DNA-freie Reagenzien und Mastermixe für die PCR

AppliCations
Nr.3
DNA-freie Reagenzien
und Mastermixe für die PCR
Der Anteil von molekularbiologischen Nachweismethoden ist in den letzten Jahren
erheblich gestiegen, besonders in den Bereichen Qualitätskontrolle, Forensik,
klinischer Forschung und Diagnostik – insbesondere der Infektionsdiagnostik.
Gerade für diese Applikationen werden hochsensitive und gleichzeitig zuverlässige
PCR-Tests benötigt. Dafür bietet AppliChem nun optimierte PCR-Kits an und widmet
sich explizit der Hintergrundproblematik, die durch DNA belastete Reagenzien und
Arbeitsplätze entstehen kann.
Keywords
Kontamination
DNA-freie Reagenzien
16S rDNA Nachweis
SYBR® Green/qPCR
Problemstellung DNA Kontamination
Nukleinsäuren sind überall in der Umwelt zu finden. Daher können Sie in jedem Produktions- und Arbeitsschritt in Produkte
für die PCR und in PCR-Reaktionen eingetragen werden. Es ist vielfach beschrieben worden, wie massiv PCR-Assays durch
DNA-Kontaminationen gestört werden, was gerade in der klinischen Diagnostik ein schwerwiegendes Problem darstellt.
Kontaminationen können also verschiedene Ursachen haben: Der Arbeitsplatz und die Gerätschaften sind mit Nukleinsäuren
oder Bakterien/Viren verunreinigt (deren Nukleinsäuren in Lyseschritten freigesetzt werden können), die durch unzureichende oder trotz Reinigung der Oberflächen präsent sind. Nukleinsäurehaltige Aerosole, die beim Pipettieren, Zentrifugieren
und vor allem beim Autoklavieren entstehen, schlagen sich nieder. Auch verkeimte Lüftungsanlagen leisten ihren unrühmlichen Beitrag. Zuguterletzt müssen die Assay-Reagenzien genannt werden, um die es hier hauptsächlich gehen soll.
Es wird geschätzt, dass sich 2 % der Publikationen mit PCR-Anwendungen mit Kontaminationen oder falsch-positiven
­Ergebnissen befassen. Ein Prozentsatz, der sich über die Jahre nicht verändert haben soll. Das mag daran liegen, dass sich
die Zahl der Anwender erhöht hat und die Technik immer empfindlicher wird (qPCR, RT-PCR!). Wenn man „nur“ 30 PCRZyklen fährt, ist die Wahrscheinlichkeit eine Kontamination nachzuweisen, natürlich deutlich geringer als bei 40 oder sogar
50 Zyklen. Alle Versuche, Oberflächen und Reagenzien zu 100 % DNA-frei zu machen, sind bisher gescheitert. Es gelingt nur
die Kontaminationsrate zu reduzieren (Abreicherung)!
In der Literatur findet man je nach Autor die unterschiedlichsten Kontaminationen in PCR-Reagenzien: Phagen-ähnliche
DNA (Newsome et al. 2004), das β-Lactamase Gen (Chiang et al. 2005), Legionellen-DNA (Evans et al. 2003), nifH und
nifH-ähnliche DNA (Goto et al. 2005) und generell bakterielle DNA, wenn universelle, bakterielle 16S rDNA-Primer eingesetzt werden (Mühl et al. 2008) usw. Zum Teil wurde akribisch versucht die Kontaminationsquelle zu identifizieren, mit dem
Ergebnis, dass im Prinzip alle eingesetzten Reagenzien betroffen sein können: Nukleinsäure-Isolierungsmatrizes, Taq
­Polymerase, Primer, Puffer, dNTPs, Wasser. Bei der Taq Polymerase erscheint das gar nicht mal so verwunderlich, denn
­rekombinantes und natives Enzym wird ja in Bakterien exprimiert.
Eine Abreicherung der DNA-Kontamination in diesen Reagenzien erweist sich besonders bei der Taq Polymerase als
­problematisch. Viele Behandlungsmethoden führen zu einem Verlust der Aktivität des Enzyms (Mühl et al., 2008).
Dekontaminationsversuche
Es sind verschiedene Methoden zur Beseitigung von DNA-Kontaminationen beschrieben worden. Man kann diese in die Kategorien physikalisch, biologisch und
chemisch einteilen. Kombinationen davon kommen ebenfalls zum Einsatz. An
dieser Stelle sei nochmals betont, dass eine 100%ige Beseitigung als quasi unmöglich gilt und praktisch in allen Fällen die Sensitivität leidet. Ausserdem wird berichtet, dass eine Methode, die in einem Labor funktioniert hat, nicht unbedingt
durch (alle) anderen Labore reproduziert werden konnte – für die Wissenschaft
nicht weiter ungewöhnlich. Die Artikel von Klaschik et al. (2002) und Corless
et al. (2000) seien an dieser Stelle besonders empfohlen, denn hier werden verschiedene Dekontaminationsmethoden vergleichend getestet.
Physikalisch: Hier kommt die γ- und UV-Bestrahlung zum Einsatz. Beide Behandlungen führen je nach Intensität und Dauer durchaus zu Schädigungen des
Enzyms Taq DNA-Polymerase und der Oligonukleotide (Deragon et al. 1990;
­Klaschik et al. 2002) mit dem Ergebnis einer reduzierten PCR-Sensitivität. Alternativ wurde auch eine Filtration der PCR-Reagenzien mit GenElute beschrieben,
einer Silika-basierten DNA-bindenden Matrix (Mohammadi et al. 2005).
Biologisch: Die vielleicht besten Ergebnisse erzielt man mit DNase I-Behandlung (Heininger et al. 2003; Klaschik et al. 2002; Corless et al. 2000). Es gibt sehr
unterschiedliche DNasen, die sich auch darin unterscheiden, ob sie doppelsträngige, einzelsträngige DNA oder beide Formen verdauen. Entscheidend ist am Ende
der Behandlung die Inaktivierung der DNase. Da die Hitzebehandlung relativ
­lange durchzuführen ist (>40 Min. bei 95°C), leiden darunter die meisten Taq
DNA-Polymerasen (Klaschik et al. 2002). Alternativ werden mit wechselndem
Erfolg auch Restriktionsendonukleasen eingesetzt, wie Sau3AI. Dieses Enzym
ist im Gegensatz zu DNase sehr viel einfacher durch kurze Hitzebehandlung
(2–3 Min.) zu inaktivieren (Carroll et al. 1999).
Chemisch: 8-Methoxypsoralen (8-MOP) ist ein DNA-Interkalator. Nach Photoaktivierung mit UV-Licht (320 – 400 nm) werden die Stränge der doppelsträngigen DNA kovalent verlinkt (Meier et al. 1993). Die üblichen Konzentrationen
liegen bei 25–50 µg/ml und einer 3 –5 Minuten-Bestrahlung mit UV-Licht der
Wellenlänge 366 nm, wobei der Erfolg der Behandlung teilweise von der Quelle
der PCR-Tubes abhing (Meier et al. 1993; Hughes et al. 1994; Corless et al.2000;
Klaschik et al. 2002, Nocker & Camper 2006).
Ethidiummonoazid (EAM) und Propidiummonoazid (PMA) sind wie 8-MOP
DNA-Interkalatoren, die ebenfalls nach Photoaktivierung kovalent mit der DNA
reagieren und durch „cross-linking“ eine Vermehrung in der PCR verhindern
(z.B. 14,3 µM EMA für 5 Min. Bestrahlung auf Eis). Der Vorteil dieser Chemikalien
liegt darin, dass mit höherwelligem, sichtbarem Licht (>400 nm; 500 W Halogenlampe) als bei 8-MOP (<400 nm; UV-Licht) bestrahlt werden kann (Rueckert &
Morgan 2007; Hein et al. 2007).
Hier sind nicht Ansätze zur Verhinderung der Übertragung von Kontaminationen
durch im Labor erzeugte PCR-Produkte („carry-over“) berücksichtigt. Dafür wird
zum Beispiel das Enzym Uracil-DNA-Glycosylase eingesetzt, basierend auf dem
Einsatz von dUTP statt dTTP in allen PCR-Reaktionen.
DNA-Kontamination verhindern
Kontaminationsquellen sind wie beschrieben die eingesetzten Reagenzien.
Daneben sind potentielle DNA-Kontaminationsquellen fast überall im Labor. Luftkeime, Haut- und Oberflächenkeime, sowie DNA-Aerosole können in den PCRAnsatz gelangen. Aus diesem Grund bedarf es zweier Strategien zur Vermeidung
von DNA-Kontaminationen. Erstens das saubere Arbeiten beim Ansetzen
der PCR und zweitens die Verwendung reiner PCR-Reagenzien.
Zur Minimierung von DNA-Kontaminationen sollte der Ort an der der PCR-Ansatz
pipettiert wird und der Ort, an dem die PCR stattfindet möglichst räumlich getrennt sein. Die Verwendung separater Pipetten, Filter-Pipettenspitzen und eine
UV-Werkbank, sowie das Tragen von Handschuhen und Schutzkleidung sind
­heute eine Selbstverständlichkeit. Des Weiteren sollte die Oberfläche vor und nach
jedem PCR-Ansatz sorgfältig dekontaminiert werden. Bei der Oberflächendekontamination ist darauf zu achten, dass die DNA zerstört und nicht nur lediglich
inaktiviert wird.
AppliChem bietet sowohl für die Oberflächendekontamination als auch für die Verwendung
hochreiner PCR-Reagenzien Lösungen an.
Nukleinsäureabbau auf Laboroberflächen
DNA-ExitusPlus™
(Bestell-Nr. A7089 DNA-ExitusPlus™)
(Bestell-Nr. A7409 DNA-ExitusPlus™ IF Indikator-frei)
DNA-ExitusPlus™ inaktiviert oder denaturiert nicht lediglich die DNA, sondern
zerstört diese vollständig. DNA-ExitusPlus™ eignet sich sowohl für die Dekontamination von Oberflächen als auch von Geräten wie Pipetten oder Elektrophoresekammern. DNA-ExitusPlus™ ist eine gebrauchsfertige Lösung, welche weder
korrosive, alkalische noch toxische Eigenschaften besitzt.
DNA-freie PCR-Reagenzien
AppliChem bietet hochreine Reagenzien und Mastermixe an, die nachweislich frei
von bakterieller DNA sind (garantiert für Amplifikate >220 bp).
PCR Einzelkomponenten
2.1 PCR Wasser, DNA-frei
(Bestell-Nr. A8510)
Hochreines, DNA-freies Wasser für die Verwendung in der PCR.
2.2 Magnesiumchlorid-Lösung (25 mM), DNA-frei
(Bestell-Nr. A8512)
DNA-freie Lösung für die Optimierung der PCR Reaktion. Magnesiumchlorid
­beeinflusst die Annealing Temperatur der Primer, sowie die Aktivität und Spezifität
der Taq Polymerase. Üblicherweise wird eine Endkonzentration von 1– 4 mM
Magnesiumchlorid in der PCR eingesetzt.
2.3 Taq DNA Polymerase, DNA-frei
(Bestell-Nr. A5434)
Hochaktive Taq Polymerase für die zuverlässige und sensitive PCR. Die thermo­
stabile Polymerase ist frei von DNA (>220 bp) und besitzt alle Standardeigenschaften einer Taq Polymerase. Sie eignet sich besonders für den molekular­
biologischen Nachweis bakterieller DNA mittels 16S oder 23S rRNA Gen-Assays.
­Zusammen mit der Polymerase (5 U/µl) wird ein spezifisch auf dieses Enzym
abgestimmter 10X Puffer und DNA-freies Wasser geliefert.
2.4 SYBR® Green-Färbelösung, DNA-frei
(Bestell-Nr. A8511)
Lösung mit interkalierendem Farbstoff für den generellen Nachweis von doppelsträngiger DNA. 10fach konzentrierte Lösung für den Einsatz in Standard-PCR
oder Real-Time PCR. Besonders geeignet für PCR-Assays, die generelle Primer
verwenden, wie z. B. 16S rRNA Gen- oder 18S rRNA Gen-Primer.
DNA-freie Mastermixe
DNA-freie Mastermixe für
ultra-sensitiven Bakterien-DNA Nachweis
Allgemeine Kits (ohne PCR Primer)
Alle Komponenten dieser Mastermixe sind für den Einsatz in Routine-PCR zur
Amplifikation von DNA/RNA-Abschnitten im Größenbereich von 200 bp bis 4 kb
ausgelegt. Die Mastermixe können auch in Real-Time-PCR oder multi-well
­Formaten verwendet werden. Das Reaktionsvolumen beträgt 25 µl.
Unsere Mastermixe sind optimiert für die verwendete Taq DNA Polymerase. Das
bedeutet hohe Ausbeute an PCR-Produkt ohne zusätzliche Optimierungsschritte.
3.1 PCR Kit, DNA-frei
(Bestell-Nr. A8509)
Flexibel einsetzbarer Mastermix für die Standard PCR, bei der es auf DNA-Freiheit
ankommt. Der Mastermix enthält 2,5fach konzentrierten Puffer, speziell abgestimmt auf die hochaktive Taq DNA Polymerase, dNTPs, BSA und DNA-freies
­Wasser. Alle Mastermix-Komponenten sind DNA-frei und garantiert bis mindestens 40 Zyklen hochaktiv.
4.1 PCR-InfectoDetect Mix DNA-frei, 16S Primer
(Bestell-Nr. A7746)
Der Mastermix 16S Primer enthält Primer, welche an hochkonservierte ­Regionen
des 16S rRNA Gens binden. Dieser Mastermix ist besonders geeignet für den
­generellen Nachweis von Bakterien. Die Primer amplifizieren eine 470 Basenpaar
lange Region des 16S rRNA Gens, welche neben hochkonservierten Regionen
auch Bakterienspezies-typische Abschnitte enthält. Dies erlaubt eine Keimidentifizierung mittels Sequenzierung des Amplifikates.
M
1
2
3
4
N
M
1
2
3
4
N
3.2 qPCR Kit, DNA-frei
(Bestell-Nr. A8514)
Ein Kit für die (Real-Time) qPCR – entspricht dem PCR Kit DNA-frei (A8509),
jedoch mit einem zusätzlichen Gefäß mit DNA-freier SYBR® Green-Färbelösung.
Tab. 1: Übersicht zu den DNA-freien PCR-Kits von AppliChem
Wettbewerb
PCR Kit
A8509
qPCR Kit
A8514
Reaktionspuffer
✓
✓
dNTPs + BSA
✓
✓
Taq DNA Polymerase
✓
✓
Wasser
✓
✓
®
SYBR Färbelösung
M
InfectoDetect
Abb. 2: Die Nachweisgrenze für bakterielle DNA in der PCR wird mit PCR-InfectoDetect
Mix DNA-frei (A7746) deutlich verbessert.
Gel-Elektrophorese von Amplifikaten mit Taq DNA Polymerase eines Wettbewerbers (links)
und AppliChems PCR-InfectoDetect 16S Primer (rechts).
Spur: 1 (1,0 ng K. pneumoniae DNA), 2 (45 pg), 3 (8,9 pg), 4 (1,7 pg); M, DNA-Marker;
N, negativ- Kontrolle
✓
— —
— — —
—
— —
+
AC
➝
4.2 InfectoDetect Mix DNA-frei, all inclusive
(Bestell-Nr. A7732)
Dieser Mastermix enthält neben den im Mastermix 16S Primer erwähnten
­Primern zusätzlich noch SYBR® Green. Hiermit kann der Mastermix auch für
die Real-Time PCR verwendet werden. Zusätzlich sind im Lieferumfang ein
­Ladepuffer und DNA-Marker für die konventionelle PCR mit anschließender
Gel-Elektrophorese enthalten.
B
➝
0.2
0.15
0.1
C
➝
0.05
0
Abb. 1: Hoch-sensitive Detektion von bakterieller DNA mit AppliChems Mastermix
(A8509) PCR Kit, DNA-frei
AppliChems PCR Kit (AC) ist DNA-frei, im Gegensatz zu Anbieter B. Gleichzeitig ist AC um
66% aktiver als Anbieter C. Die Amplifikation lief für 40 Zyklen mit universellen 16S rDNA
Primern. (–) Negativ-Kontrolle ohne Template; (+) Positiv-Kontrolle 240 pg S. aureus DNA;
Pfeil: 470 bp-PCR-Produkt; (M) DNA-Marker.
Abb. 3: (Real-Time) qPCR Analyse mit PCR-InfectoDetect Mix DNA-frei, all
inclusive (A7732).
Nachweis von 1 pg – 1 ng Staphylococcus aureus DNA im PCR-Ansatz (farbige Linien).
Schwarze Linie: Negativ-Kontrolle, (ohne Template DNA). Fluoreszenz-Signal ab ca. 40
Zyklen beruht auf der Bildung von Primer-Dimeren.
1 / 9357-11
A69, D
Tab. 2: Übersicht über AppliChems InfectoDetect PCR-Kits für den sensitiven­
Nachweis von Bakterien-DNA
16S Primer
A7746
all inclusive
A7732
Reaktionspuffer
✓
✓
dNTPs + BSA
✓
✓
16S rDNA Primer
✓
✓
Taq DNA Polymerase
✓
✓
Wasser
✓
✓
®
SYBR Färbelösung
✓
Ladepuffer + DNA-Marker
✓
Literatur
Carroll, N.M. et al. (1999) J. Clin. Microbiol. 37(10), 3402-3404. Elimination of
Bacterial DNA from Taq DNA Polymerase by Restriction Endonuclease Digestion.
Corless, C.E. et al. (2000) J. Clin. Microbiol. 38(5), 1747-1752. Contamination
and Sensitivity Issues with Real-Time Universal 16 S rRNA PCR.
Deragon, J.-M. et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(20), 6149. Use of irradiation
to eliminate DNA contamination for PCR.
Evans, G.E. et al. (2003) J. Clin. Microbiol. 41(7), 3452-3453. Contamination of
Qiagen DNA Extraction Kits with Legionella DNA.
Chiang, C.-S. et al. (2005) J. Clin. Microbiol. 43(1), 530-531. Presence of
β-Lactamase Gene TEM-1 DNA Sequence in Commercial Taq DNA Polymerase.
Goto, M. et al. (2005) FEMS Microbiol. Lett. 246, 33-38. Contamination of
diverse nifH and nifH-like DNA into commercial PCR primers.
Hein, I. et al. (2007) J. Microbiol. Methods. 71, 336-339. Ethidium monoazide
and propidium monoazide for elimination of unspecific DNA background in
quantitative universal Real-Time PCR.
Kontaminationen durch Nukleinsäuren:
Probleme & praktische Lösungen
Heininger, A. et al. (2003) J. Clin. Microbiol. 41(4), 1763-1765. DNase Pretreatment of Master Mix Reagents Improves the Validity of Universal 16S rRNA Gene
PCR Results.
AppliChem nimmt bei der Beseitigung
von Nukleinsäure-Kontaminationen eine
Kontaminationen
Vorreiterrolle ein. Die von uns in Zusammenarbeit mit multiBIND (Köln) entwidurch Nukleinsäuren
ckelten Dekontaminationsprodukte sind,
neben Chlorbleichlauge (bleach) wahrscheinlich die einzigen Reagenzien, die
Nukleinsäuren wirklich zerstören (degradieren) und nicht nur modifizieren
oder denaturieren. Die einzigartige
ExitusPlus™-Technologie, die diesen Reagenzien zugrunde liegt, schont dabei die
Umwelt, den Experimentator und die Laboreinrichtung. Alle Komponenten sind
biologisch abbaubar, nicht giftig und
nicht korrosiv (keine Säuren oder Laugen).
Selbst das Autoklavieren, ursprünglich als die Dekontaminations-Methode anerkannt, inaktiviert nur Mikroorganismen. Nukleinsäuren werden nur sehr unvollständig zerstört. Auf 64 Seiten lesen Sie mehr zu den Kontaminationsquellen,
­deren Beseitigung und der Degradation von Nukleinsäuren. Falsch-positive
PCR-Ergebnisse nehmen nach Anwendung der ExitusPlus™-Produkte­
signifikant ab.
Hughes, M.S. et al.(1994) J. Clin. Microbiol. 32(8), 2007-2008. Identification
and Elimination of DNA Sequences in Taq DNA Polymerase.
Probleme & praktische Lösungen
Take the Pink Link!
www.
.com
01.10.2007 11:57:52 Uhr
Mehr Infos unter:
[email protected]
Klaschik, S. et al. (2002) Mol. Biotechnol. 22, 231-242. Comparison of Different
Decontamination Methods for Reagents to Detect Low Concentrations of Bacterial
16S DNA by Real-Time-PCR.
Meier, A. et al.(1993) J. Clin. Microbiol. 31(3), 646-652. Elimination of Contaminating DNA within Polymerase Chain Reaction Reagents: Implications for a
General Approach to Detection of Uncultured Pathogens.
Mohammadi, T. et al. (2005) J. Microbiol. Methods 61, 285-288. Removal of
contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents.
Mühl, H. et al. (2008) Diag. Microbiol. Infect. Dis. [in press]. Activity and DNA
contamination of commercial polymerase chain reaction reagents for the
universal 16S rDNA Real-Time polymerase chain reaction detection of bacterial
pathogens in blood.
Newsome, T. et al. (2004) J. Clin. Microbiol. 42(5), 2264-2267. Presence of
Bacterial Phage-Like DNA Sequences in Commercial Taq DNA Polymerase
­Reagents.
Nocker, A. & Camper, A.K. (2006) Appl. Environ. Microbiol. 72(3), 1997-2004.
Selective Removal of DNA from Dead Cells of Mixed Bacterial Communities by Use
of Ethidium Monoazide.
Rueckert, A. & Morgan, H.W. (2007) J. Microbiol. Methods 68, 596-600. Removal
of contaminating DNA from polymerase chain reaction using ethidium
monoazide.
01/2010
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