04/12/2010 1 Microscopie Confocale

04/12/2010
2010
Microscopie Confocale
Laurent Héliot, Institut de Recherche Interdisciplinaire, CNRS/Lille1
La microscopie en biologie
Voir pour comprendre
Questions biologiques
Structures
Localisations
dynamiques
• Introduction: de Abbe à Minsky
• Principe du CLSM
• Le CLSM pièce par pièce
• Acquisition spectrale et unmixing (Corentin)
•Dynamiques et interactions moléculaires (Corentin)
• Autres méthodes confocales
• Conclusion
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04/12/2010
La microscopie photonique
Limite de résolution
1875
Dxy= 0,61 λ/ n sin α
Disque de diffraction
Source
ponctuelle
idéale
Objectif
Point lumineux
Instrumentation : La résolution
ICF/IBL
α
5
Qui a eu l’idée folle d’inventé le confocal?
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)
Marvin Minsky
(1957)
Informaticien et Roboticien américain
En 1958, il fonde le Laboratoire d’intelligence
artificielle au Massachusetts Institute of
Technology. Il est le créateur de l’intelligence
artificielle et père de la révolution
informatique et du confocal...
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04/12/2010
Les outils de la microscopie
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)
Marvin Minsky
(1957)
Section optique
• Introduction: de Abbe à Minsky
• Principe du CLSM
• Le CLSM pièce par pièce
•Dynamiques et interactions moléculaires
• Autres méthodes confocales
• Conclusion
conventionnel
Les outils de la microscopie
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)
Marvin Minsky
(1957)
Plan Image
Confocal
Plan Objet
Plan Source
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Haute résolution
Section optique
Conventionnelle
dxy = 0,61.λem/(n sinα)
dxz = 2.λem/(n sinα)2
Confocal
dxy = 0,4.λem/(n sinα)
dxz = 1,4.λem/(n sinα)2
Haute résolution
Des résultats révolutionnaires, le filtre spatial
(communiqué par Y.Usson, GDR2588)
• Introduction: de Abbe à Minsky
• Principe du CLSM
• Le CLSM pièce par pièce
•Dynamiques et interactions moléculaires
• Autres méthodes confocales
• Conclusion
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04/12/2010
Outils de la microscopie
un outil révolutionnaire
Les années 80 : La Biologie Cellulaire …
• développement des immuno-localisations
• laser pas trop cher et assez simple et stable
• électronique disponible
• Solution informatique : DOS
Outils de la microscopie
Le CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy
Photomultiplicateur
Pinhole
Source
Laser
Miroir Dichroïque
Objectif
Echantillon
Scanning
Outils de la microscopie
Les CLSM 1957 à aujourd’hui : un outil révolutionnaire
AOM
Les LASERS
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Outils de la microscopie
Laser
Outils de la microscopie
Laser
Emission stimulée
L'inversion de population
• Monochromaticité
• Polarisation
• Directionalité
Cavité laser
Outils de la microscopie
Laser
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04/12/2010
CLSM
AOTF la liberté…
AOTF
Switch AOTF 10 μs
Région d’intérêt (ROI)
ROI1: 488nm for FITC only. (Green colour)
ROI2: 364nm for Dapi, 488ncm for Fitc, and 543nm for Tritc
ROI3: 543nm for Tritc only (Red colour)
ROI4: 364nm for Dapi only (Blue colour)
(Dapi was scanned sequentially to avoid bleed through
into Fitc channel. This can be done by line-by-line sequential
scan.)
Outils de la microscopie
Chemin optique
Source
Ponctuelle
Outils de la microscopie
Dichroïque
Miroir
dichroïque
Laser
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Outils de la microscopie
Filtres acousto-optiques
Triple Dichroic 488/543/633 (TD)
vs.
AOBS
AOBS…
1.00
0.90
0.80
0.70
0.60
TD
0.50
AOBS
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
450
500
550
600
650
700
Outils de la microscopie
Filtres acousto-optiques
Outils de la microscopie
Filtres acousto-optiques
RF1
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04/12/2010
Outils de la microscopie
Filtres acousto-optiques
Outils de la microscopie
balayage
Outils de la microscopie
balayage
X mouvement continu
200-1200 Hz
Classique :200, 400, 800, 1000 Hz
Résonnant : 4 khz, 8 Khz,
15 Khz
X
Y
Y mouvement incrémental
= changement de ligne
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Outils de la microscopie
balayage
Outils de la microscopie
Scan Hybride
sources
Dïchroiques
Outils de la microscopie
balayage
0
29
Pixel
Y
512
X
512
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Outils de la microscopie
Zoom…
En CLSM la résolution numérique et le grandissement dépendent de l’angle de
balayage des miroirs du scanner.
Outils de la microscopie
Résolution et pixelisation
Travailler avec une taille optimale de pixel
Changement Nbre pixels
Resel
Changement
de taille pixels
dxy = 0,4.λem/(n sinα)
dxz = 1,4.λem/(n sinα)2
(Dorey et Ebenstein 1988)
Objectif 1.4 NA Théorie de Nyquist :
2,3 pixels /resel
100 nm / pixel
200 nm/pas en Z
échantillonage
Taille des pixels
800x800nm
200 200
200x200nm
100x100nm
50x50nm
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Coupe optique
Deplacement en Z comme SUPERZ….
• Moteur du statif
• Surplatine galvanométrique
¾ Précision du déplacement
¾ Reproductibilité
¾ rapidité
Axe Z
SP5 – Platine SuperZ
Pinhole
3
Plan Image
3
3
3
2
Plan Objet
1
1
Plan Source
2
Pinhole
Sélection spatiale
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Pinhole
Utilisation
1 Airry
Section z:
(
2 Airry
(
)) (
2
ouvert
)
2
FWHM det,axial = 0,88λem n− n2−NA2 + 2.n.PH / NA entre 0,5 et 1 Airy Unit
detecteurs
Canaux et «merge »
PMT
=
Canal
detecteurs
Ce qui se passe dedans
Tube Photo-Multiplicateur
Excitation
Filtre
Lumière
Effet photoélectrique
(Einstein, 1905, Prix Nobel)
e-
GAIN (mV)
Signal/Bruit
Intensité
voltage
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04/12/2010
detecteurs
Spectroscopie…
detecteurs
Avantage du SP…
émission
Cellule BPAE :
proteine H2B : Cy3 (vert)
Filaments intermédiaires: CY5 (Red)
CLSM
Application, analyse, imagerie 3D
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CLSM, la microscopie multidimension
Acquisition 5D
Axe Z
Plan 1
Plan 2
...
Plan 1
Plan 2
...
Plan 8
Plan 9
Plan 8
Plan 9
Plan 8
Plan 9
Axe Z
Axe Z
T=0
Plan 1
Plan 2
...
T=30
T=15
• Introduction: de Abbe à Minsky
• Principe du CLSM
• Le CLSM pièce par pièce
•Dynamiques et interactions moléculaires
• Autres méthodes confocales
• Conclusion
?
Dynamique moléculaire
CLSM= outils de mesure en cellule vivente…
200 nm
600
0nm
Milieu diffusant et
hétérogène,
complexe, dynamique
Volume de focalisation = 1μm3
Approche multimodale, quantification
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Dynamique moléculaire en cellule vivante
Fluorescence Recovery After Photobeaching (FRAP)
Cours jeudi
Compartiment
Région
d ’intérêt
Molécule
fluorescente
Acquisition
(pre-bleach)
Photobleaching ( t0)
Acquisition (t1)
Interaction Moleculaire
Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
Acquisition (t2)
Acquisition (tn)
Cours jeudi
Interaction Moleculaire
Fluorescence correlation spectroscopy
FCS autocorrection:
ligand (bleu)
ligand lié à une autre molécule (rouge)
mélange des deux (vert).
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04/12/2010
• Introduction: de Abbe à Minsky
• Principe du CLSM
• Le CLSM pièce par pièce
• Dynamiques et interactions moléculaires
• Autres méthodes confocales
• Conclusion
Autres microscopies Confocales
Spinning disk
Disque de Nipkow
Autres microscopies Confocales
Spinning disk
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Autres microscopies Confocales
Spinning disk
Avantages:
• Section optiques (< confocal)
• Fréquence d’acquisition élevée
• Photobleaching et photo toxicité
inférieure au CLSM
Widefield
Spinning disk
Inconvénient:
Confocal
• Moins bonne discrimination en z
• Acquisition multicanal le plus souvent
simultanée
• Pas de zoom optique
• Taille de pinhole fixe
• Introduction: de Abbe à Minsky
• Principe du CLSM
• Le CLSM pièce par pièce
• Acquisition spectrale et unmixing
• Dynamiques et interactions moléculaires
• Autres méthodes confocales
• Conclusion
CLSM
Les choix…
+/-
Points forts:
+/- -Multimarquage
- section optique
- 5D
- objet épais
- FRET/FCS
- microscopie multimodale
+++
++
Points Faibles:
- vitesse / plein champ
- bleaching et phototoxicité (mais
maitrisé)
> autres solutions confocales
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04/12/2010
Que le microscopie soit avec vous…..
Laurent Héliot
Aymeric Leray
Corentin Spriet
Dave Trinel
B
Bernard
dV
Vandenbunder
d b d
Institut de Recherche Interdisciplinaire
Haute Borne, Villeneuve d’Ascq
[email protected]
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