LES PUCES A ADN

LES PUCES A ADN
Rémi Bernard
Graphics courtesy of the National Human Genome Research Institute
Cellule
Chromosome
transcription
Gène (ADN)
À l’échelle
cellulaire
traduction
Transcrit (ARNm),
Simple brin
Protéine
GENOME
(ensemble des gènes d’une cellule)
TRANSCRIPTOME
(ensemble des transcrits
d’une cellule à un instant donné)
PROTEOME
(ensemble des protéines présentes
dans une cellule à un instant donné)
ETUDE DU GENOME
ETUDE DU TRANSCRIPTOME
ETUDE DU PROTEOME
GENOMIQUE
POST-GENOMIQUE
Dans une cellule seulement une fraction des
gènes est exprimée ...
Tissu nerveux
Tissu musculaire
Autre exemple: au cours d’une croissance bactérienne…
Les conditions de milieu changent et les gènes exprimés aussi !
DO 600 nm
Phase
Début de
phase stat. stationnaire
Phase
Expo.
Temps (min)
Gènes de croissance
(metabolisme…)
Gènes de mobilité (flagelle)
Gènes de carence…
Gènes de survie (sporulation..)
Gènes de défense (production d’antibiotique…)
Un des outils pour l’étude du transcriptome:
les biopuces ou puces à ADN
Le but: détecter et quantifier chacune des différentes espèces
d’ARNm présents dans la préparation.
Analyser le transcriptome c’est identifier, à un temps t,
et/ou dans une condition donnée,
les séquences codantes du génome effectivement exprimées (transcrits, ou ARNm).
L’ ADNc ou ADN complémentaire
In vivo
exon
intron
ADN génomique, double brin
…GAAATAAGCTGTTCTCTGCTTCAT…
Brin codant
…CTTTATTCGACAAGAGACGAAGTA…
transcription
ARN messager, simple brin
(instable)
…GAAAUUCUGCUUCAU…
In vitro
rétro-transcription
ADNc, simple brin (stable)
…CTTTAAGACGAAGTA…
L’ADNc ne contient que les régions codantes d’un gène (élimination des introns)
La puce a pour but de détecter les ADNc présents dans une préparation
Fabrication des puces à ADN
LE BUT: représenter sur la puce l’ensemble des transcrits
d’un génome et pouvoir les identifier
2 types de sondes fixées sur le support solide
ADN génomique du gène 1
intron
exon
ADNc Gene 1
Fragment spécifique
complémentaire simple brin
PCR
(amplification d’un fragment codant spécifique)
(obtenu par : -oligosynthèse
- synthèse in situ (photolitographie)
Chaque position sur la
puce est connue
Chaque dépôt contient des fragments spécifiques d’un seul gène.
L’ensemble des gènes du génome étudié doivent être représentés si possible sur la puce.
Ces fragments fixés sur la puce sont les sondes et ne sont pas marqués.
Ces sondes sont connues.
LES CIBLES
Préparation
Population cellulaire
(echantillon biologique)
Extraction des ARNm
totaux
Reverse transcription
et marquage
Obtention d’ADNc
totaux marqués
Hybridation de ces ADNc
sur la puce
Deux marquages possibles
ADNc marqués
[P33] dCTP
Marquage radioactif
ARNm totaux
Populations cellulaires
Marquage
avec fluorochromes
ARNm totaux
Cy3 CyX dCTP Cy5
ADNc marqués
Interaction entre la sonde et la cible: HYBRIDATION MOLECULAIRE
Lame de verre comportant les sondes fixées
Cible: ADNc du gène X
…TCCCAGCTGAAT…
dépôt contenant les sondes
spécifiques du gène X
…
AG
G
TC
CC
AG
AG
CT
GG
G
TC
GA AAT
CT
TA …
GT
CG
AC
TT
AG
A
GG
TC
AG
GA
GG
CT
TC
TA
GA
CT
TA
Hybridation: interaction
des deux chaînes de
séquences complémentaires
(liaisons hydrogènes)
Quantification des transcrits présents:
Le signal de détection est proportionnel à la concentration de la cible
Condition: excès de sondes (sur la puce) par rapport
aux cibles (venant s’hybrider sur cette puce)
Plusieurs types de puces
Analyse des résultats sur une lame de microarray
Population cellulaire 1
Population cellulaire 2
(cellules références)
(ex: cellules cultivées sans oxygène)
ARNm totaux
ARNm totaux
ADNc marqués
fluorochrome1
(CY5-dCTP)
ADNc marqués
fluorochrome2
(CY3-dCTP)
Hybridation sur la puce
Excitation 1
Excitation 2
Analyse des résultats:
Quantification de chacune des fluorescences pour chacun des dépôts (gènes) de la lame
Classification des gènes sur un graphe de type suivant
Exemples d’ Applications- Diagnostics médicaux
Cellules de foie sain
Cellules tumorales
du foie
Comparaison des
profils d’expression
par microarray
Identification des
gènes anormalement exprimés
dans les cellules tumorales
Applications similaires
pour le diagnostic:
-de maladies génétiques
-de maladies cardio-vasculaires
- recherche de marqueurs du
vieillissement (qui n’est pas un
diagnostic bien sûr)
Ces gènes constituent des marqueurs de cellules « malades »
et leurs identifications facilitent les diagnostics médicaux
Exemples d’ Applications- Microbiologie
Antibiotique
Cellules bactériennes
Comparaison des
profils d’expression
par microarray
Identification de gènes codant pour
des systèmes de résistances à cet antibiotique
(ex: un transporteur membranaire pouvant expulser l’antibiotique,
un enzyme pouvant dégrader l’antibiotique….)
Exemples d’ Applications- Toxicogénomique
Etude de l’influence de diverses substances toxiques sur l’expression des gènes:
cas particulier: les génotoxiques (agents d’origine physique ou chimique provoquant l’apparition
de lésions dans l’ADN, pouvant conduire à des mutations)
ex: benzène, amiante, rayonnements radioactifs, rayonnements solaires, produits cancérigènes
Utilités des puces ADN: analyse de la réponse cellulaire à la présence de
génotoxiques (au niveau du transcriptome)
Etude sur
un grand nombre
d’individus
RESISTANCE ?
identification de gènes participant
à la détoxication de la cellule
(Multi Drug Transporter,
enzymes de dégradation…)
variation des réponses à un même génotoxique
suivant les individus.
(du au polymorphisme génétique entre les individus,
notion de susceptibilité génétique)
perspectives
adaptation des traitements pharmaceutiques à chaque
individu selon son polymorphisme
(pharmacogénomique)
Exemples d’ Applications- Environnement
1) Détection de bactéries pathogènes dans un échantillon biologique
Puce ADN contenant des sondes dirigées contre
les ARN16S de plusieurs bactéries pathogènes
(Salmonelles, Legionelles, Staphylocoques…)
Eau, produits alimentaires,
tissus infectés…
Révélation
Hybridation
prélèvements
Caractérisation rapide du ou
des pathogènes
présents dans le prélèvement
(résultats obtenus en 24h)
Amplification des gènes d’ARN 16S présents
+ marquage
Exemples d’ Applications- Environnement
2) Détection de substances polluantes dans l’eau (les biocapteurs)
Principe
Substance polluante (ex: arsenic..)
Utilisation de ce biocapteur pour
tester la présence de l’agent polluant
dans l’eau
Analyse microarray
Identification de gènes
spécifiquement induits
et fortement induits
par l’agent polluant
(ex: gène a)
Construction d’un biocapteur
Couplage de la protéine codée par
le gène a à une protéine fluorescente
(induction de la fluorescence si l’agent
polluant est présent)
Quelques références
Animation sur le principe des puces ADN
Un topo sur les puces ADN et leurs utilités
http://www.savoirs.essonne.fr/index.php?id=67&type=single&article=60=
Pour les plus courageux… quelques publications
Cui L. et al, Antimicrob Agents Chemother. 2005, Aug; vol 49 (8): pages 3404-3413
DNA microarray-based identification of genes associated with glycopeptide resistance in Staphylococcus aureus
Bartosiewicz M. et al, Archives of Biochemistry and Biophysics 2000, April; vol 376: pages 66-73
Development of a toxicological gene array and quantitative assessment of this technology
Rogge L. et al, Nature Genetics 2000, May; vol 25: pages 96-101
Transcript imaging of the development of human T helper cells using oligonucleotide arrays
Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306
Microarrays: biotechnology’s discovery platform for functional genomics