Les gènes ménagers (HouseKeeping Gene HKG)

Les gènes ménagers (HouseKeeping Gene HKG)
En quantification relative, l’expression d’un gène cible est exprimée par rapport à un gène de
référence d’expression stable sous forme d’un rapport. Ces gènes de référence, appelés
également gènes ménagers, ne devraient en théorie pas varier dans les tissus étudiés. De
nombreuses études utilisent ces gènes constitutifs en posant l’hypothèse qu’ils ne « bougent »
pas. Mais la littérature fait maintenant apparaître que l’expression de ces gènes ménagers peut
considérablement variée selon les tissus et les conditions expérimentales (exemple :
l’expression du gène de la GAPDH varie en cas de stimulation par l’insuline ; la transcription
d’ARNr est affectée par des drogues).
Des couples d’amorces PCR de gènes ménagers ont été validés sur le site - dans le cadre de
travaux de PCR q en temps réel - pour les modèles humains et murins.
Les gènes ménagers codent principalement pour des protéines essentielles aux fonctions
cellulaires de base. Ainsi, on trouve des gènes codant :
- Pour le cytosquelette (Beta actine, alpha tubuline)
- Pour le Complexe Majeur d’Histocompatibilité de type I (Beta microglobuline)
- Pour des enzymes de la voie du glucose (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogénase,
GAPDH)
On trouve aussi des sous unité d’ARN ribosomaux (18s et 28s chez les eucaryotes) constitutif
des ribosomes. Cependant, ces ARN ribosomaux (1) sont absents dans les échantillons
d’ARNm, (2) n’ont pas de queue polyA et ne sont donc pas rétro transcrits par la méthode des
oligo(dT) et (3) sont exprimés a des taux beaucoup plus élevés que les ARNm cibles.
Un rappel :
Une cellule contient 30 pg d’ARN total
Les proportions des différents ARN sont
80-85 % d’ARN ribosomaux (25 pg)
10-15% d’ARNt et petits ARN (4 pg)
1-5 % d’ARNm (1 pg)
Dans les ARNm, on distingue :
Des ARNm abondants : 1000 à 10 000 molécules par cellule (10% des ARNm)
Des ARNm moyennement abondants : 100 à 1000 molécules par cellule (1% des ARNm)
Des ARNm faiblement exprimés : 1 à 100 molécules par cellule (la plupart des gènes)
En pratique :
Lorsque l’on choisit un gène ménager comme référence, on doit choisir un gène dont
l’expression est constante dans les conditions expérimentales testées. En fait, il est parfois
nécessaire de tester un panel de gènes ménagers pour choisir celui qui n’est pas régulé par les
conditions expérimentales.
Critères conduisant au choix d’un bon gène ménager :
- Le niveau d’expression du gène ménager est stable dans les conditions expérimentales
testées. Par exemple, si vous travaillez sur différents tissus, assurez vous que le niveau
d’expression du HKG y est identique (cf Technical note de Roche LC15/2002 page 12)
- Le niveau d’expression du gène ménager doit être le plus proche possible de la cible. Par
exemple, quantifier des transcrits rares en normalisant par un HKG fortement exprimé peut
poser problème : si l’ARN est un peu dégradé, les transcrits rares ne seront pas amplifiés alors
que les transcrits abondants le seront. Cela peut aboutir à des résultats faussement négatifs.
Pour obtenir un couple d’amorces, il vous suffit d’en faire la demande auprès du service. Les
séquences et les conditions d’utilisation vous seront communiquées. Pour quelques uns, des
aliquots pourront vous être fournis dans le laboratoire.
Le choix de ces différents gènes ménagers est variable. On a essayé dans un certain nombre
de cas, de choisir des gènes appartenants a des classes fonctionnelles différentes, évitant
d’utiliser un HKG régulé de façon identique au gène cible. Les couples décrits ont été mis au
point et validés par différents utilisateurs et sont mis à la disposition des équipes de l’Institut.
L’essentiel des couples décrits est issu d’expériences utilisant le SyBr green sur le Light
Cycler.
La validation signifie :
- Que ces couples ne présentent pas ou très peu de fixation non spécifiques (dimères
d’amorces)
- Que ces couples présentent des efficacités PCR comprises entre 100 et 85% (pentes
comprises entre 3,32 et 3,7 environ) décrites pour une gamme linéaire de Ct.
- Que les pentes ont été reproduites au moins 2 fois.
Ces couples sont classés par classe d’expression des gènes correspondants.
Liste des couples de gènes ménagers validés dans le modèle
humain :
Gènes fortement exprimés : estimés entre 1000–10000 molécules par cellule
- Béta 2 microglobuline (NM_004048): c’est la chaîne bêta du CMH de classe I exprimé a la
surface de toutes les cellules.
- Glyceraldéhyde-3-phosphate dehydrogenase (appelée GAPD) (NM_002046) : protéine
cytoplasmique de chaine de la glycolyse et de la gluconeogenese.
- Peptidylprolyl isomerase A (appelée Cyclophilin A, PPIA) (NM_021130.2, 203430.1,
203431.1) : protéine cytoplasmique intervenant dans le repliement des protéines (activité
isomérase).
- Peptidylprolyl isomerase B (appelée Cyclophilin B, PPIB) (NM_000942.4) : protéine
cytoplasmique intervenant dans le repliement des protéines (activité isomérase).
Gènes moyennement exprimés : estimés entre100-1000 molécules par cellule
- Succinate dehydrogénase -sous unité A- (SDHA) (NM_004168) : protéine de la chaine
respiratoire (localisée dans la membrane mitochondriale interne) responsable de l’oxydation
du succinate.
- Hypoxanthine phosphoribosyltransférase 1 (HPRT1) (NM_000194) : protéine
cytoplasmique intervenant dans la synthèse des purines.
- Facteur Gamma 1 d’Elongation de la Traduction (EEF1G) (NM_001404.3) : protéine
intervenant dans l’élongation de la traduction.
Gènes peu exprimés : estimés entre 1 et 100 molécules par cellule
- Ubiquitine C (UBC) (NM_021009.2) : protéine nucléaire et cytoplasmique intervenant dans
la dégradation sélective des protéines cellulaires, le maintien de la chromatine, la fabrication
des ribosomes.
Liste des couples de gènes ménagers validés dans le modèle
murin :
Gènes moyennement exprimés : estimés entre100- 1000 molécules par cellule
- Hypoxanthine phosphoribosyltransférase 1 (HPRT1) (NM_013556) : protéine
cytoplasmique intervenant dans la synthèse des purines.
Gènes peu exprimés : estimés entre 1 et 100 molécules par cellule
- Phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) (NM_008828) : protéine cytoplasmique catalysant ATP
+ 3-phospho-D-glycerate = ADP + 3-phospho-D-glyceroyl phosphate. Et intervenant dans la
glycolyse.
Bibliographie :
Goidin et al. 2001 Analytical Biochemistry 295 : 17-21
Selvey et al. 2001 Molecular and cellular probes 15 : 307-311
Vandesompele et al, 2003 Genome biology, 3 (7)
Warrington et al, 2000 Physiol Genomics 2 : 143-147
Thellin et al 1999 J. Biotechnol 75 : 291-295
Suzuki et al. 2000 Biotechniques 29 : 332-337
Bustin 2000 J. Mol. Endocrinol 25 : 169-193
Sur le net
http://www.gene-quantification.info/