Imagerie par Spectrométrie de Masse

Transcription

TOF-SIMS et imagerie par MS
David TOUBOUL
CNRS
Institut de Chimie des Substances Naturelles
Gif-sur-Yvette
[email protected]
MALDI et SIMS
Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization
Les molécules (protéines, peptides,
sucres, lipides, etc…sont mélangées
avec une petite molécule organique
appelée matrice. Celle-ci absorbe la
lumière du laser UV et permet la
désorption et l’ionisation des molécules
d’intérêt sans les fragmenter.
M. Karas, F. Hillenkamp, Anal. Chem. 1988, 60, 2299-2301.
K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida,
Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151-153.
Secondary Ion Mass Spectrometry
Un faisceau focalisé d’ions, appelés
ions primaires, vient irradier la
surface d’un échantillon de laquelle
des ions, appelés secondaires, et
caractéristiques de la surface, sont
émis.
R. Castaing, G. Slodzian, J. Microsc. 1962, 1, 395-410
A. Benninghoven, E. Loebach, Rev. Sci. Instrum. 1971, 42, 49-52.
2
Le SIMS est une analyse de surface

Les projectiles (ions primaires) pénètrent sur seulement quelques centaines d'Ångströms.

Ils endommagent la matière sur toute cette profondeur, car ils se ralentissent par des
successions de collisions élastiques avec des atomes de l'échantillon, lesquels sont déplacés
et des molécules sont donc détruites.

Les ions secondaires ne proviennent seulement que des premiers 50-100 Å.
Ion primaire
Ions secondaires,
atomes, molécules,
électrons, photons
Profondeur d'analyse (50-100 Å)
Profondeur endommagée (100-500 Å)
3
Nano SIMS
Caractéristiques du NanoSims50 :




Analyses élémentaires
Excellente transmission des ions
secondaires (80% avec M/M de 5000)
Détection en parallèle de cinq images
Haute résolution latérale (50 nm en Cs)
Brevet Université Paris-Sud (P. Slodzian)
4
Nano SIMS
Analyse isotopique
Distribution de l’iode dans la
thyroïde
Application pour les simulations
de doses absorbées
12C14N
127I
31P
129I
Champ de
60 µm x 60 µm
d'après J.-L. Guerquin-Kern, Insitut Curie, Orsay
5
TRIFT (PHI)
6
Instrumentation TOF-SIMS IV
(ION-TOF GmbH)
7 mm
Liquid Metal Ion
Gun Bi3+ 25 keV
D. Touboul, F. Halgand, A. Brunelle, R. Kersting,
E. Tallarek, B. Hagenhoff, O. Laprévote
Anal. Chem. 2004, 76, 1550-1559
D. Touboul, O. Laprévote, A. Brunelle
Curr. Opin. Chem. Biol. 2011, 15, 725-732
7
Augmenter l'émission ionique avec des agrégats
L’impact d’un projectile polyatomique est
le moyen unique de bombarder une très
petite surface simultanément avec
plusieurs atomes
Projectile Ga1+
Dépôt d’une
grande densité
d’énergie très près de la surface
Ions ou
Neutres
Projectile Bi3+
Ions ou
Neutres
Importante augmentation de l'émission ionique
8
Augmenter l'émission ionique avec des agrégats
Au1 16 keV
Y/n
Phénylalanine
Cible
de Phénylalanine
(M-H)- m/z 164.2
(Y=26)
Au3+
Au4 16 keV
Au4+
Au5+
x 10
1.08 ps
(Y=317)
Au2+
Au1+
5.70 ps
1.08 ps
E/A (keV/u)
M. Benguerba, A. Brunelle, S. Della-Negra, J. Depauw,
H. Joret, Y. Le Beyec, M.G. Blain, E.A. Schweikert,
G. Ben Assayag, P. Sudraud
Nucl. Instrum. Methods. Phys. Res. B 1991, 62, 8-22
Au11
5.70 ps Les couleurs représentent la
127 keV/atome
1.61 1010/cm2
B
A
25nm
8.80 ps
A
B
S. Bouneau, A. Brunelle, S. Della-Negra, J. Depauw,
50
100nm
D. Jacquet, Y. Le Beyec, M.0 Pautrat, M.
Fallavier,
J.C. Poizat and H.H. Andersen,
Phys. Rev. B 2002, 65, 144106 1-10
5
20.0 ps
3.60 ps
20.0 ps
température en unités de la
température de fusion de l’or
(1338K).
T.J. Colla, R. Aderjan, R. Kissel,
H.M. Urbassek,
Phys. Rev. B. 2000, 62, 8487-8493
9
Composition d'un faisceau d'agrégats de bismuth
Binq+ 25kV
Liquid Metal
Ion Gun Bi3+
25 keV
10
Intensité (pA @10kHz)
+
Bi1
1
2+
Bi3
Time of flight
+
Bi3
Spectrum
2+
Bi5
0.1
Reflectron
Detector
+
Bi5
0.01
+
Bi7
Electron
flood gun
1E-3
0
1
2
3
4
5
6
7
Temps de vol des ions primaires ~ (m/z)
14 RCJSM Borzée
8
1/2
07-08/04/09 Alain BRUNELLE ICSN GIF SUR YVETTE
10
Sélection en masse des ions primaires par leur
temps de vol entre deux jeux de plaques de
pulsation
HT
Générateur d'impulsions
Retard
HT
Temps de vol
Faisceau
pulsé
contenant
une seule
espèce
Faisceau pulsé
contenant
toutes les
espèces
Faisceau continu
i
i
t
i
t
t
11
Mass Spectrometry Imaging
MALDI and SIMS
Frozen section
ection mince
ongelée
MS images
Images
MS
TOF MS
4000
Ions
Ionsou
or
Photons
photons

6000
8000
10000
Spectre
de masse(m/z)
[m/z]
Mass spectrum
MS Images

Ion density maps

1 acquisition = one image for
each peak and one spectrum
per pixel…

Huge amount of data
M. Stoeckli, P. Chaurand, D.E. Hallahan, R.M. Caprioli, Nat. Med. 2001, 7, 493-496.
12
Mass Spectrometry Imaging
MALDI and SIMS
Frozen section
ection mince
ongelée
MS images
Images
MS
MALDI
SIMS
Desorption
UV Laser
Focused cluster
ion beam
Spatial
resolution
10-50 µm
400 nm - 2 µm
Sample
Dehydrated,
Homogeneous
matrix coating
Dehydrated
No fixation
No matrix
Mass range
m/z > 200
m/z  1500
Proteins,
Peptides,
Lipids,
Drugs,
Metabolites,…
Lipids
Glycosphingolipid
s Cyclopeptides,
Drugs,
Metabolites,
Inorganics,…
TOF MS
4000
Ions
Ionsou
or
Photons
photons

6000
8000
10000
Spectre
de masse(m/z)
[m/z]
Mass spectrum
MS Images

Ion density maps

1 acquisition = one image for
each peak and one spectrum
per pixel…

Huge amount of data
Compounds
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
Secondary Ion Mass Spectrometry
M. Stoeckli, P. Chaurand, D.E. Hallahan, R.M. Caprioli, Nat. Med. 2001, 7, 493-496.
13
Résolution latérale utile
L (nm)
Sensibilité et rendements d'émission ionique
secondaire
Résolution latérale utile
2000
1600
1200
800
400
100
+
Au1
+
Bi1
+
Au3
+
Bi3
2+
Bi5
D. Touboul, F. Kollmer, E. Niehuis, A. Brunelle, O. Laprévote,
J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 1608-1618
14
Instrumentation TOF-SIMS IV
(ION-TOF GmbH)
Liquid Metal Ion
Gun Bi3+ 25 keV
Bi1+
Bi3+
Images recorded at the edge of the
corpus callosum on a rat brain
section
256x256 pixels, 256x256 µm2
Pixel size 1x1 µm2
Same fluences 1012 ions.cm-2
Acquisition time : 4 and 10 minutes
D. Touboul, F. Halgand, A. Brunelle, R. Kersting,
E. Tallarek, B. Hagenhoff, O. Laprévote
Anal. Chem. 2004, 76, 1550-1559
D. Touboul, O. Laprévote, A. Brunelle
Curr. Opin. Chem. Biol. 2011, 15, 725-732
15
Acquisition des images: Balayage du faisceau
d'ions primaires et déplacement de l'échantillon
Champ de l'optique d'extraction
à l'entrée de l'analyseur = 500 x 500 µm2

A: Objet ≤ 500 x 500 µm2



Porte échantillon immobile
Balayage du faisceau pixel par pixel
Image vidéo simultanée

B: Objet > 500 x 500 µm2


Porte échantillon mobile
Le faisceau balaye éventuellement à l'intérieur
d'un pixel
Ajustement du nombre de pixels (de 64 x 64 à 2048 x 2048), du nombre de tirs par pixels (ou scans) et de la durée d'analyse
(gamme de masse), paramètres conditionnant la durée d'acquisition et la dose (ions.cm -2)
16
TOF-SIMS lipid imaging
Spatial resolution
50 µm
1 µm
200 nm
Acquisition time
for a 256x256
pixels image
1 hour
15 minutes
30-60 minutes
118
29
0
0
Examples
on
Rat brain
sections
Field of view

18 mm x 18 mm
256 µm x 256 µm
55 µm x 55 µm
3 colour overlay
edge of corpus callosum
Cholesterol
inside of corpus callosum
Cholesterol
Several images (positive and negative ion modes) can always be recorded on the
same area
D. Touboul, F. Kollmer, E. Niehuis, A. Brunelle, O. Laprévote, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005, 16, 1608-1618
17
Imagerie biologique et spectrométrie de masse
In vivo :
Ex vivo :
• Rayon X (absorption)
• Fluorescence (absorption/émission)
• TEP (Tomographie par émission de
positons)
• Marquage radioactif (émission)
• IRM (Imagerie par Résonance
Magnétique, absorption/émission)
• IR (Infra-Rouge, absorption)
• MEB (Microscopie électronique à balayage,
molécule)
• MFA (Microscopie à force atomique, atomes)…
Mais toutes ces techniques sont basées sur des signaux de molécules connues a priori …
Nouvelles techniques d’imagerie biologique permettant d’accéder à la distribution, à la composition
et à la structure chimique d’un grand nombre de composés en mélange sur une surface et sans
aucun a priori
… seule la Spectrométrie de Masse permet d’accéder à ces données grâce aux sources laser
(MALDI) ou aux sources d’ions (SIMS) focalisées.
18
Targeted lipids
Fatty acids:
O
OH
Phospholipids:
Sterols:
O
N
P
O
O
O
O
O
O
O
HO
HO
HO
OH
Phosphatidylcholine
O
O
OH
α-Tocopherol
HO
P
O
O
O
O
O
X
X = H, Na, K, Ca...
O
Phosphatidylinositol
O
O
P
O
Cholesterol
OH
O
N
HO
O
HN
O
Sphingomyelin
Diglycerides:
Triglycerides:
O
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
19
Étude des lipides

Lipides :

Grande variété de fonctions biologiques





Composition et distribution lipidiques qui dépendent:




Composants structurels majeurs des membranes cellulaires
Stockage d'énergie
Antioxydants
Signaux cellulaires
Du type cellulaire
De l'état d'un groupe de cellules
Des conditions physiologiques
Imageries chimiques : anatomo-pathologie  colorants lipophiles
Noir Soudan
Rouge de Nil
Lipides non polaires
Excitation 450-500 nm
Emission >528 nm


Lipides polaires
Excitation 515-560 nm
Emission >590 nm
Peu spécifiques : tous les lipides, ou seulement des familles de lipides
Spectrométrie de masse couplée à des chromatographies gazeuses ou liquides :


Excellent pour quantification et/ou identification
Extraction préalable  perte de la localisation sur le tissu
20
Préparation des échantillons: coupes au
cryostat





Après dissection, congélation rapide à -80°C (Azote liquide)
Montage du tissu sur bloc d’OCT
Sections de 10-20 µm coupées à l'aide d'un cryostat (-20°C)
Montage des sections sur une plaque (inox, verre ou silicium)
Coupes sériées pour SIMS et histologie
21
Is imaging a reproducible technique ?
1
2
Bich C, Touboul D,
Brunelle A.
Int J Mass Spectrom.
2013;337:43-49.
Instrumental repeatability
3 adjacent brain sections
Biological repeatability
3 adjacent brain sections / 4 brains
Bich C, Touboul D, Brunelle A. Int J Mass Spectrom. 2013;337:4349.
Minimal number of samples
Coefficient of variation (%)
gyrus dentatus
50
Brain 1
Brain 2
Brain 3
Brain 4
y=axb
a= 49.2 ± 8.7
b=-0.48 ± 0.12
R2 = 0.854
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
Mean value
25
30
35
C.V.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Number of sample
α≤ 1%
α≤ 5% α≤ 10% α≤ 20%
7
27
60
1
106
2
166
4
239
6
1
325
8
1
425
10
2
537
12
2
664
15
3
803
19
3
956
22
4
1121
26
5
1301
30
5
1493
35
6
1699
39
7
1
1918
44
8
1
2150
50
9
1
2396
55
10
1
2654
61
11
2
90% of the data measured during an
experiment will be in the confidence
interval
Bich C, Touboul D, Brunelle A. Int J Mass Spectrom. 2013;337:43-49.
Non-alcoholic fatty liver disease
(NAFLD)
H&E staining
1000 µm
1000 µm
Control liver
Fatty liver

Accumulation of lipids (mainly diacyl- and triacylglycerols) in hepatocytes,

On stained sections, lipid vesicles are observed in fatty liver but are not observable in healthy liver,

NAFLD represents, in the absence of alcohol abuse, a wide spectrum of conditions ranging from simple
steatosis (NAFL) to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), that may progress to cirrhosis, cancer and
necessitate liver transplantation.

Collaboration François Le Naour , INSERM, Villejuif
26
Vit.E
430.36
6
5
Chol.
Control liver
4 MAG
577.43
551.43
1
385.33
2
DAG
369.34
3
313.28
339.29
MAG
Vit.E
3
DAG
Lipid profile of a fatty liver :
Steatotic area, positive ion mode
Intensity per unit area (counts x10 )
TAG
523.47
0
300
400
500
603.44
600
PC
758.55
760.56
700
800
900
m/z
D. Debois, M.P. Bralet, F. Le Naour, A. Brunelle, O. Laprévote, Anal. Chem. 2009, 81, 2823-2831
27
MAG
Fatty liver - steatotic area
20
577.53
MAG
Chol.
369.33
15
10
0.5
0.4
0.3
551.47
313.27
339.28
3
DAG
PC
758.45
760.49
TAG
853.69
855.73
857.74
0.2
5
5
2
500
0.0
700 750 800 850 900 950
700
551.43
1
523.47
0
300
400
500


600
577.43
603.44
600
PC
758.55
760.56
700
800
900
m/z
523.44
400
DAG
369.34
3

0
300
Control liver
4 MAG
0.1
603.51
Chol.
385.33
Vit.E
Vit.E
430.36
6
313.28
339.29
3
DAG
TAG
800
Increase fo the diacylglycerol signal in
the steatotic area
Strong decrease of vitamin E signal
Detection of triacylglycerols
900
m/z
28
16
7
179
In agreement
with the
disease
description
100 µm
Cholesterol
0
Sum of TAGs
0
Sum of DAGs
0
29
16
7
179
In agreement
with the
disease
description
100 µm
Cholesterol
0
Sum of TAGs
0
Sum of DAGs
0
20
577.53
MAG
Chol.
369.33
15
10
0.3
551.47
PC
758.45
760.49
TAG
853.69
855.73
857.74
0.2
0.1
603.51
5
0
300
0.5
0.4
313.27
339.28
3
DAG
0.0
700 750 800 850 900 950
523.44
400
500
600
700
800
900
m/z
30
16
7
179
In agreement
with the
disease
description
100 µm
0
Cholesterol
19
C30 DAGs
0
0
Sum of TAGs
Sum of DAGs
50
C32 DAGs
0
0
79
C34 DAGs
0
64
C36 DAGs
0
 Only mass spectrometry imaging makes possible to distinguish between the different
localizations among the same lipid species
31
C36:4 DAGs
C36:3 DAGs
C36:2 DAGs
C36:1DAGs
C36:0 DAGs
64
C36 DAGs
0
32
17
33
0
C36:4 DAGs
38
0
C36:3 DAGs
20
0
C36:2 DAGs
9
0
C36:1DAGs
0
C36:0 DAGs
64
C36 DAGs
0
33
MAG
10
551.43
339.25
15
Fatty liver
Non-steatotic area
577.43
5
0
300
Chol.
369.27
Vit.E
430.27
400
4
Chol.
369,35
3
2
Control liver
MAG
DAG
577.43
PC
551.43
1
0
300
400
523.47
500
758.55
760.56
603.44
600
700
800
900
m/z
PC
758.45
760.49
523.37
5
385.33
DAG
Vit.E
430.37
6
313.28
339.29
20
313.23
3
3
Non-steatotic area, positive ion mode


Decrease of vitamin E signal
Increase of diacylglycerol signal
603.44
500
600
700
800
900
m/z
34
126
20
DAG
MAG
10
Fatty liver
Non-steatotic area
551.43
339.25
15
313.23
3
Sum of DAGs
577.43
5
0
300
Chol.
369.27
Vit.E
430.27
400
4
Chol.
369,35
3
2
Control liver
MAG
DAG
577.43
PC
551.43
1
0
300
400
523.47
500
758.55
760.56
603.44
600
700
800
900
m/z
PC
758.45
760.49
523.37
5
385.33
0
Vit.E
430.37
6
313.28
339.29
3


603.44
500
600
700
800
900
m/z
35
126
20
DAG
MAG
10
Fatty liver
Non-steatotic area
551.43
339.25
15
313.23
3
Sum of DAGs
577.43
5
0
300
Chol.
369.27
Vit.E
430.27
4
Chol.
369,35
3
2
Control liver
MAG
DAG
577.43
PC
551.43
1
0
300
400
523.47
500
758.55
760.56
603.44
600
700
800
900
m/z
PC
758.45
760.49
523.37
5
385.33
0
Vit.E
430.37
6
313.28
339.29
3


603.44
Relative intensity variations:
400
"All or nothing":
500
600
700
800
900
m/z
Myristic acid and tricacylglycerols detected only
in steatotic liver
Depletion of vitamin E in steatotic liver, better observed
in steatotic areas, Accumulation of diacylglycerols in
steatotic and non-steatotic areas, although "normal" for
histology
36
La maladie de Fabry
Maladie lysosomale de la famille des sphingolipidoses due à un déficit en α-Dgalactosidase-A (α-GALA) de transmission récessive liée au chromosome X
(1 cas sur 120 000 naissances)
Accumulations de glycosphingolipides Gb3 et Ga2
OH
Structure d’un Gb3 (Trihexosylceramide) :
OH
O
HO
OH
O
O
OH
O
HO
OH
O
HO
OH
O
HN
O
OH
OH
Chaîne osidique
Chaîne acyle (base) variable
(a-Gal/b-Gal/b-Glu)
Ga2 (digalactosylcéramide), enchaînement Gal/Gal
Atteinte multi systémique sévère dominée par une insuffisance rénale inexorable, des lésions
neurologiques et cardiaques évolutives et des angiokératomes
37
Biopsie cutanée de patient atteint de la maladie de
Fabry
+Médullaire
Corticale
Médullaire
Aucun traitement de l ’échantillon
236x236 µm2
Résolution: 1 µm
15 min d’acquisition
Dose: 1.25 x 1012 ions.cm-2
0
900
1156.9
1158.9
950
1000

1050
m/z

1130.9
1048.8
20

1132.9
40
994.7
996.7
1010.8
1024.8
Intensity (counts)
60
1100
1150
1200
Détection d’un faible signal de Ga2 et Gb3
Localisation uniquement d’une famille
moléculaire avec une résolution de 1 µm
Colocalisation avec la vitamine E, le
cholestérol et le sulfate de cholestéryl
D. Touboul, S. Roy, D.P. Germain, P. Chaminade,
A. Brunelle, O. Laprévote, Int. J. Mass Spectrom. 2007, 260, 158-165
38
Biopsie cutanée de patient atteint de la maladie de
Fabry
+Médullaire
Corticale
Médullaire
236x236 µm2
Résolution: 1 µm



Pour des cellules de peau en culture, il existe un lien entre l’accumulation de Ga2 et de cholestérol.
Ceci est observé directement sur des coupes de peau de patients atteints par la maladie de Fabry
La présence de vitamine E est le signe d’une réaction inflammatoire locale et intense. Une
dérégulation des NO-synthases, une réduction de la chaîne respiratoire enzymatique et une
augmentation de la fréquence de la mutation génétique eNOSG894T ont déjà été démontrées.
Le sulfate de cholestéryl intervient dans la différenciation cellulaire et dans la formation de la
barrière épidermale au niveau de la peau.
Biopsie rénale de patient atteint de la maladie de
Fabry
+
500x500 µm2
Résolution: 1 µm
Intensity (counts)
5000

4000

3000

2000
Détection d’un signal très intense de Ga2 et Gb3
Localisation possible d’une seule espèce
moléculaire avec une résolution de 1 µm
Colocalisation avec la vitamine E, le cholestérol et le
sulfate de cholestéryl
1000
0
950
1000
1050
m/z
1100
1150
1200
40
MS/MS with a TOF-SIMS:
"Post-Source Decay like" method
Δt
Detector
Time of flight
Primary ions
700
Field free space
where metastable ions decay
Reflectron
Sample
m p - m f = K × m p × ΔT
Not a true MS-MS method
only confirmation of known structures
Intensity (counts)
U0
Gb3 [M+Na]
600U1>U0
+
m/z 1158.2
500
400
300
-162 u
200
-162 u
100
0
D. Touboul, A. Brunelle, O. Laprévote,
Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 703-709
S. Della-Negra, Y. Le Beyec, Anal. Chem. 1985, 57, 2035-2040
85
90
95
100
105
110
115
Time of flight (µsec)
41
Bacterial peptides: surfactins from
Bacillus subtilis
n
Peptide sequence: E L L V D L L or (beta-hydroxy fatty acid)-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu
Surfactins: family of heptacyclopeptides in which the C-terminal carbonyl is linked with the βhydroxy group of a fatty acid (12 to 16 carbon atoms long) acylating the N-terminal function of a
glutamic acid residue.
These compounds secreted by the Gram positive bacterium Bacillus subtilis play an important role
in the formation of dendritic patterns.
A. Kakinuma et al, Agr. Biol. Chem, 1969, 33: 973-6
42
Growing and swarming of a
bacterial colony on an agar gel
• Bacillus subtilus is a model bacteria; swarming is a model of monolayer
growing of biofilms
• Linked to medicinal problems: cystic fibrosis, contamination of medical material,
dental plaque…
Swarm 11h
Early « buds »
Swarm 13h
Initial dendrites
Swarm 19h
End of swarm
The migration front is always preceded by a “wet” zone due to the excretion of
peptidolipids by the bacterial cells
43
Analyse de profils dendritiques sur une surface
chez Bacillus subtilis
Préparation d'échantillon de swarming pour l'imagerie TOF-SIMS
Disque de silicium
Transfert du motif de
swarming sur un
disque de silicium
Intensité (coups)
Faisceau d'ions
primaires
m/z
44
Large biological samples: bacterial swarming
10 mm
Image size: 23 x 23 mm²
Primary ions: Bi3+, 25 keV
Negative mode
Fluence: 109 ions.cm-2
Pixel size: 90 x 90 µm2
Acquisition time: 4 hours
D. Debois, K. Hamze, V. Guérineau, J.-P. Le Caër, I. B. Holland, P. Lopes,
J. Ouazzani, S. J. Séror, A. Brunelle, O. Laprévote, Proteomics, 2008, 8, 3682-3691
45
Surfactin imaging on Bacillus subtilis imprints
-
3
[M14-H]
1020.63
2
-
3
Normalized Intensities (x10 )
1
0
980
4
[M13-H]
1006.61
1000
Mother colony
[M15-H]
[M14-2H+Na]
1034.64
1042.58
[M15-2H+Na]
1020
1056.61
1040
1060
1080
-
[M15-2H+K]
1072.58
1100
Dendrites
3
2
1
0
980
20
1000
1020
1040
1060
1080
1100
Ring
16
12
8
4
0
980
1000
1020
1040
1060
1080
m/z
Spectra intensities normalized to the smallest ROI area
1100
46
Surfactin imaging on Bacillus subtilis imprints
-
3
[M14-H]
1020.63
2
-
3
Normalized Intensities (x10 )
1
0
980
4
[M13-H]
1006.61
1000
Mother colony
[M15-H]
[M14-2H+Na]
1034.64
1042.58
[M15-2H+Na]
1020
1056.61
1040
1060
1080
-
[M15-2H+K]
1072.58
1100
Dendrites
3
2
1
0
980
20
1000
1020
1040
1060
1080
1100
Ring
16
12
8
4
0
980
1000
1020
1040
1060
1080
m/z
Spectra intensities normalized to the smallest ROI area
Longest fatty acyl chain length = most hydrophobic
surfactins,
preferentially released from the mother colony
allowing them to spread further than the surfactins
with shorter fatty acyl chains.
Surfactins with shorter chains (13-15) may remain
associated the bacteria.
1100
47
How to improve spatial resolution ?
[C18:0–H]- m/z 283.3 (red), [C16:0–H]- m/z 255.2 (green),
and cholesterol [M–H]- m/z 385.4 (blue).
Vanbellingen QP, Elie N, Eller MJ,
Della-Negra S, Touboul D, Brunelle A.
Rapid Commun Mass Spectrom.
2015; 29(13): 1187-1195.
Optimized extraction delay: 1235 ns
Vanbellingen QP, Elie N, Eller MJ, Della-Negra S, Touboul D, Brunelle
A. Rapid Commun Mass Spectrom. 2015; 29(13): 1187-1195.
Improvement of sample preparation
Microtome
Ultramicrotome
Use of a stainless steel blade
Section thickness ~20 µm
Dry sample
Wet sample
2000 µm
Radial section
Lack of information
Use of a diamond knife
Section thickness 200 to 500 nm
200 µm
Transverse section
Loss of information
Dry sample
200 µm
Transverse section
52
Analysis of a wood (Dicorynia guianensis) section
hMr
Beam size 2.9 µm
H(M+S)r
Beam size 0.4 µm
G lignin
fragment ions
S lignin
fragment ions
Red
Green
Fragments of lignin
Fragments of tryptamine
Collaboration with Didier Stien, Véronique Eparvier et Nadine Amusant , ICSN + Guyane
Evaluation and caracterization of the capabilities
of a C60 ion source for depth profiling
Surface analysis beam
Sputter beam
Surface analysis beam:
Bi3+ 25 keV (1.5x1010 ions/step)
Sputter beam:
C60+ 10 keV (2.8x1013 ions/step)
5-10 nm
5-10 nm
5-10 nm
Schematic view of a tissue section
54
1. on model layers
~260-270 nm thickness trehalose film doped with synthetic peptides
Secondary ion signal intensities versus accumulated C60+ ion fluence during depth profiling of (a) a pure
trehalose film (270 nm), (b) a trehalose film doped with 1% GGYR (263 nm), and (c) a trehalose film doped
with 1% KRTLRR (273 nm).
J. Cheng, A. Wucher, N. Winograd, J. Phys. Chem. B, 2006, 110, 8329-8336
55
2. directly on a tissue section
Profondeur d’analyse:
200 - 300 nm
Perte de signal quand on
creuse dans la coupe
1 - 1,6 µm
Imagerie 3 D d’une
coupe de cerveau de rat
impossible
2-3 µm
D. Debois, A. Brunelle, O. Laprévote,
Int. J. Mass Spectrom., 2007, 260, 115-120
56
2. directly on a tissue section
Estimated sputtered depth (nm)
0
Intensity (counts)
10
1500
2000
2500
3
10
2
Positive ions:
+
m/z 23 Na
m/z 184 Phosphocholine
m/z 369 & 385 Cholesterol

~ 3 µm have been sputtered at the surface of
a rat brain tissue section

Lipids appear to be concentrated at the
surface, in the first 200-300 nm.(P. Sjövall et
al., Appl. Surf. Sci. 2006, 252, 6513-6516)

Damage is still too much important, for heavy
molecules, to enable depth profiling with a
good sensitivity over several microns.

The results are not in contradiction with the
literature, where model layers of several
hundreds of nm only have been successfully
profiled.
1
0
Intensity (counts)
1000
4
10
10
500
10
4
10
3
10
2
10
1
5
10
15
20
25
30
+
15
-2
C60 ion dose density (10 ions.cm )
Negative ions:
m/z 35 Cl
m/z 97 H2PO4
m/z 385 Cholesterol
m/z 255 & 283 Fatty Acids
m/z 895 Triglycerides
0
5
10
15
20
25
30
+
15
-2
C60 ion dose density (10 ions.cm )
D. Debois, A. Brunelle, O. Laprévote,
Int. J. Mass Spectrom., 2007, 260, 115-120
57
58
59
dx.doi.org/10.1021/ac4009513 | Anal.
Chem. 2013, 85, 7745−7752
60
Study of cultural heritage samples
Identification of a copper green pigment
MGN8
In painting, the green colour can be obtained with a
mineral pigment:
malachite (copper carbonate)
verdigris (copper acetate)
copper chloride
green earth (silicates with K, Si, Al, Fe and Mg)
or with an organic pigment:
copper resine
breakdown products: interaction between a mineral
pigment and a organic binding media (lipids or proteins)…
Concert of Angels
La technique picturale de Grünewald et de ses contemporains,
Eds. P. Béguerie-De Paepe, M. Menu, C2RMF CNRS-UMR171
et Musée d’Unterlinden de Colmar, 2007
P. Richardin, V. Mazel, P. Walter, O. Laprévote, A. Brunelle
J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, 22, 1729-1736
61
TOF-SIMS analysis of the painting cross section
Microscopic image of the
cross-section MGN8
Photography of an intact
cross-section deposited on
a SEM holder
Secondary ion image
(Visualisation of the analysed
area)
max
Alignment of the
cross-section
min
Image of the total ion current
62
Copper: positive ion mode
Cu+
+
m/z 63 and 65
Cun+
Cu3+
Cu2+
+
m/z 126, 128 and130
m/z 189, 191, 193 and 195
Localization of copper
Sum of all the images corresponding to the Cun+ clusters
63
Copper: positive ion mode
Cu+
+
m/z 63 and 65
Cun+
Cu3+
Cu2+
+
m/z 126, 128 and130
m/z 189, 191, 193 and 195
Localization of copper
Sum of all the images corresponding to the Cun+ clusters
Lipids: negative ion mode
lipids
Myristate
(C14:0)
(C15:0)
Carboxylates RCOO -
Palmitate
(C16:0)
(C17:0)
Oleate
(C18:0)
Localization of lipids
64
Ions -
x 104
255.35
Mass spectra of the copper / lipid rich area
(FA-H)-
1 .6
1 .4
Fatty acid carboxylates
1 .0
Complexes copper / fatty acid
carboxylates
0 .8
(FA-H)2Cu-
573.46
153.02
1 .2
0 .4
445.33
319.23
0 .6
0 .2
152.92
200
300
400
500
600
700
800
900
m as s / u
Ions +
x 104
381.31
190.88
1 .0
0 .8
286.99
0 .6
(FA)Cu2+
0 .4
200
300
400
699.56
585.35
505.44
0 .2
(FA)2Cu3+
500
600
700
800
900
m as s / u
65
Ions -
x 104
255.35
Mass spectra of the copper / lipid rich area
(FA-H)-
1 .6
1 .4
These two mass spectra
are compatible with a
copper carboxylate
pigment
(structure not clearly
established)
Fatty acid carboxylates
1 .0
Complexes copper / fatty acid
carboxylates
0 .8
(FA-H)2Cu-
573.46
153.02
1 .2
0 .4
445.33
319.23
0 .6
0 .2
152.92
200
300
400
500
600
700
800
900
m as s / u
Ions +
x 104
381.31
190.88
1 .0
0 .8
286.99
0 .6
Copper carboxylates
(R = CnH2n+1)
(FA)Cu2+
This result was
confirmed by infrared
microscopy (SR-µFTIR)
0 .4
200
300
400
699.56
585.35
505.44
0 .2
(FA)2Cu3+
500
600
700
800
900
m as s / u
66
Identification of the copper green pigment
Cun+
Copper green ?
CopCarb+
Copper
carboxylates
Color overlay shows
the distribution of Cu ions
and Cu carboxylates
This result was also confirmed by infrared
67
Copper hydroxide ions
Ions + Cu2OH+
Cun+
Cu3(OH)2+
Copper green ?
CopCarb+
Ions -
Cl-
CuCl2.CuOH-
Copper
carboxylates
Color overlay shows
and Cu carboxylates
68
Copper hydroxide ions
Ions + Cu2OH+
Cun+
Cu3(OH)2+
Copper green ?
Atacamite
Cu2(OH)3Cl
CopCarb+
Ions -
Cl-
CuCl2.CuOH-
Copper
carboxylates
Color overlay shows
and Cu carboxylates
CopCarb+
69

Imagerie par Spectrométrie de Masse

Transcription

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