DIE REGULATION DES SEKUNDÄRMETABOLISMUS
Die Produktion von Sekundärmetaboliten ist in Streptomyceten durch eine Vielzahl an Faktoren
reguliert. Das Einsetzen der Sekundärmetabolitenproduktion ist eng mit der morphologischen
Differenzierung verknüpft, so dass es einige regulatorische Faktoren gibt, die auf beide Prozesse
einen Einfluss haben (Chater 2006). Auch die Verfügbarkeit von Nährstoffen hat einen, teilweise
indirekten, Einfluss auf den Sekundärmetabolismus; so wurden u.a. Beeinflussungen durch
Phosphat, die Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle oder N-Acetyl-Glucosamin nachgewiesen (van
Wezel und McDowall 2011; Liu et al. 2013), auf die hier jedoch nicht weiter eingegangen werden
soll. Es existieren auch extrazelluläre Signale wie die γ-Butyrolactone (GBL), die über eine Kaskade
die Produktion von Sekundärmetaboliten regulieren. Ein besonders gut untersuchtes Beispiel ist
der Einfluss des A-Faktors, ein GBL von S. griseus. Die Produktion von Streptomycin hängt in
diesem Stamm vollständig von der Anwesenheit des A-Faktors ab (Ohnishi et al. 2005). Zum
Großteil existieren mehrstufige Mechanismen zwischen Regulatoren, deren Gene sich im
regulierten Cluster selbst befinden (Cluster spezifische Regulatoren, CSR; s. auch 2.4.2), und
globalen Regulatoren, die weit über das Genom verteilt sind. Die globalen Regulatoren
modulieren dabei die Expression eines oder mehrerer CSR (van Wezel und McDowall 2011; Liu et
al. 2013). Eine ausschließliche Regulation der Expression von Biosynthesegenen über globale
Regulatoren für den Sekundärmetabolismus ist selten, aber es gibt gut untersuchte Beispiele wie
die Regulation der Biosynthese von Moenomycin (Makitrynskyy et al. 2013). In vielen derartigen
Fällen spielt das Protein AdpA eine entscheidende Rolle. Orthologe zu AdpA finden sich in allen
Streptomyceten (Liu et al. 2013). Es handelt sich um ein regulatorisches Protein der AraC/XylS
Familie und hat weitreichende regulatorische Funktionen, v.a. über Gene, die im Zusammenhang
mit der morphologischen und physiologischen Differenzierung stehen. So kontrolliert AdpA in
S. griseus die Expression von mehr als 500 Genen direkt und mehr als 1000 Genen indirekt; in
anderen Streptomyceten Spezies zeichnet sich ein ähnliches Bild ab (Higo et al. 2012).
2.4.2 CLUSTERSPEZIFISCHE REGULATOREN
Der Großteil der Biosynthesegencluster für Sekundärmetaboliten in Streptomyceten enthält
mehrere CSR, die sich kaskadenmäßig gegenseitig kontrollieren (van Wezel und McDowall 2011;
Liu et al. 2013). So enthält das Biosynthesegencluster von Tylosin in S. fradiae fünf CSR (Bate et al.
1999) und das von Nanchangamycin in S. nanchangensis sechs CSR (Sun et al. 2003). Einer der CSR
hat eine Funktion als ultimativer Regulator, er führt also die Rolle als Kontrollinstanz über die
Expression der Biosynthesegene des Clusters aus (van Wezel und McDowall 2011; Liu et al. 2013).
Die Positionierung des Gens für einen CSR innerhalb eines Clusters bedeutet nicht, dass die
regulatorische Funktion nur auf dieses Cluster beschränkt ist. Es existieren Beispiele für
Auswirkungen eines CSR sowohl auf das eigene Cluster, als auch auf andere Cluster für
S. coelicolor (Huang et al. 2005) oder S. cattleya (Rodríguez et al. 2008).
13
Einleitung
Die in Streptomyceten am häufigsten vorkommende Art an CSR sind die sogenannten
„Streptomyces antibiotic regulatory proteins“ (SARP). Sie zeichnen sich strukturell durch eine
N-terminale, OmpR-ähnliche Domäne und eine bakterielle Transkriptionsaktivierungsdomäne aus
und bewirken die Aktivierung der Transkription von Biosynthesegenen (Liu et al. 2013). In 237 von
Liu et al. untersuchten Biosynthesegenclustern in Streptomyceten enthalten 57 ein oder mehrere
SARP. Der wohl bekannteste SARP ist durch das Gen actIIORF4 codiert (Wietzorrek und Bibb
1997). Er befindet sich im Biosynthesecluster für Actinorhodin in S. coelicolor und wirkt dort als
ein ultimativer Regulator für die Expression der Biosynthesegene. Die Expression von actIIORF4
selbst ist sehr vielschichtig; bisher konnte der Einfluss von mindestens acht anderen
regulatorischen Proteinen nachgewiesen werden (Liu et al. 2013).
2.4.3 BLDA – EINE TRNA MIT REGULATORISCHER FUNKTION
Abbildung 2-8: Extrazelluläre Prozesse, die in S. coelicolor und S. griseus von bldA abhängen (adaptiert nach Chater und
Chandra 2008).
In den frühen Jahren der Streptomycetenforschung fielen gewisse Mutanten von S. coelicolor auf,
deren Morphologie und Sekundärmetabolismus sich deutlich vom Wildtyp (WT) unterschied. Es
war den Mutanten nicht möglich, ein Luftmycel auszubilden und gewisse farbige Pigmente, wie
das blaue Actinorhodin, herzustellen. Die Effekte ließen sich auf Mutationen in einem Gen
zurückführen, das den Namen bldA erhielt (Merrick 1976). Durch Änderung der zur Verfügung
stehenden Kohlenstoffquelle konnte der morphologische Phänotyp des WT bei den
bldA-Mutanten wiederhergestellt werden, nicht jedoch der Sekundärmetabolismus. Das
Genprodukt von bldA konnte als eine tRNA identifiziert werden. Bei Streptomyceten stellt diese
14
Einleitung
tRNA die einzige dar, die ein UUA-Codon (entsprechend TTA auf DNA Ebene) effektiv translatieren
kann; die dabei übertragene Aminosäure ist Leucin (Leskiw et al. 1991). Mutationen im bldA-Gen
führen bei anderen Streptomyceten-Spezies zu ähnlichen Effekten im Hinblick auf Morphologie
und Sekundärmetabolismus. Als Beispiele ließen sich die phänotypischen Veränderungen von
S. globisporus 1912 und der Verlust der Biosynthese von Landomycin durch Mutationen des
bldA-Gens anführen (Rebets et al. 2006). TTA Codons sind in Streptomyceten aufgrund ihres
hohen Gehalts an Guanin und Cytosin Basen in der DNA äußerst selten. S. coelicolor enthält in
seinem gesamten Genom nur 145 TTA-haltige Gene (Chater 2006). In Genen mit regulatorischer
Funktion ist dieses Codon im Vergleich zum restlichen Genom deutlich überrepräsentiert
(Chandra und Chater 2008). Somit ergibt sich eine Involvierung von bldA in der Regulation vieler
Prozesse, die mit dem Sekundärmetabolismus und der morphologischen Entwicklung
zusammenhängen (Abbildung 2-8).
Viele Effekte der erwähnten bldA-Mutation lassen sich durch Auswirkungen auf das globale
Regulatorprotein AdpA erklären, das teilweise auch als BldH bezeichnet wird. Orthologe zum
adpA-Gen lassen sich in allen bisher untersuchten Streptomyceten-Spezies finden und enthalten
alle ein hochkonserviertes TTA-Codon (Liu et al. 2013). Eine effiziente Translation von adpA-mRNA
ist also nur in Anwesenheit einer funktionsfähigen Leu-tRNAUUA möglich, was bei einer Mutation
des bldA-Gens nicht der Fall ist. Gleichzeitig bewirkt AdpA eine verstärkte Expression des
bldA-Gens, es besteht also eine positive Rückkopplung zwischen diesen beiden Faktoren (Higo et
al. 2011). Wird das TTA Codon im adpA-Gen zu einem anderen Leucin-Codon mutiert, können sich
bldA-Mutanten von S. coelicolor morphologisch wie der WT entwickeln, der
Sekundärmetabolismus bleibt jedoch stark beeinträchtigt (Nguyen et al. 2003). Dies ist erklärbar
durch die Anwesenheit von TTA-Codons in einigen CSR, wie dem bereits in 2.4.2 besprochenen
SARP actIIORF4. Ein Austausch von TTA zum ebenfalls Leucin-codierenden Codon TTG in actIIORF4
reaktivierte die Produktion von Actinorhodin in bldA-Mutanten von S. coelicolor (FernándezMoreno et al. 1991).
Zu unterschiedlichen Wachstumsphasen lassen sich unterschiedliche Mengen an reifer,
funktionsfähiger bldA-tRNA detektieren. Vor allem am Ende des exponentiellen Wachstums ist ein
starker Anstieg feststellbar (Pettersson und Kirsebom 2011). Der Promotor des bldA-Gens ist
während aller Wachstumsphasen aktiv, die Prozessierung zur reifen tRNA wird jedoch durch eine
antisense-RNA moduliert (Leskiw et al. 1993). Eine weitere regulatorische Kontrolle der
bldA-Expression konnte durch BldD gezeigt werden (den Hengst et al. 2010). Es lässt sich also
festhalten, dass die bldA-tRNA ihre physiologischen Effekte in starker Abhängigkeit von der
Wachstumsphase ausübt und dabei noch von anderen Faktoren kontrolliert wird.
15
Einleitung
2.5 KOMPLEMENTIERUNG EINES DEFEKTS DES BLDA-GENS IN S. CALVUS
Ein eindrucksvolles Beispiel für die Wichtigkeit des bldA-Gens für den Sekundärmetabolismus und
die morphologische Entwicklung von Streptomyceten stellt Streptomyces calvus ATCC 13382
(nachfolgend S. calvus genannt) dar (Kalan et al. 2013). S. calvus wurde in den 1950er Jahren aus
einer Bodenprobe in Indien isoliert und ist durch seine mangelhafte Sporulation auf
Standardmedien auffällig. Dieser Eigenschaft verdankt er seinen Namen, da „calvus“ ein
lateinischer Ausdruck für „kahl“ ist. Außerdem wurde berichtet, dass aus Produktionskulturen von
S. calvus das Adenosin-Analogon Nucleocidin isoliert werden konnte (Thomas et al. 1956; Morton
et al. 1969). Die Morphologie des WT von S. calvus erinnert an den von bldA-Mutanten von
S. coelicolor, da er nicht fähig ist Luftmycel auszubilden. Tatsächlich konnte eine Punktmutation
an einer konservierten Stelle im bldA-Gen von S. calvus festgestellt werden (Abbildung 2-9 A).
Diese Punktmutation hat zur Folge, dass die reife tRNA eine Fehlfaltung aufweist und somit nicht
mehr funktionsfähig ist (Abbildung 2-9 B).
Abbildung 2-9: (A) Vergleich der DNA-Sequenzen des bldA-Gens aus S. calvus und vier anderer Streptomyceten-Stämme
mit Markierung der Punktmutation bei S. calvus. (B) Darstellung der vorhergesagten Strukturen der bldA-tRNA aus
S. calvus WT (links) und bei Korrektur der Punktmutation (rechts). Die mutierte Base ist rot gekennzeichnet (Vorhersage
der tRNA Struktur mit RNAfold: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).
16
Einleitung
Abbildung 2-10: (A) Auswirkungen der Komplementierung von S. calvus mit einem funktionsfähigen bldA-Gen auf die
morphologische Entwicklung nach fünf Tagen auf einer MS-Agarplatte. Links: bldA im replikativen Vektor pUWL. Rechts:
bldA im integrativen Vektor pTESa. Unten: Kontrolle mit leerem Vektor pUWL. (B) Auswirkungen der Komplementierung
von S. calvus mit einem funktionsfähigen bldA-Gen auf das Sekundärmetabolitenprofil, gezeigt durch Chromatogramme
von Ethylacetatextrakten aus 5-Tagesproduktionskulturen in patent-Medium. Oben: S. calvus WT. Unten: S. calvus
+
bldA .
Nachdem S. calvus mit einem funktionsfähigen bldA-Gen ausgestattet wurde, das über eine PCR
aus S. coelicolor gewonnen wurde, und einmal über den integrativen pTESa-Vektor und einmal
über den replikativen pUWL-Vektor eingebracht wurde, zeigten sich starke Veränderungen. Der
Stamm erlangte nicht nur die Fähigkeit zur morphologischen Differenzierung, sondern es zeigte
sich auch ein veränderter Sekundärmetabolismus (Abbildung 2-10).
Prof. David Zechel aus dem Dept. of Chemistry der Queen’s University in Kingston, ON, Kanada,
gelang die Isolierung der neu produzierten Substanzen während seines zehnmonatigen
Forschungsaufenthalts in der AG Bechthold am Institut für Pharmazeutische Biologie und
Biotechnologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Es stellte sich heraus, dass es sich bei den
Substanzen um Polyene handelt. Die Bestimmung der Strukturen war möglich durch eine
Kombination aus NMR- und HR-MS-Spektroskopie. Es zeigte sich, dass es sich um zwei Isomere
17
Einleitung
einer Substanz handelt, die sich in der Konfiguration einer Doppelbindung unterscheiden. Die
Polyene erhielten die Namen 4-Z-Annimycin (cis-Annimycin) und 4-E-Annimycin (trans-Annimycin)
(Abbildung 2-11). Bisher war nicht bekannt, dass S. calvus die Fähigkeit besitzt polyenartige
Substanzen zu bisoynthetisieren. Durch die bldA-Komplementierung wurde also ein bisher
unbekanntes Biosynthesegencluster aktiviert, für dessen Expression eine funktionsfähige
bldA-tRNA unabdingbar ist (Kalan et al. 2013).
Abbildung 2-11: Strukturformeln der Doppelbindungsisomere des Polyens Annimycin. Links 4-Z-Annimycin
(cis-Annimycin), Rechts 4-E-Annimycin (trans-Annimycin).
18
Zielsetzung
3 ZIELSETZUNG
Das Ziel dieser Arbeit ist es, Zusammenhänge zwischen dem Sekundärmetabolismus von
Streptomyceten und dem bldA-Gen zu identifizieren und zu untersuchen. Ein klarer
Zusammenhang in diesem Kontext besteht für die Biosynthese der Annimycin-Polyene in
Streptomyces calvus ATCC 13382, die als ein Isomerengemisch aus 4-Z-(cis)- und 4-E-(trans)Annimycin auftreten. Sie werden nur produziert, wenn der Stamm über ein funktionsfähiges
Genprodukt des bldA-Gens verfügt.
Das für die Produktion dieser Substanzen zuständige Biosynthesegencluster sollte identifiziert und
untersucht werden. Ein weiterer Aspekt der Annimycine, den es zu untersuchen galt, ist die
gleichzeitige Biosynthese eines cisund eines trans-Isomers.
Neben Annimycin wird ein weiterer Sekundärmetabolit von S. calvus durch das bldA-Gen
beeinflusst. Die Struktur dieses Stoffes sollte identifiziert werden und auf dieser Basis die
Genomdaten auf mögliche Biosynthesegene untersucht werden.
Weitere Untersuchungen basierten auf der konstitutiven Expression des bldA-Gens in 13
Streptomyceten Stämmen aus der Stammsammlung des DSMZ. Die Expression erfolgt ausgehend
vom rpsL-Promotor und sollte mittels intergenerischer Konjugation des integrativen
pTESa-Vektors in die Stämme eingebracht werden. Die so erhaltenen Mutanten sollten auf
veränderte Morphologie und Sekundärmetabolismus in verschiedenen Produktionsmedien
untersucht werden. Besonderes Augenmerk lag auf der möglichen Aktivierung stiller
Biosynthesegencluster und somit auf der Untersuchung der generellen Eignung dieser Strategie
zur Identifizierung neuartiger Naturstoffe aus Streptomyceten. Bei Aktivierung stiller Cluster
sollten ausgewählte Substanzen isoliert und deren chemische Struktur bestimmt werden.
19
Material und Methoden
4 MATERIAL UND METHODEN
4.1 LABORGERÄTE
Tabelle 4-1: Verwendete Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller. Bei Erstnennung wird Herkuntfsort und
Land angegeben.
Beschreibung
Hersteller
Agarosegel-Elektrophoresekammer und Zubehör
Amersham Pharmacia
(Oldendorf, D)
Biotage Isolera Prime mit Biotage KP-C18-HS SNAP 39x157 mm
Cartridges (verwendet von Stephanie Vanner an der Queen’s
University zur Isolierung von WS9326A)
Biotage LLC (Charlotte, USA)
Exactive Plus Orbitrap Mass Spectrometer (HR-MS)
Gradienten-PCR Mastercycler Epgradient
HPLC/ESI-MS (analytisch und semipräparativ) Agilent 1100 Serie:
G1322A Degasser, G1311A QuatPump, G1313A ALS, G1316A
Colcom, G1315B DAD, G1946D MSD
Hybridization oven/shaker
NMR-Konsole Bruker Avance DRX 400
NMR-Magnetsystem Spectrospin 400 UltraShield
PCR GeneAmp PCR System 9700
Rotationsverdampfer Laborota 4000
Schüttelinkubator Multitron
Test Tube Heater SHT 1D
Ultraschallbad Sonorex Super R4510H
UV-Transilluminator Image Master VDS zur
Gelbilddokumentation (312 nm)
Vakuum-Konzentrator
Zentrifuge 5415 R und 5417 R (1,5/2 ml Reaktionsgefäße)
Zentrifuge Avanti J-20XP (500 ml Zentrifugenbecher)
Zentrifuge Rotina 35 R und Rotina 380 R (15/50 ml
Zentrifugenröhrchen)
20
Thermo Scientific
(Waltham, USA)
Eppendorf (Hamburg, D)
Agilent (Waldbronn, D)
Amersham Pharmacia
Bruker (Billerica, USA)
Bruker
Applied Biosystems
(Forster City, USA)
Heidolph Instruments
(Schwabach, D)
Infors (Bottmingen, CH)
Stuart Scientific (Stone, UK)
Bandelin (Berlin, D)
Amersham Pharmacia
H. Saur (Reutlingen, D)
Eppendorf
Beckmann Coulter (Krefeld, D)
Hettich (Tuttlingen, D)
4.2 CHEMIKALIEN, MEDIENBESTANDTEILE, ENZYME UND KITS
4.2.1 CHEMIKALIEN, MEDIENBESTANDTEILE, LÖSUNGSMITTEL UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
Tabelle 4-2: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller oder Bezugsquelle. Bei
Erstnennung wird Herkuntfsort und Land angegeben.
Beschreibung
Hersteller/Bezugsquelle
(NH4)2HPO4
Agar-Agar, Kobe I
Agarose GTQ
Apramycinsulfat
B(OH)3
CaCl2
CaCO3
Carbenicillin, Dinatriumsalz
CoCl2
CuCl2·2 H2O
D-(-)-Mannitol
D-(+)-Saccharose
Dextrin
EDTA
Eisessig
Ethidiumbromid
FeSO4·7 H2O
HCl
Hefeextrakt
IPTG
K2HPO4
Kanamycinsulfat
KH2PO4
KOAc
LB-Medium Fertigmixtur
L-Valin
Malzextrakt, standard
Methylenblau
MgCl2·7 H2O
MgSO4·7 H2O
MnCl2·4 H2O
Na2MoO4
Na3-Citrat
NaCl
NaOH
Nystatin-Dihydrat
Phosphomycin, Dinatriumsalz
SDS
Merck (Darmstadt, D)
Roth (Karlsruhe, D)
Roth
AppliChem (Darmstadt, D)
Roth
Roth
Roth
Roth
Merck
Merck
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
Merck
Roth
Roth
Merck
Merck
Roth
Roth
Roth
Roth
Sigma (Taufkirchen, D)
Roth
21
Fortsetzung von Tabelle 4-2: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller oder
Bezugsquelle. Bei Erstnennung wird Herkuntfsort und Land angegeben.
Beschreibung
Sojamehl (Hensel Voll-Soja)
Sojapepton (Bacto Soytone)
Spectinomycin, Dihydrochlorid Pentahydrat
Tris
Tris-HCl
Trypton/Pepton aus Casein
TSB-Medium Fertigmixtur (CASO-Bouillon)
X-Gal
ZnSO4·7 H2O
α-D-(+)-Glucose Monohydrat
W. Schoenenberger (Magstadt,
D)
BD (Heidelberg, D)
AppliChem
Roth
Roth
Roth
Roth
AppliChem
Merck
Roth
Tabelle 4-3: Verwendete organische Lösungsmittel sowie deren Hersteller oder Bezugsquelle. Bei Erstnennung wird
Herkuntfsort und Land angegeben.
Beschreibung
Aceton
Aceton-d6
Acetonitril (HPLC grade)
Chloroform
Dichlormethan
DMSO
DMSO-d6
Ethanol
Ethylacetat
Isopropanol
Methanol
Methanol-d4
n-Hexan
Tetrahydrofuran-d8
Roth
Eurisotop (Saarbrücken, D)
Roth
Roth
Roth
Roth
Eurisotop
Roth
Roth
Fischer Scientific (Schwerte, D)
Roth
Eurisotop
AppliChem
Eurisotop
Tabelle 4-4: Verwendete Verbrauchsmaterialien sowie deren Hersteller oder Bezugsquelle. Bei Erstnennung wird
Herkuntfsort und Land angegeben.
Beschreibung
Bördelkappen N11
Spritzenfilter HPLC Chromafil PVDF 45/15 MS
Spritzenfilter Rotilabo, 0,2 µm, steril, PVDF
Petrischalen, ø90 mm
Kieselgel 60
Seesand
dNTP-Mix
Diaion HP-20
Sephadex LH-20
Macherey-Nagel (Düren, D)
Macherey-Nagel
Roth
Gosselin (Hazebrouck Cedex, F)
Merck
Roth
Peqlab (Erlangen, D)
Sigma
Amersham Pharmacia
22
Fortsetzung von Tabelle 4-4: Verwendete Verbrauchsmaterialien sowie deren Hersteller oder Bezugsquelle. Bei
Erstnennung wird Herkuntfsort und Land angegeben.
Beschreibung
Einmalspritzen (1/2/5/10 ml)
HPLC Vials Inserts 9 mm 0.15 ml
DC-Platten
B. Braun (Melsungen, D)
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
4.2.2 ENZYME
Tabelle 4-5: Verwendete Enzyme sowie deren Hersteller oder Bezugsquelle. Bei Erstnennung wird Herkuntfsort und
Land angegeben.
Beschreibung
Lysozym aus Hühnereiweiß
Pfu-Polymerase (5 U), Pfu-Polymerasepuffer 10-fach
Proteinase K
Restriktionsendonukleasen und zugehörige Puffer
RNase A
T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Ligase Puffer
Taq-Polymerase (5 U), Taq-Polymerasepuffer 10-fach
Roth
Eigenherstellung
Promega (Mannheim, D)
Promega / NEB (Ipswich, USA)
Qiagen (Hilden, D)
Promega
Eigenherstellung
4.2.3 KITS
Tabelle 4-6: Verwendete Kits sowie deren Hersteller oder Bezugsquelle. Bei Erstnennung wird Herkuntfsort und Land
angegeben.
Beschreibung
Pure Yield Plasmid Midiprep System
Wizard Plus SV Minipreps
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
Promega
Promega
Promega
23
4.3 LÖSUNGEN, NÄHRMEDIEN UND ANTIBIOTIKA-LÖSUNGEN
Zur Herstellung von Puffern und Lösungen wurde, falls nicht anders angegeben, H2Obidest
verwendet. Um den pH-Wert einzustellen wurde NaOH oder HCl (jeweils c = 1mol/l) eingesetzt.
4.3.1 LÖSUNGEN ZUR DNA ISOLIERUNG
4.3.1.1 Lösungen zur Plasmidisolierung aus E. coli durch alkalische Lyse
Tabelle 4-7: Lösungen zur Plasmidisolierung aus E. coli durch alkalische Lyse (adaptiert nach Sambrook et al. 2001).
Bezeichnung
P1
P2
P3
Bestandteile
Tris
EDTA
RNaseA
NaOH
SDS
KOAc
Konzentration
50 mmol/l
10 mmol/l
100 µg/ml
0,2 mol/l
1% (m/V)
3 mol/l
Anmerkung
Einstellung auf pH 8, Zugabe
der RNase kurz vor Gebrauch,
Lagerung bei 4°C
Einstellung auf pH 5,2
4.3.1.2 Lösungen zur Isolierung genomischer DNA aus Streptomyces spp.
Tabelle 4-8: Lösungen zur Isolierung genomischer DNA aus Streptomyces spp.
Bezeichnung
SET-Puffer
Lysozym-Lösung
Proteinase K-Lösung
SDS 10%
NaCl
Bestandteile
Tris-HCl
EDTA
NaCl
Lysozym
Proteinase K
SDS
NaCl
Konzentration
20 mmol/l
25 mmol/l
75 mmol/l
50 mg/ml
20 mg/ml
10% (m/V)
5 mol/l
Anmerkung
Einstellung auf pH 8
in SET-Puffer lösen
in SET-Puffer lösen
4.3.2 LÖSUNGEN FÜR AGAROSEGELELEKTROPHORESE
Tabelle 4-9: Lösungen für Agarosegelelektrophorese und zur Detektion von DNA.
Bezeichnung
TAE-Puffer (50fach)
Ladepuffer
Agarose 0,7%
Bestandteile
Tris
Konzentration
2 mol/l
EDTA
0,05 mol/l
Eisessig
52,2 ml
Bromphenolblau
Saccharose
0,25% (m/V)
40% (m/V)
Agarose
7 g/l
TAE-Puffer (1fach)
ad 1000 ml
24
Anmerkung
Einstellung auf pH 8 mit
Eisessig; vor Gebrauch
mit H2Obidest auf 1fache
Konzentration
verdünnen
Suspension aufkochen
bis Agarose gelöst ist;
Lagerung bei 60°C
Fortsetzung von Tabelle 4-9: Lösungen für Agarosegelelektrophorese und zur Detektion von DNA.
Bezeichnung
Ethidiumbromid-Färbelösung
Methylenblau-Färbelösung
Bestandteile
Ethidiumbromid
Methylenblau
Konzentration
10 µg/ml
0,02% (m/V)
Anmerkung
4.3.3 LÖSUNGEN FÜR BLAU-WEIß-SELEKTION
Tabelle 4-10: Lösungen für Blau-Weiß-Selektion in E. coli.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentration
IPTG-Lösung
IPTG
2 mmol/l
X-Gal-Lösung
X-Gal
10 g/l
Anmerkung
Lösung vor Gebrauch steril
filtrieren, pro Agarplatte
1 µl/ml Nährlösung
verwenden, Lagerung bei -20°C
in DMSO lösen, pro Agarplatte
1 µl/ml verwenden, Lagerung
vor Licht geschützt bei -20°C
4.3.4 LÖSUNGEN ZUR HERSTELLUNG VON STREPTOMYCES SPP. DAUERKULTUREN
Tabelle 4-11: Lösung zur Herstellung von Dauerkulturen von Streptomyces spp.
Bezeichnung
Saccharose-Lösung
Bestandteile
Saccharose
Konzentration
25% (m/V)
Anmerkung
4.3.5 NÄHRMEDIEN
Zur Herstellung von Festmedien wurde den Nährlösungen nach Einstellung des pH-Wertes
Agar-Agar in der Konzentration c = 20 g/l zugesetzt.
4.3.5.1 Nährmedium zur Kultivierung von E. coli und B. subtilis
Tabelle 4-12: Nährmedium zur Kultivierung von E. coli und B. subtilis.
Bezeichnung
LB-Medium
(Sambrook et al.
2001)
Bestandteile
Trypton
NaCl
Hefeextrakt
VE-Wasser
Konzentration
20 g/l
5 g/l
5 g/l
ad 1000 ml
25
Anmerkung
Verwendung der
Fertigmischung von Roth;
4.3.5.2 Nährmedien zur Kultivierung von Streptomyces spp.
Tabelle 4-13: Nährmedien zur Kultivierung von Streptomyces spp.
Bezeichnung
HA-Medium
(Kieser 2000)
SG+-Medium
(Kieser 2000)
NL19+-Medium
(Kieser 2000)
TSB-Medium
(Kieser 2000)
MS-Medium
(Kieser 2000)
patent-Medium
(Thomas et al. 1956)
Bestandteile
Malzextrakt
α-D-(+)-Glucose
Hefeextrakt
CaCl2
VE-Wasser
α-D-(+)-Glucose
Sojapepton
CaCO3
L-Valin
CoCl2-Lösung
VE-Wasser
D-(-)-Mannitol
Sojamehl Vollfett
L-Valin
MgCl2
VE-Wasser
CASO Bouillon
VE-Wasser
D-(-)-Mannitol
Sojamehl Vollfett
MgCl2
VE-Wasser
Dextrin
Trypton/Pepton
NaCl
(NH4)2HPO4
KH2PO4
K2HPO4
MgSO4·7 H2O
VE-Wasser
Konzentration
10 g/l
4 g/l
4 g/l
1 mmol/l
ad 1000 ml
20 g/l
10 g/l
2 g/l
2,34 g/l
0,1% (m/V)
ad 1000 ml
20 g/l
20 g/l
2,34 g/l
10 mmol/l
ad 1000 ml
30 g/l
ad 1000 ml
20 g/l
20 g/l
10 mmol/l
ad 1000 ml
10 g/l
10 g/l
2 g/l
2 g/l
1,5 g/l
0,5 g/l
0,25 g/l
ad 1000 ml
26
Anmerkung
Einstellung auf pH 7,2; Zugabe
von 0,1%iger CoCl2-Lösung
ergibt 1 mg/l im Medium
von MgCl2 nach dem
Autoklavieren unter sterilen
Bedingungen
von MgCl2 nach dem
Bedingungen
Zugabe von
Spurenelementelösung
(s. Tabelle 4-14) nach dem
Bedingungen
Tabelle 4-14: Bestandteile der Spurenelementelösung (adaptiert nach Kieser 2000).
Bestandteil
MgSO4
ZnSO4·7 H2O
FeSO4·7 H2O
MnCl2·4 H2O
CaCl2·6 H2O
NaCl
CuCl2·2 H2O
B(OH)3
Na2MoO4
CoCl2
Na3-Citrat
Konzentration [mg/50 ml]
100
100
100
100
100
100
20
20
10
10
110
Anmerkung
20facher Ansatz, vor Zusatz
zum Medium Verdünnung
auf 1fache Konzentration;
pro 100 ml Medium Zugabe
von 500 µl 1fach
konzentrierter Lösung
4.3.5.3 Nährmedien zur Kultivierung von Pilz-Stämmen
Tabelle 4-15: Nährmedien zur Kultivierung von Pilzstämmen.
Bezeichnung
YM-Medium
DSM-Medium
Bestandteile
Hefeextrakt
α-D-(+)-Glucose
Malzextrakt
Sojapepton
VE-Wasser
Kartoffel-Glucose
VE-Wasser
Konzentration
3 g/l
10 g/l
3 g/l
5 g/l
ad 1000 ml
26,5 g/l
ad 1000 ml
Anmerkung
Medium geeignet für
Candida parapsilosis
Medium geeignet für
Fusarium verticillioides
4.3.6 ANTIBIOTIKA-LÖSUNGEN
Antibiotika wurden als Stammlösungen hergestellt und den Medien so zugegeben, dass die
Zielkonzentration durch Verdünnung im Medium erreicht wurde. Zur Herstellung wurden die
Antibiotika abgewogen, in H2Obidest gelöst und durch einen Sterilfilter (Porendurchmesser 0,2 µm)
unter sterilen Bedingungen aliquotiert. Die Lagerung der Stammlösungen erfolgte bei -20°C.
Tabelle 4-16: Verwendete Selektionsantibiotika und deren Konzentration.
Antibiotikum
Apramycin
Carbenicillin
Kanamycin
Phosphomycin
Spectinomycin
Konzentration der
Stammlösung [mg/ml]
100
50
100
200
50
27
Zielkonzentration im Medium
[µg/ml]
50
50
50
200
100
4.4 VERWENDETE MIKROORGANISMEN
4.4.1 ESCHERICHIA COLI SPP.
Tabelle 4-17: Verwendete E. coli-Stämme.
Stamm
Verwendung
E. coli ET12567
x pUZ8002
Konjugation
E. coli XL1-Blue
Klonierung und
Bioaktivitätstests
Genotyp
F-, dam-13::Tn9, dcm-6 hsdM, hsdR, zjj202::Tn10, recF143, galK2, galT22,
ara-14, lacY1, xyl15, leuB6, thi1, tonA31,
rpsL136, his64, tsx78, mtl-I, glnV44
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17,
supE44, relA1, lac [F´ proAB lacIqZΔM15
Tn10 (Tetr)]
Referenz
(MacNeil et
al. 1992)
Stratagene
4.4.2 BACILLUS SUBTILIS
Tabelle 4-18: Verwendeter Bacillus-Stamm für Bioaktivitätstests.
Stamm
Bacillus subtilis (Ehrenberg)
COHN
Verwendung
ATCC-Nummer
Bioaktivitätstest
6051
4.4.3 STREPTOMYCES SPP.
Die Streptomyceten-Stämme zur Untersuchung der Auswirkungen der Überexpression des
bldA-Gens stammten aus der Sammlung des „Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH“ (DSMZ).
Tabelle 4-19: Verwendete Streptomyceten-Stämme zur konstitutiven Expression des bldA-Gens.
Stamm
Streptomyces gardneri
Streptomyces albovinaceus
Streptomyces orinoci
Streptomyces clavifer
Streptomyces ambofaciens
Streptomyces aureocirculatus
Streptomyces kasugaensis
Streptomyces olivochromogenes
Streptomyces curacoi
Streptomyces yanii
Streptomyces asterosporus
Streptomyces glomeroaurantiacus
Streptomyces synnematoformans
Streptomyces bobili
Buchstabencode
in dieser Arbeit
A
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
M
N
O
28
DSMZ-Nummer
ATCC-Nummer
40064
40136
40571
40843
40053
40386
40819
40451
40107
43887
41452
41782
41902
40056
9604
15823
23202
--23877
19823
15714
3336
13385
----15866
--3310
Fortsetzung von Tabelle 4-19: Verwendete Streptomyceten-Stämme zur konstitutiven Expression des bldA-Gens.
Stamm
Streptomyces novaecaesareae
Streptomyces vitaminophilus
Streptomyces longispororuber
Buchstabencode
in dieser Arbeit
P
Q
R
DSMZ-Nummer
ATCC-Nummer
40358
41686
40599
27452
31673
27443
Tabelle 4-20: Weitere verwendete Streptomyceten-Stämme.
Stamm
S. calvus ATCC13382
Beschreibung/Verwendung
Kontrolle bei Bioaktivitätstests von
Annimycin
S. calvus #9
Produzent von WS9326A
S. calvus pTESa-bldA
S. coelicolor M145
Produzent von Annimycin
Bioaktivitätstest von Annimycin
S. albus J1074
Bioaktivitätstests
Referenz
(Thomas et al. 1956)
Ochi,
unveröffentlicht
(Kalan et al. 2013)
(Kieser 2000)
(Chater und Wilde
1980)
4.4.4 PILZ-STÄMME
Tabelle 4-21: Verwendete Pilz-Stämme für Bioaktivitätstests.
Stamm
Beschreibung
Candida parapsilosis
Fusarium verticillioides
asexueller, diploider, pathogener
Hefepilz
Schimmelpilzart
Verwendung
DSMZNummer
Bioaktivitätstests
5784
Bioaktivitätstests
62264
4.5 VERWENDETE PLASMIDE, VEKTOREN UND PRIMER
4.5.1 VERWENDETE PLASMIDE UND VEKTOREN
Tabelle 4-22: In dieser Arbeit verwendete Plasmide und Vektoren.
Plasmid/Vektor
Resistenzgen(e)
pTESa
integrativer Vektor (C31)
aac(3)IV
pTESa-bldA
pLERE-Spec-oriT
pUC19
integrativer Vektor (C31) mit bldAGen aus S. coelicolor unter Kontrolle
des konstitutiven rpsL-Promoters
aadA und oriT flankiert von zwei
loxRE Erkennungssequenzen,
Nutzung des aadA-Gens als
Selektionsmarker
Klonierungsvektor
29
Referenz
(Herrmann et al.
2012)
aac(3)IV
(Kalan et al.
2013)
aadA, bla
Kobylyanskyy,
unveröffentlicht
bla
NEB
4.5.2 SELBSTERSTELLTE PLASMIDE UND VEKTOREN
Tabelle 4-23: Für diese Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren.
Plasmid/Vektor
pUC19-del1697
pUC19-del3100
Plasmid zur Insertionsmutagenese in einem PKS-Gen im
contig 1697 von S. calvus pTESa-bldA, internes Fragment
über BamHI-Restriktionsschnittstellen in pUC19 kloniert,
Größe des internen Fragments: 1341 bp, Selektionsmarker:
aadA aus pLERE-Spec-oriT
Plasmid zur Insertionsmutagenese in einem PKS-Gen im
contig 3100 von S. calvus pTESa-bldA, internes Fragment
über EcoRI-Restriktionsschnittstellen in pUC19 kloniert,
Größe des internen Fragments: 1836 bp, Selektionsmarker:
aadA aus pLERE-Spec-oriT
Resistenzgene
aadA, bla
aadA, bla
4.5.3 VERWENDETE PRIMER
Tabelle 4-24: Für diese Arbeit verwendete Primer.
Name
Sequenz
Primer zur Inaktivierung eines PKS I-Gens im contig 1697 von S. calvus
node1697for
5’-GCTGTACCGGATGGTGTGGGAAC-3’
node1697rev
5’-GGATCGTCGGCGAACAGTGTCTC-3’
Primer zur Inaktivierung eines PKS I-Gens im contig 3100 von S. calvus
node3100for
5’-GAAACACCGTTCACGGCACTGGGCTTC-3’
node3100rev
5’-AACATCACATCCCGCAGCGAGTGCTCC-3’
Primer zur Kontrolle der Inaktivierung eines putativen PKS-Gens im contig 3100 von S. calvus
del3100for (1)
5’-GAATCGTTCGTGCTCGAAGGGATAGG-3’
del3100rev (2)
5’-GTCATGTACCAGGACTACGGCTACTC-3’
del3100rev2 (3)
5’-GACACCGGCATGCAGATGTTCGAC-3’
delannfor (4)
5’- GTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATAC-3’
4.6 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
Bei den in diesem Abschnitt beschriebenen Methoden handelt es sich um Abwandlungen der für
die Arbeit mit DNA aus E. coli und Streptomyceten beschriebenen Standardmethoden (Sambrook
et al. 2001; Kieser 2000).
4.6.1 METHODEN ZUR ISOLIERUNG , AUFREINIGUNG UND ANALYTIK VON DNA
4.6.1.1 Plasmidisolierung aus E. coli durch alkalische Lyse
Bei Verfahren zur Plasmidisolierung macht man sich das unterschiedliche Verhalten linearer und
zirkulärer DNA während einer alkalischen Lyse zu Nutze, da sämtliche Verfahren darauf beruhen.
Alle hierfür verwendeten Lösungen sind in Tabelle 4-7 aufgelistet.
30
Für eine alkalische Lyse wurden 1-2 ml LB-Medium mit den benötigten Selektionsantibiotika mit
einer einzelnen E. coli-Kolonie beimpft und für 14-16 h bei 37°C und 180 rpm inkubiert. Die Ernte
erfolgte durch Zentrifugation (4°C, 14000 rpm, 10 min). Das so erhaltene Zellpellet wurde in
200 µl P1-Puffer resuspendiert und für 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Zugabe
von 200 µl P2-Puffer wurde das Eppendorfgefäß zur Durchmischung mehrmals invertiert und
wiederum bei Raumtemperatur für 5 min stehen gelassen. Anschließend wurden 200 µl P3-Puffer
hinzugegeben und die Lösung für 10 min auf Eis gestellt. Durch erneute Zentrifugation (4°C,
14000 rpm, 20 min) wurden ausgefallene Proteine und genomische DNA abgetrennt. Der
Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und die Plasmid-DNA durch Zugabe von
400 µl eiskalten Isopropanol ausgefällt. Ein weiterer Zentrifugationsschritt (4°C, 14000 rpm,
25 min) folgte, der Überstand wurde abgeschüttet und das Pellet einmal mit eiskalten 200 µl
Ethanol 70% (V/V) gewaschen. Anschließend wurde das Pellet im Trockenschrank bei 65°C
getrocknet und anschließend in 30 µl H2Obidest gelöst und bei -20°C gelagert.
4.6.1.2 Plasmidisolierung aus E. coli mittels Kits
Die Gewinnung größerer Mengen Plasmid-DNA mit hohem Reinheitsgrad erfolgte mittels der Kits
„Pure Yield Plasmid Midiprep System“ oder „Wizard SV Minipreps DNA Purification Systems“ von
Promega
(s. Tabelle
4-6).
Beide
Systeme
basieren
auf
dem
Prinzip
der
Anionenaustauschchromatographie. Die Plasmidisolierung erfolgte nach den Angaben des
Herstellers.
4.6.1.3 Isolierung genomischer DNA aus Streptomyces spp.
Um genomische DNA zu erhalten wurden Lösungen, wie in Tabelle 4-8 beschrieben, verwendet.
Zunächst wurde 1 ml aus einer in TSB-Medium gewachsenen Streptomyces-Kultur (vgl. 4.8.3) in
einem Eppendorfgefäß zentrifugiert (4°C, 14000 rpm, 5 min). Der Überstand wurde verworfen
und das Mycel in 500 µl H2Obidest resuspendiert. In ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß wurden 500 µl
SET-Puffer, 10 µl Lysozym-Lösung und 50-100 µl des Mycels zusammenpipettiert. Diese
Suspension wurde für 30 min im Wasserbad bei 37°C inkubiert, wobei mehrmals invertiert wurde.
Nach dieser Zeit kamen 14 µl Proteinase K-Lösung und 50 µl SDS-Lösung hinzu. Die Inkubation
erfolgte im Heizblock bei 55°C bis die Lösung klar war, jedoch maximal 1 h. Anschließend erfolgte
die Zugabe von 200 µl NaCl-Lösung und 500 µl Chloroform. Durch kräftiges Schütteln von Hand
über 2 min kam es zur gründlichen Durchmischung. Im Anschluss wurde zentrifugiert (4°C,
14000 rpm, 10 min) und die obere wässrige Phase, die die DNA enthielt, vorsichtig mit einer
Pipette in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Durch Zugabe von 500 µl eiskalten Isopropanol
wurde die DNA ausgefällt und durch Zentrifugation (4°C, 14000 rpm, 10 min) pelletiert. Der
Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal mit 500 µl Ethanol 70% (V/V) gewaschen,
wobei vor dem Verwerfen des Überstands zentrifugiert wurde (4°C, 14000 rpm, 5 min). Im
Trockenschrank bei 65°C wurde das Pellet getrocknet und je nach Größe in 50-100 µl H2Obidest
gelöst und bei -20°C gelagert.
4.6.1.4 Agarose Gelelektrophorese
Agarosegele dienten zur Analyse und Isolierung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe.
Die für die Herstellung benötigten Lösungen sind in Tabelle 4-9 beschrieben.
31
DNA in Lösung wurde zunächst mit Ladepuffer vermischt und auf ein Agarosegel aufgetragen. Als
Größenstandard diente eine 1 kb Ladder, die es erlaubte, die Größe der DNA-Fragmente
abzuschätzen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei Raumtemperatur in 1fach
konzentriertem TAE-Puffer bei einer Spannung von 80-100 V. Für analytische Zwecke wurde das
Gel für 15 min in ein Ethidiumbromid-Färbebad gelegt und die DNA mit Hilfe des
UV-Transilluminators sichtbar gemacht. Bei präparativen Gelen wurde es in ein
Methylenblau-Färbebad gelegt und mit 35 rpm geschüttelt, bis die DNA-Fragmente sichtbar
wurden. Die gewünschten Banden wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit dem Kit
„Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System“ von Promega entsprechend den Angaben des
Herstellers isoliert.
4.6.2 METHODEN ZUR KLONIERUNG VON DNA
4.6.2.1 Restriktion von DNA
Für Restriktion von DNA mittels Endonukleasen (s. Tabelle 4-5) wurden Puffersysteme und
Bedingungen gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Ein analytischer Verdau wurde in
einem Volumen von 10 µl durchgeführt; für einen präparativen Verdau wurden 70 µl angesetzt.
Das eingesetzte Volumen an zu verdauender DNA variierte je nach Konzentration. Standardmäßig
erfolgte ein Verdau bei 37°C für mindestens 2 h. Die Inaktivierung der Endonukleasen erfolgte
mittels Hitze, falls diese Möglichkeit vom Hersteller angegeben war, ansonsten durch
Aufreinigung mittels eines präparativen Agarosegels wie unter 4.6.1.4 beschrieben.
4.6.2.2 Ligation von DNA
Bei einer Ligation erfolgt die kovalente Verknüpfung der 5‘-Phosphatgruppe eines DNA-Strangs
mit der 3‘-OH-Gruppe eines anderen Strangs, katalysiert durch das Enzym Ligase (Weiss und
Richardson 1967). Das hier verwendete Enzym war die T4-DNA-Ligase (s. Tabelle 4-5) und wurde
nach Angaben des Herstellers verwendet. Das Volumen eines Ansatzes betrug üblicherweise
13 µl, wobei das Verhältnis von Insert zu Vektor 10:1 betrug. Ein Ansatz wurde nach 4 h bei
Raumtemperatur oder nach 14-18 h bei 4°C mittels eines Hitzeschocks in E. coli transformiert
(s. 4.6.3.1).
4.6.3 METHODEN ZUM TRANSFER VON DNA
4.6.3.1 CaCl2 vermittelte Transformation von DNA in E. coli
Zunächst wurden 5 ml LB-Medium, falls nötig mit Selektionsantibiotikum, mit einer E. coli
Einzelkolonie inokuliert und für 12-14 h bei 37°C bei 180 rpm inkubiert. Aus dieser Vorkultur
wurde 1 ml genutzt um 100 ml LB-Medium zu beimpfen und, wie oben beschrieben, weiter zu
kultivieren. In regelmäßigen Abständen wurde die optische Dichte (OD) bei 600 nm mit einem
UV-Spektrometer Uvikon 933 gemessen. Wenn die OD600 einen Wert zwischen 0,4 und 0,6
erreicht hatte, wurde die Kultur geerntet. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden bei 4°C und unter
sterilen Bedingungen durchgeführt. Zunächst wurde die Kultur abzentrifugiert (4°C, 5000 rpm,
10 min), das Zellpellet mit 40 ml eiskalter MgCl2-Lösung (c = 0,1 mol/l) gewaschen und abermals
wie beschrieben zentrifugiert. Nun wurde das Zellpellet vorsichtig in 20 ml eiskalter CaCl2-Lösung
32
(c = 0,1 mol/l) resuspendiert, für 20 min inkubiert und nochmals zentrifugiert, wie beschrieben.
Schließlich wurde das Pellet in 2-5 ml CaCl2-Lösung (c = 0,1 mol/l), die außerdem 15% (V/V)
Glycerol enthielt, resuspendiert, in Aliquote zu 100 µl in Eppendorfgefäße aufgeteilt und bei -80°C
eingefroren.
Um DNA zu transformieren wurde ein Aliquot CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen auf Eis aufgetaut,
mit 2-10 µl DNA versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurde das Eppendorfgefäß
mit den Zellen und der DNA für 2 min einem Hitzeschock bei 42°C auf dem Wasserbad
unterzogen. Danach wurde unter sterilen Bedingungen 1 ml LB-Medium ohne
Selektionsantibiotikum zugegeben und für 60-90 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach
Zentrifugation (21°C, 3000 rpm, 5 min) wurde der Überstand verworfen, das Pellet in einem
geringen Volumen des an der Gefäßwand zurückgebliebenen LB-Mediums resuspendiert und auf
einer LB-Agarplatte ausgestrichen. Die Platte enthielt die benötigten Selektionsantibiotika und
wurde für 14-16 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert.
Falls der transformierte Vektor ein lacZ-Gen enthalten hatte, konnte über Blau-Weiß-Selektion
eine Vorauswahl getroffen werden, ob bei einer Kolonie der Vektor mit oder ohne Insert
aufgenommen worden war. Zu diesem Zweck war die LB-Agarplatte vor Ausplattierung eines
Transformationsansatzes mit IPTG und X-Gal überschichtet worden (vgl. Tabelle 4-10).
4.6.3.2 Intergenerische Konjugation zum DNA Transfer
Die Übertragung von DNA durch intergenerische Konjugation von einem E. coli-Donorstamm auf
einen Streptomyces-Akzeptorstamm wurde genutzt um genetische Informationen zu vermitteln.
Der Stamm E. coli ET12567 wurde als Donorstamm gewählt, da er DNA nicht methyliert und sie
somit nicht im Akzeptorstamm abgebaut wird. Zusätzlich enthält dieser Stamm ein nicht
transferierbares RP4-Derivat (pUZ8002), welches für die Konjugation nötig ist. Außerdem muss
ein zu transferierender Vektor einen RP4 Ursprung (oriT) besitzen, an dem die Konjugation
initialisiert werden kann (Mazodier und Davies 1991).
Ein Vektor, der transferiert werden sollte, wurde in CaCl2-kompetente E. coli-Zellen mittels
Hitzeschock eingebracht (s. 4.6.3.1) und auf eine LB-Agarplatte ausgestrichen, die neben den
Selektionsantibiotika Kanamycin enthielt. Nach 14-16 h im Brutschrank bei 37°C wurde eine
Einzelkolonie ausgewählt und in 100 ml LB-Medium gegeben, in welchem die
Selektionsantibiotika und Kanamycin enthalten waren. Dieses LB-Medium wurde wiederum für
14-16 h bei 37°C und 180 rpm inkubiert und danach abzentrifugiert (21°C, 5000 rpm, 10 min). Das
Pellet wurde mit ca. 15 ml TSB-Medium gewaschen, nochmals zentrifugiert (21°C, 5000 rpm,
10 min), in 1-4 ml TSB-Medium resuspendiert und für die Konjugation verwendet.
Ein Akzeptorstamm war zunächst, wie unter 4.8.3 beschrieben, angezogen worden. 14-16 h bevor
die Konjugation durchgeführt werden sollte, wurden 500 µl der Vorkultur des zu konjugierenden
Stammes in 25 ml frisches TSB-Medium überimpft. Diese Konjugationskultur wurde zentrifugiert
(21°C, 5000 rpm, 10 min), mit ca. 15 ml frischem TSB-Medium gewaschen und nach erneuter
Zentrifugation (21°C, 5000 rpm, 10 min) das Pellet in 1-4 ml TSB-Medium resuspendiert. In ein
1,5 ml Eppendorfgefäß wurden 700 µl der Streptomyces-Suspension und 300 µl der
E. coli-Suspension vermischt und der gesamte Inhalt auf einer MS-Agarplatte mit Hilfe eines
Drigalsky-Spatels oder einer abgeknickten Pipettenspitze ausgestrichen. Unter der Impfbank
wurden die Platten offen stehen gelassen bis sie abgetrocknet waren, anschließend wurden sie in
33
den Brutschrank bei 28°C gestellt. Nach 7-16 h wurden die Konjugationsplatten mit
Selektionsantibiotika, gelöst in 1 ml H2Obidest, überschichtet. Neben den Selektionsantibiotika
enthielt die Überschichtungslösung immer Phosphomycin zur selektiven Inhibition der
E. coli-Zellen. War die Überschichtungslösung unter der Impfbank komplett abgetrocknet, kamen
die Platten erneut in den Brutschrank bei 28°C. Exkonjuganden waren je nach
Wachstumsgeschwindigkeit des Stammes nach 5-14 Tagen deutlich zu erkennen und wurden mit
einem sterilen Zahnstocher oder einer sterilen Pipettenspitze auf eine neue MS-Agarplatte
überpickt, die neben den Selektionsantibiotika auch Phosphomycin enthielt.
4.6.4 AMPLIFIZIERUNG VON DNA
Vervielfältigung von DNA war möglich durch Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
(Saiki et al. 1985). Nötig sind dafür zwei Oligonukleotidprimer, die das zu amplifizierende
DNA-Stück flankieren und an einen DNA-Einzelstrang binden können. Nach Bindung an die zu
vervielfältigende DNA erfolgt die Verlängerung der Matrize in Richtung 5‘→3‘ durch die
Polymerase. Die gesamte Reaktion kann unterteilt werden in eine Denaturierungsphase, eine
Anlagerungsphase und eine Elongationsphase. Diese Phasen werden zyklisch wiederholt, so dass
sich eine exponentielle Amplifizierung des gewünschten DNA-Fragments ergibt. Anwendung in
dieser Arbeit fand die Methode zur Gewinnung von DNA-Fragmenten zur Klonierung sowie zur
Überprüfung von Geninaktivierungen.
4.6.4.1 Standardbedingungen zur Durchführung einer PCR
Für einen analytischen Ansatz einer PCR wurde ein Volumen von 50 µl gewählt, sollte das
DNA-Fragment präparativ gewonnen werden, betrug das Volumen 100 µl. Ein Ansatz enthielt
üblicherweise 2% Matrizen DNA, die tatsächliche DNA-Konzentration war jedoch nach Bedarf
variabel. Weitere Bestandteile waren je 2% der Oligonukleotidprimer (c = 10 µmol/l), 2% dNTPs
(c = 10 mmol/l), 1% Polymerase-Lösung, 10% DMSO und 10% Polymerasepuffer (10fach). Das
Restvolumen wurde mit H2Obidest ergänzt. Sämtliche prozentuale Angaben in diesem Abschnitt
sind als (V/V) zu verstehen.
Tabelle 4-25 zeigt das Standardprogramm zur Durchführung einer PCR. Die
Anlagerungstemperatur ergab sich, in dem von der für die Primer vom Hersteller angegebene
Schmelztemperatur 5°C abgezogen wurden. Sollte das amplifizierte DNA-Fragment zur Klonierung
verwendet
werden,
kam
die
Pfu-Polymerase
zum
Einsatz,
für
die
eine
Amplifizierungsgeschwindigkeit von 500 bp/min angenommen wurde. Für analytische Zwecke
fand die Taq-Polymerase Verwendung, mit der es möglich war 1000 bp/min zu amplifizieren.
34
Tabelle 4-25: Standardprogramm für eine PCR.
Phase
Hotstart
Denaturierung
Anlagerung
Temperatur [°C]
95
95
Abhängig von
verwendeten
Primerpaar
Elongation
72
Endphase
72
Zeit [min]
5
1
Zyklenanzahl
1
1
Abhängig von
Polymerase und
Größe des
DNA-Fragments
8
25
1
4.7 GENINAKTIVIERUNG IN STREPTOMYCES SPP.
4.7.1 GENINAKTIVIERUNG MITTELS INSERTIONSMUTAGENESE IN S. CALVUS PTESA-BLDA
4.7.1.1 Erstellung von Inaktivierungsplasmiden und Durchführung der
Inaktivierung
Der erste Schritt der Inaktivierung mittels Insertionsmutagenese bestand darin, über eine PCR ein
internes Fragment des zu inaktivierenden Gens von genomischer DNA zu amplifizieren. In dem
Fragment sollten weder Start- noch Stop-Codon enthalten sein. Dieses DNA Fragment wurde nach
Restriktionsverdau an natürlich vorkommenden Restriktionsschnittstellen in den Vektor pUC19
kloniert, in E. coli-Zellen transformiert und über Blau-Weiß-Selektion Träger des gewünschten
Konstrukts
ausgewählt
(s. 4.6.2).
Solche
Konstrukte
wurden
um
eine
Spectinomycin-Resistenzkassette ergänzt, über die eine spätere Selektion von mutierten
Streptomyceten möglich war. Die Kassette wurde aus dem Vektor pLERE-Spec-oriT mit den
Restriktionsenzymen SpeI und NheI herausgeschnitten und in die damit kompatible XbaI
Restriktionsschnittstelle von pUC19 kloniert. Die Selektion in E. coli fand diesmal über Resistenz
gegen Spectinomycin statt. Der fertige Inaktivierungsvektor wurde mittels intergenerischer
Konjugation übertragen (s. 4.6.3.2).
Der Inaktivierungsvektor ist nicht replikativ in Streptomyceten, somit kann eine
Resistenzausbildung gegen Spectinomycin nur stattfinden, wenn der gesamte Vektor über ein
homologes Rekombinationsereignis in das Genom integriert worden ist; Resultat ist, dass bei der
Mutante zwei nicht funktionsfähige Allele vorliegen. Wichtig ist das ständige Aufrechterhalten des
Selektionsdrucks während sämtlicher Wachstumsschritte, da es sonst durch eine reversible
Integration zu einem Verlust der Mutation kommen kann (Linnenbrink 2009).
4.7.1.2 Kontrolle der Inaktivierung
Die korrekte Integration eines Vektors in die genomische DNA wurde mittels eines PCR-Ansatzes
überprüft. Für diesen Ansatz wurde die Taq-Polymerase verwendet und wechselnde
Kombinationen aus vier verschiedenen Primern. Der Ansatz ist grafisch in Abbildung 4-1 gezeigt,
35
die Sequenz der verwendeten Primer ist in Abschnitt 4.5.3 beschrieben und die Bedingungen der
durchgeführten PCR in Tabelle 4-26 dargestellt. In allen Fällen diente frisch isolierte genomische
DNA als Matrize. Die Kombination aus Primer 1 und 2 diente als Positivkontrolle, da sowohl für die
Inaktivierungsmutante als auch für ein nicht inaktiviertes Gen eine Amplifizierung zu erwarten ist.
Bei Primer 1 und 3 lässt sich bei den Inaktivierungsmutanten keine Amplifizierung erwarten, da
das entsprechende Fragment bei der gegebenen Elongationszeit zu groß wäre. Primer 1 und 4
lassen jedoch nur bei den Inaktivierungsmutanten eine Amplifizierung erwarten, da nur in diesem
Fall das Gen für die Resistenz gegen Spectinomycin an der gewollten Stelle im Genom vorhanden
ist.
Tabelle 4-26: PCR-Bedingungen zur Überprüfung der korrekten Geninaktivierung in der Insertionsmutante
S. calvus pTESa-bldA x 3100.
Phase
Hotstart
Denaturierung
Anlagerung
Elongation
Endphase
Temperatur [°C]
95
95
52
72
72
Zeit [min]
5
1
1
4
8
Zyklenanzahl
1
25
1
Abbildung 4-1: Schematische Darstellung des Ansatzes zur Kontrolle der Geninaktivierung mittels Insertionsmutagenese
mit Angabe der Größe der zu erwartenden Amplifizierungsfragmente.
4.8 BEDINGUNGEN ZUR KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN
4.8.1 KULTIVIERUNG VON E. COLI
Von einer LB-Agarplatte (Zusammensetzung s. Tabelle 4-12) wurde eine einzelne E. coli-Kolonie
mit einem sterilen Zahnstocher oder einer autoklavierten Pipettenspitze abgenommen und damit
flüssiges LB-Medium beimpft bzw. eine andere LB-Agarplatte ausgestrichen. Flüssigkulturen bis zu
10 ml wurden in einem Reagenzglas mit Aluminiumkappe angezogen, bei einem Volumen bis zu
100 ml wurde ein 300 ml Erlenmeyerkolben mit einer bis vier Schikanen verwendet. Vor dem
Animpfen waren dem Medium entsprechende Selektionsantibiotika (s. Tabelle 4-16) zugesetzt
worden. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 14-16 h in einem Brutschrank für Agarplatten oder
auf einem Schüttelturm (180 rpm) für Flüssigkulturen.
36
4.8.2 KULTIVIERUNG VON B. SUBTILIS
Die Kultivierung von B. subtilis erfolgte analog zur Anzucht von E. coli (s. 4.8.1). Nach 14-16 h bei
37°C waren sowohl in einer Flüssigkultur auf dem Schüttelturm (180 rpm), als auch auf einer
Agarplatte eine dichte Kultur angewachsen. Zur Lagerung wurden 200 µl Flüssigkultur mit 800 µl
autoklaviertem Glycerol versetzt und nach Vortexen bei -80°C gelagert.
4.8.3 KULTIVIERUNG VON STREPTOMYCES SPP.
4.8.3.1 Vorkulturen von Streptomyces spp.
Zur Anzucht einer Kultur eines Streptomyceten-Stammes wurden 50 µl einer Saccharose
Dauerkultur auf einer MS-Agarplatte, die bei Bedarf mit entsprechenden Selektionsantibiotika
(s. Tabelle 4-16) versetzt war, gegeben und auf dieser Platte so ausgestrichen, dass möglichst
Einzelkolonien wachsen konnten. Die Platte wurde bei 28°C in einem Brutschrank inkubiert, bis
deutliches Wachstum erkennbar war. Eine Einzelkolonie wurde mit einer autoklavierten
Pipettenspitze aus der Agarplatte ausgeschnitten und in 25 ml TSB-Medium in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit einer Schikane gegeben, welches ebenfalls Selektionsantibiotika enthielt.
Dieser Ansatz diente als Vorkultur für weitere Kulturen. Bis im TSB-Medium eine gesättigte Kultur
angewachsen war, wurde sie bei 28°C und 180 rpm auf einem Schüttelturm inkubiert. Die
tatsächliche Wachstumszeit hing von der Wachstumsgeschwindigkeit des Stammes ab.
4.8.3.2 Produktionskulturen von Streptomyces spp.
Die Überprüfung der Sekundärstoffproduktion erfolgte in 25 ml Produktionsmedium, versetzt mit
Selektionsantibiotika, in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane für fünf bis sieben
Tage bei 28°C und 180 rpm auf einem Schüttelturm. Um eine solche Produktionskultur zu
beimpfen wurden 500 µl gesättigte Vorkultur verwendet. Zur Gewinnung von Einzelsubstanzen
wurden 100 ml oder 200 ml Produktionsmedium in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit einer
Schikane und einer Metallspirale mit 500 µl gesättigter Vorkultur angeimpft. Nach fünf bis sieben
Tagen Wachstum bei 28°C bei 180 rpm auf dem Schüttelturm wurden die Produktionskulturen,
wie in Abschnitt 4.9 beschrieben, extrahiert.
4.8.3.3 Dauerkulturen von Streptomyces spp.
Dauerkulturen der Streptomyceten-Stämme wurden ebenfalls aus gesättigten TSB-Vorkulturen
erstellt. In einem Eppendorfgefäß wurde 1 ml der Kultur bei 4°C und 5000 rpm für 10 min
abzentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 1 ml 25%-Saccharose Lösung (s. Tabelle 4-11)
gewaschen und erneut abzentrifugiert. Nach Resuspension in 1 ml 25%-Saccharose Lösung
wurden ein Teil der Zellsuspensionen bei -20°C und ein Teil bei -80°C gelagert.
4.8.3.4 Überprüfung der Sporulation auf MS-Agarplatten
Zur Überprüfung der Sporulation wurde ein Streptomyceten-Stamm in TSB wie oben beschrieben
kultiviert bis eine gesättigte Vorkultur gewachsen war. Unter sterilen Bedingungen wurde ein Teil
einer MS-Agarplatte mit dieser Vorkultur ausgestrichen, indem eine sterilisierte Impföse in die
Vorkultur eingetaucht wurde und das im Öhr hängende Medium auf die Platte gestrichen wurde.
37
Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt und die Platte wurde nach Abtrocknen bei 28°C
bebrütet.
4.8.3.5 Überprüfung des Produktionsverlaufs von Annimycin in S. calvus
pTESa-bldA
Die Überprüfung des Produktionsverlaufs von Annimycin erfolgte, indem 21 mal 25 ml
SG+-Medium jeweils mit 500 µl gesättigter Vorkultur von S. calvus pTESa-bldA beimpft wurden.
Über sieben Tage wurden jeden Tag drei Proben genommen und, wie unter Abschnitt 4.9.1
beschrieben, extrahiert und analysiert, jedoch die Methode anniso10 statt Stand2DZ auf der
analytischen HPLC/ESI-MS genutzt. Zur Berechnung der relativ produzierten Mengen an cisund
trans-Annimycin wurden die Mittelwerte der Flächen der den Isomeren zuzuordnenden Peaks aus
den drei Proben für jeden Tag ermittelt. Das Verhältnis der Isomere zueinander wurde durch
Vergleich der Mittelwerte errechnet.
4.8.3.6 Co-Kultivierung von S. calvus und S. coelicolor
Von einer gesättigten TSB-Vorkultur von S. calvus pTESa-bldA und WT wurden 10 ml in ein 15 ml
Zentrifugenröhrchen gegeben und für 10 min mit 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen und mit einer sterilen Impföse wurde eine Hälfte einer MS-Agarplatte mit Mycel
ausgestrichen. Nach drei Tagen im Brutschrank bei 28°C wurde die andere Hälfte der Platte auf
die gleiche Weise mit S. coelicolor M145 ausgestrichen. Die Platten wurden bis zur Extraktion bei
28°C für sieben Tage im Brutschrank inkubiert.
4.9 ISOLIERUNG UND ANALYTIK VON NATURSTOFFEN
4.9.1 EXTRAKTION VON NATURSTOFFEN MIT ETHYLACETAT
Die Extraktion von Produktionskulturen zu analytischen Zwecken erfolgte mit Ethylacetat. Zu
diesem Zweck wurden 25 ml Produktionskultur in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen zentrifugiert
(21°C, 5000 rpm, 10 min) und der Überstand in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt.
Falls nötig, wurde zunächst der pH-Wert eingestellt und anschließend Ethylacetat hinzugefügt, so
dass das Verhältnis von wässriger zu organischer Phase 1:1 betrug. Nach Ausschütteln wurde
erneut zentrifugiert (21°C, 5000 rpm, 10 min), die obere organische Phase mit einer
Pasteurpipette abgenommen und in einem Rundkolben am Rotationsverdampfer eingeengt.
Dieser Vorgang wurde wiederholt, so dass jede Produktionskultur zweimal extrahiert wurde. War
die organische Ethylacetatphase völlig abrotiert, wurde der Rückstand in 500 µl Methanol gelöst
und über einen Filter der Porengröße 0,45 µm filtriert. Üblicherweise wurden 40 µl dieses
gelösten Rohextraktes nach der Methode Stand2DZ mittels analytischer HPLC/ESI-MS analysiert
(s. Tabelle 4-32).
Zur präparativen Extraktion von Substanzen durch Extraktion mit Ethylacetat wurde das wässrige
Produktionsmedium in Scheidetrichtern (Fassungsvolumen 2 l) gegeben. Nach zweimaliger
Extraktion mit Ethylacetat im Verhältnis 1:1 wurde die organische Phase über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck komplett entfernt.
38
Zur Extraktion von Naturstoffen bei der Co-Kultivierung von S. calvus und S. coelicolor (vgl. 4.8.3.6)
aus einer MS-Agarplatte wurde zunächst ein ca. 1 cm breiter Streifen der Agarplatte entlang der
Grenze der beiden Kulturen ausgeschnitten. Dieser Streifen wurde in kleinen Stücken in ein 50 ml
Zentrifugenröhrchen gegeben und auf 25 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Zentrifugenröhrchen
wurden für 10 min in ein Ultraschallbad gesetzt und im Anschluss der pH-Wert auf 4 eingestellt.
Die Extraktion mit Ethylacetat erfolgte wie oben beschrieben, jedoch wurden die Extrakte mit der
Methode Stand7DZ analysiert.
4.9.2 EXTRAKTION VON NATURSTOFFEN MIT DIAION HP-20
Für präparative Zwecke wurden große Volumina von Produktionskulturen mit Diaion HP-20
extrahiert. Die Kulturen wurden in Zentrifugenbechern in der Avanti J-20XP Beckmann-Zentrifuge
zentrifugiert (21°C, 7500 rpm, 10 min) und die Überstände vereinigt. Falls notwendig, wurde ein
bestimmter pH-Wert eingestellt und maximal 2000 ml der Überstände in 5000 ml
Erlenmeyerkolben gegeben. In diese Kolben wurde Diaion HP-20 in der Konzentration 10 g/l
gegeben, das als Sorbens lipophile Stoffe aus dem wässrigen Medium an seiner Oberfläche
anreichert. Nach 3 h bei 28°C und 180 rpm auf dem Schüttelturm wurde die Suspension über eine
Glassäule (Säulenhöhe 30 cm, ID 8 cm) abfiltriert, die im unteren Drittel mit Watte gefüllt war,
welche das Diaion HP-20 zurückhielt. Durch Anlegen von leichtem Überdruck mittels Druckluft
konnte das Filtrieren erheblich beschleunigt werden. War sämtliches Diaion HP-20 durch die
Watte abgefangen worden, wurden die lipophilen Stoffe in mehreren Waschschritten von dem
Sorbens eluiert. In den ersten beiden Schritten wurde Aceton auf das Diaion HP-20 gegeben, so
dass es vollständig bedeckt war, und für 10 min einwirken gelassen, bevor es mit leichtem
Luftdruck aus der Säule in einen Rundkolben abgelassen wurde. In den nächsten Schritten wurde
so oft mit Methanol gespült, bis das Eluat praktisch keine Färbung mehr aufwies.
Sämtliche Eluate wurden nach Einengen am Rotationsverdampfer unter mehrfachem Spülen der
Kolben mit Ethylacetat in einen Rundkolben vereinigt. Üblicherweise verblieb ein Restvolumen an
Wasser im Kolben, welches mehrfach mit Ethylacetat im Scheidetrichter extrahiert wurde bis auch
hier die organische Phase keine Färbung mehr erkennen ließ. Die organische Phase wurde jeweils
mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur kompletten Trockne am
Rotationsverdampfer eingeengt. Zur Analyse an der analytischen HPLC/ESI-MS wurde der
Rückstand in Methanol gelöst.
4.9.3 SÄULENCHROMATOGRAPHIE AN KIESELGEL
Eine grobe Abtrennung unerwünschter Stoffe in einem Rohextrakt erfolgte durch
Chromatographie an Kieselgel in einer Glassäule (Füllhöhe 30 cm, ID 2,5 cm). Zunächst musste ein
geeignetes Fließmittelsystem gefunden werden. Ein Testsystem war hier die
Dünnschichtchromatographie an mit Kieselgel beschichteten Aluplatten. Die gewünschte
Substanz sollte hier einen Rf-Wert zwischen 0,2 und 0,4 haben und möglichst gut von anderen
Stoffen getrennt sein. War ein solches System gefunden, wurde die Glassäule mit Kieselgel gefüllt,
in dem es zunächst in einem geringen Volumen des Fließmittels suspendiert und in die Säule
gefüllt wurde. Durch Anlegen von leichtem Luftdruck wurde die Säule nach und nach auf die
gewünschte Höhe gefüllt. Auf das Kieselgelbett der Säule wurde nun etwas Seesand gegeben,
damit beim späteren Nachfüllen von Fließmittel das Kieselgel möglichst nicht aufgewirbelt wird.
39
Zum Beladen der Säule wurde das Fließmittel abgelassen, bis der Seesand trocken lag, das
Kieselgel jedoch noch mit Fließmittel getränkt war; der Hahn der Säule war zu diesem Zeitpunkt
geschlossen. Der zu chromatographierende Rohextrakt wurde in einem möglichst geringen
Volumen Methanol gelöst und mit einer Pasteurpipette vorsichtig auf die Säule gegeben. Nun
wurde der Hahn geöffnet und das Methanol konnte in die Säule einsickern. Anschließend wurde
mehrfach mit dem Fließmittel nachgespült, bis der Rohextrakt vollständig an das Kieselgel
gebunden war. Nun wurde die Säule komplett mit Fließmittel gefüllt und Luftdruck angelegt, so
dass eine Tropfgeschwindigkeit von 1-2 Tropfen pro Sekunde erreicht wurde. Die einzelnen
Fraktionen wurden in Reagenzgläsern gesammelt und zunächst getestet, ob es auf einer
Kieselgelplatte zur Fluoreszenzlöschung kam. War dies der Fall, wurde eine DC-Platte mit dem
bekannten Fließmittel entwickelt. Im nächsten Schritt wurden alle Fraktionen vereinigt, die laut
den DC-Ergebnissen den gewünschten Stoff enthielten, und auf der analytischen HPLC/ESI-MS
überprüft.
4.9.4 SÄULENCHROMATOGRAPHIE AN SEPHADEX LH-20
Die Chromatographie an Sephadex LH-20 war der letzte Schritt während eines
Aufreinigungsprozesses und wurde ausschließlich mit reinem Methanol als Elutionsmittel
durchgeführt. Das Sorbens wurde in Methanol suspendiert, in eine Glassäule gefüllt und für
mindestens 12 h quellen gelassen. Die Füllhöhe betrug 40 cm bei einem Innendurchmesser von
2,5 cm. Zur Chromatographie wurde das Elutionsmittel bis zur Füllhöhe der Säule abgelassen,
dann die vorgereinigte Substanz in einer möglichst geringen Menge Methanol gelöst und mit
einer Pasteurpipette auf die Säule aufgebracht. Es wurde mehrfach nachgespült, bis der Analyt
vollständig in die Säule eingesickert war. Während des gesamten Chromatographieprozesses
betrug die Elutionsgeschwindigkeit 1-2 Tropfen pro 3 Sekunden.
Nach Ausschluss des Totvolumens wurden Fraktionen zu jeweils 2 ml gesammelt und zunächst auf
Fluoreszenzlöschung auf einer Kieselgel-DC-Platte getestet. Bei einem positiven Ergebnis wurden
die Fraktionen vereinigt und auf der analytischen HPLC/ESI-MS auf vollständige Reinheit
überprüft.
4.9.5 PRÄPARATIVE HPLC
Für Strukturaufklärungen mittels NMR und gezielte Bioaktivitätsuntersuchungen war es nötig,
Einzelsubstanzen mit einer größtmöglichen Reinheit zu gewinnen. Zum Einsatz kam hierbei ein
semipräparatives System an einer Agilent HPLC/ESI-MS der Serie 1100. Das MSD war für
semipräparative Arbeiten abgekoppelt und nicht aktiv, so dass die eluierenden Substanzen
manuell aufgefangen werden konnten. Das Säulen waren vom Typ Zorbax C18 mit einer Vorsäule
(50 x 9,4 mm, Porengröße 5 µm) und einer Hauptsäule (150 x 9,4 mm, Porengröße 5 µm). Die
Analyten waren in reinem Methanol gelöst und das Injektionsvolumen wurde so gewählt, dass bei
Detektion im Absorptionsmaximum der gewünschten Substanz der entsprechende Peak eine
Höhe von knapp über 2000 mAU hatte.
40
Tabelle 4-27: Gradient der Methode annpur zur präparativen Gewinnung von Annimycin aus S. calvus
pTESa-bldA-Kulturen.
Zeit [min]
H2O
Acetonitril
0.0
95
5
20.0
5
95
22.0
5
95
23.0
95
5
29.0
95
95
Fluss 2.5 ml/min; Säulenofen 30.0°C; Detektion 280 nm (Ref. 500 nm), 307 nm (Ref. 500 nm)
Tabelle 4-28: Gradient der Methode 1BS217 zur präparativen Gewinnung von Streptophenazin A aus S. albovinaceus
pTESa-bldA-Kulturen.
Acetonitril + 0,5% (V/V)
Essigsäure
0.0
95
5
2.0
95
5
3.0
40
60
24.0
40
60
26.0
5
95
28.0
5
95
28.1
95
5
34.0
95
95
Fluss 2.5 ml/min; Säulenofen 30.0°C; Detektion 252 nm (Ref. 400 nm), 366 nm (Ref. 500 nm)
Zeit [min]
H2O + 0,5% (V/V) Essigsäure
Tabelle 4-29: Gradient der Methode
S. glomeroaurantiacus pTESa-bldA-Kulturen.
2MH169
zur
präparativen
Gewinnung
von
Glomeromycin
Essigsäure
0.0
50
50
10.0
50
50
11.0
5
95
13.0
5
95
13.1
50
50
17.0
50
50
Fluss 2.5 ml/min; Säulenofen 30.0°C; Detektion 315 nm (Ref. 500 nm)
Zeit [min]
Tabelle 4-30: Gradient der Methode 1JN213 zur präparativen Gewinnung von J2 aus S. curacoi pTESa-bldA-Kulturen.
Essigsäure
0.0
35
65
7.0
35
65
8.0
5
95
10.0
5
95
10.1
35
65
15.0
35
65
Zeit [min]
41
aus
4.9.6 PRÄPARATIVE MPLC
An der Queen’s University in Kingston, ON, Canada kam zur präparativen Gewinnung der Substanz
WS9326A aus Kulturen von S. calvus #9 das präparative Mitteldrucksystem Biotage Isolera Prime
zum Einsatz. Die verwendete Säule war mit RP-C18 Material gefüllt und hatte die Dimensionen
39 x 157 mm. Es wurde Rohextrakt auf die Säule gegeben, der in 1 ml Methanol gelöst war.
Tabelle 4-31: Gradient der Methode “50 ml C18” zur präparativen Gewinnung von WS9326A aus S. calvus #9-Kulturen.
Essigsäure
90
10
10
90
10
90
Fluss 5 ml/min, Detektion 279 nm; CV=column volume
Volumen [CV]
0
7
10
4.9.7 ANALYTISCHE HPLC/ESI-MS
Die Analyse von Sekundärstoffen erfolgte mittels HPLC/ESI-MS der Serie 1100 von Agilent. Zur
Trennung kamen eine XBridge C18 Vorsäule (20 x 4,6 mm, Partikelgröße 3,5 µm) und eine XBridge
C18 Hauptsäule (100 x 4,6 mm, Partikelgröße 3,5 µm) zum Einsatz. Die Detektion erfolgte über
einen Diodenarray-Detektor (DAD) und einen Quadrupol-Massendetektor (MSD) mit einer
API-ESI-Quelle (atmospheric pressure electrospray ionization). Tabelle 4-32 und Tabelle 4-34
zeigen die Einstellungen des Gradienten zur Auftrennung und die Parameter der Ionisationsquelle.
Tabelle 4-32: Gradient der HPLC/ESI-MS Methoden Stand2DZ und Stand7DZ.
Essigsäure
0.0
95
5
20.0
5
95
22.0
5
95
23.0
95
5
29.0
95
95
Fluss 0.5 ml/min; Säulenofen 30.0°C; Detektion 250 nm (Ref. 400 nm), 260 nm (Ref. 400 nm), 279
nm (Ref. 500 nm), 307 nm (Ref. 500 nm), 340 nm (Ref. 500 nm); für Stand7DZ wurde bei 305 nm
(Ref. 500 nm), 406 nm (Ref. 600 nm) und 537 nm (Ref. 700 nm) detektiert
Zeit [min]
42
Tabelle 4-33: Gradient der HPLC/ESI-MS Methode anniso10.
Essigsäure
0.0
95
5
2.0
95
5
2.1
50
50
16.0
50
50
16.1
5
95
18.0
5
95
18.1
95
5
24.0
95
5
Zeit [min]
Tabelle 4-34: Parameter der ESI-Ionisationsquelle.
Parameter
MSD Signals Settings (MSD-Negative und
MSD-Positive)
Drying Gas Flow
Nebulizer Pressure
Drying Gas Temperature
Capillary Voltage
Einstellung
50-1200 Da, Fragmentor 200, Stepsize 0.15
12.0 l/min
50 psig
300 °C
3500 V (Negative), 2000 V (Positive)
4.9.8 UNTERSUCHUNGEN ZUR BIOAKTIVITÄT
Um die Bioaktivität einzelner Stoffe oder Rohextrakte zu überprüfen wurde ein Agardiffusionstest
durchgeführt. Die zu untersuchenden Mikroorganismen wurden zunächst, wie in Abschnitt 4.8
beschrieben, zu einer dichten Flüssigkultur angezogen. 250 µl der Kultur wurden mit sterilem
Anzuchtmedium auf 1 ml verdünnt und davon 500 µl auf eine Agarplatte des Anzuchtmediums
gegeben. Waren die Platten getrocknet, wurde auf Filterplättchen ein in MeOH gelöster
Rohextrakt bzw. Reinstoff pipettiert. War das Lösungsmittel verdampft wurde das Filterplättchen
mit einer Pinzette auf die Agarplatten platziert. Als Positivkontrolle wurden für Bakterien 25 µg
Apramycin auf das Filterplättchen gegeben, für Pilze waren es 50 µg Nystatin; Negativkontrolle
war in allen Fällen 10 µl reiner MeOH. Die Platten wurden anschließend bei 37 oder 28°C über
Nacht bebrütet, bei Testung der Aktivität gegen S. albus jedoch für zwei Tage.
Die Auswirkungen von Annimycin auf andere Actinomyceten wurde an der McMaster Universität
in Hamilton, ON, Kanada getestet. Zusätzlich wurden die Effekte einer Co-Kultivierung von
S. calvus pTESa-bldA und WT mit S. coelicolor auf einer MS-Agarplatte untersucht. Von einer dicht
gewachsenen S. calvus TSB-Kultur wurde mit Hilfe einer sterilisierten Impföse eine Hälfte einer
MS-Agarplatte ausgestrichen. Nach drei Tagen bei 28°C wurde die andere Hälfte der Platte mit
einer dicht gewachsenen S. coelicolor Kultur ausgestrichen und die Entwicklung des Wachstums,
sowie die Produktion von farbigen Pigmenten über sieben Tage beobachtet. Nach dieser Zeit
wurde entlang der Grenzfläche ein ca. 1 cm breiter Streifen des Agars ausgeschnitten, so dass zu
gleichen Teilen S. calvus und S. coelicolor Kultur betroffen war. Der Agar wurde in kleinen Stücken
in ein 50 ml Zentrifugationsröhrchen gegeben, 20 ml Wasser zugesetzt und dieses Gemisch für 10
43
min mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurde der wässrige Überstand auf pH 4 eingestellt
und analog zu 4.9.1 mit Ethylacetat extrahiert.
4.10 SOFTWARE, DATENBANKEN UND INTERNETSERVICES
Tabelle 4-35: Verwendete Software.
Bezeichnung
ChemStation
Rev. A09.03
MestReNova
8.1.2-11880
Clone Manager
Suite 7
ChemDraw Ultra
9.0
Verwendung
Auswertung von
HPLC/ESI-MS-Chromatogrammen
Auswertung von NMR-Spektren
Analyse und Planung von
Klonierungsexperimenten, Erstellung von
Primersequenzen
Erstellung von chemischen
Strukturformeln, Berechnung molekularer
Massen
Hersteller/Anbieter
Agilent
Mestrelab Research S.L.
(Santiago de Compostela,
Spanien)
Scientific & Educational Software
(Durham, USA)
CambridgeSoft (Waltham, USA)
Tabelle 4-36: Verwendete Datenbanken und Internetservices.
Bezeichnung
PubChem
RNAfold
NCBI BLAST
antiSMASH
TTAlynx
Reich NMR
database
Verwendung/Inhalt
Veröffentlichte chemische
Strukturen
Analyse der Faltungen von
tRNA
Vergleich von
Proteinfunktionen auf
Sequenzebene
Detektion möglicher
Biosynthesegencluster in
Actinomyceten
Analyse von Gensequenzen
auf TTA-Codons
Chemische Verschiebungen
funktioneller Gruppen bei
der NMR-Spektroskopie
Anbieter/Website
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://www.secondarymetabolites.org/
http://ttalynx.bio.lnu.edu.ua/cgi-bin/index.pl
http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/chem605/
44
Ergebnisse
5 ERGEBNISSE
5.1 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG
ANNIMYCIN IN S. CALVUS
DES
BIOSYNTHESEGENCLUSTERS
DES
POLYENS
Das Polyen Annimycin (Abbildung 5-1) wurde erstmals aus Produktionskulturen des Stamms
Streptomyces calvus von Prof. David Zechel aus dem Dept. of Chemistry der Queen’s University in
Kingston, ON, Canada isoliert (Kalan et al. 2013). Der WT von S. calvus besitzt eine Mutation im
bldA-Gen, wodurch dieses unfunktionell wird. Nach Komplementierung dieses Gendefekts
veränderten sich sowohl die morphologische Entwicklung als auch der Sekundärmetabolismus.
Produktionskulturen von S. calvus bldA+ produzierten in verschiedenen Medien Substanzen, die
als eine Mischung aus cisund trans-Annimycin identifiziert werden konnten. Da S. calvus bisher
nicht dafür bekannt war polyenartige Substanzen zu produzieren, war durch die
bldA-Komplementierung ein bisher inaktives Biosynthesegencluster aktiviert worden. Die
Identifizierung des Clusters war aus zweierlei Gründen interessant. Zum Einen um Erkenntnisse
über die Abhängigkeit der Biosynthese von Annimycin von einer funktionsfähigen bldA-tRNA zu
gewinnen und zum Anderen um das ungewöhnliche gleichzeitige Auftreten von cisund
trans-Isomeren einer Substanz zu klären.
Abbildung 5-1: Strukturformeln der Doppelbindungsisomere des Polyens Annimycin. Links 4-Z-Annimycin
(cis-Annimycin), Rechts 4-E-Annimycin (trans-Annimycin).
5.1.1 GENINAKTIVIERUNGEN ZUR IDENTIFIZIERUNG DES BIOSYNTHESEGENCLUSTERS FÜR
ANNIMYCIN
Die Analyse der vorhandenen partiellen Genom-Daten von S. calvus mit antiSMASH (Blin et al.
2013) zeigte, dass es mehrere Kandidaten für das Biosynthesegencluster für Annimycin gibt. Die
Struktur der Polyenkette lässt darauf schließen, dass sie von einer Polyketidsynthase vom Typ I
(PKS I) biosynthetisiert wird. Zur Identifizierung des Biosynthesegenclusters für Annimycin wurden
Inaktivierungsexperimente mittels Insertionsmutagenese durchgeführt (vgl. 4.7.1). Im Anschluss
wurde analysiert, ob die Mutanten noch in der Lage sind Annimycin zu produzieren. Für die
Inaktivierungen wurden Gene für PKS I auf den contigs 1697 und 3100 ausgewählt, da diese eine
hohe Ähnlichkeit zu bereits charakterisierten PKS I-Genen besitzen, die Polyene biosynthetisieren
(McAlpine et al. 2005; Chen et al. 2003).
Mit den Primerpaaren node1697for/node1697rev und node3100for/node3100rev (s. Tabelle
4-24) wurden die Fragmente, die zur Inaktivierung der PKS I-Gene nötig sind, amplifiziert. Als
45
Ergebnisse
Matrize diente frisch isolierte genomische DNA von S. calvus pTESa-bldA (s. 4.6.1.3). Für contig
1697 ergab sich ein Fragment der Größe 1875 bp und für contig 3100 ein Fragment der Größe
1925 bp. Innerhalb dieser Fragmente traten natürliche Restriktionsschnittstellen auf, die zur
Klonierung in den Vektor pUC19 genutzt wurden. Nach Restriktionsverdau des Fragments 1697
mit BamHI wurde ein 1341 bp großes Fragment in den ebenfalls mit BamHI verdauten Vektor
ligiert. Für Fragment 3100 wurde EcoRI als Restriktionsenzym verwendet, was es erlaubte ein
1836 bp großes Fragment in die EcoRI-Schnittstelle von pUC19 zu ligieren. Die resultierenden
Konstrukte pUC19_del1697 bzw. pUC19_del3100 wurden anschließend um eine SpectinomycinResistenzkassette aus dem Vektor pLERE-Spec-oriT ergänzt, die in eine XbaI Schnittstelle von
pUC19_del1697
bzw.
pUC19_del3100
kloniert
wurde.
Die
Gesamtgröße
der
Inaktivierungsvektoren betrug für pUC19_del1697_Spec 5405 bp und für pUC19_del3100_Spec
5900 bp. Zusätzlich wurde die Spectinomycinresistenzkassette auch in den leeren Vektor pUC19
kloniert um für die anstehende intergenerische Konjugation über eine Negativkontrolle zu
verfügen. Die Größe des Konstruktes pUC19_Spec betrug 4064 bp.
Zur Inaktivierung der PKS I-Gene in S. calvus pTESa-bldA wurden die Inaktivierungskonstrukte
mittels intergenerischer Konjugation in S. calvus pTESa-bldA eingebracht (vgl. 4.6.3). Die
Überschichtung der MS-Agarplatten mit den Selektionsantibiotika Apramycin, Spectinomycin und
Phosphomycin erfolgte nach 8 h im Brutschrank. Nach sechs Tagen zeigten sich Exkonjuganden
auf den Konjugationsplatten, wobei die Anzahl an Exkonjuganden bei pUC19_del3100_Spec
ungefähr dreimal so groß war wie bei pUC19_del1697_Spec. In beiden Fällen wurden 20 zufällig
ausgewählte Exkonjuganden auf eine frische MS-Agarplatte, die entsprechende
Selektionsantibiotika enthielt, überpickt.
5.1.2 PRODUKTIONSANALYSE
Die Analyse der Auswirkung der Insertionsmutagenese erfolgte wie in Abschnitt 4.8.3
beschrieben. Während aller Schritte waren die Medien für die Mutanten mit Apramycin und
Spectinomycin versetzt, die Medien der Positivkontrolle S. calvus pTESa-bldA enthielten nur
Apramycin. Das Produktionsmedium war patent-Medium und die Kulturen wurden nach sieben
Tagen Wachstum bei 28°C extrahiert (s. 4.9.1). Eine Einstellung des pH-Wertes erwies sich im
Laufe der Experimente als nicht notwendig im Hinblick auf die Extrahierbarkeit von Annimycin.
Die Ergebnisse der Testextraktionen sind in Abbildung 5-2 A dargestellt. Die Peaks für cisund
trans-Annimycin sind mit 1 bzw. 2 markiert, identifizierbar über das charakteristische
UV-Absorptionsspektrum und das Signal im MS-Spektrum (Negativ-Modus) für m/z=330.3
(Abbildung 5-2 B). Die Positivkontrolle S. calvus pTESa-bldA hat deutlich sowohl cis- als auch
trans-Annimycin produziert, außerdem ist ein Signal für eine weitere Substanz erkennbar (3),
deren Struktur zum Zeitpunkt der Versuche unbekannt war, jedoch inzwischen als nicht-ribosomal
gebildetes Peptid (NRP) identifiziert wurde (s. 5.3).
Die Insertionsmutante S. calvus pTESa-bldA x 1697 unterscheidet sich kaum von der
Positivkontrolle. Es sind Signale sowohl für 1, als auch 2 erkennbar und auch das Signal für 3
bewegt sich im selben Bereich wie das der Positivkontrolle. Es lässt sich somit festhalten, dass
durch eine Insertionsmutagenese im PKS I-Gen im contig 1697 keine Beeinflussung der Produktion
von Annimycin erfolgt.
46
Ergebnisse
Anders ist es im Fall von S. calvus pTESa-bldA x 3100, denn hier ist weder ein Signal für 1 noch ein
Signal für 2 detektierbar. Die extrahierbare Menge an 3 wurde in diesem Fall ebenfalls beeinflusst,
da das entsprechende Signal deutlich an Intensität dazu gewonnen hat. Dieses Ergebnis deutet
darauf hin, dass das PKS I-Gen im contig 3100 eine unerlässliche Rolle in der Biosynthese von
Annimycin spielt.
Abbildung 5-2: (A) Ausschnitt aus den Chromatogrammen (λ=279 nm) der Extrakte von S. calvus pTESa-bldA (unten)
sowie den Insertionsmutanten S. calvus pTESa-bldA x 1697 (Mitte) und S. calvus pTESa-bldA x 3100 (oben).
(B) UV-Absorptions- und Massenspektrum (Negativ-Modus) für 1 und 2 (entsprechend cisund trans-Annimycin).
5.1.3 INAKTIVIERUNGSNACHWEIS FÜR S. CALVUS PTESA-BLDA X 3100
Die Verifizierung der Inaktivierung des PKS I-Gens im contig 3100 wurde über eine PCR vollzogen.
Es wurden drei unterschiedliche Primeransätze gewählt, mit denen die Integration des internen
Fragments an der gewünschten Stelle gezeigt werden konnte. Die Sequenzen der verwendeten
Primer sind in Tabelle 4-24 aufgeführt. Eine genaue Erklärung der Durchführung mit einer
schematischen Darstellung des Ansatzes ist in Abschnitt 4.7.1.2 gegeben. In allen Fällen diente
frisch isolierte genomische DNA als Matrize. Für den Nachweis der Insertion wurden zwei
repräsentative Mutanten von S. calvus pTESa-bldA x 3100 ausgewählt. Das Ergebnis ist in
Abbildung 5-3 gezeigt.
Die Ansätze 1-3 mit den Primern del3100for (Primer 1) und del3100rev (Primer 2) dienten als
Kontrolle der PCR. Primer 1 setzte upstream des 5‘-Endes des internen Fragments an, diente also
zur Bestätigung der korrekten Positionierung des internen Fragments. Primer 2 setzte innerhalb
des internen Fragments an, so dass sowohl bei S. calvus pTESa-bldA als auch bei den
47
Ergebnisse
Insertionsmutanten eine Amplifizierung zu erwarten war. Tatsächlich zeigte sich in allen Fällen ein
Fragment mit der erwarteten Größe von 2,3 kbp.
Bei den Ansätzen 4-6 wurde neben Primer 1 der Primer del3100rev2 (Primer 3) verwendet, der
downstream des internen Fragments ansetzt. Eine Amplifizierung eines 3,2 kbp großen Fragments
ist somit nur zu erwarten wenn ein intaktes Gen vorliegt. Für das durch die Insertionsmutagenese
zerstörte Gen wäre ein Fragment mit der Größe von 7,3 kbp zu erwarten, da der komplette
Inaktivierungsvektor in die DNA integriert wurde. Die Elongationszeit war jedoch für ein Fragment
dieser Größe absichtlich zu kurz gewählt. Entsprechend kam es auch nur bei Ansatz 4 zur
Amplifizierung eines Fragments in der erwarteten Größe.
Für die Ansätze 7-9 wurde der Primer delannfor (Primer 4) in Kombination mit Primer 1
eingesetzt. Die Sequenz von Primer 4 war so gewählt, dass er im Gen der SpectinomycinResistenzkassette (aadA) binden konnte. Dieses Gen war nur bei den Insertionsmutanten, nicht
jedoch bei S. calvus pTESa-bldA vorhanden. Dementsprechend kam es auch nur bei den
Insertionsmutanten zu einer Amplifizierung eines Fragments in der erwarteten Größe von 3,3 kbp.
Durch die Ansatzpunkte der Primer 1 und 4 war somit sichergestellt, dass der Inaktivierungsvektor
pUC19_del3100_Spec an der gewünschten Stelle in das Genom integriert wurde.
Abbildung 5-3: Gelbild nach Agarose-Gelelektrophorese und Inkubation mit Ethidiumbromid zum Nachweis der
Inaktivierung des PKS I-Gens im contig 3100 von S. calvus pTESa-bldA x 3100. 1 kb Ladder von NEB als Größenstandard.
Ansätze 1-3 als PCR-Kontrollen (Fragmentgröße: 2,3 kbp), Ansätze 4-6 zum indirekten Nachweis der Inaktivierung
(Fragmentgröße: 3,2 kbp), Ansätze 7-9 zum direkten Nachweis der Inaktivierung (Fragmentgröße: 3,3 kbp).
48
Ergebnisse
5.1.4 ANALYSE DES BIOSYNTHESEGENCLUSTERS
Weitere Gene, die für die Biosynthese von Annimycin wichtig sind, wurden im Labor von Prof.
Zechel auf dem contig 2782 gefunden. Wichtig für die Identifizierung war das Auffinden von
Genen für die Biosynthese des Aminohydroxycyclopentenon-Rings (C5N) durch Vergleich mit der
Sequenz der Biosynthesegene für die Substanz ECO-02301, die ebenfalls dieses Strukturelement
enthält (McAlpine et al. 2005). Zwischen contig 3100 und contig 2782 besteht keine Überlappung
der DNA-Sequenzen, doch konnte die Sequenzierungslücke durch PCR-Amplifizierung und
Sequenzierung eines 1,3 kbp großen Fragments geschlossen werden. Durch die Identifizierung der
beteiligten Biosynthesegene ist es möglich die komplette Biosynthese für Annimycin zu
beschreiben. Grafisch ist dies in Abbildung 5-4 A dargestellt, Tabelle 5-1 gibt einen Überblick über
bereits charakterisierte Gene, die die größte Ähnlichkeit zu den Biosynthesegenen von Annimycin
haben. Das gesamte Biosynthesecluster hat eine Größe von 35 kbp. Für die strukturellen Gene
lassen sich fünf offene Leserahmen (ORF) vorhersagen. Bemerkenswerterweise enthält keines der
identifizierten Gene ein TTA-Codon und es wurde kein Gen identifiziert, das für eine Isomerase
codiert, welche die Doppelbindung zwischen C4 und C5 isomerisieren könnte.
Das ann2-Genprodukt hat eine sehr große Ähnlichkeit mit der 5-Aminolevulinat-Synthase von
ECO-02301 (McAlpine et al. 2005) welche eine Claisen-artige Kondensation von Glycin und
Succinyl-CoA zu 5-Aminolevulinat katalysiert. Das Genprodukt von ann3 besitzt eine hohe
Ähnlichkeit mit der Acyl-CoA-Ligase des gleichen Biosynthesewegs und aktiviert 5-Aminolevulinat
als einen Thioester. Dieser unterläuft anschließend eine intramolekulare Zyklisierung über ein
Carbanion, das an C5 erzeugt wurde. Das ann2-Genprodukt katalysiert hierbei wahrscheinlich
diese Zyklisierung durch Stabilisierung des Carbanions über ein Pyridoxal-Phosphat, wie es von
Zhang et al. 2010 beschrieben wurde. Das Genprodukt von ann1 ist homolog zur ATP abhängigen
Amidsynthase des ECO-02301 Biosynthesewegs und könnte die Verknüpfung der C5N-Gruppe mit
der Polyensäure katalysieren um schließlich Annimycin zu bilden.
Die Gene ann4 und ann5 codieren für Polypeptide, die PKS I entsprechen. Das Genprodukt für
ann4 lässt sich in vier Module einteilen und hat die größte Ähnlichkeit zu PKS I anderer Polyene
(s. Tabelle 5-1). Die Anordnung der Module und die Präsenz von KR- und DH-Domänen in jedem
Modul lassen auf die Biosynthese eines Triens schließen. Modul 1 enthält nur eine AT- und eine
ACP-Domäne, wobei die AT-Domäne laut ihrer AS-Sequenz spezifisch Propionyl-CoA auf das ACP
lädt (Abbildung 5-4 B). Auf dieselbe Art lassen sich die Substratspezifitäten der restlichen
AT-Domänen in ann4 vorhersagen, was letztlich zur Biosynthese der ersten zehn Kohlenstoffe von
Annimycin führt. Im ann5-Genprodukt finden sich die Module fünf und sechs, wobei Modul sechs
mit einer TE-Domäne endet. Das Substrat der ann5-AT-Domänen ist laut Vorhersage in beiden
Fällen Malonyl-CoA. Der Sequenzvergleich der KR-Domänen aller Module lässt darauf schließen,
dass es sich in allen Fällen um Reduktasen vom B1-Typ handelt (Abbildung 5-4 C), von denen
bekannt ist, dass sie D-3-Hydroxyacyl-Intermediate bilden (Caffrey 2003; Keatinge-Clay 2007). Die
Vorhersage der Konfiguration der Doppelbindungen wäre typischerweise in allen Fällen E, da
normalerweise eine syn-Eliminierung von Wasser von den DH-Domänen katalysiert wird
(Keatinge-Clay 2008; Valenzano et al. 2010). Betrachtet man die Ergebnisse aus 5.1.5 ist es jedoch
wahrscheinlich, dass durch die DH in Modul 5 eine Z-konfigurierte Doppelbindung zwischen C4
und C5 gebildet wird. Die detektierte DH-Domäne in Modul 6 katalysiert keine Eliminierung der
Hydroxylgruppe an C3, was den Rückschluss zulässt, dass sie defekt ist, obwohl sich auf
49
Ergebnisse
Sequenzebene keine Anhaltspunkte dafür finden lassen. Die Konfiguration an C3 lässt sich
basierend auf den Cahn-Ingold-Prelog-Regeln als S voraussagen (Caffrey 2003).
Abbildung 5-4: (A) Darstellung des Annimycin-Biosynthesegenclusters, der durch die Gene codierten Enzyme und der
vorgeschlagenen Biosynthese. Gezeigt sind außerdem die contigs 2782 und 3100 der partiellen Genom-Sequenz von
S. calvus zusammen mit dem überlappenden PCR-Fragment und die Stelle der Insertionsmutagenese durch
pUC19_del3100_Spec. Modul 6 enthält eine offensichtlich defekte DH-Domäne. PLP = Pyridoxylphosphat,
C5N = Aminohydroxycyclopentenon. (B) Sequenzmotive der detektierten AT-Domänen und Vorhersage zu deren
Substratspezifität. (C) Sequenzmotive der detektierten KR-Domänen. Die markierten Bereiche sind nach Keatinge-Clay
nummeriert und lassen sich als KR-Domänen vom B1-Typ vorhersagen (Keatinge-Clay 2007).
Die beschriebenen Biosynthesegene werden von vier weiteren ORF flankiert. ORF1 codiert für
eine Phosphohistidinphosphatase, die zu einer Familie von metabolischen, regulatorischen und
Signal-Phosphatasen gehört. Zu dieser Familie gehört auch das Protein SixA aus E. coli, welches
ein Zwei-Komponenten-Regulations-System in der „anearobic respiratory control“ (ARC) Antwort
kontrolliert (Hakoshima und Ichihara 2007). Daraus lässt sich schließen, dass das Genprodukt von
ORF1 eine regulatorische Funktion einnimmt. ORF2 codiert für ein Protein der YigZ-Familie, deren
Funktion bisher noch unbekannt ist. Die Struktur eines YigZ-Proteins aus E. coli ist bekannt
(Park et al. 2004). Der C-Terminus ähnelt dem Nukleinsäure bindender Proteine und der
N-Terminus zeigt Ähnlichkeit zu den IMPACT-Proteinen, die eine Rolle in der Regulation der
Translation spielen. ORF3 ist sehr ähnlich zu einem Membran-Efflux-Transporter, der vom Gen
50
Ergebnisse
ymR4 im Biosynthesegencluster von YM-216319 codiert wird (Jian et al. 2012), ein Hinweis auf
eine Funktion als Transporter für Annimycin. Die höchste Ähnlichkeit für ORF4 lässt sich für eine
ATP-abhängige Helicase finden, eine Funktion in der Biosynthese von Annimycin erscheint
unwahrscheinlich.
Tabelle 5-1: Funktionen der ORF im Biosynthesegencluster von Annimycin.
homologe Genprodukte
identische
/ ähnliche
AS [%]
GenBank
Accession
Number
vorgeschlagene
Funktion
ORF1 (130)
S. viridochromogenes
Phosphohistidinphosphatase
(cd07067)
79 / 88
ZP_07302293
Regulator- oder
Signalfunktion
ORF2 (199)
S. hygroscopicus
Protein der YigZ Familie
(TIGR00257)
93 / 96
YP_006243872
unbekannt
ann1 (554)
S. aizunensis
Amidsynthase
62 / 76
AAX98208
C5N Biosynthese
ann2 (429)
S. aizunensis
5-Aminolevulinatsynthase
81 / 92
AAX98209
C5N Biosynthese
ann3 (642)
S. aizunensis
Acyl-CoA Ligase
56 / 70
AAX98210
C5N Biosynthese
ann4 (5635)
Streptomyces sp. FR008
FscC
FR-008 / Candicidin PKS
53 / 64
AAQ82564
ann5 (3790)
S. aizunensis
ORF17
50 / 61
AAX98192
ORF3 (475)
Streptomyces nobilis
ymR4
74/ 83
AFJ68084
Membran Efflux
Protein
ORF4 (675)
S. hygroscopicus subsp.
jinggangensis
ATP-abhängige Helicase
89 / 93
YP_006249721
unbekannt
Gen
(Anzahl AS)
51
Typ I PKS
Module 1-4
Typ I PKS
Module 5-6 + TE
Ergebnisse
5.1.5 ANALYSE DES PRODUKTIONSVERLAUFS DER ANNIMYCIN ISOMERE
Ein Charakteristikum von Annimycin ist, dass bei der Extraktion von beispielsweise
SG+-Produktionskulturen nach fünf Tagen eine Mischung aus Doppelbindungsisomeren im
Verhältnis 1 : 1 nachweisbar ist (Kalan et al. 2013). In den meisten Fällen sind Doppelbindungen in
Polyketiden vom Typ I trans konfiguriert, die cis Konfiguration ist hingegen verhältnismäßig selten,
dabei ist normalerweise nur die eine oder die andere Form nachweisbar (Vergnolle et al. 2011).
Das gleichzeitige Auftreten einer trans- und einer cis-konfigurierten Doppelbindung an derselben
Position eines Moleküls ist deshalb ungewöhnlich. Aus diesem Grund ist es lohnend den
Produktionsverlauf von Annimycin genauer zu untersuchen um Erkenntnisse über die Bildung
dieser Isomere zu gewinnen. Zu diesem Zweck wurden insgesamt 21 Produktionskulturen von
S. calvus pTESa-bldA in SG+-Medium, wie in 4.8.3.5 beschrieben, zu unterschiedlichen Zeitpunkten
untersucht.
Da die Berechnung des Verhältnisses von cis- zu trans-Annimycin über die Flächen der jeweiligen
Peaks in den Chromatogrammen erfolgen sollte, war es zunächst notwendig, eine entsprechende
Methode zur Analyse mittels HPLC/ESI-MS zu entwickeln. Basierend auf der Methode Stand2DZ
war es möglich, durch Einführung einer isokratischen Stufe über 14 min, eine Trennung der
Isomeren-Peaks zu erreichen. Die Trennung war mit einem Auflösungsfaktor von Rs=1,97 groß
genug für eine getrennte Integrierung der Peaks (vgl. Abbildung 5-6 A). Die entsprechende
Methode anniso10 ist in Tabelle 4-33 beschrieben.
Betrachtet man die insgesamt produzierte Menge an Annimycin, unter Berücksichtigung der zur
Analyse eingesetzten Mengen an Rohextrakt, wird das Maximum zwischen dem zweiten und dem
dritten Tag erreicht (Abbildung 5-5 A). Das Verhältnis der Isomere zueinander ändert sich im Laufe
der Zeit (Abbildung 5-5 B). Am ersten Tag ist die insgesamt produzierte Menge noch gering und
das cis-Isomer ist dominierend (Verhältnis 4,0 : 1). Zwischen Tag eins und Tag zwei steigt die
detektierbare Menge an Annimycin stark an und das Verhältnis cis : trans entwickelt sich mit
4,6 : 1 noch etwas stärker zu Gunsten des cis-Isomers. Am dritten Tag ist die Menge an Annimycin
insgesamt kaum verändert, das Verhältnis ist mit 3,1 : 1 jedoch hin zu einem größeren Anteil an
trans-Isomer verschoben. Zu Tag vier hin fällt die insgesamt detektierbare Menge steil ab und das
Verhältnis cis:trans hat sich mit 2,0 : 1 weiter zu Ungunsten des cis-Isomers entwickelt. Zwischen
Tag fünf und sieben kommt es zu einer weiteren Abnahme der detektierbaren Menge an
Abbildung 5-5: (A) Entwicklung der Gesamtpeakflächen für cisund trans-Annimycin bei Anzucht von S. calvus pTESa-bldA
+
in SG -Medium über sieben Tage, (B) Entwicklung des Verhältnisses von cis- zu trans-Annimycin über sieben Tage berechnet
über die jeweiligen Peakflächen.
52
Ergebnisse
Gesamt-Annimycin. Am Übergang von Tag vier zu Tag fünf kommt es außerdem zu einer
Umkehrung des cis : trans-Verhältnisses; es beträgt an Tag fünf 0,8 : 1, an Tag sechs 0,6 : 1 und
schließlich 0,5 : 1 an Tag sieben.
Bei Betrachtung der Chromatogramme der untersuchten Proben fällt ein weiterer, bisher
unbekannter Peak bei 10.6 min auf (Abbildung 5-6 A, markiert mit 4). Das zugehörige
UV-Absorptionsspektrum hat die für Polyene typische Form mit drei eng beieinander liegenden
Maxima (Norman et al. 1972). Das ESI-MS-Spektrum (Negativ-Modus) zeigt ein deutliches Signal
für m/z=235.2 (Abbildung 5-6 C). Diese detektierbare Masse wäre zu erwarten wenn die
Polyketidkette von Annimycin frei vorliegen würde und noch nicht mit der C5N-Einheit verknüpft
wäre. Abbildung 5-6 D zeigt einen Vorschlag für die Struktur dieser freien Polyketidkette
basierend auf den Informationen, die aus den o.g. Spektren ersichtlich sind. Nennenswerte
Mengen an 4 sind nur an den Tagen zwei, drei und vier detektierbar. Ab Tag fünf tritt bei den
Chromatogrammen (λ=305 nm) ein Peak auf, der zwar eine ähnliche Retentionszeit besitzt, jedoch
ein UV-Absorptionsspektrum zeigt, welches sich deutlich von dem für 4 unterscheidet. Wird
m/z=235.2 aus dem MSD-Chromatogrammen im Negativ-Modus extrahiert, wird deutlich, dass,
ähnlich wie bei cisund trans-Annimycin, an Tag zwei und drei die größten Mengen detektierbar
sind (Abbildung 5-6 B). An Tag vier ist die Menge bereits deutlich geringer und ab Tag fünf quasi
nicht mehr existent. Das Produktionsmaximum an Tag zwei und drei wird noch deutlicher, bei
Berücksichtigung der Tatsache, dass für diese Proben nur jeweils 15 µl Rohextrakt zur Vermessung
auf die HPLC/ESI-MS gegeben wurden, an den anderen Tagen jedoch 40 µl.
Abbildung 5-6: (A) Ausgewählte Chromatogramme bei λ=305 nm der Produktionsanalyse von Annimycin über sieben
Tage. Relevante Peaks sind zu sehen für cis-Annimycin (1), trans-Annimycin (2) und ein mögliches weiteres Polyen (4).
(B) Extraktion von m/z=235.2 aus ausgewählten Chromatogrammen im MSD-Negativ-Modus der Produktionsanalyse
von Annimycin über sieben Tage. (C) UV-Absorptionsspektrum und ESI-MS-Spektrum im Negativ-Modus für 4.
(D) Strukturvorschlag für 4 basierend auf Informationen aus UV-Absorptions- und ESI-MS-Spektrum.
53
Ergebnisse
5.2 BIOAKTIVITÄT VON ANNIMYCIN
Im Jahr 2005 wurde von Yang et al. die Entdeckung des Moleküls Sch725424 veröffentlicht, das
aus Kulturen von Kitasatospora sp. gewonnen wurde. Die Struktur ist beinahe identisch mit der
von trans-Annimycin, mit dem Unterschied, dass die Polyenkette nur 12 statt 13 C-Atome lang ist.
Bei cis-Annimycin ist die Konfiguration der Doppelbindung zwischen C4 und C5 ein zusätzlicher
Unterschied. Für Sch725424 wurde eine starke Bioaktivität gegen S. aureus festgestellt (MIC um
1 µg/ml). Es ist also interessant zu erfahren, ob die strukturellen Unterschiede bei Annimycin eine
Auswirkung auf die Bioaktivität haben.
5.2.1 HPLC-REINIGUNG VON ANNIMYCIN
Im Laufe dieser Arbeit wurde festgestellt, dass es bei der Reinigung von Annimycin oft zu
Problemen aufgrund der Zersetzung des Moleküls kam. Wahrscheinlich wird die Zersetzung durch
Säure in den Fließmitteln bei chromatographischen Verfahren verursacht. Eine Trennung von cisund trans-Annimycin im analytischen Maßstab ist möglich (Abbildung 5-6 A), doch ließ sich die
Methode nicht im präparativen Maßstab durchführen. Aus diesem Grund wurde die
HPLC-Methode annpur entwickelt (Tabelle 4-27), bei der den Fließmitteln keine Essigsäure
zugesetzt ist. Dies hat zur Folge, dass sich Annimycin nicht zersetzt, jedoch auch keine Trennung
der Isomere möglich ist. Um dennoch möglichst reines cis-Annimycin zu erhalten, wurden
Produktionskulturen von S. calvus pTESa-bldA in insgesamt 4 l HA-Medium angezogen (s. 4.8.3.2),
was dazu führt, dass weit mehr cis- als trans-Annimycin gebildet wird. Nach sieben Tagen wurde
mittels Diaion HP-20 extrahiert (s. 4.9.2).
Der Rohextrakt wurde direkt mittels semipräparativer HPLC mit der Methode annpur gereinigt.
Das erhaltene Isomerenverhältnis cis : trans betrug 10 : 1, berechnet anhand des Verhältnisses
der Peakflächen bei λ=307 nm von 1 zu 2 (Abbildung 5-7 A). Die ausreichende Abtrennung von
Verunreinigungen wurde über das Chromatogramm bei λ=250 nm überprüft (Abbildung 5-7 B).
Bei den Signalen, die mit dem Symbol „*“ gekennzeichnet sind, ist aufgrund des
UV-Absorptionsspektrums davon auszugehen, dass es sich um Abbauprodukte von Annimycin
handelt, die noch eine polyenartige Struktur besitzen. Die Gesamtausbeute des Prozesses waren
3,9 mg, die nach Kanada an Maulik Thaker im Dept. of Biochemistry and Biomedical Sciences an
der McMaster University in Hamilton, ON verschickt wurden um Bioaktivitätstests durchzuführen.
54
Ergebnisse
Abbildung 5-7: (A) Chromatogramm bei λ=307 nm des aus Produktionskulturen von S. calvus pTESa-bldA in HA-Medium
extrahierten und mit der Methode annpur gereinigten Isomerengemisches von cis-Annimycin (1) und
trans-Annimycin (2) zur Überprüfung des Isomerenverhältnisses. (B) Chromatogramm bei λ=250 nm des aus
Produktionskulturen von S. calvus pTESa-bldA in HA-Medium extrahierten und mit der Methode annpur gereinigten
Isomerengemisches von cis-Annimycin (1) und trans-Annimycin (2) zur Überprüfung der Reinheit. Bei den mit dem
Symbol * gekennzeichneten Signalen handelt es sich wahrscheinlich um Abbauprodukte von Annimycin. Es ist
beispielhaft ein UV-Absorptionsspektrum der möglichen Abbauprodukte gezeigt.
55
Ergebnisse
5.2.2 BIOAKTIVITÄTSTEST MIT ANNIMYCIN
Bei den Bioaktivitätstests von Annimycin zeigte sich, dass bei Einsatz von 50 µg Annimycin, gelöst
in Methanol, auf einem Filterplättchen nur eine Aktivität gegen andere Actinomyceten-Stämme
festzustellen war. Diese Aktivität wurde nach sieben Tagen Wachstum beurteilt. Als
Positivkontrolle dienten 25 µg Apramycin und bei der Negativkontrolle wurden 10 µl Methanol
eingesetzt. Die Wirkung auf die getesteten Stämme bestand darin, dass es zu einer Inhibierung
der morphologischen Differenzierung kam (Abbildung 5-8). Besonders deutlich ist dies bei
Glycomyces sp. WAC1371 und Kribella sp. WAC1363 erkennbar. Für Streptomyces coelicolor
M1154 wird die Inhibierung deutlich, wenn die Platte von unten mit Licht beschienen wird. Bei
Amycolatopsis sp. WAC1227 und Nonomuraea sp. WAC1424 ist die Aktivität nur schwach
ausgeprägt. In allen untersuchten Fällen waren die Teststämme noch in der Lage vegetativ bis an
das Filterplättchen heranzuwachsen, jedoch kam es nicht zu einer Sporenbildung.
Abbildung 5-8: Test der Bioaktivität von Annimycin gegen die Actinomyceten-Stämme Amycolatopsis sp. WAC1227,
Streptomyces coelicolor M1154, Glycomyces sp. WAC1371, Kribella sp. WAC1363 und Nonomuraea sp. WAC1424.
Positivkontrolle: 25 µg Apramycin, Negativkontrolle: 10 µl Methanol.
56
Ergebnisse
5.2.3 CO-KULTIVIERUNG VON S. CALVUS MIT S. COELICOLOR
Die in Abschnitt 5.2.2 gezeigte Bioaktivität von Annimycin wirft die Frage auf, ob neben der
Sporulation auch der Sekundärmetabolismus betroffen ist, da zwischen beiden Prozessen ein
enger Zusammenhang besteht (Chater und Chandra 2008). Maulik Thaker untersuchte diesen
Zusammenhang, indem er auf einer 12-well-Platte jeweils 3 ml Agar füllte, ein Filterplättchen mit
50 µg Annimycin auf den Agar aufbrachte und über sieben Tage die Produktion farbiger Pigmente
von Glycomyces sp. WAC1371 und von S. coelicolor M145 beobachtete (Abbildung 5-9). In beiden
Fällen ist keine Beeinträchtigung der Produktion der farbigen Pigmente sichtbar. Jedoch ist zu
bedenken, dass die Pigmente auch bei verringerter Produktion durch das geringe Volumen
diffundieren können und somit den Anschein erwecken können, dass eine gleichmäßige
Produktion stattgefunden hat.
Abbildung 5-9: Auswirkungen von Annimycin auf die Produktion eines orangenen
Glycomyces sp. WAC1371 und von Actinorhodin bei S. coelicolor M145, Kontrolle: 10 µl Methanol.
Pigments
bei
Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Bioaktivität wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt;
die Anzuchtbedingungen sind in Abschnitt 4.8.3.6 aufgeführt. Die Entwicklung der Produktion von
blauen Pigmenten durch S. coelicolor M145 wurde über mehrere Tage beobachtet, wobei es sich
um Actinorhodin bzw. Derivate davon handeln muss. Dabei fiel auf, dass bei Co-Kultivierung mit
S. calvus pTESa-bldA die Blaufärbung bei S. coelicolor M145 deutlich weniger intensiv ist. Bei
Co-Kultivierung mit S. calvus WT ist eine Diffusion des blauen Pigments durch die Platte sichtbar
(Abbildung 5-10). Die Extraktion des blauen Pigments erfolgte gemäß der in 4.9.1 beschriebenen
Vorgehensweise. Der pH-Wert der zu extrahierenden Lösung lag bei ca. 8,5 und die wässrige
Lösung war blau gefärbt. Nach Zugabe von HCl zur Einstellung auf pH 4 änderte sich die Farbe zu
einem rötlichen Lila (vgl. Farbe der Extrakte in Abbildung 5-10).
57
Ergebnisse
Abbildung 5-10: Entwicklung der Kulturen von S. coelicolor, S. calvus pTESa-bldA (obere Reihe) und S. calvus WT (untere
Reihe) bei Co-Kultivierung auf einer MS-Agarplatte über mehrere Tage. Auffällig ist ein blaues Pigment, welches von
S. coelicolor gebildet wird und zu einem gewissen Grad durch die Platte diffundiert.
Abbildung 5-11: (A) Vergleich der Chromatogramme bei λ=537 nm der Extrakte der MS-Agarplatten auf denen S. coelicolor
mit S. calvus WT bzw. S. calvus pTESa-bldA co-kultivert worden war. Die drei auffälligsten Signale sind mit coe1, coe2 und
coe3 bezeichnet. (B) Ausschnitt aus den MSD-Chromatogrammen im Negativ-Modus (Extraktion von m/z=330) der Extrakte
der MS-Agarplatten auf denen S. coelicolor mit S. calvus WT bzw. S. calvus pTESa-bldA co-kultivert worden war. Die Signale
im unteren Chromatogramm sind charakteristisch für die Annimycin-Isomere. (C) UV-Absorptionsspektren der Substanzen
coe1, coe2 und coe3.
58
Ergebnisse
Die Extrakte wurden mittels analytischer HPLC/ESI-MS mit der Methode Stand7DZ (Tabelle 4-32)
untersucht. Der farbliche Unterschied der Extrakte spiegelte sich auch in den Chromatogrammen
wider (Abbildung 5-11 A). Es sind mehrere intensive Signale zu sehen, die in den Extrakten der
Co-Kultivierung mit S. calvus pTESa-bldA nicht detektierbar sind. Die drei intensivsten Signale sind
mit coe1, coe2 und coe3 gekennzeichnet und haben ein nahezu identisches
UV-Absorptionsspektrum, wie Abbildung 5-11 C zeigt. Annimycin war nur bei den Extrakten von
Platten detektierbar, auf denen S. calvus pTESa-bldA gewachsen war. Die Konzentration war
jedoch sehr gering, so dass ein deutliches Signal nur bei Analyse der MSD-Chromatogramme im
Negativ-Modus zu erhalten war. Zieht man den Produktionsverlauf, wie er in 5.1.5 ersichtlich ist,
heran, ist ein solches Ergebnis zu erwarten, da S. calvus pTESa-bldA im vorliegenden Fall zehn
Tage auf der Platte gewachsen war. Gleichzeitig ist davon auszugehen, dass zu früheren
Zeitpunkten die Konzentration von Annimycin höher gewesen war und entsprechend der
Sekundärmetabolismus von S. coelicolor beeinflusst werden konnte.
59
Ergebnisse
5.3 IDENTIFIZIERUNG EINES NICHT-RIBOSOMAL GEBILDETEN PEPTIDS IN S. CALVUS
PTESA-BLDA X 3100
Bei der in 5.1.2 beschriebenen Inaktivierung der Biosynthese von Annimycin fiel auf, dass ein
Signal in den Chromatogrammen der Inaktivierungsmutante S. calvus pTESa-bldA x 3100 stark an
Intensität gewonnen hatte (Abbildung 5-12 A, gekennzeichnet mit 3). Die gemessene Intensität
war auch viel stärker als bei S. calvus WT. Man kann also davon ausgehen, dass die
Komplementierung mit einem funktionsfähigen bldA-Gen zusammen mit der Inaktivierung der
Biosynthese von Annimycin eine Zunahme der Biosynthese von 3 verursacht. Christine Klaus
erarbeitete für Ihre Diplomarbeit einen Prozess, durch den 3 rein genug erhalten wurde, damit
über NMR-Experimente die Struktur des Moleküls aufgeklärt werden konnte (Klaus 2012). Aus
den Signalen des Massenspektrums lässt sich erkennen, dass es sich um ein für Naturstoffe großes
Molekül handeln muss; man sieht [M-H]- bei m/z=1035.4 und [M+Cl]- bei m/z=1071.4 (Abbildung
5-12 B). Aufgrund der Komplexität war es jedoch nicht möglich, die komplette Struktur innerhalb
des Zeitrahmens der Diplomarbeit zu bestimmen. Dennoch konnten Teilstrukturen identifiziert
werden, aus denen sich schließen lässt, dass es sich bei 3 um ein nicht-ribosomal gebildetes
Peptid (NRP) handeln könnte (Klaus 2012).
Abbildung 5-12: (A) Ausschnitt aus den Chromatogrammen (λ=279 nm) der Extrakte von S. calvus pTESa-bldA (unten)
sowie den Insertionsmutanten S. calvus pTESa-bldA x 1697 (Mitte) und S. calvus pTESa-bldA x 3100 (oben).
(B) UV-Absorptions- und Massenspektrum (Negativ-Modus) für 3.
60
Ergebnisse
5.3.1 ISOLIERUNG VON 3 DURCH MITTELDRUCK -CHROMATOGRAPHIE
Während eines Aufenthaltes im Dept. of Chemistry der Queen’s University in Kingston, ON,
Kanada im Labor von Prof. David Zechel gelang es Christine Klaus und Stephanie Vanner eine
Methode zu entwickeln, durch die 3 in großen Mengen gewonnen werden konnte (s. 4.9.6). Als
Produzent diente eine Mutante von S. calvus die im Labor von Prof. Zechel hergestellt worden
war. Kolonien von S. calvus waren einer intensiven UV-Strahlung ausgesetzt worden und
anschließend auf einer MS-Agarplatte aufgrund einer Resistenz gegen 500 µg/ml Rifampicin
selektiert worden. Eine dieser Mutanten (S. calvus #9) produzierte 3 in noch größeren Mengen als
S. calvus pTESa-bldA x 3100 bei gleichzeitig größerer Stabilität der Mutation (Zechel, pers.
Mitteilung). Aus diesem Grund wurde S. calvus #9 als produzierende Mutante gewählt. Die
Anzucht erfolgte gemäß 4.8.3, das gewählte Produktionsmedium waren 1,8 l SG+-Medium aus
dem nach sieben Tagen Wachstum mittels Extraktion mit Diaion HP-20 (s. 4.9.2) der Rohextrakt
gewonnen wurde. Die Isolierung wurde von Stephanie Vanner durchgeführt, wobei 3 nach
6 Säulenvolumina (CV) von der Säule eluierte. Insgesamt konnten auf diese Weise 21,43 mg der
Substanz gewonnen werden.
5.3.2 STRUKTURAUFKLÄRUNG VON 3 MITTELS NMR-SPEKTROSKOPIE
Durch die von Stephanie Vanner durchgeführte Isolierung von 3 war es möglich intensive
NMR-Experimente in DMSO-d6 durchzuführen um die Struktur der Substanz zu bestimmen. Diese
Experimente wurden von Dr. Françoise Sauriol durchgeführt und die erhaltenen 1H-, 13C-, HSQC-,
HMBC-, COSY-, TOCSY- und ROESY-Spektren auch von ihr ausgewertet (s. 8.3.1). Die
entsprechenden Daten sind in Tabelle 5-2 zusammengefasst, Abbildung 5-13 zeigt für die
Strukturaufklärung wichtige Korrelationen zwischen den Atomen des Moleküls.
1
13
Tabelle 5-2: Zusammenfassung der spektroskopischen Daten der H- (600 MHz) und C- (125 MHz) NMR Experimente
a
von 3 gelöst in DMSO-d6.
Position
Acyl
1
Thr
δC
165.2, s
122.7, d
127.3, d
133.1, s
126.0, d
n/d
n/d
129.6, d
137.0, s
126.8, d
134.0, d
29.9, t
21.9, t
13.53, q
1 (C=O)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
NH
α
β
γ
53.2, d
73.24, d
16.56, q
61
δH (J in Hz)
6.68, 1H, d (15.6)
7.42, 1H, d (15.6)
n/d
n/d
6.50, 1H, d (11.2)
5.83, 1H, dt (11.7, 7.4)
1.99, 2H, m
1.36, 2H, m (7.8)
0.79, 3H, t (7.4)
8.70, 1H, d (9.3)
5.33, 1H, t (9.6)
5.03, 1H, dq (9.8, 6.2)
1.15, 3H, d, 6.0
Ergebnisse
1
13
Fortsetzung von Tabelle 5-2: Zusammenfassung der spektroskopischen Daten der H- (600 MHz) und C- (125 MHz)
a
NMR Experimente von 3 in DMSO-d6.
Position
2
∆Tyr
3
Leu
δC
169.0, s
34.2, q
128.5, s
131.6, d
122.9, s
131.5, d
114.8, d
158.1, s
165.6, s
C=O
NMe
α
β
1
2,6
3,5
4
C=O
NH
α
β
γ
53.7, d
38.8, t
23.4, d
22.8, q
22.0, q
172.1, s
δ
C=O
NH
α
4
Phe
5
Thr
55.7, d
Ser
6.13, 1H, s
7.39, 2H, d (8.6)
6.59, 2H, d (8.6)
9.23, 1H, br. s
4.07, 1H, m
1.26, 2H, m
0.89, 1H, m
0.63, 3H, o. d
0.75, 3H, d (6.3)
9.16, 1H, d (7.7)
4.33 m
3.28, 1H, m
2.73, 1H, o. t (12.9)
36.3, t
1
2,6
3,5
4
C=O
NH
α
β
γ
OH
C=O
NH
α
138.7, s
128.9, d
127.9, d
n/d
170.1, s
7.32, 2H, o. d (8.4)
7.27, 2H, t, (7.6)
n/d
57.2, d
68.1, d
22.0, q
7.59, 1H, d (9.5)
4.36, 1H, o. t (9.8)
4.26, 1H, m
0.64, 3H, o. d (6.4)
5.18, 1H, d (2.9)
β
36.7, t
γ C=O
171.2, s
169.9, s
50.8, d
8.33, 1H, d (7.3)
4.44, 1H, m
2.46, 1H, m
2.41, 1H, dd (15.3, 9.9)
6.93, 1H, s
7.30, 1H, o
γNH2
7
2.98, 3H, s
β
6
Asn
δH (J in Hz)
C=O
NH
α
171.6, s
β
60.8, d
56.0, d
8.48, 1H, d (9.6)
4.33, 1H, o
3.26, 1H, o
3.16, 1H, br. t (~9)
4.78, 1H, br
OH
C=O
168.8, s
a
Zuordnung basierend auf HSQC-, COSY-, TOCSY-, HMBC- und ROESY-Experimenten.
o = overlapping signal, br = broad signal, n/d = no data
62
Ergebnisse
Abbildung 5-13: Darstellung relevanter Korrelationen aus den COSY-, TOCSY-, HMBC- und ROESY-NMR Experimenten
von 3 gelöst in DMSO-d6.
Aufgrund der TOCSY- und COSY-Spektren ließen sich verschiedene Spinsysteme identifizieren.
Ausgehend von den Signalen der NH-Protonen der Amidbindungen innerhalb des Moleküls
konnten über COSY-Korrelationen zu den α-ständigen Protonen und HMBC-Korrelationen zu den
Carbonyl-Kohlenstoffen der Amidbindungen die einzelnen Aminosäuren identifiziert werden.
Neben Aminosäuren ist das Molekül auch aus einer Acylkette aufgebaut. Dieses Strukturelement
ist über eine Amidbindung an 1Thr angebunden, was über die HMBC-Korrelationen zu C1 deutlich
wird. Um die genaue Sequenz der Aminosäuren zu bestimmen waren die Daten aus dem
ROESY-Experiment unerlässlich. Die Bestimmung der Stereochemie der Doppelbindung an 2∆Tyr,
C2 und C10 der Seitenkette war ebenfalls über die Daten des ROESY-Experiments möglich. Die
Sequenz der Aminosäuren wurde im Labor von Nathan Magarvey an der McMaster University in
Hamilton, ON, Kanada durch MS/MS Fragmentationsexperimente bestätigt.
Ein ungewöhnliches Strukturelement von 3 ist das modifizierte 2∆Tyr. Es besitzt neben einer
Methylierung des Stickstoffs der Amidbindung eine Doppelbindung, die durch Modifikation von
Tyrosin eingefügt worden sein muss. Die identifizierte Struktur für 3 entspricht der Substanz
WS9326A (Abbildung 5-14), die im Jahr 1992 aus Kulturen von Streptomyces violaceusniger
isoliert werden konnte (Hayashi et al. 1992). Die biologischen und pharmakologischen
Eigenschaften von WS9326A wurden ebenfalls untersucht. Es zeigte sich, dass dieses Molekül ein
potenter Tachykinin-Antagonist ist (Hashimoto et al. 1992) und dessen Derivate toxisch auf den
Parasiten Brugia malayi wirken, einen Verursacher von lymphatischer Filariose (Yu et al. 2012).
63
Ergebnisse
+
Abbildung 5-14: Strukturformel für WS9326A, isoliert als 3 aus Produktionskulturen von S. calvus #9 in SG -Medium, mit
Bezeichnung der für die Biosynthese verwendeten Aminosäuren.
64
Ergebnisse
5.3.3 ANALYSE DER GENOMSEQUENZ VON S. CALVUS AUF MÖGLICHE
BIOSYNTHESEGENCLUSTER FÜR WS9326A
Nach Bestimmung der chemischen Struktur von 3 bzw. WS9326A ist es möglich gezielt nach
möglichen Biosynthesegenen in der partiellen Genomsequenz von S. calvus zu suchen. Zu diesem
Zweck wurde eine Analyse von neueren Sequenzdaten mit antiSMASH (Blin et al. 2013)
durchgeführt. Bei dieser Analyse zeigten sich auf contig 8 NRPS-Biosynthesegene, die an der
Biosynthese von WS9326A beteiligt sein können (Tabelle 5-3). Das von antiSMASH bestimmte
mögliche Biosynthesegencluster beginnt bei Position 49948 nt des contig 8 und erstreckt sich über
fast 68 kbp bis Position 117501 nt. Neben NRPS Genen lassen sich zwei Gene detektieren, die
zusammen für einen ABC-Transporter vom Typ 2 codieren, und Gene, denen regulatorische
Funktionen zukommen sollten. Darüber hinaus werden von antiSMASH Gene angezeigt, die für
die Biosynthese der Acylseitenkette wichtig sein können. Eine ähnliche Kette lässt sich in dem
zyklischen Depsipeptid Skyllamycin A, produziert von Streptomyces sp. Acta 2897, finden
(Abbildung 5-15, Pohle et al. 2011). Die entsprechenden Biosynthesegene wurden identifiziert
und charakterisiert und man kann große Ähnlichkeiten mit Genen im vorliegenden möglichen
Biosynthesegencluster von WS9326A feststellen.
Eine weitere Auffälligkeit bei der Analyse war, dass bei einem Vergleich der Aminosäuresequenz
der in Tabelle 5-3 gelisteten möglichen ORF mittels NCBI BLAST eine sehr hohe Ähnlichkeit mit
Proteinen aus S. griseoflavus gefunden wurde. Die Funktionen dieser Proteine werden u.a. als
„dimodulare nicht-ribosomale Peptid Synthase“ beschrieben, jedoch ist nicht näher
charakterisiert, ob sich ihnen die Biosynthese eines bestimmten Moleküls zuordnen lässt. Aus
diesem Grund wurden sie zumeist nicht in Tabelle 5-3 aufgeführt. Eine Analyse der Sequenz des
möglichen Biosynthesegenclusters mit TTAlynx (Zaburannyy et al. 2009) ergab, dass in keinem der
Gene ein TTA-Codon zu finden ist.
Abbildung 5-15: Strukturformel der Skyllamycine (Pohle et al. 2011).
65
Ergebnisse
Tabelle 5-3: Auflistung von möglicherweise an der Biosynthese von WS9326A in S. calvus beteiligten Biosynthesegenen
mit Angabe der von antiSMASH identifizierten ORF. Die homologen Genprodukte sind vorzugsweise solche, die bereits
experimentell bekannten Naturstoffen zuzuordnen sind.
von
antiSMASH
bestimmte
ORF
(Anzahl AS)
ORF00087
(301)
ORF00090
(266)
ORF00092
(314)
identische /
ähnliche AS
[%]
Accession
Number
vorgeschlagene
Funktion
34 / 48
NC_018750.1
Regulation
36 / 62
YP_001824773.1
ABC Typ-2
Transporter
64 / 75
YP_003098925.1
ABC Transporter
ATPBindungsprotein
89 / 91
WP_004931919.1
unbekannt
68 / 83
AEA30269.1
3-oxoacyl-ACP
Reduktase
46 / 62
AEA30268.1
3-hydroxyacylACP
Dehydratase
60 / 69
AEA30267.1
3-hydroxyacylACP
Dehydratase
55 / 68
AEA30266.1
Acyl Carrier
Protein
55 / 69
AEA30265.1
3-oxoacyl-ACP
Synthase I
54 / 64
AEA30262.1
3-oxoacyl-ACP
Synthase I
62 / 74
AEA30261.1
3-oxoacyl-ACP
Synthase II
77 / 87
AEA30260.1
3-oxoacyl-ACP
Synthase II
73 / 84
AEA30259.1
Acyl Carrier
Protein
S. venezuelae
LuxR family transcriptional
regulator
S. griseus subsp. griseus
NBRC 13350
ABC transporter permease
Actinosynnema mirum
Daunorubicin ABC
Transporter ATPase
S. griseoflavus
ORF00093
(178)
ORF00094
(248)
ORF00096
(159)
ORF00097
(133)
ORF00099
(87)
ORF00101
(371)
putative YbaK/prolyl-tRNA
synthetase associated
domain-containing protein
Streptomyces sp. Acta 2897
3-oxoacyl-ACP-reductase
3-hydroxyacyl-ACP
dehydratase
3-hydroxyacyl-ACP
dehydratase
acyl carrier protein
3-oxoacyl-ACP synthase I
ORF00103
(315)
ORF00104
(379)
ORF00105
(416)
ORF00107
(86)
3-oxoacyl-ACP synthase I
3-oxoacyl-ACP synthase II
66
Ergebnisse
Fortsetzung von Tabelle 5-3: Auflistung von möglicherweise an der Biosynthese von WS9326A in S. calvus beteiligten
Biosynthesegenen mit Angabe der von antiSMASH identifizierten ORF. Die homologen Genprodukte sind vorzugsweise
solche, die bereits experimentell bekannten Naturstoffen zuzuordnen sind.
von
antiSMASH
bestimmte
ORF
(Anzahl AS)
ORF00109
(574)
ORF00110
(241)
ORF00113
(333)
ORF00112
(274)
ORF00115
(400)
ORF00117
(600)
ORF00119
(972)
ORF00120
(274)
ORF00122
(233)
ORF00126
(1892)
ORF00130
(2576)
ORF00133
(2567)
ORF00134
(407)
oxidoreductase
isomerase
thioesterase
hydrolase
putative reductase
identische /
ähnliche AS
[%]
Accession
Number
vorgeschlagene
Funktion
57 / 67
AEA30271.1
Oxidoreduktase
67 / 77
AEA30270.1
Isomerase
58 / 73
AEA30264.1
Thioesterase
40 / 57
AEA30263.1
Hydrolase
50 / 58
WP_004003551.1
Reduktase
53 / 63
CAJ18237.2
51 / 59
ABD65960.1
71 / 83
YP_003486103.1
Oxidoreduktase
59 / 72
ABD65958.1
Thioesterase
Actinoplanes friuliensis
non-ribosomal peptide
synthetase B
S. fungicidicus
nonribosomal peptide
synthetase
S. scabiei 87.22
NRPS
A(Asn)-PCP
NRPS
A(Thr)-PCP
oxidoreductase
S. fungicidicus
synthetase
NRPS
Paenibacillus elgii B69
synthetase NRPS
49 / 62
AEI70245.1
NRPS
49 / 61
AEA30274.1
peptide synthetase
peptide synthetase
S. hygroscopicus subsp.
jinggangensis 5008
C-PCP-C-A(Ser)PCP-TE
C-A(Leu)-PCP-CA(Phe)-PCP-E
NRPS
52 / 63
AEA30272.1
42 / 61
YP_006243065.1
cytochrome P450
hydroxylase
67
C-A(Thr)-PCP-CA(Tyr)-NMT-PCP
Cytochrom
P450
Hydroxylase
Ergebnisse
von
antiSMASH
bestimmte
ORF
(Anzahl AS)
ORF00136
(65)
Streptomyces sp. MspMP-M5
ORF00137
(257)
Streptomyces sp. SCSIO1666
identische /
ähnliche AS
[%]
Accession
Number
vorgeschlagene
Funktion
56 / 69
WP_018539501.1
unbekannt
44 / 56
ADY38535.1
unbekannt
49 / 65
YP_001159616.1
Dehydratase
96 / 99
WP_004931865.1
Translations
Initiations
Faktor
44 / 59
WP_009717622.1
unbekannt
46 / 58
WP_010058225.1
unbekannt
47 / 68
AEA30266.1
Acyl Carrier
Protein
85 / 85
WP_004931861.1
3-Oxoacyl-ACP
Synthase
40 / 51
YP_004964999.1
unbekannt
---
---
unbekannt
72 / 81
WP_009332399.1
unbekannt
40 / 54
AAA79278.1
Thioesterase
80 / 90
AEA30258.1
MbtH Protein
73 / 83
YP_001824783.1
Regulation
87 / 93
AEF16031.1
Regulation
putative ferredoxin
TrdC (unknown function)
Salinispora tropica CNB-440
ORF00140
(314)
ORF00141
(140)
ORF00142
(140)
ORF00144
(123)
beta-hydroxyacyl-(acylcarrier-protein) dehydratase,
FabA/FabZ
S. griseoflavus
translation initiation factor
IF-2
S. himastatinicus
hypothetical protein
S. globisporus
ORF00146
(83)
ORF00145
(413)
S. griseoflavus
ORF00147
(334)
Salinispora arenicola
ORF00148
(44)
keine homologen
Genprodukte bekannt
ORF00149
(272)
Bacillus sp. 2_A_57_CT2
ORF00152
(262)
S. hygroscopicus
ORF00153
(72)
ORF00154
(96)
thioesterase
MbtH-like protein
S. griseus subsp. griseus
NBRC 13350
transcriptional regulator
ORF00156
(211)
regulatory protein C
68
Ergebnisse
von
antiSMASH
bestimmte
ORF
(Anzahl AS)
ORF00158
(413)
identische /
ähnliche AS
[%]
Accession
Number
vorgeschlagene
Funktion
67 / 77
AEF16032.1
Regulation
regulatory protein D
69
Ergebnisse
5.4 KONSTITUTIVE EXPRESSION DES BLDA-GENS IN S. ALBOVINACEUS
5.4.1 AUSWIRKUNGEN AUF DEN SEKUNDÄRMETABOLISMUS UND DIE MORPHOLOGIE
Streptomyces albovinaceus DSM 40136 (nachfolgend S. albovinaceus genannt) wurde erstmals
1958 beschrieben und 1980 genauer klassifiziert (Skerman et al. 1980). Aus Produktionskulturen
dieses Stammes wurde das Glutarimidderivat AH-135Y isoliert, ein Stoff der potentiell zur
Bekämpfung von Herpes-Viren eingesetzt werden könnte (Uyeda et al. 1992). Bei Wachstum auf
MS-Agarplatten begann die morphologische Differenzierung üblicherweise zwischen 72 und 96 h.
Eine Pigmentierung der Kolonien war bis auf eine leichte bräunliche Einfärbung nicht zu
beobachten. Mutanten von S. albovinaceus wurden entsprechend der Vorgehensweise in 4.6.3
erhalten.
Die morphologische Entwicklung auf einer MS-Agarplatte, nach dem in 4.8.3.4 beschriebenen
Verfahren, über 96 h wurde nicht von der konstitutiven Expression des bldA-Gens beeinflusst.
Sowohl der WT, die pTESa- als auch die pTESa-bldA-Mutante zeigen einen Beginn der
Differenzierung, erkennbar durch Ausbildung weißer Sporen, nach einer Wachstumszeit zwischen
72 und 96 h (Abbildung 5-16 A). Die Beeinflussung des Sekundärmetabolismus wird deutlich bei
Betrachtung der Chromatogramme in Abbildung 5-16. In den Extrakten aus Produktionskulturen
in HA-Medium sind drei neue Signale zu erkennen (Abbildung 5-16 B) während bei den Extrakten
aus SG+-Produktionskulturen mehrere neue Signale erkennbar sind, von denen die drei
intensivsten markiert wurden (Abbildung 5-16 C). Sämtliche neu auftretenden Signale sind in den
Extrakten der S. albovinaceus pTESa Kulturen nicht detektierbar.
In Abbildung 5-16 D sind die UV-Absorptionsspektren der neu auftretenden Signale gezeigt. Für
die Substanzen B1 bis B3 ist jeweils ein Absorptionsmaximum erkennbar, das aber für jede
Substanz bei einer anderen Wellenlänge liegt. Für die Substanzen B4 bis B6 sind in allen Fällen
zwei identische und deutliche Maxima sichtbar. Das erste scharfe Maximum liegt bei 252 nm,
während das zweite breitere Maximum bei 366 nm liegt. Aufgrund der identischen Maxima der
Substanzen B4 bis B6 ist davon auszugehen, dass das Chromophor in allen Fällen identisch ist. Es
treten neben den drei markierten noch weitere Signale auf, die dasselbe UV-Absorptionsspektrum
aufweisen. Es liegt also der Schluss nahe, dass eine ganze Gruppe an Molekülen mit geringen
strukturellen Unterschieden biosynthetisiert wurde.
Für die Substanzen B2 und B4 lassen sich aus den MSD Spektren weitere Rückschlüsse auf die
molekulare Masse ziehen, die Signale der anderen Substanzen sind diesbezüglich nicht eindeutig.
Das MSD Spektrum für B2 im Negativ-Modus (Abbildung 5-16 E) zeigt Signale für m/z=438.1,
entsprechend [M-H]-, und m/z=877.2 für [2M-H]-; es ist für B2 also eine molekulare Masse von ca.
439 Da anzunehmen. Für B4 liefert das MSD Spektrum im Positiv-Modus wichtige Informationen
(Abbildung 5-16 E). Die drei markierten Signale entsprechen [M+H]+ (m/z=425.2), [M+Na]+
(m/z=447.3) sowie [2M+Na]+ (m/z=871.3), woraus sich eine molekulare Masse von ca. 424 Da für
B4 ableiten lässt.
70
Ergebnisse
Abbildung 5-16: (A) Morphologische Entwicklung von S. albovinaceus WT, pTESa und pTESa-bldA auf einer
MS-Agarplatte über 96 h bei 28°C. (B) Ausschnitt aus den Chromatogrammen bei λ=279 nm von Extrakten aus
HA-Produktionskulturen von S. albovinaceus. (C) Ausschnitt aus den Chromatogrammen bei λ=250 nm von Extrakten
+
aus SG -Produktionskulturen von S. albovinaceus. (D) UV-Absorptionsspektren neu detektierter Substanzen in den
Extrakten von S. albovinaceus pTESa-bldA Produktionskulturen. (E) MSD-Spektren der neu detektierten Substanzen B2
(links, Negativ-Modus) und B4 (rechts, Positiv-Modus).
5.4.2 PRODUKTION UND ISOLIERUNG VON B4
Zur Bestimmung der Struktur der Substanz B4 wurden insgesamt 4 l SG+-Medium, wie in 4.8.3
beschrieben, mit einer S. albovinaceus pTESa-bldA Kultur beimpft. Nach fünf Tagen wurde die
Produktionskultur mit Diaion-HP 20 extrahiert (vgl. 4.9.2) wobei der pH-Wert nicht verändert
wurde, da es aus Vorversuchen ersichtlich war, dass eine Einstellung des pH-Werts keinen Einfluss
auf die Extrahierbarkeit von B4 hat. Der erste Reinigungsschritt bestand aus einer Kieselgelsäule
(s. 4.9.3), die mit einem Gemisch aus n-Hexan/Aceton im Verhältnis 60:40 entwickelt wurde.
71
Ergebnisse
Durch diesen Schritt kam es zu einer Vorreinigung des Rohextrakts, eine Trennung von B4 und den
Substanzen B5 oder B6 war auf diese Weise nicht möglich. Es war also nötig, eine Methode zur
Trennung durch semipräparative HPLC zu finden. Aus diesem Grund wurde die Methode 1BS217
(s. 4.9.5, Tabelle 4-28) entwickelt und zur Isolierung von B4 eingesetzt. Die Elution von B4 erfolgte
mit dieser Methode nach 25.3 min. Im letzten Schritt wurde eine Säulenchromatographie an
Sephadex LH-20 durchgeführt (s. 4.9.4). Die Reinheit wurde anschließend mittels analytischer
LC/MS mit der Methode Stand2DZ analysiert; das Ergebnis ist in Abbildung 5-17 gezeigt.
Insgesamt betrug die Ausbeute an B4 als ein gelblich-weißer amorpher Feststoff 3,4 mg.
Abbildung 5-17: Chromatogramm bei λ=250 nm zur Überprüfung der Reinheit von B4.
72
Ergebnisse
5.4.3 STRUKTURAUFKLÄRUNG VON B4 MITTELS NMR-SPEKTROSKOPIE
Zur Aufklärung der Struktur von B4 wurden die erhaltenen 3,4 mg in Aceton-d6 gelöst und 1H-,
13
C-, HSQC-, HMBC- und COSY-NMR Experimente durchgeführt (s. 8.3.2). Tabelle 5-4 fasst die auf
diese Weise erhaltenen Daten zusammen und Abbildung 5-18 zeigt für die Strukturaufklärung
relevante Korrelationen innerhalb des Moleküls.
Abbildung 5-18: Darstellung relevanter Korrelationen aus den COSY- und HMBC-Experimenten von B4 gelöst in Aceton-d6.
In den Spektren ließen sich Signale für zwei Methylester bei 52.72 / 4.04 ppm und
51.42 / 3.60 ppm erkennen, die im Verlauf als 1-COOMe bzw. 1‘-COOMe bezeichnet werden. Die
zugehörigen Protonen zeigen HMBC-Korrelationen zu Carbonyl-Kohlenstoffen bei 167.76 ppm
(1-COOMe) und 175.19 ppm (1‘-COOMe). 1-COOMe hat eine weitere HMBC-Korrelation zu einem
Signal für ein aromatisches Proton bei 8.23 ppm (H2), das an ein Kohlenstoffatom mit einem
Signal bei 131.99 ppm (C2) gebunden ist. H2 lässt sich durch Kreuzsignale im COSY-Spektrum als
benachbart zu den Protonen mit Signalen bei 8.05 ppm (H3) und 8.45 ppm (H4) erkennen. Das zu
H3 gehörige Kohlenstoffatom C3 zeigt sich bei 130.63 ppm und das zu H4 gehörige C4 bei
133.53 ppm. Die Kopplungskonstante zwischen H2 und H4 beträgt 1,4 Hz, was darauf schließen
lässt, dass diese Protonen in meta-Position zueinander stehen. Dies wird bestätigt durch die
HMBC-Kreuzsignale zwischen H2 und C4 sowie H4 und C2. Die Kopplungskonstanten von H3
lassen sich aufgrund von Überlagerungen nur schwer erkennen. Die großen Kopplungskonstanten
der ersten Aufspaltung von H2 (7,0 Hz) und von H4 (8,8 Hz) sowie die starke COSY-Korrelation zu
diesen beiden Protonen sprechen für eine ortho-Position von H3 relativ zu H2 und H4. Für H3 ist
des Weiteren eine starke HMBC-Korrelation zu einem Signal bei 133.73 ppm (C1) erkennbar. Über
dieses Atom ist 1-COOMe an das aromatische System angebunden. Ein Signal bei 141.27 ppm
73
Ergebnisse
(C10a) hat starke HMBC-Kreuzsignale zu H2 und H4, was den Schluss zulässt, dass C10a in
para-Position relativ zu H3 ist. Für C4a ist in keinem der Spektren ein Signal erkennbar.
Ein weiteres aromatisches Spinsystem von B4 besitzt drei Protonen, deren Signale bei 8.07 ppm
(H7 gebunden an C7 bei 129.83 ppm), 8.02 ppm (H8 gebunden an C8 bei 131.97 ppm) und
8.19 ppm (H9 gebunden an C9 bei 129.92 ppm) auftreten. H7 und H8 überlappen mit H3,
wodurch keine Kopplungskonstanten erkennbar sind. Die dd-Form von H9 sowie die
Kopplungskonstanten von 8,6 Hz und 1,6 Hz weisen auf Protonen in ortho- und meta-Position hin.
Die Intensität der COSY-Kreuzsignale ist zwischen H9 und H8 größer als die zwischen H9 und H7,
was darauf hinweist, dass H9 und H8 ortho zueinander stehen, H9 und H7 meta zueinander
stehen und H8 und H7 wiederum ortho zueinander stehen. Das Signal für das quarternäre
Kohlenstoffatom C5a bei 141.21 ppm zeigt HMBC-Kreuzsignale mit H7 und H9 was es in
meta-Position zu beiden Protonen stehen lässt. Mit H8 haben zwei weitere Signale
HMBC-Korrelationen, dies sind C6 bei 144.23 ppm und C9a bei 142.61 ppm wodurch das
aromatische System komplettiert wird.
Ausgehend von H7 ist eine weitere HMBC-Korrelation zu einem nicht-aromatischen
Kohlenstoffatom C1‘ mit einem Signal bei 71.61 ppm, verbunden mit einem Proton mit Signal bei
6.07 ppm (H1‘), zu sehen. Die chemische Verschiebung von C1‘ und H1‘ deutet auf eine
Verbindung zu einem Sauerstoffatom hin. Ein Signal für ein Hydroxyl-Proton ist bei 4.95 ppm zu
sehen (1‘-OH). Es ist über eine H-Brücke zu einem Stickstoffatom im aromatischen Ringsystem in
seiner Position stabilisiert, was zu einem stabilen d-Signal führt, das ein COSY-Kreuzsignal mit H1‘
besitzt. Ein weiteres COSY-Kreuzsignal von H1‘ besteht zu H2‘ bei 3.25 ppm (verbunden mit dem
tertiärem C2‘ bei 54.43 ppm). Die chemische Verschiebung von H2‘ und C2‘ lässt auf Verbindung
zu einem elektrophilen Kohlenstoffatom schließen, bei dem es sich um das bereits oben erwähnte
Abbildung 5-19: Strukturformel von Streptophenazin A, isoliert als B4 aus S. albovinaceus pTESa-bldA Produktionskulturen
+
in SG -Medium.
74
Ergebnisse
1‘-COOMe handelt. Interessanterweise besteht keine HMBC-Korrelation von 1‘-COOMe zu H2‘,
jedoch zu H3‘ bei 2.28 ppm, was an C3‘ bei 34.33 ppm gebunden ist. H3‘ wiederum besitzt ein
HMBC-Kreuzsignal zum sekundären Kohlenstoffatom C4‘ bei 25.67 ppm und ein COSY-Kreuzsignal
mit H4‘ bei 1.58 ppm. Zwischen dem nächsten sekundären Kohlenstoffatom C5‘ (39.31 ppm) und
dem zugehörigen Proton H5‘ (1.02 ppm) bestehen keine Korrelationen zu C4‘ oder H4‘. Von H5‘
ausgehend ist ein HMBC-Kreuzsignal zu dem tertiären Kohlenstoffatom C6‘ (28.4 ppm, verbunden
mit H6‘ bei 1.37 ppm) erkennbar. Außerdem sind HMBC-Korrelationen zu C7‘ (22.89 ppm,
verbunden mit H7‘ bei 0.76 ppm) und C8‘ (22.61 ppm, verbunden mit H8‘ bei 0.74 ppm) mit H5‘
zu sehen. COSY-Korrelationen bestehen zwischen H6‘ und H7‘ bzw. H8‘, nicht jedoch zu H5‘.
Außerdem bestehen HMBC-Korrelationen zwischen C5‘ und H7‘ sowie H8‘.
Die chemischen Verschiebungen des aromatischen Systems passen am besten zu einem
1,6-substituierten Phenazin. Durch eine Suche nach einer ähnlichen Struktur auf PubChem
(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) zeigte sich, dass bei der Substanz Streptophenazin A eine sehr
gute Übereinstimmung mit den für B4 gemessenen NMR-Daten besteht (Mitova et al. 2008). Die
von Mitova et al. veröffentlichte Struktur wurde von Yang et al. 2012 überarbeitet, so dass eine
vollständige Übereinstimmung mit der für B4 bestimmten Struktur besteht. B4 konnte somit als
das bereits aus dem marinen Actinomyceten Streptomyces sp. HB202 bekannte
Streptophenazin A identifiziert werden (Abbildung 5-19).
1
Tabelle 5-4: Zusammenfassung der spektroskopischen Daten der H- (400 MHz),
COSY-NMR Experimente von B4 gelöst in Aceton-d6.
Position
1
2
3
4
4a
5a
6
7
8
9
9a
10a
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
1-COOMe
1-COOMe
1'-COOMe
1'-COOMe
1'-OH
δC
133.73
C
131.99
CH
130.63
CH
133.53
CH
n/d
C
142.21
C
144.23
C
129.83
CH
131.97
CH
129.92
CH
142.61
C
141.27
C
71.61
CH
54.43
CH
34.33
CH2
25.67
CH2
39.31
CH2
28.40
CH
22.89
CH3
22.61
CH3
167.76
C=O
52.72
CH3
175.19
C=O
51.42
CH3
13
C- (100 MHz), HSQC-, HMBC- und
δH (J in Hz)
HMBC (13C → 1H)
COSY (1H → 1H)
8.23 dd (7.0. 1.4)
8.05 m
8.45 dd (8.8, 1.4)
4, 10a, 1-COOMe
4
2, 10a
3, 4
2, 4
2, 3
8.07 m
8.02 m
8.19 dd (8.6, 1.6)
1', 5a, 9
6, 9a
5a, 7
8, 9
7, 9
7, 8
6.07 dd (7.1)
3.25 ddd (10.5, 7.6, 4.1)
2.28 t (7.4)
1.58 m
1.02 m
1.37 m
0.76 d (6.7)
0.74 d (6.7)
4.04 s
3.60 s
4.95 d (7.1)
n/d = no data
75
4', 1'-COOMe
2', 1’-OH
1'
4'
3'
6', 7', 8'
5', 6', 8'
5', 6', 7'
2, 1-COOMe
1-COOMe
3’, 1'-COOMe
1'-COOMe
7', 8'
6'
6'
1’
Ergebnisse
5.4.4 BIOAKTIVITÄT VON STREPTOPHENAZIN A
Bei der erstmaligen Beschreibung von Streptophenazin A wurde die Bioaktivität dieser Substanz
gegen einige Mikroorganismen untersucht (Mitova et al. 2008). Es konnte dabei eine geringe
Bioaktivität gegen Bacillus subtilis und Staphylococcus lentus festgestellt werden. Gegen
gramnegative Keime wie auch Candida glabrata war jedoch keine Aktivität erkennbar. Für das aus
S. albovinaceus pTESa-bldA isolierte Streptophenazin A wurden zusätzlich Tests auf Bioaktivität
gegen andere Actinomyceten-Stämme von Maulik Thaker durchgeführt (vgl. 5.2). Wie auch für
Annimycin wurde die Aktivität nach der Auswirkung auf das Wachstum eines Stammes nach
sieben Tagen beurteilt (s. 5.2.2). Die Positivkontrolle bestand aus 25 µg Apramycin, bei der
Negativkontrolle kamen 10 µl Methanol zum Einsatz; zur Untersuchung der Aktivität wurden
50 µg Streptophenazin A, gelöst in Methanol, auf das Filterplättchen aufgetragen. Ein Hemmhof
ist bei Glycomyces sp. WAC1371 und Nonomuraea sp. WAC1424 klar erkennbar, wobei bei
Nonomuraea sp. WAC1424 ein Synergieeffekt mit der Positivkontrolle nicht ausgeschlossen
werden kann. Bei Amycolatopsis sp. WAC1227 und Kribella sp. WAC1363 ist nur ein ganz
schwacher Hemmhof um das Filterplättchen herum erkennbar. Für Streptomyces coelicolor
M1154 ist hingegen keine Aktivität zu sehen.
Abbildung 5-20: Test der Bioaktivität von Streptophenazin A gegen die Actinomyceten-Stämme Amycolatopsis sp.
WAC1227, Streptomyces coelicolor M1154, Glycomyces sp. WAC1371, Kribella sp. WAC1363 und
Nonomuraea sp. WAC1424. Positivkontrolle: 25 µg Apramycin, Negativkontrolle: 10 µl Methanol.
76
Ergebnisse
5.5 KONSTITUTIVE EXPRESSION DES BLDA-GENS IN S. GLOMEROAURANTIACUS
Eine zusammenfassende Beschreibung der Morphologie des Stammes Streptomyces
glomeroaurantiacus DSM 41782 (nachfolgend S. glomeroaurantiacus genannt) in der Literatur
fand im Jahre 1972 statt (Shirling und Gottlieb 1972). Bei Wachstum auf MS-Agarplatten (nach
4.8.3.4) zeigte der Stamm keine morphologische Differenzierung und auch keine auffällige
Pigmentierung. Nach Ausstreichen von Mycel aus einer Dauerkultur bildeten sich die ersten
sichtbaren Kolonien nach ca. 72 h. Mutanten von S. glomeroaurantiacus wurden entsprechend
der Vorgehensweise in 4.6.3 erhalten.
Ein Einfluss auf die morphologische Entwicklung konnte durch die konstitutive Expression des
bldA-Gens nicht festgestellt werden (Abbildung 5-21 A). In den Extrakten aus
HA-Produktionskulturen zeigt sich eine deutliche Beeinflussung des Sekundärmetabolismus durch
das Auftreten zweier neuer Signale in den Chromatogrammen bei λ=340 nm (Abbildung 5-21 B).
Die UV-Absorptionsspektren der Substanzen M1 und M2, gezeigt in Abbildung 5-21 C,
unterscheiden sich stark voneinander. Das Spektrum für M1 zeigt Absorptionsmaxima bei 251,
287, 330 und 394 nm, während für M2 zwei Maxima bei 248 und 316 nm zu erkennen sind. Es ist
also davon auszugehen, dass die neu gebildeten Substanzen ein unterschiedliches Chromophor
besitzen. Aus den Daten der Massenspektren ließ sich für keine der beiden Substanzen eine
eindeutige Masse zuordnen.
Abbildung 5-21: (A) Morphologische Entwicklung von S. glomeroaurantiacus WT, pTESa und pTESa-bldA auf einer
MS-Agarplatte über 96 h bei 28°C, (B) Ausschnitt aus den Chromatogrammen bei λ=340 nm von Extrakten aus
HA-Produktionskulturen von S. glomeroaurantiacus (C) UV-Absorptionsspektren der neu detektierten Substanzen M1
und M2 in den Extrakten von S. glomeroaurantiacus pTESa-bldA Produktionskulturen in HA-Medium.
77
Ergebnisse
5.5.2 PRODUKTION UND ISOLIERUNG VON M2
Zur Strukturbestimmung von M2 wurden insgesamt 4 l HA-Medium (20 x 200 ml), wie in 4.8.3
beschrieben, kultiviert und nach fünf Tagen mit Diaion HP-20 extrahiert (s. 4.9.2). Das Medium
wurde vor der Extraktion auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, da sich bei vorhergehenden
Testextraktionen gezeigt hat, dass bei pH 7 oder pH 9 nur geringe Mengen von M2 aus dem
wässrigen Medium extrahierbar sind. Der erste Reinigungsschritt bestand aus einer Kieselgelsäule
(s. 4.9.3), die mit Ethylacetat, versetzt mit 0,1 % Essigsäure, entwickelt wurde. Der Zusatz von
Essigsäure war nötig um eine scharfe Bande von M2 zu erhalten. Ohne Essigsäure wurde M2 nicht
vom Kieselgel eluiert und blieb zu großen Teilen am Säulenkopf hängen. Nach einem zweiten
Reinigungsschritt mittels semipräparativer HPLC (Methode 2MH169, s. 4.9.5, Tabelle 4-29, Elution
von M2 nach 9.2 min) war der letzte Schritt eine Säulenchromatographie an Sephadex LH-20
(s. 4.9.4). Die Gesamtausbeute an M2 betrug 1,7 mg als ein weißes amorphes Pulver; die Reinheit
zeigt Abbildung 5-22.
Abbildung 5-22: Chromatogramm bei λ=250 nm zur Überprüfung der Reinheit von M2.
78
Ergebnisse
5.5.3 STRUKTURAUFKLÄRUNG VON M2 MITTELS NMR- UND HR-MS-SPEKTROSKOPIE
Zur Strukturaufklärung wurde M2 in Methanol-d4 gelöst und 1H-, 13C-, HSQC-, HMBC-, COSY- und
ROESY-NMR Experimente durchgeführt (s. 8.3.3). Die dabei erhaltenen Daten sind in Tabelle 5-5
zusammengefasst und für die Strukturaufklärung relevante Korrelation in Abbildung 5-23
dargestellt.
Aus dem Verhalten von M2 bei der Chromatographie an Kieselgel (s. 5.5.2) lässt sich schließen,
dass das Molekül eine leicht ionisierbare Gruppe, wie eine Carboxylgruppe tragen muss. Diese
Annahme wurde durch Auftreten eines Signals für ein Proton einer Carboxylgruppe bei 9.67 ppm
bekräftigt, als ein 1H-NMR Spektrum von M2 gelöst in DMSO-d6 aufgenommen wurde.
Nachfolgend soll die Strukturaufklärung anhand der Spektren in Methanol-d4 geschildert werden.
Im 1H-NMR Spektrum fallen zwei Signale für aromatische Protonen bei 6.97 ppm (H4) und bei
6.51 ppm (H5) auf, die mit den aromatischen Kohlenstoffen C4 (133.12 ppm) bzw. C5
(122.04 ppm) verbunden sind. H4 und H5 zeigen beide eine dd-Signalaufspaltung, wobei die erste
Aufspaltung mit einer Kopplungskonstante von 7.5 Hz leicht erkennbar ist. Die zweite Aufspaltung
ist nur schwach zu erkennen, wird aber aus den Korrelationen im COSY-Spektrum ersichtlich.
Diese Korrelationen bestehen zwischen H4 und H3a (2.14 ppm) sowie zwischen H5 und H6a (2.53
ppm). Bei H3a und H6a handelt es sich jeweils um Protonen von Methylgruppen, die mit dem
aromatischen Ring verbunden sind. Die zugehörigen Kohlenstoffsignale finden sich für C3a bei
16.05 ppm und für C6a bei 23.73 ppm. Die Verbindung der Methylgruppen zum aromatischen
Ring bestehen über C3 (123.58 ppm) bzw. C6 (139.79 ppm), was sich in den HMBC-Korrelationen
zwischen H3a und C3 und zwischen H6a und C6 verdeutlicht. Weitere HMBC-Kreuzsignale
bestehen zwischen H4 und C6 sowie zwischen H5 und C3. Die relative Position von H4 und H5
zueinander ist ortho, was sich aus der Kopplungskonstante und dem intensiven COSY-Kreuzsignal
schlussfolgern lässt. Die intensiven HMBC-Korrelationen zwischen C3 und H5 bzw. C6 und H4
Abbildung 5-23: Darstellung relevanter Korrelationen aus den HMBC- und ROESY-Experimenten von M2 gelöst in
Methanol-d4.
79
Ergebnisse
zeigen, dass zwischen diesen jeweils drei Bindungen liegen, die relative Position zueinander also
meta ist. Ausgehend von H4 lässt sich durch eine HMBC-Korrelation zu einem Signal für einen
weiteren Kohlenstoff bei 161.18 ppm (C2) ein weiteres Atom des aromatischen Rings
identifizieren. Die chemische Verschiebung von C2 deutet auf einen elektrophilen Substituenten,
wie ein Sauerstoffatom, hin. Das letzte Kohlenstoffatom bei 118.30 ppm (C1) im 6-gliedrigen
aromatischen Ring erzeugt kein Signal im 13C-Spektrum und zeigt sich nur durch eine
HMBC-Korrelation zwischen H5 und C1. Die chemische Verschiebung von C1 zeigt, dass es mit
einer Carboxylgruppe substituiert sein muss (1-COOH). Für 1-COOH lässt sich in keinem der
Spektren ein eindeutiges Signal identifizieren. Möglicherweise findet eine Überlagerung mit dem
Signal eines Carboxylesters statt, dessen genaue Position später in diesem Abschnitt erklärt wird.
Die Gruppe muss jedoch vorhanden sein, da sich anders das Verhalten von M2 an Kieselgel unter
Einfluss des pH-Wertes nicht erklären lässt.
An einem weiteren Spinsystem im Molekül sind die Kohlenstoffatome C1‘ (64.06 ppm), C2‘
(71.15 ppm) und C3‘ (66.48 ppm) beteiligt. Bei C1‘ handelt es sich um eine CH2-Gruppe mit den
Protonen H1‘ (3.55 ppm). Es besteht eine starke COSY-Korrelation von H1‘ zu H2‘ (3.81 ppm) und
eine starke HMBC-Korrelation von H1‘ zu C2‘ und C3‘. C2‘ ist eine CH-Gruppe und neben der
bereits erwähnten COSY-Korrelation zwischen H1‘ und H2‘ bestehen Kreuzsignale mit H3’a
(4.15 ppm) und H3’b (4.06 ppm). Ausgehend von H2‘ sind keinerlei HMBC-Korrelationen
erkennbar. C3‘ ist wiederum eine CH2-Gruppe, deren Protonen als getrennte Signale H3’a und
H3’b erscheinen. Diese Aufspaltung und die verschiedenen Kopplungskonstanten zu H2‘ zeigen,
dass diese Protonen eine feste Position im Bezug auf ein Stereozentrum im Molekül einnehmen.
Aufgrund der chemischen Verschiebungen müssen C1‘, C2‘ und C3‘ mit Sauerstoffatomen
verbunden sein. Daraus folgt, dass im Molekül ein Glycerol-artiger Teil vorhanden sein muss. H3’a
und H3’b haben beide eine HMBC-Korrelation zum Kohlenstoff eines Carboxylesters (C1‘‘,
175.55 ppm). Das Sauerstoffatom an C3‘ ist somit Teil einer Esterbindung, was auch seine starre
Position zum Stereozentrum an C2‘ erklärt, das wiederum durch das Sauerstoffatom an C2‘
zwangsläufig vorhanden sein muss. Die Verbindung zum aromatischen Molekülteil kann demnach
nur über eine Etherverbindung gegeben sein. Die ROESY-Korrelationen von H1‘ mit Protonen
außerhalb des Glycerolteils zeigen, dass dieses Kohlenstoffatom eine größere Flexibilität
hinsichtlich seiner Position im Raum besitzt und die Etherbindung deshalb über C2‘ besteht. Dies
wird gestützt durch NMR-Daten von Glycerolderivaten, die entweder 1,2- oder 1,3-substituiert
sind (Foss und Krane 2004; Quan et al. 2007), da die Daten für M2 mit denen eines
1,2-substituierten Glycerols übereinstimmen. C1‘ ist demnach mit einer Hydroxylgruppe
substituiert.
HMBC-Kreuzsignale von C1‘‘ zu weiteren Protonen weisen auf eine Alkylkette hin. Die Korrelation
zu H2‘‘ (2.35 ppm an C2‘‘ bei 34.95 ppm) ist dabei deutlich zu erkennen, im Vergleich dazu ist die
Korrelation zu H3‘‘ (1.62 ppm, an C3‘‘ bei 26.00 ppm) eher schwach. Im 1H-Spektrum kommt es zu
einer Anhäufung von Signalen bei 1.30 ppm, die sich über das HSQC-Spektrum mit einer
Anhäufung von Signalen bei 30.00 ppm im 13C-Spektrum in Verbindung bringen lässt. Einzelne
Signale lassen sich hierbei nicht erkennen, es lässt aber auf eine lange Kette an CH2-Gruppen
schließen. Im COSY-Spektrum zeigt sich ein Kreuzsignal zwischen dieser Signalanhäufung und H3‘‘
und im HMBC-Spektrum Kreuzsignale zu C2‘‘ und C3‘‘. Das Ende der Kette wird durch eine
Methylgruppe bei 14.43 ppm markiert (C16‘‘/C18‘‘), was sich wiederum aus HMBC-Korrelationen
zwischen C16‘‘/C18‘‘ und den Protonen um 1.30 ppm ergibt. Die Protonen H16‘‘ bzw. H18‘‘
80
Ergebnisse
erscheinen als Triplett bei 0.90 ppm, die wiederum HMBC-Kreuzsignalen zu den
Kohlenstoffatomen C15‘‘/C17‘‘ (23.41 ppm) und C14‘‘/C16‘‘ (33.07 ppm) zeigen.
1
13
Tabelle 5-5: Zusammenfassung der spektroskopischen Daten der H- (400 MHz), C- (100 MHz), HSQC-, HMBC-, COSYund ROESY-NMR Experimente von M2 gelöst in Methanol-d4.
Position
1
2
3
3a
4
5
6
6a
1'
2'
δC
118.30
C
161.18
C=O
123.58
C
16.05
CH3
133.12
CH
122.04
CH
139.79
C
23.73
CH3
64.06
CH2
71.15
CH
3'
66.48
CH2
1''
2''
3''
4'' 13''/15''
14''/16''
15''/17''
16''/18''
1-COOH
175.55
34.95
26.00
COO
CH2
CH2
ca. 30
33.07
23.41
14.43
n/d
δH (J in Hz)
2.14 s (dd)
6.97 dd (7.5, 0.4)
6.51 dd (7.5, 0.2)
2.53 s (dd)
3.55 dd (5.4, 1.5)
3.81 m
3'a: 4.15 dd (11.10, 4.45)
3'b: 4.06 dd (11.10, 6.18)
HMBC (13C → 1H)
5
3a, 4
3a, 5
4
3a
6a
4, 6a
5
3'a, 3'b
3'a, 3'b, 1'
1'
COSY (1H → 1H)
4, 6a
3a, 5
4, 6a
3a, 5
2'
1', 3'a, 3'b
3'b, 2'
3'a, 2'
2.35 t (7.4)
1.62 tt (7.4)
3'a, 3'b, 1'', 2''
3''
2''
3''
2'', 4'' - 13''/15''
CH2
ca. 1.30
2'', 3''
3''
CH2
CH2
CH3
ca. 1.30
ca. 1.30
0.90 t (7.0)
16''/18''
16''/18''
n/d = no data
81
15''/17''
Ergebnisse
D:\data_2013\bepba21s_hr3
6/19/2013 5:14:31 PM
5ul in 100ul MeOH ,3.0kV,sg10,au(N2)1,vap50,cap250,tubelens:+160V
2MH169 ,dir.pos.HR-ESI, m/z 100-1500
bepba21s_hr3 #1 RT: 0.03 AV: 1 NL: 4.45E7
T: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1500.00]
381.2975
C 21 H 42 O 4 Na
0.0405 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
Relative Abundance
60
353.2663
C 19 H 38 O 4 Na
0.0992 ppm
55
50
45
40
35
739.6061
C 42 H 84 O 8 Na
0.4050 ppm
30
25
20
15
397.2715
C 24 H 38 O 3 Na
0.3464 ppm
211.0341
10
569.3425
C 41 H 45 O 2
1.9710 ppm
619.5272
C 37 H 72 O 5 Na
-0.0578 ppm
5
0
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
m/z
Abbildung 5-24: HR-ESI-MS Spektrum von M2 nach Direktinjektion (Positivmodus).
D:\data_2013\06\1906\bepba21s_hr2
6/19/2013 5:11:13 PM
5ul in 100ul MeCN ,3.0kV,sg10,au(N2)1,vap50,cap250,tubelens:-140V
2MH169 ,dir.neg.HR-ESI, m/z 100-1500
bepba21s_hr2 #1 RT: 0.03 AV: 1 NL: 1.09E8
T: FTMS - p ESI Full ms [100.00-1500.00]
165.0557
C 9 H 9 O3
-0.3236 ppm
100
95
90
85
353.1008
C 18 H 18 O 6 Na
0.3195 ppm
80
75
70
121.0659
C8 H9 O
-0.1328 ppm
65
Relative Abundance
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
339.1045
10
541.1458
5
0
100
150
200
250
300
350
400
450
m/z
500
550
Abbildung 5-25: HR-ESI-MS Spektrum von M2 nach Direktinjektion (Negativmodus).
82
600
650
700
750
Ergebnisse
Die genaue Kettenlänge lässt sich aus den NMR-Daten nicht erkennen. Zu diesem Zweck wurde
M2 in Methanol gelöst und über Direktinjektion hochauflösende Massenspektren aufgenommen
(Abbildung 5-24 und Abbildung 5-25). Die tatsächliche Masse von M2 ist aus den Spektren nicht
ersichtlich, jedoch lassen sich Teile des Moleküls finden, die nach Spaltung der Etherbindung
zwischen dem aromatischen Teil und dem Glycerolteil entstanden sind (Abbildung 5-26). Dabei
zeigt sich, dass zwei verschiedene Kettenlängen in Frage kommen, da sowohl für eine C16- als auch
eine C18-Kette Signale und Dimere aus beiden erkennbar sind. Die Schlussfolgerung daraus ist,
dass es sich bei M2 um zwei verschiedene Moleküle mit den Summenformeln C28H46O6 (Abbildung
5-27 A) und C30H50O6 (Abbildung 5-27 B) handelt. Moleküle mit einer solchen Strukturformel
wurden noch nicht beschrieben, es handelt sich also um bisher gänzlich unbekannte Moleküle, für
die als Name hiermit Glomeromycin A und Glomeromycin B vorgeschlagen wird.
Abbildung 5-26: Aus den HR-ESI-MS Spektren bestimmte Spaltprodukte von M2 mit Angabe des berechneten m/z und
des tatsächlich gefundenen m/z.
83
Ergebnisse
Abbildung 5-27: Strukturformeln von Glomeromycin A (A) und Glomeromycin B (B), isoliert als M2 aus
S. glomeroaurantiacus pTESa-bldA Produktionskulturen in HA-Medium.
84
Ergebnisse
5.5.4 BIOAKTIVITÄT VON GLOMEROMYCIN
Der Rohextrakt von 25 ml HA-Produktionskulturen (vgl. 4.9.1) von S. glomeroaurantiacus
pTESa-bldA zeigte im Gegensatz zu Extrakten aus Produktionskulturen von S. glomeroaurantiacus
pTESa Bioaktivität gegen B. subtilis (Abbildung 5-28 A). Der Test wurde wie in 4.9.8 beschrieben
durchgeführt und dabei 10 µl des in insgesamt 500 µl Methanol gelösten Rohextraktes eingesetzt.
Wie Abbildung 5-28 B zeigt war Glomeromycin jedoch nicht verantwortlich für die im Rohextrakt
beobachtete Bioaktivität, da bei Einsatz der in Methanol gelösten Reinsubstanz bei den
untersuchten Mengen keine Bioaktivität feststellbar war. Auch gegen die Mikroorganismen E. coli
XL1-blue, S. albus J1074, Candida parapsilosis oder Fusarium verticilloides war bei bis zu 200 µg
Glomeromycin auf einem Filterplättchen keinerlei Bioaktivität erkennbar.
Abbildung 5-28: (A) Test der Bioaktivität von Rohextrakt aus HA-Produktionskulturen von S. glomeroaurantiacus pTESa
und pTESa-bldA gegen B. subtilis. (B) Test der Bioaktivität von vier verschiedenen Mengen an reinem Glomeromycin
gegen B. subtilis. Positivkontrolle: 25 µg Apramycin, Negativkontrolle: 10 µl Methanol.
85
Ergebnisse
5.6 KONSTITUTIVE EXPRESSION DES BLDA-GENS IN S. CURACOI
Der Stamm Streptomyces curacoi DSM 40107 (nachfolgend S. curacoi genannt) wurde im Jahr
1980 klassifiziert. Es ist bekannt, dass dieser Stamm das chlorhaltige Glycosid-Antibiotikum
Curamycin produziert (Galmarini und Deulofeu 1961). Eine weitere Eigenschaft wurde 1992
beschrieben, als Polyketidsynthase-Gene aus S. curacoi heterolog in S. lividans exprimiert wurden
und dabei die Produktion eines braunen Pigments beobachtet wurde (Bergh und Uhlén 1992). Die
Anzucht von S. curacoi auf MS-Agarplatten über 96 h zum Vergleich der morphologischen
Abbildung 5-29: (A) Morphologische Entwicklung von S. curacoi WT, pTESa und pTESa-bldA auf einer MS-Agarplatte über
+
96 h bei 28°C. (B) Ausschnitt aus den Chromatogrammen bei λ=279 nm von Extrakten aus NL19 -Produktionskulturen von
S. curacoi. (C) UV-Absorptionsspektren neu detektierter Substanzen in den Extrakten von S. curacoi pTESa-bldA
Produktionskulturen. (D) MSD-Spektren der neu detektierten Substanz J2 (links Positiv-Modus, rechts Negativ-Modus).
86
Ergebnisse
Entwicklung zeigt deutlich die Produktion eines braunen Pigments. Die Produktion setzt zwischen
24 und 48 h ein, dies ist auch der Zeitpunkt, zu dem sich deutlich erste Kolonien zeigen, wenn
S. curacoi aus einer Dauerkultur auf eine MS-Agarplatte ausgebracht wird. Mutanten von
S. curacoi wurden entsprechend der Vorgehensweise in 4.6.3 erhalten. Bei Anzucht, wie in 4.8.3
beschrieben, zur Überprüfung der Beeinflussung der Sporulation zeigt sich, dass bei der
pTESa-bldA Mutante die morphologische Differenzierung nach 48 bis 72 h einsetzt (Abbildung
5-29 A). Zu diesem Zeitpunkt ist bei den Kontrollen noch keine morphologische Differenzierung
sichtbar. Im weiteren Verlauf kommt es auch bei den Kontrollen zur Sporenbildung, jedoch ist
diese weniger intensiv als bei S. curacoi pTESa-bldA.
Eine Beeinflussung des Sekundärmetabolismus ist in allen drei getesteten Medien zu erkennen
(HA, SG+ und NL19+), am deutlichsten jedoch in NL19+, weshalb die entsprechenden
Chromatogramme in Abbildung 5-29 B gezeigt sind. Bei S. curacoi pTESa-bldA sind zwei neu
auftretende Signale J1 und J2 sichtbar, deren UV-Absorptionsspektren in Abbildung 5-29 C gezeigt
sind. J1 hat ein Absorptionsmaximum bei 313 nm, während für J2 zwei Maxima bei 272 und
300 nm zu sehen sind. Für J2 lassen sich aus den Daten der Massenspektren Rückschlüsse auf die
Masse des Moleküls ziehen. Im Positivmodus (Abbildung 5-29 D links) ist m/z=741.3 für [M+H]+
und m/z=763.2 für [M+Na]+ erkennbar, während im Negativmodus (Abbildung 5-29 D rechts)
m/z=739.2 für [M-H]- und m/z=775.0 für [M+Cl]- zu sehen sind. Die tatsächliche molekulare Masse
für J2 lässt sich also mit ca. 740 Da beziffern.
5.6.2 PRODUKTION UND ISOLIERUNG VON J2
Die Isolierung von J2 erfolgte nach Anzucht von S. curacoi pTESa-bldA in insgesamt 8 l
(80 x 100 ml) NL19+-Medium über fünf Tage (s. 4.8.3). Die Extraktion erfolgt mit Ethylacetat wie in
4.9.1 beschrieben, da bei Einsatz von Diaion HP-20 nur deutlich geringere Mengen extrahiert
werden konnten. Der pH-Wert hatte keinen Einfluss auf die Extrahierbarkeit von J2, sehr wohl
aber auf die Extraktion von Verunreinigungen. Wurde das Produktionsmedium vor der Extraktion
auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, konnte J2 vollständig extrahiert werden bei gleichzeitig
geringen Mengen an Verunreinigungen. Somit war es möglich, für die Reinigung direkt
semipräparative HPLC zu verwenden. Die Methode, die zu diesem Zweck entwickelt wurde, ist
unter 4.9.5, Tabelle 4-30 unter dem Namen 1JN213 vermerkt; die Elution von J2 erfolgte nach
11.3 min. Der abschließende Reinigungsschritt bestand aus Chromatographie an Sephadex LH-20
(s. 4.9.4). Die Reinheit der isolierten Substanz ist durch das Chromatogramm in Abbildung 5-30
dargestellt. Insgesamt ließen sich auf diese Weise 1,9 mg an J2 als amorpher schmutzig-weißer
Feststoff gewinnen.
87
Ergebnisse
Abbildung 5-30: Chromatogramm bei λ=250 nm zur Überprüfung der Reinheit von J2.
Eine komplette Strukturaufklärung von J2 war nicht möglich, da die Substanz sehr schlecht in
gängigen, für die NMR-Spektroskopie geeigneten Lösungsmitteln löslich war. Die beste Löslichkeit
bestand in Tetrahydrofuran (THF). Die erhaltenen NMR-Spektren waren jedoch nicht ausreichend
um einen Vorschlag für die Struktur von J2 zu machen. Durch HR-MS-Spektroskopie ließ sich ein
deutliches Signal für m/z=763.2091 im Positivmodus finden. Die, aufgrund der natürlichen
Isotopenverteilung, errechnete zugehörige Summenformel ist C50H26ON7Na. Im Negativmodus war
m/z=739.2136 deutlich erkennbar, entsprechend ist die Summenformel C50H25ON7. Für die
Substanz J2 kann also von der Summenformel C50H26ON7 ausgegangen werden.
88
Ergebnisse
5.7 KONSTITUTIVE EXPRESSION DES BLDA-GENS IN S. ORINOCI, S. OLIVOCHROMOGENES,
S. YANII UND S. ASTEROSPORUS SOWIE WEITEREN STÄMMEN
5.7.1 AUSWIRKUNGEN AUF S. ORINOCI
Der Stamm Streptomyces orinoci DSM 40571 (nachfolgend S. orinoci genannt) zeichnete sich
während der durchgeführten Experimente durch ein sehr schnelles Wachstum und intensive
Gelbfärbung der Kolonien aus. Wurde eine Einzelkolonie von einer MS-Agarplatte zur Beimpfung
von 25 ml TSB Medium verwendet, so war üblicherweise innerhalb von 24 h eine gesättigte Kultur
angewachsen. Es ist bekannt dass dieser Stamm das Polyen Neoaurethin (auch Spectinabilin
genannt) sowie das cyclische Depsipeptid Neoanthimycin produziert (Cassinelli et al. 1967). In den
überprüften Extrakten von S. orinoci lässt sich, unabhängig vom verwendeten
Produktionsmedium oder der genetischen Manipulation, eine Substanz nachweisen, die das, für
ein Polyen, typische UV-Absorptionsspektrum zeigt (Norman et al. 1972). Mutanten von S. orinoci
wurden entsprechend der Vorgehensweise in 4.6.3 erhalten.
Abbildung 5-31: (A) Morphologische Entwicklung von S. orinoci WT, pTESa und pTESa-bldA auf einer MS-Agarplatte
über 96 h bei 28°C. (B) Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Extraktes aus HA-Produktionskulturen von S. orinoci
und UV-Absorptionsspektren der überproduzierten Substanzen C1 und C2.
Die Morphologie von S. orinoci zeigt bei Anzucht auf MS-Agarplatten wie in 4.8.3 beschrieben
nach 96 h keine Beeinflussung durch die Überexpression des bldA-Gens (Abbildung 5-31 A). Der
Sekundärmetabolismus wurde jedoch beeinflusst, was sich an den Extrakten aus HA-Medium
beobachten lässt (Abbildung 5-31 B). Bei 23.4 und 23.7 min zeigen sich in den Chromatogrammen
bei λ=279 nm Signale (C1 und C2), die in den Vergleichschromatogrammen nicht auffielen, jedoch
in geringeren Mengen detektierbar sind. Der Effekt der konstitutiven Expression des bldA-Gens
89
Ergebnisse
auf den Sekundärmetabolismus zeigt sich im Fall von S. orinoci in einer verstärkten Produktion
von mindestens zwei Substanzen.
5.7.2 AUSWIRKUNGEN AUF S. OLIVOCHROMOGENES
Streptomyces olivochromogenes DSM 40451 (nachfolgend S. olivochromogenes genannt) zeigte
während der Untersuchungen für diese Arbeit auf den ersten Blick keine Auffälligkeiten. Innerhalb
von zwei bis drei Tagen wuchs in 25 ml TSB-Medium eine gesättigte Kultur, wenn eine
Einzelkolonie, die von einer MS-Agarplatte entnommen wurde, zum Beimpfen verwendet wurde.
In früheren Untersuchungen wurde berichtet, dass aus Kulturen von S. olivochromogenes die
Sekundärmetabolite Oleandomycin und Chromomycin isoliert werden konnten (Higashide et al.
1965). In neueren Veröffentlichungen wurde über die Identifizierung von neuartigen
Metalloproteasen (Simkhada et al. 2010) und Phospholipasen (Simkhada et al. 2009) aus diesem
Abbildung 5-32: (A) Morphologische Entwicklung von S. olivochromogenes WT, pTESa und pTESa-bldA auf einer
MS-Agarplatte über 96 h bei 28°C. (B) Ausschnitt aus Chromatogrammen der Extrakte aus HA-Produktionskulturen von
S. olivochromogenes bei λ=250 nm und λ=340 nm sowie die UV-Absorptionsspektren der Substanzen H1, H2 und H3; für
H2 sind zusätzlich die ESI-MS-Spektren sowohl im Negativ- als auch im Positiv-Modus dargestellt.
90
Ergebnisse
Stamm berichtet. Mutanten von S. olivochromogenes wurden entsprechend der Vorgehensweise
in 4.6.3 erhalten.
Ähnlich, wie bei S. orinoci im vorigen Abschnitt beschrieben, war auch für S. olivochromogenes
keine Beeinflussung der morphologischen Differenzierung zu beobachten (Abbildung 5-32 A). Eine
weitere Gemeinsamkeit mit den Beobachtungen bei S. orinoci ist, dass Signale in den Extrakten
aus pTESa-bldA Kulturen deutlicher hervortreten und bei den Kontrollen im Hintergrundrauschen
verschwinden (Abbildung 5-32 B). Die UV-Absorptionsspektren für H1 bei 13.9 min und für H2 bei
14.2 min zeigen jeweils nur ein Absorptionsmaximum bei λ=255nm bzw. λ=268 nm. Für H2 lässt
sich aus den Informationen der ESI-MS-Spektren eine molekulare Masse von 308 Da ableiten. Im
Negativmodus zeigen sich Signale bei m/z=307.2 und m/z=615.3, was [M-H]- und [2M-H]entspricht. Im Positivmodus ist ein Signal bei m/z=331.2 erkennbar, was durch [M+Na]+ verursacht
wird. Substanz H3 tritt nur in den Chromatogrammen, die bei λ=340 nm aufgenommen wurden,
bei 13.1 min deutlich hervor. Das UV-Absorptionsspektrum zeigt drei Maxima bei λ=258 nm,
λ=282 nm und λ=348 nm.
5.7.3 AUSWIRKUNGEN AUF S. YANII
Der Stamm Streptomyces yanii DSM 43887 (nachfolgend S. yanii genannt) war bis 2005 unter dem
Namen Microstreptospora cinerea bekannt, bis Liu et al. eine neue Einteilung vornahmen (Liu et
al. 2005). Mutanten von S. yanii wurden entsprechend der Vorgehensweise in 4.6.3 erhalten.
Morphologisch zeigten sich keine Auffälligkeiten; es kam weder zu einer Veränderung der
Abbildung 5-33: (A) Morphologische Entwicklung von S. yanii WT, pTESa und pTESa-bldA auf einer MS-Agarplatte über 96 h
bei 28°C. (B) Ausschnitt aus MSD-Chromatogrammen (mit Extraktion von m/z=742 im Negativ-Modus) der Extrakte aus
HA-Produktionskulturen von S. yanii zusammen mit dem ESI-MS-Spektrum der neu gebildeten Substanz K1.
91
Ergebnisse
morphologischen Differenzierung bei Wachstum auf einer MS-Agarplatte, wie in 4.8.3
beschrieben, durch Manipulation des bldA-Gens, noch war eine Produktion farbiger Substanzen
zu erkennen (Abbildung 5-33 A). Eine Veränderung des Profils des Sekundärmetabolismus lässt
sich bei Betrachtung der MSD-Chromatogramme der Extrakte von Produktionskulturen in
HA-Medium im Negativ-Modus erkennen. Ein Signal für m/z=742.3 tritt nur bei Mutanten mit
manipuliertem bldA-Gen bei 17.8 min auf (Abbildung 5-33 B).
5.7.4 AUSWIRKUNGEN AUF S. ASTEROSPORUS
Streptomyces asterosporus DSM 41452 (nachfolgend S. asterosporus genannt) wurde 1986 dem
Genus der Streptomyces zugeordnet (Preobrazhenskaya 1986), es existieren jedoch keine
Untersuchungen über den Sekundärmetabolismus dieses Stammes. Mutanten von S. asterosporus
wurden entsprechend der Vorgehensweise in 4.6.3 erhalten. Im Hinblick auf die morphologische
Differenzierung (vgl. 4.8.3) lässt sich über 96 h erneut kein Unterschied zwischen den
verschiedenen Mutanten erkennen (Abbildung 5-34 A). Bei Anzucht von S. asterosporus in
HA-Medium lassen sich in den Extrakten der bldA-Mutanten zwei neue Signale bei 14.0 und
14.3 min für die Substanzen L1 und L2 detektieren (Abbildung 5-34 B). Die produzierte Menge ist
jedoch nur gering und es lässt sich den Substanzen keine eindeutige Masse aus den
ESI-MS-Spektren zuordnen. Das UV-Absorptionsspektrum für L1 zeigt eine gewisse Ähnlichkeit zu
Abbildung 5-34: (A) Morphologische Entwicklung von S. asterosporus WT, pTESa und pTESa-bldA auf einer MS-Agarplatte
über 96 h bei 28°C. (B) Ausschnitt aus Chromatogrammen bei λ=340 nm der Extrakte von Produktionskulturen von
S. asterosporus in HA-Medium sowie die UV-Absorptionsspektren der neugebildeten Substanzen L1 und L2.
92
Ergebnisse
dem eines Polyens (Norman et al. 1972), jedoch gibt es zwei Absorptionsmaxima, die mit Maxima
von L2 nahezu übereinstimmen. Es wäre also möglich, dass das Signal für L1 eigentlich von zwei
Substanzen erzeugt wird, wobei eine davon ein Polyen ist und die andere dasselbe Chromophor
wie L2 besitzt.
5.7.5 AUSWIRKUNGEN AUF WEITERE STÄMME
Bei keinem der weiteren untersuchten Stämme war eine Veränderung der morphologischen
Entwicklung auf einer MS-Agarplatte sichtbar. Auch der Sekundärmetabolismus der Stämme
Streptomyces gardneri DSM 40064, Streptomyces clavifer DSM 40843, Streptomyces ambofaciens
DSM 40053, Streptomyces kasugaensis DSM 40819 und Streptomyces vitaminophilus DSM 41686
wurde bei den getesteten Bedingungen nicht durch die Manipulation des bldA-Gens beeinflusst.
Für Streptomyces aureocirculatus DSM 40386 war in einem Ansatz bei der Anzucht in SG+-Medium
in den Extrakten der bldA-Mutanten ein neu auftretendes Signal zu sehen. Dieses Ergebnis ließ
sich jedoch nicht reproduzieren.
Der Stamm Streptomyces longispororuber DSM 40599 konnte mit dem gewählten Ansatz nicht
untersucht werden, da der WT bereits eine Resistenz gegenüber Apramycin besitzt und somit
keine Selektion von gewünschten Mutanten nach einer intergenerischen Konjugation möglich
wäre.
Für die Stämme Streptomyces synnematoformans DSM 41902, Streptomyces bobili DSM 40056
und Streptomyces novaecaesareae DSM 40358 sind keine Aussagen über den Einfluss des
bldA-Gens möglich. In allen drei Fällen war die intergenerische Konjugation sowohl mit pTESa als
auch mit pTESa-bldA erfolglos geblieben. Interessanterweise verfärbten sich Kulturen dieser
Stämme auf MS-Agarplatten nach einigen Tagen im Brutschrank bei 28°C in den Farben dunkellila
(S. synnematoformans), pink (S. bobili) und rot, was schließlich in lila überging
(S. novaecaesareae).
93
Diskussion
6 DISKUSSION
6.1 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DES BIOSYNTHESEGENCLUSTERS DES POLYENS
ANNIMYCIN IN S. CALVUS
6.1.1 INAKTIVIERUNG DES BIOSYNTHESEGENCLUSTERS VON ANNIMYCIN
Die Biosynthesegene für das Polyen Annimycin sind auf DNA-Ebene in einem Cluster zu finden.
Eine Inaktivierung der Biosynthese erfolgte durch Insertionsmutagenese. Hierbei wird ein, zum zu
inaktivierenden Gen, homologer Abschnitt an DNA mittels eines Vektors in die Bakterienzelle
eingeschleust. Nach Integration dieses Abschnitts in das Genom durch homologe Rekombination
ist es dem Bakterium nicht mehr möglich ein funktionierendes Protein zu synthetisieren, da die
zugehörige DNA-Sequenz zerstört ist. Im Fall von S. calvus pTESa-bldA führte die Inaktivierung
einer PKS vom Typ I im contig 3100 zu einem Zusammenbruch der Biosynthese von Annimycin
(vgl. 5.1.1 und 5.1.2). Die Insertion des eingebrachten DNA-Fragments war an der richtigen Stelle
erfolgt, was sich durch einen PCR Ansatz nachweisen ließ (s. 5.1.3). Auf diese Weise war es
möglich, die für Annimycin zuständigen Biosynthesegene zweifelsfrei zu identifizieren.
Nach Inaktivierung der Biosynthese von Annimycin wurde von S. calvus pTESa-bldA x 3100 ein
anderer Naturstoff in größeren Mengen im Vergleich zu S. calvus pTESa-bldA und S. calvus WT
produziert. Dabei handelt es sich um das nicht-ribosomal gebildete Peptid WS9326A (vgl. 5.3 und
6.2). Als Gründe für die vermehrte Bildung von WS9326A können drei Möglichkeiten genannt
werden. Bei der Produktionsanalyse enthielt das Produktionsmedium für S. calvus
pTESa-bldA x 3100 zur Selektion auf die gewünschte Insertionsmutation das Antibiotikum
Spectinomycin, was in den Kontrollen nicht enthalten war. Das Vorhandensein eines
Antibiotikums kann zur Änderung der Aktivität anderer Biosynthesewege geführt haben. Daneben
können durch die Inaktivierung der Produktion von Annimycin mehr Ausgangstoffe für die
Biosynthese der Seitenkette von WS9326A zur Verfügung stehen. Die Inaktivierung eines
Biosyntheseweges führt häufig zur Erhöhung der produzierten Menge eines anderen Naturstoffes.
Dieses Phänomen nutzt man u.a. bei der Optimierung von Stämmen für die Produktion im
industriellen Maßstab (Park et al. 2010). Bei einem Vergleich der von S. calvus pTESa-bldA x 3100
und S. calvus WT produzierten Mengen an WS9326A fällt auf, dass S. calvus pTESa-bldA x 3100
deutlich mehr WS9326A produziert, obwohl beide Stämme kein Annimycin produzieren. Dies
kann an den im Medium vorhandenen Antibiotika liegen, es ist aber auch denkbar, dass durch das
Vorhandensein eines funktionierenden bldA-Gens eine verstärkte Expression der Biosynthesegene
verursacht wurde. Diese Beobachtung deckt sich mit den in Abschnitt 5.4 bis 5.7 beschriebenen
und wird ausführlich in Abschnitt 6.3 diskutiert.
94
Diskussion
6.1.2 ANALYSE DES BIOSYNTHESEGENCLUSTERS VON ANNIMYCIN
Durch die Identifizierung der Biosynthesegene für Annimycin lässt sich die DNA-Sequenz auf
Besonderheiten und Zusammenhänge mit der identifizierten chemischen Struktur von Annimycin
untersuchen. Eine erste Besonderheit ist, dass sich auf DNA-Ebene in keinem der Biosynthesegene
und keinem der Gene mit regulatorischer Funktion ein TTA Codon identifizieren lässt. Die
Abhängigkeit der Biosynthese von Annimycin von einer funktionierenden bldA-tRNA muss
demnach indirekt sein. Laut Hesketh kommen hierfür drei Möglichkeiten in Frage (Hesketh et al.
2007): Aktivierung durch einen globalen Regulator, wie die Aktivierung des ultimativen
Regulatorgens strR der Streptomycin Biosynthese durch AdpA in S. griseus (Ohnishi et al. 1999),
Co-Transkription mit anderen TTA-haltigen Genen oder eine Beeinflussung durch Änderung der
ppGpp-Level innerhalb der Zelle.
Die Polyenkette von Annimycin wird von einer Polyketidsynthase vom Typ I gebildet.
Normalerweise spiegelt sich die Struktur eines Polyketids in der sequentiellen Abfolge der
katalytischen Domänen der PKS wider, was als Co-Linearität bezeichnet wird. Im vorliegenden Fall
zeigen sich jedoch zwei Abweichungen. Zum Einen findet sich eine Hydroxylgruppe an C3, die
durch die KR-Domäne in Modul 5 eingefügt wurde. Laut der sequentiellen Vorhersage befindet
sich nachfolgend eine DH-Domäne. Dennoch kommt es nicht zu einer Reduktion der
Hydroxylgruppe. Dies lässt den Schluss zu, dass diese DH-Domäne trotz des Vorhandenseins der
nötigen aktiven Aminosäurereste nicht funktionell ist (Keatinge-Clay 2008). Momentan ist jedoch
noch zu wenig über die genauen Unterschiede verschiedener DH-Domänen in PKS I bekannt, als
dass sich nur anhand der Sequenzdaten eine Vorhersage über die Funktionalität von DH-Domänen
machen lässt (Keatinge-Clay 2012). Die zweite Abweichung von der Co-Linearität ist das
gleichzeitige Auftreten von 4-Z- und 4-E-Annimycin in einem dynamischen Verhältnis zueinander.
Die Diskussion über die denkbaren Ursachen dieses Phänomens findet in Abschnitt 6.1.3 statt.
95
Diskussion
6.1.3 ANALYSE DES PRODUKTIONSVERLAUFS VON ANNIMYCIN
Bei der Analyse der zu verschiedenen Zeitpunkten produzierten Mengen an Annimycin fiel auf,
dass nach zwei bis drei Tagen ein Maximum erreicht wird und danach die insgesamt detektierbare
Menge zurückgeht. Das Verhältnis von 4-Z-Annimycin (cis-Annimycin) zu 4-E-Annimycin
(trans-Annimycin) ist dabei dynamisch. Anfangs ist das Verhältnis deutlich auf Seiten des
cis-Isomers, am Ende des untersuchten Zeitraums von sieben Tagen konnte doppelt so viel transwie cis-Isomer detektiert werden. Als Ursachen für diese Dynamik kommen Gründe wie
unterschiedliche Stabilität der Isomere, verschiedenen Biosyntheseraten, Unterschiede in der
Reaktivität oder der Einfluss eines modifizierenden Enzyms, wie z.B. einer Isomerase, in Frage.
In den meisten Fällen haben Doppelbindungen in Polyketiden eine trans-Konfiguration (Hertweck
2009). Dies wird dadurch verursacht, dass die KR-Domänen meistens vom B-Typ sind, die
D-3-Hydroxyacyl-Intermediate bilden. Bei der anschließenden bevorzugten syn-Eliminierung von
Wasser durch DH-Domänen bildet sich eine trans-konfigurierte Doppelbindung aus. Die
Ausbildung einer cis-konfigurierten Doppelbindung wäre möglich, wenn eine KR-Domäne vom
A-Typ ein L-3-Hydroxyacyl-Intermediat bildet. Für die folgende syn-Eliminierung von Wasser
müsste dieses Intermediat um seine C2-C3-Achse rotieren und die Folge wäre eine
cis-konfigurierte Doppelbindung (Keatinge-Clay 2012; Valenzano et al. 2010). Für Annimycin
müssen die beschriebenen Prozesse im Modul 4 ablaufen. Die dort identifizierte KR-Domäne trägt
jedoch die Sequenzmotive einer B-Typ-KR-Domäne (Keatinge-Clay 2007; Caffrey 2003). Allerdings
ist das LDD-Motiv zu ADD verändert. Das Leucin im LDD-Motiv soll das Substrat zum
Nicotinamidring des NADHs im aktiven Zentrum der KR-Domäne leiten (Keatinge-Clay 2007).
Durch die Mutation von Leucin zu Alanin wäre es möglich, dass das Substrat durch das sterisch
weniger anspruchsvolle Alanin eine größere Flexibilität in seiner räumlichen Anordnung erfährt. In
der Folge könnten sowohl das D- als auch das L-3-Hydroxyacyl-Intermediat entstehen und die
DH-Domäne beide Doppelbindungsisomere bilden. In diesem Fall müsste das Modul 4 und alle
nachfolgenden Module über eine ausreichende Flexibilität besitzen um beide Isomere zu
prozessieren. Die gleichzeitige Bildung eines cisund eines trans-Isomer durch eine PKS I wurde
auch für Thailandamid beschrieben, jedoch ist in diesem Fall das cis-Isomer deutlich instabiler als
das trans-Isomer (Ishida et al. 2012).
Die Theorie der gleichzeitigen Bildung beider Isomere durch die PKS I allein erklärt nicht, warum
das Verhältnis zueinander nicht konstant sondern dynamisch ist. Dies deutet darauf hin, dass
weitere Faktoren auf Annimycin einwirken. Möglich wäre eine Isomerase wie sie bereits für die
Naturstoffe Phoslactomycin, Hypothemycin und Radicicol beschrieben wurde (Palaniappan et al.
2008; Reeves et al. 2008). Eine mögliche Isomerase lässt sich von den zum Cluster gehörenden
Genen jedoch nicht ableiten. Eine andere Variante wäre, dass das im Biosynthesecluster
identifizierte Membrantransportprotein bevorzugt eines der beiden Isomere erkennt und über die
Membran transportiert, in diesem Fall das cis-Isomer. Wenn wie im Fall von Thailandamid das
trans-Isomer eine höhere Stabilität als das cis-Isomer besitzt, würde dies einen Teil der
Beobachtungen erklären. Das relative Verhältnis läge anfangs auf der Seite des cis-Isomers, da es
in größeren Mengen vom Transportprotein erkannt und ins Produktionsmedium abgegeben wird.
Wenn die Biosynthese von Annimycin nach und nach zum Erliegen kommt ist die Folge, dass das
vorhandene cis-Isomer schneller abgebaut wird und, relativ gesehen, das Verhältnis sich zu
Gunsten des trans-Isomers ändert. Um zu klären, ob die Isomerisierung tatsächlich durch eine
96
Diskussion
Flexibilität der KR in Modul 4 verursacht wird, wäre ein Ansatz wie er zur Untersuchung der
Doppelbindungsverschiebung in Corallopyronin verwendet wurde möglich. Dabei wurde die
Aktivität und Funktionalität einer isolierten heterolog exprimierten DH-Domäne in deuteriertem
Puffer untersucht (Lohr et al. 2013).
Wertvolle Erkenntnisse wären in diesem Zusammenhang auch von der chemischen Struktur der
während der Experimente entdeckten möglichen freien Polyketidkette von Annimycin zu
erwarten. Gelänge es diese zu isolieren und die Konfiguration der Doppelbindungen zu
bestimmen, ließe sich klären, welches Isomer von der PKS gebildet wird. Die Chromatogramme
lassen darauf schließen, dass nur ein einzelnes Isomer gebildet wird, da nur ein Signal mit
entsprechendem UV-Absorptionsspektrum und zugehörigem Molekülion mit passendem MasseLadungsverhältnis zu finden ist.
97
Diskussion
6.1.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR BIOAKTIVITÄT VON ANNIMYCIN
Zur Untersuchung der Bioaktivität wurde eine Mischung aus 90 % cisund 10 % trans-Annimycin
gereinigt und von Maulik Thaker an der McMaster University in Hamilton, ON, Kanada untersucht
(vgl. 5.2). Diese Mischung zeigte sich inaktiv gegen die meisten getesteten Bakterien und Pilze,
zeigte aber eine Inhibition der Sporulation bei einigen Actinobacteria. Vergleicht man die
chemische Struktur von Annimycin mit der von γ-Butyrolactonen (GBL), einer wichtigen Gruppe
von Signalmolekülen, im Zusammenhang mit Sekundärmetabolismus und morphologischer
Differenzierung in Streptomyceten (Willey und Gaskell 2011), so lässt sich eine gewisse
strukturelle Ähnlichkeit erkennen (Abbildung 6-1). Es kann also zu einer gewissen Konkurrenz um
Bindungsstellen zwischen den Molekülen kommen. Im Falle von SCB1-3 aus S. coelicolor gilt es zu
bedenken, dass eine Beeinflussung durch GBL bisher nur für den Sekundärmetabolismus gezeigt
werden konnte, während die Morphologie nicht betroffen ist (Willey und Gaskell 2011). Weiterhin
können auch subletale Konzentrationen von Antibiotika, die keinen Einfluss auf die
morphologische Entwicklung haben, wie beispielsweise Apramycin, eine Inhibierung der
morphologischen Differenzierung verursachen.
Abbildung 6-1: Vergleich der chemischen Strukturen von cisund trans-Annimycin mit den γ-Butyrolactonen A-Faktor
aus S. griseus und SCB1-3 aus S. coelicolor (vgl. Willey und Gaskell 2011).
In diesem Zusammenhang war es interessant zu testen, ob Annimycin einen Einfluss auf den
Sekundärmetabolismus anderer Actinobacteria hat (s. 5.2.3). Wird die o.g. Mischung auf ein
Filterplättchen gegeben und direkt gegen S. coelicolor und Glycomyces sp. WAC1371 eingesetzt
kommt es nicht zu einer visuell erfassbaren Minderproduktion farbiger Metabolite. Werden
S. calvus pTESa-bldA und S. coelicolor über mehrere Tage auf einer Platte co-kultiviert, konnte
beobachtet werden, dass S. coelicolor im Vergleich zur Kontrolle eine geringere Menge eines
blauen Pigments produziert. Dabei handelt es sich wahrscheinlich um Actinorhodin. Ob diese
Beeinflussung tatsächlich durch Annimycin zustande kam, ist wahrscheinlich, jedoch nicht
eindeutig zu klären. Zu diesem Zweck müssten größere Mengen an Annimycin isoliert werden und
98
Diskussion
Flüssigproduktionskulturen von S. coelicolor zugesetzt werden. Auf diese Weise ließe sich eine
detailliertere Analyse vollziehen. Es ist nicht auszuschließen, dass neben dem blauen auch andere
Metabolite von S. coelicolor beeinflusst wurden.
An der Wirkung von Annimycin ist eine entscheidende Beteiligung des C5N-Rings als
wahrscheinlich anzusehen. Dieses Strukturelement lässt sich in vielen anderen Molekülen finden,
wie beispielsweise der großen Gruppe der Manumycine und der Asukamycine (Hu und Floss
2001). In sehr vielen Fällen ist dieser Ring an die Kette eines Polyens gehängt, als Ausnahme ist
Moenomycin bekannt (Zhang et al. 2010). Die α,β-ungesättigte Carbonylgruppe des C5N-Rings
scheint als Michael-Akzeptor zu wirken, wodurch es Enzyme kovalent inaktivieren kann, was ein
für viele Naturprodukte üblicher Mechanismus ist (Zhang et al. 2010).
Unabhängig vom genauen Wirkmechanismus wäre es durchaus ein evolutionärer Vorteil, wenn
S. calvus über Annimycin andere Actinobacteria in ihrem Entwicklungszyklus beeinträchtigen
könnte. Besonders dann, wenn ein limitiertes Nahrungsangebot zur Sporulation anregen würde.
Unter diesen Umständen könnte S. calvus durch eine vollendete Sporulation diese
Mangelzustände überdauern, wozu die direkten Konkurrenten nicht in der Lage wären.
Interessant wäre es auch, die relative Bioaktivität der beiden Annimycin-Isomere zu vergleichen.
Zu diesem Zweck müsste jedoch ein System entwickelt werden, das eine stabile und vollständige
Trennung erlaubt (vgl. 5.2.1).
99
Diskussion
6.2 IDENTIFIZIERUNG EINES NICHT-RIBOSOMAL GEBILDETEN PEPTIDS IN S. CALVUS
PTESA-BLDA X 3100 UND S. CALVUS #9
6.2.1 ANALYSE DER GENOMSEQUENZ AUF MÖGLICHE BIOSYNTHESEGENCLUSTER
Bei den Mutanten S. calvus pTESa-bldA x 3100 und S. calvus #9 wurde eine erhöhte Produktion
eines nicht-ribosomal gebildeten Peptids festgestellt. Bei dieser Substanz handelt es sich um
WS9326A (Abbildung 6-2), ein zyklisches Depsipeptid, das aus sieben Aminosäuren
zusammengebaut ist. Daneben enthält es eine cinnamoylartige Acylseitenkette, die über eine
Amidbindung an die Aminogruppe eines Threonins des Aminosäurengrundgerüsts angehängt ist.
Dem Threonin folgt ein modifiziertes Tyrosin, welches an der Aminogruppe methyliert ist und
zwischen dem α- und dem β-C-Atom eine Doppelbindung trägt. Dem Tyrosin nachfolgend ist die
Sequenz der Aminosäuren Leucin, Phenylalanin, Threonin, Asparagin und abschließend Serin. Der
Ring ist zwischen der Carboxylgruppe des abschließenden Serins mit der Hydroxylgruppe des
ersten Threonins durch eine Esterbindung geknüpft. Bei Molekülen in der Größe von WS9326A
und der Modifizierung des Tyrosins ist es naheliegend, dass NRPS-Gene an der Biosynthese
beteiligt sind. Bei der Suche nach einem möglichen Biosynthesegencluster lag der Fokus also auf
der Betrachtung von NRPS-Genen.
+
Abbildung 6-2: Strukturformel von WS9326A, isoliert als 3 aus Produktionskulturen von S. calvus #9 in SG -Medium, mit
Bezeichnung der für die Biosynthese verwendeten Aminosäuren.
100
Diskussion
In der Genomsequenz von S. calvus lässt sich ein mögliches Cluster auf dem contig 8 der
Genomsequenzdaten finden (vgl. 5.3.3). Neben Biosynthesegenen für das Peptidgrundgerüst und
die Acylseitenkette finden sich auch Gene mit möglicher regulatorischer Funktion und solche, die
für einen möglichen ABC-Transporter codieren. In diesem Abschnitt soll die Funktion der
strukturellen Biosynthesegene näher betrachtet und diskutiert werden.
Eine ähnliche Acylseitenkette, wie man sie in WS9326A findet, wurde bereits für die Skyllamycine
beschrieben (Pohle et al. 2011). Dabei handelt es sich, wie bei WS9326A auch, um zyklische
Depsipeptide. Der Unterschied in der Seitenkette liegt in der Länge, bei WS9326A handelt es sich
um einen C14-Grundkörper, während bei den Skyllamycinen ein C12-Grundkörper vorhanden ist.
Die Biosynthese der Skyllamycinseitenkette wurde bereits aufgeklärt, weshalb die Analyse der
möglichen Biosynthesegene der Seitenkette von WS9326A in enger Anlehnung an die der
Skyllamycine geschieht (Abbildung 6-3). In einem ersten Schritt wird ein Acetoacyl-ACP Molekül
gebildet, das in der Folge um mehrere Malonyl-CoA-Einheiten erweitert wird. Die bei Skyllamycin
wahrscheinlich beteiligten Enzyme Sky16, Sky17, Sky18, Sky19, Sky22 und Sky23 haben im
gefundenen Biosynthesegencluster von WS9326A entsprechende Homologe (s. Tabelle 6-1). Die
Reduktion zu einem Enoyl-ACP Zwischenprodukt erfolgt durch Sky24, Sky25 und Sky26. Auch hier
lassen sich entsprechende Homologe finden. Die für die Skyllamycine vorgeschlagene Ringbildung
zwischen C4 und C9 der Seitenkette erfolgt durch eine 6π-Elektronen-Zyklisierung. Diese ist nur
möglich, wenn die Polyenkette eine bestimmte Konfiguration besitzt (4E, 6Z, 8E). Von den für die
Katalyse dieser Anordnung vorgeschlagenen Enzymen Sky5 und Sky27 besitzt im vorliegenden Fall
nur Sky27 ein Homolog. Der Ringschluss soll entweder durch Sky4 oder Sky28 erfolgen, wobei nur
für Sky28 ein Homolog existiert. Für WS9326A wäre es nötig die Kette um eine Malonyl-CoA
Einheit zu verlängern, was durch die iterative Verwendung der putativen Ketosynthasen
geschehen kann. Dies ließe erwarten, dass auch zwischen C12 und C13 eine Doppelbindung
bestehen würde, was aber bei WS9326A nicht der Fall ist und auf eine zusätzliche Reduktion
schließen lässt. Durch ORF00115 wird eine mögliche Reduktase codiert, für die sich kein Homolog
im Skyllamycin-Biosynthesegencluster finden lässt. Somit könnte das durch dieses Gen codierte
Enzym die erforderliche Reaktion katalysieren. Zusammenfassend lässt sich für die Biosynthese
der Acylseitenkette sagen, dass sich sehr viele Homologien zu den Skyllamycin-Genen finden
lassen und eine Bildung der Seitenkette auf einem analogen Weg wahrscheinlich und plausibel ist.
Das Peptidgrundgerüst von WS9326A ließe sich von den NRPS-Genen im hier diskutierten Cluster
biosynthetisieren. Die Spezifität der Adenylierungsdomänen (A) der NRPS-Gene passt laut der
Vorhersage von antiSMASH (Blin et al. 2013) sehr gut zu der Sequenz der Aminosäuren in
WS9326A. Die Abfolge der Aminosäuren lässt bei nicht-ribosomal gebildeten Proteinen in vielen
Fällen auf die Abfolge der Module schließen, die sogenannte Co-Linearitätsregel (Wenzel und
Müller 2005). Im vorliegenden Fall gibt es jedoch Abweichungen von dieser Regel.
101
Diskussion
Tabelle 6-1: Auflistung von an der Biosynthese der Seitenkette der Skyllamycine beteiligten Biosynthesegene (Pohle et
al. 2011) und deren Homologe im möglichen Biosynthesegencluster von WS9326A mit deren vorgeschlagenen
Funktionen.
Gene im möglichen
Biosynthesegencluster
von WS9326A
----ORF00107
ORF00105
ORF00104
ORF00103
ORF00101
ORF00099
ORF00097
ORF00096
ORF00094
ORF00110
ORF00109
ORF00115
vorgeschlagene Funktion
homologe Biosynthesegene in
der Biosynthese von Skyllamycin
Oxidoreductase
Isomerase
Acyl Carrier Protein
3-oxoacyl-ACP Synthase II
3-oxoacyl-ACP Synthase II
3-oxoacyl-ACP Synthase I
3-oxoacyl-ACP Synthase I
Acyl Carrier Protein
3-hydroxyacyl-ACP Dehydratase
3-hydroxyacyl-ACP Dehydratase
3-oxoacyl-ACP Reductase
Isomerase
Oxidoreductase
Reductase
sky4
sky5
sky16
sky17
sky18
sky19
sky22
sky23
sky24
sky25
sky26
sky27
sky28
---
Abbildung 6-3: Darstellung der möglichen Biosynthese der Acylseitenkette von WS9326A mit Beteiligung der
vorhergesagten Genprodukte (adaptiert nach Pohle et al. 2011).
102
Diskussion
Das erste NRPS-Gen wird von ORF00133 codiert; es handelt sich dabei um eine dimodulare NRPS,
deren erstes Modul den Aufbau C-A-PCP mit der Spezifität für Threonin besitzt. Das erste Modul
einer NRPS verfügt oft nicht über eine Kondensationsdomäne (C), da nur eine Aminosäure auf das
Peptidyl-Carrier-Protein (PCP) geladen wird, ohne eine Amidbindung zu knüpfen (Strieker et al.
2010). Die Anwesenheit der C-Domäne könnte darauf hinweisen, dass Threonin durch dieses
Modul mit der Acylseitenkette verknüpft wird. Das zweite Modul besitzt einen C-A-NMT-PCP
Aufbau mit der Spezifität für Tyrosin. In WS9326A ist der Amidstickstoff methyliert, was die
vorliegende N-Methyltransferase (NMT) katalysieren könnte. Solche Modifizierungen wurden
schon häufig beobachtet und auch die Positionierung innerhalb des Moduls entspricht der bereits
charakterisierter NMT-Domänen (Marahiel 2009). In ORF00130 findet sich eine weitere
dimodulare NRPS. Im ersten Modul, mit der Spezifität für Leucin, entspricht der Aufbau mit
C-A-PCP dem kanonischer NRPS Gene. Das zweite Modul hat mit dem Aufbau C-A-PCP-E ebenfalls
einen klassischen Aufbau. Die A-Domäne ist spezifisch für Phenylalanin. Ob die
Epimerisierungsdomäne (E) tatsächlich für die Inkorporierung von D-Phenylalanin sorgt, lässt sich
aus der bisher bekannten Struktur von WS9326A nicht ableiten. Die Positionierung entspricht wie
die NMT Domäne in ORF00133 den Erwartungen (Marahiel 2009). Ab ORF00126 kommt es zu
Abweichungen von der Co-Linearitätsregel. Die NRPS von ORF00126 hat mit C-PCP-C-A-PCP-TE
einen ungewöhnlichen Aufbau. Das erste Modul (C-PCP) entspricht nicht dem Aufbau eines
üblichen NRPS Moduls. Da keine A-Domäne detektierbar ist, lässt sich vermuten, dass die
Adenylierung der PCP-Domäne in trans stattfindet. Ein möglicher Mechanismus und Ablauf der
Biosynthese wird in 6.2.2 diskutiert. Der zweite NRPS-Abschnitt mit C-A-PCP-TE entspricht dem
typischen Aufbau eines abschließenden Moduls (Condurso und Bruner 2012).
Thioesterasedomänen (TE) können, neben der Hydrolyse der Peptidkette vom abschließenden
PCP, Zyklisierungsreaktionen durchführen (Marahiel 2009). Im Fall von WS9326A muss eine solche
Zyklisierung durch die Bildung der Esterbindung zwischen der Carboxylgruppe des Serins und der
Hydroxylgruppe des ersten Threonins geschehen. Da die A-Domäne dieses Moduls spezifisch für
Serin ist, ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass es sich hierbei tatsächlich um das Abschlussmodul
der Biosynthese von WS9326A handelt. Laut der Co-Linearitätsregel sollten sich vor dem
Abschlussmodul zwei Module mit Spezifität für Threonin und Asparagin finden. Diese finden sich
jedoch erst danach in den ORFs 00119 (Threonin) und 00117 (Asparagin). Neben der
ungewöhnlichen Positionierung innerhalb des Clusters ist auch der Aufbau der Module mit jeweils
A-PCP bemerkenswert, da es die Vermutung nahe legt, dass die oben erwähnte
in trans-Adenylierung des ersten Moduls in ORF00126 durch diese beiden ungewöhnlich
aufgebauten Enzyme erfolgen könnte (s. 6.2.2). Trotz der Abweichungen von der Co-Linearität
sind die Übereinstimmungen zwischen der Struktur und Aminosäurensequenz von WS9326A und
den detektierten Biosynthesegenen sehr groß, da die Spezifität der A-Domänen gut zu den
benötigen Aminosäuren passt.
Die Wahrscheinlichkeit, dass es sich bei dem hier diskutierten Biosynthesegencluster tatsächlich
um das für die Biosynthese von WS9326A benötigte handelt, ist sehr groß, da neben den NRPS
Genen auch die Biosynthese der Acylseitenkette von den detektierten Genen durchgeführt
werden könnte. Ein experimenteller Beweis dieser Hypothese steht noch aus. Ein solcher wäre
durch eine Inaktivierung eines oder mehrerer NRPS-Gene mittels Insertionsmutagenese, analog
dem Nachweis der Biosynthesegene von Annimycin, möglich (vgl. 5.1).
103
Diskussion
Bei der Analyse der Gene des Clusters war auffallend, dass es durchgehend hohe
Übereinstimmungen von ca. 90% auf der Ebene der Aminosäuren mit Genen aus S. griseoflavus
gab. Diese Gene konnten jedoch nicht der Biosynthese eines bestimmten Moleküls zugeordnet
werden. Dies deutet darauf hin, dass S. calvus und S. griseoflavus entweder phylogenetisch eng
verwandt sind oder aber das entsprechende Biosynthesegencluster durch horizontalen
Gentransfer untereinander bzw. jeweils von einem anderen Organismus erhielten.
6.2.2 POTENTIELLE BIOSYNTHESE DES PEPTIDGRUNDGERÜSTS VON WS9326A
Die Reihenfolge der Aminosäuren in WS9326A ist unterschiedlich zu der Reihenfolge der Gene im
möglichen Biosynthesegencluster, was eine Abweichung von der Co-Linearitätsregel darstellt. In
diesem Abschnitt soll dargelegt werden, wie die Biosynthese des Peptidrückgrats von WS9326A
ablaufen könnte (Abbildung 6-4). Wie schon in 5.3.3 erwähnt, hat das erste Modul des
Genprodukts von ORF00133 den Aufbau C-A-PCP. Die Anwesenheit einer C-Domäne deutet darauf
hin, dass direkt eine Verknüpfung der Acylseitenkette mit Threonin stattfindet. In Modul 2 erfolgt
eine Erweiterung mit Tyrosin. In WS9326A lassen sich an diesem Baustein zwei Modifizierungen
erkennen. Zum Einen die Methylierung des Amidstickstoffs, die durch die detektierte
NMT-Domäne erfolgen kann. Dies ist ein Vorgang, von dem bekannt ist, dass er oft in die
Biosynthese von nicht-ribosomalen Peptiden innerhalb der NRPS integriert ist (Marahiel 2009).
Die zweite Modifizierung ist eine Doppelbindung zwischen dem α-C-Atom und dem β-C-Atom
(2∆-Tyrosin). Es gibt drei Möglichkeiten zu welchen Zeitpunkten diese Modifizierungsreaktion
stattfinden kann. Der am häufigsten zu beobachtende Zeitpunkt ist der nach der Ablösung des
Grundgerüsts von der NRPS (Nolan und Walsh 2009). Es gibt jedoch auch Beispiele bei denen eine
Modifizierung erfolgt, während das Grundgerüst an die NRPS gebunden ist, wie bei dem
Glycopeptid A40926 (Stinchi et al. 2006), oder es kommt zu einer Modifizierung der Aminosäure
bevor sie von der NRPS für die Biosynthese rekrutiert wird, wie es im Fall von Balhimycin zu sehen
ist (Puk et al. 2004). Die Einführung der Doppelbindung wäre möglich durch eine Hydroxylierung
und anschließende Eliminierung von Wasser. Diese Reaktionen könnten von den Genprodukten
der ORF00134 (Cytochrom P450 Hydroxylase) und ORF00140 (Dehydratase) katalysiert werden.
Mögliche experimentelle Ansätze zur Klärung der Frage des Zeitpunkts und des Mechanismus der
Modifizierung der Doppelbindung werden im letzten Absatz dieses Abschnitts diskutiert. In Modul
3 erfolgt der Einbau eines Leucins, wobei an diesem Modul keine außergewöhnlichen Domänen
festzustellen sind. In Modul 4 findet sich eine E-Domäne, was darauf hindeutet, dass statt
L-Phenylalanin das nicht-proteinogene D-Phenylalanin in WS9326A eingebaut wird. Die
Informationen aus den NMR-Daten zur Strukturaufklärung sind jedoch nicht ausreichend um die
tatsächliche Konfiguration zu bestimmen.
Die ersten vier Module folgen der Co-Linearitätsregel, doch nachfolgend lassen sich
Abweichungen feststellen. Ausgehend von der Abfolge der Aminosäuren in WS9326A muss nach
Phenylalanin ein Threonin eingebaut werden. Von ORF00119 wird ein NRPS-artiges Protein
codiert, dessen A-Domäne eine Spezifität für Threonin besitzt. Es wäre also denkbar, dass das für
die Biosynthese benötigte Threonin vom ORF00119 Genprodukt in trans bereitgestellt wird und
die Kondensationsreaktion durch die erste C-Domäne im ORF00126 Genprodukt katalysiert wird.
Bei der Biosynthese der NRP-Moleküle Syringomycin (Guenzi 1998), Yersiniabactin (Gehring et al.
1998) und FK228 (Cheng et al. 2007) wurden ähnliche Reaktionen nachgewiesen. In diesen Fällen
werden PCP-Domänen von C-PCP Modulen durch A-Domänen aus vorhergehenden Modulen
104
Diskussion
beladen. Der Unterschied ist jedoch, dass diese A-Domänen jeweils auch eine PCP-Domäne ihres
eigenen Moduls in cis beladen. Im vorliegenden Fall würde die Aminosäure jedoch von einem
A-PCP Modul eines eigenständigen NRPS-artigen Proteins zur Verfügung gestellt werden. Dem
Threonin nachfolgend muss ein Asparagin in das Peptidgrundgerüst eingebaut werden. Diese
Aminosäure könnte durch das A-PCP Modul im Genprodukt von ORF00117 bereitgestellt werden,
ebenfalls in trans. In diesem Fall müsste die C-Domäne von ORF00119 zwei aufeinanderfolgende
Kondensationsreaktionen durchführen. In der Literatur lässt sich ein Beispiel für ähnliche
Eigenschaften einer C-Domäne bei der Biosynthese von Myxochelin finden (Silakowski et al.
2000). Nach Inkorporation von Threonin sowie Asparagin, wie beschrieben, kann eine Weitergabe
an Modul 7 erfolgen. Dieses Modul hat durch seine TE-Domäne die Charakteristika eines
Abschlussmoduls. Die Spezifität für Serin passt sehr gut zu den Anfordernissen für die WS9326A
Biosynthese. Die Ausbildung der Esterbindung zwischen der Hydroxylgruppe und der
Carboxylgruppe des ersten Threonins könnte somit durch die TE-Domäne erfolgen. Weitere
Modifizierungen sind ausgehend von der identifizierten chemischen Struktur von WS9326A nicht
zu erwarten.
Ein experimenteller Nachweis, dass es sich bei dem detektierten Biosynthesegencluster
tatsächlich um das für WS9326A handelt, steht aus. Die Wahrscheinlichkeit dafür ist jedoch als
groß anzusehen. Die Biosynthese sämtlicher Bestandteile von WS9326A lässt sich mit den
detektierbaren Genen plausibel erklären. Für nähere Untersuchungen sollte das gesamte
Biosynthesegencluster in ein Cosmid kloniert werden, so dass eine heterologe Expression möglich
ist. Auf diese Weise ließen sich auch gezielte Geninaktivierungen zur Klärung der Funktion
einzelner Genprodukte schnell und effektiv bewerkstelligen. Die Untersuchung der Reaktionen,
die der Ausbildung der Doppelbindung im Tyrosin zugrunde liegen, ist dabei nur ein Beispiel.
Durch Inaktivierungen der Gene ORF00134 (Cytochrom P450 Hydroxylase) bzw. ORF00140
(Dehydratase) könnte deren Beteiligung bestätigt oder widerlegt werden. Die alleinige
Inaktivierung von ORF00140 könnte zu einer Variante von WS9326A mit einem hydroxylierten
Tyrosin statt 2∆-Tyrosin führen. Inaktivierung von ORF00134 (mit oder ohne Inaktivierung von
ORF00140) könnte zu einem fertigen Produkt mit unmodifiziertem Tyrosin führen. Denkbar ist
aber auch, dass es zu einem kompletten Produktionsausfall kommt, da die Modifizierung am
Tyrosin unabdingbar für die Prozessierung der Aminosäurenkette in der NRPS ist. In jedem Fall ist
darauf zu achten, dass es bei Inaktivierungsexperimenten nicht zu einer Verschiebung des
Leserahmens kommt, was sonst polare Effekte auf nachfolgende Gene zur Folge hätte. Wäre die
Beteiligung und Rolle der beiden Gene geklärt ließen sich mit den erhaltenen Mutanten
Fütterungsexperimente mit Zugabe von 2∆-Tyrosin zum Produktionsmedium durchführen. Wird
durch die Zugabe die Produktion wieder in den ursprünglichen Zustand versetzt, bedeutet dies,
dass die Modifizierung des Tyrosins vor der Aufnahme der Aminosäure in die NRPS geschieht.
Bleibt die Produktion der Mutante davon jedoch nicht beeinflusst, zeigt dies eine Modifikation
während oder nach der Biosynthese an der NRPS an (vgl. Puk et al. 2004 und Stinchi et al. 2006).
Bestätigt sich die Hypothese, dass es zu einer in trans Adenylierung durch zwei eigenständige
NRPS-artige Proteine kommt, hätte man wertvolle Werkzeuge für die kombinatorische
Biosynthese. Diese Bausteine könnten in andere Systeme integriert und ihre
Aminosäurenspezifität durch Änderung des „Erkennungscodes“ variiert werden (Marahiel 2009).
Es ist auch nicht auszuschließen, dass von S. calvus weitere Derivate von WS9326A produziert
werden können, die eine abweichende Aminosäuresequenz haben. Speziell die Aminosäuren
105
Diskussion
Threonin an Position 5 und Asparagin an Position 6 könnten betroffen sein, indem sie nicht oder
aber in umgekehrter Reihenfolge eingebaut werden.
Abbildung 6-4: Potentielle Biosynthese des
Peptidgrundgerüsts von WS9326A. Die
erste C-Domäne in ORF00126 führt zwei
Kondensationsreaktionen
aus,
die
benötigten Aminosäuren Threonin und
Asparagin werden in trans von ORF00119
und ORF00117 bereit gestellt. Die
Doppelbindung an Tyrosin entsteht nach
der Biosynthese des Rückgrats durch eine
Cytochrom P450 Hydroxylase (codiert
durch ORF00134) und einer Dehydratase
(codiert durch ORF00140).
106
Diskussion
6.3 KONSTITUTIVE EXPRESSION DES BLDA-GENS IN WEITEREN STREPTOMYCETEN-STÄMMEN
6.3.1 AUSWIRKUNGEN AUF DIE MORPHOLOGIE UND DEN SEKUNDÄRMETABOLISMUS
Die Auswirkungen der konstitutiven Expression des bldA-Gens auf verschiedene Streptomyceten
Stämme sind in den Abschnitten 5.4 bis 5.7 beschrieben. Dabei sind die Auswirkungen auf die
Morphologie und den Sekundärmetabolismus getrennt zu betrachten.
Bei der Komplementierung von S. calvus mit einem funktionsfähigen bldA-Gen erlangte der Stamm
die Fähigkeit zur morphologischen Differenzierung und konnte auf einer MS-Agarplatte Sporen
bilden (Kalan et al. 2013). Eine solch deutlich sichtbare Veränderung war bei keinem der
untersuchten Stämme zu sehen. Einzig bei S. curacoi kam es bei pTESa-bldA Mutanten zu einer
schnelleren Sporenbildung als bei den Kontrollen.
Der sogenannte kahle („bald“) Phänotyp, bei dem der betroffene Stamm nur vegetatives Wachstum,
jedoch keine Ausbildung von Luftmycel zeigt, ist typisch für ein funktionsunfähiges bldA-Genprodukt
und wurde für S. coelicolor und andere Stämme beschrieben (Merrick 1976; Chater und Chandra
2008). Das bldA-Gen ist im Prozess der morphologischen Differenzierung von Streptomyceten jedoch
nur ein Faktor in einer ganzen Reihe bisher identifizierter Faktoren (Abbildung 6-5). Eine untypische
morphologische Entwicklung kann also von weit mehr Faktoren als nur einem defekten bldA-Gen
abhängen.
Abbildung 6-5: Schematische Darstellung der bld-Kaskade und nachgeschaltete Prozesse bei der morphologischen
Differenzierung in S. coelicolor. In Klammern ist die Funktion des jeweiligen bld-Genprodukts genannt, soweit bekannt
(adaptiert nach Willey et al. 1993, Kelemen und Buttner 1998, Chater 2006 und Claessen et al. 2006).
Neben den Faktoren der bld-Kaskade wirken auch externe Faktoren auf die morphologische
Entwicklung ein. Schon früh wurde beschrieben, dass je nach zur Verfügung stehender
Kohlenstoffquelle auch bei ∆bldA-Mutanten von S. coelicolor eine normale morphologische
Differenzierung stattfinden kann (Merrick 1976); dies gilt auch für andere Stämme, wie kürzlich für
107
Diskussion
S. clavuligerus gezeigt (López-García et al. 2010). Die Auswirkungen des bldA-Gens auf die
Morphologie werden vor allem über das Genprodukt von adpA bzw. bldH, welches bei der Expression
seiner TTA-Codons auf die bldA-tRNA angewiesen ist, vermittelt, wobei zwischen beiden eine positive
Rückkopplung besteht (Higo et al. 2011; Takano et al. 2003). Die Expression von AdpA wird jedoch
noch an anderen Stellen reguliert, wie beispielsweise über die RNase III (Xu et al. 2010) oder über
γ-Butyrolactone (GBL) (Ohnishi et al. 1999). Der Einfluss der GBL auf die Morphologie ist jedoch nicht
bei allen Streptomyceten-Stämmen maßgebend (Bibb 2005; Willey und Gaskell 2011).
Aus den vorliegenden Beobachtungen bezüglich der Morphologie lassen sich nur bedingt
Rückschlüsse auf das Vorhandensein eines funktionsfähigen oder -unfähigen bldA-Gens in den
untersuchten Streptomyceten-Stämmen ziehen. Im Fall von S. calvus zeigte die drastische
Veränderung der Morphologie nach Komplementierung mit einem funktionsfähigen bldA-Gen, dass
dies der limitierende Faktor der Kaskade war. Bei den hier untersuchten Stämmen ist solch ein Effekt
nicht ersichtlich, was aufgrund der vielen nachgeschalteten Prozesse und Regulatoren auch nicht zu
erwarten war. Falls tatsächlich ein funktionsunfähiges bldA-Gen bei einem der Stämme vorgelegen
haben sollte, so wäre es immer noch möglich, dass andere Prozesse eine normale morphologische
Entwicklung verhindern und somit eine konstitutive Expression des bldA-Gens keinen Effekt hätte.
Zusätzlich ist auch zu bedenken, dass die Morphologie nur auf MS-Agarplatten betrachtet wurde. Die
dabei vorhandene Kohlenstoffquelle ist Mannitol, was in früheren Untersuchungen von
∆bldA-Mutanten von S. coelicolor dazu führte, dass diese Luftmycel ausbilden konnten, was
beispielsweise bei Glucose als Kohlenstoffquelle nicht der Fall war (Merrick 1976). Es ist nicht
auszuschließen, dass die morphologische Entwicklung auf weiteren Medien andere Rückschlüsse
zulassen könnte.
Im Gegensatz zur Morphologie zeigt sich der Sekundärmetabolismus stark von der konstitutiven
Expression des bldA-Gens beeinflusst. Die Wichtigkeit der bldA-tRNA für die Expression von
Sekundärmetaboliten in Streptomyceten konnte durch mehrere Inaktivierungsversuche in
zahlreichen Stämmen gezeigt werden, da nach Inaktivierung des bldA-Gens der
Sekundärmetabolismus fast vollständig zum Erliegen kam (Chater 2006; Chater und Chandra 2008).
Eine bemerkenswerte Ausnahme bildet in diesem Zusammenhang S. clavuligerus, bei dem trotz
Inaktivierung des bldA-Gens die Sekundärstoffe Cephamycin C und Clavulansäure gebildet zu werden
scheinen (Trepanier et al. 2002). Die Wichtigkeit für den Sekundärmetabolismus lässt sich dadurch
begründen, dass Gene, die TTA Codons enthalten, nur dann effektiv exprimiert werden können wenn
eine entsprechende funktionsfähige reife tRNA vorhanden ist. Solch eine tRNA wird nur durch das
bldA-Gen codiert (Leskiw et al. 1991). TTA Codons wiederum sind äußerst selten im Genom der
Streptomyceten, aber in regulatorischen Genen für den Sekundärmetabolismus deutlich
überrepräsentiert (Chandra und Chater 2008). Die mRNA entsprechender Gene wird also nur in
Anwesenheit der reifen bldA-tRNA effektiv translatiert, eine geringe Menge wird jedoch auch bei
einer funktionsunfähigen bldA-tRNA durch Fehltranslation von UUA-Codons in der mRNA exprimiert
(Takano et al. 2003; Rebets et al. 2006; Nguyen et al. 2003). Die Menge an reifer bldA-tRNA steigt mit
Bildung des Luftmycels im Vergleich zur Menge anderer tRNAs stark an, was die Kopplung der
Produktion vieler Sekundärmetaboliten an die morphologische Differenzierung erklärt. Vor der
Bildung großer Mengen an bldA-tRNA können aus TTA-haltigen Genen nicht effektiv Faktoren
gebildet werden, die sowohl Morphologie, als auch Sekundärmetabolismus maßgeblich beeinflussen
(Pettersson und Kirsebom 2011). Für S. coelicolor ist die Abhängigkeit dreier Sekundärmetaboliten
von bldA detailliert untersucht worden. Dabei handelt es sich um die Stoffe Actinorhodin (Fernández108
Diskussion
Moreno et al. 1991; Passantino et al. 1991), Undecylprodigiosin (White und Bibb 1997; Guthrie et al.
1998) und Methylenomycin (O'Rourke et al. 2009). In allen drei Fällen ist die bldA-tRNA essentieller
Bestandteil einer positiven Rückkopplung für regulatorische Proteine. Bei diesen Proteinen handelt
es sich um sogenannte „cluster-situated regulators“ (CSR) wie actIIORF4 bei Actinorhodin. Die
Expression des bldA-Gens wiederum ist, soweit bisher bekannt, selbst durch mehrere Faktoren
reguliert. Beispiele hierfür sind die Regulation der Prozessierung durch eine antisense-RNA (Leskiw et
al. 1993), ein Rückkopplungsmechanismus mit adpA bzw. bldH (Higo et al. 2011) und eine
Regulierung durch bldD (den Hengst et al. 2010).
Die Tatsache, dass nicht bei allen der getesteten Stämme eine Beeinflussung des
Sekundärmetabolismus festzustellen war, lässt darauf schließen, dass in den unbeeinflussten
Stämmen Biosynthesewege für Sekundärmetaboliten existieren, die nicht direkt oder indirekt von
bldA abhängen. Denkbar wäre auch, dass weitere Mechanismen vorhanden sind, die eine Expression
entsprechender Biosynthesegene unter Laborbedingungen weiterhin unterdrücken oder auch nicht
die benötigten Produktionsbedingungen, wie z.B. Zusammensetzung des Produktionsmediums,
gewählt wurden. Abhängig vom Produktionsmedium zeigen sich bei einem Stamm oft deutliche
Unterschiede im Produktionsspektrum, so dass dies als eine nicht zu unterschätzende Beeinflussung
der erhaltenen Ergebnisse anzusehen ist. Dies ist zum Teil darin begründet, dass GBL nur dann
gebildet werden wenn für die Bakterienzelle entsprechende physiologische Bedingungen herrschen
und nur so eine Expression des adpA-Gens möglich ist (Willey und Gaskell 2011). Daneben wäre es
auch möglich, dass das bldA-Gentranskript nicht richtig prozessiert wird, da es aus S. coelicolor
stammt und somit aus einem fremden Stamm kommt. In Stämmen, in denen eine Beeinflussung
erkennbar war, kann davon ausgegangen werden, dass durch die konstitutive Expression, ausgehend
vom rpsL Promoter auf pTESa-bldA, die natürliche Regulation der Expression des bldA-Gens
umgangen wird. In diesem Fall muss es so sein, dass die eigentlich fremde tRNA korrekt prozessiert
wird, also nicht bzw. nur schwach von der stammeigenen antisense-RNA gehemmt, aber dennoch
von prozessierenden Enzymen als Substrat akzeptiert wird. Auf diese Weise käme es zu einem
früheren Zeitpunkt zu höheren Leveln an reifer bldA-tRNA. UUA-haltige mRNA würde somit früher
effektiv translatiert werden. Da dies vor allem regulatorische Proteine betrifft und, wie für
Actinorhodin, Undecylprodigiosin und Methylenomycin nachgewiesen, positive Rückkopplungen
angenommen werden können, sind überproportionale Effekte auf die Biosynthese betroffener
Sekundärmetabolite die Folge. Auf diese Weise ist es möglich die Stoffe überhaupt erst zu
detektieren oder eine größere Menge an produzierter Substanz zu erhalten. Eine weitere Möglichkeit
lässt sich aus der untersuchten Regulierung der Produktion von Moenomycin ableiten (Makitrynskyy
et al. 2013). In diesem Fall enthält das Biosynthesegencluster keinen CSR, sondern die Expression der
Gene wird ausschließlich durch globale Regulatoren gesteuert. In zwei der strukturellen
Biosynthesegene finden sich TTA-Codons, was die Abhängigkeit von bldA erklärt. Eine frühere
Verfügbarkeit von reifer bldA-tRNA sollte also auch die Expressionsrate der Moenomycin-Gene
erhöhen. Neben den Effekten von regulatorischen Proteinen gibt es noch zwei weitere mögliche
Gründe (Hesketh et al. 2007): Co-Transkription und -Translation von Biosynthesegenen mit anderen
TTA-haltigen Genen oder Änderungen der ppGpp Level, was zu einer veränderten Genexpression
führen kann (vgl. auch 6.1.2).
Zur Klärung der Frage, auf welche Art der Effekt der konstitutiven Expression des bldA-Gens den
Sekundärmetabolismus genau beeinflusst, wäre es hilfreich zu untersuchen, welche Proteine in ihrer
Expression betroffen sind. Besonders interessant ist in dieser Hinsicht, ob positive Regulatorproteine
109
Diskussion
stärker oder Repressorproteine geringer exprimiert werden. In den vergangenen Jahren wurden
bereits Studien durchgeführt um zu untersuchen welchen Einfluss eine Deletion des bldA-Gens auf
das Proteom von S. coelicolor hat (Kim et al. 2005a; Kim et al. 2005b; Hesketh et al. 2007). Es wäre
also möglich die Expression und Funktion betroffener Proteine in verschiedenen Stämmen zu
vergleichen und somit grundlegend gleiche Mechanismen des Sekundärstoffmetabolismus zu
identifizieren. Auch wäre interessant zu überprüfen, ob eine höhere Anzahl an Plasmidkopien einen
größeren Einfluss als das Plasmid pTESa-bldA hat, da bei letzterem Fall nur eine begrenzte Anzahl
zusätzlicher Kopien des bldA-Gens in das Genom eingebracht wurden. Möglich wäre dies durch
Einbringen des bldA-Gens über ein high-copy-Plasmid.
Die Methode der konstitutiven Expression des bldA-Gens erwies sich als erfolgreich zur Aktivierung
mehrerer unterschiedlicher, stiller Biosynthesegencluster. Zur Entdeckung neuartiger Naturstoffe aus
Streptomyceten ist dies ein klarer Vorteil gegenüber gezielter Überexpression einzelner möglicher
Regulatorproteine, die von Genomsequenzen ableitbar sind, da auf diese Weise nur einzelne
Biosynthesegene aktivierbar sind. Ist ein Naturstoff und seine zugehörigen Biosynthesegene
identifiziert, so ist es wiederum nötig, den genauen Aktivierungsmechanismus zu kennen, falls es von
Nutzen sein sollte diesen gezielt zu gewinnen. Für diesen Fall wäre ein auf dem bldA-Gen
beruhendes, induzierbares System für die heterologe Expression vorstellbar, wie es ähnlich bereits
von Chater und Chandra vorgeschlagen wurde (Chater und Chandra 2008). Zu diesem Zweck müsste
in einem Stamm das native bldA-Gen inaktiviert werden und ein oder mehrere Kopien eines
bldA-Gens unter Kontrolle eines induzierbaren Promoters eingebracht werden. Der ultimative
positive Regulator des Biosynthesegencluster, das von Interesse ist und möglichst vollständig auf
einem Cosmid liegen sollte, müsste in diesem Fall für die Expression vollständig von der Anwesenheit
der bldA-tRNA abhängen, also über möglichst viele TTA Codons auf DNA-Ebene verfügen. Auf diese
Weise ließe sich die Biosynthese eines Naturstoffes beliebig induzieren.
Die Einbeziehung einer tRNA in regulatorische Prozesse eines Bakteriums ist generell ein sehr
interessanter Vorgang. Für Clostridium acetobutylicum existiert ein ähnlicher Mechanismus wie für
das bldA-Gen in Streptomyceten (Sauer und Dürre 1992). Auch in anderen Bakterienspezies ändert
sich der tRNA-Pool in Anpassung an die Umweltbedingungen und spielt somit eine wichtige Rolle in
der Regulation der Proteinexpression auf dem Level der Translation (Taylor et al. 2013). Es ist somit
anzunehmen, dass dieses Phänomen nicht nur auf Streptomyceten beschränkt ist und die
Identifizierung ähnlicher Mechanismen in anderen wichtigen naturstoffproduzierenden
Bakterienordnungen, wie beispielsweise den Myxobakterien, erstrebenswert wäre. Auf diese Weise
könnten auch in anderen Bakterien-Ordnungen bisher unbekannte Naturstoffe identifiziert werden.
Daneben wäre es möglich, dass neben der bldA-tRNA noch weitere tRNAs existieren, die für die
Regulation der Produktion von Sekundärstoffen wichtig sind. Die Identifizierung der bldA-tRNA als
wichtiger Faktor in diesem Zusammenhang wurde durch die Tatsache vereinfacht, dass neben der
Sekundärstoffproduktion auch die Morphologie stark betroffen ist. Für andere tRNAs muss dies nicht
der Fall sein. Zur Identifizierung anderer potentieller tRNAs mit regulatorischer Funktion wäre es
möglich, die Häufigkeit ihrer Expression zu untersuchen (vgl. Pettersson und Kirsebom 2011) und mit
dem Auftreten erkannter Codons in regulatorischen Proteinen abzugleichen.
110
Diskussion
6.3.2 AUSWIRKUNGEN AUF DEN SEKUNDÄRMETABOLISMUS VON S. ALBOVINACEUS
Der Sekundärmetabolismus von S. albovinaceus wurde durch die konstitutive Expression des
bldA-Gens unter den getesteten Bedingungen stark beeinflusst. Sowohl in HA- als auch in
SG+-Produktionskulturen konnten in den Chromatogrammen der Extrakte dieser Kulturen neue
Signale beobachtet werden. Mögliche Gründe für diese Beeinflussung wurden in 6.3.1 diskutiert. Die
Struktur einer Substanz, die in SG+-Medium neu produziert wurde, konnte bestimmt werden und es
stellte sich heraus, dass es sich dabei um das bereits bekannte Streptophenazin A handelt (Yang et al.
2012; Mitova et al. 2008). Neben Streptophenazin A wurde auch von weiteren StreptophenazinVarianten berichtet, die sich vor allem in der Substitution der Alkylkette unterscheiden. Dies ist auch
im Fall von S. albovinaceus pTESa-bldA möglich. Neben dem identifizierten Streptophenazin A tritt
eine ganze Gruppe von Signalen auf, welche ein identisches UV-Absorptionsspektrum zu
Streptophenazin A haben, jedoch einen leichten Unterschied in der Retentionszeit besitzen. Diese
Eigenschaften wären für die beschriebenen Streptophenazin-Varianten zu erwarten.
Abbildung 6-6: Darstellung der möglichen Biosynthese des Phenazin-Grundgerüsts zur weiterführenden Biosynthese von
Streptophenazin A; die Benennung der beteiligten Enzyme erfolgt in Anlehnung an bekannte Enzyme aus
Pseudomonas-Arten (adaptiert nach Ahuja et al. 2008).
Die Biosynthese von Phenazinen ist besonders gut für Pseudomonas-Arten untersucht. Für
Streptomyceten gibt es detaillierte Untersuchungen zur Biosynthese von Endophenazin in
S. cinnamonensis (Haagen et al. 2006; Seeger et al. 2011) und S. anulatus (Saleh et al. 2009). In allen
Fällen zeigt sich, dass zur Biosynthese des Phenazin Grundgerüsts ein Set von fünf Enzymen nötig ist
(Mavrodi et al. 2010; Ahuja et al. 2008). Der Ablauf der möglichen Biosynthese des Grundgerüsts von
Streptophenzain A ist grafisch in Abbildung 6-6 dargestellt. Das erste Enzym PhzE katalysiert
demnach die Umwandlung von Chorismat (1) zu 2-Amino-4-desoxyisochorismat (2) welches durch
PhzD zu trans-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilat (3) umgewandelt wird. Im nächsten Schritt wird
durch PhzF 6-amino-5-oxocyclohex-2-en-1-carboxylat (4) erzeugt. Zwei Moleküle von 4 kondensieren
anschließend zu den trizyklischen Phenazin Vorläufern 5, 5a und 5b. In vitro lässt sich diese Reaktion
111
Diskussion
spontan beobachten, in vivo ist die Reaktion jedoch durch das heterodimere Enzym PhzA/B
katalysiert. Die Oxidation zu 6 erfolgt spontan in Anwesenheit von Sauerstoff, wobei jedoch nicht
geklärt ist auf welche Weise das Sauerstoffmolekül hierfür aktiviert wird. Der letzte Oxidationsschritt
zu Phenazin-1-carboxylat (7) wird durch PhzG katalysiert. Die weiteren Schritte bis zu
Streptophenazin A sind unklar, es wäre jedoch wahrscheinlich, dass die Carboxylgruppe von 7
methyliert wird und an Position 6 des Rings eine Polyketidkette angehängt wird. Variationen in der
Alkylkette könnten durch Verwendung verschiedener Startereinheiten durch eine PKS I oder durch
verschiedene Methylierungen erfolgen.
Phenazine zeichnen sich durch eine ganze Reihe von Eigenschaften aus (Mavrodi et al. 2006). In der
Rhizosphäre vieler Pflanzen finden sich oft Bakterien, die Phenazine produzieren und auf diese Weise
die Pflanzen vor einer Pilzinfektion schützen können. Entsprechende Bioaktivität ist für
Streptophenazin nicht bekannt und in den durchgeführten Untersuchungen zur Bioaktivität zeigten
sich nur schwache Wirkungen gegen einige Actinobacteria (s. 5.4.4). Über mögliche physiologische
Funktionen der Phenazine für Bakterien ist wenig bekannt, jedoch ergibt sich aus der Inaktivierung
entsprechender Biosynthesegene ein selektiver Nachteil für die Mutanten. Bei fakultativen
Pathogenen wie Pseudomonas aeruginosa wirken Phenazine aufgrund ihrer ausgeprägten
RedOx-Eigenschaften als Virulenzfaktoren. Für synthetische Phenazine werden aktuell Anwendungen
als DNA-Interkalatoren diskutiert. In diesem Zusammenhang könnten Enzyme aus der Biosynthese
von Streptophenazin A interessant werden, da offensichtlich verschiedene Varianten existieren. Dies
weist darauf hin, dass die entsprechenden Enzyme für den Einsatz in der kombinatorischen
Biosynthese geeignet sein könnten. Um die entsprechenden Biosynthesegene zu identifizieren, wäre
eine Suche nach den beschriebenen Enzymen zur Biosynthese des Grundgerüsts erfolgversprechend.
Diese sind in allen bisher untersuchten Biosynthesen von Phenazinen beteiligt, so dass davon
auszugehen ist, dass dies auch bei S. albovinaceus der Fall sein sollte.
112
Diskussion
6.3.3 AUSWIRKUNGEN AUF DEN SEKUNDÄRMETABOLISMUS VON S. GLOMEROAURANTIACUS
S. glomeroaurantiacus pTESa-bldA produzierte in HA-Medium zwei neue detektierbare Substanzen,
von denen eine, als Glomeromycin bezeichnet, aufgereinigt wurde. Über NMR-Experimente war es
möglich einen Strukturvorschlag für diese Substanz zu machen, wobei es sich eigentlich um zwei
Substanzen handelte, die sich jedoch nur in der Kettenlänge der Fettsäure unterscheiden (s. 5.5.3).
Basierend auf diesem Strukturvorschlag ist es naheliegend anzunehmen, dass Glomeromycin aus drei
Bausteinen besteht (Abbildung 6-7 A). Die Fettsäure besteht demnach entweder aus Stearin- oder
Palmitinsäure, die mit einem Glycerol an einer der endständigen Hydroxylgruppen verestert ist. An
die mittlere Hydroxylgruppe von Glycerol ist ein 3,6-Dimethylsalicylsäurerest über eine Etherbindung
angeknüpft.
3,6-Dimethylsalicylsäure ist ein bekanntes Strukturelement bei vielen Naturstoffen. Ein Beispiel eines
Naturstoffes aus einem Streptomyceten wäre Polyketomycin (Daum et al. 2009). Der Aufbau erfolgt
aus vier Acetat-Einheiten, die zur 6-Methylsalicylsäure zusammengefügt werden, anschließend
erfolgt eine Methylierung an der Position 3 (Paululat et al. 1999). Im Falle von Polyketomycin
übernimmt die iterative PKS I pokM1 die Biosynthese der 6-Methylsalicylsäure und die
Methyltransferase pokMT1 die Methylierung an Position 3 (Daum et al. 2009). Iterative PKS I sind vor
allem aus Pilzen bekannt, jedoch gibt es auch Beispiele für derartige Enzyme bei Bakterien (Ding et al.
2010). Zur Identifizierung des zu Glomeromycin zugehörigen Biosynthesegenclusters könnte eine
Suche auf der Ebene der Genomsequenz nach diesem charakteristischen Enzym schnell zu einem
Erfolg führen.
Abbildung 6-7: (A) Darstellung der möglichen Bausteine von Glomeromycin. (B) Alternativer Vorschlag zur Ausbildung der
Phenyletherbindung in Glomeromycin.
Aus chemischer Sicht ist eine Außergewöhnlichkeit an Glomeromycin das Vorhandensein einer
Phenyletherbindung. Diese Art der Bindung wurde bei Naturstoffen bisher äußerst selten
113
Diskussion
identifiziert. Zu finden ist sie beispielsweise in Lignin, ein Biopolymer, das von Pflanzen in die
Zellwand eingebaut wird und zu deren Verholzung führt. Bei Naturstoffen aus Bakterien treten oft
nichtaromatische Polyetherverbindungen auf, wie sie in Monensin (Agtarap et al. 1967),
Tetronomycin (Dutton et al. 1995) oder Lasalocid (Minami et al. 2013) zu finden sind. Von
Phenyletherverbindungen bakteriellen Ursprungs wurde in der Literatur bisher noch nicht berichtet.
Für die Biosynthese ist es denkbar, dass die Bausteine 3,6-Dimethylsalicylsäure und Glycerol direkt
enzymatisch verknüpft werden. Ein alternativer Weg wäre eine Bildung der Etherbindung ähnlich
zum Mechanismus wie er für Lasalocid ausführlich untersucht wurde (Minami et al. 2013). Dabei wird
eine Doppelbindung durch eine Flavin-Monooxygenase zunächst zum Epoxid oxidiert. Anschließend
katalysiert eine Epoxid-Hydrolase die Ausbildung der Etherbindung. In Abbildung 6-7 B ist die
Übertragung dieses Mechanismuses auf Glomeromycin grafisch dargestellt. Ohne weitere
Informationen über im Biosynthesegencluster codierte Enzyme ist ein fundierter Vorschlag für die
Ausbildung dieser neuartigen Biosynthese jedoch nur schwer möglich.
114
Diskussion
6.4 SCHLUSSFOLGERUNG
Das Augenmerk der Untersuchungen für diese Arbeit lag auf Zusammenhängen zwischen dem
bldA-Gen und dem Sekundärmetabolismus von Streptomyceten. Bei S. calvus führte eine Korrektur
eines Defekts des bldA-Gens zur Aktivierung der Biosynthese von Annimycin. Die zugehörigen
Biosynthesegene sind in ihrer Funktionalität von der Anwesenheit einer korrekt arbeitenden
bldA-tRNA abhängig. Nach gelungener Identifizierung des Biosynthesegenclusters ließ sich jedoch in
keinem der Gene ein TTA-Codon finden, welches diese Abhängigkeit erklären könnte. Es muss
demnach eine indirekte Abhängigkeit bestehen, wie es über das globale Regulatorprotein AdpA
möglich wäre. Eine weitere Erkenntnis aus der Identifizierung des Clusters ist, dass keines der Gene
für ein Protein codiert, welches das gleichzeitige Auftreten der Doppelbindungsisomere von
Annimycin erklären könnte. Das Entstehen des dynamischen Verhältnisses der Isomere zueinander
muss einen noch nicht identifizierten Grund haben. Neben Annimycin hatte die Komplementierung
Auswirkungen auf die Biosyntheserate eines weiteren Sekundärmetaboliten. Dieser konnte als das
nicht-ribosomal gebildete Peptid WS9326A bestimmt werden. Aufgrund der chemischen Struktur
und Sequenzdaten des Genoms von S. calvus war es möglich, ein vermeintlich zugehöriges
Biosynthesegencluster in silico zu bestimmen. Die im Cluster vorhandene NRPS zeigt einen
ungewöhnlichen Aufbau im Vergleich zu bereits charakterisierten NRPS. Eine experimentelle
Bestätigung der Hypothese, dass dieses Cluster tatsächlich für die Biosynthese von WS9326A
verantwortlich ist, wäre äußerst lohnenswert.
Die Beeinflussung des Sekundärmetabolismus von 13 verschiedenen Streptomyceten-Stämmen
durch eine konstitutive Expression des bldA-Gens war bei mehr als der Hälfte der Stämme erheblich.
Es kam zum Teil zu einer vermehrten Biosynthese einiger Stoffe, zum überwiegenden Teil war es
allerdings möglich neu gebildete Stoffe zu detektieren. Dies zeigte, dass die Aktivierung stiller
Biosynthesegene mit dieser Herangehensweise möglich ist. Bei der Isolierung neu gebildeter Stoffe
zeigte sich, dass S. albovinaceus pTESa-bldA die Fähigkeit besitzt das bereits aus einem anderen
Streptomyceten-Stamm
bekannte
Streptophenazin A
zu
biosynthetisieren.
Aus
S. glomeroaurantiacus pTESa-bldA gelang die Isolierung einer Substanz mit einer für Naturstoffe aus
Streptomyceten neuartigen chemischen Struktur, dem Phenylether Glomeromycin. Die
Strukturaufklärung einer dritten Substanz aus S. curacoi pTESa-bldA war aufgrund von Problemen mit
der Löslichkeit der Substanz nicht gelungen.
Die gewonnenen Erkenntnisse der Untersuchungen dieser Arbeit unterstreichen die eminente
Wichtigkeit des bldA-Gens für den Sekundärmetabolismus von Streptomyceten. Eine konstitutive
Expression dieses Gens aktiviert die Biosynthese eines breiten Spektrums an Stoffen auch in
Unkenntnis von genomischen Sequenzdaten des betroffenen Stammes, aufgrund des Charakters der
bldA-tRNA als globales Regulatorelement. Dies ist ein klarer Vorteil gegenüber einigen bekannten
Vorgehensweisen
zur
Aktivierung
stiller
Biosynthesegene
von
Streptomyceten.
115
Literaturverzeichnis
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125
Anhang
8 ANHANG
8.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Tabelle 8-1: Allgemeine Abkürzungen und Abkürzungen physikalischer Größen und Einheiten.
Abkürzung
°C
A (im Zusammenhang mit NRPS)
A (im Zusammenhang mit RNA oder DNA)
aac(3)IV
aadA
ACP
AS
Asn
AT
ATP
AU
b(p)
B.
B/W
bla
BSA
c (als Zusatz für Einheiten, z.B. cm)
C (im Zusammenhang mit NRPS)
C (im Zusammenhang mit RNA oder DNA)
C5N
CMT
COSY
CSR
Cy
d (als Zeiteinheit)
d (im Zusammenhang mit 13C-NMR)
d (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
Da
DAD
DC
dd (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
ddd (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
δ
∆
DH
Erklärung
Grad Celsius
Adenylierungsdomäne
Adenin
3‘-N-Acetyltransferasegen
Adenylyltransferasegen
Acyl-Carrier Protein
Aminosäure
Asparagin
Acyltransferase
Adenosintriphosphat
Absorptionseinheiten
Basen(paare)
Bacillus
Blau-Weiß
β-Lactamresistenzgen
Bovines Serumalbumin
Centi
Kondensationsdomäne
Cytosin
Aminohydroxycyclopentenon-Ring
Kohlenstoff-Methyltransferase
Homonukleare Korrelationsspektroskopie (correlation
spectroscopy)
Regulator in einem Biosynthesegencluster (Clustersituated)
Zyklisierungsdomäne
Tag
Dimeres C-Atom
Dublett
Dalton
Dioden-Array Detektor
Dünnschichtchromatographie
Dublett vom Dublett
Dublett vom Dublett vom Dublett
Chemische Verschiebung in der NMR-Spektroskopie
in einer Mutante inaktiviertes Gen
Dehydrogenase
126
Anhang
Fortsetzung von Tabelle 8-1: Allgemeine Abkürzungen und Abkürzungen physikalischer Größen und Einheiten.
Abkürzung
DMSO
DNA
dNTP
DSMZ
E (im Zusammenhang mit NRPS)
E. coli
EDTA
ER
ermE-Promotor
ESI
F (im Zusammenhang mit NRPS)
g
G (im Zusammenhang mit RNA oder DNA)
GBL
h
H2O
HCl
HMBC
HPLC
HR-MS
HSQC
Hz
ID
IPTG
J
k (als Zusatz für Einheiten, z.B. kbp)
KOAc
KR
KS
l
λ
Leu
m (als Längenmaß)
m (als Zusatz für Einheiten, z.B. mmol)
m (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
m/z
MeOH
MHz
MIC
Erklärung
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxynuklesoid-5‘-triphosphat
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen
Epimerisierungsdomäne
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
Enoylreduktase
Promotor des ermE-Gens
Elektrospray-Ionisation
Formylierungsdomäne
Gramm
Guanosin
γ-Butyrolacton
Stunde
Wasser
Salzsäure
Heteronukleare Korrelationsspektroskopie über
mehrere Bindungen (heteronuclear multiple-bond
correlation)
Hochdruckflüssigchromatographie (high-performance
liquid chromatography)
Hochauflösende (high-resolution)
Massenspektrometrie
Heteronukleare Korrelationsspektroskopie über eine
Bindung (heteronuclear single-quantum coherence)
Hertz
Innendurchmesser
Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid
Kopplungskonstante
Kilo
Kaliumacetat
Ketoreduktase
Ketosynthase
Liter
Wellenlänge
Leucin
Meter
Milli
Multiplett
Masse-Ladungs-Verhältnis
Methanol
Megahertz
Minimale Inhibitions Konzentration
127
Anhang
Abkürzung
µ (als Zusatz für Einheiten, z.B. µl)
min
mol
mRNA
MS
MSD
MT
n (als Zusatz für Einheiten, z.B. nm)
nt
NaOH
NMR
NMT
NRP
NRPS
OD
ORF
ori
oriT
Ox (im Zusammenhang mit NRPS)
PCP
PCR
Phe
PKS
PKS I
PKS II
PLP
ppGpp
q (im Zusammenhang mit 13C-NMR)
q (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
R
Rf
RNA
ROESY
RP
rpm
rpsL-Promotor
Rs
RT
s
s (im Zusammenhang mit 13C-NMR)
s (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
S.
Erklärung
Mikro
Minute(n)
Einheit der Stoffmenge
Boten-(messenger)-Ribonukleinsäure
Massenspektrometrie
Massenselektiver Detektor
Methyltransferase
Nano
Nucleotide
Natronlauge
Kernspinresonanz (nuclear magnetic resonance)
Stickstoff-Methyltransferase
Nicht-ribosomal gebildetes Peptid
Nicht-ribosomale Peptidsynthase
Optische Dichte
Offener Leserahmen (open-reading frame)
Replikationsursprung
Transferursprung
Oxidationsdomäne
Peptidyl-Carrier Protein
Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction)
Phenylalanin
Polyketidsynthase
Polyketidsynthase vom Typ I
Polyketidsynthase vom Typ II
Pyridoxylphosphat
Guanosintetraphosphat
Quarternäres C-Atom
Quartett
Reduktionsdomäne
Retentionsfaktor in der DC
Ribonukleinsäure
Homonukleare Korrelationsspektroskopie über
Kreuzrelaxation nuklearer Spins (rotating frame
nuclear Overhauser effect spectroscopy)
Umkehrphase (reversed phase)
Umdrehungen (rotations) pro Minute
Promotor des rpsL-Gens
Auflösungsfaktor in der HPLC
Raumtemperatur
Sekunde(n)
Singuläres C-Atom
Singulett
Streptomyces
128
Anhang
Abkürzung
SARP
SDS
Ser
sp(p).
t (im Zusammenhang mit 13C-NMR)
t (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
T (im Zusammenhang mit DNA)
TAE
TE
THF
Thr
TOCSY
tRNA
tt (im Zusammenhang mit 1H-NMR)
Tyr
U (im Zusammenhang mit RNA)
UV
V
V (Im Zusammenhang mit Spannung)
Vis
WT
X-Gal
Erklärung
„Streptomyces antibiotic“ Regulatorprotein
Natrium-(Sodium)-Dodecylsulfat
Serin
Spezies
Tertiäres C-Atom
Triplett
Thymin
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
Thioesterase
Tetrahydrofuran
Threonin
Homonukleare Korrelationsspektroskopie über skalare
Kopplungen (total correlated spectroscopy)
Transfer-Ribonukleinsäure
Triplett vom Triplett
Tyrosin
Uracil
Ultraviolettes Licht
Volumen
Volt
Sichtbares (visible) Licht
Wildtyp
5-Brom-4-Chlor-3-inoyl-β-D-galaktopyranosid
129
Anhang
8.2 PLASMIDKARTEN
8.2.1 PUC19-DEL1697
8.2.2 PUC19-DEL3100
130
Anhang
8.2.3 PTESA
8.2.4 PTESA-BLDA
131
Anhang
8.3 NMR-SPEKTREN
8.3.1 1D-NMR SPEKTREN VON WS9326A
8.3.1.1
1
H-NMR Spektrum von WS9326A
132
Anhang
8.3.1.2
13
C-NMR Spektrum von WS9326A
133
Anhang
8.3.2 1D- UND 2D-NMR SPEKTREN VON STREPTOPHENAZIN A (B4)
8.3.2.1
1
H-NMR Spektrum von Streptophenazin A (B4)
134
Anhang
8.3.2.2
13
C-NMR-Spektrum von Streptophenazin A (B4)
135
Anhang
8.3.2.3
1
H-1H-COSY-NMR Spektrum von Streptophenazin A (B4)
136
Anhang
8.3.2.4
1
H-13C-HSQC-NMR Spektrum von Streptophenazin A (B4)
137
Anhang
8.3.2.5
1
H-13C-HMBC-NMR Spektrum von Streptophenazin A (B4)
138
Anhang
8.3.3 1D- UND 2D-NMR SPEKTREN VON GLOMEROMYCIN (M2)
8.3.3.1
1
H-NMR Spektrum von Glomeromycin (M2) in Methanol-d4
139
Anhang
8.3.3.2 Ausschnitt aus 1H-NMR Spektrum von Glomeromycin (M2) in DMSO-d6
140
Anhang
8.3.3.3
13
C-NMR Spektrum von Glomeromycin
141
Anhang
8.3.3.4
1
H-1H-COSY-NMR Spektrum von Glomeromycin
142
Anhang
8.3.3.5 Ausschnitt aus 1H-1H-ROESY-NMR Spektrum von Glomeromycin
143
Anhang
8.3.3.6
1
H-13C-HSQC-NMR Spektrum von Glomeromycin
144
Anhang
8.3.3.7
1
H-13C-HMBC-NMR Spektrum von Glomeromycin
145
Anhang
9 DANKSAGUNGEN
Eine Doktorarbeit wird von einer Person geschrieben, aber ohne die Mithilfe vieler Menschen kann
sie niemals entstehen. Hiermit möchte ich Allen Dank sagen, die durch ihre Mitarbeit und Hilfe zum
Gelingen beigetragen haben und den einen oder die andere besonders erwähnen.
Prof. Andreas Bechthold, dafür, dass er mir die Möglichkeit gab diese Arbeit anzufertigen, für die
vielfältigen Freiheiten, die mir im Laufe der Zeit eingeräumt worden waren und die immer offene Tür
bei jeglichen Problemen, Fragen oder was auch sonst immer anfiel.
Prof. Thorsten Friedrich für die Bereitschaft, die Zweitbetreuung meiner Arbeit zu übernehmen, aber
auch für die Aufnahme in das von der DFG finanzierte GRK 1478, das mir über lange Zeit finanzielle
Unterstützung gewährte, und auch die Möglichkeit gab, im Rahmen der Promotion nach Kanada zu
gehen.
Jun.-Prof. Stefan Günther für die Übernahme der Rolle des Drittprüfers.
David Zechel, who started a sabbatical year in the Bechthold group almost in parallel with my start of
my PhD work. Throughout the whole time we had a fantastic cooperation, uncountable illuminating
discussions and some very fruitful projects. I enjoyed working with you very much and still think back
to my wonderful time in your lab! Some special thanks also go to Fern McSorley and Stephanie
Vanner.
Alle ehemaligen und aktuellen Doktoranden am Institut für pharmazeutische Biologie. Ganz
besonders werde ich eure neidischen Blicke beim Mittagessen vermissen. Ich werde immer dran
denken, wenn ich mir einen Trog voll Nudeln mit Sahnesoße aufwärme…
Christine Klaus, meine Diplomandin, die einen Teil der Zeit in Kanada mit mir verbracht hat und durch
ihre Experimente wichtige Grundlagen für die Inhalte dieser Arbeit gelegt hat.
Meine Korrekturleserinnen Tanja Heitzler, Sarah Maier und meine Schwester Sabine, die sich als
Historikerin nicht hat abschrecken lassen ein naturwissenschaftliches Machwerk zu lesen.
Alle sonstigen Angestellte am Institut für pharmazeutischen Biologie, ganz besonders aber Marcus
Essing und Elisabeth Welle, die (nicht nur, aber ganz besonders) bei sämtlichen technischen
Problemen und Bestellungen gezeigt haben, wie wichtig sie sind, was man vor allem dann gemerkt
hat, wenn sie abwesend waren.
Bei den zahlreichen NMR-Experimenten gilt mein Dank all jenen, die für mich die Spektren
aufgenommen haben und unschätzbare Dienste bei der Interpretation geleistet haben: Sascha
Ferlaino, Renato Murillo, Detlef Bentrop, Francoise Sauriol und Thomas Paululat.
Die Handballer vom ESV Freiburg, für das Ausschwitzen der im Labor eingeatmeten
Lösungsmitteldämpfe, den Abbau der unvermeidbaren Frustration nach misslungenen Experimenten,
die Erörterung zahlreicher hochphilosophischer Fragestellungen und dass ich ab und zu auch mal mit
einem blauen Auge davon gekommen bin.
146
Anhang
Meine gesamte Familie, alle auf zwei Beinen und vier Pfoten, alle die von Anfang an dabei waren, alle
die erst im Laufe der Zeit dazu kamen und alle die leider nicht mehr hier sind. Ohne Euch wäre ich gar
nicht soweit gekommen wie ich es jetzt bin.
Der allergrößte Dank geht aber an meine „Mitbewohnerin“ Andrea. Egal wann, wo und wie warst
und bist Du immer für mich da!
147
Anhang
10 BILDUNGSGANG
Name:
Arne Gessner
Geburtstag:
08.11.1982
Geburtsort:
Karlsruhe
08/2010 – 02/2014
Anfertigung der vorliegenden Dissertation im Arbeitskreis von Prof. Andreas
Bechthold am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie des
Instituts für Pharmazeutische Wissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
06/2012 – 07/2012
Zweimonatiger Forschungsaufenthalt im Arbeitskreis von Prof. David Zechel
am Department of Chemistry der Queen’s University, Kingston, ON, Kanada
07/2010
3. Staatsexamen und Approbation als Apotheker
11/2009 – 05/2010
Pharmaziepraktikum in der Hof-Apotheke, Heidelberg
05/2009 – 11/2009
Pharmaziepraktikum an der School of Pharmacy der Faculty of Medical and
Health Sciences der University of Auckland, Neuseeland unter der Betreuung
von Dr. Ilva Rupenthal; Anfertigung einer Arbeit zur Erlangung eines
Postgraduate Certificate in Health Sciences, Thema: „In vitro penetration of
antisense oligonucleotides across bovine cornea”.
04/2005 – 04/2009
Studium der Pharmazie an der Philipps-Universität Marburg; Abschluss:
2. Staatsexamen, Note: 1,2
06/2002
Abitur am Gymnasium Karlsbad
148

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