Wie funktionieren Metallzentren in Proteinen? - Christian

Bioinorganic Chemistry
Felix Tuczek, Institut für Anorganische Chemie
Wie funktionieren Metallzentren in Proteinen?
Von Modellkomplexen zu biomimetischen Reaktionen
Die Bioanorganische Chemie hat sich im Laufe der Jahre zu einer eigenständigen Wissenschaft zwischen Biologie und Chemie entwickelt. Viele biologische Funktionen benötigen anorganische Elemente.
So treten als prosthetische Gruppen in Proteinen häufig Metallzentren auf, welche im Zusammenwirken
mit der Proteinumgebung spezifische Eigenschaften besitzen, die sich die Natur für eine Vielfalt von
Lebensfunktionen zunutze macht. Der Bioanorganiker untersucht die Eigenschaften dieser aktiven Metallzentren anhand von Modellkomplexen, um wichtige Informationen hinsichtlich der Wirkungsweise von
Metalloproteinen und -enyzmen auf molekularer Ebene zu erhalten.
Metal Centers in Proteins
From Model Complexes to Biomimetic Reactions
During the last decades, bioinorganic chemistry has developed into an independent discipline between biology
and chemistry. Many biological functions need inorganic elements. Metal centers often are contained in prosthetic groups which in conjunction with the protein environment have specific properties that nature uses in a
variety of biological functions. The bioinorganic chemist investigates the properties of these metal centers
based on model complexes in order to obtain important information regarding the function of metalloproteins on
a molecular level.
Stickstoff-Fixierung
Nitrogen Fixation
Einer der grundlegenden biochemischen Prozesse der Natur ist
die Stickstoff-Fixierung, d.h. die Bindung und Aktivierung von N2
sowie die Reduktion zu Ammoniak. Sie wird katalysiert durch
das Enzym Nitrogenase, welches Bakterien in die Lage versetzt,
diesen Prozess bei Normaldruck und Umgebungstemperatur
durchzuführen. Nitrogenasen bestehen aus zwei verschiedenen
Metalloproteinen, die als Eisen-Protein (Fe-Protein) und Molybdän-Eisen-Protein (MoFe-Protein) bezeichnet werden. Das MoFe-Protein ist zusammengesetzt aus zwei identischen Dimeren,
wobei jedes dieser Dimere wiederum aus zwei verschiedenen
Untereinheiten α und β besteht und zwei verschiedene Metallcluster enthält, den sogenannten "Eisen-Molybdän-Cofaktor"
(FeMoco; Bild 1a) und den P-Cluster. Bei dem Fe-Protein, welches die Elektronen für die Umwandlung von N2 zu NH3 anliefert, handelt es sich um ein Dimer, das aus zwei identischen
Untereinheiten besteht, welche über einen einzelnen Fe4S4-Cluster (Bild 1b) miteinander verbunden sind. Für derartige Cluster
gibt es zahlreiche synthetische Analoga (s. unten). Der P-Cluster des MoFe-Proteins ist am Transfer von Elektronen vom FeProtein zum FeMoco beteiligt. Es gilt inzwischen als gesichert,
Nitrogen fixation, i.e. the bonding and activation of N2 and its reduction to ammonia, is one of the fundamental biochemical
processes of nature. It is catalyzed by the enzyme nitrogenase
which enables bacteria to perform this reaction at room temperature and ambient pressure. Nitrogenase consists of two different metalloproteins which are designated as iron-protein (Fe
protein) and molybdenum-iron protein (MoFe protein). The
MoFe protein is composed of two identical dimers that each
consist of two different subunits α and β containing two different
metal clusters, the so-called iron-molybdenum cofactor (FeMoco, Figure 1a) and the P cluster. The Fe protein delivers the
electrons for the conversion of N2 to NH3 and is a dimer consisting of two identical subunits which are connected via a single
Fe4S4 cluster. Numerous synthetic analogs for this type of cluster exist (see below). The P-cluster in the MoFe protein is involved in the transfer of electrons from the Fe protein to the
FeMoco. There is strong evidence now that dinitrogen binds and
is reduced to ammonia at the FeMoco. Biological nitrogen fixation has fascinated chemists for a long time as it proceeds at
ambient conditions, in contrast to the industrial Haber-Bosch
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Bioanorganische Chemie
a
b
c
Bild 1 / Figure 1
a: FeMoco der Azotobacter vinelandii - Nitrogenase [Nach J. W. Peters et al., Biochemistry 36, 1181 (1997) und O. Einsle et al., Science 297,
1696 (2002).
b: Fe4S4(S-Cys)4-Einheit der Escherichia coli - Endonuclease III [C. F. Kuo, Jr. et al., Science 258 (1992), 434].
c: Kristallstruktur des [Fe4Se4(SCH3)4]2--Anions von [(n-C4H9)4N]2 [Fe4Se4(SCH3)4] [A. Kern, F. Tuczek, to be published].
a: FeMoco of Azotobacter vinelandii nitrogenase [adapted from J. W. Peters et al., Biochemistry 36, 1181 (1997) and O. Einsle et al., Science
297, 1696 (2002).
b: Fe4S4(S-Cys)4 unit of Escherichia coli endonuclease III [C. F. Kuo, Jr. et al., Science 258 (1992), 434].
c: X-ray crystal structure of the [Fe4Se4(SCH3)4]2- anion of [(n-C4H9)4N]2 [Fe4Se4(SCH3)4] [A. Kern, F. Tuczek, to be published].
dass Stickstoff am FeMoco bindet und dort auch zu Ammoniak
umgesetzt wird. Die biologische Stickstoff-Fixierung fasziniert
Chemiker seit langem, da sie im Gegensatz zu den drastischen
Reaktionsbedingungen des technischen Verfahrens (HaberBosch-Prozess) unter ambienten Bedingungen abläuft. Wichtige
Arbeitsfelder der bioanorganischen Chemie auf diesem Gebiet
sind einerseits die Untersuchung des enzymatischen Prozesses
im Hinblick auf ein Verständnis des Reaktionsablaufs auf molekularer Ebene, andererseits die Entwicklung eines synthetischen Systems, das Stickstoff unter ähnlichen Bedingungen reduziert.
Unsere Untersuchungen zur Stickstoff-Fixierung lassen sich in
zwei Unterbereiche gliedern. Der erste beschäftigt sich ausschließlich mit der Bindung von Stickstoff an Metallzentren in
den möglichen Geometrien side-on und end-on sowie Untersuchungen zur elektronischen Struktur der entsprechenden einoder zweikernigen Distickstoff-Komplexe. Aufgrund ihrer geringen Affinität zu N2 sind Eisen-Komplexe gut geeignet, um den
Einfluß von Coliganden, Geometrie des Komplexes und elektronischer Struktur des Zentralions auf die Bindung von Distickstoff
zu untersuchen [1]. Weiterhin gilt unser Interesse Zirkoniumund Vanadium-Komplexen mit side-on verbrückenden N2-Liganden [2]. Wichtige Informationen hinsichtlich der "Aktivierung" von
Stickstoff in diesen Systemen erhalten wir aus spektroskopischen Daten in Kombination mit quantenchemischen Rechnun-
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process. Important areas of bioinorganic research in this field
are the investigation of the enzymatic process with the goal of
understanding the reaction mechanism on a molecular level and
the development of a synthetic system which reduces dinitrogen
under similar conditions.
Our investigations in the one of nitrogen fixation can be divided
into two areas. The first exclusively deals with the bonding of
dinitrogen to transition metal centers in the possible geometries
side-on and end-on and the elucidation of the electronic structures of the respective mono- or binuclear complexes. Due to
their low affinity for N2, iron(II) complexes are well suited for
studying the influence of coligands, of the geometry and of the
electronic structure of the complex on the bonding of dinitrogen
[1]. Furthermore, we are interested in zirconium and vanadium
systems with side-on bridging N2 [2]. Important information regarding the "activation" of dinitrogen in these systems is inferred
from spectroscopic data in conjunction with quantum chemical
calculations. The second research area of our group involves
the isolation and characterization of intermediates of the reduction and protonation of N2. This is investigated using molybdenum and tungsten complexes with two bidentate phosphine ligands like depe (1,2-bis(diethylphosphino)ethane) or dppe (1,2bis(diphenylphosphino)ethane) and halide, hydride or nitrile coligands (Figure 2; [3, 4]). Based on the various species occuring
in this chemistry, the reduction pathway of N2 can be followed in
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Bild 2 / Figure 2
Struktur von [W(N2)(NCCH2CH3)(dppe)2] [4].
Bild 3 / Figure 3
Structure of [W(N2)(NCCH2CH3)(dppe)2] [4].
Zyklus der Bindung und Protonierung von N2 an Molybdän PhosphinKomplexen.
gen. Ein zweites Arbeitsgebiet unserer Gruppe ist die Isolierung
und Charakterisierung von Zwischenprodukten der Reduktion
und Protonierung von N2. Hierfür eigenen sich Molybdän- und
Wolframkomplexe mit zwei bidentat-koordinierenden Phosphinen wie z.B. dppe (1,2-Bis(diphenylphosphino)ethan) oder depe
(1,2-Bis(diethylphosphino)ethan) sowie Halogenid, Hydrid oder
Nitril als Coliganden (Bild 2; [3, 4]). Anhand der in dieser Chemie auftretenden Intermediate lässt sich der Reduktionsweg von
N2 schrittweise verfolgen (Bild 3). Da sich entsprechende
Zwischenprodukte auch für den biologischen Prozess nachweisen lassen, kann der Zyklus in Bild 3 als funktionales Modell für
die Wirkungsweise des Enzyms Nitrogenase betrachtet werden.
Eisen/Molybdän-Schwefel/Selen-Cuban- und Heterocubancluster: Synthese, Struktur und Schwingungsspektroskopie
Eisen-Schwefel-Proteine sind in biologischen Systemen weit
verbreitet und spielen insbesondere bei Elektronentransferprozessen eine wichtige Rolle. Sie enthalten oft Fe4S4-Cubancluster, wobei die Eisenatome über Sulfidionen miteinander verknüpft sind und durch Cystein-Reste mit der Peptidkette verbunden sind (s. Bild 1b). Höherkondensierte Cluster liegen im
Falle des FeMocos und des P-Clusters im MoFe-Protein des Enzyms Nitrogenase vor, wobei kuboidale Fe4S3- bzw. MoFe3S3Einheiten über Sulfidbrücken miteinander verknüpft sind (s.o.).
Neue Strukturuntersuchungen zeigen darüber hinaus, dass die
trigonale Koordination der Eisenatome im FeMoco durch einen
bisher unbekannten zentralen Liganden (vermutlich Stickstoff)
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Cycle of the bonding and protonation of N2 at molybdenum phosphine
complexes.
a stepwise manner (Figure 3). As corresponding intermediates
are detectable in the biological pathway as well, the cycle depicted in Figure 3 can be considered as a functional model of the
action of nitrogenase.
Iron/Molybdenum-Sulfur/Selenium-Cubane- and Heterocubane Clusters: Synthesis, Structure, and Vibrational
Spectroscopy
Iron-sulfur proteins are ubiquitous in biological systems and in
particular play an important role in electron transfer processes.
They often contain Fe4S4 clusters where the iron atoms are connected by sulfide anions and are attached to the peptide backbone via cysteine residues (Figure1b). Higher condensed clusters are present in the FeMoco and the P-cluster in the MoFe
protein of nitrogenase. In these cases, cuboidal Fe4S3 or
MoFe3S3 units are connected via sulfide bridges (vide supra).
Importantly, new structural investigations show that the initially
proposed trigonal coordination of the iron atoms in the FeMoco
is actually complemented by a central ligand (presumably nitrogen; Figure 1a). Our investigations in this area focus on the synthesis of Fe-S/Se- cubane clusters (Figure 1c) and their vibrational-spectroscopic characterization. Well suited for this project
are infrared and resonance Raman spectroscopy. The latter
technique is particularly useful as the vibrations of the cuboidal
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vervollständigt wird (Bild 1a). Im Mittelpunkt unserer Beschäftigung mit diesem Themenbereich steht die Synthese von
Fe-S/Se-Cubanclustern (s. Bild 1c) sowie ihre schwingungsspektroskopische Charakterisierung. Hierfür eignen sich die Infrarot- und die Resonanz-Raman-Spektroskopie, wobei durch
S/Se → Fe-Charge-Transfer-Übergänge im sichtbaren Bereich
des Spektrums vor allem die Schwingungen des würfelförmigen
Clusterkerns verstärkt werden. Die Bestimmung der Kraftfelder
vom Urey-Bradley-Typ für verschiedene Fe4(S/Se)4-Cluster
durch Normalkoordinatenanalyse trägt zu einem besseren Verständnis der elektronischen Struktur dieser Moleküle bei. Die
hierbei gewonnenen Erkenntnisse werden auch auf molybdänhaltige Heterocubane mit Relevanz zum FeMoco der Nitrogenase übertragen. Langfristiges Ziel dieser Untersuchungen ist es,
den bisher noch unbekannten Bindungsmodus des Stickstoffs
am FeMoco sowie gegebenenfalls verschiedene Intermediate
bei dessen Reduktion zu Ammoniak spektroskopisch zu erfassen.
Kupferproteine mit zweikernigen aktiven Zentren: Hämocyanin und Tyrosinase
Metalloproteine mit zwei Kupferatomen im aktiven Zentrum
(Typ3-Kupferproteine) haben in der Natur vielfältige Aufgaben.
Hämocyanine sind für den Sauerstofftransport in Mollusken und
Arthropoden zuständig. Das Sauerstoffmolekül wird dabei als
Peroxid in einer side-on verbrückenden Geometrie zwischen
den beiden Kupferzentren gebunden [5]. Die Monooxygenase
Tyrosinase, welche ein sehr ähnlich aufgebautes Typ3-Kupferzentrum besitzt, katalysiert die o-Hydroxylierung von Monophenolen zu Diphenolen und die 2-Elektronen-Oxidation von o-Diphenolen zu o-Chinonen [6]. Sie ist von entscheidender Bedeutung auf dem Weg der Biosynthese des Melanins. Für diese
Klasse von Proteinen existieren niedermolekulare Komplexe,
die sowohl die Struktur des aktiven Zentrums recht genau abbilden (strukturelle Modelle) als auch Aspekte der Reaktivität der
Metalloproteine wie die reversible O2-Bindung imitieren (funktionale Modelle). Bei der Reaktion dieser Modellsysteme mit phenolischen Substraten in Gegenwart von O2 kommt es jedoch in
der Regel zu unerwünschten Radikalkopplungsprodukten. Inzwischen gibt es jedoch ein niedermolekulares System, das sowohl die reversible Bindung von Sauerstoff erlaubt als auch die
physiologischen Reaktionen mit Mono- und Diphenolen vermittelt. Es basiert auf den Liganden α,α'-Bis{bis [2-(1'-methyl-2'benzimidazolyl)ethyl]amino}-m-xylol (L-66) bzw. bis[2-(1'-methyl-2'-benzimidazolyl)ethyl]amin} (L-6) und den entsprechenden Kupfer(I)- und Kupfer(II)-komplexen. In beiden Fällen wird
Sauerstoff in einer µ-η2:η2-Geometrie gebunden (Bild 4; [7]).
Wir untersuchen diese Modellkomplexe sowie ihre oxygenierten
Derivate hinsichtlich der Bindung und Reaktion mit externen
Substraten wie Mono- und Diphenolen. Unser besonderes Augenmerk liegt dabei auf Gemeinsamkeiten und Unterschieden
der ein- und zweikernigen Modellkomplexe von L-6 und L-66
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cluster core are selectively enhanced due to S/Se → Fe charge
transfer transitions in the visible part of the spectrum. The determination of Urey/Bradley force fields for different Fe4(S/Se)4
clusters by normal coordinate analysis contributes to a better understanding of the electronic structure of these molecules. The
information gained by these investigations is also applied to
molybdenum-containing heterocubane clusters with relevance
to the FeMoco of nitrogenase. Long-term goal of these studies
is to define the hitherto unknown bonding mode of dinitrogen to
the FeMoco and possibly detect intermediates on the reduction
pathway of N2 to ammonia at this cluster.
Copper Proteins with Binuclear Active Sites: Hemocyanin
and Tyrosinase
Metalloproteins with two copper atoms in their active sites (type
3 copper proteins) perform a variety of functions in nature. Hemocyanins mediate the oxygen transport in molluscs and
arthropods. The dioxygen molecule is bound as peroxide in a
side-on bridging geometry between the two copper centers [5].
The monooxygenase tyrosinase having a very similar type-3 active site catalyzes the o-hydroxylation of monophenols to diphenols and the two-electron oxidation of o-diphenols to o-quinones
[6]. This is of central importance to the biosynthesis of melanin.
For this class of enzymes inorganic complexes exist which both
model the structure of the active site (structural models) and reproduce aspects of the reactivity of the metalloproteins (functional models). Upon reaction of these model systems with phenolic substrates in the presence of O2, however, generally un-
Bild 4 / Figure 4
Das Peroxoaddukt [Cu2(L-66)(µ-η2:η2-O2)]2+.
The peroxo adduct [Cu2(L-66)(µ-η2:η2-O2)]2+.
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einerseits sowie Unterschieden hinsichtlich der elektronischen
Struktur der eingesetzten phenolischen Substrate andererseits.
Diese Untersuchungen können wichtige Informationen für ein
mechanistisches Verständnis der Tyrosinasereaktionen liefern.
Elektronentransfer in gemischtvalenten Fe(II)-Fe(III)-Biferrocenen
Elektronentransferphänomene sind von fundamentaler Bedeutung für die Chemie, die Physik und nicht zuletzt für die Biologie.
Der Elektronentransfer in biologischen Systemen reagiert extrem empfindlich auf konformationelle Veränderungen im Bereich der Transferpfade sowie in der Umgebung der redoxaktiven Metallzentren. Zum Studium derartiger Effekte ist es hilfreich, strukturell einfachere Systeme heranzuziehen. Hier wird
exemplarisch an gemischtvalenten Fe(II)/Fe(III)-Biferrocenverbindungen ein thermisch vermittelter Ladungs-Lokalisations/Delokalisationsübergang untersucht. Aufgrund elastischer Wechselwirkungen, welche die Geometrie der redoxaktiven Komplexe
verzerren, erfolgt der Übergang in diesen Systemen kooperativ
bei einer charakteristischen Temperatur, welche entscheidend
von den Substituenten R der Ferrocen-Ferrocenium-Dimere abhängt. Mittels 57Fe-Mössbauerspektroskopie lässt sich dieser
Effekt temperaturabhängig verfolgen. Durch Verdünnung dieser
Systeme mit isostrukturellen, jedoch redox-inaktiven Spezies
sollte sich ferner die Temperaturabhängigkeit dieses Prozesses
deutlich beeinflussen lassen. Dafür synthetisieren wir gemischtmetallische Ferrocen-Cobaltocenium-Dimere, welche identische
Substituenten R wie ihre Ferrocen-Ferrocenium-Analoga tragen.
Die Analyse der Mössbauer-Spektren gemischter Ferrocen-Ferrocenium/Ferrocen-Cobaltocenium-Systeme liefert Informationen über weitreichende, elastische Wechselwirkungen im
Festkörper und ihren Einfluss auf die Dynamik des lokalen
Elektronentransfers.
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wanted radical coupling products result. There exists one lowmolecular-weight system that not only reproduces the reversible
bonding of O2, but also mediates the physiological reaction with
mono- and diphenols. It is based on the ligands α,α'-bis{bis[2(1'-methyl-2'-benzimidazolyl)ethyl]amino}-m-xylene (L-66) and
bis[2-(1'-methyl-2'-benzimidazolyl)ethyl]amine} (L-6) and the
corresponding copper(I) and copper(II) complexes. In both cases dioxygen is bound in a µ-η2:η2 geometry (Figure 4; [7]). We
are currently investigating these model complexes and their oxygenated derivatives with respect to the reaction with external
substrates like mono- and diphenols. The focus of our research
is on similarities and differences between the mono- and binuclear model complexes of the ligands L-6 and L-66 on the one
hand, and differences in the electronic structures of the used
phenolic substrates on the other hand. These studies provide
key insight into the mechanism of the tyrosinase reaction.
Electron Transfer in Mixed-Valent Fe(II)-Fe(III)-Biferrocenes
Electron transfer phenomena are of fundamental importance in
chemistry, physics and biology. Electron transfer in biological
systems is extremely sensitive to conformational changes in the
region of the transfer path and in the vicinity of the redox active
metal centers. In order to investigate these effects, it is of interest to employ structurally simpler systems. We study a thermally driven charge localization/delocalization transition based on
mixed-valent Fe(II)/Fe(III) biferrocene compounds. Due to elastic interactions distorting the geometry of the redox active centers in these systems, this transition occurs cooperatively at a
certain temperature which decisively depends upon the substituents R of the ferrocene-ferrocenium dimers. Using 57FeMössbauer spectroscopy, this effect can be studied as a function
of temperature. By dilution of these systems with isostructural,
but redox-inactive species, the temperature dependence of this
process should be markedly influenced. Therefore, we are synthesizing mixed-valent ferrocene-cobaltocenium dimers carrying
identical substituents as their ferrocene-ferrocenium analogs.
The analysis of Mössbauer spectra of mixed ferrocene-ferrocenium/ferrocene-cobaltocenium crystals then should provide information with respect to long-range elastic interactions in the
solid and their influence on the dynamics of the local electron
transfer.
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Literaturangaben / References
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Prof. Dr. Felix Tuczek
Institut für Anorganische Chemie
Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
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D-24098 Kiel
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Fax: 0431-880-1520
E-Mail: [email protected]
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(2000).
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