Préparation en ligne à la LC-MSMS Application aux

PREPARATION EN LIGNE COUPLEE A LA LC-MS/MS.
ASPECTS PRATIQUES.
APPLICATION AUX DOSAGES DES MEDICAMENTS
ET DES STUPEFIANTS DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES.
APPLICATION ENVIRONNEMENTALE.
C. Lacroix, E. Saussereau, J.P Goullé
Laboratoire de Pharmacocinétique et de Toxicologie
Groupe Hospitalier du Havre
ISB – SRBCC -SBBC
8-10 juin 2011
1
Plan
1 – Objectif de la PEL
2 – Colonne d’extract-purification-concentration
3 – Colonne analytique
4 – Phases mobiles
5 – Préparation des échantillons
6 – Montage
7 – Exemples
2
Objectif de la PEL
1 - Problèmes : extractions liquide-liquide ou liquidesolide : longues, fastidieuses, consommatrices de
solvants, polluantes, coûteuses (SPE).
2 - Possibilités d’automation : plus adaptée au travail par
séries.
3 - Années 80, préparation en ligne (PEL).
But : Exécuter de façon automatique, les étapes
d’extraction, de concentration et de purification à partir
d’échantillons biologiques ou non, sans rupture entre la
phase préparative et la phase analytique.
3
« Cahier des charges »
 Montage « simple »
 Préparation unitaire des échantillons
 Sensibilités adaptées au suivi thérapeutique
et aux analyses médico-légales fréquentes
 Technique rapide et la plus généraliste
possible
 Peu coûteuse
4
Colonnes d’extraction …
1 - RAM (restricted access media)
2 - LPS (large particle supports)
3 - Colonnes monolithiques
Ces colonnes peuvent être ou non
couplées à une colonne analytique
Ces différents supports possèdent en
commun
la propriété d’exclure les
macromolécules
(protéines,
lipides)
pendant que les analytes sont retenus,
généralement par interaction hydrophobe
5
ou électrostatique.
RAM
Dénomination
ISRP
Pinkerton
Hagestam
1985
ADS
(Alkyl-diol-silice)
Ligand
combiné
Chromspher
Biomatrix
Nature
Silice
Silice
silice
Pores
6 nm
6 nm
13 nm
Groupements
hydrophobes
internes
Glycine-Lphénylalanine
-Lphénylalanine
C4, C8, C18, ac sulfonique
Groupements
hydrophiles
externes
Diol-glycine
Glycérylpropyl
Phényl
Polyglycidol
6
RAM
Surface semiperméable (SPS)
Silice recouverte
de protéines
Protéine-coated
silica. Biot Trap
Grpts
hydrophobes
Internes :
Nitrile, phényl,
C8, C18
Grpts
hydrophobes
Internes :
C8, C18
Grpts hydrophiles
Réseau
polymérique de
polyoxyéthylène
α1glycoprotéine
acide
Support à fc
mélangées
Mixed-functional
Material. Capcell Pak
MF
Sil enrobée de
silicone recouverte
de polymères
hydrophiles
(polyoxyéthylène) et
hydrophobes
(groupements
styrène)
Phase à écran
hydrophobe
(shielded
hydrophobic
phase) Hisep
Réseau
polymérique de
polyoxyéthylène
hydrophile
comportant des
groupements
phényl
hydrophobes
7
Support à grosses particules
(larges particles supports, LPS)
Granulométries de 30 – 60 µm autorisant des débits
élevés sans générer de hautes pressions (1 mm de
diamètre, de 2 à 5 ml/min)
Les protéines et autres substances hydrophiles
traversent la colonne ; les petites molécules sont
retenues par interaction hydrophobe.
Ces colonnes permettent de travailler en TFC (turbulent
flow
chromatography) ou chromatographie en flux
turbulent ou tourbillonnant.
Phases stationnaires : alkyles (C2, C8, C18), phényl ou
phase polymérique type HLB (divinylbenzène-Nvinylpyrrolidone copolymère) : très hydrophobe mais
également hydrophile (HLB : hydrophilic-lipophilic
balance).
8
Phases monolithiques
- Structure gélifiée très poreuse
- Haute perméabilité
- Basse pression à haut débit
- Le flux reste laminaire
- Excellente séparation
A lire : S. Souverain, S. Rudaz, J. L. Veuthey
J. Chromatogr. B, 801 (2004) 141-156
9
QUEL SUPPORT CHOISIR
- Problèmes des RAM : greffons classiques :
C4, C8, C18, phényl sur base de silice :
limitation du pH.
- TFC et copolymère (type HLB) : large
rétention, grande polyvalence. Pas de limite
de pH.
- Éviter échange d’ions (MCX ; MAX) sauf
pour régler un problème spécifique
(impossibilité de technique généraliste).
10
Aspects pratiques de la PEL
Automatiser l’extraction par SPE sans rupture
entre l’extraction, la chromatographie et la
détection implique :
• De ne jamais oublier les trois modules :
le détecteur, la LC-colonne analytique, la LC
préparative.
• De ne jamais penser globalement pour élaborer
une méthode, pour une panne ou lors du
changement d’un paramètre.
11
Colonnes analytiques
Besoins :
- rétention et séparation correctes des
composés polaires ;
- nombre de plateaux suffisants ;
- résistance aux changements brutaux et
répétitifs de phases mobiles ;
- Atlantis C18, 150 x 2,1 ; 3 µm (Waters)
12
Phases mobiles
Toujours les mêmes quelque soit l’analyse :
1 - Colonne préparative (HLB Oasis) : 2 phases
- eau + 0,2 % d’amoniaque. Débit 2 ml/min
- méthanol (90 %) + eau (10 %) + 0,2 % d’A F.
2 - Colonne analytique (Atlantis) : 2 phases
- formate d’NH4, 20 mmol, pH 2,8
- ACN – formate d’NH4 (90-10 ; V/V)
13
Préparation des échantillons
Toujours la même quelque soit l’analyse :
1 – Dilution au 1/100 ou 1/200 dans eau
du S, P, Sg total
2 – Centrifugation à 12 000 trs/min
3 – Volume injecté: 100 µl soit 1 µl (ou
0,5) de S, P, Sg total
En théorie, tous les dosages sont possibles
avec 2 µl de prélèvement.
14
Influence de la dilution sur la réponse
Réponse
(S)
(ex. de la fluvoxamine)
* 7508
*
Volume inj. constant ; Quantité inj. variable
4867
R = S (non dil.) = 7508 = 14
S (1/50)
531
x 1,3
3754
*
3141
*
*
2644
x 2.1
x 3.5
531
*
1500
*
750
1 1/2 1/5
1/10
Courbe théorique
*
x 3.5
* 150
1/50
Dilution
15
Influence de la dilution sur la réponse
Réponse
(S)
(ex. de la fluvoxamine)
Volume inj. variable ; Quantité inj. constante
1100
1390
1360
*
*
*
* 1005
852
R = S (1/50)
= 1360 = 1,6
S (non dil.)
852
Dilution
1 1/2 1/5
1/10
1/50
16
Avantages de la dilution
1 - Plus de pb liés à la qualité de la matrice
(p, s, sg, sg post-mortem)
2 - Absence de suppression d’ions
3 - Très bon rapport signal/bruit
4 - Dissociation des liaisons protéiques par
effet de la dilution au 1/100 ou 1/200
5 - Longévité de la colonne Oasis
17
Montage
1 - montage personnel ou appareillage industriel
2 - un montage personnel nécessite :
- une pompe annexe à deux canaux,
capable de débiter 2-4 ml/min ;
- deux vannes de commutation.
L’ensemble étant impérativement piloté par l’informatique
du système.
Montage personnel plus souple, moins onéreux et permet
de privilégier l’acquistion d’un système MS-MS plus
performant (sensibilité, vitesse d’acquisition …).
18
19
20
Pump 2
Alliance 2795
Injector
Back-flush
Phase de
chargement de
Configuration
l’Oasis
LOAD
STEP
Pump 1
1525
Waste
Valve 1
Position 1
Valve 2
Position 1
Extraction Column
Oasis HLB
Analytical Column
Atlantis C18
Mass
Spectrometer
Quattro micro
21
Pump 2
Alliance 2795
Injector
Pump 1
1525
Back-flush
Elution
en back-flush
Configuration
BACK-FLUSH STEP
Waste
Valve 1
Position 1
Valve 2
Position 2
Extraction Column
Oasis HLB
Analytical Column
Atlantis C18
Mass
Spectrometer
Quattro micro
22
Pompe
Analytique
Injecteur
Pompe
Préparative
Vanne 6 voies
Position 2
Vanne 10 voies
Position 2
Injection directe sur
colonne analytique
après extraction off-line
Colonne préparative
Oasis HLB
Waste
Colonne Analytique
Atlantis C18
Spectromètre
de masse
Quattro micro
23
24
NH4OH 0,2 %
CH3OH / H2O (90/10)
Pompe analytique
Injecteur
NH4COOH (20 mM, pH = 2.8)
ACN + 0.2% AF
Waste
Vanne
Oasis HLB
MS/MS
Colonne Analytique
Atlantis C18
25
Dosages des médicaments
Exemples : méprobamate, metformine,
gabapentin, topiramate, lamotrigine,
levetiracetam, oxcarbz + met, cbz, -bloquants,
halopéridol, rispéridone, neuroleptiques
phénothiaziniques, paroxétine, clozapine,
benzodiazépines, chloroquine, quinine,
tramadol, itraconazole, méthadone, EDDP,
propoxyphène, norpropo, tropatépine,
citalopram, fluoxétine, fluvoxamine,
minalcipram, sertraline, antirétroviraux,
buflomédil, imatinib, duloxétine,
antidépresseurs tricycliques, lidocaïne,
bupivacaïne…
26
V0
4 min
1.1 min
V1
95% B
V0
Atlantis C18 (150 x 2.1 mm; 3 µm)
0.3 ml/min (45°C)
1 min
0.5 min
50% B
0 min
4.1 min
92% A - 8% B
C1
2 ml/min
H20 +
0.2%
NH4OH
5 min
6 min
92% A - 8% B
C2
0.5 ml/min
C2
1 ml/min
C1
2 ml/min
90% MeOH / 10% H20
+ 0.2% AF (waste)
Oasis-HLB (20 x 2.1 mm; 25 µm)
A : NH4COOH (20 mM, pH = 2.8)
B : ACN + 10% NH4COOH (20 mM, pH = 2.8)
27
28
29
30
31
32
Autres médicaments
Idem mais remplacement de la phase
ammoniacale de chargement par de l’eau ou eau +
0,2 % d’acide formique.
 Sulfamides hypoglycémiants : glibenclamide
(Daonil), glibornuride (Glutril), gliclazide
(Diamicron), glipizide (Glibenese), glimépiride
(Amarel) : pKa 5,2 – 5,5. Elués partiellement de
l’Oasis par l’eau ammoniacale mais retenus
avec de l’eau.
 Exemple de la prégabaline
 Exemple du méthotréxate
33
Pregabaline
34
35
36
0,022 µM
37
Injections multiples
38
Application au dosage des stupéfiants
(Cocainiques, opiacés, amphétaminiques)
 Sérum / sang : dilution au 1/100 dans l’eau +
mélange d’étalons internes déteurés
 100 µl injectés
 C18 Atlantis (150 x 2,1; 3 µm)
 Mêmes phases mobiles,
 Gradient allongé (injection toutes les 15 min)
39
Nécessité d’une chromatographie
- Retarder élution des produits polaires
- Séparation des conjugués :
• M3G, M6G / C6G
morphine / codéine
• Bupré et norbupré-conj
bupré, norbup
• Morphine, norcodéine : transitions identiques
mais TR = 3,89 et 4,88
- Nb de transitions élevées, 2 par molécule,
une transition pour les deutérés
40
OPIACES
Morphine,
M3G,M6G
•
COCAINIQUES
AMPHETAMINES
Cocaïne
•
Méthylecgonine
•
Benzoylecgonine
•
Cocaéthylène
•
Norcocaïne
•
•
Amphétamine
•
Métamphétamine
•
MDA
•
MDMA
•
MDEA
•
6-MAM
•
Codéine,C6G
•
6-acétyl-codéine
•
•
Anhydroecgonine
methylester
•
•
•
•
Dihydrocodéine
•
Oxycodone
•
Noroxycodone
•
Oxymorphone
•
Hydromorphone
•
•
AUTRES
Buprénorphine
Norbuprénorphine
Bupré-conj
Norbupré-conj
MBDB
Ephedrine,
Pseudoéphedrine
PMA
•
PMMA
•
•
•
Papavérine
Noscapine
HMMA
•
BDB
•
Pholcodine
Hydrocodone
•
4-MTA
•
Norcodéine
•
Héroïne
•
Méthadone
•
EDDP
•
*+
•
deutérés
41
v
A : Formate NH4 (20 mM)
B : ACN + 10 % Formate NH4 (20 mM) 5,5 min
inj
9,0 min
Atlantis (150 x 2,1 mm; 3 µm)
0,3 ml/min (45°C)
inj
v
5 min
0,5 min
9,5 min
0 min
15 min
0,5 min
1 min
4 min
8% B
40% B
40% B
3,5 min
5,5 min
95% B
92% A
95% B
C2
1 ml/min
C1
2 ml/min
H20 +
0,2% NH4OH
C2
0,5 ml/min
2 min
90% MeOH / 10% H20
+ 0,2% AF
(évier)
C1
2 ml/min
4 min
Oasis-HLB (20 x 2,1 mm; 25 µm)
42
v
v
Opiacés
6-MAM = 13 ng/mL
Codeine = 25 ng/mL
-3
-3
= 50 ng/mL
-6
-6 = 25 ng/mL
Morphine-glucuronides
(« No Transition »)
Morphine-glucuronides
Morphine (« No Transition »)
Morphine = 10 ng/mL
328.3 > 211.2
5.83e3
300.3 > 215.1
3.57e3
462.2 > 462.1
1.33e4
462.2 > 286.3
1.46e4
286.4 > 286.3
3.82e4
286.4 > 201.1
2.44e3
43
Opiacés
Codeine-6-glucuronide
476.3 > 476.2
5.48e4
Pholcodine
399.3 > 114.1
4.42e4
342.3 > 225.3
6-monoacetyl-codeine
Oxycodone
Dihydrocodeine
2.70e4
316.2 > 298.2
7.97e4
302.3 > 199.3
4.27e4
Oxymorphone
302.1 > 284.1
Noroxycodone
7.35e4
Hydromorphone
286.3 > 185.3
2.66e4
44
Cocainiques
Benzoylecgonine
= 52 ng/mL
Methylecgonine
= 9 ng/mL
Cocaethylene
= 3,1 ng/mL
Cocaine
= 2,4 ng/mL
290.3 > 168.2
3.85e4
200.3 > 182.3
9.06e3
318.1 > 196.2
5.24e4
304.3 > 182.2
1.43e4
45
Amphétamines
MDEA
= 14 ng/mL
208.2 > 163.2
MBDB
= 15 ng/mL
208.2> 135.0
MDMA
= 21 ng/mL
194.2 > 163.0
MDA
= 12 ng/mL
180.2 > 163.2
Methamphetamine
= 17 ng/mL
150.2 > 119.0
Amphetamine
= 19 ng/mL
136.2 > 119.1
6.24e4
1.24e5
1.05e5
2.26e4
7.13e4
6.84e4
46
Buprénorphine
BuprenorphineGlucuronide = 20 ng/mL
Buprenorphine
(no transition)
644.4 > 468.1
1.50e4
468.2 > 468.1
8.20e3
Buprenorphine
= 2 ng/mL
468.1 > 54.8
NorbuprenorphineGlucuronide = 20 ng/mL
590.1 > 414.2
Norbuprenorphine
(no transition)
414.4 > 414.3
Norbuprenorphine
= 5 ng/mL
414.4 > 83.1
2.06e3
1.15e4
1.62e4
1.12e3
47
Dosages des stupéfiants
dans les cheveux
- Incubation de 20 mg de cheveux finement
coupés dans 200 µl de formate (pH 2,8), 2h
aux ultrasons, injection de 10 µl en PEL.
- Prise d’essai réduite à 5 mg voire 1 mg
(pesée délicate) dans 150 µl de formate et
injection de 100 µl en PEL.
48
Poils pubiens
6-MAM-D3
6-MAM = 1,5 ng/mg
codéine-D3
codéine = 0,2 ng/mg
morphine-D3
morphine = 2,2 ng/mg
49
noscapine
papavérine
méthadone-D3
méthadone = 70 pg/mg
EDDP-D3
EDDP = 3 pg/mg
50
cocaïne-D3
cocaïne =580 pg/mg
benzoylecgonine-D3
benzoylecgonine = 540 pg/mg
méthylecgonine-D3
méthylecgonine = 10 pg/mg
51
1 mg de cheveux dans 150 µl de formate (100 µl injectés)
MDMA-D3
MDMA = 30 pg/mg
amphétamine-D3
amphétamine = 26 pg/mg
méthamphétamine-D3
méthamphétamine = 425 pg/mg
52
cocaéthylène-D3
cocaéthylène = 18 pg/mg
cocaïne-D3
cocaïne = 1,7 ng/mg
benzoylecgonine-D3
benzoylecgonine = 1,2 ng/mg
53
6-MAM-D3
6-MAM = 15 pg/mg
morphine-D3
morphine = 6 pg/mg
54
Stupéfiants sur spots avec PEL
Goutte 30 µL
« rondelle » 3 mm
( 3 µL)
150 µL eau
+ D3 1 ng/mL
ultrasons
10 min
centrifugation
2 min
10900 trs/min
injection 100 µL
55
Application : stupéfiants avec PEL
morphine-D3
morphine = 6 ng/mL
morphine-D3
morphine = 6 ng/mL
codéine-D3
codéine = 11 ng/mL
56
Application : stupéfiants avec PEL
méthamphétamine-D3
méthamphétamine
= 10 ng/mL
MDMA-D3
amphétamine-D3
amphétamine
=12 ng/mL
MDMA = 10 ng/mL
MDA-D3
MDA = 9 ng/mL
57
Application : stupéfiants avec PEL
cocaïne-D3
cocaïne = 10 ng/mL
benzoylecgonine-D3
benzoylecgonine
= 73 ng/mL
methylecgonine-D3
methylecgonine
= 15 ng/mL
58
Etude de corrélation
spot / sang total
Molécules
Corrélation
morphine
0,98
codéine
0,93
amphétamine
0,99
méthamphétamine
0,90
MDA
0,88
MDMA
0,93
cocaïne
0,83
méthylecgonine
0,91
benzoylecgonine
0,99
Opiacés
Amphétamines
Cocaïniques
59
Dosage du cyanure après dérivation
• 200 µL eau distillée
• 25 µL sang
• 25 µL isotope (520 ng/mL)
centrifugation
6 °C
• 700 µL méthanol
• 250 µL surnageant
• 50 µL NDA (1 mM dans tampon pH 8)
• 50 µL taurine (5 mM dans tampon pH 8)
• 30 min à T°amb
injection (100 µL)
60
Réaction de dérivation
O
O
+
S
HO
NH2
+
(13)C(15)N-
O
O
taurine
NDA
H 2O
(13)C(15)N-
N CH2-CH2-SO3H
Cyano-benzoisoindole-N-substitué (CBI)
61
Résultats
étalon interne C13N15
confirmation
cyanure
confirmation
étalon interne C13N15
quantification
cyanure
quantification (260 ng/mL)
62
Charge médicamenteuse des eaux usées
63
Conclusion
Avantages de la PEL :
- Simplicité
- Rapidité
- Polyvalence
- Economie
- Non polluant
La PEL entraîne un changement radical de
l’organisation du travail au sein du laboratoire.
64