Epidémiologie moléculaire des infections bactériennes

Epidémiologie moléculaire
des maladies infectieuses
Dominique Blanc, MER PD
Service de médecine préventive hospitalière
CHUV
CHUV/SMPH/DB/CoursModuleMicrobiol/EpidemiologieMoleculaire2007.ppt
Introduction
Exemple 1: Hémocultures positives à Klebsiella pneumoniae
Question: Épidémie?
Les méthodes de typage
Phénotypique:
Le support de la variabilité
est le caractère qui peut
prendre plusieurs états
• Biochimique (biotypage)
• Résistance aux antibiotiques
(antibiogramme)
• Reconnaissance par des
anticorps (sérotype)
• Résistance aux phages
(lysotype)
Génotypique:
Le support de la variabilité
est une ou des séquences
nucléotidiques ou au sens
large les gènes. Le locus
est l’emplacement de cette
séquence sur le
chromosome et l’allèle est
les différents variants d’une
séquence à un locus
¾Epidémiologie moléculaire
Méthodes phénotypiques:
ex. Sérotypage
• Basé sur l'observation que les
microorganismes de la même espèce ont des
déterminants antigéniques exprimés à la
surface de la cellule (lipopolysaccharides,
polysacchrides capsulaires, protéines membranaires, flagelles,
fimbriae)
• Exemples de sérotypages encore utilisés:
– Salmonella, panel de plus de 2'200 anticorps
définissants les "différentes espèces" ou sérovars
– Shigella
– Pneumocoques (déterminant antigénique =
capsule => utilité pour définir la composition des
vaccins)
Méthodes par restriction de l'ADN
Méthodes par PCR
RAPD: Random Amplification Polymorphism DNA
AP-PCR: Arbritary prime PCR
Inter IS: Inter Insertion Sequence
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
MLST: Multilocus Sequence Typing
RAPD: Random Amplification Polymorphism DNA
AP-PCR: arbitrary Prime PCR
RAPD: Petits primers ( habituellement 10 mers)
AP-PCR: primers normaux (habituellement 18 to 20 mers)
! Seulement UN primer!
AFLP: Arbritary Fragment Lenght Polymorphism
Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis
(VNTR = séquence répétitive trouvée dans une région
particulière du génome = un locus)
P. Supply et al, JCM 2001, 39:3563
MLST: multilocus seqence typing
2-2-2-2-3-3-3
2-2-2-2-3-3-3 = ST 36
Base de données accessible par internet: www.mlst.net
Avantages du MLST
•
•
•
•
Hautement reproductible
Résultats non ambigus (typage défénitif)
Echange entre laboratoires
Construction de base de données
internationales
Critères d'évaluation
Aisance d'utilisation
• Versatilité (capacité de pouvoir utiliser la méthode pour plusieurs espèces
avec le minimum de modification)
• Rapidité
• Accessibilité (disponibilité des réactifs, coûts des réactifs et de l'équipement)
• Facilité d'utilisation (techniquement simple, possibilité de tester un
grand nombre d'échantillons en même temps, simplicité de la lecture et de
l'interprétation des résultats)
Critères de performance
• Typabilité: nb d'isolats typés/nb isolats testés
T=
Nt
N
• Reproductibilité: un certain nombre d'isolats sont
testés 2 fois: nb d'isolats avec même résultats /nb d'isolats
testés 2x
R=
Nr
N
Critères de performance
Pouvoir discriminant = capacité à différencier les isolats
Comparaison entre différentes méthodes
• nb de types / nb d'isolats testés
• Indice de discrimination: probabilité que la méthode
attribue 2 types différents à 2 isolats indépendants:
N
1
D = 1−
∑aj
N ( N − 1) j =1
aj = nombre d'isolats qui sont du même type que l'isolat j
Indice de diversité de Simpson (écologie des populations) repris par Hunter et
Gaston pour la caractérisation des méthodes de typage en épidémiologie.
Évaluation des différentes méthodes de typage
4. Typage comparatif et définitif
• Reproductible dans
un même essai
– RAPD
– PFGE
• Reproductible entre
les essais, entre les
laboratoires
• Nomenclature
standardisée des
types
–
–
–
–
MLST
Binary typing
VNTR
PFGE (?)
Valeurs continues ou catégorisée des marqueurs
• Valeurs continues:
– Méthodes basées sur la comparaison de fragments d'ADN de
tailles différentes
• PFGE, RAPD, AFLP
– Permet du typage comparatif (quelques centaines d'isolats
peuvent être comparés avec le support d'un programme
informatique)
• Pas optimum pour du typage définitif: difficile d'établir une
nomenclature standardisée des types
• Valeurs catégorisées:
– Méthodes permettant l’attribution d’un type de façon on ambiguë
• MLST, VNTP
– Nomenclature standardisée des types
– Permet un typage définitif
Analyse des bandes: étape 1
Isolat #1
Isolat #2
Tolérance
(variation) de
la position
des bandes
Analyse des bandes: étape 2
Isolat #1
Isolat #2
Isolat #100
Tolérance
(variation) de
la position
des bandes
Niveaux espace - temps
106
Evolution:
Temps (années)
millions d'années / mondial
101
Macro-épidémiologie:
décennies / national-continent
Micro-épidémiologie:
jours – mois / régional
⇒ Choix de la méthode de typage en fonction du niveau où se situe
le problème à étudier
Niveau de résolution des marqueurs
•
Isoenzymes: trop lent pour
micro-épidémiologie, bon pour
délimiter les principales
subdivisions d'une espèce
•
PFGE: idéal pour microépidémiologie, probablement pas
idéal pour niveau macroépidémiologique et évolutif car
trop rapide
•
RAPD: idéal pour tout les
niveaux car possibilité illimitée de
primers et très bonne
discrimination
•
MLST: théoriquement idéal pour
tous les niveaux (pas démontré
pour micro-épidémiologie)
Interprétation des résultats de typage
•
Deux isolats du même type
ne sont pas forcément
identiques (seulement une
fraction du génome est
analysée par la méthode de
typage), on dit qu'ils sont
"indistinguables".
•
Dans le contexte d'une investigation épidémiologique:
deux isolats avec un profil identique dérivent d'un ancêtre
commun par une même chaîne de transmission.
On suppose qu'ils sont épidémiologiquement apparentés.
La force de cette conclusion dépend du pouvoir discriminant
de la méthode et de la stabilité des marqueurs.
Variabilité des marqueurs
Isolats avec un ou quelques caractères de différence parmi
une multitude de caractères analysés = isolats similaires
*
Pt #6
Pt #5
*
*
Pt #4
Pt #3
*
Pt #2
*
Pt #1
*
0
1
2
3
Hospitalisation (semaines)
Variabilité des marqueurs: exemple du PFGE
Représentation schématique de l'influence d'un évènement génétique,
apparu sur un fragment de 400kb, sur le profils de restriction PFGE.
Interprétation des profils PFGE
Uniquement pour les épidémies!
Catégorie
Nb
d'événements
génétiques
Nb de bandes de Interprétation
différence
épidémiologique
fait partie de
l'épidémie
Indistinguable
0
0
"Closely related"
1
2-3
Probablement
partie de
l'épidémie
"Possibly
related"
2
4-6
Possiblement
partie de
l'épidémie
Différent
>2
>6
Pas partie de
l'épidémie
F. Tennover el al, JCM 1995, 33:2233-9
Problèmes avec ces critères
• S’appliquent indifféremment à toutes les
espèces de bactéries étudiées par
PFGE:
– Ne tient pas compte de la diversité de la
population ou de l’espèce étudiée
– Ne tient pas compte de la vitesse
d’évolution des marqueurs
Evaluation de la stabilité des profils PFGE
des MRSA durant des épidémies
Epidémie
Durée (mois) Nb personnes Indistinguables Similaires(%)
A
1
6
6
0 (0)
B
2
7
7
0 (0)
C
2.5
19
19
0 (0)
D
3
7
6
1 (14)
E
4
20
20
0 (0)
F
12
30
30
0 (0)
G
15
31
30
1 (0)
120
118
2 (1.5)
Tous
D.S.Blanc et al, JCM 2001, 39:3442
Diversité de la population étudiée et
présence de clones prédominants
Fréquence des isolats
Old
Epidemic
1
2
3
4
5
6
Type
7
8
9
10
Génétique des populations du microorganisme:
présence de clone prédominant
"Aire" de dispersion
du clone
"Aire"
analysée
Staphylococcus aureus
1-year study, 1262 adult ICU patients.
• 14 different genotypes from 92 primary isolates
• Clusters of 2 to 19 isolates:
no epidemiological relation for most of them!
• The 2 predominant types (38% of all S.aureus) belong
to predominant clones in Germany
Ö Wide distribution of some S.aureus strains which
independently colonize different patients
H. Grundmann et al. Clin. Microbiol. Inf., 1999, 5:355-63
Legionella pneumophila
Un clone prédominant:
• Retrouvé chez beaucoup de patients et
de points d'eau dans la région
parisienne
• Cette souche a également été retrouvée
dans d'autres partie de France et
d'Europe
Lawrence et al JCM 1999
Aurel et al JCM 2003
Utilisation du typage moléculaire
en épidémiologie des maladies
infectieuses
1) Investigation et contrôle des épidémies
2) Surveillance des agents infectieux (endémie)
3) Étude de l’épidémiologie des agents infectieux
Investigation d'épidémies
• Raison: Contrôle à court terme de la transmission
• But: comparer des isolats provenant d'une épidémie
suspectée pour déterminer celles qui sont
étroitement apparentées (cas de l'épidémie ou
source, ou véhicule) de celles qui ne sont pas
apparentées (cas sporadiques)
– détection, confirmation et délimitation de son étendue
– identification de(s) source(s) de contamination et /ou des vecteurs
de transmission (air, eau, personne à personne)
– évaluation de l’efficacité des mesures prises pour contenir ou
stopper la dissémination
• Échelle: jours à mois, quelques à des centaines
d'individus infectés
• Besoins: typage comparatif
M.J. Struelens et al , ICHE 1998
Épidémie Burkholderia cepacia
• 14 patients en 17 jours
• Seul facteur commun: subits une endoscopie
• Présence de ce germe dans un médicament utilisé pour
l'anesthésie locale (Novésine)
• Un seul lot de Novésine contaminé
Estagnon
• Prélèvements
d'environnement à la
pharmacie: un estagnon
d'eau distillée contaminé
avec ce germe
• Conclusion: l'eau de cette
estagnon a été utilisée pour
la fabrication de ce lot (au
lieu d'une eau
bactériologiquement
maîtrisée)
patients
Novésine
siphon
Hémocultures positives à Klebsiella pneumoniae
123456789
Ribotyping
Surveillance des agents ou des
maladies infectieux(ses) (endémie)
suivis de la tendance, de l’évolution de la
fréquence de certaine maladies ou de
certaines bactéries (MRSA, Salmonelles ...)
détection précoce d'une épidémie (ex. Neiseria
meninghitidis ou virus de la grippe pour mise
à jour des vaccins)
analyse d'une situation endémique spécifique
Surveillance des agents ou des
maladies infectieux(ses) (endémie)
• Raison: évaluation à long terme de stratégies de
prévention, détection et monitorage des infections
émergeantes ou re-émergeantes
• But: monitorage de la dissémination géographique,
des changements de prévalence des clones
épidémiques ou endémiques
• suivis de la tendance, de l’évolution de la fréquence de certaine
maladies ou de certaines bactéries (MRSA, Salmonelles ...)
• détection précoce d'une épidémie (ex. Neiseria meninghitidis
ou virus de la grippe pour mise à jour des vaccins)
• analyse d'une situation endémique spécifique
• Échelle: années à décennies, des centaines à des
milliers d'individus infectés
• Besoins: typage définitif nomenclature standardisée
des types)
M.J. Struelens et al , ICHE 1998
Épidémiologie des infections à
Staphylococcus aureus
• Identification:
–
–
–
–
–
Cocci Gram +
Catalase +
Coagulase +
DNAse +
Colonies pigmentées jaune crème - orange
S. aureus: hôtes
• hôtes naturels: primates
• hôtes temporaires: animaux domestiques,
volailles, rongeurs
• Pathogène pour les mammifères et les
oiseaux
• Contamination transitoire de l'air, des
surfaces, de l'eau, de la poussière, de la
nourriture (entérotoxine), etc. (en contact
avec l'homme...)
Portage à S.aureus
S. aureus: pathogène opportuniste
Dommages à la peau ou aux
barrières naturelles
(traumatisme, ponction,
implantation matériel médical ):
entrée dans les tissus de l'hôte,
adhérence aux tissus de l'hôte,
déjouer le système immunitaire
Relation symbiotique bénigne
(commensal ou mutualiste)
Infections à
S.aureus
Pathogène
S. aureus: facteurs de virulence
Infections versus colonisation à S.aureus
Comparaison des isolats du nez à ceux de
bactériémies
– 219 patients avec bactériémies
• 180 (82%) la même souche (profils PFGE
identique) a été retrouvée dans les 2 sites
– 1278 patients suivis sur une période de 5 ans
• 14 ont eu une bactériémie
• la même souche (PFGE identique) a été retrouvée
dans les 2 sites pour les 14 patients
• 1% des porteurs ont eu une bactériémie
C.K. von Eiff, N Engl J Med, 2001, 344 :11-16
Souches de S. aureus ayant des
caractéristiques spécifiques
Grande diversité, mais
présence de clones
prédominants!
Exemple: souches produisant la
toxine du TSS (TSST-1)
appartiennent toutes au même
clone.
Musser and Selander, 1990
Résistance aux antibiotiques de S. aureus:
1. Production de bêta-lactamase
2. Gène de résistance à la méticilline: mecA
¾ Meticilin resistant Staphylococcus aureus
(MRSA)
¾ Situé sur une cassette: SCCmec
Importance des infections à S. aureus
Influence de la résistance aux antibiotiques sur l’épidémiologie de S. aureus
"Staphylocoques
hospitaliers"
VRSA
Meticilline
Penicilline
1940
1950
1960
MRSA
sporadique
1970
lti
Mu
ré
1980
n
ta
s is
ce
1990
2000
MRSA: enjeux
• Même pouvoir pathogènes que MSSA
• Résistance à d'autres antibiotiques
⇒ utilisation de la vancomycine pour traiter les infections
(coûteux, administration i.v., toxicité auditive et rénale)
• 1997: première apparition de souches ayant une
résistance intermédiaire à la vancomycine
• 2001: première apparition de souches résistantes à
la vancomycine
• Infections à MRSA ne remplacent pas celles à
MSSA, mais se surajoutent!
Proportion de MRSA parmi les MSSA
isolés dans des prélèvements cliniques
EARSS 2002
Clones épidémiques
M. Aires de Sousa, H. de Lencastre /FEMS Immunology and Medical Microbiology 40 (2004) 101-111
Épidémiologie des MRSA en Suisse romande
300
250
200
non typés
Autres
150
D
100
C
B
50
A
0
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Évolution de l'incidence de nouveaux patients MRSA observés au CHUV.
Seuls les génotypes prédominants (>10 patients) sont individualisés, les
autres génotypes figurent dans la catégorie "autres types".
Dissémination international d’un clone MRSA
A. Belgium clone 1
1992
C. Ontario
epidemic
clone 1995
A
B
C
B. Western-CH clone
1995
Community acquired MRSA