Master 1 PG methodologie 2012

Approches méthodologiques en
pharmacogénétique
Marie-Anne Loriot
INSERM UMR-S 775,
Université Paris Descartes
UF Pharmacogénétique et
Oncologie Moléculaire,
Hôpital Européen Georges Pompidou
Paris, 1er février 2012
IDENTIFICATION DE SOUS-POPULATIONS
en fonction de la réponse et de la toxicité
Non toxique
Toxique
Inefficace
Efficace
Variabilité interindividuelle dans la réponse aux
médicaments
Médicament
Facteurs génétiques
Facteurs génétiques
Facteurs acquis
- Age, sexe
- Comorbidités
- Alimentation
- Interactions
médicamenteuses
REPONSE
INEFFICACITE/TOXICITE
Polymorphismes génétiques
- métabolisme
- transport
- cible
pharmacologique
OBJECTIF:
- immunité (HLA)
Médecine
prédictive
et
personnalisée
EFFICACITE/TOLERANCE
Pharmacogénomique
Etude des conséquences des variations de l’ADN et de l’ARN sur la
réponse aux médicaments
 Pharmacogénétique
Influence des variations de la séquence en ADN sur la réponse
aux médicaments
Qu’est-ce qu’un polymorphisme?
•
•
•
•
Phénotype d’un individu (grec phanein, f anei n se manifester) = ensemble des
caractéristiques visibles (traits physiques) et invisibles (biologiques);
Le phénotype est sous-tendu par des variations individuelles dans la séquence de
l’ADN génomique dont l’ensemble est appelé génotype;
Polymorphisme génétique : variation individuelle de la séquence nucléotidique
(substitution -SNP-, délétions et amplifications –CNV-, répétitions…)
 Existence au même locus d’au moins 2 formes différentes de la séquence,
appelés allèles
 Fréquence > 1% dans la population
SNPs très fréquents au sein du génome
 environ 10 millions de SNPs soit θ≈ 1 /300 bases
SNP= Single Nucleotide Polymorphism
CNV= Copy Variation Number
Bases moléculaires de la variabilité génétique:
Polymorphismes génétiques
(
Génotype pas de gène actif
Phénotype métaboliseurs
LENTS
1 gène actif
2 gènes actifs
métaboliseurs métaboliseurs
RAPIDES OU
RAPIDES
INTERMEDIAIRES
plus de 2 gènes actifs
métaboliseurs
ULTRARAPIDES
Gène défectueux, « non fonctionnel » (délétion, mutation inactivatrice)
(
)n
Gène actif, « normal »
Amplification du gène actif
)n
D’après de Chaisemartin et Loriot, Pathol
Biol (Paris), 2005
Principaux mécanismes moléculaires des modifications de l’activité
des EMX
Séquence non codante
Séquence codante
5 ’NC
Jonctions
exon/intron
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
ARNm
Modification
de la
quantité
d’enzyme
Diminution
de l’activité
Effet sur
l’inductibilité
Enzyme
absente
ou inactive
Enzyme
absente
Métabolisme
réduit
ou absent
Enzyme
instable
Altération
spécificité
de substrat
Quantité
d’enzyme
augmentée
Métabolisme
modifié
Métabolisme
augmenté
FREQUENCE DES POLYMORPHISMES GENETIQUES
DES ENZYMES DU METABOLISME DES XENOBIOTIQUES
CYP 1A1 (induction ~ 10%)
CYP 2A6* (5%)
CYP 1A2 (10%)
CYP 2C9 (2-3%)
CYP 2C19 (5-20%)
CYP 2D6* (5-7%)
CYP 2E1 (>1%)
CYP 3A4/5 (?)
GSTM1* (50%)
GSTT1 (10-20%)
GSTP1 (10%)
UGT1A1 (10-15%)
NAT2 (50%)
EH (<5%)
TPMT(<1%)
MDR1 (25%)
* : gènes pour lesquels une duplication est connue
POLYMORPHISMES GÉNÉTIQUES DES
ENZYMES DU MÉTABOLISME DES MÉDICAMENTS
Phase I
Phase II
Phase III: transporteurs ABC type MDR1 (ABCB1),, SLC, OAT…
Variations interindividuelles dans la réponse aux médicaments
Absorption/Excrétion*:ex. MDR1
lente/rapide
Interactions avec cible pharmacologique*:
faible/forte
Interactions
médicamenteuses
Interactions:
médicamenteuses,
médicaments-aliments
Métabolisme*: ex. CYP450
lent, rapide, ultrarapide
* variabilité génétique
Fonction rénale
Conséquences de la variabilité génétique
métaboliseur
lent
Effet sur [médicament]
[médi]
Phénotype
Conséquence clinique
Index
thérapeutique
• toxicité
métaboliseur
rapide
[médi]
tps
Index
thérapeutique
• efficacité
thérapeutique
Index
thérapeutique
• inefficacité
thérapeutique
métaboliseur
ultrarapide
[médi]
tps
tps
INTERET DE LA PHARMACOGENETIQUE
*Les variations du métabolisme, du transport et des cibles
pharmacologiques ont des conséquences:
- pharmacocinétiques
- pharmacodynamiques
- toxiques
* Rôle important quand:
- fenêtre thérapeutique étroite
- efficacité difficile à évaluer rapidement
- efficacités voisines avec profils de tolérance variable
* Il est possible de prédire le métabolisme
- génotypage
- phénotypage
Phénotype:
- activité réelle
- quantifiable
- mise en oeuvre plus difficile (in vivo, in vitro, ex vivo)
- variations (xénobiotiques, pathologies)
- pas permanent
Génotype:
- facile
- permanent
- pas quantifiable
- pas activité réelle
EXEMPLES DE PHENOTYPAGE in vivo
CYP 1A1 :
CYP 1A2 :
CYP 2A6 :
CYP 2C9 :
CYP 2C19:
CYP 2D6 :
CYP 2E1 :
CYP 3A4 :
induction lymphocytes EROD
caféine sang PX/C (NAT2)
Coumarine
Diclofenac
Méphénytoïne, Proguanil,
Oméprazole
Debrisoquine, Spartéine,
Dextromethorphane
Chlorzoxasone
6-ß-OH-Cortisol (induction),
13, 14 (C)Erythromycine,
Midazolam, Dapsone,
Dextromethorphane
GENOTYPAGE : outils
* Méthodes fondées sur la PCR : RFLP, PCR allèle-spécifique, OLA ..
(spécifiques)
séquençage
* Méthodes non spécifiques: SSCP, DGGE
D-HPLC :
==> détection de nouveaux polymorphismes
* « Carte génétique » :
puces à ADN
Intérêt pour les études sans à priori
Relation génotype phénotype
Exemple de la TPMT
MEDICAMENTS THIOPURINIQUES:
AZATHIOPRINE ET 6-MERCAPTOPURINE
 Utilisations
Gastro-entérologie, cancérologie, transplantation,
dermatologie….
 Indications dans les maladies inflammatoires
chroniques de l’intestin (MICI) de l’adulte et de l’enfant:
- maintien de la rémission clinique (taux de réponse 50%)
- sevrage des patients cortico-dépendants
- prévention des rechutes post-opératoires
 Efficacité à long terme (taux de rechute 5-10% par an)
 Délai d’efficacité: 12 à 18 semaines
THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :
métabolisme des thiopurines
AZATHIOPRINE
Imurel ®
6-MERCAPTOPURINE (6-MP)
TPMT
6-MMP
HGPRT
6-THIOGUANINES
TOXIQUES
(dose dépendant)
Hématotoxicité
Myélosuppression
XO
ACIDE
THIOURIQUE
ACTIFS
Immunosuppresseurs
Maladie de Crohn
Leucémie aigue lymphoblastique
ACTIVITE TPMT : DISTRIBUTION TRIMODALE
Wt/Wt
M/Wt
M/M
METABOLISME DE L’AZA ET LA 6-MP
AZA = azathioprine ; 6-MP = 6-mercaptopurine ; 6-TIMP = 6thioinosine monophosphate ; 6-TGN = 6-thioguanine nucléotides;
6-MMP = 6-méthylmercaptopurine ; 6-TA = acide thiourique ;
6-MeTIMP = 6-méthylthioinosine monophosphate;
6-MMP(R) = 6-méthylmercaptopurine ribonucléotides ;
HGPRT = Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransférase;
XO = xanthine oxydase ; IMPDH = inosine monophosphate
déshydrogénase
CONSEQUENCES DES VARIATIONS DE L’ACTIVITE TPMT
 Toxicité hématologique:
Corrélation entre taux de 6-TGN et activité TPMT: lien avec
la myélotoxicité
Déficit en TPMT: dans 1/3 des cas de toxicités
 Toxicité hépatique:
Dérivés méthylés hépatotoxiques
Rapport 6-TGN/6-MMP
En cas d’activité TPMT élevée production accrue de 6-MMP
 Résistance pharmacologique
En cas d’activité élevée: seuil d’activité à définir
 Adaptation de posologie
En fonction du génotype ou du phénotype
POLYMORPHISME DE LA TPMT
 Structure
du gène
5’
3’
ATG
 Principales
mutations
TPMT* 2 : G238C Ala Pro
TPMT*3A : G460A Ala  Thr
A719G Tyr  Cys
TPMT*3B : G460A Ala  Thr
Stop
Répartition
des allèles variants:
7%
78 %
<1
%
TPMT*3C : A419G Tyr  Cys
5%
PHENOTYPAGE TPMT
Activité érythrocytaire = reflet de la TPMT hépatique
Cytosols
érythrocytaires
Réaction enzymatique:
6-MP
6-MMP
Mesure radiométrique
ou
Séparation par HPLC
CORRÉLATION
GÉNOTYPE/PHÉNOTYPE
Identification de biomarqueurs
Approche gène candidat
Exemple des anticoagulants oraux
PROBLEME DE SANTE PUBLIQUE
Première cause
d’accidents iatrogènes
Près de 900 000
patients traités
PROBLEMES
LIES AUX
TRAITEMENTS
AVK
≈ 5000 décès par an
18 000
hospitalisations
par an
AVK EN FRANCE
 Coumadine® (warfarine)
cp à 2 et à 5 mg
 Sintrom® Mini-Sintrom®
cp à 4 et à 1 mg (acénocoumarol)
 Préviscan® (fluindione)
cp à 20 mg
LES MÉDICAMENTS ANTI-VITAMINE K
4-OH-Coumarine et ses dérivés :
Acénocoumarol Sintrom®
Warfarine
Coumadine ®
Tioclomarol
Apegmone ®
O
Indane-dione et ses dérivés :
Fluindione
Previscan ®
Phenindione
Pindione ®
O
O
R
R
O H
O
Cycle de la
vitamine K
II
VII
IX
X
État d’hypocoagulabilité
Synthèse de facteurs
non fonctionnels
VARIABILITE
DANS
LA
REPONSE
Nb
de
patients
Doses de warfarine (mg/semaine)
Observance du traitement
Alimentation (vit. K)
Risque
Situation physiopathologique
Risque
hémorragique
Interactions médicamenteuses
thrombotique
Facteurs génétiques
HYPERSENSIBILITE
RESISTANCE
METABOLISME
DES
AVK
O
R
Super-famille d‘enzymes essentielles
pour le métabolisme des
médicaments
O
Dans le foie:
METABOLISME
des AVK
6 and 7
hydroxylation
par CYP2C9
O
17 familles de CYPs comprenant environ 50
isoformes identifiées chez l‘Homme
R
O
classification:
famille
> 40% homologie
de séquence
↑ hydrophile
CYP 2 C 9 *1
isoenzyme
sous-famille
> 55% homologie
de séquence
allèle
ELIMINATION
(biliaire et rénale)
VARIABILITE DANS L’ACTIVITE DU CYP 2C9
 Variations environnementales: inhibition/induction
 Polymorphismes génétiques
24 variants alléliques
http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2c9.htm
Variants alléliques
Fréquence Allélique
Activité
CYP2C9*1
0,79-0,86
100 %
CYP2C9*2 (Cys144Arg)
0,08-0,19
12 %
CYP2C9*3 (Leu359Ileu)
0,06-0,1
5%
Populations caucasiennes
CIBLE PHARMACOLOGIQUE des AVK
AVK
inactif
CYP2C9
VIT K
réduite
VKOR
Cycle
de la
vitamine K
GGC
Facteurs Vit K dépendants
inactifs
VKOR =
Vitamine K
époxyde
réductase
VIT K
oxydée
GGC=γ-glutamyl
carboxylase
Facteurs Vit K dépendants
actifs
Relation entre SNP 1173C>T (intron 1) et
dose de warfarine à l’équilibre
« A polymorphism in VKORC1 gene is associated with an
inter-individual variability in the dose-anticoagulant effect
of warfarin »
D'Andrea, Blood. 2004
VKORC1
CC
CT
TT
DOSE
6,2
4,8
3,5
95% CI
5-7,3
3,8-5,9
2,2-4,8
p
Ref
0,002
0,001
n PATIENTS
54
69
24
CYP2C9 explique 21% de la variabilité
VKORC1 explique 13% de la variabilité
À
partir
d’une
étude
chez
des
volontaires
sains
(n=230)
recevant
une
dose
unique
d’acénocoumarol
détermination
de
la
part
génétique
dans
la
variabilité
de
la
réponse
pharmacologique
Collaboration CIC St Antoine, Pr Laurent Becquemont
INSERM U525, David-Alexandre Trégouët
RESULTATS CYP 2C9 (région codante)
Effets des allèles CYP 2C9*2 et *3 sur la réponse à l’acénocoumarol
(« ratio facteur VII » = J0/J24 x100 )
Répartition des génotypes:
)
%
(
Génotype
*1/*1
*1/*2
*1/*3
*2/*2
*2/*3
*3/*3
Nombre
143
44
30
4
8
1
Data allèle*2-Rapport
o 100
i
t
a 75
r
I
I
V
F
)
%
(
o
i
t
a
r
50
I
I
V
F
25
0
/2
*1
CYP2C9
CYP
2C9genotype
*2
NS
P< 0.001
Data allèle*3-Rapport
100
75
50
25
0
/
*1
/
*3
CYP
2C9genotype
*3
CYP2C9
14% de la variabilité
ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE
1 gène, plusieurs SNPs
SNP 1
Gène X
SNP 2
Réponse
Gène X
SNP 3
Gène X
SNP 1
Gène X
SNP 2
= haplotype 1
SNP 1
SNP 3
Gène X
= haplotype 2
SNP 2 SNP 3
Gène X
= haplotype 3
Réponse
ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE
≥ 2 gènes, plusieurs SNPs
SNP 1
Gène A
SNP 2
= haplotype 1
SNP 1
SNP 3
= haplotype 2
Gène A
SNP 2 SNP 3
Gène A
= haplotype 3
Réponse
SNP 1
SNP 2
Gène B
= haplotype 1
SNP 1
SNP 3
Gène B
= haplotype 2
SNP 2 SNP 3
Gène B
= haplotype 3
Intérêt des Tag SNP
HAPLOTYPES
Marqueurs
Fréquences
T C C A A G C
0.286
T C C A G G T
0.242
C A T C A G T
0.231
T A C A A G T
0.089
T C C C A G T
0.048
T A C A A G C
0.030
T A C A A A T
0.010
7 haplotypes déterminés par 4 Tags (2-4-6-7)
STRATEGIE UTILISEE POUR ETUDE
HAPLOTYPIQUE DE VKORC1
http://pga.gs.washington.edu/data/vkorc1/welcome.html
29 SNPs répartis sur 10 kb
région 5’Flanquante and promoteur
Région codante
région 3’non traduite
17 SNPs avec fréquence > 5%
-4931 T>C
-4451 C>A
-2659 G>C
-1877 A>G
-1639 G>A
497T>G 698C>T 1173C>T1542G>C 2255C>T
3730G>A
4901 A>C
5113 G>A 5408 G>C
STRATEGIE UTILISEE POUR L’ANALYSE DU GENE VKORC1
Sélection des «Tag »
SNPs
in silico
-4931 T>C
-4451 C>A
-2659 G>C
-1877 A>G
-1639 G>A
497 T>G
1173 C>T
6 Tag SNPs (5 dans la région 5’, 1 dans l’intron 1)
95 % de la diversité haplotypique
ANALYSE HAPLOTYPIQUE DES POLYMORPHISMES
DU GENE VKORC1 EN RELATION AVEC LA
REPONSE PHARMACOLOGIQUE
Base de données => SNPs : reconstruction des haplotypes
corrélation avec variation du facteur VII
SNPs
-4931T> C -4451C>A -2659G>C -1639G>A 497T>G Fréquence
Effet haplotypique
Variation du Factor VII (%) (95% CI)
C
C
G
A
G
0.27
18.9 (16.7-21.1)
C
C
G
A
T
0.12
18.6 (14.0-23.2)
T
C
G
A
G
0.019
19.2 (7.5-30.9)
T
C
G
G
T
0.23
34.3 (32.4-37.2)
T
A
C
G
T
0.21
36.8 (33.6-39.9)
18.9 (16.9-20.9)
36.0 (34.2-37.8)
T
A
G
G
T
0.11
37.6 (32.8-42.3)
C
C
G
G
T
0.017
41.5 (22.3-60.7)
7 haplotypes: SNP -1639G>A =« marqueur des haplotypes »
EFFET DE LA MUTATION VKORC1 –1639G>A SUR LA
)
REPONSE
A L’ACENOCOUMAROL
%
(
o
i
t
a
r
I
I
V
Variation
Facteur VIIro
t
c
a
F
P<0.001
***
100
***
**yyy****
***
50
0
G
A
G
A
-1639G>A
Génotype VKORC1
37% de la variabilité
Bodin Blood 2005
Identification de biomarqueurs
Approche GWAS
« Genome Wide Association
study »
Les études d'association
Mettre en évidence le rôle de gènes/régions "candidats" dans la
variabilité d'un phénotype
Comment ?
Tester l'association statistique entre des polymorphismes
(marqueurs) et le phénotype d'intérêt
Puces à ADN
Marquage fluorescent de sondes
Hybridation spécifique sur ADN de patients
Grande capacité de génotypage:
densité variable, jusqu’à 1 milllion de SNPs
Lecture automatisée sur plate-forme dédiée
P-values for each GWAS SNP tested for association with warfarin dose.
Horizontal axis shows SNP location and vertical axis is −log10(p-value) for each SNP tested by
univariate regression (A) or multivariate regression (B). Red dots and red lettering show SNPs and
implicated genes with p-values beyond the genome-wide significance threshold (1.5×10−7) which is
denoted by a horizontal line. (A) Univariate regression shows genome-wide significant association to
SNPs clustering near the warfarin drug target VKORC1 (e.g., P = 5.4×10−78, rs9923231) and near
the warfarin-metabolizing gene CYP2C9 (P = 4.5×10−17 for non-synonymous *3 SNP rs1057910,
P = 8.8×10−13 for non-synonymous *2 SNP rs1799853, P = 3.1×10−31 for *2*3 “composite” SNP
rs4917639). (B) Multivariate regression adjusting for the contributions of VKORC1 and CYP2C9 had
greater power than univariate regression and detected genome-wide significant association to the
CYP4F2 gene (P = 8.3×10−10, non-synonymous SNP rs2108622).
Résultats de l’étude d’association avec l’hépatotoxicité
de la flucloxacilline
• Pic d’association p=8.7x10-33
• Chromosome 6 = région MHC
• Identification d’un marqueur en déséquilibre
de liaison avec HLA-B*5701
51 cas/282 témoins, puce Illumina Human1M
Réplication dans étude indépendante (23 cas)
Nature genetics 2009
CONCLUSION GENERALE
Phases de Développement
Du Médicament
Utilisation
en routine clinique
Bon usage de la pharmacogénétique va permettre:
Meilleure adéquation malade-traitement
Moins d’effets secondaires
Traitement plus efficace et à moindre coût
Ce qu’il faut retenir
•
•
•
•
•
•
•
Il existe une grande variabilité interindividuelle dans la réponse
aux médicaments;
Les facteurs génétiques expliquent une part de cette variabilité;
Il est possible de prédire la réponse aux médicaments:
génotypage, phénotypage, corrélation génotype-phénotype;
Pour le génotypage: nécessité d’avoir des populations
homogènes (influence de l’ethnie sur la fréquence des SNPs)
Etudes cliniques ou chez le volontaire sain
Approches gènes candidats ou études pangénomiques «Genome
Wide Association Study »
Etudes en combinaison de SNP ou d’allèles: approche
haplotypique