Œnologie - Union des oenologues de France

Œnologie
L’azote assimilable dans le moût
de raisin : quelles méthodes
pour déterminer sa teneur ?
méthodes de dosage de l’azote assimilable dans le moût de raisin.
Pour cela, nous avons testé ces différentes méthodes sur 10 échantillons de moûts. Dans un premier temps, nous avons validé comme
méthode de référence la mesure de l’azote assimilé par les levures
selon la méthode Kjeldahl. Ensuite, nous avons comparé les résultats
de dosage selon différentes méthodes avec celui obtenu par la
méthode de référence. Les résultats montrent que la méthode
combinant le dosage des acides aminés par analyseur automatique
à la mesure de l’azote ammoniacal par kit enzymatique est la technique la plus fiable. Mais le dosage des acides aminés nécessite un
investissement élevé et prend du temps. La méthode par spectroscopie
infra rouge à transformée de Fourier (IRTF) apparaît également fiable.
De plus, étant rapide, et non destructrice de l’échantillon, elle semble
adaptée à une utilisation en routine. La formol-titration et, à un degré
moindre, la combinaison de la méthode NOPA avec le dosage de
l’azote ammoniacal par kit enzymatique sous-estiment l’azote
assimilable dans les moûts de raisin.
Mots-clefs : Azote assimilable, moût de raisin, levure,
fermentation alcoolique
Abstract: The objective of this study was to compare the main
determination methods of assimilable nitrogen in grape musts.
The study was carried out on 10 musts. We first validated the measurement of actual assimilated nitrogen according to the Kjeldahl
method as a reference method. Then, the results of assimilable
nitrogen obtained by Fourier Transformed Infra Red Spectroscopy
(FTIR), formoltitration, [orthophtaldehyde (NOPA) + ammoniacal]
nitrogen and [amino acids (automatic analyser) + ammoniacal]
nitrogen were compared with reference method values.
Results showed that the measurement of [amino acids (automatic
analyser) + ammoniacal] nitrogen is the most reliable way to measure
assimilable nitrogen in grape musts. But the determination of amino
acids is quite expensive and remains time consuming. FTIR is also a
reliable method for the measurement of assimilable nitrogen.
Moreover, being fast convenient and not sample destructive, it appears
as a fitted way of assimilable nitrogen measurement on a routine
basis. Formoltitration and to a lesser extent, [NOPA + ammoniacal]
nitrogen underestimate assimilable nitrogen in grape musts.
Keywords: assimlilable nitrogen, grape must, yeast, alcoholic
fermentation
Introduction
Dans le moût de raisin, l’azote assimilable par les levures au cours
de la fermentation alcoolique est composé principalement des acides
aminés, de l’azote ammoniacal et probablement de quelques peptides.
Il joue un rôle essentiel en œnologie, car c’est un facteur nutritionnel
important pour les levures au cours de la fermentation alcoolique,
compte tenu de son rôle dans la synthèse des protéines des levures
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et dans leur croissance. En dessous de la valeur seuil d’environ 140 mg
N L-1, la croissance des cellules levuriennes est limitée et la cinétique
de fermentation est lente (Bely et al, 1990). D’autre part, l’azote
assimilable est nécessaire pour la synthèse des marqueurs de qualité
du vin comme les alcools supérieurs et les esters (Cheynier et al, 2010).
De ce fait, disposer d’une méthode de détermination fiable et rapide
de l’azote assimilable dans les moûts de raisin est très important
pour le contrôle de la fermentation alcoolique. La teneur en acides
aminés peut être mesurée en utilisant un analyseur automatique
(Benson, 1972). Cette méthode est très fiable mais elle demande
un gros investissement en équipement et le temps d’analyse est
important. Les acides aminés peuvent aussi être dosés par la
méthode NOPA (Dukes and Butzke, 1998). Seuls les acides aminés
primaires réagissent. Ainsi, la proline et l’hydroxyproline ne sont
pas dosés (Weeks & Henschke, 1999). Crowell et al (1985) ont développé une méthode basée sur la réaction entre les groupes α-aminés
primaires et l’acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS). Cette méthode
a tendance à sous-estimer l’azote assimilable compte tenu du fait
qu’un des acides aminés les plus importants du moût, l’arginine
n’est pas dosée. L’ammonium est généralement dosé par méthode
enzymatique (Bergmeyer and Beutler, 1985) en utilisant la spectrophotométrie UV. Cette technique est rapide et très fiable.
Ces méthodes que l’on peut qualifier de mono méthodes mesurent
uniquement une partie de l’azote assimilable. Pour obtenir la teneur
de l’ensemble de azote assimilable, e.g. acides aminés et ammonium,
il est nécessaire d’associer 2 méthodes différentes, ce qui prend du
temps. Il existe seulement 2 méthodes qui déterminent directement
l’azote assimilable dans le moût de raisin :
> la formol-titration (Sorensen, 1907, Aerny, 1996). La proline et
l’hydroxyproline qui ne sont pas assimilés par les levures durant
la fermentation ne sont pas dosés par cette méthode (Dukes &
Butzke, 1998). Le règlement européen REACH (2006) a pour principaux
objectifs d’assurer un niveau élevé de protection de la santé humaine
et l’environnement contre les risques des produits chimiques.
De ce fait, la toxicité du formaldéhyde représente un inconvénient
important dans l’utilisation de cette méthode. De plus, la mesure
de l’azote assimilable par cette méthode est pH dépendante et le
résultat est peut être sous estimé lorsqu’il est comparé à l’azote
assimilé par les levures (Blateyron & Sablayrolles, 2001) ;
> l’IRTF. C’est une méthode alternative qui peut être utilisée en routine
pour mesurer l’azote assimilable (Dubernet et al, 2000). Cette
technique est rapide, économe en réactifs et non consommatrice
d’échantillon.
Il existe quelques travaux sur la comparaison des différentes
méthodes de dosage de l’azote assimilable (Dubernet et al, 2001 ;
Bely, 1990 ; Shively & Henick-Kling, 2001 ; Gump et al, 2002 ; FilipeRibeiro & Mendes-Faia , 2007). Cependant, selon les données de la
bibliographie, il n’y a pas à ce jour d’étude exhaustive sur la comparaison des différentes méthodes de dosage de l’azote assimilable.
Dans ce travail, nous avons, dans un premier temps, validé une
méthode de référence basée sur la mesure de l’azote réellement
assimilé par les levures au cours de la fermentation alcoolique.
Ensuite, nous avons comparé les principales méthodes de dosage
de l’azote assimilable sur différent moûts de raisin avec la méthode
de référence.
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Résumé : L’objectif de cette étude a consisté à comparer les principales
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par Erick Casalta, Jean-Marie Sablayrolles, Jean-Michel Salmon
INRA, UMR1083, 2, place Viala - 34060 Montpellier
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Figure 1 : Comparaison de la mesure de l’azote assimilé par Kjeldahl ( ) avec la mesure l’azote assimilé associant
le dosage des acides aminés par analyseur et le dosage des sels d’ammonium par kit enzymatique ( ).
Tableau 1 : Comparaison des différentes méthodes de détermination de l’azote assimilable dans les moûts de raisin
1. Matériel et méthodes
1.1. Moûts
Détermination de l’azote assimilé
Dix moûts du Languedoc-Roussillon provenant de 6 variétés de raisins
ont été utilisés, 8 blancs et 2 rouges obtenus par flash-détente
(merlot et syrah). Après leur obtention, ils ont été pasteurisés (72° C,
20 s) et conservés à 2°C jusqu’à leur utilisation.
Les acides aminés libres sont dosés par chromatographie liquide
à échange d’ions, selon la méthode de Benson et al (1967) à l’aide
d’un analyseur automatique (Biochrom 30, Biochrom Ltd, Cambridge,
UK). La teneur en acides aminés est également mesurée par la
méthode NOPA (Dukes and Butzke, 1998). La proline et l’hydroxyproline
ne sont pas mesurés par cette méthode (Weeks & Henschke, 1999).
L’azote assimilé est déterminé de 2 façons :
> par méthode Kjeldahl en calculant la différence entre la teneur
initiale du moût en azote total et celle du moût à 80 % de la
fermentation, soit N Assimilé Kjeldahl = [NT moût – NT à 80 %
de la fermentation],
> en combinant le dosage des acides aminés par l’analyseur automatique et le dosage des sels d’ammonium par le kit enzymatique
et en calculant la différence entre la teneur initiale du moût et
celle du moût à 80 % de la fermentation, soit N assimilé aa + NH4 =
[N Assimilable aa + NH4 moût –N Assimilable aa + NH4 80 % de la
fermentation].
Les fermentations ont été conduites dans des fermenteurs cylindriques en verre d’un volume de 1,2 L, à température constante (24° C)
sous agitation continue. Les moûts ont été inoculés avec la souche
œnologique commerciale Saccharomyces cerevisiae K1 (ICV-INRA,
Lallemand, Montreal, Canada).
Tous les résultats sont exprimés en mg N L-1.
Dosage de l’azote total
2. Résultats et discussion
L’azote total (NT) est déterminé selon la méthode Kjeldahl
(Kjeldahl, 1883).
2.1. Validation de la méthode de détermination
de l’azote assimilé au cours de la fermentation
alcoolique
Dosage de l’azote assimilable
La teneur en azote assimilé mesurée par la méthode Kjeldhal (N
Assimilé Kjeldahl) est très proche de celle déterminée par addition
des acides aminés et des sels d’ammonium (N Assimilé aa + NH4),
pour l’ensemble des échantillons (Cf. Figure 1). La moyenne des
différences entre les méthodes est de 12,1 mg N L-1 et le coefficient
concordance de 97 % (Cf. Tableau 1). De plus, N Assimilé Kjeldahl est
très fortement corrélé à la vitesse maximale de fermentation
(dCO2 dt-1)max [r = + 0,95].
Compte tenu de ces résultats concordants et cohérents, nous avons
considéré la mesure de l’azote assimilé par la méthode Kjeldahl
comme la méthode de référence pour comparer les méthodes de
dosage de l’azote assimilable, en se plaçant dans la situation où
la totalité de l’azote assimilable est consommée par les levures.
1.2 Méthodes de dosage
Dosage de l’azote ammoniacal
L’azote ammoniacal est mesuré par méthode enzymatique
(Enzytec, DiasSys Diagnostic Systems GmbH, Germany).
Dosage des acides aminés
L’azote assimilable est mesuré par formol titration (N Assimilable
Formol) (Sorensen, 1907) et par IRTF (N Assimilable IRTF) (Dubernet et
al, 2000). Par ailleurs, cette fraction peut également être indirectement calculée :
> en ajoutant les acides aminés mesurés par l’analyseur automatique et les sels d’ammonium (N Assimilable aa + NH4). La proline et
l’hydroxyproline ont été retranchés du total des acides aminés du
fait qu’ils ne sont pas assimilés par la levure durant la fermentation
(Salmon & Barre, 1998).
> en faisant la somme des acides aminés mesurés par la méthode
NOPA et des sels d’ammonium mesurés par le kit enzymatique (N
Assimilable NOPA + NH4).
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Figure 3 : Comparaison de la mesure de l’azote assimilable mesuré par spectroscopie infra-rouge à transformé de Fourier (
avec l’azote assimilé déterminé par Kjeldahl ( )
Figure 4 : Comparaison de la mesure de l’azote assimilable associant la mesure des acides aminés par NOPA (
et la détermination des sels d’ammonium par kit enzymatique avec l’azote assimilé déterminé par Kjeldahl (
Comparaison entre N Assimilable Formol et N Assimilé Kjeldahl :
N Assimilable Formol est toujours inférieur à N Assimilé Kjeldahl quel
que soit le moût (Cf. Figure 2). La moyenne des différences entre
les 2 méthodes est de 54,2 mg N/L et le coefficient de concordance
de 63 % (Tableau 2). La méthode par formol-titration sous estime
de façon importante la teneur en azote assimilable du moût.
Comparaison entre N Assimilable IRTF et N Assimilé Kjeldahl :
N Assimilable FTIR est proche des valeurs de la méthode de référence
avec une différence inférieure à 20 mg N L-1 pour 6 échantillons
sur 10 (Cf. Figure 3). L’écart le plus élevé est celui du moût merlot
(+ 90 mg N L-1). La moyenne des différences est faible (24,5 mg N/L)
et le coefficient de concordance élevé (84 %). Ces résultats montrent
que la technique IRTF est fiable. L’écart important obtenu sur le merlot
pourrait provenir d’un effet matrice. Il conviendrait donc d’intégrer
dans l’étalonnage de l’appareil des moûts atypiques comme le merlot
qui ont préalablement subi un traitement de flash détente.
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)
supérieure à N Assimilé Kjeldahl (171,3 mg N L-1), ce qui confirme que
ce moût a un comportement atypique. La moyenne des différences
est de 37,6 mg N/L et le coefficient de concordance de 72 %.
Cette méthode sous-estime l’azote assimilable du moût, excepté
pour certains échantillons comme le merlot. Mais la sous-estimation
est moins importante que dans le cas de la formol-titration.
2.2. Comparaison des méthodes de dosage
Comparaison entre N Assimilable NOPA + NH4 et N Assimilé Kjeldahl :
N Assimilable NOPA + NH4 est inférieur à N Assimilé Kjeldahl pour 9
échantillons sur 10 (Cf. Figure 4). Le moût merlot est le seul qui
présente une valeur de N Assimilable NOPA + NH4 (222,5 mg N L-1)
)
Comparaison entre N Assimilable aa + NH4 et N Assimilé Kjeldahl :
N Assimilable aa + NH4 est très proche de N Assimilé Kjeldahl pour la
plupart des échantillons testés (Cf. Figure 5). L’écart le plus important
concerne le viognier (a) (- 38,3 mg N L-1). La moyenne des différences
est 10,3 mg N/L et le coefficient de concordance de 97 %.
Cette méthode apparaît comme fiable pour déterminer la teneur
en azote assimilable.
Conclusion
Dans cette étude, différentes méthodes de détermination de l’azote
assimilable dans le moût de raisin ont été comparées. L’originalité
de l’étude repose sur le fait d’avoir choisi comme méthode de référence
l’azote réellement assimilé par les levures, déterminé par la méthode
Kjeldahl. Les résultats montrent que i) la méthode la plus fiable est
la combinaison de la détermination des acides aminés par l’analyseur
automatique et de la détermination de l’azote ammoniacal par le
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Figure 2 : Comparaison de la mesure de l’azote assimilable mesuré par formol-titration (
avec l’azote assimilé déterminé par Kjeldahl ( )
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Figure 5 : Comparaison de la mesure de l’azote assimilable associant le dosage des acides aminés par analyseur
et la détermination des sels d’ammonium par kit enzymatique ( ) avec l’azote assimilé déterminé par Kjeldahl ( )
kit enzymatique. Mais cette méthodologie est longue et exige un
investissement important ; ii) la technique IRTF présente le meilleur
compromis entre praticité et fiabilité. Elle paraît être la méthode
adaptée à un usage en routine du fait de sa rapidité et de sa faible
consommation en échantillon ; iii) la technique par formol-titration
et, à un degré moindre, la méthode combinant NOPA et le dosage
de l’azote ammoniacal par kit enzymatique sous-estiment l’azote
assimilable dans les moûts de raisin. La cause possible de la sousestimation par formol-titration et par NOPA peut s’expliquer par
le fait que seul 1 atome d’azote sur les 4 que contient l’arginine est
dosé par ces méthodes alors que 3 sont assimilés par la levure.
Dans le cas de NOPA, le dosage séparé de l’arginine par la méthode
ARGOPA (Butzke et Austin, 1999) permet d’obtenir un dosage plus
fiable mais rend la technique plus longue.
Remerciements
Les auteurs remercient Evelyne Aguera, Philippe Lienard (INRA
Pech-Rouge) et Christian Picou (INRA Montpellier) pour leur appui
technique, Marc Perez et Martine Pradal pour l’analyse des acides
aminés, Marie-Anne Robin (INRA Pech-Rouge), Mary Kelly
(Université Montpellier 1), Isabelle Falleri (Laboratoire d’Analyses
Inter-Rhône) pour leur participation aux analyses et Isabelle Sanchez
(INRA Montpellier) pour le traitement statistique des données.
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