bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0
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bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 READ HIGHLIGHTED CHANGES 3000-1168 1 x 96 TESTS 3000-1169 5 x 96 TESTS (480) ELISA test for the detection of antibodies to Human Immunodeficiency Viruses (HIV) type 1 (group M-O) or type 2 in human serum or plasma samples in clinical laboratories and as a first-line screening assay in blood centres. Summary Serological evidence of infection with HIV may be obtained by testing for presence of HIV antigens or antibodies in serum of individuals suspected for HIV infection. Antigen can generally be detected during both acute phase and the symptomatic phase of AIDS only. The antibodies to HIV-1 and/or HIV-2 can be detected throughout virtually the whole infection period, starting at or shortly after the acute phase and lasting till the end stage of AIDS. Therefore, the use of highly sensitive antibody assays is the primary approach in serodiagnosis of HIV infection. Apart from sexual transmission, the principal route of infection with HIV is blood transfusion. HIV can present both in cellular and cell-free fractions of human blood. Therefore, all donations of blood or plasma should be tested because due to the risk of HIV transmission through contaminated blood. This can be effectively achieved by testing for the antibodies to HIV-1 and HIV-2 by using a highly sensitive ELISA tests. Principle bioelisa HIV-1+2 3.0 is a two step incubation antigen “sandwich” enzyme immunoassay kit, in which the wells of a microplate are coated with recombinant HIV antigens expressed in E. coli (recombinant HIV-1 gp41, gp120, and recombinant HIV-2 gp-36). Serum or plasma samples are added to these wells. If specific HIV1/2 antibodies are present in the sample, they will form stable complexes with the HIV recombinant antigens. The microwells are then washed to remove unbound serum proteins. A second set of recombinant antigens conjugated with peroxidase and expressing the same epitopes are added to the wells. During the second incubation step, these antigens will bind to the specific captured antibodies. After a second wash to remove unbound conjugate a Chromogen solutions are added to the wells. In wells containing the antigen-antibody-antigen “sandwich” immunocomplex, the colorless Chromogens are hydrolyzed by the bound conjugate to a blue colored product. The blue color changes to yellow after blocking the reaction with sulfuric acid. The intensity of colour can be measured and is proportional to the anti-HIV 1/2 antibodies concentration in the sample. Wells containing negative samples remain colourless. Components 1. MCPL MICROPLATE: 12 x 8 wells coated with recombinant HIV 1/2 antigens (recombinant HIV-1 gp41, gp120, and recombinant HIV-2 gp36). The microwell strips are for SINGLE USE only. Do not use if the vacuum sealing has been damaged when first time taken of out the box. 2. CONTROL + 1 HIV-1 POSITIVE CONTROL: Antibodies to HIV-1 diluted in protein stabilized buffer. Contains 0.1% ProClinTM 300 as preservative and red dye. Ready to use. 3. CONTROL + 2 HIV-2 POSITIVE CONTROL: Antibodies to HIV-2 diluted in protein stabilized buffer. Contains 0.1% ProClinTM 300 as preservative and red dye. Ready to use. 4. CONTROL – NEGATIVE CONTROL: Protein stabilized buffer tested negative for HBsAg and for antibodies to HIV-1, HIV-2, HCV and TP. Contains 0.1% ProClinTM 300 as preservative and yellow dye. Ready to use. 5. CONJ CONJUGATE: HIV-1 and HIV-2 recombinant antigens conjugated with peroxidase. Contains 0.1% ProClinTM 300 as preservative and red dye. Ready to use. 6. WASH SOLN 20x CONCENTRATE WASHING SOLUTION: Concentrate PBS buffer pH 7.4 (20x). Contains Tween-20 as detergent. To be diluted 1/20 in distilled or deionised water before use. 7. CHROM A CHROMOGEN SOLUTION A: Urea peroxide solution. Ready to use. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 1 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa 8. CHROM B CHROMOGEN SOLUTION B: TMB solution (Tetramethyl benzidine dissolved in citric acid). 9. H2SO4 0.5M STOPPING SOLUTION: 0.5M sulphuric acid. Ready to use. 10. SEALS ADHESIVE SEALS: To cover the microplate during incubations. 11. BAG RESEALABLE BAG: For storage of unused strips. Precautions bioelisa HIV-1+2 3.0 is intended for IN VITRO diagnostic use. For professional used only. IVD WARNING: Materials from human origin may have been used in the preparation of the negative control of the kit. These materials have been tested with tests kits with accepted performance and found negative for antibodies to HIV 1/2, HCV, TP and HBsAg. However, there is no analytical method that can assure that infectious agents in the specimens or reagents are completely absent. Therefore, handle reagents and specimens with extreme caution as if capable of transmitting infectious diseases. Bovine derived sera have been used for stabilizing of the positive and negative controls. Bovine serum albumin (BSA) and fetal calf sera (FCS) are derived from animals from BSE/TSE free-geographical areas. The Negative Control, HIV-1 Positive Control, HIV-2 Positive Control and Conjugate contains 0.1% ProClinTM as preservative. The following are the appropriate risk (R) and safety (S) phrases: R43 May cause sensitisation by skin contact. S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. S28 After contact with skin, wash immediately with plenty of water. S36/37/39 Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face protection. S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the label where possible). S60 This material and its container must be disposed of as hazardous waste. S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/ Safety data sheets. The ELISA assays are time and temperature sensitive. To avoid incorrect result, strictly follow the test procedure steps and do not modify them. 1. Do not exchange reagents from different lots or use reagents from other commercially available kits. The components of the kit are precisely matched for optimal performance of the tests. 2. Make sure that all reagents are within the validity indicated on the kit box and of the same lot. Never use reagents beyond their expiry date stated on labels or boxes. 3. CAUTION - CRITICAL STEP: Allow the reagents and specimens to reach room temperature (18-30°C) before use. Shake reagent gently before use. Return at 2-8°C immediately after use. 4. Use only sufficient volume of sample as indicated in the procedure steps. Failure to do so, may cause in low sensitivity of the assay. 5. Do not touch the bottom exterior of the wells; fingerprints or scratches may interfere with the reading. When reading the results, ensure that the plate bottom is dry and there are no air bubbles inside the wells. 6. Never allow the microplate wells to dry after the washing step. Immediately proceed to the next step. Avoid the formation of air bubbles when adding the reagents. 7. Avoid assay steps long time interruptions. Assure same working conditions for all wells. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 2 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa 8. Calibrate the pipette frequently to assure the accuracy of samples/reagents dispensing. Use different disposal pipette tips for each specimen and reagents in order to avoid cross-contaminations. 9. Assure that the incubation temperature is 37°C inside the incubator. 10. When adding specimens, do not touch the well’s bottom with the pipette tip. 11. When measuring with a plate reader, determine the absorbance at 450 nm or at 450/620-630 nm. 12. The enzymatic activity of the conjugate might be affected from dust and reactive chemical and substances like sodium hypochlorite, acids, alkalis etc. Do not perform the assay in the presence of these substances. 13. If using fully automated equipment, during incubation, do not cover the plates with the plate cover. The tapping out of the remainders inside the plate after washing, can also be omitted. 14. All specimens from human origin should be considered as potentially infectious. Strict adherence to GLP (Good Laboratory Practice) regulations can ensure the personal safety. 15. Never eat, drink, smoke, or apply cosmetics in the assay laboratory. Never pipette solutions by mouth. 16. Chemical should be handled and disposed of only in accordance with the current GLP (Good Laboratory Practices) and the local or national regulations. 17. The pipette tips, vials, strips and specimen containers should be collected and autoclaved for not less than 2 hours at 121°C or treated with 10% sodium hypochlorite for 30 minutes to decontaminate before any further steps of disposal. Solutions containing sodium hypochlorite should NEVER be autoclaved. Materials Safety Data Sheet (MSDS) available upon request. 18. Some reagents may cause toxicity, irritation, burns or have carcinogenic effect as raw materials. Contact with the skin and the mucosa should be avoided but not limited to the following reagents: Stopping solution, the Chromogens, and the washing solution. INDICATIONS OF INSTABILITY DETERIORATION OF THE REAGENT: Values of the positive or negative controls, which are out of the indicated quality control range, are indicators of possible deterioration of the reagents and/or operator or equipment errors. In such case, the results should be considered as invalid and the samples must be retested. In case of constant erroneous results and proven deterioration or instability of the reagents, immediately substitute the reagents with new one or contact your local distributor or Biokit technical support for further assistance. Storage and stability The components of the kit will remain stable through the expiration date indicated on the label and package when stored between 2-8°C, do not freeze. To assure maximum performance of bioelisa HIV-1+2 3.0 kit, during storage protect the reagents from contamination with microorganism or chemicals. The microwell strips can be broken to be used separately. Place unused wells or strips in the plastic sealable storage bag together with the desiccant and return to 2-8°C. Once open the microplate is stable one month at 2-8°C. The negative control, HIV-1 positive control, HIV-2 positive control, conjugate, chromogen solution A, chromogen solution B and stopping solution, once open are stable one month at 2-8°C. The washing solution, once diluted, is stable for one week at room temperature or for two weeks at 2-8°C. Available packaging - 1 plate kit (96 tests), REF 3000-1168. Contains: 1 plate, 1 x 1 ml negative control, 1 x 1 ml HIV-1 positive control, 1 x 1 ml HIV-2 positive control, 1 x 12 ml conjugate, 1 x 50 ml washing solution, 1 x 8 ml chromogen solution A, 1 x 8 ml chromogen solution B, 1 x 8 ml stopping solution, 1 plastic bag and adhesive seals (6 units). - 5 plates kit (5 x 96 tests), REF 3000-1169. Contains: 5 plate, 3 x 1 ml negative control, 3 x 1 ml HIV-1 positive control, 3 x 1 ml HIV-2 positive control, 5 x 12 ml conjugate, 2 x 125 ml washing solution, 1 x 60 ml chromogen solution A, 1 x 60 ml chromogen solution B, 1 x 60 ml stopping solution, 1 plastic bag and adhesive seals (20 units). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 3 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa Material required not provided Distilled or deionized water. Disposable gloves and timer. Appropriate waste containers for potentially contaminated materials. Disposable V-shaped troughs. Dispensing system and/or pipette (single or multichannel) and disposable pipette tips. Absorbent tissue or clean towel. Dry incubator or water bath, 37 ± 1°C. Microshaker for dissolving and mixing conjugate with samples. Microplate reader with a 450 nm filter. Reference filter of 620 nm or 630 is advisable. Manual or automated wash system. Sample collection transporting and storage 1. No special patient’s preparation required. Collect the specimen in accordance with the normal laboratory practice. Either fresh serum or plasma specimens can be used with this assay. Blood collected by venipuncture should be allowed to clot naturally and completely – the serum/plasma must be separated from the clot as early as possible as to avoid haemolysis. Care should be taken to ensure that the serum specimens are clear and not contaminated by microorganisms. Any visible particulate matters in the specimen should be removed by centrifugation at 3000 RPM (round per minutes) for 20 minutes at room temperature or by filtration. 2. Plasma specimens collected into EDTA, sodium citrate or heparin may be tested, but highly lipaemic, icteric, or hemolytic specimens should not be used as they can give false results in the assay. Do not heat inactivate specimens. This can cause deterioration of the target analyte. Samples with visible microbial contamination should never be used. 3. bioelisa HIV-1+2 3.0 is intended ONLY for testing of individual serum or plasma samples. Do not use the assay for testing of cadaver samples, saliva, urine or other body fluids, or pooled (mixed) blood. 4. Transportation and Storage: Store specimens at 2-8°C. Specimens not required for assaying within 3 days should be stored frozen (-20°C or lower). Multiple freeze-thaw cycles should be avoided. For shipment, samples should be packaged and labeled in accordance with the existing local and international regulations for transportation of clinical samples and etiological agents. Automatic processing Automated or semi-automated assay may be used with different instruments. It is very important to validate any automated system to demonstrate that results obtained for samples are equivalent to the ones obtained using manual assay. It is recommended that the user validate periodically the instrument. If there is any difficulty in the programming and setting of Biokit automatic processors, please contact your distributor. PROCEDURE (see procedural flow chart) Previous operations Allow all the reagents to reach room temperature (20-25°C) before running the assay. Check the washing solution concentrate for the presence of salt crystals. If crystals have formed, resolubilize by warming at 37°C until crystals dissolve. Dilute 1:20 the washing solution as indicated in the washing step instructions. Use distilled or deionized water and only clean vessels to dilute the buffer. All other reagents are READY TO USE. Washing step instructions A good washing procedure is essential in order to obtain correct and precise analytical data. Is therefore recommended to use a good quality ELISA microplate washer, maintained at the best level of washing performances. In general no less than 5 automatic washing cycles of 350-400 µl/well are sufficient to avoid false positive reactions and high background. To avoid cross-contaminations of the plate with specimen or conjugate, after incubation do not discard the content of the wells but allow the microplate washer to aspirate it automatically. Assure that the microplate washer liquid dispensing channels are not blocked or contaminated and sufficient volume of washing solution is dispensing each time into the wells. In case of manual washing, we suggest to carry out 5 washing cycles, dispensing 350-400 µl/well and aspirating the liquid for 5 times. If poor results (higher background) are observed, increase the washing cycles or soaking time per well. In any case, the liquid aspirated out the strips should be treated with a sodium hypochlorite solution at a final concentration of 2.5% for 24 hours, before they are wasted in an appropriate way. The concentrated washing solution should be diluted 1:20 before use. If less than a whole plate is used, prepare the proportional volume of solution. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 4 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa Step 1 Preparation: Mark three wells as negative control (e.g. B1, C1, D1), two wells as positive control (e.g. E1 for HIV-1 and F1 for HIV-2) and one Blank (e.g. A1, neither samples or conjugate should be added into the Blank well). If the results will be determined by using dual wavelength plate reader, the requirement for use of Blank well could be omitted. Use only number of strips required for the test. Step 2 Adding Sample: Add 100 μl of samples, and 100 μl of positive and negative controls into their respective wells. NOTE: Use a separate disposable pipette tip for each specimen, negative and positive control as to avoid cross-contamination. Step 3 Incubating Sample: Cover the plate with the plate cover and incubate at 37°C for 30 ± 1 minutes. It is recommended to use thermostat-controlled water tank to assure the temperature stability and humidity during incubation. If dry incubator is used, do not open the door frequently. Step 4 Washing(1): After the end of the incubation, remove and discard the plate cover. Wash each well 5 (five) times with diluted Washing buffer. Each time allow the microwells to soak for 30-60 seconds. After the final washing cycle, turn down the plate onto blotting paper or clean towel and tap it to remove any remainders. Step 5 Adding Conjugate: Add 100 μl of conjugate reagent into each well except the Blank. Step 6 Incubating Conjugate: Cover the plate with the plate cover and incubate at 37°C for 30 ± 1 minutes. Step 7 Washing(2): As Step 4. Step 8 Coloring: Add 50 μl of chromogen A and 50 μl of chromogen B solutions into each well including the Blank. Incubate the plate at 37°C for 15 minutes avoiding light. The enzymatic reaction between the chromogen solutions and the conjugate produces blue color in positive control and HIV 1/2 positive sample wells. Step 9 Stopping Reaction: Using a multichannel pipette or manually, add 50 µl of stopping solution into each well and mix gently. Intensive yellow color develops in positive control and HIV 1/2 positive sample wells. Step 10 Measuring the Absorbance: Calibrate the plate reader with the Blank well and read the absorbance at 450 nm. If a dual filter instrument is used, set the reference wavelength at 620 nm or 630 nm. Calculate the cut-off value and evaluate the results. (NOTE: read the absorbance within 10 minutes after stopping the reaction). Quality control It is recommended that each laboratory must establish appropriate quality control system with quality control material similar to or identical with the patient sample being analyzed. - The Absorbance value of the Blank well, which contains only chromogen and stopping solution, must be less than 0.080 at 450 nm. The Absorbance value of the positive control must be ≥ 0.800 at 450/620-630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. Each individual absorbance value of the negative control must be less than 0.100 at 450/620-630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. If one of the negative control values does not meet the Quality Control criteria, it should be discarded and the mean value calculated again using the remaining two values. If more than one negative control Absorbance values do not meet the Quality Control Range specifications, the test is invalid and must be repeated. Results Each microplate should be considered separately when calculating and interpreting the results of the assay, regardless of the number of plates concurrently processed. The results are calculated by relating each specimen absorbance (S) value to the cut-off value (CO) of the plate. If the cut-off reading is based on single filter plate reader, the results should be calculated by subtracting the Blank well A value from the print report values of specimens and controls. In case the reading is based on dual filter plate reader, do not subtract the Blank well A value from the print report values of specimens and controls. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 5 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa Calculate the cut-off value by adding 0.120 to the mean absorbance of the negative control. Cut-off = NCx + 0.120 Example: Blank well Absorbance value: A1= 0.025 at 450 nm (NOTE: blanking is required only when reading with single filter at 450 nm). Well No.: Neg Ctrl: Well No.: Pos Ctrl: B1 0.012 E1 2.363 C1 0.010 F1 2.436 D1 0.011 All controls values are within the stated quality control range. Calculation of the NCx = (0.012 + 0.010 + 0.011)/3 = 0.011 Calculation of the cut-off: (CO) = 0.011 + 0.120 = 0.131 Interpretation of results Divide the sample absorbance by the cut-off value. (S/CO) Negative Results (S/CO < 1): Specimens giving absorbance less than the cut-off value are negative for this assay, which indicates that no anti-HIV 1/2 antibodies have been detected with bioelisa HIV-1+2 3.0 kit. A negative result does not exclude the possibility of exposure or infection with HIV. Positive Results (S/CO ≥ 1): Specimens giving an absorbance equal to or greater than the cut-off value are considered initially reactive, which indicates that anti-HIV 1/2 antibodies have probably been detected using bioelisa HIV-1+2 3.0. All initially reactive specimens should be retested in duplicates using bioelisa HIV-1+2 3.0 before the final assay results interpretation. Repeatedly reactive specimens can be considered positive for antibodies to HIV 1/2 with bioelisa HIV-1+2 3.0. Borderline (S/CO = 0.9-1.1): Specimens with absorbance to cut-off ratio between 0.9 and 1.1 are considered borderline and retesting of these specimens in duplicates is required to confirm the initial results. Follow-up, confirmation and supplementary testing of any positive specimen with other analytical system (e.g. WB, PCR) is required. Clinical diagnosis should not be established based on a single test result. It should integrate clinical and other laboratory data and findings. INITIAL RESULTS INTERPRETATION AND FOLLOW-UP ALL INITIALY REACTIVE OR BORDERLINE SAMPLES Rep. in duplicate ○,+○,+ ○,+○,- ○,-○,- Interpretation + Follow-up S/CO ≥ 0.9 Interpretation S/CO < 0.9 IND - IND = non interpretable - - If, after retesting of the initially reactive samples, both wells are negative results (S/CO < 0.9), these samples should be considered as non-repeatable positive (or, false positive) and recorded as negative. As with many very sensitive ELISA assays, false positive results can occur due to the several reasons, most of which are connected with, but not limited to, inadequate washing step. For more information regarding bioelisa troubleshooting, please refer to bioelisa Troubleshooting Guide. If after retesting in duplicates, one or both wells are positive results, the final result from this ELISA test should be recorded as repeatedly reactive. Repeatedly reactive specimens can be considered positive for antibodies to HIV 1/2 and therefore the patient is probably infected with HIV 1/2 and the blood unit must be discarded. After retesting in duplicates, samples with values close to the cut-off value should be interpreted with caution and considered as " borderline" zone sample, or uninterpretable for the time of testing. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 6 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa Limitations of the procedure 1. Positive results must be confirmed with another available method and interpreted in conjunction with the patient clinical information. 2. Antibodies may be undetectable during the early stage of the disease and in some immunosuppressed individuals. Therefore, negative results obtained with bioelisa HIV-1+2 3.0 are only indication that the sample does not contain detectable level of anti-HIV 1 or 2 antibodies and any negative result should not be considered as conclusive evidence that the individual is not infected with HIV 1 or 2. 3. The most common assay mistakes are: using kits beyond the expiry date, bad washing procedures, contaminated reagents, incorrect assay procedure steps, insufficient aspiration during washing, failure to add specimens or reagents, improper operation with the laboratory equipment, timing errors, the use of highly heamolysed specimens or specimens containing fibrin, incompletely clotted serum specimens. 4. The prevalence of the marker will affect the assay’s predictive values. 5. This assay cannot be utilize to test pooled (mixed) plasma. bioelisa HIV-1+2 3.0 has been evaluated only with individual serum or plasma specimens. 6. bioelisa HIV-1+2 3.0 is a qualitative assay and the results cannot be use to measure antibodies concentrations. This assay cannot distinguish between infections with HIV-1 and HIV-2. Performance characteristics Evaluation study carried in Alkmaar, the Netherlands, between April and November 2005, demonstrated the following performance characteristics of bioelisa HIV-1+2 3.0. The diagnostic specificity of the kit was 99.85% as determined on all negative samples (5471) that were investigated. When examined on the unselected donors only (random and first time donors), the specificity was 99.92% (95% CI 99.84-100%). bioelisa HIV-1+2 3.0 test results on unselected donors: Panel Number tested Random serum donor Random plasma donor First time donor 2,654 1,400 989 Total 5,043 Positive (S/CO ≥ 1) Number % 2 0.08 1 0.07 1 0.10 4 0.08 Negative (S/CO < 1) Number % 2,652 99.92 1,399 99.93 988 99.90 5,039 99.92 All panels of HIV-1, HIV-1 subtype O and HIV-2 confirmed antibody positive samples that were used in this study were also tested reactive with bioelisa HIV-1+2 3.0 which resulted in diagnostic sensitivity of 100%. A total of 32 seroconversion panels, which represent 210 samples tested. 13 samples not classified from PRB918 and PRB917 because there are not data of Antigen or RNA determination required for the classification. 41 samples classified as negative. RNA and or Antigen negative. 61 samples classified as early-seroconversion. 95 samples classified as seroconversion. The testing results also show that bioelisa HIV-1+2 3.0 is a state-of-the-art compare to most of the currently available on the market CE-marked tests. The analytical sensitivity was evaluated on PeliCheck anti-HIV panels. The analytical sensitivity of bioelisa HIV-1+2 3.0 on the PeliCheck anti-HIV standard dilutions was comparable to other anti-HIV assays. Analytical specificity: bioelisa HIV-1+2 3.0 test results on samples from hospitalised patients and samples containing potentially cross-reacting blood-specimens: BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 7 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa Type of sample Number tested Mononucleosis Pregnant woman RF+ Anti-TPO Anti-smooth muscle Elevated IgG Levels 296 101 17 5 5 4 Total 428 Positive (S/CO ≥ 1) Number % 4 1.35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 Negative (S/CO < 1) Number % 292 98.65 101 100 17 100 5 100 5 100 4 100 0.93 424 99.07 In a separate study, the following specificity results were obtained: - Possible high dose hook effect is eliminated due to the implementation of two-step procedure. Frozen positive/negative specimens have been tested to check for interferences due to collection and storage. The performance characteristics of bioelisa HIV-1+2 3.0 were not affected for at least 3 freeze/thaw cycles. Samples from patients infected with hepatitis A,B,C and E viruses as well as samples from patients infected with Treponema pallidum were tested with no cross-reactive reactions observed. 25 positive fresh serum samples tested in INSTITUTE FOR TROPICAL MEDICINE, BELGIUM have been tested with bioelisa HIV-1+2 3.0. All 25 positive fresh serum samples have been positive with bioelisa HIV-1+2 3.0. Accuracy: The below tables represent the results of analytical sensitivity and reproducibility of bioelisa HIV-1+2 3.0 as controlled with PeliSpyMulti-Marker run control and with Internal QC sample tested in every plate, the 1:2048 dilution of the anti-HIV standard in this PeliSpy sample was consistently detected in all plates. Internal QC sample was always detected in all plates. PeliSpyMulti-Marker results: Dilution n Average 1:2048 80 3.08 Percentiles 5 95th 1.76 4.39 Measured Min Max 1.70 4.96 th Internal QC sample results: A B C D E F G H n Average 160 7.71 Percentiles 5th 95th 5.32 10.10 Measured Min Max 4.37 10.89 EXAMPLE SCHEME OF CONTROL/SAMPLES DISPENSING 1 2 3 4 5 6 7 … … Blank SMP3 Neg … Neg … Neg Pos (HIV-1) Pos (HIV-2) SMP 1 SMP 2 BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 8 12 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa bioelisa: Troubleshooting guide Problem Possible causes Solution 1. Controls out of validation. 1a. Incorrect temperature, timing or pipetting. 1b. Improper preparation of reagents, error of dilution, reagents not well mixed. 1c. Cross-contamination of controls. Check procedure. Repeat assay. Check procedure. Repeat assay. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. No colour or only a light colour developed at the end of the assay. 2a. 2b. 2c. 2d. Pipette carefully. Do not interchange caps. Repeat assay. Incorrect reading filter. Check that the wavelenght of the filter used is 450 nm. If no reference 620 - 630 nm is used, absorbance increases approximately 0.050. Interference in the optical Check the reader. Clean or pathway. dry the bottom of microplate. Check for air bubbles. Repeat reading. Used components from Do not use components from different lots. different lots as they are adjusted for each batch released. Expired reagents. Check the kit expiry date. Use a non- expired kit. One or more reagents not Check procedure. Repeat added or added in wrong assay. sequence. Inactive conjugate: Check for contamination. improper conservation. Recheck procedure. Repeat assay. Inactive microplate: Always keep unused strips in Improper conservation. the bag very well closed, with the desiccant inside. Repeat assay. Inactive chromogen Use disposable containers or solutions A and/or B: wash with acid or ethanol and improper conservation. rinse with deionised water The container used affects before re-use. Recheck chromogen stability, cross- procedure. Repeat assay. contamination with the stopping solution. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 9 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa bioelisa: Troubleshooting guide Problem Possible causes 3. Too much colour in all microplate wells. 3a. Contaminated, oxidised chromogen solutions A and/or B 4. Poor reproducibility or high number of non-repeatable reactive samples. Solution Check that chromogen solutions A and B are colourless, discard if blue. Use acid or ethanol washed or disposable containers. Repeat assay. 3b. Contaminated or Check for contamination improperly prepared (turbid aspect). Check reagents. dilutions. Repeat assay. 3c. Contaminated washing Check the quality of distilled solution (1x). or deionised water used for dilution. Repeat assay. 3d. Insufficient washing Check the washing device. Fill or washing not consistent: wells with washing solution Filling volume and/or close to the top, aspirate aspiration insufficient completely. Increase the or not uniform. Insufficient number of wash cycles. number of washing After washing, blot the cycles, contaminated inverted microplate on tissue device. paper. 3e. Using of a washing Use only the washing solution solution from other kit. supplied with the kit. 4a. Washing problems. See 3c, 3d, 3e. 4b. Uncalibrated pipettes Use only calibrated pipettes, or tips not well fitted. with well fitted tips and pipette Improper pipetting. carefully, without bubbles and splashing. Repeat assay. 4c. Reagents and sera not Equilibrate reagents to room at room temperature or temperature and mix not well mixed before thoroughly before using. using. 4d. Air currents over the Keep the microplate protected microplate during from air currents. incubations. 4e. Too long time for addition Develop consistent and of samples and/or uniform technique. reagents. Inconsistency in time intervals. Air bubbles. 4f. Interference in the optical See 1e. pathway. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 10 3000-1168 R03 08.2015 eng 1293 bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 LEER CAMBIOS SOMBREADOS 3000-1168 1 x 96 TESTS 3000-1169 5 x 96 TESTS (480) Test de ELISA para la detección de anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) tipo 1 (grupos M-O) o tipo 2 en muestras de suero o plasma humano para ser utilizado en laboratorios clínicos y como análisis de cribado de primera línea en bancos de sangre. Sumario La demostración serológica de infección por HIV puede obtenerse comprobando la presencia de antígenos o anticuerpos HIV en el suero de personas con sospecha de infección por HIV. En general, el antígeno sólo se puede detectar en la fase aguda y en la fase sintomática del SIDA. Los anticuerpos frente a HIV-1 o HIV-2 pueden detectarse casi durante todo el periodo de infección, comenzando en la fase aguda o poco después de esta y manteniéndose hasta la fase terminal del SIDA. Por lo tanto, la utilización de análisis de anticuerpos altamente sensibles es el primer abordaje en el serodiagnóstico de la infección por HIV. Aparte de la transmisión sexual, la principal vía de infección por HIV es la transfusión de sangre. El HIV puede aparecer tanto en las fracciones globulares como en las no globulares de la sangre humana. Por ello deberían analizarse todas las donaciones de sangre o plasma debido al riesgo de transmisión de HIV a través de sangre contaminada. Esto se puede conseguir eficazmente mediante la detección de anticuerpos frente al HIV-1 y HIV-2 en pruebas ELISA de alta sensibilidad. Principio bioelisa HIV-1+2 3.0 es un método inmunoenzimático directo, tipo “sándwich”, de dos pasos de incubación, en donde los pocillos de un microplaca están recubiertos con antígenos recombinantes de HIV expresados en E. coli (recombinantes de HIV-1 gp41 y gp120 y recombinante de HIV-2 gp-36). A estos pocillos se les añade muestras de suero o plasma a analizar. Si en la muestra existen anticuerpos HIV-1/2 específicos, formarán complejos estables con los antígenos recombinantes del HIV. A continuación, se lavan los micropocillos para eliminar las proteínas séricas no ligadas. Se añade a los pocillos un segundo juego de antígenos recombinantes conjugados con la peroxidasa y que expresan los mismos epítopos. Durante la segunda fase de incubación, estos antígenos se unirán a los anticuerpos específicos capturados. Tras un segundo lavado para eliminar el conjugado no unido se añaden a los pocillos las soluciones de cromógeno. En los pocillos que contienen el inmunocomplejo "sándwich" antígeno-anticuerpo-antígeno, los cromógenos incoloros son hidrolizados por el conjugado ligado formando un producto de color azul. El color azul vira a amarillo tras bloquear la reacción con ácido sulfúrico. La intensidad del color es mensurable y proporcional a la concentración de anticuerpos anti-HIV 1/2 en la muestra. Los pocillos que contienen muestras negativas permanecen incoloros. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocillos recubiertos con antígenos HIV 1/2 recombinantes (HIV-1 recombinante gp41, gp120 y HIV-2 recombinante gp36). Las tiras de micropocillos son para UN SOLO USO. No utilizarla si el sellado al vacio ha sido dañado cuando se extrae por primera vez de la caja. 2. CONTROL + 1 CONTROL POSITIVO HIV-1: Anticuerpos frente a HIV-1 diluidos en tampón proteínico estabilizado. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como conservante y colorante rojo. Listo para usar. 3. CONTROL + 2 CONTROL POSITIVO HIV-2: Anticuerpos frente a HIV-2 diluidos en tampón proteínico estabilizado. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como conservante y colorante rojo. Listo para usar. 4. CONTROL – CONTROL NEGATIVO: Tampón proteínico estabilizado negativo frente a HBsAg y anticuerpos HIV-1, HIV-2, HCV y TP. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como conservante y colorante amarillo. Listo para usar. 5. CONJ CONJUGADO: Antígenos recombinantes HIV-1 y HIV-2 conjugados con peroxidasa. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como conservante y colorante rojo. Listo para usar. 6. WASH SOLN 20x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA: Tampón PBS concentrado de pH 7,4 (20x). Contiene Tween-20 como detergente. Diluir 1/20 en agua destilada o desionizada antes del uso. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 11 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa 7. CHROM A SOLUCIÓN DE CROMÓGENO A: Solución de peróxido de urea. Listo para usar. 8. CHROM B SOLUCIÓN DE CROMÓGENO B: Solución TMB (tetrametilbencidina disuelta en ácido cítrico). 9. H2SO4 0,5M SOLUCIÓN DE PARADA: Ácido sulfúrico 0,5M. Listo para usar. 10. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS: Para cubrir la microplaca durante las incubaciones. 11. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar las tiras sin usar. Precauciones bioelisa HIV-1+2 3.0 es para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. IVD ADVERTENCIA: En la preparación del control negativo del kit se han podido utilizar materiales de origen humano. Estos materiales se han analizado con kits analíticos de eficacia comprobada y su resultado ha dado negativo a anticuerpos frente a HIV 1/2, HCV, TP y HBsAg. No obstante, no existe ningún método analítico que garantice la total ausencia de agentes infecciosos en muestras o reactivos. Por tanto, los reactivos y las muestras deben manejarse con extrema precaución, como si pudieran transmitir enfermedades. Para la estabilización de los controles positivos y negativos se han utilizado sueros de origen bovino. La albúmina de suero bovino (ASB) y el suero fetal bovino (SFB) provienen de animales de áreas geográficas libres de EEB/EET. El Control Negativo, el Control Positivo HIV-1, el Control Positivo HIV-2 y el Conjugado contienen 0,1% de TM ProClin como conservante. A continuación se presentan las frases de riesgo (R) y de seguridad (S) aplicables: R43 Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. S26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. S28 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua. S36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. S45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). S60 Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. S61 Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad. Los análisis ELISA son sensibles al tiempo y la temperatura. Para evitar un resultado incorrecto, seguir estrictamente los pasos del procedimiento de prueba y no modificarlos. 1. No intercambiar reactivos de diferentes lotes ni usar reactivos de otros kits comerciales. Los componentes del kit están ajustados con precisión para ofrecer un rendimiento óptimo de los tests. 2. Comprobar que todos los reactivos se encuentran dentro del periodo de validez indicado en la caja del kit y que pertenecen al mismo lote. No usar nunca reactivos después de la fecha de caducidad declarada en las etiquetas o las cajas. 3. PRECAUCIÓN - PASO CRÍTICO: Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente (18-30°C) antes de su uso. Agitar suavemente el reactivo antes de usarlo. Llevar de nuevo a 2-8°C inmediatamente después del uso. 4. Usar sólo el volumen suficiente de muestra según lo indicado en los pasos del procedimiento. En caso contrario, el análisis puede perder sensibilidad. 5. No tocar la base exterior de los pocillos; las huellas de dedos o los arañazos pueden interferir en la lectura. Al efectuar la lectura de los resultados, asegurarse de que la base de la placa está seca y de que no existen burbujas de aire dentro de los pocillos. 6. No dejar secar nunca los pocillos de la microplaca después del paso de lavado. Pasar inmediatamente al siguiente paso. Evitar la formación de burbujas de aire al añadir los reactivos. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 12 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa 7. Evitar interrupciones muy prolongadas durante los pasos del análisis. Asegurar las mismas condiciones de trabajo en todos los pocillos. 8. Calibrar la pipeta con frecuencia para garantizar la exactitud de la dispensación de muestras/reactivos. Usar diferentes puntas de pipetas desechables con cada muestra y reactivo para evitar contaminaciones cruzadas. 9. Asegurar una temperatura de incubación de 37°C dentro del incubador. 10. Al añadir las muestras, no tocar la base del pocillo con la punta de la pipeta. 11. En la medición con un lector de placas, determinar la absorbancia a 450 nm o a 450/620-630 nm. 12. La actividad enzimática del conjugado podría resultar afectada por el polvo y reactivos y sustancias químicas como hipoclorito sódico, ácidos, álcalis, etc. No realizar el análisis en presencia de estas sustancias. 13. Si se utiliza un equipo totalmente automático durante la incubación, no cubrir las placas con la lámina adhesiva. También puede omitirse la acción de golpear la placa después del lavado para eliminar los restos que quedan dentro de ella. 14. Todas las muestras de origen humano deben considerarse potencialmente infecciosas. El cumplimiento estricto de las normas BPL (Buena Práctica de Laboratorio) puede garantizar la seguridad del personal. 15. No comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio de análisis. No pipetear las soluciones con la boca. 16. Los productos químicos deben manipularse y eliminarse sólo conforme a las normas BPL (Buena Práctica de Laboratorio) vigentes y a las regulaciones locales o nacionales. 17. Las puntas de pipetas, viales, tiras y envases de muestras deben recogerse y esterilizarse en autoclave durante no menos de 2 horas a 121°C o tratarse con hipoclorito sódico al 10% durante 30 minutos para descontaminar antes de desecharlas. Las soluciones que contienen hipoclorito sódico NUNCA deben esterilizarse en autoclave. Se dispondrá de una ficha de datos de seguridad (FDS). 18. Las materias primas de algunos reactivos pueden causar toxicidad, irritación, quemaduras o ser carcinógenos. Debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas, entre otros, con los siguientes reactivos: solución de parada, cromógenos y solución de lavado. SIGNOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DEL REACTIVO: Los valores de los controles positivo o negativo que se encuentren fuera de los límites de control de calidad indicados son indicadores de un posible deterioro de los reactivos o errores del operario o del instrumento. En tal caso los resultados deben considerarse no válidos y las muestras deben ser reanalizadas. En el caso de resultados erróneos constantes y deterioro o inestabilidad demostrados de los reactivos, sustituir inmediatamente estos por unos nuevos o ponerse en contacto con su distribuidor local o servicio técnico de Biokit para más información. Conservación y estabilidad Los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta y en el envase, si se almacenan entre 2-8°C y no se congelan. Para garantizar el máximo rendimiento del kit bioelisa HIV-1+2 3.0, durante el almacenamiento proteger los reactivos de la contaminación con microorganismos o productos químicos. Se pueden romper las tiras de micropocillos para usarlas por separado. Para el almacenamiento colocar los pocillos o tiras no utilizados en la bolsa de plástico sellable junto con el desecante y llevarlos de nuevo a 2-8°C. Una vez abierta, la microplaca es estable 1 mes a 2-8°C. Una vez abiertos, el control negativo, el control positivo HIV-1, el control positivo HIV-2, el conjugado, la solución de cromógeno A, la solución de cromógeno B y la solución de parada son estables 1 mes a 2-8°C. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante 1 semana a temperatura ambiente o durante 2 semanas a 2-8°C. Presentaciones disponibles Kit de 1 placa (96 tests), REF 3000-1168. Contiene: 1 placa, 1 x 1 ml control negativo, 1 x 1 ml control positivo HIV-1, 1 x 1 ml control positivo HIV-2, 1 x 12 ml conjugado, 1 x 50 ml solución de lavado, 1 x 8 ml solución cromógeno A, 1 x 8 ml solución cromógeno B, 1 x 8 ml solución de parada, 1 bolsa de plástico y láminas adhesivas (6 unidades). - Kit de 5 placas (5 x 96 tests), REF 3000-1169. Contiene: 5 placas, 3 x 1 ml control negativo, 3 x 1 ml control positivo HIV-1, 3 x 1 ml control positivo HIV-2, 5 x 12 ml conjugado, 2 x 125 ml solución de lavado, 1 x 60 ml solución cromógeno A, 1 x 60 ml solución cromógeno B, 1 x 60 ml solución de parada, 1 bolsa de plástico y láminas adhesivas (20 unidades). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 13 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa Material necesario no incluido Agua destilada o desionizada. Guantes desechables y cronómetro. Recipientes de desecho adecuados para materiales potencialmente contaminados. Palanganas desechables en forma de V. Sistema de dispensación o pipeta (simple o multicanal) y puntas de pipeta desechables. Paños absorbentes o toallitas secas. Incubador seco o baño maría, 37°C ± 1°C. Microagitador para disolver y mezclar el conjugado con las muestras. Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 ó 630 nm. Sistema de lavado manual o automático. Recogida, transporte y almacenamiento de muestras 1. No se necesita una preparación especial del paciente. Recoger la muestra conforme a la práctica normal de laboratorio. En este análisis se pueden utilizar muestras de suero o plasma fresco. Se puede recoger la sangre por venopunción para su coagulación natural y completa: el suero/plasma debe separarse del coágulo lo antes posible para evitar la hemólisis. Asegurarse de que las muestras séricas son transparentes y no están contaminadas por microorganismos. Eliminar cualquier partícula visible en la muestra por centrifugación a 3000 rpm (revoluciones por minuto) durante 20 minutos a temperatura ambiente o por filtración. 2. Pueden utilizarse muestras de plasma recogidas en EDTA, citrato sódico o heparina, aunque no deben utilizarse muestras muy lipémicas, ictéricas o hemolíticas, ya que pueden dar resultados falsos en el análisis. No usar muestras inactivadas, ya que se puede deteriorar el analito diana. No usar nunca muestras con contaminación microbiana visible. 3. bioelisa HIV-1+2 3.0 está diseñado para analizar ÚNICAMENTE muestras de suero o plasma. No usar para examinar muestras de cadáveres, saliva, orina u otros líquidos corporales, o sangre agrupada (mixta). 4. Transporte y almacenamiento: Almacenar las muestras a 2-8°C. Las muestras no necesarias para los análisis de los próximos 3 días deberán congelarse (-20°C o menos). Evitar repetir ciclos de congelación-descongelación. Para el envío embalar y etiquetar las muestras conforme a las normativas locales e internacionales existentes sobre transporte de muestras clínicas y sustancias etiológicas. Procesamiento automático Puede utilizarse un análisis automático o semiautomático con diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a las obtenidas con el análisis manual. Se recomienda al usuario la validación periódica del instrumento. Si tiene dificultades para programar y ajustar los procesadores automáticos Biokit, póngase en contacto con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Antes de iniciar el análisis, llevar todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25°C). Examinar el tampón de lavado concentrado en busca de sales cristalinas. Si se han formado cristales, disolver calentando a 37°C hasta que se disuelvan los cristales. Diluir 1:20 la solución de lavado según se indica en las instrucciones del paso de lavado. Usar agua destilada o desionizada y limpiar sólo los recipientes para diluir el tampón. Todos los demás reactivos están LISTOS PARA USAR. Instrucciones del paso de lavado Es esencial un buen lavado para obtener datos analíticos correctos y precisos. Por tanto, se recomienda usar un lavador de microplacas ELISA de buena calidad, mantenido en condiciones óptimas para ofrecer el mejor rendimiento de lavado. En general son suficientes no menos de 5 ciclos de lavado automático de 350-400 µl/pocillo para evitar reacciones falsas positivas y un ruido de fondo elevado. Para evitar contaminaciones cruzadas de la placa con las muestras o el conjugado, después de la incubación no desechar el contenido de los pocillos pero dejar que el lavador de microplacas lo aspire automáticamente. Asegurar que los canales de dispensación del líquido de lavado de las microplacas no estén obturados o contaminados y que continuamente se dispensa un volumen suficiente de solución de lavado en los pocillos. En el caso de lavado manual sugerimos realizar 5 ciclos de lavado que dispensen 350-400 µl/pocillo y aspiren el líquido 5 veces. Si se observan resultados insuficientes (ruido de fondo), aumentar los ciclos de lavado o el tiempo de inmersión por pocillo. En cualquier caso, el líquido aspirado de las tiras debe tratarse con una solución de hipoclorito sódico a una concentración final del 2,5% durante 24 horas, antes de eliminarlo adecuadamente. El tampón de lavado concentrado debe diluirse 1:20 antes del uso. Si no se utiliza la placa completa, preparar el volumen proporcional de la solución. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 14 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa Paso 1 Preparación: Marcar 3 pocillos como control negativo (p. ej., B1, C1, D1), 2 pocillos como control positivo (p. ej., E1 para HIV-1 y F1 para HIV-2) y un blanco (p. ej., A1; no deben añadirse muestras o conjugado en el pocillo del blanco). Si los resultados se determinarán utilizando el lector de placas de longitud de onda doble, puede suprimirse el uso del pocillo del blanco. Utilizar sólo el número de tiras necesarias para el test. Paso 2 Adición de la muestra: Añadir 100 μl de las muestras y 100 μl de los controles positivo y negativo en sus respectivos pocillos. NOTA: utilizar una punta de pipeta desechable nueva para cada muestra, control negativo y positivo para evitar la contaminación cruzada. Paso 3 Incubación de la muestra: Cubrir la placa con la lámina adhesiva e incubar a 37°C durante 30 ± 1 minutos. Se recomienda usar un recipiente con agua controlado con termostato para garantizar la estabilidad de la temperatura y la humedad durante la incubación. Si se utiliza un incubador seco, intentar abrir la puerta lo menos posible. Paso 4 Lavado (1): Después del final de la incubación, retirar y eliminar la lámina adhesiva de la placa. Lavar cada pocillo 5 (cinco) veces con solución de lavado diluida. Remojar cada vez los micropocillos durante 30-60 segundos. Después del ciclo de lavado final, volcar la placa sobre papel secante o un paño limpio y golpear para desprender los restos. Paso 5 Adición del conjugado: Añadir 100 μl del reactivo conjugado en cada pocillo excepto el del blanco. Paso 6 Incubación del conjugado: Cubrir la placa con la lámina adhesiva e incubar a 37°C durante 30 ± 1 minutos. Paso 7 Lavado (2): Como el Paso 4. Paso 8 Tinción: Añadir 50 μl de solución de cromógeno A y 50 μl de solución de cromógeno B en cada pocillo, incluido el blanco. Incubar la placa a 37°C durante 15 minutos en oscuridad. La reacción enzimática entre las soluciones de cromógeno y el conjugado produce un color azul en los pocillos del control positivo y de la muestra positiva a HIV-1/2. Paso 9 Parada de la reacción: Con una pipeta multicanal o manualmente, añadir 50 µl de solución de parada en cada pocillo y mezclar suavemente. Se desarrolla un color amarillo intenso en los pocillos del control positivo y de la muestra positiva a HIV-1/2. Paso 10 Medición de la absorbancia: Calibrar el lector de placas con el pocillo del blanco y efectuar la lectura de la absorbancia a 450 nm. Si se usa un instrumento de filtro doble, ajustar la longitud de onda de referencia a 620 nm o 630 nm. Calcular el valor umbral y evaluar los resultados. (NOTA: Efectuar la lectura de la absorbancia en el plazo máximo de 10 minutos después de parar la reacción). Control de calidad Se recomienda a los laboratorios establecer un sistema de control de calidad adecuado con material de control de calidad similar o idéntico a la muestra del paciente a analizar. - El valor de la absorbancia del pocillo del blanco, que contiene sólo solución de cromógeno y solución de parada, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm. El valor de la absorbancia del control positivo debe ser ≥ 0,800 a 450/620-630 nm o a 450 nm después de restar el blanco. Cada valor de la absorbancia individual del control negativo debe ser menor que 0,100 a 450/620-630 nm o a 450 nm después de restar el blanco. Si uno de los valores del control negativo no cumple los criterios del control de calidad, debe desecharse y calcular de nuevo el valor medio de los dos valores restantes. Si más de un valor de absorbancia del control negativo no cumple las especificaciones de los límites del control de calidad, el test no es válido y debe repetirse. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 15 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa Resultados Cada microplaca debe considerarse por separado para calcular e interpretar los resultados del análisis, independientemente del número de placas procesadas al mismo tiempo. Los resultados se calculan relacionando el valor de la absorbancia (S) de cada muestra con el valor umbral (CO) de la placa. Si la lectura del valor umbral se hace con el lector de placas de un solo filtro, los resultados se calcularán restando el valor del pocillo A del blanco de los valores de muestras y controles del informe impreso. En caso de que la lectura se efectúe con un lector de placas de filtro doble, no restar el valor del pocillo A del blanco de los valores de muestras y controles del informe impreso. Calcular el valor umbral añadiendo 0,120 a la absorbancia media del control negativo. Valor umbral = CNx + 0,120 Ejemplo: Valor de la absorbancia del pocillo del blanco: A1 = 0,025 a 450 nm (NOTA: el blanco sólo es necesario si se efectúa la lectura con un filtro simple a 450 nm). Pocillo n.º: Control negativo: Pocillo n.º: Control positivo: B1 0,012 E1 2,363 C1 0,010 F1 2,436 D1 0,011 Todos los valores de los controles se encuentran dentro del intervalo del control de calidad declarado. Cálculo de CNx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011 Cálculo del valor umbral: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131 Interpretación de los resultados Dividir la absorbancia de la muestra (S) por el valor umbral (S/CO). Resultados negativos (S/CO < 1): Las muestras que den una absorbancia inferior al valor umbral son negativas para este análisis, lo cual indica que no se han detectado anticuerpos anti-HIV-1/2 con el kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición a HIV o infección por este virus. Resultados positivos (S/CO ≥ 1): Las muestras que den una absorbancia igual o superior al valor umbral se consideran inicialmente reactivas, lo que indica que probablemente se han detectado anticuerpos anti-HIV-1/2 con bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas las muestras inicialmente reactivas deben reanalizarse por duplicado usando bioelisa HIV-1+2 3.0 antes de la interpretación final de los resultados analíticos. Las muestras repetidamente reactivas pueden considerarse positivas para anticuerpos frente a HIV-1/2 con bioelisa HIV-1+2 3.0. Dudosos (S/CO = 0,9-1,1): Las muestras con una relación absorbancia/valor umbral entre 0,9 y 1,1 se consideran dudosas y es necesario reanalizarlas por duplicado para confirmar los resultados iniciales. Es necesario seguir, confirmar y realizar análisis complementarios de cualquier muestra positiva con otro sistema analítico (p. ej., WB, PCR). El diagnóstico clínico no debe establecerse basándose en el resultado de un solo test, sino que debe integrar datos y resultados clínicos y analíticos. INTERPRETACIÓN INICIAL DE LOS RESULTADOS Y SEGUIMIENTO DE TODAS LAS MUESTRAS INICIALMENTE REACTIVAS O DUDOSAS Rep. por duplicado ○,+○,+ Interpretación + Seguimiento ○,+○,- ○,-○,- S/CO ≥ 0,9 S/CO < 0,9 Interpretación IND - IND = no interpretable BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 16 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa - - - Si después de reanalizar las muestras inicialmente reactivas ambos pocillos arrojan resultados negativos (M/VU < 0,9), estas muestras deben considerarse como positivas no repetibles (o positivos falsos) y registrarse como negativas. Al igual que con muchos análisis ELISA muy sensibles, pueden aparecer resultados falsos positivos por diversos motivos, la mayoría de ellos relacionados, entre otros, con un paso de lavado inadecuado. Para más información sobre la solución de problemas de bioelisa, consulte la Guía de Problemas. Si después de reanalizar los duplicados uno o ambos pocillos dan resultados positivos, el resultado final de este análisis ELISA se anotará como repetidamente reactivo. Las muestras repetidamente reactivas pueden considerarse positivas para anticuerpos frente a HIV-1/2 y, por tanto, el paciente está probablemente infectado con HIV-1/2 y deberá desecharse la unidad de sangre. Después de reanalizar los duplicados, las muestras con valores cercanos al valor umbral deben interpretarse con precaución y considerarse como muestra en zona "dudosa" no interpretable en el momento de la prueba. Limitaciones del procedimiento 1. Los resultados positivos deben confirmarse con otro método disponible e interpretarse conjuntamente con la información clínica del paciente. 2. Los anticuerpos pueden ser indetectables durante la fase temprana de la enfermedad y en algunas personas inmunodeprimidas. Por tanto, los resultados negativos obtenidos con bioelisa HIV-1+2 3.0 únicamente indican que la muestra no contiene un nivel detectable de anticuerpos anti-HIV-1/2 y el resultado negativo no debe considerarse una prueba concluyente de que la persona no está infectada por HIV-1 o -2. 3. Los errores más frecuentes del análisis son: uso de los kits después de su fecha de caducidad, procedimientos deficientes de lavado, reactivos contaminados, pasos incorrectos del procedimiento analítico, aspiración insuficiente durante el lavado, omitir la adición de muestras o reactivos, operación inadecuada con los equipos de laboratorio, errores de temporización, uso de muestras muy hemolizadas o de muestras que contienen fibrina o muestras de suero coaguladas de modo incompleto. 4. La prevalencia del marcador afectará al valor pronóstico del análisis. 5. Este análisis no puede utilizarse para analizar plasma conjunto (mixto). bioelisa HIV-1+2 3.0 sólo se ha evaluado con muestras de suero o plasma individuales. 6. bioelisa HIV-1+2 3.0 es un análisis cualitativo y los resultados no pueden utilizarse para medir concentraciones de anticuerpos. Este análisis no distingue entre infecciones por HIV-1 o HIV-2. Características funcionales El estudio de evaluación, realizado en Alkmaar, Países Bajos, entre abril y noviembre de 2005, demostró las siguientes características funcionales del bioelisa HIV-1+2 3.0. La especificidad diagnóstica del kit fue del 99,85%, determinado en todas las muestras negativas (5471) que fueron investigadas. Examinada sólo en donantes no seleccionados (donantes al azar y donantes por primera vez), la especificidad fue del 99,92% (IC 95%: 99,84-100%). Resultados del análisis bioelisa HIV-1+2 3.0 en donantes no seleccionados: Tipo de muestra Donante de suero al azar Donante de plasma al azar Donante por primera vez Total Cantidad examinada 2654 1400 989 5043 Positivas (S/CO ≥ 1) Número % 2 0,08 1 0,07 1 0,10 4 0,08 Negativas (S/CO < 1) Número % 2652 99,92 1399 99,93 988 99,90 5039 99,92 Todos las muestras positivas confirmadas para anticuerpos HIV-1, HIV-1 subtipo O y HIV-2 utilizadas en este estudio también fueron reactivas con bioelisa HIV-1+2 3.0 cuyo resultado fue una sensibilidad diagnóstica del 100%. Un total de 32 paneles de seroconversión, que representan 210 muestras analizadas. Hay 13 muestras no clasificadas de PRB918 y PRB917 porque no hay datos de antígeno o determinación de ARN necesarios para la clasificación. 41 muestras clasificadas como negativas. ARN y/o antígeno negativas. 61 muestras clasificadas como seroconversión temprana. 95 muestras clasificadas como seroconversión. Los resultados de las pruebas también muestran que bioelisa HIV-1+2 3.0 es un método de última generación comparable a la mayoría de los ensayos con marca CE disponibles en la actualidad en el mercado. Se evaluó la sensibilidad analítica en muestras anti-HIV PeliCheck. La sensibilidad analítica de bioelisa HIV-1+2 3.0 en las diluciones estándar anti-HIV PeliCheck fue comparable a la de otros análisis anti-HIV. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 17 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa Especificidad analítica: Resultados del análisis bioelisa HIV-1+2 3.0 en muestras de pacientes hospitalizados y muestras potenciales de contaminación cruzada: Cantidad examinada 296 101 17 5 5 Tipo de muestra Mononucleosis Mujeres embarazadas FR+ Anti-TPO Anti-músculo liso Concentraciones elevadas de IgG Total Positivas (S/CO ≥ 1) Número % 4 1,35 0 0 0 0 0 0 0 0 Negativas (S/CO < 1) Número % 292 98,65 101 100 17 100 5 100 5 100 4 0 0 4 100 428 4 0,93 424 99,07 En un estudio aparte se obtuvieron los siguientes resultados de la especificidad: - Con la implementación del procedimiento de dos pasos se elimina el posible efecto gancho de dosis elevada. Se han examinado muestras positivas/negativas congeladas para comprobar las interferencias derivadas de la recogida y el almacenamiento. Las características funcionales de bioelisa HIV-1+2 3.0 no resultaron afectadas durante al menos 3 ciclos de congelación/descongelación. Se examinaron muestras de pacientes infectados con virus de la hepatitis A, B, C y E y muestras de pacientes infectados con Treponema pallidum sin que se observasen reacciones cruzadas. 25 muestras de suero frescos positivos probadas en el INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL, BÉLGICA fueron examinadas con el bioelisa HIV-1+2 3.0. Las 25 muestras de sueros frescos positivos han sido positivas con el bioelisa HIV-1+2 3.0. Precisión: Las tablas siguientes representan los resultados de la sensibilidad analítica y la reproducibilidad de bioelisa HIV-1+2 3.0 controlado con el control de serie PeliSpyMulti-Marker y con una muestra de CC (control de calidad) interno examinada en cada placa; la dilución 1:2048 del patrón anti-HIV en esta muestra PeliSpy se detectó sistemáticamente en todas las placas. La muestra de CC interno se detectó siempre en todas las placas. Resultados de PeliSpyMulti-Marker: Dilución n Media 1:2048 80 3,08 Percentiles 5% 95% 1,76 4,39 Mín. 1,70 Medidos Máx. 4,96 Resultados de la muestra de CC interno: n Media 160 7,71 Percentiles 5% 95% 5,32 10,10 Mín. 4,37 Medidos Máx. 10,89 ESQUEMA DE EJEMPLO DE LA DISPENSACIÓN DE CONTROLES/MUESTRAS 1 2 3 4 5 6 7 … … 12 A Blanco SMP3 B Negativo … C Negativo … D Negativo E Positivo (HIV-1) F Positivo (HIV-2) G SMP 1 H SMP 2 BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 18 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa bioelisa: Guía de Problemas Problema Posibles causas Solución 1. Controles fuera de validación. 1a. Temperatura, incubación o pipeteo incorrecto. 1b. Preparación incorrecta de reactivos, error en las diluciones, reactivos no mezclados correctamente. 1c. Contaminación cruzada entre controles. Comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. Comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. Sin color o poco color al final del ensayo. 2a. 2b. 2c. 2d. Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Repetir el ensayo. Filtro de lectura Comprobar que el filtro de incorrecto. lectura sea de 450 nm. Si no se usa filtro de referencia de 620-630 nm, las absorbancias aumenta aprox. 0,050. Interferencia en el camino Comprobar el lector. Limpiar o óptico. secar el fondo de la microplaca. Comprobar la presencia de burbujas de aire. Repetir la lectura. Se han utilizado No utilizar componentes de componentes de lotes lotes diferentes puesto que diferentes están ajustados para cada lote en particular. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del kit y sus componentes. No utilizar un kit o reactivos caducados. Uno o más reactivos no Comprobar el procedimiento. añadidos o añadidos en Repetir el ensayo. secuencia incorrecta. Conjugado inactivo: Comprobar si ha habido conservación incorrecta. contaminación, comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. Microplaca inactiva: Mantener siempre las tiras no conservación incorrecta. utilizadas dentro de la bolsa bien cerrada, con el desecante dentro. Repetir el ensayo. Soluciones de cromógeno Usar contenedores A o B inactivas: desechables o lavados con conservación inadecuada. ácido o etanol y aclarar con El contenedor utilizado agua desionizada antes de afecta a la estabilidad del reutilizarlos. Comprobar el cromógeno, contaminación procedimiento. Repetir el cruzada con la solución de ensayo. parada. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 19 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa bioelisa: Guía de Problemas Problema Posibles causas 3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca. 3a. Soluciones de cromógeno Comprobar que las A o B oxidadas, soluciones de cromógeno A y contaminadas B son incoloras; desechar si son azules. Usar contenedores desechables o lavados con ácido o etanol. Repetir el ensayo. 3b. Reactivos contaminados Comprobar la contaminación o preparados de forma (aspecto turbio). Comprobar incorrecta las diluciones. Repetir el ensayo. 3c. Solución de lavado Comprobar la calidad del contaminada (1x). agua destilada o desionizada utilizada para preparar la dilución. Repetir el ensayo. 3d. Lavado insuficiente o no Comprobar el lavador. Llenar consistente: llenado o los pocillos con solución de aspiración insuficiente o lavado casi hasta arriba, no uniforme. Número aspirar totalmente. insuficiente de ciclos de Incrementar el número de lavado, dispositivo ciclos de lavado y tiempo contaminado. de remojo. Después de lavar, invertir la microplaca y secarla sobre papel secante. 3e. Se ha utilizado solución Usar únicamente la solución de lavado de otro de lavado suministrada con el fabricante. kit. 4a. Problemas de lavado. Véanse 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas o Usar únicamente pipetas puntas mal encajadas. calibradas, con puntas bien Técnica de pipeteo encajadas y pipetear con incorrecta. cuidado, sin burbujas ni salpicaduras. Repetir el ensayo. 4c. Reactivos y muestra no Atemperar muestras y llevados a temperatura reactivos y mezclarlos bien ambiente o mal antes de utilizarlos. mezclados antes de usar 4d. Corrientes de aire sobre Proteger la microplaca de las la microplaca durante las corrientes de aire. incubaciones. 4e. Tiempo de adición de Desarrollar una técnica muestras o reactivos uniforme y consistente. demasiado prolongado. Inconsistencia en los intervalos de tiempo. Burbujas de aire. 4f. Interferencia en el camino Véase 1e. óptico. 4. Reproducibilidad deficiente o número elevado de muestras reactivas no repetibles. Solución BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 20 3000-1168 R03 08.2015 spa 1293 bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN 3000-1168 1 x 96 TESTS 3000-1169 5 x 96 TESTS (480) ELISA-Test für den Nachweis von Antikörpern gegen Humane Immundefizienz-Viren (HIV) Typ 1 (Gruppe M-O) oder Typ 2 in humanen Serum- oder Plasmaproben zur Verwendung in klinischen Laboren und als Erstlinienassay in Blutbanken. Zusammenfassung Serologischer Beweis von Infektionen mit HIV kann durch Testen auf Vorhandensein von HIV-Antigenen oder -Antikörpern im Serum von Personen, bei denen eine HIV-Infektion vermutet wird, erfolgen. Antigene können normalerweise nur während der akuten Phase und der symptomatischen Phase von AIDS nachgewiesen werden. Die Antikörper gegen HIV-1 und/oder HIV-2 können praktisch während des gesamten Infektionszeitraums, beginnend kurz nach der akuten Phase, anhaltend bis zum Endstadium von AIDS, nachgewiesen werden. Deshalb ist der Gebrauch von hochempfindlichen Antikörper-Assays der Hauptansatz bei der Serodiagnose einer HIV-Infektion. Abgesehen von der sexuellen Übertragung ist der Hauptinfektionsweg mit HIV die Bluttransfusion. HIV kann sowohl in der zellulären als auch der zellfreien Fraktion von menschlichem Blut vorhanden sein. Deshalb sollten alle Blut- oder Plasmaspenden wegen des Risikos der HIV-Übertragung über infiziertes Blut getestet werden. Dies kann in wirksamer Weise durch Testen auf die Antiköper gegen HIV-1 und HIV-2 mittels hochempfindlicher ELISA-Tests erfolgen. Prinzip bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ein „Sandwich“-Enzym-Immunassay-Kit mit zwei Inkubationsphasen, bei welchem die Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit rekombinanten, in E. coli exprimierten HIV-Antigenen (rekombinantes HIV-1 gp41, gp120 und rekombinantes HIV-2 gp-36) beschichtet sind. Zu analysierende Serum- oder Plasmaproben werden in diese Vertiefungen hinzugefügt. Falls in der Probe spezifische HIV-1/2-Antikörper vorhanden sind, werden sie stabile Komplexe mit den rekombinanten HIV-Antigenen bilden. Die Vertiefungen werden dann gewaschen, um ungebundene Serumproteine zu entfernen. Ein zweites Set von rekombinanten Antigenen, konjugiert mit Peroxidase, welche dieselben Epitope exprimieren, werden in die Vertiefungen hinzugefügt. Während des zweiten Inkubationsschrittes werden diese Antigene an spezifische Capture-Antikörper binden. Nach dem zweiten Waschen zur Entfernung von ungebundenem Konjugat werden Chromogenlösungen in die Vertiefungen hinzugefügt. In Vertiefungen, welche den Antigen-Antiköper-Antigen-„Sandwich“-Immunkomplex enthalten, werden die farblosen Chromogene vom gebundenem Konjugat hydrolysiert und es entsteht ein blau gefärbtes Produkt. Nach Blockieren der Reaktion mit Schwefelsäure wechselt die blaue Färbung zu gelb. Die Intensität der Färbung kann gemessen werden und ist proportional zur Konzentration der HIV-1/2-Antikörper in der Probe. Vertiefungen, die negative Proben enthalten, bleiben farblos. Bestandteile 1. MCPL MIKROTITERPLATTE: 12 x 8 Vertiefungen beschichtet mit rekombinanten HIV 1/2-Antigenen (rekombinantes HIV-1 gp41, gp120 und rekombinantes HIV-2 gp36). Die Mikrotiterstreifen sind nur zum EINMALGEBRAUCH bestimmt. Nicht verwenden, wenn bei erstmaliger Entnahme aus der Box die Vakuumversiegelung beschädigt ist. 2. CONTROL + 1 HIV-1-POSITIVKONTROLLE: HIV-1-Antikörper gelöst in proteinstabilisierendem Puffer. Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig. 3. CONTROL + 2 HIV-2-POSITIVKONTROLLE: HIV-2-Antikörper gelöst in proteinstabilisierendem Puffer Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig. 4. CONTROL – NEGATIVE KONTROLLE: Proteinstabilisierender Puffer negativ getestet für HBsAg, and HIV-1,HIV-2, HCV und TP-Antikörper. Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel und gelben Farbstoff. Gebrauchsfertig. 5. CONJ KONJUGAT: HIV-1 und HIV-2 rekombinante Antigene konjugiert mit Peroxidase. Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig. 6. WASH SOLN 20x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG: PBS-Pufferkonzentrat pH 7,4 (20x). Enthält Tween-20 als Waschmittel. Vor der Anwendung 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnen. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 21 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa 7. CHROM A CHROMOGENLÖSUNG A: Harnstoffperoxidlösung. Gebrauchsfertig. 8. CHROM B CHROMOGENLÖSUNG B: TMB-Lösung (Tetramethylbenzidin gelöst in Zitronensäure). 9. H2SO4 0,5M STOPPLÖSUNG: 0,5M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. 10. SEALS HAFTFOLIEN: Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationen. 11. BAG WIEDERVERSCHLIEßBARER FOLIENBEUTEL: Zur Lagerung unbenutzter Streifen. Vorsichtsmaßnahmen bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal. IVD WARNHINWEIS: Humane Materialien können für die Zubereitung der negativen Kontrollen des Kits verwendet worden sein. Diese Materialien wurden mit Testkits mit einer akzeptierten Leistungsfähigkeit getestet und für negativ auf Antikörper gegen HIV 1/2, HCV, TP und HBsAg befundet worden. Es gibt jedoch keine analytische Methode, die versichern kann, dass infektiöse Agenzien in den Proben oder Reagenzien komplett fehlen. Deshalb sind Reagenzien und Proben mit extremer Vorsicht, als wären sie imstande, infektiöse Krankheiten zu übertragen, zu behandeln. Rinderseren wurden angewendet, um positive und negative Kontrollen zu stabilisieren. Rinderalbumin (BSA) und fetales Kälberserum (FKS) stammen von Tieren aus BSE/TSE-freien Gebieten. Negative Kontrolle, HIV-1-Positivkontrolle, HIV-2-Positivkontrolle und Konjugat enthalten 0,1% ProClinTM als Konservierungsmittel. Die zutreffenden Risiko- (R) und Sicherheitssätze (S) sind nachfolgend aufgeführt: R43 Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. S26 Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. S28 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser. S36/37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). S60 Dieses Produkt und sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. S61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen einholen/Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen. Die ELISA-Assays sind zeit- und temperaturempfindlich. Folgen Sie genau den Arbeitsschritten des Tests und verändern Sie diese nicht, um falsche Ergebnisse zu vermeiden. 1. Tauschen Sie keine Reagenzien von verschiedenen Chargen oder verwenden Sie keine Reagenzien von anderen im Handel erhältlichen Kits. Die Bestandteile des Kits sind für optimale Ergebnisse der Tests genau aufeinander abgestimmt. 2. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien innerhalb der auf der Schachtel des Kits angegebenen Gültigkeit liegen und zur gleichen Charge gehören. Verwenden Sie niemals Reagenzien nach Ablauf des auf den Aufklebern oder Schachteln angegebenen Haltbarkeitsdatums. 3. ACHTUNG - ENTSCHEIDENDER SCHRITT: Warten Sie vor Gebrauch ab, bis Reagenzien und Proben Raumtemperatur (18-30°C) erreicht haben. Vor Anwendung vorsichtig schütteln. Sofort nach Gebrauch wieder bei 2-8°C aufbewahren. 4. Benutzen Sie nur ausreichende Volumina von Proben, wie in den Arbeitsschritten beschrieben. Wenn dies nicht erfolgt, kann das eine niedrige Sensitivität des Assays zur Folge haben. 5. Berühren Sie nicht den Boden der Vertiefungen von außen, da sich Fingerabdrücke und Kratzer störend auf das Lesen auswirken können. Stellen Sie beim Lesen der Ergebnisse sicher, dass der Boden der Platte trocken ist und sich keine Luftblasen in den Vertiefungen befinden. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 22 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa 6. Lassen Sie niemals zu, dass die Vertiefungen der Mikrotiterplatte nach dem Waschschritt komplett austrocknen. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Vermeiden Sie beim Hinzufügen der Reagenzien, dass sich Luftblasen bilden. 7. Vermeiden Sie lange Unterbrechungen zwischen Arbeitsbedingungen für alle Vertiefungen sicher. 8. Kalibrieren Sie die Pipette regelmäßig, um die Genauigkeit bei der Verteilung der Proben/Reagenzien sicherzustellen. Verwenden Sie unterschiedliche Einmal-Pipettenspitzen für jede Probe und jedes Reagens, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. 9. Stellen Sie sicher, dass die Inkubationstemperatur im Inkubator 37°C beträgt. den Arbeitsschritten. Stellen Sie die gleichen 10. Berühren Sie beim Hinzufügen der Proben den Boden der Vertiefungen nicht mit der Pipettenspitze. 11. Bestimmen Sie die Absorption bei 450 nm oder bei 450/620-630 nm, wenn Sie mit einem Plattenlesegerät messen. 12. Die enzymatische Aktivität des Konjugats kann durch Staub und reaktionsfähige Chemikalien und Substanzen wie Natriumhypochlorit, Säuren, Basen etc. beeinflusst werden. Führen Sie den Assay nicht in Gegenwart dieser Substanzen durch. 13. Bedecken Sie während der Inkubation die Platten nicht mit der Haftfolie, falls Sie automatisierte Ausrüstung benutzen. Das Abklopfen der Rückstände innerhalb der Platte nach dem Waschen kann ebenfalls weggelassen werden. 14. Alle Proben humanen Ursprungs sollten als potentiell infektiös betrachtet werden. Genaues Einhalten von GLP-Richtlinien (Gute Laborpraxis) kann die persönliche Sicherheit gewährleisten. 15. Essen, trinken, rauchen Sie niemals und tragen Sie niemals Kosmetika im Assaylabor auf. Pipettieren Sie keine Lösungen mit dem Mund. 16. Chemikalien sollten nur in Übereinstimmung mit den derzeitigen GLP-Richtlinien (Gute Laborpraxis) sowie den lokalen und nationalen Gesetzgebungen angewendet und entsorgt werden. 17. Die Pipettenspitzen, Reagenzgläser, Streifen und Probenbehälter sollten gesammelt und zur Dekontamination vor der Entsorgung für mindestens 2 Stunden bei 121°C autoklaviert bzw. 30 Minuten mit 10% Natriumhypochlorit behandelt werden. Lösungen die Natriumhypochlorit sollten NIEMALS autoklaviert werden. Das Material-Sicherheitsdatenblatt (MSDS) ist auf Anfrage erhältlich. 18. Einige Reagenzien können Toxizität, Irritation, Verätzungen verursachen oder haben als Ausgangsstoffe krebserregende Wirkung. Kontakt mit der Haut und der Schleimhaut sollte vermieden werden, aber ist nicht beschränkt auf die folgenden Reagenzien: Stopplösung, Chromogene und Waschpuffer. INDIKATOREN FÜR INSTABILITÄTSSCHÄDIGUNG DER REAGENZIEN: Werte der positiven oder negativen Kontrolle, die außerhalb des angegebenen Qualitätskontrollbereichs liegen, sind Indikatoren für eine mögliche Schädigung der Reagenzien und/oder Anwender und/oder Gerätefehler. In diesem Fall sollten die Ergebnisse als ungültig betrachtet werden und die Proben müssen nochmals getestet werden. Im Fall von konstant fehlerhaften Ergebnissen und nachgewiesener Schädigung oder Instabilität der Reagenzien ersetzen Sie die Reagenzien umgehend durch neue oder nehmen Sie für weitere Hilfe Kontakt zu Ihrem lokalen Händler oder dem Technischen Support von biokit auf. Lagerung und Stabilität Die Bestandteile des Kits bleiben bis zum Ende des auf dem Aufkleber und der Verpackung angegebenen Haltbarkeitsdatums stabil, wenn sie zwischen 2-8°C gelagert werden. Frieren Sie das Kit nicht ein. Schützen Sie die Reagenzien während der Lagerung vor Kontamination mit Mikroorganismen oder Chemikalien, um die maximale Leistung des bioelisa HIV-1+2 3.0 Kits zu gewährleisten. Die Mikrotiterplattenstreifen können zum separaten Gebrauch abgetrennt werden. Lagern Sie unbenutzte Vertiefungen oder Streifen in den wiederverschließbaren Folienbeuteln zusammen mit dem Trocknungsmittel bei 2-8°C. Nachdem die Mikrotiterplatte geöffnet wurde, ist sie einen Monat lang bei 2-8°C stabil. Die negativ Kontrolle, HIV-1-Positivkontrolle, HIV-2-Positivkontrolle, Konjugat, Chromogenlösung A, Chromogenlösung B und Stopplösung sind nach dem Öffnen einen Monat lang bei 2-8°C stabil. Die Waschlösung ist nach dem Verdünnen eine Woche lang bei Raumtemperatur und zwei Wochen lang bei 2-8°C stabil. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 23 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa Packungsinhalt Kit mit 1 Mikrotiterplatte (96 Tests), REF 3000-1168. Enthält: 1 Mikrotiterplatte, 1 x 1 ml negative Kontrolle, 1 x 1 ml HIV-1-Positivkontrolle, 1 x 1 ml HIV-2-Positivkontrolle, 1 x 12 ml Konjugat, 1 x 50 ml Waschlösung, 1 x 8 ml Chromogenlösung A, 1 x 8 ml Chromogenlösung B, 1 x 8 ml Stopplösung, 1 Folienbeutel und Haftfolien (6 Einheiten). - Kit mit 5 Mikrotiterplatten (5 x 96 Tests), REF 3000-1169. Enthält: 5 Mikrotiterplatten, 3 x 1 ml negative Kontrolle, 3 x 1 ml HIV-1-Positivkontrolle, 3 x 1 ml HIV-2-Positivkontrolle, 5 x 12 ml Konjugat, 2 x 125 ml Waschlösung, 1 x 60 ml Chromogenlösung A, 1 x 60 ml Chromogenlösung B, 1 x 60 ml Stopplösung, 1 Folienbeutel und Haftfolien (20 Einheiten). Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material Destilliertes oder entionisiertes Wasser. Wegwerfhandschuhe und Zeitmesser. Geeignete Abfallbehälter für potentiell kontaminierte Materialien. V-förmige Wegwerfwannen. Dosiersystem und/oder Pipette (Ein- oder Mehrkanal) und Wegwerfpipettenspitzen. Saugpapier oder sauberes Handtuch. Trockeninkubator oder Wasserbad, 37 ± 1°C. Mikroshaker zum Auflösen und Mischen der Konjugate mit den Proben. Lesegerät für Mikrotiterplatten mit einem 450 nm Filter. Referenzfilter von 620 nm oder 630 nm sind zu empfehlen. Manuelles oder automatisiertes Waschsystem. Entnahme, Transport und Lagerung der Proben 1. Keine besondere Patientenvorbereitung erforderlich. Probenentnahme in Übereinstimmung mit der normalen Laborpraxis. Es können entweder frische Serum- oder Plasmaproben für diesen Assay benutzt werden. Durch Venenpunktion entnommenes Blut sollte man natürlich und vollständig gerinnen lassen – das Serum/Plasma muss so früh wie möglich von dem Koagulat separiert werden, um Hämolyse zu vermeiden. Dies sollte vorsichtig erfolgen, um sicherzustellen, dass die Serumprobe klar und nicht durch Mikroorganismen verunreinigt ist. Jegliche sichtbare Partikel sollten durch Zentrifugation bei 3000 rpm (Umdrehungen pro Minute) für 20 Minuten bei Raumtemperatur oder durch Filtration entfernt werden. 2. In EDTA entnommene Plasmaproben, Natriumcitrat oder Heparin können verwendet werden, jedoch sollten hochgradig lipämische, ikterische oder hämolytische Proben nicht verwendet werden, da sie falsche Ergebnisse im Assay ergeben können. Verwenden Sie keine inaktivierten Proben. Dies kann zur Schädigung des Zielanalyts führen. Proben mit sichtbarer mikrobieller Verunreinigung sollten nie verwendet werden. 3. bioelisa HIV-1+2 3.0 ist NUR zum Testen von Serum- oder Plasmaproben vorgesehen. Nicht zum Testen von Leichenproben, Speichel, Urin oder anderen Körperflüssigkeiten oder Mischblut verwenden. 4. Transport und Lagerung: Lagern Sie die Proben bei 2-8°C. Proben, die nicht dazu vorgesehen sind innerhalb von 3 Tagen untersucht zu werden, sollten eingefroren werden (-20°C oder niedriger). Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Zum Versand sollten die Proben gemäß den lokalen und internationalen Gesetzen zum Transport von klinischen Proben und ätiologisch Agenzien verpackt und gekennzeichnet werden. Automatisierte Verarbeitung Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler in Verbindung. DURCHFÜHRUNG (siehe schematischer Ablauf) Vorbereitung Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur (20-25°C) gebracht worden sein. Überprüfen Sie das Waschpufferkonzentrat auf das Vorhandensein von Salzkristallen. Erwärmen Sie auf 37°C, falls sich Kristalle gebildet haben, um diese aufzulösen. Verdünnen Sie den Waschpuffer 1:20 wie in der Anleitung zum Wascharbeitsschritt beschrieben. Benutzen Sie destilliertes oder entionisiertes Wasser und reinigen Sie die Gefäße nur, um den Puffer zu verdünnen. Alle anderen Reagenzien sind GEBRAUCHSFERTIG. Waschschritt-Anleitung Eine gutes Waschverfahren ist unverzichtbar, um korrekte und genaue analytische Daten zu erhalten. Daher wird empfohlen, ein ELISA-Mikrotiterplattenwaschgerät von guter Qualität zu benutzen, das auf dem besten Level von Waschleistung arbeitet. Im Allgemeinen sind nicht weniger als 5 automatisierte Waschzyklen 350-400 µl/Vertiefung ausreichend, um falsch-positive Reaktionen und laute Hintergrundgeräusche zu vermeiden. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 24 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa Verwerfen Sie den Inhalt der Vertiefungen nicht nach der Inkubation, sondern lassen Sie ihn automatisch vom Waschgerät aspirieren, um Kreuzkontaminationen der Platte mit Probe oder Konjugat zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeitsverteilkanäle des Mikrotiterplattenwaschgeräts nicht verstopft oder verunreinigt sind und dass jedes Mal ausreichend Volumen von Waschpuffer in die Vertiefungen dosiert wird. Im Falle von manuellem Waschen empfehlen wir 5 Waschzyklen durchzuführen und 350-400 µl/Vertiefung zu dosieren und die Flüssigkeit fünfmal zu aspirieren. Erhöhen Sie die Waschzyklen sowie die Durchtränkungszeit pro Vertiefung, falls schlechte Ergebnisse (hoher Hintergrund) beobachtet werden. Auf jeden Fall sollte die aus den Streifen aspirierte Flüssigkeit mit Natriumhypochlorit in einer Konzentration von 2,5% für 24 Stunden behandelt werden, bevor sie in geeigneter Weise entsorgt wird. Das Waschpufferkonzentrat sollte vor Verwendung 1:20 verdünnt werden. Bereiten Sie das proportionale Volumen der Lösung vor, falls weniger als die gesamte Platte benutzt wird. Schritt 1 Vorbereitung: Markieren Sie drei Vertiefungen als negative Kontrolle (z. B. B1, C1, D1), zwei Vertiefungen als positive Kontrolle (z. B. E1 für HIV-1 und F1 für HIV-2) und eine Blindprobe (z. B. A1, weder Proben noch Konjugat sollten in die Vertiefung der Blindprobe hinzugefügt werden). Wenn die Ergebnisse mit einem dualen Wellenlängenplattenlesegerät bestimmt werden, kann die Forderung für den Gebrauch einer Blindprobe weggelassen werden. Benutzen Sie nur die Anzahl der Vertiefungen, die Sie für den Test benötigen. Schritt 2 Hinzufügen der Probe: Füllen Sie 100 μl der Probe sowie 100 μl der positiven und negativen Kontrolle in die entsprechenden Vertiefungen. ANMERKUNG: Benutzen Sie eine Einmal-Pipettenspitze für jede Probe, negative und positive Kontrolle, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Schritt 3 Inkubation der Probe: Bedecken Sie die Platte mit der Haftfolie und inkubieren Sie sie bei 37°C für 30 ± 1 Minuten. Es wird empfohlen, einen thermostatkontrollierten Wasserbehälter zu verwenden, um die Temperaturstabilität und Luftfeuchte während der Inkubation zu gewährleisten. Öffnen Sie die Tür nicht oft, falls ein Trockeninkubator benutzt wird. Schritt 4 Waschen (1): Entfernen Sie nach Ende der Inkubation die Haftfolie und verwerfen Sie sie. Waschen Sie jede Vertiefung 5 (fünf) Mal mit verdünntem Waschpuffer. Erlauben Sie jeweils 30-60 Sekunden Durchtränken der Vertiefungen. Drehen Sie nach dem letzten Waschgang die Platte auf Saugpapier oder ein sauberes Handtuch um und entfernen Sie jegliche Reste. Schritt 5 Konjugat hinzufügen: Fügen Sie 100 μl des Konjugats in jede Vertiefung außer der Blindprobe hinzu. Schritt 6 Inkubation des Konjugats: Bedecken Sie die Platte mit der Haftfolie und inkubieren Sie bei 37°C für 30 ± 1 Minuten. Schritt 7 Waschen (2): Wie Schritt 4. Schritt 8 Färben: Fügen Sie 50 μl Chromogen A- und 50 μl Chromogen B-Lösung in jede Vertiefung einschließlich der Blindprobe hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37°C für 15 Minuten im Dunkeln. Die Enzymreaktion zwischen den Chromogenlösungen und dem Konjugat produziert eine Blaufärbung in der positiven Kontrolle und den Vertiefungen der HIV 1/2-positiven Proben. Schritt 9 Stoppreaktion: Füllen Sie die 50 µl Stopplösung unter Verwendung einer Multikanalpipette oder manuell in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig. Die positive Kontrolle und HIV 1/2-positive Proben entwickeln eine intensive Gelbfärbung. Schritt 10 Messen der Absorption: Kalibrieren Sie das Plattenlesegerät mit der Blindprobe und lesen Sie die Absorption bei 450 nm. Stellen Sie die Referenzwellenlänge auf 620 nm oder 630 nm, falls ein Instrument mit dualem Filter benutzt wird. Berechnen Sie den Grenzwert und bewerten Sie die Ergebnisse. (ANMERKUNG: messen Sie die Extinktion innerhalb von max. 10 Minuten nach Beenden der Reaktion). Qualitätskontrolle Es wird empfohlen, dass jedes Labor ein geeignetes System zur Qualitätskontrolle etabliert, mit Materialien zur Qualitätskontrolle, die ähnlich oder identisch zu den analysierten Patientenproben sind. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 25 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa - Der Extinktionswert der Blindprobe, welche nur Chromogen und Stopplösung enthält, muss weniger als 0,080 bei 450 nm betragen. Der Extinktionswert der positiven Kontrolle muss ≥ 0,800 bei 450/620-630 nm oder bei 450 nm nach Subtrahieren der Blindprobe sein. Jeder individuelle Extinktionswert der negativen Kontrolle muss weniger als 0,100 bei 450/620-630 nm oder bei 450 nm nach Subtrahieren der Blindprobe sein. Falls ein Wert der negativen Kontrollen die Kriterien der Qualitätskontrolle nicht erfüllt, sollte er verworfen werden und der Mittelwert wieder aus den beiden verbleibenden Werten berechnet werden. Falls mehr als ein Extinktionswert der negativen Kontrollen die Kriterien des Qualitätskontrollbereichs nicht erfüllen, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. Ergebnisse Jede Mikrotiterplatte muss für die Berechnung und Interpretation der Ergebnisse des Assays separat betrachtet werden, ungeachtet dessen, wie viele Platten gleichzeitig verarbeitet wurden. Die Ergebnisse werden berechnet, indem der Extinktionswert (S) jeder Probe mit dem Grenzwert (CO) der Platte ins Verhältnis gesetzt wird. Falls der Grenzwert auf einem Einfilterplattenlesegerät beruht, sollten die Ergebnisse berechnet werden, indem der A-Wert der Blindprobe von den Werten des Druckberichts für Proben und Kontrollen subtrahiert wird. Subtrahieren Sie den A-Wert der Blindprobe nicht von den Werten des Druckberichts für Proben und Kontrollen, für den Fall, dass die Messungen auf einem Dualfilterplattenlesegerät basieren. Berechnen Sie den Grenzwert, indem Sie zur durchschnittlichen Extinktion der negativen Kontrolle 0,120 addieren. Grenzwert = NKx + 0,120 Beispiel: Extinktionswert der Blindprobe: A1= 0,025 bei 450 nm (Anmerkung: Blindprobe ist nur bei Messung mit Einzelfilter bei 450 nm erforderlich). Vertiefung-Nr.: Neg Kontrolle: Vertiefung-Nr.: Pos Kontrolle: B1 0,012 E1 2,363 C1 0,010 F1 2,436 D1 0,011 Alle Kontrollwerte liegen innerhalb des angegebenen Qualitätskontrollbereichs. Berechnung von NKx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011 Berechnung des Grenzwertes: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131 Auswertung der Ergebnisse Dividieren Sie die Probenextinktion durch den Grenzwert (S/CO). Negative Ergebnisse (S/CO < 1): Proben, die eine geringere Extinktion als den Grenzwert ergeben, sind in diesem Assay negativ, was anzeigt, dass keine Anti-HIV1/2-Antikörper mit dem bioelisa HIV-1+2 3.0 Kit nachgewiesen wurden. Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit der Exponierung oder Infektion mit HIV nicht aus. Positive Ergebnisse (S/CO ≥ 1): Proben, die eine Extinktion ergeben, die genauso groß oder größer als der Grenzwert ist, werden als zunächst als reaktiv betrachtet, was anzeigt, dass Anti-HIV1/2-Antikörper möglicherweise mit bioelisa HIV-1+2 3.0 nachgewiesen wurden. Alle zunächst reaktiven Proben sollten vor der abschließenden Interpretation der Assayergebnisse in Doppelwerten wiederholt mittels bioelisa HIV-1+2 3.0 getestet werden. Wiederholt reaktive Proben können als positiv für Antikörper gegen HIV-1/2 mit bioelisa HIV-1+2 3.0 betrachtet werden. Zweifelhafte Ergebnisse (S/CO = 0,9-1,1): Proben mit dem Verhältnis von Extinktion zu -Grenzwert zwischen 0,9 und 1,1 werden als zweifelhaft betrachtet. Wiederholtes Testen dieser Proben in Doppelwerten ist erforderlich, um das erste Ergebnis zu bestätigen. Follow-up, Bestätigung und zusätzliches Testen jeder positiven Probe mit einem anderen Testsystem (z. B. WB, PCR) ist erforderlich. Die klinische Diagnose sollte nicht auf einem einzelnen Testergebnis beruhen. Sie sollte klinische und andere Laborwerte und Befunde einbeziehen. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 26 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa INTERPRETATION DER ERSTERGEBNISSE UND FOLLOW-UP ALLER ZUNÄCHST REAKTIVEN ODER ZWEIFELHAFTEN PROBEN Rep. Als Doppelwert ○,+○,+ Interpretation + Follow-up ○,+○,- ○,-○,- S/CO ≥ 0,9 Interpretation S/CO < 0,9 IND - IND = nicht interpretierbar - - - Falls nach wiederholtem Testen von zunächst reaktiven Proben beide Vertiefungen ein negatives Ergebnis aufweisen (S/CO < 0,9), sollten diese Proben als nicht-wiederholt positiv betrachtet werden (oder fasch-positiv) und als negativ verzeichnet werden. Wie bei vielen sehr empfindlichen ELISA-Assays können falsch-positive Ergebnisse aus verschiedenen Gründen auftreten; die meisten stehen in Zusammenhang mit unzureichendem Waschschritt, beschränken sich aber nicht darauf. Für weitere Informationen bezüglich bioelisa-Troubleshooting konsultieren Sie bitte den bioelisa Leitfaden zur Problemlösung. Falls nach wiederholtem Testen in Doppelwerten eine oder beide Vertiefungen ein positives Ergebnis haben, sollte das Endergebnis dieses ELISA-Tests als wiederholt reaktiv verzeichnet werden. Wiederholt reaktive Proben können als positiv für Antikörper gegen HIV-1/2 betrachtet werden und deshalb ist der Patient wahrscheinlich mit HIV-1/2 infiziert und das Blut muss verworfen werden. Nach wiederholtem Testen in Doppelwerten sollten Proben mit Werten nahe am Grenzwert mit Vorsicht interpretiert werden und als „zweifelhafte“ Probe oder als nicht interpretierbar für den Testzeitraum betrachtet werden. Begrenzung der Methode 1. Positive Ergebnisse müssen mittels einer anderen erhältlichen Methode bestätigt und in Zusammenhang mit den klinischen Informationen zum Patienten interpretiert werden. 2. Antikörper können während des frühen Krankheitsstadiums und bei immunsupprimierten Personen nicht nachweisbar sein. Deshalb sind negative Ergebnisse, die mit bioelisa HIV-1+2 3.0 erhalten wurden, nur ein Indiz, dass die Probe keine nachweisbaren Level von Anti-HIV-1- oder HIV-2-Antikörper enthält, und alle negativen Ergebnisse sollten nicht als endgültiger Beweis betrachtet werden, dass eine Person nicht mit HIV-1 oder -2 infiziert ist. 3. Die häufigsten Assay-Fehler sind: Anwenden von Kits nach Ablaufen des Haltbarkeitsdatums, schlechtes Waschverfahren, verunreinigte Reagenzien, falsche Assay-Arbeitsschritte, ungenügende Aspiration während des Waschens, Fehler beim Hinzufügen von Proben oder Reagenzien, unangebrachte Anwendung von Laborinstrumenten, Zeitfehler, Anwendung von stark hämolysierten Proben oder Proben, die Fibrin enthalten, unvollständig geronnene Serumproben. 4. Die Prävalenz des Markers beeinflusst den Vorhersagewert des Assays. 5. Dieser Assay kann nicht angewendet werden, um Mischplasma zu untersuchen. bioelisa HIV-1+2 3.0 wurde nur für individuelle Serum- oder Plasmaproben evaluiert. 6. bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ein qualitativer Assay und die Ergebnisse können nicht angewendet werden, um Antikörperkonzentrationen zu bestimmen. Dieser Assay kann nicht zwischen Infektionen mit HIV-1 und HIV-2 unterscheiden. Charakteristika des Tests Die Evaluierungsstudie, die in Alkmaar, Niederlande, zwischen April und November 2005 durchgeführt wurde, hat die folgenden funktionellen Charakteristika von bioelisa HIV-1+2 3.0 gezeigt. Die diagnostische Spezifität des Kits lag bei 99,85%, wie an allen negativen Proben (5471) bestimmt wurde, die untersucht wurden. Als nur bei nicht-ausgewählten Spendern untersucht (zufällig und Erstspender) betrug die Spezifität 99,92% (95% CI 99,84-100%). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 27 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 Testergebnisse bei nicht-ausgewählten Spendern: Panel Zufällig Serumspender Zufällig Plasmaspender Erstspender Gesamt Anzahl untersucht 2.654 1.400 989 5.043 Positiv (S/CO ≥ 1) Anzahl % 2 0,08 1 0,07 1 0,10 4 Negativ (S/CO < 1) Anzahl % 2.652 99,92 1.399 99,93 988 99,90 0,08 5.039 99,92 Alle Proben mit bestätigt positivem Antikörper für HIV-1, HIV-1 Subtyp O und HIV-2, die in dieser Studie benutzt wurden, waren auch mit bioelisa HIV-1+2 3.0 reaktiv, was eine diagnostische Sensitivität von 100% ergab. Insgesamt 32 Serokonversionspanels, die 210 getestete Proben darstellen. 13 Proben nicht aus PRB918 und PRB917 klassifiziert, da keine zur Klassifizierung erforderlichen Daten zur Antigen- oder RNA-Bestimmung vorliegen. 41 Proben als negativ klassifiziert. RNA- und/oder Antigen-negativ. 61 Proben als frühe Serokonversion klassifiziert. 95 Proben als Serokonversion klassifiziert. Die Testergebnisse zeigen auch, dass bioelisa HIV-1+2 3.0 im Vergleich zu den meisten derzeit im Handel erhältlichen und CE-geprüften Tests dem neuesten Stand der Technik entspricht. Die analytische Sensitivität wurde anhand von PeliCheck Anti-HIV-Panels bewertet. Die analytische Sensitivität von bioelisa HIV-1+2 3.0 anhand der PeliCheck Anti-HIV-Standardverdünnungen war vergleichbar mit anderen Anti-HIV-Assays. Analytische Spezifität: bioelisa HIV-1+2 3.0 Testergebnisse von Proben von Krankenhauspatienten und Proben, die potenziell kreuzreaktive Blutproben enthalten: Art der Probe Mononukleose Schwangere Frau RF+ Anti-TPO Anti-glatter Muskel Erhöhte IgG-Werte Gesamt Anzahl getestet 296 101 17 5 5 4 428 Positiv (S/CO ≥ 1) Anzahl % 4 1,35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 Negativ (S/CO < 1) Anzahl % 292 98,65 101 100 17 100 5 100 5 100 4 100 0,93 424 99,07 In einer separaten Studie wurden die folgenden Ergebnisse für Spezifität erhalten: - Möglicher Hook-Effekt wird durch die Anwendung des Zwei-Schritt-Verfahrens eliminiert. Gefrorene positive/negative Proben wurden getestet, um Beeinflussung durch Probengewinnung und Lagerung zu überprüfen. Die Leistungscharakteristika von bioelisa HIV-1+2 3.0 wurden von wenigstens 3-maligem Einfrieren und Auftauen nicht beeinträchtigt. Proben von Patienten, die mit Hepatitis-A, -B, -C und -E Viren infiziert sind, sowie Proben von Patienten, die mit Treponema pallidum infiziert sind, wurden getestet, ohne dass kreuzreaktive Reaktionen beobachtet wurden. 25 positive frische Serumproben, die am INSTITUT FÜR TROPENMEDIZIN, BELGIEN, getestet wurden, wurden mit bioelisa HIV-1+2 3.0 getestet. Alle 25 positiven frischen Serumproben fielen unter bioelisa HIV-1+2 3.0 positiv aus. Präzision: Die unten stehenden Tabellen zeigen die Ergebnisse der analytischen Sensitivität und Reproduzierbarkeit von bioelisa HIV-1+2 3.0, die mit PeliSpyMulti-Marker-Kontrolle und mit interner QC-Probe bei jeder Platte getestet wurde, die 1:2048 Verdünnung des Anti-HIV-Standards in dieser PeliSpy-Probe wurde gleichbleibend bei allen Platten nachgewiesen. Die interne QC-Probe wurde immer bei allen Platten analysiert. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 28 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa Ergebnisse der PeliSpyMulti-Marker: Verdünnung n 1:2048 80 Perzentile 5th 95th 1,76 4,39 Durchschnit t 3,08 Gemessen Min Max 1,70 4,96 Ergebnisse der internen QC-Probe: n Durchschnitt 160 7,71 Perzentile 5 95th 5,32 10,10 th Gemessen Min Max 4,37 10,89 BEISPIELSCHEMA FÜR DIE VERTEILUNG DER KONTROLLEN/PROBEN 1 2 3 4 5 6 7 … … 12 A Blindprobe SMP3 B Neg … C Neg … D Neg E Pos (HIV-1) F Pos (HIV-2) G SMP 1 H SMP 2 BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 29 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen Lösung 1. Kontrollen außerhalb der Validierung. 1a. Temperatur, Inkubation oder Pipettieren falsch. 1b. Unsachgemäße Vorbereitung der Reagenzien, falsche Verdünnung, Reagenzien nicht richtig durchgemischt. 1c. Kreuzkontamination zwischen Kontrollen. Überprüfen Sie die Arbeitsschritte. Wiederholen Sie den Assay. Überprüfen Sie die Arbeitsschritte. Wiederholen Sie den Assay. 1d. Falscher Lesefilter. 1e. Interferenzen im optischen Weg. 1f. Es wurden Komponenten aus unterschiedlichen Chargen verwendet. 1g. Abgelaufene Reagenzien. 2. Keine oder nur schwache Färbung am Ende des Tests. Pipettieren Sie vorsichtig. Vertauschen Sie nicht die Reagenzflaschenverschlüsse. Wiederholen Sie den Assay. Überprüfen Sie, ob ein Lesefilter der Wellenlänge 450 nm eingesetzt ist. Wird kein Referenzfilter mit 620630 nm eingesetzt, dann erhöht sich die Extinktion um ca. 0,050. Überprüfen Sie das Lesegerät. Reinigen oder trocknen Sie den Grund der Vertiefungen. Überprüfen Sie auf Luftblasen. Wiederholen Sie die Ablesung. Mischen Sie keine Komponenten aus unterschiedlichen Chargen, da diese spezifisch für jede Charge zusammengestellt sind. Überprüfen Sie das Verfallsdatum des Kits und der dazugehörigen Komponenten. Verwenden Sie keine Kits oder Reagenzien, deren Verfallsdatum abgelaufen ist. Überprüfen Sie die Arbeitsschritte. Wiederholen Sie den Assay. 2a. Ein oder mehrere Reagenzien nicht hinzugefügt oder in der falschen Reihenfolge hinzugefügt. 2b. Inaktives Konjugat: Falsche Auf Verunreinigung überprüfen. Die Konservierung. Arbeitsschritte überprüfen. Wiederholen Sie den Assay. 2c. Inaktive Mikrotiterplatte: Belassen Sie unbenutzte Platten Falsche Konservierung. immer gut verschlossen in der Tüte, die das Trocknungsmittel enthält. Wiederholen Sie den Assay. 2d. Inaktive Benutzen Sie Wegwerfbehälter Chromogenlösungen A oder waschen Sie sie vor und/oder B: falsche Wiederverwendung mit Säure oder Konservierung. Der benutzte Ethanol und spülen Sie sie mit Behälter beeinflusst die entionisiertem Wasser aus. Chromogenstabilität, Nochmals die Arbeitsschritte Kreuzkontamination mit der überprüfen. Wiederholen Sie den Stopplösung. Assay. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 30 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen Lösung 3. Zu viel Farbe in allen Vertiefungen der Mikrotiterplatte. 3a. Kontaminierte, oxidierte Chromogenlösung A und/oder B Überprüfen Sie, ob die Chromogenlösungen A und B farblos sind, und verwerfen Sie sie falls blau. Benutzen Sie mit Säure oder Ethanol gewaschene Behälter oder Wegwerfbehälter. Wiederholen Sie den Assay. Überprüfen Sie auf Kontaminationen (hinsichtlich Trübung). Überprüfen Sie die Verdünnungen. Wiederholen Sie den Assay. Überprüfen Sie die Qualität des destillierten oder entionisierten Wassers, welches zur Herstellung der Verdünnung verwendet wurde. Wiederholen Sie den Assay. Überprüfen Sie das Waschgerät. Füllen Sie die Vertiefungen mit Waschlösung bis fast zum Rand und aspirieren Sie vollständig. Erhöhen Sie die Anzahl der Waschzyklen und die Einweichzeit. Legen Sie die Mikrotiterplatte nach dem Waschen auf Saugpapier. Verwenden Sie nur die mit dem Kit gelieferte Waschlösung. 3b. Kontaminierte oder falsch zubereitete Reagenzien. 3c. Kontaminierte Waschlösung (1x). 4. Schlechte Reproduzierbarkeit oder große Anzahl von nicht wiederholten reaktiven Proben. 3d. Ungenügendes Waschen oder nicht konsistentes Waschen. Füllvolumen und/oder Aspiration ungenügend oder ungleichförmig. Ungenügende Anzahl von Waschzyklen, kontaminiertes Gerät. 3e. Es wurde eine Waschlösung eines anderen Herstellers verwendet. 4a. Waschprobleme. 4b. Schlecht kalibrierte Pipetten oder schlecht eingesetzte Pipettenspitzen. Unsachgemäße Pipettiertechnik. 4c. Reagenzien und Probe nicht bei Raumtemperatur oder vor Gebrauch schlecht gemischt. 4d. Luftstrom über der Mikrotiterplatte während der Inkubationen. 4e. Zu langer Zeitraum für Hinzufügen von Proben und/oder Reagenzien. Inkonsistente Zeitintervalle. Luftblasen. 4f. Interferenzen im optischen Weg. Siehe 3c, 3d, 3e. Benutzen Sie nur kalibrierte Pipetten mit passenden Spitzen und pipettieren Sie vorsichtig ohne Blasen und Spritzen. Wiederholen Sie den Assay. Lassen Sie die Reagenzien Raumtemperatur erreichen und mischen Sie sie vor Gebrauch gründlich. Schützen Sie die Mikrotiterplatte vor Luftströmen. Entwickeln Sie eine einheitliche, konsistente Technik. Siehe 1e. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 31 3000-1168 R03 08.2015 ger 1293 bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS 3000-1168 1 x 96 TESTS 3000-1169 5 x 96 TESTS (480) Test ELISA pour la détection d’anticorps contre le virus de l'immunodéficience humaine (HIV) de type 1 (groupe M-O) ou de type 2 dans le sérum humain ou les échantillons de plasma pour être utilisé dans les laboratoires cliniques et comme un dépistage de premier choix dans les centres de transfusion sanguine. Sommaire Une preuve sérologique d’infection par le HIV peut être obtenue par des tests pour dépister les antigènes ou les anticorps HIV présents dans le sérum de sujets susceptibles de présenter une infection par le HIV. L’antigène peut généralement être détecté aussi bien pendant la phase aiguë que la phase symptomatique du SIDA uniquement. Les anticorps du virus HIV-1 ou HIV-2 peuvent être détectés pratiquement pendant toute la période d’infection, à partir de, ou peu de temps après, la phase aiguë, et ce, jusqu’à la phase finale du SIDA. Par conséquent, l’utilisation de tests d’anticorps extrêmement sensibles constitue la première approche dans le sérodiagnostic de l’infection par le HIV. Mise à part la transmission sexuelle, la principale voie d’infection du HIV est la transfusion sanguine. Le HIV peut présenter à la fois des fractions cellulaires et acellulaires du sang humain. Par conséquent, tous les dons de sang ou de plasma doivent être testés en raison du risque de transmission du HIV par du sang contaminé. Cela peut être réalisé de manière efficace avec un test ELISA extrêmement sensible pour dépister les anticorps du HIV-1 et du HIV-2. Principe bioelisa HIV-1+2 3.0 est un kit est une méthode immuno-enzymatique directe, de type «sandwich», impliquant une incubation en deux étapes. Dans ce kit d’essai, les puits de la microplaque sont recouverts d’antigènes du HIV recombinants exprimés en E. coli (recombinant HIV-1 gp41, gp120, et recombinant HIV-2, gp-36). Les échantillons de plasma ou de sérum à analyser sont versés dans ces puits. Si des anticorps HIV1/2 sont présents dans l’échantillon, ils formeront des complexes stables avec les antigènes recombinants du HIV. Les micropuits sont ensuite lavés afin d’enlever les protéines libres de sérum. Un second lot d’antigènes recombinants conjugués à la peroxydase et exprimant les mêmes épitopes sont placés dans les puits. Pendant la seconde étape d’incubation, ces antigènes vont se lier aux anticorps spécifiques capturés. Après un deuxième lavage pour enlever le conjugué libre, des solutions chromogènes sont versées dans les puits. Dans les puits contenant le complexe en sandwich antigène-anticorps-antigène, les chromogènes incolores sont hydrolysés par le conjugué pour donner un produit de couleur bleue. La couleur bleue vire au jaune après l’arrêt de la réaction avec de l’acide sulfurique. L’intensité de la couleur peut être mesurée : elle est proportionnelle à la concentration d’anticorps anti-HIV 1/2 présents dans l’échantillon. Les puits contenant les échantillons négatifs restent incolores. Composants 1. MCPL MICROPLAQUE: 12 x 8 puits recouverts d’antigènes recombinants HIV 1/2 (recombinant HIV-1 gp41, gp120, et recombinant HIV-2 gp36). Les bandelettes de micropuits sont destinées à une UTILISATION UNIQUE. Ne pas utiliser si l'emballage sous vide a été endommagé lorsque le produit a été retiré pour la première fois de la boîte. 2. CONTROL + 1 HIV-1 CONTRÔLE POSITIF: Anticorps du HIV-1 dilués dans la solution tampon stabilisée de protéine. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme conservateur et colorant rouge. Prêt à l’emploi. 3. CONTROL + 2 HIV-2 CONTRÔLE POSITIF: Anticorps du HIV-2 dilués dans la solution tampon stabilisée de protéine. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme conservateur et colorant rouge. Prêt à l’emploi. 4. CONTROL – CONTRÔLE NÉGATIF: Solution tampon stabilisée de protéine testée négative pour HBsAg et les anticorps du HIV-1, du HIV-2, du HCV et du TP. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme conservateur et colorant rouge. Prêt à l’emploi. 5. CONJ CONJUGUÉ: Antigènes recombinants HIV-1 et HIV-2 conjugués avec la peroxydase. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme conservateur et colorant rouge. Prêt à l’emploi. 6. WASH SOLN 20x SOLUTION DE LAVAGE CONCENTRÉE: Tampon concentré au PBS pH 7,4 (20x). Contient du Tween-20 comme détergent. À diluer 1/20 dans de l’eau distillée ou désionisée avant utilisation. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 32 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa 7. CHROM A SOLUTION CHROMOGÈNE A: Solution de peroxyde d'urée. Prêt à l’emploi. 8. CHROM B SOLUTION CHROMOGÈNE B: Solution TMB (tétraméthyle benzidine dissous dans de l’acide citrique). 9. H2SO4 0,5M SOLUTION D’ARRÊT: Acide sulfurique solution 0,5M. Prêt à l’emploi. 10. SEALS LAMELLES ADHÉSIVES: Pour couvrir la microplaque pendant l’incubation. 11. BAG SACHET REFERMABLE: Pour le stockage des bandelettes non utilisées. Précautions bioelisa HIV-1+2 3.0 est destiné à un usage diagnostique IN VITRO. Utisation réservée aux professionnels. IVD AVERTISSEMENT: des matières d’origine humaine ont été utilisées dans la préparation du témoin négatif du kit. Ces matières ont été testées avec des kits de tests ayant des performances acceptées et ont donné des résultats négatifs aux anticorps HIV1/2, HCV, TP et HBsAg. Cependant, il n’existe pas de méthode analytique pouvant garantir que les échantillons ou les réactifs sont totalement exempts d’agents infectieux. C’est pourquoi il convient de manipuler les réactifs et les échantillons avec une extrême prudence, car ils peuvent transmettre des maladies infectieuses. Les sérums dérivés de bovins ont été utilisés pour la stabilisation des contrôles positifs et négatifs. La séralbumine bovine (BSA) et le sérum de veau fœtal (SVF) sont des dérivés d’animaux des zones géographiques exemptes d’ESB et d’EST. Le contrôle négatif, contrôle positif HIV-1, contrôle positif HIV-2 et le conjugué contiennent 0,1% de ProClin comme conservateur. Les phrases de risque (R) et de sécurité (S) appropriés sont énumérées ci-dessous: TM R43 Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l’eau et consulter un spécialiste. S28 Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l’eau. S36/37/39 Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux/du visage. S45 En cas d'accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin (si possible lui montrer l'étiquette). S60 Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux. S61 Éviter le rejet dans l'environnement. Consulter les instructions spéciales/la fiche de données de sécurité. Les tests ELISA sont limités dans le temps et sensibles à la température. Afin d’éviter tout résultat erroné, veuillez suivre strictement les étapes de procédure du test ci-dessous et ne pas les modifier. 1. N’échangez pas les réactifs entre différents lots et n’utilisez pas de réactifs provenant d’autres kits commercialisés. Les composants du kit sont précisément adaptés pour un résultat optimal des tests. 2. Assurez-vous que tous les réactifs ne sont pas périmés en vous référant à la date de péremption indiquée sur la boîte du kit et vérifiez qu’ils appartiennent tous au même lot. N’utilisez jamais de réactifs au-delà de la date de péremption mentionnée sur les étiquettes ou les boîtes. 3. ATTENTION - ÉTAPE IMPORTANTE: attendez que les réactifs et les échantillons prennent une température ambiante (18 à 30°C) avant utilisation. Secouez légèrement le réactif avant utilisation. Replacez les réactifs et les échantillons à une température située entre 2 et 8°C immédiatement après utilisation. 4. Utilisez uniquement la quantité suffisante d’échantillon comme indiqué dans la procédure. Dans le cas contraire, le test pourrait perdre en sensibilité. 5. Ne touchez pas l’extérieur du fond des puits; les traces de doigts et les rayures pourraient biaiser les résultats du test. En lisant les résultats, assurez-vous que le dessous de la plaque est sec et qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur des puits. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 33 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa 6. Ne laissez jamais les puits de la microplaque sécher après le lavage. Passez immédiatement à la prochaine étape. Évitez la formation de bulles d’air en ajoutant les réactifs. 7. Évitez les interruptions longues des étapes du test. Assurez-vous de travailler dans les mêmes conditions pour tous les puits. 8. Étalonnez la pipette fréquemment pour assurer la précision de la dispensation échantillons/réactifs. Utilisez des cônes de pipettes jetables pour chaque échantillon ou réactif afin d’éviter les contaminations croisées. 9. Assurez-vous que la température d’incubation est de 37°C à l’intérieur de l’incubateur. 10. Lorsque vous ajoutez les échantillons, ne touchez pas le fond des puits avec l’embout de la pipette. 11. Lorsque vous étalonnez le lecteur de la plaque, positionnez le niveau d’absorbance à 450 nm ou à 450/620-630 nm. 12. L’activité enzymatique du conjugué pourrait être affectée par la poussière, les agents chimiques et les substances des réactifs, comme l’hypochlorite de sodium, les acides, les alcalis, etc. Ne procédez pas au test en présence de ces substances. 13. Si vous utilisez un équipement entièrement automatisé, pendant l’incubation, ne recouvrez pas les plaques avec la lamelle adhésive. Il n’est pas également nécessaire de recouvrir le produit restant à l’intérieur de la plaque après le lavage. 14. Tous les échantillons d’origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Respectez rigoureusement les règles de BPL (bonnes pratiques de laboratoire) afin d’assurer la sécurité du personnel. 15. Ne jamais manger, boire, fumer ou appliquer de cosmétiques dans le laboratoire où le test est réalisé. Ne jamais pipetter les solutions avec la bouche. 16. Les agents chimiques doivent être manipulés et rejetés uniquement conformément aux BPL (bonnes pratiques de laboratoire) et aux réglementations locales ou nationales en vigueur. 17. Avant d’être utilisés lors des étapes successives ou d’être jetés, les cônes de pipette, les flacons, les bandelettes et les conteneurs d’échantillon doivent être collectés et autoclavés pendant 2 heures minimum à 121°C ou traités avec 10% d’hypochlorite de sodium pendant 30 minutes pour décontamination. Les solutions contenant de l’hypochlorite de sodium ne doivent JAMAIS être autoclavées. La fiche de données de sécurité (FDS) est disponible sur demande. 18. Certains réactifs peuvent être toxiques et peuvent causer des irritations, des brûlures ou avoir des effets cancérigènes lorsqu’ils sont utilisés comme matière première. Le contact avec la peau et les muqueuses doit être évité mais pas limité aux réactifs suivants: solution d’arrêt, chromogènes et tampon de lavage. INDICATIONS SUR L’INSTABILITÉ ET LA DÉTÉRIORATION DU RÉACTIF: valeurs des contrôles positifs et négatifs, qui sont en dehors de l’intervalle de contrôle de la qualité, qui sont des indicateurs de détérioration possible des réactifs voire d’erreurs de la part de l’opérateur ou du matériel. Dans un tel cas, les résultats doivent être considérés comme invalides et les échantillons retestés. En cas de résultats fréquemment erronés et d’une détérioration ou d’une instabilité prouvées des réactifs, remplacez immédiatement les réactifs ou contactez votre distributeur local ou le soutien technique Biokit afin d’obtenir une aide supplémentaire. Conservation et stabilité Les composants du kit resteront stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette et le conditionnement à condition qu’ils soient stockés à une température comprise entre 2 et 8°C. Ne congelez pas. Afin de garantir des performances optimales du kit bioelisa HIV-1+2 3.0, protégez les réactifs d’une contamination par un micro-organisme ou par des agents chimiques. Les bandelettes du micropuits peuvent se détacher afin de les utiliser séparément. Placez les puits ou les bandelettes non utilisés dans le sachet en plastique refermable avec le déshydratant et stockez à température comprise entre 2 et 8°C. Une fois ouverte, la microplaque est stable pendant un mois à température comprise entre 2 et 8°C. Le contrôle négatif, le contrôle positif HIV-1, le contrôle positif HIV-2, le conjugué, la solution chromogène A, la solution chromogène B et la solution d’arrêt, une fois ouverts, sont stables pendant un mois à température comprise entre 2 et 8°C. La solution de lavage, une fois diluée, est stable pendant une semaine à température ambiante ou pendant deux semaines à une température comprise entre 2 et 8°C. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 34 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa Présentations disponibles Coffret de 1 plaque (96 tests), REF 3000-1168. Contient: 1 plaque, 1 x 1 ml de contrôle négatif, 1 x 1 ml de contrôle positif HIV-1, 1 x 1 ml de contrôle positif HIV-2, 1 x 12 ml de conjugué, 1 x 50 ml de solution de lavage, 1 x 8 ml de solution chromogène A, 1 x 8 ml de solution chromogène B, 1 x 8 ml de solution d’arrêt, 1 sachet plastique et des lamelles adhésives (6 unités). - Coffret de 5 plaques (5 x 96 tests), REF 3000-1169. Contient: 5 plaques, 3 x 1 ml de contrôle négatif, 3 x 1 ml de contrôle positif HIV-1, 3 x 1 ml de contrôle positif HIV-2, 5 x 12 ml de conjugué, 2 x 125 ml de solution de lavage, 1 x 60 ml de solution chromogène A, 1 x 60 ml de solution chromogène B, 1 x 60 ml de solution d’arrêt, 1 sachet plastique et des lamelles adhésives (20 unités). Matériel nécessaire non fourni Eau distillée ou désionisée. Gants jetables et chronomètre. Conteneur de déchets adapté pour matériaux potentiellement contaminés. Bacs jetables en forme de « V ». Système de délivrance ou pipette (simple ou multicanal) et cônes de pipette jetables. Tissu absorbant ou serviette propre. Incubateur sec ou bain-marie, 37 ± 1°C. Microshaker pour dissoudre et mélanger le conjugué avec les échantillons. Lecteur de microplaque avec un filtre de 450 nm. Un filtre de référence de 620 nm ou 630 nm est recommandé. Système de lavage manuel ou automatique. Prélèvement, transport et conservation des échantillons 1. Aucune préparation spéciale du patient n’est requise. Prélevez les échantillons conformément aux pratiques de laboratoire habituelles. Des échantillons de sérum frais ou de plasma peuvent être utilisés pour le test. Le sang prélevé par ponction veineuse doit se coaguler complètement et naturellement – le sérum/plasma doit être séparé du caillot aussitôt que possible pour éviter l’hémolyse. Il convient de s’assurer que les échantillons de sérum sont propres et non contaminés par des micro-organismes. Toute particule visible dans l’échantillon doit être retirée par centrifugation à 3 000 tr/min (tour par minute) pendant 20 minutes à température ambiante ou par filtration. 2. Les échantillons de plasma prélevés dans l’EDTA, le citrate de sodium ou l’héparine peuvent être utilisés; en revanche, les échantillons hautement lipémiques, ictériques ou hémolytiques ne doivent pas être utilisés, car ils peuvent biaiser les résultats du test. N’utilisezpas les échantillons inactifs, car cela pourrait provoquer la détérioration de l’analyte cible. Les échantillons présentant une contamination microbienne visible ne doivent jamais être utilisés. 3. bioelisa HIV-1+2 3.0 est conçu UNIQUEMENT pour les tests sur échantillons individuels de sérum ou de plasma. Ne l’utilisez pas sur des échantillons de cadavre, de salive, d’urine ou de tout autre fluide corporel ou de sang mis en commun (mélangé). 4. Transport et stockage: stockez les échantillons à une température comprise entre 2 et 8°C. Les échantillons non utilisés dans le test sous trois jours doivent être congelés (-20°C ou moins). Évitez les cycles de gel-dégel trop fréquents. Pour le transport, les échantillons doivent être conditionnés et étiquetés conformément aux règlements locaux et internationaux concernant le transport des échantillons cliniques et des agents éthologiques. Traitement automatique Ce test peut être utilisé de manière automatique ou semi-automatique avec divers instruments. Il est très important de valider un système automatique pour démontrer que les résultats obtenus sur les échantillons sont équivalents aux résultats d’un test manuel. Il est recommandé à l’utilisateur de valider l’instrument régulièrement. Si vous rencontrez des difficultés dans la programmation et le réglage des processeurs automatiques de Biokit, veuillez contacter votre distributeur. PROCÉDURE (Voir schéma de la procédure) Opérations préalables Portez l’ensemble des réactifs à température ambiante (20 à 25°C) avant de procéder au test. Vérifiez la présence de cristaux de sels dans le concentré de la solution tampon de lavage. Si des cristaux se sont formés, dissolvez en chauffant à 37°C jusqu’à leur dissolution. Diluez 1:20 de solution tampon de lavage comme indiqué dans les instructions de l’étape de lavage. Utilisez de l’eau distillée ou désionisée et lavez uniquement les cuves pour diluer le tampon. Tous les autres réactifs sont PRÊT A L’EMPLOI. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 35 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa Instructions pour l’étape de lavage Une procédure de lavage optimale est essentielle afin d’obtenir des données analytiques correctes et précises. Il est donc recommandé d’utiliser un bon système de lavage des plaques ELISA, maintenu à son meilleur niveau de performances. En général, un minimum de 5 cycles de lavages automatiques de 350 à 400 µl/puits est suffisant pour éviter les réactions fausses positives et bruit de fond élevé. Pour prévenir les contaminations croisées de la plaque avec un échantillon ou le conjugué, après l’incubation, ne rejetez pas le contenu du puits, laissez plutôt le laveur de la microplaque l’aspirer automatiquement. Assurez-vous que les canaux de distribution de liquide du laveur de la microplaque ne sont pas bloqués ou contaminés et qu’une quantité suffisante de tampon de lavage est toujours distribuée dans les puits. En cas de lavage manuel, nous vous recommandons d’effectuer 5 cycles de lavage, en distribuant 350 à 400 µl de liquide par puits et en aspirant ceux-ci 5 fois de suite. Si vous observez de mauvais résultats (couleurs de fond plus vives), augmenter les cycles de lavage ou le temps de trempage par puits. Dans tous les cas, le liquide aspiré par les bandelettes doit être traité avec une solution d’hypochlorite de sodium à une concentration finale de 2,5% pendant 24 heures, avant de les jeter d’une manière convenable. Le tampon de lavage concentré doit être dilué à 1:20 avant utilisation. Si la plaque n’est pas utilisée dans sa totalité, préparez une quantité de solution proportionnelle. Étape 1 Préparation: marquez trois puits comme contrôle négatif (ex. B1, C1, D1), deux puits comme contrôle positif (ex. E1 pour HIV-1 et F1 pour HIV-2) et un blanc (ex. A1, ni les échantillons ni le conjugué ne doivent être versés dans le puits blanc). Si les résultats doivent être lus avec un lecteur de microplaque à deux longueurs d’onde, l’utilisation du puits blanc peut être omise. Utilisez uniquement le nombre de bandelettes nécessaire pour le test. Étape 2 Ajout de l’échantillon: ajoutez 100 μl d’échantillons et 100 μl de contrôle positif et négatif dans leur puits respectif. REMARQUE: utilisez un embout de pipette jetable différent pour chaque échantillon et chaque contrôle positif et négatif afin d’éviter une contamination croisée. Étape 3 Incubation de l’échantillon: recouvrez la plaque avec la lamelle adhésive et incubez à 37°C pendant 30 ± 1 minutes. Il est recommandé d’utiliser un récipient avec de l’eau thermorégulé pour assurer la stabilité de la température et le degré d’humidité pendant l’incubation. Si un incubateur à sec est utilisé, évitez d’ouvrir la porte à plusieurs reprises. Étape 4 Lavage (1): à la fin de l’incubation, retirez la lamelle adhésive et jetez-la. Lavez chaque puits 5 (cinq) fois avec le tampon de lavage dilué. À chaque fois, laissez tremper les puits pendant 30 à 60 secondes. À la fin du dernier cycle de lavage, retournez la plaque sur du papier buvard ou une serviette propre et tapotez pour enlever tout résidu. Étape 5 Ajout du conjugué: ajoutez 100 μl de réactif conjugué dans chaque puits excepté le blanc. Étape 6 Incubation du conjugué: recouvrez la plaque avec la lamelle adhésive et incubez à 37°C pendant 30 ± 1 minutes. Étape 7 Lavage (2): voir étape 4. Étape 8 Coloration: ajoutez 50 μl de solution chromogène A et 50 μl de solution chromogène B dans chaque puits, y compris le blanc. Incubez la plaque à 37°C pendant 15 minutes dans le noir. La réaction enzymatique entre les solutions chromogènesne et le conjugué produit une couleur bleue dans les puits contenant les échantillons contrôle positif et positifs HIV 1/2. Étape 9 Réaction d’arrêt: en utilisant une pipette multicanal ou manuelle, ajoutez 50 µl de solution d’arrêt dans chaque puits et mélangez doucement. Une vive couleur jaune apparaît dans les puits contenant le contrôle positif et l’échantillon de contrôle positif au HIV 1/2. Étape 10 Mesure du degré d’absorbance: étalonnez le lecteur de la plaque avec le puits blanc et lisez l’absorbance à 450 nm. Si vous utilisez un instrument doté d’un double filtre, configurez la longueur d’onde à 620 nm ou 630 nm. Calculez la valeur seuil et évaluer les résultats. (REMARQUE: lisez l’absorbance dans un délai maximum de 10 minutes après l’arrêt de la réaction). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 36 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa Contrôle de qualité Il est recommandé que chaque laboratoire établisse un système de contrôle de la qualité avec un matériau similaire à l’échantillon du patient à analyser. - La valeur d’absorbance du puits blanc, qui contient uniquement les solutions de chromogène et d’arrêt, doit être inférieure à 0,080 à 450 nm. La valeur d’absorbance du contrôle positif doit être ≥ 0,800 à 450/620-630 nm ou à 450 nm après soustraction du blanc. Chaque valeur d’absorbance individuelle du contrôle négatif doit être inférieure à 0,100 à 450/620-630 nm ou à 450 nm après soustraction du blanc. Si l’une des valeurs du contrôle négatif ne satisfait pas aux critères de contrôle de la qualité, elle doit être écartée et la valeur moyenne recalculée en utilisant les deux valeurs restantes. Si plus d’une valeur d’absorbance du contrôle négatif ne satisfait pas aux spécifications de l’intervalle de contrôle de la qualité, le test est invalide et doit être renouvelé. Résultats Chaque microplaque doit être considérée séparément lorsque vous calculez et interprétez les résultats du test, indépendamment du nombre de plaques traitées parallèlement. Les résultats sont calculés en confrontant chaque valeur (S) d’absorbance d’échantillon et la valeur seuil (CO) de la plaque. Si la lecture de la valeur seuil est basée sur un lecteur de plaque à un filtre, les résultats doivent être calculés en soustrayant la valeur A du puits blanc des valeurs rapportées des échantillons et des contrôles. Si la lecture est basée sur un lecteur de plaque à deux filtres, ne soustrayez pas la valeur A du puits blanc des valeurs rapportées des échantillons et des contrôles. Calculez la valeur seuil en ajoutant 0,120 à l’absorbance moyenne du contrôle négatif. Seuil = CNx + 0,120 Exemple: Valeur d’absorbance du puits blanc: A1= 0,025 à 450 nm (REMARQUE: le blanc est requis uniquement pour la lecture avec un seul filtre à 450 nm) o Puits n : Ctrl nég.: Puits no: Ctrl pos.: B1 0,012 E1 2,363 C1 0,010 F1 2,436 D1 0,011 Toutes les valeurs des contrôles se trouvent dans l’intervalle du contrôle de la qualité susmentionné. Calcul du CNx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011 Calcul du seuil: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131 Interprétation des résultats Divisez l’absorbance de l’échantillon par la valeur seuil. (S/CO) Résultats négatifs (S/CO < 1): les échantillons présentant une absorbance inférieure à la valeur seuil sont négatifs pour le test, ce qui indique qu’aucun anticorps anti-HIV 1/2 n’a été détecté avec le kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Un résultat négatif n’exclut pas la possibilité d’exposition ou d’infection par le HIV. Résultats positifs (S/CO ≥ 1): les échantillons présentant une absorbance égale ou supérieure à la valeur seuil sont considérés comme initialement réactifs, ce qui indique que des anticorps anti-HIV 1/2 ont probablement été détectés grâce au test bioelisa HIV-1+2 3.0. Tous les échantillons initialement réactifs doivent être retestés deux fois en utilisant bioelisa HIV-1+2 3.0 avant toute interprétation finale des résultats du test. Des échantillons réactifs à plusieurs reprises peuvent être considérés comme positifs pour les anticorps du HIV 1/2 avec bioelisa HIV-1+2 3.0. Douteux (S/CO = 0,9-1,1): les échantillons ayant un rapport d’absorbance-seuil situé entre 0,9 et 1,1 sont considérés comme douteux; c’est pourquoi il convient de les retester deux fois pour confirmer les résultats initiaux. Suivi, confirmation et test supplémentaire de tout échantillon positif avec un autre instrument d’analyse (ex. WB, PCR). Un diagnostic clinique ne doit pas être établi sur la base d’un seul résultat de test. Il doit intégrer des données cliniques et des données et conclusion d’autres laboratoires. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 37 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS INITIAUX ET SUIVI DE TOUS LES ÉCHANTILLONS INITIALEMENT RÉACTIFS OU DOUTEUX Rép. deux fois ○,+○,+ ○,+○,- ○,-○,- Interprétation + Suivi S/CO ≥ 0.9 Interprétation S/CO < 0.9 IND - IND = non interprétable - - - Si, après avoir retesté les échantillons initialement réactifs, les deux puits présentent des résultats négatifs (S/CO < 0,9), lesdits échantillons doivent être considérés comme positifs et non répétables (ou, faux positifs) et enregistrés comme négatifs. Comme avec de nombreux tests ELISA très sensibles, les résultats faux positifs peuvent survenir en raison de plusieurs facteurs, dont la plupart sont liés notamment à une mauvaise étape de lavage. Pour plus d’informations concernant les dépannages du test bioelisa, veuillez vous reporter au guide de dépannage. Si après avoir retesté les échantillons à deux reprises, un puits ou les deux présentent des résultats positifs, le résultat final du test ELISA doit être enregistré comme réactif à plusieurs reprises. Les échantillons réactifs à plusieurs reprises peuvent être considérés comme positifs aux anticorps du HIV 1/2; par conséquent, le patient est probablement infecté par le HIV 1/2 et l’unité de sang peut être écartée. Après avoir retesté les échantillons à deux reprises, ceux présentant des valeurs proches à la valeur seuil doivent être interprétés avec prudence et considérés comme échantillon de zone « douteux », ou non interprétables pendant la durée du test. Limites de la procédure 1. Les résultats positifs doivent être confirmés avec une autre méthode disponible et interprétés par rapport aux informations cliniques du patient. 2. Les anticorps peuvent être indétectables pendant la phase initiale de la maladie et chez certains sujets immunocompromis. Par conséquent, les résultats négatifs obtenus avec bioelisa HIV-1+2 3.0 indiquent seulement que l’échantillon ne contient pas un taux détectable d’anticorps anti-HIV 1 ou 2 et qu’aucun résultat ne doit être considéré comme une preuve concluante que le sujet n’est pas infecté par le HIV 1 ou 2. 3. Les erreurs de tests les plus fréquentes sont les suivantes : utilisation de kit dont la date de péremption est expirée, mauvaises procédures de lavage, réactifs contaminés, étapes de la procédure du test incorrectes, aspiration insuffisante pendant le lavage, échec dans l’ajout d’échantillons ou de réactifs, manipulation incorrecte de l’équipement du laboratoire, erreurs de chronométrage, utilisation d’échantillons hautement hémolysés ou des échantillons contenant de la fibrine, trempage incomplet des échantillons de sérum. 4. La prévalence du marqueur affectera les valeurs prédictives du test. 5. Ce test ne peut pas être utilisé pour le plasma mis en commun (mélangé). bioelisa HIV-1+2 3.0 a été évalué uniquement avec du sérum individuel ou des échantillons de plasma. 6. bioelisa HIV-1+2 3.0 est un test qualitatif et les résultats ne peuvent donc pas être utilisés pour mesurer les concentrations d’anticorps. Ce test ne peut pas différencier les infections par le HIV-1 des infections par le HIV-2. Caractéristiques fonctionnelles Une étude d’évaluation menée à Alkmaar, Pays-Bas, entre avril et novembre 2005, a démontré les caractéristiques fonctionnelles du test bioelisa HIV-1+2 3.0 présentées ci-dessous : La spécificité diagnostique du kit était de 99,85%, telle que déterminée sur tous les échantillons négatifs (5471) analysés. Lorsqu’elle était testée uniquement sur les donneurs non choisis (donneurs choisis de façon aléatoire et participant pour la première fois), la spécificité était de 99,92% (95% CI 99,84-100%). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 38 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa Résultats du test bioelisa HIV-1+2 3.0 sur les donneurs non choisis: Panels Nombre testé Donneur de sérum choisi de façon aléatoire Donneur de plasma choisi de façon aléatoire Donneur participant pour la première fois Total Positif (S/CO ≥ 1) Nombre % Négatif (S/CO < 1) Nombre % 2 654 2 0,08 2 652 99,92 1 400 1 0,07 1 399 99,93 989 1 0,10 988 99,90 5 043 4 0,08 5 039 99,92 Tous les panels de HIV-1, HIV-1HIV sous-type O et HIV-2 ont confirmé que les échantillons positifs aux anticorps ayant été utilisés dans cette étude ont également été testés réactifs avec bioelisa HIV-1+2 3.0, ce qui a engendré une sensibilité diagnostique de 100%. Un total de 32 panels de séroconversion, qui représentent 210 échantillons testés. 13 échantillons n'ont pas été classés du PRB918 et du PRB917 car il n'y a pas de données relatives aux antigènes ou de détermination de l'ARN requises pour la classification. 41 échantillons classés négatifs. ARN et/ou antigènes négatifs. 61 échantillons classés séroconversion précoce. 95 échantillons classés séroconversion. Les résultats des tests indiquent également que bioelisa HIV-1+2 3.0 est à la pointe de la technologie par rapport à la plupart des tests marqués CE actuellement commercialisés. La sensibilité analytique a été évaluée sur les panels PeliCheck anti-HIV. La sensibilité analytique de bioelisa HIV-1+2 3.0 sur les dilutions étalons PeliCheck anti-HIV était comparable aux autres tests anti-HIV. Spécificité analytique: Résultat du test bioelisa HIV-1+2 3.0 portant sur des échantillons de patients hospitalisés et des échantillons potentiels de contamination croisée: Type d’échantillon Nombre testé Mononucléose Femme enceinte RF+ Anti-TPO Antimuscle lisse Concentration élevée d’IgG 296 101 17 5 5 4 Total 428 Positif (S/CO ≥ 1) Nombre % 4 1,35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 Négatif (S/CO < 1) Nombre % 292 98,65 101 100 17 100 5 100 5 100 4 100 0,93 424 99,07 Dans une étude séparée, les résultats de spécificité suivants ont été obtenus: - La possibilité d’un effet crochet à haute concentration est écartée en raison de la mise en place d’une procédure à deux étapes. Les échantillons positifs/négatifs congelés ont été testés pour vérifier les interférences dues aux prélèvements et au stockage. Les caractéristiques de performance bioelisa HIV-1+2 3.0 n’étaient pas affectées pendant au moins 3 cycles de gel/dégel. Les échantillons prélevés sur des patients infectés par les virus de l’hépatite A,B,C et E tout comme les échantillons de patients infectés par Treponema pallidum n’ont pas présenté de réactions croisées. 25 échantillons de sérum frais positifs testés à l'INSTITUT DE MÉDECINE TROPICALE (BELGIQUE) ont été testés avec bioelisa HIV-1+2 3.0. La totalité des 25 échantillons de sérum frais positifs ont été classés positifs avec bioelisa HIV-1+2 3.0. Précision: Les tableaux ci-dessous affichent les résultats de la sensibilité analytique et de reproductibilité du test bioelisa HIV-1+2 3.0 contrôlés avec PeliSpyMulti-Marker run control et avec un échantillon interne de CQ testé dans chaque plaque; la dilution 1:2048 de l’étalon anti-HIV dans cet échantillon PeliSpy a été systématiquement détecté dans chaque plaque. L’échantillon interne de CQ a toujours été détecté dans toutes les plaques. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 39 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa Résultats du PeliSpy Multi-Marker: Dilution n Moyenne 1:2048 80 3,08 Centiles 5e 1,76 Mesuré 95e 4,39 Min 1,70 Max 4,96 Résultats de l’échantillon interne de CQ : A B C D E F G H n Moyenne 160 7,71 Centiles e Mesuré e 5 5,32 95 10,10 Min 4,37 Max 10,89 EXEMPLE DE SCHÉMA DE RÉPARTITION CONTRÔLE/ÉCHANTILLON 1 2 3 4 5 6 7 … … 12 Blanc Éch. 3 Nég. … Nég. … Nég. Pos. (HIV-1) Pos. (HIV-2) Échantillon 1 Échantillon 2 BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 40 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa Bioelisa: Guide de problèmes Problème Causes éventuelles Solution 1. Contrôles hors validation. 1a. Température, incubation ou pipettage incorrects. 1b. Préparation incorrecte des réactifs, erreur dans les dilutions, réactifs non mélangés correctement. 1c. Contamination croisée entre contrôles. Vérifier la procédure. Refaire le test. Vérifier la procédure. Refaire le test. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. Incolore ou faible couleur 2a. à la fin du test. 2b. 2c. 2d. Pipeter soigneusement. Ne pas échanger les bouchons des flacons. Refaire le test. Filtre de lecture incorrect. S’assurer que le filtre de lecture soit bien de 450 nm. Si le filtre de référence de 620630 nm n’est pas utilisé, les absorbances augmentent d’environ 50 milliunités. Interférence sur le chemin Vérifier le lecteur. Nettoyer ou optique. sécher le fond des puits. S’assurer de l’absence de bulles d’air. Répéter la lecture. Des composants de lots Ne pas utiliser de lots différents ont été utilisés. différents dans la mesure où ils sont faits pour chaque lot en particulier. Réactifs périmés. Vérifier la date d’expiration du coffret. Ne pas utiliser de coffret ni de réactifs périmés. Un ou plusieurs réactifs Vérifier la procédure. Refaire n’ont pas été ajoutés ou le test. l’ont été dans une séquence erronée. Conjugué inactif : Vérifier la contamination. mauvaise conservation. Revérifier la procédure. Refaire le test. Microplaque inactive : Toujours conserver les mauvaise conservation. barrettes non usagées dans un sac bien fermé, avec le desséchant à l’intérieur. Refaire le test. Solutions chromogène A Utiliser des conteneurs ou B inactive(s) : jetables ou les laver avec de mauvaise conservation. l’acide ou de l’éthanol et Le conteneur utilisé altère rincez avec de l’eau la stabilité du substrat. désionisée avant réutilisation. Contamination croisée Vérifier la procédure. avec la solution d’arrêt. Refaire le test. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 41 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa Bioelisa: Guide de problème Problème Causes éventuelles 3. Trop de couleur dans les puits de la microplaque. 3a. Solutions chromogènes A Vérifier que les solutions ou B contaminées, chromogènes A et B sont oxydées. incolores, les jeter si elles sont bleues. Utiliser des conteneurs préalablement lavés à l’acide ou à l’éthanol ou des conteneurs jetables. Refaire le test. 3b. Réactifs contaminés ou Vérifier la présence de mal préparés. contamination (aspect turbide). Vérifier les dilutions. Refaire le test. 3c. Solution de lavage (1x) Vérifier la qualité de l’eau contaminée. distillée ou désionisée utilisée pour la dilution. Refaire le test. 3d. Lavage insuffisant ou non Vérifier le lavoir. Vérifier le consistant: remplissage lavoir. Remplir les puits ou aspiration insuffisant jusqu’en haut et aspirer ou non uniforme, nombre complètement. Augmenter le de cycles de lavage nombre de cycles de lavage insuffisant. Lavoir et le temps de trempage. contaminé. Taper la plaque inversée contre le papier buvard. 3e. Une solution de lavage Utiliser la solution de lavage d’un autre coffret a été du biokit. utilisée. 4a. Problèmes de lavage. Voir rubriques 3c, 3d, 3e. 4b. Pipettes mal calibrées ou Utiliser des pipettes calibrées cônes mal encastrés. avec des cônes bien ajustés. Technique de pipetage Pipeter soigneusement sans incorrecte. faire de bulles et sans éclaboussures. Refaire le test. 4c. Réactifs et sérums non Porter les réactifs à placés à température température ambiante et ambiante ou non mélanger minutieusement correctement mélangés avant utilisation. avant l’usage. 4d. Courants d’air sur la Mettre la microplaque à l’abri microplaque pendant des courants d’air. l’incubation. 4e. Trop de temps dans Développer une technique l’addition des échantillons uniforme et reproductible. et/ou des réactifs. Inconsistance dans les intervalles de temps, bulles d’air. 4f. Interférence sur le chemin Voir 1e. optique. 4. Reproductibilité pauvre ou élevé nombre d’échantillons réactifs qui ne se répètent pas. Solution BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 42 3000-1168 R03 08.2015 fre 1293 bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 VEDI CAMBI RISALTATI 3000-1168 1 x 96 TESTS 3000-1169 5 x 96 TESTS (480) Test ELISA per la determinazione degli anticorpi contro i virus dell’immunodeficienza umana (HIV) tipo 1 (gruppo M-O) o tipo 2 nei campioni di siero o plasma umani a uso dei laboratori clinici e come screening di prima linea nelle banche del sangue. Sommario L’evidenza sierologica dell’infezione da HIV si può ottenere mediante analisi finalizzate alle ricerca della presenza di antigeni o anticorpi HIV nel siero di soggetti in cui si sospetta un’infezione da HIV. In genere, l’antigene può essere individuato solo durante la fase acuta o la fase sintomatica dell’AIDS. Gli anticorpi contro l’HIV-1 e/o l’HIV-2 possono essere determinati durante l’intero periodo dell’infezione, a partire dalla fase acuta, o appena dopo, e fino alla fase terminale dell'AIDS. Quindi, l'impiego di test per anticorpi altamente sensibili è l'approccio principale nella sierodiagnosi dell'infezione da HIV. Oltre alla trasmissione sessuale, la principale via di infezione è rappresentata dalle trasfusioni di sangue. L'HIV può essere presente sia nelle frazioni cellulari sia in quelle acellulari del sangue umano. Quindi, tutto il sangue o il plasma proveniente da donazioni deve essere analizzato a causa del rischio di trasmissione dell’HIV attraverso sangue contaminato. Tale obiettivo può essere perseguito in modo efficace ricercando gli anticorpi contro l’HIV-1 e l'HIV-2 con test ELISA altamente sensibili. Principio Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è un metodo immuno-enzimatico di tipo “sandwich”, in cui i pozzetti di una micropiastra sono stati ricoperti con antigeni ricombinanti di HIV espressi in E. coli (ricombinanti di HIV-1 gp41 e gp120, e ricombinante di HIV-2 gp-36). I campioni di siero o plasma da analizzare vengono aggiunti in questi pozzetti. Se nel campione sono presenti anticorpi specifici anti-HIV1/2, essi formeranno complessi stabili con gli antigeni HIV ricombinanti. I micropozzetti vengono quindi lavati per rimuovere le proteine sieriche non legate. Nei pozzetti viene aggiunta una seconda serie di antigeni ricombinanti coniugati con perossidasi che esprimono gli stessi epitopi. Durante la seconda fase di incubazione, questi antigeni si legheranno agli specifici anticorpi di cattura. Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, vengono aggiunte soluzioni di cromogeno nei pozzetti. Nei pozzetti contenenti l’mmunocomplesso a “sandwich” antigene-anticorpo-antigene, i cromogeni incolori vengono idrolizzati da parte del coniugato legato, dando origine ad un prodotto di colore blu. Il colore blu virerà al giallo dopo l’arresto della reazione con acido solforico. L’intensità del colore può essere misurata e sarà proporzionale alla concentrazione di anticorpi anti-HIV 1/2 presente nel campione. I pozzetti contenenti campioni negativi rimarranno incolori. Componenti 1. MCPL MICROPIASTRA: 12 x 8 pozzetti rivestiti con antigeni HIV 1/2 ricombinanti (HIV-1 gp41 e gp120 ricombinanti, e HIV-2 gp36 ricombinante). Le strisce di micropozzetti sono esclusivamente MONOUSO. Non utilizzare se la sigillatura sottovuoto è stata danneggiata durante la prima estrazione dalla scatola. 2. CONTROL + 1 CONTROLLO POSITIVO HIV-1: Anticorpi anti-HIV-1 diluiti in un tampone proteico stabilizzato. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come conservante e colorante rosso. Pronto all’uso. 3. CONTROL + 2 CONTROLLO POSITIVO HIV-2: Anticorpi anti-HIV-2 diluiti in un tampone proteico stabilizzato. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come conservante e colorante rosso. Pronto all’uso. 4. CONTROL – CONTROLLO NEGATIVO: Tampone proteico stabilizzato negativo rispetto HBsAg e agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV e anti-TP. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come conservante e colorante giallo. Pronto all’uso. 5. CONJ CONIUGATO: Antigeni HIV-1 e HIV-2 ricombinanti coniugati con perossidasi. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come conservante e colorante rosso. Pronto all'uso. 6. WASH SOLN 20x SOLUZIONE DI LAVAGGIO CONCENTRATA: Tampone PBS concentrato pH 7,4 (20x). Contiene Tween-20 come detergente. Da diluire 1/20 in acqua distillata o acqua deionizzata prima dell’uso. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 43 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa 7. CHROM A SOLUZIONE DI CROMOGENO A: Soluzione di perossido di urea. Pronta all’uso. 8. CHROM B SOLUZIONE DI CROMOGENO B: Soluzione TMB (tetrametilbenzidina dissolta in acido citrico). 9. H2SO4 0,5M SOLUZIONE BLOCCANTE: Acido solforico 0,5M. Pronta all’uso. 10. SEALS FOGLI ADESIVI: Per coprire la micropiastra durante le incubazioni. 11. BAG SACCHETTO DI PLASTICA: Per conservare le strisce non adoperate. Precauzioni Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è per uso diagnostico IN VITRO. Solo per uso professionale. IVD ATTENZIONE: per la preparazione del controllo negativo di questo kit possono essere stati utilizzati materiali di origine umana. Questi materiali sono stati testati utilizzando kit con prestazioni accettate e sono risultati negativi per gli anticorpi contro HIV 1/2, HCV, TP e HBsAg. Tuttavia, poiché non esiste un metodo analitico che possa garantire la totale assenza di agenti infettivi nei campioni o nei reagenti, occorre trattare reagenti e campioni con estrema cautela, come se fossero in grado di trasmettere malattie infettive. Per stabilizzare i controlli positivi e negativi sono stati utilizzati sieri di derivazione bovina. L’albumina sierica bovina (BSA) e il siero fetale di vitello (FCS) derivano da animali provenienti da aree geografiche dove non è presente BSE/TSE. Controllo negativo, controllo positivo HIV-1, controllo positivo HIV-2 e coniugato contengono lo 0,1% di TM ProClin come conservante. Di seguito sono riportate le indicazioni di rischio (R) e sicurezza (S) appropriate: R43 Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. S28 In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente con abbondante acqua. S36/37/39 Usare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S45 In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). S60 Questo materiale e il suo contenitore devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi. S61 Non disperdere nell'ambiente. Riferirsi alle istruzioni speciali/ schede informative in materia di sicurezza. I test ELISA sono sensibili al trascorrere del tempo e alla temperatura. Per evitare risultati non corretti, seguire rigorosamente le fasi della procedura senza apportare alcuna modifica. 1. Non scambiare i reagenti provenienti da lotti differenti o impiegare reagenti di altri kit in commercio. I componenti del kit sono abbinati con precisione al fine di assicurare un’ottimale esecuzione dei test. 2. Assicurarsi che tutti i reagenti siano entro la data di validità riportata sulla scatola del kit e che appartengano allo stesso lotto. Non usare mai reagenti oltre la data di scadenza indicata sulle etichette o sulle scatole. 3. ATTENZIONE! Prima dell’uso, attendere che i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente (18-30°C). Agitare con delicatezza il reagente prima dell'uso. Riportare ad una temperatura di 2-8°C subito dopo l’uso. 4. Usare solo la quantità di campione indicata nella procedura. La mancata osservanza di questa indicazione può far diminuire la sensibilità del test. 5. Non toccare la parte inferiore esterna dei pozzetti: impronte o graffi possono interferire con la lettura dei risultati. Quando si leggono i risultati, assicurarsi che il fondo della piastra sia asciutto e che non vi siano bolle d'aria all'interno dei pozzetti. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 44 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa 6. Evitare che i pozzetti della micropiastra si asciughino dopo il lavaggio. Passare immediatamente alla fase successiva. Evitare la formazione di bolle d’aria quando si aggiungono i reagenti. 7. Evitare lunghi intervalli tra le varie fasi del test. Assicurare le stesse condizioni di lavoro per tutti i pozzetti. 8. Calibrare frequentemente le pipette per assicurare che la distribuzione di campioni/reagenti avvenga in modo preciso. Usare un puntale per pipette monouso diverso per ciascun campione e reagente, onde evitare contaminazioni crociate. 9. Assicurarsi che la temperatura di incubazione all’interno dell’incubatore sia di 37°C. 10. Quando si aggiungono i campioni, non toccare il fondo del pozzetto con il puntale della pipetta. 11. Quando si esegue una misurazione con un lettore di micropiastre, determinare l’assorbanza a 450 nm o a 450/620-630 nm. 12. L’attività enzimatica del coniugato potrebbe essere influenzata da polvere, reattivi chimici e sostanze come ipoclorito di sodio, acidi, alcali, ecc. Non eseguire il test in presenza di queste sostanze. 13. Se si impiega un’attrezzatura completamente automatica, durante l’incubazione, non coprire le piastre con il foglio adesivo. Dopo il lavaggio, si può anche evitare di estrarre i residui all’interno della piastra. 14. Tutti i campioni di origine umana devono essere considerati come potenzialmente infettivi. Una stretta osservanza delle norme di buona pratica di laboratorio può garantire la sicurezza delle persone. 15. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nel laboratorio di analisi. Non aspirare mai le soluzioni con la bocca direttamente dalla pipetta. 16. Le sostanze chimiche devono essere maneggiate e smaltite in conformità con le norme di buona pratica di laboratorio vigenti e con le normative locali o nazionali. 17. I puntali delle pipette, le fiale, le strisce ed i contenitori dei campioni, devono essere raccolti e sterilizzati in autoclave per almeno 2 ore a 121°C o trattati con ipoclorito di sodio al 10% per 30 minuti per decontaminarle prima di ogni ulteriore fase di smaltimento. Le soluzioni contenenti ipoclorito di sodio non devono MAI essere sterilizzate in autoclave. Le Schede di Sicurezza dei Materiali (MSDS) sono disponibili su richiesta. 18. Alcuni reagenti allo stato grezzo possono causare tossicità, irritazione, ustioni o avere un effetto cancerogeno. Evitare il contatto di cute e mucose con i seguenti reagenti (in via esemplificativa, ma non esaustiva): soluzione bloccante, cromogeni e tampone di lavaggio. INDIZI DI INSTABILITÀ E DETERIORAMENTO DEL REAGENTE: i valori dei controlli positivo o negativo al di fuori del range del controllo di qualità indicato, sono indicatori di un possibile deterioramento dei reagenti e/o di errori dell’operatore o dell’attrezzatura. In tal caso, i risultati devono essere considerati non validi e i campioni devono essere nuovamente testati. In caso di risultati erronei costanti e di provato deterioramento o instabilità dei reagenti, sostituire immediatamente il reagente con uno nuovo o contattare il distributore locale o il supporto tecnico Biokit per ottenere assistenza. Conservazione e stabilità I componenti del kit si manterranno stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta e sulla confezione, se conservati a 2-8°C. Non congelare. Per assicurare le massime prestazioni del kit bioelisa HIV-1+2 3.0, durante la conservazione proteggere i reagenti dalla contaminazione da parte di microrganismi o agenti chimici. Le strisce di micropozzetti si possono rompere ed essere utilizzate separatamente. Conservare i pozzetti o le strisce non utilizzati nel sacchetto di plastica richiudibile ermeticamente insieme al deumidificante e riportare a 2-8°C. Una volta aperta, la micropiastra è stabile per un mese a 2-8°C. Dopo l’apertura, il controllo negativo, il controllo positivo HIV-1, il controllo positivo HIV-2, il coniugato, la soluzione di cromogeno A, la soluzione di cromogeno B e la soluzione bloccante sono stabili per un mese a 2-8°C. La soluzione di lavaggio, una volta diluita, è stabile per una settimana a temperatura ambiente o per due settimane a 2-8°C. Confezioni disponibili Kit da 1 piastra (96 test), REF 3000-1168. Contiene: 1 piastra, 1 x 1 ml controllo negativo, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-1, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-2, 1 x 12 ml coniugato, 1 x 50 ml soluzione di lavaggio, 1 x 8 ml soluzione di cromogeno A, 1 x 8 ml soluzione di cromogeno B, 1 x 8 ml soluzione bloccante, 1 sacchetto di plastica e fogli adesivi (6 unità). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 45 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa - Kit da 5 piastre (5 x 96 test), REF 3000-1169. Contiene: 5 piastre, 3 x 1 ml controllo negativo, 3 x 1 ml controllo positivo HIV-1, 3 x 1 ml controllo positivo HIV-2, 5 x 12 ml coniugato, 2 x 125 ml soluzione di lavaggio, 1 x 60 ml soluzione di cromogeno A, 1 x 60 ml soluzione di cromogeno B, 1 x 60 ml soluzione bloccante, 1 sacchetto di plastica e fogli adesivi (20 unità). Materiale necessario non incluso Acqua distillata o deionizzata. Guanti monouso e timer. Contenitori adeguati per lo smaltimento di materiali potenzialmente contaminati. Condotti a V monouso. Sistema di distribuzione e/o pipetta (singola o multicanale) e puntali per pipetta monouso. Carta assorbente o asciugamano pulito. Incubatore a secco o bagno d’acqua, 37 ± 1°C. Microagitatore per sciogliere e mescolare il coniugato con i campioni. Lettore di micropiastre con filtro da 450 nm. Raccomandabile un filtro di riferimento da 620 nm o 630 nm. Sistema di lavaggio manuale o automatico. Raccolta, trasporto e conservazione del campione 1. Non è necessaria una particolare preparazione del paziente. Prelevare il campione secondo la normale pratica di laboratorio. Per il test possono essere utilizzati campioni di siero o plasma freschi. Il sangue prelevato mediante venipuntura deve essere lasciato coagulare completamente e in modo naturale (il siero/plasma deve essere separato dal coagulo il più presto possibile per evitare l’emolisi). Prestare particolare attenzione per assicurarsi che i campioni di siero siano limpidi e non contaminati da microrganismi. Tutte le particelle di materia visibili nel campione devono essere rimosse mediante centrifugazione a 3000 RPM (giri al minuto) per 20 minuti a temperatura ambiente o mediante filtraggio. 2. È possibile utilizzare campioni di plasma prelevati in EDTA, citrato di sodio o eparina, ma non si devono impiegare campioni altamente lipemici, itterici o emolitici poiché possono dare risultati falsi. Non inattivare a caldo i campioni in quanto ciò potrebbe causare il deterioramento dell’analita bersaglio. Non si devono mai utilizzare campioni con contaminazione microbica visibile. 3. Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è pensato SOLO per l’analisi di campioni di siero o plasma. Non eseguire il test su campioni prelevati da cadavere, saliva, urina o altri fluidi corporei, o sangue accumulato (mescolato). 4. Trasporto e conservazione: conservare i campioni a 2-8°C. I campioni che non devono essere analizzati entro 3 giorni devono essere congelati (-20°C o temperatura inferiore). Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento del campione. Per il trasporto, i campioni devono essere imballati ed etichettati secondo la vigente normativa locale e internazionale per il trasporto di campioni clinici e agenti etiologici. Trattamento automatico Questo test è utilizzabile con vari strumenti. È molto importante validare qualsiasi sistema automatico per dimostrare che i risultati ottenuti con i campioni sono equivalenti a quelli del test manuale. È raccomandabile validare periodicamente lo strumento. In caso di difficoltà nella programmazione e regolazione dei processori automatici Biokit, contattare il proprio distributore. PROCEDURA (vedere schema del procedimento) Operazioni preliminari Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (20-25°C) prima di cominciare il test. Controllare il tampone di lavaggio concentrato per determinare la presenza di cristalli di sale. Se si sono formati cristalli, solubilizzare riscaldando a 37°C finché i cristalli non si dissolvono. Diluire il tampone di lavaggio 1:20, come indicato nelle istruzioni per il lavaggio. Utilizzare acqua distillata o deionizzata e solo recipienti puliti per diluire il tampone. Tutti gli altri reagenti sono PRONTI ALL’USO. Istruzioni per il lavaggio Una buona procedura di lavaggio è essenziale per ottenere dati analitici corretti e precisi. Si raccomanda di utilizzare un lavatore per micropiastre ELISA di buona qualità, mantenuto al miglior livello delle prestazioni di lavaggio. Generalmente sono necessari almeno 5 cicli di lavaggio automatico da 350-400 µl/pozzetto per evitare false reazioni positive ed un rumore di fondo elevato. Per evitare contaminazioni crociate della piastra con campione o coniugato, dopo l’incubazione non eliminare il contenuto dei pozzetti ma lasciare che il lavatore per micropiastre lo aspiri automaticamente. Assicurarsi che i canali dispensatori del liquido del lavatore per micropiastre non siano ostruiti o contaminati e che una quantità sufficiente di tampone di lavaggio venga ogni volta distribuita nei pozzetti. In caso di lavaggio manuale, si suggerisce di eseguire 5 cicli di lavaggio dispensando 350-400 µl/pozzetto e aspirando il liquido per 5 volte. Se si osservano scarsi risultati (rumore di fondo più elevato), aumentare i cicli di lavaggio o il tempo di ammollo dei pozzetti. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 46 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa In ogni caso, prima che possa essere smaltito in modo adeguato, il liquido aspirato dalle strisce deve essere trattato con una soluzione di ipoclorito sodico a una concentrazione finale di 2,5% per 24 ore. Il tampone di lavaggio concentrato deve essere diluito a 1:20 prima dell’uso. Se non si usa tutta la piastra, preparare un volume di soluzione proporzionale all’uso. Fase 1 Preparazione: contrassegnare tre pozzetti come controllo negativo (ad es. B1, C1, D1), due pozzetti come controllo positivo (ad es. E1 per HIV-1 e F1 per HIV-2) e uno come bianco (ad es. A1, nel pozzetto del bianco non vanno aggiunti né campioni né coniugato). Se i risultati saranno determinati mediante l’uso di un lettore di piastra a lunghezza d’onda doppia, si può evitare l'impiego del pozzetto del bianco. Utilizzare solamente il numero di strisce necessario per il test. Fase 2 Aggiunta del Campione: aggiungere 100 μl di campioni e 100 μl di controlli positivo e negativo nei rispettivi pozzetti. NOTA: usare un puntale monouso per pipetta diverso per ciascun campione, controllo negativo e positivo per evitare contaminazioni crociate. Fase 3 Incubazione del campione: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37°C per 30 ± 1 minuti. È consigliabile utilizzare un recipiente con acqua controllata con termostato per assicurare che temperatura e umidità rimangano stabili durante l’incubazione. Se viene utilizzato un incubatore a secco, non aprire lo sportello frequentemente. Fase 4 Lavaggio (1): al termine dell’incubazione, rimuovere ed eliminare il foglio adesivo. Lavare ciascun pozzetto 5 (cinque) volte con tampone di lavaggio diluito. Lasciare ogni volta i micropozzetti in ammollo per 30-60 secondi. Dopo l’ultimo ciclo di lavaggio, capovolgere la piastra su carta assorbente o su un asciugamano pulito e asciugarla per rimuovere eventuali residui. Fase 5 Aggiunta del coniugato: aggiungere 100 μl di reagente coniugato in ciascun pozzetto, tranne che in quello del bianco. Fase 6 Incubazione del coniugato: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37°C per 30 ± 1 minuti. Fase 7 Lavaggio (2): come nella Fase 4. Fase 8 Colorazione: aggiungere 50 μl di soluzione di cromogeno A e 50 μl di soluzione di cromogeno B in ciascun pozzetto, incluso il bianco. Incubare la piastra a 37°C per 15 minuti al riparo dalla luce. La reazione enzimatica tra le soluzioni di cromogeno ed il coniugato dà luogo a una colorazione blu nei pozzetti del controllo positivo e dei campioni positivi HIV 1/2. Fase 9 Reazione bloccante: aggiungere 50 µl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto manualmente o impiegando una pipetta multicanale e mescolare delicatamente. Nei pozzetti del controllo positivo e dei campioni positivi HIV 1/2 si sviluppa un colore giallo intenso. Fase 10 Misurazione dell’assorbanza: calibrare il lettore di piastra con il pozzetto del bianco e leggere l’assorbanza a 450 nm. Se viene impiegato uno strumento a doppio filtro, regolare la lunghezza d’onda di riferimento a 620 nm o 630 nm. Calcolare il valore di soglia e valutare i risultati. (NOTA: leggere l’assorbanza entro un massimo di 10 minuti dall’arresto della reazione.) Controllo di qualità Ciascun laboratorio dovrebbe definire un adeguato sistema di controllo di qualità con materiali di controllo della qualità simili o identici a quelli del campione dei pazienti analizzato. - Il valore di assorbanza del pozzetto del bianco, che contiene solo soluzioni di cromogeno e bloccante, deve essere inferiore a 0,080 a 450 nm. Il valore di assorbanza del controllo positivo deve essere ≥ 0,800 a 450/620-630 nm o a 450 nm dopo la sottrazione del bianco. Ogni singolo valore di assorbanza del controllo negativo deve essere inferiore a 0,100 a 450/620-630 nm o a 450 nm dopo aver sottratto il bianco. Se uno dei valori del controllo negativo non rientra nei criteri del controllo di qualità, deve essere scartato e il valore medio va ricalcolato utilizzando i due valori rimanenti. Se più di un valore di assorbanza del controllo negativo non rientrano nell’intervallo del controllo di qualità, il test non è valido e deve essere ripetuto. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 47 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa Risultati Ciascuna micropiastra deve essere considerata separatamente quando si calcolano e si interpretano i risultati del test, indipendentemente dal numero di piastre processate contemporaneamente. I risultati vengono calcolati mettendo in relazione il valore di assorbanza (S) di ciascun campione con il valore di soglia (CO) della piastra. Se la lettura del valore di soglia si basa su un lettore di piastra a filtro singolo, i risultati vanno calcolati sottraendo il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei campioni e dei controlli. Nel caso di un lettore di piastra a doppio filtro, non si deve sottrarre il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei campioni e dei controlli. Calcolare il valore di soglia aggiungendo 0,120 all’assorbanza media del controllo negativo. Valore di soglia = CNx + 0,120 Esempio: Valore di assorbanza del pozzetto del bianco: A1= 0,025 a 450 nm (NOTA: il pozzetto del bianco è necessario solo per la lettura con filtro singolo a 450 nm). Pozzetto n.: Ctrl Neg: Pozzetto n.: Ctrl Pos: B1 0,012 E1 2,363 C1 0,010 F1 2,436 D1 0,011 Tutti i valori dei controlli sono entro il range del controllo di qualità stabilito. Calcolo del CNx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011 Calcolo del valore di soglia: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131 Interpretazione dei risultati Dividere l’assorbanza del campione per il valore di soglia. (S/CO) Risultati negativi (S/CO < 1): i campioni con un’assorbanza inferiore al valore di soglia sono negativi per questo test: ciò significa che non sono stati determinati anticorpi anti-HIV 1/2 con il kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Un risultato negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HIV. Risultati positivi (S/CO ≥ 1): i campioni con un’assorbanza uguale o maggiore al valore di soglia sono considerati inizialmente reattivi: ciò indica che, probabilmente, impiegando bioelisa HIV-1+2 3.0 sono stati rilevati anticorpi anti-HIV 1/2. Prima dell’interpretazione finale dei risultati del test, tutti i campioni inizialmente reattivi devono essere testati nuovamente in duplicato con bioelisa HIV-1+2 3.0. I campioni ripetutamente reattivi possono essere considerati positivi per gli anticorpi anti-HIV 1/2 con bioelisa HIV-1+2 3.0. Dubbi (S/CO = 0,9-1,1): i campioni con un rapporto assorbanza / valore di soglia compreso tra 0,9 e 1,1 sono considerati dubbi ed è necessario un nuovo test in duplicato di questi campioni per confermare i risultati iniziali. Sono necessari follow-up, conferma e test supplementari dei campioni positivi con altri sistemi di analisi (ad es. WB, PCR). La diagnosi clinica non deve essere stabilita basandosi sul risultato di un singolo test, ma deve integrare i dati clinici con altri dati e reperti di laboratorio. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI INIZIALI E FOLLOW-UP DI TUTTI I CAMPIONI INIZIALMENTE REATTIVI O DUBBI Rip. in duplicato ○,+○,+ Interpretazione + Follow-up ○,+○,- ○,-○,- S/CO ≥ 0,9 Interpretazione S/CO < 0,9 IND - IND = non interpretabile BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 48 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa - - - Se, dopo la ripetizione del test dei campioni inizialmente reattivi, entrambi i pozzetti danno risultati negativi (S/CO < 0,9), questi campioni devono essere considerati positivi non ripetibili (o falsi positivi) e registrati come negativi. Come per molti test ELISA molto sensibili, i falsi positivi possono verificarsi per svariate ragioni, la maggior parte delle quali connesse, ma non limitate, ad un lavaggio inadeguato. Per maggiori informazioni relative alla risoluzione dei problemi del test bioelisa, fare riferimento alla Guida per la soluzione dei problemi. Se dopo la ripetizione del test in duplicato, uno o entrambi i pozzetti danno risultati positivi, il risultato finale di questo test ELISA deve essere registrato come ripetutamente reattivo. I campioni ripetutamente reattivi possono essere considerati positivi per gli anticorpi anti-HIV 1/2 e quindi il paziente presenta probabilmente infezione da HIV 1/2 e l’unità di sangue deve essere smaltita. Dopo la ripetizione del test in duplicato, campioni con valori prossimi al valore di soglia dovranno essere interpretati con cautela e considerati come campioni in zona "dubbia" o non interpretabili al momento del test. Limitazioni della procedura 1. I risultati positivi devono essere confermati con un altro metodo disponibile e interpretati congiuntamente alle informazioni cliniche del paziente. 2. È possibile che durante la fase iniziale della malattia e in alcuni soggetti immunodepressi gli anticorpi non siano determinabili. Pertanto, i risultati negativi ottenuti con il test bioelisa HIV-1+2 3.0 indicano soltanto che il campione non contiene un livello rilevabile di anticorpi anti-HIV 1/2 e che ogni risultato negativo non va considerato come un’evidenza conclusiva di infezione da HIV-1 o HIV-2. 3. Gli errori più comuni relativi al test sono: impiego di kit scaduti, procedure di lavaggio non corrette, reagenti contaminati, fasi della procedura non corrette, aspirazione insufficiente durante il lavaggio, mancata aggiunta di campioni o reagenti, utilizzo inadeguato dell’attrezzatura del laboratorio, errore nel calcolo dei tempi, uso di campioni altamente emolizzati o di campioni contenenti fibrina, campioni di siero non completamente coagulati. 4. La prevalenza del marker inciderà sui valori predittivi del test. 5. Questo test non può essere utilizzato per analizzare plasma accumulato (mescolato). Il test bioelisa HIV-1+2 3.0 è stato validato solo per l’analisi di campioni di siero o plasma singoli. 6. bioelisa HIV-1+2 3.0 è un test qualitativo ed i risultati non possono essere impiegati per misurare la concentrazione degli anticorpi. Questo test non consente di effettuare una distinzione tra infezioni da HIV-1 e da HIV-2. Caratteristiche di funzionalità Lo studio di valutazione condotto ad Alkmaar, Paesi Bassi, tra aprile e novembre 2005, ha dimostrato le seguenti caratteristiche di funzionalità di bioelisa HIV-1+2 3.0. La specificità diagnostica del kit è stata del 99,85% come determinato su tutti i campioni negativi analizzati (5471). Quando la specificità è stata studiata solo su donatori non selezionati (donatori casuali e alla prima donazione), è risultata del 99,92% (IC 95%, 99,84-100%). Risultati del test bioelisa HIV-1+2 3.0 su donatori non selezionati: Pannello Donatori casuali siero Donatori casuali plasma Donatori alla prima donazione Totale Positivo (S/CO ≥ 1) Numero % 2 0,08 1 0,07 1 0,10 Numero testati 2654 1400 989 5043 4 Negativo (S/CO < 1) Numero % 2652 99,92 1399 99,93 988 99,90 0,08 5039 99,92 Tutti i pannelli di campioni positivi confermati per gli anticorpi anti-HIV-1, HIV-1 sottotipo O e HIV-2 utilizzati in questo studio, sono anche risultati reattivi con il test bioelisa HIV-1+2 3.0, determinando una sensibilità diagnostica del 100%. Un totale di 32 pannelli di sieroconversione, che rappresentano 210 campioni testati. 13 campioni non classificati da PRB918 e PRB917 a causa dell'assenza dei dati sulla determinazione dell'RNA o dell'antigene necessari per la classificazione. 41 campioni classificati come negativi. Negativi per l'RNA e/o l'antigene. 61 campioni classificati come sieroconversione precoce. 95 campioni classificati come sieroconversione. I risultati del test mostrano anche che bioelisa HIV-1+2 3.0 è un test all'avanguardia rispetto alla maggior parte dei test con marchio CE attualmente disponibili sul mercato. La sensibilità analitica è stata valutata su pannelli anti-HIV PeliCheck. La sensibilità analitica di bioelisa HIV-1+2 3.0 sulle diluizioni standard anti-HIV PeliCheck è risultata comparabile a quella di altri test anti-HIV. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 49 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa Specificità analitica: I risultati del test bioelisa HIV-1+2 3.0 su campioni prelevati da pazienti ospedalizzati e su campioni con possibile reattività crociata: Numero di campioni testati 296 101 17 5 5 4 Tipo di campione Mononucleosi Donna in gravidanza RF+ Anti-TPO Anti- muscolo liscio Livelli di IgG elevati Totale 428 Positivi (S/CO ≥1) Negativi (S/CO <1) Numero 4 0 0 0 0 0 % 1,35 0 0 0 0 0 Numero 292 101 17 5 5 4 % 98,65 100 100 100 100 100 4 0,93 424 99,07 In un altro studio, sono stati ottenuti i seguenti risultati di specificità: - Il possibile effetto gancio alle alti dosi viene eliminato a causa dell’esecuzione di una procedura a due fasi. Sono stati analizzati campioni positivi/negativi congelati per verificare le interferenze dovute al prelievo e alla conservazione. Non sono stati osservati effetti sulle caratteristiche delle prestazioni di bioelisa HIV-1+2 3.0 per almeno 3 cicli di congelamento/scongelamento. Sono stati testati campioni prelevati da pazienti con virus dell’epatite A, B, C ed E, nonché campioni prelevati da pazienti con infezione da Treponema pallidum, e non è stata osservata alcuna reattività crociata. Con il bioelisa HIV-1+2 3.0 sono stati testati 25 campioni di siero fresco positivi, analizzati presso l'ISTITUTO DI MEDICINA TROPICALE, BELGIO. Tutti i 25 campioni di siero fresco positivi sono risultati positivi al bioelisa HIV-1+2 3.0. Precisione: Le seguenti tabelle riportano i risultati della sensibilità analitica e della riproducibilità di bioelisa HIV-1+2 3.0 con run control PeliSpy Multi-Marker e con campione QC interno testato in ciascuna piastra; la diluizione 1:2048 dello standard anti-HIV in questo campione PeliSpy è stata rilevata in modo coerente in tutte le piastre. In tutte le piastre è stato sempre determinato un campione QC interno. Risultati con PeliSpy Multi-Marker: Diluizione n Media 1:2048 80 3,08 Percentili 5° 95° 1,76 4,39 Misurati Min 1,70 Max 4,96 Risultati con campione QC interno: n Media 160 7,71 Percentili 5° 95° 5,32 10,10 Misurati Min 4,37 Max 10,89 MODELLO DI SCHEMA DELLA DISTRIBUZIONE DEI CONTROLLI/CAMPIONI 1 2 3 4 5 6 7 … … 12 A Bianco CAMP 3 B Neg … C Neg … D Neg E Pos (HIV-1) F Pos (HIV-2) G CAMP 1 H CAMP 2 BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 50 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi Problema Possibili cause Soluzione 1. Controlli non convalidanti. 1a. Temperatura, incubazione o pipettaggio erronei. 1b. Preparazione erronea dei reagenti, errore nelle diluizioni, reagenti non correttamente mescolati. 1c. crociata Inquinamento incrociato dei controlli. Verificare procedimento. Ripetere il test. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. Senza colore o con poco colore alla fine della prova. 2a. 2b. 2c. 2d. Verificare procedimento. Ripetere il test. Pipettare con attenzione. Non scambiare i tappi. Ripetere il test. Filtro di lettura erroneo. Controllare che il filtro di lettura sia di 450 nm. Se non si usa un filtro di riferimento di 620-630 nm, le assorbanze aumentano di circa 0,050. Interferenza nella via Controllare il lettore. Pulire o ottica. asciugare il fondo della micropiastra. Verificare l’assenza di bolle d’aria. Ripetere la lettura. Sono stati usati Non utilizzare componenti di componenti di lotti diversi. lotti diversi dato che sono dosati per ogni singolo lotto. Reagenti scaduti. Controllare la scadenza del kit e dei suoi componenti. Non usare kit o reagenti scaduti. Uno o più reagenti non Verificare procedimento. sono stati aggiunti o sono Ripetere il test. stati aggiunti in sequenza sbagliata. Coniugato inattivo: Controllare se vi è stato conservazione erronea. inquinamento. Verificare il procedimento. Ripetere il test. Micropiastra inattiva: Conservare sempre le strisce conservazione erronea. non utilizzate nel sacchetto ben chiuso con il deumidificante dentro. Ripetere il test. Soluzioni di cromogeno A Utilizzare contenitori monouso e/o B inattive: oppure lavati con acido o conservazione erronea. Il etanolo e sciacquati con contenitore utilizzato acqua deionizzata prima del influisce sulla stabilità del riutilizzo. Verificare il cromogeno, inquinamento procedimento. Ripetere il test. incrociato con la soluzione bloccante. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 51 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi Problema Possibili cause Soluzione 3a. Soluzioni di cromogeno A Controllare che le soluzioni di e/o B contaminate, cromogeno A e B siano ossidate. incolori, scartarle se sono blu. Utilizzare contenitori lavati con acido o etanolo oppure monouso. Ripetere il test. 3b. Reagenti contaminati o Controllare l’inquinamento preparati in modo (aspetto torbido). Controllare sbagliato. le diluizioni. Ripetere il test. 3c. Soluzione di lavaggio (1x) Controllare la qualità inquinata. dell’acqua distillata o deionizzata per utilizzata per preparare la diluizione. Ripetere il test. 3d. Lavaggio insufficiente o Controllare il lavatore. impreciso: riempimento Riempire i pozzetti fino all’orlo e/o aspirazione con la soluzione di lavaggio e insufficienti o non aspirare completamente. uniformi. Numero di cicli Aumentare il numero dei di lavaggio insufficiente, cicli di lavaggio e il tempo di contaminato lavatore ammollo. Dopo il lavaggio, inquinato. asciugare la micropiastra capovolta su carta assorbente. 3e. È stata adoperata una Utilizzare solo la soluzione di soluzione di lavaggio di lavaggio fornita con il kit. differente marca diversa. 4a. Problemi di lavaggio. 4. Troppo colore in tutti i Vedere 3c, 3d, 3e. pozzetti della micropiastra. 4b. Pipette calibrate male o Usare solo pipette calibrate, puntali incastrati male. con puntali ben fissati e Tecnica di pipetaggio pipettare accuratamente, erronea. senza fare bolle né schizzi. Ripetere il test. 4c. Reagenti e campione non Portare a temperatura a temperatura ambiente o ambiente i campioni e i non mescolati reagenti e miscelare bene correttamente prima prima dell’uso. 4d. Correnti d’aria sulla Mantenere la micropiastra al micropiastra durante le riparo dalle correnti d’aria. incubazioni. 4e. Tempi troppo lunghi La tecnica deve essere nell’aggiunta di campioni uniforme e precisa. e/o reagenti. Imprecisione negli intervalli di tempo. Bolle d’aria. 4f. Interferenza nella via Vedere 1e. ottica. 3. Troppo colore in tutti i pozzetti della micropiastra. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 52 3000-1168 R03 08.2015 ita 1293 bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 LER ALTERAÇÕES DESTACADAS 3000-1168 1 x 96 TESTS 3000-1169 5 x 96 TESTS (480) Teste de ELISA para a detecção de anticorpos dos Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) tipo 1 (grupo M-O) ou tipo 2 em amostras de soro ou plasma humanos em laboratórios clínicos e como teste de rastreamento de primeira linha nos centros hematológicos. Sumário As evidências serológicas de infecção por HIV podem ser obtidas testando a presença de antígenos ou anticorpos no soro de indivíduos com suspeita de infecção por HIV. Normalmente, o antígeno só pode ser detectado na fase aguda e na fase sintomática da AIDS. Os anticorpos de HIV-1 e/ou HIV-2 podem ser detectados em praticamente todo o período de infecção, começando na, ou pouco depois da fase aguda, e durando até a fase final da AIDS. Assim, o uso de testes de anticorpos altamente sensíveis é a abordagem primária nos serodiagnósticos da infecção por HIV. Além da transmissão sexual, a principal via de transmissão do HIV é a transfusão sanguínea O HIV pode estar presente nas frações celulares ou nas frações acelulares do sangue humano. Portanto, todas as doações de sangue ou plasma devem ser testadas devido ao risco de transmissão de HIV através de sangue contaminado. Isso pode ser realizado eficazmente testando a presença de anticorpos de HIV-1 e de HIV-2 usando testes ELISA altamente sensíveis. Princípio O bioelisa HIV-1+2 3.0 é um método imunoenzimático direto, de tipo “sanduíche” de dois passos de incubação, em que os pocinhos de uma microplaca são recobertos com antígenos recombinantes de HIV expressos em E. coli (HIV-1 recombinante gp41, gp120 e HIV-2 recombinante gp-36). As amostras de soro ou plasma são adicionadas a esses pocinhos para análise. Se estiverem presentes anticorpos específicos de HIV1/2 na amostra, irão formar complexos estáveis com os antígenos de HIV recombinante. Os micropocinhos são depois lavados para remover proteínas séricas não ligadas. Adiciona-se aos pocinhos um segundo conjunto de antígenos recombinantes conjugados com peroxidase e expressando os mesmos epítopos. Durante o segundo passo de incubação, esses antígenos vão ligar-se a anticorpos capturados específicos. Depois de uma segunda lavagem para remover o conjugado não ligado, é adicionada uma solução Cromogênica aos pocinhos. Nos pocinhos que contêm o imunocomplexo do tipo sanduíche antígeno-anticorpo-antígeno, os Cromogênios incolores são hidrolisados pelo conjugado ligado, a um produto de cor azul. A cor azul muda para amarelo depois do bloqueio da reação com ácido sulfúrico. A intensidade da cor pode ser medida e é proporcional à concentração de anticorpos anti-HIV 1/2 da amostra. Os pocinhos que contêm amostras negativas permanecem incolores. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocinhos recobertos com antígenos recombinantes HIV 1/2 (HIV-1 recombinante gp41, gp120 e HIV-2 recombinante gp36). As tiras de micropocinhos são para USO ÚNICO. Não utilizar se a vedação a vácuo estiver danificada ao retirá-las da caixa pela primeira vez. 2. CONTROL + 1 HIV-1 CONTROLE POSITIVO: Anticorpos de HIV-1 diluídos em solução tampão estabilizada com proteínas. Contém 0,1% ProClinTM 300 como conservante e corante vermelho. Pronto para usar. 2. CONTROL + 2 HIV-2 CONTROLE POSITIVO: Anticorpos de HIV-2 diluídos em solução tampão estabilizada com proteínas. Contém 0,1% ProClinTM 300 como conservante e corante vermelho. Pronto para usar. 4. CONTROL – CONTROLE NEGATIVO: Solução tampão estabilizada com proteínas negativa perante HBsAg, HIV-1, HIV-2, HCV e TP. Contém 0,1% ProClinTM 300 como conservante e corante amarelo. Pronto para usar. 5. CONJ CONJUGADO: Antígenos recombinantes HIV-1 e HIV-2 conjugados com peroxidase. Contém 0,1% ProClinTM 300 como conservante e corante vermelho. Pronto para usar. 6. WASH SOLN 20x SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA: Solução tampão PBS concentrada pH 7,4 (20x). Contém Tween-20 como detergente. A diluir 1/20 em água destilada ou desionizada antes de usar. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 53 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa 7. CHROM A SOLUÇÃO CROMOGÊNICA A: Solução de peróxido de ureia. Pronto para usar. 8. CHROM B SOLUÇÃO CROMOGÊNICA B: Solução TMB (Tetrametilbenzidina dissolvida em ácido cítrico). 9. H2SO4 0,5M SOLUÇÃO DE BLOQUEIO: Ácido sulfúrico 0,5M. Pronto para usar. 10. SEALS FOLHAS ADESIVAS: Para recobrir as microplacas durante as incubações. BOLSAS DE PLÁSTICO: 11. BAG Para guardar as tiras não utilizadas. Precauções O bioelisa HIV-1+2 3.0 é para o diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivamente por profissionais. IVD AVISO: Podem ter sido usados materiais de origem humana na preparação do Controle Negativo do kit. Esses materiais foram testados com kits de teste com desempenho aceite e considerados negativos a anticorpos de HIV 1/2, HCV, TP e HBsAg. No entanto, não existe qualquer método analítico que possa garantir a ausência total de agentes infecciosos das amostras ou dos reagentes. Assim, os agentes e as amostras devem ser manuseados com extrema precaução como se fossem material potencialmente infeccioso. Foram usados soros derivados de bovinos para estabilizar os controles positivo e negativo. A albumina de soro bovino (BSA) e os soros fetais de vitela (FCS) são derivados de animais de zonas geográficas isentas de EEB/EET. O Controle negativo, o controle positivo HIV-1, o controle positivo HIV-2 e o Conjugado contêm 0,1% de TM ProClin como conservante. A seguir, indicam-se as frases de risco (R) e de segurança (S) adequadas: R43 Pode causar sensibilização em contato com a pele. S26 Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um especialista. S28 Após contacto com a pele, lavar imediata e abundantemente com bastante água. S36/37/39 Usar vestuário de protecção, luvas e equipamento protector para os olhos/face adequados. S45 Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente o médico (se possível mostrar-lhe o rótulo). S60 Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos. S61 Evitar a libertação para o ambiente. Obter instruções específicas/fichas de segurança. Os testes ELISA são sensíveis ao tempo e à temperatura. Para evitar resultados incorretos, cumpra exatamente os passos do procedimento do teste e não os modifique. 1. Não troque reagentes de lotes diferentes, nem use reagentes de outros kits à venda no mercado. Os componentes desse kit correspondem exatamente a um desempenho ótimo dos testes. 2. Assegure-se que todos os reagentes se encontram no prazo de validade indicado na caixa do kit e são do mesmo lote. Nunca use reagentes depois da data de validade indicada nas etiquetas ou nas caixas. 3. PRECAUÇÃO - PASSO CRÍTICO: Deixe que todos os reagentes e amostras atinjam a temperatura ambiente (18-30ºC) antes de usar. Agite suavemente o reagente antes de usar. Volte a colocar a uma temperatura entre 2 e 8°C imediatamente depois de usar. 4. Use apenas o volume de amostra suficiente, como indicado nos passos do procedimento. Caso contrário, pode provocar uma baixa sensibilidade do teste. 5. Não toque na parte exterior do fundo dos pocinhos; dedadas ou arranhões podem interferir na leitura. Ao ler os resultados, assegure-se que a parte inferior da placa está seca e que não existem bolhas de ar nos pocinhos. 6. Nunca deixe os pocinhos da microplaca secarem depois do passo de lavagem. Passe imediatamente para o passo seguinte. Evite a formação de bolhas de ar quando adicionar os reagentes. 7. Evite interrupções demoradas entre os passos do teste. Assegure-se que as condições de trabalho são iguais para todos os pocinhos. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 54 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa 8. Calibre a pipeta frequentemente para garantir a exatidão da dispensa das amostras e dos reagentes. Use ponteiras de pipeta diferentes para cada amostra e reagente para evitar contaminações cruzadas. 9. Assegure-se que a temperatura da incubação é de 37°C no interior do incubador. 10. Quando adicionar as amostras, não toque na parte inferior do pocinho com a ponteira da pipeta. 11. Quando medir com um leitor de placas, determine a absorvância a 450 nm ou a 450/620-630 nm. 12. A atividade enzimática do Conjugado pode ser afetada por pó, produtos e substâncias químicas como o hipoclorito de sódio, ácidos, bases, etc. Não efetue o teste na presença dessas substâncias. 13. Se usar equipamento totalmente automatizado, durante a incubação, não tape as placas com a folha adesiva. A parte de bater na placa para retirar os resíduos depois da lavagem também pode se omitida. 14. Todas as amostras de origem humana devem ser consideradas como potencialmente infecciosas. A adesão estrita aos regulamentos de Boas Práticas Laboratoriais (GLP) pode garantir a segurança pessoal. 15. Nunca coma, beba, fume ou aplique cosméticos no laboratório de testes. Nunca pipete as soluções com a boca. 16. Os produtos químicos devem ser manuseados e eliminados apenas de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais (GLP) atuais e com os regulamentos nacionais ou locais. 17. As ponteiras das pipetas, os frascos, as tiras e os recipientes das amostras devem ser recolhidos e colocados em autoclave durante um período nunca inferior a 2 horas a 121°C ou tratados com hipoclorito de sódio a 10% durante 30 minutos para descontaminação, antes de qualquer outro passo de eliminação. As soluções que contêm hipoclorito de sódio NUNCA devem ser colocadas em autoclave. Ficha de dados de segurança do material (MSDS) disponível a pedido. 18. Alguns reagentes podem causar toxicidade, irritação, queimaduras ou ter efeitos carcinogênicos como matérias-primas. O contacto com a pele e as mucosas deve ser evitado e não se limita aos seguintes reagentes: Solução de bloqueio, os Cromogênios e o Tampão de lavagem. INDICAÇÕES DE INSTABILIDADE E DETERIORAÇÃO DO REAGENTE: Os valores dos controles Positivo e Negativo que estão fora do intervalo de controle de qualidade indicado, são indicadores da possível deterioração dos reagentes e/ou erros do operador ou do equipamento. Nesse caso, os resultados devem ser considerados inválidos e as amostras devem ser testadas novamente. No caso de resultados errados constantes e deterioração ou instabilidade comprovada dos reagentes, substitua de imediato os reagentes por um novo reagente ou contate o distribuidor local ou a assistência técnica do biokit para obter ajuda. Conservação e estabilidade Os componentes do kit irão permanecer estáveis até a data de validade indicada na etiqueta e na embalagem quando armazenados entre 2 e 8°C. Não congelar. Para garantir o máximo desempenho do kit bioelisa HIV-1+2 3.0, durante o armazenamento, proteja os reagentes de contaminação com microrganismos ou produtos químicos. As tiras do micropocinhos podem ser separadas para uso individual. Coloque os pocinhos ou as tiras não usados na bolsa de plástico para armazenamento junto com o dessecante e volte a colocar entre 2 e 8°C. Depois de aberta, a microplaca é estável durante um mês a uma temperatura entre 2 e 8°C. O Controle Negativo, o Controle Positivo HIV-1, o Controle Positivo HIV-2, o Conjugado, a Solução Cromogênica A, a Solução Cromogênica B e a Solução de Bloqueio, depois de abertos, são estáveis durante um mês a uma temperatura entre 2 e 8°C. A Solução de Lavagem, depois de diluída, é estável durante uma semana à temperatura ambiente ou durante duas semanas a uma temperatura entre 2 e 8°C. Apresentações disponíveis Kit de 1 placa (96 testes), REF 3000-1168. Contendo: 1 placa, 1 x 1 ml controle negativo, 1 x 1 ml controle positivo HIV-1, 1 x 1 ml controle positivo HIV-2, 1 x 12 ml conjugado, 1 x 50 ml solução de lavagem, 1 x 8 ml solução cromogênica A, 1 x 8 ml solução cromogênica B, 1 x 8 ml solução de bloqueio, 1 bolsa de plástico e folhas adesivas (6 unidades). - Kit de 5 placas (5 x 96 testes), REF 3000-1169. Contendo: 5 placas, 3 x 1 ml controle negativo, 3 x 1 ml controle positivo HIV-1, 3 x 1 ml controle positivo HIV-2, 5 x 12 ml conjugado, 2 x 125 ml solução de lavagem, 1 x 60 ml solução cromogênica A, 1 x 60 ml solução cromogênica B, 1 x 60 ml solução de bloqueio, 1 bolsa de plástico e folhas adesivas (20 unidades). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 55 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa Material necessário não incluído Água destilada ou desionizada Luvas descartáveis e temporizador. Recipientes de resíduos adequados para material potencialmente contaminado. Recipientes descartáveis em V. Sistema de dispensa e/ou pipeta (simples ou multicanal) e ponteiras de pipeta descartáveis. Tecido absorvente ou toalha limpa. Incubadora a seco ou em banho-maria, 37 ± 1°C. Microagitador para dissolver e misturar o conjugado com as amostras. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Recomenda-se um filtro de referência de 620 nm ou 630. Sistema de lavagem manual ou automático. Coleta, transporte e armazenamento de amostras 1. Não é necessária uma preparação especial do doente. Recolha a amostra de acordo com as práticas laboratoriais normais. Esse teste permite a utilização de amostras frescas de soro ou plasma. O sangue coletado por punção venosa deve coagular totalmente de forma natural – o soro ou plasma deve separar-se do coágulo o mais depressa possível para evitar a hemólise. Devem ser tomadas precauções para garantir que as amostras de soro são límpidas e não estão contaminadas por microrganismos. Qualquer partícula visível na amostra deve ser removida por centrifugação a 3000 RPM (rotações por minuto) durante 20 minutos à temperatura ambiente ou por filtração. 2. Podem ser utilizadas amostras de plasma coletadas em EDTA, citrato de sódio ou heparina, mas não devem ser usadas amostras altamente lipêmicas, ictéricas ou hemolíticas, pois podem originar resultados falsos no teste. Não utilizar amostras inativadas. Isso pode causar a deterioração do analito alvo. Nunca devem ser usadas amostras com contaminação microbinana visível. 3. O bioelisa HIV-1+2 3.0 destina-se APENAS para o teste de amostras individuais de soro ou plasma. Não usar o teste em amostras de cadáveres, saliva, urina ou outros fluidos corporais ou sangue agrupado (misturado). 4. Transporte e armazenamento: Armazenar as amostras a uma temperatura entre 2 e 8°C. As amostras que não sejam testadas em um prazo de 3 dias devem ser congeladas (-20°C ou menos). Devem ser evitados vários ciclos de congelamento-descongelamento. Para o envio, as amostras devem ser embaladas e etiquetadas conforme os regulamentos locais e internacionais de transporte de amostras clínicas e agentes etiológicos. Processamento automático Os testes automáticos ou semiautomáticos podem ser realizados com diferentes instrumentos. É muito importante validar qualquer sistema automático para demonstrar que os resultados obtidos para as amostras são equivalentes aos resultados obtidos usando testes manuais. Recomenda-se que o usuário valide periodicamente o instrumento. Em caso de dificuldade na programação e configuração dos processadores automáticos Biokit, contate seu distribuidor. PROCEDIMENTO (Ver esquema do procedimento) Operações prévias Deixe que todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente (20-25°C) antes de efetuar o teste. Verifique a presença de cristais de sal no tampão de lavagem concentrado. Se houver formação de cristais, volte a solubilizar aquecendo a 37°C até que os cristais se dissolvam. Dilua o tampão de lavagem a 1:20 como indicado nas instruções do passo de lavagem. Use água destilada ou desionizada e apenas recipientes limpos para diluir o tampão. Todos os outros reagentes estão PRONTOS A USAR. Instruções do passo de lavagem É essencial um procedimento de lavagem correto para obter dados analíticos corretos e precisos. Assim, recomenda-se a utilização de um purificador de microplacas ELISA de boa qualidade e que seja mantido no melhor nível de desempenho de lavagem. Em geral, é necessário um mínimo de 5 ciclos de lavagem automática de 350-400 µl/pocinho para evitar reações falsas positivas e uma alta interferência de fundo. Para evitar contaminações cruzadas da placa com amostra ou conjugado, depois da incubação não destape o conteúdo dos pocinhos, deixando que o purificador de microplacas o aspire automaticamente. Assegure-se que os canais de dispensa de líquido do purificador de microplacas não estão bloqueados ou contaminados e que é sempre dispensado um volume suficiente de tampão de lavagem nos pocinhos. No caso de lavagem manual, sugerimos que efetue 5 ciclos de lavagem, dispensando 350-400 µl/pocinho e aspirando o líquido 5 vezes. Se forem observados resultados fracos (alta interferência de fundo), aumente os ciclos de lavagem ou o tempo de molho por pocinho. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 56 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa Em qualquer caso, o líquido aspirado para fora das tiras deve ser tratado com uma solução de hipoclorito de sódio em uma concentração final de 2,5% durante 24 horas, antes de serem eliminadas de forma adequada. O Tampão de lavagem concentrado deve ser diluído a 1:20 antes de ser usado. Se usar menos de uma placa, prepare um volume proporcional de solução. Passo 1 Preparação: Marque três pocinhos como Controle Negativo (por ex., B1, C1, D1), dois pocinhos como Controlo Positivo (por ex., E1 para HIV-1 e F1 para HIV-2) e um Branco (por ex., A1, não devem ser adicionadas amostras, nem Conjugado no pocinho Branco). Se for usado um leitor de placas com duplo comprimento de onda, o requisito de uso de Branco pode ser omitido. Use apenas o número de tiras necessário para o teste. Passo 2 Adicionar a amostra: Adicione 100 μl de amostras e 100 μl de controles Positivo e Negativo nos respectivos pocinhos. NOTA: Use uma ponteira de pipeta descartável separada para cada amostra, Controle Positivo e Negativo para evitar contaminação cruzada. Passo 3 Incubar a amostra: Tape a placa com a folha adesiva e faça a incubação a 37°C durante 30 ± 1 minutos. Recomenda-se a utilização de um recipiente com água controlado por termostato para garantir a estabilidade da temperatura e da umidade durante a incubação. Se usar uma incubadora a seco, não abra a porta frequentemente Passo 4 Lavagem (1): Depois do final da incubação, retire e elimine a folha adesiva. Lave bem cada um dos pocinhos 5 (cinco) vezes com Tampão de lavagem diluído. Deixe sempre os micropoços embebidos durante 30 a 60 segundos. Depois do ciclo de lavagem final, volte a placa para baixo em papel absorvente ou em uma toalha limpa e bata para remover todo o conteúdo. Passo 5 Adicionar o Conjugado: Adicione 100 μl de Reagente conjugado em cada pocinho, exceto o Branco. Passo 6 Incubar o Conjugado: Tape a placa com a folha adesiva e faça a incubação a 37°C durante 30 ± 1 minutos. Passo 7 Lavagem (2): Como o Passo 4. Passo 8 Coloração: Adicione 50 μl da solução Cromogênica A e 50 μl da solução Cromogênica B em cada poço, incluindo o Branco. Faça a incubação da placa a 37°C durante 15 minutos, evitando a luz. A reação enzimática entre as soluções Cromogênicas e o Conjugado produz uma cor azul nos pocinhos do controle Positivo e de amostras positivas para HIV 1/2. Passo 9 Reação de Bloqueio: Usando uma pipeta multicanal ou manualmente, adicione 50 µl de Solução de bloqueio em cada pocinho e misture suavemente. Desenvolve-se uma cor amarela intensa nos pocinhos do controlo Positivo e da amostra positiva para HIV 1/2. Passo 10 Medição da Absorvância: Calibre o leitor de placas com o pocinho Branco e leia a absorvância a 450 nm. Se usar um instrumento de filtro duplo, defina o comprimento de onda de referência para 620 nm ou 630 nm. Calcule o valor do Cut-off e avalie os resultados. (NOTA: leia a absorvância no prazo máximo de 10 minutos depois do bloqueio da reação). Controle de qualidade Recomenda-se que cada laboratório defina um sistema de controle de qualidade adequado com material de controle de qualidade semelhante ou idêntico à amostra do doente que está a ser analisada. - O valor da Absorvância do pocinho Branco, que contém apenas Cromagênio e a Solução de bloqueio, deve ser inferior a 0,080 a 450 nm. O valor da Absorvância do controle Positivo deve ser ≥ 0,800 a 450/620-630 nm ou a 450 nm depois de ser subtraído o branco. Cada valor da Absorvância individual do controle Negativo deve ser inferior a 0,100 a 450/620-630 nm ou a 450 nm depois de ser subtraído o branco. Se um dos valores do controle Negativo não cumprir os critérios de Controle de Qualidade, deverá ser eliminado e o valor médio deverá ser novamente calculado usado os dois valores restantes. Se as especificações do Intervalo do Controle de Qualidade não forem cumpridas por mais de um valor de Absorvância do controlo Negativo, o teste não será válido e deverá ser repetido. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 57 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa Resultados Cada microplaca dever ser considerada separadamente quando os resultados do teste são calculados e interpretados, independentemente do número de placas processadas em simultâneo. Os resultados são calculados relacionando o valor da absorvância (S) de cada amostra com o valor do Cut-off (CO) da placa. Se a leitura do Cut-off se basear em um leitor de placas de filtro simples, os resultados devem ser calculados subtraindo o valor A do pocinho do Branco a partir dos valores do relatório impresso das amostras e dos controles. Se a leitura se basear em um leitor de placas de filtro duplo, não subtraia o valor A do pocinho do Branco a partir dos valores do relatório impresso das amostras e dos controles. Calcule o valor do cut-off adicionando 0,120 à absorvância média do controle negativo. Cut-off = NCx + 0,120 Exemplo: Valor da Absorvância do pocinho do Branco: A1= 0,025 a 450 nm (NOTA: o Branco só é necessário quando a leitura é efetuada com um filtro simples a 450 nm) N.º do pocinho: Ctrl. Neg.: N.º do pocinho: Ctrl. Pos.: B1 0,012 E1 2,363 C1 0,010 F1 2,436 D1 0,011 Todos os valores dos controles estão dentro do intervalo do controle de qualidade indicado. Cálculo de NCx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011 Cálculo do Cut-off: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131 Interpretação dos resultados Dividir a absorvância da amostra pelo valor do cut-off. (S/CO) Resultados Negativos (S/CO < 1): As amostras com resultados de absorvância inferiores ao valor do Cut-off são negativas para esse teste, o que indica que não foram detectados anticorpos anti-HIV 1/2 com o kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por HIV. Resultados Positivos ( S/CO ≥ 1): As amostras com resultados de absorvância iguais ou superiores ao valor do Cut-off são consideradas como inicialmente reativas, o que indica que, provavelmente, foram detectados anticorpos anti-HIV 1/2 usando o kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas as amostras inicialmente reativas devem ser testadas novamente em duplicados usando o bioelisa HIV-1+2 3.0 antes da interpretação final dos resultados. As amostras repetidamente reativas podem ser consideradas positivas a anticorpos HIV 1/2 com o bioelisa HIV-1+2 3.0. Duvidoso (S/CO = 0,9-1,1): As amostras com uma relação de absorvância para Cut-off entre 0,9 e 1,1 são consideradas duvidosas e é necessário voltar a testar essas amostras em duplicado para confirmar os resultados iniciais. É necessário efetuar testes de seguimento, confirmação e suplementares de todas as amostras positivas usando outro sistema de análises (por ex., WB, PCR). Não deve ser determinado um diagnóstico clínico com base em um único resultado de teste. Este deve integrar outros dados e conclusões clínicas e laboratoriais. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS INICIAIS E ACOMPANHAMENTO DE TODAS AS AMOSTRAS INICIALMENTE REATIVAS OU DUVIDOSAS Rep. em duplicado ○,+○,+ Interpretação + Seguimento ○,+○,- ○,-○,- S/CO ≥ 0,9 Interpretação S/CO < 0,9 IND - IND = não é possível interpretar BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 58 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa - - - Se, depois da repetição do teste das amostras inicialmente reativas, ambos os pocinhos tiverem resultados negativos (S/CO < 0,9), essas amostras devem ser consideradas como positivas não repetíveis (ou falso positivo) e registradas como negativas. Tal como em muitos testes ELISA de alta sensibilidade, podem ocorrer resultados falsos positivos por diversas razões, estando a maioria delas relacionada, mas não se limitando a, um passo de lavagem inadequado. Para mais informações sobre o bioelisa, consulte a Guia de problemas do bioelisa. Se, depois da repetição do teste em duplicado, um ou ambos os pocinhos tiverem resultados positivos, o resultado final desse teste ELISA deve ser registrado como repetidamente reativo. As amostras repetidamente reativas podem ser consideradas positivas para anticorpos de HIV 1/2 e, assim, o doente está, provavelmente infectado com HIV 1/2 e a unidade de sangue deve ser eliminada. Depois da repetição do teste em duplicado, as amostras com valores próximos do valor do Cut-off devem ser interpretadas com precaução e consideradas como amostra na zona “duvidosa” ou como não sendo possível interpretar durante o período do teste. Limitações do procedimento 1. Os resultados positivos podem ser confirmados com outro método disponível e interpretados em conjunto com a informação clínica do doente. 2. Os anticorpos podem não ser detectáveis durante as fases precoces da doença e em alguns indivíduos imunodeprimidos. Assim, os resultados negativos obtidos com o bioelisa HIV-1+2 3.0 indicam apenas que a amostra não contém um nível detectável de anticorpos anti-HIV 1 ou 2 e qualquer resultado negativo não deve ser considerado como evidência conclusiva de que o indivíduo não está infectado por HIV 1 ou 2. 3. Os erros mais comuns nos testes são: usar os kits depois da data de validade, procedimentos de lavagem incorretos, reagentes contaminados, passos incorretos do procedimento do teste, aspiração insuficiente durante a lavagem, não adicionar amostras ou reagentes, utilização inadequada do equipamento laboratorial, erros de temporização, utilização de amostras altamente hemolizadas ou amostras que contêm fibrina, amostras de soro não totalmente coagulado. 4. A prevalência do marcador irá afetar os valores preditivos do teste. 5. Este teste não pode ser usado para testar plasma agrupado (misturado). O bioelisa HIV-1+2 3.0 foi avaliado apenas com amostras de soro ou plasma individuais. 6. O bioelisa HIV-1+2 3.0 é um teste qualitativo e os resultados não podem ser usados para medir as concentrações de anticorpos. Este teste não consegue fazer a distinção entre as infecções por HIV-1 e HIV-2. Características funcionais O estudo de avaliação efetuado em Alkmaar, nos Países Baixos, entre Abril e Novembro de 2005, demonstrou as seguintes características técnicas do bioelisa HIV-1+2 3.0. A especificidade diagnóstica do kit foi de 99,85% conforme determinado em todas as amostras negativas (5471) que foram investigadas. Examinamos apenas doadores não selecionados (doadores aleatórios e de primeira vez), a especificidade foi de 99,92% (95% IC 99,84-100%). Resultados do teste bioelisa HIV-1+2 3.0 em doadores não selecionados: Número testado Painel Doador de soro aleatório Doador de plasma aleatório Doador de primeira vez 2654 1400 989 Total 5043 Positivos (S/CO ≥ 1) Número % 2 0,08 1 0,07 1 0,10 4 0,08 Negativos (S/CO <1) Número % 2652 99,92 1399 99,93 988 99,90 5039 99,92 Todos os painéis de HIV-1, HIV-1 subtipo O e HIV-2 confirmaram amostras positivas a anticorpos usadas nesse estudo que também foram reativas com o bioelisa HIV-1+2 3.0, resultando em uma sensibilidade diagnóstica de 100%. Total de 32 painéis de soroconversão, representando 210 amostras testadas. 13 amostras de PRB918 e PRB917 não classificadas devido à ausência de dados de determinação de antígeno ou de RNA necessários para a classificação. 41 amostras classificadas como negativas. Negativo para RNA e/ou antígeno. 61 amostras classificadas como soroconversão precoce. 95 amostras classificadas como soroconversão. Os resultados dos testes também indicam que o bioelisa HIV-1+2 3.0 é um método de última geração, comparável à maioria dos testes disponíveis atualmente no mercado com a marca CE. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 59 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa A sensibilidade analítica foi avaliada em painéis PeliCheck anti-HIV. A sensibilidade analítica do bioelisa HIV-1+2 3.0 nas diluições padrão anti-HIV PeliCheck foi comparável à de outros testes anti-HIV. Especificidade analítica: Resultados do teste bioelisa HIV-1+2 3.0 em amostras de doentes hospitalizados e amostras potenciais de contaminação cruzada: Número testado 296 101 17 5 5 4 Tipo de amostra Mononucleose Mulheres grávidas RF+ Anti-TPO Anti-músculo liso Níveis de IgG elevados Total 428 Positivos (S/CO ≥ 1) Número % 4 1,35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 Negativos (S/CO <1) Número % 292 98,65 101 100 17 100 5 100 5 100 4 100 0,93 424 99,07 Em um estudo separado, foram obtidos os seguintes resultados de especificidade: - Possibilidade de efeito de gancho por dose elevada eliminado devido à implementação do procedimento de dois passos. Foram testadas amostras positivas/negativas congeladas para verificar interferências na coleta e armazenamento. As características técnicas do bioelisa HIV-1+2 3.0 não foram afetadas durante pelo menos 3 ciclos de congelamento/descongelamento. As amostras de doentes infectados pelos vírus da hepatite A, B, C e E, bem como amostras de doentes infectados por Treponema pallidum foram testadas, sem que tenham sido observadas reações reativas cruzadas. 25 amostras positivas de soro fresco foram testadas no INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL, BÉLGICA, com bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas as 25 amostras de soro fresco apresentaram resultado positivo com o bioelisa HIV+1+2 3.0. Precisão: As tabelas abaixo representam os resultados da sensibilidade analítica e da reprodutibilidade do bioelisa HIV-1+2 3.0 tal como controlado pelo controle executado PeliSpyMulti-Marker e pela amostra de CQ Interno testada em cada placa; a diluição a 1:2048 do padrão anti-HIV nesta amostra PeliSpy foi consistentemente detectada em todas as placas. A amostra de CQ Interno foi sempre detectada em todas as placas. Resultados do PeliSpyMulti-Marker: Diluição n Média 1:2048 80 3,08 Percentis 5º 1,76 Medido 95º 4,39 Mín. 1,70 Máx. 4,96 Resultados da amostra de CQ Interno: A B C D E F G H n Média 160 7,71 Percentis 5º 95º 5,32 10,10 Medido Mín. 4,37 Máx. 10,89 EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISPENSA DE CONTROLES/AMOSTRAS 1 2 3 4 5 6 7 … … 12 Branco SMP3 Neg … Neg … Neg Pos (HIV-1) Pos (HIV-2) SMP 1 SMP 2 BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 60 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa bioelisa: Guia de problemas Problema Causas possíveis Solução 1. Controles fora de validação. 1a. Temperatura, incubação ou pipetagem incorreta. 1b. Preparação incorreta dos reativos, erro de diluição. Reativos não homogenizados corretamente. 1c. Contaminação cruzada entre controles. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. 1d. Filtro de leitura incorreto. 1e. Interferência no caminho ótico. 1f. Foram utilizados componentes de lotes diferentes. 1g. Reagentes vencidos. 2. Sem cor ou pouca cor ao 2a. Um ou mais reativos não foram adicionados ou final do ensaio. foram adicionados na sequencia incorreta. 2b. Conjugado inativado: conservação incorreta. 2c. Microplaca inativada: conservação incorreta. 2d. Soluções cromogênicas A e/ou B inativas: conservação incorreta. O recipiente utilizado afeta a estabilidade do substrato, contaminação cruzada com a solução de bloqueio. Pipetar com cuidado. Não intercambiar as tampas dos frascos. Repetir o ensaio. Comprovar que o filtro de leitura seja de 450 nm. Se não se usa a referência de 620 - 630 nm, a absorvância aumenta cerca de 0,050. Comprovarar o leitor. Limpar ou secar a parte inferior da microplaca. Verificar a presença de bolhas de ar. Repetir a leitura. Não utilizar componentes de lotes diferentes já que os mesmos são ajustados para cada lote em particular. Verificar a data de validade do kit e de seus componentes. Não utilizar kits ou reagentes vencidos. Comprovar o procedimento. Repetir o ensaio. Comprovar se há contaminação, verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Manter sempre as tiras não usadas na bolsa de plástico bem fechada, com o dessecante no interior. Repetir o ensaio. Utilizar recipientes descartáveis ou lavados com ácido ou etanol e enxaguar com água desionizada antes de voltar a utilizar. Voltar a verificar o procedimento. Repetir o ensaio. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 61 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa bioelisa: Guia de problemas Problema Causas possíveis 3. Demasiada cor em todos os pocinhos da microplaca. 3a. Soluções cromogênicas A Verificar se as soluções e/ou B oxidadas, cromogênicas A e B são contaminadas incolores, eliminar se estiverem azuis. Usar recipientes lavados com ácido ou etanol ou descartáveis. Repetir o ensaio. 3b. Reativos contaminados Verificar a presença de ou preparados de forma contaminação (aspecto turvo). incorreta. Comprovar as diluições. Repetir o ensaio. 3c. Solução de lavagem (1x) Verificar a qualidade da água contaminada. destilada ou desionizada utilizada para preparara diluição. Repetir o ensaio. 3d. Lavagem insuficiente ou Verificar o dispositivo de não consistente: Volume lavagem. Encher os pocinhos dispensado e/ou com solução de lavagem até aspiração insuficiente ou o topo, aspirar não uniforme. Número completamente. Aumentar o insuficiente de ciclos de número de ciclos de lavagem, dispositivo lavagem e o tempo de contaminado. molho. Depois de lavar, limpe as microplacas invertidas em papel absorvente. 3e. Foi utilizada solução de Utilizar somente a solução de lavagem de outro lavagem fornecida com o kit. fabricante. 4a. Problemas de lavagem. Ver 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas ou Utilizar apenas pipetas ponteiras mal calibradas com ponteiras bem encaixadas. Técnica de encaixadas e pipetar com pipetagem incorreta. cuidado, sem bolhas e salpicos. Repetir o ensaio. 4c. Reativos e amostras não Deixar que os reativos estão à temperatura alcancem a temperatura ambiente ou não foram ambiente e misture-os bem bem misturados antes de antes de usar. usar. 4d. Correntes de ar sobre a Manter a microplaca microplaca durante a protegida de correntes de ar. incubação. 4e. Demasiado tempo até a Desenvolver técnica adição das amostras e/ou consistente e uniforme. reativos. Inconsistência nos intervalos de tempo. Bolhas de ar. 4f. Interferência no caminho Ver 1e. ótico. 4. Reprodutibilidade pobre ou elevado número de amostras reativas que não se repetem. Solução BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 62 3000-1168 R03 08.2015 por 1293 bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0 READ HIGHLIGHTED CHANGES 3000-1168 3000-1169 1 x 96 TESTS 5 x 96 TESTS (480) Bibliography - Bibliografía - Literatur - Bibliographie - Bibliografia - Bibliografia 1. Barbé F, Klein M, Badonnel Y. Early detection of antibodies to human immunodeficiency virus 1 by a third-generation enzyme immunoassay. A comparative study with the results of second-generation immunoassays and western blot. Ann. Biol. Clin. 1994; 52: 341-45. 2. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamarat S, Gruest J, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science. 1984; 220: 868-71. 3. Chandrasekhar K, Profy AT, Dyson HJ. Solution conformational preferences of immunogenic peptides derived from the principal neutralizing determinant of the HIV-1 envelope glycoprotein gp120. Biochemistry. 1991; 30: 9187-94. 4. Constantine NT. Serologic test for the retroviruses: approaching a decade of evolution. AIDS. 1993; 7: 1-13 5. Gnann JW, McCormick JB, Mitchell S, Nelson JA, Oldstone MB. Synthetic peptide immunoassay distinguished HIV type 1 and HIV type 2 infections. Science. 1987; 237: 1346-49. 6. Barr PJ, Steimer KS, Sabin EA, Parkes D, Geroge-Nascimento C, Stephans JC, et al. Antigenicity and immunogenicity of domains of the human immunodeficiency virus (HIV) envelope polypeptide expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Vaccine. 1987; 5:90-01 BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 63 3000-1168 R02 08.2015 bibliography 1293 bioelisa READ HIGHLIGHTED CHANGES bioelisa HIV-1+2 3.0 3000-1168 3000-1169 1 x 96 TESTS 5 x 96 TESTS (480) Procedural flow chart / Esquema del procedimiento / Schematischer Ablauf / Schéma de la procédure / Schema del procedimento / Esquema do procedimento Pipette Samples: 100 µl/well Dispensar Muestras: 100 µl/pocillo Proben verteilen: 100 µl/Vertiefung Dispenser Échantillons: 100 µl/puits Dispensare Campioni: 100 µl/pozzetto Pipetar Amostras: 100 µl/pocinho Ð Pipette Controls: 100 µl/well Dispensar Controles: 100 µl/pocillo Kontrollen verteilen: 100 µl/Vertiefung Dispenser Contrôles: 100 µl/puits Dispensare Controlli: 100 µl/pozzetto Pipetar Controles: 100 µl/pocinho Ð Incubate 30 minutes at 37°C Incubar 30 minutos a 37°C 30 Minuten bei 37°C inkubieren Incuber 30 minutes à 37°C Incubare 30 minuti a 37°C Incubar 30 minutos a 37°C Ð Wash 5x / Lavar 5x Waschen 5x / Laver 5x Lavare 5x / Lavar 5x Ð Pipette Conjugate: 100 µl/well Dispensar el Conjugado: 100 µl/pocillo Konjugat pipettieren: 100 µl/Vertiefung Dispenser le Conjugué: 100 µl/puits Dispensare il Coniugato: 100 µl/pozzetto Pipetar o Conjugado: 100 µl/pocinho Ð Incubate 30 minutes at 37°C Incubar 30 minutos a 37°C 30 Minuten bei 37°C inkubieren Incuber 30 minutes à 37°C Incubare 30 minuti a 37°C Incubar 30 minutos a 37°C Ð Wash 5x / Lavar 5x Waschen 5x / Laver 5x Lavare 5x / Lavar 5x Ð Pipette Chromogen A: 50 µl/well Dispensar el Cromogeno A: 50 µl/pocillo Chromogen A pipettieren: 50 µl/Vertiefung Dispenser le Chromogène A: 50 µl/puits Dispensare il Cromogeno A: 50 µl/pozzetto Pipetar o Cromogênio A: 50 µl/pocinho Ð Pipette Chromogen B: 50 µl/well Dispensar el Cromogeno B: 50 µl/pocillo Chromogen B pipettieren: 50 µl/Vertiefung Dispenser le Chromogène B: 50 µl/puits Dispensare il Cromogeno B: 50 µl/pozzetto Pipetar o Cromogênio B: 50 µl/pocinho Ð Incubate 15 minutes at 37°C Incubar 15 minutos a 37°C 15 Minuten bei 37°C inkubieren Incuber 15 minutes à 37°C Incubare 15 minuti a 37°C Incubar 15 minutos a 37°C Ð Pipette Stopping Solution: 50 µl/well Dispensar la Solución de Parada: 50 µl/pocillo Stopplösung zufügen: 50 µl/Vertiefung Dispenser la Solution d’Arrêt: 50 µl/puits Dispensare la Soluzione Bloccante: 50 µl/pozzetto Pipetar a Solução de Bloqueio: 50 µl/pocinho Ð Cut-off: NCx + 0.120 Valor umbral: CNx + 0,120 Schwellenwert: CKx + 0,120 Valeur seuil: CNx + 0,120 Valore di soglia: CNx + 0,120 Cut-off: CNx + 0,120 Read at 450 nm Leer a 450 nm Bei 450 nm ablesen Lire à 450 nm Leggere a 450 nm Ler a 450 nm BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 64 3000-1168 R02 08.2015 procedural flow chart 1293 3800-4257 R02